JP2004504020A - ２型樹状細胞前駆体由来のコード核酸ならびに関連の組成物および方法 - Google Patents

Abstract

免疫系の樹状細胞に関連する遺伝子が、単離され、クローニングされ、配列決定され、そして機能的に同定された。これらの核酸およびコードされたタンパク質を、診断目的および治療目的のために使用し得る。配列番号２、４または６に由来するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。成熟タンパク質のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。配列番号２、４または６に由来するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、免疫系において機能する細胞である樹状細胞に関連する遺伝子に関する。本発明は、より具体的には、樹状細胞から単離された核酸、該核酸によってコードされるタンパク質ならびに関連の診断的および治療的な組成物および方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
樹状細胞は、抗原の取り込みおよびＴ細胞に対する抗原提示において専門化する。従って、樹状細胞は、抗原特異的免疫応答において重要な役割を果たす。
【０００３】
樹状細胞は、体中で種々のリンパ組織および非リンパ組織に広く分布する、形態学的に類似した細胞型の多様な集団によって表される（Ｃａｕｘら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　１６：２；Ｓｔｅｉｎｍａｎ、１９９１、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１−２９６）。例えば、これらの細胞としては、脾臓のリンパ樹状細胞、表皮のランゲルハンス細胞および血液循環中のベール細胞が挙げられる。樹状細胞は、集合的に、その形態、高レベルの表面ＭＨＣクラスＩＩ発現、ならびにＴ細胞の結合および同時刺激を媒介するいくつかのアクセサリー分子（Ｂ７−１［ＣＤ８０］およびＢ７−２［ＣＤ８６］）の発現に基づいて、グループとして分類される（Ｉｎａｂａら、１９９０、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１９７−２０６；Ｆｒｅｎｄｅｎｔｈａｌら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：７６９８）。さらに、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球およびナチュラルキラー細胞上で発現される特定の他の表面マーカーの非存在は、樹状細胞を示す。
【０００４】
樹状細胞は、骨髄由来であり、そして血流を介して前駆体として組織に移動し、ここで、樹状細胞は、表皮のランゲルハンス細胞のような常在性の細胞になる。末梢において、病原体の侵入後に、未成熟樹状細胞（例えば、新鮮なランゲルハンス細胞）は、炎症部位で補充され（Ｋａｐｌａｎら、１９９２、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１７１７−１７２８；ＭｃＷｉｌｌｉａｍら、１９９４、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１３３１−１３３６）、ここで、樹状細胞は、抗原を捕捉し、そしてプロセシングする（Ｉｎａｂａら、１９８６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：６０５−６１３；Ｓｔｒｅｉｌｅｉｎら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３９２５−３９３３；Ｒｏｍａｎｉら、１９８９、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１１６９−１１７８；Ｐｕｒｅら、１９９０、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１４５９−１４６９；Ｓｃｈｕｌｅｒら、１９８５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６１：５２６−５４６）。
【０００５】
次いで、抗原をロードされた樹状細胞は、末梢組織から、リンパ管を介してリンパ節のＴ細胞豊富な領域に移動し、ここで、成熟樹状細胞は、樹枝状細胞（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｉｎｇ　ｃｅｌｌ）と呼ばれる。（Ａｕｓｔｙｎら、１９８８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：６４６−６５１；Ｋｕｐｉｅｃ−Ｗｅｇｌｉｎｓｋｉら、１９８８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：６３２−６４５；Ｌａｒｓｅｎら、１９９０、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１４８３−１４９４；Ｆｏｓｓｕｍ，Ｓ．１９８８、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：９７−１０５；Ｍａｃａｔｏｎｉａら、１９８７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１６５４−１６６７；Ｋｒｉｐｋｅら、１９９０、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：２８３３−２８３８）。この部位で、樹状細胞は、プロセシングされた抗原をナイーブなＴ細胞に提示し、そして抗原特異的な一次Ｔ細胞応答を生成する（Ｌｉｕら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：１２９９−１３０７；Ｓｏｒｎａｓｓｅら、１９９２、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１５−２１；Ｈｅｕｆｌｅｒら、１９８８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：７００−７０５）。
【０００６】
末梢組織からリンパ器官への移動の間、樹状細胞は、表現型および機能におけうる劇的な変化を包含する、成熟プロセスを経る（Ｌａｒｓｅｎら、１９９０、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１４８３−１４９４；Ｓｔｒｅｉｌｅｉｎｅら、１９９０、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１１７：１５９−１８４；Ｄｅ　Ｓｍｅｄｔら、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：１４１３−１４２４）。特に、可溶性タンパク質を効果的に捕捉およびプロセスし、そして特異的記憶およびエフェクターＴ細胞の活性化において有効な、未成熟樹状細胞（例えば、新鮮なランゲルハンス細胞）とは対照的に、成熟樹状細胞（例えば、リンパ器官の樹枝状細胞）は、抗原捕捉およびプロセシングにおいて劣るが、ナイーブなＴ細胞のプライミングにおいては顕著に効果的である（Ｉｎａｂａら、１９８６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：６０５−６１３；Ｓｔｒｅｉｌｅｉｎら、１９８９、Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３９２５−３９３３；Ｒｏｍａｎｉら、１９８９、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１１６９−１１７８；Ｐｕｒｅら、１９９０、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１４５９−１４６９；Ｓａｌｌｕｓｔｏら、１９９５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：３８９−４００；Ｃｅｌｌａら、１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１０−１６）。複合体輸送および樹状細胞の成熟パターンを調節するシグナルは、複雑でありかつ完全には理解されていない。
【０００７】
抗原提示およびＴ細胞活性化における機能に加えて、腫瘍抗原をロードされた樹状細胞は、腫瘍の発達を予防し、そして確立された腫瘍の退行を誘導しさえすることが示されている。さらに、樹状細胞の特定の亜集団は、同種移植およびおそらく異種移植の分野において非常に有用であることを証明し得る特性である耐性状態を誘導し得るという証拠が、現在存在する。従って、どの樹状細胞のサブセットが、異なる病理学において標的化されるべきかを規定することが重要である。
【０００８】
免疫系機能および関連の腫瘍増殖抑制に対する樹状細胞の重要性にもかかわらず、樹状細胞は、樹状細胞の起源、樹状細胞が発現するタンパク質、および樹状細胞の多くの機能に関して、特徴付けが不十分のままである。特に、免疫応答の開始（抗原のプロセシングおよび提示を含む）に関連するプロセスおよび機構は、十分に解明されていない。
【０００９】
樹状細胞は、骨髄および非骨髄由来の細胞型を含む、いくつかの供給源に起源する。こうして同定された樹状細胞の多くは、はるかに単球（骨髄）起源に由来する。おそらくリンパ起源に由来する樹状細胞の、これまで分類分けされていないサブセットは、特に研究および分類分けの価値がある。なぜなら、この樹状細胞のサブセットは、大量のインターフェロンαを生成するからである。インターフェロンαは、ウイルス病原体の抑制において特に重要であり、そしてまた癌抑制においても意図される。
【００１０】
従って、樹状細胞の成熟、輸送および機能に関与する遺伝子およびタンパク質の同定についての重要な必要性が、当該分野において存在する。さらに、免疫系の機能に非常に重要なこれらの細胞の不適切な調節、発達および／または生理学によって引き起こされる医学的状態の診断および処置において有用な薬剤についての必要性が存在する。
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、樹状細胞から単離された新規遺伝子を提供することによって、これらの必要性を満たす。樹状細胞のこの特定のサブセットは、おそらく、骨髄起源に対して、リンパ起源のものである。この新規遺伝子は、おそらく、細胞表面レセプターおよび分泌タンパク質としてこのような分子をコードする。これらの遺伝子は、樹状細胞によって生成されるかまたは樹状細胞上に発現される特定の遺伝子産物の存在、量、分布および常態を研究するために使用され得る。これらはまた、特定の疾患状態を診断および処置するために有用な、組成物および方法の発見を容易にするために使用され得る。
【００１２】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号２、４または６に由来するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。配列番号２、４または６に由来するポリペプチドは、配列番号２、４または６由来の少なくとも８、好ましくは少なくとも１０、そして最も好ましくは少なくとも約１２以上連続するアミノ酸残基ならびにこれらの配列の配列と機能の保存的改変体を含む。好ましい実施形態において、このアミノ酸配列は、成熟タンパク質をコードする。
【００１３】
関連の実施形態において、本発明は、配列番号２、４または６に由来するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。この単離された核酸配列は、配列番号２、４または６由来の、少なくとも約１２、好ましくは少なくとも約１８、より好ましくは少なくとも２０〜３５、そして最も好ましくは３５〜５５以上連続するヌクレオチドを含む。この核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＡＮＤ／ＲＮＡ二重鎖、タンパク質−核酸またはこれらの誘導体であり得る。好ましい実施形態において、この核酸配列は、配列番号１、３または５に示される核酸配列を含む。
【００１４】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡベクター（ＤＮＡベクターおよび発現ベクターを含む）；このようなベクターを含む細胞（細菌、真菌、植物、昆虫および哺乳動物の細胞を含む）、ならびにこれらの配列によってコードされるＲＮＡおよびポリペプチドを含む発現産物を生成するための方法を包含する。
【００１５】
なお別の実施形態において、本発明は、請求項１のポリペプチドに特異的に結合する結合化合物を提供する。好ましくは、この結合化合物は、抗体または抗体フラグメントである。最も好ましくは、この結合化合物は、モノクローナル抗体である。
【００１６】
本発明はまた、サンプル中の本発明の核酸およびポリペプチドを検出するための方法を提供する。本発明の核酸を検出するための方法は、以下の工程を包含する：（１）ハイブリダイゼーションが生じ得る条件下で、サンプルを、配列番号１、３または５から選択される少なくとも８連続するヌクレオチドを含む核酸を含むプローブと接触させる工程；および（２）存在する場合、ハイブリダイゼーションを検出する工程。本発明のポリペプチドを検出するための方法は、以下の工程を包含する：（１）サンプルを、検出されるべきポリペプチドに特異的な抗体または抗体フラグメントと接触させる工程；および（２）抗原−抗体複合体の存在を検出する工程。
【００１７】
