JP2004357575A

JP2004357575A - Circulating culture method for microorganism

Info

Publication number: JP2004357575A
Application number: JP2003159410A
Authority: JP
Inventors: 淳子 ▲高▼橋; Junko Takahashi
Original assignee: Daikin Industries Ltd
Current assignee: Daikin Industries Ltd
Priority date: 2003-06-04
Filing date: 2003-06-04
Publication date: 2004-12-24

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method and an apparatus for culturing microorganisms in a medium in a proliferating way, and to provide a method and an apparatus for carrying out a water quality testing by utilizing the above method. <P>SOLUTION: A circulating culture method for microorganisms is provided, comprising culturing the microorganisms in a proliferating way while circulating a suspension containing the microorganisms in a medium through a circulating flow path. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物の培養、および水質検査を行うためのバイオアッセイ方法および装置に関する。
【０００２】
【従来の技術および解決課題】
理想的な培養条件下では、微生物、特に細菌は時間に比例してその数を増す。細胞数の変化は増殖曲線で表され、通常、増殖誘導期、対数増殖期および定常期の３期で示される。増殖誘導期は新しい環境に適応して発育を再開するまでの時期、対数増殖期は菌が一定の発育速度で増殖し、菌がもっている増殖能が最高に発揮されている状態の時期、そして定常期は菌の発育が殆ど停止し集団内で死滅していく菌と分裂する菌の数がほぼ同じ割合で全体的に均衡が保たれているようにみえる時期である。
微生物を培養するための方法および装置はこれまで種々報告されているが（特許文献１、２、３）、特定の時期、増殖誘導期の終わりから定常期の初めにかけて細胞が増殖する時期、特に対数増殖期、を保持させつつ培養するものはこれまで知られていない。また、藻類を閉鎖系で培養する装置も知られているが（特許文献４）、この装置も特定の時期に指向しておらず、また専ら培養槽において培養する方式である。
他方、河川・湖沼等の環境水および下水、排水中に含まれている化学物質等の水質検査を行う、微生物を指標としているバイオアッセイ装置は、微生物固定膜を利用している（特許文献５、６および７）。しかし、微生物固定膜は微生物の応答が維持できる期間を超えると、微生物固定膜の交換が必要である等、不都合な点が多い。外部環境に最も影響を受けやすいのは細胞周期のすべてのステージの細胞を含む対数増殖期であり、よって対数増殖期の状態を長期に保持できる培養方法は、水質検査のための微生物として有効に機能すると考えられる。
【０００３】
【特許文献１】
特開昭４７−１４３８２
【特許文献２】
特開昭６３−１４１５７６
【特許文献３】
特開平７−８２６０
【特許文献４】
特開平１−２９１７８３
【特許文献５】
特開平７−６３７２５
【特許文献６】
特開平１１−３７９６９
【特許文献７】
特開２０００−２０６０８７
【０００４】
【課題解決手段】
今回、本発明者は、培地中の微生物懸濁液を循環流路に循環させつつ培養すれば、微生物を対数増殖期に保持できることを見出した。そして、この培養方法が、微生物固定膜を用いない、水質検査を行うためのバイオアッセイに応用できることを見出し、本発明を完成した。
【０００５】
即ち、本発明は、
（１）培地中の微生物懸濁液を循環流路に循環させつつ微生物を増殖的に培養する、微生物の培養方法；
具体的には、循環流路を循環している微生物懸濁液の所定量を排出し、排出される懸濁液の所定量と同量の培地を補給することにより、循環流路中の微生物懸濁液の微生物濃度を定期的に調整し、微生物を増殖的に培養する本発明の方法、あるいは
循環流路を循環している微生物懸濁液の所定量を恒常的に排出し、排出される懸濁液の所定量と同量の培地を恒常的に補給することにより、循環流路中の微生物懸濁液の微生物濃度を一定に保持しつつ、微生物を増殖的に培養する、本発明の方法；
さらに具体的には、循環が一定方向または循環の方向を所定の時間間隔で逆転させる本発明の方法；
【０００６】
（２）ａ）培地中の微生物懸濁液が循環する循環流路、ｂ）循環流路に連結している懸濁液排出口、ｃ）循環流路に連結している培地供給槽を含む、微生物を培養するための装置；好ましくは、微生物を増殖的に培養するための本発明の装置；
具体的には、ａ）循環流路中では微生物懸濁液が一定方向、または所定の時間間隔で逆転して流れることができ、
ｂ）懸濁液排出口は、微生物懸濁液の所定量を排出し、
ｃ）培地供給槽は、懸濁液排出口から排出される懸濁液の所定量と同量の培地を補給し、それにより循環流路中の微生物懸濁液の微生物濃度を定期的に調整する本発明の装置；
さらに具体的には、ａ）循環流路中では微生物懸濁液が一定の流速度で流れており、
ｂ）懸濁液排出口は、微生物懸濁液の所定量を恒常的に排出し、
ｃ）培地供給槽は、懸濁液排出口から排出される懸濁液の所定量と同量の培地を恒常的に補給し、それにより循環流路中の微生物懸濁液の微生物濃度を一定に保持させつつ微生物を培養する、本発明の装置；
好ましくは、ｄ）循環流路中の微生物懸濁液の一部を取り出すためのサンプリング口をさらに備えた本発明の装置；
【０００７】
（３）検水中の有害物質混入の有無を検出する方法であって、循環流路中を移動している微生物を採取し、採取した微生物に対して検水を負荷し、負荷される検水に対する微生物応答を測定し、検水中に有害物質が混入した場合に引き起こされる微生物応答の変化を検出することを特徴とする方法；
好ましくは、循環流路中を移動している微生物が本発明の方法あるいは本発明の装置により培養されている方法；
【０００８】
（４）ａ）培地中の微生物懸濁液が循環する循環流路、ｂ）循環流路に連結している懸濁液排出口、ｃ）循環流路に連結している培地供給槽、ｄ）循環流路から分岐している、一定量の微生物懸濁液が流れる試験流路、ｅ）試験流路に検水を注入するための検水注入装置、およびｆ）検水が負荷された、試験流路を流れる微生物の応答を検出するための微生物応答検出装置を含む、検水中の有害物質混入の有無を検出するための装置；
具体的には、ａ）循環流路中では微生物懸濁液が一定方向、または所定の時間間隔で逆転して流れることができ、
ｂ）懸濁液排出口は、微生物懸濁液の所定量を排出し、
ｃ）培地供給槽は、懸濁液排出口から排出される懸濁液の所定量と同量の培地を補給し、それにより循環流路中の微生物懸濁液の微生物濃度を定期的に調整し、
ｄ）試験流路中では循環流路からの一定量の微生物懸濁液が流れており、
ｅ）検水注入装置は、試験流路中を移動している対数増殖期の微生物に検水を負荷し、
ｆ）微生物応答検出装置は、検水中に有害物質が混入した場合に微生物応答の変化が引き起こされるに充分な移動時間を与える位置に配置されている、本発明の装置；
さらに具体的には、ａ）循環流路中では微生物懸濁液が一定の流速度で流れており、
ｂ）懸濁液排出口は、微生物懸濁液の所定量を恒常的に排出し、
ｃ）培地供給槽は、懸濁液排出口から排出される懸濁液の所定量と同量の培地を恒常的に補給し、それにより循環流路中の微生物懸濁液の微生物濃度を定期的に調整し、
ｄ）試験流路中では循環流路からの一定量の微生物懸濁液が一定の流速度で流れており、
ｅ）検水注入装置は、試験流路中を移動している対数増殖期の微生物に検水を負荷し、
ｆ）微生物応答検出装置は、検水中に有害物質が混入した場合に微生物応答の変化が引き起こされるに充分な移動時間を与える位置に配置されている、本発明の装置；
好ましくは、検水注入装置が連結していない点以外は同じ試験流路を対照流路としてさらに含む、本発明の装置；
【０００９】
（５）培地中の微生物懸濁液を循環流路に循環させつつ微生物を増殖的に培養する、微生物を対数増殖期に保持させる方法；
