JP2004506880A - エピトープの免疫検出のための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
発明の背景
細胞生物学および医学における中心的な問題の1つは、タンパク質、脂質、糖および代謝物レベル、並びに、単一の生存細胞中でのこれらの修飾をモニターすることが不可能であることに関する。種々の技術が用いられて、これらの分子の検出の感受性が改善された。
【0002】
例えば、極めて少ない量でタンパク質を検出することができるイムノアッセイの感受性を増大させるために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術が、慣用の免疫検出方法と組み合わされた(米国特許第5,665,539号)。イムノ−PCRと名付けられたこの技術は、タンパク質を検出する極めて感受性のある方法を提供する。イムノ−PCRにおいて、DNAおよび抗体に対する二重特異結合親和性を有するリンカー分子を用いて、抗原−抗体複合体に特異的にマーカーDNA分子を付着させ、従って特異的な抗原−抗体−DNA接合体の形成がもたらされている。
【0003】
付着したマーカーDNAを、PCRにより、適切なプライマーを用いて増幅することができる。米国特許第5,665,539号に記載されているように、抗原を、マイクロタイタープレートの表面上に固定化し、その後イムノ−PCRにより検出する。この技術を用いて、アルカリホスファターゼ接合ELISAに対し、感受性において約105の増大が得られた。イムノ−PCRの感受性の利点は、その後、マウス抗リポタンパク質IgG(Ruzicka et al. Science 1993 260: 698−699);ヒトプロトオンコジーンタンパク質(Zhou et al. Nucleic Acid Res. 1993 21: 6038−6039);および腫瘍壊死因子アルファ(Sanna et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1995 92: 272−275)についてのアッセイにおいて確認された。
【0004】
しかし、本来のイムノ−PCRプロトコルは、ストレプトアビジン−プロテインAキメラを用いて、抗原−抗体複合体を検出した。種々の群のIgGに対するプロテインAの親和性の変化により、広い範囲の抗原の検出における直接的な適用が制限される。ある改善されたプロトコルは、この問題を、ビオチン化された二次抗体または遊離のストレプトアビジンを導入することにより、解決することを試みた。
【0005】
Joerger et al. (Clin. Chem. 1995 41(9): 1371−1377)は、二重らせんDNA標識が、抗体に直接付着することができ、従って接合体試薬を、アッセイ前に調製することが可能になることを例証した。
【0006】
Suzuki et al. (Jpn. J. Cancer Res. 1995 86: 885−889)は、2種のモノクローナル抗体を用い、ここで、抗原をはさみ、特異的なDNA分子をマーカーとして用いる、二重決定因子(double−deteminant)イムノポリメラーゼ連鎖反応(二重決定因子イムノ−PCR)と呼ばれる方法を記載している。この方法において、循環抗原に結合する第1のモノクローナル抗体を、抗原自体の代わりに、固定化する。ビオチン化された第2のモノクローナル抗体を、抗原に結合させ、遊離のストレプトアビジンを用いて、ビオチン化されたDNAを、第2のモノクローナル抗体に付着させる。抗原−抗体−ストレプトアビジンと複合した、ビオチン化されたDNAを、PCRにより増幅する。次に、生成物を、サザンブロット分析により分析する。
【0007】
これらのイムノ−PCR手法が、タンパク質検出の伝統的な方法にまさる利点、例えば感受性の増大を提供した一方、これらの使用に対していくつかの顕著な制限が尚存在する。イムノ−PCRの主要な制限の1つは、PCR反応の非直線的増幅能力にある。シグナルの量と存在するタンパク質の量との間には、直接的な相関はない。従って、この手法は、定量的検出方法としては制限される。
【0008】
米国特許第5,922,553号には、イムノ−aRNAと呼ばれる手法により、選択されたタンパク質のレベルを定量するための方法が開示されている。この方法において、選択されたタンパク質に標的された第1の抗体を、固体支持体に固定化する。次に、支持体を、選択されたタンパク質と接触させ、選択されたタンパク質が、第1の抗体に固定化されるようにする。次に、固体支持体を、選択されたタンパク質に標的された第2の抗体に共有結合した、RNAプロモーターにより駆動されたcDNA配列と接触させて、第2の抗体が、結合した選択されたタンパク質に結合するようにする。選択されたタンパク質の量を、結合した第2の抗体に共有結合した、プロモーターにより駆動されたcDNA配列のレベルを、増幅されたRNA手法により定量することにより、決定する。好ましい態様において、T7プロモーターにより駆動されたcDNA配列を、第2の抗体に共有結合させる。
【0009】
