JP2004500036A - 栽培(家畜化)された植物および動物中のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列における進化的に有意な変化を同定する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、栽培(家畜化)植物または動物における商業的にまたは審美的に関連する形質と随伴する可能性があるポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を同定するための方法を提供する。該方法は、該栽培(家畜化)生物およびその祖先からの相同遺伝子の比較を用い、進化的に有意な変化を同定する。このように同定された配列は、栽培(家畜化)生物における商業的にまたは審美的に望ましい形質の増強に役立つことが可能である。
Description
【0001】
技術分野
本発明は、栽培(家畜化)された植物および動物中の商業的にまたは審美的に関連する形質に対応するポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を同定する分子的および進化的技術を使用することに関する。
【0002】
背景技術
人類は何千年もの間、ある種の商業的に価値のあるおよび/または審美的な形質を選択しながら、植物や動物を育ててきた。栽培植物は、収穫量、短日長開花、タンパク質および/または油含量、収穫の容易さ、味、耐病性および耐乾燥性のような形質で、それらの野生祖先と相違する。家畜は、脂肪および/またはタンパク質含量、乳生産、扱いやすさ、繁殖力および成熟までの期間のような形質で、それらの野生祖先と相違する。今のところ、上記の相違の基礎をなす大部分の遺伝子は不明であり、また同じように重要なのは、それらの能力を付与する当該遺伝子に発生した特定の変化もわかっていないことである。栽培(家畜化)された植物および動物とそれらの野生祖先との間における前記の相違の基盤を明らかにすれば、それらの形質の維持および増強に役立つ情報が得られるはずである。作物の場合、所望の形質を制御する特定遺伝子類の同定により、それまではできなかった仕方で、直接かつ迅速な改良が可能になるであろう。
【0003】
栽培(家畜化)種とそれらの野生祖先との相同遺伝子またはタンパク質を比較すれば、保存性の分子配列および機能特色に関して有用な情報が得られる可能性はあるが、その方法は、ヒトが課した淘汰圧のために変化した配列をもつ遺伝子を同定するには、あまり役立たない。優れたアルゴリズムおよび分析方法の出現によって、どの遺伝子が積極的に(正に)淘汰されたかについて、DNA配列変化からずっと多くの情報を引き出せるようになっている。それらの方法のうちで最も有力な“KA/KS”は、
【0004】
【式1】
非同義( nonsynonymous )部位当りの非同義ヌクレオチド置換(K A )
同義(synonymous)部位当りの同義置換(KS)
の比率についての、整列させたタンパク質コードヌクレオチド配列間での、ペアワイズ(pairwise)比較である(ここで非同義はコードされるアミノ酸を変える置換を意味し、同義はコードされるアミノ酸を変えない置換を意味する)。「KA/KS型方法」は、本法および同様な方法を含む。
【0005】
これらの方法は、ダーウィン(すなわち自然)型の分子レベルの正の淘汰が発生し、相同タンパク質にアミノ酸の差異をもたらしたことの証明に、既に使われている。複数のグループが、そのような方法を使って、ある特定のタンパク質は、中立置換速度より速やかに進化したこと、したがってダーウィン分子レベル正の淘汰の存在を支持する証拠を提供している。例えば、McDonaldおよびKreitman(1991)Nature 351:652−654は、ある遺伝子座のコード領域中のアミノ酸の非同義置換(replacement substitutions,nonsynonymous substitutions)の同義置換に対する数の比較に基づき、中立タンパク質進化説の統計検定を提案している。彼らはこの検定を3種のショウジョウバエ(Drosophila)のAdh遺伝子座に適用し、代わりに、当該遺伝子座が淘汰的に有利な突然変異の適応固定を受け、適応突然変異の淘汰的固定が、大部分のタンパク質進化の説明として、中立突然変異の正確な蓄積に対する現実的な代案である可能性を示すと結論している。Jekinsら(1995)Proc.R.Soc.Lond.B261:203−207は、McDonald & Kreitman検定を用いて、適応進化が転写を制御している配列(非コード配列)中に生じているかどうかを調べている。
【0006】
Nakashimaら(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:5606−5609は、MiyataおよびYasunagaの方法を用いて、2種のヘビからの10個のPLA2アイソザイム遺伝子のヌクレオチド配列のペアワイズ比較を行っている;この方法は、イントロンを含む非コード領域(KN)およびKAおよびKSについての部位当りのヌクレオチド置換の数を比較するものである。タンパク質コード領域はイントロンを含む非コード領域よりずっと高速で進化してきたと、彼らは結論している。その高度に加速された置換率は、被食者を捕らえるために、あるいは捕食者に対する防御のために、強い淘汰利益を提供してきたに違いない新たな生理活動を生み出すための、PLA2アイソザイム遺伝子類のダーウィン分子レベル進化の基になっている。Endoら(1996)Mol.Biol.Evol.13(5):685−690は、正の自然淘汰が作動する候補遺伝子を同定する目的のために、そこではdNが非同義置換の数でdSが同義置換の数であるNeiおよびGojoboriの方法を用いている。MetzおよびPalumbi(1996)Mol.Biol.Evol.13(2):397−406は、McDonald & Kreitman検定(上記参照)ならびにNeiおよびGojobori,NeiおよびJin,またKumar,Tamura,およびNeiによる方法を用い;種の形成の準備行為として急速に進化しているかどうかを検討するためにウニ類における結合遺伝子に対する正の淘汰の証拠を探す目的で、アミノ酸の非同義置換部位当りの非同義置換Pn、およびサイレント部位当りのサイレント置換Ps、の平均割合を調べている。Goodwinら(1996)Mol.Biol.Evol.13(2):346−358は、同様な方法を用いて特定のネズミ遺伝子ファミリーの進化を調べ、そして実験的に操作可能な系においてどのように淘汰が遺伝的分岐を駆動するかに、それらの方法は重要かつ基本的な洞察を提供すると結論している。Edwardsら(1995)は、縮重プライマーを用い各種鳥類およびミシシッピーワニ類からMHC遺伝子座を引き出し、次いでそれらをNeiおよびGojobori法(dN:dS比率)により分析し、MHC研究を非哺乳類脊椎動物に拡張している。Whitfieldら(1993)Nature 364:713−715は、KA/KS分析を用い、(雄性を決定する)SRY遺伝子中の保存領域に隣接する領域中に方向性淘汰を探している。SRYの急速な進化は、生殖的隔離の有意の原因となり、新種を生む可能性があることを、彼らは示唆している。Wettsetinら(1996)Mol.Biol.Evol.13(1):56−66は、Kumar,TamuraおよびNeiのMEGAプログラムおよび系統分析を適用し、リスおよび関連げっ歯動物のMHCクラスI遺伝子類の多様化を研究している。ParhamおよびOhta(1996)Science 272:67−74は、淘汰の検定ならびに遺伝子変換および中立浮動を含む集団生物学的方法が、ヒトMHCクラスI多型の生成および維持を分析するのに必要であると述べている。Hughes(1997)Mol.Biol.Evol.14(1):1−5は、脊椎動物免疫系の細胞中で発現されるタンパク質が異常に速く進化するという仮説を検証するためにNeiおよびGojoboriの方法(dN:dS比率)を用いて、ヒトおよびげっ歯動物の100個以上のオルソロガス(orthologous)免疫グロブリンC2ドメインを比較した。SwansonおよびVacquier(1998)Science 281:710−712は、ライシン(溶解素、lysin)とライシンに対する卵受容体との協調進化を証明するためにdN:dS比率を用い、そして新種形成(種分化)におけるそのような協調進化の役割を論考している。MessierおよびStewart(1997)Nature 385:151−154は、霊長類リゾチームにおける正の淘汰を証明するために、KA/KSを使用した。
栽培(家畜化)に関連する遺伝的変化は、トウモロコシ(maize,corn)で最も広く研究されてきた(Dorweiler(1993)Science 262:232−235)。トウモロコシ(Zea ssp.mays mays)の場合、現在の栽培種とその野生祖先種ブタモロコシ(teosinte)(Zea mays ssp paruiglumis)とのすべての差異を、少数の単一遺伝子変化から明らかに説明できる(Dorweiler,1993)。QTL(量的形質遺伝子座)分析(Doebley(1990)PNASUSA 87:9888−9892)は、15個より多くない遺伝子が、トウモロコシの興味深い形質を制御しており、トウモロコシとブタモロコシとの形態の大きな相違を説明することを、証明した(Wang(1999)Nature
398:236−239)。
【0007】
重要なのは、コメ、コムギ、キビおよびコウリャンを含む他のイネ科草本由来の農作物で、同様に少数の遺伝子が興味深い形質を制御しているらしいことである(Paterson(1995)Science 269:1714−1718)。実際、トウモロコシにおけるそれらの関連遺伝子の大部分について、当該相同遺伝子が、他のイネ科草本由来農作物の同じような形質を制御しているらしい(Paterson,1995)。したがって、トウモロコシでそれらの遺伝子が同定されれば、コメ、コムギ、キビおよびコウリャンにおける相同遺伝子類の同定が容易になるだろう。
【0008】
上に引用した論文に見られるように、急速に進化する遺伝子を同定する分子進化の分析方法(KA/KS型方法)は、多くの異なる目的を達成するのに適用可能で、最も普通にはダーウィン分子レベル正の淘汰の存在を確認するためであるが、またダーウィン分子レベル正の淘汰の頻度の査定、系統関係の理解、新種が形成される機構の解明、あるいは特定の遺伝子多型についての単一または複数の起源の確立にも適用可能である。上記の引用論文および文献中の他の論文から明白なのは、著者の誰一人として、人工的な淘汰圧によりもたらされた栽培(家畜化)植物および動物における進化的変化の同定に、KA/KS型法を適用していないことである。Turcichら(1996)Sexual Plant Reproduction 9:65−74が、植物遺伝子にKS分析の使用を記載しているものの、望ましい商業的または審美的形質の開発、維持または増強に利用可能な進化的に有意な変化を含むような遺伝子を、栽培(家畜化)植物および動物に同定するための系統的な手段としてKA/KS型分析を使用した者は誰もいないと思われる。
【0009】
相同の祖先遺伝子類に比較して、独特の、増強された、または変更された機能を付与するように進化した遺伝子類を、栽培(家畜化)種に同定することは、それらの機能を調整する薬剤の開発に利用できよう。基盤となっている栽培(家畜化)遺伝子類および進化した特定のヌクレオチド変化の同定、およびそれらの進化遺伝子類によりコードされるタンパク質における物理的および生化学的変化のさらなる性状把握は、所望される形質の基礎となる機構に関する貴重な情報を提供することになろう。この貴重な情報は、標的タンパク質の機能をさらに増強する薬剤の開発に適用できよう。あるいは、関係遺伝子類をさらに操作することによって、所望の形質を修飾または増進することが可能であろう。加えて、同定される遺伝子類は、他の栽培植物で興味ある形質の制御に一役買っていることもあろう。同様な方法で、家畜に興味深い形質の遺伝子を同定することも可能である。
【0010】
本明細書に引用されたすべての参考文献は、そっくりそのまま本明細書で参考文献として援用される。
発明の開示
本発明は、植物および動物を含む栽培(家畜化)生物に、商業的または審美的形質と関連する、進化的に有意な変化をもつポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を同定するための方法を提供する。本発明は、比較ゲノミクスを用いて、商業的にまたは審美的に関連する形質のような、構造的、生化学的もしくは生理学的状態に関連し、そして原因ともなる、特定の遺伝子変化を同定し、そしてそれらの形質から得られた情報を用いて、興味深い増強された形質をもつ栽培(家畜化)生物を開発する。
【0011】
一つの好ましい実施態様では、栽培(家畜化)植物または動物のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、該栽培種に存在し、その野生祖先に存在しない進化的に有意な変化をもたらした人工淘汰を受けている。本実施態様の一例は、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、その祖先種に比べて、作物収穫量の増加と関連していてもよい。他の例として、短日長開花(すなわち、日照時間が、ある臨界時間より短い場合にのみ開花)、タンパク質含量、油含量、収穫の容易さ、味、耐乾燥性および耐病性がある。当該発明は、それ故、栽培(家畜化)生物における機能あるいは形質の根底にある分子機構を洞察するのに役立つ可能性がある。この情報は、該機能または形質をさらに増進するためのポリヌクレオチドをデザインするのに役立つ可能性がある。例えば、作物収穫量改善の原因であることが明らかにされたポリヌクレオチドに、ランダムまたは定方向突然変異誘発を行って、次いで当該変異体遺伝子類を検査し、その形質をさらに亢進するものを同定してもよい。
【0012】
従って、一つの側面において、栽培(家畜化)された生物(例えば、植物または動物)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を同定するための方法が提供されるが、ここで該ポリペプチドは、該栽培(家畜化)生物の野生祖先に比較して、その栽培(家畜化)生物に独特で、亢進または変更された、商業的にまたは審美的に関連する形質と随伴する可能性があって、またa)当該栽培(家畜化)生物のタンパク質コードヌクレオチド配列を、該野生祖先のタンパク質コードヌクレオチド配列と比較する;そしてb)該野生祖先の対応配列に比較して、ヌクレオチド変化を含み、そこで当該変化が進化的に有意である、該栽培(家畜化)生物中のポリヌクレオチド配列を選択する:工程を含む前記方法である。
【0013】
本発明のもう一つの側面では、栽培(家畜化)された生物(例えば、植物または動物)のタンパク質コードヌクレオチド配列における進化的に有意な変化を同定するための方法が提供されるが、またa)当該栽培(家畜化)生物のタンパク質コードヌクレオチド配列を、該栽培(家畜化)生物の野生祖先の対応配列と比較する;そしてb)該野生祖先の対応配列に比較して、ヌクレオチド変化を含み、そこで当該変化が進化的に有意である、該栽培(家畜化)生物中のポリヌクレオチド配列を選択する:工程を含む前記方法である。
【0014】
実施態様によっては、本明細書に記載された方法のいずれかにより同定されたヌクレオチド変化は、非同義置換である。実施態様によっては、該ヌクレオチド変化の進化有意性は、該ヌクレオチド配列の非同義置換割合(KA)に従って決定される。実施態様によっては、該進化的に有意な変化は、該栽培(家畜化)生物ポリヌクレオチドと対応する祖先ポリヌクレオチドとのKA/KS比を決定することにより査定される。好ましくは、該比率は少なくとも約0.75、またはさらに好ましくは該比率は少なくとも約1.25,1.50および2.00である。
【0015】
もう一つの側面では、本発明は、該栽培(家畜化)生物における関連形質を調整する可能性がある薬剤を同定する方法を提供するが、そこで該薬剤はポリペプチドの機能を調整する能力により同定され、進化的に有意な変化をもつポリヌクレオチド配列を発現する細胞、モデル系、またはトランスジェニック植物または動物と、少なくとも一つの候補薬剤を接触させることを含む前記方法である。
【0016】
また、栽培(家畜化)生物のタンパク質コードヌクレオチド配列と野生祖先からのタンパク質コード配列との大規模配列比較の方法も提供されるが、またa)栽培(家畜化)生物配列と野生祖先からの対応配列とを、配列ホモロジーに従って整列させる;そしてb)該野生祖先霊長類(?)からの相同配列に比較して、該栽培(家畜化)生物の配列内に何らかのヌクレオチド変化を同定する:ことを含む前記方法である。
【0017】
もう一つの側面では、本主題発明は、進化的に有意なヌクレオチド変化を、栽培(家畜化)生物中で独特で、亢進または変更された、商業的にまたは審美的に関連する形質に相関させるための方法を提供するが、またa)本明細書に記載された方法に従って、進化的に有意な変化をもつヌクレオチド配列を同定する;そしてb)該栽培(家畜化)生物またはモデル系で、その同定された配列の存否の機能効果を分析する:ことを含む前記方法である。
【0018】
本主題方法に使用される栽培植物は、トウモロコシ(コーン)、コメ、トマト、ジャガイモ、または野生祖先が現存し、そして知られているどの栽培植物でもよい。例えば、コーンの祖先はブタモロコシであり;コムギの祖先類はTriticum monococcum,T.speltoidesおよびAegilops tauschii;そしてコメの祖先類はOryza nivoraおよびO.rufipogonである。関連形質は、収穫量、短日長開花、タンパク質含量、油含量、耐乾燥性、味、収穫の容易さ、または耐病性のような、商業的にまたは審美的に関連するどのような形質であってもよい。
【0019】
本主題方法に使用される家畜は、ブタ、ウシ、ウマ、イヌおよびネコを含め、祖先が入手できるどのような家畜であってもよい。例えば、ウマの祖先はPryzewalskii‘s Horseであり;そしてウシの祖先はいくつかのIndian品種を含む。関連する形質は、例えば、脂肪含量、タンパク質含量、乳生産、成熟までの期間、繁殖力、扱いやすさまたは耐病性および罹病性であってもよい。
【0020】
発明の詳細な説明
本発明は、栽培(家畜化)生物(例えば、植物および動物)において商業的にまたは審美的に関連する形質に随伴する、したがってそれらに寄与するか、あるいは原因となっている可能性がある、特定の遺伝子変化を同定するために、比較ゲノミクスを利用する。
【0021】
好ましい実施態様で、本明細書に記載されている方法は、農業的に重要な栽培植物中の興味深い形質を制御する遺伝子類を同定するのに適用可能である。人類は、栽培植物の形質を制御する遺伝子類については何も知らずに、数千年もの間それらを育ててきた。関与する特定の遺伝機構が明らかになれば、分子レベルでずっと速やかに直接介入して、所望の、あるいは増強された形質をもつ植物をつくれるようになるだろう。
【0022】
人類は、人工選択によって、農作物に強い淘汰圧を加えてきた。この圧力は、栽培生物とそれらの野生祖先の相同遺伝子類の間の進化的に有意な変化に反映されている。ごく少数の遺伝子、例えば、1種当り10−15個が、栽培農作物で商業的に興味ある形質を制御していることが、わかってきた。これらの少数の遺伝子を、植物分子生物学の標準法によって同定することは、従来きわめて困難であった。本明細書に記載のKA/KSおよび関連分析は、興味ある形質を制御している遺伝子類がそのタンパク質コード領域で変化を受けているのであれば、それらの遺伝子を同定することが可能である。
【0023】
関心のあるどの農作物についても、栽培種または亜種およびその野生祖先からcDNAライブラリーを構築できる。1999年1月29日出願のUSSN09/240,915に記載されているように、各々のcDNAライブラリーは、相同ポリヌクレオチドを同定するために相互に“ブラーストされている(BLASTed)”。あるいは、当業者は、cDNAライブラリーを構築するよりも、
www.central.edu/homepages/liedlb/genetics/gene−site.html;
www.ornl.gov/Techresources/Human−Genome/genetics.html;および
www.mcb.harvard.edu/Biolinks/Sequences.html
www.ncbi.nlm.gov/Web/Genbank/index.html
で見られるような商業的におよび/または公共的に入手可能なゲノムまたはcDNAデータベースにアクセス可能である。次に、淘汰圧の下に急速に進化した淘汰された遺伝子類を同定するため、KA/KSまたは関連分析を実施する。それらの遺伝子は、商業的または審美的に興味ある形質に一役買っているかどうかを明らかにするため、標準的な分子およびトランスジェニック植物法を用いて、評価される。次いで興味ある当該遺伝子を、例えば、ランダムまたは定方向突然変異誘発により、操作して、新しい、改良変種、亜種、株または栽培品種を開発する。
【0024】
同様に、本明細書に記載の方法は、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコおよび野生祖先が入手可能な他の家畜を含む、家畜に適用できる。特にウシおよびウマは重要な商業的関心対象となっている。植物の場合のように、人類は動物を何千年もの間飼育し、そしてそれらの強い淘汰圧は、興味ある急速に進化した遺伝子について、高いKA/KS比率に反映していると思われる。この場合も、相同ポリヌクレオチドを同定するために、家畜およびそれらの野生祖先の構築cDNAライブラリーを相互にブラーストすることが可能であり、および/または入手できる公共または私設のゲノムまたはcDNAデータベースにアクセスが可能である。相同配列について、KA/KSまたは関連分析を実施し、それにより人工淘汰圧の下に急速に進化したポリヌクレオチドを同定する。次いでそれらの遺伝子は、商業的または審美的関心の形質に一役買っているかどうかを明らかにするため、標準的な分子およびトランスジェニック動物法を用いて評価される。次にそれらの遺伝子を操作して、新しい改良動物変種または亜種の開発が可能である。
【0025】
