JP2004506414A - Ｄｎａ／ｒｎａ組み込み媒体およびその使用法 - Google Patents
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Abstract
単一細胞または細胞組織において、その中に含まれる天然ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを、０℃以下の温度において長期に渡って、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ増幅に好適な状態に保存するための組み込み媒体であって、事実上、１個または数個の水溶性セルロース誘導体および、要すれば添加してもよい浸透圧安定化剤の水溶液から成る。さらに、このようにして保存されたＤＮＡおよび／またはＲＮＡの増幅法、および、同方法によって得られた増幅ＤＮＡまたはＲＮＡが開示される。
Description
【０００１】
（発明の属する技術分野）
本発明は、天然ＤＮＡおよび／または天然ＲＮＡを含む細胞および組織を組み込む媒体であって、保存時にそのＤＮＡおよび／またはＲＮＡ構造を保持するための組み込み媒体に関する。本発明はまた、ＤＮＡ／ＲＮＡ増幅、特にＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲによる増幅に使用が予定される天然ＤＮＡ／ＲＮＡを保護するための組み込み媒体の使用法にも関する。
【０００２】
（発明の背景）
特定の核酸配列（断片）について、多数の複製コピーが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅によってＤＮＡから、あるいは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってＲＮＡから入手することが可能である。ＰＣＲの詳細については、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，ＱｕｉｒｋｅおよびＴａｙｌｏｒ編、「ＰＣＲ実習法（ＰＣＲ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、１９９１を参照されたい。
【０００３】
細胞や組織の病理学的状態を定量するには定量的ＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲが用いられる。そのような病理学的状態としては例えば、病原性微生物の有無や、悪性腫瘍をもたらす遺伝子突然変異の有無がある。後者について言えば例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞リンパ腫のようなリンパ腫や、ホジキン病に罹っているという疑いのある患者から単離したリンパ球に悪性腫瘍をもたらす突然変異がある。多くの場合、このような理由でサンプルされた細胞や組織はその場で定量されることはないので、定量前の一定期間保存する必要がある。そのような保存時において、ＤＮＡの天然の状態が保持されることは重要である。この保存の問題は取るに足りないものではない。なぜなら、広く使用されている組み込み媒体、最適切断温度（Ｏｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ登録商標、ＯＣＴ）中における凍結組織保存はＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲを抑制する可能性のあることが報告されているからである（Ｇ．Ｒ．Ｔｕｒｂｅｔｔ ａｎｄ Ｌｏｒｙｎ Ｎ．Ｓｅｌｌｎｅｒ，Ｄｉａｇｎ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．６（５）：２９８−３０３，１９９７）。
【０００４】
「天然ＤＮＡ」および「天然ＲＮＡ」とは、組織標本における天然ＤＮＡ／ＲＮＡを指すばかりでなく、単離された天然の染色体ＤＮＡ／ＲＮＡ、および、その核酸配列をも指す。
【０００５】
（発明の目的）
本発明の一つの目的は、ＤＮＡ／ＲＮＡの天然状態を長期に渡って保存するための、前述のタイプの媒体を供給することである。
【０００６】
本発明のもう一つの目的は、ＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法に使用が予定されている細胞および組織中の天然ＤＮＡ／ＲＮＡを保存するための媒体の使用法を供給することである。
【０００７】
本発明の目的は他にも多々あるがそれらは、本発明の下記の大要、好ましい実施態様の説明、および、付属の特許請求項をつぶさに参照することによって自ずから明らかになろう。
【０００８】
（発明の概要）
本発明によれば、単一細胞または細胞組織を、その中に含まれる天然ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを、０℃を越えない温度において長期に渡って、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ増幅に好適な状態に保存するための組み込み媒体であって、実質的に、１個または数個の水溶性セルロース誘導体および、要すれば添加してもよい浸透圧安定化剤の水溶液から成ることを特徴とする組み込み媒体が供給される。この媒体は、実質的に、１個または数個の水溶性セルロース誘導体および、要すれば添加してもよい浸透圧安定化剤の水溶液から成る。
【０００９】
好ましい水溶性セルロース誘導体は、アルキル化セルロース、ヒドロキシ‐アルキル化セルロース、および、アルキル化／ヒドロキシ‐アルキル化セルロースから選ばれる。特に好ましいのは、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチル‐メチルセルロース、ヒドロキシエチル‐エチルセルロース、ヒドロキシプロピル‐メチルセルロースである。もっとも好ましいのはヒドロキシプロピル‐メチルセルロース（ＨＰＭＣ）である。もっとも好ましいのはヒドロキシプロピル‐メチルセルロースである。
【００１０】
好ましいＤＮＡ増幅法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。好ましいＲＮＡ増幅法は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む。
【００１１】
本発明の方法によって天然ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの保存が可能な長期期間は、０℃未満の温度において、好ましくは−２０℃以下の温度において、もっとも好ましくは約−７０℃において、２ヶ月以上である。この「保存される」と言う用語は、特にＤＮＡおよび／またはＲＮＡ増幅における保存能力を指す。
【００１２】
前記浸透圧安定化剤は、生理学的に受容可能なものであれば、いかなる浸透圧安定化剤であってもよいが、好ましくは、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウムの内の１個または数個を含む。
【００１３】
前記水溶性セルロース誘導体の濃度は、好ましくは、約０．１から約５重量％の範囲にある。複数の水溶性セルロース誘導体を組み合わせる場合には、この数字はそれら誘導体の合計濃度を表す。
【００１４】
本発明によれば、天然ＤＮＡおよび／または天然ＲＮＡの増幅法が開示される。その方法は、
被験者、動物、単一細胞、または、多数の単一細胞から、天然ＤＮＡおよび／または天然ＲＮＡを含むサンプルを入手すること、