ここで、単鎖フラグメントおよび、環外ペプチドに基づいた相補性決定領域(CDR)サブユニットを、このイムノ−aRNA手法において用いることができることが見出された。さらに、PCRおよび増幅されたRNA手法を用いて、結合した単鎖フラグメントまたはCDRサブユニットに共有結合した、プロモーターにより駆動されたcDNA配列を定量することができる。すでに存在する大きい単鎖または環式ペプチドライブラリーと結合した、一層小さい抗体結合単位およびフラグメントを用いることおよびロボット工学的補助を用いることにより、この方法が、医学的および研究目的の両方のために広範囲に有用になる。さらに、単一の第3の検出体種を、二重らせんDNAと結合させ、単鎖FvまたはCDRのいずれかに結合させ、検出を均一かつ簡単にすることができる。これを、本明細書において、普遍的検出体と呼ぶ。
【0010】
発明の概説
本発明の目的は、試料中の選択されたエピトープを発現する分子を検出するための方法を提供することである。この方法において、選択されたエピトープに特異的なエピトープアンカーを、選択された表面に固定化する。エピトープアンカーは、単鎖Fvフラグメント、CDR、抗体または、選択されたエピトープと相互作用する他のリガンドペプチドもしくは化学物質もしくは医薬を含むことができる。次に、表面を、選択されたエピトープを発現する分子を含むことが疑われる試料と接触させて、分子が、固定化されたエピトープアンカーに結合するようにする。次に、オリゴヌクレオチドに付着した、選択されたエピトープに対する単鎖Fvまたは束縛されたエピトープ特異的CDRを含むエピトープ検出体を用いて、すべての結合した分子を検出する。1つの態様において、単鎖FvまたはCDRを修飾して、オリゴヌクレオチドの単一の部位への付着を可能にした。あるいはまた、本発明の方法を、エピトープアンカーと共に実施することができる。この態様において、エピトープ検出体を用いて、表面に直接結合する分子を規定する。
【0011】
本発明の他の目的は、選択されたエピトープを発現する分子を検出するためのシステムを提供することである。本発明のこれらのシステムは、選択されたエピトープに特異的なエピトープアンカー、エピトープを固定化するか、または固定化することができる、選択された表面および、オリゴヌクレオチドに付着した、選択されたエピトープに対する単鎖Fvまたは束縛されたエピトープ特異的CDRを含むエピトープ検出体を含む。1つの態様において、単鎖Fvまたは束縛されたエピトープ特異的CDRを修飾して、オリゴヌクレオチドの付着を可能にする。
【0012】
本発明の尚他の目的は、選択されたエピトープを発現する分子を検出するためのキットであって、選択されたエピトープに特異的なエピトープアンカーおよび、オリゴヌクレオチドに付着した、選択されたエピトープに対する単鎖Fvまたは束縛されたエピトープ特異的CDRを含むエピトープ検出体を含む、前記キットを提供することにある。1つの態様において、単鎖Fvまたは束縛されたエピトープ特異的CDRを修飾して、オリゴヌクレオチドの付着を可能にする。
【0013】
発明の詳説
本発明は、選択された分子のレベルを定量するための改善された方法並びに、これらの改善された方法を実施するためのシステムおよびキットに関する。1つの態様において、この方法は、分子の選択されたエピトープに特異的なエピトープアンカーを選択された表面に結合させることを含む。エピトープアンカーは、単鎖Fvフラグメント、CDR、抗体または、選択されたエピトープに特異的な他のリガンドペプチドもしくは化学物質を含むことができる。好ましい態様において、エピトープアンカーを、表面上の指定された箇所に結合させる。例えば、表面は、チップを含むことができ、エピトープアンカーは、チップの規定された箇所に結合する。1つの態様において、エピトープアンカーは、ピペッターまたは、単一の部位における適用を可能にする同様の装置の補助の下に、表面またはプレート上に堆積する。次に、結合したエピトープアンカーを有する表面を、選択されたエピトープを発現する分子を含むことが疑われる試料と接触させて、分子がエピトープアンカーに結合するようにする。他の態様において、分子を、エピトープアンカーを用いずに、表面に直接付着させる。
【0014】
本発明の方法によりアッセイすることができる試料の例には、個別の細胞および、生物学的流体、例えば血清を含む溶液が含まれるが、これには限定されない。次に、表面上のすべての結合した分子に結合することができるエピトープ検出体を用いて、結合した分子の量を検出し、定量する。エピトープ検出体は、オリゴヌクレオチドを単一の部位において付着させることを可能にするように修飾された、選択されたエピトープに対する単鎖Fvまたは束縛されたエピトープ特異的CDRを含む。
【0015】
選択されたエピトープのためのFvフラグメントを、細胞中に、または微生物上に、組み換えDNA技術を用いることにより、得ることができる。例えば、SkerraおよびPluckthun (Science 1988 240: 1038−1041)には、大腸菌中での機能的Fvフラグメントの生成のための発現システムが記載されている。
【0016】