本発明の実行には、別途指示がない限り、当該技術の技能の範囲内にある分子生物学、遺伝学および分子進化学の通常の技術を使用する。そうした技術は、“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,第2版(Sambrookら,1989);“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait編,1984);“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubelら編,1987);“PCR:The Polymerase Chain Reaction”,(Mullisら編,1994);“Molecular Evolution”,(Li,1997)のような文献に十分に説明されている。
【0026】
定義
本明細書で使われているように、“ポリヌクレオチド”は、リボヌクレオチド類またはデオキシリボヌクレオチド類のいずれか、またはそれらの類似体の、あらゆる長さのヌクレオチド類の重合型を指す。この用語は、当該分子の一次構造を指すので、二本および一本鎖DNAならびに二本および一本鎖RNAを含む。またメチル化および/またはキャップされた(capped)ポリヌクレオチド類のような修飾ポリヌクレオチド類も含む。“ポリヌクレオチド”および“ヌクレオチド配列”という用語は互換的に使われる。
【0027】
本明細書で使われているように、“遺伝子”は、タンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの部分を指す。遺伝子が、(プロモーター、エンハンサー、リプレッサー、および他の調節配列のような)5´および3´フランキング配列ならびにイントロンのような非コード配列も含むことは、当該技術分野ではよく知られている。 用語“ポリペプチド”、“ペプチド”、および“タンパク質”は、あらゆる長さのアミノ酸の重合体を指すために、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、グリコシル化、アセチル化およびリン酸化を含む反応を介して翻訳後に修飾されるタンパク質も含む。
【0028】
用語“栽培(家畜化)生物”は、人工淘汰圧に曝されたことがあり、そして商業的または審美的に関連する形質を発達させた個々の現存生物またはその集団、種、亜種、変種、栽培品種または株を指す。好ましい実施態様によっては、該栽培(家畜化)生物は、コーン、コムギ、コメ、コウリャン、トマト、ジャガイモ、または祖先がわかっている、商業的に興味深いすべてのその他の栽培植物から成る群から選択される植物である。別の好ましい実施態様では、該栽培(家畜化)生物は、ウシ、ウマ、ブタ、ネコおよびイヌより成る群から選択される動物である。栽培(家畜化)生物およびその祖先は、異なる種、亜種、変種、栽培品種または株またはそれらのあらゆる組合せとしての関係であってもよい。
【0029】
用語“野生祖先”または“祖先”は、それから栽培(家畜化)生物、種、亜種、変種、栽培品種または株が発生した、先駆者または前任者生物、種、亜種、変種、栽培品種または株を意味する。栽培(家畜化)生物は一つまたは一つより多い祖先をもつことがある。典型的には、栽培植物は一つまたは複数の祖先をもつことがあるのに対して、家畜は通常単一祖先のみをもつ。
【0030】
用語“商業的にまたは審美的に関連する形質”は、植物または動物のような栽培(家畜化)生物の分析によって、当該形質の要因であるポリペプチドを調整できる薬剤の開発に関連する情報(例えば、物理的または生化学的データ)の提供も可能である前記生物に存在する形質を指すのに、本明細書では使われる。その商業的にまたは審美的に関連する形質は、当該祖先に比べて、独特で、増強または変更されていてもよい。“変更されている”とは、その関連形質が該祖先に見られる形質と質的または量的に相違するとの意味である。
【0031】
用語“KA/KS型法”は、相同遺伝子類における非同義置換および同義置換の数間の、しばしば(必ずしも常にではないが)比率として示される、相違を評価する方法で、(非同義および同義部位を決定する、より厳密な方法を含む)ものを意味する。これらの方法は、非限定的にKA/KS,dN/dS,DN/DSを含むいくつかの命名システムを用いて指定される。
【0032】
用語“進化的に有意な変化”および“適応進化的変化”は、二つの生物、種、亜種、変種、栽培品種および/または株間の、正の淘汰圧に帰属される可能性がある、一つまたは一つより多いヌクレオチドまたはペプチドの配列変化を指す。進化的に有意な変化の存在を決定する一つの方法は、KA/KS比率を測定するような、KA/KS型分析法を適用することである。典型的には、KA/KS比率が少なくとも約0.75,より好ましくは少なくとも約1.0,より好ましくは少なくとも約1.25,より好ましくは少なくとも約1.5,そして最も好ましくは少なくとも約2.0であれば、正の淘汰の作用を示し、進化的に有意な変化があると考えられる。
【0033】
用語“正の進化的に有意な変化”は、特定の生物、種、亜種、変種、栽培品種または株における進化的に有意な変化で、他の関連生物に比べて積極的な適応変化をもたらすものを意味する。正の進化的に有意な変化の例は、農作物における収穫量の増加をもたらした変化である。
【0034】
用語“耐性”は、好ましくは非耐性生物と比べた場合、ある生物が、疾患状態および/またはその疾患の発症を避ける、またはその程度を低減する能力を示すことを意味する。
【0035】
用語“罹病性”は、好ましくは、耐性であることが知られている生物に比べた場合、ある生物が、疾患状態および/またはその疾患状態の発症を避ける、またはその程度を低減することができないことを意味する。
【0036】
耐性および罹病性は個体ごとに変り、そして本発明の目的のためにこれらの用語は、ある種内の個体の群にも適用し、また耐性および罹病性の比較は、種内比較に使ってもよいが、一般には種間の全体的な平均差異を指すと理解される。
【0037】
用語“相同”または“同族体”または“オルソログ”は、当該技術分野では知られて、またよく理解されており、共通の祖先をもつ関係配列を指し、そして配列同一性の程度に基づいて決定される。これらの用語は、一つの種、亜種、変種、栽培品種または株に見られる一つの遺伝子と、もう一つの種、亜種、変種、栽培品種または株における対応または相当遺伝子との間の関係を説明している。本発明の目的のためには、相同配列が比較される。“相同配列”または“同族体”または“オルソログ”は機能的に関係すると、考えられ、信じられ、あるいは知られている。機能的関係は、(a)配列同一性の程度;(b)同一のまたは同様な生物機能;を非限定的に含む多数の方途のいずれか一つで示されてもよい。好ましくは、(a)および(b)の両方で示される。配列同一性の程度は変動することがあるが、(当該技術分野で知られる標準的な配列アラインメント(整列、alignment)プログラムを用いる場合)好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約85%である。ホモロジーは、Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubelら編,1987)補遺30,節7.718,表7.71に記載のもののような、当該技術分野で容易に入手可能なソフトウエアプログラムを用いて、決定できる。好ましいアラインメントプログラムは、MacVector(Oxford Molecular Ltd,オックスフォード、英国)およびALIGN Plus(Scientific and Educational Software, ペンシルバニア)である。もう一つの好ましいアラインメントプログラムはデフォルトパラメーターを用いるSequencher(GeneCodes,Ann Arbor,ミシガン)である。
【0038】
用語“ヌクレオチド変化”は、当該技術分野ではよく理解されているように、ヌクレオチドの置換、欠失、および/または挿入を指す。
“ハウスキーピング遺伝子”は、当該技術分野ではよく理解されている用語で、増殖、分裂、静止、代謝、および/または死を非限定的に含む全般的細胞機能に随伴する遺伝子類を意味する。“ハウスキーピング”遺伝子類は一般に、一つ以上の細胞タイプで見られる機能を遂行する。それに対し、細胞特異的遺伝子類は一般に、特定の細胞タイプおよび/またはクラスでの機能を遂行する。
【0039】
用語“薬剤(agent)”は、本明細書で使われる場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能を調整する単純または複雑な有機または無機分子、ペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドのような生物学的または化学的化合物を意味する。例えば、オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドのようなオリゴマー類、さまざまなコア構造に基づく合成の有機および無機化合物類など、膨大な種類の化合物の合成も可能であり、そしてそれらも用語“薬剤”の中に含まれる。加えて、さまざまな天然物は、植物または動物抽出物などのようなスクリーニング用の化合物を提供することも可能である。化合物は、単独でも、他のものと組合せてテストしてもよい。
【0040】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの“機能を調整すること”という用語は、該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能が、薬剤を添加しない場合に比べて、変えられることを意味する。調整は、機能に影響するどのようなレベルでも生じることも可能である。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能は直接的でも、間接的でもよく、そして直接的に、または間接的に測定も可能である。
“ポリヌクレオチドの機能”は、複製;翻訳;発現パターンを非限定的に含む。ポリヌクレオチド機能は、該ポリヌクレオチド内でコードされるポリペプチドに随伴する機能も含む。例えば、ポリヌクレオチドに作用し、タンパク質の発現、コンホメーション、フォールディング(または他の物理的特性)、(リガンドのような)他の分子部分(moieties)への結合、活性(または他の機能特性)、タンパク質構造または機能の調節および/または他の側面、などに影響する薬剤は、調整性ポリヌクレオチド機能をもつと考えられる。
【0041】
“ポリペプチドの機能”は、コンホメーション、フォールディング(または他の物理的特性)、(リガンドのような)他の分子部分への結合、活性(または他の機能特性)、および/またはタンパク質構造または機能の他の側面、を 非限定的に含む。例えば、ポリペプチドに作用し、そのコンホメーション、フォールディング(または他の物理的特性)、(リガンドのような)他の分子部分への結合、活性(または他の機能特性)、および/またはタンパク質構造または機能の他の側面に影響する薬剤は、調節性ポリペプチド機能をもつと考えられる。有効な薬剤がポリペプチドの機能を調整するように作用する仕方は、1)コンホメーション、フォールディングまたは他の物理的特性を変えること;2)天然リガンドへの結合力を変えることまたはリガンドへの結合の特異性を変えること;および3)該ポリペプチドの活性を変更すること、を非限定的に含む。
【0042】
用語“標的部位”は、単一アミノ酸であってもよく、および/または、構造および/または機能モチーフの一部、例えば結合部位、二量体化ドメイン、または触媒活性部位である、ポリペプチド中の場所を意味する。標的部位は、治療薬のような薬剤との直接または間接相互作用に有用と思われる。
【0043】
用語“分子差”は、何らかの構造および/または機能差を含む。そうした差を検出する方法、ならびにそうした差の例は、本明細書に記載されている。
“機能的効果”は、当該技術分野で周知の用語で、直接、間接を問わず、活性の何らかのレベルで表示される何らかの効果を意味する。
【0044】
用語“収穫の容易さ”は、消費または他の商業的処理のために、構造物または部分(例えば、果実、葉、根)の手動または自動収集を容易にする植物特性または特徴を指す。
【0045】
技術分野で知られる一般的手順
本発明の目的のための、栽培(家畜化)植物または動物またはその祖先からのポリヌクレオチドの原料は、適切であればどのようなものでも可能で、例えば、ゲノム配列またはcDNA配列である。好ましくは、cDNA配列が比較される。タンパク質コード配列は、本明細書に記載のような利用できる私設、公共および/または商業データベースからの入手も可能である。それらのデータベースは、現在も進行中の研究努力によりつくられた分子配列データの貯蔵所として役立っている。あるいは、タンパク質コード配列は、例えば、当該技術分野で周知の方法に従って、細胞中で発現されるmRNAから逆転写されたcDNAの配列決定から、またはPCR増幅後に、得てもよい。あるいは、ゲノム配列を、配列比較に使用してもよい。ゲノム配列は、利用できる私設、公共および/または商業データベースから、または商業的に利用できるゲノムDNAライブラリーの配列決定から、またはPCR後にゲノムDNAから、入手も可能である。
【0046】
実施態様によっては、所定の発生段階における組織、または当該生物をある種の環境条件においた後に得られる組織から得たmRNAからcDNAを調製する。本発明の配列比較に使われるcDNAライブラリーは、当該技術分野の文献に十分説明されている通常のcDNAライブラリー構築技術を用いて構築できる。全mRNAを鋳型として用い、cDNAを逆転写する。転写されたcDNAは適切なベクター中へサブクローニングして、cDNAライブラリーを確立する。確立されたcDNAライブラリーは完全長cDNA含量へマキシマイズ(maximize)も可能だが、完全長以下のcDNAを使用してもよい。さらに、配列頻度を、例えば、Bonaldoら(1996)Genome Research 6:791−806に従って、標準化することも可能である。その構築cDNAライブラリーからランダムに選択されたcDNAクローンは、標準自動シークエンシング法を用いて、配列を決定できる。好ましくは、完全長cDNAクローンがシークエンシングに使われる。cDNAライブラリーからの全部またはかなりの部分のcDNAクローンの配列決定も可能であるが、単一cDNAまたはいくつかのcDNAクローンという少数を配列決定することにより、本発明の実施態様の一部を実行することも可能である。
【0047】
本発明の一つの好ましい実施態様では、配列決定されるcDNAクローンは、それらの発現特異性に従って、前選択することも可能である。特異的に発現される活性遺伝子に対応するcDNAを選択するには、同一動物の他の器官、組織または細胞から得たmRNAを用いて、当該cDNAを差引きハイブリダイゼーションにかけてもよい。適切な厳密性と濃度を備えたある種のハイブリダイゼーション条件下では、組織非特異的mRNAとハイブリダイズし、したがって“ハウスキーピング”遺伝子を表すと思われるcDNAは、当該cDNAプールから除外されることになる。したがって、残る配列決定予定のcDNAは、組織特異的機能に随伴している可能性が高い。差引きハイブリダイゼーションの目的のために、組織非特異的mRNAは、一つの器官から得てもよいが、好ましくは異なる器官および細胞の組合せから得る。組織非特異的mRNAの量は、組織特異的cDNAを飽和するように、マキシマイズする。
【0048】
あるいは、オンラインデータベースからの情報を使って、特定の機能に随伴する可能性が高いcDNAに優先順位を選択するか与えてもよい。例えば、配列決定のための祖先cDNA候補は、候補栽培(家畜化)生物cDNA配列からデザインされたプライマーを使ってPCRにより、選択することも可能である。候補栽培(家畜化)生物cDNA配列は、例えば、骨格筋のような特定の組織にのみ見られるか、特定の機能に重要らしい遺伝子に対応するものである。そうした組織特異的cDNA配列は、cDNA配列についての発現プロファイルおよび/または生物活性に関する情報が指定されているオンライン配列データベースを検索して得てもよい。既知栽培(家畜化)生物の遺伝子に対する祖先同族体の配列は、(例えば、GeneAmp PCR System 9700 thermocyclers(Applied Biosystems,Inc.)を用いる)PCR法のような当該技術分野で標準的な方法を使って、得てもよい。例えば、配列決定用の祖先cDNA候補は、候補栽培(家畜化)生物cDNA配列からデザインされたプライマーを用いてPCRにより選択も可能である。PCRのために、PRIMERR(Whitehead Institute)のような公共的に利用できるプライマーデザインプログラムを含む当該技術分野での標準法を用いて、その栽培(家畜化)生物の配列からプライマーを作ってもよい。次いで増幅された当該祖先配列は、自動シークエンサー(Applied Biosystems,Inc)のような当該技術分野で標準的な方法および装置を用いて配列決定してもよい。
【0049】
発明の一般的方法
本発明の一般的方法は以下のとおりである。要するに、ヌクレオチド配列を栽培(家畜化)生物および野生祖先から得る。その栽培(家畜化)生物および祖先のヌクレオチド配列を相互に比較し、相同的な配列を同定する。当該相同配列を分析し、前記栽培(家畜化)生物および祖先間に核酸配列に差異があるものを同定する。次に分子進化分析を実施して、前記差異の進化的有意性を定性的におよび定量的に評価する。正の淘汰を受けた遺伝子について、外群分析を行って、(その祖先とは異なり)栽培(家畜化)生物で正の淘汰を受けた遺伝子を同定する。次にその配列について、分子/遺伝子同一性および生体機能の点から、特性把握を行う。最後に、その情報を用いて、当該遺伝子によりコードされるポリペプチドの生体機能を調整できる薬剤を同定する。
【0050】
本発明の一般的方法は、必然的に祖先および栽培(家畜化)生物のタンパク質コードヌクレオチド配列の比較を伴う。その比較には生命情報科学を適用し、進化的に有意な変化であるヌクレオチド変化を含む配列を選択する。本発明によって、何らかの進化的利益を与えるように進化した遺伝子類の同定およびその特定の進化変化の同定が可能になる。
【0051】
栽培(家畜化)生物およびその祖先のタンパク質コード配列を比較して、相同配列を同定する。この比較を完成するための何らかの適切な機構が、本発明により意図される。アラインメントは、手動でも、またソフトウエアによってでも実施可能である(適切なアラインメントプログラムの例は当該技術分野では知られている)。好ましくは、データベース検索、例えば、BLAST検索を介して、祖先からのタンパク質コード配列を当該栽培(家畜化)種配列と比較する。高得点“ヒット”、すなわち、BLAST分析で有意な類似性を示す配列が、回収され、そして分析される。有意な類似性を示す配列とは、少なくとも約60%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%または少なくとも約90%の配列同一性をもつものである。好ましくは、約80%より大きな同一性を示す配列がさらに分析される。データベース検索を介して同定された相同配列は、Higginsら(1992)CABIOS 8:189−191による、普通使われる簡単なアラインメントプログラムCLUSTAL Vのような、技術分野で知られ、利用できる配列アラインメント方法およびプログラムを用いて、全体を整列可能である。
【0052】
あるいは、栽培(家畜化)生物およびその祖先間の、タンパク質コード配列の配列決定および相同性比較は、新しく開発されたシークエンシングチップ法により同時に実施してもよい。例えば、Ravaら米国特許第5,545,531号を参照されたい。
【0053】
栽培(家畜化)生物および祖先の整列済みタンパク質コード配列は、特定の部位におけるヌクレオチド配列の差異を同定するために、分析される。ここでも、この分析を達成するための何らかの適切な方法が、本発明によって意図される。ヌクレオチド配列に差異がない場合は、該祖先タンパク質コード配列は、通常それ以上分析されない。検出された配列変化は一般に、そして好ましくは、始めに精度についてチェックされる。好ましくは、その当初チェッキングは、当該技術分野ではどれもまたすべてが知られている下記の一つまたは一つ以上の工程の実施を含む:(a)該祖先および栽培(家畜化)生物配列間に変化がある点を見い出す;(b)該祖先または栽培(家畜化)生物に特有と思われる塩基が、コールされた塩基に特異的な強い鮮明なシグナルに対応するかどうかを決定するために、該配列フルオログラム(クロマトグラム)をチェックする;(c)配列変化に対応する一つ以上の栽培(家畜化)生物配列があるかどうかを見るために、該栽培(家畜化)生物ヒットをチェックする;ことである。祖先配列中に異なるヌクレオチドがある位置に同一ヌクレオチドをもつ同一遺伝子についての複数の栽培(家畜化)生物配列記入は、その栽培(家畜化)配列が正確であり、その変化が有意であることの独立した裏付けとなる。そうした変化はデータベース情報および遺伝暗号を用いて調べ、それらのヌクレオチド配列変化が、コードされるタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすかどうかを決定する。“ヌクレオチド変化”の定義が明らかにしているように、本発明は、栽培(家畜化)生物のタンパク質コードポリヌクレオチド配列中に、その祖先からの対応配列に比較して、少なくとも一つのヌクレオチド変化、すなわち置換、欠失または挿入のいずれかを含む。好ましくは、その変化はヌクレオチド置換である。さらに好ましくは、当該同定配列中に一つ以上の置換が存在し、そして分子進化分析を受けさせることである。
【0054】
栽培(家畜化)種遺伝子配列と対応する祖先の配列との間に同定されたヌクレオチド変化の進化有意性を定性的および定量的に評価するために、いくつかの異なる分子進化分析、すなわちKA/KS型法のどれでも採用可能である。KreitmanおよびAkashi(1995)Annu.Rev.Ecol.Syst.26:403−422;Li,Molecular Evolution,Sinauer Associates,Sunderland,ミネソタ、1997。例えば、タンパク質上の正の淘汰(すなわち、分子レベル適応進化)は、非同義部位当りの非同義ヌクレオチド置換(KA)の同義部位当りの同義置換(KS)に対する比率のペアワイズ比較により、タンパク質コード遺伝子中に検出可能である(Liら,1985;Li,1993)。KAおよびKSの比較はどれでも使えるが、これら二つの変数を比率として比較するのが、特に便利で、しかも最も有効である。標準統計法を用い、KAおよびKS間の統計的に有意な差を示すことにより、配列は同定される。
【0055】