【００１０】
（６）培地中の微生物懸濁液を循環流路に循環させつつ微生物を増殖的に培養する、対数増殖期の微生物を調製する方法；および
【００１１】
（７）検水中の有害物質混入の有無を検出する方法であって、増殖的に培養している微生物に対して検水を負荷し、負荷される検水に対する微生物応答を測定し、検水中に有害物質が混入した場合に引き起こされる微生物応答の変化を検出することを特徴とする方法、および
ａ）増殖的に培養している微生物を供給できる培養機構を有する培養装置、ｂ）該培養装置から微生物を採取するための採取装置、ｃ）採取した微生物に検水を注入するための検水注入装置、およびｆ）検水が負荷された微生物の応答を検出するための微生物応答検出装置を含む、検水中の有害物質混入の有無を検出するための装置；に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
（１）微生物の培養方法
第１の態様として、本発明は、培地中の微生物懸濁液を循環流路に循環させつつ微生物を増殖的に培養する、微生物の培養方法に関する。
本発明の微生物培養方法は、微生物懸濁液を循環させながら増殖的な培養を行うことを特徴とする。本発明において「増殖的な培養」とは、増殖曲線の対数増殖期を保持しつつ微生物を培養することを意味する。微生物を希釈して試験管内や閉鎖系にて培養し増殖曲線を描くと、まず増殖速度の遅い増殖誘導期が現れ、徐々に増殖速度が速い対数増殖期に入りその速度が最大となる。しかし、細胞数が増え過ぎると増殖速度が低下しはじめ、それ以上細胞数が増加しなくなる増殖曲線の定常期の状態となる。本発明の「増殖的な培養」とは、増殖曲線における定常期の状態でなく、微生物が一定の発育速度で増殖し、微生物がもっている増殖能が最高に発揮されて活発に活動している状態を保持させつつ培養する意味である。
【００１３】
本発明において「循環流路」とは、微生物懸濁液が流れる閉鎖系の流路である。以下に説明する通り、本発明の循環流路は閉鎖系であるが、所定量の懸濁液を排出でき、また所定量の培地を補給できる。よって、本発明における「循環流路」の閉鎖系とは、所定の目的のために微生物を一旦循環流路に供給すれば、その微生物が継代可能な期間は新たに微生物を供給せずに流路を循環させることを意味する。また、培養槽を用いる培養も閉鎖系であるが、本発明の循環流路による培養は流路中で増殖的な培養を行う点で培養槽を用いる培養と異なる。流路中の培養は、簡便な手法・装置により培地を効率的に交換できる点で培養槽培養よりも有利である。また、好気性細菌を培養する場合、好気的培養条件を設定するために培養槽培養では気相と液相を別個に設け、そして振盪させるという煩雑な手法やそのための装置が必要である。しかし、循環流路による培養では循環流路をガス透過性にするという簡便な手法を用いることにより好気的培養が可能である。さらに、循環流路は閉鎖系であるため、培地供給層の設置・交換および当初の液体培地と微生物の供給を無菌的に行うのみで、以降は無菌的な培養が可能となる利点をも有する。ここに、無菌的な培養とは不要な雑菌を伴わない培養を意味する。
循環流路は環状であっても、非環状であってもよい。
【００１４】
本発明の培養方法に適した微生物は、懸濁状態で継代培養が可能な細胞または微生物であれば、特に制限されない。例えば、継代数が多いまたは限りない天然に存在する野生株または野生型株、例えばヒト、マウスその他の哺乳類由来の動物細胞および動物細胞の樹立株；魚類、線虫等の細胞、昆虫細胞、酵母等の真菌細胞；大腸菌等の細菌細胞；ウイルス；原生動物；微小後生動物（線虫、ミジンコ）の何れであってもよい。野生株は天然に存在する組換えを行っていない微生物である。野生型株は注目する遺伝子に手をつけていない微生物である。樹立株は動物細胞で継代培養できるもの、例えばガン細胞などの組換えが施されていないものも含む。なお、本発明においては、循環流路にて培養できる細胞であれば、特別に区別する意味がないため、培養対象である微生物には動物細胞も含まれるものとする。
【００１５】
本発明に用いる培地は、用いる微生物に応じて変動し、微生物が酵母の場合、通常ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、ブドウ糖２％）、またはＳＤ培地（ｙｅａｓｔｎｉｔｒｏｇｅｎｂａｓｅｗｉｔｈｏｕｔａｍｉｎｏａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ．０９１９−１５−３））にグルコース、アミノ酸を加えたものを用いる。補給する培地とは、微生物生育に適した栄養分を含み、ｐＨが調整され、必要に応じて滅菌された、または雑菌を含まない培地である。例えば、懸濁液排出口からの廃液を濾過し微生物を除去した後のもの、またｐＨを生育に至適になるよう調整したものを含む。微生物生育に適した培地は例えば、須藤隆一：環境微生物実験法、講談社、１９９９，ｐｐ２０，ｐｐ２６２−２７３に詳しい。
【００１６】
本発明の培養方法を行うには、まず微生物を循環流路に供給する。本発明では、循環流路に対し、微生物の一定量を一回で供給する。供給する微生物は、凍結保存したもの、凍結乾燥保存したもの、冷蔵保存したもの、常温のもののいずれでも良い。
【００１７】
本発明の循環流路は閉鎖系であるので、循環させつつ培養を続けると、細胞濃度が高まり増殖曲線の定常期の状態となる。そこで、本発明では好ましくは、循環流路を循環している微生物懸濁液の所定量を排出し、排出される懸濁液の所定量と同量の培地を補給する。それを定期的に行うことにより、循環流路中の微生物懸濁液の微生物濃度を一定に保持させる。これが、本発明における「微生物濃度を定期的に調整する」の意である。
【００１８】
「定期的」の頻度ならびに排出する懸濁液の所定量および培地の補給量は、循環流路中の微生物の増加量により決定される。例えば、微生物が２倍になった場合、循環流路中の微生物懸濁液の半量を排出し、これと同量の培地を加える。また、細胞が１０倍になった場合、循環流路中の微生物懸濁液の９／１０を排出し、これと同量の培地を加える。温度、培地等の培養条件が一定なら、微生物種に固有の倍加時間はある程度予測できる。その予測値および、循環流路の長さ、内径、流速から、微生物懸濁液の排出量および培地の供給量が決定できる。例えば、ある微生物の倍加時間が１時間、循環流路の流路長６０ｃｍ、内径１ｍｍ、流速０．０７８５ｍｌ／分である場合、循環流路を１周する間に微生物懸濁液の１／２を排出し、これと等量の培地を供給すればよい。循環している微生物懸濁液における吸光度、酸素消費量等を計測するセンサにより微生物濃度をモニタリングし、その値により排出量および供給量を決定することもできる。
【００１９】
微生物懸濁液の排出と培地の補給とは「恒常的」に行うことができる。ここに、「恒常的」とは、循環流路中を循環している間は絶え間無くの意である。微生物懸濁液の排出と培地の補給を恒常的に行う場合、補給する培地は、懸濁液排出口からの廃液を濾過し微生物を除去した後のものが好ましい。
【００２０】
より具体的には、例えば酵母細胞ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＷ３０３（ＡＴＣＣ２０１２３９）に対し休眠状態の細胞活性を回復させる前培養を行った後、培地で希釈し、ＯＤ６６０＝０．０１にして２５℃で振とう培養すると、２４時間後にはＯＤ６６０＝２．５００になり、細胞数は約２５０倍に増える。このことから、酵母細胞Ｗ３０３の倍加時間は３時間程度であると計算される。よって、微生物としてこの酵母細胞を用いる場合、倍加時間の３時間ごとに細胞懸濁液の１／２が培地と置き換わるように懸濁液の排出と培地の供給とを制御すれば、系内は常に一定の細胞濃度に保たれ、細胞も常に対数増殖期の状態を維持できる。
【００２１】
本発明の方法では、循環流路中の微生物濃度を一定に保持させることが重要であるが、その手段はどんな方法であってもよい。好ましい微生物濃度は、対数増殖を維持する濃度、例えば酵母細胞Ｗ３０３の場合、ＯＤ６６０が０．１−３程度である。一定の細胞濃度に保つためには、常にＯＤ６６０を測定する等、流路中の細胞濃度を監視する。
【００２２】
循環流路中の微生物懸濁液の循環の方向は一定方向であっても、または所定の時間間隔で逆転してもよい。循環流路中の微生物懸濁液は常に流れている必要はなく、断続的に流れを中止させ、次いで所定の時間間隔で順方向、あるいは逆方向に流すことができる。流れを逆転させることにより、流路内に乱流を生じさせ、その乱流の攪拌作用により、細胞の沈殿が防止されるという効果を期待できる。この場合、循環流路は非環状であることができる。微生物懸濁液の循環は必要に応じてポンプを用いる。
【００２３】