このサンプルに、実質的に、１個または数個の水溶性セルロース誘導体、および、要すれば添加してもよい浸透圧安定化剤から成る、ＤＮＡ／ＲＮＡ保存用水溶液を供給すること、
サンプルとＤＮＡ／ＲＮＡ保存液の混合物を凍結すること、
前記凍結混合物を０℃以下の温度で長期に渡って保存すること、
前記凍結混合物を０℃を越える温度に上げること、
潅水または水洗によって前記保存液の全てまたは一部を除去すること、
要すれば、前記サンプルから前記ＤＮＡ／ＲＮＡを分離すること、
そのＤＮＡおよび／またはＲＮＡを増幅すること、
を含む。
【００１５】
本発明の方法では、ＤＮＡは好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅され、ＲＮＡは好ましくは逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で増幅される。
【００１６】
本発明において有用な水溶性セルロース誘導体は、アルキル化セルロース、ヒドロキシ‐アルキル化セルロース、および、アルキル化／ヒドロキシ‐アルキル化セルロースから選ばれる。特に好ましい誘導体としては、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチル‐メチルセルロース、ヒドロキシエチル‐エチルセルロース、ヒドロキシプロピル‐メチルセルロースが挙げられる。もっとも好ましいのはヒドロキシプロピル‐メチルセルロースである。もっとも好ましいのはヒドロキシプロピル‐メチルセルロース（ＨＰＭＣ）である。
【００１７】
本発明の好ましい第一の形態によれば、実質的に、水溶性セルロース誘導体と、要すれば添加してもよい浸透圧安定化剤から成る水溶液に０℃未満の温度で長期に渡って組み込まれた（細胞または組織における）天然形で保存されるＤＮＡの増幅によって得られたＤＮＡが開示される。増幅は好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実行される。
【００１８】
本発明の好ましい第二の形態によれば、実質的に、水溶性セルロース誘導体と、要すれば添加してもよい浸透圧安定化剤から成る水溶液に０℃未満の温度で長期に渡って組み込まれた、細胞または組織中の天然形で保存されたＲＮＡの増幅によって得られるＲＮＡまたはＤＮＡが開示される。増幅は好ましくは逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって実行される。
【００１９】
本発明の利点および用途は他にも多々あるがそれらは、本発明の好ましい実施態様の説明、および、特許請求項をつぶさに参照することによって自ずから明らかになろう。
【００２０】
（発明を実施するための最良の形態）
これから本発明を、図面に示される、いくつかの好ましいが、だがそれらに限定されるという意味を含まない実施態様を参照しながらさらに詳しく説明することにする。この図面には、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ定量で得られた、アガロース上における、それぞれ、ＤＮＡとＲＮＡに関するいくつかの電気泳動分離図が含まれる。
【００２１】
細胞サンプル
ａ）｛ＰＣＲ用として｝特定の免疫グロブリン遺伝子再編成をクローンマーカーとして使用が可能な、Ｕ２９０４モノクロナールＢリンパ球を、ＰＣＲの陽性コントロールとして用いた。これは、例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍株のモノクロナール増殖検出用のＢ細胞クローン分析に使用される。
ｂ）｛ＰＣＲ用として｝Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（登録商標）（Ｎｙｃｏｍｅｄ、ノルウェー）によって、造血機能異常性リンパ球過剰増殖疾患の疑われる患者から単離され、かつ、ＰＢＳで洗浄したＢリンパ球。
ｃ）｛ＲＴ−ＰＣＲ用として｝ｔ（９；２２）陽性細胞系統Ｋ５６２。
【００２２】
細胞処理および保存
約５０ｘ１０６個細胞のサンプルをペレットとした。
コントロール――５個のサンプルを−２０℃で、５個のサンプルを−７０℃で保存した。これらを、分子レベル病理分析において標準的なやり方で、すなわち、試薬を全く添加せずに処理した。
ＯＴＣ媒体処理サンプルとＨＭＰＣ媒体処理サンプル――各媒体について１０個のサンプルを、一層の各媒体で被った。各媒体について、５個のサンプルを−２０℃で、５個のサンプルを−７０℃で保存した。
保存時間は全てのサンプルについて２ヶ月であった。
【００２３】
ＲＮＡとＤＮＡの調製
細胞ペレットを解凍し、ＰＢＳ再懸濁によって二度洗浄し、約２，０００ｘｇにて１分の遠心を行って、組み込み用媒体を除去した。
【００２４】
細胞原形質ＲＮＡは、Ｋ５６２細胞ペレットに、０．１４Ｍ塩化ナトリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、および、ｐＨ８．６の１０ｍＭトリスバッファーを含む、細胞溶解性バッファー水溶液を添加して調製した。２０ｍＭバナジルリボヌクレオシド複合体及び、１ｍＭジチオスレイトールに加えて、ノニデットＰ−４０を、最終的に０．５重量％となるように添加した。細胞溶解のために、細胞を、前記の細胞溶解性バッファーに懸濁して氷上において５分間インキュベートした。この懸濁液を、１５，０００ｘｇにて１．５分遠心した。細胞核ペレットを用いて、ｔ（９；２２）陽性Ｋ５６２ゲノムＤＮＡを単離した。上清を別の試験管に移し、ｐＨ８．０の０．２Ｍトリス、０．３Ｍ塩化ナトリウム、２％ＳＤＳ、および、８０ｎｇ／μｌプロテイナーゼＫを含む蛋白分解バッファーと混合した。この溶液を５６℃にて３０分間インキュベートし、５００μｌフェノールと十分に混合し、２，５００ｘｇにて５分間遠心した。上部相を新規の試験管に移し、５００μｌの冷却イソプロパノールと混合し、細胞原形質ＲＮＡを沈殿させ、４℃にて１５，０００ｘｇで３０分遠心した。このようにして形成されたＲＮＡペレットを、適当な容量のＤＥＰＣ（ジエチルピロカルボネート）処理水に溶解した。
【００２５】
Ｕ２９０４Ｂリンパ球、または、患者から得られたリンパ球由来のゲノムＤＮＡは、１０６個の細胞当たり２０μｌの１ｘＰＣＲバッファー（後述）、および、プロテイナーゼＫを、最終濃度が３００μｇ／ｍｌとなるように添加して調製した。この細胞を５６℃にて４時間保存し、次に９５℃にて４分間加熱し、プロテイナーゼＫを失活させた。細胞デブリを、１，２０００ｘｇにて１０分遠心してペレットとして、合計容量１５μｌのＰＣＲ反応あたり１μｌの上清を用いた。この方法を用いる場合、ＤＮＡ濃度を分光学的に定量することはできない。ＤＮＡ濃度は、各細胞が６ｐｇのＤＮＡを含むこと、かつ、５０ｘ１０６個の細胞が、１．０１５μｌの溶液に溶解されたという事実に基づいて３００ｎｇ／μｌまで計算した。
【００２６】
ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ
３通りのＰＣＲ定量法および１通りのＲＴ−ＰＣＲ定量法を用いて、異なる媒体で保存した場合における天然ＤＮＡの変性の程度を定量した。それぞれ、２６８塩基対（ｂｐ）および５３６ｂｐの断片を生成するプライマー対による、２通りのＰＣＲ定量法を、ベータグロビン検出のために実行した。ベータグロビンは、実験室においてゲノムＤＮＡ品質管理用に用いられる。方法は塩化マグネシウム濃度（１．５ｍＭ）に関して最適化した。３番目のＰＣＲ定量法は、共通プライマーによる免疫グロブリン遺伝子の検出に関わる（Ｍ．ＤｅａｎｅおよびＪ．Ｄ．Ｎｏｒｔｏｎ，“Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅ ‘Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ，’ａｎ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｃｌｏｎａｌｉｔｙ ｉｎ Ｌｙｍｐｒｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，”（「免疫グロブリン遺伝子指紋検出法――リンパ球過剰増殖性疾患におけるＢリンパ球クローン性分析法」）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｈｅａｍａｔｏｌ．，１９９１，７７：２７４−２８１）。このプライマーは、各種Ｂ細胞悪性腫瘍を検出するための臨床ルーチンで使用されている。こうして形成されるアンプリコン（増幅単位）は２８０−３５０ｂｐを変動する。Ｕ２９０４由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用いた。
【００２７】
単離ＲＮＡを分析するために、ベータアクチンを標的としてコードするｍＲＮＡ、および、３９２ｂｐの断片を生成する特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ定量法を実行した。
【００２８】
前記ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ定量法を、加温サイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、ｍｏｄｅｌ ９６００および９７００、Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ。この二つのモデルは等価的な結果を与えると考えられている）を用いて実行した。
Ｂ細胞における、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲによる免疫グロブリン遺伝子分析試薬は、米国、カリフォルニア州、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより購入した。５‘末端プライマーＶＨ３（配列――ＧＧＴ ＣＣＣ ＴＧＡ ＧＡＣ ＴＣＴ ＣＣＴ ＧＴＧ ＣＡ）、３’末端プライマーＶＬＪＨ（配列――ＡＣＣ ＴＧＡ ＧＧＡ ＧＡＣ ＧＧＴ ＧＡＣ ＣＡＧ ＧＧＴ）。ＰＣＲ反応は、５０ｍＭのＫＣｌ；１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．３；０．５μＭプライマー；３ｍＭ塩化マグネシウム；０．２ｍＭの各ヌクレオチド（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＵＴＰ）；０．０２５Ｕ／μｌ ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼを含むＰＣＲバッファー中にて実行した。ホットスタートを実現するために、ＴａｑＳｔａｒｔ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、カリフォルニア州）をポリメラーゼに加えておいた。サイクル条件は、９５℃、３０秒；６９℃、３０秒；７２℃、３０秒から成る４０サイクルである。ベータグロビン分析――５‘末端プライマーＧＨ２０（配列――ＧＡＡ ＧＡＧ ＣＣＡ ＡＧＧ ＡＣＡ ＧＧＴ ＡＣ）、３’末端プライマーＰＣ０４（配列――ＣＡＡ ＣＴＴ ＣＡＴ ＣＣＡ ＣＧＴ ＴＣＡ ＣＣ）。このプライマーペアは、２６８ｂｐ長のアンプリコンを生成した。５３６ｂｐのアンプリコンを得るためには、５‘末端プライマーＫＭ２９（配列――ＧＧＴ ＴＧＧ ＣＣＡ ＡＴＣ ＴＡＣ ＴＣＣ ＣＡＧ Ｇ）および３’末端プライマーＲＳ４２（配列――ＧＣＴ ＣＡＣ ＴＣＡ ＧＴＧ ＴＧＧ ＣＡＡ ＡＧ）を用いた。ＰＣＲ反応は、免疫グロブリン遺伝子の場合と同じ条件で行った。ただし、塩化マグネシウム濃度を１．５ｍＭとした。サイクル条件も同じであるが、ただしアニーリング温度を５５℃とした点が異なる。
【００２９】
ベータアクチン分析には、配列がそれぞれＴＧＧ ＧＴＣ ＡＴＣ ＴＴＣ ＴＣＧ ＣＧＧ ＴＴおよびＧＴＧ ＧＧＧ ＣＧＣ ＣＣＣ ＡＧＧ ＣＡＣ ＣＡである２種のプライマーを用いて、２５９ｂｐ長のアンプリコンを生成した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、逆転写酵素とポリメラーゼとを兼ねるｒｔＴＨ酵素（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いてメーカーの指示に従って行った。酢酸マンガン濃度は２．５ｍＭであった。サイクル条件――６０℃、３０分および９４℃、２分の１サイクル、その後に、９４℃、３０秒および６０℃、１分から成る４０サイクル。伸張は７２℃で２分間行った。
【００３０】
アンプリコンとゲノムＤＮＡの電気泳動
ＤＮＡ変性の可能性を調べるために、１０μｇのゲノムＤＮＡについて、２％アガロースゲルを用いて電気泳動を行った。同じゲル媒体をアンプリコン検出にも用いた。ＨａｅＩＩＩ切断ＰｈｉＸＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マジソン、ウィスコンシン州）を、ＤＮＡサイズマーカーとして用いた。泳動バッファーはグリセロールとブロモフェノールブルーから成る。
【００３１】
細胞および組織保存媒体のｐＨの定量
ｐＨ５−１０、ｐＨ７．５−１４の範囲を持つｐＨ指示スティック（Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット）を用いて評価した。
【００３２】
コントロール（対照）
前記各種実験において、「コントロール」とは、それぞれの細胞タイプにおいて、保存媒体を与えられてはいないが、その他の点では保存媒体を与えられたサンプルと同様に処理されたサンプル（単数または複数）を指す。
【００３３】
細胞保存媒体中におけるＲＮＡ調製時に見られた所見
ＲＮＡおよびＤＮＡ調製時に、次のことが観察された。すなわち、ＯＣＴ媒体において−７０℃で凍結・保存された細胞ペレットは、ＰＢＳに簡単に再懸濁される。しかしながら、この再懸濁細胞を遠心すると細胞溶解が起こった。すなわち、新規のペレットではなく、上清と分離不能な粘稠塊が形成された。このサンプルからＲＮＡを分離することは困難であるか、または、ある場合には不可能であることが判明した。
【００３４】
ＨＰＭＣ媒体によって凍結・保存されたペレットは、簡単には再懸濁されない凝集塊を形成した。しかしながら、ＲＮＡ調製に用いると、このＨＰＭＣ媒体処理凝集細胞は未処理の細胞のように振る舞い、良好な収率でＲＮＡを供給した。
【００３５】
実施例１
添加された細胞保存媒体のＰＣＲにたいする作用
新鮮なＵ２９０４細胞から調製したＤＮＡにたいして、１０％（容量／容量）ＯＣＴ媒体またはＨＭＰＣ媒体を添加した。これは、凍結組織片にたいして誤って、例えば、水洗のやり方が悪かったために、凍結組織片調製ＤＮＡに残存することが通常予想される量を相当に上回る大量の組み込み媒体である。ＰＣＲ（図１）は、ベータグロビンの２６８ｂｐアンプリコンである。レーン特性はそれぞれ、１，２は陽性コントロールであり、３，４はＨＭＰＣ１０％（ｖ／ｖ）であり、５，６はＯＴＣ１０％（ｖ／ｖ）であり、７はマーカーである。ＲＴ−ＰＣＲ（図２）は、ベータアクチンの２５９ｂｐアンプリコンである。レーン特性はそれぞれ、１，２は陽性コントロールであり、３，４はＨＭＰＣ１０％（ｖ／ｖ）であり、５，６はＯＣＴ１０％（ｖ／ｖ）であり、７はマーカーである。