好ましくは、LiらによるKA/KS分析を使って本発明を実行するが、種間の正の淘汰遺伝子を検出できる他の分析プログラムも使用可能である。Liら(1985)Mol.Biol.Evol.2:150−174;Li(1993)J.Mol.Evol.36:96−99も参照;MessierおよびStewart(1997)Nature 385:151−154;Nei(1987)Molecular Evolutionary Genetics(New York,Columbia Univeristy Press)。比率に関して遺伝子の相同タンパク質コード領域間の、非同義部位当りの非同義置換の割合と同義部位当りの同義置換の割合との比較を含む該KA/KS法は、進化の際の、中立淘汰ではなく、適応淘汰により駆動される配列置換を同定するのに用いられる。同義(“サイレント”)置換は、遺伝暗号の縮重のため、コードされるアミノ酸配列に変化を起さないものであり;非同義置換はアミノ酸交換をもたらす。各タイプの変化の程度は、同義部位当りの同義置換および非同義部位当りの非同義置換の数である、それぞれKAおよびKSとして推定可能である。KA/KSの計算は、手動でも、ソフトウエアの使用によっても実施してよい。適切なプログラムの例はMEGA(Molecular Genetics Institute,Pennsylvania State University)である。
【0056】
KAおよびKSを推定する目的のために、完全または部分タンパク質コード配列のいずれかを用いて、同義および非同義置換ならびに非同義および同義部位の総数を計算する。分析されるポリヌクレオチド配列の長さは、適切であればどのようでもよい。好ましくは、ありとあらゆる有意な変化を決定するためには、全コード配列が比較される。すべてのペアワイズ比較のためのKAおよびKS値の計算には、Li93(Li(1993)J.Mol.Evol.36:96−99)またはINAのような、公共的に利用できるコンピュータープログラムが使用可能である。この分析は、少数の重要な変化が全体の配列によってマスクされないように、“スライディングウインドウ”様式で配列を調べるのにも適用可能である。“スライディングウインドウ”は、該遺伝子の連続重複サブセクション(サブセクションはどのような長さでもよい)の検討を指す。
【0057】
非同義および同義置換割合の比較はKA/KS比率により表される。KA/KSは、検討中の当該配列で適応進化が作用してきた程度を反映することが、明らかにされている。コード配列の完全長または部分セグメントが、該KA/KS分析に使用可能である。KA/KS比率が高いほど、配列は適応進化を受けた可能性が高く、そしてその非同義置換は進化的に有意である。例えば、MessierおよびStewart(1997)を参照されたい。好ましくは、該KA/KS比率は少なくとも約0.75、より好ましくは少なくとも約1.0、より好ましくは少なくとも約1.25、より好ましくは少なくとも約1.50、またより好ましくは約2.00である。好ましくは、すべての高KA/KS比率について、スチューデントのt検定およびYang(1998)Mol.Biol.Evol.37:441−456により記載の同様な比率検定のような標準方法を非限定的に含む、統計分析を実施する。
【0058】
相同配列のペアワイズ比較については、1より有意に大きいKA/KS比率は、偶然だけの結果として予測されるよりも多くのアミノ酸置換を正の淘汰が固定し、そしてその比率が1より少ないか等しい場合に普通に観察されるパターンとは対照的であることを、強く示唆する。Nei(1987);HughesおよびHei(1988)Nature 335:167−170;MessierおよびStewart(1994)Current Biol.4:911−913;KreitmanおよびAkashi(1995)Ann.Rev.Eco.Syst.26:403−422;MessierおよびStewart(1997)。1以下の比率は、負の、または浄化淘汰の役割を一般には意味する:すなわち、機能性の、有効なタンパク質類の一次構造は変化しないようにする強い圧力がかかっている。
【0059】
KA/KSを計算するためのすべての方法は、祖先および栽培(家畜化)生物からの相同遺伝子類のタンパク質コード領域についての同義部位当りの同義置換の数に対する、非同義部位当りの非同義置換の数のペアワイズ比較に基づいている。各方法は、“複数ヒット”(すなわち同一部位における一つ以上のヌクレオチド置換)を見積るための異なる補正処置を備えている。また各方法は、進化的時間にわたってどのようにDNA配列が変化するかについて、異なるモデルを使用している。それ故、好ましくは、異なるアルゴリズムからの結果の組合せを用いて、正に淘汰された遺伝子を検出する感度およびその結果の信頼度のレベルを高める。
【0060】
好ましくは、KA/KS比率は、パラロガス(paralogous)遺伝子ペア(すなわち、遺伝子重複の結果である遺伝子とは違い、種分化から生じる遺伝子)ではなく、オルソロガス遺伝子ペアについて、計算しなければならない、MessierおよびStewart(1997)。この区別は、系統樹構築を可能にする、別の祖先との追加比較を実施することにより、行ってもよい。オルソロガス遺伝子は、系統樹構築に使われた場合、既知の“種系統樹”をつくる、すなわち、既知の生物樹を回復する系統樹を生産するはずである。それに反して、パラロガス遺伝子は、既知の生物樹に違反する系統樹をつくるはずである。
【0061】
本明細書に記載された方法は、タンパク質コード配列に機能的に関係する、祖先または栽培(家畜化)生物ポリヌクレオチド配列の同定をもたらすと、理解される。そうした配列は、非限定的に、非コード配列またはタンパク質をコードしないコード配列を含む可能性もある。これらの関連配列は、例えば、イントロンまたは(プロモーターおよびエンハンサーのような調節エレメントを含む)5´および3´隣接配列のように、該ゲノム中のタンパク質コード配列に物理的に隣接していることもある。それらの関連配列は、利用できる公共、私設および/または商業ゲノムデータベースの検索を介して、あるいは、タンパク質コード配列をプローブとして当該生物のゲノムライブラリーをスクリーニングし、そして配列分析することにより、入手してもよい。関連コード配列を用いて非コード配列を入手するための方法および技術は、当業者には周知である。
【0062】
KA/KS分析のような分子進化分析により検出される進化的に有意なヌクレオチド変化は、当該栽培(家畜化)生物におけるそれらの独特の存在またはそれらの変化が当該生物に独特である程度を、さらに査定可能である。例えば、その栽培(家畜化)遺伝子に同定された変化は、当該栽培(家畜化)生物と共通の祖先をもつ関連種、亜種または他の生物の別の配列中の存否について検査が可能である。この比較(“外群分析”)によって、その正に淘汰された遺伝子が、(祖先と違って)当該栽培(家畜化)生物のために積極的に選択されるかどうかの決定が可能になる。
【0063】
栽培(家畜化)生物およびその祖先と間の少なくとも一つの進化的に有意な変化をもつ配列は、他の祖先タンパク質コード配列のPCR分析のためのプライマーとして使用可能で、そして得られたポリヌクレオチドは、他の祖先に同一変化が存在するかどうかを見るために、配列分析される。それらの比較によって、当該適応進化的変化が、他の祖先に比較して当該栽培(家畜化)系譜に独特なのかどうか、または当該適応変化が、当該栽培(家畜化)種および他の祖先に比較して当該祖先に独特かどうか、に関してさらに識別が可能になる。栽培(家畜化)生物に検出されるが、他の祖先には検出されないヌクレオチド変化は、当該栽培(家畜化)生物での適応進化的変化を表している可能性がさらに高い。あるいは、該栽培(家畜化)生物または他の祖先に検出されず、該祖先に検出されるヌクレオチド変化は、祖先適応進化的変化を表している可能性が高い。比較に用いる他の祖先は、当該栽培(家畜化)生物との系統分類関係に基づいて、選択可能である。そうした比較の統計学的有意性は、確立され利用可能なプログラム、例えば、MessierおよびStewart(1997)Nature 385:151−154により使われているt検定を用いて決定してもよい。統計的に高いKA/KS比率を示す遺伝子類は、適応進化を受けた可能性が極めて高い。
【0064】
有意な変化をもつ配列は、該配列変化が一つ以上の栽培(家畜化)集団により共有されているかどうかを見るために、異なる栽培(家畜化)集団からのゲノム中でプローブとして使用可能である。異なる栽培(家畜化)集団からのゲノム配列は、データベースから、または別に、多数の無関係で多様な栽培(家畜化)集団からのPCR増幅DNAの直接配列分析から、得てもよい。異なる栽培(家畜化)集団に当該同定変化が存在すれば、当該変化の進化有意性をさらに示すことになる。
【0065】
種間で有意な変化をもつ配列は、普通の当業者に知られている方法および技術を用いて、それらの分子/遺伝子同一性および生物機能に関して、さらに性状把握が可能である。例えば、それらの配列は、公共的に利用できる生命情報科学プログラムを用いて、当該生物のゲノム内に遺伝子的におよび物理的に位置させることも可能である。ヌクレオチド配列内に新たに同定される有意な変化は、当該生物の進化におけるその遺伝子の潜在的役割、および独特で、増強され、または変更された機能性能力の潜在的随伴とを示唆している。同定された配列をもつ推定遺伝子は、例えば、ホモログ検索によりさらに特性把握してもよい。該推定遺伝子の既知遺伝子との共有相同性は、同じような生体役割または機能示す可能性もある。推定遺伝子配列の特性把握をするためのもう一つの模範的な方法は、既知の配列モチーフに基づくものである。ある種の配列パターンは、シグナル配列、DNA結合ドメイン、または膜貫通ドメインのような特定の生体特徴をもつタンパク質の領域をコードすることが知られている。
【0066】
有意な変化をもつ同定された配列は、組織特異性または細胞タイプ特異性の点で、当該遺伝子がどこで発現されるかを見ることにより、さらに評価することも可能である。例えば、同定コード配列は、該配列の発現パターンを明らかにするインシトウ(in situ)mRNAハイブリッド形成を実施するためのプローブとして用いることも可能である。ある組織で発現される遺伝子は、その組織、例えば、骨格筋組織に伴う重要な機能と随伴することの、よりよい候補としてもよい。ある種(species)のメンバーの発生各段階での遺伝子発現のタイミングも決定できる。
【0067】
配列特性把握のもう一つの模範的な方法として、有意変化をもつ同定ヌクレオチド配列の機能的役割を、トランスフェクトされた栽培(家畜化)生物、例えば、トランスジェニック植物または動物で、同定された遺伝子の異なる対立遺伝子について機能分析を実行することにより査定してもよい。
【0068】
配列特性把握のもう一つの模範的方法として、コンピュータープログラムの使用により、栽培(家畜化)生物および祖先からの相同タンパク質の三次元構造のモデル化と視覚化が可能である。祖先タンパク質中でどのアミノ酸が置換されているかを正確に特定できれば、機能の相違に伴うであろう構造変化を検出できる。このように、モデル化技術の使用は、前項で論考した機能的役割の同定と密接に関連している。これらの技術の個別または組合せ使用は本発明の一部を構成する。
【0069】
本主題方法により同定される栽培(家畜化)生物の遺伝子は、祖先を共有する他種における相同遺伝子の同定に使用可能である。例えば、コーン、コメ、コムギ、キビおよびコウリャンは共通の祖先をもっており、コーンで同定される遺伝子はこれらの他のイネ科草本植物で相同遺伝子を直接もたらす可能性がある。同様に、トマトとポテトは共通の祖先をもっており、本主題方法によりトマトで同定される遺伝子はポテトに相同体があると予測される。 本明細書に記載の方法により同定される配列は、栽培(家畜化)生物の独特で増進あるいは変更された機能能力の調整、および/または当該配列を用いるそれらの能力の欠陥の修正に有用な薬剤の同定に使用可能である。それらの方法は、例えば、in vitro(試験管内)系、細胞基盤発現系およびトランスジェニック動物および植物のような当該技術分野で知られるスクリーニング技術を採用する。本発明により提供されるアプローチは、急速に進化した遺伝子を同定するだけでなく、もう一つの種に存在するため毒性が強過ぎないと思われるタンパク質に対して行える調整も、指示する。
【0070】
スクリーニング方法
本発明は、上記の方法により同定および特性把握されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いるスクリーニング方法も、提供する。これらのスクリーニング方法は、栽培(家畜化)生物における特徴を増強または低減するのに役立つはずの仕方で、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能を調整する可能性がある薬剤を、同定するのに有用である。一般に、当該方法は、検査される少なくとも一つの薬剤を、上記の方法により同定されたポリヌクレオチド配列でトランスフェクトされたトランスジェニック生物または細胞か、そのようなポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの調製物かのいずれかと接触させることを課すものであって、そこで薬剤は、該ポリヌクレオチド配列か、該ポリペプチドかのいずれかの機能を調整するその能力により同定される、前記方法である。例えば、薬剤は、栽培(家畜化)植物または動物に適用または接触させて、所望の時間に同定された遺伝子の発現を誘導するような化合物であってもよい。植物に関して特異的には、薬剤は、適切な時期に開花を誘導するのに使用することもできよう。
【0071】
本明細書で使われるように、用語“薬剤”は、単純または複雑な有機または無機分子、ペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドのような生物学的または化学的化合物を意味する。膨大な群の化合物が合成可能で、例えば、オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドのようなオリゴマー類、およびさまざまなコア構造に基づく合成有機および無機化合物で、そしてそれらは用語“薬剤”にも含まれる。加えて、さまざまな天然源が、植物または動物抽出物などのような、スクリーニング用の化合物を提供できる。化合物の検査は、単独でも、相互に組合せて行ってもよい。
【0072】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの“機能を調整する”は、薬剤を加えない場合と比較すると、該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能が変更されることを意味する。調整は、どの程度に機能に影響してもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能は、直接でも、間接でもよく、直接的にまたは間接的に測定してもよい。ポリヌクレオチドの“機能”は、非限定的に、複製、翻訳、および発現パターンを含む。ポリヌクレオチド機能は、該ポリヌクレオチド内でコードされるポリペプチドに随伴する機能も含む。例えば、ポリヌクレオチドに作用し、タンパク質の発現、コンホメーション、フォールディング(または他の物理的特性)、(リガンドのような)他の分子部分への結合、活性(または他の機能特性)、タンパク質の構造または機能の調節および/または他の側面に、影響を及ぼす薬剤は、ポリヌクレオチド調整機能をもつと考えられる。有効な薬剤がポリヌクレオチドの発現調整するために働く仕方は、1)転写因子が該ポリヌクレオチド中の転写因子応答エレメントへ結合するのを修飾する;2)該ポリヌクレオチドの発現に必要な二つの転写因子間の相互作用を修飾する;3)該ポリヌクレオチドの発現に必要な転写因子が核へ入る能力を変更する;4)該ポリヌクレオチドの転写に関与する転写因子の活性化を阻害する;5)通常、リガンドと相互作用し、そのリガンドとの結合が該ポリヌクレオチドの発現をもたらす細胞表面受容体を修飾する;6)該ポリヌクレオチドの発現をもたらすシグナル伝達カスケードの成分の不活性化を阻害する;そして7)該ポリヌクレオチドの転写に関与する転写因子の活性化を亢進する、ことを非限定的に含む。
【0073】
ポリペプチドの“機能”は、非限定的に、コンホメーション、フォールディング(または他の物理的特性)、(リガンドのような)他の分子部分への結合、活性(または他の機能特性)、および/またはタンパク質の構造または機能の他の側面を含む。例えば、ポリペプチドに作用し、そのコンホメーション、フォールディング(または他の物理的特性)、(リガンドのような)他の分子部分への結合、活性(または他の機能特性)、および/またはタンパク質の構造または機能の他の側面に影響する薬剤は、ポリペプチド調整機能をもつと考えられる。有効な薬剤がポリペプチドの機能を調整するように働く仕方は、1)そのコンホーメーション、フォールディングまたは他の物理的特性を変える;2)その天然リガンドへの結合力を変える、またはリガンドへの結合の特異性を変える;および3)該ポリペプチドの活性を変更する、ことを非限定的に含む。
【0074】
一般に、スクリーンされる薬剤の選択は、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的、その認知された機能、その三次元構造(わかっているか、推測されている場合)、および合理的なドラッグデザインの他の側面のような、いくつかのパラメーターにより支配される。コンビナトリアルケミストリーの技術も、候補物質の多数の順列を作るのに使ってもよい。当業者は、検査用の適切な薬剤を工夫および/または入手することができる。
【0075】
本明細書に記載されているin vivo(生体内)スクリーニングアッセイは、従来の薬剤スクリーニングアッセイに比べて、いくつかの長所をもつと思われる:すなわち、1)薬剤が、所望の治療効果を達成するために、細胞に入らなければならないのであれば、in vivoアッセイは、その薬剤が細胞に入れるかどうかについて、兆候を示すことが可能である;2)in vivoスクリーニングアッセイは、該アッセイ系に添加された状態では、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド機能の調整に伴う少なくとも一つの特徴を発揮するのに無効だが、それらが有効な薬剤になるように、一旦細胞の内部では細胞成分により修飾される薬剤を、同定できる;3)最も重要なのは、in vivoアッセイ系は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド機能に随伴する特徴を最終的にもたらす経路のいずれかの成分に影響する薬剤の同定を、可能にすることである。
【0076】
一般にスクリーニングは、本発明の方法を用いて同定されたポリヌクレオチドでトランスフェクトされた適切な細胞試料に、薬剤を添加し、そしてその効果、すなわち該ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチド内でコードされた該ポリペプチドの機能の調整をモニターすることにより実施可能である。当該実験は、候補薬剤を入れない対照試料を含むことが好ましい。次いで、それらの処理および無処理細胞は、顕微鏡分析、生存力試験、複製する能力、組織学的検査、当該細胞に伴う特定のRNAまたはポリペプチドの含量、当該細胞または細胞溶解物により発現される酵素活性のレベル、感染性因子に曝露された場合の当該細胞の相互作用、および他細胞または化合物と相互作用する当該細胞の能力、を非限定的に含む、いずれかの適切な表現型的基準により比較する。処理および無処理細胞間の相違は、当該候補薬剤に帰属される効果を示す。至適には、該薬剤は、対照細胞よりも実験細胞により大きな効果をもつ。適切な宿主細胞は、非限定的に、好ましくは哺乳動物細胞を含む真核生物細胞である。。細胞の選択は、意図するアッセイの性質に少なくとも部分的には依存する。 ポリヌクレオチドの発現を上向き調節する薬剤を検査するためには、該ポリヌクレオチドが発現(本明細書で使われる場合、発現は転写および/または翻訳を含む)されるように、その興味あるポリヌクレオチドでトランスフェクトした適切な宿主細胞を、検査する薬剤と接触させる。薬剤は、mRNAおよび/またはポリペプチドの発現増加をもたらす能力について検査される。ベクターの作製およびトランスフェクションの方法は、当該技術分野では周知である。“トランスフェクション”は、例えば、リポフェクション、形質導入、感染または電気穿孔を含む、外因性配列を導入するいずれかの方法を包含する。該外因性ポリヌクレオチドは、(プラスミドのような)非組込みベクターとして維持されてもよく、あるいは該宿主ゲノムへ組込まれてもよい。
【0077】
特異的に転写を活性化する薬剤を同定するために、転写調節領域はレポーター遺伝子に連結され、そしてその構築体が適切な宿主細胞に添加される。本明細書で使われる場合、用語“レポーター遺伝子”は、同定可能な遺伝子産物(すなわちレポータータンパク質)をコードする遺伝子を意味する。レポーター遺伝子は、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、および緑色蛍光タンパク質(GFP)を非限定的に含む。レポーター遺伝子の産物の同定方法は、非限定的に、酵素アッセイおよび蛍光アッセイを含む。レポーター遺伝子およびそれらの産物を検出するためのアッセイ法は、当該技術分野では周知で、そして例えば、Ausubelら(1987)および定期更新資料に記載されている。レポーター遺伝子、レポーター遺伝子アッセイ、および試薬キットも、市販源から容易に入手できる。適切な細胞の例は、非限定的に、カビ、酵母、哺乳動物細胞、および他の真核生物細胞を含む。通常の技術の実行者は、ウイルスベクターのような適当なベクターの調製;電気穿孔によるような該ベクターを前記細胞中へ搬入すること;およびレポーターまたは薬剤感受性エレメントを用いるような形質転換された細胞を選択することを含む、真核生物にトランスフェクトするための技術を熟知しているはずである。それらの構築体中の調節領域からの転写への薬剤の効果は、当該レポーター遺伝子産物の活性を介して査定される。
【0078】
上述のように普通は抑制される条件下での発現の増加の他に、正常に発現されるはずの場合に、発現が減少することがある。ある薬剤は、転写速度の低下を介してこれを行うことがあり、上記のレポーター遺伝子系はこれをアッセイする手段となる。そうした薬剤を査定するための宿主細胞は、発現に対して許容的であることが必要である。
【0079】