抗体軽鎖または重鎖のみの可変ドメインをコードするDNA配列を有するオペロンを有する真核発現ベクターを有する真核ホスト細胞において、Fvフラグメントを得るための方法もまた、記載されている(J. Mol. Biol. 1988 203: 825−828)。Fvフラグメントの鎖は、ホスト細胞により分泌され、正確に組み立てられて、完全に機能的なFvフラグメントが、培養上清液中に生成するようにされている。さらに、DNAコード配列を、この5’末端の方向に変化させて、アミノ末端が、オリゴヌクレオチドの共有結合に適する表面を有する1または2以上の残基を発現するようにすることができる。さらに、3’末端を変化させて、システイン残基が、各々の可変ドメインのC末端の方向に生成して、二量体中の可変ドメインがジスルフィド結合により一緒に連結されることを可能にするようにすることができる。また、これにより、Fvフラグメントの組立が促進される。
【0017】
あるいはまた、Fvフラグメントを、第1の可変ドメインをコードする第1のDNA配列および第2の可変ドメインをコードする第2のDNA配列を有し、第1の配列および第2の配列が、接合ペプチド配列をコードする第3のDNA配列により結合されているベクターを用いることにより、安定化することができる。この場合において、接合ペプチド配列は、2つのポリペプチドを機能的な単鎖Fvに折り畳むのを可能にするのに十分長く、可撓性である。好ましくは、ホスト細胞は、形質転換前に、抗体または軽鎖の全体を分泌しない骨髄腫細胞系である。このような細胞系は、十分知られており、広範囲に入手可能である(Reichmann et al. J. Mol. Biol. 1988 203: 825−828)。
【0018】
また、すべてのハプテンまたは化学的化合物に対するランダムなファージ技術を用いて、Fvを選択することができると考えられる(Harrison et al. United States Biochemical Pharma Ltd. (Europe), Watford, 英国)。
【0019】
CDR技術は、十分知られており、米国特許第5,334,702号、米国特許第5,663,144号および米国特許第5,919,764号に記載されている。一般的に、CDRは、環状に束縛され、芳香族残基により修飾された6〜15量体ペプチドを含む。本発明において用いるための配座的に束縛されたペプチドの設計における重要な段階は、活性のために重要な残基の描写である。これは、一般的に、先ず、最初の抗体またはレセプターまたは種々の長さのリガンドの生物活性なドメインからの1つの群の類似体を合成し、完全なおよび部分的な活性についての最小の鎖の長さを確立することにより、達成される。
【0020】
最小の鎖の長さが確立された後に、各々の側鎖を、系統的に変化させて、電荷、立体的嵩、疎水性、芳香性およびキラリティーを各々の位置において決定することができる。多くの一連の類似体の特性の評価の後に、官能基を同定し、結合に伴う特徴を確認することが可能である。次に、種々の配座的に束縛された類似体を、発生させることができる。ペプチドを束縛するための種々の手段が、開発された。
【0021】
1つの手段は、配座的に束縛されたアミノ酸を導入することを含む。Hruby (Life Sci. 1982 31: 189−199)は、本来的な配座的束縛を有する多数のアミノ酸およびジペプチドの合成、並びにこれらの生物学的に活性なペプチド中への導入を記載している。Prasad et al. (Biopolymers 1995 35: 11−20)はまた、α−炭素における水素原子をメチル基で置換して、ジアルキルアミノ酸を生成することによる、アミノ酸単位の配座を束縛する方法を記載している。米国特許第6,022,523号には、アミノ酸の配座的自由度を、C−αおよびC−β原子において二重結合を導入することにより制限する方法が記載されている。
【0022】
ペプチドを束縛するための他の手段は、共有架橋の導入を含む。ペプチド主鎖を共有架橋の導入により束縛することにより、異常なアミノ酸を導入するよりも劇的な効果が得られる。大環化(macrocyclization)は、しばしば、ペプチドN末端とC末端との間、側鎖とNまたはC末端との間、または2つの側鎖の間にアミド結合を形成することにより、達成される。最初の発生のジアルコキシ−ベンジル結合剤である、4−ヒドロキシメチル−3−メトキシフェノキシ酢酸で誘導体化されたポリステリン樹脂上でのFmoc/t−ブチル固相手順により合成された、側面保護されたペプチドの頭尾環化は、Sheppard, R. C. (Int. J. Peptide Res. 1982 20: 451−454)により記載されている。
【0023】
さらに、類似体結合剤である、4−(4−ヒドロキシメチル−3−メトキシフェノキシ)−酪酸(HAMA)は、最近、フラグメント縮合、およびこれらの高度に酸性感受性であるリンカーを用いたペプチドの固相合成において用いられた(ペプチドにおいて、E. GiraltおよびD. Andreu編、ESCOM, Leiden, オランダ国、1991, 131−133)。Schillerにより記載されているエンケファリン類似体は、側鎖から主鎖への共有環化の例を提供し、ここで、D−lys残基のe−アミノ基の、LeuのC末端主鎖カルボン酸基への共有結合により、高い効力および顕著なμレセプター選択性を有する、環式16員環類似体が得られる(Schiller et al. Int. J. Pep. Prot. Res. 1985; 25: 171−177)。BOP試薬およびカルボイミド/1−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾールの組み合わせはまた、環式ペプチドの形成において有用であると報告されている(Felix, A. M. Int. J. Pep. Prot. Res. 1988 31:231−238)。Degrado et al.はまた、m−アミノメチル安息香酸をリンカーとして用いて、GP IIb/IIIa複合体の生物学的に活性な環化されたペプチド類似体を開発した(米国特許第6,022,523号)。