【００３６】
図１および２から明らかなように、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ定量法のいずれも、本発明によるＨＰＭＣ媒体が相当量存在してもそれよってごく僅かしか影響されない。同量の、従来技術による細胞保存媒体ＯＣＴは、同じ定量法にたいして破壊的に作用する。
【００３７】
実施例２
様々な量の細胞保存媒体を添加した場合のＰＣＲにたいする作用
条件は実施例１の場合と同様である。図３はベータグロビンの２６８ｂｐアンプリコンである。レーン特性はそれぞれ、１はＨＭＰＣ１０％（ｖ／ｖ）であり、２はＨＭＰＣ２０％（ｖ／ｖ）であり、３はＨＭＰＣ３０％（ｖ／ｖ）であり、４はＨＭＰＣ４０％（ｖ／ｖ）であり、５はマーカーである。１ａはＯＣＴ１０％（ｖ／ｖ）であり、２ａはＯＴＣ５％（ｖ／ｖ）であり、３ａはＯＴＣ２．５％（ｖ／ｖ）であり、４ａはＯＴＣ１．２５％（ｖ／ｖ）であり、５ａはＯＴＣ１％（ｖ／ｖ）であり、６ａは（０．５）であり、７ａはマーカーである。図３に示すように、ＰＣＲは、本発明によるＨＰＭＣ媒体によってごく僅かしか影響されない。一方、従来技術による媒体ＯＣＴは、約１％を越える濃度（容量／容量）においてＰＣＲにたいして破壊的に作用する。
【００３８】
実施例３
細胞保存媒体中に保存した細胞のゲノムＤＮＡの保存性
アガロース上でゲノムＤＮＡ断片のサイズ分析を行ったところ、−２０℃で保存したＯＣＴ処理Ｕ２９０４細胞におけるＤＮＡ変性はほぼ完全であった。一方、同じＤＮＡ標本のＰＣＲ定量を行ったところ、いくつかのサンプルにおいて増幅用の鋳型として働くのに十分な無傷のＤＮＡが残されていることが示された（図５、レーン１１−１５）。同様の結果が、保存温度−７０℃においても得られた（図４、レーン１２−１６）。上とは対照的に、本発明によるＨＰＭＣ媒体によって処理された細胞由来のＤＮＡは、全てのサンプルで、両保存温度において大量のアンプリコンを生成した（図４、レーン７−１１、および、図５、レーン６−１０、上記図４、５においてレーン１−５はコントロール）。
【００３９】
実施例４
細胞保存媒体中に保存した細胞の原形質ＲＮＡの保存性
保存Ｕ２９０４細胞から単離したＲＮＡによるＲＴ−ＰＣＲ――標的ベータアクチンは、約２５９ｂｐのＰＣＲ断片である。図６は保存温度−７０℃の場合。レーン特性はそれぞれ、１−５はコントロール、６−１０はＨＰＭＣ（ＯＣＴ中で−７０℃で保存した細胞からはＲＮＡが調製されなかった）、１４はマーカーである。図７は保存温度−２０℃の場合。レーン特性はそれぞれ、１−５はコントロール、６，７，９−１１はＨＰＭＣ、８はマーカー、１２−１５はＯＣＴ、１６はマーカーである。図６および７から、ＯＣＴ媒体による原形質ＲＮＡの保存性は悪いが、本発明によるＨＰＭＣ媒体の場合保存性は良好である。−７０℃における核酸保存は、保存媒体無しでも良好ではあるが、−２０℃の温度で保存した場合、保存媒体を使用しないと核酸保存は得られなかった。
【００４０】
ＯＣＴ媒体に関わる実施例についてのコメント
−２０℃保存の細胞中のＤＮＡの方が、−７０℃保存の細胞のものよりもＯＴＣ媒体によって影響を被ることが予想されよう。しかしながら、実際はそうではない。−７０℃で保存した５個のサンプルの中２個は全く増幅されなかったが、一方、−２０℃で保存した５個のサンプル全てが増幅可能なＤＮＡを含んでいた。ただし、そのＤＮＡは、生成されたアンプリコンの数から明らかなように（図５参照）、未処理の細胞、または、本発明によるＨＰＭＣ媒体によって処理した細胞のものよりもはるかにその品質が劣っていた。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明によるＨＰＭＣ媒体、および、従来技術の組織保存媒体中に保存されたヒトＤＮＡのＰＣＲによって得られた２６８塩基対（ｂｐ）ベータグロビン断片の構成を示す。
【図２】
図２は、本発明によるＨＰＭＣ媒体、および、従来技術の組織保存媒体中に保存されたヒトｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって得られた２５９ｂｐベータアクチン断片の構成を示す。
【図３】
図３は、本発明によるＨＰＭＣ媒体、および、従来技術の組織保存媒体中に保存された、ヒト細胞系統Ｕ２９０４由来ＤＮＡのＰＣＲによって得られた、図１の、２６８ｂｐベータグロビン断片の構成を示す。
【図４】
図４は、本発明によるＨＰＭＣ媒体、および、従来技術の組織保存媒体において−７０℃で保存したＢリンパ球Ｕ２９０４細胞ゲノムＤＮＡのＰＣＲによって得られた５３６ｂｐベータグロビン断片の構成を示す。
【図５】
図５は、本発明によるＨＰＭＣ媒体、および、従来技術の組織保存媒体において−２０℃で保存したＢリンパ球Ｕ２９０４細胞ゲノムＤＮＡのＰＣＲによって得られた５３６ｂｐベータグロビン断片の構成を示す。
【図６】
図６は、本発明によるＨＰＭＣ媒体、および、従来技術の組織保存媒体において−７０℃で保存した、ｔ（９９；２２）陽性Ｋ５６２細胞由来の細胞原形質ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって得られた２５９ｂｐベータアクチン断片の構成を示す。
【図７】
図７は、本発明によるＨＰＭＣ媒体、および、従来技術の組織保存媒体において−２０℃で保存した、ｔ（９９；２２）陽性Ｋ５６２細胞由来の細胞原形質ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって得られた２５９ｂｐベータアクチン断片の構成を示す。
（発明の属する技術分野）
本発明は、天然ＤＮＡおよび／または天然ＲＮＡを含む細胞および組織を組み込む媒体であって、保存時にそのＤＮＡおよび／またはＲＮＡ構造を保持するための組み込み媒体に関する。本発明はまた、ＤＮＡ／ＲＮＡ増幅、特にＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲによる増幅に使用が予定される天然ＤＮＡ／ＲＮＡを保護するための組み込み媒体の使用法にも関する。
【０００２】
（発明の背景）
特定の核酸配列（断片）について、多数の複製コピーが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅によってＤＮＡから、あるいは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってＲＮＡから入手することが可能である。ＰＣＲの詳細については、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，ＱｕｉｒｋｅおよびＴａｙｌｏｒ編、「ＰＣＲ実習法（ＰＣＲ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、１９９１を参照されたい。
【０００３】
細胞や組織の病理学的状態を定量するには定量的ＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲが用いられる。そのような病理学的状態としては例えば、病原性微生物の有無や、悪性腫瘍をもたらす遺伝子突然変異の有無がある。後者について言えば例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞リンパ腫のようなリンパ腫や、ホジキン病に罹っているという疑いのある患者から単離したリンパ球に悪性腫瘍をもたらす突然変異がある。多くの場合、このような理由でサンプルされた細胞や組織はその場で定量されることはないので、定量前の一定期間保存する必要がある。そのような保存時において、ＤＮＡの天然の状態が保持されることは重要である。この保存の問題は取るに足りないものではない。なぜなら、広く使用されている組み込み媒体、最適切断温度（Ｏｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ登録商標、ＯＣＴ）中における凍結組織保存はＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲを抑制する可能性のあることが報告されているからである（Ｇ．Ｒ．Ｔｕｒｂｅｔｔ ａｎｄ Ｌｏｒｙｎ Ｎ．Ｓｅｌｌｎｅｒ，Ｄｉａｇｎ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．６（５）：２９８−３０３，１９９７）。