(関心のあるポリヌクレオチドから)mRNAを転写する細胞を用いて、mRNAの半減期および/またはmRNAの翻訳を特異的に調整する薬剤を同定することも可能である。そうした細胞は、該ポリペプチドのプロセシングおよび/または翻訳後の修飾に及ぼす薬剤の作用を査定するのにも使えるはずである。薬剤は、該ポリペプチドの代謝回転(すなわち、その半減期の増加または減少)を修飾することにより、ポリペプチドの量を調整することもある。該mRNAおよびポリペプチドに関する薬剤の特異性は、該薬剤の非存在下で当該産物を調べること、および無関係なmRNAおよびポリペプチドの産物を調べることにより、決定されるはずである。mRNA半減期、タンパク質プロセシング、およびタンパク質代謝回転を調べる方法は、当業者には周知である。
【0080】
In vivoスクリーニング法は、該ポリペプチドとの相互作用を介してポリペプチド機能を直接調整する薬剤の同定にも有用である。そうした薬剤は、ときに、正常なポリペプチド・リガンド相互作用を遮断したり、あるいはそのような相互作用を亢進したり、安定化したりすることもある。そうした薬剤は、該ポリペプチドのコンホメーションを変えることもある。該薬剤の作用は、免疫沈澱反応を用いて決定可能である。適切な抗体を使えば、該ポリペプチドおよびそれと強固に結合したいかなるタンパク質でも、沈澱させるはずである。処理細胞および無処理細胞から免疫沈澱されたポリペプチドを比較することにより、ポリペプチド・リガンド相互作用がもしあれば、それを増強または阻害する薬剤を同定できるだろう。ポリペプチド・リガンド相互作用は、ポリペプチド間の密接ではあるが、非共有相互作用を共有相互作用へ変換する架橋試薬を用いて、査定することも可能である。タンパク質・タンパク質相互作用を調べる技術は、当業者にはよく知られている。タンパク質のコンホメーションを査定する技術も当業者には周知である。
【0081】
スクリーニング法は、無細胞転写または翻訳系のようなin vitro法を含んでもよいことは、理解される。それらの系では、転写または翻訳が生じることが可能で、薬剤は、機能を調整するその能力が検査される。薬剤がmRNAまたはポリペプチドの翻訳を調整するかどうかを決定するアッセイでは、in vitro転写/翻訳系を使用してもよい。それらの系は商業的に入手でき、そして関心あるポリヌクレオチド配列に相当するmRNAをつくるin vitro手段を提供する。mRNAが作られた後、それをin vitroで翻訳し、そしてその翻訳産物を比較することも可能である。薬剤を含まないin vitro発現系(負の対照)と、薬剤を含むin vitro発現系とで翻訳産物を比較すれば、当該薬剤が翻訳に影響するかどうかが明らかになる。対照および検査ポリヌクレオチドとの間の翻訳産物を比較すれば、当該薬剤が、もしこのレベルで作用しているならば、(一般的な非選択的または非特異的な仕方で翻訳に影響するのではなく)、選択的に翻訳に影響するかどうかが、明らかになる。ポリペプチド機能の調整は、上に挙げたin vivoおよびin vitroアッセイならびにタンパク質調製物を用いるin vitroアッセイを、非限定的に、含む多くの仕方で達成可能である。ポリペプチド類を天然源または組換え体源から抽出および/または精製して、タンパク質調製物をつくることが可能である。薬剤をタンパク質調製物の試料に添加し、その効果をモニターしてもよい;すなわち、当該薬剤がポリペプチドに作用するかどうか、そしてそのコンホメーション、フォールディング(または他の物理的特性)、他の分子部分(リガンドのような)への結合、活性(または他の機能特性)、および/またはタンパク質構造や機能の他の側面にどのように影響するかを検討し、調整されたポリペプチド機能を明らかにする。
【0082】
本明細書に記載の方法により同定されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに結合する薬剤についてのアッセイの一例では、ポリペプチドが、自然タンパク質として、または(上記のように同定されたポリヌクレオチドによりコードされる)ポリペプチドが、特性が十分明らかにされているエピトープまたはタンパク質と共役している融合タンパク質として、原核生物または真核生物発現系で、まず組換え体的に発現される。次いで、組換え体ポリペプチドは、例えば、適正な抗体または抗エピトープ抗体を用いる免疫沈澱により、または該共役体の固定化リガンドに結合させることにより、精製する。次に、ポリペプチドまたは融合タンパク質から成るアフィニティカラムを使用して、適切に標識された化合物の混合物をスクリーンする。適切な標識は、非限定的に、蛍光色素、ラジオアイソトープ、酵素および化学発光化合物を含む。非結合および結合化合物は、当業者により日常的に採用されているさまざまな条件(例えば、高塩類溶液、界面活性剤)を用いて洗浄すことにより分離できる。該アフィニティカラムへの非特異的結合は、該共役体またはエピトープだけを含むアフィニティカラムを用いて、前記化合物混合物を前洗浄することにより、最少限にできる。同様な方法は、ポリペプチドへの結合を競合する薬剤(類)のスクリーニングにも使用可能である。アフィニティクロマトグラフィーの他に、融点の変化、あるいはもう一つの分子と結合すると変化するタンパク質の蛍光異方性を測定するような他の技術もある。例えば、ポリペプチドに共有結合しているセンサーチップ(Pharmacia Biosensorにより供給,Stittら(1995)Cell 80:661−670)を用いるBIAコアアッセイは、異なる薬剤の結合活性を定量するのに実行してもよい。
【0083】
本発明のin vitroスクリーニング法は、ポリペプチドのアミノ酸配列、三次元原子構造、または他の性質が、ポリペプチドへ結合すると見込まれる薬剤をデザインするための基礎を提供する、構造的、合理的薬剤デザインを含むことも了解されよう。一般に、この状況での薬剤のデザインおよび/または選択は、栽培(家畜化)生物のポリペプチドおよび相同祖先ポリペプチドの構造の並置比較、該ポリペプチド標的の認知された機能、その三次元構造(わかっているか、推測されている場合)、および合理的なドラッグデザインの他の側面のようないくつかのパラメーターにより支配される。コンビナトリアルケミストリーの技術も、候補薬剤の多数の順列を作るのに使ってもよい。
【0084】
本発明のスクリーニング法で同様に意図されるのは、トランスジェニック動物および植物系であるが、それらは当該技術分野では知られている。
上記のスクリーニング法は一次スクリーンを表しており、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能を調整する活性を示す薬剤を検出するためにデザインされている。薬剤をさらに評価するためには、二次検査が必要であろうことを、当業者は認識するだろう。例えば、二次スクリーンは、技術分野では知られているマウスおよび他の動物モデル(ラットのような)、または栽培(家畜化)植物または動物そのものを用いる感染性アッセイで当該薬剤(類)を検査することを含んでもよい。加えて、一次スクリーンで陽性と検査された薬剤が生物での使用に適しているとの、さらなる確証として細胞毒性アッセイを実施しなければならない。例えばMTTアッセイ(Promega)を含む、細胞毒性のどのようなアッセイでも、この目的には適しているはずである。
【0085】
本発明はまた、本明細書に記載のスクリーニング法により同定された薬剤も含む。
以下の実施例は、当該分野における通常の技術をさらに支援するために、提供するものである。それらの実施例はわかり易いように意図されており、したがって本発明を限定するものとみなすべきではない。多数の典型的な修飾や変更が本明細書に記載されており、そして他のものも当業者には自明となろう。そうした変更は、本明細書に記載および請求されているように、本発明の範疇に入ると考えられる。
【0086】
【実施例】
実施例1:cDNAライブラリーの構築
栽培(家畜化)植物または動物cDNAライブラリーは、植物または動物の適正な組織を用いて構築される。当該分野の普通の技術をもつ者には、関心にある形質に従って分析するための適正な組織がわかるはずである。あるいは、当該生物全体を使ってもよい。例えば、1日令の植物実生は該植物遺伝子の大部分を発現することがわかっている。
【0087】
全RNAを該組織から抽出し(RNeasyキット,Quiagen;無RNAse Rapid Total RNAキット,5Prime‐‐3Prime,Inc.)、該RNAの完全性および純度は、通常の分子クローニング法に従って決定する。PolyA+RNAを単離し(Mini−Oligo(dT)Cellulose Spin Columns,5Prime‐‐3Prime,Inc.)、そしてプライマーとしてoligo(dT)を用いるcDNAの逆転写のための鋳型として使用する。合成されたcDNAは、商業的に入手できるキットを用いて、クローニングのために処理そして修飾する。次いで組換え体は宿主細胞系にパッケージされ、繁殖される。パッケージング混合物の一部を増幅し、残りは増幅前に保留する。該ライブラリーは標準化し、そしてライブラリー中の独立組換え体の数を決定することも可能である。
【0088】
実施例2:配列比較
候補栽培(家畜化)生物遺伝子に基づく適切なプライマーを調製し、cDNAライブラリーからか、またはmRNAから調製されたcDNAのいずれかの祖先cDNAのPCR増幅のために使用する。該cDNAライブラリーから選択された祖先cDNAクローンは、ABI377のような自動シークエンサーを用いて、配列決定する。配列決定を実施するには、M13 UniversalおよびReverseプライマー類のようなクローニングベクター上で普通使われるプライマー類を使用する。エンドシークエンシングによって完全には配列決定されていない挿入断片については、色素標識ターミネーターまたはカスタムプライマーを用いて残りのギャップ充たすことも可能である。
【0089】
検出された配列の差異は、まず正確さについてチェックされるが、それは例えば、栽培(家畜化)および祖先配列間に差異があるポイントを見つける;栽培(家畜化)生物に独特に思われる塩基類が、当該塩基に特異的な強い鮮明なシグナルに対応するかどうかを決定するために、配列フルオログラム(クロマトグラム)をチェックする;配列変化に対応する一つ以上の配列があるかどうかを見るために、該栽培(家畜化)生物のヒットをチェックする;そして必要ならば当該技術分野で知られる他の方法も用いる。異なる祖先ヌクレオチドがある位置に同一ヌクレオチドをもつ同一遺伝子についての複数の栽培(家畜化)生物配列記入は、その栽培(家畜化)配列が正確であり、その栽培(家畜化)差異が真実であることの独立した裏付けとなる。そうした変化は公共または商業データベース情報および遺伝暗号を用いて調べ、それらのDNA配列変化が、コードされるタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすかどうかを決定する。それらの配列は、コードされたタンパク質の直接配列決定により調べることも可能である。
【0090】
実施例3:分子進化分析
比較対象の栽培(家畜化)植物または動物および野生祖先配列を、KA/KS分析に供する。この分析では、Li93およびINAのような公共的または商業的に利用できるコンピュータープログラムを用いて、上記のように検討された各配列について、部位当りの同義変化の数(KS)により除した部位当りの非同義変化の数(KA)を求める。完全長コード領域またはコード領域の部分セグメントを使用できる。KA/KS比率が大きいほど、配列は適応進化を受けた可能性がそれだけ高い。KA/KS値の統計有意性は、t検定のような確立された統計方法および利用できるプログラムを用いて決定する。
【0091】
高いKA/KS比率の有意性をさらに裏付けるために、検討中の栽培(家畜化)配列を、他の進化的に近縁種と比較することも可能である。これらの比較によって、当該適応進化変化が、他の近縁種に比べてその栽培(家畜化)植物または動物系譜に独特かどうかについて、さらに明確化できる。当該配列が該栽培(家畜化)植物または動物にどの程度保存されているかを査定するために、いくつかの多様な栽培(家畜化)集団の代表からの関心ある遺伝子を直接配列分析して、当該配列を調べることも可能である。
【0092】
4:cDNAライブラリーの構築
ブタモロコシ(teosinte:トウモロコシ原種)cDNAライブラリーを1日令ブタモロコシ実生全体、または他の適切な植物組織を用いて構築する。全RNAを実生組織から抽出し、該RNAの完全性および純度は、通常の分子クローニング法に従って決定する。PolyA+RNAを選択し、そしてプライマーとしてoligo(dT)を用いるcDNAの逆転写のための鋳型として使用する。合成されたcDNAは、商業的に入手できるキットを用いて、クローニングのために処理そして修飾する。次いで組換え体は宿主細胞系にパッケージされ、繁殖される。パッケージング混合物の一部を増幅し、残りは増幅前に保留する。確立された方法を用いて、大腸菌(E.coli)宿主細胞にトランスフェクトするのに、組換え体DNAを使用する。該ライブラリーは標準化し、そしてライブラリー中の独立組換え体の数を決定することも可能である。
【0093】
実施例5:配列比較
該cDNAライブラリーからランダムに選択されたブタモロコシ実生cDNAクローンは、ABI377のような自動シークエンサーを用いて、配列決定する。配列決定を実施するには、M13 UniversalおよびReverseプライマー類のようなクローニングベクター上で普通使われるプライマー類を使用する。エンドシークエンシングによって完全には配列決定されていない挿入断片については、色素標識ターミネーターを用いて残りのギャップ充たす。
【0094】
得られたブタモロコシ配列は、データベース検索を介して栽培コーン配列と比較する。ゲノムデータベースは、コーンを含む多くの種について、公共的にあるいは商業的に利用できる。コーンデータベースの一例はwww.central.edu/homepages/liedlb/genetics/gene−site.htmlで見ることができる。他の適正なコーンEST(発現配列標識)データベースが私有され、維持されている。高得点“ヒット”、すなわち、相同性分析で有意な(例えば>80%の)類似性を示す配列が、回収され、そして分析される。次いでそれら二つの相同配列は、Higginsら(1992)により開発されたアラインメントプログラムCLUSTAL Vを用いて整列される。ヌクレオチドの置換、挿入および欠失を含むどのような配列差異でも、該アラインメントにより検出され、記録される。
【0095】
検出された配列の差異は、まず正確さについてチェックされるが、それはブタモロコシおよびコーン配列間に差異があるポイントを見つける;コーンに独特と思われる塩基類が、当該塩基に特異的な強い鮮明なシグナルに対応するかどうかを決定するために、該配列フルオログラム(クロマトグラム)をチェックする;配列変化に対応する一つ以上のコーン配列があるかどうかを見るために、該コーンヒットをチェックする;そして必要ならば当該技術分野で知られる他の方法も用いる。異なるブタモロコシヌクレオチドがある位置に同一ヌクレオチドをもつ同一遺伝子についての複数のコーン配列記入は、そのコーン配列が正確であり、そのブタモロコシ/コーン差異が真実であることの独立した裏付けとなる。そうした変化は公共/商業データベース情報および遺伝暗号を用いて調べ、それらのDNA配列変化が、コードされるタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすかどうかを決定する。それらの配列は、コードされたタンパク質の直接配列決定により調べることも可能である。
【0096】
実施例6:分子進化分析
比較対象のブタモロコシおよびコーン配列を、KA/KS分析に供する。この分析では、Li93およびINAのような公共的または商業的に利用できるコンピュータープログラムを用いて、上記のように検討された各配列について、部位当りの同義変化の数(KS)により除した部位当りの非同義変化の数(KA)を求める。この比率KA/KSは、適応進化、すなわち正の淘汰が、検討中の配列で働いてきた程度を反映することが明らかにされている。典型的には、完全長コード領域が、それらの比較分析では使われてきた。しかし、コード領域の部分セグメントも効率的に使用できる。KA/KS比率が大きいほど、配列は適応進化を受けた可能性がそれだけ高い。KA/KS値の統計有意性は、t検定のような確立された統計方法および利用できるプログラムを用いて決定する。ブタモロコシおよびコーン遺伝子間で統計的に高いKA/KS比率を示すそれらの遺伝子は、適応進化を受けた可能性が非常に高い。
【0097】
高いKA/KS比率の有意性をさらに裏付けるために、検討中の配列を、他の祖先コーン種と比較することも可能である。これらの比較によって、当該適応進化変化が、他の祖先に比べてその栽培コーン系譜に独特かどうかについて、さらに明確化できる。当該配列が該コーン種にどの程度保存されているかを査定するために、いくつかの多様なコーン集団の代表からの関心ある遺伝子を直接配列分析して、当該配列を調べることも可能である。
【0098】
実施例7:データベースから入手したコーンおよびブタモロコシ相同配列に対するKA/KS法の適用
Genbank(www.ncbi.nlm.gov/Web/Genbank/index.html)上で利用できる栽培コーンおよびブタモロコシ配列の比較から、少なくとも4つの相同遺伝子waxy,A1*,A1およびglobulinが明らかになった。コーンおよびブタモロコシの両者でそれらの遺伝子について入手できるすべての配列を比較した。KA/KS比率は、Li93および/またはINAを用いて決定した。
【0099】
【表1】
コーンに観察される多型(複対立遺伝子コピー)および/または倍数性(細胞当り2セット以上の染色体)が、KA/KS分析を複雑にするか、困難にすることも予測されたが、そうではないことがわかった。
【0100】
上記KA/KS値はそれらの遺伝子が正に淘汰されてないことを示しているが、この例は、KA/KS法が、データベースから得たコーンおよびそのブタモロコシ配列に適用可能なこと例証している。
【0101】
実施例8:トランスジェニック植物を用いるタンパク質機能の検討
実施例4−7の方法に従って得た正に淘汰された遺伝子の機能性の役割は、トランスジェニックコーン植物における当該遺伝子の各対立遺伝子の評価を実施することにより査定可能である。トランスジェニック植物は、Pengら(1999)Nature 400:256−261に記載の方法を応用して作出可能である。該トランスジェニック植物またはそのタンパク質抽出物の生理学的、形態学的および/または生化学的試験により、各対立遺伝子の特定の表現型との関連付けが可能になろう。
【0102】
実施例9:QTLsへの正に淘汰された遺伝子のマッピング
QTL(定量的形質遺伝子座)分析は、高さおよび油含量を含む、メイズにおける関心のあるいくつかの表現型的形質を制御する遺伝子類を含む染色体領域を明らかにした。この方法により同定された正に淘汰された各遺伝子を既知QTLsの一つへマッピングすることにより、正に淘汰された各遺伝子により制御される特定の形質を、迅速かつ明確に同定可能である。
【0103】
前掲の発明は、明確さおよび理解を助けるため、例証や実施例により多少詳しく記載されているが、ある種の変更や修飾が実行可能なことは、当該分野の普通の技術をもつ者には明らかであろう。それ故、当該記述および実施例は、付随の特許請求範囲により叙述される本発明の範囲を制限するものと解釈してはならない。
技術分野
本発明は、栽培(家畜化)された植物および動物中の商業的にまたは審美的に関連する形質に対応するポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を同定する分子的および進化的技術を使用することに関する。
【0002】
背景技術
人類は何千年もの間、ある種の商業的に価値のあるおよび/または審美的な形質を選択しながら、植物や動物を育ててきた。栽培植物は、収穫量、短日長開花、タンパク質および/または油含量、収穫の容易さ、味、耐病性および耐乾燥性のような形質で、それらの野生祖先と相違する。家畜は、脂肪および/またはタンパク質含量、乳生産、扱いやすさ、繁殖力および成熟までの期間のような形質で、それらの野生祖先と相違する。今のところ、上記の相違の基礎をなす大部分の遺伝子は不明であり、また同じように重要なのは、それらの能力を付与する当該遺伝子に発生した特定の変化もわかっていないことである。栽培(家畜化)された植物および動物とそれらの野生祖先との間における前記の相違の基盤を明らかにすれば、それらの形質の維持および増強に役立つ情報が得られるはずである。作物の場合、所望の形質を制御する特定遺伝子類の同定により、それまではできなかった仕方で、直接かつ迅速な改良が可能になるであろう。
【0003】
栽培(家畜化)種とそれらの野生祖先との相同遺伝子またはタンパク質を比較すれば、保存性の分子配列および機能特色に関して有用な情報が得られる可能性はあるが、その方法は、ヒトが課した淘汰圧のために変化した配列をもつ遺伝子を同定するには、あまり役立たない。優れたアルゴリズムおよび分析方法の出現によって、どの遺伝子が積極的に(正に)淘汰されたかについて、DNA配列変化からずっと多くの情報を引き出せるようになっている。それらの方法のうちで最も有力な“KA/KS”は、
【0004】
【式1】
非同義( nonsynonymous )部位当りの非同義ヌクレオチド置換(K A )
同義(synonymous)部位当りの同義置換(KS)
の比率についての、整列させたタンパク質コードヌクレオチド配列間での、ペアワイズ(pairwise)比較である(ここで非同義はコードされるアミノ酸を変える置換を意味し、同義はコードされるアミノ酸を変えない置換を意味する)。「KA/KS型方法」は、本法および同様な方法を含む。
【0005】
これらの方法は、ダーウィン(すなわち自然)型の分子レベルの正の淘汰が発生し、相同タンパク質にアミノ酸の差異をもたらしたことの証明に、既に使われている。複数のグループが、そのような方法を使って、ある特定のタンパク質は、中立置換速度より速やかに進化したこと、したがってダーウィン分子レベル正の淘汰の存在を支持する証拠を提供している。例えば、McDonaldおよびKreitman(1991)Nature 351:652−654は、ある遺伝子座のコード領域中のアミノ酸の非同義置換(replacement substitutions,nonsynonymous substitutions)の同義置換に対する数の比較に基づき、中立タンパク質進化説の統計検定を提案している。彼らはこの検定を3種のショウジョウバエ(Drosophila)のAdh遺伝子座に適用し、代わりに、当該遺伝子座が淘汰的に有利な突然変異の適応固定を受け、適応突然変異の淘汰的固定が、大部分のタンパク質進化の説明として、中立突然変異の正確な蓄積に対する現実的な代案である可能性を示すと結論している。Jekinsら(1995)Proc.R.Soc.Lond.B261:203−207は、McDonald & Kreitman検定を用いて、適応進化が転写を制御している配列(非コード配列)中に生じているかどうかを調べている。
