JP2004506873A - 自動化マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーのための系および方法 - Google Patents
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Abstract
広範囲のマッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー(MIPC)の系および方法、ならびにそれに関連するコンピュータプログラムもしくはソフトウェアにおいて、該系は、広範なMIPC分離方法のサンプル選択、移動相勾配の選択および制御、カラムおよび移動相の温度制御、ならびにフラグメント収集のための自動化されたオプションを提供する。MIPC分離方法は、DNAフラグメントの大きさに基づく分離、突然変異の検出、DNAフラグメントの精製、PCR過程のモニタリング、および他の新規過程を遂げるために適用することができる。本発明は、これらの手順の多くを自動化する系およびソフトウェアに向けられ、複雑な分離方法を達成するための該系の使用を助長する。本発明の一態様において、使用者は混合物中の二本鎖DNAフラグメント(1種もしくは複数)の大きさ範囲を指定し、ソフトウェアが該フラグメント(1種もしくは複数)を溶出するための溶媒の勾配を計算し、そして、系が、計算された勾配を使用してクロマトグラフィー分離を実施する。DNA突然変異の検出で有用な一態様においては、使用者が野性型DNA分子の塩基配列を指定し、ソフトウェアが混合物中のDNAのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖分子を部分的に変性させるための温度を計算し、ソフトウェアがフラグメントを溶出するための溶媒の勾配を計算し、そして、系が、計算された勾配および温度を使用してクロマトグラフィー分離を実施する。
Description
【0001】
(発明の分野)
本発明は、DNAの大きさに基づく(塩基対長さ)分離を遂げるのに適するDNA分離の系および方法に関する。とりわけ、本発明は、DNAの大きさに基づく分離を遂げる高度に自動化されたマッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー(MIPC)の系および方法、ならびに該系を作動させるための制御およびソフトウェアに関する。
【0002】
(発明の背景)
DNA分子はデオキシヌクレオチドと呼ばれるサブユニットを含んで成るポリマーである。DNA中で見出される4種のデオキシヌクレオチドは、それぞれA、G、CおよびTと本明細書で称される4種の塩基、アデニン(プリン)、グアニン(プリン)、シトシン(ピリミジン)およびチミン(ピリミジン)のいずれかに共有結合される共通の環状糖デオキシリボースを含んで成る。リン酸基が、1個のデオキシヌクレオチドの3’−ヒドロキシルを別のデオキシヌクレオチドの5’−ヒドロキシルと連結してポリマー鎖を形成する。二本鎖DNA中の2本の鎖は、いわゆる相補塩基の間の水素結合によりらせん構造で一緒に保持される。塩基の相補性はそれらの化学構造により決定される。二本鎖DNA中で、各AはTと対をなし、また、各GはCと対をなす。すなわち、プリンはピリミジンと対をなす。理想的には、DNAは、人体もしくは他の生存する生物体中で細胞分裂の間にDNAポリメラーゼにより正確なコピーに複製される。DNA鎖はまたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってインビトロで複製することもできる。ときに、正確な複製が失敗し、そして誤った塩基対形成が起こる。該新たな鎖のさらなる複製は、親のものとの塩基配列の遺伝する差異を含有する二本鎖DNAの子孫を生じさせる。塩基対配列のこうした遺伝する変化を突然変異と呼ぶ。
【0003】
本明細書で使用されるところの二本鎖DNAは二重鎖と称される。一方の鎖の塩基配列が他方の鎖の塩基配列に完全に相補的である場合、該二重鎖をホモ二重鎖と呼ぶ。二重鎖が相補的でない最低1個の塩基対を含有する場合、該二重鎖をヘテロ二重鎖と呼ぶ。ヘテロ二重鎖は、DNAポリメラーゼ酵素により誤りが生じられかつ複製されているポリヌクレオチド鎖に非相補的塩基が付加されるDNA複製の間に形成される。ヘテロ二重鎖のさらなる複製は、理想的には、ヘテロ接合性であるホモ二重鎖を生じさせることができる。すなわち、これらのホモ二重鎖は、元の親DNA鎖と比較して変えられた配列を有することができる。親DNAが天然に存在する集団中で有意を占める配列を有する場合、該配列は一般に「野性型」と称される。
【0004】
多くの異なる型のDNA突然変異が既知である。DNA突然変異の例は、限定されるものでないが、「点突然変異」もしくは「単一塩基対突然変異」を挙げることができ、ここでは1個の誤った塩基対形成が起こる。最も普遍的な点突然変異は、1個のプリンもしくはピリミジン塩基が別のものに取って替わる「転位」、およびプリンがピリミジンの代わりに用いられる(そして逆もまた同じ)「トランスバージョン」を含んで成る。点突然変異は、その中で1個の塩基がDNA鎖に付加されもしくはそれから欠失される突然変異もまた含んで成る。こうした「挿入」もしくは「欠失」は「フレームシフト突然変異」としてもまた既知である。それらは点突然変異より少ない頻度で起こるとは言え、複数の塩基対に影響を及ぼすより大きな突然変異もまた起こる可能性があり、かつ、重要であるかもしれない。突然変異のより詳述された論考は、Modrichへの米国特許第5,459,039号明細書(1995)およびCottonへの米国特許第5,698,400号明細書(1997)に見出すことができる。
【0005】
DNA中の塩基対の配列はタンパク質の産生のための暗号である。とりわけ、DNA鎖のエキソン部分のDNA配列は、タンパク質中の対応するアミノ酸配列をコードする。従って、DNA配列中の突然変異は、タンパク質のアミノ酸配列中の変化をもたらすかもしれない。アミノ酸配列中のこうした変化は、完全に良性であるかもしれないか、あるいはタンパク質を不活性化するかまたは生命を脅かすかもしくは致死的であるようにその機能を変えるかもしれない。他方、DNA鎖のイントロン部分中の突然変異は、生物学的影響を有することが期待されないとみられる。イントロン区分はタンパク質産生のための暗号を含有しないからである。にもかかわらず、イントロン区分中での突然変異の検出は、例えば法廷の検討において重要であるかもしれない。
【0006】
従って、突然変異の検出は、疾患の診断、疾患の起源の理解、および潜在的な治療の開発で非常に重要である。DNAサンプル中の突然変異の検出および類似性もしくは差異の同定もまた、疾患に抵抗性のかつ/もしくはより多く産する作物系統を開発することによる世界の食糧供給の増大、法廷科学、進化および集団の研究、ならびに一般に学術研究において決定的に重要である(Guyerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:10841(1995);Cotton、TIG 13:43(1997))。
【0007】
良性である、もしくは負の結果を有しないDNA配列中の変化は、ときに「多形」と呼ばれる。本出願の目的上、DNA配列中の全部の変化は、それらが負の結果を有するにしろしないにしろ、本明細書で「突然変異」と定義する。明快さのために、「突然変異」という用語を、参照鎖(一般に、しかし必ずしもでなく、野性型)に比較したDNA鎖の塩基配列中の変化を意味するのに本明細書で使用する。本明細書で使用されるところの「突然変異」という用語は、「多形」という用語、または当該技術のいずれかの他の類似のもしくは同等な用語を包含する。
【0008】
従来技術において、DNAサンプルの大きさに基づく分析は標準的ゲル電気泳動(GEP)により達成される。キャピラリーゲル電気泳動(CGE)もまた、多様な長さを有するDNAフラグメントの混合物、例えばDNAサンプルの制限酵素切断により生じられた消化物を分離かつ分析するのに使用されている。しかしながら、これらの方法は、同一の塩基対長さを有するがしかし異なる塩基配列を有するDNAフラグメントを識別することができない。これはGEPの重大な限界である。
【0009】
「部分的に変性する」条件下のヘテロ二重鎖DNA鎖中の突然変異は、変性勾配ゲル電気泳動(DGGE)および変性勾配ゲルキャピラリー電気泳動(DGGC)のようなゲルに基づく分析方法により検出することができる。「部分的に変性する」という用語は、DNA二本鎖の他の部分が無傷のままである、すなわち分離されない一方での、該二本鎖中の不適正にされた塩基対の分離(温度、pH、溶媒もしくは他の要因により引き起こされる)であると定義する。「部分的変性」の現象は、ヘテロ二重鎖が該鎖の残部を変性させるのに必要とされるよりもより低温で塩基対不適正の部位で変性することができるため発生する。
【0010】
これらのゲルに基づく技術は困難であり、かつ、高度に熟練した実験室科学者を必要とする。加えて、各分析は冗長な準備および分離を必要とする。変性キャピラリーゲル電気泳動分析は、比較的小さいフラグメントのみを利用することができる。90塩基対のフラグメントの分離は30分以上かかる。勾配変性ゲルは一夜泳動し、そして約1日の準備時間を必要とする。勾配ゲルの付加的な欠陥は、分離されたDNAフラグメントを単離するようにこれらの手順を適合させること(専門の技術および器具を必要とする)、ならびに単離に必要とされる条件を確立することという困難である。条件は各フラグメントについて実験的に開発しなければならない(Laboratory Methods for the Detection of Mutations and Polymorphisms、G.R.Taylor編、CRC プレス(CRC Press)、1997)。ゲルの方法論の長い分析時間は、ゲル中でのDNAフラグメントの動きが、DNAフラグメントの長さに幾何学的関係で逆比例するという事実によりさらに悪化される。従って、より長いDNAフラグメントの分析時間は、しばしば擁護できない可能性がある。
【0011】
上に挙げられた変性ゲルの方法の欠陥に加え、これらの技術は、ゲルの調製および分析の実施がひとりの操作者から別の者まで高度に変動性である可能性があるため、常に再現可能もしくは正確であるわけでない。
【0012】
GEPもしくはDGGEによる二本鎖核酸フラグメント混合物の分離は直線状の一列のバンドを生じさせ、列中の各バンドはその混合物の分離された二本鎖核酸成分に相当する。多くの混合物が典型的に同一のゲルスラブ上の別個のレーンで同時に分離かつ分析されるため、平行な一連のこうした直線状のバンドの列が生じられる。バンドはしばしばまっすぐであるよりはむしろ湾曲し、それらの移動度および形状はゲルの幅にわたって変わる可能性があり、そしてレーンおよびバンドは相互に混じる可能性がある。こうした不正確さの起源は、ゲル床、電気浸透、熱勾配および拡散効果の均一性および均質性の欠如、ならびに多数の他の要因から起因する。この種の不正確さはGEP技術で公知であり、そして、分離結果の表示における重大な歪曲および不正確さにつながる可能性がある。加えて、GEP分離から得られたバンド表示データは、バンドの形状および完全性に関係する不正確さのため、定量的もしくは正確でない。GEP分離により生じられた直線状のバンドの列の表示の定量は、直線状のバンドの列を検出器で走査しそして生じるデータを積分する場合でさえ達成することができない。直線状のバンドの列はバンドの中央を横切ってのみ走査されるからである。検出器はいずれかの所定のバンドの小さい一部分のみ見、そしてバンドは均一でないため、走査法により生じられる結果は正確でなく、そして紛らわしくさえある可能性がある。
【0013】
染色もしくはオートラジオグラフィーのようなGEPおよびDGGE分離の可視化方法もまた厄介でありかつ時間がかかる。加えて、分離データはハードコピーの形態であり、そして容易な検索および比較のため電子的に保存することができず、また、接近した分離の可視化を改良するためにそれを高めることもできない。
【0014】
二本鎖デオキシリボ核酸(dsDNA)フラグメントの分離、およびDNA突然変異の検出は、医学、物理および社会科学、ならびに法廷の検討で非常に重要である。ヒトゲノムプロジェクトは膨大な量の遺伝情報を提供しており、そして突然変異とヒトの障害との間の関連を評価するための新たな情報を生じている(Guyerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:10841(1995))。例えば、疾患の最終的な起源は野性型と異なる遺伝暗号により記述される(Cotton、TIG 13:43(1997))。疾患の遺伝的基礎の理解は治療法の出発点となる可能性がある。同様に、遺伝暗号中の差異の決定は、進化および集団の研究への強力かつおそらく決定的な洞察を提供する可能性がある(Cooperら、Human Genetics vol.69:201(1985))。これらおよび遺伝暗号に関する他の論点の理解は、あるDNAフラグメント中の野性型に関しての異常すなわち突然変異を同定する能力を必要とする。
【0015】
伝統的なクロマトグラフィーは、「固定相」と「移動相」との間での混合物の成分の分配に基づく分離方法である。固定相は、セルロース、シリカゲル、被覆シリカゲル、ポリマービーズ、多糖などの粒子もしくは通路の表面の形態の多くの多様な物質を含むことができる固体素材の表面により提供される。これらの素材は、ガラス板上のような固体表面上で支持することができるか、もしくはカラム中に充填することができる。移動相は液体、もしくはガスクロマトグラフィーでは気体であることができる。本発明は液体の移動相に関する。
【0016】
分離の原理は、一般に、使用される素材、素材の形態、もしくは使用される装置に関係なく同一である。混合物の多様な成分は、固定相および移動相中の異なるそれぞれの溶解度を有する。従って、移動相が固定相の上を流れる際に平衡が存在し、そこでサンプルの成分が固定相と移動相との間で分配される。移動相がカラムを通過する際に、該平衡は移動相の方を選んで絶えず移動される。これは、平衡混合物が、いずれの時点でも、新たな移動相に会いそして新たな移動相中に分配するために起こる。移動相がカラムを下に運搬される際に、移動相は新たな固定相に会いそして該固定相中に分配する。ついには、カラムの端ではもはや固定相が存在せず、そしてサンプルはただ移動相中でカラムを離れる。
【0017】
混合物の成分が、わずかに異なる、固定相に対する親和性および/もしくは移動相中の溶解性を有し、そして従って異なる分配平衡値を有するために、混合物の成分の分離が起こる。従って、混合物の成分は異なる速度でカラムを下に進む。
【0018】
クロマトグラフィー分離は固定相との相互作用に依存するため、固定相の表面積を増大させることにより分離を改良することができることが既知である。
【0019】
伝統的な液体クロマトグラフィーにおいては、ガラスカラムを固定相粒子で充填し、そして移動相が重力によってのみ引かれてカラムを通過する。しかしながら、カラム中でより小さい固定相粒子を使用する場合、重力単独の引っ張りは移動相にカラムを貫流させるのに不十分である。代わりに、圧を適用しなければならない。しかしながら、ガラスカラムは約200psiに耐えることができるのみである。移動相に5ミクロンの粒子で充填されたカラムを通過させることは、約2000psiもしくはそれ以上の圧がカラムに適用されることを必要とする。5ないし10ミクロンの粒子が今日、標準的である。5ミクロンより小さい粒子は、とりわけ困難な分離もしくはある特別な場合に使用する)。この方法は「高速液体クロマトグラフィー」もしくはHPLCという用語により示される。
【0020】
HPLCは、大きな粒子の重力カラムで可能であったよりも、より広範な化学構造を分離するのに使用されるはるかにより広範な型の粒子の使用を可能にした。しかしながら、分離の原理はそれでもなお同一である。
【0021】
HPLCに基づくイオン対形成クロマトグラフィー法は、一般に二本鎖ポリヌクレオチド、およびとりわけDNAの混合物を効果的に分離するために最近導入され、ここでは分離は塩基対長さに基づく(Bonnへの米国特許第5,585,236号明細書(1996);Huberら、Chromatographia 37:653(1993);Huberら、Anal.Biochem.212:351(1993))。これらの参考文献およびその中に含有される参考文献は、そっくりそのまま本明細書に組み込まれる。「マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー」(MIPC)という用語を本明細書で定義し、そして本方法に適用する。分離の機構が、伝統的な分配よりもむしろ分離表面へのDNAの結合およびそれからの放出に基づくことが見出されたためである。MIPCは塩基対長さに基づいてDNAフラグメントを分離し、そしてゲルに基づく分離方法に伴う欠陥により制限されない。
【0022】
本明細書で使用されるところのマッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーは、非極性の分離媒体を使用する一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドの分離方法と定義し、ここで、該方法は、対イオン剤、および分離媒体からポリヌクレオチドを放出させる有機溶媒を使用する。MIPC分離は10分未満、および頻繁には5分未満で完了することができる。
【0023】
MIPC分離方法は、液体がカラムを通過する際の移動相と固定相との間の一連の平衡分離により分離が達成されないため、伝統的なHPLC分離方法と異なる。代わりに、サンプルdsDNAを分離媒体表面に結合させる溶媒強度を使用して、サンプルをカラム中にフィードする。特定の塩基対長さの鎖を固定相表面から除去し、そして特定の溶媒濃度によりカラムを下に運搬する。溶媒の増大する勾配にサンプルを通過させることにより、連続的により大きな塩基対長さが連続して除去され、そしてカラムを通過する。該分離はカラム長さもしくは固定相の面積に依存しない。
【0024】
本MIPC方法は温度感受性であり、そして正確な温度制御がMIPC分離方法でとりわけ重要である。
【0025】
MIPCの使用および理解が進展した際に、部分的変性温度、すなわち塩基対不適正の部位でヘテロ二重鎖を変性させるのに十分な温度でMIPC分析を実施した場合に、同一の塩基対長さを有するヘテロ二重鎖からホモ二重鎖を分離することができたことが発見された(米国特許第5,795,976号明細書;Hayward−Lesterら、Genome Research 5:494(1995);Underhillら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:193(1996);Dorisら、DHPLC Workshop、スタンフォード大学、(1997))。これらの参考文献およびその中に含有される参考文献はそっくりそのまま本明細書に組み込まれる。従って、変性HPLC(DHPLC)の使用が、突然変位の検出に適用された(Underhillら、Genome Research 7:996(1997);Liuら、Nucleic Acid Res.、26;1396(1998))。
【0026】
DHPLCは、1塩基対程度だけ異なるヘテロ二重鎖を分離することができる。しかしながら、ホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖の分離は乏しく分離される可能性がある。人工物および不純物もまた、人工物もしくは不純物と推定の突然変異との間を識別するのが難しいかもしれないという意味において、DHPLC分離クロマトグラムの解釈を妨害する可能性がある(Underhillら、Genome Res.7:996(1997))。突然変異の存在は完全に見逃されさえするかもしれない(Liuら、Nucleic Acid Res.、26:1396(1998))。
【0027】
HPLCおよびDHPLCによるDNAの分離および突然変異の検出の重要な局面は、クロマトグラフィー系の構成部品を含んで成る素材の処理;分離媒体を含んで成る素材の処理;方法の開発時間を最小限にするための溶媒の前選択;MIPCの間のヘテロ二重鎖の部分的変性を遂げるための最適温度の前選択;および自動化高スループット突然変異検出スクリーニングアッセイのためのDHPLCの最適化を包含する。これらの要因は、明白な、正確な、再現可能なかつ高スループットのDNA分離および突然変異の検出の結果を達成するために不可欠である。
【0028】
突然変異の検出においてホモ二重鎖からヘテロ二重鎖を分離するために使用される部分的変性条件下でのマッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー(MIPC)の応用は、下でDMPICと称する。DMIPCにおいては、部分的変性温度、すなわち、ヘテロ二重鎖の突然変異部位に存在する不適正にされたDNAが変性することができるがしかし適合されたDNAが二本鎖に結合されたまま留まることができる温度で、移動相および固定相双方を維持するために、正確な温度制御が必要とされる。
【0029】
HPLC分離系のある構成部品および作動は、伝統的な分配に基づく分離を助長するために部分的に自動化されている。一例は、それらのHPLCクロマトグラフィー装置とともに日立により提供されるHSM制御系である。これらの制御の使用において、クロマトグラフィーの専門家が、分離のための特定のサンプルを得るために詳細な命令をオートサンプラーに、所望の溶媒の勾配を遂げるために詳細な単純命令を比例弁に、および特定の温度の命令をカラムオーブンに人的に入力する。制御系がこれらの命令を自動的に実行してHPLC分離を遂げる。
【0030】
MIPC系は、現存する制御系で満足させることができない系の作動要件を導入している。増大された数のウェルをもつサンプルトレイが導入され、サンプルのそれぞれの分離アリコートを引き出すための対応する詳細なオートサンプラーの命令を必要とする。より複雑かつ多様な溶媒濃度および勾配の命令が必要とされる。より正確な温度制御が不可欠であり、また、若干の作動においては、同一のサンプルからのアリコートを、多様な予め設定された温度で分離することになる。MIPC系を使用して、それぞれが単一の塩基対の大きさを有する純粋な画分を単離することができ;これらはPCRもしくはクローニング増幅技術に必要とされる。これは、MIPC分離過程と協調して作動するフラグメントコレクタの使用を必要とする。さらに、MIPC分離方法の拡大する応用は、該系がクロマトグラフィーの専門家よりはむしろ訓練された技術者により操作可能であることを必要とする。加えて、DNAフラグメントを大きさの差異に基づいて分離することができかつまた同一の長さを有するがしかし塩基対配列が異なる(野性型からの突然変異)DNAを正確な、再現可能な、信頼できる様式で分離することもできるHPLC系に対する必要性が存在する。こうした系は自動化されかつ効率的であるべきであり、慣例の高スループットサンプルスクリーニングの応用に適合可能であるべきであり、そして最小限の操作者の注意で高スループットサンプルスクリーニングを提供すべきである。
【0031】
これらの新たな要件は、現在入手可能な機器および関連する制御系により満足されない。
【0032】
(発明の要約)
クロマトグラフィーの専門家よりはむしろ訓練された技術者により操作されることができるMIPC分離系および方法を提供することが、本発明の一目的である。
【0033】
広範な分離スキームについて、複数のサンプルを含有するトレイもしくはプレートからサンプルを選択し、各分離について溶媒の溶出勾配を設定し、各分離についてカラムの温度(1種もしくは複数)を設定し、そして継続される監視および人的制御なしで所望の画分を収集することができるMIPC分離系およびソフトウェア制御を提供することが、本発明のさらなる一目的である。
【0034】
一局面において、本発明は、移動相の溶媒溶液および水性成分の流量を制御するための移動相流量制御手段(該流量制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し);MIPC分離カラム;移動相を移動相流量制御手段からMIPC分離カラムに向かわせるための導管手段;ならびにその中に固有のソフトウェア移動相流量制御モジュールを有する移動相流量制御手段と通信するコンピュータを含んで成る高速液体クロマトグラフィー系を用いるDNAフラグメントの混合物の塩基対長さに基づく分離を遂げる方法に関する。該方法は、分離されるべきDNAフラグメントの混合物中の塩基対長さの数値の範囲を受領すること;DNAフラグメントの混合物からの選択されたフラグメントの分離を遂げることができる溶媒濃度および対応する溶媒の勾配の範囲を計算すること;溶媒濃度および溶媒の勾配の前記範囲を移動相流量制御モジュールに提供すること;ならびに分離を実施すること、のコンピュータ化された段階を包含し、ここで、移動相流量制御モジュールが、選択されたフラグメントの分離を遂げるのに必要とされる勾配および溶媒濃度を果たすように移動相流量制御手段の設定を制御する。移動相流量制御手段は、それぞれ流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する自動開放制御を伴う一組の流量制御弁を包含することができる。移動相流量制御手段は、その流量設定が流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する一組のポンプを包含することができる。該方法において、塩基対長さに基づく分離は、DNAフラグメントの混合物のフラグメントの全部の分離であることができるか、または、DNAフラグメントの混合物の1種もしくはそれ以上のフラグメントの分離であることができる。該方法で使用される勾配はイソクラチック勾配を包含することができる。
【0035】
該方法の一態様において、溶媒濃度は、最小のフラグメントについて計算された%Bの値より下で開始するよう計算され、かつ、最大のフラグメントについて計算された%Bの値より上で終了するよう計算され、ここで、%Bは、以下の式:
【0036】
【数13】
【0037】
%Bは有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり
p1、p2およびp3は、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される。
【0038】
該方法の別の態様において、溶媒濃度は、最小のフラグメントについて計算された%Bの値より下で開始するよう計算され、かつ、最大のフラグメントについて計算された%Bの値より上で終了するよう計算され、ここで、%Bは、以下の式:
【0039】
【数14】
【0040】
式中、
【0041】
【数15】
【0042】
%Bは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり;
sは勾配の傾きであり;
d、void、p4、p5、p6、p7およびp8は、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される。
【0043】
別の局面において、本発明はコンピュータ化された制御手段を包含する高速液体クロマトグラフィー系に関し、該クロマトグラフィー系は、移動相の溶媒溶液および水性成分の流量を制御するための移動相流量制御手段(該流量制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し);MIPC分離カラム;移動相を移動相流量制御手段からMIPC分離カラムに向かわせるための導管手段;ならびに移動相流量制御手段と通信するコンピュータ;該コンピュータおよび移動相流量制御手段と作業連合にあるソフトウェア移動相流量制御モジュールを含んで成り、ここで、該移動相流量制御手段は、それぞれが流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する自動開放制御を伴う一組の流量制御弁であるか、もしくは、移動相制御手段は一組のポンプであって、その流量設定が流量制御モジュールからの制御コマンドに応答し、前記コンピュータは溶媒の勾配の開始および終了溶媒濃度をコンピュータ計算するための溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアを包含する。
【0044】
該液体クロマトグラフィー系の一態様において、溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアは、DNAフラグメントの混合物中の分離されるべきフラグメントの塩基対長さの範囲を受領し、かつ、分離されるべき最小のフラグメントについて計算された%Bの値より下で開始しかつ分離されるべき最大のフラグメントについて計算された%Bの値より上で終了する溶媒濃度を計算するためのソフトウェア手段を包含し、ここで、%Bは、以下の式:
【0045】
【数16】
【0046】
%Bは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり;
p1、p2およびp3は、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される。
【0047】
該高速液体クロマトグラフィー系の別の態様において、溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアが、DNAフラグメントの混合物中の分離されるべきフラグメントの塩基対長さの範囲を受領し、かつ、分離されるべき最小のフラグメントについて計算された%Bの値より下で開始しかつ分離されるべき最大のフラグメントについて計算された%Bの値より上で終了する溶媒濃度を計算するためのソフトウェア手段を包含し、ここで、%Bは、以下の式:
【0048】
【数17】
【0049】
式中
【0050】
【数18】
【0051】
%Bは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり;
sは勾配の傾きであり;
d、void、p4、p5、p6、p7およびp8は、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される。
【0052】
なお別の局面において、本発明は、DNAフラグメントの混合物から分離されるべき塩基対長さの範囲を受領するための手段、MIPCにより分離されるべき塩基対長さの範囲を分離するのに必要とされる溶媒濃度を計算するための手段、およびMIPCにより分離されるべき塩基対長さの範囲を分離するのに使用されるべき溶媒の勾配を選択するための手段を包含するソフトウェアプログラムに関し、ここで、前記溶媒濃度を計算するための手段は、分離されるべき最小のフラグメントについて計算された%Bの値より下で開始しかつ分離されるべき最大のフラグメントについて計算された%Bの値より上で終了するよう溶媒濃度を計算するための手段を包含し、ここで、%Bは、以下の式:
【0053】
【数19】
【0054】
%Bは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり
p1、p2およびp3は、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される。
【0055】
別の局面において、本発明は、DNAフラグメントの混合物から分離されるべき塩基対長さの範囲を受領するための手段、MIPCにより分離されるべき塩基対長さの範囲を分離するのに必要とされる溶媒濃度を計算するための手段、およびMIPCにより分離されるべき塩基対長さの範囲を分離するのに使用されるべき溶媒の勾配を選択するための手段を包含するソフトウェアプログラムに関し、ここで、前記溶媒濃度を計算するための手段は、分離されるべき最小のフラグメントについて計算された%Bの値より下で開始しかつ分離されるべき最大のフラグメントについて計算された%Bの値より上で終了するよう溶媒濃度を計算するための手段を包含し、ここで、%Bは、以下の式:
【0056】
【数20】
【0057】
式中
【0058】
【数21】
【0059】
%Bは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり;
sは勾配の傾きであり;
d、void、p4、p5、p6、p7およびp8は、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される。
【0060】
別の局面においては、本発明は、高速液体クロマトグラフィー系を用いる混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子の分離を遂げる方法に関する。該系は、マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離カラム;カラムに進入する移動相の温度を制御するためのオーブン温度制御手段(該オーブン温度制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し);およびその中に固有のオーブン温度制御ソフトウェアモジュールを有するオーブン温度制御手段と通信するコンピュータを包含する。本方法は、約50℃ないし約75℃の温度範囲の一連の変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離において、変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーにより混合物を分析することを包含する温度の最適化を実施することのコンピュータ化された段階を包含し、各連続する分離は、突然変異分離プロフィルが観察されるかもしくは突然変異分離温度範囲のいずれかの突然変異分離プロフィルの非存在が観察されるまで、先行する分離よりもより高温を有し、ここで、突然変異分離プロフィルは突然変異の存在を同定し、かつ、突然変異分離プロフィルの非存在はサンプル中の突然変異の非存在を示す。あるいは、50℃ないし約75℃の温度範囲の一連の変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離において、変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーにより混合物を分析すること、各連続する分離は、突然変異分離プロフィルが観察されるかもしくは突然変異分離温度範囲のいずれかの突然変異分離プロフィルの非存在が観察されるまで、先行する分離よりもより低温を有し、ここで、突然変異分離プロフィルは突然変異の存在を同定し、かつ、突然変異分離プロフィルの非存在はサンプル中の突然変異の非存在を示す。本方法において、オーブン温度制御モジュールは、連続する分離の間の温度を果たすオーブン温度制御手段の設定を制御する。本発明の本局面のオーブン温度制御手段は以下の態様を包含することができる。第一に、循環空気温度制御系を有する空気浴オーブン;入口端および出口端を有するある長さの毛細管(該毛細管の出口端は分離カラムの入口端と連結され、また、毛細管の入口端は工程液を受領するための手段を含んで成り、該管は6から400cmまでの完全に伸長された長さを有し;そして、分離カラムおよび毛細管のコイルが空気浴オーブン中に囲まれかつその中の空気に曝露され、該温度制御系はオーブン温度制御モジュールからの制御コマンドに応答する)。第二に、第一の熱伝達表面、分離カラム差込口、およびキャピラリーコイル差込口を有する熱伝導ブロック;その内壁と熱伝導の関係で分離カラム差込口内に配置される分離カラム;ならびに、キャピラリーコイル差込口中に配置される毛細管のコイル(該コイルの外側先端はキャピラリーコイル差込口の内壁と熱伝導の関係にあり、温度制御系はオーブン温度制御モジュールからの制御コマンドに応答する)。ペルティエ型の加熱および冷却装置が該第一の熱伝達表面と熱伝導の関係で提供されることができる。
【0061】
別の局面において、本発明は、高速液体クロマトグラフィー系を用いる混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子の分離を遂げる方法に関する。該系は、マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離カラム;分離カラムに進入する移動相の温度を制御するためのオーブン温度制御手段(該オーブン温度制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し);およびその中に固有のオーブン温度制御ソフトウェアモジュールを有するオーブン温度制御手段と通信するコンピュータを包含する。該方法は、以下のコンピュータ化された段階、すなわちa)予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度を受領すること;b)DNA分子の混合物を、予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度に加熱すること;c)予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度で、変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーを用いて段階(b)の生成物を分析して、その中のいかなるヘテロ突然変異体部位の分離された成分の存在も同定することを包含する。該方法において、予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度は:a)計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度を得るための計算段階;b)予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度を得るための予測段階、の段階により得ることができ;ここで、計算段階は、第一の数学的モデルに従って、計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度を計算することを含んで成り;ここで、予測段階は、第二の数学的モデルに従って、計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度を補正することを含んで成り;ここで、第二の数学的モデルは、計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度との、経験的に決定されたヘテロ突然変異体部位分離温度の比較に基づく。
【0062】
本発明の本局面の一態様において、予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度は、以下の式:T(hsst)=X+m・T(w)により計算され、ここで、T(hsst)は予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度であり、T(w)は、野性型二本鎖DNAの変性された状態と非変性状態との間に選択された平衡が存在する、ソフトウェアにより計算されたかもしくは実験的に決定された温度であり、Xは変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー検出係数であり、そしてmは0と2との間で選択される重み係数である。
【0063】
別の局面において、本発明はコンピュータ化された制御手段を包含する変性高速液体クロマトグラフィー系に関し、該クロマトグラフィー系は、マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離カラム;分離カラムに進入する移動相の温度を制御するためのオーブン温度制御手段(該温度制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し);移動相MIPC分離カラムを指図するための導管手段;オーブン温度制御手段と通信するコンピュータ;コンピュータおよびオーブン温度制御手段と作業連合にあるオーブン温度制御ソフトウェアモジュールを含んで成り、該コンピュータは、混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子の分離のためヘテロ突然変異体部位分離温度をコンピュータ計算するための温度コンピュータ計算ソフトウェアを包含する。該系において、マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離カラムが入口端を包含し、そして、オーブン温度制御手段が:循環空気温度制御系を有する空気浴オーブン;入口端および出口端を有するある長さの毛細管を包含し、該毛細管の出口端は分離カラムの入口端と連結され、また、毛細管の入口端は工程液を受領するための手段を含んで成り、該管は6から400cmまでの完全に伸長された長さを有し;そして、分離カラムおよび毛細管のコイルが空気浴オーブン中に囲まれかつその中の空気に曝露され、該温度制御系はオーブン温度制御モジュールからの制御コマンドに応答する。
【0064】
あるいは、該オーブン温度制御手段は:第一の熱伝達表面、分離カラム差込口、およびキャピラリーコイル差込口を有する熱伝導ブロック;その内壁と熱伝導の関係で分離カラム差込口内に配置される分離カラム;ならびに、キャピラリーコイル差込口中に配置される毛細管のコイルを包含することができ、該コイルの外側先端はキャピラリーコイル差込口の内壁と熱伝導の関係にあり、該温度制御系はオーブン温度制御モジュールからの制御コマンドに応答する。ペルティエ型の加熱および冷却装置が、該第一の熱伝達表面と熱伝導の関係で提供されることができる。
【0065】
なお別の局面において、本発明は、分離されるべき混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子の塩基対長さを受領するための手段、変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーによる該等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子の分離に必要とされるヘテロ突然変異体部位分離温度を計算するための手段を包含するソフトウェアプログラムを提供し、ここで、該ヘテロ突然変異体部位分離温度が、以下の式:T(hsst)=X+m・T(w)により計算され、ここで、T(hsst)はヘテロ突然変異体部位分離温度であり、T(w)は、野性型二本鎖DNAの変性された状態と非変性状態との間に選択された平衡が存在する、ソフトウェアにより計算されたかもしくは実験的に決定された温度であり、Xは変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー検出係数であり、そしてmは0と2との間で選択される重み係数である。
【0066】
別の局面において、本発明は、高速液体クロマトグラフィー系を用いて混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子の分離を遂げる方法に関する。該系は、移動相の溶媒溶液および水性成分の流量を制御するための移動相流量制御手段(該流量制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し);MIPC分離カラム;移動相を移動相流量制御手段からMIPC分離カラムに向かわせるための導管手段;およびその中に固有のソフトウェア移動相流量制御モジュールを有する移動相流量制御手段と通信するコンピュータを包含する。該方法は、(a)混合物中の変性されないホモ二重鎖もしくはヘテロ二重鎖分子の長さを有するDNA分子の塩基対長さの数値を受領すること;(b)非変性条件下で該カラムからの該塩基対長さを有する分子の溶出を遂げることができる溶媒濃度を計算すること;(c)該ヘテロ二重鎖を部分的に変性させるのに有効な条件下で該分離を遂げることができる溶媒濃度および対応する溶媒の勾配の範囲を計算すること;(d)移動相流量制御モジュールに、溶媒濃度および溶媒の勾配の範囲を提供すること;ならびに(e)分離を実施すること、のコンピュータ化された段階を包含し、ここで、移動相流量制御モジュールが、選択されたフラグメントの分離を遂げるのに必要とされる勾配および溶媒濃度を果たすように移動相流量制御手段の設定を制御する。該移動相流量制御手段は、それぞれが流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する自動開放制御を伴う一組の流量制御弁であることができるか、もしくは、その流量設定が流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する一組のポンプであることができる。該方法において、勾配はイソクラチック勾配であることができる。また、該方法において、溶媒濃度を、該塩基対長さを有するDNA分子について計算された%Bの値より下で開始するよう計算し、かつ、該塩基対長さのDNA分子について計算された%Bの値より上で終了するよう計算することができ、ここで、%Bは有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり、ここで、%Bは、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数を有する一次、双曲線、二次もしくは三次の式により計算される。
【0067】
なお別の局面において、本発明は、コンピュータ化された制御手段を包含する変性高速液体クロマトグラフィー系に関する。該クロマトグラフィー系は、移動相の溶媒溶液および水性成分の流量を制御するための移動相流量制御手段(該流量制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し);MIPC分離カラム;移動相を移動相流量制御手段からMIPC分離カラムに向かわせるための導管手段;ならびに移動相流量制御手段と通信するコンピュータ;該コンピュータおよび移動相流量制御手段と作業連合にあるソフトウェア移動相流量制御モジュールを包含し、ここで、該移動相流量制御手段は、それぞれが流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する自動開放制御を伴う一組の流量制御弁であるか、もしくは、移動相制御手段は一組のポンプであって、その流量設定が流量制御モジュールからの制御コマンドに応答し、コンピュータは、混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子の分離のための溶媒の勾配の開始および終了溶媒濃度をコンピュータ計算するための溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアを包含する。該系において、溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアは、該混合物中のホモ二重鎖もしくはヘテロ二重鎖分子の塩基対長さを受領しかつ該塩基対長さを有するDNA分子について計算された%Bの値より下で開始する溶媒濃度を計算するためのソフトウェア手段を包含することができ、かつ、該塩基対長さのDNA分子について計算された%Bの値より上で終了するよう計算され、ここで、%Bは有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり、ここで、%Bは、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数を有する一次、双曲線、二次もしくは三次の式により計算される。
【0068】
さらになお別の局面において、本発明は、分離されるべき混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子の塩基対長さを受領するための手段、MIPCにより該塩基対長さを有するDNA分子を溶出するのに必要とされる溶媒濃度を計算するための手段、ならびに部分的変性条件下で該ヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子を分離するのに使用されるべき溶媒の勾配を選択するための手段を包含するソフトウェアプログラムに関する。溶媒濃度を計算するための手段は、該塩基対長さを有するDNA分子について計算された%Bの値より下で開始する溶媒濃度を計算するための手段を包含し、かつ、該塩基対長さのDNA分子について計算された%Bの値より上で終了するよう計算され、ここで、%Bは有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり、ここで、%Bは、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数を有する一次、双曲線、二次もしくは三次の式により計算される。該ソフトウェアの一態様において、%Bは、以下の式:
【0069】
【数22】
【0070】
式中
p1、p2およびp3は、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される。別の態様において、%Bは、以下の式:
【0071】
【数23】
【0072】
式中
【0073】
【数24】
【0074】
sは勾配の傾きであり;
d、void、p4、p5、p6、p7およびp8は、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される。
【0075】
(発明の詳細な記述)
本発明の目的は、広範囲のMIPC系および方法、ならびにそれに関連するコンピュータプログラムもしくはソフトウェアで提供される。該系は、本発明の広範なMIPC分離方法のためのサンプル選択、移動相の勾配の選択および制御、カラムおよび移動相の温度制御ならびにフラグメント収集の自動化されたオプションを提供する。より早期の同時係属中かつ共通に譲渡された米国特許もしくは特許出願(米国特許第5,772,889号;同第5,997,742号;同第5,972,222号明細書;1998年10月30日に出願された米国特許出願第09/183,123号;1998年10月30日に出願された同第09/183,450号;1999年7月9日に出願された同第09/350,737号;1998年5月18日の同第09/080,547号明細書(それらのそれぞれは引用することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる))に記述されたとおり、MIPC分離方法は、DNAフラグメントの大きさに基づく分離、突然変異の検出、DNAフラグメントの精製、PCR過程のモニタリングおよび他の新規方法を遂げるのに適用することができる。本発明は、複雑な分離方法を達成するための該系の使用を助長する、これらの手順の多くを自動化する系およびソフトウェアに向けられる。
【0076】
図1は、本発明の一態様による該系の図解的配置である。複数の容器を、移動相を構成する溶液溜めとして使用することができる。例えば、容器2は、対イオン剤(例えば酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA))の水性溶液のような移動相の水性成分を含有することができ、そして、容器4は、有機(駆動)溶媒を含む対イオン剤の水性溶液(例えばアセトニトリルを含むTEAA)を含有することができる。
【0077】
本発明の記述を単純化する目的上、そして制限としてでなく、容器2中の水性溶液を溶液Aと称することができ、また、容器4中の有機溶媒を含有する溶液を溶液Bと称することができる。補助液体(例えば補助溶媒)を容器6中に保持することができる。これらの溶液を混合して、分離の間に移動相中の有機溶媒の選択された濃度を達成する。これらの溶液の他の例は、本明細書の実施例、および上に示された共通に譲渡された特許に提供される。容器は、対イオン溶液輸送管8、溶媒溶液輸送管10、およびそれと連絡しかつ脱気装置14に至る補助液体輸送管12のようなそれぞれの輸送管を有する。
【0078】
ポリヌクレオチドという用語は、リン酸残基を介して1個のリボース(もしくはデオキシリボース)から別のものに連結される不定の数のヌクレオチドを含有する直鎖状ポリマーと定義する。本発明は、二本鎖もしくは一本鎖のDNAもしくはRNAの分離で使用することができる。本発明の記述を単純化する目的上、そして制限としてでなく、二本鎖DNAの分離を本明細書の実施例で記述することができ、全部のポリヌクレオチドが本発明の範囲内に包含されることを意図していることが理解される。
【0079】
脱気装置14は、溶解された気体を液体から除去する。適する脱気装置の一例はデガスイット(Degassit)モデル6324である。溶解酸素の除去はとりわけ重要である。その存在は、系の構成部品中の鉄もしくは他の酸化可能な金属を酸化する危険を増大させ、そして従って移動相液体中に対応する陽イオンを導入するからである。
【0080】
カラム浄化溶液が浄化溶液容器16中に含有され、これは同様に、それと連絡して脱気装置14に至る浄化溶液輸送導管18を有する。本態様において、浄化溶液は容器16が脱気装置および注入弁54より上に上昇される場合に重力圧により流れることができる。あるいは、図2に示されるようなポンプ110を、浄化溶液の流れを達成するために提供することができる。
【0081】
本発明の系は、移動相の溶媒溶液および水性成分の流量を制御する慣習的な移動相流量制御手段を組込む。一態様において、移動相流量制御手段は、それぞれが下述されるところのコンピュータ制御下に自動開放制御をもつ、一組の流量制御弁を含んで成る。別の態様において、移動相流量制御手段は一組のポンプを含んで成り、その流量設定は下述されるところのコンピュータ制御に応答する。
【0082】
図1に具体的に説明される系は、一組の流量制御弁を包含する移動相流量制御手段の一態様を利用する。脱気装置14から至る、脱気された対イオン溶液導管20、脱気された溶媒溶液導管22、および脱気された補助液体導管24が、それぞれの水性成分比例弁26、溶媒溶液比例弁29、および補助液体比例弁30と連絡する。これらの比例弁の設定は、それらに関連したステッピングモーターのような弁作動器により設定かつ変更され、また、これらの弁作動器は、下により詳細に記述される移動相流量制御ソフトウェアモジュールからのコマンドに応答して所望の一組の設定を確立するよう応答する。流量制御弁26、28および30は、移動相の溶媒溶液および他の成分の流量を制御する移動相流量制御手段の一態様を含んで成る。これらの弁の設定は、インジェクタ弁および分離カラムを通る液体(補助溶媒、溶媒溶液、など)の比を制御する。導管32、34および36は、それぞれの比例弁26、28および30からポンプ38の取込みまで至る。
【0083】
浄化溶液輸送導管31は浄化溶液弁40に至る。任意の浄化溶液導管42が弁40から至りかつポンプ38の入口と連絡する。弁33は導管42を通る流れを制御する。
【0084】
弁26、28および30の開口部が、移動相(MIPCによる大きさに基づくDNA分離は溶媒濃度の関数であるため本系の最も重要な部分)内の有機溶媒および他の成分の相対比を正確に設定する。多様なDNAフラグメント分離方法に関して記述されるであろうとおり、時間の関数としての有機溶媒の勾配の傾きが分離過程の間に変えられ、そして最も決定的な相は、非常に正確な勾配、もしくはいくつかの過程については、高度に正確なイソクラチック(一定の溶媒濃度)組成を必要とするかもしれない。弁26、28および30の設定は、慣習的弁制御装置へのシグナルにより遠隔で設定することができる慣習的な弁作動器により確立される。下により詳細に記述されるであろうとおり、本発明の装置制御ソフトウェアはコンピュータに制御される命令を提供し、それらは系の作動の間の適切な時点で正確な流量値への弁26、28および30の設定を確立する。
【0085】
同様な様式で、本発明の装置制御ソフトウェアは、ポンプの切/入状態およびポンプの圧もしくは流速の設定のようなポンプ38の作動上のパラメータを確立するためのコンピュータに制御される命令を提供する。
【0086】
ポンプ流出導管44はインラインミキサー46と連絡し、成分の徹底的な混合のためミキサー46を通る液体の流れを指図する。混合された液体の流出導管48は、任意のガードカラム50と連絡して、混合された液体を処理してDNAフラグメントの分離を妨害するとみられる多価金属陽イオンおよび他の汚染物質を除去する。ガードカラム50は、慣習的イオン交換による多価金属陽イオンの除去のためにナトリウムもしくは水素の形態の陽イオン交換樹脂を含有することができる。導管52はガードカラムの出口および浄化溶液インジェクタ弁54の入口と連絡する。浄化溶液供給導管56は弁40を浄化溶液インジェクタ弁54と連結し、そして廃棄出口導管58は廃液溜めに至る。導管60は弁54からサンプル注入弁62に至る。
【0087】
サンプルアリコートセレクター64は、サンプル導管66を通ってインジェクタ弁62と連絡する。廃棄導管68はインジェクタ弁から至りそして廃棄液体を除去する。サンプルアリコートセレクター64についての詳細は図3に関して下により詳細に提供し、また、浄化溶液ならびにサンプルインジェクタ弁54および62、ならびにそれらの作動についての詳細は、図4−8に関して下により詳細に提示する。
【0088】
インジェクタ弁62において、サンプルが、導管60から弁を通過する溶媒および担体液の流れに導入される。サンプル導管70は、インジェクタ弁62の出口および空気浴オーブン72中のカラムプレフィルター74と連絡する。毛細管コイル76はプレフィルター74および分離カラム78の入口と連絡する。キャピラリーコイル76の伸長された長さは、加熱されたオーブン空気からコイルを通過する液体に十分な熱を進ませて、液体を選択された温度の±0.05℃以内にする。オーブン72は、プレフィルター74、コイル76および分離カラム78中のこの温度の均一性を確立する。
【0089】
分離カラム78は、MICP過程により対イオンの存在下でのDNAフラグメントの大きさに基づく分離を遂げる独特の分離表面を有するビーズで、慣習的なカラム構築物中に充填される。分離過程およびビーズについての詳細は下に詳細に記述する。塩基対長さの大きさで分離されたDNAフラグメントを含有する移動相の流れが、導管80を通り分離カラム78から出る。
【0090】
導管80は検出器84と連絡する。検出器は、液体の移動相中のDNAフラグメント構造のUV透過を測定する慣習的なUV透過装置であることができる。吸光度は、試験されている液体中のDNAフラグメントの濃度の関数である。
【0091】
あるいは、DNAを蛍光マーカーで標識することができる場合、検出器は、該蛍光マーカーに最も適切な周波数で発射レベルを検出することにより液体中の該マーカーのレベルを継続的に測定することができる蛍光検出器であることができる。その中のDNAフラグメントの濃度の関数である液体の一特徴を継続的に測定することが可能ないかなる検出系も適し、かつ、本発明の範囲内にあることを意図していることが容易に明らかであろう。導管86は試験された液体を除去する。適する検出器の例は、日立から入手可能なL−7420 UV可視検出器およびL−7480蛍光検出器を包含する。検出器からの電気的出力は、好ましくは、A/D変換器によりディジタルの形態に変換され、そしてコンピュータ500中のディスクドライブのようなディジタル記憶装置に標準ディジタル形式で記録される。
【0092】
その後、移動相が、図14−24に関して下により詳細に記述されるフラグメントコレクタ88に進む。フラグメントコレクタ88において、分離されたDNA画分を含有する移動相の選択された部分を、後の処理もしくは分析のためバイアルに収集する。収集されない画分は、廃棄導管90を通って除去される。
【0093】
該DNA分離過程は多価陽イオンの存在により損なわれる。上の記述において、液体流系は一連の導管として記述される。該導管は、多価陽イオンの液体への導入を回避するよう選択された毛細管である。好ましい毛細管の素材はチタンおよびPEEKである。類似の理由から、系の他の構成部品は好ましくはチタンもしくはPEEKから作成されるか、またはそれらを酸化から保護しかつ液体への多価陽イオンの導入を予防するようにPEEKで被覆された、液体に露出される表面を有する。ステンレス鋼もまた使用することができるが、但し、それは全部の酸化された表面素材を除去するよう処理されており、また、ステンレス鋼表面を接触する溶液は溶解酸素を含まない。
【0094】
移動相流量制御手段の別の態様を具体的に説明する図2は、移動相組成を確立するためのポンプ系の部分的図解である。本系は、下述される溶液AおよびBのような水性成分および溶媒溶液の比を制御するのに比例ポンプに頼る。比例ポンプ92、94および96の入口は、それらのそれぞれの供給導管98、100および102によって脱気装置14と連絡し、また、それらのそれぞれの出口導管104、106および108によってインラインミキサー46と連絡する。これらの比例ポンプの作動速度は、下により詳細に記述される流量制御ソフトウェアモジュールにより、それを通る流速に較正されかつ制御される。これらの比例弁の設定が、インジェクタ弁および分離カラムを通る液体(補助溶媒、駆動溶媒、など)の液体流速および比を制御する。