【０００４】
「天然ＤＮＡ」および「天然ＲＮＡ」とは、組織標本における天然ＤＮＡ／ＲＮＡを指すばかりでなく、単離された天然の染色体ＤＮＡ／ＲＮＡ、および、その核酸配列をも指す。
【０００５】
（発明の目的）
本発明の一つの目的は、ＤＮＡ／ＲＮＡの天然状態を長期に渡って保存するための、前述のタイプの媒体を供給することである。
【０００６】
本発明のもう一つの目的は、ＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法に使用が予定されている細胞および組織中の天然ＤＮＡ／ＲＮＡを保存するための媒体の使用法を供給することである。
【０００７】
本発明の目的は他にも多々あるがそれらは、本発明の下記の大要、好ましい実施態様の説明、および、付属の特許請求項をつぶさに参照することによって自ずから明らかになろう。
【０００８】
（発明の概要）
本発明によれば、単一細胞または細胞組織を、その中に含まれる天然ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを、０℃を越えない温度において長期に渡って、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ増幅に好適な状態に保存するための組み込み媒体であって、実質的に、１個または数個の水溶性セルロース誘導体および、要すれば添加してもよい浸透圧安定化剤の水溶液から成ることを特徴とする組み込み媒体が供給される。この媒体は、実質的に、１個または数個の水溶性セルロース誘導体および、要すれば添加してもよい浸透圧安定化剤の水溶液から成る。
【０００９】
好ましい水溶性セルロース誘導体は、アルキル化セルロース、ヒドロキシ‐アルキル化セルロース、および、アルキル化／ヒドロキシ‐アルキル化セルロースから選ばれる。特に好ましいのは、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチル‐メチルセルロース、ヒドロキシエチル‐エチルセルロース、ヒドロキシプロピル‐メチルセルロースである。もっとも好ましいのはヒドロキシプロピル‐メチルセルロース（ＨＰＭＣ）である。もっとも好ましいのはヒドロキシプロピル‐メチルセルロースである。
【００１０】
好ましいＤＮＡ増幅法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。好ましいＲＮＡ増幅法は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む。
【００１１】
本発明の方法によって天然ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの保存が可能な長期期間は、０℃未満の温度において、好ましくは−２０℃以下の温度において、もっとも好ましくは約−７０℃において、２ヶ月以上である。この「保存される」と言う用語は、特にＤＮＡおよび／またはＲＮＡ増幅における保存能力を指す。
【００１２】
前記浸透圧安定化剤は、生理学的に受容可能なものであれば、いかなる浸透圧安定化剤であってもよいが、好ましくは、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウムの内の１個または数個を含む。
【００１３】
前記水溶性セルロース誘導体の濃度は、好ましくは、約０．１から約５重量％の範囲にある。複数の水溶性セルロース誘導体を組み合わせる場合には、この数字はそれら誘導体の合計濃度を表す。
【００１４】
本発明によれば、天然ＤＮＡおよび／または天然ＲＮＡの増幅法が開示される。その方法は、
被験者、動物、単一細胞、または、多数の単一細胞から、天然ＤＮＡおよび／または天然ＲＮＡを含むサンプルを入手すること、
このサンプルに、実質的に、１個または数個の水溶性セルロース誘導体、および、要すれば添加してもよい浸透圧安定化剤から成る、ＤＮＡ／ＲＮＡ保存用水溶液を供給すること、
サンプルとＤＮＡ／ＲＮＡ保存液の混合物を凍結すること、
前記凍結混合物を０℃以下の温度で長期に渡って保存すること、
前記凍結混合物を０℃を越える温度に上げること、
潅水または水洗によって前記保存液の全てまたは一部を除去すること、
要すれば、前記サンプルから前記ＤＮＡ／ＲＮＡを分離すること、
そのＤＮＡおよび／またはＲＮＡを増幅すること、
を含む。
【００１５】
本発明の方法では、ＤＮＡは好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅され、ＲＮＡは好ましくは逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で増幅される。
【００１６】
本発明において有用な水溶性セルロース誘導体は、アルキル化セルロース、ヒドロキシ‐アルキル化セルロース、および、アルキル化／ヒドロキシ‐アルキル化セルロースから選ばれる。特に好ましい誘導体としては、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチル‐メチルセルロース、ヒドロキシエチル‐エチルセルロース、ヒドロキシプロピル‐メチルセルロースが挙げられる。もっとも好ましいのはヒドロキシプロピル‐メチルセルロースである。もっとも好ましいのはヒドロキシプロピル‐メチルセルロース（ＨＰＭＣ）である。
【００１７】
本発明の好ましい第一の形態によれば、実質的に、水溶性セルロース誘導体と、要すれば添加してもよい浸透圧安定化剤から成る水溶液に０℃未満の温度で長期に渡って組み込まれた（細胞または組織における）天然形で保存されるＤＮＡの増幅によって得られたＤＮＡが開示される。増幅は好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実行される。
【００１８】
本発明の好ましい第二の形態によれば、実質的に、水溶性セルロース誘導体と、要すれば添加してもよい浸透圧安定化剤から成る水溶液に０℃未満の温度で長期に渡って組み込まれた、細胞または組織中の天然形で保存されたＲＮＡの増幅によって得られるＲＮＡまたはＤＮＡが開示される。増幅は好ましくは逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって実行される。
【００１９】
本発明の利点および用途は他にも多々あるがそれらは、本発明の好ましい実施態様の説明、および、特許請求項をつぶさに参照することによって自ずから明らかになろう。
【００２０】
（発明を実施するための最良の形態）
これから本発明を、図面に示される、いくつかの好ましいが、だがそれらに限定されるという意味を含まない実施態様を参照しながらさらに詳しく説明することにする。この図面には、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ定量で得られた、アガロース上における、それぞれ、ＤＮＡとＲＮＡに関するいくつかの電気泳動分離図が含まれる。