【0024】
ジスルフィドはまた、ある位置におけるシステインの導入による酸化により、生成することができる。例えば、Romani, S. (Int. J. Pep. Prot. Res. 1987 29: 107−117)は、非対称ジスルフィドを、アゾジカルボン酸のジ−tert−ブチルエステルの補助により構築することができることを例証した。Ploux, O. (Int. J. Pep. Prot. Res. 1987 29: 162−169)はまた、3S−3−ニトロ−2−ピリジンスルフェニル基のチオール置換による、非対称ジスルフィドの生成のための方法を記載している。
【0025】
好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、T7プロモーターにより駆動されたcDNA配列を含み、従って、これを、T7RNAポリメラーゼを用いて増幅することができる。この態様において、二重らせんcDNAを、T7RNAポリメラーゼ転写のための鋳型として用いるために合成する。T7RNAポリメラーゼは、このプロモーター部位が、二重らせんであることを必要とする。
【0026】
1つの態様において、オリゴヌクレオチドが付着するFvまたはCDR上の部位は、化学物質、例えばヘテロ二量体カップリング試薬からなるリンカーまたは他のリンカーの付着を可能にする、一連の残基を含む。これらの残基は、リンカー付着のための均一な結合部位を提供する。このリンカーは、この部位に付着し、またオリゴヌクレオチドをFvまたはCDRに結合させる。オリゴヌクレオチドはまた、修飾されていないかまたは修飾されていることができる。例えば、増幅されたオリゴヌクレオチドの存在は、指針または蛍光標識したオリゴヌクレオチドを混合物中に導入し、エピトープ発現分子の迅速な半定量的評価を可能にすることにより、増強することができる(Tan et al., Chemistry Eur. J. 2000 6(7): 1107−1111; Leone et al., Nucleic Acids Res. 1998 26(9): 2150−2155)。
【0027】
結合したエピトープ検出体を、方法、例えば慣用のPCRまたはaRNA手法による増幅により定量することができる。用いる検出方法がイムノaRNAである場合には、二重らせんオリゴヌクレオチドを、エピトープ検出体において用いる。この例において、aRNAを、特定のプロモーターを認識するポリメラーゼ、例えばT7RNAポリメラーゼ、T3RNAポリメラーゼまたはSP6RNAポリメラーゼ、未標識リボヌクレオチドおよび蛍光的に標識されたリボヌクレオチドを用いて、固体支持体上に転写する。
【0028】
種々の手段が、エピトープ検出体の増幅された生成物の検出のために有用である。1つの態様において、aRNAを、例えば放射活性標識または蛍光標識で検出可能に標識する。あるいはまた、aRNAを、cDNAに転化し、方法、例えばゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー、ハイブリッド形成アッセイ、免疫組織化学的アッセイおよび/または特異的に結合するタンパク質アッセイにより、検出することができる。
【0029】
FvおよびCDRペプチドをエピトープ検出体として用いることにより、この方法が、米国特許第5,922,553号のイムノ−aRNA手法により同定することができるよりも大きいポリペプチドの同定において、および上清液、流体、細胞もしくは細菌の抽出物またはすべての他の真核生物におけるモチーフの同定において、有用になる。従って、本発明の方法は、医学的および研究目的の両方において、広範囲の適用可能性を有する。さらに、本発明の方法は、現在入手可能な方法よりも感受性が高く、定量的結果を提供する。
【0030】
本発明の方法において選択された分子のエピトープ検出体として作用する、FvおよびCDRペプチドの能力を、p185レセプターについて例証した。この方法を用いて、放出されたp185レセプターを、ELISAに対し感受性において108倍の増大、およびウエスタン−ECL方法に対し約1000倍の増大で検出した。これらの実験のために、7.16.4の単鎖Fv(ScFv)構造物(7.16.4ScFvと表示する)を、Peterson & Greene (DNA and Cell Biology 1998 17(12): 1031−1040)により概説された手順に従って生成し、ここで、重鎖および軽鎖領域のFv領域は、(gly4−Ser)5リンカーにより接合された。ScFv7.16.4が、ポリヒスチジンタグを含んでいたため、これを、Ni−NTA樹脂上で精製した。精製の後に、7.16.4ScFvの結合を、B104−1−1細胞に対するFACS分析により、直接結合およびモノクローナル抗体7.16.4に対する競合的結合の両方において確認した。