【0095】
ポンプ110は、任意の導管112を通って系に浄化溶液を供給することができる。任意の導管107は導管112から至り、そしてインラインミキサー46と連絡する。弁111は導管107を通る流れを制御する。
【0096】
本発明での使用に適する移動相制御手段の例は、日立から入手可能なプログラム可能な二連ピストンポンプモデルL−7100、およびウォーターズ(Waters)から入手可能なモデル2690分離モジュールを包含する。
【0097】
図3は、MIPC系で使用されるオートランプラーサブシステムの図解である。本オートサンプラーは、マルチウェル113中の選択されたウェルもしくはその中で支持されるバイアル(例えば微小遠心管)から、予め決められた容量を有するアリコートを取り出す。マイクロウェルプレートは、標準的な96穴マルチウェルプレートのような、各ウェルについて正確な寸法位置を有する、いずれかの予め決められた数のウェル114を有することができる。サンプリング針115はサンプリングキャリジ116上に支持される。サンプリングキャリジ116は、垂直支持体117上の垂直の動きのため据え付けられた針支持体118を有する。垂直支持体117はキャリジ116上の側方の動きのため据え付けられる。支持体117の側方の動きは、選択されたウェルもしくは注入弁120のインジェクタ口119の上に針を配置する。可撓性の管123は、一方の端で針115と、および他方の端でシリンジ針124と封止嵌合で据え付けられる。シリンジ針124はシリンジ筒125の内部体積と連絡する。ピストン126はシリンジ作動器ロッド128上に据え付けられ、そして筒125の内壁と封止嵌合を形成する。作動においては、シリンジ作動器ロッド128の垂直の上向きの動きが筒125中の液体を置き換え、また、シリンジ作動器ロッド128の垂直の下向きの動きがシリンジ中に液体を引く。ロッド128は、ガイド要素132に沿った動きのため支持されるクランプ130に取付られる。弁122が針124と管123との間の連絡を提供するように配置される場合、ピストン126の下向きの動きが、サンプルをウェル114から針115中に引く。針115がインジェクタ弁口119の上に配置される場合、ピストン126の上向きの動きが、サンプルを針115から口119中に放出する。
【0098】
導管131は弁122から浄化溶液溜め121まで伸長する。弁122が針124と導管131との間の連絡を提供する位置にある場合、ピストン126の下向きの動きが浄化溶液を針中に引く。針115がインジェクタ口119の上に配置されかつ弁122が針124と導管123との間の連絡を提供するよう配置される場合、ピストン126の上向きの動きが浄化溶液をインジェクタ口119中に放出する。適するオートサンプラーの例は、日立モデルL−7250プログラム可能オートサンプラー、およびHTS PAL高スループットオートサンプラー(島津、メリーランド州コロンビア)を包含する。
【0099】
オートサンプラーの動作は以下の制御の連続を包含する。すなわち
1.サンプリング針115を、選択されたウェル114の中央のプログラムされたX−Y座標に動かす。
2.サンプリング針115をプログラムされた距離下げて、針を選択されたウェル114中の液体中に下げる。
3.シリンジロッド128の下向きの垂直の動き、予め決められた容量のサンプルを針115中に引くプログラムされた距離。
4.マイクロタイタープレート113の上部の上のある距離まで針115を上げること。
5.針115をインジェクタ口119の位置に動かすこと。
6.針115をインジェクタ口119まで下げること。
7.サンプルを針115からインジェクタ口119中に追い出す、シリンジロッド128の上向きの垂直の動き。
8.針124を浄化溶液121に連結する弁122の動き。
9.浄化溶液をシリンジ中に引くピストン126の下向きの動き。
10.針124を導管123に連結する弁122の動き。
11.浄化溶液を注入口119中に放出するピストン126の上向きの動き。
12.次のDNA分離の開始で、段階1−11を反復する。
【0100】
図4は、MIPC系での使用のためのサンプル注入弁および浄化溶液注入弁の構造を示す図解である。同一の弁構造を、サンプル注入および浄化溶液注入の双方に使用することができる。注入弁150はステッピングモーター(示されない)のような慣習的な弁モーターにより作動される六口の回転弁である。例示的弁は、レオダイン(RHEODYNE)(カリフォルニア州コタチ)から入手可能なラブプロ(LabPRO)弁を包含する。該弁は入口および出口導管に永続的に連結された6個の外口を有する。外口152は、分析されるべきサンプルを受領するための注入ライン154と連結される。外口156は分離カラム78(図1)と連絡するカラム供給導管158と連結される。外口160はポンプ38(図1)の出口と連絡する入口導管162と連結される。外口164は廃棄導管166と連結される。反対の出口168および170は、サンプルループ172の反対のサンプル入口および出口端と連絡する。浄化溶液の注入の間、弁が一区画の浄化溶液を溶媒の流れに注入して、分離カラムおよび注入の下流の他の構成部品を再生および浄化し、蓄積された残渣および分析前から残存するいかなる残余のDNAも表面から除去する。
【0101】
外口と内的通路との間の連結、および図1中の浄化溶液インジェクタ弁54およびサンプルインジェクタ弁62でのそれらの作動を、図5−8に記述する。下の記述はサンプル注入弁62について提示されるが、しかし、同一の関係および作動が、注入されている液体およびそれらの供給源を除いて、浄化溶液注入弁に当てはまる。
【0102】
図5および6は充填されたループ注入(より多量のサンプル(もしくは浄化溶液)が注入されるはずである場合に使用される様式)のための弁の使用を記述する。図5はサンプル負荷位置の注入弁の図解であり、また、図6は注入位置の注入弁の図解である。図5に示される負荷位置において、弁の第一の内的通路174が、ループ172の第一端176をサンプル注入ライン154と連結し、また、第二の内的通路178は、ループ172の第二端180を廃棄導管166と連結する。第三の内的通路182は、ポンプ出口導管162を分離カラム78への導管158と連結する。注入口154からのサンプルが通路174を通ってサンプルループ172に導入される際に、ループ172中のいかなる剰余分もしくは液体も通路178を通って廃棄導管166に排出される。同時に、移動相溶液が、ポンプ導管162から分離カラム78に、第三の導管182を通って流れる。
【0103】
図6に示される注入位置への矢印150の方向の弁の回転が、内的通路を動かして、入口および出口導管との異なる一組の連結を確立する。通路179は、ループ172の一端180を分離カラムに至る導管158と連結し、また、通路175は、ループ172の他端176をポンプに至る入口導管162と連結する。ポンプからの移動相溶液が通路175に進入しそしてループ172を通過して、サンプル溶液をカラムに至る導管158に排出し、そしてループをすすぎ続け、いかなる残渣もカラム導管158中に運搬する。そのうちに、通路183がサンプル注入導管154を廃棄に連結し、所望の場合は通路183を通る浄化溶液の通過を可能にする。この手順は、分離カラム78(図1)に至る導管への測定された容量のサンプル溶液の信頼できる注入を提供し、該液体は、それが分離カラムに達する前に、プレフィルター74および温度調節コイル76を通過する。
【0104】
図1−8に関して上述されたところの多口弁を使用する改良されたカラム浄化系の特徴は、共通に所有される同時係属中の1999年4月2日に出願された米国特許出願第09/285,331号明細書(その完全な内容はこれにより引用することにより組み込まれる)に、より詳細に記述される。
【0105】
図7および8は、図5および6に関して記述されたと同一の作動の連続を、しかしサンプル溶液もしくは廃棄液体の部分的ループ注入を伴い示す。
【0106】
本発明の系は、分離カラムおよびカラムに進入する移動相の温度を制御するためのオーブン温度制御手段を組込む。
【0107】
図9および10は温度制御手段の一態様を具体的に説明する。図9はHPLC DNA分析装置カラムオーブンの工程区画(process compartment)の前面図であり、また、図10は図9に示されるHPLC DNA分析装置カラムオーブンの平面図である。図9および10に示される態様の工程区画は、空気廃棄口202が配置される背壁200により加熱区画から分割される。熱電対もしくはサーミスタのような温度センサーを囲む金属棒204が口202中に配置されて、該口を通過する空気の温度を測定する。毛細管206はサンプルインジェクタ(示されない)からプレフィルター208に至る。プレフィルター208は、入ってくる液体から汚染物質を除去する、米国特許第5,772,889号明細書に記述されるようなインラインフィルターもしくはガードカートリッジである。毛細管の長いコイル210は、それから移動相液体を受領するためのプレフィルター208と連絡する入口端を有する。長いコイル210は、分離カラム214の入口端212と連絡する出口端を有する。分離カラム214は、好ましくはMIPC分離媒体を含有する。出口管216は分離カラム214の出口端218から検出器84(図1)に至る。コイル210はチタンもしくはPEEKのようなDNAに適合性の多価陽イオンを含まない管から作成される液体加熱コイルである。使用される管の長さおよび直径は、それを通過する液体移動相が処理区画(processing compartment)中の空気の平衡温度に達することを可能にするのに十分であるいずれかの長さである。6から400cmまでの管の長さ、および0.15から0.4mmまでの管の直径が通常十分である。管210の長さは該系により達成される成分の分離を低下しないため、該長さは工程液の効果的な加熱を達成するのに必要とされる長さに基づいて選択することができる。
【0108】
図10を参照すれば、処理区画220からの空気は、温度調節のためのヒーター/ファン系222を通って壁200中の開口部202を通過する。加熱区画224により受領される調節された空気は、側壁227とオーブン外壁228との間の空間により規定される通路226に沿って処理区画220に再循環する。図9および10に示される態様中の加熱コイルは、±0.2℃の範囲内までの温度の正確さを提供し、そして5℃の温度変化について5分より下、および1℃までの温度変化について2分より下まで、温度設定の間の温度平衡時間を短縮する。
【0109】
図11および12は、温度制御手段の別の態様を具体的に説明する。図11は小型のカラムヒーターの端部図であり、また、図12は図11の線A−Aに沿って採られた断面図である。本態様は、系の構成部品へのおよびそれからの熱の直接の金属から金属への伝導に頼り、そして、温度の変化および正確さを達成する空気浴に依存しない。本態様は2カラム系について示されるが、とは言え所望の場合は単一カラムに使用することができる。それは、系の構成部品を受領するよう大きさおよび形状を定められた差込口を有する熱伝導ブロック(230、232)を含んで成る。フィルター空隙もしくはプレフィルター差込口(234、236)は、プレフィルター(238、240)を受領するよう大きさを定められた内表面を有し、かつ、その外表面と熱伝達接触を確立する。分離カラム差込口(242、244)は、それぞれの分離カラム(246、248)、および毛細管をそれぞれの分離カラムに連結する分離カラム継手(250)(1個が図12に示される)を受領するよう大きさを定められた内表面を有する。差込口(242、244)は、ブロック(230、232)の内熱伝達表面と、その中で受領される分離カラム構成部品の間の熱伝達接触を確立するよう大きさおよび形状を定められる。キャピラリーコイル差込口252(1個が図12に示される)は、毛細管254(1個が図12に示される)のコイルを受領しかつその外表面との熱伝達接触を確立するような形状にされる内表面を有する。これらの図に示される態様において、差込口(234、236)および(242、244)は、共通の面に存するおおよそ平行な中心軸を伴う筒状の穴であることができる。他の形状が等しく適しかつ全部の形状が本発明の範囲内にあると考えられることが、当業者に容易に明らかであろう。
【0110】
温度センサー差込口(256、258)が熱伝導ブロック(230、232)中に提供される。熱伝導の関係にある連結管262を受領するためのキャピラリー差込口通路260もまた加熱伝導ブロック(230、232)中に提供される。キャピラリーコイル差込口252が、本図で、それらの軸が差込口(234、236)および(242、244)の軸に垂直な筒状の空隙であることが示される。場合によっては、伝導金属筒(示されない)を、金属ブロック加熱アセンブリとコイル中の液体との間の熱交換面積を増大させるため、その内表面との熱伝導接触でキャピラリーコイル内に配置することができる。カプトン(KAPTON)抵抗ヒーターもしくは他の型の加熱装置264は、熱伝導ブロックに熱を伝達するように、加熱ブロック(230、232)の表面266と268との間にかつそれらと熱伝導接触で配置される。冷却用放熱器(270、272)は、それから熱を除去するように、熱伝導ブロック(230、232)の反対の冷却表面(274、276)と熱伝導関係で配置される。冷却ファン278および280は冷却用放熱器270および272と熱除去関係にあり、そしてそれからの熱除去を加速するよう起動される。
【0111】
熱伝導ブロック230および232、ならびに冷却用放熱器270および272は、アルミニウムもしくは銅のような高い熱伝導性を有する素材から作成されるが、とは言え、それらは、鉄金属のような他の熱伝導性固体、もしくは必須の熱伝導性を有するいずれかの他の固体材料から作成することができる。ヒートパイプもまた冷却用放熱器として使用することができる。
【0112】
毛細管はPEEKもしくはチタンから作成することができるが、とは言え最大の熱伝達効率にはチタンが好ましい。本改良された熱伝達で、キャピラリーコイルは約5cmの完全に伸長された長さを有することができるが、とは言え10cmの最小のコイル長さが好ましい。PEEK管のより長いコイルが、チタンの毛細管と同一の熱伝達を達成するのに必要とされるとみられる。
【0113】
図11および12に示される系は鏡像の2系を含んで成る。単一のカラムに系の半分が十分であるとみられ、かつ本発明の範囲内に包含されることを意図していることが容易に明らかであろう。差込口の位置、整列および間隔は本発明の決定的な特徴でない。小型かつ熱伝達効率の良い結果を提供するいかなる整列および形状も、本発明の範囲内に包含されることを意図している。
【0114】
図11および12に示される本発明の態様は、ヒーターの制御に対しより応答性であり、一温度基準から別のものへの迅速な変化を提供し、そして設定温度の±0.5℃以内の温度の正確さを維持する、小型のヒーターを提供する。加熱ブロックと加熱されている要素との間の、金属と金属の接触で得られる熱伝達速度は、空気浴系で得ることができるよりはるかにより大きく、変更された温度に対するより迅速な応答およびより大きな温度の正確さを提供する。それはまた、より短い毛細管コイルでの工程液温度の調節も可能にする。
【0115】
温度制御手段のなお別の具体的説明において、図13は、本発明の好ましいペルティエ型のヒーター/冷却器の態様の図解を示す。加熱ブロック282は、所望の温度に達しかつ維持するのに必要とされる加熱もしくは冷却のためのペルティエ型加熱要素(示されない)と伝導接触にある。チャンネル284は、プレフィルター288と熱伝導関係にある内表面286を有するプレフィルター受容器である。チャンネル290は、分離カラム298の継手294および端ナット要素296と熱伝導関係にある内表面292を有するカラムおよびカラムガード受容器である。毛細管300はプレフィルター288ならびにサンプルおよび溶液供給源(示されない)と連絡する。分離カラム288の出口からの毛細管302は分析装置84(図1)と連絡する。毛細管304はプレフィルター288の出口端を継手294と連結し、それは順に分離カラム298と連絡する。毛細管304は、加熱ブロック282のチャンネルの迷路様の形状中で受領されて、増大されたキャピラリー長さ、および毛細管304と加熱ブロック282との間の表面接触を提供する。迷路および管の形状は、チャンネルあたり1個以上の列(pass)の付加的なループおよびキャピラリーの配置を包含する、十分なキャピラリー長さおよび表面接触を提供するいかなる形状であることもできる。毛細管304はPEEKもしくはチタンであることができ、その高い熱伝導性のためチタンが好ましい。加熱ブロック282はいずれかの熱伝導性の金属であることができる。アルミニウムもしくは銅がそれらのより高い熱伝導性のため好ましいが、とは言え鋼のような鉄金属を使用することができる。ペルティエ型ヒーターは、ペルティエ型熱循環器(thermocycler)で使用される系のような、慣習的な温度および制御系(示されない)で制御される。図11および12で示される態様でのように、ペルティエ型の加熱されたブロックにより達成される温度の正確さは±0.5℃である。
【0116】
図9−13に関して上述された、改良された空気浴オーブンおよび固体ブロック加熱系の特徴は、共通に所有される同時係属中の1999年4月19日に出願された米国特許出願第09/295,474号明細書(その完全な内容はこれにより引用することにより組み込まれる)に、より詳細に記述される。
【0117】
図14は、本発明の好ましいフラグメントコレクタ348の透視図であり、図15はその前面図であり、そして図16はその端部図である。これらはX軸の動きの制御系の詳細を具体的に説明する。フラグメントコレクタ350は、制御部ハウジング352、サンプルトレイ支持体354および一吹き(puff)制御部ハウジング356を有する。ピンチ弁358が、液体の流れを終了させるために制御部ハウジング352の前に据え付けられる。マルチウェルプレート360はペルティエ型の冷却された冷却パッド362上に支持される。フラグメント分注器364が分注器支持キャリジ366上に支持される。分注器支持キャリジ366は、Y軸の動きの制御部368上でY軸の動きについて支持される。Y軸の動きの制御部368は、溝穴370を通って、図17に示されるX軸の動きの制御系372まで伸長する。X軸およびY軸の動きの制御系は、その中に画分が分注されるはずであるプレート360中のウェルの中心軸に対応するX−Y座標に分注器支持体366を動かし、画分が分注されるまで分注器をこの位置で維持し、そしてその後、画分が分注されるはずである次のウェルの中心軸に対応するX−Y座標に分注器を動かす。
【0118】
図17は、フラグメント分注器のX軸の動きについてウォーム歯車装置駆動アセンブリの詳細を示すために前面パネルが除去された、図15のフラグメントコレクタの部分的前面図である。ガイドロッド374が、左および右支持パネル376および378によりその端部で支持される。支持パネル376および378は水平の支持プレート380上に据え付けられる。外にねじを切られたウォーム歯車装置382が、左および右支持パネル376および378上に支持された慣習的ベアリング(示されない)上のその中心軸の周りの回転のため据え付けられる。右支持パネル378上に据え付けられたステッピングモーター384は車軸386を有し、その上に第一の駆動プーリー388が据え付けられる。第二の駆動プーリー390は、ウォーム歯車装置382上で、第一の駆動プーリー388と整列された位置に据え付けられる。駆動ベルト392がプーリー388および390を嵌合して、モーター車軸386の回転運動をウォーム歯車装置382に移す。
【0119】
Y軸の動きの制御部368はX軸の動きキャリジ394(図17)上に支持される。X軸の動きキャリジ394は、ウォーム歯車装置382の外的ねじ山を嵌合する内側にねじを切られたボア396を有する。X軸の動きキャリジ394中のチャンネル398は、X軸方向の滑る動きのためのガイドロッド374と滑り嵌合のため配置される。ガイドロッド374は、ウォーム歯車装置382が回転する場合にウォーム歯車装置の軸の周りの回転に対してX軸の動きキャリジを安定化する。ステッピングモーター384の段階状の起動は、ウォーム歯車装置382の段階状の回転に移され、X軸の動きキャリジをX軸に沿って左もしくは右に、画分が分注されるはずであるウェルのX軸座標と整列して分注器を配置する位置まで動かす。
【0120】
図18は、フラグメント分注器のY軸の動きのための駆動アセンブリのモーターおよびウォーム歯車装置アセンブリの部分図である。Y軸ステッピングモーター400はX軸の動きキャリジ394の支持表面402上に支持される。Y軸ウォーム歯車装置404はステッピングモーター駆動装置406上に据え付けられる。Y軸ウォーム歯車装置404は外鞘408中に部分的に囲まれる。外鞘408はステッピングモーター400のハウジングの表面410上に据え付けることができるか、あるいは、それはキャリジ394に取付けることができる。溝穴370は前面パネル416の反対の縁412および414により規定される。ガイド418は、鞘408およびウォーム歯車装置404と軸方向に平行な整列で鞘408の下面上に据え付けられる。
【0121】
図19は、図17および18に示される駆動アセンブリの端部図である。これはフラグメント分注器のY軸の動きのための駆動アセンブリのさらなる詳細を示す。鞘408は、ウォーム歯車装置404のねじを切られた嵌合表面409を露出させる側方開口部を有する。分注器支持体416は、ガイド418および適合された分注器支持溝420の相互嵌合により支持される。ガイド418の内側に勾配をつけられた縁は、支持溝420の対応して外側に勾配をつけられた反対の縁を嵌合する。分注器支持体366は、ウォーム歯車装置404の嵌合表面409を嵌合する、溝をつけられた表面422を有する。ウォーム歯車装置404の回転は分注器支持体366のY軸の動きを遂げる。ガイド418との溝420の嵌合は、分注器支持体366が回転する場合に、それをウォーム歯車装置404の軸の周りの回転する動きに対して安定化する。ステッピングモーター400の段階状の起動は、ウォーム歯車装置404の段階状の回転に移され、分注器支持体366を、Y軸に沿って後方にもしくは前方に、画分が分注されるはずであるウェルのY軸座座標と整列して分注器を配置する位置まで動かす。ガイド418および溝420の適合された嵌合表面が、ガイド、ならびにガイドおよび溝の嵌合の安定化機能を提供する他の配置であることができることが、当業者に容易に明らかであろう。適するフラグメントコレクタの例は、トランスゲノミック(Transgenomic)から入手可能なモデルASW100、およびギルソン(Gilson)(ウィスコンシン州ミドルトン)からのモデルFC 203/204フラクションコレクタを包含する。
【0122】
図20は標準的な96穴マルチウェルプレートの平面図である。プレート424はサンプルウェル426を有し、各ウェルの中心軸は、次の隣接するウェルの中心軸から、XおよびY軸に沿った正確に反復される間隔を有する。ウェルの数およびウェルの間隔は所望のいずれかの値を有するよう選択することができる。ウェルの形状、大きさおよび分布は、例えば96、384および1536穴マイクロタイタープレートについて標準化することができ、そしてこれらのそれぞれもしくは全部を本発明のフラグメントコレクタとともに使用することができる。ウェルは示されるとおり使用することができるか、または、それらは、個別のサンプルバイアルの内張り、もしくはマイクロタイタープレートのウェルの内側寸法に対応する外側寸法を有するサンプルバイアルを含有する慣習的な上置き板状内張りの使用により、サンプルの汚染から保護することができる。
【0123】
図21は、本発明の空気一吹き(air−puff)分注器の一態様の図解である。該分注器の特徴は、同時係属中の共通に譲渡される1998年8月28日に出願された米国特許出願第09/143,456号明細書(その完全な内容はこれにより引用することにより組み込まれる)に記述される。加圧ガスが、加圧ガスの供給源(示されない)から導管430を通り一吹き弁428にフィードされる。導管432は一吹き弁428およびサンプル分注器434と連絡する。導管80は図1に示される分離系および分注器434と連絡する。一吹き弁428は、制御部から作動する弁開放および弁閉鎖シグナルを受領するための連絡ライン438によりフラグメントコレクタ制御部436と連結される。サンプルがマルチウェルプレート424中のウェルもしくはバイアルに分注されるはずである場合に、弁開放シグナルが一吹き弁428に与えられ、また、弁閉鎖シグナルは、サンプル収集が完了した場合、もしくはバイアルが一杯になった場合のいずれかより早いほうで、一吹き弁428に与えられる。収集制御部436は、例えば連絡ライン440、442および444により受領されるデータおよび命令に応答して、弁開放および弁閉鎖シグナルを提供する。
【0124】
図22は、一吹き弁428が閉鎖された位置にある場合のその要素を示す、図21の空気一吹き分注器の態様の拡大断面図である。サンプル供給導管80が分注器434の湾曲した通路446の入口端と連絡する。廃棄への導管90は湾曲した通路446の出口端と連絡する。湾曲した通路446の中央448は、該通路中の開口部を通って空気一吹き導管432と連絡する。空気一吹き導管432は、湾曲した通路446との連絡にその出口を配置するよう位置を定められた、分注器434の筒状のくぼみ450中で受領される。湾曲した通路446の中央部分は、分注通路452と連絡するさらなる1個の開口部を有する。一吹き弁428が閉鎖される場合、サンプル液は導管80、中央通路446を通り、そして廃棄導管90に進む。分注通路はキャピラリーの大きさを有し、従ってこの通路中の液体は、一吹き弁428が閉鎖される場合に静的である。
【0125】
図23は、一吹き弁428がサンプルの液滴をマルチウェルプレートの1個のウェル中に排出するよう開放される場合の、図22に示される分注器先端の拡大断面部分図である。本図において、サンプルは入口導管80を通って流れ続ける。一吹き弁428が開放される場合、一吹きの空気が導管432を通って湾曲したチャンバー446の中央部分448に進み、チャンバー448中の圧を増大させ、そして通路452の先端454から一滴451の液体をウェル426中に排出する。一吹き弁428は、迅速な一連のバーストを創製するよう開放および閉鎖することができ、サンプル収集が完了するかもしくはウェル426がいっぱいになるかのいずれかまで、ウェル426中に一連の液滴を排出する。
【0126】
図24は、出口ライン中の流れの制限を伴う本発明の分注器先端の代替の一態様の断面図である。それを通ってサンプル画分を含有する移動相が突出先端474中の突出しチャンバー472に至る移動相入口導管470。突出しチャンバー472は出口廃棄導管476と、および液滴突出し口478はキャピラリーの大きさの液滴形成開口部480と連絡する。開口部480から下落する液滴482はサンプルバイアル(示されない)中に収集される。制限作動器486を有する流れ制限484が出口導管476中に配置される。制限作動器は慣習的ソレノイドであることができる。制限作動器486および制限484へのシグナル電圧は、導管476を通る流れ中に所望の程度の制限を提供するよう構築することができる。流れの制限はピンチ弁、ゲート弁などを包含するいずれかの調節可能な貫流弁により達成することができることが当業者に容易に明らかであろうし、また、本発明は、所望の程度の制限を提供する全部の調節可能な制限弁の使用を包含することを意図している。
【0127】
図25は、本発明の慣習的検出器、中央制御部および液滴の大きさ制御系の組み合わせの図解である。ポリヌクレオチド画分を含有する移動相の流れが検出セル492まで導管490を通過する。光源494はセル492を通って光を向かわせる。セルから発射される光は検出器496により収集かつ測定され、出口電圧を生じさせ、これは選択された波長での透過の関数である。268nmの波長を有するUV光が、ポリヌクレオチドレベルの測定に慣習的に使用される。ポリヌクレオチドがそれに結合された蛍光部分を有する場合、検出器は、該蛍光部分の主たる発射波長に合致する波長で発射を測定する蛍光検出器であることができる。
【0128】
検出器496からの出力電圧シグナルは、ライン498により中央制御装置500にフィードされ、ここでシグナルが増幅かつ分析される。測定セル492を出る移動相の流れは、導管504により液滴形成装置502に向けられる。本態様において、液滴形成装置502は例えば図21、22および23においてより詳細に示される空気一吹き系であることができる。液滴形成装置502の突出しチャンバーは、導管508を通って圧縮ガスを受領した一吹き弁506からの空気一吹きを供給される。空気一吹きは、一吹き弁506および突出しチャンバー502と連絡する空気一吹き導管510を通って突出しチャンバーにフィードされて画分の液滴を形成し、これらがプレート512中のサンプル容器に収集される。一吹き弁506はライン514を通る制御部500からの開放弁シグナルに応答して開放する。液滴形成後に残存する移動相は、制限弁518を包含する導管516を通って廃棄にフィードされる。
【0129】
図26は検出器、中央制御部および流量制限制御系の組み合わせの図解である。図26の図解は図25の図解と同一の要素の多くを有し、そしてここで同一の数字を双方の図で同一の要素に使用する。液滴形成装置520は図24に記述されると同一であることができる。制限手段522は制限起動装置を包含し、それは中央制御部500からライン524を通って起動制限コマンドに応答し、それにより突出しチャンバー中の圧を増大させる。図24を参照すれば、必要とされる増大された圧は、突出しチャンバー472中の液体の界面張力を克服しかつキャピラリーの大きさの開口部480を通って液体を流れさせるのに十分である。
【0130】
図27は、時間間隔、閾値および傾きに基づく画分収集の基準を具体的に説明するクロマトグラムの表示である。画分は、図21に示される一吹き弁428を開放すること、もしくは図24に示されるところの流れ制限484を閉鎖すること、または双方が1つの系中に提供される場合は双方により収集される。開放一吹き弁もしくは閉鎖制限コマンドは、画分の存在を示すピークの存在の確認を伴いもしくは伴わずに、時間窓の間にそれぞれの収集起動装置に送ることができる。言い換えれば、収集は、標的ポリヌクレオチドが存在する場合に、該ポリヌクレオチドを含有することが既知である選択された時間窓(垂直線526および528により示される)で盲目にすることができる。これは、サンプルが、ポリヌクレオチドの痕跡量の所望の塩基対長さの画分のみを含有する場合にとりわけ有用である。この方法は最も広範な画分範囲を収集し、そして生成物は別の画分の部分を包含するかもしれない。盲目収集は、共通に譲渡される1999年5月13日に出願された米国特許出願第09/311,116号明細書(引用することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる)に記述される。
【0131】
あるいは、開放一吹き弁もしくは閉鎖制限コマンドは、検出器シグナルが破線530により示される絶対的閾値より上である場合に、ある間隔の間、それぞれの収集起動装置に送ることができる。この方法は、ピークが明瞭である場合に他の画分を排除してより狭い画分範囲を収集する。しかしながら、ピークが明瞭に規定されない場合、収集されたサンプル中に他の画分が包含されるかもしれない。
【0132】
第三の代替において、開放一吹き弁もしくは閉鎖制限コマンドは、前縁の傾きがある選択された値より上である場合、および後縁の負数が選択された値より上である場合に、ある間隔の間、それぞれの収集起動装置に送ることができる。傾きの値は、より小さな傾きの値(垂線532および534により示される)を選択することにより、画分の大部分を収集するよう選択することができる。あるいは、傾きの値は、画分の中心の最も純粋な部分のみを収集するために、より大きな値(垂線536および538により示される)であるよう選択することができる。
【0133】
図1および2に示されるところの各系の構成部品は、物理的装置と該装置を制御するソフトウェアとの間の通信インターフェースとして作用する慣習的なコンピュータ命令入力手段を好ましく包含することが認識されるであろう。例えば、上述されたところの好ましい注入弁は、RS−232口ならびにTTLおよび接触閉鎖制御のための設備を包含する。
【0134】
好ましい一態様において、系の構成部品の全部は標準的通信インターフェースを共有する。一例として、モデルL−7100ポンプ(日立)は、他の系の構成部品との双方向的交流および統合のためのD−Lineネットワーク通信を包含する。好ましい系の構成部品はまた、中央制御部500から送られかつ受領されたシグナルを処理するための集積回路も組み込む。
【0135】
図28は、その各構成部品に関連した制御ソフトウェアモジュールと一緒の図1のMIPC系の図解である。装置制御ソフトウェアの構成要素を図28の右側に示す。装置制御ソフトウェアは、それぞれがクロマトグラフィー系の特定の一構成部品もしくは一群の構成部品を制御する原因であるいくつかのモジュールより成る。
【0136】
これらのモジュールの1つ、移動相流量制御モジュール560は、水性成分比例弁26、溶媒溶液比例弁28、補助液体比例弁30および浄化溶液弁40を制御する。モジュール560は、分離過程の間中、弁26、28および30の1個もしくはそれ以上で弁の設定を変えることにより、分離過程の間に特定の溶媒濃度勾配を提供するよう、弁26および28(ならびにおそらく30)のはたらきを制御する。比例弁26、28、30および40の設定は、対応するステッピングモーター(示されない)などの操作により変えることができる。溶媒の濃度を変えるために、モジュール560は命令を弁26、28および30のステッピングモーターに送り、そして弁26、28および30は増大の指示された数だけ閉鎖もしくは開放する。モジュール560は、好ましくはポンプ38を通る一定の流速を提供するように同時に閉鎖および/もしくは開放することを弁に命令する。
【0137】
また、モジュール560は、弁40を開放しかつそれにより浄化溶液容器16からの浄化溶液で注入弁54、毛細管76、インラインの系の構成部品および分離カラム78を洗い流すよう、浄化溶液弁40に関連するステッピングモーターに命令することにより、分離の間にカラム浄化を提供することができる。弁33は好ましくは浄化過程の間閉鎖される。
【0138】
あるいは、系が流量制御ポンプ92、94、96(図2)を包含する場合、移動相流量制御モジュール560は、中央制御部500から受領された体積流量命令を、所望の容量を送達するポンプの設定に変える。指定された勾配を確立するためモジュール560に送られた命令は、例えば溶液AおよびBの所望の比に対応する流量命令を包含することができる。
【0139】
図2に示される系での任意の浄化溶媒の浄化相は、移動相流量制御ソフトウェアモジュール560に指定時刻に作動する命令を送って、ポンプ110を開放しかつ浄化溶液を注入弁54、毛細管76、インラインの系の構成部品および分離カラム78を通過させることにより遂げられる。好ましくは、弁111は浄化過程の間閉鎖される。
【0140】
ポンプ制御モジュール562は、ポンプ38の入/切状態および流速もしくは液圧レベルのようなポンプ38の作動上のパラメータを制御する。ポンプ制御モジュール562は、分離過程の間、ポンプ38を通る流速をモニターし、そして指示されたレベルで流速を維持するようポンプを調節する。
【0141】
インジェクタ制御モジュール564は、分離カラム78に流れる溶液の流れ中への選択されたサンプルの注入を遂げるため、サンプルアリコートセレクター64およびインジェクタ弁62の作動を制御する。インジェクタ制御モジュール564は多様な命令コードに応答することができる。これらのコードは、それを用いてインジェクタ系64およびインジェクタ弁62を制御することができる有用なインジェクタモジュール機能を包含する。例は、サンプルの吸引、分注、管の同定、針の高さ、針の動く速度、弁位置の設定、タイマーの設定のためのコマンド、および他のコマンドを包含する。
【0142】
オーブン温度制御モジュール566は空気浴オーブン72の作動を制御する。オーブン温度は図9−13に示されるような熱制御系により決定される。オーブン温度制御モジュールは空気浴オーブン72を起動し、そして分離過程の全分析時間の間中、オーブン72中の温度レベルを継続的に制御する。オーブン温度制御モジュール566は、所望の工程温度とともに命令を加熱手段制御部に送る。加熱手段制御部は、順に、所望の温度変化を起動する加熱/冷却手段にコマンドを送る。オーブン温度制御モジュール566は、センサー204(図9)のような較正された温度センサーからフィードバックデータを受領する。それは空気浴オーブン72中の空気温についての情報を提供する。所望の工程温度と空気温度との間の絶対的な差異が許容される限界より上である場合、オーブン温度制御モジュール566は、所望の工程温度と温度センサー204の示度との間の差異に従って加熱/冷却手段の設定を調節するよう、加熱手段制御部に命令する。場合によっては、オーブン温度制御モジュール566は、工程温度のより正確な読取りのためにコイル管76上に直接配置された温度センサーから温度の示度を受領し、そして相応して加熱/冷却手段の設定を調節する。
【0143】
他のソフトウェアモジュールは、検出器84の作動を制御する検出器制御およびデータ収集モジュール568;フラグメントコレクタ系を制御するフラグメントコレクタモジュール570を包含する。指定されたサンプルを分析するのに使用することができる利用可能な予め設定されたメソッドを列挙する利用可能なサンプルテーブルの一覧を使用者に提示するサンプル分析モジュール。あるいは、使用者は、サンプル分析モジュール550のプロンプトで必要とされる情報を入力することにより、彼自身のメソッドを規定することができる。こうした情報は、温度条件、勾配の条件、注入モードなどを包含することができる。
【0144】
図29は、MIPC系のコンピュータ化された制御プロセス、および該プロセスの各部分に関連するモジュールの一態様の図解である。
【0145】
第一に、分析されるべきサンプルが使用者により同定される。サンプル分析モジュール550が、サンプルの正体を、分析されるべきサンプルを含有するバイアルの数字、もしくはこうしたバイアルのX−Y座標の形態で受領する。
【0146】
サンプルテーブルの一覧がサンプル分析モジュール550により表示され、指定されたサンプルを分析するのに使用することができる利用可能な予め設定されたメソッドを列挙する。
【0147】
その後、果たされるべきメソッドを包含するサンプルテーブルが使用者により指定される。あるいは、使用者は、サンプル分析モジュール550のプロンプトで必要とされる情報を入力することにより、彼自身のメソッドを規定することができる。こうした情報は、温度条件、勾配の条件、注入モードなどを包含することができる。
【0148】
フラグメントの収集が望ましい場合、使用者はまたフラグメント収集パラメータも指定する。使用者は、予め規定されたフラグメント収集方法の1つを選択することができるか、もしくは彼自身の方法を指定することができる。盲目収集の場合、使用者は収集のための時間間隔を指定する。閾値収集の場合、使用者は収集が開始する閾値を指定する。傾き収集の場合、使用者は収集が開始する強度曲線の角度を指定する。この情報に基づき、フラグメントコレクタ制御モジュール570への命令を含有するフラグメント収集テーブルが創製される。
【0149】
分析過程が使用者により開始される。その後、サンプルテーブルのロードをサンプル分析モジュール550により実施する。サンプルテーブルは各サンプルの選択されたメソッドを包含する。サンプルテーブルの依存性はサンプルテーブルモジュール552により確かめる。
【0150】
ハードウェアおよびソフトウェアのチェックがサンプルテーブルモジュール552により開始される。サンプルテーブルモジュール552は、指定されたメソッドにより必要とされる全部のハードウェアおよびソフトウェアが利用可能かつ運転可能であるかどうかをチェックするように装置制御部554に命令する。流量制御モジュール560が、溶媒比例弁26、担体液比例弁28、補助液体比例弁30および浄化溶液弁40が存在しかつ適正に作動していることを確かめる。ポンプ制御モジュール562は、ポンプ38が存在しかつ適正に作動しているかどうかをチェックする。インジェクタ制御モジュール564は、サンプルアリコートセレクター64およびインジェクタ弁62が存在しかつ適正に作動していることを確かめる。オーブン温度制御モジュール566が、空気浴オーブン72、プレフィルター74およびカラム78が存在しかつ適正に作動していることを確かめる。フラグメント収集が選ばれたメソッドの一部である場合、フラグメントコレクタモジュール570が、フラグメントコレクタ88が系中に存在しかつ適正に作動するかどうかを確かめる。
【0151】
装置制御部554がエラーを見出す、すなわち、この特定のメソッドに必要とされる装置もしくはソフトウェアが存在する系の環境設定で利用可能でない場合、サンプルテーブルモジュールは分析を中止し、そして使用者にエラーを報告する。
【0152】
そうでなければ、指定されたメソッドが系にロードされる。サンプルテーブルモジュール552が、メソッドテーブルへの選択されたメソッドの特定のパラメータの計算を開始する。こうしたパラメータは、分析されるべきサンプルを含有するバイアルの数字もしくは座標、分析されるべきサンプルの容量、サンプルの注入方法、注入の速度、溶媒の流速、注入溶媒の濃度、溶媒濃度の勾配の詳細、空気浴オーブンの温度、所望の工程温度と実際の工程温度との間の許容される不一致、分析装置の読取り頻度、などを包含する。移動相の勾配の詳細は、%Bが変えられるべきである時間および変化の大きさを指定するテーブルの形態であることができる。あるいは、該テーブルは、%Bが変化されるべきである特定の時間、およびこれらの時間で確立されるべき絶対的な%Bを含有することができる。あるいは、該テーブルは、移動相濃度の更新の頻度、および時間に基づく所望の%Bを計算するための式を含有することができる。この場合、流量制御モジュール560への命令は分離過程の間に実時間で計算される。
【0153】
その後、分析をメソッドモジュール556により開始する。メソッドモジュール556は、装置制御部554に分析を開始するよう命令する。装置制御部は、順に、装置制御ソフトウェアモジュールにより以下の分析前手順を果たす:
オーブン温度制御モジュール566は、加熱/冷却手段制御部に命令を送ることにより選択されたメソッドにより指示されたレベルにオーブン温度をするよう、温度制御手段に命令する。これらの命令は所望の工程温度を含有する。オーブン温度制御モジュール566は、温度センサー204からのデータを所望の工程温度と比較することにより、空気浴オーブン72が所望の温度に達したことを確かめる。指示された温度と実際の温度との間の差異がメソッドテーブルで提供された誤差の許容される限界より大きい場合、オーブン温度制御モジュールは、加熱/冷却手段制御部にオーブン温度を相応して上げるもしくは下げるよう命令する。実際のオーブン温度が所望のパラメータ内になるまでこのプロセスが反復される。
【0154】
流量制御モジュール560は、メソッドテーブルにて設定されるところの注入溶媒濃度を達成するための対応するステッピングモーターの作動により、弁26、28および30を設定する。この溶媒濃度は、溶媒、担体液および補助液体の流速の均衡をはかることにより達せられる。初期溶媒濃度は、好ましくは、非極性分離媒体へのサンプル中のDNAフラグメントの結合を遂げる。
【0155】
ポンプ制御モジュール562は、ポンプ38を所望のポンプ速度に設定して、メソッドテーブルで指示される流速を助長する。
【0156】
その後、メソッドモジュール556が、装置制御部554に分析を開始するよう命令する。
【0157】
装置制御部554は、順に、装置制御ソフトウェアモジュールにより以下の動きを果たす:
インジェクタ制御モジュール564は、メソッドテーブルにて指定されるところの114でのような選択されたウェルからのサンプルアリコートセレクター64によるサンプルの注入を助長する。サンプルはメソッドテーブルにより指定される様式で注入される。注入されたサンプル中のDNAフラグメントが非極性分離媒体に結合する。勾配分離の場合は、指示された時間間隔で、流量制御モジュール560が弁26、28、30の設定を変えて、メソッドモジュールテーブルにより指示されたレベルまで溶媒濃度を増大させる。溶液AおよびBの比は所望の勾配中の溶媒比を維持するように連続的に変えられる。イソクラチック流のためには、溶液AおよびBの比は一定の値で維持される。
【0158】
塩基対の大きさによるDNAフラグメントの混合物の分離においては、いくつかの異なる移動相勾配を使用してよい。増大する移動相勾配は溶液Bの濃度の段階的もしくは連続的増大であり、そして、勾配の1個もしくはそれ以上の部分が平坦もしくは一定の%Bの相(イソクラチック溶媒流)であってよい。DNAフラグメントは、低い%Bを含有する移動相流で、分離カラム78中の分離媒体の非極性表面上に付着する。DNAフラグメントは、比較的狭い範囲の%Bでカラムから分離される。
【0159】
図30は、MIPC過程での核酸フラグメントの基礎的分離の間の移動相中の溶媒濃度のグラフ表示である。図30を参照すれば、カラム78中の分離媒体にDNAフラグメントが結合する平坦な溶媒濃度572は、t(0)からt(1)までである。これの後に、t(2)の分離相の開始までの急な溶媒の勾配の上昇574が続くことができる。この点で、溶媒勾配はDNA分離勾配576に変えられ、これはt(2)で開始し、かつ、目的の全部のDNAフラグメントがt(3)でカラムから放出された溶媒濃度レベルまで継続する。その後、駆動する溶媒の勾配がより急な勾配578に変わり、これは、分離カラム78から全部の残存する核酸を除去しかつ次の分離手順のためカラムを準備するt(4)のレベルまで継続する。
【0160】
これらの相の間に、弁26および28の設定は、分離カラム78を通過する液体中で所望の移動相組成を遂げるよう継続的に調節される。弁の調節は漸増するため、それらはまた微小段階の調節として見ることもでき、そして勾配は微小段階の勾配として見ることができる。
【0161】
流量制御モジュール560は、特定の容量および容量比を対応する弁制御設定に変換するための転換式を包含する。指定された勾配を確立するための流量制御モジュール560への命令は、溶液AおよびBの比のパラメータを包含する。
【0162】
分析の間中、オーブン温度制御モジュール566が、オーブン温度をモニターし、そして、オーブン温度が誤りの許容される限界よりも大きく指示されたレベルから逸脱する場合に、オーブン温度制御手段の設定を調節する。
【0163】
分析が開始する場合、検出器制御およびデータ収集モジュール568が装置制御部554により起動され、そして順に検出器84を起動する。装置制御部554は、モジュール568に、検出器84の作動モードでの特定の命令を提供する。こうした命令は、UV検出器の場合、検出されるべきUV透過の基礎レベル、検出されるべき透過レベルの範囲、および検出器により得られるべき読取りの頻度を包含することができる。分析装置は進む液体を分析することを開始し、かつ、収集されたデータをモジュール568に渡す。検出器84による各読取りについて、モジュール568は、検出された透過のレベルおよび読取りの時間を記録する。モジュール568は、得られた情報を解読かつ収集し、そしてまたこのデータを実時間表示のためサンプル分析モジュール550にアナログ形式で渡す。
【0164】
フラグメント収集が選ばれたメソッドの一部である場合、フラグメントコレクタモジュール570が装置制御部554により起動される。フラグメントコレクタモジュール570は、フラグメントコレクタパラメータテーブルに従ってフラグメントコレクタ88にコマンドを与える。モジュール568により収集された情報もまた、フラグメントコレクタ88に渡されかつ移動相の閾値もしくは傾き収集に使用されることができる。
【0165】
フラグメントコレクタモジュール570は、装置制御部554から収集の時間枠で命令を受領する。盲目収集の場合、命令は、特定の画分の収集を開始および終了するための特定の時間、もしくは開始時間および収集間隔の長さの形態であることができる。分析装置84からの実際のピークの存在の確認は必要とされない。
【0166】
閾値収集については、フラグメントコレクタモジュール570が、収集が開始すべきである分析装置84により生じられる強度のレベルを受領する。強度のレベルがこの閾値より下に下落するか、もしくはこのフラグメントの収集に指定されたバイアルがいっぱいである場合、フラグメントコレクタモジュール570はフラグメントコレクタに収集を終了するためのコマンドを与える。
【0167】
勾配収集については、フラグメントコレクタモジュール570が、傾きの閾値、すなわち収集が開始するべきであるUV検出器326により生じられる強度の増加の速度のレベルを受領する。曲線の傾きが指定された閾値を越える場合、制御部330はフラグメントコレクタ88に収集を開始するための命令を与える。収集は、該フラグメントの収集に指定されたバイアルがいっぱいである場合はいずれの点でも中断することができる。そうでなければ、収集は、傾きが負に転じる、すなわち強度のピーク値を過ぎるまで進行する。収集は、曲線の傾きの絶対値が指定されたレベルより下に下落する場合に中断される。
【0168】
これらのフラグメント収集方法はまた組み合わせでも使用することができる。例えば、盲目収集は、存在するフラグメントの確認が閾値もしくは傾き法により受領される場合にのみ起こることができる。
【0169】
サンプル分析モジュール550は、結果が検出器制御およびデータ収集モジュール568により獲得されている際に、分析の進行を表示する。
【0170】
分析が完了すれば、結果データモジュール558が創製され、そしてメソッドのパラメータがそこで保存される。結果データモジュール558は検出制御およびデータ収集モジュール568により収集された情報を受領し、そして結果を分析する。その後、結果データモジュール558が分析の結果を保存する。サンプルテーブルモジュール552が、結果データモジュール558による分析の品質管理(quality control)チェックおよび後分析を開始する。その後、サンプル分析モジュール550が分析の後処理結果を表示し、そしてサンプルテーブルモジュール552がレポートを印刷する。
【0171】
図31は、本発明の系を使用して実施されるところの分離過程の段階を具体的に説明する:
段階600において、空気浴オーブン72がメソッドテーブルにより指示された工程温度に加熱される。加熱手順はオーブン温度制御モジュールにより制御される。
【0172】
段階602において、ポンプのパラメータがメソッドテーブル中のパラメータに従って設定され、そして、ポンプ38のスイッチが入れられる。ポンプを通る移動相の流速が達成される。ポンプを通る指示された移動相の流速を確立する過程は、ポンプ制御モジュール562により制御される。
【0173】
弁26、28および30が、メソッドテーブルにより指示されたところの初期移動相組成を達成するよう設定される。604で示されるこの段階は、図30でt(0)とt(1)との間の傾き572として示される。初期溶媒濃度を確立する過程は流量制御モジュール560により制御される。
【0174】
弁26、28および30、ポンプ38の速度、ならびに空気浴オーブン72の温度の設定が確立された後に、インジェクタ64が、段階606で示されるとおり、サンプルを溶媒の流れに注入する。サンプル注入の過程はインジェクタ制御モジュール564により制御される。サンプルが系に注入され、そしてサンプルのDNAフラグメントがそれら自身をカラム78の分離媒体に付着させた後に、迅速な溶媒の勾配を遂げるように弁26、28、30の設定が変えられる。該過程のこの段階608は、図30でt(1)とt(2)との間の勾配574として示される。この迅速な勾配は、その分離が所望されないより短いDNAフラグメントを洗い流す。
【0175】
より短いDNAフラグメントがカラムから溶出された後に、勾配の傾きがより遅い速度に変えられる。該過程のこの段階は610で示され、かつ、図30でt(2)とt(3)との間の傾き576として示される。t(2)とt(3)との間のこの期間の間に、分離過程が起こる(すなわち、DNAフラグメントが溶媒濃度に比例するそれらの塩基対長さに依存して系から溶出される)。溶媒の勾配ならびに弁26、28および30の関連する作動は、流量制御モジュール560により制御される。
【0176】
分離過程が起こる際に、検出器84は分離カラム78の流出物中の溶出されたDNAフラグメントの存在を絶えず検出し、そして、時間のいずれかの特定の瞬間に存在するDNA物質の量を記録する。検出器84の作動は検出器制御モジュール568により制御される。検出器の出力は段階612で示されるとおり収集され、ディジタル形式に変換され、そしてデータ記憶装置に保存される。
【0177】
フラグメントの収集が望ましい場合は、フラグメントコレクタ88が、任意の段階614で示されるとおり、検出器84の流出物から分離された物質を収集する。盲目収集、閾値収集および傾き収集のようなフラグメント収集方法は上述する(図27を参照されたい)。フラグメントコレクタ88の作動はフラグメントコレクタ制御モジュール570により制御される。
【0178】
分離過程が完了しかつ目的の全部のDNAフラグメントがカラムから溶出された後に、溶媒濃度を再度増大させる。有機溶媒の濃度を迅速に増大させて、分離カラム78から全部の残存するDNAフラグメントを溶出するのに十分高い濃度に達せさせる。該過程のこの段階618はt(3)とt(4)との間の傾き578として示される。移動相溶媒の勾配ならびに弁26、28および30の関連する作動は、流量制御モジュール560により制御される。
【0179】
時々、過酷な洗浄が、系およびとりわけ分離媒体の状態を十分に維持するために必要とされる。これらの例では、分離過程の最後の部分は、好ましくは弁33の同時の閉鎖を伴い浄化溶液弁40を開放すること、および系全体に溶液をポンプで送っていかなる残渣も除去することにより、浄化溶液容器16からの浄化溶液を用いて系を洗い流すことであることができる。
【0180】
同一サンプルの複数の注入を本発明の系により実施することができる。例えば、注入あたりの容量および注入の回数を、サンプルテーブルのロウに示されるとおり、特定のバイアルについて指定することができる。追加の注入を意思決定分岐551(図29)の状態に基づき行うことができる。
【0181】
また、複数の異なるサンプルを分析することができる。図32は、例えばソフトウェアに対ルーチン(counter routine)を包含することにより、複数の異なるサンプルの分析を実施することができる、MIPC系の一態様の流れ図の表示である。この場合、各個別のサンプルは例えば異なる範囲の目的のフラグメント長さを含有することができる。特定の一サンプルの注入前に、後に溶出されるべきDNAが、注入がなされる場合にカラムの頭部に集まるように、十分に低い有機溶媒濃度を有する移動相で、カラムを平衡化する(図30で572に示されるような)。
【0182】
図30に示されるとおり、分離サイクルは3つの主要な段階、すなわち付着相574、分離相576および浄化相578より成る。使用者が興味をもつ全部のDNAフラグメントが、移動相勾配の分離相576の間に溶出されなければならない。高分離度の分離を達成するためには、分離相576の勾配の傾きは非常に低い増加速度を有しなければならない。他方、DNA分離過程のサイクル時間を短縮するために、溶媒の勾配の分離相576は可能な限り短くすべきである。これらの目的を達成するために、本発明のコンピュータ化されたHPLC系が、目的の最短のDNAフラグメントが溶出されるであろう%B、および目的の最長のDNAフラグメントが溶出されるであろう%Bを決定する。その後、該系は、目的の最短のDNAフラグメントが溶出される%Bの直前に分離サイクルの分離相576を開始し、そして、目的の最長のDNAフラグメントが溶出される%Bの直後に分離サイクルの浄化相578を開始する。
【0183】
該系は、DNAフラグメント分離過程のための移動相勾配を確立するためのいくつかのオプションを有する。使用者は、全部の勾配の情報を、時間点(もしくは間隔)および溶液Bの対応するレベルを含むテーブルの形態で提供することができる。あるいは、使用者が、勾配の分離相576が開始するレベル(%B2)、分離相576が終了するレベル(%B3)および勾配の増加の速度を提供することができる。直線、凹形、凸形もしくは他の形状のような勾配の形状もまた選択することができる。このデータは分離勾配を完全に規定することができる。
【0184】
あるいは、コンピュータ500は、溶媒の勾配の開始および終了溶媒濃度をコンピュータ計算するための溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアを包含する。
【0185】
好ましい一態様において、本発明は、分離で使用されるべき溶媒の勾配の開始および終了溶媒濃度をコンピュータ計算するための溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアを提供する。一態様において、普遍的勾配が実施例1で記述されるとおり利用可能である。好ましい一態様において、該系は、目的のDNAフラグメントの塩基対長さに基づく分離勾配に移動相中の%B2および%B3の好ましいレベルを提供するソフトウェアを包含する。DNAフラグメントの混合物を分析する場合、使用者が、目的のDNAフラグメントの最短のものおよび最長のもののbp値、もしくは混合物中の目的のフラグメント(1種もしくは複数)の塩基対長さを入力し、そしてこれらの値を好ましい移動相組成の計算で使用する。単一フラグメントを分析する場合、ただ1個のbp長さを入力する必要があり、そして、ソフトウェアが、該フラグメントを溶出することができる%Bより下で開始しかつ該フラグメントを溶出することができる%Bの上で終了する勾配を計算する。一態様において、対応する溶媒濃度は、一定の傾きの分離勾配についての双曲線の式(i):
【0186】
【数25】
【0187】
式中、%Bは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり;bpは目的のDNAフラグメントの塩基対長さであり;
p1、p2、p3は系に依存する係数である
に従って、DNAフラグメントの塩基対長さに基づいて計算される。
【0188】
既知の長さのDNAフラグメントの標準混合物の分析から、発明者らは、有機溶媒としてアセトニトリルを使用して実施例2に記述される(かつ図33に示されるような)条件下で、系に依存する係数について以下の値を決定した:
p1=19.24
p2=53.6
p3=78.5
式(i)は溶媒濃度の直線状勾配を想定し、そして同一の勾配が較正および実際の分析に使用される場合に好ましい。いかなる傾きも使用することができる。しかしながら、系に依存する係数は、その場合に異なることができ、そして式(i)の形態を有する等式への実験データの曲線のあてはめを包含する較正過程により決定しなければならない。
【0189】
等式(i)を使用する場合、あるフラグメントの保持時間(Rt)は、以下の等式:
Rt=死時間+負荷時間+(%B(calculated)−%B(at start of gradient)/
傾き
式中、%B(calculated)は等式(i)から計算された%Bであり;
死時間は実施例3で記述されるとおり決定され;
負荷時間は勾配574の時間に対応する
から計算することができる。
【0190】
本発明の他の態様において、他の等式を経験的データにあてはめ、そして本明細書に記述されるところの移動相組成の予測に使用した。例えば、形式%B=a1(bp)+a2を有する一次等式;形式%B=a1(bp)2+a2(bp)+a3を有する二次等式;および形式%B=a1(bp)3 a2(bp)2+a3(bp)+a4を有する三次等式(a1、a2、a3およびa4は経験的に決定される定数である)を使用した。他の態様において、目的の範囲内の適切な形状を有するいかなる等式も使用することができる。
【0191】
本発明の不可欠のかつ従来認識されていない特徴は、非変性条件下で、DNAフラグメントが、各大きさについて特定の有機溶媒濃度で塩基対組成に独立に、かつ、有機溶媒の勾配の傾きの値に独立に、それらの大きさに基づいてMIPCカラムから溶出する、および、この溶出はMIPCを使用して高度に再現可能であるという、発明者らによる発見である。従って、各サンプル分析についてMIPCカラムを較正することは必要でない。1日1回の、もしくは週1回の較正さえ通常は必要でない。溶媒濃度が所定の塩基対長さについて決定されれば、その大きさのフラグメントを溶出するための%Bは、同一のカラムで日ごとにのみならず、しかしまた1本のカラムから別のものまで一定であることができる。溶媒濃度を塩基対長さに関係づける参照を創製すること、およびいずれかの付加的な方法の開発を伴わずに既知の塩基対長さのDNAフラグメントを溶出するための溶媒濃度を予測することを可能にするのは、この驚くべき発見である。デフォルト値(標準的DNA混合物を以前に分析することにより得られた)を用いかつ較正を伴わずに良好な結果を得ることができるとは言え、好ましい実務は、新たなカラムまたは溶離剤(緩衝液もしくは移動相)を装置に設置する場合に較正することである。高度に正確な結果を、内部標準の使用を伴わずに得ることができる。該方法は、既知の長さのフラグメントが特定の勾配でいつ溶出するであろうかを予測するのに使用することができ、また、特定の溶媒の勾配でのその保持時間から未知のフラグメントの分子量を確かめるのにもまた使用することができる。DNAフラグメントの溶出の予測可能性は、速度および分離度に関する勾配の最適化を助長する。