最後に、本発明は、候補治療剤のスクリーニングの方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（１）配列番号２、４または６由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドを標的として選択する工程；および（２）試験化合物を標的配列と接触させる工程；および（３）この標的配列に結合する試験化合物を、候補治療剤として選択する工程。
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、樹状細胞由来の核酸およびコードされたタンパク質に関する。さらに、本発明は、これらの核酸およびタンパク質を利用する診断方法および治療方法に関する。
【００１９】
本明細書中で引用される全ての特許出願、特許および文献は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【００２０】
本発明の実行において、分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡにおける多くの慣用的な技術が使用される。このような技術は、周知であり、そして、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ；ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻、１９８５（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、１９８４（Ｍ．Ｌ．Ｇａｉｔ編）；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、１９８５（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、１９８４（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編）；Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ、１９８６（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ、１９８６（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）；Ｐｅｒｂａｌ、１９８４、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；シリーズ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．）；Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌｓ、１９８７（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；およびＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１５４巻および第１５５巻（それぞれ、ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ編、ならびにＷｕ編）において完全に説明される。
【００２１】
本発明を詳細に説明する前に、以下の定義が、本明細書および特許請求の範囲の理解を助けるために提供される：
「樹状細胞由来の（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ−ｄｅｒｉｖｅｄ）」核酸またはポリペプチドとは、その配列が元々単離された供給源をいう。
【００２２】
「富化された遺伝子産物」とは、特定の細胞型または組織によって大量に生成されるタンパク質である。
【００２３】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」とは、任意の長さの、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドのいずれか、あるいは混合されたポリリボ−ポリデオキシリボヌクレオチドの、プリン含有ポリマーおよびピリミジン含有ポリマーをいう。これは、一本鎖の分子および二本鎖の分子（すなわち、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド）、ならびにアミノ酸骨格に塩基を結合体化することによって形成される「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）を含む。これはまた、改変された塩基を含む核酸を含む。
【００２４】
「コード配列」または「タンパク質コード配列」とは、ｍＲＮＡに転写され得るポリヌクレオチド配列および／またはポリペプチドに翻訳され得るポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、代表的に、５’末端の翻訳開始コドンおよび３’末端の翻訳終止コドンによって決定される。
【００２５】
核酸配列の「相補体」とは、元の配列とのＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対に関与する「アンチセンス」配列をいう。
【００２６】
「単離された」核酸またはポリペプチドとは、その元の環境（例えば、それが天然に存在する場合は、天然の環境）から取り出された成分をいう。単離された核酸またはポリペプチドは、好ましくは、それが元々関連する細胞成分の約５０％未満、より好ましくは約７５％未満、そして最も好ましくは約９０％未満を含む。
【００２７】
指定された配列「に由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ）」核酸配列またはポリペプチド配列とは、指定された配列のある領域に対応する配列をいう。核酸配列について、これは、この配列ならびに「配列保存的改変体」および「機能保存的改変体」に相同または相補的である配列を包含する。ポリペプチド配列について、これは、「機能保存的改変体」を包含する。配列保存的改変体とは、所定のコドン位置における１以上のヌクレオチド変化がその位置でのコードされたアミノ酸の変更を生じない、改変体である。機能保存的改変体は、ポリペプチド中の所定のアミノ酸残基がネイティブなポリペプチドの全体の立体構造および機能を実質的に変更せずに変化された改変体であり、同様の物理化学的特性（例えば、酸性、塩基性、疎水性など）を有するアミノ酸でのアミノ酸の置換を含むが、これに限定されない。「機能保存的」改変体はまた、指定されたポリペプチドに特異的な抗体を惹起する能力を有する任意のポリペプチドを含む。
【００２８】
「プローブ」は、プローブ中の少なくとも１つの配列の、標的中の配列との相補性に起因して、この標的領域中の配列とハイブリッド構造を形成する核酸またはオリゴヌクレオチドをいう。
【００２９】
核酸は、核酸の少なくとも１つの鎖が、規定されたストリンジェンシーの条件下で別の核酸鎖にアニールし得る場合に、互いに「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば、ａ）ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄が実行される温度、そしてｂ）ハイブリダイゼーション溶液および洗浄溶液のイオン強度および極性（例えば、ホルムアミド）ならびに他のパラメーターによって決定される。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が実質的に相補的な配列を含むことを必要とする；しかし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、ミスマッチが許容され得る。核酸をハイブリダイズするために適切なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度、当該分野で周知の変数に依存する。
【００３０】
「免疫原性成分」とは、宿主動物において体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を惹起し得る部分をいう。
【００３１】
「抗原性成分」とは、十分に高い親和性でその特異的な抗体に結合し、検出可能な抗原−抗体複合体を形成する部分をいう。
【００３２】
「サンプル」とは、例えば、個体またはインビトロの細胞培養物成分から単離される組織または液体のような生物学的サンプル、ならびに実験室の手順から獲得されるサンプルをいう。
【００３３】
本発明は、樹状細胞によって発現されるかおよび／または樹状細胞上に発現される哺乳動物タンパク質をコードする核酸配列を提供する。特定のヒト樹状細胞由来の遺伝子および遺伝子産物が本明細書中に記載されるが、本発明は、他の供給源または哺乳動物種由来の構造的に関連する（例えば、配列）実施形態（多型改変体または個体改変体を含む）を包含する。これらとしては、例えば、配列（例えば、約５％未満）および数（例えば、２０残基未満の置換（代表的には、１５未満、好ましくは１０未満およびより好ましくは５未満の置換））に置いて相対的にほとんど変化を示さないタンパク質が挙げられる。これらとしてはまた、これらの配列の実質的なセグメントを含む全長タンパク質および融合タンパク質から短縮されたバージョンが挙げられる。
【００３４】
本発明者らは、推定リンパ起源の樹状細胞から、３つの遺伝子を単離した。ヒトは、樹状細胞前駆体の２つの別個のサブセットを有する。末梢血単球は、いくつかの補因子での刺激および／または身体における適切なプロセシング後に、成熟骨髄（Ｉ型）樹状細胞（ＤＣ１）を生じる。ＩＩ型樹状細胞（ＤＣ２）は、推定リンパ起源から生じる。例えば、ヒト扁桃および血液由来のプラズマ細胞（リンパ）は、ＩＩ型樹状細胞に分化する（Ｒｉｓｓｏａｎら、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８３：１１８３）。Ｉ型およびＩＩ型の樹状細胞は、異なる表面マーカーを有する。ＩＩ型、ＣＤ３⁻ＣＤ４^＋ＣＤ１１ｃ⁻の樹状細胞は、エンベロープのあるウイルス、細菌および腫瘍細胞に応答する、主要なインターフェロンαプロデューサーである（Ｓｉｅｇａｌら、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８４：１８３５）。実施例Ｉは、これらのＩＩ型樹状細胞の単離を記載する。
【００３５】
（実施例Ｉ）
（ＣＤ３⁻ＣＤ４^＋ＣＤ１１ｃ⁻Ｌｉｎ⁻細胞の精製）
ＣＤ３⁻ＣＤ４^＋ＣＤ１１ｃ⁻細胞を、ヒト扁桃から単離した。簡潔には、扁桃を、小片に切断し、そしてＲＰＭＩ　１６４０中のコラゲナーゼＩＶ（１ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）およびデオキシリボヌクレアーゼＩ（５０ＫＵ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）で、３７℃で１２分間消化した。２回の組織消化からプールされた細胞を、４００ｇで２０分、５０％を超えるＰｅｒｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で遠心分離した。ＣＤ３^＋Ｔ細胞、ＣＤ１４^＋単球ＣＤ１９^＋Ｂ細胞およびＣＤ２０^＋Ｂ細胞、ならびにＣＤ５６^＋ＮＫ細胞を、得られた低密度の細胞から、免疫磁気ビーズ（シート抗マウスＩｇコートされたＤｙｎａｂｅａｄｓ；Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）によって枯渇させた。得られた細胞を、マウス抗ＣＤ４−ＰＥ−Ｃｙ５（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）、抗ＣＤ１１ｃ−ＰＥ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ならびにＦＩＴＣ標識されたｍＡｂ抗ＣＤ３および抗ＣＤ３４のカクテル（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ５７、抗ＣＤ７、抗ＣＤ１４および抗ＣＤ１６（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ならびに抗ＣＤ１ａ（Ｏｒｔｈｏ）で染色した。次いで、ＣＤ３⁻ＣＤ４^＋ＣＤ１１ｃ⁻Ｌｉｎ⁻細胞を、細胞分類によって単離した。分類された細胞の再分析によって、９８％の純度を確認した（Ｇｒｏｕａｒｄら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８５：１１０１−１１１１）。
【００３６】
ＣＤ３⁻ＣＤ４^＋ＣＤ１１ｃ⁻細胞によって主におよび／または排他的に生成される３つの遺伝子（本明細書中以降、コンティグ５８、９２および２０という）を、単離し、配列決定し、そしてｃＤＮＡサブトラクションを介して機能的に同定した。コンティグ５８は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列および配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。コンティグ９２は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する。コンティグ２０は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列および配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する。要するに、ｃＤＮＡサブトラクションは、１つのｍＲＮＡ集団で発現されるが、別のｍＲＮＡ集団においては減少しているかまたは存在しない遺伝子を見出すための方法である。実施例ＩＩは、このサブトラクションプロセスを記載する。
【００３７】
（実施例ＩＩ）
（サブトラクトされたｃＤＮＡライブラリーの構築）