【0031】
抗ヒトp185抗体4D5のCDR3.H領域から設計された、束縛された環外ペプチドである、AHNPもまた、用いた。AHNPは、p185に結合し、4D5の成長阻害効果を模擬する(Park et al. Nature Biotechnology 2000 18: 194−198)。
【0032】
ScFv7.16.4とAHNPとの両方を、二重らせんオリゴヌクレオチド(ds−オリゴ)に結合させて、エピトープ検出体を形成した。ds−オリゴが結合した7.16.4ScFvおよびAHNPの両方は、これらの抗原、それぞれB104−1−1細胞からのラットp185neuおよびT6−17細胞からのヒトp185her2/neuを検出することが可能であった。さらに、ds−オリゴと接合して、エピトープ検出体を形成することにより、プラスモン共鳴分析により決定して、CDR検出分子のこれらの抗原との結合親和性は、変化しなかった。7.16.4ScFvおよびmAb7.16.4が、p185レセプターに対して同等の結合親和性を有するため、これらを、このアッセイにおいて同等のモル濃度において用いた。しかし、親和性が、4D5よりも、p185Her2/neuに対して低いため、AHNPを、一層高い濃度で用いた。
【0033】
ds−オリゴをCDRまたは単鎖Fvに直接カップリングさせることは、特に目的が、質量スクリーニングプロテオミクスアッセイにおいて、数百または数千の抗原を検出することである場合には、時間を消費する手順であり得る。さらに、カップリング能力の変化は、増幅結果の解釈を複雑にし得る。従って、本発明の好ましい態様において、FvまたはCDRは、一般的な、またはユニバーサルエピトープ、例えばヘマグルチニンHAタグまたはポリヒスチジンタグを含む。一般的な、またはユニバーサルエピトープの例は、最初はタンパク質の精製のために設計された7.16.4ScFvにおけるポリ−His−タグである。次に、単一のモノクローナル抗体またはds−DNAと結合した単鎖Fvを用いて、一般的なエピトープに結合させて、ユニバーサルエピトープ検出体を作成する。
【0034】
本発明の方法におけるユニバーサルエピトープ検出体の能力は、7.16.4ScFvにおけるポリ−His−タグを用いて例証された。これらの実験において、p185レセプターを、プレート上に塗布したA11により捕集し、遊離の7.16.4ScFvを加え、続いて、長時間洗浄し、次にds−オリゴと接合した抗His抗体と共にインキュベートした。T7ポリメラーゼ増幅の後に、細胞の10−6希釈の可溶化液からの特異的なバンドを検出した。従って、この感受性は、ユニバーサルエピトープ検出体を有しない基本的なプロトコルを用いて見られる感受性よりも、さらに高かった。
【0035】
本発明の方法はまた、翻訳後修飾の検出において有用である。PCRおよびaRNA手法を、最初に開発して、DNAレベルにおける標的遺伝子の活性を検出した。これらの方法は、専ら、時々ハイブリッド形成と組み合わせて、ゲノム研究の用途において採用された。感受性にかかわらず、これらの方法は、タンパク質レベルにおける翻訳後修飾を検出することはできない。しかし、このような事象のモニタリングは、リン酸化およびグリコシル化を含むが、これらには限定されない多くの修飾が、タンパク質の機能的な状態に関連するため、極めて重要である。
【0036】
従って、実験を実施して、本発明の方法の、EGF処理により誘発されたp185レセプターのリン酸化を検出する能力を例証した。シグナル形成モデルを確立し、ここで、EGF刺激により、EGFRは、p185とヘテロ二量体化し、これをトランス活性化し(trans−activate)、p185レセプター上のチロシン残基のリン酸化がもたらされる(Qian et al. Proc. Natl Acad. Sci. 1994 91: 1500−1504)。EGFRおよびp185erbB2を過剰発現するA431細胞系を、これらの実験において用いた。EGF刺激の後に、細胞可溶化液中のp185レセプターを、1E1により捕集し、モノクローナル抗体を、p185erB2/neuに対して発生させた。抗リン酸化Tyr抗体のIgG2bタイプである、PY99を用いて、リン酸化されたレセプターを検出した。
【0037】
第2の抗体である、ds−オリゴと結合した抗IgG2bを用いて、抗原−抗体サンドイッチ複合体を探索した。EGFで刺激したA431細胞は、正のバンドを形成し、これは、EGF処理を施さない細胞においては、観察されなかった。しかし、T6−17細胞はまた、正のバンドを示し、p185レセプター上の構成的ホスホチロシンを示した。これらのデータは、この方法が、タンパク質の機能的な状態を、この修飾を分析することにより検出することが可能であることを示す。また、ds−オリゴに結合したFvまたはCDRを含むエピトープ検出体を用いて、タンパク質の機能的な状態を検出することができる。
【0038】