【0006】
Nakashimaら(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:5606−5609は、MiyataおよびYasunagaの方法を用いて、2種のヘビからの10個のPLA2アイソザイム遺伝子のヌクレオチド配列のペアワイズ比較を行っている;この方法は、イントロンを含む非コード領域(KN)およびKAおよびKSについての部位当りのヌクレオチド置換の数を比較するものである。タンパク質コード領域はイントロンを含む非コード領域よりずっと高速で進化してきたと、彼らは結論している。その高度に加速された置換率は、被食者を捕らえるために、あるいは捕食者に対する防御のために、強い淘汰利益を提供してきたに違いない新たな生理活動を生み出すための、PLA2アイソザイム遺伝子類のダーウィン分子レベル進化の基になっている。Endoら(1996)Mol.Biol.Evol.13(5):685−690は、正の自然淘汰が作動する候補遺伝子を同定する目的のために、そこではdNが非同義置換の数でdSが同義置換の数であるNeiおよびGojoboriの方法を用いている。MetzおよびPalumbi(1996)Mol.Biol.Evol.13(2):397−406は、McDonald & Kreitman検定(上記参照)ならびにNeiおよびGojobori,NeiおよびJin,またKumar,Tamura,およびNeiによる方法を用い;種の形成の準備行為として急速に進化しているかどうかを検討するためにウニ類における結合遺伝子に対する正の淘汰の証拠を探す目的で、アミノ酸の非同義置換部位当りの非同義置換Pn、およびサイレント部位当りのサイレント置換Ps、の平均割合を調べている。Goodwinら(1996)Mol.Biol.Evol.13(2):346−358は、同様な方法を用いて特定のネズミ遺伝子ファミリーの進化を調べ、そして実験的に操作可能な系においてどのように淘汰が遺伝的分岐を駆動するかに、それらの方法は重要かつ基本的な洞察を提供すると結論している。Edwardsら(1995)は、縮重プライマーを用い各種鳥類およびミシシッピーワニ類からMHC遺伝子座を引き出し、次いでそれらをNeiおよびGojobori法(dN:dS比率)により分析し、MHC研究を非哺乳類脊椎動物に拡張している。Whitfieldら(1993)Nature 364:713−715は、KA/KS分析を用い、(雄性を決定する)SRY遺伝子中の保存領域に隣接する領域中に方向性淘汰を探している。SRYの急速な進化は、生殖的隔離の有意の原因となり、新種を生む可能性があることを、彼らは示唆している。Wettsetinら(1996)Mol.Biol.Evol.13(1):56−66は、Kumar,TamuraおよびNeiのMEGAプログラムおよび系統分析を適用し、リスおよび関連げっ歯動物のMHCクラスI遺伝子類の多様化を研究している。ParhamおよびOhta(1996)Science 272:67−74は、淘汰の検定ならびに遺伝子変換および中立浮動を含む集団生物学的方法が、ヒトMHCクラスI多型の生成および維持を分析するのに必要であると述べている。Hughes(1997)Mol.Biol.Evol.14(1):1−5は、脊椎動物免疫系の細胞中で発現されるタンパク質が異常に速く進化するという仮説を検証するためにNeiおよびGojoboriの方法(dN:dS比率)を用いて、ヒトおよびげっ歯動物の100個以上のオルソロガス(orthologous)免疫グロブリンC2ドメインを比較した。SwansonおよびVacquier(1998)Science 281:710−712は、ライシン(溶解素、lysin)とライシンに対する卵受容体との協調進化を証明するためにdN:dS比率を用い、そして新種形成(種分化)におけるそのような協調進化の役割を論考している。MessierおよびStewart(1997)Nature 385:151−154は、霊長類リゾチームにおける正の淘汰を証明するために、KA/KSを使用した。
栽培(家畜化)に関連する遺伝的変化は、トウモロコシ(maize,corn)で最も広く研究されてきた(Dorweiler(1993)Science 262:232−235)。トウモロコシ(Zea ssp.mays mays)の場合、現在の栽培種とその野生祖先種ブタモロコシ(teosinte)(Zea mays ssp paruiglumis)とのすべての差異を、少数の単一遺伝子変化から明らかに説明できる(Dorweiler,1993)。QTL(量的形質遺伝子座)分析(Doebley(1990)PNASUSA 87:9888−9892)は、15個より多くない遺伝子が、トウモロコシの興味深い形質を制御しており、トウモロコシとブタモロコシとの形態の大きな相違を説明することを、証明した(Wang(1999)Nature
398:236−239)。
【0007】
重要なのは、コメ、コムギ、キビおよびコウリャンを含む他のイネ科草本由来の農作物で、同様に少数の遺伝子が興味深い形質を制御しているらしいことである(Paterson(1995)Science 269:1714−1718)。実際、トウモロコシにおけるそれらの関連遺伝子の大部分について、当該相同遺伝子が、他のイネ科草本由来農作物の同じような形質を制御しているらしい(Paterson,1995)。したがって、トウモロコシでそれらの遺伝子が同定されれば、コメ、コムギ、キビおよびコウリャンにおける相同遺伝子類の同定が容易になるだろう。
【0008】
上に引用した論文に見られるように、急速に進化する遺伝子を同定する分子進化の分析方法(KA/KS型方法)は、多くの異なる目的を達成するのに適用可能で、最も普通にはダーウィン分子レベル正の淘汰の存在を確認するためであるが、またダーウィン分子レベル正の淘汰の頻度の査定、系統関係の理解、新種が形成される機構の解明、あるいは特定の遺伝子多型についての単一または複数の起源の確立にも適用可能である。上記の引用論文および文献中の他の論文から明白なのは、著者の誰一人として、人工的な淘汰圧によりもたらされた栽培(家畜化)植物および動物における進化的変化の同定に、KA/KS型法を適用していないことである。Turcichら(1996)Sexual Plant Reproduction 9:65−74が、植物遺伝子にKS分析の使用を記載しているものの、望ましい商業的または審美的形質の開発、維持または増強に利用可能な進化的に有意な変化を含むような遺伝子を、栽培(家畜化)植物および動物に同定するための系統的な手段としてKA/KS型分析を使用した者は誰もいないと思われる。
【0009】
相同の祖先遺伝子類に比較して、独特の、増強された、または変更された機能を付与するように進化した遺伝子類を、栽培(家畜化)種に同定することは、それらの機能を調整する薬剤の開発に利用できよう。基盤となっている栽培(家畜化)遺伝子類および進化した特定のヌクレオチド変化の同定、およびそれらの進化遺伝子類によりコードされるタンパク質における物理的および生化学的変化のさらなる性状把握は、所望される形質の基礎となる機構に関する貴重な情報を提供することになろう。この貴重な情報は、標的タンパク質の機能をさらに増強する薬剤の開発に適用できよう。あるいは、関係遺伝子類をさらに操作することによって、所望の形質を修飾または増進することが可能であろう。加えて、同定される遺伝子類は、他の栽培植物で興味ある形質の制御に一役買っていることもあろう。同様な方法で、家畜に興味深い形質の遺伝子を同定することも可能である。
【0010】
本明細書に引用されたすべての参考文献は、そっくりそのまま本明細書で参考文献として援用される。
発明の開示
本発明は、植物および動物を含む栽培(家畜化)生物に、商業的または審美的形質と関連する、進化的に有意な変化をもつポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を同定するための方法を提供する。本発明は、比較ゲノミクスを用いて、商業的にまたは審美的に関連する形質のような、構造的、生化学的もしくは生理学的状態に関連し、そして原因ともなる、特定の遺伝子変化を同定し、そしてそれらの形質から得られた情報を用いて、興味深い増強された形質をもつ栽培(家畜化)生物を開発する。
【0011】
一つの好ましい実施態様では、栽培(家畜化)植物または動物のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、該栽培種に存在し、その野生祖先に存在しない進化的に有意な変化をもたらした人工淘汰を受けている。本実施態様の一例は、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、その祖先種に比べて、作物収穫量の増加と関連していてもよい。他の例として、短日長開花(すなわち、日照時間が、ある臨界時間より短い場合にのみ開花)、タンパク質含量、油含量、収穫の容易さ、味、耐乾燥性および耐病性がある。当該発明は、それ故、栽培(家畜化)生物における機能あるいは形質の根底にある分子機構を洞察するのに役立つ可能性がある。この情報は、該機能または形質をさらに増進するためのポリヌクレオチドをデザインするのに役立つ可能性がある。例えば、作物収穫量改善の原因であることが明らかにされたポリヌクレオチドに、ランダムまたは定方向突然変異誘発を行って、次いで当該変異体遺伝子類を検査し、その形質をさらに亢進するものを同定してもよい。
【0012】
従って、一つの側面において、栽培(家畜化)された生物(例えば、植物または動物)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を同定するための方法が提供されるが、ここで該ポリペプチドは、該栽培(家畜化)生物の野生祖先に比較して、その栽培(家畜化)生物に独特で、亢進または変更された、商業的にまたは審美的に関連する形質と随伴する可能性があって、またa)当該栽培(家畜化)生物のタンパク質コードヌクレオチド配列を、該野生祖先のタンパク質コードヌクレオチド配列と比較する;そしてb)該野生祖先の対応配列に比較して、ヌクレオチド変化を含み、そこで当該変化が進化的に有意である、該栽培(家畜化)生物中のポリヌクレオチド配列を選択する:工程を含む前記方法である。
【0013】
本発明のもう一つの側面では、栽培(家畜化)された生物(例えば、植物または動物)のタンパク質コードヌクレオチド配列における進化的に有意な変化を同定するための方法が提供されるが、またa)当該栽培(家畜化)生物のタンパク質コードヌクレオチド配列を、該栽培(家畜化)生物の野生祖先の対応配列と比較する;そしてb)該野生祖先の対応配列に比較して、ヌクレオチド変化を含み、そこで当該変化が進化的に有意である、該栽培(家畜化)生物中のポリヌクレオチド配列を選択する:工程を含む前記方法である。
【0014】
実施態様によっては、本明細書に記載された方法のいずれかにより同定されたヌクレオチド変化は、非同義置換である。実施態様によっては、該ヌクレオチド変化の進化有意性は、該ヌクレオチド配列の非同義置換割合(KA)に従って決定される。実施態様によっては、該進化的に有意な変化は、該栽培(家畜化)生物ポリヌクレオチドと対応する祖先ポリヌクレオチドとのKA/KS比を決定することにより査定される。好ましくは、該比率は少なくとも約0.75、またはさらに好ましくは該比率は少なくとも約1.25,1.50および2.00である。
【0015】
もう一つの側面では、本発明は、該栽培(家畜化)生物における関連形質を調整する可能性がある薬剤を同定する方法を提供するが、そこで該薬剤はポリペプチドの機能を調整する能力により同定され、進化的に有意な変化をもつポリヌクレオチド配列を発現する細胞、モデル系、またはトランスジェニック植物または動物と、少なくとも一つの候補薬剤を接触させることを含む前記方法である。
【0016】
また、栽培(家畜化)生物のタンパク質コードヌクレオチド配列と野生祖先からのタンパク質コード配列との大規模配列比較の方法も提供されるが、またa)栽培(家畜化)生物配列と野生祖先からの対応配列とを、配列ホモロジーに従って整列させる;そしてb)該野生祖先霊長類(?)からの相同配列に比較して、該栽培(家畜化)生物の配列内に何らかのヌクレオチド変化を同定する:ことを含む前記方法である。
【0017】
もう一つの側面では、本主題発明は、進化的に有意なヌクレオチド変化を、栽培(家畜化)生物中で独特で、亢進または変更された、商業的にまたは審美的に関連する形質に相関させるための方法を提供するが、またa)本明細書に記載された方法に従って、進化的に有意な変化をもつヌクレオチド配列を同定する;そしてb)該栽培(家畜化)生物またはモデル系で、その同定された配列の存否の機能効果を分析する:ことを含む前記方法である。
【0018】
本主題方法に使用される栽培植物は、トウモロコシ(コーン)、コメ、トマト、ジャガイモ、または野生祖先が現存し、そして知られているどの栽培植物でもよい。例えば、コーンの祖先はブタモロコシであり;コムギの祖先類はTriticum monococcum,T.speltoidesおよびAegilops tauschii;そしてコメの祖先類はOryza nivoraおよびO.rufipogonである。関連形質は、収穫量、短日長開花、タンパク質含量、油含量、耐乾燥性、味、収穫の容易さ、または耐病性のような、商業的にまたは審美的に関連するどのような形質であってもよい。
【0019】
本主題方法に使用される家畜は、ブタ、ウシ、ウマ、イヌおよびネコを含め、祖先が入手できるどのような家畜であってもよい。例えば、ウマの祖先はPryzewalskii‘s Horseであり;そしてウシの祖先はいくつかのIndian品種を含む。関連する形質は、例えば、脂肪含量、タンパク質含量、乳生産、成熟までの期間、繁殖力、扱いやすさまたは耐病性および罹病性であってもよい。
【0020】
発明の詳細な説明
本発明は、栽培(家畜化)生物(例えば、植物および動物)において商業的にまたは審美的に関連する形質に随伴する、したがってそれらに寄与するか、あるいは原因となっている可能性がある、特定の遺伝子変化を同定するために、比較ゲノミクスを利用する。
【0021】
好ましい実施態様で、本明細書に記載されている方法は、農業的に重要な栽培植物中の興味深い形質を制御する遺伝子類を同定するのに適用可能である。人類は、栽培植物の形質を制御する遺伝子類については何も知らずに、数千年もの間それらを育ててきた。関与する特定の遺伝機構が明らかになれば、分子レベルでずっと速やかに直接介入して、所望の、あるいは増強された形質をもつ植物をつくれるようになるだろう。
【0022】
人類は、人工選択によって、農作物に強い淘汰圧を加えてきた。この圧力は、栽培生物とそれらの野生祖先の相同遺伝子類の間の進化的に有意な変化に反映されている。ごく少数の遺伝子、例えば、1種当り10−15個が、栽培農作物で商業的に興味ある形質を制御していることが、わかってきた。これらの少数の遺伝子を、植物分子生物学の標準法によって同定することは、従来きわめて困難であった。本明細書に記載のKA/KSおよび関連分析は、興味ある形質を制御している遺伝子類がそのタンパク質コード領域で変化を受けているのであれば、それらの遺伝子を同定することが可能である。
【0023】
関心のあるどの農作物についても、栽培種または亜種およびその野生祖先からcDNAライブラリーを構築できる。1999年1月29日出願のUSSN09/240,915に記載されているように、各々のcDNAライブラリーは、相同ポリヌクレオチドを同定するために相互に“ブラーストされている(BLASTed)”。あるいは、当業者は、cDNAライブラリーを構築するよりも、
www.central.edu/homepages/liedlb/genetics/gene−site.html;
www.ornl.gov/Techresources/Human−Genome/genetics.html;および
www.mcb.harvard.edu/Biolinks/Sequences.html
www.ncbi.nlm.gov/Web/Genbank/index.html
で見られるような商業的におよび/または公共的に入手可能なゲノムまたはcDNAデータベースにアクセス可能である。次に、淘汰圧の下に急速に進化した淘汰された遺伝子類を同定するため、KA/KSまたは関連分析を実施する。それらの遺伝子は、商業的または審美的に興味ある形質に一役買っているかどうかを明らかにするため、標準的な分子およびトランスジェニック植物法を用いて、評価される。次いで興味ある当該遺伝子を、例えば、ランダムまたは定方向突然変異誘発により、操作して、新しい、改良変種、亜種、株または栽培品種を開発する。
【0024】
同様に、本明細書に記載の方法は、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコおよび野生祖先が入手可能な他の家畜を含む、家畜に適用できる。特にウシおよびウマは重要な商業的関心対象となっている。植物の場合のように、人類は動物を何千年もの間飼育し、そしてそれらの強い淘汰圧は、興味ある急速に進化した遺伝子について、高いKA/KS比率に反映していると思われる。この場合も、相同ポリヌクレオチドを同定するために、家畜およびそれらの野生祖先の構築cDNAライブラリーを相互にブラーストすることが可能であり、および/または入手できる公共または私設のゲノムまたはcDNAデータベースにアクセスが可能である。相同配列について、KA/KSまたは関連分析を実施し、それにより人工淘汰圧の下に急速に進化したポリヌクレオチドを同定する。次いでそれらの遺伝子は、商業的または審美的関心の形質に一役買っているかどうかを明らかにするため、標準的な分子およびトランスジェニック動物法を用いて評価される。次にそれらの遺伝子を操作して、新しい改良動物変種または亜種の開発が可能である。
【0025】
本発明の実行には、別途指示がない限り、当該技術の技能の範囲内にある分子生物学、遺伝学および分子進化学の通常の技術を使用する。そうした技術は、“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,第2版(Sambrookら,1989);“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait編,1984);“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubelら編,1987);“PCR:The Polymerase Chain Reaction”,(Mullisら編,1994);“Molecular Evolution”,(Li,1997)のような文献に十分に説明されている。
【0026】
定義
本明細書で使われているように、“ポリヌクレオチド”は、リボヌクレオチド類またはデオキシリボヌクレオチド類のいずれか、またはそれらの類似体の、あらゆる長さのヌクレオチド類の重合型を指す。この用語は、当該分子の一次構造を指すので、二本および一本鎖DNAならびに二本および一本鎖RNAを含む。またメチル化および/またはキャップされた(capped)ポリヌクレオチド類のような修飾ポリヌクレオチド類も含む。“ポリヌクレオチド”および“ヌクレオチド配列”という用語は互換的に使われる。
【0027】
本明細書で使われているように、“遺伝子”は、タンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの部分を指す。遺伝子が、(プロモーター、エンハンサー、リプレッサー、および他の調節配列のような)5´および3´フランキング配列ならびにイントロンのような非コード配列も含むことは、当該技術分野ではよく知られている。 用語“ポリペプチド”、“ペプチド”、および“タンパク質”は、あらゆる長さのアミノ酸の重合体を指すために、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、グリコシル化、アセチル化およびリン酸化を含む反応を介して翻訳後に修飾されるタンパク質も含む。
【0028】
用語“栽培(家畜化)生物”は、人工淘汰圧に曝されたことがあり、そして商業的または審美的に関連する形質を発達させた個々の現存生物またはその集団、種、亜種、変種、栽培品種または株を指す。好ましい実施態様によっては、該栽培(家畜化)生物は、コーン、コムギ、コメ、コウリャン、トマト、ジャガイモ、または祖先がわかっている、商業的に興味深いすべてのその他の栽培植物から成る群から選択される植物である。別の好ましい実施態様では、該栽培(家畜化)生物は、ウシ、ウマ、ブタ、ネコおよびイヌより成る群から選択される動物である。栽培(家畜化)生物およびその祖先は、異なる種、亜種、変種、栽培品種または株またはそれらのあらゆる組合せとしての関係であってもよい。
【0029】
用語“野生祖先”または“祖先”は、それから栽培(家畜化)生物、種、亜種、変種、栽培品種または株が発生した、先駆者または前任者生物、種、亜種、変種、栽培品種または株を意味する。栽培(家畜化)生物は一つまたは一つより多い祖先をもつことがある。典型的には、栽培植物は一つまたは複数の祖先をもつことがあるのに対して、家畜は通常単一祖先のみをもつ。
【0030】
用語“商業的にまたは審美的に関連する形質”は、植物または動物のような栽培(家畜化)生物の分析によって、当該形質の要因であるポリペプチドを調整できる薬剤の開発に関連する情報(例えば、物理的または生化学的データ)の提供も可能である前記生物に存在する形質を指すのに、本明細書では使われる。その商業的にまたは審美的に関連する形質は、当該祖先に比べて、独特で、増強または変更されていてもよい。“変更されている”とは、その関連形質が該祖先に見られる形質と質的または量的に相違するとの意味である。
【0031】
用語“KA/KS型法”は、相同遺伝子類における非同義置換および同義置換の数間の、しばしば(必ずしも常にではないが)比率として示される、相違を評価する方法で、(非同義および同義部位を決定する、より厳密な方法を含む)ものを意味する。これらの方法は、非限定的にKA/KS,dN/dS,DN/DSを含むいくつかの命名システムを用いて指定される。
【0032】