扁桃由来の９８％精製されたＣＤ３⁻ＣＤ４^＋ＣＤ１１ｃ⁻細胞から単離されたｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡを、ＣＤ３⁻ＣＤ４^＋ＣＤ１１ｃ⁻細胞によって排他的に生成されるか、または少なくとも豊富な生成を示す遺伝子産物を決定するために、単球由来のＤＣ１から単離されたｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡからサブトラクトした。このＣＤ３⁻ＣＤ４^＋ＣＤ１１ｃ⁻細胞を、ＩＬ−３およびＣＤ４０Ｌ繊維芽細胞中で、一晩または４８時間培養した（細胞の２つのサブセットをプールした）。単球由来のＤＣ１を、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ４中で６日間培養し、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＣＤ４０Ｌで一晩または４８時間活性化した。相補的ＤＮＡの合成およびサブトラクションを、Ａｄｖａｎｔａｇｅ^ＴＭ　Ｋｌｅｎ　Ｔａｇポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用するＰＣＲ−ｓｅｌｅｃｔキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）を利用して実行した。サーマルサイクラー（４８０；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｏｒｐ．、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）で、１回目のＰＣＲ反応を２８サイクル行い、そして２回目の（ネスト化）ＰＣＲを１２サイクル行った。サブトラクトしたＤＣ　ｃＤＮＡをクローニングするため、１０回のネスト化反応物をプールし、そして２％の低融点アガロースで分離した。個々のバンドを照準として、０．７〜１．４ｋｂのサイズ範囲のゲルスライスを切り出し；ＤＮＡを溶出し、そして直接または増幅後のいずれかで、Ｔ／Ａベクター（ｐＣＲＩＩ　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中にクローニングした。挿入物を自動配列決定によって、両方の方向で配列決定した。ＧｅｎＢａｎｋおよびｄｂｅｓｔデータベースに対する比較ならびにタンパク質相同性予測を、ＮＣＢＩ　ｂｌａｓｔサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）から獲得した。
【００３８】
（コンティグ５８）
コンティグ５８は、実施例Ｉに記載のプラズマ細胞の富化された遺伝子産物であるが、これらの細胞によって排他的に生成されない。コンティグ５８は、配列番号１によってコードされる。コンティグ５８によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２に示される。
【００３９】
コンティグ５８の完全配列を獲得した後、ＢＬＡＳＴ分析を使用して、他の遺伝子に対する相同性について配列を分析した。実施例ＩＩＩは、このプロセスを記載する。
【００４０】
（実施例ＩＩＩ）
（単離されたコンティグの、既知の遺伝子に対する配列比較）
配列比較のために、代表的に１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、必要な場合、部分配列の座標を指定し、そして配列アルゴリズムパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する、試験配列の配列同一性パーセントを算定する。
【００４１】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所的相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：２４４４の類似性検索方法、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ、５７５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）のコンピューター化された実行、または目視検査（一般には、Ａｕｓｂｅｌら、前出を参照のこと）によって実行され得る。
【００４２】
配列の同一性および配列の類似性のパーセントを決定するのに適切なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載される）である。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を介して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、問い合わせ配列中のＷ長の短い単語を同定することによって、高いスコアリング配列の対（ＨＳＰ）を最初に同定することを包含し、これは、データベース配列において同じ長さの単語とアラインメントさせる（ａｌｉｇｎ）場合に何らかの正の値の閾値スコアＴと一致するかまたは閾値スコアＴを満足させるかのいずれかである。Ｔとは、近隣単語スコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前出）。これらの最初の近隣単語のヒットは、検索を開始するためにシード（ｓｅｅｄ）として作用して、これらを含む、より長いＨＳＰを見出す。次いで、これらの単語のヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。各方向におけるこれらの単語のヒットの伸長は、以下の場合に中断される：累積アラインメントのスコアがその最大到達値から量Ｘ低下する場合；累積スコアが、１つ以上の負のスコアリングの残基アラインメントの累積に起因して、ゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、このアラインメントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、単語長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：１０９１５を参照のこと）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較をデフォルトとして用いる。
【００４３】
配列同一性のパーセントを算出するのに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的解析を実施する（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：５８７３−５７８７を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間または２つのアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸の参照核酸との比較における最小和確率が約０．１より低い、より好ましくは約０．０１より低い、そして最も好ましくは約０．００１より低い場合、参照配列に類似するとみなされる。
【００４４】
保存されたアラインメントのパターン（いくつかの程度のストリンジェンシーで認められる）を、コンセンサスプログラム（インターネットＵＲＬ　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｏｒｋ．ｅｍｂｌ−Ｌｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ．ｈｔｍｌ）によって引き出した。タンパク質のフィンガープリントのＰＲＩＮＴＳライブラリー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｂｓｍ／ｄｂｂｒｏｗｓｅｒ／ＰＲＩＮＴＳ／ＰＲＩＮＴＳ／ｈｔｍｌ）（Ａｔｔｗｏｏｄら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：２１２−２１７）は、多様なロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）のＮ末端の特徴およびＣ末端の特徴を柔軟に一致させる化合物モチーフ（ＰＲＩＮＴＳコードＬｅｕｒｉｃｈｒｐｔ）を用いてコンティグ５８の細胞外セグメント中に存在するＬＲＲを確実に同定した。三状態（ｔｈｒｅｅ−ｓｔａｔｅ）の精度が７２％を超える２つの予測アルゴリズムを用いて、認識作動力（ｅｆｆｏｒｔ）を折り畳むための架橋（ｂｒｉｄｇｅ）として細胞内ドメインのアラインメントについてのコンセンサス二次構造を誘導した（Ｆｉｓｃｈｅｒら（１９９６）ＦＡＳＥＢ　Ｊ．１０：１２６−１３６）。神経ネットワークプログラムＰＨＤ（ＲｏｓｔおよびＳａｎｄｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　１９：５５−７２）ならびに統計学的予測方法ＤＳＣ（ＫｉｎｇおよびＳｔｅｒｎｂｅｒｇ（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉ．５：２２９８−２３１０）は両方とも、インターネットサーバー（それぞれのＵＲＬ　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ−ｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ｐｒｅｄｉｃｔｐｒｏｔｅｉｎ／ｐｈｄ＿ｐｒｅｄ．ｈｔｍｌおよびｈｔｔｐ：ｂｏｎｓａｉ．ｌｉｆ．ｉｃｎｅｔ．ｕｋ／ｂｍｍ／ｄｓｃ／ｄｓｃ＿ｒｅａｄ＿ａｌｉｇｎ．ｈｔｍｌ）を有する。
【００４５】
（実施例ＩＶ：コンティグの染色体局在決定）
染色体局在決定を、Ｓｔａｎｆｏｒｄ　Ｇ３　ＲＨ中分解能パネルを用いて実施した（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）。ＰＣＲを、目的の遺伝子を特異的に増幅するが、そのマウス等価物を増幅しないオリゴヌクレオチドを用いて実施する。結果を、異なる細胞株由来のゲノムＤＮＡ中のＰＣＲフラグメントの存在または非存在によってスコアリングする。この情報を、手動でスコアリングし、そして解析をＲＨマッパー（ｍａｐｐｅｒ）プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｓｈｇｃ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ）を用いて実施する。この方法を用いると、コンティグ５８は、染色体１９ｑ１３−ｑ１２（免疫系の細胞表面レセプターをコードする多数の遺伝子を含む染色体の領域）に局在決定された。同様に、ＢＡＣクローンＡＣ００８３９７に対する相同性によって、類似の染色体の局在が示される。
【００４６】
ＢＬＡＳＴ解析に加えて、コンティグ５８の推定ＯＲＦを、ｐＳＯＲＴを用いてモチーフおよびタンパク質局在シグナルに関して解析した。
【００４７】
（実施例Ｖ：コンティグのｐＳＯＲＴ解析）
（１．シグナル配列の認識）
真核生物において、いわゆる小胞経路（大きな流れ）を介してソーティングされるタンパク質は、通常、Ｎ末端にシグナル配列（リーダーペプチドともいう）を有し、これは、ＥＲ膜を介してトランスロケーションされた後、切断される。いくつかのＮ末端シグナル配列は、切断されず、膜貫通セグメントとして残っているが、これは、これらのタンパク質がＥＲに保持されることを意味しない；これらはさらに、小胞中に含まれてソーティングされ得る。ｐＳＯＲＴは、シグナル配列の存在を、ＮａｋａｉおよびＫａｎｅｈｉｓａ（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　１１（２）：９５−１１０　１９９１）ならびにＮａｋａｉ，１９９６によって改変されたＭｃＧｅｏｃｈ方法（Ｄ．Ｊ．ＭｃＧｅｏｃｈ，Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ．，３：２７１，１９８５）によって最初に予測する。それは、シグナル配列のＮ末端の正に荷電した領域（Ｎ領域）および中央の疎水性領域（Ｈ領域）を考慮する。判別スコアを、３つの値：Ｈ領域の長さ、Ｈ領域のピーク値、およびＮ領域の正味の電荷から算出する。大きな正の判別スコアは、そのタンパク質がシグナル配列を保有する可能性が高いことを意味するが、それはその切断の可能性とは関連しない。次に、ｐＳＯＲＴは、シグナル配列認識のｖｏｎ　Ｈｅｉｊｎｅ方法（Ｇ．ｖｏｎ　Ｈｅｉｊｎｅ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１４：４６８３，１９８６）を適用する。それは、重み行列方法であり、そして切断部位（（−３，−１）規則）周辺のコンセンサスパターンの情報およびＨ領域の特性を組み込む。従って、それを用いて、シグナル−アンカー配列を検出し得る。この「ＧｖＨ」のアウトプットスコアは、３．５を減じた、もとの重み行列スコア（真核生物について）である。大きな正のアウトプットは、それが切断可能なシグナル配列を有する可能性が高いことを意味する。可能性のある切断部位の位置（すなわち、シグナル配列の最もＣ末端側の位置）もまた、報告される。
【００４８】
（２．膜貫通セグメントの認識）
