JP2004508533A - 膜 - Google Patents
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Abstract
【課題】
【解決手段】本発明は、低自己蛍光性、特に湿潤状態の下での熱循環能、及び三次元結合能といった、一つまたはそれ以上の利点を有する滑らかな表面をした多孔性膜である。膜はフリースタンドにすることもできるが、複合膜中で支持体との組み合わせによるものが好ましい。本発明は、支持体上に配置された多孔性ポリマー層を備える複合膜を提供する。本発明は、さらに核酸のような生物材料の分析のための複合体を備える装置、例えばマイクロアレイを提供する。
【選択図】図1
【解決手段】本発明は、低自己蛍光性、特に湿潤状態の下での熱循環能、及び三次元結合能といった、一つまたはそれ以上の利点を有する滑らかな表面をした多孔性膜である。膜はフリースタンドにすることもできるが、複合膜中で支持体との組み合わせによるものが好ましい。本発明は、支持体上に配置された多孔性ポリマー層を備える複合膜を提供する。本発明は、さらに核酸のような生物材料の分析のための複合体を備える装置、例えばマイクロアレイを提供する。
【選択図】図1
Description
【0001】
この出願は、2000年2月18日にされた米国仮特許出願Nos.60/183,327及び2000年7月26日にされた米国仮特許出願Nos.60/220,825の優先権を主張するものである。これらの仮出願は参照として取り込む。
【0002】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般的に滑らかな表面を持った物質、例えば、膜、特に核酸のような生物材料の結合に適した、例えばマイクロアレイ用途への使用に適した低自己蛍光性の滑らかな表面をした多孔性複合膜に関するものである。
【0003】
【従来の技術】
マイクロアレイは、生物材料のスクリーニング、DNAシークエンス、及び遺伝子発現分析を含む様々な用途に使用できる。マイクロアレイは、一般的には、例えば表面が修飾されたグラススライド、又は多数の生物材料が付着している支持体ナイロン膜といった基材から成る。典型的なマイクロアレイの用途では、基材が生物材料を含むサンプル、例えば核酸と、分析されるために接触する。基材は、ラベリングした核酸のようなプローブ分子と接触する。ラベリングした核酸は、サンプル中の相補的核酸とハイブリダイズする。ハイブリダイズしなかったプローブ分子は、例えば洗浄によって取り除かれ、マイクロアレイはその後適切なシグナル検出装置、例えば蛍光発光によって読みとられる。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
従来知られたいくつかの基材は、一つないし複数の欠点を持っている。例えば、高い自己蛍光を有すること、高価な大量の生物サンプルの使用が必要であることである。これでは、わずかな量でも有用である微量サンプルを検出することが困難である。いくつかの基材は、均一性を欠いており、変動し易く、信頼性を欠いた結果を得ることにつながる。
【0005】
加えて、いくつかの基材の標本は、必要以上の労力、及び/又は外部材料の使用、例えば、固体支持体に基材をつける粘着物を必要とすることがある。そのような外部材料は、マイクロアレイのバックグラウンドシグナル、例えば、蛍光の増加を必要としないことがあり、分析の精度を低下する。多くの従来基材及び/又は粘着物はまた、一度の使用にしか適用されない。このような基材は、複数のプローブに関係したプロトコルに必要な耐熱性、耐水性を欠いてしまう。
【0006】
前記のものは、低自己蛍光性を有する基材を必要とする。さらに、かなり薄い基材を必要とし、そうすれば、正確な結果を提供するために大量の生物サンプルを必要としなくなり、及び/又は耐熱性を持つようになる。またさらに、外部材料のない、または実質的にない基材を必要とする。
【0007】
こういった事実に基づいた本発明の優位性は、ここに示した詳細な説明からはっきりと理解できるであろう。
【0008】
前記した問題は、一つもしくは複数の優位性、例えば低自己蛍光性、熱循環能(thermal−cyclability)、及び三次元的結合可能性を有する滑らかな表面構造をした基材、例えば多孔性膜を提供できる本発明によって解決される必要がある。膜はフリースタンドでもよいが、支持体との組み合わせが好ましい。それに応じて、本発明の実施例では、多孔性ポリマー層を含む複合膜を提供する。好ましい実施例において、膜は生物材料との三次元での結合可能性を有している。好ましいこの膜は、一度ないし何度も使用できる。
【0009】
本発明はさらに、核酸のような生物材料の分析のために複合体を含んでいるマイクロアレイ装置のような装置を提供する。本発明はさらに、サンプル中にある核酸量の検出方法及び/又は定量化方法を提供する。本発明はさらに、サンプル中にある生物材料を測定するキットを提供する。本発明はまた、膜、複合体、または装置を作成する方法を提供する。
【0010】
本発明は、確かな好ましい実施例および手順と共に、以下に説明、開示されているけれども、それは、これらの特定実施例に発明を制限することを意図するものではない。むしろ、発明の特質および範囲内に属する、全ての代替え実施例および変形例を含むことを意味している。
【0011】
【課題を解決するための手段】
本発明は、滑らかな表面構造をもつ多孔性膜を提供する。実施例に基づくと、本発明は、支持体上に配置された薄い多孔性ポリマー層を含む複合膜を提供する。本発明による膜は、マイクロアレイ用途を含む幅広い多様な用途への使用に魅力的である。
【0012】
この膜は、多様なマイクロアレイの準備の使用を見い出せ、例えば、少なくともおよそ100/cm2、好ましくは少なくともおよそ1000/cm2、さらに好ましくはおよそ1000/cm2からおよそ10000/cm2までの密度を有する生物材料結合領域をもっているマイクロアレイがある。マイクロアレイ中の領域は寸法、例えば、およそ10μmからおよそ250μmまでの範囲の直径をもつことができ、望むならばアレイ中の他の領域からおおよそ同じ距離で離される。
【0013】
多孔性ポリマー層は、生物材料と親和性をもつポリマーを含むことが好ましい。生物材料には、自然材料または人工材料がありうる。生物材料の例としては、核酸、例えば、DNA、cDNA、RNAおよびmRNAに加えて、少なくとも一つのオリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、抗原、タンパク質、ペプチド、脂質、リポタンパク質、多糖類、及びそれらの誘導体を含む。
【0014】
この膜の表面は滑らかである。滑らかさは、ピークや谷間を含んでいる表面形状と関係づけられる。例えば、滑らかな膜は、ピークや谷間が少なく、高さ又は谷間のピーク及び/又は深さがほとんど変化しない。滑らかさは、当業者によるあらゆる多くの方法で定量的に評価することができる。例として、滑らかさは、平均表面粗さ(Ra)、二乗平均平方根粗さ(Rq)、外形の最大高さ(Rt)、または外形の平均最大高さ(Rz)によって表すことができる。Raは、膜全体に渡って計算された平均高さである。Raの測定においては、単一の見せかけのピークによる効果は、平均化されて除かれる。Rqは、評価域内で得た測定高さ偏差の二乗平均平方根平均値であり、平均線上表面から測定される。
【0015】
表面が、平均表面レベルからほとんど偏差のない外形をもっているのならば、RaとRqの値は近くなる。かなりの数の隆起やくぼみがあれば、外形高さ関数の最大値は、表面特徴を支配し、RqはRaより大きい。Rzは最大ピークと谷間の間隔の平均値である。滑らかさは、当業者に知られた方法、例えばプロフィロメトリー(profilometry)によって測定される。そのような機器は、制限しないけれども、Veeco Instruments Inc.,Plainview,NYから利用可能なthe WYKO(商標) Profilersは、滑らかさを測定するために使用可能である。
【0016】
一つの実施例に従って、本発明は、およそ800nmより小さいRa値をもつ膜を提供する。別の実施例においては、本発明は、およそ1000nm、好ましくはおよそ500nm、さらに好ましくはおよそ300nmより小さいRq値をもつ膜を提供する。さらに別の実施例では、本発明は、およそ10μm、好ましくはおよそ8μm、さらに好ましくはおよそ5μmより小さいRz値をもつ膜を提供する。さらに別の実施例では、本発明は、およそ15μm、好ましくはおよそ10μm、さらに好ましくはおよそ7μmより小さいRt値をもつ膜を提供する。本発明の別の実施例に従って、膜は、上記した少なくとも二つの表面形状のあらゆる組合せをもつ。
【0017】
本発明による複合膜は、低いまたは最小のポリマー層のシグナル特性、例えば、自己蛍光性、ガンマ線、エックス線、UV、VISまたはIRのスペクトル吸収率や透過率を提供する。例えば複合膜は、特に可視スペクトル範囲で低自己蛍光性を提供する。
【0018】
膜の自己蛍光性はあらゆる適切な方法、例えば蛍光検出、共焦点顕微鏡、CCDカメラの使用によって決定できる。例えば、蛍光検出において、決定されるべきサンプルの自己蛍光性は、光線によって光を当てる。光は赤色励起蛍光スキャンによる赤(例えば、波長635nm)、青色蛍光スキャンによる青(例えば、波長450nm)である。青色または赤色光が、適切なフルオロフォア、例えば、蛍光色素を含むサンプルのエリアにヒットするとき、フルオロフォアは、ある特定のスペクトルで光を放出する。放出された光は集められ、例えば光電子増倍管(PMT)を使用してシグナルに変換される。シグナルの強さは、サンプル中に存在する蛍光量に比例する。膜の自己蛍光性を測定するのに使われる商業的システムの例として、STORM(商標)光学走査器、例えばMolecular Dynamics,Sunnyvale,CAによるSTORM860がある。
【0019】
本発明の複合膜は、一つの実施例において、波長域400nmから700nmで、およそ5000units、好ましくは3000units、さらに好ましくは2000units、またさらに好ましくは1000unitsより小さい自己蛍光性をもつ。別の実施例では、本発明は、波長域420nmから490nmで、特に青色波長域およそ470nmで、およそ5000units、好ましくは3000units、さらに好ましくは2000units、またさらに好ましくは1000unitsより小さい自己蛍光性をもつ複合膜を提供する。さらに別の実施例では、本発明は、波長域640nmから700nmで、特に赤色波長域およそ650nmで、およそ2000units、好ましくは1000units、さらに好ましくは500unitsより小さい自己蛍光性をもつ複合膜を提供する。ここに記載された自己蛍光単位は、800Vに設定されたPMTと100μmのスキャニングピクセルサイズで、STORM860 Imagerで測定されたものである。ただし、他の方法およびシステムでも上記に記載したような自己蛍光性を計測するのに使用することができる。
【0020】
別の実施例によると、本発明は、支持体上に配置された多孔性ポリマー層を備える複合膜を提供する。複合体は、支持体よりも少ない自己蛍光性をもつ。例えば、複合体の自己蛍光性は、支持体の自己蛍光性よりおよそ1/10より少なく、好ましくは1/5より少ない。さらに別の実施例によると、本発明は、支持体上に配置された多孔性ポリマー層を備える複合体を提供する。複合体は熱循環能(thermal cyclable)を有している。
【0021】
多孔性ポリマー層はかなり薄い。多孔性ポリマー層は、およそ150μmより薄い厚さ、例えば、典型的にはおよそ0.1μmからおよそ100μm、好ましくはおよそ10μmからおよそ100μm、さらに好ましくはおよそ10μmからおよそ60μmの厚さをもっている。実施例において、好ましい厚さはおよそ1μmからおよそ60μmである。膜は微孔質のものが好ましい。ポリマー層は、少なくともおよそ容量で50%の空隙率をもっている。実施例においては、膜は相互接続した細孔を含む。ある実施例におけるポリマー層、特に結晶化ポリマーを含むものでは、一次元、二次元ないしは三次元での分子配向をもつ。
【0022】
本発明による実施例では、多孔性ポリマー層が分子特性、例えば高分子ネットワーク、十分な物理的強度または他の(複数の)特性を有し、層を形作るこの(これらの)特性は、支持体の無い状態でさえもその統合性や形を維持する。この点で、多孔性ポリマー層は、セルフサポートまたはフリースタンドな層になることができる。
【0023】
実施例において、ポリマー層は結晶度が低く、典型的にはおよそ40%より低く、例えば、およそ10%からおよそ40%、好ましくはおよそ10%からおよそ30%、さらに好ましくはおよそ20%からおよそ30%である。例えばナイロン66は、24.8%の結晶度のポリマー層を製造するためにスピンコート(5000rpm,30秒)できる。(スピンコーティングについては以下に示す)結晶度は、あらゆる適切な方法、例えば高角度エックス線回折法によって決定できる。コーティング中のより高いスピン率は、減少した結晶度をもつポリマー層を製造することができる。
【0024】
ポリマー層は、多孔質であるのが好ましい。多孔質ポリマー層は、典型的にはおよそ0.01μmよりも大きい、例えばおよそ0.01μmからおよそ10μm、好ましくはおよそ0.1μmからおよそ1μm、さらに好ましくはおよそ0.2μmからおよそ0.5μmの平均細孔サイズをもつ。実施例においては、多孔質ポリマー層は平均細孔サイズがおよそ0.5μmまたはそれ以上、例えば、およそ0.5μmからおよそ1μmである。
【0025】