従って、本発明は、イムノ−PCR手法の非定量的な性質についての懸念を解消し、プロテオミクスの分野における極めて大きい可能性を提供する、感受性のある検出方法を提供する。特異的なプロモーターを認識するポリメラーゼ、例えばT7RNAポリメラーゼ、T3RNAポリメラーゼまたはSP6RNAポリメラーゼおよび増幅段階における特異的プロモーターを用いることにより、この方法に従って実施されるアッセイは、生物学的および医学的アッセイに関連する直線状の増幅および正確な定量を有する。検出の感受性に影響する因子の数もまた、減少した。抗原と、これらのFvまたは1価のCDRとの間の特異的な結合は、この方法の唯一の臨界的に重要なパラメーターである。
【0039】
ユニバーサルエピトープ検出体を提供する能力により、本発明の方法に、多数の追加の利点が付与される。先ず、すべての細胞抗原を、先ずモノクローナル抗体をds−オリゴに結合させずに検出することができる。ユニバーサルプローブを用いないと、この方法は、1種または数種の特定の抗原を一度に観察するのに有用であるに過ぎない。他方、ユニバーサルプローブにより、有用なFvまたはCDRを有するすべての細胞状または流体存在抗原の検出が可能である。さらに、プロトコルをわずかに変更して、種々の大きさのオリゴヌクレオチドが、エピトープ検出体のFvまたはCDRに付着する際には、種々のタンパク質を、単一の電気泳動レーンにおいて同時に検出することができる。従って、本明細書中に例証するように、本発明の方法は、タンパク質抗原の同定並びに、検出の単一の細胞レベルでの、ポリペプチドおよび他の構造物、例えば糖または脂質の翻訳後修飾に適用可能な、多用途の手法を提供する。
【0040】
この方法はまた、タンパク質相互作用の分析および小さい分子の検出に有用であると考えられる。例えば、リガンドペプチドを、組織試料に対するエピトープ検出体として用いて、特定のレセプターの発現を同定することができ、またその逆もできる。有用なFv、CDRまたは結合タンパク質を用いて、小さい分子、例えばトキシンまたは薬剤代謝物を、水、食物および体液を含むが、これらには限定されないすべての溶液において検出することができる。
【0041】
最初のイムノ−PCRは、アッセイにおいて純粋な抗原を用いた。イムノ−PCRの後の反復は、混合された抗原を試験したが(Hendrickson et al. Nucleic Acids Research 1995 23(3): 522−529)、ELISAよりも2〜3桁高い感受性を示したに過ぎない。極めて大きい種々の非特異的抗原を含む背景を有する実在のアッセイにおいて、感受性は、常に、アッセイの特異性により制限される。FvまたはCDRフラグメントにより結合したエピトープは、比較的大きいポリペプチドを同定すると予測され、これを用いて、上清液、流体、細胞もしくは細菌の抽出物またはすべての他の真核生物におけるモチーフを同定することができる。さらに、ポリペプチド、有機分子または糖構造の実際の同一性を、いくつかのエピトープのFvによる結合をガイドとして用いて、データベースのコンピューターにより補助された分析により、決定することができる。
【0042】
例えば、Fv a、d、eおよびfによる結合により、側鎖a、d、eおよびfを有するものとして糖分子が同定され、従って、これらの同一の側鎖を有する等の族に属する。このようにして、本発明により、細胞中の、すべてではないとしても、多くの分子の定義および同定が、すべての1の特定の時点において可能である。さらに、この方法を用いて、活性細胞または細胞上清液において翻訳された代替の転写形態を同定することができる。この手順は、1)非放射活性検出方法での使用、2)微小化された(microtized)液体取り扱い手順、3)低い試料体積検出、例えば「タンパク質チップ」分析および4)自動化の影響を容易に受ける。
【0043】
以下の限定的でない例を提供して、本発明をさらに例示する。
例
例1:材料
用いた抗体は、mAbs7.16.4およびA11を含み、これらの各々は、p185neuの細胞外ドメイン中の異なるエピトープと反応性である。p185neuの細胞内ドメインに対して向けられた、ポリクローナル抗血清、α−Bacneuを、ウエスタンブロッティングのために用いた。1E1は、ヒトp185her2/neuの外部ドメインに対して発生したIgG1モノクローナル抗体である。rhuMAb 4D5(Herceptin)を、Genentechから得た。
【0044】
抗ホスホチロシンモノクローナル抗体PY99を、Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)から得た。細胞系B104−1−1を、NIH3T3細胞から、ラットオンコジーンp185neuを発現させることにより、誘導した。B104−1−1細胞中のp185neuの発現レベルを、125Iで標識した抗neu mAb結合アッセイを用いて決定した。EGFRおよびp185neuの両方に陰性のNR6は、NIH3T3からのサブクローンであった。T6−17を、NIH3T3から、ヒトp185her2/neuレセプターを過剰発現させることにより、誘導した。これらの細胞系を、すべて、10%胎児ウシ血清(FBS、Hyclone)を含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中で、37℃において5%CO2雰囲気中で培養した。
【0045】