循環流路における微生物の循環および／または培養条件は用いる微生物に応じて変動するが、一般には温度が一定であることに加え、細胞が均一に分布するよう攪拌されつつ循環されることが好ましい。それには、流路中に邪魔板を設置し、あるいは流路自体を振動させればよい。温度は微生物の生育に適した温度であり、酵母であれば、２５−３０℃、大腸菌では３０−３７℃、動物細胞では３７℃が好ましい。循環における懸濁液の流速度は流路径によって変動する。
【００２４】
用いる微生物が嫌気的か好気的かによっても循環条件は変動する。好気的培養が必要な場合は、循環流路の材質としてガス透過性のチューブを用いる、または圧縮空気を混合した培養液をノズルを通して多孔板へ噴出させ，酸素を効率良く溶解させる（登録１１３２６７３）、または流路に通した中空糸によりガス交換するという方法が挙げられる。嫌気的培養が必要な場合は、培地供給槽の培地の酸素を除去し、ガス不透過性チューブを用いる。また、操作全体を嫌気チャンバー内に設置する。
【００２５】
（２）微生物の培養装置
本発明は別の態様として、本発明の培養方法を実施するための装置に関する。詳細には、培地中の微生物懸濁液が循環する循環流路、ｂ）循環流路に連結している懸濁液排出口、ｃ）循環流路に連結している培地供給槽を含む、微生物を培養するための装置、好ましくはｄ）微生物を必要とする場合に循環流路中の微生物懸濁液の一部を取り出すためのサンプリング口をさらに備えた装置である。
【００２６】
「循環流路中では微生物懸濁液は一定方向、または所定の時間間隔で逆転して流れることができる」とは、循環流路中の微生物懸濁液の循環の方向は一定方向であっても、または所定の時間間隔で逆転してもよいことを意味し、ここに、循環流路中の微生物懸濁液は常に流れている必要はなく、断続的に流れを中止させ、次いで所定の時間間隔で順方向、あるいは逆方向に流すことができる。
【００２７】
循環流路の形態は環状であっても、非環状であってもよい。循環流路は通常、管状であるが、形状は何でも構わない。管状の場合、内径は通常、数十μｍ−数ｍｍ、通常は１ｍｍであり、閉鎖系全体の流路長は数ｃｍ−数ｍ、通常は２ｍである。「μＴＡＳ（Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）」と呼ばれる数１０−数１００μｍ幅の微小回路にすることも可能である（化学工業Ｖｏｌ．５２，Ｎｏ．１１，２００１．１１．ｐ．ｐ１−５１）。
【００２８】
流路は微生物の培養に適した材質であれば何でもよいが、シリコン製、ＰＴＦＥ、ＰＦＡ製が好適に用いられる。また、複数種類の微生物培養を想定し、流路は複数であってもよい。また、用いる微生物種を変える場合を考慮し、循環流路は、流路ごと交換できるような使い捨ての構造をとることが好ましい。
【００２９】
懸濁液排出口には流量を可変できるバルブを付ける。培地供給槽は培地注入口を介して循環流路と連結する。この培地注入口には流量を可変できるバルブを付ける。排出口および注入口のバルブは、微生物種、流路長、流速および温度により予測される微生物の増加率に基づき決定される排出量および供給量を調節・制御するものである。このような調節・制御はバルブを兼ねたコントローラを用いて行うことができる。制御は、循環している微生物懸濁液における吸光度、酸素消費量等を計測するセンサにより微生物濃度をモニタリングし、その値に基づき行うこともできる。ここで用いるバルブは開閉可能で逆流しないものが好ましい。排出および注入は必要に応じてポンプを用いる。
本発明の装置は、微生物を必要とする場合に循環流路中の微生物懸濁液の一部を取り出すためのサンプリング口をさらに備えることができる。
本発明の培養装置における循環流路が環状である装置を図１および図２に示す。
【００３０】
（３）有害物質混入の有無を検出する方法
本発明はさらに別の態様として、検水中の有害物質混入の有無を検出する方法であって、循環流路中を移動している微生物を採取し、採取した微生物に対して検水を負荷し、負荷される検水に対する微生物応答を測定し、検水中に有害物質が混入した場合に引き起こされる微生物応答の変化を検出することを特徴とする方法に関する。この方法は要するに、循環流路を循環している微生物に対し、水質検査の対象となる検水を加えて生育させ、検水負荷前と負荷後の微生物の応答を測定し比較することにより、検水中の有害物質の有無の検出を行うものである。これにより、微生物固定膜を用いずに水質検査を行うためのバイオアッセイが可能となる。
【００３１】
本発明において「検水」とは、河川・湖沼等の環境水および下水、排水から供給される検体試料水であり、これらは有害物質が混入されていないか、水質検査が常に必要な試料水である。
【００３２】
「検水の負荷」は、循環流路中を移動している微生物を採取し、採取した微生物に対して行う。ここに使用される微生物は本発明の方法または装置により培養されているものが好ましい。本発明では、「検水の負荷」は間欠的であっても連続的であってもよい。間欠的に検水を負荷する場合、検水は異なる場所から採取した試料水であってよく、同じ場所から異なる時間に採取した試料水であってよい。「検水の負荷」を連続的に行う場合、本発明により、検水の経時的な水質検査が可能となる。よって、この態様では、本発明は、検水中の有害物質混入の有無を経時的にモニターする方法であって、循環流路中を移動している微生物を恒常的に採取し、採取した微生物に対して検水を連続的に負荷し、負荷される検水に対する微生物応答を測定し、検水中に有害物質が混入した場合に引き起こされる微生物応答の変化を経時的に検出することを特徴とする方法を提供する。ここに、検水の経時的な水質検査は、任意にモニターしたい時間行うことができる。通常は、数時間から数日、あるいは数ヶ月である。基本的には、モニター時間は、微生物の応答性に依存する。
本発明の検出方法では、微生物応答の測定に用いられた微生物はそのまま排出される。
【００３３】
本発明において「微生物応答」とは、天然に存在する野生株または野生型株の場合、微生物細胞数、生細胞数、呼吸量、ＡＴＰ量等である。また、有害物質の存在下に変動する遺伝子のｍＲＮＡレベルであることができる。ｍＲＮＡレベルは、ノーザンブロット法（緒方宣邦、野島博：遺伝子工学キーワードブック改定第２版、羊土社、２０００，ｐｐ２９９−３０１）、逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）（中別府雄作、他：細胞工学別冊Ｔｉｐｓシリーズ改定ＰＣＲＴｉｐｓ，秀潤社、１９９９，ｐｐ２５−４３）等によって測定できる。
ここに、「有害物質の存在下に変動する遺伝子」は、酵母細胞の場合、公共のデータベース（例えば、ドイツのＭＩＰＳ：ＭｕｎｉｃｈＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒｆｏｒＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅ、米国のＳＧＤ：ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓＧｅｎｏｍｅＤａｔａｂａｓｅ）に開示されている酵母遺伝子の中から適宜選択し、これらはインターネットを介して知ることができる。好ましい遺伝子は、ミトコンドリアタンパク質、遺伝子修復系タンパク質、エネルギー系タンパク質、トランスポート促進タンパク質、ストレスタンパク質、代謝系タンパク質、脱毒性タンパク質および機能未知の遺伝子である。例えば、ＹＬＲ３０３Ｗ、ＹＬＬ０５７Ｃ、ＹＯＲ３８２Ｗ、ＹＣＲ１０２Ｃ、ＹＫＬ０７１Ｗ等である。
【００３４】
本発明で使用される微生物にはまた、上記天然に存在する細胞の組換え体、即ち形質転換体が含まれる。本発明に用いる形質転換体は、上記「有害物質の存在下に変動する遺伝子」のプロモーターのポリヌクレオチド配列に、マーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結して得られるポリヌクレオチド構築物を含むベクターを上記天然に存在する細胞に導入することにより調製できる。プロモーターにタンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結する方法は周知である（例えばＲ．Ｗ．オールド、Ｓ．Ｂ．プリムローズ遺伝子操作の原理原書第５版，培風館，ｐｐ１３８−１６５，ｐｐ．２３４−２６３，２０００を参照）。プロモーターの配列は、例えば酵母の場合、公共のデータベース（ＳＣＰＤ：ＴｈｅＰｒｏｍｏｔｅｒＤａｔａｂａｓｅｏｆＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に開示されている。マーカータンパク質の例としてはＧＦＰ（ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰｒｏｔｅｉｎ）（Ｈｅｉｍ，Ｒ．，Ｃｕｂｉｔｔ，Ａ．Ｂ．ａｎｄＴｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ３７３，６６３−６６４；Ｈｅｉｍ，Ｒ．，ＰｒａｓｈｅｒＤＣ．ａｎｄＴｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１，１２５０１−１２５０４；Ｗａｒｇ，Ｓ．ａｎｄＨａｚｅｒｉｇｇ，Ｔ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ６３９，４００−４０３；Ｙｏｕｖａｎ，Ｄ．Ｃ．ａｎｄＭｉｃｈｅｌ−Ｂｅｙｅｒｌｅ，Ｍ．Ｅ．（１９９６）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４１２１９−１２２０；Ｃｈａｌｆｉｅ，Ｍ．，Ｔｕ，Ｙ．，Ｅｕｓｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇ．，Ｗａｒｄ，Ｗ．Ｗ．ａｎｄＰｒａｓｈｅｒ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６３，８０２−８０５）、β−ガラクトシダーゼ（ＣａｎｅｓｔｒｏＣ，ＡｌｂａｌａｔＲ，ＥｓｃｒｉｖａＨ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−ＤｕａｒｔｅＲ．Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎａｍｐｈｉｏｘｕｓ：ａｕｓｅｆｕｌｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｍａｒｋｅｒｆｏｒｔｈｅｄｉｇｅｓｔｉｖｅｓｙｓｔｅｍ．ＤｅｖＧｅｎｅｓＥｖｏｌ２００１Ｍａｒ２１１（３）：１５４−６）、ルシフェラーゼ（ＡｒｃｈＴｏｘｉｃｏｌ２００２Ｊｕｎ；７６（５−６）：２５７−６１、ＥｓｔｒｏｇｅｎｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＵＶｆｉｌｔｅｒｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙａｎｉｎｖｉｔｒｏｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅａｓｓａｙａｎｄａｎｉｎｖｉｖｏｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｚｅｂｒａｆｉｓｈａｓｓａｙ．ＳｃｈｒｅｕｒｓＲ，ＬａｎｓｅｒＰ，ＳｅｉｎｅｎＷ，ＶａｎＤｅｒＢｕｒｇＢ．）、及びアセチルトランスフェラーゼ（ＪＲｅｃｅｐｔＳｉｇｎａｌＴｒａｎｓｄｕｃｔＲｅｓ２００１Ｆｅｂ；２１（１）：７１−８４，Ａｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒｌａｒｇｅｓｃａｌｅｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｉｔｓｕｓｅｉｎｓｔｕｄｉｅｓｏｆｓｔｅｒｏｉｄｓａｎｄｓｔｅｒｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．ＺｈａｎｇＳ，ＬｕＪ，ＩｙａｍａＫ，ＬｏＳＣ，ＤａｎｉｅｌｓｅｎＭ．）等が挙げられる。
【００３５】
ベクターの調製は、例えば酵母細胞の場合、酵母において複製可能なプラスミドを選択し、これにマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入し、次いでプロモーター配列を含むポリヌクレオチドをマーカー遺伝子の上流部分に挿入することにより行うことができる。
形質転換体は周知の手法により調製できる。例えば、酵母細胞を形質転換する方法は、ＫａｉｓｅｒＣ，ＭｉｃｈａｅｌｉｓＳ，ＭｉｔｃｈｅｌｌＡ：ＡＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｕｒｓｅＭａｎｕａｌ１９９４ｅｄｉｔｉｏｎ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）ｐｐ．１３３−１３４，１９９４に記載されている。
【００３６】
形質転換体を用いた場合、本発明に使用される「微生物応答」はマーカータンパク質の発現レベルである。マーカータンパク質の発現レベルは、形質転換体を粉砕しタンパク質抽出液を得、この液中のマーカータンパク質量を測定することにより得られる。例えばマーカータンパク質がＧＦＰの場合、タンパク質抽出液の蛍光量を蛍光分光光度計により計測する。また、マーカータンパク質の発現レベルは、形質転換体を粉砕しなくても直接、蛍光顕微鏡、レーザー顕微鏡による画像処理、フローサイトメトリーによる計測、エバネッセント光による計測、さらに比色計などを用いた検出方法により、細胞の蛍光（ＧＦＰ）もしくはもしくは発色（β−ｇａｌ）を測定できる場合もある。好ましい形質転換体は、酵母遺伝子のプロモーターをマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したポリヌクレオチドを含むベクターによって形質転換されている酵母、または染色体のＯＲＦをマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドで置換するように形質転換されている酵母であり、さらに好ましくは、その酵母遺伝子がミトコンドリアタンパク質、遺伝子修復系タンパク質、エネルギー系タンパク質、トランスポート促進タンパク質、ストレスタンパク質、代謝系タンパク質、脱毒性タンパク質および機能未知の遺伝子のなかから選ばれるものである。
【００３７】
本発明の検出方法では、検水中に有害物質が混入した場合に引き起こされる微生物応答の変化を検出する。検水に有害物質が存在する場合、循環流路から採取された微生物が検水と接触すると、生育阻害、呼吸量低下等の影響を受ける。加えて微生物が組換え体である場合、レポーター遺伝子の発現が起きる。
【００３８】
本発明では上記の通り、微生物は循環流路から採取され、そのまま排出される。そのため、本発明において測定できる「微生物応答」として、酸素消費量等の可逆的な応答のみならず、微生物の死滅を伴う生細胞数および細胞を破壊して測定する細胞内の酵素活性などの不可逆的な応答も利用できる。
【００３９】
循環流路に供給される微生物が凍結保存したもの、凍結乾燥保存したもの、または冷蔵保存したものである場合、微生物は休眠状態にある。よって、本発明では好ましくは、検水を負荷する前に、循環流路から採取される微生物を一定時間循環流路中で増殖培養させ、それにより休眠状態の微生物の活性を回復させる前培養を行い、次いで検水の負荷を行い試験培養する。前培養では、微生物の化学物質感受性を上げるため、可能な限り、細胞周期のすべてのステージの細胞を含む状態である対数増殖期とすることが望ましい。前培養では、循環流路中を循環している微生物を所定量排出し、培地を供給することで希釈培養し、それにより微生物が対数増殖期になるように温度および時間を制御する。具体的には、酵母の場合、前培養の条件は２５−３０℃、２時間から十数時間である。試験培養は、検出すべき微生物の応答により異なるが、数１０分から数時間である。
【００４０】
（４）有害物質混入の有無を検出する装置
本発明はさらに別の態様として、本発明の検出方法を実施するための装置を提供する。詳細には、ａ）培地中の微生物懸濁液が循環する循環流路、ｂ）循環流路に連結している懸濁液排出口、ｃ）循環流路に連結している培地供給槽、ｄ）循環流路から分岐している、一定量の微生物懸濁液が流れる試験流路、ｅ）試験流路に検水を注入するための検水注入装置、およびｆ）検水が負荷された、試験流路を流れる微生物の応答を検出するための微生物応答検出装置を含む、検水中の有害物質混入の有無を検出するための装置である。この装置では、試験流路に設けたサンプリング口から循環流路中の微生物懸濁液の一部を取り出し、検水を加えてさらに試験培養を行い、検出装置にて細胞応答、例えば、細胞数（吸光度により計測）、プロモーターアッセイの場合は蛍光や発色を計測し、検水の有害物質の有無を検出する。
【００４１】
好ましくは、循環流路（ａ）中では微生物懸濁液が一定の流速度で流れており、懸濁液排出口（ｂ）は、微生物懸濁液の所定量を恒常的に排出させ、培地供給槽（ｃ）は、懸濁液排出口から排出される懸濁液の所定量と同量の培地を恒常的に補給し、それにより循環流路中の微生物懸濁液の微生物濃度を定期的に調整する。そして、試験流路（ｄ）中では循環流路からの一定量の微生物懸濁液が一定の流速度で流れる。試験流路は循環流路からサンプリング口を介して分岐している。試験流路は通常、管状であるが、形状は何でも構わない。その他の特徴は循環流路と同様である。試験流路全体の長さは微生物応答検出のために充分な微生物移動時間を与える長さであり、通常、数分−数時間である。例えば、微生物応答時間が１時間、流速１ｃｍ／分の場合、長さは６０ｃｍ以上を確保する。