細孔サイズはあらゆる適切な方法、例えば泡立ち点ポロメーター方法(bubble point porometer method)によって決定することができる。すなわち、ある実施例による複合膜は、最小細孔サイズが0.25μm、平均流量サイズが0.44μm、泡立ち点細孔サイズが0.74μmであるナイロン66を備えている。高い多孔性質の膜は、その層の厚さ方向において生物材料が実質的に全ての利用可能なポリマーと接近し、結合することを可能にする。ポリマー層は、好ましくは三次元における生物材料に対する親和力を持っている。三次元親和力は、高い結合容量、例えば、主に表面上に結合しているそれらのような二次元親和力をもっている基質より高い結合容量を提供する。三次元親和力はまた、膜が少領域で膜上、例えばマイクロアレイ用途中に点状の液体を制限するという利点を提供する。液体は、実質的には異なるラテラル速度(lateral velocities)で異なる方向には移動しない。結果として、高い一様な点状外形を達成することが可能である。
【0026】
ある実施例において、多孔性ポリマー層の多孔性構造は、実質的に、好ましくは完全にランダムである。細孔分布が三次元である。実施例において、多孔性ポリマー層は、本質的に周期性がない。例えば、規則性がなく組織的でない交互性の構造である。多孔性領域および非多孔性領域は区別され、ランダムにサイズ化される。
【0027】
多孔性ポリマー層は、実施例においては、非対称構造をもつ。例えば、孔の数や大きさは、底面(すなわち、支持体に接触した表面)と比較して上面でより小さい。図4aと図4cにナイロン66膜の非対称構造を示す。ナイロン66膜は部分的に閉鎖細孔構造をもつ。
【0028】
ポリマー層は典型的には高い表面域をもち、例えば、スピンコートされたポリマー層の表面領域は、およそ30%、好ましくはおよそ30%からおよそ70%、さらに好ましくはおよそ50%であり、ドクターブレード(doctor blade)の使用を含むキャスティング技術によって製造されたポリマー層の表面領域よりも大きい。表面領域は、あらゆる適した方法、例えば、BET方法によって決定できる。例えば、ナイロン66は、19.1m2/gのBET表面領域をもつ層を製造するためにスピンコートされ得る。膜の高さ表面領域は、低いバックグラウンドシグナルを生産し、生物材料の検出において高い感度を達成することが可能であるという利点を提供する。実施例においては、スピンコートしたナイロン66膜は、高い感度を有し、特に標識が、例えば赤または遠赤外の蛍光標識が使用されるとき、ナイフキャスティングによって生産されたナイロン66膜の使用で可能になるよりも、低いレベルの生物材料、例えば1/10またはそれより小さいレベルを検出することが可能である。
【0029】
ポリマー層はあらゆる適切なポリマーを含むことができる。例えば、生物材料に親和性を示すポリマーがある。ポリマー層は親水性ポリマー、極性ポリマー、または荷電ポリマーを含むことができる。親水性ポリマーは水または溶液を基礎にした水または、およそ0.37(±0.005)erg/sq.mmより大きい、例えばおよそ0.37erg/sq.mmからおよそ1erg/sq.mmまたはそれ以上、そしていくつかの実施例では、およそ0.38erg/sq.mmから0.73erg/sq.mmまでの限界湿潤表面張力(critical wetting surface tension)に対する親和性を持っているポリマーを含む。極性ポリマーは、およそ10.0(±0.2)[cal/cm3]1/2より大きい、例えばおよそ10[cal/cm3]1/2からおよそ20[cal/cm3]1/2またはそれ以上、そして好ましくは10[cal/cm3]1/2からおよそ16[cal/cm3]1/2までの溶解パラメーターを持っているポリマーを含む。荷電ポリマーは、ポジティブ、ネガティブまたは両性ポリマーを含んでいるポリマーを含む。
【0030】
適切なポリマーの例としては、ポリアミド、ポリスルホン、ポリオレフィン、ポリハロゲンオレフィン、ポリスチレン、ポリオール、ポリアミン、ポリイミン、ポリエステル、アクリル重合体、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリビニル複素環、多複素環、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリアミド−イミド、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリグリコリド/ラクチド、ポリペプチド、ポリシロキサン、ポリシラン、ポリアセチレン、ポリホスファゼン、多糖、ポリエーテル、エポキシ樹脂、ポリアセタール、ポリウレタン、ポリウレア、尿素ホルムアルデヒド樹脂、ポリフェノール、フェノールホルムアルデヒド樹脂、アルキド樹脂、メラミンホルムアルデヒド樹脂、デンドリマー、スピロポリマー、ポリアリーレンオキシド(polyaryleneoxide)、ポリスルフィド、ポリケトン、ポリエーテルケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリアロマティック(polyaromatic)、ポリアルデヒド、アリル樹脂、セルロース、セルロースエステル、セルロース誘導体、及びこれらの組合せが挙げられ、中性ポリマーを含む上記したあらゆるポリマーは、荷電、極性、または親水性グループを含むために修飾される。ポリハロゲンオレフィンの例は、ポリビニリデンフッ化物である。
【0031】
例えば、二つまたはそれ以上の上記ポリマーの混合体は使用可能であり、一つまたはそれ以上のこれらのポリマーの単量体セグメントを備える共重合体も、使用可能である。セルロース誘導体の例としては、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロースが挙げられる。セルロースエステルの例としては、セルロース硝酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩が挙げられる。
【0032】
荷電ポリマーの例としては、ポリアミド、ポリアミン、ポリイミン、ポリアクリルアミド、ポリビニル複素環、多複素環、ポリイミド、ポリアミド−イミド、ポリペプチド、ポリウレタン、ポリウレア、尿素ホルムアルデヒド樹脂、メラミンホルムアルデヒド樹脂、デンドリマー、およびセルロース誘導体が挙げられる。
【0033】
親水性ポリマーの例としては、ポリアミド、ポリオール、ポリアミン、ポリイミン、ポリエステル、アクリル重合体、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリアクリル酸アミド、ポリアクリル酸ニトリル、ポリビニル複素環、多複素環、ポリイミド、ポリアミド−イミド、ポリラクチド、ポリペプチド、多糖、ポリエーテル、エポキシ樹脂、ポリアセタール、ポリウレタン、ポリウレア、尿素ホルムアルデヒド樹脂、ポリフェノール、フェノールホルムアルデヒド樹脂、アルキド樹脂、メラミン−ホルムアルデヒド樹脂、デンドリマー、スピロポリマー、ポリスルフィド、ポリケトン、ポリアルデヒド、セルロース、セルロースエステル、またはセルロース誘導体が挙げられ、ポリスルホン、ポリオレフィン、ポリハロゲンオレフィン、ポリスチレンポリカーボネート、ポリシロキサン、ポリシラン、ポリアセチレン、ポリホスファゼン、ポリアロマティック(polyaromatic)、ポリアリーレンオキシド(polyaryleneoxide)、アリル樹脂、ポリエーテルエーテルケトン、およびポリエーテルケトン、それ自体が親水性であるもの、あるいは親水性になるように修飾されたものを含み、さらに、上記したものを組み合せたものを含む。
【0034】
極性ポリマーの特定の例としては、ポリアミド、ポリスルホン、ポリオール、ポリアミン、ポリイミン、ポリエステル、アクリル重合体、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリアクリル酸アミド、ポリアクリル酸ニトリル、ポリビニル複素環、多複素環、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリアミド−イミド、ポリラクチド、ポリペプチド、多糖、ポリエーテル、エポキシ樹脂、ポリアセタール、ポリウレタン、ポリウレア、尿素ホルムアルデヒド樹脂、ポリフェノール、フェノールホルムアルデヒド樹脂、アルキド樹脂、メラミンホルムアルデヒド樹脂、デンドリマー、スピロポリマー、ポリアリーレンオキシド(polyaryleneoxide)、ポリスルフィド、ポリケトン、ポリエーテルケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリアロマティック(polyaromatic)、ポリアルデヒド、セルロース、セルロースエステル、またはセルロース誘導体が挙げられ、ポリオレフィン、ポリハロゲンオレフィン、ポリシロキサン、ポリアセチレン、ポリホスファゼン、ポリスチレン、ポリシラン、及びアリル樹脂、それ自体が極性であるもの、あるいはそれらに極性を与えるように修飾したものを含み、さらに、上記したものを組み合せたものを含む。無極性ポリマーに極性を与えるために、あらゆる適切な方法が使用できる。例えば、酸化、還元、スルホン化、ニトロ化、アミド化、カルボニル化、水酸化、カルボキシル化、リン酸化、界面活性剤による処置、及び/又は、極性単量体または重合体のグラフトがある。
【0035】
好ましくは、ポリマー層は、ポリアミド、コポリアミド、ポリスルホン、またはポリビニリデンフッ化物を含む。ポリアミドおよびコポリアミドの特定の例では、ナイロン、例えばナイロン4、ナイロン45、ナイロン6、ナイロン66、ナイロン11、ナイロン610、ナイロン612、およびナイロン6Tが挙げられる。ナイロン66はさらに好ましいポリアミドである。ポリスルホンの特定の例では、ビスフェノールAポリスルホン、ポリエーテルスルホン、およびポリアリールスルホンを含む。ポリエーテルスルホンはさらに好ましいポリスルホンである。
【0036】
上記に記載した一つまたはそれ以上のポリマーは、キャスティング、コーティングされ、多孔性ポリマー層として適用され得る。代替えとして、一つまたはそれ以上のポリマーは、ポリマーを修飾することで結合され、さらにキャスティング、コーティングされ、多孔性層として適用され得る。修飾しているポリマーは、あらゆる数のメカニズム、例えば共有結合、イオン結合、配位結合、水素結合、またはファンデルワールス相互作用または結合によって、多孔性層に親水性、荷電性、または極性を付与するような多孔性ポリマーと結び付けられる。別の実施例において、多孔性層は、初めに形成され、そして表面は、修飾しているポリマー、ポリマーまたは重合化している修飾モノマー、モノマー混合物をコーティング及び/又は治療することで修飾した。
【0037】
修飾ポリマーまたはモノマーは様々な機能的グループ、例えば、ヒドロキシル、カルボキシル、アミン、ピリジル、スルホン基、メルカプト基、チオカルボニル、ホスフィン、ホスホリル、およびイミンを持つことができる。適切な修飾ポリマーの例としては、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、無水マレイン酸/メチルビニルエーテルの加水分解共重合体、ポリスチレンスルホン酸、またはそれらの塩、ポリビニルスルホン酸またはそれらの塩、例えば、米国特許4,707,266に記載されたようなものが挙げられ、ポリヒドロキシアクリレートのようなポリマーを含んでいるヒドロキシルについては、例えば米国特許4,959,150、 4,906,374、 4,964,989、 5,019,260および4,886,836、に記載されたようなものが挙げられ、カチオニックポリアミド/ポリアミノ−エピクロルヒドリン樹脂、及びポリアミンエピクロルヒドリン樹脂については、例えば米国特許4,702,840及び5,128,041に記載されたようなものが挙げられる。
【0038】
本発明の膜は、親水性が好ましい。膜は、水、水溶液、及び/又は有機溶媒、特に極性有機溶媒で湿潤される。膜表面の限界湿潤表面張力(critical wetting surface tension)は、あらゆる適切な値をとり得、典型的には、およそ0.4erg/sq.mmまたはより大きい、例えば0.72erg/sq.mmからおよそ1erg/sq.mmであり、好ましくは0.72erg/sq.mmからおよそ0.90erg/sq.mmで、25℃である。
【0039】
複合膜の支持体は多孔性、またはさらに好ましくは無孔性である。支持体は適切な形状、例えば、平面の、ロッド、球形の、楕円形の、好ましくはシート状の、例えば、スライドやディスク状の形状をとり得る。シート状の支持体は、適切な厚さ、典型的には厚さが0.01mmよりも厚い、例えば、およそ0.01mmからおよそ2mmまで、そして好ましくはおよそ0.1mmからおよそ1mmの厚さを持つ。支持体は十分な物理的強度を持ち、例えば、曲げ強度、使用中に伴うストレスに加えて複合体またはマイクロアレイ装置を二次加工するに伴って生じるストレスに耐えること、例えば、ハイブリダイゼーション、免疫測定、ウェスタンブロッティング、及び/又は分析(自動分析を含む)がある。
【0040】
支持体はあらゆる適切な材料、好ましくは、低シグナル、特に、低蛍光発光材料を含む。支持体は有機または無機である。無機支持体は、ガラス、セラミック、ゲル、または金属を含み、有機支持体は、ポリマーまたは重合体ゲルを支持体とする。支持体は、選択的に片側または両側での反射コーティングを含む。反射コーティングの例としては、金属コーティングが挙げられる。すなわち、複合膜は、多孔性ポリマー層とその支持体の間に反射コーティングを含むことができる。反射コーティングは、支持体材料の自己蛍光性を減少させ、除去することができる。反射コーティングは、当業者に知られた方法、例えば、スパッタリングまたは真空蒸着によって提供することができる。
【0041】