【００２１】
細胞サンプル
ａ）｛ＰＣＲ用として｝特定の免疫グロブリン遺伝子再編成をクローンマーカーとして使用が可能な、Ｕ２９０４モノクロナールＢリンパ球を、ＰＣＲの陽性コントロールとして用いた。これは、例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍株のモノクロナール増殖検出用のＢ細胞クローン分析に使用される。
ｂ）｛ＰＣＲ用として｝Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（登録商標）（Ｎｙｃｏｍｅｄ、ノルウェー）によって、造血機能異常性リンパ球過剰増殖疾患の疑われる患者から単離され、かつ、ＰＢＳで洗浄したＢリンパ球。
ｃ）｛ＲＴ−ＰＣＲ用として｝ｔ（９；２２）陽性細胞系統Ｋ５６２。
【００２２】
細胞処理および保存
約５０ｘ１０６個細胞のサンプルをペレットとした。
コントロール――５個のサンプルを−２０℃で、５個のサンプルを−７０℃で保存した。これらを、分子レベル病理分析において標準的なやり方で、すなわち、試薬を全く添加せずに処理した。
ＯＴＣ媒体処理サンプルとＨＭＰＣ媒体処理サンプル――各媒体について１０個のサンプルを、一層の各媒体で被った。各媒体について、５個のサンプルを−２０℃で、５個のサンプルを−７０℃で保存した。
保存時間は全てのサンプルについて２ヶ月であった。
【００２３】
ＲＮＡとＤＮＡの調製
細胞ペレットを解凍し、ＰＢＳ再懸濁によって二度洗浄し、約２，０００ｘｇにて１分の遠心を行って、組み込み用媒体を除去した。
【００２４】
細胞原形質ＲＮＡは、Ｋ５６２細胞ペレットに、０．１４Ｍ塩化ナトリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、および、ｐＨ８．６の１０ｍＭトリスバッファーを含む、細胞溶解性バッファー水溶液を添加して調製した。２０ｍＭバナジルリボヌクレオシド複合体及び、１ｍＭジチオスレイトールに加えて、ノニデットＰ−４０を、最終的に０．５重量％となるように添加した。細胞溶解のために、細胞を、前記の細胞溶解性バッファーに懸濁して氷上において５分間インキュベートした。この懸濁液を、１５，０００ｘｇにて１．５分遠心した。細胞核ペレットを用いて、ｔ（９；２２）陽性Ｋ５６２ゲノムＤＮＡを単離した。上清を別の試験管に移し、ｐＨ８．０の０．２Ｍトリス、０．３Ｍ塩化ナトリウム、２％ＳＤＳ、および、８０ｎｇ／μｌプロテイナーゼＫを含む蛋白分解バッファーと混合した。この溶液を５６℃にて３０分間インキュベートし、５００μｌフェノールと十分に混合し、２，５００ｘｇにて５分間遠心した。上部相を新規の試験管に移し、５００μｌの冷却イソプロパノールと混合し、細胞原形質ＲＮＡを沈殿させ、４℃にて１５，０００ｘｇで３０分遠心した。このようにして形成されたＲＮＡペレットを、適当な容量のＤＥＰＣ（ジエチルピロカルボネート）処理水に溶解した。
【００２５】
Ｕ２９０４Ｂリンパ球、または、患者から得られたリンパ球由来のゲノムＤＮＡは、１０６個の細胞当たり２０μｌの１ｘＰＣＲバッファー（後述）、および、プロテイナーゼＫを、最終濃度が３００μｇ／ｍｌとなるように添加して調製した。この細胞を５６℃にて４時間保存し、次に９５℃にて４分間加熱し、プロテイナーゼＫを失活させた。細胞デブリを、１，２０００ｘｇにて１０分遠心してペレットとして、合計容量１５μｌのＰＣＲ反応あたり１μｌの上清を用いた。この方法を用いる場合、ＤＮＡ濃度を分光学的に定量することはできない。ＤＮＡ濃度は、各細胞が６ｐｇのＤＮＡを含むこと、かつ、５０ｘ１０６個の細胞が、１．０１５μｌの溶液に溶解されたという事実に基づいて３００ｎｇ／μｌまで計算した。
【００２６】
ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ
３通りのＰＣＲ定量法および１通りのＲＴ−ＰＣＲ定量法を用いて、異なる媒体で保存した場合における天然ＤＮＡの変性の程度を定量した。それぞれ、２６８塩基対（ｂｐ）および５３６ｂｐの断片を生成するプライマー対による、２通りのＰＣＲ定量法を、ベータグロビン検出のために実行した。ベータグロビンは、実験室においてゲノムＤＮＡ品質管理用に用いられる。方法は塩化マグネシウム濃度（１．５ｍＭ）に関して最適化した。３番目のＰＣＲ定量法は、共通プライマーによる免疫グロブリン遺伝子の検出に関わる（Ｍ．ＤｅａｎｅおよびＪ．Ｄ．Ｎｏｒｔｏｎ，“Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅ ‘Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ，’ａｎ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｃｌｏｎａｌｉｔｙ ｉｎ Ｌｙｍｐｒｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，”（「免疫グロブリン遺伝子指紋検出法――リンパ球過剰増殖性疾患におけるＢリンパ球クローン性分析法」）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｈｅａｍａｔｏｌ．，１９９１，７７：２７４−２８１）。このプライマーは、各種Ｂ細胞悪性腫瘍を検出するための臨床ルーチンで使用されている。こうして形成されるアンプリコン（増幅単位）は２８０−３５０ｂｐを変動する。Ｕ２９０４由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用いた。
【００２７】
単離ＲＮＡを分析するために、ベータアクチンを標的としてコードするｍＲＮＡ、および、３９２ｂｐの断片を生成する特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ定量法を実行した。
【００２８】
前記ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ定量法を、加温サイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、ｍｏｄｅｌ ９６００および９７００、Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ。この二つのモデルは等価的な結果を与えると考えられている）を用いて実行した。
Ｂ細胞における、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲによる免疫グロブリン遺伝子分析試薬は、米国、カリフォルニア州、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより購入した。５‘末端プライマーＶＨ３（配列――ＧＧＴ ＣＣＣ ＴＧＡ ＧＡＣ ＴＣＴ ＣＣＴ ＧＴＧ ＣＡ）、３’末端プライマーＶＬＪＨ（配列――ＡＣＣ ＴＧＡ ＧＧＡ ＧＡＣ ＧＧＴ ＧＡＣ ＣＡＧ ＧＧＴ）。ＰＣＲ反応は、５０ｍＭのＫＣｌ；１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．３；０．５μＭプライマー；３ｍＭ塩化マグネシウム；０．２ｍＭの各ヌクレオチド（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＵＴＰ）；０．０２５Ｕ／μｌ ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼを含むＰＣＲバッファー中にて実行した。ホットスタートを実現するために、ＴａｑＳｔａｒｔ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、カリフォルニア州）をポリメラーゼに加えておいた。サイクル条件は、９５℃、３０秒；６９℃、３０秒；７２℃、３０秒から成る４０サイクルである。ベータグロビン分析――５‘末端プライマーＧＨ２０（配列――ＧＡＡ ＧＡＧ ＣＣＡ ＡＧＧ ＡＣＡ ＧＧＴ ＡＣ）、３’末端プライマーＰＣ０４（配列――ＣＡＡ ＣＴＴ ＣＡＴ ＣＣＡ ＣＧＴ ＴＣＡ ＣＣ）。このプライマーペアは、２６８ｂｐ長のアンプリコンを生成した。５３６ｂｐのアンプリコンを得るためには、５‘末端プライマーＫＭ２９（配列――ＧＧＴ ＴＧＧ ＣＣＡ ＡＴＣ ＴＡＣ ＴＣＣ ＣＡＧ Ｇ）および３’末端プライマーＲＳ４２（配列――ＧＣＴ ＣＡＣ ＴＣＡ ＧＴＧ ＴＧＧ ＣＡＡ ＡＧ）を用いた。ＰＣＲ反応は、免疫グロブリン遺伝子の場合と同じ条件で行った。ただし、塩化マグネシウム濃度を１．５ｍＭとした。サイクル条件も同じであるが、ただしアニーリング温度を５５℃とした点が異なる。