【0192】
分離勾配の式の別の態様において、等式(ii)が、特定の塩基対長さの特定のフラグメントが溶出するとみられる傾きsの直線状勾配の経過中に達せられるとみられる%Bを表し:
【0193】
【数26】
【0194】
式中
【0195】
【数27】
【0196】
%Bは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり;
sは濃度増加の速度(すなわち傾き)であり;
d、void、p4、p5、p6、p7およびp8は系に依存する係数である。
【0197】
既知の長さのDNAフラグメントの標準混合物の統計学的な曲線のあてはめの分析から、発明者らは、実施例2に示される溶出条件下でトランスゲノミック インク(Transgenomic,Inc.)(カリフォルニア州サンノゼ)から入手可能なDNASEPカラム(50mm×直径4.6mm)を装備されたMIPC系で使用されるべき系のパラメータについて、以下の好ましい値を決定した:
d=2.0
空隙時間=1.95
p4=9.596×10−4
p5=0.417
p6=25.4
p7=45.2
p8=85.0
等式(i)および(ii)において、異なる逆相分離カラム、異なる分離条件、もしくは異なる系の構成部品を使用するクロマトグラフィー系について、曲線のあてはめの後に、他の系のパラメータを得ることができる。例えば、多様な製造供給元からの系の構成部品が入手可能であり(例えば、ヒューレット パッカード(Hewlett−Packard)、バリアン(Varian)、ベックマン コールター(Beckman Coulter)、ウォーターズ(Waters)、島津)、そして本発明で使用することができる。しかしながら、等式の一般的形式は変えられないことができる。
【0198】
本発明の好ましいソフトウェアは、分離されるべきDNAの塩基対でのフラグメント長さを入力するためのユーザーインターフェースを提供する。該ソフトウェアは、crtもしくはフラットパネルモニタのようなディスプレイ装置上にグラフィカル・ユーザー・インターフェースを生成させる。ユーザーインターフェースの一例は、図34に具体的に説明されるような勾配テンプレート699である。塩基対でのフラグメント長さに基づき、該ソフトウェアは、以下、すなわち直線状勾配の傾き、負荷段階の%Bの持続期間および変化、勾配の持続期間、洗浄の持続期間、洗浄後の平衡化の持続期間、ならびに勾配の開始および終了、を設定する。具体的に説明される例において、直線状勾配の傾きは700に示され、また50℃でのDNAフラグメントの予測されるRtが垂直の棒702により示される。該インターフェースは、バイアル番号、注入容量、注入回数、アプリケーションの型、サンプル名、シーケンスファイル、オーブン温度、塩基対、メソッド名、分離勾配の開始での%B、および時間の移動のようなサンプルデータを入力するもしくは見るためのテーブル704を包含する。該インターフェースは、移動相勾配を計算するためのクリックボタン706を包含する。該インターフェースはまた、ポンプもしくは検出器のいずれかで表示されるべき勾配の位置を決定するためのパネル708;分析時間および急落流速(plump flow rate)を見るもしくは入力するためのパネル710も包含する。検出器での勾配を表示する場合、2個の特徴が好ましく包含される。第一は、等式(例えば等式(ii))が当てはまる勾配の区分の開始および終了を表す2本の垂直の破線705および707である。第二は、規定された大きさのフラグメントが検出器を越して溶出するとみられる時間を示す、数字を付けられた刻み印(hash mark)703である。
【0199】
パネル712は、多様な勾配のパラメータ、すなわち、1分あたりの%Bの勾配の傾きを示し;パネル712は、他のフィールドのそれぞれをエディットすることに対する一代替としてのこれらの設定名に一致する他のフィールド(傾きのフィールドを除外する)に予め規定された値を置く、注意(Cautious)、正常(Normal)および速い(Fast)のような設定を有する注意レベル(Caution Level)を包含し;負荷に関する下落(Drop for Loading)は、保持されない成分(PCR産物が注入される場合は典型的にはdNTP、プライマー、緩衝剤など)が予測不可能な様式で分離に影響しないようにそれらを通過させるためのカラムへのDNAの負荷に関する%Bの下落を示し;負荷に関する下落(Drop for Loading)が直線状勾配の開始まで上昇する持続期間を提供する負荷持続期間(Loading Duration)(典型的には0.1もしくは0.5分);傾き(Slope)のオプションにより選択される1分あたりの%Bで%Bが直線的に上昇することができる時間の長さを規定する勾配持続期間(Gradient Duration);%Bがカラムから高分子量DNAを取り除くために100%で留まることができる時間を示す除去持続期間(Clean Duration)(例えば100%への上昇および100%からの下落は0.1分で起こる);%Bが次の注入のために平衡化するよう一定のまま留まる時間を示す平衡持続期間(Equilibration Duration)。勾配テンプレートはまた、勾配の洗浄部分を上述されたとおり任意の浄化溶液インジェクタ弁54により実施することができる場合に使用される迅速浄化(Fast Clean)の設定も包含することができる。迅速浄化のオプションを選択する場合、勾配の洗浄部分は排除される。この機能は代わりに弁54により実施され、より高いサンプルのスループットを可能にするからである。フィールド714は使用者によりエディットすることができる勾配テーブルを表示する。フィールド713は、突然変異の検出(Mutation Detection)、単一フラグメントの二本鎖の大きさ分類(Double Stranded Sizing for a single fragment)、複数のフラグメントの二本鎖の大きさ分類(Double Stranded Sizing for multiple fragments)、および較正(Calibration)のようなアプリケーションを選択するためのオプションを表示する。
【0200】
目的のDNAフラグメント(1種もしくは複数)の提供される長さに基づく、必要とされる最小および最大の溶媒濃度の計算後に、サンプル分析モジュール550が、勾配テーブル699のようなインターフェースにより、これらの勾配パラメータを使用者に表示し、使用者は、系の示唆を受容するかもしくは勾配パラメータを補正するかのいずれかができる。勾配パラメータが使用者により承認された後に、パラメータがメソッドファイル中のディジタルメモリに保存され、そしてサンプル分析モジュール550が、各サンプルをメソッドと関連させるサンプルテーブルを形成する。
【0201】
選択された塩基対長さのDNAフラグメントのフラグメント収集が望ましい場合には、こうしたフラグメントの溶出の時間が、上に提示された式に従ってサンプル分析モジュール550により計算されることができる。サンプル分析モジュール550は、目的のDNAフラグメントの溶出に対応する移動相組成を計算する。その後、対応する保持時間を勾配テンプレートで見ることができる。生じる保持時間は、カラムからの該DNAフラグメントの溶出と、フラグメントコレクタ88へのその到着との間の系の遅延について補正される。その後、盲目収集についてのこれらの時間が使用者に提示されることができ、使用者はそれらを受容するかもしくは補正することができる。このデータに基づき、フラグメント収集テーブルが、サンプルテーブルモジュール552により計算される。
【0202】
突然変異の検出においては、異なる大きさの複数のフラグメントが存在する状況と対照的に、単一の塩基対長さのみが使用者により入力される。ホモ二重鎖からのヘテロ二重鎖の分離は、DNAをちょうど融解し始める温度での勾配溶出を必要とする。ヘテロ二重鎖は、不適正にされた塩基により不安定化され、そして従ってこの温度でホモ二重鎖よりわずかにより多く融解される。保持時間はDNAが変性する際に減少し、そしてこれゆえにより多くの変性されたヘテロ二重鎖がホモ二重鎖より先に出現する。本明細書に記述されるところのサンプル分析モジュール550は、例えば等式(i)を使用して、塩基対長さに基づき移動相勾配を計算する。好ましい一態様において、該計算はまた、例えばフラグメントが溶出する%Bよりすぐ下で勾配を開始しかつ目的のピークが検出器を通りすぎた直後に勾配を停止することにより、分離度の喪失を伴わずに分析の時間を減少させる勾配を決定することもできる。サンプル分析モジュール550は、単一の塩基対長さに関連する移動相組成を「一括する(bracket)」勾配を計算することができる。一態様において、サンプル分析モジュール550は、非変性条件下で直線状勾配のちょうど終点にDNAフラグメントを置く最適化された勾配パラメータを計算する。これを行うのに必要とされる%BをXと呼ぶ場合には、下の勾配を示されるとおり計算することができる:
【0203】
【表1】
【0204】
複数のDNAフラグメントを分析する場合、該ソフトウェアは、最大のDNAフラグメントを直線状勾配のちょうど終点に置きかつ最小のDNAフラグメントを直線状勾配のちょうど開始点に置くことにより、最適化された勾配パラメータを計算することができる。例えば、最小および最大のフラグメントを溶出するのに必要とされる%Bを決定することができる。%Bのこれらの値は、予備的な「フラグメントを一括する範囲」を決定する。フラグメントを一括する範囲は最初の%Bおよび最終の%Bを有する。最初の%Bは、混合物中の最初に溶出するDNA分子を溶出するのに必要とされる量までの有機溶媒濃度を含有する。最終の%Bは、混合物中の最後に溶出するDNAフラグメントを溶出するのに十分な有機溶媒濃度を含有する。好ましい一態様において、最適化されたフラグメントを一括する範囲の最初の%Bは、最初の%Bの約15パーセンテージ単位下より少ないかもしくはこれに等しい。最終の%Bは、最終の%Bより少なくとも約5パーセンテージ単位より高い。上述された手順は実務で広範に応用可能であるとは言え、最初および最終の溶媒濃度は特定の応用について補正することができることが認識されるであろう。
【0205】
dsDNAフラグメントの混合物、ならびにホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖dsDNAフラグメントの混合物の改良された分離は、イソクラチック移動相の条件下でMIPCを使用して達成することができる。以下の等式(iii)を使用して、dsDNAフラグメントの分離に好ましい移動相組成を決定することができる:
【0206】
【数28】
【0207】
式中
【0208】
【数29】
【0209】
Pは分配画分であり
%Bは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり;
また、式中、void、p4、p5、p6、p7およびp8は、等式(ii)に関して記述されたような曲線のあてはめから得られる、系に依存する係数である。好ましい一態様において、これらのパラメータは等式(ii)に関して示されたと同一の値を有する。
【0210】
分配画分はカラムを通るDNAフラグメントの速度に比例する。P=0でDNAは静的である一方、P=1でDNAは最大の速度(空隙ピークのものに等しい)で動いている。
【0211】
等式(iii)を論理的に導くために、pBR322 HaeIII消化物からのフラグメントの混合物の一連のイソクラチック溶出を、50から65%までのすべての整数の%Bのイソクラチック移動相でカラムを溶出したことを除き、実施例1で記述される条件下で実施した。Rt対%Bのプロットを準備した(図35)。空隙時間(1.95)の観察された値を使用して図35からのデータを再計算し、そして図36にプロットした。等式(iii)を使用して計算された曲線を、図37に示されるとおり生じさせた。
【0212】
等式(iii)の使用方法の一態様において、図37の計算されたデータをディジタルメモリに保存することができる。DNAの1種もしくはそれ以上のフラグメントのイソクラチック溶出プロフィルを予測するために、ソフトウェアが、いかなる選択された%Bでも保存されたデータの「テーブルの調査」を実施し、そして所定のフラグメント長さについてP値を決定する。便宜性のため、グラフィカル・ユーザー・インターフェースが図37のプロットを示し、そして使用者が、説明716に示されるようなフラグメントの長さに基づく検分により%Bを選択する。%Bが選択される場合、勾配テンプレートのようなユーザーインターフェースが、予測された保持時間(1種もしくは複数)のプレビュープロットを示す。
【0213】
等式(iii)の使用方法の別の態様において、使用者は、塩基対長さおよび所望の保持時間を入力するよう指示される。Pの値は、関係P=(空隙体積)/(所望の保持時間)からソフトウェアにより計算され、そしてその後、等式(iii)を使用して%Bの値を決定する。勾配テンプレートのようなディスプレイが移動相プロフィルを示し、また、好ましくは、目的のフラグメントもしくは複数のフラグメントの予測される保持時間もまた表示する。本態様のソフトウェアの段階を具体的に説明する流れ図を図43に示す。
【0214】
等式(iii)の使用において、装置の空隙体積が予め決定されかつコンピュータのメモリに入力されていなければならない。例えば、空隙体積について1.95mLという値が、実施例2で記述されるとおり決定された。
【0215】
分離勾配の開始および終了の点を変えることにより、選択された塩基対長さのフラグメントの分離が、DNAフラグメントの混合物内のフラグメントの全部の分離を包含することができるか、または、DNAフラグメントの混合物内の1種もしくはそれ以上のフラグメントの分離を包含することができることが認識されるであろう。
【0216】
本発明は、MIPCカラムからDNAフラグメントを溶出するのに必要とされる移動相中の有機溶媒の濃度と、DNAフラグメントの塩基対長さとの間の高度に再現可能な関係を利用する。溶媒濃度が所定の塩基対長さについて決定されれば、そのフラグメントの保持時間は、同一のカラムで日ごとにのみならず、しかしまた1本のカラムから別のものまでその溶媒濃度で一定であることができる。この再現可能な品質は、溶媒濃度を塩基対長さに関係づける参照を創製すること、およびいずれかの付加的な方法の開発を伴わずに既知の塩基対長さのDNAフラグメントを溶出するための溶媒濃度を予測することを可能にする。良好な結果はデフォルト値を用いてかつ較正を伴わずに得ることができるとは言え、好ましい実務は、該装置で新たなカラムを使用する場合、またはフラグメントが一貫して期待されたより早くもしくは遅く溶出している場合に較正することである。分離カラムの較正は、既知の大きさの1種もしくはそれ以上のDNAフラグメント(1種もしくは複数)を溶出するのに必要とされる%Bを決定することにより達成される。完全な較正手順の一例を実施例2に記述し、ここでは、pUC18 DNA−HaeIII消化物から得られた標準フラグメントを使用した。標準は、好ましくは既知の大きさの3種もしくはそれ以上のフラグメントを有する。標準のピークは、好ましくは較正のために十分に分離し、また、ピーク高さが平均して5〜10mVの間となるように十分な標準を使用しなければならない。
【0217】
完全な較正に対する一代替としてゼロ点較正を選択することができ、ここでは、コンピュータメモリ内の(実施例2に記述されるとおり得られた%B対bpの値のような)デフォルト値を使用し、そして、標準を分析しない。
【0218】
完全な較正に対する別の代替として、単一点較正手順を使用することができ、そして、サンプルの全部が同一長さのものである場合に十分である。この過程の第一段階で、使用者が勾配テンプレートのページを選択し、オプションの二本鎖の大きさ分類−単一フラグメント(Double−Stranded Sizing−single fragment)を選択し、塩基対(Base−pairs)フィールドにフラグメントの大きさを入力し、そして更新(Update)ボタンを押す。使用者は、予測された勾配および予測された保持時間を検査し、オーブン温度フィールドが50℃に設定されていることをチェックし、そしてサンプルを注入する。分析後に、結果を吟味し、そして予測された保持時間と比較する。予測された保持時間および観察された保持時間が0.5分以上だけ異なる場合、使用者は、較正ダイアログボックス(示されない)に観察された保持時間を入力し、そして観察された保持時間に基づく再較正を強制するよう選択を行う。
【0219】
例えば第一の標準に対して非常に異なる大きさ(例えば大きさが50%以上異なる)のフラグメントについて第二の較正点が必要とされる場合、使用者は第二の点を使用することができる(第一の標準について予測される勾配を変えることなく第二の標準で較正する段階的較正)。使用者は、第一の点の較正後のいずれの時点でも第二の点の較正を実行することができる。この過程において、使用者は勾配テンプレートのページを選択し、オプションの二本鎖の大きさ分類−単一フラグメント(Double−Stranded Sizing−single fragment)を選択し、そして使用するであろうフラグメントの大きさを入力する。これは、好ましくは、第一の標準と大きさが最低50%異なる。その後、使用者は更新ボタンを押す。使用者は、予測された勾配および予測された保持時間を検査し、オーブン温度フィールドが50℃に設定されていることをチェックし、そしてサンプルを注入する。分析後に、結果を吟味し、そして予測された保持時間と比較する。予測された保持時間および観察された保持時間が0.5分以上だけ異なる場合、使用者は、較正ダイアログボックス(示されない)に第二の標準の観察された保持時間を入力し、そして観察された第二の標準の保持時間に基づく再較正を強制するよう選択を行う。
【0220】
グラフィカル・ユーザー・インターフェースの別の態様において、図38は注入テーブル780の一態様を示す。注入テーブルは、バイアル番号、注入の容量、注入の回数、メソッド名、サンプル名、コメントおよび温度のエントリーを提供するサンプルテーブル781を包含する。最も右の3個のカラムが、勾配を改変するためのオプションを提供する。「+/−分」と名称をつけられたカラム782は、式、容量・傾きに従って、勾配テーブルのロウ714の全部の%Bを相殺する。従って、1分あたり2%の傾きで、−1のエントリーは洗浄を除き全部のロウで2%だけ%Bを減少させる。%Bのこの減少は、ピークに保持時間の1分の増大を与えることができる。「塩基対」と名称を付けられたカラム784は、述べられた長さのDNAフラグメントに必要とされるパーセンテージだけ、勾配テンプレート(洗浄を除く)を相殺する。例えば、勾配テンプレートが207bpのフラグメント長さを想定し、かつ、使用者が同一のテンプレートを使用して392bpのフラグメントを分析したい場合、カラム784に392を入力することは、勾配を3%Bだけ相殺することができる。実際の%Bの変化は、カラムの較正に依存して変動するかもしれない。%Bと名称を付けられたカラム786は、勾配の開始の%Bが明確に設定されることを可能にする。勾配テンプレートで設定された傾きが維持される。カラム786で入力された値は、カラム782もしくは784のいずれか中のものを上書きする。好ましくは、カラム782、784および786中の設定は、既に得られた結果に基づいて来るべきサンプルパラメータに対する補正を使用者が行うことができるように、ソフトウェアが実行している際に「進行中に」補正することができる。
【0221】
一態様において、勾配テンプレートを使用して複数のフラグメントが分析されている場合、使用者は、ピーク間の分離を増大させるために、例えば多段階勾配を創製することにより勾配を改変することができる。
【0222】
注入テーブルは、好ましくは、以下のオプション、すなわちポンプを作動もしくは停止させるポンプオン(Pumps On);サンプルテーブル中の全部のエントリーを削除するテーブルクリア(clear Table);オーブンが温まる際に安全な低い流速(例えば0.2mL/分)を提供するウォームアップ(Warm Up);サンプルテーブル中に列挙されるサンプルを分析するサンプル分析(Run Samples);結果を保存することができるアプリケーションフォルダを示すアプリケーションフォルダ(Application folder);デフォルトとして使用されるべきオーブン温度を示すデフォルト温度(Default temperature)(この温度は、DNAシーケンス画面上の選択されたシーケンスについて決定された);あるサンプルについて示された1回以上の注入が存在する場合に各注入についての温度の増大の値を示す温度増加(Tempetature Incriment)(デフォルトは1に設定される)もまた包含する。注入テーブルはまた、1分析内の持続期間もしくは時間;印刷されたクロマトグラムを生じさせるための設定;および1回の分析を終了した後にポンプ、検出器ランプもしくはヒーターを停止させるためのオプションのような、カラムを平衡化するためのオプションも包含することができる。
【0223】
本発明のソフトウェアはまた、利用可能なサンプルについてのデータファイルのロケーションを包含する情報を列挙する結果テーブル(示されない)を表示するためのインターフェースも包含することができる。1種もしくはそれ以上のサンプルからのクロマトグラムを見るために選択することができる。
【0224】
本発明のためのソフトウェアの実行は当該技術分野の熟練内にあり、かつ、特定のコンピュータ、もしくは使用されるコンピュータ、およびオペレーティングシステムのような因子に依存する。同様に、コンピュータとHPLCとの間の連結は、ハードがワイヤードである必要はない。赤外線もしくは他の電磁放射線を使用して、普遍的設計の適切な変復調装置を用いて制御機能をHPLCにつなぐことが可能である。コンピュータ500(図1)もしくは同等の論理実行ユニットがMIPC系の論理およびオペレーションを命令する。好ましくは、OS/Warp(IBM コーポレーション(IBM Corporation)の製品)、Windows−98もしくはWindows−NT(双方ともマイクロソフト コーポレーション(Microsoft Corporation)の製品)のようなマルチタスキングオペレーティングシステムを実行する単一のコンピュータ、例えばIBM−PCもしくはIBM−PC互換機コンピュータを使用する。コンピュータ500は、好ましくは、適切なメモリ、ハードおよびフロッピーディスクドライブ、ビデオモニタ、キーボード、ポインティング・デバイスおよび他の周辺装置を装備される。本明細書に記述されるところのユーザーインターフェースおよび勾配計算は、好ましくはWindowsに基づくオペレーティングシステムと統合するよう設計されているVisual Basic(マイクロソフト(Microsoft))、C++、JAVAもしくはDelphiのようなソフトウェアパッケージを使用して実行される。しかしながら、システムが、アップル コンピュータ インク(Apple Computer,Inc.)から入手可能なMac OSを実行するマッキントッシュ(Macintosh)のコンピュータのような他のオペレーティングシステムをもつ他のコンピュータ、またはヒューレット パッカード(Hewlett−Packard)もしくはディジタル エキップメント コーポレーション(Digital Equipment Corporation)から入手可能な他のコンピュータで実行することができない理由は存在しない。好ましくは、ソフトウェアは、必要とされる情報の入力で補助するため、ならびに結果を吟味および分析するためにユーザー・フレンドリーな画面を提供するよう実装されることができる。一態様において、本明細書に記述されるソフトウェアは、MIPCを実施するためにカスタマイズすることができる、製造供給元に供給されるソフトウェアを包含することができる。例えば、日立は、HSMと統合するカスタマイズされたソフトウェアを使用者が開発することを可能にするアクセス可能な選択されたコンピュータの説明書を作成している。HSMは、記述されるD−7000 HPLCシステムマネージャユーザーマニュアル(部品番号810−9441−3)、第4版(1996年7月)(引用することにより本明細書に組み込まれる)である。
【0225】
図39は、溶媒勾配の開始および終了溶媒濃度をコンピュータ計算するための溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアの一態様を具体的に説明する図を示す。使用者は、550で目的のフラグメントの塩基対での長さを入力し、そしてソフトウェアが552で等式(i)を使用して勾配パラメータを計算する。使用者は、754、756で分離を促進する最適化された勾配パラメータを使用することを選択することができる。移動相プロフィルが758で保持時間と一緒に表示される。使用者は、760、762でパラメータを人的に補正することができる。使用者がパラメータを受容する場合、ソフトウェアは、装置制御ソフトウェアによりアクセスされるべきディジタルメモリにそれらを(764で示されるとおり)保存する。
【0226】
図40は、図39に類似のしかし勾配パラメータ770の計算における等式(ii)の使用を具体的に説明する図を示す。使用者は、イソクラチック勾配を使用するというオプションもまた有し、この場合、(図37に示されるような)プロットが772で表示され、そして使用者が等式(iii)に関して上述されたような%Bを選択する。
【0227】
図41は、突然変異の検出について事実がそうであるとみられるような、単一のbp長さのみが入力されることを除き、図39に類似である。
【0228】
図42は、図40に類似であるが、しかし単一塩基対長さの1個のフラグメントについてである。
【0229】
図43は、%Bを計算するための等式(iii)の使用を具体的に説明する。使用者は、塩基対長さを774で、および所望の保持時間を775で入力するよう指示される。
【0230】
本発明の別の局面は、DNAの突然変異の検出の実施での使用のための系および方法に関する。上で論考されたとおり、本発明は二本鎖DNA中の突然変異を検出するのに使用することができる。以下の定義を本明細書で使用することができる:
「融解温度」は、DNAフラグメント中の塩基対の50%が相補鎖から分離されている温度を意味すると本明細書で定義する。
【0231】
「ホモ二重鎖」は、各鎖中の塩基が他方の鎖中のそれらの対蹠物の塩基に関して相補的である二本鎖DNAフラグメントを意味すると本明細書で定義する。
【0232】
「ヘテロ二重鎖」は、各鎖中の最低1個の塩基が他方の鎖中の最低1個の対蹠物の塩基に相補的でない二本鎖DNAフラグメントを意味すると本明細書で定義する。これは、不適正にされた塩基もしくは欠失による可能性がある。ヘテロ二重鎖中の最低1個の塩基対が相補的でないため、それは、ホモ二重鎖中のその完全に相補的な塩基対類似物に比較して、その部位で塩基を分離させるのにより少ないエネルギーを利用する。これは、ホモ二重鎖に比較してヘテロ二重鎖の不適正にされた塩基の部位でのより低い融解温度をもたらす。
【0233】
「ハイブリダイゼーション」という用語は、dsDNAサンプルを加熱および冷却する、例えば95℃に加熱し次いでゆっくりと冷却することの過程を指す。加熱過程はDNA鎖を変性させる。冷却に際して、鎖は主に統計学的様式で二重鎖に再結合する。サンプルが野性型および突然変異体のDNAの混合物を含有する場合には、ハイブリダイゼーションはヘテロおよびホモ二重鎖の混合物を形成することができる。
【0234】
「ヘテロ突然変異体部位分離温度」T(hsst)は、突然変異の部位でヘテロ二重鎖DNAを優先的に変性させかつヘテロ二重鎖とホモ二重鎖との間の変性の程度の最大の差異を生じる温度を意味すると本明細書で定義する。これは、DMIPCによるヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖のクロマトグラフィー分離を遂げ、そしてこれゆえに突然変異を検出するのに最適である温度である。
【0235】
「ヘテロ突然変異体」という用語は、多形もしくは非相補的塩基対を含有するDNAフラグメントを意味すると本明細書で定義する。
【0236】
「突然変異分離温度範囲」という用語は、DNAセグメントが完全に変性されない最高温度と、DNAセグメントが完全に変性される最低温度との間の温度範囲を意味すると本明細書で定義する。
【0237】
「突然変異分離プロフィル」という用語は、ホモ二重鎖からのヘテロ二重鎖の分離を示すDMIPC分離クロマトグラムを意味すると本明細書で定義する。こうした分離プロフィルは、突然変異もしくは多形を含有しかつDMIPCにより分離されている前にハイブリダイズされているサンプルに特徴的である。51℃ないし61℃で実施された図45に示されるDMIPC分離クロマトグラムは、本明細書で定義されるところの突然変異分離プロフィルを例示する。
【0238】
本明細書で使用されるところのDNAの「温度の最適化」という用語は、DMIPCからの保持時間が、横座標としてのカラム温度に対して縦座標としてプロットされる実験処置である。
【0239】
突然変異を検出するための信頼できる一方法は、野性型鎖とのサンプル中の推定の突然変異体鎖のハイブリダイゼーションによる(Lermanら、Meth.Enzymol.、155:482(1987))。突然変異体鎖が存在する場合には、図44に示されるとおり、ハイブリダイゼーション過程の結果として2種のホモ二重鎖および2種のヘテロ二重鎖が形成されることができる。これゆえに、ホモ二重鎖からのヘテロ二重鎖の分離は、サンプル中の突然変異体のDNAセグメントの存在もしくは非存在の直接の確認方法を提供する。
【0240】
本発明の一態様は、温度の最適化に基づくT(hsst)の選択方法である。本態様において、突然変異を含有するサンプルを、帰納的な最適化のアプローチを使用して、一連の温度で検査する。本手順により得られた至適温度は、ピークのパターンの差異により突然変異体のDNAフラグメントが野性型DNAと最も容易に識別される温度である。
【0241】
本発明において、好ましいソフトウェアは、使用者に最初の注入の温度を入力させるサンプルテーブルのようなユーザーインターフェースを提供する。デフォルトの温度は予測される温度である(下述されるような)。しかしながら、使用者はいかなる温度も入力するオプションを有する。使用者は、次に、所望の注入回数および注入ごとの温度の増加を入力する。増加のデフォルト値は1℃である。例えば、予測される温度が55℃であり、そして使用者が55+/−2℃の範囲を包含するように5回の注入の温度の最適化を実施したい場合、使用者は最初にサンプルテーブル中で53℃として温度を設定することができ、そしてその後注入回数を5に設定することができる。
【0242】
温度の最適化の一例において、DMIPCによる209塩基対のホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖を含有する標準品の温度依存性の分離を、一連の分離クロマトグラムとして図45に示し、また、分離方法を実施例4に記述する。突然変異体のフラグメントが野性型からの単一塩基対の逸脱を含有した209塩基対のホモ二重鎖フラグメントのヘテロ接合性のサンプルを含有するサンプルを、加熱およびその後冷却することによりハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション過程は、図44に図で示されるとおり2種のホモ二重鎖および2種のヘテロ二重鎖を創製した。図45に示されるとおり、MIPCを51℃で実施した場合、全4種の混合物の成分を表す単一ピークがみられた。全4種の成分が同一の塩基対長さを有しかつ分離が非変性条件、すなわちなんらかの変性を引き起こすには低すぎる温度で実施されたため、この結果は期待された。53℃で、ショルダーが主ピークの小さい保持時間側に出現した。これは、融解の開始、ならびにヘテロ二重鎖の潜在的な存在および部分的分離を示した。分離の温度を漸増的に増大させた際に、元の単一ピークは結局、4個のはっきりと明確なピークに分離した。2種のヘテロ二重鎖を表す2個のより小さい保持時間のピーク、および2種のホモ二重鎖を表す2個のより大きい保持時間のピークが図45に示される。遺伝子座168のA−T塩基対はC−G塩基対より低温で変性するため、2種のホモ二重鎖は分離する。理論により束縛されることを願わないが、該結果は、一方の二重鎖中でのより大きい程度の変性、および/もしくは他方に比較して一方の部分的に変性されたヘテロ二重鎖の極性の差異と矛盾せず、MIPCカラム上での保持時間の差異をもたらす。図45の溶出プロフィルからのホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖種の温度の最適化を図46に示す。
【0243】
図45にみられるとおり、57°ないし58℃の温度範囲がこの分離に最適であった。図44のハイブリダイゼーションの図解に基づき期待された結果に一致して、突然変異が元のサンプル中に存在した場合に、4個の識別可能なピークの出現が観察された。その温度より上では、突然変異を含有する領域が完全に変性されている。これは、分離が約59°−61℃で実施された場合に小さい保持時間でみられる、4個の同等に変性された種を表す単一ピークにより明示される。
【0244】
いくつかの突然変異分析においては、2個のピークもしくは部分的に分離されたピーク(1個もしくは複数)のみがDMIPC分析で観察される。2個のホモ二重鎖のピークは1個のピークもしくは部分的に分離されたピークとして出現するかもしれず、また、2個のヘテロ二重鎖のピークは1個のピークもしくは部分的に分離されたピークとして出現するかもしれない。いくつかの場合には、最初のピークの拡がりのみが、部分的変性条件下で観察される。
【0245】
あるサンプルが同一長さのホモ接合性のDNAフラグメントを含有した場合には、ヘテロ二重鎖が形成される可能性がなかっため、ハイブリダイゼーションおよびMIPCによる分析は、いずれの温度でも単一ピークのみを生じることができた。本方法の実施において、突然変異の決定は、既知の野性型フラグメントとホモ接合性のサンプルをハイブリダイズさせること、および部分的変性温度でDMIPC分析を実施することにより行うことができる。サンプルが野性型フラグメントのみを含有した場合には、ヘテロ二重鎖が形成される可能性がなかったため、単一ピークがDMIPC分析で見られことができた。
【0246】
発明者らは、ヘテロ突然変異体部位分離温度T(hsst)を予測するための式を開発した。一般に、この式は、等式:
T(hsst)=X+m・T(w) (iv)
により表され、
ここで、T(hsst)はヘテロ突然変異体部位分離温度であり、ここでXはDMIPC検出係数であり、そしてmは0と2との間で選択される重み係数であり;双方の係数はT(w)をT(hsst)に対し補正するのに使用する。
【0247】
本発明の特定の一態様において、T(w)は正常な(すなわち野性型)DNA二重鎖のUV融解プロフィルから決定される融解温度である。別の特定の態様において、T(w)は下述されるとおりソフトウェアにより計算される。mの値は好ましくは0と2との間である。
【0248】
既知のフラグメントの融解挙動の熱力学的数学的モデルを使用して、サンプルそれ自身に対するいかなる実験的作業も伴わずに新たなフラグメントの融解挙動を予測することができる。該モデルは、突然変異の検出のための最適温度を予測するため、およびまた該技術への該フラグメントの適合性を評価するためにも使用される。DNAの融解挙動の模型作成は文献中で十分に開発されている。しかしながら、公表された熱力学的融解手順は、それらを突然変異の検出のための温度予測に完全に使用することができる前に改変しなければならない。
【0249】
本発明の好ましい一態様において、突然変異の検出のためのサンプルのDMIPC分析で使用されるべき融解T(hsst)は、数学的モデルにより予測される。一般的アプローチの一例として、予測されるT(hsst)は、計算されたT(hsst)を得るための計算段階、および予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度を得るための予測段階を含んで成る方法により得ることができる。該計算段階は、第一の数学的モデルに従って、計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度を計算することを含んで成る。該予測段階は、第二の数学的モデルに従って、計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度を補正することを含んで成る。好ましくは、第二の数学的モデルは、計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度との、経験的に決定されたヘテロ突然変異体部位分離温度の比較に基づく。
【0250】
本アプローチの一例において、計算された融解温度は、ポーランド(Poland)のモデルのフィクスマン−フリエル(Fixman−Friere)の実装のような第一の数学的モデルを使用して論理的に導かれる。その後、予測される融解温度が、第二の数学的モデルに従って計算された融解温度を補正することにより論理的に導かれる。第二の数学的モデルの好ましい一例は、第一のモデルに基づく計算された温度を、温度の最適化から観察される経験的に決定された温度と比較することにより開発される補正等式である。該補正等式を使用して、野性型もしくはホモ二重鎖のDNAの配列情報のみを使用してDMIPCの融解のT(hsst)を予測するのことができる。フィクスマン−フリエル(Fixman−Friere)で計算された温度の補正は、熱力学的データを得ることにおいて使用される条件(Breslauerら Proc Natl.Acad.Sci USA 83:3746(1986)(引用することにより本明細書に組み込まれる))と、DMIPCで使用される条件との間の差異を説明するために必要である。
【0251】
数学的モデルから論理的に導かれる等式の一具体的説明は以下であり、これは等式(iv)の特定の一態様である:
Tm0.75’=19.6+0.68・Tm0.75 (v)
式中、Tm’0.75は75%のらせん含有量に対応する予測される温度であり、また、Tm0.75は、0.0001というσ値を使用して、ポーランド(Poland)のモデルのフィクスマン−フリエル(Fixman−Friere)の実装(Poland、Biopolymers 13:1859(1974)およびFixmanら、Biopolymers 16:2693(1977)(双方の参考文献は引用することにより本明細書に組み込まれる))から計算される温度である。図47は、経験的に観察される融解温度に対する計算された融解温度のグラフである。等式(v)は、図47からの40個の点の直線のあてはめを表す図48中の実線から論理的に導かれる。Tm0.75’を表す線の1℃上および下を表す破線もまた図48のグラフ上にプロットされる。これらの破線は、予測されるTm0.75’の正確さが、経験的に決定された値の約1℃以内であると予測してよいことを示す。
【0252】
等式(v)中のT(hsst)は、これが実験的に観察された温度の最適化のデータとT(hsst)の予測される値との間の最良の一致を与えたため、75%のらせん含有量で選択された。当業者は、経験的な温度最適化曲線上の他の点を選択することができ(例えば50%もしくは90%のらせん含有量)、また、計算された温度を得かつ上述されたとおり補正することができることを認識するであろう。
【0253】
T(hsst)を予測するための上の一般的アプローチを使用することの他の例において、マックメルト[MacMelt](商標)(バイオラッド ラボラトリーズ(BioRad Laboratories)、カリフォルニア州ハーキュリーズ)、MELT(Lermanら Meth.Enzymol.155:482(1987))もしくはウィンメルト[WinMelt](商標)(バイオラッド ラボラトリーズ(BioRad Laboratories))のようなソフトウェアを使用して、あるフラグメントの計算された融解プロフィルを得ることができる。
【0254】
Oefnerら Current Protocols in Human Genetics、ワイリー アンド サンズ(Wiley & Sons)、ニューヨーク、Suppl.19:7.10−7.10.12、およびClinical Chem.45:1133−1140(1999)中のJonesら(これらの参考文献は引用することにより本明細書に組み込まれる)により記述される等式のような、T(hsst)の予測される値を与える他の等式を、本発明で使用することができる。
【0255】
T(hsst)の予測される値は、特定のサンプルのサンプルテーブルのようなグラフィカル・ユーザー・インターフェースで人的に入力することができる。
【0256】
本発明の一態様において、使用者は、コンピュータのインターフェースで、ホモ二重鎖の野性型DNAの塩基の配列を入力するか、もしくはbpのフラグメント長さを入力し、また、予測されるT(hsst)の値を入力し、これは、上述されたようなサンプルの分析でオーブン温度制御ソフトウェアモジュールにより使用されるようにディジタルメモリに保存される。
【0257】
本発明の好ましい一態様において、使用者が、コンピュータのインターフェースでホモ二重鎖の野性型DNAの塩基の配列を入力し、T(hsst)を予測するためのコンピュータ内の(もしくはネットワークを通じてのようなコンピュータに連結された)ソフトウェアが、予測されるT(hsst)を生じさせ、これは使用者により場合によっては吟味されることができ、また、これは、上述されたようなサンプルの分析でオーブン温度制御ソフトウェアモジュールにより使用されるようにディジタルメモリに保存されてる。
【0258】
別の好ましい態様において、使用者は、コンピュータのインターフェースでホモ二重鎖の野性型DNAの塩基の配列を入力し、そして、T(hsst)を予測するためのソフトウェア、ならびに溶媒濃度および勾配をコンピュータ計算するためのソフトウェアの双方が一緒に、必要とされるメソッドのパラメータの全部を生じさせ、これは場合によっては吟味されることができ、そしてDMIPC分析が自動的に実施される。
【0259】
本発明の好ましいソフトウェアは、DMIPCによる突然変異の検出のためのデータ入力および評価を助長する新規のグラフィカル・ユーザー・インターフェース画面を提供する。こうしたインターフェースの一態様を具体的に説明する図49は、クリックボタン800によりアクセス可能であるDNA配列画面798を示す。フィールド802は、キーボード、クリップボードもしくはASCIIテキストファイルからDNA配列を入力するためのフィールドを提供する。フラグメント記述フィールド804が、フラグメントの記述を入力するためのフィールドを提供する。塩基対の数が自動的に計算され、フィールド806に表示され、そしてまたサンプルについての関連した勾配テンプレートでも入力される。好ましくは本明細書に記述される等式(v)により予測されるT(hsst)が808に表示される。現在のカーソル位置が810に示される。配列の%GCが812に表示される。
【0260】
図50は、クリックボタン820によりアクセス可能である融解プロフィル画面818を具体的に説明する。この画面は、DNA配列フィールド802で入力された二重鎖フラグメントの、上述された等式(v)のような等式により予測されるところの融解挙動を表示するフィールド822および824を包含する。
【0261】
フィールド822はらせん状画分対温度を示す。特定の一塩基でのらせん度パーセントは、フィールド826で塩基の位置を入力することにより表示することができる。該フィールドが空白のまま残される場合、らせん度の平均パーセントが表示される。いずれの場合も、プロットは計算ボタン828を押すことにより更新される。本明細書に記述されるユーザーインターフェースの全部が、他のコンピュータアプリケーションへの編集、ペーストおよびコピーのための通常のオプションを組込む。
【0262】
フィールド824は、フィールド830、832、834で入力された温度でのフラグメントに沿った変性のパターンを示す。複数の跡(例えば示されるような3個)を、異なる色により識別される異なる温度で表示されることができる。図51は、フラグメントの異なる領域中の突然変異を検出するのに必要とされる温度を決定するためのフィールド824でのグラフの使用を具体的に説明する。破線の跡836は、およそ120ないし209bpからの領域中に配置された突然変異が57℃のオーブン温度で見出されるとみられることを示す一方、実線の跡838は、領域1−120bp中の突然変異が62℃のオーブン温度を必要とするとみられることを示す。第一の温度は、等式(v)のような等式を使用してソフトウェアにより自動的に決定される。第二の温度は、ボックスに試験温度を入力すること、および融解曲線を計算することにより決定することができる。好ましい温度は、約30ないし80パーセントの間のらせん状画分に目的の領域を表示することができる。
【0263】
図52は、840に融解プロフィル画面の別の態様を具体的に説明する。75%らせんに対応する温度を、フィールド842中でフラグメントの大きさ(塩基対)に対しプロットする。温度の目盛りがプロット822のものに合致するように、このプロットを90℃だけ回転させることができる。
【0264】
その最も一般的な形態において、本発明のクロマトグラフィー系で使用される分離方法は、非極性表面を有する静的分離媒体を利用するポリヌクレオチド、例えばDNAの分離に関する。好ましい表面は、ポリヌクレオチドを捕捉する可能性のある多価陽イオン汚染を本質的に含まない。該分離は静止表面上で実施される。該表面は多孔質であることができるが、しかし、好ましくは、いかなる表面の孔も、分析されている最小のポリヌクレオチドを排除する大きさのものである。
【0265】
一態様において、非極性表面はポリマービーズの表面を含んで成る。代替の一態様において、該表面は、成形されたポリマー性モノリス中の細隙空間の表面を含んで成る。本発明の記述を単純化する目的上、そして制限としてでなく、非多孔質ビーズを使用するポリヌクレオチドの分離、およびこうしたビーズの製造法を主として本明細書に記述することができ、ポリマー性モノリスの細隙空間のような他の分離表面が本発明の範囲内に包含されることを意図していることが理解される。棒材のようなモノリスは、溶出溶媒および被検体を通過させる通し孔もしくは細隙空間を有する単一構造としてカラムの内側に形成されておりかつ非極性分離表面を提供する、ポリマー性分離媒体を含有する。
【0266】
一般に、本発明の分離媒体に対する唯一の要件は、それらが、固有に非極性である表面を有しなくてはならないか、もしくは対イオン剤と相互作用するのに十分な非極性を有する表面を形成する素材と結合されなければならないかのいずれかであることである。
【0267】
非多孔質ポリマービーズは、約0.5〜100ミクロン;好ましくは1〜10ミクロン;より好ましくは1〜5ミクロンの平均直径を有することができる。1.0〜3.0ミクロンの平均直径を有するビーズが最も好ましい。
【0268】
米国特許第5,585,236号明細書において、Bonnらは、該核酸分離過程を逆相イオン対形成クロマトグラフィー(RPIPC)として特徴づけた。しかしながら、RPIPCは本発明に記述されるある種の必須の特徴を組込んでいないため、別の用語、マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー(MIPC)を選択した。本明細書で使用されるところのMIPCは、非極性ビーズを使用して一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドを分離するための方法と定義され、ここで、該方法は、対イオン剤、およびビーズから核酸を溶出させるための有機溶媒を使用し、また、ここで、該ビーズは最低0.05のDNA分離係数を有することを特徴とする。好ましい一態様において、ビーズは最低0.5のDNA分離係数を有する。最適な一態様において、ビーズは最低0.95のDNA分離係数を有する。
【0269】
本発明のビーズは、二本鎖および一本鎖DNAのMIPCによる高効率の分離を提供する。ビーズの性能を測定するための有用な一基準は、同時係属中の特許出願第09/183,123号明細書に詳細に記述されるDNA分離係数である。これは、pUC18 DNA−HaeIII制限消化物の257および267塩基対の二本鎖DNAフラグメントの分離として測定され、そして、ピークのベースラインから頂点までの距離に対しての、ピークの間の谷からピークの頂点までの距離の比と定義される。図53の図解を参照すれば、DNA分離係数は、ベースラインからピーク「b」と「c」との間の谷「e」までの距離「a」、および谷「e」からピーク「b」もしくは「c」の一方の頂点までの距離「d」を測定することにより決定される。ピーク高さが等しくない場合は、最高のピークを使用して「d」を得る。DNA分離係数はd/(a+d)の比である。本図解中の257および267塩基対のピークは高さが同様である。本発明の使用できるビーズは最低0.05のDNA分離係数を有する。好ましいビーズは最低0.5のDNA分離係数を有する。
【0270】
理論により束縛されることを願わないが、発明者らは、本明細書で指定されるところのDNA分離係数に従うビーズが、分離されているポリヌクレオチドがビーズに進入することを本質的に排除する孔径を有すると考える。本明細書で使用されるところの「非多孔質」という用語は、その中で使用される溶媒媒体中での分離で最小のDNAフラグメントの大きさおよび形状より小さい直径を有する表面孔を有するビーズを示すと定義する。それらの本来の状態でこれらの指定された最大の大きさの制限を有するか、もしくは必要とされる最大有効孔径に合致するようにそれらの孔径を減少させるよう処理されているポリマービーズが、本定義に包含される。好ましくは、最低0.5のDNA分離係数を提供する全部のビーズが、「非多孔質」ビーズの定義内に包含されることを意図している。
【0271】
本発明の非多孔質ビーズの表面のコンホメーションは、分離過程を妨害しないくぼみ(depression)および浅いくぼみ(pit)様構造を包含することができる。それを非多孔質にするための多孔質ビーズの前処理は、ビーズ構造中の孔を満たすことができかつMIPC過程を大きく妨害しないいかなる素材を用いても遂げることができる。
【0272】
孔は、それを通って移動相および他の物質がビーズ構造に進入することができる開放構造である。孔は、しばしば、1個の孔に進入する液体が別の孔から出ることができるように相互に連結されている。発明者らは、相互に連結される孔構造およびビーズ中へのポリヌクレオチドの動きを可能にする寸法を有する孔は、分離の分離度を損なうか、もしくは非常に長い保持時間を有する分離をもたらすと考える。しかしながら、MIPCにおいては、ビーズは「非多孔質」であり、そしてポリヌクレオチドはビーズ構造に進入しない。
【0273】
カラムビーズのクロマトグラフィー効率は、主として表面および近表面領域の特性により影響される。この理由から、以下の記述はとりわけポリマービーズの表面に近い領域に関する。こうしたビーズの本体および/もしくは中心は、本発明のポリマービーズの表面もしくは表面近くで観察されるものと全く異なった化学および物理特性の組を表す可能性がある。
【0274】
本発明の別の態様において、分離媒体は棒状様モノリスカラムのようなポリマー性モノリスの形態であることができる。モノリスカラムは、下の実施例に記述されるとおり、管の内側の単一の単位として重合もしくは形成される。通し孔もしくは細隙空間が溶出溶媒および被検体物質の通路を提供する。分離は静止表面上で実施される。表面は多孔質であることができるが、しかし好ましくは非多孔質である。分離の形態および機能は、ビーズで充填されたカラムに同一である。ビーズでのように、棒材中に含有される孔はDNAと適合性でなくてはならず、かつ、該物質を捕捉してはならない。また、棒材は、DNAを捕捉することができる汚染を含有してはならない。
【0275】
本発明の成形されたポリマー性棒材は、クロマトグラフィーカラムの範囲内のバルクフリーラジカル重合により製造される。棒材のベースポリマーは多様な重合可能な単量体から製造することができる。例えば、モノリス棒材は、スチレン、置換スチレン、α−置換スチレンおよびジビニルベンゼンのようなモノおよびジビニル置換芳香族化合物;アクリレートおよびメタクリレート;ポリプロピレンおよびポリエチレンのようなポリオレフィン;ポリエステル;ポリウレタン;ポリアミド;ポリカーボネートを包含するポリマー;ならびに商標テフロン[TEFLON]で公知のフルオロ置換エチレンを包含する置換ポリマーから作成することができる。ベースポリマーはまたポリマーの混合物であることもでき、その制限しない例は、ポリ(グリシジルメタクリレートコエチレンジメタクリレート)、ポリ(スチレン−ジビニルベンゼン)およびポリ(エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン)を包含する。棒材は、置換されないことができるか、または炭化水素アルキルもしくはアリール基のような置換基で置換されることができる。アルキル基は、場合によっては、直鎖もしくは分枝状鎖中に1ないし1,000,000個の炭素を有し、そして、アルデヒド、ケトン、エステル、エーテル、アルキル基などを包含する多様な型の直鎖、分枝状鎖、環状、飽和、不飽和の非イオン性官能基を包含し、また、アリール基は、フェニル、ナフチルなどを包含する単環、二環および三環の芳香族炭化水素基を包含する。好ましい一態様において、アルキル基は1−24個の炭素を有する。より好ましい一態様において、アルキル基は1−8個の炭素を有する。置換はまた、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ基、もしくは非極性の逆相官能基であると考えられる同様のものも含有することもできる。炭化水素の置換方法は当該技術分野で慣習的かつ公知であり、そして本発明の一局面でない。ポリマー性モノリスの製造法は、以下の参考文献、すなわちWangら(J.Chromatog.A 699:230(1994))、Petroら(Ana.Chem.68:315(1996))、および以下の米国特許第5,334,310号;同第5,453,185号;同第5,522,994号明細書(Frechetへ)に記述されるところの当該技術分野で公知の慣習的方法による。モノリスもしくは棒材カラムは、メルク アンド カンパニー(Merck & Co)(ドイツ・ダルムシュタット)から商業的に入手可能である。
【0276】
本発明の非多孔質ポリマービーズは二段階の工程により製造され、ここで、小さい種ビーズが適する重合可能な単量体の乳化重合により最初に製造される。本発明の乳化重合手順は、Goodwinら(Colloid & Polymer Sci.、252:464−471(1974))の手順の変法である。種ビーズを製造するための乳化重合工程で使用することができる単量体は、スチレン、アルキル置換スチレン、α−メチルスチレンおよびアルキル置換α−メチルスチレンを包含する。その後、種ビーズを拡大させ、そして場合によっては多様な基での置換により修飾して、本発明の非多孔質ポリマービーズを製造する。
【0277】
乳化重合により製造される種ビーズは、ポリマービーズの大きさを増大させるためのいずれかの既知の方法により拡大することができる。例えば、ポリマービーズは、米国特許第4,563,510号明細書に開示される活性化膨潤工程により拡大することができる。拡大もしくは膨潤されたポリマービーズは、架橋する重合可能な単量体および重合開始剤を用いてさらに膨潤される。重合は、拡大されたポリマービーズの架橋密度を増大させ、かつ、ビーズの表面多孔性を減少させる。適する架橋単量体は、開始剤の存在下で重合が可能な最低2個の炭素−炭素二重結合を含有する。好ましい架橋単量体は、ジビニル単量体、好ましくはアルキルおよびアリール(フェニル、ナフチルなど)ジビニル単量体であり、そしてジビニルベンゼン、ブタジエンなどを包含する。ポリマーの種ビーズの活性化膨潤は、1から約100ミクロンまでの範囲にわたる平均直径を有するポリマービーズを製造するのに有用である。
【0278】
あるいは、ポリマーの種ビーズは、乳化重合から生じる種ラテックスを単に加熱することにより拡大することができる。この代替は、活性化溶媒での種ビーズの活性化膨潤の必要性を排除する。代わりに、種ラテックスを、架橋単量体のための水と混合可能な溶媒と一緒にもしくはそれを伴わずに、上述された架橋単量体および重合開始剤と混合する。適する溶媒はアセトン、テトラヒドロフラン(THF)、メタノールおよびジオキサンを包含する。生じる混合物を、重合開始剤の開始温度より下の温度、一般に約10℃−80℃、好ましくは30℃−60℃で約1−12時間、好ましくは約4−8時間加熱する。場合によっては、混合物の温度を10−20%だけ増大させることができ、そして混合物を追加の1ないし4時間加熱することができる。重合開始剤に対する単量体の比は、最低200の重合度を確実にするために、最低100:1、好ましくは約100:1ないし約500:1、より好ましくは約200:1である。この重合度を有するビーズは、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)の応用で使用されるのに十分に圧に安定である。この熱的膨潤工程は、ビーズの大きさを約110−160%だけ増大させて約5ミクロン、好ましくは約2−3ミクロンまでの平均直径を有するポリマービーズを得ることを可能にする。従って、熱的膨潤手順は、活性化膨潤手順によってのみ以前に到達可能なより小さい粒子径を製造するのに使用することができる。
【0279】
熱的拡大の後に、過剰の架橋単量体を除去し、そして紫外光もしくは熱への曝露により粒子を重合させる。重合は、例えば、拡大された粒子の重合開始剤の活性化温度への加熱、および所望の重合度が達成されるまで重合を継続することにより実施することができる。継続された加熱および重合は、500より大きい重合度を有するビーズを得ることを可能にする。
【0280】
本発明において、Bonnら、もしくは米国特許第4,563,510号明細書により開示された充填材料を、アルキル基でのポリマービーズの置換により修飾することができるか、もしくは、その修飾されない状態で使用することができる。例えば、ポリマービーズを、ヨウ化メチルもしくはヨウ化エチルのようなアルキル化剤とビーズを接触させることにより1もしくは2個の炭素原子でアルキル化することができる。アルキル化は、ポリマービーズをフリーデル−クラフツ触媒の存在下にアルキルハロゲン化物と混合して、ポリマーブレンドの表面の芳香環で親電子芳香族置換を遂げることにより達成する。適するフリーデル−クラフツ触媒は当該技術分野で公知であり、そして塩化アルミニウム、三フッ化ホウ素、四塩化スズなどのようなルイス酸を包含する。ビーズは、例えば上の手順でヨウ化メチルの代わりに対応する炭化水素ハロゲン化物を用いることにより炭化水素置換することができる。
【0281】
本発明のビーズに関して本明細書で使用されるところのアルキルという用語は、1から1,000,000個までの炭素を有するアルキルおよびアルキル置換アリール基を包含すると定義し、アルキル基は、アルデヒド、ケトン、エステル、エーテル、アルキル基などを包含する多様な型の直鎖、分枝状鎖、環状、飽和、不飽和の非イオン性官能基を包含し、また、アリール基はフェニル、ナフチルなどを包含する単環、二環および三環の芳香族炭化水素基として包含する。アルキル置換方法は当該技術分野で慣習的かつ公知であり、そして本発明の一局面でない。置換はまた、非極性の逆相官能基であると考えられるヒドロキシ、シアノ、ニトロ基なども含有することができる。
【0282】
Bonnの特許で報告されたクロマトグラフィー素材は、最低3個の炭素を有するアルキル基で置換された非多孔質ビーズに限定された。Bonnらはこの置換を欠くポリマービーズを使用して分離を得ることにおいて成功しなかったからである。加えて、該ポリマービーズは、小さな群のビニル芳香族単量体に限定され、また、Bonnらは、他の素材を用いて二本鎖DNAの分離を遂げることが不可能であった。
【0283】
本発明において、二本鎖DNAの成功裏の分離は、誘導体化されない非多孔質ビーズを使用して、ならびに、1ないし1,000,000個の炭素を有するアルキル基で誘導体化されたビーズを使用して、達成することができる。
【0284】