用語“進化的に有意な変化”および“適応進化的変化”は、二つの生物、種、亜種、変種、栽培品種および/または株間の、正の淘汰圧に帰属される可能性がある、一つまたは一つより多いヌクレオチドまたはペプチドの配列変化を指す。進化的に有意な変化の存在を決定する一つの方法は、KA/KS比率を測定するような、KA/KS型分析法を適用することである。典型的には、KA/KS比率が少なくとも約0.75,より好ましくは少なくとも約1.0,より好ましくは少なくとも約1.25,より好ましくは少なくとも約1.5,そして最も好ましくは少なくとも約2.0であれば、正の淘汰の作用を示し、進化的に有意な変化があると考えられる。
【0033】
用語“正の進化的に有意な変化”は、特定の生物、種、亜種、変種、栽培品種または株における進化的に有意な変化で、他の関連生物に比べて積極的な適応変化をもたらすものを意味する。正の進化的に有意な変化の例は、農作物における収穫量の増加をもたらした変化である。
【0034】
用語“耐性”は、好ましくは非耐性生物と比べた場合、ある生物が、疾患状態および/またはその疾患の発症を避ける、またはその程度を低減する能力を示すことを意味する。
【0035】
用語“罹病性”は、好ましくは、耐性であることが知られている生物に比べた場合、ある生物が、疾患状態および/またはその疾患状態の発症を避ける、またはその程度を低減することができないことを意味する。
【0036】
耐性および罹病性は個体ごとに変り、そして本発明の目的のためにこれらの用語は、ある種内の個体の群にも適用し、また耐性および罹病性の比較は、種内比較に使ってもよいが、一般には種間の全体的な平均差異を指すと理解される。
【0037】
用語“相同”または“同族体”または“オルソログ”は、当該技術分野では知られて、またよく理解されており、共通の祖先をもつ関係配列を指し、そして配列同一性の程度に基づいて決定される。これらの用語は、一つの種、亜種、変種、栽培品種または株に見られる一つの遺伝子と、もう一つの種、亜種、変種、栽培品種または株における対応または相当遺伝子との間の関係を説明している。本発明の目的のためには、相同配列が比較される。“相同配列”または“同族体”または“オルソログ”は機能的に関係すると、考えられ、信じられ、あるいは知られている。機能的関係は、(a)配列同一性の程度;(b)同一のまたは同様な生物機能;を非限定的に含む多数の方途のいずれか一つで示されてもよい。好ましくは、(a)および(b)の両方で示される。配列同一性の程度は変動することがあるが、(当該技術分野で知られる標準的な配列アラインメント(整列、alignment)プログラムを用いる場合)好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約85%である。ホモロジーは、Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubelら編,1987)補遺30,節7.718,表7.71に記載のもののような、当該技術分野で容易に入手可能なソフトウエアプログラムを用いて、決定できる。好ましいアラインメントプログラムは、MacVector(Oxford Molecular Ltd,オックスフォード、英国)およびALIGN Plus(Scientific and Educational Software, ペンシルバニア)である。もう一つの好ましいアラインメントプログラムはデフォルトパラメーターを用いるSequencher(GeneCodes,Ann Arbor,ミシガン)である。
【0038】
用語“ヌクレオチド変化”は、当該技術分野ではよく理解されているように、ヌクレオチドの置換、欠失、および/または挿入を指す。
“ハウスキーピング遺伝子”は、当該技術分野ではよく理解されている用語で、増殖、分裂、静止、代謝、および/または死を非限定的に含む全般的細胞機能に随伴する遺伝子類を意味する。“ハウスキーピング”遺伝子類は一般に、一つ以上の細胞タイプで見られる機能を遂行する。それに対し、細胞特異的遺伝子類は一般に、特定の細胞タイプおよび/またはクラスでの機能を遂行する。
【0039】
用語“薬剤(agent)”は、本明細書で使われる場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能を調整する単純または複雑な有機または無機分子、ペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドのような生物学的または化学的化合物を意味する。例えば、オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドのようなオリゴマー類、さまざまなコア構造に基づく合成の有機および無機化合物類など、膨大な種類の化合物の合成も可能であり、そしてそれらも用語“薬剤”の中に含まれる。加えて、さまざまな天然物は、植物または動物抽出物などのようなスクリーニング用の化合物を提供することも可能である。化合物は、単独でも、他のものと組合せてテストしてもよい。
【0040】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの“機能を調整すること”という用語は、該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能が、薬剤を添加しない場合に比べて、変えられることを意味する。調整は、機能に影響するどのようなレベルでも生じることも可能である。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能は直接的でも、間接的でもよく、そして直接的に、または間接的に測定も可能である。
“ポリヌクレオチドの機能”は、複製;翻訳;発現パターンを非限定的に含む。ポリヌクレオチド機能は、該ポリヌクレオチド内でコードされるポリペプチドに随伴する機能も含む。例えば、ポリヌクレオチドに作用し、タンパク質の発現、コンホメーション、フォールディング(または他の物理的特性)、(リガンドのような)他の分子部分(moieties)への結合、活性(または他の機能特性)、タンパク質構造または機能の調節および/または他の側面、などに影響する薬剤は、調整性ポリヌクレオチド機能をもつと考えられる。
【0041】
“ポリペプチドの機能”は、コンホメーション、フォールディング(または他の物理的特性)、(リガンドのような)他の分子部分への結合、活性(または他の機能特性)、および/またはタンパク質構造または機能の他の側面、を 非限定的に含む。例えば、ポリペプチドに作用し、そのコンホメーション、フォールディング(または他の物理的特性)、(リガンドのような)他の分子部分への結合、活性(または他の機能特性)、および/またはタンパク質構造または機能の他の側面に影響する薬剤は、調節性ポリペプチド機能をもつと考えられる。有効な薬剤がポリペプチドの機能を調整するように作用する仕方は、1)コンホメーション、フォールディングまたは他の物理的特性を変えること;2)天然リガンドへの結合力を変えることまたはリガンドへの結合の特異性を変えること;および3)該ポリペプチドの活性を変更すること、を非限定的に含む。
【0042】
用語“標的部位”は、単一アミノ酸であってもよく、および/または、構造および/または機能モチーフの一部、例えば結合部位、二量体化ドメイン、または触媒活性部位である、ポリペプチド中の場所を意味する。標的部位は、治療薬のような薬剤との直接または間接相互作用に有用と思われる。
【0043】
用語“分子差”は、何らかの構造および/または機能差を含む。そうした差を検出する方法、ならびにそうした差の例は、本明細書に記載されている。
“機能的効果”は、当該技術分野で周知の用語で、直接、間接を問わず、活性の何らかのレベルで表示される何らかの効果を意味する。
【0044】
用語“収穫の容易さ”は、消費または他の商業的処理のために、構造物または部分(例えば、果実、葉、根)の手動または自動収集を容易にする植物特性または特徴を指す。
【0045】
技術分野で知られる一般的手順
本発明の目的のための、栽培(家畜化)植物または動物またはその祖先からのポリヌクレオチドの原料は、適切であればどのようなものでも可能で、例えば、ゲノム配列またはcDNA配列である。好ましくは、cDNA配列が比較される。タンパク質コード配列は、本明細書に記載のような利用できる私設、公共および/または商業データベースからの入手も可能である。それらのデータベースは、現在も進行中の研究努力によりつくられた分子配列データの貯蔵所として役立っている。あるいは、タンパク質コード配列は、例えば、当該技術分野で周知の方法に従って、細胞中で発現されるmRNAから逆転写されたcDNAの配列決定から、またはPCR増幅後に、得てもよい。あるいは、ゲノム配列を、配列比較に使用してもよい。ゲノム配列は、利用できる私設、公共および/または商業データベースから、または商業的に利用できるゲノムDNAライブラリーの配列決定から、またはPCR後にゲノムDNAから、入手も可能である。
【0046】
実施態様によっては、所定の発生段階における組織、または当該生物をある種の環境条件においた後に得られる組織から得たmRNAからcDNAを調製する。本発明の配列比較に使われるcDNAライブラリーは、当該技術分野の文献に十分説明されている通常のcDNAライブラリー構築技術を用いて構築できる。全mRNAを鋳型として用い、cDNAを逆転写する。転写されたcDNAは適切なベクター中へサブクローニングして、cDNAライブラリーを確立する。確立されたcDNAライブラリーは完全長cDNA含量へマキシマイズ(maximize)も可能だが、完全長以下のcDNAを使用してもよい。さらに、配列頻度を、例えば、Bonaldoら(1996)Genome Research 6:791−806に従って、標準化することも可能である。その構築cDNAライブラリーからランダムに選択されたcDNAクローンは、標準自動シークエンシング法を用いて、配列を決定できる。好ましくは、完全長cDNAクローンがシークエンシングに使われる。cDNAライブラリーからの全部またはかなりの部分のcDNAクローンの配列決定も可能であるが、単一cDNAまたはいくつかのcDNAクローンという少数を配列決定することにより、本発明の実施態様の一部を実行することも可能である。
【0047】
本発明の一つの好ましい実施態様では、配列決定されるcDNAクローンは、それらの発現特異性に従って、前選択することも可能である。特異的に発現される活性遺伝子に対応するcDNAを選択するには、同一動物の他の器官、組織または細胞から得たmRNAを用いて、当該cDNAを差引きハイブリダイゼーションにかけてもよい。適切な厳密性と濃度を備えたある種のハイブリダイゼーション条件下では、組織非特異的mRNAとハイブリダイズし、したがって“ハウスキーピング”遺伝子を表すと思われるcDNAは、当該cDNAプールから除外されることになる。したがって、残る配列決定予定のcDNAは、組織特異的機能に随伴している可能性が高い。差引きハイブリダイゼーションの目的のために、組織非特異的mRNAは、一つの器官から得てもよいが、好ましくは異なる器官および細胞の組合せから得る。組織非特異的mRNAの量は、組織特異的cDNAを飽和するように、マキシマイズする。
【0048】
あるいは、オンラインデータベースからの情報を使って、特定の機能に随伴する可能性が高いcDNAに優先順位を選択するか与えてもよい。例えば、配列決定のための祖先cDNA候補は、候補栽培(家畜化)生物cDNA配列からデザインされたプライマーを使ってPCRにより、選択することも可能である。候補栽培(家畜化)生物cDNA配列は、例えば、骨格筋のような特定の組織にのみ見られるか、特定の機能に重要らしい遺伝子に対応するものである。そうした組織特異的cDNA配列は、cDNA配列についての発現プロファイルおよび/または生物活性に関する情報が指定されているオンライン配列データベースを検索して得てもよい。既知栽培(家畜化)生物の遺伝子に対する祖先同族体の配列は、(例えば、GeneAmp PCR System 9700 thermocyclers(Applied Biosystems,Inc.)を用いる)PCR法のような当該技術分野で標準的な方法を使って、得てもよい。例えば、配列決定用の祖先cDNA候補は、候補栽培(家畜化)生物cDNA配列からデザインされたプライマーを用いてPCRにより選択も可能である。PCRのために、PRIMERR(Whitehead Institute)のような公共的に利用できるプライマーデザインプログラムを含む当該技術分野での標準法を用いて、その栽培(家畜化)生物の配列からプライマーを作ってもよい。次いで増幅された当該祖先配列は、自動シークエンサー(Applied Biosystems,Inc)のような当該技術分野で標準的な方法および装置を用いて配列決定してもよい。
【0049】
発明の一般的方法
本発明の一般的方法は以下のとおりである。要するに、ヌクレオチド配列を栽培(家畜化)生物および野生祖先から得る。その栽培(家畜化)生物および祖先のヌクレオチド配列を相互に比較し、相同的な配列を同定する。当該相同配列を分析し、前記栽培(家畜化)生物および祖先間に核酸配列に差異があるものを同定する。次に分子進化分析を実施して、前記差異の進化的有意性を定性的におよび定量的に評価する。正の淘汰を受けた遺伝子について、外群分析を行って、(その祖先とは異なり)栽培(家畜化)生物で正の淘汰を受けた遺伝子を同定する。次にその配列について、分子/遺伝子同一性および生体機能の点から、特性把握を行う。最後に、その情報を用いて、当該遺伝子によりコードされるポリペプチドの生体機能を調整できる薬剤を同定する。
【0050】
本発明の一般的方法は、必然的に祖先および栽培(家畜化)生物のタンパク質コードヌクレオチド配列の比較を伴う。その比較には生命情報科学を適用し、進化的に有意な変化であるヌクレオチド変化を含む配列を選択する。本発明によって、何らかの進化的利益を与えるように進化した遺伝子類の同定およびその特定の進化変化の同定が可能になる。
【0051】
栽培(家畜化)生物およびその祖先のタンパク質コード配列を比較して、相同配列を同定する。この比較を完成するための何らかの適切な機構が、本発明により意図される。アラインメントは、手動でも、またソフトウエアによってでも実施可能である(適切なアラインメントプログラムの例は当該技術分野では知られている)。好ましくは、データベース検索、例えば、BLAST検索を介して、祖先からのタンパク質コード配列を当該栽培(家畜化)種配列と比較する。高得点“ヒット”、すなわち、BLAST分析で有意な類似性を示す配列が、回収され、そして分析される。有意な類似性を示す配列とは、少なくとも約60%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%または少なくとも約90%の配列同一性をもつものである。好ましくは、約80%より大きな同一性を示す配列がさらに分析される。データベース検索を介して同定された相同配列は、Higginsら(1992)CABIOS 8:189−191による、普通使われる簡単なアラインメントプログラムCLUSTAL Vのような、技術分野で知られ、利用できる配列アラインメント方法およびプログラムを用いて、全体を整列可能である。
【0052】
あるいは、栽培(家畜化)生物およびその祖先間の、タンパク質コード配列の配列決定および相同性比較は、新しく開発されたシークエンシングチップ法により同時に実施してもよい。例えば、Ravaら米国特許第5,545,531号を参照されたい。
【0053】
栽培(家畜化)生物および祖先の整列済みタンパク質コード配列は、特定の部位におけるヌクレオチド配列の差異を同定するために、分析される。ここでも、この分析を達成するための何らかの適切な方法が、本発明によって意図される。ヌクレオチド配列に差異がない場合は、該祖先タンパク質コード配列は、通常それ以上分析されない。検出された配列変化は一般に、そして好ましくは、始めに精度についてチェックされる。好ましくは、その当初チェッキングは、当該技術分野ではどれもまたすべてが知られている下記の一つまたは一つ以上の工程の実施を含む:(a)該祖先および栽培(家畜化)生物配列間に変化がある点を見い出す;(b)該祖先または栽培(家畜化)生物に特有と思われる塩基が、コールされた塩基に特異的な強い鮮明なシグナルに対応するかどうかを決定するために、該配列フルオログラム(クロマトグラム)をチェックする;(c)配列変化に対応する一つ以上の栽培(家畜化)生物配列があるかどうかを見るために、該栽培(家畜化)生物ヒットをチェックする;ことである。祖先配列中に異なるヌクレオチドがある位置に同一ヌクレオチドをもつ同一遺伝子についての複数の栽培(家畜化)生物配列記入は、その栽培(家畜化)配列が正確であり、その変化が有意であることの独立した裏付けとなる。そうした変化はデータベース情報および遺伝暗号を用いて調べ、それらのヌクレオチド配列変化が、コードされるタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすかどうかを決定する。“ヌクレオチド変化”の定義が明らかにしているように、本発明は、栽培(家畜化)生物のタンパク質コードポリヌクレオチド配列中に、その祖先からの対応配列に比較して、少なくとも一つのヌクレオチド変化、すなわち置換、欠失または挿入のいずれかを含む。好ましくは、その変化はヌクレオチド置換である。さらに好ましくは、当該同定配列中に一つ以上の置換が存在し、そして分子進化分析を受けさせることである。
【0054】
栽培(家畜化)種遺伝子配列と対応する祖先の配列との間に同定されたヌクレオチド変化の進化有意性を定性的および定量的に評価するために、いくつかの異なる分子進化分析、すなわちKA/KS型法のどれでも採用可能である。KreitmanおよびAkashi(1995)Annu.Rev.Ecol.Syst.26:403−422;Li,Molecular Evolution,Sinauer Associates,Sunderland,ミネソタ、1997。例えば、タンパク質上の正の淘汰(すなわち、分子レベル適応進化)は、非同義部位当りの非同義ヌクレオチド置換(KA)の同義部位当りの同義置換(KS)に対する比率のペアワイズ比較により、タンパク質コード遺伝子中に検出可能である(Liら,1985;Li,1993)。KAおよびKSの比較はどれでも使えるが、これら二つの変数を比率として比較するのが、特に便利で、しかも最も有効である。標準統計法を用い、KAおよびKS間の統計的に有意な差を示すことにより、配列は同定される。
【0055】
好ましくは、LiらによるKA/KS分析を使って本発明を実行するが、種間の正の淘汰遺伝子を検出できる他の分析プログラムも使用可能である。Liら(1985)Mol.Biol.Evol.2:150−174;Li(1993)J.Mol.Evol.36:96−99も参照;MessierおよびStewart(1997)Nature 385:151−154;Nei(1987)Molecular Evolutionary Genetics(New York,Columbia Univeristy Press)。比率に関して遺伝子の相同タンパク質コード領域間の、非同義部位当りの非同義置換の割合と同義部位当りの同義置換の割合との比較を含む該KA/KS法は、進化の際の、中立淘汰ではなく、適応淘汰により駆動される配列置換を同定するのに用いられる。同義(“サイレント”)置換は、遺伝暗号の縮重のため、コードされるアミノ酸配列に変化を起さないものであり;非同義置換はアミノ酸交換をもたらす。各タイプの変化の程度は、同義部位当りの同義置換および非同義部位当りの非同義置換の数である、それぞれKAおよびKSとして推定可能である。KA/KSの計算は、手動でも、ソフトウエアの使用によっても実施してよい。適切なプログラムの例はMEGA(Molecular Genetics Institute,Pennsylvania State University)である。
【0056】
KAおよびKSを推定する目的のために、完全または部分タンパク質コード配列のいずれかを用いて、同義および非同義置換ならびに非同義および同義部位の総数を計算する。分析されるポリヌクレオチド配列の長さは、適切であればどのようでもよい。好ましくは、ありとあらゆる有意な変化を決定するためには、全コード配列が比較される。すべてのペアワイズ比較のためのKAおよびKS値の計算には、Li93(Li(1993)J.Mol.Evol.36:96−99)またはINAのような、公共的に利用できるコンピュータープログラムが使用可能である。この分析は、少数の重要な変化が全体の配列によってマスクされないように、“スライディングウインドウ”様式で配列を調べるのにも適用可能である。“スライディングウインドウ”は、該遺伝子の連続重複サブセクション(サブセクションはどのような長さでもよい)の検討を指す。
【0057】
非同義および同義置換割合の比較はKA/KS比率により表される。KA/KSは、検討中の当該配列で適応進化が作用してきた程度を反映することが、明らかにされている。コード配列の完全長または部分セグメントが、該KA/KS分析に使用可能である。KA/KS比率が高いほど、配列は適応進化を受けた可能性が高く、そしてその非同義置換は進化的に有意である。例えば、MessierおよびStewart(1997)を参照されたい。好ましくは、該KA/KS比率は少なくとも約0.75、より好ましくは少なくとも約1.0、より好ましくは少なくとも約1.25、より好ましくは少なくとも約1.50、またより好ましくは約2.00である。好ましくは、すべての高KA/KS比率について、スチューデントのt検定およびYang(1998)Mol.Biol.Evol.37:441−456により記載の同様な比率検定のような標準方法を非限定的に含む、統計分析を実施する。
【0058】
相同配列のペアワイズ比較については、1より有意に大きいKA/KS比率は、偶然だけの結果として予測されるよりも多くのアミノ酸置換を正の淘汰が固定し、そしてその比率が1より少ないか等しい場合に普通に観察されるパターンとは対照的であることを、強く示唆する。Nei(1987);HughesおよびHei(1988)Nature 335:167−170;MessierおよびStewart(1994)Current Biol.4:911−913;KreitmanおよびAkashi(1995)Ann.Rev.Eco.Syst.26:403−422;MessierおよびStewart(1997)。1以下の比率は、負の、または浄化淘汰の役割を一般には意味する:すなわち、機能性の、有効なタンパク質類の一次構造は変化しないようにする強い圧力がかかっている。
【0059】