ｐＳＯＲＴの現在のバーションは、全ての内在性膜タンパク質が疎水性の膜貫通セグメント（膜中でαへリックスであると考えられる）を有すると仮定する。ｐＳＯＲＴは、ＮａｋａｉおよびＫａｎｅｈｉｓａ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９２，１４（４）：８９７−９１１　１９９２）によって改変された潜在的な膜貫通セグメントを検出するためのＫｌｅｉｎらの方法（ＡＬＯＭ，ＫＫＤともいう）（Ｐ．Ｋｌｅｉｎ，Ｍ．Ｋａｎｅｈｉｓａ，およびＣ．ＤｅＬｉｓｉ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，８１５：４６８，１９８５）を利用する。それを反復して、存在する場合、１７残基のセグメントの平均疎水性値から最もありそうな膜貫通セグメントを同定する。これは、判別スコア（「ＡＬＯＭスコア」として報告される）を閾値パラメーターと比較して、そのセグメントが膜貫通セグメント（内在性（ＩＮＴＥＧＲＡＬ））であるかまたはそうでない（周辺性（ＰＥＲＩＰＨＥＲＡＬ））かを予測する。内在性膜タンパク質について、膜貫通セグメントの位置もまた、報告される。これらの長さを１７に固定するが、その伸長（すなわち、判別基準を満たす最大範囲）もまた丸括弧の中に示す。上記の判別工程は、検出されたセグメントを除いた後、推定膜貫通セグメントがなくなるまで続ける。項目「ＴＭＳの数」は、推定膜貫通セグメントの数である。このアルゴリズムを、推定成熟配列（すなわち、切断可能なシグナル配列が含まれない）に対して適用するので、この数を、成熟タンパク質についての数字であると予測する。ＮａｋａｉおよびＫａｎｅｈｉｓａ，１９９２による改変は、２種類の閾値の値を利用した。なぜなら、ＡＬＯＭは、ポリトープ性（ｐｏｌｙｔｏｐｉｃ）（すなわち、複数の膜貫通）タンパク質の膜貫通セグメントの正確な数を予測するのにそれほど厳密ではないからである。このアプローチの理論的根拠は、一旦このポリペプチドの一部が組み込まれると、より疎水性の低いセグメントはより容易に膜に組み込まれるようであることである。特に、ｐＳＯＲＴは、よりストリンジェントの低い値（０．５）を用いて膜貫通セグメントの数を最初に試験的に評価する。次いで、よりストリンジェントな閾値（−２．０）を用いることによってその数を再評価する。少なくとも１つの膜貫通セグメントを有すると依然として予測される場合、先の閾値の値が用いられる。
【００４９】
（３．膜トポロジーの予測）
いずれの膜タンパク質も、膜に組み込まれるべきそれ自体の配向性を有する。換言すると、膜タンパク質は、どちら側（細胞質側または細胞質外側）にＮ末端が位置するかをわかっている。このような配向は、膜トポロジーといわれる。膜トポロジーについてのＳｉｎｇｅｒの分類（Ｓ．Ｊ．Ｓｉｎｇｅｒ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，６：２４７，１９９０）を利用した。膜トポロジーの予測は重要である。なぜなら、いくつかのソーティングされたシグナルは、特定のトポロジーにおいて特定の位置（例えば、細胞質末尾）に存在するからである（以下を参照のこと）。ｐＳＯＲＴは、膜トポロジーの予測のためにＨａｒｔｍａｎｎらの方法（Ｅ．Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｔ．Ａ．Ｒａｐｏｐｏｒｔ，およびＨ．Ｆ．Ｌｏｄｉｓｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：５７８６，１９８９）；ｐＳＯＲＴにおいて「ＭＴＯＰ」といわれる）を用いる。ＭＴＯＰは、真核生物の膜タンパク質の全体のトポロジーが、両側における最もＮ末端側の膜貫通セグメントに隣接する１５残基の正味の電荷の差によって決定されると仮定する。このようなセグメントの中央の残基は、最初に報告される。タンパク質が切断可能な１つのシグナル配列および１つの膜貫通セグメントを有すると予測される場合、そのトポロジーは、「１ａ」である。タンパク質が切断可能なシグナル配列を有さないが１つの膜貫通セグメントを有すると予測される場合、その位置が試験される。それがそのＣ末端付近に存在する場合、そのトポロジーは、「Ｎｔ（Ｎ尾部）」として割り当てられる（Ｕ．Ｋｕｔａｙら，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，３：７２−７５，１９９３を参照のこと）。他の場合、そのトポロジーは、ＭＴＯＰによって報告される電荷の差に依存して「１ｂ」または「２」に割り当てられる。ポリトープ性タンパク質について、それらのトポロジーは、ＭＴＯＰによって単純に予測される。
【００５０】
コンティグ５８について、ｐＳＯＲＴは、１型膜タンパク質（すなわち、（アミノ酸約１〜２４の）Ｎ末端の切断可能なシグナルペプチドおよび約１６６〜１８２の１つの膜貫通セグメントを有するタンパク質）を予測する。このタンパク質のＮ末端は細胞の外側に存在し、Ｃ末端は細胞の内側に存在する。コンティグ５８によってコードされるタンパク質は、いくつかのロイシンリッチリピートを有すると特徴付けられる。これらのリピートは、タンパク質／タンパク質の相互作用にしばしば関連する。広範な潜在的なリガンドは、これらのモチーフを認識し、これは、分泌サイトカイン様の低分子のシステインｋｎｏｔファミリーのメンバーを含む。この型のドメインもまた、非タンパク質リガンド（例えば、核酸またはリポ多糖類）と相互作用することが公知である。従って、コンティグ５８によってコードされる分子は、新規パターン認識レセプターを示し得る。
【００５１】
推定アミノ酸配列はまた、２つのチロシンベースのモチーフ、ＰＩ３キナーゼとの相互作用のためのモチーフ（ＹＥＮＭ）、およびＩＴＡＭ（免疫レセプターチロシンベースの活性化モチーフ：ＹＸＸＩ／Ｌ　Ｘ（７／８）ＹＸＸＩ／Ｌ）を示す。これらのモチーフは、以下の参考文献に記載される：Ｂｉｅｒｙ　Ｍ．Ｏｌｃｅｓｅら，「Ｅａｒｌｙ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｖｉａ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ａｎｄ　Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ＮＫ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」，Ｈｕｍ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１：５１−６４（Ｊａｎ．６，２０００）；Ｇｅｒｇｅｌｙ　Ｊ．Ｐｅｃｈｔ　Ｉら，「Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｍｏｔｉｆ−ｂｅａｒｉｎｇ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　Ｒｅｇｕｌａｔｅ　ｔｈｅ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｍｏｔｉｆ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ」，Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｌｅｔｔ　１：３−１５（Ｍａｙ　１９９９）；Ｄａｅｒｏｎ，Ｍ．，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｂａｓｅｓ　ｏｆ　Ｆｃ　Ｇａｍｍａ　Ｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ」，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ　１６：１−２７，（１９９７）。
【００５２】
コンティグ５８は、架橋したとき細胞の活性化を引き起こすシグナルを生じる、膜複合体の成分である型の分子であると考えられる。ＩＴＡＭ型のモチーフは、一般的に免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーまたはレクチンに関連し、従って、この分子は、新規ファミリーの細胞表面レセプターを示し得る。
【００５３】
ｐＳＯＲＴによって解明されるようなその構造、ＢＬＡＳＴによって解明されるような他の遺伝子に対するその相同性、およびそのアミノ酸配列に基づいて、コンティグ５８は、先天免疫細胞および好転免疫細胞の損傷誘導性活性化に関連する新規型のレセプターを示し得る。コンティグ５８によってコードされるレセプターを誘発することは、免疫機能を刺激または調整し得る。同様に、このレセプターをブロックすることは、状態（例えば、自己免疫、移植片拒絶、および中毒性ショック）における過剰な刺激の影響を低減させ得る。
【００５４】
（実施例ＶＩ：ＲＴ−ＰＣＲによる発現分析）
コンティグ５８の発現パターンを、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって分析した。ｍＲＮＡを、細胞、組織または細胞株から、ｍＲＮＡを含むポリＡを単離するためのオリゴｄＴ結合体化磁気ビーズを用いて単離し、そして第１鎖ｃＤＮＡ合成を標準的方法を用いて実施した。次いで、コンティグ５８の発現パターンを分析した。新たに単離された細胞において、コンティグ５８は、非活性化Ｂ細胞、単球およびＣＤ３−ＣＤ４＋Ｃｄ１１ｃ−ＤＣによって発現される。インビトロで生じた細胞において、コンティグ５８は、ＣＤ３４＋前駆体から生じた顆粒球およびＤＣによって発現される。コンティグ５８によってコードされる遺伝子の発現は、ＭＲＣ５（胎児肺線維芽細胞）、ＣＨＡ（腎臓上皮細胞）、ＪＹ（ＥＢＶ誘導性Ｂ細胞株）、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ細胞株）、Ｕ９３７（組織球性骨髄腫）およびＴＦ１（造血前駆体）のような細胞株においては見られない。
【００５５】
コンティグ５８によってコードされるこの新規分子は、造血細胞においてＣＤ４０−リガンド活性化によってダウンレギュレートされる。ｍＲＮＡは、ＰＭＡ−イオノマイシンで活性化された造血細胞株および非造血細胞株において検出されなかった。
【００５６】
（実施例ＶＩＩ：組織ノーザンブロットによる発現分析）
総ＲＮＡを、ノーザンブロットおよび第１鎖ｃＤＮＡの調製のために用いた。ノーザンブロットを、ホルムアルデヒド変性ゲルで分離した１０μｇの総ＲＮＡを用いて調製し、そしてＨｙｂｏｎｄ　Ｎ^＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｌｅｓ　Ｕｌｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）にブロッティングした。ヒト成人組織およびヒト胎児組織のブロットもまた用いた（ＭＴＮブロット７７６０−１および７７５６−１　Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ．）。ゲノムＤＮＡを、標準的技術を用いてＰＢＬから単離し、制限酵素で切断し、１％のアガロースゲルで分離し、そしてＨｙｂｏｎｄ　Ｎ^＋膜にブロッティングした。ノーザンブロットおよびサザンブロットのハイブリダイゼーションは、Ｈｉｇｈ　Ｐｒｉｍｅ　Ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍｅｙｌａｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて［^３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した特定のｃＤＮＡに対応するＤＮＡフラグメントを用いてであった。高ストリンジェンシー洗浄を、０．２×ＳＳＣ、０．２％のＳＤＳを用いて２回、３０分間実施した。第１鎖ｃＤＮＡを、５μｇの総ＲＮＡのＤｎａｓｅ　Ｉ処理後、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔキットを用いてオリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｏｒｓａｙ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて調製した。ｃＤＮＡの合成を、βアクチンプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによってチェックした。ＲＴ−ＰＣＲを、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素ならびに緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、０．８ｍＭのｄＮＴＰおよび最終濃度５％のＤＭＳＯを用いて実施した。
【００５７】
ノーザンブロットは、コンティグ５８が、末梢血リンパ球において強い発現を示し、そして脾臓およびリンパ節においてより低い発現を示すことを示す。６０時間の暴露で癌細胞株中で検出可能な発現は存在しない。１８日後、Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫Ｒａｊｉ（ＥＢＶ　Ｂ細胞株）中で弱い発現が存在する。
【００５８】
（コンティグ９２）
コンティグ９２は、実施例Ｉに記載される形質細胞様細胞によって主に産生されるようである。コンティグ９２について、ｐＳＯＲＴは、約５７〜７４の非切断シグナルアンカー配列を有するＩＩ型膜貫通タンパク質を予測する。このタンパク質について予測されるトポロジーは、Ｃ末端が細胞外側、Ｎ末端が細胞質ゾル側である。
【００５９】
（ＲＴ−ＰＣＲによる発現分析）
コンティグ９２にコードされるタンパク質の発現パターンを分析するために利用される詳細なプロトコルについては実施例ＶＩを参照のこと。コンティグ９２の発現パターンを、ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。この遺伝子は、ＣＤ３−　ＣＤ４＋　ＣＤ１１ｃ−　ＤＣによって非常に強く発現され、単球および単球由来のＤＣによって発現され、インビトロで生じた顆粒球において弱く発現され、そしてＴ細胞、Ｂ細胞、ならびに細胞株ＪＹおよび細胞株Ｊｕｒｋａｔにおいて非常に弱く発現された。
【００６０】
（組織ノーザンブロットによる発現分析）
詳細なプロトコルについては実施例ＶＩＩを参照のこと。コンティグ９２によってコードされるタンパク質の発現は、全ての造血細胞において検出され、胸腺および虫垂において非常に強く検出され、リンパ節および脾臓、胎児肝臓、骨髄において強く検出され、そして末梢血リンパ球においてより弱く検出される。癌細胞株において、発現は、黒色腫、および慢性白血病ＭＯＬＴ−４において見出される。