本発明のベースポリマーは他のポリマーでもあることもまたでき、その制限しない例は、スチレン、置換スチレン、α−置換スチレンおよびジビニルベンゼンのようなモノおよびジビニル置換芳香族;アクリレートおよびメタクリレート;ポリプロピレンおよびポリエチレンのようなポリオレフィン;ポリエステル;ポリウレタン;ポリアミド;ポリカーボネート;ならびに、商標テフロン[TEFLON]で公知のフルオロ置換エチレンを包含する置換ポリマーを包含する。ベースポリマーはまたポリマーの混合物であることもでき、その制限しない例はポリ(スチレン−ジビニルベンゼン)およびポリ(エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン)を包含する。これらのポリマーからのビーズの作成方法は当該技術分野で慣習的かつ公知である(例えば、米国特許第4,906,378号明細書を参照されたい)。ビーズの表面および近表面領域の物理特性は、クロマトグラフィー効率に対する支配的な影響である。ポリマーは、誘導体化されるにしろされないにしろ、MIPC分離に非多孔質、非反応性、かつ非極性の表面を提供しなければならない。
【0285】
本発明の分離方法の記述は、制限としてでなくしかし提示を単純化するために、上述された非極性表面をもつポリマービーズに関して提示される。分離表面は上述されたモノリスのポリマー性素材によってもまた提供されることができるか、もしくは、それらは、下述される非極性表面をもつ無機ポリマーにより提供されることができ、そして、これらの素材の全部を包含する方法および系が本発明の範囲内に包含されることを意図していることが理解されるべきである。
【0286】
本発明のビーズは、同時係属中の特許出願第09/183,450号明細書(その完全な内容はこれにより引用することにより組み込まれる)に記述される素材のような、その表面に結合されたもしくはその上に被覆された非極性分子もしくは非極性ポリマーを有する非多孔質粒子を含んで成る。一般に、該ビーズは、ポリマーで被覆されているか、または、実質的に全部の表面基質基が非極性炭化水素もしくは置換炭化水素基と反応されかついかなる残存する表面基質基も上述されるようにトリ(低級アルキル)クロロシランもしくはテトラ(低級アルキル)ジクロロジシラザンでエンドキャッピングされている、非多孔質粒子を含んで成る。
【0287】
非多孔質粒子は、好ましくは無機粒子であるが、しかし非多孔質有機粒子であることができる。非多孔質粒子は、例えば、シリカ、シリカカーバイド、亜硝酸シリカ、酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化ジルコニウム、炭素、セルロースのような不溶性多糖、もしくはケイソウ土、または非多孔質であるように改変されたこれらの素材のいずれかであることができる。炭素粒子の例は、いかなる妨害する汚染物質も除去するように処理されているダイアモンドおよびグラファイトを包含する。好ましい粒子は本質的に非変形性でありかつ高圧に耐えることができる。非多孔質粒子は既知の手順により製造される。好ましい粒子径は約0.5−100ミクロン;好ましくは1−10ミクロン;より好ましくは1−5ミクロンである。1.0−3.0ミクロンの平均直径を有するビーズが最も好ましい。
【0288】
慣習的なシリカに基づく逆相HPLC素材の製造の化学は公知であるため、本明細書の本発明のビーズの記述の大部分はシリカに関して提示される。しかしながら、上に列挙されたもののような他の非多孔質粒子を同一の様式で修飾することができ、また、本発明の方法でシリカの代わりに用いることができることが理解されるべきである。シリカの一般的化学の記述については、Colin F.PooleとSalwa K.Poole、Chromatography Today、エルゼビア(Elsevier):ニューヨーク(1991)、pp.313−342、およびSnyder,R.L.とJ.J.Kirkland、Introduction to Modern Liquid Chromatography、第2版、ジョン ワイリー アンド サンズ インク(John Wiley & Sons,Inc.):ニューヨーク(1979)、pp.272−278(それらの開示はこれによりそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
【0289】
本発明の非多孔質ビーズは、被覆もしくはケイ酸化(silating)試薬との反応後に最小限の露出されたシラノール基を有することを特徴とする。最小限のシラノール基は、支持体とのDNAの相互作用を減少させるため、ならびにまた高いpHおよび水性の環境中での素材の安定性を向上させるために必要とされる。シラノール基は、それらがDNA分子の負の電荷に反発してカラムの固定相とのDNAの相互作用を予防もしくは制限する可能性があるために、有害である可能性がある。相互作用の別の可能な機構は、シラノールがイオン交換部位として作用して鉄(III)もしくはクロム(III)のような金属を取り込む可能性があることである。鉄(III)もしくはカラム上に捕捉される他の金属は、DNAのピークを歪める可能性があるか、もしくはDNAがカラムから溶出されることを予防さえする可能性がある。
【0290】
シラノール基は水に基づく移動相により加水分解される可能性がある。加水分解は、より多くのシラノール基を露出させることにより、もしくはシリカコア中に存在する可能性のある金属を露出させることにより、固定相の極性および反応性を増大させることができる。加水分解は、増大された誘導体化されないシラノール基でより優勢であることができる。DNA分離に対するシラノール基の影響は、妨害のどの機構が最も優勢であるかに依存する。例えば、鉄(III)は、鉄(III)が移動相中に存在するか、機器中に存在するか、もしくはサンプル中に存在するかに依存して、露出されたシラノール部位に結合されたようになる可能性がある。
【0291】
金属の影響は、金属が系もしくは試薬内に既に存在する場合にのみ発生する可能性がある。系もしくは試薬内に存在する金属は、シリカ上のイオン交換部位により捕捉されたようになる可能性がある。しかしながら、系もしくは試薬内に金属が存在しない場合には、シラノール基それら自身がDNA分離の妨害を引き起こす可能性がある。水性環境による露出されたシラノール部位の加水分解は、シリカコア中に存在するかもしれない金属を露出させる可能性がある。
【0292】
完全に加水分解されたシリカは、表面1平方メートルあたり約8マイクロモルのシラノール基の濃度を含有する。せいぜい、立体構造の考慮により、最大で1平方メートルあたり約4.5マイクロモルのシラノール基が反応する可能性があり、シラノールの残部は反応された基により立体的に遮蔽される。最小限のシラノール基は、シラノール基が分離を妨害することを予防するのに十分な遮蔽の理論的限界に達するもしくはそれを有すると定義される。
【0293】
非多孔質のシリカコア粒子を形成するための多数の方法が存在する。例えば、メタノール中に注がれたケイ酸ナトリウム溶液は、ケイ酸ナトリウムの微細に分割された球形粒子の懸濁物を生じさせることができる。これらの粒子は酸との反応により中和される。こうして、約1−2ミクロンの直径を有するシリカゲルの球形粒子が得られる。シリカは、有機液体もしくは蒸気から沈殿させることができる。高温(約2000℃)でシリカは蒸発され、そして該蒸気は、温度の低下もしくは酸化ガスを使用することのいずれかにより凝縮されて微細に分割されたシリカを形成することができる。シリカの合成および特性は、R.K.Ilerにより、The Chemistry of Silica,Solubility,Polymerization,Colloid and Surface Properties,and Biochemistry、ジョン ワイリー アンド サンズ(John Wiley & Sons):ニューヨーク(1979)に記述されている。
【0294】
W.Stoberらは、J.Colloid and Interface Sci.、26:62−69(1968)に、ミクロンの大きさ範囲の単分散シリカ球体の制御された成長を記述した。Stoberらは、アルキルケイ酸塩の加水分解およびアルコール溶液中でのケイ酸のその後の凝縮によって、均一な大きさの球形のシリカ粒子の制御された成長を可能にする、化学反応の系を記述する。形態的触媒としてアンモニアを使用する。懸濁物中で得られる粒子径は、直径が0.05μm未満から2μmまでの範囲にわたる。
【0295】
非多孔質シリカコアビーズは、ミクラ サイエンティフィック(Micra Scientific)(イリノイ州ノースブルック)およびケミーエ ユティコン(Chemie Uetikkon)(スイス・ローザンヌ)から得ることができる。
【0296】
本発明の非多孔質ビーズを製造するためには、非多孔質粒子を、非多孔質粒子の実質的に全部の表面基質基が非極性炭化水素もしくは置換炭化水素基で封鎖されるように、ポリマーで被覆するかもしくは反応させかつエンドキャッピングする。これはいくつかの方法により達成することができる。
【0297】
有機結合された相のシロキサンコーティングは、単分子層もしくは重合された多層コーティングとして作成することができる。いわゆる単分子有機層をもつ充填剤は、通常、シリカ質基礎粒子の表面シラノール基を一、二もしくは三官能性のクロロ、ジメチル、アミノ、シロキシもしくはアルコキシシランと反応させることにより製造する。これらの反応で使用される典型的な一官能性反応体はX−Si−Rを包含し、ここでX=Cl、OH、OCH3もしくはOC2H5、また、Rは有機基である。図54は、シリカコア902および単分子有機層を有するビーズ900の図解である。(該図は、本発明のビーズの形態学もしくは孔構造を必ずしも反映せず、そして具体的説明の目的上のみ意味される。)
表面の修飾にR2SiX2およびRSiX3のような二および三官能性反応体を使用すれば、結合された官能基あたり2個までのSi−X基が反応されないまま留まる。水での処理後に、これらの反応されない基の加水分解が起こり、そして付加的なシラノール基が、充填剤中に存在する結合された有機官能基とほぼ同一濃度で(ときにポリマーマトリックス中で)形成される。これらの酸性有機シラノール基は、溶質の保持挙動に有意に影響を及ぼす可能性があり、また、pH>7の水性溶液中での充填剤の安定性に悪影響を及ぼす。
【0298】
従って、シラン試薬との表面の不完全な反応、または二もしくは三官能性の修飾剤を使用することからの新たなSi−OH基の形成は、移動相もしくはサンプルの分子に容易に到達可能である残余の酸性のSi−OH基の集団をもたらす可能性がある。従って、最近の傾向は、(a)部分的被覆の代わりに官能基の密な単層、および(b)残余のSi−OH基の最小限の可能性を伴う均質な有機コーティングを提供するための一官能性のジメチルシラン[X−Si(CH3)2−R]の使用に向かっている。必要とされる有機官能性を調製することができる場合はモノクロロシラン試薬が好ましい。一官能性修飾剤中のR基の2個がメチルである場合、表面被覆は(炭素分析に基づき)1平方メートルの有機物あたり約4マイクロモル程度であることができる。後者の場合、シリカ表面上の残余のSi−OH基は、立体遮蔽のため、大部分の溶質とのクロマトグラフィー相互作用に利用不可能である。
【0299】
有機シラノール(例えばHO−Si−R3)もしくは有機アルコキシ(例えばRO−Si−R3)シランのシリカ支持体との重合を伴わない反応もまた、良好な充填剤を生じさせることができる。これらの反応は比較的再現可能であるが、但し、痕跡の水もしくは他の反応性種が存在しない。反応されない到達可能なシラノールが最初の反応後に残る可能性があるが、しかし、これらはクロロトリメチルシランでの充填剤のキャッピングにより除去することができる(但し、R基が後者のシランと反応しない)。
【0300】
一方法により、非多孔質粒子はポリマーコーティングで被覆される。該粒子の被覆での使用に適するポリマーは、連鎖反応ポリマーおよび段階反応ポリマー、例えば、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリアミド、セルロースのような不溶性多糖、ポリジメチルシロキサン、ポリジアルキルシロキサンおよび関係する素材を包含する。ポリマーコーティングは、表面の完全な遮蔽が達成されるように、多被覆工程によって非多孔質粒子に結合することができる。
【0301】
最近数年に、ポリマーで被覆されたもしくはポリマーで被包化された充填剤として知られる新たな結合された相の充填剤が、開放管カラムガスクロマトグラフィーのための固定された固定相を製造するのに使用される技術に基づき導入されている。この場合、該相は、裸のシリカもしくは前シラン化された(presilanized)シリカのいずれかの微粒子をポリ(シロキサン)もしくはポリ(ブタジエン)プレポリマーで機械的に被覆することにより製造され、それがその後、過酸化物、アゾ−tert−ブタンもしくはγ放射に誘導される化学的架橋反応により固定される。図55は、シリカコア906およびポリマーコーティング908を有する被覆されたビーズ904の図解である。(該図は、本発明のビーズの形態学もしくは孔構造を必ずしも反映せず、かつ、具体的説明の目的上のみ意味される。)
代替の一方法は、ビニルを含有するシラン分子と共有結合すること、およびその後粒子の表面上のコーディングを重合することの組み合わせを含んで成る。残余のシラノール基もしくは金属基が存在する場合は、第二のコーティングを適用することができる。
【0302】
本方法の一変形物において、シリカ表面を最初にビニルトリクロロシランとの反応により修飾し、次いでアクリル酸誘導体を誘導体化されたシリカ表面にかつその上に重合する。多数の有用な単量体およびプレポリマーの利用可能性が、広範な逆相、極性およびイオン交換充填剤が同一の一般的反応を使用して製造されることを可能にした。また、一般的アプローチは下にある支持体の化学に依存しないため、シリカ以外の素材、例えばアルミナおよび酸化ジルコニウムを修飾しかつ例えばpH範囲2−7.5の外側の移動相を用いるシリカが適しない条件下で使用することができる。シリカに戻れば、前シラン化は活性のシラノール基の数を減少させ、それらはその後表面上に固定されるポリマー性薄膜によりさらに遮蔽される。逆相液体クロマトグラフィーにおいて、これらの充填剤は、塩基性溶質の分離のための単量体の化学的に結合された相に比較して、改良されたクロマトグラフィー特性を示した。ポリマーで被包化された充填剤は、理にかなった物質移動の特徴を維持するための約1nmの薄膜厚を有する。この手順の記述はEngelhartら(Chromatographia、27:535(1989))により発表された。
【0303】
上の方法のいずれかにより製造されたポリマー被覆されたビーズは、それらの修飾されない状態で使用することができるか、もしくは炭化水素基での置換により修飾することができる。いかなる炭化水素基も適する。本明細書で使用されるところの「炭化水素」という用語は、1から1,000,000個までの炭素を有するアルキルおよびアルキル置換アリール基を包含すると定義され、アルキル基は、アルデヒド、ケトン、エステル、エーテル、アルキル基などを包含する多様な型の直鎖、分枝状鎖、環状、飽和、不飽和の非イオン性官能基を包含し、また、アリール基は、フェニル、ナフチルなどを包含する単環、二環および三環の芳香族炭化水素として包含する。炭化水素の置換方法は当該技術分野で慣習的かつ公知であり、そして本発明の一局面でない。炭化水素はまた、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ基、もしくは非極性の逆相官能基であると考えられる同様のものも含有することができる。好ましい炭化水素基はアルキル基であり、また、下の適する置換方法の記述は、単純化の目的上かつ制限としてでなく、アルキル化として提示され、慣習的手順によるアリール置換もまた本発明の範囲内に包含されることを意図していることが理解される。
【0304】
ポリマー被覆されたビーズは、ヨウ化アルキルのような対応するアルキルハロゲン化物との反応によりアルキル化することができる。アルキル化は、ポリマー被覆されたビーズをフリーデル−クラフツ触媒の存在下にアルキルハロゲン化物と混合して、ポリマーブレンドの表面の芳香環で親電子芳香族置換を遂げることにより達成する。適するフリーデル−クラフツ触媒は当該技術分野で公知であり、そして塩化アルミニウム、三フッ化ホウ素、四塩化スズなどのようなルイス酸を包含する。1から1,000,000個まで、および好ましくは1から22個までの炭素を有する炭化水素基での置換を、これらの方法により遂げることができる。23から1,000,000個までの炭素を有する炭化水素基は、本明細書で炭化水素ポリマーとして参考文献として引用される。
【0305】
アルキル化は多数の既知の合成手順により達成することができる。これらは、アルキルハロゲン化物を用いるフリーデル−クラフツアルキル化、エーテルを形成するためのクロロメチル化されたビーズへのアルキルアルコールの結合などを包含する。本発明のポリマー被覆されたビーズの好ましいアルキル化方法は、ポリマーコーティングが非多孔質粒子上で形成された後のアルキル化であるとは言え、アルキル化の代替の一方法は、アルキル化された単量体を重合して非多孔質粒子上にアルキル化されたポリマーのコーティングを形成することである。本態様において、単量体は、例えば分離変数の要件に依存して、いずれかの数の炭素原子、例えば1から100まで、1ないし50もしくは1ないし24個を有するアルキル基で置換することができる。
【0306】
ポリマーコーティングに対する一代替として、非多孔質粒子を、アルキル基、もしくはシアノ、エステルおよび他の非イオン性基を包含する他の非極性官能基で官能性化することができ、次いで完全なエンドキャッピング過程でシラノールおよび金属の相互作用を減少させることができる。非多孔質粒子のエンドキャッピングは、例えば、トリメチルクロロシランもしくはジクロロテトライソプロピルジシラザンのようなトリアルキルクロロシランもしくはテトラアルキルジクロロジシラザンと粒子を反応させることにより達成することができる。
【0307】
多数の因子が、結合反応の成功および最終的な結合された相の生成物の質に影響する。結合反応の速度および程度は、シランの反応性、溶媒および触媒の選択、時間、温度、ならびに基質に対する試薬の比に依存する。脱離基としてのCl、OH、OR、N(CH3)2、OCOCF3およびエノレートをもつ反応性有機シランが広範に使用されている。ジメチルアミン、トリフルオロアセテート、およびペンタン−2,4−ジオンのエノールエーテルが最も反応性の脱離基であるとは言え、経済性、利用可能性および熟知が、とりわけ商業的製造元の間で最も広範に使用されているクロロシランおよびアルコキシシランをもたらす。当初、反応はほぼ化学量論的であることができるが、しかし、表面被覆が最大値に近づく際に、反応は非常に遅くなる。この理由から、反応時間は長くなる傾向にあり(12〜72時間)、反応温度は中程度に高くなる傾向があり(大部分の場合で約100℃)、そして、クロロシランの場合には酸受容体触媒(例えばピリジン)が使用される。アルキルシリルエノレートおよびアルキルシリルジメチルアミンのようないくつかの試薬は、該反応を実施するための付加的な触媒、もしくは溶媒さえ必要としない。使用される最も普遍的な溶媒はトルエンおよびキシレンであるとは言え、四塩化炭素、トリクロロエタンおよびジメチルホルムアミド(DMF)のような他の溶媒が優れているとして推奨されてきた。該結合反応は不活性雰囲気中で還流することにより実施するため、溶媒はしばしば有機シランに対する良好な溶媒である、および還流で所望の反応温度に到達するそれらの能力に基づき選択される。3−シアノプロピルシロキサン結合された相を除き、ある種の極性官能基(例えばOHなど)に対するクロロシランの高い反応性は、極性の逆相の結合された相の製造のためのこれらの基の使用を予め除外する。酸性もしくは塩基性の官能基を含有するアルコキシシランは自己触媒性であり、そして、結合された相は、通常、不活性溶媒中、表面のシラノール基との縮合反応により形成されるアルコールを蒸留分離するのに十分高温でシランを還流することにより製造する。中性の極性リガンドの結合は、一般に、シリカの単層被覆を生じさせるのに十分な水の存在下に、トルエン−4−スルホン酸もしくはトリエチルアミンのような触媒の添加を必要とする。水の存在は、溶液中で重合するよりはむしろ表面シラノール基と反応する傾向がある吸着された有機シランのアルコキシ基の加水分解を加速する。表面シラノール基が物理的に吸着された有機シランにより封鎖されて、理論的に予測される最大よりも低い結合された相の密度を操作後に生じさせることが、極性の結合された相の製造で一般的な問題であるようである。結合された相の密度は、反応を第二の回反復することにより増大させることができるか、もしくは、露出されたシラノール基はエンドキャッピングにより最小限にすることができる。
【0308】
大部分の結合された相は、ケイ素に結合された単一官能性化されたリガンドを含有する有機シランから製造され、残存する基は脱離基および/もしくはメチル基であるとは言え、より高度に置換された有機シランもまた使用することができる。1,3−ジクロロテトライソプロピルジシラザンのような二官能性有機シランは、鎖の両端の表面シラノール基と反応することが可能であり、慣習的有機シランから形成される結合された相よりもより加水分解的に安定である結合された相を形成する。二歯の(bidentate)有機シランは、シリカ表面上のシラノール基の間隔により緊密に合致する反応性部位を有し、そして、双方の脱離基が同一のケイ素原子に結合されて、ジクロロシランで達成されるより大きい結合された相の被覆を提供する。アルキルジメチルシランについては、アルキル基の長さを増大させることは、トリメチルシリル結合されたリガンドのものに関して結合された相の加水分解の安定性を増大させる。メチル基の鎖長を増大させることは、結合された相の加水分解の安定性を増大させるが、しかし、立体効果により相の被覆を低下させる。シランのケイ素原子上に1もしくは2個の嵩高い基、例えばイソプロピルもしくはt−ブチルを含有する一官能性有機シランの使用が、低いpHでの使用のための結合された相の製造でより重要になる可能性がある。嵩高いアルキル基は、メチル基が提供するよりも、充填剤表面上の加水分解的に感受性のシロキサン基に対するより良好な立体保護を提供する。
【0309】
シリカ支持体の被覆およびエンドキャッピングの一般的方法は公知の技術である。しかしながら、これらの素材を使用したことのある者の一般的理解は、それらが高性能の二本鎖DNA分離に適しないことである。しかしながら、本発明のビーズは、シリカコアの徹底的な遮蔽を遂げるような被覆およびエンドキャッピング手順のより慎重な適用により形成され、生じるビーズは、一本鎖および二本鎖双方のDNAの迅速な分離を実施する能力を有し、それは例えば米国特許第5,585,236号明細書に開示されるアルキル化された非多孔質ポリマービーズを使用して達成されるものに等しいかもしくはそれより良好である。
【0310】
ビーズの表面が最小限のシラノールもしくは金属酸化物の露出を有すること、および、表面が非多孔質のままであることを確実にするために、ビーズの製造の間は注意が払われなければならない。
【0311】
本発明の重要な一局面において、本発明のビーズおよび他の媒体は、DNAを結合する可能性のある少量の金属汚染物質もしくは他の汚染物質を有することを特徴とする。本発明の好ましいビーズは、いかなる多価陽イオン汚染物質(例えば、Fe(III)、Cr(III)もしくはコロイド状金属汚染物質)も実質的に排除するよう設計された酸洗浄処理のような除染処理を包含する、製造の間の予防措置にさらされていることを特徴とする。生じるビーズが最小限の金属含有量を有することができるために、非常に純粋な金属を含有しない素材のみをビーズの製造で使用すべきである。
【0312】
実質的に金属を含まないビーズそれら自身に加え、発明者らは、MIPCの間に最適なピーク分離を達成するためには、分離カラム、およびカラム内に保持されるもしくはカラムを通って流れる全部の工程溶液が、好ましくは多価陽イオン汚染物質を実質的に含まないこともまた見出した。共通に所有される米国特許第5,772,889号;同第5,997,742号;および同第5,972,222号明細書、ならびに同時係属中の米国特許出願第09/080,547号明細書(1998年5月18日に出願された)に記述されるとおり、これは、分離カラムを多価陽イオン汚染から保護するために、カラム内に保持されるもしくはカラムを通って流れる工程溶液中に多価陽イオンを放出しない素材から作成された工程溶液接触表面を有する構成部品をカラムに進入する溶液に供給しかつそれをフィードすることことにより達成することができる。系の構成部品の工程溶液接触表面は、好ましくは、チタン、被覆ステンレス鋼、不動態化ステンレス鋼および有機ポリマーより成る群から選択される素材である。
【0313】
多価陽イオン結合剤、例えばキレート剤をMIPC分離で使用する2つの場所が存在する。一態様において、これらの結合剤は、それを移動相が通過する固体に組込むことができる。汚染物質は、分離に害を与える可能性のある系内の場所にそれらが達する前に捕捉される。これらの場合、官能基が固体マトリックスもしくは樹脂(例えば貫流カートリッジ、通常は有機ポリマー、しかしときにシリカもしくは他の素材)に結合される。該マトリックスの容量は、好ましくは約2m等量/gである。適するキレート樹脂の一例は、イミノジアセテート官能基を含有する、商標ケレックス[CHELEX]100(ダウ ケミカル カンパニー(Dow Chemical Co.))で入手可能である。
【0314】
別の態様においては、多価陽イオン結合剤を移動相に添加することができる。結合する官能基が有機化学構造中に組み込まれる。好ましい多価陽イオン結合剤は3つの要件を満たす。第一に、それは移動相中で可溶性である。第二に、金属との錯体が移動相中で可溶性である。EDTAのような多価陽イオン結合剤は、キレート剤および多価陽イオン結合剤−金属複合体の双方が、それら双方を水溶性にする電荷を含有するため、この要件を満たす。また、例えばアセトニトリルの場合、いずれの沈殿物も添加されない。水性移動相中での可溶性は、硫酸塩、カルボン酸塩もしくはヒドロキシのような共有結合されたイオン性の官能性を付加することにより高めることができる。好ましい多価陽イオン結合剤は、水、有機溶媒もしくは移動相で洗浄することによりカラムから容易に除去することができる。第三に、結合剤はクロマトグラフィー過程を妨害してはならない。
【0315】
多価陽イオン結合剤は配位化合物であることができる。好ましい配位化合物の例は、水溶性キレート剤およびクラウンエーテルを包含する。本発明で使用することができる多価陽イオン結合剤の制限しない例は、アセチルアセトン、アリザリン、アルミノン、クロラニル酸、コウジ酸、モリン、ロジゾン酸、チオナリド、チオ尿素、α−フリルジオキム、ニオキシム、サリチルアルドキシム、ジメチルグリオキシム、α−フリルジオキシム、クペロン、α−ニトロソ−β−ナフトール、ニトロソ−R−塩、ジフェニルチオカルバゾン、ジフェニルカルバゾン、エリオクロムブラックT、PAN、SPADNS、グリオキサルビス(2−ヒドロキシアニル)、ムレキシド、α−ベンゾインオキシム、マンデル酸、アントラニル酸、エチレンジアミン、グリシン、トリアミノトリエチルアミン、チオナリド、トリエチレンテトラミン、EDTA、金属フタレイン、アルソン酸、α,α’−ビピリジン、4−ヒドロキシベンゾチアゾール、8−ヒドロキシキナルジン、8−ヒドロキシキノリン、1,10−フェナントロリン、ピコリン酸、キナルジン酸、α,α’,α’’−ターピリジル、9−メチル−2,3,7−トリヒドロキシ−6−フルオロン、ピロカテコール、サリチル酸、チロン、4−クロロ−1,2−ジメルカプトベンゼン、ジチオール、メルカプトベンゾチアゾール、ルベアン酸、シュウ酸、ジエチルジチオカルバルバメートナトリウムおよびジベンジルジチオカルバメート亜鉛を包含する。これらおよび他の例は、Perrinにより、Organic Complexing Reagents:Structure,Behavior,and Application to Inorganic Analysis、ロバート E.クリーガー パブリッシング カンパニー(Robert E.Krieger Publishing Co.)(1964)に記述される。本発明において好ましい多価陽イオン結合剤はEDTAである。
【0316】
ポリヌクレオチドの高分離度のクロマトグラフィー分離を達成するために、クロマトグラフィーカラムを固定相のポリマービーズできつく充填することが一般に必要である。十分な高分離度の分離を得るために、カラム充填剤でのカラムのいずれかの既知の充填方法を本発明で使用することができる。典型的には、ポリマービーズの密度に等しいかもしくはそれより小さい密度を有する溶媒を使用して、ポリマービーズのスラリーを調製する。その後、カラムをポリマービーズのスラリーで満たし、そして振動もしくは攪拌してカラム中でのポリマービーズの充填密度を向上させる。充填密度を向上させるのに、機械的振動もしくは超音波処理を典型的に使用する。
【0317】
例えば、50×直径4.6mmのカラムを充填するために、2.0グラムのビーズを、超音波処理の助けを借りて10mLのメタノールに懸濁することができる。その後、該懸濁物を、8,000psiの圧で50mLのメタノールを使用してカラムに充填する。これは充填された床の密度を向上させる。
【0318】
本発明の分離方法は、一般に、DNAおよびRNAの一本鎖および二本鎖のポリヌクレオチドのクロマトグラフィー分離に応用可能である。ポリヌクレオチドの混合物を含有するサンプルは、ポリヌクレオチドの全合成、制限エンドヌクレレアーゼまたは他の酵素もしくは化学物質でのDNAもしくはRNAの切断、ならびにポリメラーゼ連鎖反応技術を使用して増殖および増幅された核酸サンプルから生じさせることができる。
【0319】
本発明の方法は、約1500ないし2000塩基対までを有する二本鎖ポリヌクレオチドを分離するのに使用することができる。多くの場合、該方法は、600塩基もしくは塩基対までを有する、または5ないし80塩基もしくは塩基対までを有するポリヌクレオチドを分離するのに使用する。
【0320】
好ましい一態様において、該分離はマッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー(MIPC)による。本発明の非多孔質ビーズは、DNA分離を遂げるための対イオン剤および溶媒の勾配とともに機能することができる逆相素材として使用する。MIPCにおいて、ポリヌクレオチドが対イオンと対にされ、そしてその後、本発明の非多孔質ビーズを使用する逆相クロマトグラフィーにかけられる。
【0321】
MIPCでの使用に適するいくつかの型の対イオンが存在する。これらは、プロトン供与されて正の対電荷(counter charge)を形成することができるモノ、ジもしくはトリアルキルアミン、または既に正の対電荷を含有する四級のアルキル置換アミンを包含する。アルキル置換は、均一(例えば、酢酸トリエチルアンモニウムもしくは酢酸テトラプロピルアンモニウム)または混合(例えば、酢酸プロピルジエチルアンモニウム)であってよい。アルキル基の大きさは、とりわけ1個の置換アルキル基のみが大きくかつ他者が小さい場合は、小さくても(メチル)もしくは大きくても(30個までの炭素)よい。例えば、酢酸オクチルジメチルアンモニウムが適する対イオン剤である。好ましい対イオン剤は、エチル、プロピルもしくはブチルの大きさ範囲からのアルキル基を含有するものである。
【0322】
アルキル基の目的は、ポリ核酸が分離媒体の非極性表面と相互作用することができるようにマッチトイオン過程によりポリ核酸に非極性の特徴を与えることである。対イオン−DNA対の非極性の程度に対する要件は、分離媒体の極性、分離に必要とされる溶媒条件、粒子径、および分離されているフラグメントの型に依存する。例えば、分離媒体の極性が増大される場合には、表面の極性に合致させかつ対イオン−DNA対の相互作用を増大させるように対イオン剤の極性を変えなくてはならないかもしれない。酢酸トリエチルアンモニウムが好ましいとは言え、余分の非極性の特徴が必要とされるかもしくは望ましい場合は、テトラプロピルもしくはテトラブチルアンモニウム塩のような四級アンモニウム試薬を使用することができる。一般に、アルキル基の極性が増大される際に、大きさ特異的な分離、配列に依存しない分離がより可能になる。四級の対イオン試薬は揮発性でなく、フラグメントの収集をより困難にする。
【0323】
いくつかの場合には、分離を実施するのに使用される有機溶媒の濃度の範囲を増大させることが望ましいかもしれない。例えば、対イオン剤上のアルキルの長さを増大させることは、対イオン−DNA対の非極性を増大させることができ、移動相有機溶媒の濃度を増大させるか、もしくは有機溶媒の型の強さを増大させる(例えば、アセトニトリルはポリ核酸を溶出するためにメタノールより約2倍より効果的である)かのいずれかの必要性をもたらす。カラムからフラグメントを溶出させるのに必要とされる有機溶媒の濃度と、フラグメントの長さとの間に、正の相関が存在する。しかしながら、高有機溶媒濃度ではポリヌクレオチドが沈殿する可能性がある。沈殿を回避するために、強い有機溶媒もしくはより小さい対イオンアルキル基を使用することができる。対イオン試薬のアルキル基はまた、ハロゲン化物、ニトロ基などで極性を和らげるように置換することもできる。
【0324】
移動相は、好ましくは対イオン剤を含有する。典型的な対イオン剤は、低級アルキル一級、二級および低級の三級アミンのような有機もしくは無機酸のトリアルキルアンモニウム塩、低級トリアルキアンモニウム塩、ならびに低級四級アルキアルモニウム塩を包含する。低級アルキルは、メチル、エチル、n−ブチル、i−ブチル、t−ブチル、イソアミル、n−ペンチルおよびイソペンチルにより例示されるような1ないし6個の炭素原子のアルキル基を指す。対イオン剤の例は、酢酸オクチルアンモニウム、酢酸オクタジメチルアンモニウム、酢酸デシルアンモニウム、酢酸オクタデシルアンモニウム、酢酸ピリジニウムアンモニウム、酢酸シクロヘキシルアンモニウム、酢酸ジエチルアンモニウム、酢酸プロピルエチルアンモニウム、酢酸プロピルジエチルアンモニウム、酢酸ブチルエチルアンモニウム、酢酸メチルヘキシルアンモニウム、酢酸テトラメチルアンモニウム、酢酸テトラエチルアンモニウム、酢酸テトラプロピルアンモニウム、酢酸テトラブチルアンモニウム、酢酸ジメチルジエチルアンモニウム、酢酸トリエチルアンモニウム、酢酸トリプロピルアンモニウム、酢酸トリブチルアンモニウム、酢酸テトラプロピルアンモニウムおよび酢酸テトラブチルアンモニウムを包含する。上の例中の陰イオンは酢酸であるとは言え、炭酸、リン酸、硫酸、硝酸、プロピオン酸、ギ酸、塩化物および臭化物を包含する他の陰イオン、もしくは陽イオンおよび陰イオンのいかなる組み合わせもまた使用してよい。これらおよび他の作用物質は、GjerdeらによりIon Chromatography、第2版、ドクター アルフレッド ヒューティッヒ フェアラーク ハイデルベルク(Dr.Alfred Huthig Verlag Heidelberg)(1987)に記述される。揮発性である対イオン剤が本発明の方法での使用に好ましく、酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA)およびトリエチルアンモニウムヘキサフルオロイソプロピルアルコールが最も好ましい。
【0325】
MIPCは、ホモ二重鎖からヘテロ二重鎖を分離することにより二本鎖DNA中の突然変異の検出に成功裏に適用されてきた。こうした分離は、完全に相補的なホモ二重鎖DNAフラグメントに比較して、塩基対不適正の部位でヘテロ二重鎖を変性させるのに必要とされるより低い温度に依存する。MIPCは、ヘテロ二重鎖を部分的に変性させるのに十分である温度で実施される場合に、本明細書で変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー(DMIPC)と称される。DMIPCは、典型的には52℃と70℃との間の温度で実施する。DMIPCを実施するための最適温度は54℃ないし59℃である。
実施例1
MIPCを使用する突然変異の検出のための普遍的勾配
以下の普遍的勾配は、分析の速度について最適化されておらず、そして、MIPCに敏感に反応する大きさ範囲内のいかなるサンプルの突然変異の検出にも使用することができる:
【0326】
【表2】
【0327】
移動相溶液は、A=0.1M TEAA、pH7、B=0.1M TEAAおよび25%アセトニトリルを生じるように、濃酢酸トリエチルアンモニウム(100mL トランスゲノミック(Transgenomic)部品番号553301)から調製する。分離は、以下の条件、すなわち、カラム:アルキル化ポリ(スチレン−ジビニルベンゼン)ビーズ(DNASEP(商標)、トランスゲノミック インク(Transgenomic,Inc.))を含有する50×直径4.6mm;流速は0.9mL/分でありかつ260nmでのUVによる検出下で、WAVE(商標)DNAフラグメント分析系(トランスゲノミック インク(Transgenoic,Inc.)、カリフォルニア州サンノゼ)を使用して得られる。
実施例2
移動相対ヌクレオチド塩基対長さの参照グラフの準備
80、102、174、257、267、298、434、458および587の塩基対長さを有するDNAフラグメントを含有する、標準のpUC18 HaeIII制限酵素消化物(トランスゲノミック インク(Transgenomic,Inc.)、カリフォルニア州サンノゼから入手可能な部品番号440582)を、非変性温度(50℃)でMIPCカラムに適用した。カラムは普遍的勾配を使用して溶出した。分離(示されない)は、以下の条件、すなわち、カラム:アルキル化ポリ(スチレン−ジビニルベンゼン)ビーズ(DNASEP(商標)、トランスゲノミック インク(Transgenomic,Inc.))を含有する50×直径4.6mm下で、WAVE(商標)DNAフラグメント分析系(トランスゲノミック インク(Transgenoic,Inc.)、カリフォルニア州サンノゼ)を使用して得;UV検出は260nmで実施した。各フラグメントのbp長さおよび保持時間(Rt)をコンピュータインターフェース(示されない)で入力した。好ましいインターフェースは、Rt対bpおよび/もしくは%B対bpのグラフィック表示を包含するカラム較正ウインドウである。図33に示される参照曲線590を、本発明のソフトウェア内の統計学的曲線あてはめルーチンを使用して、観察されたデータを等式(i)にあてはめることにより得た。
実施例3
死時間の決定
実施例2に記述されたところのカラムおよび装置を使用して、示されるような勾配方形波であったメソッドを入力した:
【0328】
【表3】
【0329】
次に、本勾配を使用して0μLの注入を実施した。スペクトルのバックグラウンドの上昇が約4.8分に観察された(示されない)。死時間は、この観察された上昇時間から2を差し引くことにより得た。死時間についての約2.8分という値が、ディジタルメモリに保存された。
実施例4
温度依存性のDMIPC分離過程の記述
本実施例は図45を指す(51°ないし61℃の温度範囲にわたるヘテロ二重鎖の分離)。
【0330】
位置168にAからGの突然変異をもつヒトY染色体の遺伝子座DYS271からの209塩基対のフラグメントを含有する突然変異標準(トランスゲノミック(Transgenomic)からの部品番号440582、およびSeielstadら、Hum.Mol.Genet.3:2159(1994)により記述されるような)を、製造供給元により推奨されるとおりハイブリダイズし、そしてサンプルを51℃でMIPCカラム(50mm×直径4.6mm)に注入した。カラムは、7分にわたる0.1M TEAA中アセトニトリルの勾配を用いて0.9mL/分で溶出した。クロマトグラフィーは、UV検出器を使用して260nmをモニターした。混合物中に存在するヘテロ二重鎖は51℃で変性されず;従って単一ピークが観察された。
【0331】
図45にみられるとおり、該サンプルの注入およびクロマトグラフィーを、温度の1℃の増大する増加で反復した。ヘテロ二重鎖の潜在的存在を示すショルダーが、53℃で主ピークの小さい保持時間側に観察された。54℃で3本のピークがみられた。そして、55°−58°で4本のピークがみられ、突然変異の決定的な存在を示した。2本のより小さい保持時間のピークは2種のヘテロ二重鎖であり、また、より大きい保持時間のピークはホモ二重鎖であった。
【0332】
本発明は自動化された系および方法を提供し、これらは使用するのが簡単であり、そしてMIPCによるDNAフラグメントの分離における最適な移動相濃度および温度を決定するための経験的方法の使用を最小限にする。
【0333】
前述は本発明の特定の態様を提示した一方、これらの態様は例としてのみ提示されたことが理解されるべきである。他者は、前述と異なるとは言え本明細書に記述かつ特許請求されるところの本発明の技術思想および範囲から離れない変形物を認めかつ実施することができることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図1】
発明にかかる、溶出溶媒の勾配を確立するための弁および弁制御を使用する単一カラムのMIPC系の図解である。
【図2】
発明にかかる、溶出溶媒の勾配を確立するためのポンプ系の部分図である。
【図3】
発明にかかる、MIPC系で使用されるオートサンプラーサブシステムの図解である。
【図4】
発明にかかる、MIPC系で使用される注入弁の図解である。
【図5】
発明にかかる、充填されたループの負荷位置の注入弁の図解である。
【図6】
発明にかかる、充填されたループの注入位置の注入弁の図解である。
【図7】
発明にかかる、部分的ループ負荷位置の注入弁の図解である。
【図8】
発明にかかる、部分的ループ注入位置の注入弁の図解である。
【図9】
発明にかかる、本発明の改良されたHPLC DNA分析装置カラムオーブンの分離区画の前面図である。
【図10】
発明にかかる、図9に示されるHPLC DNA分析装置カラムオーブンの平面図である。
【図11】
発明にかかる、本発明の小型のカラムヒーターの態様の端部図である。
【図12】
発明にかかる、図11の線A―Aに沿って採られた断面図である。
【図13】
発明にかかる、本発明のペルティエ型のヒーター/冷却器の態様の図解である。
【図14】
発明にかかる、フラグメントコレクタの透視図である。
【図15】
発明にかかる、本発明のフラグメントコレクタの前面図である。
【図16】
発明にかかる、図15に示されるフラグメントコレクタの端部図である。
【図17】
発明にかかる、フラグメント分注器のX軸の動きについてのウォーム歯車装置駆動アセンブリの詳細を示すために前面パネルが除去された、図15のフラグメントコレクタの部分的前面図である。
【図18】
発明にかかる、フラグメント分注器のY軸の動きについての該駆動アセンブリのモーターおよびウォーム歯車装置アセンブリの部分図である。
【図19】
発明にかかる、フラグメント分注器のY軸の動きについての該駆動アセンブリの端部図である。
【図20】
発明にかかる、標準的な96穴マルチウェルプレートの平面図である。
【図21】
発明にかかる、本発明の空気一吹き分注器の一態様の図解である。
【図22】
発明にかかる、図21の空気一吹き分注器の態様の拡大断面図である。
【図23】
発明にかかる、分注器先端および図22のマルチウェルプレートの提示のウェルの拡大断面部分図である。
【図24】
発明にかかる、出口ライン中の流量制限を伴う、本発明の分注器先端の代替の一態様の断面図である。
【図25】
発明にかかる、検出器、中央制御部および空気一吹き液滴大きさ制御系の組み合わせの図解である。
【図26】
発明にかかる、検出器、中央制御部および流れ制限制御系の組み合わせの図解である。
【図27】
発明にかかる、時間間隔、閾値および傾きに基づく画分収集の基準を具体的に説明するクロマトグラムの表示である。
【図28】
発明にかかる、その各構成部品を伴う制御モジュールと一緒の図1のMIPC系の図解である。
【図29】
発明にかかる、MIPC系のコンピュータ化された制御プロセスおよび該プロセスの各部分に関連するモジュールの一態様の図解である。
【図30】
発明にかかる、MIPC過程における核酸フラグメントの基礎的分離の間の溶媒濃度のグラフ表示である。
【図31】
発明にかかる、本発明の分離方法の一態様を具体的に説明する流れ図である。
【図32】
発明にかかる、MIPC系のコンピュータ化された制御プロセスおよび該プロセスの各部分に関連するモジュールの別の態様の図解である。
【図33】
発明にかかる、既知の塩基対長さのDNAフラグメントを含有する標準混合物についての溶液Bのパーセント対塩基対長さを示す参照図である。
【図34】
発明にかかる、移動相の勾配プロフィルを見るためのグラフィカル・ユーザー・インターフェースの一態様を具体的に説明する。
【図35】
発明にかかる、pBR322 HaeIII消化物からのDNAフラグメントについてのRt対%Bのプロットを示す。
【図36】
発明にかかる、pBR322 HaeIII消化物からのDNAフラグメントについてのP対%Bのプロットを示す。
【図37】
発明にかかる、P対%Bの計算されたプロットを示す。
【図38】
発明にかかる、サンプルテーブルを含んで成るグラフィカル・ユーザー・インターフェースの一態様を具体的に説明する。
【図39】
発明にかかる、MIPCによりある範囲の塩基対長さを有するDNAフラグメントを分離するために使用されるべき移動相の勾配を計算するためのソフトウェアの一態様のオペレーションを示す流れ図である。
【図40】
発明にかかる、MIPCによりある範囲の塩基対長さを有するDNAフラグメントを分離するために使用されるべき移動相の勾配を計算するためのソフトウェアの別の態様のオペレーションを示す流れ図である。
【図41】
発明にかかる、DMIPCによる既知の塩基対長さを有するDNAヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖フラグメントを分離するのに使用されるべき移動相の勾配を計算するためのソフトウェアの一態様のオペレーションを示す流れ図である。
【図42】
発明にかかる、DMIPCによる既知の塩基対長さを有するDNAヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖フラグメントを分離するのに使用されるべき移動相の勾配を計算するためのソフトウェアの一態様のオペレーションを示す流れ図である。
【図43】
発明にかかる、DMIPCによる既知の塩基対長さを有するDNAヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖フラグメントを分離するのに使用されるべき移動相のイソクラチック勾配を計算するためのソフトウェアの一態様のオペレーションを示す流れ図である。
【図44】
発明にかかる、ホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖を形成するためのハイブリダイゼーションの図解を示す。
【図45】
発明にかかる、ホモおよびヘテロ二重鎖の温度依存性の分離を具体的に説明する。
【図46】
発明にかかる、図45からのホモおよびヘテロ二重鎖のピークの温度での保持時間の変化を示す。
【図47】
発明にかかる、計算された融解温度対経験的に決定される融解温度のグラフである。
【図48】
発明にかかる、計算された融解温度対予測される融解温度のグラフである。
【図49】
発明にかかる、突然変異の検出での使用のためのソフトウェアのインターフェース画面の一態様である。
【図50】
発明にかかる、突然変異の検出での使用のためのソフトウェアのインターフェース画面の第二の態様である。
【図51】
発明にかかる、図50のインターフェース画面からのフィールドの一例である。
【図52】
発明にかかる、突然変異の検出での使用のためのソフトウェアのインターフェース画面の第三の態様である。
【図53】
発明にかかる、DNA分離係数の決定の図解である。
【図54】
発明にかかる、シリカコアおよびエンドキャッピング遮蔽物を伴う逆相ビーズの代表の断面図である。
【図55】
発明にかかる、シリカコアおよびポリマー遮蔽物を伴う逆相ビーズの代表の断面図である。
(発明の分野)
本発明は、DNAの大きさに基づく(塩基対長さ)分離を遂げるのに適するDNA分離の系および方法に関する。とりわけ、本発明は、DNAの大きさに基づく分離を遂げる高度に自動化されたマッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー(MIPC)の系および方法、ならびに該系を作動させるための制御およびソフトウェアに関する。
【0002】
(発明の背景)
DNA分子はデオキシヌクレオチドと呼ばれるサブユニットを含んで成るポリマーである。DNA中で見出される4種のデオキシヌクレオチドは、それぞれA、G、CおよびTと本明細書で称される4種の塩基、アデニン(プリン)、グアニン(プリン)、シトシン(ピリミジン)およびチミン(ピリミジン)のいずれかに共有結合される共通の環状糖デオキシリボースを含んで成る。リン酸基が、1個のデオキシヌクレオチドの3’−ヒドロキシルを別のデオキシヌクレオチドの5’−ヒドロキシルと連結してポリマー鎖を形成する。二本鎖DNA中の2本の鎖は、いわゆる相補塩基の間の水素結合によりらせん構造で一緒に保持される。塩基の相補性はそれらの化学構造により決定される。二本鎖DNA中で、各AはTと対をなし、また、各GはCと対をなす。すなわち、プリンはピリミジンと対をなす。理想的には、DNAは、人体もしくは他の生存する生物体中で細胞分裂の間にDNAポリメラーゼにより正確なコピーに複製される。DNA鎖はまたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってインビトロで複製することもできる。ときに、正確な複製が失敗し、そして誤った塩基対形成が起こる。該新たな鎖のさらなる複製は、親のものとの塩基配列の遺伝する差異を含有する二本鎖DNAの子孫を生じさせる。塩基対配列のこうした遺伝する変化を突然変異と呼ぶ。
【0003】
本明細書で使用されるところの二本鎖DNAは二重鎖と称される。一方の鎖の塩基配列が他方の鎖の塩基配列に完全に相補的である場合、該二重鎖をホモ二重鎖と呼ぶ。二重鎖が相補的でない最低1個の塩基対を含有する場合、該二重鎖をヘテロ二重鎖と呼ぶ。ヘテロ二重鎖は、DNAポリメラーゼ酵素により誤りが生じられかつ複製されているポリヌクレオチド鎖に非相補的塩基が付加されるDNA複製の間に形成される。ヘテロ二重鎖のさらなる複製は、理想的には、ヘテロ接合性であるホモ二重鎖を生じさせることができる。すなわち、これらのホモ二重鎖は、元の親DNA鎖と比較して変えられた配列を有することができる。親DNAが天然に存在する集団中で有意を占める配列を有する場合、該配列は一般に「野性型」と称される。
【0004】
多くの異なる型のDNA突然変異が既知である。DNA突然変異の例は、限定されるものでないが、「点突然変異」もしくは「単一塩基対突然変異」を挙げることができ、ここでは1個の誤った塩基対形成が起こる。最も普遍的な点突然変異は、1個のプリンもしくはピリミジン塩基が別のものに取って替わる「転位」、およびプリンがピリミジンの代わりに用いられる(そして逆もまた同じ)「トランスバージョン」を含んで成る。点突然変異は、その中で1個の塩基がDNA鎖に付加されもしくはそれから欠失される突然変異もまた含んで成る。こうした「挿入」もしくは「欠失」は「フレームシフト突然変異」としてもまた既知である。それらは点突然変異より少ない頻度で起こるとは言え、複数の塩基対に影響を及ぼすより大きな突然変異もまた起こる可能性があり、かつ、重要であるかもしれない。突然変異のより詳述された論考は、Modrichへの米国特許第5,459,039号明細書(1995)およびCottonへの米国特許第5,698,400号明細書(1997)に見出すことができる。
【0005】
DNA中の塩基対の配列はタンパク質の産生のための暗号である。とりわけ、DNA鎖のエキソン部分のDNA配列は、タンパク質中の対応するアミノ酸配列をコードする。従って、DNA配列中の突然変異は、タンパク質のアミノ酸配列中の変化をもたらすかもしれない。アミノ酸配列中のこうした変化は、完全に良性であるかもしれないか、あるいはタンパク質を不活性化するかまたは生命を脅かすかもしくは致死的であるようにその機能を変えるかもしれない。他方、DNA鎖のイントロン部分中の突然変異は、生物学的影響を有することが期待されないとみられる。イントロン区分はタンパク質産生のための暗号を含有しないからである。にもかかわらず、イントロン区分中での突然変異の検出は、例えば法廷の検討において重要であるかもしれない。
【0006】
従って、突然変異の検出は、疾患の診断、疾患の起源の理解、および潜在的な治療の開発で非常に重要である。DNAサンプル中の突然変異の検出および類似性もしくは差異の同定もまた、疾患に抵抗性のかつ/もしくはより多く産する作物系統を開発することによる世界の食糧供給の増大、法廷科学、進化および集団の研究、ならびに一般に学術研究において決定的に重要である(Guyerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:10841(1995);Cotton、TIG 13:43(1997))。
【0007】
良性である、もしくは負の結果を有しないDNA配列中の変化は、ときに「多形」と呼ばれる。本出願の目的上、DNA配列中の全部の変化は、それらが負の結果を有するにしろしないにしろ、本明細書で「突然変異」と定義する。明快さのために、「突然変異」という用語を、参照鎖(一般に、しかし必ずしもでなく、野性型)に比較したDNA鎖の塩基配列中の変化を意味するのに本明細書で使用する。本明細書で使用されるところの「突然変異」という用語は、「多形」という用語、または当該技術のいずれかの他の類似のもしくは同等な用語を包含する。
【0008】
従来技術において、DNAサンプルの大きさに基づく分析は標準的ゲル電気泳動(GEP)により達成される。キャピラリーゲル電気泳動(CGE)もまた、多様な長さを有するDNAフラグメントの混合物、例えばDNAサンプルの制限酵素切断により生じられた消化物を分離かつ分析するのに使用されている。しかしながら、これらの方法は、同一の塩基対長さを有するがしかし異なる塩基配列を有するDNAフラグメントを識別することができない。これはGEPの重大な限界である。
【0009】
「部分的に変性する」条件下のヘテロ二重鎖DNA鎖中の突然変異は、変性勾配ゲル電気泳動(DGGE)および変性勾配ゲルキャピラリー電気泳動(DGGC)のようなゲルに基づく分析方法により検出することができる。「部分的に変性する」という用語は、DNA二本鎖の他の部分が無傷のままである、すなわち分離されない一方での、該二本鎖中の不適正にされた塩基対の分離(温度、pH、溶媒もしくは他の要因により引き起こされる)であると定義する。「部分的変性」の現象は、ヘテロ二重鎖が該鎖の残部を変性させるのに必要とされるよりもより低温で塩基対不適正の部位で変性することができるため発生する。
【0010】
これらのゲルに基づく技術は困難であり、かつ、高度に熟練した実験室科学者を必要とする。加えて、各分析は冗長な準備および分離を必要とする。変性キャピラリーゲル電気泳動分析は、比較的小さいフラグメントのみを利用することができる。90塩基対のフラグメントの分離は30分以上かかる。勾配変性ゲルは一夜泳動し、そして約1日の準備時間を必要とする。勾配ゲルの付加的な欠陥は、分離されたDNAフラグメントを単離するようにこれらの手順を適合させること(専門の技術および器具を必要とする)、ならびに単離に必要とされる条件を確立することという困難である。条件は各フラグメントについて実験的に開発しなければならない(Laboratory Methods for the Detection of Mutations and Polymorphisms、G.R.Taylor編、CRC プレス(CRC Press)、1997)。ゲルの方法論の長い分析時間は、ゲル中でのDNAフラグメントの動きが、DNAフラグメントの長さに幾何学的関係で逆比例するという事実によりさらに悪化される。従って、より長いDNAフラグメントの分析時間は、しばしば擁護できない可能性がある。
【0011】
上に挙げられた変性ゲルの方法の欠陥に加え、これらの技術は、ゲルの調製および分析の実施がひとりの操作者から別の者まで高度に変動性である可能性があるため、常に再現可能もしくは正確であるわけでない。
【0012】
GEPもしくはDGGEによる二本鎖核酸フラグメント混合物の分離は直線状の一列のバンドを生じさせ、列中の各バンドはその混合物の分離された二本鎖核酸成分に相当する。多くの混合物が典型的に同一のゲルスラブ上の別個のレーンで同時に分離かつ分析されるため、平行な一連のこうした直線状のバンドの列が生じられる。バンドはしばしばまっすぐであるよりはむしろ湾曲し、それらの移動度および形状はゲルの幅にわたって変わる可能性があり、そしてレーンおよびバンドは相互に混じる可能性がある。こうした不正確さの起源は、ゲル床、電気浸透、熱勾配および拡散効果の均一性および均質性の欠如、ならびに多数の他の要因から起因する。この種の不正確さはGEP技術で公知であり、そして、分離結果の表示における重大な歪曲および不正確さにつながる可能性がある。加えて、GEP分離から得られたバンド表示データは、バンドの形状および完全性に関係する不正確さのため、定量的もしくは正確でない。GEP分離により生じられた直線状のバンドの列の表示の定量は、直線状のバンドの列を検出器で走査しそして生じるデータを積分する場合でさえ達成することができない。直線状のバンドの列はバンドの中央を横切ってのみ走査されるからである。検出器はいずれかの所定のバンドの小さい一部分のみ見、そしてバンドは均一でないため、走査法により生じられる結果は正確でなく、そして紛らわしくさえある可能性がある。
【0013】
染色もしくはオートラジオグラフィーのようなGEPおよびDGGE分離の可視化方法もまた厄介でありかつ時間がかかる。加えて、分離データはハードコピーの形態であり、そして容易な検索および比較のため電子的に保存することができず、また、接近した分離の可視化を改良するためにそれを高めることもできない。
【0014】
二本鎖デオキシリボ核酸(dsDNA)フラグメントの分離、およびDNA突然変異の検出は、医学、物理および社会科学、ならびに法廷の検討で非常に重要である。ヒトゲノムプロジェクトは膨大な量の遺伝情報を提供しており、そして突然変異とヒトの障害との間の関連を評価するための新たな情報を生じている(Guyerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:10841(1995))。例えば、疾患の最終的な起源は野性型と異なる遺伝暗号により記述される(Cotton、TIG 13:43(1997))。疾患の遺伝的基礎の理解は治療法の出発点となる可能性がある。同様に、遺伝暗号中の差異の決定は、進化および集団の研究への強力かつおそらく決定的な洞察を提供する可能性がある(Cooperら、Human Genetics vol.69:201(1985))。これらおよび遺伝暗号に関する他の論点の理解は、あるDNAフラグメント中の野性型に関しての異常すなわち突然変異を同定する能力を必要とする。
【0015】
伝統的なクロマトグラフィーは、「固定相」と「移動相」との間での混合物の成分の分配に基づく分離方法である。固定相は、セルロース、シリカゲル、被覆シリカゲル、ポリマービーズ、多糖などの粒子もしくは通路の表面の形態の多くの多様な物質を含むことができる固体素材の表面により提供される。これらの素材は、ガラス板上のような固体表面上で支持することができるか、もしくはカラム中に充填することができる。移動相は液体、もしくはガスクロマトグラフィーでは気体であることができる。本発明は液体の移動相に関する。
【0016】
分離の原理は、一般に、使用される素材、素材の形態、もしくは使用される装置に関係なく同一である。混合物の多様な成分は、固定相および移動相中の異なるそれぞれの溶解度を有する。従って、移動相が固定相の上を流れる際に平衡が存在し、そこでサンプルの成分が固定相と移動相との間で分配される。移動相がカラムを通過する際に、該平衡は移動相の方を選んで絶えず移動される。これは、平衡混合物が、いずれの時点でも、新たな移動相に会いそして新たな移動相中に分配するために起こる。移動相がカラムを下に運搬される際に、移動相は新たな固定相に会いそして該固定相中に分配する。ついには、カラムの端ではもはや固定相が存在せず、そしてサンプルはただ移動相中でカラムを離れる。
【0017】
混合物の成分が、わずかに異なる、固定相に対する親和性および/もしくは移動相中の溶解性を有し、そして従って異なる分配平衡値を有するために、混合物の成分の分離が起こる。従って、混合物の成分は異なる速度でカラムを下に進む。
【0018】
クロマトグラフィー分離は固定相との相互作用に依存するため、固定相の表面積を増大させることにより分離を改良することができることが既知である。