KA/KSを計算するためのすべての方法は、祖先および栽培(家畜化)生物からの相同遺伝子類のタンパク質コード領域についての同義部位当りの同義置換の数に対する、非同義部位当りの非同義置換の数のペアワイズ比較に基づいている。各方法は、“複数ヒット”(すなわち同一部位における一つ以上のヌクレオチド置換)を見積るための異なる補正処置を備えている。また各方法は、進化的時間にわたってどのようにDNA配列が変化するかについて、異なるモデルを使用している。それ故、好ましくは、異なるアルゴリズムからの結果の組合せを用いて、正に淘汰された遺伝子を検出する感度およびその結果の信頼度のレベルを高める。
【0060】
好ましくは、KA/KS比率は、パラロガス(paralogous)遺伝子ペア(すなわち、遺伝子重複の結果である遺伝子とは違い、種分化から生じる遺伝子)ではなく、オルソロガス遺伝子ペアについて、計算しなければならない、MessierおよびStewart(1997)。この区別は、系統樹構築を可能にする、別の祖先との追加比較を実施することにより、行ってもよい。オルソロガス遺伝子は、系統樹構築に使われた場合、既知の“種系統樹”をつくる、すなわち、既知の生物樹を回復する系統樹を生産するはずである。それに反して、パラロガス遺伝子は、既知の生物樹に違反する系統樹をつくるはずである。
【0061】
本明細書に記載された方法は、タンパク質コード配列に機能的に関係する、祖先または栽培(家畜化)生物ポリヌクレオチド配列の同定をもたらすと、理解される。そうした配列は、非限定的に、非コード配列またはタンパク質をコードしないコード配列を含む可能性もある。これらの関連配列は、例えば、イントロンまたは(プロモーターおよびエンハンサーのような調節エレメントを含む)5´および3´隣接配列のように、該ゲノム中のタンパク質コード配列に物理的に隣接していることもある。それらの関連配列は、利用できる公共、私設および/または商業ゲノムデータベースの検索を介して、あるいは、タンパク質コード配列をプローブとして当該生物のゲノムライブラリーをスクリーニングし、そして配列分析することにより、入手してもよい。関連コード配列を用いて非コード配列を入手するための方法および技術は、当業者には周知である。
【0062】
KA/KS分析のような分子進化分析により検出される進化的に有意なヌクレオチド変化は、当該栽培(家畜化)生物におけるそれらの独特の存在またはそれらの変化が当該生物に独特である程度を、さらに査定可能である。例えば、その栽培(家畜化)遺伝子に同定された変化は、当該栽培(家畜化)生物と共通の祖先をもつ関連種、亜種または他の生物の別の配列中の存否について検査が可能である。この比較(“外群分析”)によって、その正に淘汰された遺伝子が、(祖先と違って)当該栽培(家畜化)生物のために積極的に選択されるかどうかの決定が可能になる。
【0063】
栽培(家畜化)生物およびその祖先と間の少なくとも一つの進化的に有意な変化をもつ配列は、他の祖先タンパク質コード配列のPCR分析のためのプライマーとして使用可能で、そして得られたポリヌクレオチドは、他の祖先に同一変化が存在するかどうかを見るために、配列分析される。それらの比較によって、当該適応進化的変化が、他の祖先に比較して当該栽培(家畜化)系譜に独特なのかどうか、または当該適応変化が、当該栽培(家畜化)種および他の祖先に比較して当該祖先に独特かどうか、に関してさらに識別が可能になる。栽培(家畜化)生物に検出されるが、他の祖先には検出されないヌクレオチド変化は、当該栽培(家畜化)生物での適応進化的変化を表している可能性がさらに高い。あるいは、該栽培(家畜化)生物または他の祖先に検出されず、該祖先に検出されるヌクレオチド変化は、祖先適応進化的変化を表している可能性が高い。比較に用いる他の祖先は、当該栽培(家畜化)生物との系統分類関係に基づいて、選択可能である。そうした比較の統計学的有意性は、確立され利用可能なプログラム、例えば、MessierおよびStewart(1997)Nature 385:151−154により使われているt検定を用いて決定してもよい。統計的に高いKA/KS比率を示す遺伝子類は、適応進化を受けた可能性が極めて高い。
【0064】
有意な変化をもつ配列は、該配列変化が一つ以上の栽培(家畜化)集団により共有されているかどうかを見るために、異なる栽培(家畜化)集団からのゲノム中でプローブとして使用可能である。異なる栽培(家畜化)集団からのゲノム配列は、データベースから、または別に、多数の無関係で多様な栽培(家畜化)集団からのPCR増幅DNAの直接配列分析から、得てもよい。異なる栽培(家畜化)集団に当該同定変化が存在すれば、当該変化の進化有意性をさらに示すことになる。
【0065】
種間で有意な変化をもつ配列は、普通の当業者に知られている方法および技術を用いて、それらの分子/遺伝子同一性および生物機能に関して、さらに性状把握が可能である。例えば、それらの配列は、公共的に利用できる生命情報科学プログラムを用いて、当該生物のゲノム内に遺伝子的におよび物理的に位置させることも可能である。ヌクレオチド配列内に新たに同定される有意な変化は、当該生物の進化におけるその遺伝子の潜在的役割、および独特で、増強され、または変更された機能性能力の潜在的随伴とを示唆している。同定された配列をもつ推定遺伝子は、例えば、ホモログ検索によりさらに特性把握してもよい。該推定遺伝子の既知遺伝子との共有相同性は、同じような生体役割または機能示す可能性もある。推定遺伝子配列の特性把握をするためのもう一つの模範的な方法は、既知の配列モチーフに基づくものである。ある種の配列パターンは、シグナル配列、DNA結合ドメイン、または膜貫通ドメインのような特定の生体特徴をもつタンパク質の領域をコードすることが知られている。
【0066】
有意な変化をもつ同定された配列は、組織特異性または細胞タイプ特異性の点で、当該遺伝子がどこで発現されるかを見ることにより、さらに評価することも可能である。例えば、同定コード配列は、該配列の発現パターンを明らかにするインシトウ(in situ)mRNAハイブリッド形成を実施するためのプローブとして用いることも可能である。ある組織で発現される遺伝子は、その組織、例えば、骨格筋組織に伴う重要な機能と随伴することの、よりよい候補としてもよい。ある種(species)のメンバーの発生各段階での遺伝子発現のタイミングも決定できる。
【0067】
配列特性把握のもう一つの模範的な方法として、有意変化をもつ同定ヌクレオチド配列の機能的役割を、トランスフェクトされた栽培(家畜化)生物、例えば、トランスジェニック植物または動物で、同定された遺伝子の異なる対立遺伝子について機能分析を実行することにより査定してもよい。
【0068】
配列特性把握のもう一つの模範的方法として、コンピュータープログラムの使用により、栽培(家畜化)生物および祖先からの相同タンパク質の三次元構造のモデル化と視覚化が可能である。祖先タンパク質中でどのアミノ酸が置換されているかを正確に特定できれば、機能の相違に伴うであろう構造変化を検出できる。このように、モデル化技術の使用は、前項で論考した機能的役割の同定と密接に関連している。これらの技術の個別または組合せ使用は本発明の一部を構成する。
【0069】
本主題方法により同定される栽培(家畜化)生物の遺伝子は、祖先を共有する他種における相同遺伝子の同定に使用可能である。例えば、コーン、コメ、コムギ、キビおよびコウリャンは共通の祖先をもっており、コーンで同定される遺伝子はこれらの他のイネ科草本植物で相同遺伝子を直接もたらす可能性がある。同様に、トマトとポテトは共通の祖先をもっており、本主題方法によりトマトで同定される遺伝子はポテトに相同体があると予測される。 本明細書に記載の方法により同定される配列は、栽培(家畜化)生物の独特で増進あるいは変更された機能能力の調整、および/または当該配列を用いるそれらの能力の欠陥の修正に有用な薬剤の同定に使用可能である。それらの方法は、例えば、in vitro(試験管内)系、細胞基盤発現系およびトランスジェニック動物および植物のような当該技術分野で知られるスクリーニング技術を採用する。本発明により提供されるアプローチは、急速に進化した遺伝子を同定するだけでなく、もう一つの種に存在するため毒性が強過ぎないと思われるタンパク質に対して行える調整も、指示する。
【0070】
スクリーニング方法
本発明は、上記の方法により同定および特性把握されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いるスクリーニング方法も、提供する。これらのスクリーニング方法は、栽培(家畜化)生物における特徴を増強または低減するのに役立つはずの仕方で、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能を調整する可能性がある薬剤を、同定するのに有用である。一般に、当該方法は、検査される少なくとも一つの薬剤を、上記の方法により同定されたポリヌクレオチド配列でトランスフェクトされたトランスジェニック生物または細胞か、そのようなポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの調製物かのいずれかと接触させることを課すものであって、そこで薬剤は、該ポリヌクレオチド配列か、該ポリペプチドかのいずれかの機能を調整するその能力により同定される、前記方法である。例えば、薬剤は、栽培(家畜化)植物または動物に適用または接触させて、所望の時間に同定された遺伝子の発現を誘導するような化合物であってもよい。植物に関して特異的には、薬剤は、適切な時期に開花を誘導するのに使用することもできよう。
【0071】
本明細書で使われるように、用語“薬剤”は、単純または複雑な有機または無機分子、ペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドのような生物学的または化学的化合物を意味する。膨大な群の化合物が合成可能で、例えば、オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドのようなオリゴマー類、およびさまざまなコア構造に基づく合成有機および無機化合物で、そしてそれらは用語“薬剤”にも含まれる。加えて、さまざまな天然源が、植物または動物抽出物などのような、スクリーニング用の化合物を提供できる。化合物の検査は、単独でも、相互に組合せて行ってもよい。
【0072】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの“機能を調整する”は、薬剤を加えない場合と比較すると、該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能が変更されることを意味する。調整は、どの程度に機能に影響してもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能は、直接でも、間接でもよく、直接的にまたは間接的に測定してもよい。ポリヌクレオチドの“機能”は、非限定的に、複製、翻訳、および発現パターンを含む。ポリヌクレオチド機能は、該ポリヌクレオチド内でコードされるポリペプチドに随伴する機能も含む。例えば、ポリヌクレオチドに作用し、タンパク質の発現、コンホメーション、フォールディング(または他の物理的特性)、(リガンドのような)他の分子部分への結合、活性(または他の機能特性)、タンパク質の構造または機能の調節および/または他の側面に、影響を及ぼす薬剤は、ポリヌクレオチド調整機能をもつと考えられる。有効な薬剤がポリヌクレオチドの発現調整するために働く仕方は、1)転写因子が該ポリヌクレオチド中の転写因子応答エレメントへ結合するのを修飾する;2)該ポリヌクレオチドの発現に必要な二つの転写因子間の相互作用を修飾する;3)該ポリヌクレオチドの発現に必要な転写因子が核へ入る能力を変更する;4)該ポリヌクレオチドの転写に関与する転写因子の活性化を阻害する;5)通常、リガンドと相互作用し、そのリガンドとの結合が該ポリヌクレオチドの発現をもたらす細胞表面受容体を修飾する;6)該ポリヌクレオチドの発現をもたらすシグナル伝達カスケードの成分の不活性化を阻害する;そして7)該ポリヌクレオチドの転写に関与する転写因子の活性化を亢進する、ことを非限定的に含む。
【0073】
ポリペプチドの“機能”は、非限定的に、コンホメーション、フォールディング(または他の物理的特性)、(リガンドのような)他の分子部分への結合、活性(または他の機能特性)、および/またはタンパク質の構造または機能の他の側面を含む。例えば、ポリペプチドに作用し、そのコンホメーション、フォールディング(または他の物理的特性)、(リガンドのような)他の分子部分への結合、活性(または他の機能特性)、および/またはタンパク質の構造または機能の他の側面に影響する薬剤は、ポリペプチド調整機能をもつと考えられる。有効な薬剤がポリペプチドの機能を調整するように働く仕方は、1)そのコンホーメーション、フォールディングまたは他の物理的特性を変える;2)その天然リガンドへの結合力を変える、またはリガンドへの結合の特異性を変える;および3)該ポリペプチドの活性を変更する、ことを非限定的に含む。
【0074】
一般に、スクリーンされる薬剤の選択は、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的、その認知された機能、その三次元構造(わかっているか、推測されている場合)、および合理的なドラッグデザインの他の側面のような、いくつかのパラメーターにより支配される。コンビナトリアルケミストリーの技術も、候補物質の多数の順列を作るのに使ってもよい。当業者は、検査用の適切な薬剤を工夫および/または入手することができる。
【0075】
本明細書に記載されているin vivo(生体内)スクリーニングアッセイは、従来の薬剤スクリーニングアッセイに比べて、いくつかの長所をもつと思われる:すなわち、1)薬剤が、所望の治療効果を達成するために、細胞に入らなければならないのであれば、in vivoアッセイは、その薬剤が細胞に入れるかどうかについて、兆候を示すことが可能である;2)in vivoスクリーニングアッセイは、該アッセイ系に添加された状態では、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド機能の調整に伴う少なくとも一つの特徴を発揮するのに無効だが、それらが有効な薬剤になるように、一旦細胞の内部では細胞成分により修飾される薬剤を、同定できる;3)最も重要なのは、in vivoアッセイ系は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド機能に随伴する特徴を最終的にもたらす経路のいずれかの成分に影響する薬剤の同定を、可能にすることである。
【0076】
一般にスクリーニングは、本発明の方法を用いて同定されたポリヌクレオチドでトランスフェクトされた適切な細胞試料に、薬剤を添加し、そしてその効果、すなわち該ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチド内でコードされた該ポリペプチドの機能の調整をモニターすることにより実施可能である。当該実験は、候補薬剤を入れない対照試料を含むことが好ましい。次いで、それらの処理および無処理細胞は、顕微鏡分析、生存力試験、複製する能力、組織学的検査、当該細胞に伴う特定のRNAまたはポリペプチドの含量、当該細胞または細胞溶解物により発現される酵素活性のレベル、感染性因子に曝露された場合の当該細胞の相互作用、および他細胞または化合物と相互作用する当該細胞の能力、を非限定的に含む、いずれかの適切な表現型的基準により比較する。処理および無処理細胞間の相違は、当該候補薬剤に帰属される効果を示す。至適には、該薬剤は、対照細胞よりも実験細胞により大きな効果をもつ。適切な宿主細胞は、非限定的に、好ましくは哺乳動物細胞を含む真核生物細胞である。。細胞の選択は、意図するアッセイの性質に少なくとも部分的には依存する。 ポリヌクレオチドの発現を上向き調節する薬剤を検査するためには、該ポリヌクレオチドが発現(本明細書で使われる場合、発現は転写および/または翻訳を含む)されるように、その興味あるポリヌクレオチドでトランスフェクトした適切な宿主細胞を、検査する薬剤と接触させる。薬剤は、mRNAおよび/またはポリペプチドの発現増加をもたらす能力について検査される。ベクターの作製およびトランスフェクションの方法は、当該技術分野では周知である。“トランスフェクション”は、例えば、リポフェクション、形質導入、感染または電気穿孔を含む、外因性配列を導入するいずれかの方法を包含する。該外因性ポリヌクレオチドは、(プラスミドのような)非組込みベクターとして維持されてもよく、あるいは該宿主ゲノムへ組込まれてもよい。
【0077】
特異的に転写を活性化する薬剤を同定するために、転写調節領域はレポーター遺伝子に連結され、そしてその構築体が適切な宿主細胞に添加される。本明細書で使われる場合、用語“レポーター遺伝子”は、同定可能な遺伝子産物(すなわちレポータータンパク質)をコードする遺伝子を意味する。レポーター遺伝子は、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、および緑色蛍光タンパク質(GFP)を非限定的に含む。レポーター遺伝子の産物の同定方法は、非限定的に、酵素アッセイおよび蛍光アッセイを含む。レポーター遺伝子およびそれらの産物を検出するためのアッセイ法は、当該技術分野では周知で、そして例えば、Ausubelら(1987)および定期更新資料に記載されている。レポーター遺伝子、レポーター遺伝子アッセイ、および試薬キットも、市販源から容易に入手できる。適切な細胞の例は、非限定的に、カビ、酵母、哺乳動物細胞、および他の真核生物細胞を含む。通常の技術の実行者は、ウイルスベクターのような適当なベクターの調製;電気穿孔によるような該ベクターを前記細胞中へ搬入すること;およびレポーターまたは薬剤感受性エレメントを用いるような形質転換された細胞を選択することを含む、真核生物にトランスフェクトするための技術を熟知しているはずである。それらの構築体中の調節領域からの転写への薬剤の効果は、当該レポーター遺伝子産物の活性を介して査定される。
【0078】
上述のように普通は抑制される条件下での発現の増加の他に、正常に発現されるはずの場合に、発現が減少することがある。ある薬剤は、転写速度の低下を介してこれを行うことがあり、上記のレポーター遺伝子系はこれをアッセイする手段となる。そうした薬剤を査定するための宿主細胞は、発現に対して許容的であることが必要である。
【0079】
(関心のあるポリヌクレオチドから)mRNAを転写する細胞を用いて、mRNAの半減期および/またはmRNAの翻訳を特異的に調整する薬剤を同定することも可能である。そうした細胞は、該ポリペプチドのプロセシングおよび/または翻訳後の修飾に及ぼす薬剤の作用を査定するのにも使えるはずである。薬剤は、該ポリペプチドの代謝回転(すなわち、その半減期の増加または減少)を修飾することにより、ポリペプチドの量を調整することもある。該mRNAおよびポリペプチドに関する薬剤の特異性は、該薬剤の非存在下で当該産物を調べること、および無関係なmRNAおよびポリペプチドの産物を調べることにより、決定されるはずである。mRNA半減期、タンパク質プロセシング、およびタンパク質代謝回転を調べる方法は、当業者には周知である。
【0080】
In vivoスクリーニング法は、該ポリペプチドとの相互作用を介してポリペプチド機能を直接調整する薬剤の同定にも有用である。そうした薬剤は、ときに、正常なポリペプチド・リガンド相互作用を遮断したり、あるいはそのような相互作用を亢進したり、安定化したりすることもある。そうした薬剤は、該ポリペプチドのコンホメーションを変えることもある。該薬剤の作用は、免疫沈澱反応を用いて決定可能である。適切な抗体を使えば、該ポリペプチドおよびそれと強固に結合したいかなるタンパク質でも、沈澱させるはずである。処理細胞および無処理細胞から免疫沈澱されたポリペプチドを比較することにより、ポリペプチド・リガンド相互作用がもしあれば、それを増強または阻害する薬剤を同定できるだろう。ポリペプチド・リガンド相互作用は、ポリペプチド間の密接ではあるが、非共有相互作用を共有相互作用へ変換する架橋試薬を用いて、査定することも可能である。タンパク質・タンパク質相互作用を調べる技術は、当業者にはよく知られている。タンパク質のコンホメーションを査定する技術も当業者には周知である。
【0081】
スクリーニング法は、無細胞転写または翻訳系のようなin vitro法を含んでもよいことは、理解される。それらの系では、転写または翻訳が生じることが可能で、薬剤は、機能を調整するその能力が検査される。薬剤がmRNAまたはポリペプチドの翻訳を調整するかどうかを決定するアッセイでは、in vitro転写/翻訳系を使用してもよい。それらの系は商業的に入手でき、そして関心あるポリヌクレオチド配列に相当するmRNAをつくるin vitro手段を提供する。mRNAが作られた後、それをin vitroで翻訳し、そしてその翻訳産物を比較することも可能である。薬剤を含まないin vitro発現系(負の対照)と、薬剤を含むin vitro発現系とで翻訳産物を比較すれば、当該薬剤が翻訳に影響するかどうかが明らかになる。対照および検査ポリヌクレオチドとの間の翻訳産物を比較すれば、当該薬剤が、もしこのレベルで作用しているならば、(一般的な非選択的または非特異的な仕方で翻訳に影響するのではなく)、選択的に翻訳に影響するかどうかが、明らかになる。ポリペプチド機能の調整は、上に挙げたin vivoおよびin vitroアッセイならびにタンパク質調製物を用いるin vitroアッセイを、非限定的に、含む多くの仕方で達成可能である。ポリペプチド類を天然源または組換え体源から抽出および/または精製して、タンパク質調製物をつくることが可能である。薬剤をタンパク質調製物の試料に添加し、その効果をモニターしてもよい;すなわち、当該薬剤がポリペプチドに作用するかどうか、そしてそのコンホメーション、フォールディング(または他の物理的特性)、他の分子部分(リガンドのような)への結合、活性(または他の機能特性)、および/またはタンパク質構造や機能の他の側面にどのように影響するかを検討し、調整されたポリペプチド機能を明らかにする。
【0082】