有機支持体としては、例えば、ポリアミド、ポリスルホン、ポリオレフィン、ポリハロゲンオレフィン、ポリスチレン、ポリオール、ポリアミン、ポリイミン、ポリエステル、アクリルポリマー、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリヒドロキシルアルキルアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリビニル複素環、多複素環、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリラクチド、ポリペプチド、ポリシロキサン、ポリシラン、ポリアセチレン、ポリホスファゼン、多糖、ポリエーテル、エポキシ樹脂、ポリアセタール、ポリウレタン、ポリウレア、尿素ホルムアルデヒド樹脂、ポリフェノール、フェノールホルムアルデヒド樹脂、アルキド樹脂、メラニンホルムアルデヒド樹脂、デンドリマー、スピロポリマー、ポリアリーレンオキサイド(polyaryleneoxide)、ポリスルフィド、ポリケトン、ポリエーテルケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリアロマティック(polyaromatic)、ポリアルデヒド、アリル樹脂、セルロース、セルロースエステル、セルロース誘導体、およびそれらの組合せを挙げることができる。
【0042】
支持体の特定の例としては、ガラス、アクリルおよびポリカーボネートが挙げられる。特定の支持体材料は、TOPAS樹脂のようなポリオレフィン樹脂を備える。本発明の実施例において、複合体は本質的にはポリマー層と支持体の間の付着プロモーターは無い。もし望むならば、複合体はポリマー層と支持体の間の付着プロモーターを含むことができる。例えば、付着プロモーターは、ガラスとポリアミドのような特定ポリマー層の間の結合を向上するのが望ましい。付着プロモーターは、貢献するべきでなく、さもなければ蛍光性の検出、及び/または測定、あるいは複合膜の他のシグナルを妨げることになる。
【0043】
あらゆる適切な付着プロモーターは使用でき、例えば、カップリング剤、例えばシランカップリング剤が使用できる。代替えとして、チタン酸塩のような付着プロモーターは、使用できる。適切なシランカップリング剤の例としては、アミノシラン、ハロシラン、アルコキシシランおよびグリシジルシランが挙げられる。適切なチタン酸塩の例としては、チタンアルコキシド、チタンアミノアルコキシド、チタンアルコキシドアルカンジオネート、およびチタンアンモニウム乳酸塩、および好ましくはチタンアルコキシドおよびチタンアミノアルコキシドが挙げられる。
【0044】
代替えとして、または加えて、基質は扱われた表面、例えば、処理表面(surfacetreated)になり得る。それは適切な方法、例えば、プラズマ処理、コロナ放電、フレイミング(flaming)、酸化、スパッタリング、エッチング、及び類似方法によって基質上にポリマー層を設置する前である。
【0045】
本発明の実施例によると、複合体は荷電、例えば陽極または陰極に荷電することができる。陽極に荷電した複合体は、例えば四級アンモニウムのグループを含むことができる。すなわち、例えば、陽極に荷電したポリマーは、支持体上に配置することができ、荷電したポリマーのコーティングは、荷電していないポリマー層上に置くことができる。陰極に荷電した複合体は、例えばスルホン基のまたはカルボキシル基をもつグループを含むことができる。別の実施例に基づくと、ポリマー層は極性グループを含むことができる。
【0046】
本発明の複合膜は、特に多湿状態の下で、例えばハイブリダイゼーション中に直面するようなとき、熱循環抵抗を有しているという利点を持っている。複合体は、多湿状態下で、崩壊し、離層しない。すなわち、本発明のいくつかの実施例において、複合体は一度以上使うことができる。この性質は、多重プロービングに魅力的な膜を作る。例えば、ハイブリダイズし、同じ配列を二回、三回、もしくはそれ以上プロービングする。
【0047】
多重プロービングの間、複合膜は、膜に結合した生物材料に影響せずに以前に結合したプローブの除去を認める。
【0048】
本発明の実施例は、平面状の荷電したポリマー層が多孔性であり、およそ800nmより小さいRa値を持つところの、支持体上に配置された平面状の荷電したポリマー層を備える複合体、平面上の荷電したポリマー層が多孔性であり、およそ1000nmよりも小さいRq値を持つところの、支持体上に配置された平面状の荷電したポリマー層を備える複合体、平面状の荷電したポリマー層が多孔性であり、およそ10μmより小さいRz値を持つところの、支持体上に配置された平面状の荷電したポリマー層を備える複合体、平面状の荷電したポリマー層が多孔性であり、およそ15μmより小さいRt値を持つところの、支持体上に配置された平面状の荷電したポリマー層を備える複合体を含む。
【0049】
本発明の実施例はまた、平面状親水性ポリマー層が多孔性であり、およそ800nmより小さいRa値を持つところの、支持体上に配置された平面状の親水性荷電ポリマー層を備える複合体、平面状親水性ポリマー層が多孔性であり、およそ1000nmより小さいRq値を持つところの、支持体上に配置された平面状の親水性荷電ポリマー層を備える複合体、平面状親水性ポリマー層が多孔性であり、およそ10μmより小さいRz値を持つところの、支持体上に配置された平面状の親水性荷電ポリマー層を備える複合体、平面状親水性ポリマー層が多孔性であり、およそ15μmより小さいRt値を持つところの、支持体上に配置された平面状の親水性荷電ポリマー層を備える複合体、平面状親水性荷電ポリマー層が多孔性であり、およそ800nmより小さいRa値を持つところの、支持体上に配置された平面状の親水性荷電ポリマー層を備える複合体、平面状親水性荷電ポリマー層が多孔性であり、およそ1000nmより小さいRq値を持つところの、支持体上に配置された平面状の親水性荷電ポリマー層を備える複合体、平面状親水性荷電ポリマー層が多孔性であり、およそ10μmより小さいRz値を持つところの、支持体上に配置された平面状の親水性荷電ポリマー層を備える複合体、平面状親水性荷電ポリマー層が多孔性であり、およそ15μmより小さいRt値を持つところの、支持体上に配置された平面状の親水性荷電ポリマー層を備える複合体、平面状極性ポリマー層が多孔性であり、およそ800nmより小さいRa値を持つところの、支持体上に配置された平面状の極性ポリマー層を備える複合体、平面状極性ポリマー層が多孔性であり、およそ1000nmより小さいRq値を持つところの、支持体上に配置された平面状の極性ポリマー層を備える複合体、平面状極性ポリマー層が多孔性であり、およそ10μmより小さいRz値を持つところの、支持体上に配置された平面状の極性ポリマー層を備える複合体、平面状極性ポリマー層が多孔性であり、およそ15μmより小さいRt値を持つところの、支持体上に配置された平面状の極性ポリマー層を備える複合体を含む。
【0050】
本発明による他の実施例は、およそ800nmより小さいRa値を持つ、滑らかな平面状の親水性ポリマー表面を備える多孔性膜、およそ1000nmより小さいRq値を持つ、滑らかな平面状の親水性ポリマー表面を備える多孔性膜、およそ10μmより小さいRz値を持つ、滑らかな平面状の親水性ポリマー表面を備える多孔性膜、およそ15μmより小さいRt値を持つ、滑らかな平面状の親水性ポリマー表面を備える多孔性膜、およそ800nmより小さいRa値を持つ、滑らかな平面状の荷電ポリマー表面を備える多孔性膜、およそ1000nmより小さいRq値を持つ、滑らかな平面状の荷電ポリマー表面を備える多孔性膜、およそ10μmより小さいRz値を持つ、滑らかな平面状の荷電ポリマー表面を備える多孔性膜、およそ15μmより小さいRt値を持つ、滑らかな平面状の極性ポリマー表面を備える多孔性膜、およそ800nmより小さいRa値を持つ、滑らかな平面状の極性ポリマー表面を備える多孔性膜、およそ1000nmより小さいRq値を持つ、滑らかな平面状の極性ポリマー表面を備える多孔性膜、およそ10μmより小さいRz値を持つ、滑らかな平面状の極性ポリマー表面を備える多孔性膜、およそ15μmより小さいRt値を持つ、滑らかな平面状の極性ポリマー表面を備える多孔性膜を含む。
【0051】
本発明による実施例はまた、低自己蛍光性を有し、及び/又は熱循環能を有する複合体を含む。そのような実施例は、支持体上に配置された多孔性荷電ポリマー層を備える複合体を含み、支持体上に配置された多孔性ポリアミド層を備える複合体を備える。さらにそのような実施例は、支持体上に配置された多孔性親水性ポリマー層を備える複合体を含み、支持体上に配置された多孔性親水性荷電ポリマー層を備える複合体、及び支持体上に配置された多孔性極性ポリマー層を備える複合体を含む。
【0052】
本発明のさらなる実施例は、その支持体の蛍光性よりも低自己蛍光性を有する複合体を含む。そのような実施例は、支持体上に配置された多孔性荷電ポリマー層を備える複合体を含み、支持体上に配置された多孔性ポリアミド層を備える複合体、支持体上に配置された多孔性親水性ポリマー層を備える複合体、及び支持体上に配置された多孔性極性ポリマー層を備える複合体を含む。
【0053】
本発明による膜は、当業者に知られた方法、例えば、ポリマー溶液または融解物をキャスティングまたは押し出しして、支持体上に薄いシート状に形成し、これを例えば熱的に誘導した位相反転、ポリマー誘導位相反転、または非溶媒誘導位相反転などの位相反転に関係する方法によって作成することができる。膜の特定の実施例では、真空蒸着、例えば、化学的又は物理的真空蒸着、スパッタリング、及びアノディックアークデポジション(anodic arc deposition)、プラズマ重合、界面の重縮合(interfacial polycondensation)またはラングムイル−ブロドゲットテクニック(Langmuir−Blodgett techniques)によって生産される。
【0054】
ポリマー溶液は、ナイフコーティング、ブレードコーティング、ディップコーティング、ロッドコーティング、ロールコーティング、グラビアコーティング、スロットコーティング、スライドコーティング、スクリーンプリンティング、または好ましくはスピンコーティングによって支持体上でキャスティングされ得る。
【0055】
好ましい実施例として、本発明の膜は、支持体上にポリマー溶液をスピンコーティングし、次いで非溶媒で接触することによって位相反転を引き起こすことによって作成される。膜の多孔率は、スピンコーティングと非溶媒コーティングの間の適切な時間を与えることによってコントロールできる。より長時間にわたる間隔は、より引き締まった膜、例えばより小さい孔サイズのものを生産する傾向がある。本発明による実施例において、支持体は、スピンコーティングの後直ちに非溶媒と接触する。
【0056】
従って、本発明は、上記に記した複合膜を作成するための方法を提供する。その膜は、(a)支持体を提供する工程と、(b)溶媒、及びポリマー層のポリマーを備える組成を提供する工程と、(c)(b)の組成を持った支持体をスピンコーティングする工程と、(d)溶媒を取り除く工程と、及び(e)複合膜を再被膜する工程とを備えている。
【0057】
ポリマー層のポリマーは、あらゆる適切な溶媒中に溶解することができる。ポリアミドのための適切な溶媒の例としては、ギ酸およびジメチルアセタミドを含む。例えば米国特許4,340,479.参照。ポリスルホンのための適切な溶媒の例としては、ジメチルホルムアミドおよびジメチルアセタミドを含む。ポリビニリデンフッ化物のための適切な溶媒の例としては、トリエチルホスフィット(triethylphosphite)およびジメチルホルムアミドを含む。
【0058】
溶媒の追加例は文献に見い出せ、例えば、R.E.Kesting,Synthetic Polymer Membranes,pp.186−223(1985).ポリマー溶液はまた、適切な細孔フォーマ(formers)、例えば水、ポリビニルピロリドン、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、塩化亜鉛、およびグリセロールを含む。
【0059】
好ましい実施例として、ポリマー溶液は、従動載置台上にある支持体上に配置される。載置台の速度、またはスピニング速度は、10000rpmまたはそれ以上、典型的にはおよそ1000rpmからおよそ10000rpm、そして好ましくはおよそ2000rpmからおよそ8000rpmにできる。遠心力によりポリマー溶液が支持体全面で、薄いままとなり、後に均一フィルムとなる。加えて、コーティング過程中、いくつかの溶媒は、蒸発の結果として取り除かれる。これは、薄いコーティングレベルの形状に導くポリマー溶液の粘性を増加することができる。コーティング過程を、温度及び/又は湿度を制御した制御雰囲気下で行って、例えば、膜の多孔度を適合することができる。
【0060】
スピンコーティングされた支持体は、ポリマー層を凝固させるために非溶媒バス中に浸し得る。非溶媒の例は、水、アルコール、および水、ホルムアミド、ギ酸、アルコールのうち一つまたはそれ以上を含んでいる混合液を含む。生じた複合膜は典型的には、膜に会合したいくつかのまたは全ての非溶媒を取り除くために乾燥される。もし望むのなら、膜は支持体から離され得る。マイクロアレイ適用のために、膜は、複合形態で使用されるのが好ましい。この膜は、生物材料との結合ではっきりした点状外形を提供する。
【0061】
上記で明らかにしたように、ポリマー混合体はまた、本発明による膜をキャスティングするのに使用することができる。好ましくは,ポリマー混合体は少なくとも一つの極性,親水性,又は荷電ポリマーを備える。非混和性または部分的に混和性ブレンドは、膜フィルムが凝固する時に相分離する。多孔性構造は、一つのポリマー相を選択的に取り除くことによって、例えば、溶媒、適用温度またはエッチングで抽出することによって、作ることができる。このアプローチによって作成された膜は、蛍光試験を伴った光の波長よりも小さい極性を有する多孔性ネットワークを生じることができる。膜、特におよそ0.1μmからおよそ0.4μmの厚さをもつ膜は、光に対する反射を減少させる。膜の好ましい実施例は、入射光に対して透過性であり、自己蛍光は、最小または消失する。膜の実施例は低反射率(low light reflectivity)を有し、透過性である。