例2:免疫ブロット手順
10cmディッシュ中のサブコンフルエント(subconfluent)細胞を、冷PBSで2回洗浄し、PI/RIPA(1%のトライトンX−100、1%のデオキシコール酸塩、0.1%のSDS、0.15MのNaCl、0.01Mのリン酸ナトリウム、pH7.4、1%のアプロチニン、1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド、2mMのEDTA、10mMのピロリン酸ナトリウム、400mMのオルトバナジウム酸ナトリウムおよび10nMのヨードアセトアミド緩衝液)で可溶化した。タンパク質を、適切な濃度のSDS−PAGEにより分離し、ニトロセルロース膜(Nitrobind, MSI)に移送した。膜を、ブロッキング緩衝液(PBS中の0.5%脱脂乳および5%ヤギ血清)と共に一晩インキュベートした。免疫ブロット(ウエスタンブロット)分析のために、抗体を、0.1%脱脂乳および1%ヤギ血清を含むPBSで希釈した。すべてのポリクローナル血清および二次的HRP共役抗体(Boehringer Mannheim)を、1:5000の希釈において用いた。バンドを、ECLアッセイ(Amersham)を用いて視覚化した。
【0046】
例3:Hisタグ7.16.4の発現および精製
50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地(150ml)に、15mlの大腸菌DH5αの一晩の培養物を接種し、0.5の光学密度(600nm)が得られるまで、30℃に維持した。イソプロピル−β−(−D−チオガラクトピラノシド)(IPTG)を、1mMの最終濃度において加えて、Hisタグ7.16.4ScFvを誘発した。3時間後、細胞を収穫し、凍結および融解することにより溶解し、0.5mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド、2μMのペプスタチンAおよび2μMのロイペプチンを捕捉した10mlの尿素溶解緩衝液(10mMのトリス−Cl、pH8.0、0.1MのNaH2PO4、1MのNaCl、8Mの尿素)中に再懸濁した。
【0047】
不溶性の細胞残骸を、遠心分離(12,000×gで15分間、続いて12,000×gで30分間)により除去した。透明にした上清液を、2mlのNi−NTAアガロースと混合し、続いて、氷上で1時間温和に振盪した。混合物を、空のカラム中に装入し、結合していないタンパク質を、4℃で尿素溶解緩衝液(pH6.3)で洗浄した。Hisタグタンパク質を、尿素溶解緩衝液(pH4.5)で溶離し、溶離フラクションを、例4に記載するように、SDS−PAGEおよびFACS分析により試験した。ピークフラクションにおけるタンパク質をプールし、TKC緩衝液(50mMのトリス−Cl、pH8.0、100mMのKCl、10mMのCaCl2、1mMのEDTA、0.1mMのPMSF)に対して透析した。
【0048】
例4:FACS分析による7.16.4ScFv結合の確認
細胞表面抗原を、蛍光活性化細胞分類(FACS)により検出した。B104−1−1細胞(約5×105)を、精製した7.16.4ScFvを含む200μlのFACS緩衝液(0.5%ウシ血清アルブミンおよび0.02%アジ化ナトリウムを含むPBS)中で、インキュベートした(4℃で30分間)。次に、細胞を、FACS緩衝液で洗浄し、抗His抗体(Invitrogen)と共にインキュベートした(30分、4℃)。この第2のインキュベーションの後に、細胞を、FACS緩衝液で再び洗浄し、さらに、マウス免疫グロブリンに対してFITC標識したIgG(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)と共にインキュベートした。
【0049】
FACS緩衝液で洗浄した後、細胞ペレットを、PBS緩衝液中に懸濁させ、FACS走査フローサイトメーター(Becton Dickinson)による分析のために加工した。各々の試料について、10,000個の生存可能な細胞を、大きさ(前方向散乱、FSC)および粒度(側面散乱、SSC)パラメーターに続いてゲートし、CellQuest Software (Becton Dickinson)を用いて分析した。競合的結合のために、B104−1−1細胞を、先ず、種々の濃度の7.16.4ScFvの存在下で、モノクローナル抗体7.16.4と共にインキュベートした。次に、細胞を、FACS緩衝液で洗浄し、マウス免疫グロブリンに対してFITC標識したIgG(Sigma Chemical Co.)と共にさらにインキュベートし、次にフローサイトメーター上で分析した。
【0050】
例5:ds−cDNAの抗体またはFvまたはCDRへの付着
以下の配列
【外1】
を有するcDNAオリゴヌクレオチドを、5’末端において活性化可能なアミンと共に設計して、T7RNAポリメラーゼの酵素活性によりcDNA鋳型からRNAの合成を導くために用いられる、一級アミンおよびT7プロモーター部位
【外2】
への共有結合を可能にする。1μgの抗体を30μgのds cDNAに、または1μgのCDRを0.1μgのds cDNAに、または1μgのScFvを3μgのds cDNAに付着させるために、等しい容量の0.1%のグルタルアルデヒドを、10μlのアリコート中に加えた。溶液を、回転装置上で3時間、室温で混合した。次に、エタノールアミン(1M;1/20容積;pH7.5)を加えた。溶液を、さらに2時間、室温で混合した。タンパク質−DNA複合体を、4℃で貯蔵した。