本明細書に記載の方法により同定されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに結合する薬剤についてのアッセイの一例では、ポリペプチドが、自然タンパク質として、または(上記のように同定されたポリヌクレオチドによりコードされる)ポリペプチドが、特性が十分明らかにされているエピトープまたはタンパク質と共役している融合タンパク質として、原核生物または真核生物発現系で、まず組換え体的に発現される。次いで、組換え体ポリペプチドは、例えば、適正な抗体または抗エピトープ抗体を用いる免疫沈澱により、または該共役体の固定化リガンドに結合させることにより、精製する。次に、ポリペプチドまたは融合タンパク質から成るアフィニティカラムを使用して、適切に標識された化合物の混合物をスクリーンする。適切な標識は、非限定的に、蛍光色素、ラジオアイソトープ、酵素および化学発光化合物を含む。非結合および結合化合物は、当業者により日常的に採用されているさまざまな条件(例えば、高塩類溶液、界面活性剤)を用いて洗浄すことにより分離できる。該アフィニティカラムへの非特異的結合は、該共役体またはエピトープだけを含むアフィニティカラムを用いて、前記化合物混合物を前洗浄することにより、最少限にできる。同様な方法は、ポリペプチドへの結合を競合する薬剤(類)のスクリーニングにも使用可能である。アフィニティクロマトグラフィーの他に、融点の変化、あるいはもう一つの分子と結合すると変化するタンパク質の蛍光異方性を測定するような他の技術もある。例えば、ポリペプチドに共有結合しているセンサーチップ(Pharmacia Biosensorにより供給,Stittら(1995)Cell 80:661−670)を用いるBIAコアアッセイは、異なる薬剤の結合活性を定量するのに実行してもよい。
【0083】
本発明のin vitroスクリーニング法は、ポリペプチドのアミノ酸配列、三次元原子構造、または他の性質が、ポリペプチドへ結合すると見込まれる薬剤をデザインするための基礎を提供する、構造的、合理的薬剤デザインを含むことも了解されよう。一般に、この状況での薬剤のデザインおよび/または選択は、栽培(家畜化)生物のポリペプチドおよび相同祖先ポリペプチドの構造の並置比較、該ポリペプチド標的の認知された機能、その三次元構造(わかっているか、推測されている場合)、および合理的なドラッグデザインの他の側面のようないくつかのパラメーターにより支配される。コンビナトリアルケミストリーの技術も、候補薬剤の多数の順列を作るのに使ってもよい。
【0084】
本発明のスクリーニング法で同様に意図されるのは、トランスジェニック動物および植物系であるが、それらは当該技術分野では知られている。
上記のスクリーニング法は一次スクリーンを表しており、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能を調整する活性を示す薬剤を検出するためにデザインされている。薬剤をさらに評価するためには、二次検査が必要であろうことを、当業者は認識するだろう。例えば、二次スクリーンは、技術分野では知られているマウスおよび他の動物モデル(ラットのような)、または栽培(家畜化)植物または動物そのものを用いる感染性アッセイで当該薬剤(類)を検査することを含んでもよい。加えて、一次スクリーンで陽性と検査された薬剤が生物での使用に適しているとの、さらなる確証として細胞毒性アッセイを実施しなければならない。例えばMTTアッセイ(Promega)を含む、細胞毒性のどのようなアッセイでも、この目的には適しているはずである。
【0085】
本発明はまた、本明細書に記載のスクリーニング法により同定された薬剤も含む。
以下の実施例は、当該分野における通常の技術をさらに支援するために、提供するものである。それらの実施例はわかり易いように意図されており、したがって本発明を限定するものとみなすべきではない。多数の典型的な修飾や変更が本明細書に記載されており、そして他のものも当業者には自明となろう。そうした変更は、本明細書に記載および請求されているように、本発明の範疇に入ると考えられる。
【0086】
【実施例】
実施例1:cDNAライブラリーの構築
栽培(家畜化)植物または動物cDNAライブラリーは、植物または動物の適正な組織を用いて構築される。当該分野の普通の技術をもつ者には、関心にある形質に従って分析するための適正な組織がわかるはずである。あるいは、当該生物全体を使ってもよい。例えば、1日令の植物実生は該植物遺伝子の大部分を発現することがわかっている。
【0087】
全RNAを該組織から抽出し(RNeasyキット,Quiagen;無RNAse Rapid Total RNAキット,5Prime‐‐3Prime,Inc.)、該RNAの完全性および純度は、通常の分子クローニング法に従って決定する。PolyA+RNAを単離し(Mini−Oligo(dT)Cellulose Spin Columns,5Prime‐‐3Prime,Inc.)、そしてプライマーとしてoligo(dT)を用いるcDNAの逆転写のための鋳型として使用する。合成されたcDNAは、商業的に入手できるキットを用いて、クローニングのために処理そして修飾する。次いで組換え体は宿主細胞系にパッケージされ、繁殖される。パッケージング混合物の一部を増幅し、残りは増幅前に保留する。該ライブラリーは標準化し、そしてライブラリー中の独立組換え体の数を決定することも可能である。
【0088】
実施例2:配列比較
候補栽培(家畜化)生物遺伝子に基づく適切なプライマーを調製し、cDNAライブラリーからか、またはmRNAから調製されたcDNAのいずれかの祖先cDNAのPCR増幅のために使用する。該cDNAライブラリーから選択された祖先cDNAクローンは、ABI377のような自動シークエンサーを用いて、配列決定する。配列決定を実施するには、M13 UniversalおよびReverseプライマー類のようなクローニングベクター上で普通使われるプライマー類を使用する。エンドシークエンシングによって完全には配列決定されていない挿入断片については、色素標識ターミネーターまたはカスタムプライマーを用いて残りのギャップ充たすことも可能である。
【0089】
検出された配列の差異は、まず正確さについてチェックされるが、それは例えば、栽培(家畜化)および祖先配列間に差異があるポイントを見つける;栽培(家畜化)生物に独特に思われる塩基類が、当該塩基に特異的な強い鮮明なシグナルに対応するかどうかを決定するために、配列フルオログラム(クロマトグラム)をチェックする;配列変化に対応する一つ以上の配列があるかどうかを見るために、該栽培(家畜化)生物のヒットをチェックする;そして必要ならば当該技術分野で知られる他の方法も用いる。異なる祖先ヌクレオチドがある位置に同一ヌクレオチドをもつ同一遺伝子についての複数の栽培(家畜化)生物配列記入は、その栽培(家畜化)配列が正確であり、その栽培(家畜化)差異が真実であることの独立した裏付けとなる。そうした変化は公共または商業データベース情報および遺伝暗号を用いて調べ、それらのDNA配列変化が、コードされるタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすかどうかを決定する。それらの配列は、コードされたタンパク質の直接配列決定により調べることも可能である。
【0090】
実施例3:分子進化分析
比較対象の栽培(家畜化)植物または動物および野生祖先配列を、KA/KS分析に供する。この分析では、Li93およびINAのような公共的または商業的に利用できるコンピュータープログラムを用いて、上記のように検討された各配列について、部位当りの同義変化の数(KS)により除した部位当りの非同義変化の数(KA)を求める。完全長コード領域またはコード領域の部分セグメントを使用できる。KA/KS比率が大きいほど、配列は適応進化を受けた可能性がそれだけ高い。KA/KS値の統計有意性は、t検定のような確立された統計方法および利用できるプログラムを用いて決定する。
【0091】
高いKA/KS比率の有意性をさらに裏付けるために、検討中の栽培(家畜化)配列を、他の進化的に近縁種と比較することも可能である。これらの比較によって、当該適応進化変化が、他の近縁種に比べてその栽培(家畜化)植物または動物系譜に独特かどうかについて、さらに明確化できる。当該配列が該栽培(家畜化)植物または動物にどの程度保存されているかを査定するために、いくつかの多様な栽培(家畜化)集団の代表からの関心ある遺伝子を直接配列分析して、当該配列を調べることも可能である。
【0092】
4:cDNAライブラリーの構築
ブタモロコシ(teosinte:トウモロコシ原種)cDNAライブラリーを1日令ブタモロコシ実生全体、または他の適切な植物組織を用いて構築する。全RNAを実生組織から抽出し、該RNAの完全性および純度は、通常の分子クローニング法に従って決定する。PolyA+RNAを選択し、そしてプライマーとしてoligo(dT)を用いるcDNAの逆転写のための鋳型として使用する。合成されたcDNAは、商業的に入手できるキットを用いて、クローニングのために処理そして修飾する。次いで組換え体は宿主細胞系にパッケージされ、繁殖される。パッケージング混合物の一部を増幅し、残りは増幅前に保留する。確立された方法を用いて、大腸菌(E.coli)宿主細胞にトランスフェクトするのに、組換え体DNAを使用する。該ライブラリーは標準化し、そしてライブラリー中の独立組換え体の数を決定することも可能である。
【0093】
実施例5:配列比較
該cDNAライブラリーからランダムに選択されたブタモロコシ実生cDNAクローンは、ABI377のような自動シークエンサーを用いて、配列決定する。配列決定を実施するには、M13 UniversalおよびReverseプライマー類のようなクローニングベクター上で普通使われるプライマー類を使用する。エンドシークエンシングによって完全には配列決定されていない挿入断片については、色素標識ターミネーターを用いて残りのギャップ充たす。
【0094】
得られたブタモロコシ配列は、データベース検索を介して栽培コーン配列と比較する。ゲノムデータベースは、コーンを含む多くの種について、公共的にあるいは商業的に利用できる。コーンデータベースの一例はwww.central.edu/homepages/liedlb/genetics/gene−site.htmlで見ることができる。他の適正なコーンEST(発現配列標識)データベースが私有され、維持されている。高得点“ヒット”、すなわち、相同性分析で有意な(例えば>80%の)類似性を示す配列が、回収され、そして分析される。次いでそれら二つの相同配列は、Higginsら(1992)により開発されたアラインメントプログラムCLUSTAL Vを用いて整列される。ヌクレオチドの置換、挿入および欠失を含むどのような配列差異でも、該アラインメントにより検出され、記録される。
【0095】
検出された配列の差異は、まず正確さについてチェックされるが、それはブタモロコシおよびコーン配列間に差異があるポイントを見つける;コーンに独特と思われる塩基類が、当該塩基に特異的な強い鮮明なシグナルに対応するかどうかを決定するために、該配列フルオログラム(クロマトグラム)をチェックする;配列変化に対応する一つ以上のコーン配列があるかどうかを見るために、該コーンヒットをチェックする;そして必要ならば当該技術分野で知られる他の方法も用いる。異なるブタモロコシヌクレオチドがある位置に同一ヌクレオチドをもつ同一遺伝子についての複数のコーン配列記入は、そのコーン配列が正確であり、そのブタモロコシ/コーン差異が真実であることの独立した裏付けとなる。そうした変化は公共/商業データベース情報および遺伝暗号を用いて調べ、それらのDNA配列変化が、コードされるタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすかどうかを決定する。それらの配列は、コードされたタンパク質の直接配列決定により調べることも可能である。
【0096】
実施例6:分子進化分析
比較対象のブタモロコシおよびコーン配列を、KA/KS分析に供する。この分析では、Li93およびINAのような公共的または商業的に利用できるコンピュータープログラムを用いて、上記のように検討された各配列について、部位当りの同義変化の数(KS)により除した部位当りの非同義変化の数(KA)を求める。この比率KA/KSは、適応進化、すなわち正の淘汰が、検討中の配列で働いてきた程度を反映することが明らかにされている。典型的には、完全長コード領域が、それらの比較分析では使われてきた。しかし、コード領域の部分セグメントも効率的に使用できる。KA/KS比率が大きいほど、配列は適応進化を受けた可能性がそれだけ高い。KA/KS値の統計有意性は、t検定のような確立された統計方法および利用できるプログラムを用いて決定する。ブタモロコシおよびコーン遺伝子間で統計的に高いKA/KS比率を示すそれらの遺伝子は、適応進化を受けた可能性が非常に高い。
【0097】
高いKA/KS比率の有意性をさらに裏付けるために、検討中の配列を、他の祖先コーン種と比較することも可能である。これらの比較によって、当該適応進化変化が、他の祖先に比べてその栽培コーン系譜に独特かどうかについて、さらに明確化できる。当該配列が該コーン種にどの程度保存されているかを査定するために、いくつかの多様なコーン集団の代表からの関心ある遺伝子を直接配列分析して、当該配列を調べることも可能である。
【0098】
実施例7:データベースから入手したコーンおよびブタモロコシ相同配列に対するKA/KS法の適用
Genbank(www.ncbi.nlm.gov/Web/Genbank/index.html)上で利用できる栽培コーンおよびブタモロコシ配列の比較から、少なくとも4つの相同遺伝子waxy,A1*,A1およびglobulinが明らかになった。コーンおよびブタモロコシの両者でそれらの遺伝子について入手できるすべての配列を比較した。KA/KS比率は、Li93および/またはINAを用いて決定した。
【0099】
【表1】
コーンに観察される多型(複対立遺伝子コピー)および/または倍数性(細胞当り2セット以上の染色体)が、KA/KS分析を複雑にするか、困難にすることも予測されたが、そうではないことがわかった。
【0100】
上記KA/KS値はそれらの遺伝子が正に淘汰されてないことを示しているが、この例は、KA/KS法が、データベースから得たコーンおよびそのブタモロコシ配列に適用可能なこと例証している。
【0101】
実施例8:トランスジェニック植物を用いるタンパク質機能の検討
実施例4−7の方法に従って得た正に淘汰された遺伝子の機能性の役割は、トランスジェニックコーン植物における当該遺伝子の各対立遺伝子の評価を実施することにより査定可能である。トランスジェニック植物は、Pengら(1999)Nature 400:256−261に記載の方法を応用して作出可能である。該トランスジェニック植物またはそのタンパク質抽出物の生理学的、形態学的および/または生化学的試験により、各対立遺伝子の特定の表現型との関連付けが可能になろう。
【0102】
実施例9:QTLsへの正に淘汰された遺伝子のマッピング
QTL(定量的形質遺伝子座)分析は、高さおよび油含量を含む、メイズにおける関心のあるいくつかの表現型的形質を制御する遺伝子類を含む染色体領域を明らかにした。この方法により同定された正に淘汰された各遺伝子を既知QTLsの一つへマッピングすることにより、正に淘汰された各遺伝子により制御される特定の形質を、迅速かつ明確に同定可能である。
【0103】
前掲の発明は、明確さおよび理解を助けるため、例証や実施例により多少詳しく記載されているが、ある種の変更や修飾が実行可能なことは、当該分野の普通の技術をもつ者には明らかであろう。それ故、当該記述および実施例は、付随の特許請求範囲により叙述される本発明の範囲を制限するものと解釈してはならない。
Claims (34)
- 栽培(家畜化)生物のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を同定する方法であって、ここで当該ポリペプチドが、当該栽培(家畜化)生物の野生祖先に比較して、当該栽培(家畜化)生物中で独特であるか、増強されているか、または変更されている商業的にまたは審美的に関連する形質に随伴する可能性があり、そして
a)当該栽培(家畜化)生物のタンパク質コードヌクレオチド配列を、当該野生祖先のタンパク質コードヌクレオチド配列と比較する;そして
b)該野生祖先中の対応配列に比較してヌクレオチド変化を含む該栽培(家畜化)生物中のポリヌクレオチド配列で、そこでの当該変化が進化的に有意な、配列を選択する:工程を含む、前記方法。 - 請求項1の方法であって、ここで当該栽培(家畜化)生物が、トウモロコシ(コーン)、コメ、トマト、ジャガイモおよびその祖先が既知の他の栽培植物より成る群から選択される植物である、前記方法。
- 当該栽培植物がコーンであり、そして当該野生祖先がブタモロコシ(teosinte)である、請求項2の方法。
- 請求項1の方法であって、ここで当該栽培(家畜化)生物が、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコおよびその祖先が既知の他の家畜化動物より成る群から選択される動物である、前記方法。
- 当該栽培(家畜化)種のタンパク質コードヌクレオチド配列がcDNAに対応する、請求項1の方法。
- 該ヌクレオチド変化が非同義置換である、請求項1の方法。
- 該ヌクレオチド変化の進化的有意性が、該ヌクレオチド配列の非同義置換割合(KA)に従って決定される、請求項6の方法。
- 該ヌクレオチド変化の進化的有意性が、該ヌクレオチド配列の同義置換割合(KS)に対する非同義置換割合(KA)の比率により決定される、請求項7の方法。
- 該KA/KS比率が少なくとも約0.50である、請求項8の方法。
- 該KA/KS比率が少なくとも約0.75である、請求項9の方法。
- 該KA/KS比率が少なくとも約1.00である、請求項10の方法。
- 請求項1の方法であって、ここで該栽培(家畜化)生物が植物であり、そして該関連形質が、収穫量、短日長開花、タンパク質含量、油含量、味、収穫の容易さ、耐病性、耐乾燥性および商業的関心のある他の形質より成る群から選択される、前記方法。
- 請求項1の方法であって、ここで該栽培(家畜化)生物が動物であり、そして該関連形質が、脂肪含量、タンパク質含量、乳生産、成熟までの期間、扱いやすさ、繁殖性、耐病性および商業的関心のある他の形質より成る群から選択される、前記方法。
- 請求項1の該関連形質を調整する可能性がある薬剤を同定する方法であって、当該方法が、請求項1中で同定される該ポリヌクレオチド配列を発現する細胞またはトランスジェニック生物と、少なくとも一つの候補薬剤とを接触させることを含み、ここでの該薬剤は、請求項1の該同定ポリペプチドの機能を調整するその能力により同定される、前記方法。
- 栽培(家畜化)生物のタンパク質コードヌクレオチド配列中の進化的に有意な変化を同定するための方法であって、
a)当該栽培(家畜化)生物のタンパク質コードヌクレオチド配列を、当該野生祖先の対応配列と比較する;そして
b)該野生祖先中の対応配列に比較してヌクレオチド変化を含む当該栽培(家畜化)生物中のポリヌクレオチド配列で、そこでの該変化が進化的に有意な、配列を選択する:工程を含む、前記方法。 - 請求項15の方法であって、ここで当該栽培(家畜化)生物が、コーン、コメ、トマト、ジャガイモおよびその祖先が既知の他の栽培植物より成る群から選択される植物である、前記方法。
- 当該栽培植物がコーンであり、そして当該野生祖先がブタモロコシである、請求項16の方法。
- 請求項15の方法であって、ここで当該栽培(家畜化)生物が、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコおよびその祖先が既知の他の家畜化動物より成る群から選択される動物である、前記方法。
- 当該栽培(家畜化)種のタンパク質コードヌクレオチド配列がcDNAに対応する、請求項15の方法。
- 該ヌクレオチド変化が非同義置換である、請求項15の方法。
- 該ヌクレオチド変化の進化的有意性が、該ヌクレオチド配列の非同義置換割合(KA)に従って決定される、請求項20の方法。
- 該ヌクレオチド変化の進化的有意性が、該ヌクレオチド配列の同義置換割合(KS)に対する非同義置換割合(KA)の比率により決定される、請求項21の方法。
- 該KA/KS比率が少なくとも約0.50である、請求項22の方法。
- 該KA/KS比率が少なくとも約0.75である、請求項23の方法。
- 該KA/KS比率が少なくとも約1.00である、請求項24の方法。
- 請求項15の方法であって、ここで該栽培(家畜化)生物が植物であり、そして該関連形質が、収穫量、短日長開花、タンパク質含量、油含量、味、収穫の容易さ、耐乾燥性および商業的関心のある他の形質より成る群から選択される、前記方法。
- 請求項15の方法であって、ここで該栽培(家畜化)生物が動物であり、そして該関連形質が、脂肪含量、タンパク質含量、乳生産、成熟までの期間、扱いやすさ、繁殖性、耐病性および商業的関心のある他の形質より成る群から選択される、前記方法。
- 請求項15の関連形質を調整する可能性がある薬剤を同定する方法であって、当該方法が、請求項15中で同定される該ポリヌクレオチド配列を発現する細胞またはトランスジェニック生物と、少なくとも一つの候補薬剤とを接触させることを含み、ここでの該薬剤は、請求項15の該同定ポリペプチドの機能を調整するその能力により同定される、前記方法。
- 栽培(家畜化)生物のタンパク質コードヌクレオチド配列と、当該栽培(家畜化)生物の野生祖先からのタンパク質コード配列との間の大規模配列比較のための方法であって、
a)該栽培(家畜化)生物配列を、該野生祖先からの対応配列とともに、配列相同性に従い、整列する;そして
b)該野生祖先からの相同配列に比較して、該栽培(家畜化)生物配列内にヌクレオチド変化があれば同定する:ことを含む、前記方法。 - 請求項29の方法であって、ここで該栽培(家畜化)生物が、コーン、コメ、トマトおよびその祖先が既知の他の栽培植物より成る群から選択される植物である、前記方法。
- 当該栽培植物がコーンであり、そして当該野生祖先がブタモロコシである、請求項30の方法。
- 請求項29の方法であって、ここで当該栽培(家畜化)生物が、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコおよびその祖先が既知の他の家畜化動物より成る群から選択される動物である、前記方法。
- 当該栽培(家畜化)種のタンパク質コードヌクレオチド配列がcDNAに対応する、請求項29の方法。
- 進化的に有意なヌクレオチド変化を、栽培(家畜化)生物における独特であるか、増強されているか、または変更されている商業的にまたは審美的に関連する形質に相関させるための方法であって、
a)請求項1に従ってヌクレオチド配列を同定する;そして
b)該栽培(家畜化)生物において同定された配列の存否の機能的効果を分析する:ことを含む、前記方法。
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