【0062】
応じて、本発明は、支持体上に配置された多孔性荷電、親水性、または極性ポリマー層を備える低い自己蛍光性を有する複合体を作成するための方法を提供する。その方法は、(a)支持体を提供する工程と、(b)溶媒、及び少なくとも一つのポリマーが荷電、親水性、または極性ポリマーである多数のポリマーを含む組成を提供する工程と、(c)(b)による組成で支持体をスピンコーティングする工程と、(d)溶媒を取り除く工程と、(e)荷電、親水性、または極性ポリマーを残すために、選択的に一つ又はそれ以上のポリマーを取り除く工程と、(f)複合体を再被膜する工程とを備える。
【0063】
本発明はさらに、サンプル中に存在する生物材料、特に核酸の量を特定し、測定するための方法を提供する。この方法は、(a)上記に記載したような複合膜を提供する工程と、(b)サンプルを複合膜と接触させて、生物材料結合複合体を得る工程と、(c)生物材料結合複合膜を、ハイブリダイジングまたは生物材料と結合することができる核酸プローブのような結合剤と接触させる工程と、(d)ハイブリダイゼーションまたは結合の成否を確定する工程とを備える。方法の実施例はまた、サンドイッチアッセイを含む。
【0064】
本発明のいくつかの実施例のアッセイを行うにあたり、アッセイすべき生物材料を含むサンプルは、アッセイされる生物材料が、膜に結合するのに適切な状態の下で、膜と接触する。結合は多数のメカニズムを含み、好ましくは非共有結合メカニズム、例えば、疎水性相互作用を通して行われる。生物材料が膜に結合した後に、膜は一つまたはそれ以上の結合剤、例えばプローブ分子と接触する。結合生物材料とプローブ分子の結合を作り出すためである。例えば、生物材料の分析されるものは核酸であり、膜はハイブリダイゼーション状態、例えばドデシル硫酸ナトリウムの10%溶液の下でプローブ分子と接触する。本発明は、滑らかさまたは低自己蛍光性複合体を備え、膜、及び複合体または膜の多孔性ポリマー層と結合した多数の生物材料を備えるマイクロアレイを提供する。ある実施例においては、生物材料は核酸またはタンパク質を含む。あらゆる適切なハイブリダイゼーション状態、例えば高度に厳密または適度に厳密な状態は使用することができる。例えば、低い厳密さのハイブリダイゼーション状態とは、50℃で6×SSC(0.9M塩化ナトリウム/0.09Mクエン酸ナトリウム)である。一方、厳密な状態の下でのハイブリダイゼーションは50℃またはそれより高温で0.1×SSC(15mM塩化ナトリウム/1.5mMクエン酸ナトリウム)である。過剰なプローブ分子は一般的には取り除かれ、マイクロアレイは蛍光のようなシグナルに対して分析される。
【0065】
あらゆる適切な結合剤、例えばプローブといったものは、使用可能であり、例えば、核酸プローブは核酸と標識、例えば蛍光標識で構成される。二つまたはそれ以上の結合剤が利用される実施例においては、少なくとも一つの結合剤が特別な結合剤であることが好ましい。適切な標識としては、フルオレセイン、ローダミン、BODIPY、Cy5のようなシアニン色素、および放射性同位元素、例えば、32S、32P、3Hのようなものを含む。多重プローブおよび多重標識は、本発明の実施例に基づいて利用することができる。
【0066】
本発明による膜は、様々な異なるマイクロアレイに二次加工するこができる。例えば、マイクロアレイは、ポリヌクレオチドやそのアナログ又は模倣体の結合やハイブリダイゼーションに使用することができる。アナログ又は模倣体には、ホスホジエステル結合が代用結合に置換された核酸(代用結合としては、例えばホホロチオネート(phophorothioate)、メチルイミノ、メチルホスホネート、ホスホルアミダート(phosphoramidate)、グアニジン、および類似の結合がある。)、リボースサブユニットが置換された核酸(例えばヘキソースホスホジエステルがある。)、ペプチド核酸、及び類似体が含まれる。
【0067】
本発明はさらに、上記に記載したアッセイの改良法を提供する。例えば、本発明の実施例は、プローブ分子がマイクロアレイに結合し、複合体、及び分析すべきそのサンプルは、ハイブリダイゼーションまたは免疫測定法状態下でプローブと接触して配置されるというアッセイを含む。アッセイは二重抗体アッセイまたはサンドイッチアッセイを含む。生物材料の分析されるもの、及び少なくとも一つの標識した結合剤を含んでいる複合体は、分析することができ、シグナルを検出できる。
【0068】
本発明の実施例は、様々な技術およびアッセイ、例えばハイブリダイゼーションアッセイ及び免疫測定法で行うことができ、もちろんこれに限定するものではないが、アレイ(例えば、マイクロアレイ、例を挙げれば“Microarrays:Biotechnology‘s Discovery Platform for Functional Genomics,”M.Schena,et al.,Trends in Biotechnology,16,301−306(1998))に記載されたもの、但しこれに限定しない)、mRNA存在量分析(mRNA abundance analyses)、サザン、ノーザン、ウェスタン、サザン−ウェスタン、ドット、スロット、およびコロニーブロットを含む。本発明の実施例は、高い処理能力に加えて、自動化及び半自動化した手順に適合する。
【0069】
本発明はさらに、サンプル中に存在している核酸のような生物材料の量を特定し、測定するキットであって、(a)支持体上に配置されたポリマー層を備える低自己蛍光性を有する複合体、及び(b)核酸プローブのような少なくとも一つの結合剤を含むキットを提供する。本発明はさらに、複合体を含むサンプル中に存在する核酸のような生物材料を特定し、測定する装置を提供する。すなわち、その装置は、サンプルが複合体に接触することができるように配置され、または複合体上で結合剤に接触することができるように配置される。複合体が、そのサンプルと少なくとも一つの結合剤との間に形成された後に、生物材料は特定及び/又は定量化される。
【0070】
【発明の実施の形態】
次の例でさらに、本発明を例証していくが、多少なりとも本発明の範囲を制限するものとみなすべきでないことは言うまでもない。
【0071】
実施例1
この例では、本発明による実施例に基づいて複合膜を作成するための方法を示す。
【0072】
ナイロン66溶液、86重量%ギ酸と14重量%水を含む溶媒中の14.5重量%の固体、はポリカーボネート支持体ディスク上にスピンコートされた。Specialty Coating Systems,Inc.in Indianapolis,IN.Model No.P6204−Aのスピンコーターが使用された。結果として生じるコーティングされた支持体は、60℃の水中の52%ギ酸溶液を含むバス中に浸した。膜は、100℃のオーブン中でおよそ15分間乾燥した。様々な厚さの膜がスピニング速度およびスピニング時間を変えることによって作成された。
【0073】
膜は、レーザー光線の照射によって自己蛍光性を測定され、青色及び赤色波長の放出速度は、STORM860 Imagerで測定された。Imagerの光電子増倍管チューブは800Vで操作され、スキャニングピクセルサイズは100μmであった。得られた結果を下に示す。
【0074】
【表1】
前述した例は、本発明による膜が低自己蛍光性を有することを示している。
【0075】
実施例2
この例は、本発明による実施例に基づいて作成された複合膜の滑らかな表面を例証する。
【0076】
ポリカーボネート支持体上にナイロン66層を備える複合膜が作成され、その表面をWYKO光学プロファイラ上でSWLIMによって分析した。
【0077】
得られた表面外形の三次元プロットを図1に示した。表面外形の三次元プロットと比較した膜、Pall社のBIODYNE PLUSによるものが得られ、そのプロットを図2に示した。Ra、Rq、Rt、およびRz値が測定され、二つの膜に関して下に示している。
【0078】
【表2】
前述した例は,本発明による複合膜が滑らかな表面外形を有していることを示している。
【0079】
実施例3
この例は,本発明の実施例に基づいて複合膜の熱循環を例証する。ポリカーボネート支持体上にスピンコートされたナイロン66層を備える複合膜は、10%ドデシル硫酸ナトリウム溶液中に浸されている間、オートクレーブされた。オートクレーブは2サイクル完了させ、それぞれのサイクルは1時間、オートクレーブ温度は118℃とした。
【0080】
この状態の加速試験は、およそ45℃でオーバーナイトする通常のハイブリダイゼーション手順を含んだ。
【0081】
2サイクル終了後、膜を視覚的に調査し、ポリマー層の層間剥離は観察されなかった。
【0082】
実施例4
この例は、支持体へのポリマー層の優れた付着を例証する。ナイロン66層は、ポリカーボネート支持体上にスピンコートされた。この結果生じる複合膜は、10%ドデシル硫酸ナトリウム溶液に45℃で6週間の間、浸された。ポリマー層の層間剥離は観察されなかった。
【0083】
別の試験では、複合膜に28回に及ぶオートクレーブ処理をした。その間、120℃の10%ドデシル硫酸ナトリウム溶液に浸され、各サイクルは30分間続いた。ポリマー層の層間剥離は観察されなかった。
【0084】
特許および刊行物を含む、本文中で引用されたすべての参照文献は、参照としてそのまま本文中に記載した。
【0085】
本発明は、いくつかの実施例を強調して記載したものであるが、様々な実施例が使用され、本発明が、この中に記載された特定のもの以外に別の方法で実施されることを意図するということは、当業者にとって明らかである。それゆえに、本発明は、特許請求の範囲で定められた発明の本質および範囲内に包含される全ての変形例を含む。
【図面の簡単な説明】
【図1】
本発明の実施例に基づいた複合膜の自己発光性を示す。この膜は、ポリカーボネート支持体上の多孔性ナイロン66層を含む。X軸は、ナイロン66層の厚さを表し、Y軸は、青色発光と赤色発光の測定された蛍光の強さを任意の単位で表したものである。
【図2】
本発明の実施例に基づいた複合膜の3次元表面形状を示す。多孔性ポリマー層は、ナイロン66で構成され、支持体はポリカーボネートで構成された。表面形状は、走査白色光干渉顕微鏡法(SWLIM)によって決定した。サンプルリング深さは、表面から1.68μmで、倍率は5倍とした。
【図3】
ナイロン66膜、Pall社から入手可能なBIODYNE PLUS(商標)の3次元表面形状を示す。表面形状は、SWLIMで決定された。サンプルリング深さは、表面から1.68μmで、倍率は5倍とした。
【図4】
図4aは、本発明の実施例に基づいた複合膜のナイロン66層(表面はポリカーボネート支持体と接触している)の滑走面の走査顕微鏡写真(SEM)を示す。図4bと図4cは、それぞれ上面及びナイロン66層の断面図のSEMを示す。図4aと図4cは、ナイロン66層が非対称構造をしていることを示している。
この出願は、2000年2月18日にされた米国仮特許出願Nos.60/183,327及び2000年7月26日にされた米国仮特許出願Nos.60/220,825の優先権を主張するものである。これらの仮出願は参照として取り込む。
【0002】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般的に滑らかな表面を持った物質、例えば、膜、特に核酸のような生物材料の結合に適した、例えばマイクロアレイ用途への使用に適した低自己蛍光性の滑らかな表面をした多孔性複合膜に関するものである。
【0003】
【従来の技術】
マイクロアレイは、生物材料のスクリーニング、DNAシークエンス、及び遺伝子発現分析を含む様々な用途に使用できる。マイクロアレイは、一般的には、例えば表面が修飾されたグラススライド、又は多数の生物材料が付着している支持体ナイロン膜といった基材から成る。典型的なマイクロアレイの用途では、基材が生物材料を含むサンプル、例えば核酸と、分析されるために接触する。基材は、ラベリングした核酸のようなプローブ分子と接触する。ラベリングした核酸は、サンプル中の相補的核酸とハイブリダイズする。ハイブリダイズしなかったプローブ分子は、例えば洗浄によって取り除かれ、マイクロアレイはその後適切なシグナル検出装置、例えば蛍光発光によって読みとられる。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
従来知られたいくつかの基材は、一つないし複数の欠点を持っている。例えば、高い自己蛍光を有すること、高価な大量の生物サンプルの使用が必要であることである。これでは、わずかな量でも有用である微量サンプルを検出することが困難である。いくつかの基材は、均一性を欠いており、変動し易く、信頼性を欠いた結果を得ることにつながる。
【0005】
加えて、いくつかの基材の標本は、必要以上の労力、及び/又は外部材料の使用、例えば、固体支持体に基材をつける粘着物を必要とすることがある。そのような外部材料は、マイクロアレイのバックグラウンドシグナル、例えば、蛍光の増加を必要としないことがあり、分析の精度を低下する。多くの従来基材及び/又は粘着物はまた、一度の使用にしか適用されない。このような基材は、複数のプローブに関係したプロトコルに必要な耐熱性、耐水性を欠いてしまう。
【0006】
前記のものは、低自己蛍光性を有する基材を必要とする。さらに、かなり薄い基材を必要とし、そうすれば、正確な結果を提供するために大量の生物サンプルを必要としなくなり、及び/又は耐熱性を持つようになる。またさらに、外部材料のない、または実質的にない基材を必要とする。