【００４２】
検水注入装置（ｅ）は、試験流路中を移動している対数増殖期の微生物に検水を負荷する。検水の負荷を間欠的に行う場合、検水の１回の負荷量は試験流路の径に依存するが、例えば径が１−３ｍｍであれば、通常、検水０．００１−５ｍｌを負荷する。検水の負荷を連続的に行う場合、検水の試験流路への通水量は、試験流路の径に依存するが、例えば径が１−３ｍｍであれば、通常、検水０．００１−５ｍｌ／分である。
【００４３】
試験流路には、試験培養にとって充分な、即ち検水中に有害物質が混入した場合に微生物応答の変化が引き起こされるに充分な移動時間を与える位置に微生物応答検出装置（ｆ）が配置される。試験培養は、検出すべき微生物の応答により異なるが、数１０分から数時間である。時間に応じて、試験流路の長さを調節する。
本発明の典型的な装置において、循環流路が環状である態様を図３に、循環流路が非環状である態様を図４に示す。
【００４４】
本発明の検出装置は、検水注入装置が連結していない点以外は同じ試験流路を対照流路としてさらに含むことができる。対照流路を備えた本発明の装置を図４に示す。微生物の応答を検出する場合、対照となる状態との差をとることにより、より正確な応答を把握することができる。そこで、検水を加えない対照区として別の試験流路を設け、検出区と同様にモニタリングする。
【００４５】
循環流路を複数用いることで、応答を検出する微生物を複数にすることができる。循環流路各々に、それに連結する懸濁液排出口、培地供給槽、試験流路、検水注入装置および微生物応答検出装置を配する。微生物応答検出装置は１台で必要に応じて循環流路を切り替えて用いることも可能である。このようにして、同一の検水について複数種類の微生物応答を計測し、その応答を比較することによって、検水中の有害物質を推定することが可能となる。例えば、微生物として酵母遺伝子ＹＬＬ０５７Ｃのプロモーターアッセイ細胞および酵母遺伝子ＹＢＲ０７２Ｗのプロモーターアッセイ細胞を循環させたそれぞれ２つの循環流路を用いた場合、検水にペンタクロロフェノールが含まれるとＹＬＬ０５７Ｃ細胞のみが応答し、２−４−ジクロロフェノールまたはｐ−ノニルフェノールが含まれるとＹＢＲ０７２Ｗ細胞のみが応答する。また、亜ヒ酸塩が検水に含まれると、ＹＬＬ０５７Ｃ細胞およびＹＢＲ０７２Ｗ細胞の両方が応答する。
【００４６】
（５）微生物を対数増殖期に保持させる方法
本発明はさらに別の態様として、培地中の微生物懸濁液を循環流路に循環させつつ微生物を増殖的に培養する、微生物を対数増殖期に保持させる方法、およびそのための装置に関する。この方法および装置の詳細は、上記した本発明の培養方法および培養装置と同様である。
微生物を対数増殖期に保持させれば、例えばレポーター遺伝子の産物が非常に安定であるレポータージーンアッセイを行う場合、培養時間や保存時間が長いと、遺伝子の誘導以前に高レベルのタンパク質が細胞内に蓄積するという問題がある。本発明の培養方法であれば、静止期（Ｇ０期）、老化、アポトーシスのような細胞の割合が少なく、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期の状態の細胞割合が多い微生物懸濁液が常に供給されるため、前培養、本培養というような対数増殖期の細胞を得るための手間、時間を省くことができるので、この点で特に有用である。
【００４７】
（６）対数増殖期の微生物を調製する方法
本発明はさらに別の態様として、培地中の微生物懸濁液を循環流路に循環させつつ微生物を増殖的に培養する、対数増殖期の微生物を調製する方法、およびそのための装置に関する。この方法および装置の詳細は、上記した本発明の培養方法および培養装置と同様である。
本発明の調製方法により得られる微生物は対数増殖期の状態にある。
【００４８】
（７）増殖的に培養している微生物を用いる、有害物質混入の有無を検出する方法およびそのための装置
本発明は別の態様として、検水中の有害物質混入の有無を検出する方法であって、増殖的に培養している微生物に対して検水を負荷し、負荷される検水に対する微生物応答を測定し、検水中に有害物質が混入した場合に引き起こされる微生物応答の変化を検出することを特徴とする方法、およびその方法を実施するための装置に関する。
上記の通り、対数増殖期に保持された微生物は、例えばレポーター遺伝子の産物が非常に安定であるレポータージーンアッセイに使用する場合、定常状態の細胞に比してレポーター遺伝子の発現の割合が低い。有害物質を負荷しない状態で遺伝子発現が高い場合は、有害物質負荷により遺伝子が誘導されても、その違いを検出するのが難しい。さらに、定常状態では有害物質感受性が低いと考えられる。これらのことから、対数増殖期を維持する培養機構を有するバイオアッセイ装置は有用であると考えられる。
【００４９】
対数増殖期を維持する培養機構は、本発明の循環流路を利用する上記方法を実施できる装置などである。
【００５０】
この態様に関連し、本発明は、ａ）増殖的に培養している微生物を供給できる培養機構を有する培養装置、ｂ）該培養装置から微生物を採取するための採取装置、ｃ）採取した微生物に検水を注入するための検水注入装置、およびｆ）検水が負荷された微生物の応答を検出するための微生物応答検出装置を含む、検水中の有害物質混入の有無を検出するための装置に関する。この装置は、検水を負荷されていない、増殖的に培養している微生物の微生物応答を検出する手段をさらに含むことができる。
【００５１】
【実施例】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
実施例１
酵母細胞の継続的培養
凍結保存した酵母ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＷ３０３株（ＡＴＣＣ２００１２３９）を選択培地（ＳＤ培地：ｙｅａｓｔｎｉｔｒｏｇｅｎｂａｓｅｗｉｔｈｏｕｔａｍｉｎｏａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ．０９１９−１５−３）＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ウラシル、ロイシン）にて２５℃において振盪培養し、定常状態になるまで時間、増殖させた。培養物に同じ選択培地を加え、ＯＤ６６０が０．５となるように希釈し、そのうち２０ｍｌを容量５０ｍｌのチューブに入れ、２５℃でさらに振盪培養した。倍加時間の３時間ごとに培養液の半分を廃棄して等量の上記選択培地を加え、これを繰り返した。その間、培養液のＯＤ６６０を経時的に計測した。得られた結果を図６に示す。
図６の結果は、倍加時間ごとに細胞懸濁液の１／２を排出し、等量の培地を供給することにより細胞懸濁液の濃度を定期的に調整すれば、細胞濃度を一定に保持できることを示している。
【００５２】
実施例２
生育の計測による毒性物質の検出
凍結保存した酵母ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＷ３０３株（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＡＴＣＣ２００１２３９）を選択培地（ＳＤ培地：ｙｅａｓｔｎｉｔｒｏｇｅｎｂａｓｅｗｉｔｈｏｕｔａｍｉｎｏａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ．０９１９−１５−３）＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ウラシル、ロイシン））にて２５℃において振盪培養することにより定常状態になるように増殖させた。
定常状態にある酵母を４℃にて１週間保存し、次いで上記同じ培地で１０倍希釈し、２５℃にて２時間、前培養を行った。その後、被検試料を添加しさらに４時間、２５℃にて培養した。これと同条件で化学物質を添加せずに培養して対照区とした。６００ｎｍの吸光度を測定することにより、細胞の増殖を計測した。化学物質の添加により、いずれも細胞増殖の阻害が確認された。
【表１】

【００５３】
以上の結果より、検水負荷の４時間後における循環流路中の検体の吸光度を測定することにより、検水中の有害物質の有無が検出できることが明らかとなった。
【００５４】
実施例３
レポーター・ジーン・アッセイによる有害物質の検出
１．酵母遺伝子ＹＬＬ０５７Ｃプロモーターアッセイ細胞作成
酵母遺伝子ＹＬＬ０５７Ｃのプロモーター配列を含むオリゴヌクレオチド（配列番号１）をＰＣＲにより増幅するためのプライマーを作成した。プライマーはプライマー設計用のソフトウェアであるＯｌｉｇｏ４．０−Ｓ，Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ_Ｉマッキントッシュ版を用いて設計し、アッパープライマーの塩基配列は