【００６１】
（コンティグ２０）
コンティグ２０について、ｐＳＯＲＴは、切断可能なシグナルペプチドを有する分泌タンパク質を予測する。
【００６２】
（ＲＴ−ＰＣＲによる発現分析）
詳細なプロトコルについては実施例ＶＩを参照のこと。コンティグ２０の発現パターンを、ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。この遺伝子は、新たに単離されたＴ細胞およびＢ細胞、ＣＤ３−　ＣＤ４＋　Ｃｄ１１ｃ−　ＤＣ、インビトロで生じた顆粒球およびＣＤ３４＋前駆体から生じたＤＣ、ならびに単球によって発現される。さらに、この遺伝子は、造血細胞株ＪＹおよび造血細胞株Ｊｕｒｋａｔによって発現されるが、造血細胞株Ｕ９３７および造血細胞株ＴＦ１によって発現されず、そして非造血細胞株ＣＨＡおよび非造血細胞株ＭＲＣ５によって発現されない。
【００６３】
（組織ノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）による発現分析）
詳細なプロトコルについては実施例ＶＩＩを参照のこと。ノーザンブロットは、０．７ｋｂの１つの主なバンドおよび４．４ｋｂおよび７．５ｋｂのより高分子量の２つのバンドを示す。
【００６４】
０．７ｋｂのバンドは、配列番号６に示される推定ｃＤＮＡ配列に対応する。より高いＭＷの２つのバンドは、おそらく核のプレｍＲＮＡ（スプライシングされていない）である。この新規タンパク質（コンティグ２０）は、ヒト骨髄、末梢血リンパ球、脾臓、およびリンパ節において高度に発現される。胸腺、虫垂および胎児肝臓において、発現は低減される。コンティグ２０は、ヒト癌細胞株のＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫Ｒａｊｉおよび慢性白血病ＭＯＬＴ−４において発現される。
【００６５】
コンティグ２０は、造血細胞によって発現される推定分泌分子をコードするようである。コンティグ２０において発現されるタンパク質は、サイトカインであり得る。なぜなら、それは分泌され、それは造血細胞中に存在し、その広範な分布は、このタンパク質が細胞の相互作用に重要であることを示唆するからである。
【００６６】
コンティグ２０によってコードされるタンパク質はまた、ディフェンシン様分子であり得る。なぜなら、ディフェンシンは、３つまたは４つの分子内システインジスルフィド結合を有する小さなペプチドのファミリーであり、そしてディフェンシンは、免疫細胞を化学誘引する能力に基づく抗微生物活性を有し、これによって宿主の免疫性を促進させるからである。
【００６７】
コンティグ２０は、新規の広範な造血性増殖因子、およびいくつかの癌（白血病）に対するオートクライン因子を示し得る。これは、免疫細胞の相互作用を定量的および定性的の両方で制御し得、そして免疫刺激因子としてかまたは免疫調節因子として用いられ得る。あるいは、コンティグ２０は、望ましくない免疫反応性（例えば、自己免疫疾患または移植片拒絶）の状態においてブロッキング因子についての標的を示し得る。
【００６８】
（マウスの等価物）
上記の配列のマウス相同体を、各遺伝子のＯＲＦのＢＬＡＳＴ解析（ｔＢＬＡＳＴｎ）を用いて同一の特徴を有するタンパク質を潜在的にコードするマウスＥＳＴを検出することによって検出した。コンティグを、得られた配列を用いて作製し、そして推定タンパク質を、そのヒトタンパク質のように解析した。
【００６９】
コンティグ５８のマウス相同体は、ＥＳＴのＷ８５３０７およびＡＩ４３０３０１によってコードされる。
【００７０】
コンティグ９２のマウス相同体は、脳において発現される（ＥＳＴＡＢ０３０１９９）。
【００７１】
複数のＥＳＴ（８０を超える）が、コンティグ２０に対するマウス相同体として同定された。これら（ｔｈｓｅｓｅ）（および原則として全てのＯＲＦを含むＥＳＴ）のうちの最も５’側のものは、ＡＡ９６８２４２、ＡＡ７９６４６４、ＡＩ３１７７７５である。ノーザンブロットは、脾臓における非常に強い発現、心臓、肺、および肝臓における強い発現、ならびに腎臓における弱い発現を２ｋｂのサイズで示す。精巣において、２ｋｂおよび２．４ｋｂの２つのバンドが見られる。２．４ｋｂのバンドがより強い。骨格筋および脳において発現は見られない
（核酸、ベクター、および宿主細胞）
本発明は、核酸配列（詳細には、配列番号１、配列番号３または配列番号５に示される核酸配列、あるいは配列番号２、配列番号４または配列番号６に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列）を提供する。本発明は、本明細書中で開示される個々の核酸配列の全てまたはその一部を含む単離された核酸フラグメントを包含する。本発明の核酸配列は、少なくとも約１２、好ましくは少なくとも約１８、より好ましくは少なくとも約２０〜３５、そして最も好ましくは少なくとも約３５〜５５またはそれより多い連続するヌクレオチド（完全なタンパク質コード配列、またはその相補体を含む）を含む。本発明は、これらの配列の配列保存的（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）改変体および機能保存的（ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）改変体を包含する。
【００７２】
本明細書中で開示される配列のいずれかを含む核酸またはその部分配列は、配列番号１、配列番号３または配列番号５に提供される核酸配列情報を用いて標準的方法によって調製され得る。例えば、核酸は、例えば、以下を用いて化学的に合成され得る：Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら，１９８１，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５のホスホルアミダイト固体支持体法、Ｙｏｏら，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．７６４：１７０７８の方法、または他の周知の方法。これは、一連のオリゴヌクレオチドカセット（合成用オリゴヌクレオチドの対を含む）を順番に連結することによってなされ得る。核酸は、細胞から直接単離され得る。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法を用いて、化学的に合成された鎖またはゲノム材料のいずれかをテンプレートとして用いて本発明の核酸を産生し得る。ＰＣＲに用いるプライマーは、本明細書中で提供する配列情報を用いて合成され得、そしてさらに、所望の場合、組換え発現のための所定のベクターへの組み込みを容易にするため、適切な新しい制限部位を導入するよう設計され得る。当然のことながら、遺伝コードの縮重に起因して、多数の異なるヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号４または配列番号６に規定するアミノ酸配列あるいはその部分配列を有するポリペプチドをコードし得る。コドンを、原核生物系または真核生物系における最適な発現のために選択し得る。このような縮重改変体もまた、本発明によって包含される。
【００７３】
コードされるポリペプチドは、多数の既知のベクター（例えば、ｐＵＣプラスミド、ｐＥＴプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、またはｐＲＳＥＴもしくはｐＲＥＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））、ならびに多数の適切な宿主細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ならびに昆虫細胞株および哺乳動物細胞株）を用いて、当業者に公知の方法を用いることによって発現され得る。ベクター／宿主の特定の選択は、本発明の実施に重要ではない。
【００７４】
本発明の核酸は、例えば、ペプチドまたはポリペプチドの組換え産生のためのテンプレートとして、本明細書中で記載されるヒト遺伝子の検出のため、および染色体マッピングのためのプローブおよびプライマーとして、ならびに他哺乳動物種における相同遺伝子を同定するためのプローブとしてまたはＰＣＲプライマーを設計するための用途を見出す。相同性は実験的に決定され得る。あるいは、相同性分析は、コンピューターにより実施され得る。本発明の実施において、別の哺乳動物種のゲノムと少なくとも約７０％のＤＮＡ配列相同性をヌクレオチドレベルで共有する遺伝子は、その種中に存在すると考えられる。遺伝子が別の哺乳動物中に存在するという決定は、当該分野で公知の任意の技術を用いて達成され得る。適切な技術としては、限定することなく、ゲノムＤＮＡへのハイブリダイゼーション、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーへのコロニーハイブリダイゼーション、縮重プライマーまたは遺伝子特異的プライマーおよびテンプレートとしてのゲノムＤＮＡを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝的相補性、抗体交差反応性、あるいはインビトロでの生化学的相補性が挙げられる。
【００７５】
これらの技術の適用において、プローブとテンプレートとの間の異なるレベルの相同性を判別する条件が確立される。例えば、固定化したＤＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーション（サザンブロットにおいてであろうと、ドットブロットにおいてであろうと、コロニーハイブリダイゼーション形式においてであろうと）について、緩衝液中のＳＳＣ濃度を変更することは、異なるレベルの相同性を有するハイブリッドの検出を可能にする（１×ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌ−０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａである）。６Ｍの尿素および０．４％のドデシル硫酸ナトリウムを含む洗浄緩衝液において、２×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、および０．０５×ＳＳＣの存在は、それぞれ、少なくとも５５％＋５％、６５％＋５％、７５％＋５％、および＞８５％の閾値の相同性を有するハイブリッドの形成を可能にする。好ましくは、一旦遺伝子がハイブリダイゼーションまたはＰＣＲによって別の生物体において同定されると、この遺伝子のＤＮＡ配列は、直接決定される。
【００７６】
相同配列を検出するいくつかの方法は、特定の遺伝子のタンパク質コード配列全体の一部のみの同定または単離を生じ得ることが理解される。タンパク質コード配列全体は、例えば、その配列の既知の部分をコードする単離された核酸、またはそのフラグメントを用いて、テンプレートとしてｃＤＮＡを用いた配列決定反応を開始し、続いてこの増幅された産物を配列決定することによって単離および同定され得る。開示される配列をコードする単離された核酸、またはそのフラグメントはまた、適切なｃＤＮＡライブラリーにハイブリダイズされて、より短い配列が一部を形成するタンパク質コード配列のさらなる完全なセグメントを含むクローンが同定され得る。次いで、タンパク質コード配列全体もしくはそのフラグメント、またはその配列の全体もしくは一部をコードする核酸、またはその配列保存的改変体もしくは機能保存的改変体は、本発明の実施において用いられ得る。
【００７７】
類似の様式において、このタンパク質をコードする配列の５’隣接領域および３’隣接領域由来のさらなる配列（調節配列を含む）は、単離され得、そしてこのヌクレオチド配列が決定され得る。
【００７８】
（ポリペプチド）
本明細書中に記載される、天然に存在する形態のポリペプチドおよび組換え形態のポリペプチド（グリコシル化形態および非グリコシル化形態の両方を含む）は両方とも、本発明によって包含される。本発明のポリペプチド（機能保存的改変体を含む）は、ヒト単球、またはタンパク質コード配列が導入および発現されている異種生物体もしくは異種細胞（例えば、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、および哺乳動物細胞）から単離され得る。本明細書中に記載されるタンパク質、またはその部分はまた、他のタンパク質との融合物として発現され得る。これらのポリペプチドは、市販の自動化手順（排他的固相合成（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ　ｓｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、部分的固相方法、フラグメント縮合（ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）または古典的溶液合成が挙げられるがこれらに限定されない）によって化学合成され得る。ポリペプチドはまた、インビトロ翻訳によって有利に作製され得る。
【００７９】
ポリペプチド精製のための方法は、当該分野で周知であり、この方法としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：分取ディスク−ゲル電気泳動（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　ｄｉｓｃ−ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、等電点電気泳動、スクロース密度勾配遠心分離（ｓｕｃｒｏｓｅ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび分配クロマトグラフィー、および向流分配。いくつかの目的のために、タンパク質が、精製を容易にするさらなる配列タグ（限定するわけではないが、例えば、ポリヒスチジン配列）を含む組換え系においてポリペプチドを産生することが好ましい。次いで、ポリペプチドは、適切な固相マトリクスにおけるクロマトグラフィーによって宿主細胞の粗溶解産物から精製され得る。あるいは、タンパク質に対してかまたはそれ由来のペプチドに対して産生される抗体は、精製試薬として用いられ得る。他の精製方法が可能である。