【0007】
こういった事実に基づいた本発明の優位性は、ここに示した詳細な説明からはっきりと理解できるであろう。
【0008】
前記した問題は、一つもしくは複数の優位性、例えば低自己蛍光性、熱循環能(thermal−cyclability)、及び三次元的結合可能性を有する滑らかな表面構造をした基材、例えば多孔性膜を提供できる本発明によって解決される必要がある。膜はフリースタンドでもよいが、支持体との組み合わせが好ましい。それに応じて、本発明の実施例では、多孔性ポリマー層を含む複合膜を提供する。好ましい実施例において、膜は生物材料との三次元での結合可能性を有している。好ましいこの膜は、一度ないし何度も使用できる。
【0009】
本発明はさらに、核酸のような生物材料の分析のために複合体を含んでいるマイクロアレイ装置のような装置を提供する。本発明はさらに、サンプル中にある核酸量の検出方法及び/又は定量化方法を提供する。本発明はさらに、サンプル中にある生物材料を測定するキットを提供する。本発明はまた、膜、複合体、または装置を作成する方法を提供する。
【0010】
本発明は、確かな好ましい実施例および手順と共に、以下に説明、開示されているけれども、それは、これらの特定実施例に発明を制限することを意図するものではない。むしろ、発明の特質および範囲内に属する、全ての代替え実施例および変形例を含むことを意味している。
【0011】
【課題を解決するための手段】
本発明は、滑らかな表面構造をもつ多孔性膜を提供する。実施例に基づくと、本発明は、支持体上に配置された薄い多孔性ポリマー層を含む複合膜を提供する。本発明による膜は、マイクロアレイ用途を含む幅広い多様な用途への使用に魅力的である。
【0012】
この膜は、多様なマイクロアレイの準備の使用を見い出せ、例えば、少なくともおよそ100/cm2、好ましくは少なくともおよそ1000/cm2、さらに好ましくはおよそ1000/cm2からおよそ10000/cm2までの密度を有する生物材料結合領域をもっているマイクロアレイがある。マイクロアレイ中の領域は寸法、例えば、およそ10μmからおよそ250μmまでの範囲の直径をもつことができ、望むならばアレイ中の他の領域からおおよそ同じ距離で離される。
【0013】
多孔性ポリマー層は、生物材料と親和性をもつポリマーを含むことが好ましい。生物材料には、自然材料または人工材料がありうる。生物材料の例としては、核酸、例えば、DNA、cDNA、RNAおよびmRNAに加えて、少なくとも一つのオリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、抗原、タンパク質、ペプチド、脂質、リポタンパク質、多糖類、及びそれらの誘導体を含む。
【0014】
この膜の表面は滑らかである。滑らかさは、ピークや谷間を含んでいる表面形状と関係づけられる。例えば、滑らかな膜は、ピークや谷間が少なく、高さ又は谷間のピーク及び/又は深さがほとんど変化しない。滑らかさは、当業者によるあらゆる多くの方法で定量的に評価することができる。例として、滑らかさは、平均表面粗さ(Ra)、二乗平均平方根粗さ(Rq)、外形の最大高さ(Rt)、または外形の平均最大高さ(Rz)によって表すことができる。Raは、膜全体に渡って計算された平均高さである。Raの測定においては、単一の見せかけのピークによる効果は、平均化されて除かれる。Rqは、評価域内で得た測定高さ偏差の二乗平均平方根平均値であり、平均線上表面から測定される。
【0015】
表面が、平均表面レベルからほとんど偏差のない外形をもっているのならば、RaとRqの値は近くなる。かなりの数の隆起やくぼみがあれば、外形高さ関数の最大値は、表面特徴を支配し、RqはRaより大きい。Rzは最大ピークと谷間の間隔の平均値である。滑らかさは、当業者に知られた方法、例えばプロフィロメトリー(profilometry)によって測定される。そのような機器は、制限しないけれども、Veeco Instruments Inc.,Plainview,NYから利用可能なthe WYKO(商標) Profilersは、滑らかさを測定するために使用可能である。
【0016】
一つの実施例に従って、本発明は、およそ800nmより小さいRa値をもつ膜を提供する。別の実施例においては、本発明は、およそ1000nm、好ましくはおよそ500nm、さらに好ましくはおよそ300nmより小さいRq値をもつ膜を提供する。さらに別の実施例では、本発明は、およそ10μm、好ましくはおよそ8μm、さらに好ましくはおよそ5μmより小さいRz値をもつ膜を提供する。さらに別の実施例では、本発明は、およそ15μm、好ましくはおよそ10μm、さらに好ましくはおよそ7μmより小さいRt値をもつ膜を提供する。本発明の別の実施例に従って、膜は、上記した少なくとも二つの表面形状のあらゆる組合せをもつ。
【0017】
本発明による複合膜は、低いまたは最小のポリマー層のシグナル特性、例えば、自己蛍光性、ガンマ線、エックス線、UV、VISまたはIRのスペクトル吸収率や透過率を提供する。例えば複合膜は、特に可視スペクトル範囲で低自己蛍光性を提供する。
【0018】
膜の自己蛍光性はあらゆる適切な方法、例えば蛍光検出、共焦点顕微鏡、CCDカメラの使用によって決定できる。例えば、蛍光検出において、決定されるべきサンプルの自己蛍光性は、光線によって光を当てる。光は赤色励起蛍光スキャンによる赤(例えば、波長635nm)、青色蛍光スキャンによる青(例えば、波長450nm)である。青色または赤色光が、適切なフルオロフォア、例えば、蛍光色素を含むサンプルのエリアにヒットするとき、フルオロフォアは、ある特定のスペクトルで光を放出する。放出された光は集められ、例えば光電子増倍管(PMT)を使用してシグナルに変換される。シグナルの強さは、サンプル中に存在する蛍光量に比例する。膜の自己蛍光性を測定するのに使われる商業的システムの例として、STORM(商標)光学走査器、例えばMolecular Dynamics,Sunnyvale,CAによるSTORM860がある。
【0019】
本発明の複合膜は、一つの実施例において、波長域400nmから700nmで、およそ5000units、好ましくは3000units、さらに好ましくは2000units、またさらに好ましくは1000unitsより小さい自己蛍光性をもつ。別の実施例では、本発明は、波長域420nmから490nmで、特に青色波長域およそ470nmで、およそ5000units、好ましくは3000units、さらに好ましくは2000units、またさらに好ましくは1000unitsより小さい自己蛍光性をもつ複合膜を提供する。さらに別の実施例では、本発明は、波長域640nmから700nmで、特に赤色波長域およそ650nmで、およそ2000units、好ましくは1000units、さらに好ましくは500unitsより小さい自己蛍光性をもつ複合膜を提供する。ここに記載された自己蛍光単位は、800Vに設定されたPMTと100μmのスキャニングピクセルサイズで、STORM860 Imagerで測定されたものである。ただし、他の方法およびシステムでも上記に記載したような自己蛍光性を計測するのに使用することができる。
【0020】
別の実施例によると、本発明は、支持体上に配置された多孔性ポリマー層を備える複合膜を提供する。複合体は、支持体よりも少ない自己蛍光性をもつ。例えば、複合体の自己蛍光性は、支持体の自己蛍光性よりおよそ1/10より少なく、好ましくは1/5より少ない。さらに別の実施例によると、本発明は、支持体上に配置された多孔性ポリマー層を備える複合体を提供する。複合体は熱循環能(thermal cyclable)を有している。
【0021】
多孔性ポリマー層はかなり薄い。多孔性ポリマー層は、およそ150μmより薄い厚さ、例えば、典型的にはおよそ0.1μmからおよそ100μm、好ましくはおよそ10μmからおよそ100μm、さらに好ましくはおよそ10μmからおよそ60μmの厚さをもっている。実施例において、好ましい厚さはおよそ1μmからおよそ60μmである。膜は微孔質のものが好ましい。ポリマー層は、少なくともおよそ容量で50%の空隙率をもっている。実施例においては、膜は相互接続した細孔を含む。ある実施例におけるポリマー層、特に結晶化ポリマーを含むものでは、一次元、二次元ないしは三次元での分子配向をもつ。
【0022】
本発明による実施例では、多孔性ポリマー層が分子特性、例えば高分子ネットワーク、十分な物理的強度または他の(複数の)特性を有し、層を形作るこの(これらの)特性は、支持体の無い状態でさえもその統合性や形を維持する。この点で、多孔性ポリマー層は、セルフサポートまたはフリースタンドな層になることができる。
【0023】
実施例において、ポリマー層は結晶度が低く、典型的にはおよそ40%より低く、例えば、およそ10%からおよそ40%、好ましくはおよそ10%からおよそ30%、さらに好ましくはおよそ20%からおよそ30%である。例えばナイロン66は、24.8%の結晶度のポリマー層を製造するためにスピンコート(5000rpm,30秒)できる。(スピンコーティングについては以下に示す)結晶度は、あらゆる適切な方法、例えば高角度エックス線回折法によって決定できる。コーティング中のより高いスピン率は、減少した結晶度をもつポリマー層を製造することができる。
【0024】
ポリマー層は、多孔質であるのが好ましい。多孔質ポリマー層は、典型的にはおよそ0.01μmよりも大きい、例えばおよそ0.01μmからおよそ10μm、好ましくはおよそ0.1μmからおよそ1μm、さらに好ましくはおよそ0.2μmからおよそ0.5μmの平均細孔サイズをもつ。実施例においては、多孔質ポリマー層は平均細孔サイズがおよそ0.5μmまたはそれ以上、例えば、およそ0.5μmからおよそ1μmである。
【0025】
細孔サイズはあらゆる適切な方法、例えば泡立ち点ポロメーター方法(bubble point porometer method)によって決定することができる。すなわち、ある実施例による複合膜は、最小細孔サイズが0.25μm、平均流量サイズが0.44μm、泡立ち点細孔サイズが0.74μmであるナイロン66を備えている。高い多孔性質の膜は、その層の厚さ方向において生物材料が実質的に全ての利用可能なポリマーと接近し、結合することを可能にする。ポリマー層は、好ましくは三次元における生物材料に対する親和力を持っている。三次元親和力は、高い結合容量、例えば、主に表面上に結合しているそれらのような二次元親和力をもっている基質より高い結合容量を提供する。三次元親和力はまた、膜が少領域で膜上、例えばマイクロアレイ用途中に点状の液体を制限するという利点を提供する。液体は、実質的には異なるラテラル速度(lateral velocities)で異なる方向には移動しない。結果として、高い一様な点状外形を達成することが可能である。
【0026】
ある実施例において、多孔性ポリマー層の多孔性構造は、実質的に、好ましくは完全にランダムである。細孔分布が三次元である。実施例において、多孔性ポリマー層は、本質的に周期性がない。例えば、規則性がなく組織的でない交互性の構造である。多孔性領域および非多孔性領域は区別され、ランダムにサイズ化される。
【0027】
多孔性ポリマー層は、実施例においては、非対称構造をもつ。例えば、孔の数や大きさは、底面(すなわち、支持体に接触した表面)と比較して上面でより小さい。図4aと図4cにナイロン66膜の非対称構造を示す。ナイロン66膜は部分的に閉鎖細孔構造をもつ。
【0028】
ポリマー層は典型的には高い表面域をもち、例えば、スピンコートされたポリマー層の表面領域は、およそ30%、好ましくはおよそ30%からおよそ70%、さらに好ましくはおよそ50%であり、ドクターブレード(doctor blade)の使用を含むキャスティング技術によって製造されたポリマー層の表面領域よりも大きい。表面領域は、あらゆる適した方法、例えば、BET方法によって決定できる。例えば、ナイロン66は、19.1m2/gのBET表面領域をもつ層を製造するためにスピンコートされ得る。膜の高さ表面領域は、低いバックグラウンドシグナルを生産し、生物材料の検出において高い感度を達成することが可能であるという利点を提供する。実施例においては、スピンコートしたナイロン66膜は、高い感度を有し、特に標識が、例えば赤または遠赤外の蛍光標識が使用されるとき、ナイフキャスティングによって生産されたナイロン66膜の使用で可能になるよりも、低いレベルの生物材料、例えば1/10またはそれより小さいレベルを検出することが可能である。
【0029】
ポリマー層はあらゆる適切なポリマーを含むことができる。例えば、生物材料に親和性を示すポリマーがある。ポリマー層は親水性ポリマー、極性ポリマー、または荷電ポリマーを含むことができる。親水性ポリマーは水または溶液を基礎にした水または、およそ0.37(±0.005)erg/sq.mmより大きい、例えばおよそ0.37erg/sq.mmからおよそ1erg/sq.mmまたはそれ以上、そしていくつかの実施例では、およそ0.38erg/sq.mmから0.73erg/sq.mmまでの限界湿潤表面張力(critical wetting surface tension)に対する親和性を持っているポリマーを含む。極性ポリマーは、およそ10.0(±0.2)[cal/cm3]1/2より大きい、例えばおよそ10[cal/cm3]1/2からおよそ20[cal/cm3]1/2またはそれ以上、そして好ましくは10[cal/cm3]1/2からおよそ16[cal/cm3]1/2までの溶解パラメーターを持っているポリマーを含む。荷電ポリマーは、ポジティブ、ネガティブまたは両性ポリマーを含んでいるポリマーを含む。
【0030】