ＧＣＴＡＡＣＧＡＡＣＡＧＧＡＴＧＧＴＡＴＴＧＡ（配列番号２）
であり、ロウワープライマーの塩基配列は、
ＡＴＴＴＴＡＡＣＴＧＧＧＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴ（配列番号３）
とした。ＰＣＲはテンプレートとして酵母の染色体（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳ２８８Ｃ，Ｃａｔ．４０８０２，ＲｅｓｅｒｃｈＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を用い試薬は市販のキット（ＫＯＤＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ；コードＫＯＤ−１０１、Ｔｏｙｏｂｏ）を使用した。
【００５５】
使用するベクターは大腸菌と酵母の両方で複製されるＹＥｐ型シャトルベクターであるｐＹＥＳ２（ｐＹＥＳ２，Ｃａｔｎｏ：Ｖ８２５−２０，ＩｎｖｉｒｔｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）（Ｒ．Ｗ．オールド、Ｓ．Ｂ．プリムローズ遺伝子操作の原理原書第５版，培風館，ｐｐ．２３４−２６３，２０００））を用いた。また、マーカータンパク質ＧＦＰをコードするポリヌクレオチド（配列番号４）はベクターｐＱＢＩ６３（Ｃａｔｎｏ．５４−００８２，和光純薬工業（株））のＧＦＰの部分を用いた。まず、ｐＹＥＳ２の多重クローニング部位（ｍｕｌｔｉｐｌｅｃｌｏｎｉｎｇｓｉｔｅ）の中にＧＦＰのオリゴヌクレオチドを挿入したベクターを作成した。その後、ｐＹＥＳ２のＧＡＬ１プロモーターの部分を目的とする酵母遺伝子であるＹＬＬ０５７Ｃのプロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドで置換した。ＧＦＰおよびプロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドの挿入の操作は、適当な制限酵素を選択して行った。
【００５６】
ベクターで酵母を形質転換する手順を以下に示す。
１）酵母細胞Ｗ３０３を２００ｍｌのＳＤ培地でＯＤ６６０が０．５になるまで振とう培養する。
２）集菌して５ｍｌのＴＥ−ｂｕｆｆｅｒにけん濁する。
３）２．５Ｍのリチウムアセテイト２５０μＬを添加する。
４）３００μｌずつ分注し１０μｌのプラスミドベクターを添加し、３０℃３０分培養する。
５）７００μｌの５０％ＰＥＧ４０００を付加し、３０℃６０分振とう培養する。
６）ヒートショック（４２℃、５分）後、急冷する。
７）１Ｍソルビト−ルで２回洗浄する。
８）最小栄養培地で作成した寒天プレートに播種する。
形質転換の確認は選択培地（ＳＤ培地）＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ロイシン）により行った。選択培地の寒天プレートに生育したコロニーはさらに、アミノ酸の栄養要求性を確認した。
【００５７】
２．酵母遺伝子ＹＢＲ０７２Ｗのプロモーターアッセイ細胞作成
酵母遺伝子ＹＢＲ０７２Ｗのプロモーター配列を含むオリゴヌクレオチド（配列番号７）をＰＣＲにより増幅し、そのためのプライマーとして、アッパープライマー：
ＧＣＡＧＴＣＡＡＣＧＡＧＧＡＧＣＧＡＡＴＣＡＧ（配列番号５）、
ロウワープライマー：
ＧＴＴＡＡＴＴＴＧＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＴＴＧ（配列番号６）、を用いる以外は、上記１．と同様に処理し、目的の形質転換体を作成した。
【００５８】
３．生育の計測による毒性物質の検出
得られた形質転換体を選択培地（ＳＤ培地）＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ロイシン）にて２５℃において振盪培養することにより定常状態になるように増殖させた。
次いで、上記同じ培地で５００倍希釈し、前培養を２５℃にて１５時間行った。その後、被検試料を添加しさらに４時間培養した。これと同条件で化学物質を添加せずに培養して対照区とした。サンプルを採取し、フローサイトメトリー（ＥＰＩＣＳＸＬ：ベックマンコールター）で蛍光を計測した。化学物質を負荷しない場合の蛍光強度を予め測定し、その１．５倍以上の蛍光強度を有するものを蛍光検出有りとして＋と表示した。
【００５９】
【表２】

【００６０】
表２は、検水にペンタクロロフェノールが含まれるとＹＬＬ０５７Ｃ細胞のみが応答し、２−４−ジクロロフェノールまたはｐ−ノニルフェノールが含まれるとＹＢＲ０７２Ｗ細胞のみが応答し、そして検水に亜ヒ酸塩が含まれると、ＹＬＬ０５７Ｃ細胞およびＹＢＲ０７２Ｗ細胞の両方が応答することを示している。
これにより、複数のプロモーターアッセイ細胞の循環流路を用いることにより、化学物質の推定が可能となることが示された。
【００６１】
実施例４
培養条件がレポーター遺伝子の発現に及ぼす影響
実施例３にて調製した形質転換体を選択培地（ＳＤ培地）＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ロイシン）にて２５℃において振盪培養することにより定常状態になるように増殖させた。
定常状態の形質転換体を上記同じ培地で５００倍希釈し、前培養を２５℃にて１５時間行い対数増殖期とした細胞の蛍光をフローサイトメトリーで計測した。さらに、４８時間培養し定常状態としたものの蛍光を同様に計測した。定常状態の蛍光強度と対数増殖期の蛍光強度の比を求め、蛍光強度比とした。得られた結果を表３に示す。
【００６２】
【表３】
プロモーターアッセイ細胞蛍光強度比
ＹＬＬ０５７Ｃ１．５
ＹＢＲ０７２Ｗ２．３
【００６３】
表３の結果から、対数増殖期のように静止期（Ｇ０期）の細胞の割合が少なく、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期の細胞割合が多い状態の方が、定常期のように静止期（Ｇ０期）の細胞が多いものより、レポーター遺伝子の発現の割合が低いことがわかる。有害物質を負荷しない状態でレポーター遺伝子の発現が高い場合は、有害物質負荷によりレポーター遺伝子が誘導されても、その違いを検出するのが難しい。さらに、定常状態では有害物質感受性が低いと考えられる。これらのことから、対数増殖期を維持する培養機構を有するバイオアッセイ装置は有用であると考えられる。
【００６４】
【発明の効果】
本発明の培養方法および培養装置により奏される効果を以下に列挙する。
１．通常、微生物の継代は、培養液を無菌的に培地で希釈する等の煩雑な手作業を伴う。しかし、本発明では、自動的に懸濁液を排出し自動的に培地を供給させることにより自動的な微生物の培養、継代が可能となる。よって、上記のような煩雑手作業が必要なくなる。例えば、再生医療や通常の臨床診断、あるいは研究室や実験室おける培養または継代作業に好適に使用できる。
２．通常の微生物の保存法として凍結もしくは凍結乾燥処理が挙げられる。しかし、これらの処理により致死的な損傷を受け、再調製後の生存率が著しく悪くなるような微生物、例えば動物細胞等は、凍結もしくは凍結乾燥処理が出来ない。そのような微生物では継代培養による維持が必要である。本発明を用いれば、これを簡便に行うことができ、微生物の保存的培養の観点からも本発明は有用である。
【００６５】
本発明の検出方法および検出装置により奏される効果を以下に列挙する。
１．従来の微生物固定膜は他の微生物混入、有害物質による過度な障害により微生物の損傷を受けた場合、微生物固定膜の交換の必要があった。本発明では、循環流路を用いることで微生物が増殖的に培養され、膜交換は不要である。
２．本発明では、循環流路から分岐した試験流路を介して検出装置へ微生物を供給し、その微生物は試験終了後排出される。よって、酸素消費量等の可逆的な微生物応答の測定のみならず、微生物の死滅を伴う生細胞数および細胞を破壊して測定する細胞内の酵素活性などの不可逆的な微生物応答の計測をも用いることができる。また、細胞を膜に固定していない為、個々の細胞をフローサイトメトリーで計測するという方法を用いることも可能となる。
３．微生物を膜に固定する方法では、バイオセンサとしての感受性が高い種類の微生物だとしても、活性を維持し難い種類のものは使用できない。しかし、本発明では、このように比較的短命もしくは脆弱な微生物、例えば血球細胞のような動物細胞の樹立株をも対象微生物として用いることが可能である。
４．微生物固定膜の場合は繰り返しまたは連続的に膜上の細胞をモニタするので、生細胞数および細胞の活性等の細胞状態をある程度一定に保つ必要がある。しかし、本発明の場合は細胞状態を一定に保つ必要が無いので、細胞数の増加を計測するなどの、微生物応答の測定において極めて標準的な計測法を用いることも可能である。