【0019】
伝統的な液体クロマトグラフィーにおいては、ガラスカラムを固定相粒子で充填し、そして移動相が重力によってのみ引かれてカラムを通過する。しかしながら、カラム中でより小さい固定相粒子を使用する場合、重力単独の引っ張りは移動相にカラムを貫流させるのに不十分である。代わりに、圧を適用しなければならない。しかしながら、ガラスカラムは約200psiに耐えることができるのみである。移動相に5ミクロンの粒子で充填されたカラムを通過させることは、約2000psiもしくはそれ以上の圧がカラムに適用されることを必要とする。5ないし10ミクロンの粒子が今日、標準的である。5ミクロンより小さい粒子は、とりわけ困難な分離もしくはある特別な場合に使用する)。この方法は「高速液体クロマトグラフィー」もしくはHPLCという用語により示される。
【0020】
HPLCは、大きな粒子の重力カラムで可能であったよりも、より広範な化学構造を分離するのに使用されるはるかにより広範な型の粒子の使用を可能にした。しかしながら、分離の原理はそれでもなお同一である。
【0021】
HPLCに基づくイオン対形成クロマトグラフィー法は、一般に二本鎖ポリヌクレオチド、およびとりわけDNAの混合物を効果的に分離するために最近導入され、ここでは分離は塩基対長さに基づく(Bonnへの米国特許第5,585,236号明細書(1996);Huberら、Chromatographia 37:653(1993);Huberら、Anal.Biochem.212:351(1993))。これらの参考文献およびその中に含有される参考文献は、そっくりそのまま本明細書に組み込まれる。「マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー」(MIPC)という用語を本明細書で定義し、そして本方法に適用する。分離の機構が、伝統的な分配よりもむしろ分離表面へのDNAの結合およびそれからの放出に基づくことが見出されたためである。MIPCは塩基対長さに基づいてDNAフラグメントを分離し、そしてゲルに基づく分離方法に伴う欠陥により制限されない。
【0022】
本明細書で使用されるところのマッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーは、非極性の分離媒体を使用する一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドの分離方法と定義し、ここで、該方法は、対イオン剤、および分離媒体からポリヌクレオチドを放出させる有機溶媒を使用する。MIPC分離は10分未満、および頻繁には5分未満で完了することができる。
【0023】
MIPC分離方法は、液体がカラムを通過する際の移動相と固定相との間の一連の平衡分離により分離が達成されないため、伝統的なHPLC分離方法と異なる。代わりに、サンプルdsDNAを分離媒体表面に結合させる溶媒強度を使用して、サンプルをカラム中にフィードする。特定の塩基対長さの鎖を固定相表面から除去し、そして特定の溶媒濃度によりカラムを下に運搬する。溶媒の増大する勾配にサンプルを通過させることにより、連続的により大きな塩基対長さが連続して除去され、そしてカラムを通過する。該分離はカラム長さもしくは固定相の面積に依存しない。
【0024】
本MIPC方法は温度感受性であり、そして正確な温度制御がMIPC分離方法でとりわけ重要である。
【0025】
MIPCの使用および理解が進展した際に、部分的変性温度、すなわち塩基対不適正の部位でヘテロ二重鎖を変性させるのに十分な温度でMIPC分析を実施した場合に、同一の塩基対長さを有するヘテロ二重鎖からホモ二重鎖を分離することができたことが発見された(米国特許第5,795,976号明細書;Hayward−Lesterら、Genome Research 5:494(1995);Underhillら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:193(1996);Dorisら、DHPLC Workshop、スタンフォード大学、(1997))。これらの参考文献およびその中に含有される参考文献はそっくりそのまま本明細書に組み込まれる。従って、変性HPLC(DHPLC)の使用が、突然変位の検出に適用された(Underhillら、Genome Research 7:996(1997);Liuら、Nucleic Acid Res.、26;1396(1998))。
【0026】
DHPLCは、1塩基対程度だけ異なるヘテロ二重鎖を分離することができる。しかしながら、ホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖の分離は乏しく分離される可能性がある。人工物および不純物もまた、人工物もしくは不純物と推定の突然変異との間を識別するのが難しいかもしれないという意味において、DHPLC分離クロマトグラムの解釈を妨害する可能性がある(Underhillら、Genome Res.7:996(1997))。突然変異の存在は完全に見逃されさえするかもしれない(Liuら、Nucleic Acid Res.、26:1396(1998))。
【0027】
HPLCおよびDHPLCによるDNAの分離および突然変異の検出の重要な局面は、クロマトグラフィー系の構成部品を含んで成る素材の処理;分離媒体を含んで成る素材の処理;方法の開発時間を最小限にするための溶媒の前選択;MIPCの間のヘテロ二重鎖の部分的変性を遂げるための最適温度の前選択;および自動化高スループット突然変異検出スクリーニングアッセイのためのDHPLCの最適化を包含する。これらの要因は、明白な、正確な、再現可能なかつ高スループットのDNA分離および突然変異の検出の結果を達成するために不可欠である。
【0028】
突然変異の検出においてホモ二重鎖からヘテロ二重鎖を分離するために使用される部分的変性条件下でのマッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー(MIPC)の応用は、下でDMPICと称する。DMIPCにおいては、部分的変性温度、すなわち、ヘテロ二重鎖の突然変異部位に存在する不適正にされたDNAが変性することができるがしかし適合されたDNAが二本鎖に結合されたまま留まることができる温度で、移動相および固定相双方を維持するために、正確な温度制御が必要とされる。
【0029】
HPLC分離系のある構成部品および作動は、伝統的な分配に基づく分離を助長するために部分的に自動化されている。一例は、それらのHPLCクロマトグラフィー装置とともに日立により提供されるHSM制御系である。これらの制御の使用において、クロマトグラフィーの専門家が、分離のための特定のサンプルを得るために詳細な命令をオートサンプラーに、所望の溶媒の勾配を遂げるために詳細な単純命令を比例弁に、および特定の温度の命令をカラムオーブンに人的に入力する。制御系がこれらの命令を自動的に実行してHPLC分離を遂げる。
【0030】
MIPC系は、現存する制御系で満足させることができない系の作動要件を導入している。増大された数のウェルをもつサンプルトレイが導入され、サンプルのそれぞれの分離アリコートを引き出すための対応する詳細なオートサンプラーの命令を必要とする。より複雑かつ多様な溶媒濃度および勾配の命令が必要とされる。より正確な温度制御が不可欠であり、また、若干の作動においては、同一のサンプルからのアリコートを、多様な予め設定された温度で分離することになる。MIPC系を使用して、それぞれが単一の塩基対の大きさを有する純粋な画分を単離することができ;これらはPCRもしくはクローニング増幅技術に必要とされる。これは、MIPC分離過程と協調して作動するフラグメントコレクタの使用を必要とする。さらに、MIPC分離方法の拡大する応用は、該系がクロマトグラフィーの専門家よりはむしろ訓練された技術者により操作可能であることを必要とする。加えて、DNAフラグメントを大きさの差異に基づいて分離することができかつまた同一の長さを有するがしかし塩基対配列が異なる(野性型からの突然変異)DNAを正確な、再現可能な、信頼できる様式で分離することもできるHPLC系に対する必要性が存在する。こうした系は自動化されかつ効率的であるべきであり、慣例の高スループットサンプルスクリーニングの応用に適合可能であるべきであり、そして最小限の操作者の注意で高スループットサンプルスクリーニングを提供すべきである。
【0031】
これらの新たな要件は、現在入手可能な機器および関連する制御系により満足されない。
【0032】
(発明の要約)
クロマトグラフィーの専門家よりはむしろ訓練された技術者により操作されることができるMIPC分離系および方法を提供することが、本発明の一目的である。
【0033】
広範な分離スキームについて、複数のサンプルを含有するトレイもしくはプレートからサンプルを選択し、各分離について溶媒の溶出勾配を設定し、各分離についてカラムの温度(1種もしくは複数)を設定し、そして継続される監視および人的制御なしで所望の画分を収集することができるMIPC分離系およびソフトウェア制御を提供することが、本発明のさらなる一目的である。
【0034】
一局面において、本発明は、移動相の溶媒溶液および水性成分の流量を制御するための移動相流量制御手段(該流量制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し);MIPC分離カラム;移動相を移動相流量制御手段からMIPC分離カラムに向かわせるための導管手段;ならびにその中に固有のソフトウェア移動相流量制御モジュールを有する移動相流量制御手段と通信するコンピュータを含んで成る高速液体クロマトグラフィー系を用いるDNAフラグメントの混合物の塩基対長さに基づく分離を遂げる方法に関する。該方法は、分離されるべきDNAフラグメントの混合物中の塩基対長さの数値の範囲を受領すること;DNAフラグメントの混合物からの選択されたフラグメントの分離を遂げることができる溶媒濃度および対応する溶媒の勾配の範囲を計算すること;溶媒濃度および溶媒の勾配の前記範囲を移動相流量制御モジュールに提供すること;ならびに分離を実施すること、のコンピュータ化された段階を包含し、ここで、移動相流量制御モジュールが、選択されたフラグメントの分離を遂げるのに必要とされる勾配および溶媒濃度を果たすように移動相流量制御手段の設定を制御する。移動相流量制御手段は、それぞれ流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する自動開放制御を伴う一組の流量制御弁を包含することができる。移動相流量制御手段は、その流量設定が流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する一組のポンプを包含することができる。該方法において、塩基対長さに基づく分離は、DNAフラグメントの混合物のフラグメントの全部の分離であることができるか、または、DNAフラグメントの混合物の1種もしくはそれ以上のフラグメントの分離であることができる。該方法で使用される勾配はイソクラチック勾配を包含することができる。
【0035】
該方法の一態様において、溶媒濃度は、最小のフラグメントについて計算された%Bの値より下で開始するよう計算され、かつ、最大のフラグメントについて計算された%Bの値より上で終了するよう計算され、ここで、%Bは、以下の式:
【0036】
【数13】
【0037】
%Bは有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり
p1、p2およびp3は、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される。
【0038】
該方法の別の態様において、溶媒濃度は、最小のフラグメントについて計算された%Bの値より下で開始するよう計算され、かつ、最大のフラグメントについて計算された%Bの値より上で終了するよう計算され、ここで、%Bは、以下の式:
【0039】
【数14】
【0040】
式中、
【0041】
【数15】
【0042】
%Bは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり;
sは勾配の傾きであり;
d、void、p4、p5、p6、p7およびp8は、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される。
【0043】
別の局面において、本発明はコンピュータ化された制御手段を包含する高速液体クロマトグラフィー系に関し、該クロマトグラフィー系は、移動相の溶媒溶液および水性成分の流量を制御するための移動相流量制御手段(該流量制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し);MIPC分離カラム;移動相を移動相流量制御手段からMIPC分離カラムに向かわせるための導管手段;ならびに移動相流量制御手段と通信するコンピュータ;該コンピュータおよび移動相流量制御手段と作業連合にあるソフトウェア移動相流量制御モジュールを含んで成り、ここで、該移動相流量制御手段は、それぞれが流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する自動開放制御を伴う一組の流量制御弁であるか、もしくは、移動相制御手段は一組のポンプであって、その流量設定が流量制御モジュールからの制御コマンドに応答し、前記コンピュータは溶媒の勾配の開始および終了溶媒濃度をコンピュータ計算するための溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアを包含する。
【0044】
該液体クロマトグラフィー系の一態様において、溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアは、DNAフラグメントの混合物中の分離されるべきフラグメントの塩基対長さの範囲を受領し、かつ、分離されるべき最小のフラグメントについて計算された%Bの値より下で開始しかつ分離されるべき最大のフラグメントについて計算された%Bの値より上で終了する溶媒濃度を計算するためのソフトウェア手段を包含し、ここで、%Bは、以下の式:
【0045】
【数16】
【0046】
%Bは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり;
p1、p2およびp3は、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される。
【0047】
該高速液体クロマトグラフィー系の別の態様において、溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアが、DNAフラグメントの混合物中の分離されるべきフラグメントの塩基対長さの範囲を受領し、かつ、分離されるべき最小のフラグメントについて計算された%Bの値より下で開始しかつ分離されるべき最大のフラグメントについて計算された%Bの値より上で終了する溶媒濃度を計算するためのソフトウェア手段を包含し、ここで、%Bは、以下の式:
【0048】
【数17】
【0049】
式中
【0050】
【数18】
【0051】
%Bは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり;
sは勾配の傾きであり;
d、void、p4、p5、p6、p7およびp8は、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される。
【0052】
なお別の局面において、本発明は、DNAフラグメントの混合物から分離されるべき塩基対長さの範囲を受領するための手段、MIPCにより分離されるべき塩基対長さの範囲を分離するのに必要とされる溶媒濃度を計算するための手段、およびMIPCにより分離されるべき塩基対長さの範囲を分離するのに使用されるべき溶媒の勾配を選択するための手段を包含するソフトウェアプログラムに関し、ここで、前記溶媒濃度を計算するための手段は、分離されるべき最小のフラグメントについて計算された%Bの値より下で開始しかつ分離されるべき最大のフラグメントについて計算された%Bの値より上で終了するよう溶媒濃度を計算するための手段を包含し、ここで、%Bは、以下の式:
【0053】
【数19】
【0054】
%Bは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり
p1、p2およびp3は、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される。
【0055】
別の局面において、本発明は、DNAフラグメントの混合物から分離されるべき塩基対長さの範囲を受領するための手段、MIPCにより分離されるべき塩基対長さの範囲を分離するのに必要とされる溶媒濃度を計算するための手段、およびMIPCにより分離されるべき塩基対長さの範囲を分離するのに使用されるべき溶媒の勾配を選択するための手段を包含するソフトウェアプログラムに関し、ここで、前記溶媒濃度を計算するための手段は、分離されるべき最小のフラグメントについて計算された%Bの値より下で開始しかつ分離されるべき最大のフラグメントについて計算された%Bの値より上で終了するよう溶媒濃度を計算するための手段を包含し、ここで、%Bは、以下の式:
【0056】
【数20】
【0057】
式中
【0058】
【数21】
【0059】
%Bは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり;
sは勾配の傾きであり;
d、void、p4、p5、p6、p7およびp8は、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される。
【0060】
別の局面においては、本発明は、高速液体クロマトグラフィー系を用いる混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子の分離を遂げる方法に関する。該系は、マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離カラム;カラムに進入する移動相の温度を制御するためのオーブン温度制御手段(該オーブン温度制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し);およびその中に固有のオーブン温度制御ソフトウェアモジュールを有するオーブン温度制御手段と通信するコンピュータを包含する。本方法は、約50℃ないし約75℃の温度範囲の一連の変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離において、変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーにより混合物を分析することを包含する温度の最適化を実施することのコンピュータ化された段階を包含し、各連続する分離は、突然変異分離プロフィルが観察されるかもしくは突然変異分離温度範囲のいずれかの突然変異分離プロフィルの非存在が観察されるまで、先行する分離よりもより高温を有し、ここで、突然変異分離プロフィルは突然変異の存在を同定し、かつ、突然変異分離プロフィルの非存在はサンプル中の突然変異の非存在を示す。あるいは、50℃ないし約75℃の温度範囲の一連の変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離において、変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーにより混合物を分析すること、各連続する分離は、突然変異分離プロフィルが観察されるかもしくは突然変異分離温度範囲のいずれかの突然変異分離プロフィルの非存在が観察されるまで、先行する分離よりもより低温を有し、ここで、突然変異分離プロフィルは突然変異の存在を同定し、かつ、突然変異分離プロフィルの非存在はサンプル中の突然変異の非存在を示す。本方法において、オーブン温度制御モジュールは、連続する分離の間の温度を果たすオーブン温度制御手段の設定を制御する。本発明の本局面のオーブン温度制御手段は以下の態様を包含することができる。第一に、循環空気温度制御系を有する空気浴オーブン;入口端および出口端を有するある長さの毛細管(該毛細管の出口端は分離カラムの入口端と連結され、また、毛細管の入口端は工程液を受領するための手段を含んで成り、該管は6から400cmまでの完全に伸長された長さを有し;そして、分離カラムおよび毛細管のコイルが空気浴オーブン中に囲まれかつその中の空気に曝露され、該温度制御系はオーブン温度制御モジュールからの制御コマンドに応答する)。第二に、第一の熱伝達表面、分離カラム差込口、およびキャピラリーコイル差込口を有する熱伝導ブロック;その内壁と熱伝導の関係で分離カラム差込口内に配置される分離カラム;ならびに、キャピラリーコイル差込口中に配置される毛細管のコイル(該コイルの外側先端はキャピラリーコイル差込口の内壁と熱伝導の関係にあり、温度制御系はオーブン温度制御モジュールからの制御コマンドに応答する)。ペルティエ型の加熱および冷却装置が該第一の熱伝達表面と熱伝導の関係で提供されることができる。
【0061】
別の局面において、本発明は、高速液体クロマトグラフィー系を用いる混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子の分離を遂げる方法に関する。該系は、マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離カラム;分離カラムに進入する移動相の温度を制御するためのオーブン温度制御手段(該オーブン温度制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し);およびその中に固有のオーブン温度制御ソフトウェアモジュールを有するオーブン温度制御手段と通信するコンピュータを包含する。該方法は、以下のコンピュータ化された段階、すなわちa)予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度を受領すること;b)DNA分子の混合物を、予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度に加熱すること;c)予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度で、変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーを用いて段階(b)の生成物を分析して、その中のいかなるヘテロ突然変異体部位の分離された成分の存在も同定することを包含する。該方法において、予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度は:a)計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度を得るための計算段階;b)予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度を得るための予測段階、の段階により得ることができ;ここで、計算段階は、第一の数学的モデルに従って、計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度を計算することを含んで成り;ここで、予測段階は、第二の数学的モデルに従って、計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度を補正することを含んで成り;ここで、第二の数学的モデルは、計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度との、経験的に決定されたヘテロ突然変異体部位分離温度の比較に基づく。
【0062】
本発明の本局面の一態様において、予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度は、以下の式:T(hsst)=X+m・T(w)により計算され、ここで、T(hsst)は予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度であり、T(w)は、野性型二本鎖DNAの変性された状態と非変性状態との間に選択された平衡が存在する、ソフトウェアにより計算されたかもしくは実験的に決定された温度であり、Xは変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー検出係数であり、そしてmは0と2との間で選択される重み係数である。
【0063】
別の局面において、本発明はコンピュータ化された制御手段を包含する変性高速液体クロマトグラフィー系に関し、該クロマトグラフィー系は、マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離カラム;分離カラムに進入する移動相の温度を制御するためのオーブン温度制御手段(該温度制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し);移動相MIPC分離カラムを指図するための導管手段;オーブン温度制御手段と通信するコンピュータ;コンピュータおよびオーブン温度制御手段と作業連合にあるオーブン温度制御ソフトウェアモジュールを含んで成り、該コンピュータは、混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子の分離のためヘテロ突然変異体部位分離温度をコンピュータ計算するための温度コンピュータ計算ソフトウェアを包含する。該系において、マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離カラムが入口端を包含し、そして、オーブン温度制御手段が:循環空気温度制御系を有する空気浴オーブン;入口端および出口端を有するある長さの毛細管を包含し、該毛細管の出口端は分離カラムの入口端と連結され、また、毛細管の入口端は工程液を受領するための手段を含んで成り、該管は6から400cmまでの完全に伸長された長さを有し;そして、分離カラムおよび毛細管のコイルが空気浴オーブン中に囲まれかつその中の空気に曝露され、該温度制御系はオーブン温度制御モジュールからの制御コマンドに応答する。
【0064】
あるいは、該オーブン温度制御手段は:第一の熱伝達表面、分離カラム差込口、およびキャピラリーコイル差込口を有する熱伝導ブロック;その内壁と熱伝導の関係で分離カラム差込口内に配置される分離カラム;ならびに、キャピラリーコイル差込口中に配置される毛細管のコイルを包含することができ、該コイルの外側先端はキャピラリーコイル差込口の内壁と熱伝導の関係にあり、該温度制御系はオーブン温度制御モジュールからの制御コマンドに応答する。ペルティエ型の加熱および冷却装置が、該第一の熱伝達表面と熱伝導の関係で提供されることができる。
【0065】
なお別の局面において、本発明は、分離されるべき混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子の塩基対長さを受領するための手段、変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーによる該等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子の分離に必要とされるヘテロ突然変異体部位分離温度を計算するための手段を包含するソフトウェアプログラムを提供し、ここで、該ヘテロ突然変異体部位分離温度が、以下の式:T(hsst)=X+m・T(w)により計算され、ここで、T(hsst)はヘテロ突然変異体部位分離温度であり、T(w)は、野性型二本鎖DNAの変性された状態と非変性状態との間に選択された平衡が存在する、ソフトウェアにより計算されたかもしくは実験的に決定された温度であり、Xは変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー検出係数であり、そしてmは0と2との間で選択される重み係数である。
【0066】
別の局面において、本発明は、高速液体クロマトグラフィー系を用いて混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子の分離を遂げる方法に関する。該系は、移動相の溶媒溶液および水性成分の流量を制御するための移動相流量制御手段(該流量制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し);MIPC分離カラム;移動相を移動相流量制御手段からMIPC分離カラムに向かわせるための導管手段;およびその中に固有のソフトウェア移動相流量制御モジュールを有する移動相流量制御手段と通信するコンピュータを包含する。該方法は、(a)混合物中の変性されないホモ二重鎖もしくはヘテロ二重鎖分子の長さを有するDNA分子の塩基対長さの数値を受領すること;(b)非変性条件下で該カラムからの該塩基対長さを有する分子の溶出を遂げることができる溶媒濃度を計算すること;(c)該ヘテロ二重鎖を部分的に変性させるのに有効な条件下で該分離を遂げることができる溶媒濃度および対応する溶媒の勾配の範囲を計算すること;(d)移動相流量制御モジュールに、溶媒濃度および溶媒の勾配の範囲を提供すること;ならびに(e)分離を実施すること、のコンピュータ化された段階を包含し、ここで、移動相流量制御モジュールが、選択されたフラグメントの分離を遂げるのに必要とされる勾配および溶媒濃度を果たすように移動相流量制御手段の設定を制御する。該移動相流量制御手段は、それぞれが流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する自動開放制御を伴う一組の流量制御弁であることができるか、もしくは、その流量設定が流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する一組のポンプであることができる。該方法において、勾配はイソクラチック勾配であることができる。また、該方法において、溶媒濃度を、該塩基対長さを有するDNA分子について計算された%Bの値より下で開始するよう計算し、かつ、該塩基対長さのDNA分子について計算された%Bの値より上で終了するよう計算することができ、ここで、%Bは有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり、ここで、%Bは、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数を有する一次、双曲線、二次もしくは三次の式により計算される。
【0067】
なお別の局面において、本発明は、コンピュータ化された制御手段を包含する変性高速液体クロマトグラフィー系に関する。該クロマトグラフィー系は、移動相の溶媒溶液および水性成分の流量を制御するための移動相流量制御手段(該流量制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し);MIPC分離カラム;移動相を移動相流量制御手段からMIPC分離カラムに向かわせるための導管手段;ならびに移動相流量制御手段と通信するコンピュータ;該コンピュータおよび移動相流量制御手段と作業連合にあるソフトウェア移動相流量制御モジュールを包含し、ここで、該移動相流量制御手段は、それぞれが流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する自動開放制御を伴う一組の流量制御弁であるか、もしくは、移動相制御手段は一組のポンプであって、その流量設定が流量制御モジュールからの制御コマンドに応答し、コンピュータは、混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子の分離のための溶媒の勾配の開始および終了溶媒濃度をコンピュータ計算するための溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアを包含する。該系において、溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアは、該混合物中のホモ二重鎖もしくはヘテロ二重鎖分子の塩基対長さを受領しかつ該塩基対長さを有するDNA分子について計算された%Bの値より下で開始する溶媒濃度を計算するためのソフトウェア手段を包含することができ、かつ、該塩基対長さのDNA分子について計算された%Bの値より上で終了するよう計算され、ここで、%Bは有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり、ここで、%Bは、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数を有する一次、双曲線、二次もしくは三次の式により計算される。
【0068】
さらになお別の局面において、本発明は、分離されるべき混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子の塩基対長さを受領するための手段、MIPCにより該塩基対長さを有するDNA分子を溶出するのに必要とされる溶媒濃度を計算するための手段、ならびに部分的変性条件下で該ヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子を分離するのに使用されるべき溶媒の勾配を選択するための手段を包含するソフトウェアプログラムに関する。溶媒濃度を計算するための手段は、該塩基対長さを有するDNA分子について計算された%Bの値より下で開始する溶媒濃度を計算するための手段を包含し、かつ、該塩基対長さのDNA分子について計算された%Bの値より上で終了するよう計算され、ここで、%Bは有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり、ここで、%Bは、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数を有する一次、双曲線、二次もしくは三次の式により計算される。該ソフトウェアの一態様において、%Bは、以下の式:
【0069】
【数22】
【0070】
式中
p1、p2およびp3は、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される。別の態様において、%Bは、以下の式:
【0071】
【数23】
【0072】
式中
【0073】
【数24】
【0074】
sは勾配の傾きであり;
d、void、p4、p5、p6、p7およびp8は、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される。
【0075】
(発明の詳細な記述)
本発明の目的は、広範囲のMIPC系および方法、ならびにそれに関連するコンピュータプログラムもしくはソフトウェアで提供される。該系は、本発明の広範なMIPC分離方法のためのサンプル選択、移動相の勾配の選択および制御、カラムおよび移動相の温度制御ならびにフラグメント収集の自動化されたオプションを提供する。より早期の同時係属中かつ共通に譲渡された米国特許もしくは特許出願(米国特許第5,772,889号;同第5,997,742号;同第5,972,222号明細書;1998年10月30日に出願された米国特許出願第09/183,123号;1998年10月30日に出願された同第09/183,450号;1999年7月9日に出願された同第09/350,737号;1998年5月18日の同第09/080,547号明細書(それらのそれぞれは引用することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる))に記述されたとおり、MIPC分離方法は、DNAフラグメントの大きさに基づく分離、突然変異の検出、DNAフラグメントの精製、PCR過程のモニタリングおよび他の新規方法を遂げるのに適用することができる。本発明は、複雑な分離方法を達成するための該系の使用を助長する、これらの手順の多くを自動化する系およびソフトウェアに向けられる。
【0076】
図1は、本発明の一態様による該系の図解的配置である。複数の容器を、移動相を構成する溶液溜めとして使用することができる。例えば、容器2は、対イオン剤(例えば酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA))の水性溶液のような移動相の水性成分を含有することができ、そして、容器4は、有機(駆動)溶媒を含む対イオン剤の水性溶液(例えばアセトニトリルを含むTEAA)を含有することができる。
【0077】
本発明の記述を単純化する目的上、そして制限としてでなく、容器2中の水性溶液を溶液Aと称することができ、また、容器4中の有機溶媒を含有する溶液を溶液Bと称することができる。補助液体(例えば補助溶媒)を容器6中に保持することができる。これらの溶液を混合して、分離の間に移動相中の有機溶媒の選択された濃度を達成する。これらの溶液の他の例は、本明細書の実施例、および上に示された共通に譲渡された特許に提供される。容器は、対イオン溶液輸送管8、溶媒溶液輸送管10、およびそれと連絡しかつ脱気装置14に至る補助液体輸送管12のようなそれぞれの輸送管を有する。
【0078】
ポリヌクレオチドという用語は、リン酸残基を介して1個のリボース(もしくはデオキシリボース)から別のものに連結される不定の数のヌクレオチドを含有する直鎖状ポリマーと定義する。本発明は、二本鎖もしくは一本鎖のDNAもしくはRNAの分離で使用することができる。本発明の記述を単純化する目的上、そして制限としてでなく、二本鎖DNAの分離を本明細書の実施例で記述することができ、全部のポリヌクレオチドが本発明の範囲内に包含されることを意図していることが理解される。
【0079】
脱気装置14は、溶解された気体を液体から除去する。適する脱気装置の一例はデガスイット(Degassit)モデル6324である。溶解酸素の除去はとりわけ重要である。その存在は、系の構成部品中の鉄もしくは他の酸化可能な金属を酸化する危険を増大させ、そして従って移動相液体中に対応する陽イオンを導入するからである。
【0080】
カラム浄化溶液が浄化溶液容器16中に含有され、これは同様に、それと連絡して脱気装置14に至る浄化溶液輸送導管18を有する。本態様において、浄化溶液は容器16が脱気装置および注入弁54より上に上昇される場合に重力圧により流れることができる。あるいは、図2に示されるようなポンプ110を、浄化溶液の流れを達成するために提供することができる。
【0081】
本発明の系は、移動相の溶媒溶液および水性成分の流量を制御する慣習的な移動相流量制御手段を組込む。一態様において、移動相流量制御手段は、それぞれが下述されるところのコンピュータ制御下に自動開放制御をもつ、一組の流量制御弁を含んで成る。別の態様において、移動相流量制御手段は一組のポンプを含んで成り、その流量設定は下述されるところのコンピュータ制御に応答する。
【0082】
図1に具体的に説明される系は、一組の流量制御弁を包含する移動相流量制御手段の一態様を利用する。脱気装置14から至る、脱気された対イオン溶液導管20、脱気された溶媒溶液導管22、および脱気された補助液体導管24が、それぞれの水性成分比例弁26、溶媒溶液比例弁29、および補助液体比例弁30と連絡する。これらの比例弁の設定は、それらに関連したステッピングモーターのような弁作動器により設定かつ変更され、また、これらの弁作動器は、下により詳細に記述される移動相流量制御ソフトウェアモジュールからのコマンドに応答して所望の一組の設定を確立するよう応答する。流量制御弁26、28および30は、移動相の溶媒溶液および他の成分の流量を制御する移動相流量制御手段の一態様を含んで成る。これらの弁の設定は、インジェクタ弁および分離カラムを通る液体(補助溶媒、溶媒溶液、など)の比を制御する。導管32、34および36は、それぞれの比例弁26、28および30からポンプ38の取込みまで至る。
【0083】
浄化溶液輸送導管31は浄化溶液弁40に至る。任意の浄化溶液導管42が弁40から至りかつポンプ38の入口と連絡する。弁33は導管42を通る流れを制御する。
【0084】
弁26、28および30の開口部が、移動相(MIPCによる大きさに基づくDNA分離は溶媒濃度の関数であるため本系の最も重要な部分)内の有機溶媒および他の成分の相対比を正確に設定する。多様なDNAフラグメント分離方法に関して記述されるであろうとおり、時間の関数としての有機溶媒の勾配の傾きが分離過程の間に変えられ、そして最も決定的な相は、非常に正確な勾配、もしくはいくつかの過程については、高度に正確なイソクラチック(一定の溶媒濃度)組成を必要とするかもしれない。弁26、28および30の設定は、慣習的弁制御装置へのシグナルにより遠隔で設定することができる慣習的な弁作動器により確立される。下により詳細に記述されるであろうとおり、本発明の装置制御ソフトウェアはコンピュータに制御される命令を提供し、それらは系の作動の間の適切な時点で正確な流量値への弁26、28および30の設定を確立する。
【0085】
同様な様式で、本発明の装置制御ソフトウェアは、ポンプの切/入状態およびポンプの圧もしくは流速の設定のようなポンプ38の作動上のパラメータを確立するためのコンピュータに制御される命令を提供する。
【0086】
ポンプ流出導管44はインラインミキサー46と連絡し、成分の徹底的な混合のためミキサー46を通る液体の流れを指図する。混合された液体の流出導管48は、任意のガードカラム50と連絡して、混合された液体を処理してDNAフラグメントの分離を妨害するとみられる多価金属陽イオンおよび他の汚染物質を除去する。ガードカラム50は、慣習的イオン交換による多価金属陽イオンの除去のためにナトリウムもしくは水素の形態の陽イオン交換樹脂を含有することができる。導管52はガードカラムの出口および浄化溶液インジェクタ弁54の入口と連絡する。浄化溶液供給導管56は弁40を浄化溶液インジェクタ弁54と連結し、そして廃棄出口導管58は廃液溜めに至る。導管60は弁54からサンプル注入弁62に至る。
【0087】
サンプルアリコートセレクター64は、サンプル導管66を通ってインジェクタ弁62と連絡する。廃棄導管68はインジェクタ弁から至りそして廃棄液体を除去する。サンプルアリコートセレクター64についての詳細は図3に関して下により詳細に提供し、また、浄化溶液ならびにサンプルインジェクタ弁54および62、ならびにそれらの作動についての詳細は、図4−8に関して下により詳細に提示する。
【0088】
インジェクタ弁62において、サンプルが、導管60から弁を通過する溶媒および担体液の流れに導入される。サンプル導管70は、インジェクタ弁62の出口および空気浴オーブン72中のカラムプレフィルター74と連絡する。毛細管コイル76はプレフィルター74および分離カラム78の入口と連絡する。キャピラリーコイル76の伸長された長さは、加熱されたオーブン空気からコイルを通過する液体に十分な熱を進ませて、液体を選択された温度の±0.05℃以内にする。オーブン72は、プレフィルター74、コイル76および分離カラム78中のこの温度の均一性を確立する。
【0089】
分離カラム78は、MICP過程により対イオンの存在下でのDNAフラグメントの大きさに基づく分離を遂げる独特の分離表面を有するビーズで、慣習的なカラム構築物中に充填される。分離過程およびビーズについての詳細は下に詳細に記述する。塩基対長さの大きさで分離されたDNAフラグメントを含有する移動相の流れが、導管80を通り分離カラム78から出る。
【0090】
導管80は検出器84と連絡する。検出器は、液体の移動相中のDNAフラグメント構造のUV透過を測定する慣習的なUV透過装置であることができる。吸光度は、試験されている液体中のDNAフラグメントの濃度の関数である。
【0091】
あるいは、DNAを蛍光マーカーで標識することができる場合、検出器は、該蛍光マーカーに最も適切な周波数で発射レベルを検出することにより液体中の該マーカーのレベルを継続的に測定することができる蛍光検出器であることができる。その中のDNAフラグメントの濃度の関数である液体の一特徴を継続的に測定することが可能ないかなる検出系も適し、かつ、本発明の範囲内にあることを意図していることが容易に明らかであろう。導管86は試験された液体を除去する。適する検出器の例は、日立から入手可能なL−7420 UV可視検出器およびL−7480蛍光検出器を包含する。検出器からの電気的出力は、好ましくは、A/D変換器によりディジタルの形態に変換され、そしてコンピュータ500中のディスクドライブのようなディジタル記憶装置に標準ディジタル形式で記録される。
【0092】
その後、移動相が、図14−24に関して下により詳細に記述されるフラグメントコレクタ88に進む。フラグメントコレクタ88において、分離されたDNA画分を含有する移動相の選択された部分を、後の処理もしくは分析のためバイアルに収集する。収集されない画分は、廃棄導管90を通って除去される。
【0093】
該DNA分離過程は多価陽イオンの存在により損なわれる。上の記述において、液体流系は一連の導管として記述される。該導管は、多価陽イオンの液体への導入を回避するよう選択された毛細管である。好ましい毛細管の素材はチタンおよびPEEKである。類似の理由から、系の他の構成部品は好ましくはチタンもしくはPEEKから作成されるか、またはそれらを酸化から保護しかつ液体への多価陽イオンの導入を予防するようにPEEKで被覆された、液体に露出される表面を有する。ステンレス鋼もまた使用することができるが、但し、それは全部の酸化された表面素材を除去するよう処理されており、また、ステンレス鋼表面を接触する溶液は溶解酸素を含まない。
【0094】
移動相流量制御手段の別の態様を具体的に説明する図2は、移動相組成を確立するためのポンプ系の部分的図解である。本系は、下述される溶液AおよびBのような水性成分および溶媒溶液の比を制御するのに比例ポンプに頼る。比例ポンプ92、94および96の入口は、それらのそれぞれの供給導管98、100および102によって脱気装置14と連絡し、また、それらのそれぞれの出口導管104、106および108によってインラインミキサー46と連絡する。これらの比例ポンプの作動速度は、下により詳細に記述される流量制御ソフトウェアモジュールにより、それを通る流速に較正されかつ制御される。これらの比例弁の設定が、インジェクタ弁および分離カラムを通る液体(補助溶媒、駆動溶媒、など)の液体流速および比を制御する。
【0095】
ポンプ110は、任意の導管112を通って系に浄化溶液を供給することができる。任意の導管107は導管112から至り、そしてインラインミキサー46と連絡する。弁111は導管107を通る流れを制御する。
【0096】
本発明での使用に適する移動相制御手段の例は、日立から入手可能なプログラム可能な二連ピストンポンプモデルL−7100、およびウォーターズ(Waters)から入手可能なモデル2690分離モジュールを包含する。
【0097】
図3は、MIPC系で使用されるオートランプラーサブシステムの図解である。本オートサンプラーは、マルチウェル113中の選択されたウェルもしくはその中で支持されるバイアル(例えば微小遠心管)から、予め決められた容量を有するアリコートを取り出す。マイクロウェルプレートは、標準的な96穴マルチウェルプレートのような、各ウェルについて正確な寸法位置を有する、いずれかの予め決められた数のウェル114を有することができる。サンプリング針115はサンプリングキャリジ116上に支持される。サンプリングキャリジ116は、垂直支持体117上の垂直の動きのため据え付けられた針支持体118を有する。垂直支持体117はキャリジ116上の側方の動きのため据え付けられる。支持体117の側方の動きは、選択されたウェルもしくは注入弁120のインジェクタ口119の上に針を配置する。可撓性の管123は、一方の端で針115と、および他方の端でシリンジ針124と封止嵌合で据え付けられる。シリンジ針124はシリンジ筒125の内部体積と連絡する。ピストン126はシリンジ作動器ロッド128上に据え付けられ、そして筒125の内壁と封止嵌合を形成する。作動においては、シリンジ作動器ロッド128の垂直の上向きの動きが筒125中の液体を置き換え、また、シリンジ作動器ロッド128の垂直の下向きの動きがシリンジ中に液体を引く。ロッド128は、ガイド要素132に沿った動きのため支持されるクランプ130に取付られる。弁122が針124と管123との間の連絡を提供するように配置される場合、ピストン126の下向きの動きが、サンプルをウェル114から針115中に引く。針115がインジェクタ弁口119の上に配置される場合、ピストン126の上向きの動きが、サンプルを針115から口119中に放出する。
【0098】
導管131は弁122から浄化溶液溜め121まで伸長する。弁122が針124と導管131との間の連絡を提供する位置にある場合、ピストン126の下向きの動きが浄化溶液を針中に引く。針115がインジェクタ口119の上に配置されかつ弁122が針124と導管123との間の連絡を提供するよう配置される場合、ピストン126の上向きの動きが浄化溶液をインジェクタ口119中に放出する。適するオートサンプラーの例は、日立モデルL−7250プログラム可能オートサンプラー、およびHTS PAL高スループットオートサンプラー(島津、メリーランド州コロンビア)を包含する。
【0099】
オートサンプラーの動作は以下の制御の連続を包含する。すなわち
1.サンプリング針115を、選択されたウェル114の中央のプログラムされたX−Y座標に動かす。
2.サンプリング針115をプログラムされた距離下げて、針を選択されたウェル114中の液体中に下げる。
3.シリンジロッド128の下向きの垂直の動き、予め決められた容量のサンプルを針115中に引くプログラムされた距離。
4.マイクロタイタープレート113の上部の上のある距離まで針115を上げること。
5.針115をインジェクタ口119の位置に動かすこと。
6.針115をインジェクタ口119まで下げること。
7.サンプルを針115からインジェクタ口119中に追い出す、シリンジロッド128の上向きの垂直の動き。
8.針124を浄化溶液121に連結する弁122の動き。
9.浄化溶液をシリンジ中に引くピストン126の下向きの動き。
10.針124を導管123に連結する弁122の動き。
11.浄化溶液を注入口119中に放出するピストン126の上向きの動き。
12.次のDNA分離の開始で、段階1−11を反復する。
【0100】
図4は、MIPC系での使用のためのサンプル注入弁および浄化溶液注入弁の構造を示す図解である。同一の弁構造を、サンプル注入および浄化溶液注入の双方に使用することができる。注入弁150はステッピングモーター(示されない)のような慣習的な弁モーターにより作動される六口の回転弁である。例示的弁は、レオダイン(RHEODYNE)(カリフォルニア州コタチ)から入手可能なラブプロ(LabPRO)弁を包含する。該弁は入口および出口導管に永続的に連結された6個の外口を有する。外口152は、分析されるべきサンプルを受領するための注入ライン154と連結される。外口156は分離カラム78(図1)と連絡するカラム供給導管158と連結される。外口160はポンプ38(図1)の出口と連絡する入口導管162と連結される。外口164は廃棄導管166と連結される。反対の出口168および170は、サンプルループ172の反対のサンプル入口および出口端と連絡する。浄化溶液の注入の間、弁が一区画の浄化溶液を溶媒の流れに注入して、分離カラムおよび注入の下流の他の構成部品を再生および浄化し、蓄積された残渣および分析前から残存するいかなる残余のDNAも表面から除去する。
【0101】
外口と内的通路との間の連結、および図1中の浄化溶液インジェクタ弁54およびサンプルインジェクタ弁62でのそれらの作動を、図5−8に記述する。下の記述はサンプル注入弁62について提示されるが、しかし、同一の関係および作動が、注入されている液体およびそれらの供給源を除いて、浄化溶液注入弁に当てはまる。
【0102】
図5および6は充填されたループ注入(より多量のサンプル(もしくは浄化溶液)が注入されるはずである場合に使用される様式)のための弁の使用を記述する。図5はサンプル負荷位置の注入弁の図解であり、また、図6は注入位置の注入弁の図解である。図5に示される負荷位置において、弁の第一の内的通路174が、ループ172の第一端176をサンプル注入ライン154と連結し、また、第二の内的通路178は、ループ172の第二端180を廃棄導管166と連結する。第三の内的通路182は、ポンプ出口導管162を分離カラム78への導管158と連結する。注入口154からのサンプルが通路174を通ってサンプルループ172に導入される際に、ループ172中のいかなる剰余分もしくは液体も通路178を通って廃棄導管166に排出される。同時に、移動相溶液が、ポンプ導管162から分離カラム78に、第三の導管182を通って流れる。
【0103】
図6に示される注入位置への矢印150の方向の弁の回転が、内的通路を動かして、入口および出口導管との異なる一組の連結を確立する。通路179は、ループ172の一端180を分離カラムに至る導管158と連結し、また、通路175は、ループ172の他端176をポンプに至る入口導管162と連結する。ポンプからの移動相溶液が通路175に進入しそしてループ172を通過して、サンプル溶液をカラムに至る導管158に排出し、そしてループをすすぎ続け、いかなる残渣もカラム導管158中に運搬する。そのうちに、通路183がサンプル注入導管154を廃棄に連結し、所望の場合は通路183を通る浄化溶液の通過を可能にする。この手順は、分離カラム78(図1)に至る導管への測定された容量のサンプル溶液の信頼できる注入を提供し、該液体は、それが分離カラムに達する前に、プレフィルター74および温度調節コイル76を通過する。
【0104】
図1−8に関して上述されたところの多口弁を使用する改良されたカラム浄化系の特徴は、共通に所有される同時係属中の1999年4月2日に出願された米国特許出願第09/285,331号明細書(その完全な内容はこれにより引用することにより組み込まれる)に、より詳細に記述される。
【0105】
図7および8は、図5および6に関して記述されたと同一の作動の連続を、しかしサンプル溶液もしくは廃棄液体の部分的ループ注入を伴い示す。
【0106】
本発明の系は、分離カラムおよびカラムに進入する移動相の温度を制御するためのオーブン温度制御手段を組込む。
【0107】
図9および10は温度制御手段の一態様を具体的に説明する。図9はHPLC DNA分析装置カラムオーブンの工程区画(process compartment)の前面図であり、また、図10は図9に示されるHPLC DNA分析装置カラムオーブンの平面図である。図9および10に示される態様の工程区画は、空気廃棄口202が配置される背壁200により加熱区画から分割される。熱電対もしくはサーミスタのような温度センサーを囲む金属棒204が口202中に配置されて、該口を通過する空気の温度を測定する。毛細管206はサンプルインジェクタ(示されない)からプレフィルター208に至る。プレフィルター208は、入ってくる液体から汚染物質を除去する、米国特許第5,772,889号明細書に記述されるようなインラインフィルターもしくはガードカートリッジである。毛細管の長いコイル210は、それから移動相液体を受領するためのプレフィルター208と連絡する入口端を有する。長いコイル210は、分離カラム214の入口端212と連絡する出口端を有する。分離カラム214は、好ましくはMIPC分離媒体を含有する。出口管216は分離カラム214の出口端218から検出器84(図1)に至る。コイル210はチタンもしくはPEEKのようなDNAに適合性の多価陽イオンを含まない管から作成される液体加熱コイルである。使用される管の長さおよび直径は、それを通過する液体移動相が処理区画(processing compartment)中の空気の平衡温度に達することを可能にするのに十分であるいずれかの長さである。6から400cmまでの管の長さ、および0.15から0.4mmまでの管の直径が通常十分である。管210の長さは該系により達成される成分の分離を低下しないため、該長さは工程液の効果的な加熱を達成するのに必要とされる長さに基づいて選択することができる。
【0108】
図10を参照すれば、処理区画220からの空気は、温度調節のためのヒーター/ファン系222を通って壁200中の開口部202を通過する。加熱区画224により受領される調節された空気は、側壁227とオーブン外壁228との間の空間により規定される通路226に沿って処理区画220に再循環する。図9および10に示される態様中の加熱コイルは、±0.2℃の範囲内までの温度の正確さを提供し、そして5℃の温度変化について5分より下、および1℃までの温度変化について2分より下まで、温度設定の間の温度平衡時間を短縮する。
【0109】
図11および12は、温度制御手段の別の態様を具体的に説明する。図11は小型のカラムヒーターの端部図であり、また、図12は図11の線A−Aに沿って採られた断面図である。本態様は、系の構成部品へのおよびそれからの熱の直接の金属から金属への伝導に頼り、そして、温度の変化および正確さを達成する空気浴に依存しない。本態様は2カラム系について示されるが、とは言え所望の場合は単一カラムに使用することができる。それは、系の構成部品を受領するよう大きさおよび形状を定められた差込口を有する熱伝導ブロック(230、232)を含んで成る。フィルター空隙もしくはプレフィルター差込口(234、236)は、プレフィルター(238、240)を受領するよう大きさを定められた内表面を有し、かつ、その外表面と熱伝達接触を確立する。分離カラム差込口(242、244)は、それぞれの分離カラム(246、248)、および毛細管をそれぞれの分離カラムに連結する分離カラム継手(250)(1個が図12に示される)を受領するよう大きさを定められた内表面を有する。差込口(242、244)は、ブロック(230、232)の内熱伝達表面と、その中で受領される分離カラム構成部品の間の熱伝達接触を確立するよう大きさおよび形状を定められる。キャピラリーコイル差込口252(1個が図12に示される)は、毛細管254(1個が図12に示される)のコイルを受領しかつその外表面との熱伝達接触を確立するような形状にされる内表面を有する。これらの図に示される態様において、差込口(234、236)および(242、244)は、共通の面に存するおおよそ平行な中心軸を伴う筒状の穴であることができる。他の形状が等しく適しかつ全部の形状が本発明の範囲内にあると考えられることが、当業者に容易に明らかであろう。
【0110】
温度センサー差込口(256、258)が熱伝導ブロック(230、232)中に提供される。熱伝導の関係にある連結管262を受領するためのキャピラリー差込口通路260もまた加熱伝導ブロック(230、232)中に提供される。キャピラリーコイル差込口252が、本図で、それらの軸が差込口(234、236)および(242、244)の軸に垂直な筒状の空隙であることが示される。場合によっては、伝導金属筒(示されない)を、金属ブロック加熱アセンブリとコイル中の液体との間の熱交換面積を増大させるため、その内表面との熱伝導接触でキャピラリーコイル内に配置することができる。カプトン(KAPTON)抵抗ヒーターもしくは他の型の加熱装置264は、熱伝導ブロックに熱を伝達するように、加熱ブロック(230、232)の表面266と268との間にかつそれらと熱伝導接触で配置される。冷却用放熱器(270、272)は、それから熱を除去するように、熱伝導ブロック(230、232)の反対の冷却表面(274、276)と熱伝導関係で配置される。冷却ファン278および280は冷却用放熱器270および272と熱除去関係にあり、そしてそれからの熱除去を加速するよう起動される。
【0111】
熱伝導ブロック230および232、ならびに冷却用放熱器270および272は、アルミニウムもしくは銅のような高い熱伝導性を有する素材から作成されるが、とは言え、それらは、鉄金属のような他の熱伝導性固体、もしくは必須の熱伝導性を有するいずれかの他の固体材料から作成することができる。ヒートパイプもまた冷却用放熱器として使用することができる。
【0112】
毛細管はPEEKもしくはチタンから作成することができるが、とは言え最大の熱伝達効率にはチタンが好ましい。本改良された熱伝達で、キャピラリーコイルは約5cmの完全に伸長された長さを有することができるが、とは言え10cmの最小のコイル長さが好ましい。PEEK管のより長いコイルが、チタンの毛細管と同一の熱伝達を達成するのに必要とされるとみられる。
【0113】
図11および12に示される系は鏡像の2系を含んで成る。単一のカラムに系の半分が十分であるとみられ、かつ本発明の範囲内に包含されることを意図していることが容易に明らかであろう。差込口の位置、整列および間隔は本発明の決定的な特徴でない。小型かつ熱伝達効率の良い結果を提供するいかなる整列および形状も、本発明の範囲内に包含されることを意図している。
【0114】