【0051】
例6:RNA増幅
RNA増幅を、第1のAb−抗原複合体を含む96ウェルプレート中で実施した。以下の試薬を加えた:1X RNA増幅緩衝液(40mMのトリス−塩基、pH7.5、7mMのMgCl2、10mMのNaCl、2mMのスペルミジン;5mMのDTT;250μMのATP、UTP、GTP;5μMのCTP;0.5μlのRNAsin;1000UのT7 RNAポリメラーゼおよび3μlのP32−CTP)。次に、この溶液を、4時間37℃でインキュベートした。RNA生成物を、ウェルから除去し、3μlを、3μlの反応停止溶液(95%のホルムアミド、10mMのEDTA、0.1%のブロモフェノールブルー、0.1%のキシレンシアノール)に加え、15%変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。ゲルを、ホスホイメージャー(phosphoimager)スクリーンに5〜60分間並べ、100uMの解像度でホスホイメージャー上で現像した。
【0052】
例7:対照方法としての標準的なサンドイッチELISA
96ウェルマイクロタイタープレート(Nunc−Immuno Plate, MaxiSorpTM)を、1E1(ヒトp185の細胞外ドメインに対して向けられたモノクローナル抗体)で、100μlの被覆緩衝液(抗体濃度:5μg/ml)と共に、4℃で一晩インキュベーティングプレートにより被覆した。次に、プレートを、0.2%のトウィーン20(PBS−T;200μl/ウェル)を含むPBSで3回洗浄し、0.5%のPBSおよび0.2%のトウィーン20(200μl/ウェル)を含むPBSで1時間室温でブロッキングし、再びPBS−T(200μl/ウェル)で3回洗浄した。平行して、T6−17細胞可溶化液の連続希釈100μlを、プレートに加え、2時間室温でインキュベートした。
【0053】
このインキュベーション段階の後に、プレートを、PBS−T(6回、200μl/ウェル)で洗浄し、ヒト化抗p185Her2抗体4D5(150ng/ml、50μl/ウェル)と共に2時間、室温でインキュベートした。その後、プレートを、6回洗浄し、50μlの抗ヒトIgG−HRP(Zymed;最終的な希釈:1:10,000)でさらに2時間、室温でインキュベートした。酵素反応を、室温で、TMB(各々0.1Mのリン酸−クエン酸緩衝液中で2.5mM、pH5.0)(100μlの各々の試薬/ウェル)を加えることにより、実施した。反応を、15〜60分後に、50μlの1MのH2SO4を加えることにより、停止した。発色を、ELISA読みとり機を用いて、450nmにおいて測定した。
Claims (11)
- 試料中の選択されたエピトープを発現する分子を検出するための方法であって:
(a)試料中の選択されたエピトープを発現する分子を、選択された表面に固定化し;
(b)表面と、エピトープ検出体とを接触させて、エピトープ検出体が、表面上の固定化された分子に結合するようにし;および
(c)表面に結合したすべてのエピトープ検出体を検出し、ここで、結合したエピトープ検出体は、試料中の選択されたエピトープを発現する分子を示す
ことを含む、前記方法。 - 選択されたエピトープを発現する分子が、選択された表面に、選択されたエピトープに特異的な表面上のエピトープアンカーに結合することにより固定化される、請求項1に記載の方法。
- エピトープ検出体が、一般的なエピトープを検出するユニバーサルエピトープ検出体を含む、請求項1に記載の方法。
- 検出された分子が、翻訳後に修飾される、請求項1に記載の方法。
- 選択されたエピトープを発現する分子を検出するためのシステムであって:
(a)選択されたエピトープを発現する分子を固定化するか、または固定化することができる、選択された表面;および
(b)選択されたエピトープに対する単鎖Fvまたは束縛されたエピトープ特異的CDRを含み、それが修飾されてオリゴヌクレオチドの付着を可能にする、エピトープ検出体
を含む、前記システム。 - さらに、分子を選択された表面に固定化するためのエピトープアンカーを含み、前記エピトープアンカーが、選択されたエピトープに特異的である、請求項5に記載のシステム。
- エピトープ検出体が、一般的なエピトープを検出するユニバーサルエピトープ検出体を含む、請求項5に記載のシステム。
- 選択されたエピトープを発現する分子を検出するためのキットであって、選択されたエピトープに対する単鎖Fvまたは束縛されたエピトープ特異的CDRを含むエピトープ検出体を含む、前記キット。
- さらに、選択されたエピトープに特異的なエピトープアンカーを含む、請求項8に記載のキット。
- 単鎖Fvまたは束縛されたエピトープ特異的CDRが、オリゴヌクレオチドの付着のために修飾されている、請求項8に記載のキット。
- エピトープ検出体が、一般的エピトープを検出するユニバーサルエピトープ検出体を含む、請求項8に記載のキット。
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