５．プロモーターアッセイを用いる場合、マーカー蛋白質が細胞内に蓄積されてベースが上がってしまうという問題がある。本発明により、常に対数増殖期の若い細胞の供給が可能となり、このような問題が解決される。
６．レポーター遺伝子の産物が安定であるレポータージーンアッセイを行う場合、培養時間や保存時間が長いと、遺伝子の誘導以前に高レベルのタンパク質が細胞内に蓄積するという問題がある。しかし、本発明のように自動的に継代培養を行う方法であれば、常に短い培養時間の細胞を供給できるため、細胞内蓄積の問題が回避され、さらに前準備の手間、時間を省くことができる。
【００６６】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ａ）循環流路、ｂ）懸濁液排出口、ｃ）培地供給槽を含む、微生物を培養するための装置の概念図である。
【図２】コントローラをさらに備えた本発明の培養装置である。
【図３】ａ）環状の循環流路、ｂ）懸濁液排出口、ｃ）培地供給槽、ｄ）試験流路、ｅ）検水注入装置、およびｆ）微生物応答検出装置を含む、検水中の有害物質混入の有無を検出するための装置の概念図である。
【図４】ａ）非環状の循環流路、ｂ）懸濁液排出口、ｃ）培地供給槽、ｄ）試験流路、ｅ）検水注入装置、およびｆ）微生物応答検出装置を含む、検水中の有害物質混入の有無を検出するための装置の概念図である。
【図５】対照流路をさらに備えた本発明の検出装置である。
【図６】酵母Ｗ３０３株の培養液の半分を倍加時間ごとに廃棄し、等量の選択培地を加える操作を繰り返し、得られた培養液のＯＤ６６０の経時的グラフである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a bioassay method and apparatus for culturing microorganisms and conducting water quality tests.
[0002]
[Prior art and solutions]
Under ideal culture conditions, microorganisms, especially bacteria, increase in number in proportion to time. The change in cell number is represented by a growth curve and is usually indicated in three phases: a growth induction phase, a logarithmic growth phase and a stationary phase. The growth induction period is the period before the growth is resumed by adapting to the new environment, the logarithmic growth period is the period when the bacteria are growing at a constant growth rate, and the growth ability of the bacteria is exerted to the maximum, and The stationary phase is a period in which the growth of bacteria almost stops, and the number of bacteria that die and the number of bacteria that divide in the population seems to be generally balanced at almost the same ratio.
Various methods and devices for culturing microorganisms have been reported so far (Patent Documents 1, 2, and 3), but at a specific time, the time when cells proliferate from the end of the growth induction phase to the beginning of the stationary phase, particularly, What culture | cultivates, maintaining a logarithmic growth phase is not known until now. An apparatus for culturing algae in a closed system is also known (Patent Document 4). However, this apparatus is not suitable for a specific time, and is a method of culturing algae exclusively in a culture tank.
On the other hand, a bioassay device using a microorganism as an indicator for inspecting water quality of environmental substances such as rivers and lakes, sewage, and chemical substances contained in wastewater uses a microorganism-immobilized membrane (Patent Document 5). , 6 and 7). However, the microorganism fixed membrane has many disadvantages, such as the necessity of replacing the microorganism fixed membrane when the period over which the response of the microorganism can be maintained is exceeded. The most susceptible to the external environment is the logarithmic growth phase, which includes cells at all stages of the cell cycle.Thus, a culture method that can maintain the logarithmic growth state for a long period of time can be used effectively as a microorganism for water quality testing. It is thought to work.
[0003]
[Patent Document 1]
JP-A-47-14382
[Patent Document 2]
JP-A-63-141576
[Patent Document 3]
JP-A-7-8260
[Patent Document 4]
JP-A-1-291784
[Patent Document 5]
JP-A-7-63725
[Patent Document 6]
JP-A-11-37969
[Patent Document 7]
JP 2000-206077
[0004]
[Problem solving means]
The present inventors have now found that the microorganism can be maintained in the logarithmic growth phase by culturing the microorganism suspension in the medium while circulating the suspension in the circulation channel. Then, they have found that this culture method can be applied to a bioassay for performing a water quality test without using a microorganism-fixed membrane, and completed the present invention.