適切なポリマーの例としては、ポリアミド、ポリスルホン、ポリオレフィン、ポリハロゲンオレフィン、ポリスチレン、ポリオール、ポリアミン、ポリイミン、ポリエステル、アクリル重合体、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリビニル複素環、多複素環、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリアミド−イミド、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリグリコリド/ラクチド、ポリペプチド、ポリシロキサン、ポリシラン、ポリアセチレン、ポリホスファゼン、多糖、ポリエーテル、エポキシ樹脂、ポリアセタール、ポリウレタン、ポリウレア、尿素ホルムアルデヒド樹脂、ポリフェノール、フェノールホルムアルデヒド樹脂、アルキド樹脂、メラミンホルムアルデヒド樹脂、デンドリマー、スピロポリマー、ポリアリーレンオキシド(polyaryleneoxide)、ポリスルフィド、ポリケトン、ポリエーテルケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリアロマティック(polyaromatic)、ポリアルデヒド、アリル樹脂、セルロース、セルロースエステル、セルロース誘導体、及びこれらの組合せが挙げられ、中性ポリマーを含む上記したあらゆるポリマーは、荷電、極性、または親水性グループを含むために修飾される。ポリハロゲンオレフィンの例は、ポリビニリデンフッ化物である。
【0031】
例えば、二つまたはそれ以上の上記ポリマーの混合体は使用可能であり、一つまたはそれ以上のこれらのポリマーの単量体セグメントを備える共重合体も、使用可能である。セルロース誘導体の例としては、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロースが挙げられる。セルロースエステルの例としては、セルロース硝酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩が挙げられる。
【0032】
荷電ポリマーの例としては、ポリアミド、ポリアミン、ポリイミン、ポリアクリルアミド、ポリビニル複素環、多複素環、ポリイミド、ポリアミド−イミド、ポリペプチド、ポリウレタン、ポリウレア、尿素ホルムアルデヒド樹脂、メラミンホルムアルデヒド樹脂、デンドリマー、およびセルロース誘導体が挙げられる。
【0033】
親水性ポリマーの例としては、ポリアミド、ポリオール、ポリアミン、ポリイミン、ポリエステル、アクリル重合体、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリアクリル酸アミド、ポリアクリル酸ニトリル、ポリビニル複素環、多複素環、ポリイミド、ポリアミド−イミド、ポリラクチド、ポリペプチド、多糖、ポリエーテル、エポキシ樹脂、ポリアセタール、ポリウレタン、ポリウレア、尿素ホルムアルデヒド樹脂、ポリフェノール、フェノールホルムアルデヒド樹脂、アルキド樹脂、メラミン−ホルムアルデヒド樹脂、デンドリマー、スピロポリマー、ポリスルフィド、ポリケトン、ポリアルデヒド、セルロース、セルロースエステル、またはセルロース誘導体が挙げられ、ポリスルホン、ポリオレフィン、ポリハロゲンオレフィン、ポリスチレンポリカーボネート、ポリシロキサン、ポリシラン、ポリアセチレン、ポリホスファゼン、ポリアロマティック(polyaromatic)、ポリアリーレンオキシド(polyaryleneoxide)、アリル樹脂、ポリエーテルエーテルケトン、およびポリエーテルケトン、それ自体が親水性であるもの、あるいは親水性になるように修飾されたものを含み、さらに、上記したものを組み合せたものを含む。
【0034】
極性ポリマーの特定の例としては、ポリアミド、ポリスルホン、ポリオール、ポリアミン、ポリイミン、ポリエステル、アクリル重合体、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリアクリル酸アミド、ポリアクリル酸ニトリル、ポリビニル複素環、多複素環、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリアミド−イミド、ポリラクチド、ポリペプチド、多糖、ポリエーテル、エポキシ樹脂、ポリアセタール、ポリウレタン、ポリウレア、尿素ホルムアルデヒド樹脂、ポリフェノール、フェノールホルムアルデヒド樹脂、アルキド樹脂、メラミンホルムアルデヒド樹脂、デンドリマー、スピロポリマー、ポリアリーレンオキシド(polyaryleneoxide)、ポリスルフィド、ポリケトン、ポリエーテルケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリアロマティック(polyaromatic)、ポリアルデヒド、セルロース、セルロースエステル、またはセルロース誘導体が挙げられ、ポリオレフィン、ポリハロゲンオレフィン、ポリシロキサン、ポリアセチレン、ポリホスファゼン、ポリスチレン、ポリシラン、及びアリル樹脂、それ自体が極性であるもの、あるいはそれらに極性を与えるように修飾したものを含み、さらに、上記したものを組み合せたものを含む。無極性ポリマーに極性を与えるために、あらゆる適切な方法が使用できる。例えば、酸化、還元、スルホン化、ニトロ化、アミド化、カルボニル化、水酸化、カルボキシル化、リン酸化、界面活性剤による処置、及び/又は、極性単量体または重合体のグラフトがある。
【0035】
好ましくは、ポリマー層は、ポリアミド、コポリアミド、ポリスルホン、またはポリビニリデンフッ化物を含む。ポリアミドおよびコポリアミドの特定の例では、ナイロン、例えばナイロン4、ナイロン45、ナイロン6、ナイロン66、ナイロン11、ナイロン610、ナイロン612、およびナイロン6Tが挙げられる。ナイロン66はさらに好ましいポリアミドである。ポリスルホンの特定の例では、ビスフェノールAポリスルホン、ポリエーテルスルホン、およびポリアリールスルホンを含む。ポリエーテルスルホンはさらに好ましいポリスルホンである。
【0036】
上記に記載した一つまたはそれ以上のポリマーは、キャスティング、コーティングされ、多孔性ポリマー層として適用され得る。代替えとして、一つまたはそれ以上のポリマーは、ポリマーを修飾することで結合され、さらにキャスティング、コーティングされ、多孔性層として適用され得る。修飾しているポリマーは、あらゆる数のメカニズム、例えば共有結合、イオン結合、配位結合、水素結合、またはファンデルワールス相互作用または結合によって、多孔性層に親水性、荷電性、または極性を付与するような多孔性ポリマーと結び付けられる。別の実施例において、多孔性層は、初めに形成され、そして表面は、修飾しているポリマー、ポリマーまたは重合化している修飾モノマー、モノマー混合物をコーティング及び/又は治療することで修飾した。
【0037】
修飾ポリマーまたはモノマーは様々な機能的グループ、例えば、ヒドロキシル、カルボキシル、アミン、ピリジル、スルホン基、メルカプト基、チオカルボニル、ホスフィン、ホスホリル、およびイミンを持つことができる。適切な修飾ポリマーの例としては、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、無水マレイン酸/メチルビニルエーテルの加水分解共重合体、ポリスチレンスルホン酸、またはそれらの塩、ポリビニルスルホン酸またはそれらの塩、例えば、米国特許4,707,266に記載されたようなものが挙げられ、ポリヒドロキシアクリレートのようなポリマーを含んでいるヒドロキシルについては、例えば米国特許4,959,150、 4,906,374、 4,964,989、 5,019,260および4,886,836、に記載されたようなものが挙げられ、カチオニックポリアミド/ポリアミノ−エピクロルヒドリン樹脂、及びポリアミンエピクロルヒドリン樹脂については、例えば米国特許4,702,840及び5,128,041に記載されたようなものが挙げられる。
【0038】
本発明の膜は、親水性が好ましい。膜は、水、水溶液、及び/又は有機溶媒、特に極性有機溶媒で湿潤される。膜表面の限界湿潤表面張力(critical wetting surface tension)は、あらゆる適切な値をとり得、典型的には、およそ0.4erg/sq.mmまたはより大きい、例えば0.72erg/sq.mmからおよそ1erg/sq.mmであり、好ましくは0.72erg/sq.mmからおよそ0.90erg/sq.mmで、25℃である。
【0039】
複合膜の支持体は多孔性、またはさらに好ましくは無孔性である。支持体は適切な形状、例えば、平面の、ロッド、球形の、楕円形の、好ましくはシート状の、例えば、スライドやディスク状の形状をとり得る。シート状の支持体は、適切な厚さ、典型的には厚さが0.01mmよりも厚い、例えば、およそ0.01mmからおよそ2mmまで、そして好ましくはおよそ0.1mmからおよそ1mmの厚さを持つ。支持体は十分な物理的強度を持ち、例えば、曲げ強度、使用中に伴うストレスに加えて複合体またはマイクロアレイ装置を二次加工するに伴って生じるストレスに耐えること、例えば、ハイブリダイゼーション、免疫測定、ウェスタンブロッティング、及び/又は分析(自動分析を含む)がある。
【0040】
支持体はあらゆる適切な材料、好ましくは、低シグナル、特に、低蛍光発光材料を含む。支持体は有機または無機である。無機支持体は、ガラス、セラミック、ゲル、または金属を含み、有機支持体は、ポリマーまたは重合体ゲルを支持体とする。支持体は、選択的に片側または両側での反射コーティングを含む。反射コーティングの例としては、金属コーティングが挙げられる。すなわち、複合膜は、多孔性ポリマー層とその支持体の間に反射コーティングを含むことができる。反射コーティングは、支持体材料の自己蛍光性を減少させ、除去することができる。反射コーティングは、当業者に知られた方法、例えば、スパッタリングまたは真空蒸着によって提供することができる。
【0041】
有機支持体としては、例えば、ポリアミド、ポリスルホン、ポリオレフィン、ポリハロゲンオレフィン、ポリスチレン、ポリオール、ポリアミン、ポリイミン、ポリエステル、アクリルポリマー、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリヒドロキシルアルキルアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリビニル複素環、多複素環、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリラクチド、ポリペプチド、ポリシロキサン、ポリシラン、ポリアセチレン、ポリホスファゼン、多糖、ポリエーテル、エポキシ樹脂、ポリアセタール、ポリウレタン、ポリウレア、尿素ホルムアルデヒド樹脂、ポリフェノール、フェノールホルムアルデヒド樹脂、アルキド樹脂、メラニンホルムアルデヒド樹脂、デンドリマー、スピロポリマー、ポリアリーレンオキサイド(polyaryleneoxide)、ポリスルフィド、ポリケトン、ポリエーテルケトン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリアロマティック(polyaromatic)、ポリアルデヒド、アリル樹脂、セルロース、セルロースエステル、セルロース誘導体、およびそれらの組合せを挙げることができる。
【0042】
支持体の特定の例としては、ガラス、アクリルおよびポリカーボネートが挙げられる。特定の支持体材料は、TOPAS樹脂のようなポリオレフィン樹脂を備える。本発明の実施例において、複合体は本質的にはポリマー層と支持体の間の付着プロモーターは無い。もし望むならば、複合体はポリマー層と支持体の間の付着プロモーターを含むことができる。例えば、付着プロモーターは、ガラスとポリアミドのような特定ポリマー層の間の結合を向上するのが望ましい。付着プロモーターは、貢献するべきでなく、さもなければ蛍光性の検出、及び/または測定、あるいは複合膜の他のシグナルを妨げることになる。
【0043】
あらゆる適切な付着プロモーターは使用でき、例えば、カップリング剤、例えばシランカップリング剤が使用できる。代替えとして、チタン酸塩のような付着プロモーターは、使用できる。適切なシランカップリング剤の例としては、アミノシラン、ハロシラン、アルコキシシランおよびグリシジルシランが挙げられる。適切なチタン酸塩の例としては、チタンアルコキシド、チタンアミノアルコキシド、チタンアルコキシドアルカンジオネート、およびチタンアンモニウム乳酸塩、および好ましくはチタンアルコキシドおよびチタンアミノアルコキシドが挙げられる。
【0044】
代替えとして、または加えて、基質は扱われた表面、例えば、処理表面(surfacetreated)になり得る。それは適切な方法、例えば、プラズマ処理、コロナ放電、フレイミング(flaming)、酸化、スパッタリング、エッチング、及び類似方法によって基質上にポリマー層を設置する前である。
【0045】
本発明の実施例によると、複合体は荷電、例えば陽極または陰極に荷電することができる。陽極に荷電した複合体は、例えば四級アンモニウムのグループを含むことができる。すなわち、例えば、陽極に荷電したポリマーは、支持体上に配置することができ、荷電したポリマーのコーティングは、荷電していないポリマー層上に置くことができる。陰極に荷電した複合体は、例えばスルホン基のまたはカルボキシル基をもつグループを含むことができる。別の実施例に基づくと、ポリマー層は極性グループを含むことができる。
【0046】
本発明の複合膜は、特に多湿状態の下で、例えばハイブリダイゼーション中に直面するようなとき、熱循環抵抗を有しているという利点を持っている。複合体は、多湿状態下で、崩壊し、離層しない。すなわち、本発明のいくつかの実施例において、複合体は一度以上使うことができる。この性質は、多重プロービングに魅力的な膜を作る。例えば、ハイブリダイズし、同じ配列を二回、三回、もしくはそれ以上プロービングする。
【0047】