【００２９】
ベータアクチン分析には、配列がそれぞれＴＧＧ ＧＴＣ ＡＴＣ ＴＴＣ ＴＣＧ ＣＧＧ ＴＴおよびＧＴＧ ＧＧＧ ＣＧＣ ＣＣＣ ＡＧＧ ＣＡＣ ＣＡである２種のプライマーを用いて、２５９ｂｐ長のアンプリコンを生成した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、逆転写酵素とポリメラーゼとを兼ねるｒｔＴＨ酵素（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いてメーカーの指示に従って行った。酢酸マンガン濃度は２．５ｍＭであった。サイクル条件――６０℃、３０分および９４℃、２分の１サイクル、その後に、９４℃、３０秒および６０℃、１分から成る４０サイクル。伸張は７２℃で２分間行った。
【００３０】
アンプリコンとゲノムＤＮＡの電気泳動
ＤＮＡ変性の可能性を調べるために、１０μｇのゲノムＤＮＡについて、２％アガロースゲルを用いて電気泳動を行った。同じゲル媒体をアンプリコン検出にも用いた。ＨａｅＩＩＩ切断ＰｈｉＸＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マジソン、ウィスコンシン州）を、ＤＮＡサイズマーカーとして用いた。泳動バッファーはグリセロールとブロモフェノールブルーから成る。
【００３１】
細胞および組織保存媒体のｐＨの定量
ｐＨ５−１０、ｐＨ７．５−１４の範囲を持つｐＨ指示スティック（Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット）を用いて評価した。
【００３２】
コントロール（対照）
前記各種実験において、「コントロール」とは、それぞれの細胞タイプにおいて、保存媒体を与えられてはいないが、その他の点では保存媒体を与えられたサンプルと同様に処理されたサンプル（単数または複数）を指す。
【００３３】
細胞保存媒体中におけるＲＮＡ調製時に見られた所見
ＲＮＡおよびＤＮＡ調製時に、次のことが観察された。すなわち、ＯＣＴ媒体において−７０℃で凍結・保存された細胞ペレットは、ＰＢＳに簡単に再懸濁される。しかしながら、この再懸濁細胞を遠心すると細胞溶解が起こった。すなわち、新規のペレットではなく、上清と分離不能な粘稠塊が形成された。このサンプルからＲＮＡを分離することは困難であるか、または、ある場合には不可能であることが判明した。
【００３４】
ＨＰＭＣ媒体によって凍結・保存されたペレットは、簡単には再懸濁されない凝集塊を形成した。しかしながら、ＲＮＡ調製に用いると、このＨＰＭＣ媒体処理凝集細胞は未処理の細胞のように振る舞い、良好な収率でＲＮＡを供給した。
【００３５】
実施例１
添加された細胞保存媒体のＰＣＲにたいする作用
新鮮なＵ２９０４細胞から調製したＤＮＡにたいして、１０％（容量／容量）ＯＣＴ媒体またはＨＭＰＣ媒体を添加した。これは、凍結組織片にたいして誤って、例えば、水洗のやり方が悪かったために、凍結組織片調製ＤＮＡに残存することが通常予想される量を相当に上回る大量の組み込み媒体である。ＰＣＲ（図１）は、ベータグロビンの２６８ｂｐアンプリコンである。レーン特性はそれぞれ、１，２は陽性コントロールであり、３，４はＨＭＰＣ１０％（ｖ／ｖ）であり、５，６はＯＴＣ１０％（ｖ／ｖ）であり、７はマーカーである。ＲＴ−ＰＣＲ（図２）は、ベータアクチンの２５９ｂｐアンプリコンである。レーン特性はそれぞれ、１，２は陽性コントロールであり、３，４はＨＭＰＣ１０％（ｖ／ｖ）であり、５，６はＯＣＴ１０％（ｖ／ｖ）であり、７はマーカーである。
【００３６】
図１および２から明らかなように、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ定量法のいずれも、本発明によるＨＰＭＣ媒体が相当量存在してもそれよってごく僅かしか影響されない。同量の、従来技術による細胞保存媒体ＯＣＴは、同じ定量法にたいして破壊的に作用する。
【００３７】
実施例２
様々な量の細胞保存媒体を添加した場合のＰＣＲにたいする作用
条件は実施例１の場合と同様である。図３はベータグロビンの２６８ｂｐアンプリコンである。レーン特性はそれぞれ、１はＨＭＰＣ１０％（ｖ／ｖ）であり、２はＨＭＰＣ２０％（ｖ／ｖ）であり、３はＨＭＰＣ３０％（ｖ／ｖ）であり、４はＨＭＰＣ４０％（ｖ／ｖ）であり、５はマーカーである。１ａはＯＣＴ１０％（ｖ／ｖ）であり、２ａはＯＴＣ５％（ｖ／ｖ）であり、３ａはＯＴＣ２．５％（ｖ／ｖ）であり、４ａはＯＴＣ１．２５％（ｖ／ｖ）であり、５ａはＯＴＣ１％（ｖ／ｖ）であり、６ａは（０．５）であり、７ａはマーカーである。図３に示すように、ＰＣＲは、本発明によるＨＰＭＣ媒体によってごく僅かしか影響されない。一方、従来技術による媒体ＯＣＴは、約１％を越える濃度（容量／容量）においてＰＣＲにたいして破壊的に作用する。
【００３８】
実施例３
細胞保存媒体中に保存した細胞のゲノムＤＮＡの保存性
アガロース上でゲノムＤＮＡ断片のサイズ分析を行ったところ、−２０℃で保存したＯＣＴ処理Ｕ２９０４細胞におけるＤＮＡ変性はほぼ完全であった。一方、同じＤＮＡ標本のＰＣＲ定量を行ったところ、いくつかのサンプルにおいて増幅用の鋳型として働くのに十分な無傷のＤＮＡが残されていることが示された（図５、レーン１１−１５）。同様の結果が、保存温度−７０℃においても得られた（図４、レーン１２−１６）。上とは対照的に、本発明によるＨＰＭＣ媒体によって処理された細胞由来のＤＮＡは、全てのサンプルで、両保存温度において大量のアンプリコンを生成した（図４、レーン７−１１、および、図５、レーン６−１０、上記図４、５においてレーン１−５はコントロール）。
【００３９】
実施例４
細胞保存媒体中に保存した細胞の原形質ＲＮＡの保存性
保存Ｕ２９０４細胞から単離したＲＮＡによるＲＴ−ＰＣＲ――標的ベータアクチンは、約２５９ｂｐのＰＣＲ断片である。図６は保存温度−７０℃の場合。レーン特性はそれぞれ、１−５はコントロール、６−１０はＨＰＭＣ（ＯＣＴ中で−７０℃で保存した細胞からはＲＮＡが調製されなかった）、１４はマーカーである。図７は保存温度−２０℃の場合。レーン特性はそれぞれ、１−５はコントロール、６，７，９−１１はＨＰＭＣ、８はマーカー、１２−１５はＯＣＴ、１６はマーカーである。図６および７から、ＯＣＴ媒体による原形質ＲＮＡの保存性は悪いが、本発明によるＨＰＭＣ媒体の場合保存性は良好である。−７０℃における核酸保存は、保存媒体無しでも良好ではあるが、−２０℃の温度で保存した場合、保存媒体を使用しないと核酸保存は得られなかった。
【００４０】
ＯＣＴ媒体に関わる実施例についてのコメント