【００８０】
本発明はまた、本明細書中に特に開示されるポリペプチドの誘導体およびホモログも包含する。いくつかの目的のために、ペプチドをコードする核酸配列は、機能的に等価な分子（すなわち、機能保存的改変体）を提供する置換、付加、または欠失によって変更され得る。例えば、その配列内の１つ以上のアミノ酸残基は、類似の性質の別のアミノ酸（例えば、正に荷電したアミノ酸（アルギニン、リジン、およびヒスチジン）；負に荷電したアミノ酸（アスパルテートおよびグルタメート）；極性の中性アミノ酸；ならびに非極性アミノ酸）によって置換され得る。
【００８１】
単離されたポリペプチドは、例えば、リン酸化、硫酸化、アシル化、または他のタンパク質改変によって改変され得る。これらはまた、検出可能なシグナルを提供することが可能な標識（放射線同位体および蛍光化合物が挙げられるがこれらに限定されない）で、直接的または間接的のいずれかで改変され得る。
【００８２】
本発明のポリペプチドは、例えば、結合研究のため、改変分子の構築および発現のため、構造／機能研究のため、ならびにポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製のための使用を見出す。抗体を調製するための免疫原性成分として有用なポリペプチドまたは結合因子研究のための標的として有用なポリペプチドは、長さが少なくとも５残基以上である。好ましくは、このポリペプチドは、少なくとも約１２残基、より好ましくは少なくとも約２０残基、および最も好ましくは少なくとも約３０残基以上を含む。これらのポリペプチドを得るための方法は、周知であり、そしてＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７（Ｍａｙｅｒ　ａｎｄ　Ｗａｌｅｒ，編；Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｓｃｏｐｅｓ，１９８７，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第２版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．）およびＨａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８６，第Ｉ−ＩＶ巻（Ｗｅｉｒ　ａｎｄ　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，編）に説明されている。
【００８３】
特異的な相互作用の結合パートナーのうちの１つのメンバーが単離されると、対抗するパートナーを単離するための方法が存在する。例えば、Ｇｅａｒｉｎｇら，１９８９，ＥＭＢＯ　Ｊ．８：３６６７−３６７６を参照のこと。結合活性についてスクリーニングする多くの方法が、当業者によって公知であり、そして本発明の実施に使用され得る。例えば、発現ライブラリーは、そのタンパク質に対する特異的な結合について、例えば、細胞分類、またはそのような結合成分を発現する亜集団を検出するための他のスクリーニングによって、スクリーニングされ得る。例えば、Ｈｏら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：１１２６７−１１２７１を参照のこと。あるいは、パニング方法が、使用され得る。例えば、ＳｅｅｄおよびＡｒｕｆｆｏ，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：３３６５−３３６９を参照のこと。ツーハイブリッド選択系もまた、利用可能なタンパク質配列を用いて適切な構築物の作製することによって適用され得る。例えば、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ　３４０：２４５−２４６を参照のこと。自動化アッセイのいくつかの方法が近年開発され、短期間での何万の化合物のスクリーニングを可能にする。
【００８４】
（物理的改変体）
本発明はまた、配列番号２、４または６のアミノ酸配列に実質的なアミノ酸配列類似性を有するタンパク質またはペプチドを含む。置換（例えば、２０個未満、好ましくは１０個未満、より好ましくは５個未満の置換）を示す改変体が、含まれる。置換が保存的置換である場合、改変体は、対応する天然配列のタンパク質と免疫原性もしくは抗原性の類似性を共有するか、または交差反応性を共有する。天然の改変体としては、個体の改変体、対立遺伝子改変体、多型改変体、系統改変体、および種改変体が挙げられる。
【００８５】
アミノ酸配列の類似性または配列同一性は、残基の一致を最適化し、必要な場合、必要とされるギャップを導入することによって決定される。これは、保存的置換を一致とみなす場合、変化する。保存的置換は、代表的に、以下の群の中での置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。相同アミノ酸配列としては、各それぞれのタンパク質配列における天然の対立遺伝子バリエーションおよび種間バリエーションが挙げられる。代表的な相同タンパク質またはペプチドは、関連タンパク質のアミノ酸配列内に、５０〜１００％の類似性（ギャップが導入され得る場合）から７５〜１００％の相同性（保存的置換が含まれる場合）を有する。同一性の尺度は、少なくとも約５０％、一般的に少なくとも６０％、より一般的に少なくとも６５％、通常少なくとも７０％、より通常では少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、およびより好ましくは少なくとも８０％、そして特に好ましい実施形態において、少なくとも８５％以上である。Ｎｅｅｄｌｅｈａｍら，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３；Ｓａｎｋｏｆｆら，１９８３，Ｔｉｍｅ　Ｗａｒｐｓ，Ｓｔｒｉｎｇ　Ｅｄｉｔｓ，ａｎｄ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｔｈｅ　Ｔｈｅｏｒｙ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　Ｃｈａｐｔｅｒ　Ｏｎｅ，Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ，Ｒｅａｄｉｎｇ，ＭＡ；ならびにＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ，ＣＡからのソフトウェアパッケージ；およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩからのソフトウェアパッケージもまた参照のこと。
【００８６】
対応するタンパク質をコードする核酸は、代表的に、ストリンジェントな条件下で配列番号１、３または５にハイブリダイズする。例えば、それぞれのタンパク質をコードする核酸は、代表的に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１、３または５の核酸にハイブリダイズするが、いくつかの擬陽性ハイブリダイゼーションシグナルを提供する。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて、ハイブリダイズする配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約１０℃下で選択される。Ｔｍは、完全に一致するプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度およびｐＨ下）である。代表的に、ストリンジェントな条件は、洗浄中の塩濃度がｐＨ７において約０．０２モル濃度であり、そして温度が少なくとも約５０℃である条件である。他の因子（とりわけ、塩基組成および相補鎖のサイズ、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）の存在、および塩基ミスマッチの存在）は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに有意に影響を与え得る。好ましい実施形態は、５０％　ホルムアミドおよび２０〜５０ｍＭ　ＮａＣｌ、４２℃において開示された配列に結合する核酸を含む。
【００８７】
単離された核酸は、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入、およびヌクレオチドストレッチの逆位によって、容易に改変され得る。これらの改変は、高度に類似する生理学的活性、免疫原性活性、または抗原性活性を有する抗原、それらの誘導体またはタンパク質をコードする、新規ＤＮＡ配列を生じる。
【００８８】
改変された配列を使用して、変異体抗原を生成し得るか、または発現を増強し得る。発現の増強としては、遺伝子増幅、転写の増加、翻訳の増加および他の機構が挙げられ得る。このような変異体タンパク質誘導体としては、それぞれのタンパク質またはそのフラグメントの予め決定された変異または部位特異的変異が挙げられる。「変異体タンパク質」は、他の点では上記のようなタンパク質の相同性定義内に入るが、欠失、置換または挿入のいずれかによって天然に見出されるタンパク質のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。特に、「部位特異的変異体タンパク質」は、一般的に、配列番号２、４または６の配列を有するタンパク質と有意な類似性を有するタンパク質を含む。一般的に、改変体は、これらの配列と多くの物理化学的活性および生物学的活性（例えば、抗原性活性または免疫原性活性）を共有し、好ましい実施形態において、開示された配列のほとんどまたは全てを含む。
【００８９】
例えば、合成およびプロセシングの間、またはさらなるプロセシング工程においてポリペプチドのグリコシル化パターンを改変することによって作製されるグリコシル化変更が、含まれる。これを達成するための特に好ましい手段は、通常このようなプロセシングを提供する細胞由来のグリコシル化酵素（例えば、哺乳動物グリコシル化酵素）に、ポリペプチドを曝露することによる手段である。脱グリコシル化酵素もまた、意図される。他の主要でない改変（リン酸化アミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホトレオニン）を含む）または他の部分（リボシル基または架橋試薬を含む）を有する同じ一次アミノ酸配列のバージョンもまた、含まれる。置換を含むタンパク質もまた含まれ、このタンパク質は、実質的な免疫原性を保持し、配列番号２、４、または６のタンパク質を認識する抗体を生成するべきである。代表的に、これらのタンパク質は、開示された配列から２０個未満の残基置換、より代表的には１０個未満の置換、好ましくは５個未満、より好ましくは３個未満の置換を含む。あるいは、構造ドメインで始まりそして構造ドメインで終わるタンパク質は、通常、抗原性および交差免疫原性を保持する。
【００９０】
誘導体の主要なグループは、本明細書中に開示されるタンパク質またはそのフラグメントと他のタンパク質またはポリペプチドとの共有結合体である。これらの誘導体は、組換え培養物中で合成され得るか（例えば、Ｎ末端融合体またはＣ末端融合体）、または反応性側鎖基を介するタンパク質の架橋において有用性が当該分野で公知である試薬の使用によって、合成され得る。架橋因子を有する好ましいタンパク質誘導体化部位は、遊離のアミノ基、炭水化物部分、およびシステイン残基である。
【００９１】
これらのタンパク質と他の相同タンパク質または異種タンパク質との間の融合ポリペプチドもまた、提供される。異種ポリペプチドは、異なる表面マーカー間の融合物であり得、例えば、ハイブリッドタンパク質を生じる。同様に、誘導体タンパク質の特性または活性の組み合わせを示す異種融合物が、構築され得る。代表的な例は、レポーターポリペプチド（例えば、ルシフェラーゼ）とタンパク質のセグメントまたはドメイン（例えば、レセプター結合セグメント）との融合体であり、その結果、この融合タンパク質の存在または位置は、容易に決定され得る。例えば、米国特許第４，８５９，６０９号を参照のこと。他の遺伝子融合パートナーとしては、細菌β−ガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、プロテインＡ、β−ラクタマーゼ、αアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、および酵母α接合因子が挙げられる。例えば、Ｇｏｄｏｗｓｋｉら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：８１２−８１６を参照のこと。
【００９２】
このようなポリペプチドはまた、リン酸化、スルホン化、ビオチン化または他の部分（特に、リン酸基に類似した分子形状を有するもの）の付加もしくは除去によって、化学的に改変されたアミノ酸残基を有し得る。いくつかの実施形態において、改変は、有用な標識試薬であるか、または精製標的（例えば、アフィニティーリガンド）として役立つ。
【００９３】