図11および12に示される本発明の態様は、ヒーターの制御に対しより応答性であり、一温度基準から別のものへの迅速な変化を提供し、そして設定温度の±0.5℃以内の温度の正確さを維持する、小型のヒーターを提供する。加熱ブロックと加熱されている要素との間の、金属と金属の接触で得られる熱伝達速度は、空気浴系で得ることができるよりはるかにより大きく、変更された温度に対するより迅速な応答およびより大きな温度の正確さを提供する。それはまた、より短い毛細管コイルでの工程液温度の調節も可能にする。
【0115】
温度制御手段のなお別の具体的説明において、図13は、本発明の好ましいペルティエ型のヒーター/冷却器の態様の図解を示す。加熱ブロック282は、所望の温度に達しかつ維持するのに必要とされる加熱もしくは冷却のためのペルティエ型加熱要素(示されない)と伝導接触にある。チャンネル284は、プレフィルター288と熱伝導関係にある内表面286を有するプレフィルター受容器である。チャンネル290は、分離カラム298の継手294および端ナット要素296と熱伝導関係にある内表面292を有するカラムおよびカラムガード受容器である。毛細管300はプレフィルター288ならびにサンプルおよび溶液供給源(示されない)と連絡する。分離カラム288の出口からの毛細管302は分析装置84(図1)と連絡する。毛細管304はプレフィルター288の出口端を継手294と連結し、それは順に分離カラム298と連絡する。毛細管304は、加熱ブロック282のチャンネルの迷路様の形状中で受領されて、増大されたキャピラリー長さ、および毛細管304と加熱ブロック282との間の表面接触を提供する。迷路および管の形状は、チャンネルあたり1個以上の列(pass)の付加的なループおよびキャピラリーの配置を包含する、十分なキャピラリー長さおよび表面接触を提供するいかなる形状であることもできる。毛細管304はPEEKもしくはチタンであることができ、その高い熱伝導性のためチタンが好ましい。加熱ブロック282はいずれかの熱伝導性の金属であることができる。アルミニウムもしくは銅がそれらのより高い熱伝導性のため好ましいが、とは言え鋼のような鉄金属を使用することができる。ペルティエ型ヒーターは、ペルティエ型熱循環器(thermocycler)で使用される系のような、慣習的な温度および制御系(示されない)で制御される。図11および12で示される態様でのように、ペルティエ型の加熱されたブロックにより達成される温度の正確さは±0.5℃である。
【0116】
図9−13に関して上述された、改良された空気浴オーブンおよび固体ブロック加熱系の特徴は、共通に所有される同時係属中の1999年4月19日に出願された米国特許出願第09/295,474号明細書(その完全な内容はこれにより引用することにより組み込まれる)に、より詳細に記述される。
【0117】
図14は、本発明の好ましいフラグメントコレクタ348の透視図であり、図15はその前面図であり、そして図16はその端部図である。これらはX軸の動きの制御系の詳細を具体的に説明する。フラグメントコレクタ350は、制御部ハウジング352、サンプルトレイ支持体354および一吹き(puff)制御部ハウジング356を有する。ピンチ弁358が、液体の流れを終了させるために制御部ハウジング352の前に据え付けられる。マルチウェルプレート360はペルティエ型の冷却された冷却パッド362上に支持される。フラグメント分注器364が分注器支持キャリジ366上に支持される。分注器支持キャリジ366は、Y軸の動きの制御部368上でY軸の動きについて支持される。Y軸の動きの制御部368は、溝穴370を通って、図17に示されるX軸の動きの制御系372まで伸長する。X軸およびY軸の動きの制御系は、その中に画分が分注されるはずであるプレート360中のウェルの中心軸に対応するX−Y座標に分注器支持体366を動かし、画分が分注されるまで分注器をこの位置で維持し、そしてその後、画分が分注されるはずである次のウェルの中心軸に対応するX−Y座標に分注器を動かす。
【0118】
図17は、フラグメント分注器のX軸の動きについてウォーム歯車装置駆動アセンブリの詳細を示すために前面パネルが除去された、図15のフラグメントコレクタの部分的前面図である。ガイドロッド374が、左および右支持パネル376および378によりその端部で支持される。支持パネル376および378は水平の支持プレート380上に据え付けられる。外にねじを切られたウォーム歯車装置382が、左および右支持パネル376および378上に支持された慣習的ベアリング(示されない)上のその中心軸の周りの回転のため据え付けられる。右支持パネル378上に据え付けられたステッピングモーター384は車軸386を有し、その上に第一の駆動プーリー388が据え付けられる。第二の駆動プーリー390は、ウォーム歯車装置382上で、第一の駆動プーリー388と整列された位置に据え付けられる。駆動ベルト392がプーリー388および390を嵌合して、モーター車軸386の回転運動をウォーム歯車装置382に移す。
【0119】
Y軸の動きの制御部368はX軸の動きキャリジ394(図17)上に支持される。X軸の動きキャリジ394は、ウォーム歯車装置382の外的ねじ山を嵌合する内側にねじを切られたボア396を有する。X軸の動きキャリジ394中のチャンネル398は、X軸方向の滑る動きのためのガイドロッド374と滑り嵌合のため配置される。ガイドロッド374は、ウォーム歯車装置382が回転する場合にウォーム歯車装置の軸の周りの回転に対してX軸の動きキャリジを安定化する。ステッピングモーター384の段階状の起動は、ウォーム歯車装置382の段階状の回転に移され、X軸の動きキャリジをX軸に沿って左もしくは右に、画分が分注されるはずであるウェルのX軸座標と整列して分注器を配置する位置まで動かす。
【0120】
図18は、フラグメント分注器のY軸の動きのための駆動アセンブリのモーターおよびウォーム歯車装置アセンブリの部分図である。Y軸ステッピングモーター400はX軸の動きキャリジ394の支持表面402上に支持される。Y軸ウォーム歯車装置404はステッピングモーター駆動装置406上に据え付けられる。Y軸ウォーム歯車装置404は外鞘408中に部分的に囲まれる。外鞘408はステッピングモーター400のハウジングの表面410上に据え付けることができるか、あるいは、それはキャリジ394に取付けることができる。溝穴370は前面パネル416の反対の縁412および414により規定される。ガイド418は、鞘408およびウォーム歯車装置404と軸方向に平行な整列で鞘408の下面上に据え付けられる。
【0121】
図19は、図17および18に示される駆動アセンブリの端部図である。これはフラグメント分注器のY軸の動きのための駆動アセンブリのさらなる詳細を示す。鞘408は、ウォーム歯車装置404のねじを切られた嵌合表面409を露出させる側方開口部を有する。分注器支持体416は、ガイド418および適合された分注器支持溝420の相互嵌合により支持される。ガイド418の内側に勾配をつけられた縁は、支持溝420の対応して外側に勾配をつけられた反対の縁を嵌合する。分注器支持体366は、ウォーム歯車装置404の嵌合表面409を嵌合する、溝をつけられた表面422を有する。ウォーム歯車装置404の回転は分注器支持体366のY軸の動きを遂げる。ガイド418との溝420の嵌合は、分注器支持体366が回転する場合に、それをウォーム歯車装置404の軸の周りの回転する動きに対して安定化する。ステッピングモーター400の段階状の起動は、ウォーム歯車装置404の段階状の回転に移され、分注器支持体366を、Y軸に沿って後方にもしくは前方に、画分が分注されるはずであるウェルのY軸座座標と整列して分注器を配置する位置まで動かす。ガイド418および溝420の適合された嵌合表面が、ガイド、ならびにガイドおよび溝の嵌合の安定化機能を提供する他の配置であることができることが、当業者に容易に明らかであろう。適するフラグメントコレクタの例は、トランスゲノミック(Transgenomic)から入手可能なモデルASW100、およびギルソン(Gilson)(ウィスコンシン州ミドルトン)からのモデルFC 203/204フラクションコレクタを包含する。
【0122】
図20は標準的な96穴マルチウェルプレートの平面図である。プレート424はサンプルウェル426を有し、各ウェルの中心軸は、次の隣接するウェルの中心軸から、XおよびY軸に沿った正確に反復される間隔を有する。ウェルの数およびウェルの間隔は所望のいずれかの値を有するよう選択することができる。ウェルの形状、大きさおよび分布は、例えば96、384および1536穴マイクロタイタープレートについて標準化することができ、そしてこれらのそれぞれもしくは全部を本発明のフラグメントコレクタとともに使用することができる。ウェルは示されるとおり使用することができるか、または、それらは、個別のサンプルバイアルの内張り、もしくはマイクロタイタープレートのウェルの内側寸法に対応する外側寸法を有するサンプルバイアルを含有する慣習的な上置き板状内張りの使用により、サンプルの汚染から保護することができる。
【0123】
図21は、本発明の空気一吹き(air−puff)分注器の一態様の図解である。該分注器の特徴は、同時係属中の共通に譲渡される1998年8月28日に出願された米国特許出願第09/143,456号明細書(その完全な内容はこれにより引用することにより組み込まれる)に記述される。加圧ガスが、加圧ガスの供給源(示されない)から導管430を通り一吹き弁428にフィードされる。導管432は一吹き弁428およびサンプル分注器434と連絡する。導管80は図1に示される分離系および分注器434と連絡する。一吹き弁428は、制御部から作動する弁開放および弁閉鎖シグナルを受領するための連絡ライン438によりフラグメントコレクタ制御部436と連結される。サンプルがマルチウェルプレート424中のウェルもしくはバイアルに分注されるはずである場合に、弁開放シグナルが一吹き弁428に与えられ、また、弁閉鎖シグナルは、サンプル収集が完了した場合、もしくはバイアルが一杯になった場合のいずれかより早いほうで、一吹き弁428に与えられる。収集制御部436は、例えば連絡ライン440、442および444により受領されるデータおよび命令に応答して、弁開放および弁閉鎖シグナルを提供する。
【0124】
図22は、一吹き弁428が閉鎖された位置にある場合のその要素を示す、図21の空気一吹き分注器の態様の拡大断面図である。サンプル供給導管80が分注器434の湾曲した通路446の入口端と連絡する。廃棄への導管90は湾曲した通路446の出口端と連絡する。湾曲した通路446の中央448は、該通路中の開口部を通って空気一吹き導管432と連絡する。空気一吹き導管432は、湾曲した通路446との連絡にその出口を配置するよう位置を定められた、分注器434の筒状のくぼみ450中で受領される。湾曲した通路446の中央部分は、分注通路452と連絡するさらなる1個の開口部を有する。一吹き弁428が閉鎖される場合、サンプル液は導管80、中央通路446を通り、そして廃棄導管90に進む。分注通路はキャピラリーの大きさを有し、従ってこの通路中の液体は、一吹き弁428が閉鎖される場合に静的である。
【0125】
図23は、一吹き弁428がサンプルの液滴をマルチウェルプレートの1個のウェル中に排出するよう開放される場合の、図22に示される分注器先端の拡大断面部分図である。本図において、サンプルは入口導管80を通って流れ続ける。一吹き弁428が開放される場合、一吹きの空気が導管432を通って湾曲したチャンバー446の中央部分448に進み、チャンバー448中の圧を増大させ、そして通路452の先端454から一滴451の液体をウェル426中に排出する。一吹き弁428は、迅速な一連のバーストを創製するよう開放および閉鎖することができ、サンプル収集が完了するかもしくはウェル426がいっぱいになるかのいずれかまで、ウェル426中に一連の液滴を排出する。
【0126】
図24は、出口ライン中の流れの制限を伴う本発明の分注器先端の代替の一態様の断面図である。それを通ってサンプル画分を含有する移動相が突出先端474中の突出しチャンバー472に至る移動相入口導管470。突出しチャンバー472は出口廃棄導管476と、および液滴突出し口478はキャピラリーの大きさの液滴形成開口部480と連絡する。開口部480から下落する液滴482はサンプルバイアル(示されない)中に収集される。制限作動器486を有する流れ制限484が出口導管476中に配置される。制限作動器は慣習的ソレノイドであることができる。制限作動器486および制限484へのシグナル電圧は、導管476を通る流れ中に所望の程度の制限を提供するよう構築することができる。流れの制限はピンチ弁、ゲート弁などを包含するいずれかの調節可能な貫流弁により達成することができることが当業者に容易に明らかであろうし、また、本発明は、所望の程度の制限を提供する全部の調節可能な制限弁の使用を包含することを意図している。
【0127】
図25は、本発明の慣習的検出器、中央制御部および液滴の大きさ制御系の組み合わせの図解である。ポリヌクレオチド画分を含有する移動相の流れが検出セル492まで導管490を通過する。光源494はセル492を通って光を向かわせる。セルから発射される光は検出器496により収集かつ測定され、出口電圧を生じさせ、これは選択された波長での透過の関数である。268nmの波長を有するUV光が、ポリヌクレオチドレベルの測定に慣習的に使用される。ポリヌクレオチドがそれに結合された蛍光部分を有する場合、検出器は、該蛍光部分の主たる発射波長に合致する波長で発射を測定する蛍光検出器であることができる。
【0128】
検出器496からの出力電圧シグナルは、ライン498により中央制御装置500にフィードされ、ここでシグナルが増幅かつ分析される。測定セル492を出る移動相の流れは、導管504により液滴形成装置502に向けられる。本態様において、液滴形成装置502は例えば図21、22および23においてより詳細に示される空気一吹き系であることができる。液滴形成装置502の突出しチャンバーは、導管508を通って圧縮ガスを受領した一吹き弁506からの空気一吹きを供給される。空気一吹きは、一吹き弁506および突出しチャンバー502と連絡する空気一吹き導管510を通って突出しチャンバーにフィードされて画分の液滴を形成し、これらがプレート512中のサンプル容器に収集される。一吹き弁506はライン514を通る制御部500からの開放弁シグナルに応答して開放する。液滴形成後に残存する移動相は、制限弁518を包含する導管516を通って廃棄にフィードされる。
【0129】
図26は検出器、中央制御部および流量制限制御系の組み合わせの図解である。図26の図解は図25の図解と同一の要素の多くを有し、そしてここで同一の数字を双方の図で同一の要素に使用する。液滴形成装置520は図24に記述されると同一であることができる。制限手段522は制限起動装置を包含し、それは中央制御部500からライン524を通って起動制限コマンドに応答し、それにより突出しチャンバー中の圧を増大させる。図24を参照すれば、必要とされる増大された圧は、突出しチャンバー472中の液体の界面張力を克服しかつキャピラリーの大きさの開口部480を通って液体を流れさせるのに十分である。
【0130】
図27は、時間間隔、閾値および傾きに基づく画分収集の基準を具体的に説明するクロマトグラムの表示である。画分は、図21に示される一吹き弁428を開放すること、もしくは図24に示されるところの流れ制限484を閉鎖すること、または双方が1つの系中に提供される場合は双方により収集される。開放一吹き弁もしくは閉鎖制限コマンドは、画分の存在を示すピークの存在の確認を伴いもしくは伴わずに、時間窓の間にそれぞれの収集起動装置に送ることができる。言い換えれば、収集は、標的ポリヌクレオチドが存在する場合に、該ポリヌクレオチドを含有することが既知である選択された時間窓(垂直線526および528により示される)で盲目にすることができる。これは、サンプルが、ポリヌクレオチドの痕跡量の所望の塩基対長さの画分のみを含有する場合にとりわけ有用である。この方法は最も広範な画分範囲を収集し、そして生成物は別の画分の部分を包含するかもしれない。盲目収集は、共通に譲渡される1999年5月13日に出願された米国特許出願第09/311,116号明細書(引用することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる)に記述される。
【0131】
あるいは、開放一吹き弁もしくは閉鎖制限コマンドは、検出器シグナルが破線530により示される絶対的閾値より上である場合に、ある間隔の間、それぞれの収集起動装置に送ることができる。この方法は、ピークが明瞭である場合に他の画分を排除してより狭い画分範囲を収集する。しかしながら、ピークが明瞭に規定されない場合、収集されたサンプル中に他の画分が包含されるかもしれない。
【0132】
第三の代替において、開放一吹き弁もしくは閉鎖制限コマンドは、前縁の傾きがある選択された値より上である場合、および後縁の負数が選択された値より上である場合に、ある間隔の間、それぞれの収集起動装置に送ることができる。傾きの値は、より小さな傾きの値(垂線532および534により示される)を選択することにより、画分の大部分を収集するよう選択することができる。あるいは、傾きの値は、画分の中心の最も純粋な部分のみを収集するために、より大きな値(垂線536および538により示される)であるよう選択することができる。
【0133】
図1および2に示されるところの各系の構成部品は、物理的装置と該装置を制御するソフトウェアとの間の通信インターフェースとして作用する慣習的なコンピュータ命令入力手段を好ましく包含することが認識されるであろう。例えば、上述されたところの好ましい注入弁は、RS−232口ならびにTTLおよび接触閉鎖制御のための設備を包含する。
【0134】
好ましい一態様において、系の構成部品の全部は標準的通信インターフェースを共有する。一例として、モデルL−7100ポンプ(日立)は、他の系の構成部品との双方向的交流および統合のためのD−Lineネットワーク通信を包含する。好ましい系の構成部品はまた、中央制御部500から送られかつ受領されたシグナルを処理するための集積回路も組み込む。
【0135】
図28は、その各構成部品に関連した制御ソフトウェアモジュールと一緒の図1のMIPC系の図解である。装置制御ソフトウェアの構成要素を図28の右側に示す。装置制御ソフトウェアは、それぞれがクロマトグラフィー系の特定の一構成部品もしくは一群の構成部品を制御する原因であるいくつかのモジュールより成る。
【0136】
これらのモジュールの1つ、移動相流量制御モジュール560は、水性成分比例弁26、溶媒溶液比例弁28、補助液体比例弁30および浄化溶液弁40を制御する。モジュール560は、分離過程の間中、弁26、28および30の1個もしくはそれ以上で弁の設定を変えることにより、分離過程の間に特定の溶媒濃度勾配を提供するよう、弁26および28(ならびにおそらく30)のはたらきを制御する。比例弁26、28、30および40の設定は、対応するステッピングモーター(示されない)などの操作により変えることができる。溶媒の濃度を変えるために、モジュール560は命令を弁26、28および30のステッピングモーターに送り、そして弁26、28および30は増大の指示された数だけ閉鎖もしくは開放する。モジュール560は、好ましくはポンプ38を通る一定の流速を提供するように同時に閉鎖および/もしくは開放することを弁に命令する。
【0137】
また、モジュール560は、弁40を開放しかつそれにより浄化溶液容器16からの浄化溶液で注入弁54、毛細管76、インラインの系の構成部品および分離カラム78を洗い流すよう、浄化溶液弁40に関連するステッピングモーターに命令することにより、分離の間にカラム浄化を提供することができる。弁33は好ましくは浄化過程の間閉鎖される。
【0138】
あるいは、系が流量制御ポンプ92、94、96(図2)を包含する場合、移動相流量制御モジュール560は、中央制御部500から受領された体積流量命令を、所望の容量を送達するポンプの設定に変える。指定された勾配を確立するためモジュール560に送られた命令は、例えば溶液AおよびBの所望の比に対応する流量命令を包含することができる。
【0139】
図2に示される系での任意の浄化溶媒の浄化相は、移動相流量制御ソフトウェアモジュール560に指定時刻に作動する命令を送って、ポンプ110を開放しかつ浄化溶液を注入弁54、毛細管76、インラインの系の構成部品および分離カラム78を通過させることにより遂げられる。好ましくは、弁111は浄化過程の間閉鎖される。
【0140】
ポンプ制御モジュール562は、ポンプ38の入/切状態および流速もしくは液圧レベルのようなポンプ38の作動上のパラメータを制御する。ポンプ制御モジュール562は、分離過程の間、ポンプ38を通る流速をモニターし、そして指示されたレベルで流速を維持するようポンプを調節する。
【0141】
インジェクタ制御モジュール564は、分離カラム78に流れる溶液の流れ中への選択されたサンプルの注入を遂げるため、サンプルアリコートセレクター64およびインジェクタ弁62の作動を制御する。インジェクタ制御モジュール564は多様な命令コードに応答することができる。これらのコードは、それを用いてインジェクタ系64およびインジェクタ弁62を制御することができる有用なインジェクタモジュール機能を包含する。例は、サンプルの吸引、分注、管の同定、針の高さ、針の動く速度、弁位置の設定、タイマーの設定のためのコマンド、および他のコマンドを包含する。
【0142】
オーブン温度制御モジュール566は空気浴オーブン72の作動を制御する。オーブン温度は図9−13に示されるような熱制御系により決定される。オーブン温度制御モジュールは空気浴オーブン72を起動し、そして分離過程の全分析時間の間中、オーブン72中の温度レベルを継続的に制御する。オーブン温度制御モジュール566は、所望の工程温度とともに命令を加熱手段制御部に送る。加熱手段制御部は、順に、所望の温度変化を起動する加熱/冷却手段にコマンドを送る。オーブン温度制御モジュール566は、センサー204(図9)のような較正された温度センサーからフィードバックデータを受領する。それは空気浴オーブン72中の空気温についての情報を提供する。所望の工程温度と空気温度との間の絶対的な差異が許容される限界より上である場合、オーブン温度制御モジュール566は、所望の工程温度と温度センサー204の示度との間の差異に従って加熱/冷却手段の設定を調節するよう、加熱手段制御部に命令する。場合によっては、オーブン温度制御モジュール566は、工程温度のより正確な読取りのためにコイル管76上に直接配置された温度センサーから温度の示度を受領し、そして相応して加熱/冷却手段の設定を調節する。
【0143】
他のソフトウェアモジュールは、検出器84の作動を制御する検出器制御およびデータ収集モジュール568;フラグメントコレクタ系を制御するフラグメントコレクタモジュール570を包含する。指定されたサンプルを分析するのに使用することができる利用可能な予め設定されたメソッドを列挙する利用可能なサンプルテーブルの一覧を使用者に提示するサンプル分析モジュール。あるいは、使用者は、サンプル分析モジュール550のプロンプトで必要とされる情報を入力することにより、彼自身のメソッドを規定することができる。こうした情報は、温度条件、勾配の条件、注入モードなどを包含することができる。
【0144】
図29は、MIPC系のコンピュータ化された制御プロセス、および該プロセスの各部分に関連するモジュールの一態様の図解である。
【0145】
第一に、分析されるべきサンプルが使用者により同定される。サンプル分析モジュール550が、サンプルの正体を、分析されるべきサンプルを含有するバイアルの数字、もしくはこうしたバイアルのX−Y座標の形態で受領する。
【0146】
サンプルテーブルの一覧がサンプル分析モジュール550により表示され、指定されたサンプルを分析するのに使用することができる利用可能な予め設定されたメソッドを列挙する。
【0147】
その後、果たされるべきメソッドを包含するサンプルテーブルが使用者により指定される。あるいは、使用者は、サンプル分析モジュール550のプロンプトで必要とされる情報を入力することにより、彼自身のメソッドを規定することができる。こうした情報は、温度条件、勾配の条件、注入モードなどを包含することができる。
【0148】
フラグメントの収集が望ましい場合、使用者はまたフラグメント収集パラメータも指定する。使用者は、予め規定されたフラグメント収集方法の1つを選択することができるか、もしくは彼自身の方法を指定することができる。盲目収集の場合、使用者は収集のための時間間隔を指定する。閾値収集の場合、使用者は収集が開始する閾値を指定する。傾き収集の場合、使用者は収集が開始する強度曲線の角度を指定する。この情報に基づき、フラグメントコレクタ制御モジュール570への命令を含有するフラグメント収集テーブルが創製される。
【0149】
分析過程が使用者により開始される。その後、サンプルテーブルのロードをサンプル分析モジュール550により実施する。サンプルテーブルは各サンプルの選択されたメソッドを包含する。サンプルテーブルの依存性はサンプルテーブルモジュール552により確かめる。
【0150】
ハードウェアおよびソフトウェアのチェックがサンプルテーブルモジュール552により開始される。サンプルテーブルモジュール552は、指定されたメソッドにより必要とされる全部のハードウェアおよびソフトウェアが利用可能かつ運転可能であるかどうかをチェックするように装置制御部554に命令する。流量制御モジュール560が、溶媒比例弁26、担体液比例弁28、補助液体比例弁30および浄化溶液弁40が存在しかつ適正に作動していることを確かめる。ポンプ制御モジュール562は、ポンプ38が存在しかつ適正に作動しているかどうかをチェックする。インジェクタ制御モジュール564は、サンプルアリコートセレクター64およびインジェクタ弁62が存在しかつ適正に作動していることを確かめる。オーブン温度制御モジュール566が、空気浴オーブン72、プレフィルター74およびカラム78が存在しかつ適正に作動していることを確かめる。フラグメント収集が選ばれたメソッドの一部である場合、フラグメントコレクタモジュール570が、フラグメントコレクタ88が系中に存在しかつ適正に作動するかどうかを確かめる。
【0151】
装置制御部554がエラーを見出す、すなわち、この特定のメソッドに必要とされる装置もしくはソフトウェアが存在する系の環境設定で利用可能でない場合、サンプルテーブルモジュールは分析を中止し、そして使用者にエラーを報告する。
【0152】
そうでなければ、指定されたメソッドが系にロードされる。サンプルテーブルモジュール552が、メソッドテーブルへの選択されたメソッドの特定のパラメータの計算を開始する。こうしたパラメータは、分析されるべきサンプルを含有するバイアルの数字もしくは座標、分析されるべきサンプルの容量、サンプルの注入方法、注入の速度、溶媒の流速、注入溶媒の濃度、溶媒濃度の勾配の詳細、空気浴オーブンの温度、所望の工程温度と実際の工程温度との間の許容される不一致、分析装置の読取り頻度、などを包含する。移動相の勾配の詳細は、%Bが変えられるべきである時間および変化の大きさを指定するテーブルの形態であることができる。あるいは、該テーブルは、%Bが変化されるべきである特定の時間、およびこれらの時間で確立されるべき絶対的な%Bを含有することができる。あるいは、該テーブルは、移動相濃度の更新の頻度、および時間に基づく所望の%Bを計算するための式を含有することができる。この場合、流量制御モジュール560への命令は分離過程の間に実時間で計算される。
【0153】
その後、分析をメソッドモジュール556により開始する。メソッドモジュール556は、装置制御部554に分析を開始するよう命令する。装置制御部は、順に、装置制御ソフトウェアモジュールにより以下の分析前手順を果たす:
オーブン温度制御モジュール566は、加熱/冷却手段制御部に命令を送ることにより選択されたメソッドにより指示されたレベルにオーブン温度をするよう、温度制御手段に命令する。これらの命令は所望の工程温度を含有する。オーブン温度制御モジュール566は、温度センサー204からのデータを所望の工程温度と比較することにより、空気浴オーブン72が所望の温度に達したことを確かめる。指示された温度と実際の温度との間の差異がメソッドテーブルで提供された誤差の許容される限界より大きい場合、オーブン温度制御モジュールは、加熱/冷却手段制御部にオーブン温度を相応して上げるもしくは下げるよう命令する。実際のオーブン温度が所望のパラメータ内になるまでこのプロセスが反復される。
【0154】
流量制御モジュール560は、メソッドテーブルにて設定されるところの注入溶媒濃度を達成するための対応するステッピングモーターの作動により、弁26、28および30を設定する。この溶媒濃度は、溶媒、担体液および補助液体の流速の均衡をはかることにより達せられる。初期溶媒濃度は、好ましくは、非極性分離媒体へのサンプル中のDNAフラグメントの結合を遂げる。
【0155】
ポンプ制御モジュール562は、ポンプ38を所望のポンプ速度に設定して、メソッドテーブルで指示される流速を助長する。
【0156】
その後、メソッドモジュール556が、装置制御部554に分析を開始するよう命令する。
【0157】
装置制御部554は、順に、装置制御ソフトウェアモジュールにより以下の動きを果たす:
インジェクタ制御モジュール564は、メソッドテーブルにて指定されるところの114でのような選択されたウェルからのサンプルアリコートセレクター64によるサンプルの注入を助長する。サンプルはメソッドテーブルにより指定される様式で注入される。注入されたサンプル中のDNAフラグメントが非極性分離媒体に結合する。勾配分離の場合は、指示された時間間隔で、流量制御モジュール560が弁26、28、30の設定を変えて、メソッドモジュールテーブルにより指示されたレベルまで溶媒濃度を増大させる。溶液AおよびBの比は所望の勾配中の溶媒比を維持するように連続的に変えられる。イソクラチック流のためには、溶液AおよびBの比は一定の値で維持される。
【0158】
塩基対の大きさによるDNAフラグメントの混合物の分離においては、いくつかの異なる移動相勾配を使用してよい。増大する移動相勾配は溶液Bの濃度の段階的もしくは連続的増大であり、そして、勾配の1個もしくはそれ以上の部分が平坦もしくは一定の%Bの相(イソクラチック溶媒流)であってよい。DNAフラグメントは、低い%Bを含有する移動相流で、分離カラム78中の分離媒体の非極性表面上に付着する。DNAフラグメントは、比較的狭い範囲の%Bでカラムから分離される。
【0159】
図30は、MIPC過程での核酸フラグメントの基礎的分離の間の移動相中の溶媒濃度のグラフ表示である。図30を参照すれば、カラム78中の分離媒体にDNAフラグメントが結合する平坦な溶媒濃度572は、t(0)からt(1)までである。これの後に、t(2)の分離相の開始までの急な溶媒の勾配の上昇574が続くことができる。この点で、溶媒勾配はDNA分離勾配576に変えられ、これはt(2)で開始し、かつ、目的の全部のDNAフラグメントがt(3)でカラムから放出された溶媒濃度レベルまで継続する。その後、駆動する溶媒の勾配がより急な勾配578に変わり、これは、分離カラム78から全部の残存する核酸を除去しかつ次の分離手順のためカラムを準備するt(4)のレベルまで継続する。
【0160】
これらの相の間に、弁26および28の設定は、分離カラム78を通過する液体中で所望の移動相組成を遂げるよう継続的に調節される。弁の調節は漸増するため、それらはまた微小段階の調節として見ることもでき、そして勾配は微小段階の勾配として見ることができる。
【0161】
流量制御モジュール560は、特定の容量および容量比を対応する弁制御設定に変換するための転換式を包含する。指定された勾配を確立するための流量制御モジュール560への命令は、溶液AおよびBの比のパラメータを包含する。
【0162】
分析の間中、オーブン温度制御モジュール566が、オーブン温度をモニターし、そして、オーブン温度が誤りの許容される限界よりも大きく指示されたレベルから逸脱する場合に、オーブン温度制御手段の設定を調節する。
【0163】
分析が開始する場合、検出器制御およびデータ収集モジュール568が装置制御部554により起動され、そして順に検出器84を起動する。装置制御部554は、モジュール568に、検出器84の作動モードでの特定の命令を提供する。こうした命令は、UV検出器の場合、検出されるべきUV透過の基礎レベル、検出されるべき透過レベルの範囲、および検出器により得られるべき読取りの頻度を包含することができる。分析装置は進む液体を分析することを開始し、かつ、収集されたデータをモジュール568に渡す。検出器84による各読取りについて、モジュール568は、検出された透過のレベルおよび読取りの時間を記録する。モジュール568は、得られた情報を解読かつ収集し、そしてまたこのデータを実時間表示のためサンプル分析モジュール550にアナログ形式で渡す。
【0164】
フラグメント収集が選ばれたメソッドの一部である場合、フラグメントコレクタモジュール570が装置制御部554により起動される。フラグメントコレクタモジュール570は、フラグメントコレクタパラメータテーブルに従ってフラグメントコレクタ88にコマンドを与える。モジュール568により収集された情報もまた、フラグメントコレクタ88に渡されかつ移動相の閾値もしくは傾き収集に使用されることができる。
【0165】
フラグメントコレクタモジュール570は、装置制御部554から収集の時間枠で命令を受領する。盲目収集の場合、命令は、特定の画分の収集を開始および終了するための特定の時間、もしくは開始時間および収集間隔の長さの形態であることができる。分析装置84からの実際のピークの存在の確認は必要とされない。
【0166】
閾値収集については、フラグメントコレクタモジュール570が、収集が開始すべきである分析装置84により生じられる強度のレベルを受領する。強度のレベルがこの閾値より下に下落するか、もしくはこのフラグメントの収集に指定されたバイアルがいっぱいである場合、フラグメントコレクタモジュール570はフラグメントコレクタに収集を終了するためのコマンドを与える。
【0167】
勾配収集については、フラグメントコレクタモジュール570が、傾きの閾値、すなわち収集が開始するべきであるUV検出器326により生じられる強度の増加の速度のレベルを受領する。曲線の傾きが指定された閾値を越える場合、制御部330はフラグメントコレクタ88に収集を開始するための命令を与える。収集は、該フラグメントの収集に指定されたバイアルがいっぱいである場合はいずれの点でも中断することができる。そうでなければ、収集は、傾きが負に転じる、すなわち強度のピーク値を過ぎるまで進行する。収集は、曲線の傾きの絶対値が指定されたレベルより下に下落する場合に中断される。
【0168】
これらのフラグメント収集方法はまた組み合わせでも使用することができる。例えば、盲目収集は、存在するフラグメントの確認が閾値もしくは傾き法により受領される場合にのみ起こることができる。
【0169】
サンプル分析モジュール550は、結果が検出器制御およびデータ収集モジュール568により獲得されている際に、分析の進行を表示する。
【0170】
分析が完了すれば、結果データモジュール558が創製され、そしてメソッドのパラメータがそこで保存される。結果データモジュール558は検出制御およびデータ収集モジュール568により収集された情報を受領し、そして結果を分析する。その後、結果データモジュール558が分析の結果を保存する。サンプルテーブルモジュール552が、結果データモジュール558による分析の品質管理(quality control)チェックおよび後分析を開始する。その後、サンプル分析モジュール550が分析の後処理結果を表示し、そしてサンプルテーブルモジュール552がレポートを印刷する。
【0171】
図31は、本発明の系を使用して実施されるところの分離過程の段階を具体的に説明する:
段階600において、空気浴オーブン72がメソッドテーブルにより指示された工程温度に加熱される。加熱手順はオーブン温度制御モジュールにより制御される。
【0172】
段階602において、ポンプのパラメータがメソッドテーブル中のパラメータに従って設定され、そして、ポンプ38のスイッチが入れられる。ポンプを通る移動相の流速が達成される。ポンプを通る指示された移動相の流速を確立する過程は、ポンプ制御モジュール562により制御される。
【0173】
弁26、28および30が、メソッドテーブルにより指示されたところの初期移動相組成を達成するよう設定される。604で示されるこの段階は、図30でt(0)とt(1)との間の傾き572として示される。初期溶媒濃度を確立する過程は流量制御モジュール560により制御される。
【0174】
弁26、28および30、ポンプ38の速度、ならびに空気浴オーブン72の温度の設定が確立された後に、インジェクタ64が、段階606で示されるとおり、サンプルを溶媒の流れに注入する。サンプル注入の過程はインジェクタ制御モジュール564により制御される。サンプルが系に注入され、そしてサンプルのDNAフラグメントがそれら自身をカラム78の分離媒体に付着させた後に、迅速な溶媒の勾配を遂げるように弁26、28、30の設定が変えられる。該過程のこの段階608は、図30でt(1)とt(2)との間の勾配574として示される。この迅速な勾配は、その分離が所望されないより短いDNAフラグメントを洗い流す。
【0175】
より短いDNAフラグメントがカラムから溶出された後に、勾配の傾きがより遅い速度に変えられる。該過程のこの段階は610で示され、かつ、図30でt(2)とt(3)との間の傾き576として示される。t(2)とt(3)との間のこの期間の間に、分離過程が起こる(すなわち、DNAフラグメントが溶媒濃度に比例するそれらの塩基対長さに依存して系から溶出される)。溶媒の勾配ならびに弁26、28および30の関連する作動は、流量制御モジュール560により制御される。
【0176】
分離過程が起こる際に、検出器84は分離カラム78の流出物中の溶出されたDNAフラグメントの存在を絶えず検出し、そして、時間のいずれかの特定の瞬間に存在するDNA物質の量を記録する。検出器84の作動は検出器制御モジュール568により制御される。検出器の出力は段階612で示されるとおり収集され、ディジタル形式に変換され、そしてデータ記憶装置に保存される。
【0177】
フラグメントの収集が望ましい場合は、フラグメントコレクタ88が、任意の段階614で示されるとおり、検出器84の流出物から分離された物質を収集する。盲目収集、閾値収集および傾き収集のようなフラグメント収集方法は上述する(図27を参照されたい)。フラグメントコレクタ88の作動はフラグメントコレクタ制御モジュール570により制御される。
【0178】
分離過程が完了しかつ目的の全部のDNAフラグメントがカラムから溶出された後に、溶媒濃度を再度増大させる。有機溶媒の濃度を迅速に増大させて、分離カラム78から全部の残存するDNAフラグメントを溶出するのに十分高い濃度に達せさせる。該過程のこの段階618はt(3)とt(4)との間の傾き578として示される。移動相溶媒の勾配ならびに弁26、28および30の関連する作動は、流量制御モジュール560により制御される。
【0179】
時々、過酷な洗浄が、系およびとりわけ分離媒体の状態を十分に維持するために必要とされる。これらの例では、分離過程の最後の部分は、好ましくは弁33の同時の閉鎖を伴い浄化溶液弁40を開放すること、および系全体に溶液をポンプで送っていかなる残渣も除去することにより、浄化溶液容器16からの浄化溶液を用いて系を洗い流すことであることができる。
【0180】
同一サンプルの複数の注入を本発明の系により実施することができる。例えば、注入あたりの容量および注入の回数を、サンプルテーブルのロウに示されるとおり、特定のバイアルについて指定することができる。追加の注入を意思決定分岐551(図29)の状態に基づき行うことができる。
【0181】
また、複数の異なるサンプルを分析することができる。図32は、例えばソフトウェアに対ルーチン(counter routine)を包含することにより、複数の異なるサンプルの分析を実施することができる、MIPC系の一態様の流れ図の表示である。この場合、各個別のサンプルは例えば異なる範囲の目的のフラグメント長さを含有することができる。特定の一サンプルの注入前に、後に溶出されるべきDNAが、注入がなされる場合にカラムの頭部に集まるように、十分に低い有機溶媒濃度を有する移動相で、カラムを平衡化する(図30で572に示されるような)。
【0182】
図30に示されるとおり、分離サイクルは3つの主要な段階、すなわち付着相574、分離相576および浄化相578より成る。使用者が興味をもつ全部のDNAフラグメントが、移動相勾配の分離相576の間に溶出されなければならない。高分離度の分離を達成するためには、分離相576の勾配の傾きは非常に低い増加速度を有しなければならない。他方、DNA分離過程のサイクル時間を短縮するために、溶媒の勾配の分離相576は可能な限り短くすべきである。これらの目的を達成するために、本発明のコンピュータ化されたHPLC系が、目的の最短のDNAフラグメントが溶出されるであろう%B、および目的の最長のDNAフラグメントが溶出されるであろう%Bを決定する。その後、該系は、目的の最短のDNAフラグメントが溶出される%Bの直前に分離サイクルの分離相576を開始し、そして、目的の最長のDNAフラグメントが溶出される%Bの直後に分離サイクルの浄化相578を開始する。
【0183】
該系は、DNAフラグメント分離過程のための移動相勾配を確立するためのいくつかのオプションを有する。使用者は、全部の勾配の情報を、時間点(もしくは間隔)および溶液Bの対応するレベルを含むテーブルの形態で提供することができる。あるいは、使用者が、勾配の分離相576が開始するレベル(%B2)、分離相576が終了するレベル(%B3)および勾配の増加の速度を提供することができる。直線、凹形、凸形もしくは他の形状のような勾配の形状もまた選択することができる。このデータは分離勾配を完全に規定することができる。
【0184】
あるいは、コンピュータ500は、溶媒の勾配の開始および終了溶媒濃度をコンピュータ計算するための溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアを包含する。
【0185】
好ましい一態様において、本発明は、分離で使用されるべき溶媒の勾配の開始および終了溶媒濃度をコンピュータ計算するための溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアを提供する。一態様において、普遍的勾配が実施例1で記述されるとおり利用可能である。好ましい一態様において、該系は、目的のDNAフラグメントの塩基対長さに基づく分離勾配に移動相中の%B2および%B3の好ましいレベルを提供するソフトウェアを包含する。DNAフラグメントの混合物を分析する場合、使用者が、目的のDNAフラグメントの最短のものおよび最長のもののbp値、もしくは混合物中の目的のフラグメント(1種もしくは複数)の塩基対長さを入力し、そしてこれらの値を好ましい移動相組成の計算で使用する。単一フラグメントを分析する場合、ただ1個のbp長さを入力する必要があり、そして、ソフトウェアが、該フラグメントを溶出することができる%Bより下で開始しかつ該フラグメントを溶出することができる%Bの上で終了する勾配を計算する。一態様において、対応する溶媒濃度は、一定の傾きの分離勾配についての双曲線の式(i):
【0186】
【数25】
【0187】
式中、%Bは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり;bpは目的のDNAフラグメントの塩基対長さであり;
p1、p2、p3は系に依存する係数である
に従って、DNAフラグメントの塩基対長さに基づいて計算される。
【0188】
既知の長さのDNAフラグメントの標準混合物の分析から、発明者らは、有機溶媒としてアセトニトリルを使用して実施例2に記述される(かつ図33に示されるような)条件下で、系に依存する係数について以下の値を決定した:
p1=19.24
p2=53.6
p3=78.5
式(i)は溶媒濃度の直線状勾配を想定し、そして同一の勾配が較正および実際の分析に使用される場合に好ましい。いかなる傾きも使用することができる。しかしながら、系に依存する係数は、その場合に異なることができ、そして式(i)の形態を有する等式への実験データの曲線のあてはめを包含する較正過程により決定しなければならない。
【0189】
等式(i)を使用する場合、あるフラグメントの保持時間(Rt)は、以下の等式:
Rt=死時間+負荷時間+(%B(calculated)−%B(at start of gradient)/
傾き
式中、%B(calculated)は等式(i)から計算された%Bであり;
死時間は実施例3で記述されるとおり決定され;
負荷時間は勾配574の時間に対応する
から計算することができる。
【0190】
本発明の他の態様において、他の等式を経験的データにあてはめ、そして本明細書に記述されるところの移動相組成の予測に使用した。例えば、形式%B=a1(bp)+a2を有する一次等式;形式%B=a1(bp)2+a2(bp)+a3を有する二次等式;および形式%B=a1(bp)3 a2(bp)2+a3(bp)+a4を有する三次等式(a1、a2、a3およびa4は経験的に決定される定数である)を使用した。他の態様において、目的の範囲内の適切な形状を有するいかなる等式も使用することができる。
【0191】
本発明の不可欠のかつ従来認識されていない特徴は、非変性条件下で、DNAフラグメントが、各大きさについて特定の有機溶媒濃度で塩基対組成に独立に、かつ、有機溶媒の勾配の傾きの値に独立に、それらの大きさに基づいてMIPCカラムから溶出する、および、この溶出はMIPCを使用して高度に再現可能であるという、発明者らによる発見である。従って、各サンプル分析についてMIPCカラムを較正することは必要でない。1日1回の、もしくは週1回の較正さえ通常は必要でない。溶媒濃度が所定の塩基対長さについて決定されれば、その大きさのフラグメントを溶出するための%Bは、同一のカラムで日ごとにのみならず、しかしまた1本のカラムから別のものまで一定であることができる。溶媒濃度を塩基対長さに関係づける参照を創製すること、およびいずれかの付加的な方法の開発を伴わずに既知の塩基対長さのDNAフラグメントを溶出するための溶媒濃度を予測することを可能にするのは、この驚くべき発見である。デフォルト値(標準的DNA混合物を以前に分析することにより得られた)を用いかつ較正を伴わずに良好な結果を得ることができるとは言え、好ましい実務は、新たなカラムまたは溶離剤(緩衝液もしくは移動相)を装置に設置する場合に較正することである。高度に正確な結果を、内部標準の使用を伴わずに得ることができる。該方法は、既知の長さのフラグメントが特定の勾配でいつ溶出するであろうかを予測するのに使用することができ、また、特定の溶媒の勾配でのその保持時間から未知のフラグメントの分子量を確かめるのにもまた使用することができる。DNAフラグメントの溶出の予測可能性は、速度および分離度に関する勾配の最適化を助長する。
【0192】
分離勾配の式の別の態様において、等式(ii)が、特定の塩基対長さの特定のフラグメントが溶出するとみられる傾きsの直線状勾配の経過中に達せられるとみられる%Bを表し:
【0193】
【数26】
【0194】
式中
【0195】
【数27】
【0196】
%Bは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり;
sは濃度増加の速度(すなわち傾き)であり;
d、void、p4、p5、p6、p7およびp8は系に依存する係数である。
【0197】
既知の長さのDNAフラグメントの標準混合物の統計学的な曲線のあてはめの分析から、発明者らは、実施例2に示される溶出条件下でトランスゲノミック インク(Transgenomic,Inc.)(カリフォルニア州サンノゼ)から入手可能なDNASEPカラム(50mm×直径4.6mm)を装備されたMIPC系で使用されるべき系のパラメータについて、以下の好ましい値を決定した:
d=2.0
空隙時間=1.95
p4=9.596×10−4
p5=0.417
p6=25.4
p7=45.2
p8=85.0
等式(i)および(ii)において、異なる逆相分離カラム、異なる分離条件、もしくは異なる系の構成部品を使用するクロマトグラフィー系について、曲線のあてはめの後に、他の系のパラメータを得ることができる。例えば、多様な製造供給元からの系の構成部品が入手可能であり(例えば、ヒューレット パッカード(Hewlett−Packard)、バリアン(Varian)、ベックマン コールター(Beckman Coulter)、ウォーターズ(Waters)、島津)、そして本発明で使用することができる。しかしながら、等式の一般的形式は変えられないことができる。
【0198】
本発明の好ましいソフトウェアは、分離されるべきDNAの塩基対でのフラグメント長さを入力するためのユーザーインターフェースを提供する。該ソフトウェアは、crtもしくはフラットパネルモニタのようなディスプレイ装置上にグラフィカル・ユーザー・インターフェースを生成させる。ユーザーインターフェースの一例は、図34に具体的に説明されるような勾配テンプレート699である。塩基対でのフラグメント長さに基づき、該ソフトウェアは、以下、すなわち直線状勾配の傾き、負荷段階の%Bの持続期間および変化、勾配の持続期間、洗浄の持続期間、洗浄後の平衡化の持続期間、ならびに勾配の開始および終了、を設定する。具体的に説明される例において、直線状勾配の傾きは700に示され、また50℃でのDNAフラグメントの予測されるRtが垂直の棒702により示される。該インターフェースは、バイアル番号、注入容量、注入回数、アプリケーションの型、サンプル名、シーケンスファイル、オーブン温度、塩基対、メソッド名、分離勾配の開始での%B、および時間の移動のようなサンプルデータを入力するもしくは見るためのテーブル704を包含する。該インターフェースは、移動相勾配を計算するためのクリックボタン706を包含する。該インターフェースはまた、ポンプもしくは検出器のいずれかで表示されるべき勾配の位置を決定するためのパネル708;分析時間および急落流速(plump flow rate)を見るもしくは入力するためのパネル710も包含する。検出器での勾配を表示する場合、2個の特徴が好ましく包含される。第一は、等式(例えば等式(ii))が当てはまる勾配の区分の開始および終了を表す2本の垂直の破線705および707である。第二は、規定された大きさのフラグメントが検出器を越して溶出するとみられる時間を示す、数字を付けられた刻み印(hash mark)703である。
【0199】
パネル712は、多様な勾配のパラメータ、すなわち、1分あたりの%Bの勾配の傾きを示し;パネル712は、他のフィールドのそれぞれをエディットすることに対する一代替としてのこれらの設定名に一致する他のフィールド(傾きのフィールドを除外する)に予め規定された値を置く、注意(Cautious)、正常(Normal)および速い(Fast)のような設定を有する注意レベル(Caution Level)を包含し;負荷に関する下落(Drop for Loading)は、保持されない成分(PCR産物が注入される場合は典型的にはdNTP、プライマー、緩衝剤など)が予測不可能な様式で分離に影響しないようにそれらを通過させるためのカラムへのDNAの負荷に関する%Bの下落を示し;負荷に関する下落(Drop for Loading)が直線状勾配の開始まで上昇する持続期間を提供する負荷持続期間(Loading Duration)(典型的には0.1もしくは0.5分);傾き(Slope)のオプションにより選択される1分あたりの%Bで%Bが直線的に上昇することができる時間の長さを規定する勾配持続期間(Gradient Duration);%Bがカラムから高分子量DNAを取り除くために100%で留まることができる時間を示す除去持続期間(Clean Duration)(例えば100%への上昇および100%からの下落は0.1分で起こる);%Bが次の注入のために平衡化するよう一定のまま留まる時間を示す平衡持続期間(Equilibration Duration)。勾配テンプレートはまた、勾配の洗浄部分を上述されたとおり任意の浄化溶液インジェクタ弁54により実施することができる場合に使用される迅速浄化(Fast Clean)の設定も包含することができる。迅速浄化のオプションを選択する場合、勾配の洗浄部分は排除される。この機能は代わりに弁54により実施され、より高いサンプルのスループットを可能にするからである。フィールド714は使用者によりエディットすることができる勾配テーブルを表示する。フィールド713は、突然変異の検出(Mutation Detection)、単一フラグメントの二本鎖の大きさ分類(Double Stranded Sizing for a single fragment)、複数のフラグメントの二本鎖の大きさ分類(Double Stranded Sizing for multiple fragments)、および較正(Calibration)のようなアプリケーションを選択するためのオプションを表示する。
【0200】
目的のDNAフラグメント(1種もしくは複数)の提供される長さに基づく、必要とされる最小および最大の溶媒濃度の計算後に、サンプル分析モジュール550が、勾配テーブル699のようなインターフェースにより、これらの勾配パラメータを使用者に表示し、使用者は、系の示唆を受容するかもしくは勾配パラメータを補正するかのいずれかができる。勾配パラメータが使用者により承認された後に、パラメータがメソッドファイル中のディジタルメモリに保存され、そしてサンプル分析モジュール550が、各サンプルをメソッドと関連させるサンプルテーブルを形成する。
【0201】
選択された塩基対長さのDNAフラグメントのフラグメント収集が望ましい場合には、こうしたフラグメントの溶出の時間が、上に提示された式に従ってサンプル分析モジュール550により計算されることができる。サンプル分析モジュール550は、目的のDNAフラグメントの溶出に対応する移動相組成を計算する。その後、対応する保持時間を勾配テンプレートで見ることができる。生じる保持時間は、カラムからの該DNAフラグメントの溶出と、フラグメントコレクタ88へのその到着との間の系の遅延について補正される。その後、盲目収集についてのこれらの時間が使用者に提示されることができ、使用者はそれらを受容するかもしくは補正することができる。このデータに基づき、フラグメント収集テーブルが、サンプルテーブルモジュール552により計算される。
【0202】
突然変異の検出においては、異なる大きさの複数のフラグメントが存在する状況と対照的に、単一の塩基対長さのみが使用者により入力される。ホモ二重鎖からのヘテロ二重鎖の分離は、DNAをちょうど融解し始める温度での勾配溶出を必要とする。ヘテロ二重鎖は、不適正にされた塩基により不安定化され、そして従ってこの温度でホモ二重鎖よりわずかにより多く融解される。保持時間はDNAが変性する際に減少し、そしてこれゆえにより多くの変性されたヘテロ二重鎖がホモ二重鎖より先に出現する。本明細書に記述されるところのサンプル分析モジュール550は、例えば等式(i)を使用して、塩基対長さに基づき移動相勾配を計算する。好ましい一態様において、該計算はまた、例えばフラグメントが溶出する%Bよりすぐ下で勾配を開始しかつ目的のピークが検出器を通りすぎた直後に勾配を停止することにより、分離度の喪失を伴わずに分析の時間を減少させる勾配を決定することもできる。サンプル分析モジュール550は、単一の塩基対長さに関連する移動相組成を「一括する(bracket)」勾配を計算することができる。一態様において、サンプル分析モジュール550は、非変性条件下で直線状勾配のちょうど終点にDNAフラグメントを置く最適化された勾配パラメータを計算する。これを行うのに必要とされる%BをXと呼ぶ場合には、下の勾配を示されるとおり計算することができる:
【0203】
【表1】
【0204】
複数のDNAフラグメントを分析する場合、該ソフトウェアは、最大のDNAフラグメントを直線状勾配のちょうど終点に置きかつ最小のDNAフラグメントを直線状勾配のちょうど開始点に置くことにより、最適化された勾配パラメータを計算することができる。例えば、最小および最大のフラグメントを溶出するのに必要とされる%Bを決定することができる。%Bのこれらの値は、予備的な「フラグメントを一括する範囲」を決定する。フラグメントを一括する範囲は最初の%Bおよび最終の%Bを有する。最初の%Bは、混合物中の最初に溶出するDNA分子を溶出するのに必要とされる量までの有機溶媒濃度を含有する。最終の%Bは、混合物中の最後に溶出するDNAフラグメントを溶出するのに十分な有機溶媒濃度を含有する。好ましい一態様において、最適化されたフラグメントを一括する範囲の最初の%Bは、最初の%Bの約15パーセンテージ単位下より少ないかもしくはこれに等しい。最終の%Bは、最終の%Bより少なくとも約5パーセンテージ単位より高い。上述された手順は実務で広範に応用可能であるとは言え、最初および最終の溶媒濃度は特定の応用について補正することができることが認識されるであろう。
【0205】
dsDNAフラグメントの混合物、ならびにホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖dsDNAフラグメントの混合物の改良された分離は、イソクラチック移動相の条件下でMIPCを使用して達成することができる。以下の等式(iii)を使用して、dsDNAフラグメントの分離に好ましい移動相組成を決定することができる:
【0206】
【数28】
【0207】
式中
【0208】
【数29】
【0209】
Pは分配画分であり
%Bは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり;
また、式中、void、p4、p5、p6、p7およびp8は、等式(ii)に関して記述されたような曲線のあてはめから得られる、系に依存する係数である。好ましい一態様において、これらのパラメータは等式(ii)に関して示されたと同一の値を有する。
【0210】
分配画分はカラムを通るDNAフラグメントの速度に比例する。P=0でDNAは静的である一方、P=1でDNAは最大の速度(空隙ピークのものに等しい)で動いている。
【0211】
等式(iii)を論理的に導くために、pBR322 HaeIII消化物からのフラグメントの混合物の一連のイソクラチック溶出を、50から65%までのすべての整数の%Bのイソクラチック移動相でカラムを溶出したことを除き、実施例1で記述される条件下で実施した。Rt対%Bのプロットを準備した(図35)。空隙時間(1.95)の観察された値を使用して図35からのデータを再計算し、そして図36にプロットした。等式(iii)を使用して計算された曲線を、図37に示されるとおり生じさせた。
【0212】
等式(iii)の使用方法の一態様において、図37の計算されたデータをディジタルメモリに保存することができる。DNAの1種もしくはそれ以上のフラグメントのイソクラチック溶出プロフィルを予測するために、ソフトウェアが、いかなる選択された%Bでも保存されたデータの「テーブルの調査」を実施し、そして所定のフラグメント長さについてP値を決定する。便宜性のため、グラフィカル・ユーザー・インターフェースが図37のプロットを示し、そして使用者が、説明716に示されるようなフラグメントの長さに基づく検分により%Bを選択する。%Bが選択される場合、勾配テンプレートのようなユーザーインターフェースが、予測された保持時間(1種もしくは複数)のプレビュープロットを示す。
【0213】
等式(iii)の使用方法の別の態様において、使用者は、塩基対長さおよび所望の保持時間を入力するよう指示される。Pの値は、関係P=(空隙体積)/(所望の保持時間)からソフトウェアにより計算され、そしてその後、等式(iii)を使用して%Bの値を決定する。勾配テンプレートのようなディスプレイが移動相プロフィルを示し、また、好ましくは、目的のフラグメントもしくは複数のフラグメントの予測される保持時間もまた表示する。本態様のソフトウェアの段階を具体的に説明する流れ図を図43に示す。
【0214】
等式(iii)の使用において、装置の空隙体積が予め決定されかつコンピュータのメモリに入力されていなければならない。例えば、空隙体積について1.95mLという値が、実施例2で記述されるとおり決定された。
【0215】
分離勾配の開始および終了の点を変えることにより、選択された塩基対長さのフラグメントの分離が、DNAフラグメントの混合物内のフラグメントの全部の分離を包含することができるか、または、DNAフラグメントの混合物内の1種もしくはそれ以上のフラグメントの分離を包含することができることが認識されるであろう。
【0216】