多重プロービングの間、複合膜は、膜に結合した生物材料に影響せずに以前に結合したプローブの除去を認める。
【0048】
本発明の実施例は、平面状の荷電したポリマー層が多孔性であり、およそ800nmより小さいRa値を持つところの、支持体上に配置された平面状の荷電したポリマー層を備える複合体、平面上の荷電したポリマー層が多孔性であり、およそ1000nmよりも小さいRq値を持つところの、支持体上に配置された平面状の荷電したポリマー層を備える複合体、平面状の荷電したポリマー層が多孔性であり、およそ10μmより小さいRz値を持つところの、支持体上に配置された平面状の荷電したポリマー層を備える複合体、平面状の荷電したポリマー層が多孔性であり、およそ15μmより小さいRt値を持つところの、支持体上に配置された平面状の荷電したポリマー層を備える複合体を含む。
【0049】
本発明の実施例はまた、平面状親水性ポリマー層が多孔性であり、およそ800nmより小さいRa値を持つところの、支持体上に配置された平面状の親水性荷電ポリマー層を備える複合体、平面状親水性ポリマー層が多孔性であり、およそ1000nmより小さいRq値を持つところの、支持体上に配置された平面状の親水性荷電ポリマー層を備える複合体、平面状親水性ポリマー層が多孔性であり、およそ10μmより小さいRz値を持つところの、支持体上に配置された平面状の親水性荷電ポリマー層を備える複合体、平面状親水性ポリマー層が多孔性であり、およそ15μmより小さいRt値を持つところの、支持体上に配置された平面状の親水性荷電ポリマー層を備える複合体、平面状親水性荷電ポリマー層が多孔性であり、およそ800nmより小さいRa値を持つところの、支持体上に配置された平面状の親水性荷電ポリマー層を備える複合体、平面状親水性荷電ポリマー層が多孔性であり、およそ1000nmより小さいRq値を持つところの、支持体上に配置された平面状の親水性荷電ポリマー層を備える複合体、平面状親水性荷電ポリマー層が多孔性であり、およそ10μmより小さいRz値を持つところの、支持体上に配置された平面状の親水性荷電ポリマー層を備える複合体、平面状親水性荷電ポリマー層が多孔性であり、およそ15μmより小さいRt値を持つところの、支持体上に配置された平面状の親水性荷電ポリマー層を備える複合体、平面状極性ポリマー層が多孔性であり、およそ800nmより小さいRa値を持つところの、支持体上に配置された平面状の極性ポリマー層を備える複合体、平面状極性ポリマー層が多孔性であり、およそ1000nmより小さいRq値を持つところの、支持体上に配置された平面状の極性ポリマー層を備える複合体、平面状極性ポリマー層が多孔性であり、およそ10μmより小さいRz値を持つところの、支持体上に配置された平面状の極性ポリマー層を備える複合体、平面状極性ポリマー層が多孔性であり、およそ15μmより小さいRt値を持つところの、支持体上に配置された平面状の極性ポリマー層を備える複合体を含む。
【0050】
本発明による他の実施例は、およそ800nmより小さいRa値を持つ、滑らかな平面状の親水性ポリマー表面を備える多孔性膜、およそ1000nmより小さいRq値を持つ、滑らかな平面状の親水性ポリマー表面を備える多孔性膜、およそ10μmより小さいRz値を持つ、滑らかな平面状の親水性ポリマー表面を備える多孔性膜、およそ15μmより小さいRt値を持つ、滑らかな平面状の親水性ポリマー表面を備える多孔性膜、およそ800nmより小さいRa値を持つ、滑らかな平面状の荷電ポリマー表面を備える多孔性膜、およそ1000nmより小さいRq値を持つ、滑らかな平面状の荷電ポリマー表面を備える多孔性膜、およそ10μmより小さいRz値を持つ、滑らかな平面状の荷電ポリマー表面を備える多孔性膜、およそ15μmより小さいRt値を持つ、滑らかな平面状の極性ポリマー表面を備える多孔性膜、およそ800nmより小さいRa値を持つ、滑らかな平面状の極性ポリマー表面を備える多孔性膜、およそ1000nmより小さいRq値を持つ、滑らかな平面状の極性ポリマー表面を備える多孔性膜、およそ10μmより小さいRz値を持つ、滑らかな平面状の極性ポリマー表面を備える多孔性膜、およそ15μmより小さいRt値を持つ、滑らかな平面状の極性ポリマー表面を備える多孔性膜を含む。
【0051】
本発明による実施例はまた、低自己蛍光性を有し、及び/又は熱循環能を有する複合体を含む。そのような実施例は、支持体上に配置された多孔性荷電ポリマー層を備える複合体を含み、支持体上に配置された多孔性ポリアミド層を備える複合体を備える。さらにそのような実施例は、支持体上に配置された多孔性親水性ポリマー層を備える複合体を含み、支持体上に配置された多孔性親水性荷電ポリマー層を備える複合体、及び支持体上に配置された多孔性極性ポリマー層を備える複合体を含む。
【0052】
本発明のさらなる実施例は、その支持体の蛍光性よりも低自己蛍光性を有する複合体を含む。そのような実施例は、支持体上に配置された多孔性荷電ポリマー層を備える複合体を含み、支持体上に配置された多孔性ポリアミド層を備える複合体、支持体上に配置された多孔性親水性ポリマー層を備える複合体、及び支持体上に配置された多孔性極性ポリマー層を備える複合体を含む。
【0053】
本発明による膜は、当業者に知られた方法、例えば、ポリマー溶液または融解物をキャスティングまたは押し出しして、支持体上に薄いシート状に形成し、これを例えば熱的に誘導した位相反転、ポリマー誘導位相反転、または非溶媒誘導位相反転などの位相反転に関係する方法によって作成することができる。膜の特定の実施例では、真空蒸着、例えば、化学的又は物理的真空蒸着、スパッタリング、及びアノディックアークデポジション(anodic arc deposition)、プラズマ重合、界面の重縮合(interfacial polycondensation)またはラングムイル−ブロドゲットテクニック(Langmuir−Blodgett techniques)によって生産される。
【0054】
ポリマー溶液は、ナイフコーティング、ブレードコーティング、ディップコーティング、ロッドコーティング、ロールコーティング、グラビアコーティング、スロットコーティング、スライドコーティング、スクリーンプリンティング、または好ましくはスピンコーティングによって支持体上でキャスティングされ得る。
【0055】
好ましい実施例として、本発明の膜は、支持体上にポリマー溶液をスピンコーティングし、次いで非溶媒で接触することによって位相反転を引き起こすことによって作成される。膜の多孔率は、スピンコーティングと非溶媒コーティングの間の適切な時間を与えることによってコントロールできる。より長時間にわたる間隔は、より引き締まった膜、例えばより小さい孔サイズのものを生産する傾向がある。本発明による実施例において、支持体は、スピンコーティングの後直ちに非溶媒と接触する。
【0056】
従って、本発明は、上記に記した複合膜を作成するための方法を提供する。その膜は、(a)支持体を提供する工程と、(b)溶媒、及びポリマー層のポリマーを備える組成を提供する工程と、(c)(b)の組成を持った支持体をスピンコーティングする工程と、(d)溶媒を取り除く工程と、及び(e)複合膜を再被膜する工程とを備えている。
【0057】
ポリマー層のポリマーは、あらゆる適切な溶媒中に溶解することができる。ポリアミドのための適切な溶媒の例としては、ギ酸およびジメチルアセタミドを含む。例えば米国特許4,340,479.参照。ポリスルホンのための適切な溶媒の例としては、ジメチルホルムアミドおよびジメチルアセタミドを含む。ポリビニリデンフッ化物のための適切な溶媒の例としては、トリエチルホスフィット(triethylphosphite)およびジメチルホルムアミドを含む。
【0058】
溶媒の追加例は文献に見い出せ、例えば、R.E.Kesting,Synthetic Polymer Membranes,pp.186−223(1985).ポリマー溶液はまた、適切な細孔フォーマ(formers)、例えば水、ポリビニルピロリドン、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、塩化亜鉛、およびグリセロールを含む。
【0059】
好ましい実施例として、ポリマー溶液は、従動載置台上にある支持体上に配置される。載置台の速度、またはスピニング速度は、10000rpmまたはそれ以上、典型的にはおよそ1000rpmからおよそ10000rpm、そして好ましくはおよそ2000rpmからおよそ8000rpmにできる。遠心力によりポリマー溶液が支持体全面で、薄いままとなり、後に均一フィルムとなる。加えて、コーティング過程中、いくつかの溶媒は、蒸発の結果として取り除かれる。これは、薄いコーティングレベルの形状に導くポリマー溶液の粘性を増加することができる。コーティング過程を、温度及び/又は湿度を制御した制御雰囲気下で行って、例えば、膜の多孔度を適合することができる。
【0060】
スピンコーティングされた支持体は、ポリマー層を凝固させるために非溶媒バス中に浸し得る。非溶媒の例は、水、アルコール、および水、ホルムアミド、ギ酸、アルコールのうち一つまたはそれ以上を含んでいる混合液を含む。生じた複合膜は典型的には、膜に会合したいくつかのまたは全ての非溶媒を取り除くために乾燥される。もし望むのなら、膜は支持体から離され得る。マイクロアレイ適用のために、膜は、複合形態で使用されるのが好ましい。この膜は、生物材料との結合ではっきりした点状外形を提供する。
【0061】
上記で明らかにしたように、ポリマー混合体はまた、本発明による膜をキャスティングするのに使用することができる。好ましくは,ポリマー混合体は少なくとも一つの極性,親水性,又は荷電ポリマーを備える。非混和性または部分的に混和性ブレンドは、膜フィルムが凝固する時に相分離する。多孔性構造は、一つのポリマー相を選択的に取り除くことによって、例えば、溶媒、適用温度またはエッチングで抽出することによって、作ることができる。このアプローチによって作成された膜は、蛍光試験を伴った光の波長よりも小さい極性を有する多孔性ネットワークを生じることができる。膜、特におよそ0.1μmからおよそ0.4μmの厚さをもつ膜は、光に対する反射を減少させる。膜の好ましい実施例は、入射光に対して透過性であり、自己蛍光は、最小または消失する。膜の実施例は低反射率(low light reflectivity)を有し、透過性である。
【0062】
応じて、本発明は、支持体上に配置された多孔性荷電、親水性、または極性ポリマー層を備える低い自己蛍光性を有する複合体を作成するための方法を提供する。その方法は、(a)支持体を提供する工程と、(b)溶媒、及び少なくとも一つのポリマーが荷電、親水性、または極性ポリマーである多数のポリマーを含む組成を提供する工程と、(c)(b)による組成で支持体をスピンコーティングする工程と、(d)溶媒を取り除く工程と、(e)荷電、親水性、または極性ポリマーを残すために、選択的に一つ又はそれ以上のポリマーを取り除く工程と、(f)複合体を再被膜する工程とを備える。
【0063】
本発明はさらに、サンプル中に存在する生物材料、特に核酸の量を特定し、測定するための方法を提供する。この方法は、(a)上記に記載したような複合膜を提供する工程と、(b)サンプルを複合膜と接触させて、生物材料結合複合体を得る工程と、(c)生物材料結合複合膜を、ハイブリダイジングまたは生物材料と結合することができる核酸プローブのような結合剤と接触させる工程と、(d)ハイブリダイゼーションまたは結合の成否を確定する工程とを備える。方法の実施例はまた、サンドイッチアッセイを含む。
【0064】
本発明のいくつかの実施例のアッセイを行うにあたり、アッセイすべき生物材料を含むサンプルは、アッセイされる生物材料が、膜に結合するのに適切な状態の下で、膜と接触する。結合は多数のメカニズムを含み、好ましくは非共有結合メカニズム、例えば、疎水性相互作用を通して行われる。生物材料が膜に結合した後に、膜は一つまたはそれ以上の結合剤、例えばプローブ分子と接触する。結合生物材料とプローブ分子の結合を作り出すためである。例えば、生物材料の分析されるものは核酸であり、膜はハイブリダイゼーション状態、例えばドデシル硫酸ナトリウムの10%溶液の下でプローブ分子と接触する。本発明は、滑らかさまたは低自己蛍光性複合体を備え、膜、及び複合体または膜の多孔性ポリマー層と結合した多数の生物材料を備えるマイクロアレイを提供する。ある実施例においては、生物材料は核酸またはタンパク質を含む。あらゆる適切なハイブリダイゼーション状態、例えば高度に厳密または適度に厳密な状態は使用することができる。例えば、低い厳密さのハイブリダイゼーション状態とは、50℃で6×SSC(0.9M塩化ナトリウム/0.09Mクエン酸ナトリウム)である。一方、厳密な状態の下でのハイブリダイゼーションは50℃またはそれより高温で0.1×SSC(15mM塩化ナトリウム/1.5mMクエン酸ナトリウム)である。過剰なプローブ分子は一般的には取り除かれ、マイクロアレイは蛍光のようなシグナルに対して分析される。
【0065】
あらゆる適切な結合剤、例えばプローブといったものは、使用可能であり、例えば、核酸プローブは核酸と標識、例えば蛍光標識で構成される。二つまたはそれ以上の結合剤が利用される実施例においては、少なくとも一つの結合剤が特別な結合剤であることが好ましい。適切な標識としては、フルオレセイン、ローダミン、BODIPY、Cy5のようなシアニン色素、および放射性同位元素、例えば、32S、32P、3Hのようなものを含む。多重プローブおよび多重標識は、本発明の実施例に基づいて利用することができる。
【0066】
本発明による膜は、様々な異なるマイクロアレイに二次加工するこができる。例えば、マイクロアレイは、ポリヌクレオチドやそのアナログ又は模倣体の結合やハイブリダイゼーションに使用することができる。アナログ又は模倣体には、ホスホジエステル結合が代用結合に置換された核酸(代用結合としては、例えばホホロチオネート(phophorothioate)、メチルイミノ、メチルホスホネート、ホスホルアミダート(phosphoramidate)、グアニジン、および類似の結合がある。)、リボースサブユニットが置換された核酸(例えばヘキソースホスホジエステルがある。)、ペプチド核酸、及び類似体が含まれる。