本発明はまた、アミノ酸配列バリエーションまたはグリコシル化におけるバリエーション以外の、これらのタンパク質の誘導体の使用を意図する。このような誘導体は、化学部分との共有結合または凝集性結合を含み得る。これらの誘導体は、一般的に、３つのクラスに含まれる：（１）塩、（２）側鎖および末端残基の共有結合改変、ならびに（３）吸着複合体（例えば、細胞膜と）。このような共有結合的な誘導体または凝集性誘導体は、免疫原としてか、免疫アッセイにおける試薬としてか、または精製方法（例えば、リガンドまたは他の結合リガンドのアフィニティー精製）において、有用である。例えば、タンパク質抗原は、抗体のアッセイまたは精製における使用のために、共有結合によって固体支持体（例えば、臭化シアン活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に固定され得るか、もしくは当該分野で周知の方法によって固定され得るか、またはグルタルアルデヒド架橋剤ありまたは無しで、ポリオレフィン表面上に吸着され得る。タンパク質はまた、検出可能な基を用いて標識され得る（例えば、クロラミンＴ手順によって放射性ヨウ素化され得るか、希土類キレートに共有結合され得るか、または診断アッセイにおける使用のための別の蛍光部分と結合体化され得る）。これらのタンパク質の精製は、固定化された抗体によって達成され得る。
【００９４】
（抗体）
上記のように、本発明の免疫原性成分は、標準的な方法によって抗体を調製するための抗原として有用である。このような免疫原性成分は、大きなポリペプチドのタンパク質分解性切断によってか、または化学合成もしくは組換え技術によって生成され得、従って、タンパク質分解性切断部位によって制限されない。好ましくは、より小さい免疫原性成分をまず、免疫原性のキャリア分子（すなわち、宿主動物において免疫学的応答を独立して誘発する特性を有する高分子であって、これに本発明の免疫原性成分が、共有結合的に連結され得る）に対して架橋することによってかまたはカップリングすることによって、より免疫原性にする。キャリア分子への架橋または結合体化が必要とされ得る。なぜなら、小さいポリペプチドフラグメントは、しばしばハプテン（抗体に特異的に結合し得るが、抗体産生を誘発し得ない分子であって、すなわちこれらは免疫原性ではない）として作用するからである。このようなフラグメントの免疫原性キャリア分子への結合体化は、「キャリア効果」として一般的に公知の効果を介してこのようなフラグメントを免疫原性にする。
【００９５】
本発明に従う抗体としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が挙げられる。抗体は、本発明の免疫原性成分を用いた免疫によって動物宿主中で誘発され得るか、または免疫細胞のインビトロ免疫（感作）によって形成され得る。抗体産生を誘発するために使用される免疫原性成分は、ヒト細胞（例えば、ヒト樹状細胞）から単離され得るか、または化学合成され得る。抗体はまた、適切な抗体をコードするＤＮＡを用いてプログラムされた組換え系において産生され得る。あるいは、抗体は、精製された重鎖および軽鎖の生化学再構成によって構築され得る。
【００９６】
本発明の抗体は、標準的な方法（調製ディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび分配クロマトグラフィー、ならびに逆流分配（ｃｏｕｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎｔ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を含むが、これらに限定されない）によって精製され得る。抗体の精製方法は、例えば、Ｔｈｅ　Ａｒｔ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，１９８９，Ａｍｉｃｏｎ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ　＆　Ｃｏ．に開示される。一般的なタンパク質精製方法は、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｒ．Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ，編，１９８７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹに記載される。
【００９７】
動物のワクチン接種のための適切なアジュバントとしては、アジュバント６５（ピーナッツオイル、マンニットモノオレアート（ｍａｎｎｉｄｅ　ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ）およびアルミニウムモノステアレートを含む）；フロイントの完全アジュバントもしくは不完全アジュバント；ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびミョウバン）；界面活性剤（例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リゾレシチン、ジメチルジオクタデシル−臭化アンモニウム、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシメチル）プロパン−ジアミン、メトキシヘキサデシルグリセロールおよびプルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ　ｐｏｌｙｏｌ））；ポリアニオン（例えば、ピラン、硫酸デキストラン、ポリＩＣ、ポリアクリル酸およびカルボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ））；ペプチド（例えば、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、およびツフトシン（ｔｕｆｔｓｉｎ））；ならびにオイルエマルジョンが挙げられるが、これらに限定されない。免疫原性成分はまた、リポソームまたは他の微小キャリアへの組込み後に投与され得る。アジュバントおよび免疫アッセイの種々の局面に関する情報は、例えば、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９８７，Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，第３版，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋによるシリーズに開示される。
【００９８】
このように免疫された動物から生成される血清は、直接使用され得る。あるいは、ＩｇＧ画分が、プラズマフェレシス（ｐｌａｓｍａｐｈｏｒｅｓｉｓ）またはＩｇＧ特異的吸着剤（例えば、固定化されたプロテインＡ）を用いた吸着クロマトグラフィーのような標準的な方法を使用して血清から分離され得る。
【００９９】
本発明の免疫原性成分に対するモノクローナル抗体を作製するために使用される本発明のハイブリドーマは、周知技術によって生成される。通常、このプロセスは、所望の抗体を産生するＢリンパ球と不死化細胞との融合を含む。あるいは、不死化抗体産生細胞を作製するための非融合技術が可能であり、そして本発明の範囲内にある（例えば、ウイルス誘導形質転換）Ｃａｓａｌｉら，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３４：４７６。不死化細胞は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特に、げっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。より頻繁には、簡便性および利用可能性の問題として、ラットまたはマウスの骨髄種細胞株が利用される。
【０１００】
免疫原性成分を注射された哺乳動物から適切なリンパ球を得るための技術が、周知である。一般的に、ヒト起源の細胞が所望される場合、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）が使用されるか、または非ヒト哺乳動物供給源が所望される場合、脾細胞またはリンパ節細胞が使用される。宿主動物に、好ましく精製された免疫原性成分の反復投薬量を注射し、そして不死化細胞株との融合のために収集する前に、この動物に所望の抗体産生細胞を生成させる。融合のための技術もまた、当該分野で周知であり、そして一般的に、細胞を融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）と混合する工程を包含する。
【０１０１】
ハイブリドーマは、標準的な手順、例えば、ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）選択によって選択される。これらのハイブリドーマの間から、所望の抗体を分泌する細胞が、これらの培養培地を標準的な免疫アッセイ（例えば、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）など）によってアッセイすることによって選択される。抗体は、標準的なタンパク質精製技術を用いて培地から収集される、Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９８５，Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ。
【０１０２】
上記の技術のうちのいずれかを適用する際の手引きのための多くの参考文献が、利用可能である：Ｋｏｈｌｅｒら，１９８０，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ；Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９８５，Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，１９８４，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；Ｈｕｒｒｅｌｌ，１９８２，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，ＦＬ。モノクローナル抗体もまた、周知のファージライブラリー系を用いて産生され得る。
【０１０３】
抗体フラグメントの使用および生成もまた、周知である。例えば、Ｆａｂフラグメント：Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９８５，Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；Ｆｖフラグメント：Ｈｏｃｈｍａｎら，１９７３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１２：１１３０；Ｓｈａｒｏｎら，１９７６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１５：１５９１；Ｅｈｒｌｉｃｈら，米国特許第４，３５５，０２３号；ならびに抗体ハーフ分子：Ａｕｄｉｔｏｒｅ−Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ，米国特許第４，４７０，９２５号。これらはまた、免疫アッセイにおいて有用であり得る。
【０１０４】
これらの抗体（ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体に関わらず）は、例えば、周知の方法によって固体支持体に結合した固定形態で使用されて、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって免疫原性成分を単離および精製し得る。抗体は、組織および細胞型分布を識別するためのプローブとして有用である。抗体は、特定の発現産物について発現ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。通常、このような手順に使用される抗体は、抗体結合による抗原の存在の簡単な検出を可能にする部分を用いて標識される。タンパク質に対する抗体は、それぞれのタンパク質を発現する特定の細胞集団成分の分析または同定のために使用され得る。本明細書中に記載されるタンパク質を発現する細胞の発現産物をアッセイすることによって、疾患（例えば、免疫欠損状態、単球涸渇状態、または単球の過剰産生）を診断することが可能である。タンパク質に対して惹起される抗体はまた、抗イディオタイプ抗体を惹起するために使用される。これらは、それぞれの抗原の発現に関連する種々の免疫学的状態を検出または診断する際に有用である。本発明は、単球由来の免疫原性成分を特異的に認識する抗体を含む。このような抗体は、例えば、単球細胞成分の精製のための試薬としてか、または診断適用において、慣習的に使用され得る。
【０１０５】
（診断適用）
本発明は、定性的診断または定量的診断の臨床設定（すなわち、生物学的サンプル中の特定の成分の検出）において有用な組成物、方法およびキットを含む。これらの適用は、核酸、ペプチド／ポリペプチド、または本明細書中に記載される成分に特異的な抗体を利用する。抗体に基づく診断方法および核酸に基づく診断方法（ＰＣＲに基づく診断方法を含む）の両方が、意図される。サンプル中に存在する特定の型の樹状細胞のレベルの検出が、特定の異常な疾患状態の診断に重要であり得る。例えば、胸部癌腫組織において、樹状細胞の成熟段階に特異的なマーカーは、腫瘍内に存在する樹状細胞が、未成熟段階で据え置かれることを示し、ゆえに、腫瘍脱出のための可能な機構を例示する。Ｂｅｌｌ　Ｄ．ら，「Ｉｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｔｉｓｓｕｅ，ｉｍｍａｔｕｒｅ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｒｅｓｉｄｅ　ｗｉｔｈｉｎ　ｔｈｅ　ｔｕｍｏｒ，ｗｈｅｒｅａｓ　ｍａｔｕｒｅ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ａｒｅ　ｌｏｃａｔｅｄ　ｉｎ　ｐｅｒｉｔｕｍｏｒａｌ　ａｒｅａｓ．」Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ．１９９９　Ｎｏｖ　１５，１９０（１０）：１４１７−２６）。
【０１０６】
本発明のタンパク質の、天然に存在する形態および組換え形態の両方が、このタンパク質に対する結合活性について化合物をスクリーニングし得るキットおよびアッセイ方法において特に有用である。