−２０℃保存の細胞中のＤＮＡの方が、−７０℃保存の細胞のものよりもＯＴＣ媒体によって影響を被ることが予想されよう。しかしながら、実際はそうではない。−７０℃で保存した５個のサンプルの中２個は全く増幅されなかったが、一方、−２０℃で保存した５個のサンプル全てが増幅可能なＤＮＡを含んでいた。ただし、そのＤＮＡは、生成されたアンプリコンの数から明らかなように（図５参照）、未処理の細胞、または、本発明によるＨＰＭＣ媒体によって処理した細胞のものよりもはるかにその品質が劣っていた。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明によるＨＰＭＣ媒体、および、従来技術の組織保存媒体中に保存されたヒトＤＮＡのＰＣＲによって得られた２６８塩基対（ｂｐ）ベータグロビン断片の構成を示す。
【図２】
図２は、本発明によるＨＰＭＣ媒体、および、従来技術の組織保存媒体中に保存されたヒトｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって得られた２５９ｂｐベータアクチン断片の構成を示す。
【図３】
図３は、本発明によるＨＰＭＣ媒体、および、従来技術の組織保存媒体中に保存された、ヒト細胞系統Ｕ２９０４由来ＤＮＡのＰＣＲによって得られた、図１の、２６８ｂｐベータグロビン断片の構成を示す。
【図４】
図４は、本発明によるＨＰＭＣ媒体、および、従来技術の組織保存媒体において−７０℃で保存したＢリンパ球Ｕ２９０４細胞ゲノムＤＮＡのＰＣＲによって得られた５３６ｂｐベータグロビン断片の構成を示す。
【図５】
図５は、本発明によるＨＰＭＣ媒体、および、従来技術の組織保存媒体において−２０℃で保存したＢリンパ球Ｕ２９０４細胞ゲノムＤＮＡのＰＣＲによって得られた５３６ｂｐベータグロビン断片の構成を示す。
【図６】
図６は、本発明によるＨＰＭＣ媒体、および、従来技術の組織保存媒体において−７０℃で保存した、ｔ（９９；２２）陽性Ｋ５６２細胞由来の細胞原形質ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって得られた２５９ｂｐベータアクチン断片の構成を示す。
【図７】
図７は、本発明によるＨＰＭＣ媒体、および、従来技術の組織保存媒体において−２０℃で保存した、ｔ（９９；２２）陽性Ｋ５６２細胞由来の細胞原形質ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって得られた２５９ｂｐベータアクチン断片の構成を示す。
Claims (20)
- 単一細胞または細胞組織を、その中に含まれる天然ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを、０℃を越えない温度において長期に渡って、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ増幅に好適な状態に保存するための組み込み媒体であって、実質的に、１個または数個の水溶性セルロース誘導体および、要すれば添加してもよい浸透圧安定化剤の水溶液から成ることを特徴とする組み込み媒体。
- 前記１個または数個の水溶性セルロース誘導体は、アルキル化セルロース、ヒドロキシ‐アルキル化セルロース、および、アルキル化／ヒドロキシ‐アルキル化セルロースから選ばれることを特徴とする請求項１の組み込み媒体。
- 前記１個または数個の水溶性セルロース誘導体は、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチル‐メチルセルロース、ヒドロキシエチル‐エチルセルロース、ヒドロキシプロピル‐メチルセルロースから選ばれ、もっとも好ましいのはヒドロキシプロピル‐メチルセルロース（ＨＰＭＣ）であることを特徴とする請求項２の組み込み媒体。
- 前記１個の水溶性セルロース誘導体がヒドロキシプロピル‐メチルセルロースであることを特徴とする請求項３の組み込み媒体。
- 前記ＤＮＡ増幅法がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含むことを特徴とする請求項１の組み込み媒体。
- 前記ＲＮＡ増幅法が逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を含むことを特徴とする請求項１の組み込み媒体。
- 前記長期は２ヶ月以上であることを特徴とする請求項１の組み込み媒体。
- 前記温度は−２０℃以下であることを特徴とする請求項１の組み込み媒体。
- 前記浸透圧安定化剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウムの中の１個または数個であることを特徴とする請求項１の組み込み媒体。
- 前記１個または数個の水溶性セルロース誘導体の濃度は、０．１から５重量％であることを特徴とする請求項３の組み込み媒体。
- 天然ＤＮＡおよび／または天然ＲＮＡの増幅法であって、
被験者や動物から、または、単一細胞や多数の単一細胞から、天然ＤＮＡおよび／または天然ＲＮＡを含むサンプルを入手すること、
このサンプルに、実質的に、１個または数個の水溶性セルロース誘導体、および、要すれば添加してもよい浸透圧安定化剤から成る、ＤＮＡ／ＲＮＡ保存水溶液を供給すること、
サンプルとＤＮＡ／ＲＮＡ保存液の混合物を凍結すること、
前記凍結混合物を０℃以下の温度で長期に渡って保存すること、
前記凍結混合物を０℃を越える温度に上げること、
潅水または水洗によって前記保存液の全てまたは一部を除去すること、
所望により、前記サンプルから前記ＤＮＡ／ＲＮＡを分離すること、
そのＤＮＡおよび／またはＲＮＡを増幅すること、
を含むことを特徴とする方法。 - ＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅されることを特徴とする請求項１１の方法。
- ＲＮＡは逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅されることを特徴とする請求項１１の方法。
- 前記１個または数個の水溶性セルロース誘導体は、アルキル化セルロース、ヒドロキシ‐アルキル化セルロース、および、アルキル化／ヒドロキシ‐アルキル化セルロースから選ばれることを特徴とする請求項１１の方法。
- 前記１個または数個の水溶性セルロース誘導体は、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチル‐メチルセルロース、ヒドロキシエチル‐エチルセルロース、ヒドロキシプロピル‐メチルセルロースから選ばれることを特徴とする請求項１４の組み込み媒体。
- 前記１個の水溶性セルロース誘導体がヒドロキシプロピル‐メチルセルロースであることを特徴とする請求項１５の組み込み媒体。
- 実質的に、水溶性セルロース誘導体および、要すれば添加してもよい浸透圧安定化剤から成る水溶液中に、０℃未満の温度で長期に渡って組み込まれた細胞および組織由来のＤＮＡの増幅によって得られたＤＮＡ。
- ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された、請求項１７のＤＮＡ。
- 実質的に、水溶性セルロース誘導体および、要すれば添加してもよい浸透圧安定化剤から成る水溶液中に、０℃未満の温度で長期に渡って組み込まれた細胞および組織由来のＲＮＡの増幅によって得られたＤＮＡ。
- 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅された、請求項１９のＤＮＡ。
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