【0067】
本発明はさらに、上記に記載したアッセイの改良法を提供する。例えば、本発明の実施例は、プローブ分子がマイクロアレイに結合し、複合体、及び分析すべきそのサンプルは、ハイブリダイゼーションまたは免疫測定法状態下でプローブと接触して配置されるというアッセイを含む。アッセイは二重抗体アッセイまたはサンドイッチアッセイを含む。生物材料の分析されるもの、及び少なくとも一つの標識した結合剤を含んでいる複合体は、分析することができ、シグナルを検出できる。
【0068】
本発明の実施例は、様々な技術およびアッセイ、例えばハイブリダイゼーションアッセイ及び免疫測定法で行うことができ、もちろんこれに限定するものではないが、アレイ(例えば、マイクロアレイ、例を挙げれば“Microarrays:Biotechnology‘s Discovery Platform for Functional Genomics,”M.Schena,et al.,Trends in Biotechnology,16,301−306(1998))に記載されたもの、但しこれに限定しない)、mRNA存在量分析(mRNA abundance analyses)、サザン、ノーザン、ウェスタン、サザン−ウェスタン、ドット、スロット、およびコロニーブロットを含む。本発明の実施例は、高い処理能力に加えて、自動化及び半自動化した手順に適合する。
【0069】
本発明はさらに、サンプル中に存在している核酸のような生物材料の量を特定し、測定するキットであって、(a)支持体上に配置されたポリマー層を備える低自己蛍光性を有する複合体、及び(b)核酸プローブのような少なくとも一つの結合剤を含むキットを提供する。本発明はさらに、複合体を含むサンプル中に存在する核酸のような生物材料を特定し、測定する装置を提供する。すなわち、その装置は、サンプルが複合体に接触することができるように配置され、または複合体上で結合剤に接触することができるように配置される。複合体が、そのサンプルと少なくとも一つの結合剤との間に形成された後に、生物材料は特定及び/又は定量化される。
【0070】
【発明の実施の形態】
次の例でさらに、本発明を例証していくが、多少なりとも本発明の範囲を制限するものとみなすべきでないことは言うまでもない。
【0071】
実施例1
この例では、本発明による実施例に基づいて複合膜を作成するための方法を示す。
【0072】
ナイロン66溶液、86重量%ギ酸と14重量%水を含む溶媒中の14.5重量%の固体、はポリカーボネート支持体ディスク上にスピンコートされた。Specialty Coating Systems,Inc.in Indianapolis,IN.Model No.P6204−Aのスピンコーターが使用された。結果として生じるコーティングされた支持体は、60℃の水中の52%ギ酸溶液を含むバス中に浸した。膜は、100℃のオーブン中でおよそ15分間乾燥した。様々な厚さの膜がスピニング速度およびスピニング時間を変えることによって作成された。
【0073】
膜は、レーザー光線の照射によって自己蛍光性を測定され、青色及び赤色波長の放出速度は、STORM860 Imagerで測定された。Imagerの光電子増倍管チューブは800Vで操作され、スキャニングピクセルサイズは100μmであった。得られた結果を下に示す。
【0074】
【表1】
前述した例は、本発明による膜が低自己蛍光性を有することを示している。
【0075】
実施例2
この例は、本発明による実施例に基づいて作成された複合膜の滑らかな表面を例証する。
【0076】
ポリカーボネート支持体上にナイロン66層を備える複合膜が作成され、その表面をWYKO光学プロファイラ上でSWLIMによって分析した。
【0077】
得られた表面外形の三次元プロットを図1に示した。表面外形の三次元プロットと比較した膜、Pall社のBIODYNE PLUSによるものが得られ、そのプロットを図2に示した。Ra、Rq、Rt、およびRz値が測定され、二つの膜に関して下に示している。
【0078】
【表2】
前述した例は,本発明による複合膜が滑らかな表面外形を有していることを示している。
【0079】
実施例3
この例は,本発明の実施例に基づいて複合膜の熱循環を例証する。ポリカーボネート支持体上にスピンコートされたナイロン66層を備える複合膜は、10%ドデシル硫酸ナトリウム溶液中に浸されている間、オートクレーブされた。オートクレーブは2サイクル完了させ、それぞれのサイクルは1時間、オートクレーブ温度は118℃とした。
【0080】
この状態の加速試験は、およそ45℃でオーバーナイトする通常のハイブリダイゼーション手順を含んだ。
【0081】
2サイクル終了後、膜を視覚的に調査し、ポリマー層の層間剥離は観察されなかった。
【0082】
実施例4
この例は、支持体へのポリマー層の優れた付着を例証する。ナイロン66層は、ポリカーボネート支持体上にスピンコートされた。この結果生じる複合膜は、10%ドデシル硫酸ナトリウム溶液に45℃で6週間の間、浸された。ポリマー層の層間剥離は観察されなかった。
【0083】
別の試験では、複合膜に28回に及ぶオートクレーブ処理をした。その間、120℃の10%ドデシル硫酸ナトリウム溶液に浸され、各サイクルは30分間続いた。ポリマー層の層間剥離は観察されなかった。
【0084】
特許および刊行物を含む、本文中で引用されたすべての参照文献は、参照としてそのまま本文中に記載した。
【0085】
本発明は、いくつかの実施例を強調して記載したものであるが、様々な実施例が使用され、本発明が、この中に記載された特定のもの以外に別の方法で実施されることを意図するということは、当業者にとって明らかである。それゆえに、本発明は、特許請求の範囲で定められた発明の本質および範囲内に包含される全ての変形例を含む。
【図面の簡単な説明】
【図1】
本発明の実施例に基づいた複合膜の自己発光性を示す。この膜は、ポリカーボネート支持体上の多孔性ナイロン66層を含む。X軸は、ナイロン66層の厚さを表し、Y軸は、青色発光と赤色発光の測定された蛍光の強さを任意の単位で表したものである。
【図2】
本発明の実施例に基づいた複合膜の3次元表面形状を示す。多孔性ポリマー層は、ナイロン66で構成され、支持体はポリカーボネートで構成された。表面形状は、走査白色光干渉顕微鏡法(SWLIM)によって決定した。サンプルリング深さは、表面から1.68μmで、倍率は5倍とした。
【図3】
ナイロン66膜、Pall社から入手可能なBIODYNE PLUS(商標)の3次元表面形状を示す。表面形状は、SWLIMで決定された。サンプルリング深さは、表面から1.68μmで、倍率は5倍とした。
【図4】
図4aは、本発明の実施例に基づいた複合膜のナイロン66層(表面はポリカーボネート支持体と接触している)の滑走面の走査顕微鏡写真(SEM)を示す。図4bと図4cは、それぞれ上面及びナイロン66層の断面図のSEMを示す。図4aと図4cは、ナイロン66層が非対称構造をしていることを示している。
Claims (44)
- 支持体上に配置されたポリマー層を備え、このポリマー層は、多孔性であり、(a)およそ800nmよりも小さい平均表面粗さ(Ra)、(b)およそ1000nmよりも小さい二乗平均平方根表面粗さ(Rq)、(c)およそ10μmより小さい表面外形の平均最大高さ(Rz)、及び(d)およそ15μmより小さい表面外形の最大高さ(Rt)の少なくとも一つを有する、複合体。
- 支持体上に配置されたポリマー層を備えた複合体であって、低自己蛍光性を有する複合体。
- 支持体上に配置されたポリマー層を備えた複合体であって、熱循環性を有する複合体。
- ポリマー層はポリアミドを含む、請求項1ないし3のいずれか記載の複合体。
- ポリマー層は多孔性親水性ポリマー層を備える、請求項1ないし3のいずれか記載の複合体。
- ポリマー層は多孔性荷電ポリマー層を備える、請求項1ないし3のいずれか記載の複合体。
- ポリマー層は極性ポリマー層を備える、請求項1ないし3のいずれか記載の複合体。
- 波長域400nmから700nmでおよそ5000ユニットより少ない自己蛍光性を有する請求項1ないし7のいずれか記載の複合体。
- 波長域420nmから490nmでおよそ5000ユニットより少ない自己蛍光性を有する請求項8の複合体。
- 波長域640nmから700nmでおよそ2000ユニットより少ない自己蛍光性を有する、請求項1ないし7のいずれか記載の複合体。
- 波長域400nmから700nmでおよそ2000ユニットより少ない自己蛍光性を有する、請求項10に記載の複合体。
- およそ1000ユニットより少ない自己蛍光性を有する、請求項11の複合体。
- 支持体の自己蛍光性よりも少ない自己蛍光性を有する,請求項1ないし12のいずれか記載の複合体。
- 支持体の自己蛍光性よりおよそ1/10より少ない自己蛍光性を有する、請求項13に記載の複合体。
- 支持体の自己蛍光性よりおよそ1/5より少ない自己蛍光性を有する、請求項13又は14に記載の複合体。
- ポリマー層またはポリアミド層がおよそ150μmより薄い厚さを有する、請求項1ないし15のいずれか記載の複合体。
- ポリマー層またはポリアミド層がおよそ10μmからおよそ100μmの厚さを有する、請求項16に記載の複合体。
- ポリマー層またはポリアミド層が生物材料に対する親和性を有する、請求項1ないし17のいずか記載の複合体。
- 生物材料が核酸を含む、請求項18に記載の複合体。
- ポリアミド層がナイロンを含む、請求項4に記載の複合体。
- ナイロンがナイロン66である、請求項20に記載の複合体。
- 多孔性ポリマー層がポリスルホンを含む、請求項1ないし3のいずれか、又は8ないし19のいずれか記載の複合体。
- 多孔性ポリマー層がポリビニリデンフッ化物を含む、請求項1ないし3のいずれか、又は8ないし19のいずれか記載の複合体。
- 支持体が無孔性である、請求項1ないし23のいずれか記載の複合体。
- 支持体がガラス,セラミック,金属,又は支持体ポリマーを備えている、請求項24に記載の複合体。
- 支持体ポリマーがポリカーボネート,アクリル樹脂,ポリスチレン、又はポリオレフィンを備えている、請求項25に記載の複合体。
- 実質的に付着プロモーターのない、請求項1ないし26のいずか記載の複合体。
- 支持体がガラスである、請求項24又は25に記載の複合体。
- 付着プロモーターを含む、請求項28に記載の複合体。
- 付着プロモーターがシランである、請求項29に記載の複合体。
- 荷電ポリマー層が陽極の荷電ポリマーを含む、請求項6に記載の複合体。
- 荷電ポリマー層が陽極に荷電したコーティング及び中性ポリマーを含む、請求項6に記載の複合体。
- 第4級アンモニウムグループを含む、請求項31または32の複合体。
- 滑らかな平面状親水性ポリマー表面を備え、滑らかな平面状荷電ポリマー表面を備え、又は滑らかな平面状極性ポリマー表面を備え、この多孔性膜が、(a)およそ800nmより少ない平均表面粗さ(Ra)、(b)およそ1000nmよりも少ない2乗平均平方根表面粗さ(Rq)、(c)およそ10μmより少ない表面外形の平均最大高さ(Rz)、及び(d)およそ15μmより少ない表面外形の最大高さ(Rt)の少なくとも一つを有する、多孔性膜。
- サンプル中に存在している生物材料の量を特定、または測定するための方法であって、(a)請求項1ないし34のいずか記載の複合体または多孔性膜を提供する工程と、(b)サンプルを複合体と接触させて生物材料結合複合体を得る工程と、(c)生物材料と結合可能な結合剤と生物材料結合複合体を接触させる工程と、(d)結合の成否を確定する工程とを備えた方法。
- 生物材料が核酸を含む、請求項35に記載の方法。
- 結合剤が核酸、及び標識を含む、請求項35又は36に記載の方法。
- サンプル中に存在している生物材料の量を特定し、測定するキットであって、(a)請求項1ないし34のいずれに記載の複合体又は多孔性膜、及び(b)生物プローブを含むキット。
- 請求項1ないし34のいずか記載の複合体または多孔性膜を備えるサンプル中に存在する生物材料の量を特定、または測定するための装置であって、複合体とサンプルを接触させるための配列、生物材料プローブと複合体を接触させるための配列、及び結合が生物材料とプローブの間で起こるかどうかを決定するための配列を有する装置。
- 支持体上に配置された多孔性ポリマー層を備えている低自己蛍光性の複合体を作成する方法であって、(a)支持体を提供する工程と、(b)溶媒及びポリマーを含む組成を提供する工程と、(c)(b)による組成を持った支持体をスピンコーティングする工程と、(d)溶剤を取り除く工程と、(e)複合体を再被膜する工程とを備えている方法。
- ポリマーが親水性ポリマーまたは荷電ポリマーである、請求項40に記載の方法。
- 多孔性ポリマー層がポリアミドを含む、請求項40または41に記載の方法。
- 支持体上に配置された多孔性ポリマー層を備える低自己蛍光性の複合体を作成する方法であって、(a)支持体を提供する工程と、(b)溶媒、及び少なくとも一つのポリマーが荷電、親水性、または極性ポリマーである多数のポリマーを備えた組成を提供する工程と、(c)(b)による組成で支持体をスピンコーティングする工程と、(d)溶媒を取り除く工程と、(e)荷電、親水性、又は極性ポリマーを残すために、選択的に一つ又はそれ以上のポリマーを取り除く工程と、(f)複合体を再被膜する工程とを備えている方法。
- 請求項40ないし43のいずれか記載の方法によって作成された複合体。
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