【０１０７】
核酸型診断方法において、分析されるサンプルは、核酸プローブと直接接触され得る。プローブとしては、少なくとも１２ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド長、最も好ましくは２０〜３５以上のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドが挙げられる。あるいは、サンプルは、サンプル中に含まれる核酸を抽出するために処理され得る。ＤＮＡを抽出するために使用される特定の方法が生物学的サンプルの性質に依存することが、理解される。サンプルから得られる核酸は、ゲル電気泳動もしくは他のサイズ分離技術に供され得るか、または核酸サンプルは、サイズ分離を伴わずに、適切な固体マトリックス上に固定され得るか、もしくはＰＣＲに使用され得る。
【０１０８】
抗体に基づく診断適用に適切なキットは、代表的に、１つ以上の以下の成分を備える。
【０１０９】
（ｉ）抗体：抗体は、事前に標識され得るか；あるいは、この抗体は、標識され得ず、そして標識のための成分が、別々の容器中でそのキットに含まれ得るか、または標識した二次抗体が提供される；および
（ｉｉ）反応成分：キットはまた、特定の免疫アッセイプロトコールに必要とされる他の適切にパッケージングされた試薬および材料（固相マトリックス（適用可能な場合）および標準物質を含む）を含む。
【０１１０】
核酸に基づく診断適用に適切なキットは、代表的に、以下の成分を備える。
【０１１１】
（ｉ）プローブＤＮＡ：このプローブＤＮＡは、予め標識され得るか；あるいは、このプローブＤＮＡは、標識され得ず、そして標識のための成分が、別々の容器中でそのキットに含まれ得る；および
（ｉｉ）ハイブリダイゼーション試薬：このキットはまた、特定のハイブリダイゼーションプロトコールに必要とされる他の適切にパッケージングされた試薬および材料（固相マトリックス（適用可能な場合）および標準物質を含む）を含み得る。
【０１１２】
ＰＣＲに基づく診断キットがまた、意図され、そして本発明によって含まれる。
【０１１３】
上記に参照されるキットは、試験を実行するための指示書を備え得る。さらに、好ましい実施形態において、診断キットは、高スループットおよび／または自動化操作に適用可能である。
【０１１４】
（治療適用）
本発明はまた、有意な治療価値を示し得る試薬を提供する。タンパク質（天然に存在するタンパク質または組換えタンパク質）、そのフラグメント、およびこのタンパク質に対する抗体は、このタンパク質に対する結合親和性を有するとして同定された化合物とともに、異常な生理機能または発生と関連する状態の処置に有用であり得る。例えば、樹状細胞（例えば、抗原提示細胞）による異常な発現または異常なシグナル伝達と関連する疾患または障害は、タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストについての標的である。タンパク質はおそらく、免疫学的応答（例えば、抗原提示および生じるエフェクター機能）に影響をもたらす造血細胞（例えば、リンパ球細胞）の調節または発生において役割を果たす。
【０１１５】
本発明の組換え樹状細胞由来タンパク質または抗体は、精製され、そして患者へ投与され得る。これらの試薬は、治療用途のために、生理学的に無害の安定剤または賦形剤と一緒に、さらなる活性成分または不活性成分（例えば、従来の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤（例えば、免疫原性アジュバント））と合わされ得る。特に、これらは、ワクチンの状況において有用であり得、ここで、抗原は、アゴニストまたはアンタゴニストの治療バージョンのうちの１つと合わされる。これらの組合せは、滅菌濾過され、そして凍結乾燥されによって投薬量バイアル中に投薬量形態で配置されるか、または安定化された水性調製物中に保存され得る。本発明はまた、補体結合でない形態を含む、抗体またはその結合フラグメントの使用を意図する。
【０１１６】
抗体もしくはレセプターまたはそれらのフラグメントを使用する薬物スクリーニングは、これらの樹状細胞由来タンパク質に結合親和性を有する化合物を同定し得る（関連成分の単離を含む）。次いで、引き続く生物学的アッセイを利用して、この化合物がタンパク質の活性をブロックまたは拮抗するか否かを決定し得る。同様に、固有の刺激活性を有する化合物は、そのタンパク質を介して細胞を活性化し得、ゆえに、アゴニストである。本発明はさらに、アンタゴニストとしての、タンパク質に対する抗体の治療的使用を含む。
【０１１７】
効果的な治療に必要な試薬の量は、多くの異なる因子（投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、および投与された他の医薬を含む）に依存する。従って、処置投薬量は、安全性および効率を最適化するために滴定されるべきである。代表的に、インビトロで使用される投薬量は、これらの試薬のインサイチュ投与に有用な量で、有用な手引きを提供し得る。特定の疾患の処置のための有効用量の動物試験は、ヒト投薬量のさらなる推定的な指標を提供する。種々の考慮が、例えば、Ｇｉｌｍａｎら（編）（１９９０）ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ：Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂａｓｅｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（第８版）Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ；ならびに（１９９０）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１７版）Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載される。投与（例えば、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、または筋内投与、経皮拡散など）のための方法は、本明細書中および以下に議論される。薬学的に受容可能なキャリアとしては、水、生理食塩水、緩衝液および例えば、Ｍｅｒｃｋ　Ｉｎｄｅｘ，Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪに記載される他の化合物が挙げられる。投薬量範囲は、本来、適切なキャリアを伴って、１ｍＭ未満の濃度の量であることが予想され、代表的に、約１０μＭ未満の濃度、通常約１００ｎＭ未満、好ましくは約１０ｐＭ（ピコモル濃度）未満、そして最も好ましくは約１ｆＭ（フェムトモル濃度）未満の濃度であることが予想される。低速放出処方物または低速放出装置は、しばしば、連続した投与のために利用される。
【０１１８】
タンパク質、アンタゴニストおよびアゴニストは、処置される宿主に直接投与され得るか、または化合物のサイズに依存して投与され、これらの投与前に、これらのタンパク質、アンタゴニストおよびアゴニストをキャリアタンパク質（例えば、オボアルブミンまたは血清アルブミン）に結合体化させることが望ましくあり得る。治療処方物は、多くの従来の投薬量処方物に投与され得る。活性な成分が単独で投与されることは可能であるが、活性な成分が薬学的処方物として存在することが好ましい。処方物は、代表的に、上記に規定されるような少なくとも１つの成分を、その受容可能なキャリアの１つ以上とともに含む。各キャリアは、他の成分と適合であり、そして患者に対して有害でないという意味において、薬学的および生理学的の両方で利用可能であるべきである。処方物としては、経口投与、直腸投与、経鼻投与または非経口投与（皮下投与、筋内投与、静脈内投与および皮内投与）に適切な処方物が挙げられる。処方物は、単位投薬量形態で好都合に存在し得、そして薬学分野において周知の任意の方法によって調製され得る。例えば、Ｇｉｌｍａｎら（編）（１９９０）ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ：Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂａｓｅｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（第８版）Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ；ならびに（１９９０）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１７版）Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ；Ａｖｉｓら（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｄｏｓａｇｅ　Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ　Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ　Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｄｏｓｇａｅ　Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ　Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｄｏｓａｇｅ　Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹを参照のこと。本発明の治療は、他の化学療法剤または化学予防剤と合わされ得るか、またはこれらと共同して使用され得る。
【０１１９】
本発明の多くの改変およびバリエーションが、当業者に明らかであるように、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書中に記載される特定の実施形態は、例示のためにのみ提供され、そして本発明は、このような特許請求の範囲が与えられるものに対して等価な全範囲と共に、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ制限される。

Claims (17)

1. 配列番号２、４または６に由来するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
2. 成熟タンパク質のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 配列番号２、４または６に由来するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
4. 前記ヌクレオチド配列が前記成熟タンパク質をコードする、請求項３に記載の核酸。
5. 配列番号１、３または５に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載の核酸。
6. 請求項１に記載のポリペプチドを含む、融合タンパク質。
7. 請求項１に記載のポリペプチドに特異的に結合する、結合化合物。
8. 前記結合化合物が、抗体または抗体フラグメントである、請求項７に記載の結合化合物。
9. 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項８に記載の結合化合物。
10. 請求項３に記載の核酸を含む、発現ベクター。
11. 請求項５に記載の核酸を含む、発現ベクター。
12. 請求項１０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
13. ポリペプチドを組換え的に生成するためのプロセスであって、該プロセスは、該ポリペプチドが発現される条件下で請求項１２に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、プロセス。
14. サンプル中の特定の核酸配列を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
    ａ）配列番号１、３または５から選択される少なくとも８連続ヌクレオチドを含む核酸配列を含むプローブと、特定の核酸配列を含むことが疑われるサンプルを、該プローブと該サンプル中の該特定の核酸との間のハイブリッドを形成し得る条件下で接触させる工程；
    ｂ）工程（ａ）において形成された任意のハイブリッドを検出する工程であって、ここで、該ハイブリッドの検出が、該サンプル中の該特定の核酸配列の存在を示す、工程、
    を包含する、方法。
15. 前記検出する工程の前に、前記サンプル中の前記特定の配列を増幅する工程をさらに包含する、請求項１４に記載の方法。
16. サンプル中の特定の抗原性成分を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
    ａ）配列番号２、４または６に由来するアミノ酸配列によってコードされる特定の抗原性成分を含むことが疑われるサンプルを、該成分に対して特異的な抗体または抗体フラグメントと、該抗体または該抗体フラグメントと該サンプル中の該抗原性成分との間で安定な抗原−抗体複合体が形成され得る条件下で接触させる工程；および
    ｂ）工程（ａ）において形成された任意の抗原−抗体複合体を検出する工程であって、ここで、抗原−抗体複合体の検出が、該サンプル中の該抗原性成分の存在を示す、工程、
    を包含する、方法。
17. 候補治療剤をスクリーニングする方法であって、以下：
    ａ）配列番号２、４または６に由来するアミノ酸配列を有するポリペプチドを、標的配列として選択する工程；
    ｂ）試験化合物を、該標的配列と接触させる工程；および
    ｃ）該標的配列に結合する試験化合物を、該候補治療剤として選択する工程、を包含する、方法。