本発明は、MIPCカラムからDNAフラグメントを溶出するのに必要とされる移動相中の有機溶媒の濃度と、DNAフラグメントの塩基対長さとの間の高度に再現可能な関係を利用する。溶媒濃度が所定の塩基対長さについて決定されれば、そのフラグメントの保持時間は、同一のカラムで日ごとにのみならず、しかしまた1本のカラムから別のものまでその溶媒濃度で一定であることができる。この再現可能な品質は、溶媒濃度を塩基対長さに関係づける参照を創製すること、およびいずれかの付加的な方法の開発を伴わずに既知の塩基対長さのDNAフラグメントを溶出するための溶媒濃度を予測することを可能にする。良好な結果はデフォルト値を用いてかつ較正を伴わずに得ることができるとは言え、好ましい実務は、該装置で新たなカラムを使用する場合、またはフラグメントが一貫して期待されたより早くもしくは遅く溶出している場合に較正することである。分離カラムの較正は、既知の大きさの1種もしくはそれ以上のDNAフラグメント(1種もしくは複数)を溶出するのに必要とされる%Bを決定することにより達成される。完全な較正手順の一例を実施例2に記述し、ここでは、pUC18 DNA−HaeIII消化物から得られた標準フラグメントを使用した。標準は、好ましくは既知の大きさの3種もしくはそれ以上のフラグメントを有する。標準のピークは、好ましくは較正のために十分に分離し、また、ピーク高さが平均して5〜10mVの間となるように十分な標準を使用しなければならない。
【0217】
完全な較正に対する一代替としてゼロ点較正を選択することができ、ここでは、コンピュータメモリ内の(実施例2に記述されるとおり得られた%B対bpの値のような)デフォルト値を使用し、そして、標準を分析しない。
【0218】
完全な較正に対する別の代替として、単一点較正手順を使用することができ、そして、サンプルの全部が同一長さのものである場合に十分である。この過程の第一段階で、使用者が勾配テンプレートのページを選択し、オプションの二本鎖の大きさ分類−単一フラグメント(Double−Stranded Sizing−single fragment)を選択し、塩基対(Base−pairs)フィールドにフラグメントの大きさを入力し、そして更新(Update)ボタンを押す。使用者は、予測された勾配および予測された保持時間を検査し、オーブン温度フィールドが50℃に設定されていることをチェックし、そしてサンプルを注入する。分析後に、結果を吟味し、そして予測された保持時間と比較する。予測された保持時間および観察された保持時間が0.5分以上だけ異なる場合、使用者は、較正ダイアログボックス(示されない)に観察された保持時間を入力し、そして観察された保持時間に基づく再較正を強制するよう選択を行う。
【0219】
例えば第一の標準に対して非常に異なる大きさ(例えば大きさが50%以上異なる)のフラグメントについて第二の較正点が必要とされる場合、使用者は第二の点を使用することができる(第一の標準について予測される勾配を変えることなく第二の標準で較正する段階的較正)。使用者は、第一の点の較正後のいずれの時点でも第二の点の較正を実行することができる。この過程において、使用者は勾配テンプレートのページを選択し、オプションの二本鎖の大きさ分類−単一フラグメント(Double−Stranded Sizing−single fragment)を選択し、そして使用するであろうフラグメントの大きさを入力する。これは、好ましくは、第一の標準と大きさが最低50%異なる。その後、使用者は更新ボタンを押す。使用者は、予測された勾配および予測された保持時間を検査し、オーブン温度フィールドが50℃に設定されていることをチェックし、そしてサンプルを注入する。分析後に、結果を吟味し、そして予測された保持時間と比較する。予測された保持時間および観察された保持時間が0.5分以上だけ異なる場合、使用者は、較正ダイアログボックス(示されない)に第二の標準の観察された保持時間を入力し、そして観察された第二の標準の保持時間に基づく再較正を強制するよう選択を行う。
【0220】
グラフィカル・ユーザー・インターフェースの別の態様において、図38は注入テーブル780の一態様を示す。注入テーブルは、バイアル番号、注入の容量、注入の回数、メソッド名、サンプル名、コメントおよび温度のエントリーを提供するサンプルテーブル781を包含する。最も右の3個のカラムが、勾配を改変するためのオプションを提供する。「+/−分」と名称をつけられたカラム782は、式、容量・傾きに従って、勾配テーブルのロウ714の全部の%Bを相殺する。従って、1分あたり2%の傾きで、−1のエントリーは洗浄を除き全部のロウで2%だけ%Bを減少させる。%Bのこの減少は、ピークに保持時間の1分の増大を与えることができる。「塩基対」と名称を付けられたカラム784は、述べられた長さのDNAフラグメントに必要とされるパーセンテージだけ、勾配テンプレート(洗浄を除く)を相殺する。例えば、勾配テンプレートが207bpのフラグメント長さを想定し、かつ、使用者が同一のテンプレートを使用して392bpのフラグメントを分析したい場合、カラム784に392を入力することは、勾配を3%Bだけ相殺することができる。実際の%Bの変化は、カラムの較正に依存して変動するかもしれない。%Bと名称を付けられたカラム786は、勾配の開始の%Bが明確に設定されることを可能にする。勾配テンプレートで設定された傾きが維持される。カラム786で入力された値は、カラム782もしくは784のいずれか中のものを上書きする。好ましくは、カラム782、784および786中の設定は、既に得られた結果に基づいて来るべきサンプルパラメータに対する補正を使用者が行うことができるように、ソフトウェアが実行している際に「進行中に」補正することができる。
【0221】
一態様において、勾配テンプレートを使用して複数のフラグメントが分析されている場合、使用者は、ピーク間の分離を増大させるために、例えば多段階勾配を創製することにより勾配を改変することができる。
【0222】
注入テーブルは、好ましくは、以下のオプション、すなわちポンプを作動もしくは停止させるポンプオン(Pumps On);サンプルテーブル中の全部のエントリーを削除するテーブルクリア(clear Table);オーブンが温まる際に安全な低い流速(例えば0.2mL/分)を提供するウォームアップ(Warm Up);サンプルテーブル中に列挙されるサンプルを分析するサンプル分析(Run Samples);結果を保存することができるアプリケーションフォルダを示すアプリケーションフォルダ(Application folder);デフォルトとして使用されるべきオーブン温度を示すデフォルト温度(Default temperature)(この温度は、DNAシーケンス画面上の選択されたシーケンスについて決定された);あるサンプルについて示された1回以上の注入が存在する場合に各注入についての温度の増大の値を示す温度増加(Tempetature Incriment)(デフォルトは1に設定される)もまた包含する。注入テーブルはまた、1分析内の持続期間もしくは時間;印刷されたクロマトグラムを生じさせるための設定;および1回の分析を終了した後にポンプ、検出器ランプもしくはヒーターを停止させるためのオプションのような、カラムを平衡化するためのオプションも包含することができる。
【0223】
本発明のソフトウェアはまた、利用可能なサンプルについてのデータファイルのロケーションを包含する情報を列挙する結果テーブル(示されない)を表示するためのインターフェースも包含することができる。1種もしくはそれ以上のサンプルからのクロマトグラムを見るために選択することができる。
【0224】
本発明のためのソフトウェアの実行は当該技術分野の熟練内にあり、かつ、特定のコンピュータ、もしくは使用されるコンピュータ、およびオペレーティングシステムのような因子に依存する。同様に、コンピュータとHPLCとの間の連結は、ハードがワイヤードである必要はない。赤外線もしくは他の電磁放射線を使用して、普遍的設計の適切な変復調装置を用いて制御機能をHPLCにつなぐことが可能である。コンピュータ500(図1)もしくは同等の論理実行ユニットがMIPC系の論理およびオペレーションを命令する。好ましくは、OS/Warp(IBM コーポレーション(IBM Corporation)の製品)、Windows−98もしくはWindows−NT(双方ともマイクロソフト コーポレーション(Microsoft Corporation)の製品)のようなマルチタスキングオペレーティングシステムを実行する単一のコンピュータ、例えばIBM−PCもしくはIBM−PC互換機コンピュータを使用する。コンピュータ500は、好ましくは、適切なメモリ、ハードおよびフロッピーディスクドライブ、ビデオモニタ、キーボード、ポインティング・デバイスおよび他の周辺装置を装備される。本明細書に記述されるところのユーザーインターフェースおよび勾配計算は、好ましくはWindowsに基づくオペレーティングシステムと統合するよう設計されているVisual Basic(マイクロソフト(Microsoft))、C++、JAVAもしくはDelphiのようなソフトウェアパッケージを使用して実行される。しかしながら、システムが、アップル コンピュータ インク(Apple Computer,Inc.)から入手可能なMac OSを実行するマッキントッシュ(Macintosh)のコンピュータのような他のオペレーティングシステムをもつ他のコンピュータ、またはヒューレット パッカード(Hewlett−Packard)もしくはディジタル エキップメント コーポレーション(Digital Equipment Corporation)から入手可能な他のコンピュータで実行することができない理由は存在しない。好ましくは、ソフトウェアは、必要とされる情報の入力で補助するため、ならびに結果を吟味および分析するためにユーザー・フレンドリーな画面を提供するよう実装されることができる。一態様において、本明細書に記述されるソフトウェアは、MIPCを実施するためにカスタマイズすることができる、製造供給元に供給されるソフトウェアを包含することができる。例えば、日立は、HSMと統合するカスタマイズされたソフトウェアを使用者が開発することを可能にするアクセス可能な選択されたコンピュータの説明書を作成している。HSMは、記述されるD−7000 HPLCシステムマネージャユーザーマニュアル(部品番号810−9441−3)、第4版(1996年7月)(引用することにより本明細書に組み込まれる)である。
【0225】
図39は、溶媒勾配の開始および終了溶媒濃度をコンピュータ計算するための溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアの一態様を具体的に説明する図を示す。使用者は、550で目的のフラグメントの塩基対での長さを入力し、そしてソフトウェアが552で等式(i)を使用して勾配パラメータを計算する。使用者は、754、756で分離を促進する最適化された勾配パラメータを使用することを選択することができる。移動相プロフィルが758で保持時間と一緒に表示される。使用者は、760、762でパラメータを人的に補正することができる。使用者がパラメータを受容する場合、ソフトウェアは、装置制御ソフトウェアによりアクセスされるべきディジタルメモリにそれらを(764で示されるとおり)保存する。
【0226】
図40は、図39に類似のしかし勾配パラメータ770の計算における等式(ii)の使用を具体的に説明する図を示す。使用者は、イソクラチック勾配を使用するというオプションもまた有し、この場合、(図37に示されるような)プロットが772で表示され、そして使用者が等式(iii)に関して上述されたような%Bを選択する。
【0227】
図41は、突然変異の検出について事実がそうであるとみられるような、単一のbp長さのみが入力されることを除き、図39に類似である。
【0228】
図42は、図40に類似であるが、しかし単一塩基対長さの1個のフラグメントについてである。
【0229】
図43は、%Bを計算するための等式(iii)の使用を具体的に説明する。使用者は、塩基対長さを774で、および所望の保持時間を775で入力するよう指示される。
【0230】
本発明の別の局面は、DNAの突然変異の検出の実施での使用のための系および方法に関する。上で論考されたとおり、本発明は二本鎖DNA中の突然変異を検出するのに使用することができる。以下の定義を本明細書で使用することができる:
「融解温度」は、DNAフラグメント中の塩基対の50%が相補鎖から分離されている温度を意味すると本明細書で定義する。
【0231】
「ホモ二重鎖」は、各鎖中の塩基が他方の鎖中のそれらの対蹠物の塩基に関して相補的である二本鎖DNAフラグメントを意味すると本明細書で定義する。
【0232】
「ヘテロ二重鎖」は、各鎖中の最低1個の塩基が他方の鎖中の最低1個の対蹠物の塩基に相補的でない二本鎖DNAフラグメントを意味すると本明細書で定義する。これは、不適正にされた塩基もしくは欠失による可能性がある。ヘテロ二重鎖中の最低1個の塩基対が相補的でないため、それは、ホモ二重鎖中のその完全に相補的な塩基対類似物に比較して、その部位で塩基を分離させるのにより少ないエネルギーを利用する。これは、ホモ二重鎖に比較してヘテロ二重鎖の不適正にされた塩基の部位でのより低い融解温度をもたらす。
【0233】
「ハイブリダイゼーション」という用語は、dsDNAサンプルを加熱および冷却する、例えば95℃に加熱し次いでゆっくりと冷却することの過程を指す。加熱過程はDNA鎖を変性させる。冷却に際して、鎖は主に統計学的様式で二重鎖に再結合する。サンプルが野性型および突然変異体のDNAの混合物を含有する場合には、ハイブリダイゼーションはヘテロおよびホモ二重鎖の混合物を形成することができる。
【0234】
「ヘテロ突然変異体部位分離温度」T(hsst)は、突然変異の部位でヘテロ二重鎖DNAを優先的に変性させかつヘテロ二重鎖とホモ二重鎖との間の変性の程度の最大の差異を生じる温度を意味すると本明細書で定義する。これは、DMIPCによるヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖のクロマトグラフィー分離を遂げ、そしてこれゆえに突然変異を検出するのに最適である温度である。
【0235】
「ヘテロ突然変異体」という用語は、多形もしくは非相補的塩基対を含有するDNAフラグメントを意味すると本明細書で定義する。
【0236】
「突然変異分離温度範囲」という用語は、DNAセグメントが完全に変性されない最高温度と、DNAセグメントが完全に変性される最低温度との間の温度範囲を意味すると本明細書で定義する。
【0237】
「突然変異分離プロフィル」という用語は、ホモ二重鎖からのヘテロ二重鎖の分離を示すDMIPC分離クロマトグラムを意味すると本明細書で定義する。こうした分離プロフィルは、突然変異もしくは多形を含有しかつDMIPCにより分離されている前にハイブリダイズされているサンプルに特徴的である。51℃ないし61℃で実施された図45に示されるDMIPC分離クロマトグラムは、本明細書で定義されるところの突然変異分離プロフィルを例示する。
【0238】
本明細書で使用されるところのDNAの「温度の最適化」という用語は、DMIPCからの保持時間が、横座標としてのカラム温度に対して縦座標としてプロットされる実験処置である。
【0239】
突然変異を検出するための信頼できる一方法は、野性型鎖とのサンプル中の推定の突然変異体鎖のハイブリダイゼーションによる(Lermanら、Meth.Enzymol.、155:482(1987))。突然変異体鎖が存在する場合には、図44に示されるとおり、ハイブリダイゼーション過程の結果として2種のホモ二重鎖および2種のヘテロ二重鎖が形成されることができる。これゆえに、ホモ二重鎖からのヘテロ二重鎖の分離は、サンプル中の突然変異体のDNAセグメントの存在もしくは非存在の直接の確認方法を提供する。
【0240】
本発明の一態様は、温度の最適化に基づくT(hsst)の選択方法である。本態様において、突然変異を含有するサンプルを、帰納的な最適化のアプローチを使用して、一連の温度で検査する。本手順により得られた至適温度は、ピークのパターンの差異により突然変異体のDNAフラグメントが野性型DNAと最も容易に識別される温度である。
【0241】
本発明において、好ましいソフトウェアは、使用者に最初の注入の温度を入力させるサンプルテーブルのようなユーザーインターフェースを提供する。デフォルトの温度は予測される温度である(下述されるような)。しかしながら、使用者はいかなる温度も入力するオプションを有する。使用者は、次に、所望の注入回数および注入ごとの温度の増加を入力する。増加のデフォルト値は1℃である。例えば、予測される温度が55℃であり、そして使用者が55+/−2℃の範囲を包含するように5回の注入の温度の最適化を実施したい場合、使用者は最初にサンプルテーブル中で53℃として温度を設定することができ、そしてその後注入回数を5に設定することができる。
【0242】
温度の最適化の一例において、DMIPCによる209塩基対のホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖を含有する標準品の温度依存性の分離を、一連の分離クロマトグラムとして図45に示し、また、分離方法を実施例4に記述する。突然変異体のフラグメントが野性型からの単一塩基対の逸脱を含有した209塩基対のホモ二重鎖フラグメントのヘテロ接合性のサンプルを含有するサンプルを、加熱およびその後冷却することによりハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション過程は、図44に図で示されるとおり2種のホモ二重鎖および2種のヘテロ二重鎖を創製した。図45に示されるとおり、MIPCを51℃で実施した場合、全4種の混合物の成分を表す単一ピークがみられた。全4種の成分が同一の塩基対長さを有しかつ分離が非変性条件、すなわちなんらかの変性を引き起こすには低すぎる温度で実施されたため、この結果は期待された。53℃で、ショルダーが主ピークの小さい保持時間側に出現した。これは、融解の開始、ならびにヘテロ二重鎖の潜在的な存在および部分的分離を示した。分離の温度を漸増的に増大させた際に、元の単一ピークは結局、4個のはっきりと明確なピークに分離した。2種のヘテロ二重鎖を表す2個のより小さい保持時間のピーク、および2種のホモ二重鎖を表す2個のより大きい保持時間のピークが図45に示される。遺伝子座168のA−T塩基対はC−G塩基対より低温で変性するため、2種のホモ二重鎖は分離する。理論により束縛されることを願わないが、該結果は、一方の二重鎖中でのより大きい程度の変性、および/もしくは他方に比較して一方の部分的に変性されたヘテロ二重鎖の極性の差異と矛盾せず、MIPCカラム上での保持時間の差異をもたらす。図45の溶出プロフィルからのホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖種の温度の最適化を図46に示す。
【0243】
図45にみられるとおり、57°ないし58℃の温度範囲がこの分離に最適であった。図44のハイブリダイゼーションの図解に基づき期待された結果に一致して、突然変異が元のサンプル中に存在した場合に、4個の識別可能なピークの出現が観察された。その温度より上では、突然変異を含有する領域が完全に変性されている。これは、分離が約59°−61℃で実施された場合に小さい保持時間でみられる、4個の同等に変性された種を表す単一ピークにより明示される。
【0244】
いくつかの突然変異分析においては、2個のピークもしくは部分的に分離されたピーク(1個もしくは複数)のみがDMIPC分析で観察される。2個のホモ二重鎖のピークは1個のピークもしくは部分的に分離されたピークとして出現するかもしれず、また、2個のヘテロ二重鎖のピークは1個のピークもしくは部分的に分離されたピークとして出現するかもしれない。いくつかの場合には、最初のピークの拡がりのみが、部分的変性条件下で観察される。
【0245】
あるサンプルが同一長さのホモ接合性のDNAフラグメントを含有した場合には、ヘテロ二重鎖が形成される可能性がなかっため、ハイブリダイゼーションおよびMIPCによる分析は、いずれの温度でも単一ピークのみを生じることができた。本方法の実施において、突然変異の決定は、既知の野性型フラグメントとホモ接合性のサンプルをハイブリダイズさせること、および部分的変性温度でDMIPC分析を実施することにより行うことができる。サンプルが野性型フラグメントのみを含有した場合には、ヘテロ二重鎖が形成される可能性がなかったため、単一ピークがDMIPC分析で見られことができた。
【0246】
発明者らは、ヘテロ突然変異体部位分離温度T(hsst)を予測するための式を開発した。一般に、この式は、等式:
T(hsst)=X+m・T(w) (iv)
により表され、
ここで、T(hsst)はヘテロ突然変異体部位分離温度であり、ここでXはDMIPC検出係数であり、そしてmは0と2との間で選択される重み係数であり;双方の係数はT(w)をT(hsst)に対し補正するのに使用する。
【0247】
本発明の特定の一態様において、T(w)は正常な(すなわち野性型)DNA二重鎖のUV融解プロフィルから決定される融解温度である。別の特定の態様において、T(w)は下述されるとおりソフトウェアにより計算される。mの値は好ましくは0と2との間である。
【0248】
既知のフラグメントの融解挙動の熱力学的数学的モデルを使用して、サンプルそれ自身に対するいかなる実験的作業も伴わずに新たなフラグメントの融解挙動を予測することができる。該モデルは、突然変異の検出のための最適温度を予測するため、およびまた該技術への該フラグメントの適合性を評価するためにも使用される。DNAの融解挙動の模型作成は文献中で十分に開発されている。しかしながら、公表された熱力学的融解手順は、それらを突然変異の検出のための温度予測に完全に使用することができる前に改変しなければならない。
【0249】
本発明の好ましい一態様において、突然変異の検出のためのサンプルのDMIPC分析で使用されるべき融解T(hsst)は、数学的モデルにより予測される。一般的アプローチの一例として、予測されるT(hsst)は、計算されたT(hsst)を得るための計算段階、および予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度を得るための予測段階を含んで成る方法により得ることができる。該計算段階は、第一の数学的モデルに従って、計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度を計算することを含んで成る。該予測段階は、第二の数学的モデルに従って、計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度を補正することを含んで成る。好ましくは、第二の数学的モデルは、計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度との、経験的に決定されたヘテロ突然変異体部位分離温度の比較に基づく。
【0250】
本アプローチの一例において、計算された融解温度は、ポーランド(Poland)のモデルのフィクスマン−フリエル(Fixman−Friere)の実装のような第一の数学的モデルを使用して論理的に導かれる。その後、予測される融解温度が、第二の数学的モデルに従って計算された融解温度を補正することにより論理的に導かれる。第二の数学的モデルの好ましい一例は、第一のモデルに基づく計算された温度を、温度の最適化から観察される経験的に決定された温度と比較することにより開発される補正等式である。該補正等式を使用して、野性型もしくはホモ二重鎖のDNAの配列情報のみを使用してDMIPCの融解のT(hsst)を予測するのことができる。フィクスマン−フリエル(Fixman−Friere)で計算された温度の補正は、熱力学的データを得ることにおいて使用される条件(Breslauerら Proc Natl.Acad.Sci USA 83:3746(1986)(引用することにより本明細書に組み込まれる))と、DMIPCで使用される条件との間の差異を説明するために必要である。
【0251】
数学的モデルから論理的に導かれる等式の一具体的説明は以下であり、これは等式(iv)の特定の一態様である:
Tm0.75’=19.6+0.68・Tm0.75 (v)
式中、Tm’0.75は75%のらせん含有量に対応する予測される温度であり、また、Tm0.75は、0.0001というσ値を使用して、ポーランド(Poland)のモデルのフィクスマン−フリエル(Fixman−Friere)の実装(Poland、Biopolymers 13:1859(1974)およびFixmanら、Biopolymers 16:2693(1977)(双方の参考文献は引用することにより本明細書に組み込まれる))から計算される温度である。図47は、経験的に観察される融解温度に対する計算された融解温度のグラフである。等式(v)は、図47からの40個の点の直線のあてはめを表す図48中の実線から論理的に導かれる。Tm0.75’を表す線の1℃上および下を表す破線もまた図48のグラフ上にプロットされる。これらの破線は、予測されるTm0.75’の正確さが、経験的に決定された値の約1℃以内であると予測してよいことを示す。
【0252】
等式(v)中のT(hsst)は、これが実験的に観察された温度の最適化のデータとT(hsst)の予測される値との間の最良の一致を与えたため、75%のらせん含有量で選択された。当業者は、経験的な温度最適化曲線上の他の点を選択することができ(例えば50%もしくは90%のらせん含有量)、また、計算された温度を得かつ上述されたとおり補正することができることを認識するであろう。
【0253】
T(hsst)を予測するための上の一般的アプローチを使用することの他の例において、マックメルト[MacMelt](商標)(バイオラッド ラボラトリーズ(BioRad Laboratories)、カリフォルニア州ハーキュリーズ)、MELT(Lermanら Meth.Enzymol.155:482(1987))もしくはウィンメルト[WinMelt](商標)(バイオラッド ラボラトリーズ(BioRad Laboratories))のようなソフトウェアを使用して、あるフラグメントの計算された融解プロフィルを得ることができる。
【0254】
Oefnerら Current Protocols in Human Genetics、ワイリー アンド サンズ(Wiley & Sons)、ニューヨーク、Suppl.19:7.10−7.10.12、およびClinical Chem.45:1133−1140(1999)中のJonesら(これらの参考文献は引用することにより本明細書に組み込まれる)により記述される等式のような、T(hsst)の予測される値を与える他の等式を、本発明で使用することができる。
【0255】
T(hsst)の予測される値は、特定のサンプルのサンプルテーブルのようなグラフィカル・ユーザー・インターフェースで人的に入力することができる。
【0256】
本発明の一態様において、使用者は、コンピュータのインターフェースで、ホモ二重鎖の野性型DNAの塩基の配列を入力するか、もしくはbpのフラグメント長さを入力し、また、予測されるT(hsst)の値を入力し、これは、上述されたようなサンプルの分析でオーブン温度制御ソフトウェアモジュールにより使用されるようにディジタルメモリに保存される。
【0257】
本発明の好ましい一態様において、使用者が、コンピュータのインターフェースでホモ二重鎖の野性型DNAの塩基の配列を入力し、T(hsst)を予測するためのコンピュータ内の(もしくはネットワークを通じてのようなコンピュータに連結された)ソフトウェアが、予測されるT(hsst)を生じさせ、これは使用者により場合によっては吟味されることができ、また、これは、上述されたようなサンプルの分析でオーブン温度制御ソフトウェアモジュールにより使用されるようにディジタルメモリに保存されてる。
【0258】
別の好ましい態様において、使用者は、コンピュータのインターフェースでホモ二重鎖の野性型DNAの塩基の配列を入力し、そして、T(hsst)を予測するためのソフトウェア、ならびに溶媒濃度および勾配をコンピュータ計算するためのソフトウェアの双方が一緒に、必要とされるメソッドのパラメータの全部を生じさせ、これは場合によっては吟味されることができ、そしてDMIPC分析が自動的に実施される。
【0259】
本発明の好ましいソフトウェアは、DMIPCによる突然変異の検出のためのデータ入力および評価を助長する新規のグラフィカル・ユーザー・インターフェース画面を提供する。こうしたインターフェースの一態様を具体的に説明する図49は、クリックボタン800によりアクセス可能であるDNA配列画面798を示す。フィールド802は、キーボード、クリップボードもしくはASCIIテキストファイルからDNA配列を入力するためのフィールドを提供する。フラグメント記述フィールド804が、フラグメントの記述を入力するためのフィールドを提供する。塩基対の数が自動的に計算され、フィールド806に表示され、そしてまたサンプルについての関連した勾配テンプレートでも入力される。好ましくは本明細書に記述される等式(v)により予測されるT(hsst)が808に表示される。現在のカーソル位置が810に示される。配列の%GCが812に表示される。
【0260】
図50は、クリックボタン820によりアクセス可能である融解プロフィル画面818を具体的に説明する。この画面は、DNA配列フィールド802で入力された二重鎖フラグメントの、上述された等式(v)のような等式により予測されるところの融解挙動を表示するフィールド822および824を包含する。
【0261】
フィールド822はらせん状画分対温度を示す。特定の一塩基でのらせん度パーセントは、フィールド826で塩基の位置を入力することにより表示することができる。該フィールドが空白のまま残される場合、らせん度の平均パーセントが表示される。いずれの場合も、プロットは計算ボタン828を押すことにより更新される。本明細書に記述されるユーザーインターフェースの全部が、他のコンピュータアプリケーションへの編集、ペーストおよびコピーのための通常のオプションを組込む。
【0262】
フィールド824は、フィールド830、832、834で入力された温度でのフラグメントに沿った変性のパターンを示す。複数の跡(例えば示されるような3個)を、異なる色により識別される異なる温度で表示されることができる。図51は、フラグメントの異なる領域中の突然変異を検出するのに必要とされる温度を決定するためのフィールド824でのグラフの使用を具体的に説明する。破線の跡836は、およそ120ないし209bpからの領域中に配置された突然変異が57℃のオーブン温度で見出されるとみられることを示す一方、実線の跡838は、領域1−120bp中の突然変異が62℃のオーブン温度を必要とするとみられることを示す。第一の温度は、等式(v)のような等式を使用してソフトウェアにより自動的に決定される。第二の温度は、ボックスに試験温度を入力すること、および融解曲線を計算することにより決定することができる。好ましい温度は、約30ないし80パーセントの間のらせん状画分に目的の領域を表示することができる。
【0263】
図52は、840に融解プロフィル画面の別の態様を具体的に説明する。75%らせんに対応する温度を、フィールド842中でフラグメントの大きさ(塩基対)に対しプロットする。温度の目盛りがプロット822のものに合致するように、このプロットを90℃だけ回転させることができる。
【0264】
その最も一般的な形態において、本発明のクロマトグラフィー系で使用される分離方法は、非極性表面を有する静的分離媒体を利用するポリヌクレオチド、例えばDNAの分離に関する。好ましい表面は、ポリヌクレオチドを捕捉する可能性のある多価陽イオン汚染を本質的に含まない。該分離は静止表面上で実施される。該表面は多孔質であることができるが、しかし、好ましくは、いかなる表面の孔も、分析されている最小のポリヌクレオチドを排除する大きさのものである。
【0265】
一態様において、非極性表面はポリマービーズの表面を含んで成る。代替の一態様において、該表面は、成形されたポリマー性モノリス中の細隙空間の表面を含んで成る。本発明の記述を単純化する目的上、そして制限としてでなく、非多孔質ビーズを使用するポリヌクレオチドの分離、およびこうしたビーズの製造法を主として本明細書に記述することができ、ポリマー性モノリスの細隙空間のような他の分離表面が本発明の範囲内に包含されることを意図していることが理解される。棒材のようなモノリスは、溶出溶媒および被検体を通過させる通し孔もしくは細隙空間を有する単一構造としてカラムの内側に形成されておりかつ非極性分離表面を提供する、ポリマー性分離媒体を含有する。
【0266】
一般に、本発明の分離媒体に対する唯一の要件は、それらが、固有に非極性である表面を有しなくてはならないか、もしくは対イオン剤と相互作用するのに十分な非極性を有する表面を形成する素材と結合されなければならないかのいずれかであることである。
【0267】
非多孔質ポリマービーズは、約0.5〜100ミクロン;好ましくは1〜10ミクロン;より好ましくは1〜5ミクロンの平均直径を有することができる。1.0〜3.0ミクロンの平均直径を有するビーズが最も好ましい。
【0268】
米国特許第5,585,236号明細書において、Bonnらは、該核酸分離過程を逆相イオン対形成クロマトグラフィー(RPIPC)として特徴づけた。しかしながら、RPIPCは本発明に記述されるある種の必須の特徴を組込んでいないため、別の用語、マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー(MIPC)を選択した。本明細書で使用されるところのMIPCは、非極性ビーズを使用して一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドを分離するための方法と定義され、ここで、該方法は、対イオン剤、およびビーズから核酸を溶出させるための有機溶媒を使用し、また、ここで、該ビーズは最低0.05のDNA分離係数を有することを特徴とする。好ましい一態様において、ビーズは最低0.5のDNA分離係数を有する。最適な一態様において、ビーズは最低0.95のDNA分離係数を有する。
【0269】
本発明のビーズは、二本鎖および一本鎖DNAのMIPCによる高効率の分離を提供する。ビーズの性能を測定するための有用な一基準は、同時係属中の特許出願第09/183,123号明細書に詳細に記述されるDNA分離係数である。これは、pUC18 DNA−HaeIII制限消化物の257および267塩基対の二本鎖DNAフラグメントの分離として測定され、そして、ピークのベースラインから頂点までの距離に対しての、ピークの間の谷からピークの頂点までの距離の比と定義される。図53の図解を参照すれば、DNA分離係数は、ベースラインからピーク「b」と「c」との間の谷「e」までの距離「a」、および谷「e」からピーク「b」もしくは「c」の一方の頂点までの距離「d」を測定することにより決定される。ピーク高さが等しくない場合は、最高のピークを使用して「d」を得る。DNA分離係数はd/(a+d)の比である。本図解中の257および267塩基対のピークは高さが同様である。本発明の使用できるビーズは最低0.05のDNA分離係数を有する。好ましいビーズは最低0.5のDNA分離係数を有する。
【0270】
理論により束縛されることを願わないが、発明者らは、本明細書で指定されるところのDNA分離係数に従うビーズが、分離されているポリヌクレオチドがビーズに進入することを本質的に排除する孔径を有すると考える。本明細書で使用されるところの「非多孔質」という用語は、その中で使用される溶媒媒体中での分離で最小のDNAフラグメントの大きさおよび形状より小さい直径を有する表面孔を有するビーズを示すと定義する。それらの本来の状態でこれらの指定された最大の大きさの制限を有するか、もしくは必要とされる最大有効孔径に合致するようにそれらの孔径を減少させるよう処理されているポリマービーズが、本定義に包含される。好ましくは、最低0.5のDNA分離係数を提供する全部のビーズが、「非多孔質」ビーズの定義内に包含されることを意図している。
【0271】
本発明の非多孔質ビーズの表面のコンホメーションは、分離過程を妨害しないくぼみ(depression)および浅いくぼみ(pit)様構造を包含することができる。それを非多孔質にするための多孔質ビーズの前処理は、ビーズ構造中の孔を満たすことができかつMIPC過程を大きく妨害しないいかなる素材を用いても遂げることができる。
【0272】
孔は、それを通って移動相および他の物質がビーズ構造に進入することができる開放構造である。孔は、しばしば、1個の孔に進入する液体が別の孔から出ることができるように相互に連結されている。発明者らは、相互に連結される孔構造およびビーズ中へのポリヌクレオチドの動きを可能にする寸法を有する孔は、分離の分離度を損なうか、もしくは非常に長い保持時間を有する分離をもたらすと考える。しかしながら、MIPCにおいては、ビーズは「非多孔質」であり、そしてポリヌクレオチドはビーズ構造に進入しない。
【0273】
カラムビーズのクロマトグラフィー効率は、主として表面および近表面領域の特性により影響される。この理由から、以下の記述はとりわけポリマービーズの表面に近い領域に関する。こうしたビーズの本体および/もしくは中心は、本発明のポリマービーズの表面もしくは表面近くで観察されるものと全く異なった化学および物理特性の組を表す可能性がある。
【0274】
本発明の別の態様において、分離媒体は棒状様モノリスカラムのようなポリマー性モノリスの形態であることができる。モノリスカラムは、下の実施例に記述されるとおり、管の内側の単一の単位として重合もしくは形成される。通し孔もしくは細隙空間が溶出溶媒および被検体物質の通路を提供する。分離は静止表面上で実施される。表面は多孔質であることができるが、しかし好ましくは非多孔質である。分離の形態および機能は、ビーズで充填されたカラムに同一である。ビーズでのように、棒材中に含有される孔はDNAと適合性でなくてはならず、かつ、該物質を捕捉してはならない。また、棒材は、DNAを捕捉することができる汚染を含有してはならない。
【0275】
本発明の成形されたポリマー性棒材は、クロマトグラフィーカラムの範囲内のバルクフリーラジカル重合により製造される。棒材のベースポリマーは多様な重合可能な単量体から製造することができる。例えば、モノリス棒材は、スチレン、置換スチレン、α−置換スチレンおよびジビニルベンゼンのようなモノおよびジビニル置換芳香族化合物;アクリレートおよびメタクリレート;ポリプロピレンおよびポリエチレンのようなポリオレフィン;ポリエステル;ポリウレタン;ポリアミド;ポリカーボネートを包含するポリマー;ならびに商標テフロン[TEFLON]で公知のフルオロ置換エチレンを包含する置換ポリマーから作成することができる。ベースポリマーはまたポリマーの混合物であることもでき、その制限しない例は、ポリ(グリシジルメタクリレートコエチレンジメタクリレート)、ポリ(スチレン−ジビニルベンゼン)およびポリ(エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン)を包含する。棒材は、置換されないことができるか、または炭化水素アルキルもしくはアリール基のような置換基で置換されることができる。アルキル基は、場合によっては、直鎖もしくは分枝状鎖中に1ないし1,000,000個の炭素を有し、そして、アルデヒド、ケトン、エステル、エーテル、アルキル基などを包含する多様な型の直鎖、分枝状鎖、環状、飽和、不飽和の非イオン性官能基を包含し、また、アリール基は、フェニル、ナフチルなどを包含する単環、二環および三環の芳香族炭化水素基を包含する。好ましい一態様において、アルキル基は1−24個の炭素を有する。より好ましい一態様において、アルキル基は1−8個の炭素を有する。置換はまた、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ基、もしくは非極性の逆相官能基であると考えられる同様のものも含有することもできる。炭化水素の置換方法は当該技術分野で慣習的かつ公知であり、そして本発明の一局面でない。ポリマー性モノリスの製造法は、以下の参考文献、すなわちWangら(J.Chromatog.A 699:230(1994))、Petroら(Ana.Chem.68:315(1996))、および以下の米国特許第5,334,310号;同第5,453,185号;同第5,522,994号明細書(Frechetへ)に記述されるところの当該技術分野で公知の慣習的方法による。モノリスもしくは棒材カラムは、メルク アンド カンパニー(Merck & Co)(ドイツ・ダルムシュタット)から商業的に入手可能である。
【0276】
本発明の非多孔質ポリマービーズは二段階の工程により製造され、ここで、小さい種ビーズが適する重合可能な単量体の乳化重合により最初に製造される。本発明の乳化重合手順は、Goodwinら(Colloid & Polymer Sci.、252:464−471(1974))の手順の変法である。種ビーズを製造するための乳化重合工程で使用することができる単量体は、スチレン、アルキル置換スチレン、α−メチルスチレンおよびアルキル置換α−メチルスチレンを包含する。その後、種ビーズを拡大させ、そして場合によっては多様な基での置換により修飾して、本発明の非多孔質ポリマービーズを製造する。
【0277】
乳化重合により製造される種ビーズは、ポリマービーズの大きさを増大させるためのいずれかの既知の方法により拡大することができる。例えば、ポリマービーズは、米国特許第4,563,510号明細書に開示される活性化膨潤工程により拡大することができる。拡大もしくは膨潤されたポリマービーズは、架橋する重合可能な単量体および重合開始剤を用いてさらに膨潤される。重合は、拡大されたポリマービーズの架橋密度を増大させ、かつ、ビーズの表面多孔性を減少させる。適する架橋単量体は、開始剤の存在下で重合が可能な最低2個の炭素−炭素二重結合を含有する。好ましい架橋単量体は、ジビニル単量体、好ましくはアルキルおよびアリール(フェニル、ナフチルなど)ジビニル単量体であり、そしてジビニルベンゼン、ブタジエンなどを包含する。ポリマーの種ビーズの活性化膨潤は、1から約100ミクロンまでの範囲にわたる平均直径を有するポリマービーズを製造するのに有用である。
【0278】
あるいは、ポリマーの種ビーズは、乳化重合から生じる種ラテックスを単に加熱することにより拡大することができる。この代替は、活性化溶媒での種ビーズの活性化膨潤の必要性を排除する。代わりに、種ラテックスを、架橋単量体のための水と混合可能な溶媒と一緒にもしくはそれを伴わずに、上述された架橋単量体および重合開始剤と混合する。適する溶媒はアセトン、テトラヒドロフラン(THF)、メタノールおよびジオキサンを包含する。生じる混合物を、重合開始剤の開始温度より下の温度、一般に約10℃−80℃、好ましくは30℃−60℃で約1−12時間、好ましくは約4−8時間加熱する。場合によっては、混合物の温度を10−20%だけ増大させることができ、そして混合物を追加の1ないし4時間加熱することができる。重合開始剤に対する単量体の比は、最低200の重合度を確実にするために、最低100:1、好ましくは約100:1ないし約500:1、より好ましくは約200:1である。この重合度を有するビーズは、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)の応用で使用されるのに十分に圧に安定である。この熱的膨潤工程は、ビーズの大きさを約110−160%だけ増大させて約5ミクロン、好ましくは約2−3ミクロンまでの平均直径を有するポリマービーズを得ることを可能にする。従って、熱的膨潤手順は、活性化膨潤手順によってのみ以前に到達可能なより小さい粒子径を製造するのに使用することができる。
【0279】
熱的拡大の後に、過剰の架橋単量体を除去し、そして紫外光もしくは熱への曝露により粒子を重合させる。重合は、例えば、拡大された粒子の重合開始剤の活性化温度への加熱、および所望の重合度が達成されるまで重合を継続することにより実施することができる。継続された加熱および重合は、500より大きい重合度を有するビーズを得ることを可能にする。
【0280】
本発明において、Bonnら、もしくは米国特許第4,563,510号明細書により開示された充填材料を、アルキル基でのポリマービーズの置換により修飾することができるか、もしくは、その修飾されない状態で使用することができる。例えば、ポリマービーズを、ヨウ化メチルもしくはヨウ化エチルのようなアルキル化剤とビーズを接触させることにより1もしくは2個の炭素原子でアルキル化することができる。アルキル化は、ポリマービーズをフリーデル−クラフツ触媒の存在下にアルキルハロゲン化物と混合して、ポリマーブレンドの表面の芳香環で親電子芳香族置換を遂げることにより達成する。適するフリーデル−クラフツ触媒は当該技術分野で公知であり、そして塩化アルミニウム、三フッ化ホウ素、四塩化スズなどのようなルイス酸を包含する。ビーズは、例えば上の手順でヨウ化メチルの代わりに対応する炭化水素ハロゲン化物を用いることにより炭化水素置換することができる。
【0281】
本発明のビーズに関して本明細書で使用されるところのアルキルという用語は、1から1,000,000個までの炭素を有するアルキルおよびアルキル置換アリール基を包含すると定義し、アルキル基は、アルデヒド、ケトン、エステル、エーテル、アルキル基などを包含する多様な型の直鎖、分枝状鎖、環状、飽和、不飽和の非イオン性官能基を包含し、また、アリール基はフェニル、ナフチルなどを包含する単環、二環および三環の芳香族炭化水素基として包含する。アルキル置換方法は当該技術分野で慣習的かつ公知であり、そして本発明の一局面でない。置換はまた、非極性の逆相官能基であると考えられるヒドロキシ、シアノ、ニトロ基なども含有することができる。
【0282】
Bonnの特許で報告されたクロマトグラフィー素材は、最低3個の炭素を有するアルキル基で置換された非多孔質ビーズに限定された。Bonnらはこの置換を欠くポリマービーズを使用して分離を得ることにおいて成功しなかったからである。加えて、該ポリマービーズは、小さな群のビニル芳香族単量体に限定され、また、Bonnらは、他の素材を用いて二本鎖DNAの分離を遂げることが不可能であった。
【0283】
本発明において、二本鎖DNAの成功裏の分離は、誘導体化されない非多孔質ビーズを使用して、ならびに、1ないし1,000,000個の炭素を有するアルキル基で誘導体化されたビーズを使用して、達成することができる。
【0284】
本発明のベースポリマーは他のポリマーでもあることもまたでき、その制限しない例は、スチレン、置換スチレン、α−置換スチレンおよびジビニルベンゼンのようなモノおよびジビニル置換芳香族;アクリレートおよびメタクリレート;ポリプロピレンおよびポリエチレンのようなポリオレフィン;ポリエステル;ポリウレタン;ポリアミド;ポリカーボネート;ならびに、商標テフロン[TEFLON]で公知のフルオロ置換エチレンを包含する置換ポリマーを包含する。ベースポリマーはまたポリマーの混合物であることもでき、その制限しない例はポリ(スチレン−ジビニルベンゼン)およびポリ(エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン)を包含する。これらのポリマーからのビーズの作成方法は当該技術分野で慣習的かつ公知である(例えば、米国特許第4,906,378号明細書を参照されたい)。ビーズの表面および近表面領域の物理特性は、クロマトグラフィー効率に対する支配的な影響である。ポリマーは、誘導体化されるにしろされないにしろ、MIPC分離に非多孔質、非反応性、かつ非極性の表面を提供しなければならない。
【0285】
本発明の分離方法の記述は、制限としてでなくしかし提示を単純化するために、上述された非極性表面をもつポリマービーズに関して提示される。分離表面は上述されたモノリスのポリマー性素材によってもまた提供されることができるか、もしくは、それらは、下述される非極性表面をもつ無機ポリマーにより提供されることができ、そして、これらの素材の全部を包含する方法および系が本発明の範囲内に包含されることを意図していることが理解されるべきである。
【0286】
本発明のビーズは、同時係属中の特許出願第09/183,450号明細書(その完全な内容はこれにより引用することにより組み込まれる)に記述される素材のような、その表面に結合されたもしくはその上に被覆された非極性分子もしくは非極性ポリマーを有する非多孔質粒子を含んで成る。一般に、該ビーズは、ポリマーで被覆されているか、または、実質的に全部の表面基質基が非極性炭化水素もしくは置換炭化水素基と反応されかついかなる残存する表面基質基も上述されるようにトリ(低級アルキル)クロロシランもしくはテトラ(低級アルキル)ジクロロジシラザンでエンドキャッピングされている、非多孔質粒子を含んで成る。
【0287】
非多孔質粒子は、好ましくは無機粒子であるが、しかし非多孔質有機粒子であることができる。非多孔質粒子は、例えば、シリカ、シリカカーバイド、亜硝酸シリカ、酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化ジルコニウム、炭素、セルロースのような不溶性多糖、もしくはケイソウ土、または非多孔質であるように改変されたこれらの素材のいずれかであることができる。炭素粒子の例は、いかなる妨害する汚染物質も除去するように処理されているダイアモンドおよびグラファイトを包含する。好ましい粒子は本質的に非変形性でありかつ高圧に耐えることができる。非多孔質粒子は既知の手順により製造される。好ましい粒子径は約0.5−100ミクロン;好ましくは1−10ミクロン;より好ましくは1−5ミクロンである。1.0−3.0ミクロンの平均直径を有するビーズが最も好ましい。
【0288】
慣習的なシリカに基づく逆相HPLC素材の製造の化学は公知であるため、本明細書の本発明のビーズの記述の大部分はシリカに関して提示される。しかしながら、上に列挙されたもののような他の非多孔質粒子を同一の様式で修飾することができ、また、本発明の方法でシリカの代わりに用いることができることが理解されるべきである。シリカの一般的化学の記述については、Colin F.PooleとSalwa K.Poole、Chromatography Today、エルゼビア(Elsevier):ニューヨーク(1991)、pp.313−342、およびSnyder,R.L.とJ.J.Kirkland、Introduction to Modern Liquid Chromatography、第2版、ジョン ワイリー アンド サンズ インク(John Wiley & Sons,Inc.):ニューヨーク(1979)、pp.272−278(それらの開示はこれによりそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
【0289】
本発明の非多孔質ビーズは、被覆もしくはケイ酸化(silating)試薬との反応後に最小限の露出されたシラノール基を有することを特徴とする。最小限のシラノール基は、支持体とのDNAの相互作用を減少させるため、ならびにまた高いpHおよび水性の環境中での素材の安定性を向上させるために必要とされる。シラノール基は、それらがDNA分子の負の電荷に反発してカラムの固定相とのDNAの相互作用を予防もしくは制限する可能性があるために、有害である可能性がある。相互作用の別の可能な機構は、シラノールがイオン交換部位として作用して鉄(III)もしくはクロム(III)のような金属を取り込む可能性があることである。鉄(III)もしくはカラム上に捕捉される他の金属は、DNAのピークを歪める可能性があるか、もしくはDNAがカラムから溶出されることを予防さえする可能性がある。
【0290】
シラノール基は水に基づく移動相により加水分解される可能性がある。加水分解は、より多くのシラノール基を露出させることにより、もしくはシリカコア中に存在する可能性のある金属を露出させることにより、固定相の極性および反応性を増大させることができる。加水分解は、増大された誘導体化されないシラノール基でより優勢であることができる。DNA分離に対するシラノール基の影響は、妨害のどの機構が最も優勢であるかに依存する。例えば、鉄(III)は、鉄(III)が移動相中に存在するか、機器中に存在するか、もしくはサンプル中に存在するかに依存して、露出されたシラノール部位に結合されたようになる可能性がある。
【0291】
金属の影響は、金属が系もしくは試薬内に既に存在する場合にのみ発生する可能性がある。系もしくは試薬内に存在する金属は、シリカ上のイオン交換部位により捕捉されたようになる可能性がある。しかしながら、系もしくは試薬内に金属が存在しない場合には、シラノール基それら自身がDNA分離の妨害を引き起こす可能性がある。水性環境による露出されたシラノール部位の加水分解は、シリカコア中に存在するかもしれない金属を露出させる可能性がある。
【0292】
完全に加水分解されたシリカは、表面1平方メートルあたり約8マイクロモルのシラノール基の濃度を含有する。せいぜい、立体構造の考慮により、最大で1平方メートルあたり約4.5マイクロモルのシラノール基が反応する可能性があり、シラノールの残部は反応された基により立体的に遮蔽される。最小限のシラノール基は、シラノール基が分離を妨害することを予防するのに十分な遮蔽の理論的限界に達するもしくはそれを有すると定義される。
【0293】
非多孔質のシリカコア粒子を形成するための多数の方法が存在する。例えば、メタノール中に注がれたケイ酸ナトリウム溶液は、ケイ酸ナトリウムの微細に分割された球形粒子の懸濁物を生じさせることができる。これらの粒子は酸との反応により中和される。こうして、約1−2ミクロンの直径を有するシリカゲルの球形粒子が得られる。シリカは、有機液体もしくは蒸気から沈殿させることができる。高温(約2000℃)でシリカは蒸発され、そして該蒸気は、温度の低下もしくは酸化ガスを使用することのいずれかにより凝縮されて微細に分割されたシリカを形成することができる。シリカの合成および特性は、R.K.Ilerにより、The Chemistry of Silica,Solubility,Polymerization,Colloid and Surface Properties,and Biochemistry、ジョン ワイリー アンド サンズ(John Wiley & Sons):ニューヨーク(1979)に記述されている。
【0294】
W.Stoberらは、J.Colloid and Interface Sci.、26:62−69(1968)に、ミクロンの大きさ範囲の単分散シリカ球体の制御された成長を記述した。Stoberらは、アルキルケイ酸塩の加水分解およびアルコール溶液中でのケイ酸のその後の凝縮によって、均一な大きさの球形のシリカ粒子の制御された成長を可能にする、化学反応の系を記述する。形態的触媒としてアンモニアを使用する。懸濁物中で得られる粒子径は、直径が0.05μm未満から2μmまでの範囲にわたる。
【0295】
非多孔質シリカコアビーズは、ミクラ サイエンティフィック(Micra Scientific)(イリノイ州ノースブルック)およびケミーエ ユティコン(Chemie Uetikkon)(スイス・ローザンヌ)から得ることができる。
【0296】
本発明の非多孔質ビーズを製造するためには、非多孔質粒子を、非多孔質粒子の実質的に全部の表面基質基が非極性炭化水素もしくは置換炭化水素基で封鎖されるように、ポリマーで被覆するかもしくは反応させかつエンドキャッピングする。これはいくつかの方法により達成することができる。
【0297】
有機結合された相のシロキサンコーティングは、単分子層もしくは重合された多層コーティングとして作成することができる。いわゆる単分子有機層をもつ充填剤は、通常、シリカ質基礎粒子の表面シラノール基を一、二もしくは三官能性のクロロ、ジメチル、アミノ、シロキシもしくはアルコキシシランと反応させることにより製造する。これらの反応で使用される典型的な一官能性反応体はX−Si−Rを包含し、ここでX=Cl、OH、OCH3もしくはOC2H5、また、Rは有機基である。図54は、シリカコア902および単分子有機層を有するビーズ900の図解である。(該図は、本発明のビーズの形態学もしくは孔構造を必ずしも反映せず、そして具体的説明の目的上のみ意味される。)
表面の修飾にR2SiX2およびRSiX3のような二および三官能性反応体を使用すれば、結合された官能基あたり2個までのSi−X基が反応されないまま留まる。水での処理後に、これらの反応されない基の加水分解が起こり、そして付加的なシラノール基が、充填剤中に存在する結合された有機官能基とほぼ同一濃度で(ときにポリマーマトリックス中で)形成される。これらの酸性有機シラノール基は、溶質の保持挙動に有意に影響を及ぼす可能性があり、また、pH>7の水性溶液中での充填剤の安定性に悪影響を及ぼす。
【0298】
従って、シラン試薬との表面の不完全な反応、または二もしくは三官能性の修飾剤を使用することからの新たなSi−OH基の形成は、移動相もしくはサンプルの分子に容易に到達可能である残余の酸性のSi−OH基の集団をもたらす可能性がある。従って、最近の傾向は、(a)部分的被覆の代わりに官能基の密な単層、および(b)残余のSi−OH基の最小限の可能性を伴う均質な有機コーティングを提供するための一官能性のジメチルシラン[X−Si(CH3)2−R]の使用に向かっている。必要とされる有機官能性を調製することができる場合はモノクロロシラン試薬が好ましい。一官能性修飾剤中のR基の2個がメチルである場合、表面被覆は(炭素分析に基づき)1平方メートルの有機物あたり約4マイクロモル程度であることができる。後者の場合、シリカ表面上の残余のSi−OH基は、立体遮蔽のため、大部分の溶質とのクロマトグラフィー相互作用に利用不可能である。
【0299】
有機シラノール(例えばHO−Si−R3)もしくは有機アルコキシ(例えばRO−Si−R3)シランのシリカ支持体との重合を伴わない反応もまた、良好な充填剤を生じさせることができる。これらの反応は比較的再現可能であるが、但し、痕跡の水もしくは他の反応性種が存在しない。反応されない到達可能なシラノールが最初の反応後に残る可能性があるが、しかし、これらはクロロトリメチルシランでの充填剤のキャッピングにより除去することができる(但し、R基が後者のシランと反応しない)。
【0300】
一方法により、非多孔質粒子はポリマーコーティングで被覆される。該粒子の被覆での使用に適するポリマーは、連鎖反応ポリマーおよび段階反応ポリマー、例えば、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリアミド、セルロースのような不溶性多糖、ポリジメチルシロキサン、ポリジアルキルシロキサンおよび関係する素材を包含する。ポリマーコーティングは、表面の完全な遮蔽が達成されるように、多被覆工程によって非多孔質粒子に結合することができる。
【0301】
最近数年に、ポリマーで被覆されたもしくはポリマーで被包化された充填剤として知られる新たな結合された相の充填剤が、開放管カラムガスクロマトグラフィーのための固定された固定相を製造するのに使用される技術に基づき導入されている。この場合、該相は、裸のシリカもしくは前シラン化された(presilanized)シリカのいずれかの微粒子をポリ(シロキサン)もしくはポリ(ブタジエン)プレポリマーで機械的に被覆することにより製造され、それがその後、過酸化物、アゾ−tert−ブタンもしくはγ放射に誘導される化学的架橋反応により固定される。図55は、シリカコア906およびポリマーコーティング908を有する被覆されたビーズ904の図解である。(該図は、本発明のビーズの形態学もしくは孔構造を必ずしも反映せず、かつ、具体的説明の目的上のみ意味される。)
代替の一方法は、ビニルを含有するシラン分子と共有結合すること、およびその後粒子の表面上のコーディングを重合することの組み合わせを含んで成る。残余のシラノール基もしくは金属基が存在する場合は、第二のコーティングを適用することができる。
【0302】
本方法の一変形物において、シリカ表面を最初にビニルトリクロロシランとの反応により修飾し、次いでアクリル酸誘導体を誘導体化されたシリカ表面にかつその上に重合する。多数の有用な単量体およびプレポリマーの利用可能性が、広範な逆相、極性およびイオン交換充填剤が同一の一般的反応を使用して製造されることを可能にした。また、一般的アプローチは下にある支持体の化学に依存しないため、シリカ以外の素材、例えばアルミナおよび酸化ジルコニウムを修飾しかつ例えばpH範囲2−7.5の外側の移動相を用いるシリカが適しない条件下で使用することができる。シリカに戻れば、前シラン化は活性のシラノール基の数を減少させ、それらはその後表面上に固定されるポリマー性薄膜によりさらに遮蔽される。逆相液体クロマトグラフィーにおいて、これらの充填剤は、塩基性溶質の分離のための単量体の化学的に結合された相に比較して、改良されたクロマトグラフィー特性を示した。ポリマーで被包化された充填剤は、理にかなった物質移動の特徴を維持するための約1nmの薄膜厚を有する。この手順の記述はEngelhartら(Chromatographia、27:535(1989))により発表された。
【0303】
上の方法のいずれかにより製造されたポリマー被覆されたビーズは、それらの修飾されない状態で使用することができるか、もしくは炭化水素基での置換により修飾することができる。いかなる炭化水素基も適する。本明細書で使用されるところの「炭化水素」という用語は、1から1,000,000個までの炭素を有するアルキルおよびアルキル置換アリール基を包含すると定義され、アルキル基は、アルデヒド、ケトン、エステル、エーテル、アルキル基などを包含する多様な型の直鎖、分枝状鎖、環状、飽和、不飽和の非イオン性官能基を包含し、また、アリール基は、フェニル、ナフチルなどを包含する単環、二環および三環の芳香族炭化水素として包含する。炭化水素の置換方法は当該技術分野で慣習的かつ公知であり、そして本発明の一局面でない。炭化水素はまた、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ基、もしくは非極性の逆相官能基であると考えられる同様のものも含有することができる。好ましい炭化水素基はアルキル基であり、また、下の適する置換方法の記述は、単純化の目的上かつ制限としてでなく、アルキル化として提示され、慣習的手順によるアリール置換もまた本発明の範囲内に包含されることを意図していることが理解される。
【0304】
ポリマー被覆されたビーズは、ヨウ化アルキルのような対応するアルキルハロゲン化物との反応によりアルキル化することができる。アルキル化は、ポリマー被覆されたビーズをフリーデル−クラフツ触媒の存在下にアルキルハロゲン化物と混合して、ポリマーブレンドの表面の芳香環で親電子芳香族置換を遂げることにより達成する。適するフリーデル−クラフツ触媒は当該技術分野で公知であり、そして塩化アルミニウム、三フッ化ホウ素、四塩化スズなどのようなルイス酸を包含する。1から1,000,000個まで、および好ましくは1から22個までの炭素を有する炭化水素基での置換を、これらの方法により遂げることができる。23から1,000,000個までの炭素を有する炭化水素基は、本明細書で炭化水素ポリマーとして参考文献として引用される。
【0305】
アルキル化は多数の既知の合成手順により達成することができる。これらは、アルキルハロゲン化物を用いるフリーデル−クラフツアルキル化、エーテルを形成するためのクロロメチル化されたビーズへのアルキルアルコールの結合などを包含する。本発明のポリマー被覆されたビーズの好ましいアルキル化方法は、ポリマーコーティングが非多孔質粒子上で形成された後のアルキル化であるとは言え、アルキル化の代替の一方法は、アルキル化された単量体を重合して非多孔質粒子上にアルキル化されたポリマーのコーティングを形成することである。本態様において、単量体は、例えば分離変数の要件に依存して、いずれかの数の炭素原子、例えば1から100まで、1ないし50もしくは1ないし24個を有するアルキル基で置換することができる。
【0306】
ポリマーコーティングに対する一代替として、非多孔質粒子を、アルキル基、もしくはシアノ、エステルおよび他の非イオン性基を包含する他の非極性官能基で官能性化することができ、次いで完全なエンドキャッピング過程でシラノールおよび金属の相互作用を減少させることができる。非多孔質粒子のエンドキャッピングは、例えば、トリメチルクロロシランもしくはジクロロテトライソプロピルジシラザンのようなトリアルキルクロロシランもしくはテトラアルキルジクロロジシラザンと粒子を反応させることにより達成することができる。
【0307】
多数の因子が、結合反応の成功および最終的な結合された相の生成物の質に影響する。結合反応の速度および程度は、シランの反応性、溶媒および触媒の選択、時間、温度、ならびに基質に対する試薬の比に依存する。脱離基としてのCl、OH、OR、N(CH3)2、OCOCF3およびエノレートをもつ反応性有機シランが広範に使用されている。ジメチルアミン、トリフルオロアセテート、およびペンタン−2,4−ジオンのエノールエーテルが最も反応性の脱離基であるとは言え、経済性、利用可能性および熟知が、とりわけ商業的製造元の間で最も広範に使用されているクロロシランおよびアルコキシシランをもたらす。当初、反応はほぼ化学量論的であることができるが、しかし、表面被覆が最大値に近づく際に、反応は非常に遅くなる。この理由から、反応時間は長くなる傾向にあり(12〜72時間)、反応温度は中程度に高くなる傾向があり(大部分の場合で約100℃)、そして、クロロシランの場合には酸受容体触媒(例えばピリジン)が使用される。アルキルシリルエノレートおよびアルキルシリルジメチルアミンのようないくつかの試薬は、該反応を実施するための付加的な触媒、もしくは溶媒さえ必要としない。使用される最も普遍的な溶媒はトルエンおよびキシレンであるとは言え、四塩化炭素、トリクロロエタンおよびジメチルホルムアミド(DMF)のような他の溶媒が優れているとして推奨されてきた。該結合反応は不活性雰囲気中で還流することにより実施するため、溶媒はしばしば有機シランに対する良好な溶媒である、および還流で所望の反応温度に到達するそれらの能力に基づき選択される。3−シアノプロピルシロキサン結合された相を除き、ある種の極性官能基(例えばOHなど)に対するクロロシランの高い反応性は、極性の逆相の結合された相の製造のためのこれらの基の使用を予め除外する。酸性もしくは塩基性の官能基を含有するアルコキシシランは自己触媒性であり、そして、結合された相は、通常、不活性溶媒中、表面のシラノール基との縮合反応により形成されるアルコールを蒸留分離するのに十分高温でシランを還流することにより製造する。中性の極性リガンドの結合は、一般に、シリカの単層被覆を生じさせるのに十分な水の存在下に、トルエン−4−スルホン酸もしくはトリエチルアミンのような触媒の添加を必要とする。水の存在は、溶液中で重合するよりはむしろ表面シラノール基と反応する傾向がある吸着された有機シランのアルコキシ基の加水分解を加速する。表面シラノール基が物理的に吸着された有機シランにより封鎖されて、理論的に予測される最大よりも低い結合された相の密度を操作後に生じさせることが、極性の結合された相の製造で一般的な問題であるようである。結合された相の密度は、反応を第二の回反復することにより増大させることができるか、もしくは、露出されたシラノール基はエンドキャッピングにより最小限にすることができる。
【0308】
大部分の結合された相は、ケイ素に結合された単一官能性化されたリガンドを含有する有機シランから製造され、残存する基は脱離基および/もしくはメチル基であるとは言え、より高度に置換された有機シランもまた使用することができる。1,3−ジクロロテトライソプロピルジシラザンのような二官能性有機シランは、鎖の両端の表面シラノール基と反応することが可能であり、慣習的有機シランから形成される結合された相よりもより加水分解的に安定である結合された相を形成する。二歯の(bidentate)有機シランは、シリカ表面上のシラノール基の間隔により緊密に合致する反応性部位を有し、そして、双方の脱離基が同一のケイ素原子に結合されて、ジクロロシランで達成されるより大きい結合された相の被覆を提供する。アルキルジメチルシランについては、アルキル基の長さを増大させることは、トリメチルシリル結合されたリガンドのものに関して結合された相の加水分解の安定性を増大させる。メチル基の鎖長を増大させることは、結合された相の加水分解の安定性を増大させるが、しかし、立体効果により相の被覆を低下させる。シランのケイ素原子上に1もしくは2個の嵩高い基、例えばイソプロピルもしくはt−ブチルを含有する一官能性有機シランの使用が、低いpHでの使用のための結合された相の製造でより重要になる可能性がある。嵩高いアルキル基は、メチル基が提供するよりも、充填剤表面上の加水分解的に感受性のシロキサン基に対するより良好な立体保護を提供する。
【0309】
シリカ支持体の被覆およびエンドキャッピングの一般的方法は公知の技術である。しかしながら、これらの素材を使用したことのある者の一般的理解は、それらが高性能の二本鎖DNA分離に適しないことである。しかしながら、本発明のビーズは、シリカコアの徹底的な遮蔽を遂げるような被覆およびエンドキャッピング手順のより慎重な適用により形成され、生じるビーズは、一本鎖および二本鎖双方のDNAの迅速な分離を実施する能力を有し、それは例えば米国特許第5,585,236号明細書に開示されるアルキル化された非多孔質ポリマービーズを使用して達成されるものに等しいかもしくはそれより良好である。
【0310】
ビーズの表面が最小限のシラノールもしくは金属酸化物の露出を有すること、および、表面が非多孔質のままであることを確実にするために、ビーズの製造の間は注意が払われなければならない。
【0311】
本発明の重要な一局面において、本発明のビーズおよび他の媒体は、DNAを結合する可能性のある少量の金属汚染物質もしくは他の汚染物質を有することを特徴とする。本発明の好ましいビーズは、いかなる多価陽イオン汚染物質(例えば、Fe(III)、Cr(III)もしくはコロイド状金属汚染物質)も実質的に排除するよう設計された酸洗浄処理のような除染処理を包含する、製造の間の予防措置にさらされていることを特徴とする。生じるビーズが最小限の金属含有量を有することができるために、非常に純粋な金属を含有しない素材のみをビーズの製造で使用すべきである。
【0312】
実質的に金属を含まないビーズそれら自身に加え、発明者らは、MIPCの間に最適なピーク分離を達成するためには、分離カラム、およびカラム内に保持されるもしくはカラムを通って流れる全部の工程溶液が、好ましくは多価陽イオン汚染物質を実質的に含まないこともまた見出した。共通に所有される米国特許第5,772,889号;同第5,997,742号;および同第5,972,222号明細書、ならびに同時係属中の米国特許出願第09/080,547号明細書(1998年5月18日に出願された)に記述されるとおり、これは、分離カラムを多価陽イオン汚染から保護するために、カラム内に保持されるもしくはカラムを通って流れる工程溶液中に多価陽イオンを放出しない素材から作成された工程溶液接触表面を有する構成部品をカラムに進入する溶液に供給しかつそれをフィードすることことにより達成することができる。系の構成部品の工程溶液接触表面は、好ましくは、チタン、被覆ステンレス鋼、不動態化ステンレス鋼および有機ポリマーより成る群から選択される素材である。
【0313】
多価陽イオン結合剤、例えばキレート剤をMIPC分離で使用する2つの場所が存在する。一態様において、これらの結合剤は、それを移動相が通過する固体に組込むことができる。汚染物質は、分離に害を与える可能性のある系内の場所にそれらが達する前に捕捉される。これらの場合、官能基が固体マトリックスもしくは樹脂(例えば貫流カートリッジ、通常は有機ポリマー、しかしときにシリカもしくは他の素材)に結合される。該マトリックスの容量は、好ましくは約2m等量/gである。適するキレート樹脂の一例は、イミノジアセテート官能基を含有する、商標ケレックス[CHELEX]100(ダウ ケミカル カンパニー(Dow Chemical Co.))で入手可能である。
【0314】
別の態様においては、多価陽イオン結合剤を移動相に添加することができる。結合する官能基が有機化学構造中に組み込まれる。好ましい多価陽イオン結合剤は3つの要件を満たす。第一に、それは移動相中で可溶性である。第二に、金属との錯体が移動相中で可溶性である。EDTAのような多価陽イオン結合剤は、キレート剤および多価陽イオン結合剤−金属複合体の双方が、それら双方を水溶性にする電荷を含有するため、この要件を満たす。また、例えばアセトニトリルの場合、いずれの沈殿物も添加されない。水性移動相中での可溶性は、硫酸塩、カルボン酸塩もしくはヒドロキシのような共有結合されたイオン性の官能性を付加することにより高めることができる。好ましい多価陽イオン結合剤は、水、有機溶媒もしくは移動相で洗浄することによりカラムから容易に除去することができる。第三に、結合剤はクロマトグラフィー過程を妨害してはならない。
【0315】
多価陽イオン結合剤は配位化合物であることができる。好ましい配位化合物の例は、水溶性キレート剤およびクラウンエーテルを包含する。本発明で使用することができる多価陽イオン結合剤の制限しない例は、アセチルアセトン、アリザリン、アルミノン、クロラニル酸、コウジ酸、モリン、ロジゾン酸、チオナリド、チオ尿素、α−フリルジオキム、ニオキシム、サリチルアルドキシム、ジメチルグリオキシム、α−フリルジオキシム、クペロン、α−ニトロソ−β−ナフトール、ニトロソ−R−塩、ジフェニルチオカルバゾン、ジフェニルカルバゾン、エリオクロムブラックT、PAN、SPADNS、グリオキサルビス(2−ヒドロキシアニル)、ムレキシド、α−ベンゾインオキシム、マンデル酸、アントラニル酸、エチレンジアミン、グリシン、トリアミノトリエチルアミン、チオナリド、トリエチレンテトラミン、EDTA、金属フタレイン、アルソン酸、α,α’−ビピリジン、4−ヒドロキシベンゾチアゾール、8−ヒドロキシキナルジン、8−ヒドロキシキノリン、1,10−フェナントロリン、ピコリン酸、キナルジン酸、α,α’,α’’−ターピリジル、9−メチル−2,3,7−トリヒドロキシ−6−フルオロン、ピロカテコール、サリチル酸、チロン、4−クロロ−1,2−ジメルカプトベンゼン、ジチオール、メルカプトベンゾチアゾール、ルベアン酸、シュウ酸、ジエチルジチオカルバルバメートナトリウムおよびジベンジルジチオカルバメート亜鉛を包含する。これらおよび他の例は、Perrinにより、Organic Complexing Reagents:Structure,Behavior,and Application to Inorganic Analysis、ロバート E.クリーガー パブリッシング カンパニー(Robert E.Krieger Publishing Co.)(1964)に記述される。本発明において好ましい多価陽イオン結合剤はEDTAである。
【0316】
ポリヌクレオチドの高分離度のクロマトグラフィー分離を達成するために、クロマトグラフィーカラムを固定相のポリマービーズできつく充填することが一般に必要である。十分な高分離度の分離を得るために、カラム充填剤でのカラムのいずれかの既知の充填方法を本発明で使用することができる。典型的には、ポリマービーズの密度に等しいかもしくはそれより小さい密度を有する溶媒を使用して、ポリマービーズのスラリーを調製する。その後、カラムをポリマービーズのスラリーで満たし、そして振動もしくは攪拌してカラム中でのポリマービーズの充填密度を向上させる。充填密度を向上させるのに、機械的振動もしくは超音波処理を典型的に使用する。
【0317】
例えば、50×直径4.6mmのカラムを充填するために、2.0グラムのビーズを、超音波処理の助けを借りて10mLのメタノールに懸濁することができる。その後、該懸濁物を、8,000psiの圧で50mLのメタノールを使用してカラムに充填する。これは充填された床の密度を向上させる。
【0318】
本発明の分離方法は、一般に、DNAおよびRNAの一本鎖および二本鎖のポリヌクレオチドのクロマトグラフィー分離に応用可能である。ポリヌクレオチドの混合物を含有するサンプルは、ポリヌクレオチドの全合成、制限エンドヌクレレアーゼまたは他の酵素もしくは化学物質でのDNAもしくはRNAの切断、ならびにポリメラーゼ連鎖反応技術を使用して増殖および増幅された核酸サンプルから生じさせることができる。
【0319】
本発明の方法は、約1500ないし2000塩基対までを有する二本鎖ポリヌクレオチドを分離するのに使用することができる。多くの場合、該方法は、600塩基もしくは塩基対までを有する、または5ないし80塩基もしくは塩基対までを有するポリヌクレオチドを分離するのに使用する。
【0320】
好ましい一態様において、該分離はマッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー(MIPC)による。本発明の非多孔質ビーズは、DNA分離を遂げるための対イオン剤および溶媒の勾配とともに機能することができる逆相素材として使用する。MIPCにおいて、ポリヌクレオチドが対イオンと対にされ、そしてその後、本発明の非多孔質ビーズを使用する逆相クロマトグラフィーにかけられる。
【0321】
MIPCでの使用に適するいくつかの型の対イオンが存在する。これらは、プロトン供与されて正の対電荷(counter charge)を形成することができるモノ、ジもしくはトリアルキルアミン、または既に正の対電荷を含有する四級のアルキル置換アミンを包含する。アルキル置換は、均一(例えば、酢酸トリエチルアンモニウムもしくは酢酸テトラプロピルアンモニウム)または混合(例えば、酢酸プロピルジエチルアンモニウム)であってよい。アルキル基の大きさは、とりわけ1個の置換アルキル基のみが大きくかつ他者が小さい場合は、小さくても(メチル)もしくは大きくても(30個までの炭素)よい。例えば、酢酸オクチルジメチルアンモニウムが適する対イオン剤である。好ましい対イオン剤は、エチル、プロピルもしくはブチルの大きさ範囲からのアルキル基を含有するものである。
【0322】
アルキル基の目的は、ポリ核酸が分離媒体の非極性表面と相互作用することができるようにマッチトイオン過程によりポリ核酸に非極性の特徴を与えることである。対イオン−DNA対の非極性の程度に対する要件は、分離媒体の極性、分離に必要とされる溶媒条件、粒子径、および分離されているフラグメントの型に依存する。例えば、分離媒体の極性が増大される場合には、表面の極性に合致させかつ対イオン−DNA対の相互作用を増大させるように対イオン剤の極性を変えなくてはならないかもしれない。酢酸トリエチルアンモニウムが好ましいとは言え、余分の非極性の特徴が必要とされるかもしくは望ましい場合は、テトラプロピルもしくはテトラブチルアンモニウム塩のような四級アンモニウム試薬を使用することができる。一般に、アルキル基の極性が増大される際に、大きさ特異的な分離、配列に依存しない分離がより可能になる。四級の対イオン試薬は揮発性でなく、フラグメントの収集をより困難にする。
【0323】
いくつかの場合には、分離を実施するのに使用される有機溶媒の濃度の範囲を増大させることが望ましいかもしれない。例えば、対イオン剤上のアルキルの長さを増大させることは、対イオン−DNA対の非極性を増大させることができ、移動相有機溶媒の濃度を増大させるか、もしくは有機溶媒の型の強さを増大させる(例えば、アセトニトリルはポリ核酸を溶出するためにメタノールより約2倍より効果的である)かのいずれかの必要性をもたらす。カラムからフラグメントを溶出させるのに必要とされる有機溶媒の濃度と、フラグメントの長さとの間に、正の相関が存在する。しかしながら、高有機溶媒濃度ではポリヌクレオチドが沈殿する可能性がある。沈殿を回避するために、強い有機溶媒もしくはより小さい対イオンアルキル基を使用することができる。対イオン試薬のアルキル基はまた、ハロゲン化物、ニトロ基などで極性を和らげるように置換することもできる。
【0324】
移動相は、好ましくは対イオン剤を含有する。典型的な対イオン剤は、低級アルキル一級、二級および低級の三級アミンのような有機もしくは無機酸のトリアルキルアンモニウム塩、低級トリアルキアンモニウム塩、ならびに低級四級アルキアルモニウム塩を包含する。低級アルキルは、メチル、エチル、n−ブチル、i−ブチル、t−ブチル、イソアミル、n−ペンチルおよびイソペンチルにより例示されるような1ないし6個の炭素原子のアルキル基を指す。対イオン剤の例は、酢酸オクチルアンモニウム、酢酸オクタジメチルアンモニウム、酢酸デシルアンモニウム、酢酸オクタデシルアンモニウム、酢酸ピリジニウムアンモニウム、酢酸シクロヘキシルアンモニウム、酢酸ジエチルアンモニウム、酢酸プロピルエチルアンモニウム、酢酸プロピルジエチルアンモニウム、酢酸ブチルエチルアンモニウム、酢酸メチルヘキシルアンモニウム、酢酸テトラメチルアンモニウム、酢酸テトラエチルアンモニウム、酢酸テトラプロピルアンモニウム、酢酸テトラブチルアンモニウム、酢酸ジメチルジエチルアンモニウム、酢酸トリエチルアンモニウム、酢酸トリプロピルアンモニウム、酢酸トリブチルアンモニウム、酢酸テトラプロピルアンモニウムおよび酢酸テトラブチルアンモニウムを包含する。上の例中の陰イオンは酢酸であるとは言え、炭酸、リン酸、硫酸、硝酸、プロピオン酸、ギ酸、塩化物および臭化物を包含する他の陰イオン、もしくは陽イオンおよび陰イオンのいかなる組み合わせもまた使用してよい。これらおよび他の作用物質は、GjerdeらによりIon Chromatography、第2版、ドクター アルフレッド ヒューティッヒ フェアラーク ハイデルベルク(Dr.Alfred Huthig Verlag Heidelberg)(1987)に記述される。揮発性である対イオン剤が本発明の方法での使用に好ましく、酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA)およびトリエチルアンモニウムヘキサフルオロイソプロピルアルコールが最も好ましい。
【0325】
MIPCは、ホモ二重鎖からヘテロ二重鎖を分離することにより二本鎖DNA中の突然変異の検出に成功裏に適用されてきた。こうした分離は、完全に相補的なホモ二重鎖DNAフラグメントに比較して、塩基対不適正の部位でヘテロ二重鎖を変性させるのに必要とされるより低い温度に依存する。MIPCは、ヘテロ二重鎖を部分的に変性させるのに十分である温度で実施される場合に、本明細書で変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー(DMIPC)と称される。DMIPCは、典型的には52℃と70℃との間の温度で実施する。DMIPCを実施するための最適温度は54℃ないし59℃である。
実施例1
MIPCを使用する突然変異の検出のための普遍的勾配
以下の普遍的勾配は、分析の速度について最適化されておらず、そして、MIPCに敏感に反応する大きさ範囲内のいかなるサンプルの突然変異の検出にも使用することができる:
【0326】
【表2】
【0327】
移動相溶液は、A=0.1M TEAA、pH7、B=0.1M TEAAおよび25%アセトニトリルを生じるように、濃酢酸トリエチルアンモニウム(100mL トランスゲノミック(Transgenomic)部品番号553301)から調製する。分離は、以下の条件、すなわち、カラム:アルキル化ポリ(スチレン−ジビニルベンゼン)ビーズ(DNASEP(商標)、トランスゲノミック インク(Transgenomic,Inc.))を含有する50×直径4.6mm;流速は0.9mL/分でありかつ260nmでのUVによる検出下で、WAVE(商標)DNAフラグメント分析系(トランスゲノミック インク(Transgenoic,Inc.)、カリフォルニア州サンノゼ)を使用して得られる。
実施例2
移動相対ヌクレオチド塩基対長さの参照グラフの準備
80、102、174、257、267、298、434、458および587の塩基対長さを有するDNAフラグメントを含有する、標準のpUC18 HaeIII制限酵素消化物(トランスゲノミック インク(Transgenomic,Inc.)、カリフォルニア州サンノゼから入手可能な部品番号440582)を、非変性温度(50℃)でMIPCカラムに適用した。カラムは普遍的勾配を使用して溶出した。分離(示されない)は、以下の条件、すなわち、カラム:アルキル化ポリ(スチレン−ジビニルベンゼン)ビーズ(DNASEP(商標)、トランスゲノミック インク(Transgenomic,Inc.))を含有する50×直径4.6mm下で、WAVE(商標)DNAフラグメント分析系(トランスゲノミック インク(Transgenoic,Inc.)、カリフォルニア州サンノゼ)を使用して得;UV検出は260nmで実施した。各フラグメントのbp長さおよび保持時間(Rt)をコンピュータインターフェース(示されない)で入力した。好ましいインターフェースは、Rt対bpおよび/もしくは%B対bpのグラフィック表示を包含するカラム較正ウインドウである。図33に示される参照曲線590を、本発明のソフトウェア内の統計学的曲線あてはめルーチンを使用して、観察されたデータを等式(i)にあてはめることにより得た。
実施例3
死時間の決定
実施例2に記述されたところのカラムおよび装置を使用して、示されるような勾配方形波であったメソッドを入力した:
【0328】
【表3】
【0329】
次に、本勾配を使用して0μLの注入を実施した。スペクトルのバックグラウンドの上昇が約4.8分に観察された(示されない)。死時間は、この観察された上昇時間から2を差し引くことにより得た。死時間についての約2.8分という値が、ディジタルメモリに保存された。
実施例4
温度依存性のDMIPC分離過程の記述
本実施例は図45を指す(51°ないし61℃の温度範囲にわたるヘテロ二重鎖の分離)。
【0330】
位置168にAからGの突然変異をもつヒトY染色体の遺伝子座DYS271からの209塩基対のフラグメントを含有する突然変異標準(トランスゲノミック(Transgenomic)からの部品番号440582、およびSeielstadら、Hum.Mol.Genet.3:2159(1994)により記述されるような)を、製造供給元により推奨されるとおりハイブリダイズし、そしてサンプルを51℃でMIPCカラム(50mm×直径4.6mm)に注入した。カラムは、7分にわたる0.1M TEAA中アセトニトリルの勾配を用いて0.9mL/分で溶出した。クロマトグラフィーは、UV検出器を使用して260nmをモニターした。混合物中に存在するヘテロ二重鎖は51℃で変性されず;従って単一ピークが観察された。
【0331】
図45にみられるとおり、該サンプルの注入およびクロマトグラフィーを、温度の1℃の増大する増加で反復した。ヘテロ二重鎖の潜在的存在を示すショルダーが、53℃で主ピークの小さい保持時間側に観察された。54℃で3本のピークがみられた。そして、55°−58°で4本のピークがみられ、突然変異の決定的な存在を示した。2本のより小さい保持時間のピークは2種のヘテロ二重鎖であり、また、より大きい保持時間のピークはホモ二重鎖であった。
【0332】
本発明は自動化された系および方法を提供し、これらは使用するのが簡単であり、そしてMIPCによるDNAフラグメントの分離における最適な移動相濃度および温度を決定するための経験的方法の使用を最小限にする。
【0333】
前述は本発明の特定の態様を提示した一方、これらの態様は例としてのみ提示されたことが理解されるべきである。他者は、前述と異なるとは言え本明細書に記述かつ特許請求されるところの本発明の技術思想および範囲から離れない変形物を認めかつ実施することができることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図1】
発明にかかる、溶出溶媒の勾配を確立するための弁および弁制御を使用する単一カラムのMIPC系の図解である。
【図2】
発明にかかる、溶出溶媒の勾配を確立するためのポンプ系の部分図である。
【図3】
発明にかかる、MIPC系で使用されるオートサンプラーサブシステムの図解である。
【図4】
発明にかかる、MIPC系で使用される注入弁の図解である。
【図5】
発明にかかる、充填されたループの負荷位置の注入弁の図解である。
【図6】
発明にかかる、充填されたループの注入位置の注入弁の図解である。
【図7】
発明にかかる、部分的ループ負荷位置の注入弁の図解である。
【図8】
発明にかかる、部分的ループ注入位置の注入弁の図解である。
【図9】
発明にかかる、本発明の改良されたHPLC DNA分析装置カラムオーブンの分離区画の前面図である。
【図10】
発明にかかる、図9に示されるHPLC DNA分析装置カラムオーブンの平面図である。
【図11】
発明にかかる、本発明の小型のカラムヒーターの態様の端部図である。
【図12】
発明にかかる、図11の線A―Aに沿って採られた断面図である。
【図13】
発明にかかる、本発明のペルティエ型のヒーター/冷却器の態様の図解である。
【図14】
発明にかかる、フラグメントコレクタの透視図である。
【図15】
発明にかかる、本発明のフラグメントコレクタの前面図である。
【図16】
発明にかかる、図15に示されるフラグメントコレクタの端部図である。
【図17】
発明にかかる、フラグメント分注器のX軸の動きについてのウォーム歯車装置駆動アセンブリの詳細を示すために前面パネルが除去された、図15のフラグメントコレクタの部分的前面図である。
【図18】
発明にかかる、フラグメント分注器のY軸の動きについての該駆動アセンブリのモーターおよびウォーム歯車装置アセンブリの部分図である。
【図19】
発明にかかる、フラグメント分注器のY軸の動きについての該駆動アセンブリの端部図である。
【図20】
発明にかかる、標準的な96穴マルチウェルプレートの平面図である。
【図21】
発明にかかる、本発明の空気一吹き分注器の一態様の図解である。
【図22】
発明にかかる、図21の空気一吹き分注器の態様の拡大断面図である。
【図23】
発明にかかる、分注器先端および図22のマルチウェルプレートの提示のウェルの拡大断面部分図である。
【図24】
発明にかかる、出口ライン中の流量制限を伴う、本発明の分注器先端の代替の一態様の断面図である。
【図25】
発明にかかる、検出器、中央制御部および空気一吹き液滴大きさ制御系の組み合わせの図解である。
【図26】
発明にかかる、検出器、中央制御部および流れ制限制御系の組み合わせの図解である。
【図27】
発明にかかる、時間間隔、閾値および傾きに基づく画分収集の基準を具体的に説明するクロマトグラムの表示である。
【図28】
発明にかかる、その各構成部品を伴う制御モジュールと一緒の図1のMIPC系の図解である。
【図29】
発明にかかる、MIPC系のコンピュータ化された制御プロセスおよび該プロセスの各部分に関連するモジュールの一態様の図解である。
【図30】
発明にかかる、MIPC過程における核酸フラグメントの基礎的分離の間の溶媒濃度のグラフ表示である。
【図31】
発明にかかる、本発明の分離方法の一態様を具体的に説明する流れ図である。
【図32】
発明にかかる、MIPC系のコンピュータ化された制御プロセスおよび該プロセスの各部分に関連するモジュールの別の態様の図解である。
【図33】
発明にかかる、既知の塩基対長さのDNAフラグメントを含有する標準混合物についての溶液Bのパーセント対塩基対長さを示す参照図である。
【図34】
発明にかかる、移動相の勾配プロフィルを見るためのグラフィカル・ユーザー・インターフェースの一態様を具体的に説明する。
【図35】
発明にかかる、pBR322 HaeIII消化物からのDNAフラグメントについてのRt対%Bのプロットを示す。
【図36】
発明にかかる、pBR322 HaeIII消化物からのDNAフラグメントについてのP対%Bのプロットを示す。
【図37】
発明にかかる、P対%Bの計算されたプロットを示す。
【図38】
発明にかかる、サンプルテーブルを含んで成るグラフィカル・ユーザー・インターフェースの一態様を具体的に説明する。
【図39】
発明にかかる、MIPCによりある範囲の塩基対長さを有するDNAフラグメントを分離するために使用されるべき移動相の勾配を計算するためのソフトウェアの一態様のオペレーションを示す流れ図である。
【図40】
発明にかかる、MIPCによりある範囲の塩基対長さを有するDNAフラグメントを分離するために使用されるべき移動相の勾配を計算するためのソフトウェアの別の態様のオペレーションを示す流れ図である。
【図41】
発明にかかる、DMIPCによる既知の塩基対長さを有するDNAヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖フラグメントを分離するのに使用されるべき移動相の勾配を計算するためのソフトウェアの一態様のオペレーションを示す流れ図である。
【図42】
発明にかかる、DMIPCによる既知の塩基対長さを有するDNAヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖フラグメントを分離するのに使用されるべき移動相の勾配を計算するためのソフトウェアの一態様のオペレーションを示す流れ図である。
【図43】
発明にかかる、DMIPCによる既知の塩基対長さを有するDNAヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖フラグメントを分離するのに使用されるべき移動相のイソクラチック勾配を計算するためのソフトウェアの一態様のオペレーションを示す流れ図である。
【図44】
発明にかかる、ホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖を形成するためのハイブリダイゼーションの図解を示す。
【図45】
発明にかかる、ホモおよびヘテロ二重鎖の温度依存性の分離を具体的に説明する。
【図46】
発明にかかる、図45からのホモおよびヘテロ二重鎖のピークの温度での保持時間の変化を示す。
【図47】
発明にかかる、計算された融解温度対経験的に決定される融解温度のグラフである。
【図48】
発明にかかる、計算された融解温度対予測される融解温度のグラフである。
【図49】
発明にかかる、突然変異の検出での使用のためのソフトウェアのインターフェース画面の一態様である。
【図50】
発明にかかる、突然変異の検出での使用のためのソフトウェアのインターフェース画面の第二の態様である。
【図51】
発明にかかる、図50のインターフェース画面からのフィールドの一例である。
【図52】
発明にかかる、突然変異の検出での使用のためのソフトウェアのインターフェース画面の第三の態様である。
【図53】
発明にかかる、DNA分離係数の決定の図解である。
【図54】
発明にかかる、シリカコアおよびエンドキャッピング遮蔽物を伴う逆相ビーズの代表の断面図である。
【図55】
発明にかかる、シリカコアおよびポリマー遮蔽物を伴う逆相ビーズの代表の断面図である。
Claims (40)
- 移動相の溶媒溶液および水性成分の流量を制御するための移動相流量制御手段(該流量制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し);MIPC分離カラム;移動相を移動相流量制御手段からMIPC分離カラムに向かわせるための導管手段;ならびにその中に固有のソフトウェア移動相流量制御モジュールを有する移動相流量制御手段と通信するコンピュータ;
a)分離されるべきDNAフラグメントの混合物中の塩基対長さの数値の範囲を受領すること;
b)DNAフラグメントの混合物からの選択されたフラグメントの分離を遂げることができる溶媒濃度および対応する溶媒の勾配の範囲を計算すること;
c)溶媒濃度および溶媒の勾配の前記範囲を移動相流量制御モジュールに提供すること;ならびに
d)分離を実施すること(ここで、移動相流量制御モジュールが、選択されたフラグメントの分離を遂げるのに必要とされる勾配および溶媒濃度を果たすように、移動相流量制御手段の設定を制御する)
のコンピュータ化された段階、を含んで成る、高速液体クロマトグラフィー系を用いるDNAフラグメントの混合物の塩基対長さに基づく分離を遂げるための方法において。 - 移動相流量制御手段が、それぞれ流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する自動開放制御を伴う一組の流量制御弁である、請求項1記載の方法。
- 移動相流量制御手段が一組のポンプであり、その流量設定が流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する、請求項1記載の方法。
- フラグメントの選択された塩基対長さに基づく分離が、DNAフラグメントの混合物のフラグメントの全部の分離である、請求項1記載の方法。
- フラグメントの選択された塩基対長さに基づく分離が、DNAフラグメントの混合物の1種もしくはそれ以上のフラグメントの選択である、請求項1記載の方法。
- 勾配がイソクラチック勾配を包含する、請求項1記載の方法。
- 溶媒濃度が、最小のフラグメントについて計算された%Bの値より下で開始するよう計算され、かつ、最大のフラグメントについて計算された%Bの値より上で終了するよう計算され、ここで、%B、ここで、前記%Bは有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり、ここで、前記%Bは、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数を有する一次、双曲線、二次もしくは三次の式により計算される、請求項1記載の方法。
- 移動相の溶媒溶液および水性成分の流量を制御するための移動相流量制御手段(該流量制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し);MIPC分離カラム;移動相を移動相流量制御手段からMIPC分離カラムに向かわせるための導管手段;ならびに移動相流量制御手段と通信するコンピュータ;該コンピュータおよび移動相流量制御手段と作業連合にあるソフトウェア移動相流量制御モジュール(ここで、該移動相流量制御手段は、それぞれが流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する自動開放制御を伴う一組の流量制御弁であるか、もしくは、移動相制御手段は一組のポンプであって、その流量設定が流量制御モジュールからの制御コマンドに応答し、前記コンピュータは溶媒の勾配の開始および終了溶媒濃度をコンピュータ計算するための溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアを包含する)を含んで成る、コンピュータ化された制御手段を包含する高速液体クロマトグラフィー系。
- 溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアが、DNAフラグメントの混合物中の分離されるべきフラグメントの塩基対長さの範囲を受領しかつ最小のフラグメントについて計算された%Bの値より下で開始する溶媒濃度を計算するためのソフトウェア手段を含んで成り、かつ、最大のフラグメントについて計算された%Bの値より上で終了するよう計算され、ここで、前記%Bは有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり、ここで、前記%Bは、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数を有する一次、双曲線、二次もしくは三次の式により計算される、請求項10記載の高速液体クロマトグラフィー系。
- 溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアが、DNAフラグメントの混合物中の分離されるべきフラグメントの塩基対長さの範囲を受領し、かつ、分離されるべき最小のフラグメントについて計算された%Bの値より下で開始しかつ分離されるべき最大のフラグメントについて計算された%Bの値より上で終了する溶媒濃度を計算するためのソフトウェア手段を含んで成り、ここで、%Bが、以下の式:
%Bは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり;
p1、p2およびp3は、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される、請求項10記載の高速液体クロマトグラフィー系。 - 溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアが、DNAフラグメントの混合物中の分離されるべきフラグメントの塩基対長さの範囲を受領し、かつ、分離されるべき最小のフラグメントについて計算された%Bの値より下で開始しかつ分離されるべき最大のフラグメントについて計算された%Bの値より上で終了する溶媒濃度を計算するためのソフトウェア手段を含んで成り、ここで、%Bが、以下の式:
sは勾配の傾きであり;
d、void、p4、p5、p6、p7およびp8は、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である、
により計算される、請求項10記載の高速液体クロマトグラフィー系。 - DNAフラグメントの混合物から分離されるべき塩基対長さの範囲を受領するための手段、MIPCにより分離されるべき塩基対長さの範囲を分離するのに必要とされる溶媒濃度を計算するための手段、ならびにMIPCにより分離されるべき塩基対長さの範囲を分離するのに使用されるべき溶媒の勾配を選択するための手段(ここで、前記溶媒濃度を計算するための手段は、最小のフラグメントについて計算された%Bの値より下で開始する溶媒濃度を計算するための手段を包含しかつ最大のフラグメントについて計算された%Bの値より上で終了するよう計算され、ここで、前記%Bは、有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり、ここで、前記%Bは、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数を有する一次、双曲線、二次もしくは三次の式により計算される)を含んで成るソフトウェアプログラム。
- マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離カラム;カラムに進入する移動相の温度を制御するためのオーブン温度制御手段(該オーブン温度制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し);およびその中に固有のオーブン温度制御ソフトウェアモジュールを有するオーブン温度制御手段と通信するコンピュータ、を含んで成る高速液体クロマトグラフィー系を用いる混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子の分離を遂げる方法において:
約50℃ないし約75℃の温度範囲の一連の変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離において、変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーにより混合物を分析すること(各連続する分離は、突然変異分離プロフィルが観察されるかもしくは突然変異分離温度範囲のいずれかの突然変異分離プロフィルの非存在が観察されるまで、先行する分離より高温を有し、ここで、突然変異分離プロフィルは突然変異の存在を同定し、かつ、突然変異分離プロフィルの非存在はサンプル中の突然変異の非存在を示し;また、ここで、オーブン温度制御モジュールは、連続する分離の間の温度を果たすオーブン温度制御手段の設定を制御する)
のコンピュータ化された段階を含んで成る方法。 - マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離カラム;カラムに進入する移動相の温度を制御するためのオーブン温度制御手段(該オーブン温度制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し);およびその中に固有のオーブン温度制御ソフトウェアモジュールを有するオーブン温度制御手段と通信するコンピュータ、を含んで成る高速液体クロマトグラフィー系を用いる混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子の分離を遂げる方法において:
50℃ないし約75℃の温度範囲の一連の変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離において、変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーにより混合物を分析すること(各連続する分離は、突然変異分離プロフィルが観察されるかもしくは突然変異分離温度範囲のいずれかの突然変異分離プロフィルの非存在が観察されるまで、先行する分離より低温を有し、ここで、突然変異分離プロフィルは突然変異の存在を同定し、かつ、突然変異分離プロフィルの非存在はサンプル中の突然変異の非存在を示し;また、ここで、オーブン温度制御モジュールは、連続する分離の間の温度を果たすオーブン温度制御手段の設定を制御する)
のコンピュータ化された段階を含んで成る方法。 - 前記マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離カラムが入口端を有し、かつ、オーブン温度制御手段が:循環空気温度制御系を有する空気浴オーブン;入口端および出口端を有するある長さの毛細管(該毛細管の出口端は分離カラムの入口端と連結され、また、毛細管の入口端は工程液を受領するための手段を含んで成り、該管は6から400cmまでの完全に伸長された長さを有し;そして、分離カラムおよび毛細管のコイルが空気浴オーブン中に囲まれかつその中の空気に曝露され、前記温度制御系はオーブン温度制御モジュールからの制御コマンドに応答する)を含んで成る、請求項17記載の方法。
- オーブン温度制御手段が:第一の熱伝達表面、分離カラム差込口、およびキャピラリーコイル差込口を有する熱伝導ブロック;その内壁と熱伝導の関係で分離カラム差込口内に配置される分離カラム;ならびに、キャピラリーコイル差込口中に配置される毛細管のコイル(該コイルの外側先端はキャピラリーコイル差込口の内壁と熱伝導の関係にあり、前記温度制御系はオーブン温度制御モジュールからの制御コマンドに応答する)を含んで成る、請求項17記載の方法。
- オーブン温度制御手段が、ペルティエ型の加熱および冷却装置を含んで成り、該ペルティエ型の加熱および冷却装置が前記第一の熱伝達表面と熱伝導の関係にある、請求項20記載の方法。
- マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離カラム;分離カラムに進入する移動相の温度を制御するためのオーブン温度制御手段(該オーブン温度制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し);およびその中に固有のオーブン温度制御ソフトウェアモジュールを有するオーブン温度制御手段と通信するコンピュータ、を含んで成る高速液体クロマトグラフィー系を用いる混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子の分離を遂げる方法において:
a)予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度を受領すること;
b)DNA分子の前記混合物を、前記予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度に加熱すること;および
c)予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度で、変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーを用いて段階(b)の生成物を分析して、その中のいかなるヘテロ突然変異体部位の分離された成分の存在も同定すること
のコンピュータ化された段階を含んで成る方法。 - 予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度が:
a)計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度を得るための計算段階;
b)予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度を得るための予測段階
の段階により得られ;
ここで、計算段階は、第一の数学的モデルに従って、前記計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度を計算することを含んで成り;ここで、予測段階は、第二の数学的モデルに従って、前記計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度を補正することを含んで成り;ここで、第二の数学的モデルは、計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度との経験的に決定されたヘテロ突然変異体部位分離温度の比較に基づく、請求項22記載の方法。 - 予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度が、以下の式:T(hsst)=X+m・T(w)(ここで、T(hsst)は予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度であり、T(w)は、野性型二本鎖DNAの変性された状態と非変性状態との間に選択された平衡が存在する、ソフトウェアにより計算されたかもしくは実験的に決定された温度であり、Xは変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーの検出係数であり、そしてmは0と2との間で選択される重み係数である)により計算される、請求項22記載の方法。
- マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離カラム;分離カラムに進入する移動相の温度を制御するためのオーブン温度制御手段(該温度制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し);移動相MIPC分離カラムを指図するための導管手段;オーブン温度制御手段と通信するコンピュータ;コンピュータおよびオーブン温度制御手段と作業連合にあるオーブン温度制御ソフトウェアモジュール(前記コンピュータは、混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子の分離のためのヘテロ突然変異体部位分離温度をコンピュータ計算するための温度コンピュータ計算ソフトウェアを包含する)を含んで成る、コンピュータ化された制御手段を包含する変性高速液体クロマトグラフィー系。
- 前記マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離カラムが入口端を有し、そして、オーブン温度制御手段が:循環空気温度制御系を有する空気浴オーブン;入口端および出口端を有するある長さの毛細管(該毛細管の出口端は分離カラムの入口端と連結され、また、毛細管の入口端は工程液を受領するための手段を含んで成り、該管は6から400cmまでの完全に伸長された長さを有し;そして、分離カラムおよび毛細管のコイルが空気浴オーブン中に囲まれかつその中の空気に曝露され、前記温度制御系はオーブン温度制御モジュールからの制御コマンドに応答する)を含んで成る、請求項25記載の系。
- オーブン温度制御手段が:第一の熱伝達表面、分離カラム差込口、およびキャピラリーコイル差込口を有する熱伝導ブロック;その内壁と熱伝導の関係で分離カラム差込口内に配置される分離カラム;ならびに、キャピラリーコイル差込口中に配置される毛細管のコイル(該コイルの外側先端はキャピラリーコイル差込口の内壁と熱伝導の関係にあり、前記温度制御系はオーブン温度制御モジュールからの制御コマンドに応答する)を含んで成る、請求項25記載の系。
- オーブン温度制御手段が、ペルティエ型の加熱および冷却装置を含んで成り、該ペルティエ型の加熱および冷却装置が前記第一の熱伝達表面と熱伝導の関係にある、請求項27記載の方法。
- 分離されるべき混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子の塩基対長さを受領するための手段、変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーによる前記等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子の分離に必要とされるヘテロ突然変異体部位分離温度を計算するための手段(ここで、前記ヘテロ突然変異体部位分離温度が、以下の式:T(hsst)=X+m・T(w)(ここで、T(hsst)はヘテロ突然変異体部位分離温度であり、T(w)は、野性型二本鎖DNAの変性された状態と非変性状態との間に選択された平衡が存在する、ソフトウェアにより計算されたかもしくは実験的に決定された温度であり、Xは変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーの検出係数であり、そしてmは0と2との間で選択される重み係数である)により計算される)、を含んで成るソフトウェアプログラム。
- 移動相の溶媒溶液および水性成分の流量を制御するための移動相流量制御手段(該流量制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し);MIPC分離カラム;移動相を移動相流量制御手段からMIPC分離カラムに向かわせるための導管手段;ならびにその中に固有のソフトウェア移動相流量制御モジュールを有する移動相流量制御手段と通信するコンピュータ;
a)混合物中の変性されないホモ二重鎖もしくはヘテロ二重鎖分子の長さを有するDNA分子の塩基対長さの数値を受領すること;
b)非変性条件下で前記カラムからの前記塩基対長さを有する分子の溶出を遂げることができる溶媒濃度を計算すること;
c)前記ヘテロ二重鎖を部分的に変性させるのに有効な条件下で前記分離を遂げることができる溶媒濃度および対応する溶媒の勾配の範囲を計算すること;
d)移動相流量制御モジュールに、溶媒濃度および溶媒の勾配の前記範囲を提供すること;ならびに
e)分離を実施すること(ここで、移動相流量制御モジュールが、選択されたフラグメントの分離を遂げるのに必要とされる勾配および溶媒濃度を果たすように移動相流量制御手段の設定を制御する)
のコンピュータ化された段階、を含んで成る高速液体クロマトグラフィー系を用いて混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子の分離を遂げる方法において。 - 移動相流量制御手段が、それぞれが流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する自動開放制御を伴う一組の流量制御弁である、請求項30記載の方法。
- 移動相流量制御手段が一組のポンプであり、その流量設定が流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する、請求項30記載の方法。
- 勾配がイソクラチック勾配を包含する、請求項30記載の方法。
- 溶媒濃度が、前記塩基対長さを有するDNA分子について計算された%Bの値より下で開始するよう計算され、かつ、前記塩基対長さのDNA分子について計算された%Bの値より上で終了するよう計算され、ここで、前記%Bは有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり、ここで、前記%Bは、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数を有する一次、双曲線、二次もしくは三次の式により計算される、請求項30記載の方法。
- 移動相の溶媒溶液および水性成分の流量を制御するための移動相流量制御手段(該流量制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し);MIPC分離カラム;移動相を移動相流量制御手段からMIPC分離カラムに向かわせるための導管手段;ならびに移動相流量制御手段と通信するコンピュータ;該コンピュータおよび移動相流量制御手段と作業連合にあるソフトウェア移動相流量制御モジュール(ここで、該移動相流量制御手段は、それぞれが流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する自動開放制御を伴う一組の流量制御弁であるか、もしくは、移動相制御手段は一組のポンプであって、その流量設定が流量制御モジュールからの制御コマンドに応答し、前記コンピュータは、混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子の分離のための溶媒の勾配の開始および終了溶媒濃度をコンピュータ計算するための溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアを包含する)を含んで成る、コンピュータ化された制御手段を包含する変性高速液体クロマトグラフィー系。
- 溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアが、前記混合物中のホモ二重鎖もしくはヘテロ二重鎖分子の塩基対長さを受領し、かつ、前記塩基対長さを有するDNA分子について計算された%Bの値より下で開始する溶媒濃度を計算するためのソフトウェア手段を含んで成り、かつ、前記塩基対長さのDNA分子について計算された%Bの値より上で終了するよう計算され、ここで、前記%Bは有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり、ここで、前記%Bは、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数を有する一次、双曲線、二次もしくは三次の式により計算される、請求項35記載の高速液体クロマトグラフィー系。
- 分離されるべき混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子の塩基対長さを受領するための手段、MIPCにより前記塩基対長さを有するDNA分子を溶出するのに必要とされる溶媒濃度を計算するための手段、ならびに部分的変性条件下で前記ヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子を分離するのに使用されるべき溶媒の勾配を選択するための手段(ここで、前記溶媒濃度を計算するための手段が、前記塩基対長さを有するDNA分子について計算された%Bの値より下で開始する溶媒濃度を計算するための手段を包含し、かつ、前記塩基対長さのDNA分子について計算された%Bの値より上で終了するよう計算され、ここで、前記%Bは有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり、ここで、前記%Bが、DNAフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数を有する一次、双曲線、二次もしくは三次の式により計算される)を含んで成るソフトウェアプログラム。
- マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離カラム;移動相の溶媒溶液および水性成分の流量を制御するための移動相流量制御手段(該流量制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し);移動相を移動相流量制御手段からMIPC分離カラムに向かわせるための導管手段;分離カラムに進入する移動相の温度を制御するためのオーブン温度制御手段(該オーブン温度制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し);ならびにその中に固有のソフトウェア移動相流量制御モジュールを有する移動相流量制御手段と通信するコンピュータ(オーブン温度制御手段と通信する前記コンピュータは、その中に固有のオーブン温度制御ソフトウェアモジュールを有し)を含んで成る高速液体クロマトグラフィー系を用いて混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖DNA分子の分離を遂げる方法において:
a)混合物中のホモ二重鎖もしくはヘテロ二重鎖分子の長さを有するDNA分子の塩基対長さの数値を受領すること;
b)非変性条件下で前記カラムからの前記塩基対長さを有する分子の溶出を遂げることができる溶媒濃度を計算すること;
c)前記塩基対長さを有するDNA分子について計算された%Bの値より下で開始する溶媒濃度を計算すること、かつ、前記塩基対長さのDNA分子について計算された%Bの値より上で終了するよう計算され、ここで、前記%Bは有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり;
d)移動相流量制御モジュールに、溶媒濃度および溶媒の勾配の前記範囲を提供すること;
e)予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度を受領すること;DNA分子の前記混合物を前記予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度に加熱すること;ならびに
f)分離を実施すること(ここで、移動相流量制御モジュールは、予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度での変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーによるホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖フラグメントの分離を遂げるのに必要とされる勾配および溶媒濃度を果たすように移動相流量制御手段の設定を制御して、混合物中のいかなるヘテロ突然変異体部位の分離された成分の存在も同定する)
のコンピュータ化された段階を含んで成る方法。
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