[0005]
That is, the present invention
(1) a method for culturing microorganisms, which comprises culturing microorganisms proliferatively while circulating a microorganism suspension in a culture medium through a circulation channel;
Specifically, by discharging a predetermined amount of the microbial suspension circulating in the circulation channel and replenishing the same amount of medium as the predetermined amount of the discharged suspension, the microorganism in the circulation channel is replenished. The method of the present invention for periodically adjusting the concentration of microorganisms in the suspension and proliferating the microorganisms, or
By constantly discharging a predetermined amount of the microbial suspension circulating in the circulation flow path and constantly replenishing the same amount of medium as the predetermined amount of the discharged suspension, The method of the present invention, wherein the microorganisms are proliferatively cultured while maintaining the microorganism concentration of the microorganism suspension constant;
More specifically, the method of the invention wherein the circulation is reversed in a certain direction or the direction of the circulation at predetermined time intervals;
[0006]
(2) a) a circulation channel through which the microbial suspension in the medium circulates; b) a suspension outlet connected to the circulation channel; c) a medium supply tank connected to the circulation channel. A device for culturing microorganisms; preferably a device of the present invention for culturing microorganisms productively;
Specifically, a) the microbial suspension can flow in the circulation channel in a certain direction or reversely at predetermined time intervals,
b) the suspension outlet discharges a predetermined amount of the microbial suspension,
c) The medium supply tank replenishes the same amount of medium as the predetermined amount of the suspension discharged from the suspension outlet, thereby periodically adjusting the concentration of microorganisms in the microorganism suspension in the circulation channel. Device of the present invention;
More specifically, a) the microorganism suspension is flowing at a constant flow velocity in the circulation channel;
b) The suspension outlet constantly discharges a predetermined amount of the microbial suspension,
c) The medium supply tank constantly replenishes the same amount of medium as the predetermined amount of the suspension discharged from the suspension outlet, thereby keeping the concentration of microorganisms in the microorganism suspension in the circulation channel constant. A device of the present invention for culturing microorganisms while keeping the microorganisms;
Preferably, d) a device according to the invention, further comprising a sampling port for removing a part of the microbial suspension in the circulation channel;
[0007]
(3) A method for detecting the presence or absence of contamination with harmful substances in a test water, which collects microorganisms moving in a circulation channel, applies a test to the collected microorganisms, and applies the test water Measuring a microbial response to harmful substances in the test water, and detecting a change in the microbial response caused by the contamination of the test water with a harmful substance;
Preferably, a method in which microorganisms moving in the circulation channel are cultured by the method of the present invention or the apparatus of the present invention;
[0008]
(4) a) a circulation channel through which the microbial suspension in the medium circulates; b) a suspension outlet connected to the circulation channel; c) a medium supply tank connected to the circulation channel; d. A) a test channel branched from the circulation channel, through which a certain amount of microbial suspension flows, e) a sample injection device for injecting a sample into the test channel, and f) a sample loaded. A device for detecting the presence or absence of harmful substances in a test water, including a microbial response detection device for detecting a response of a microorganism flowing in the test channel;
Specifically, a) the microbial suspension can flow in the circulation channel in a certain direction or reversely at predetermined time intervals,
b) the suspension outlet discharges a predetermined amount of the microbial suspension,
c) The culture medium supply tank replenishes the same amount of culture medium as the predetermined amount of the suspension discharged from the suspension discharge port, thereby periodically adjusting the concentration of microorganisms in the microorganism suspension in the circulation channel. And
d) a certain amount of microbial suspension flowing from the circulation channel in the test channel;
e) The test sample injection device loads a test sample on the logarithmically growing microorganisms moving in the test channel,
f) the device of the present invention, wherein the device for detecting a microbial response is arranged at a position that gives sufficient transit time to cause a change in the microbial response when a harmful substance is mixed in the test water;
More specifically, a) the microorganism suspension is flowing at a constant flow velocity in the circulation channel;
b) The suspension outlet constantly discharges a predetermined amount of the microbial suspension,
c) The medium supply tank constantly replenishes the same amount of medium as the predetermined amount of the suspension discharged from the suspension outlet, thereby periodically controlling the concentration of microorganisms in the microbial suspension in the circulation channel. To adjust,
d) In the test channel, a certain amount of microbial suspension from the circulation channel is flowing at a constant flow velocity,
e) The test sample injection device loads a test sample on the logarithmically growing microorganisms moving in the test channel,
f) the device of the present invention, wherein the device for detecting a microbial response is arranged at a position that gives sufficient transit time to cause a change in the microbial response when a harmful substance is mixed in the test water;
Preferably, the device of the present invention further comprising the same test channel as a control channel except that the sample injection device is not connected;
[0009]
(5) a method of culturing the microorganisms proliferatively while circulating the microorganism suspension in the medium through the circulation channel, and maintaining the microorganisms in a logarithmic growth phase;
[0010]
(6) a method for preparing a logarithmically growing microorganism, wherein the microorganism is proliferatively cultured while circulating the microorganism suspension in the medium through a circulation channel; and
[0011]
(7) A method for detecting the presence or absence of contamination of harmful substances in a test water, which comprises applying a test water to microorganisms cultured in a proliferative manner, measuring the microbial response to the loaded test water, Detecting a change in the microbial response caused by contamination with harmful substances, and
a) a culturing device having a culturing mechanism capable of supplying microorganisms cultured in a proliferative manner; b) a collecting device for collecting microorganisms from the culturing device; c) a water sample for injecting a test water into the collected microorganisms. An injection device, and f) a device for detecting the presence or absence of contamination with harmful substances in the test water, the device including a microbial response detection device for detecting the response of the microorganism loaded with the water test.
[0012]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
(1) Culture method of microorganism
As a first aspect, the present invention relates to a microorganism culturing method for culturing microorganisms proliferating while circulating a microorganism suspension in a culture medium through a circulation channel.
The microorganism culturing method of the present invention is characterized in that a proliferative culture is performed while circulating a microorganism suspension. In the present invention, “proliferative culture” means culturing a microorganism while maintaining the logarithmic growth phase of a growth curve. When a microorganism is diluted and cultured in a test tube or in a closed system and a growth curve is drawn, a growth induction period having a slow growth rate appears, and a logarithmic growth period in which the growth speed is gradually increased and the growth speed is maximized. However, when the number of cells increases too much, the growth rate starts to decrease, and the cell enters a stationary phase of the growth curve in which the number of cells does not increase any more. The `` proliferative culture '' of the present invention is not in a stationary phase in a growth curve, but a microorganism grows at a constant growth rate, and the growth ability of the microorganism is exerted to the maximum and is actively active. This means culturing while maintaining the state.
[0013]
In the present invention, the “circulation channel” is a closed channel through which the microorganism suspension flows. As described below, the circulation channel of the present invention is a closed system, but can discharge a predetermined amount of suspension and can supply a predetermined amount of medium. Therefore, the closed system of the "circulation channel" in the present invention, once the microorganisms are supplied to the circulation channel for a predetermined purpose, without supplying new microorganisms during the period in which the microorganisms can be subcultured It means to circulate the flow path. The culture using the culture tank is also a closed system, but the culture using the circulation flow path of the present invention is different from the culture using the culture tank in that the culture is performed proliferatively in the flow path. Culturing in a flow channel is more advantageous than culturing in a culture tank in that the medium can be exchanged efficiently by a simple method / apparatus. In addition, when culturing aerobic bacteria, a complicated technique of separately providing a gas phase and a liquid phase and shaking in a culture tank cultivation in order to set aerobic culturing conditions and a device for shaking are required. However, aerobic cultivation is possible by using a simple method of making the circulation channel gas-permeable in the cultivation using the circulation channel. Furthermore, since the circulation flow path is a closed system, only the sterilization of the installation / replacement of the culture medium supply layer and the supply of the initial liquid culture medium and microorganisms is performed. . Here, aseptic culture means cultivation without unnecessary bacteria.
The circulation channel may be annular or non-annular.
[0014]
Microorganisms suitable for the culture method of the present invention are not particularly limited as long as they are cells or microorganisms that can be subcultured in suspension. For example, naturally occurring wild-type or wild-type strains having a large or infinite number of passages, such as animal cells derived from humans, mice and other mammals, and established animal cell lines; cells such as fish and nematodes; insect cells; Bacterial cells such as Escherichia coli; viruses; protozoa; and micro metazoans (nematodes, daphnia). A wild strain is a naturally occurring, non-recombinant microorganism. A wild-type strain is a microorganism that does not touch the gene of interest. Established strains include those that can be subcultured with animal cells, for example, those that have not been recombined, such as cancer cells. In the present invention, as long as the cells can be cultured in the circulation channel, there is no special significance in distinguishing the cells. Therefore, the microorganism to be cultured includes animal cells.
[0015]
The medium used in the present invention varies depending on the microorganism used, and when the microorganism is yeast, it is usually YPD medium (1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% glucose) or SD medium (yeast nitrogen base with amino acids ( Difco. 0919-15-3)) to which glucose and amino acids are added. The medium to be supplemented is a medium containing nutrients suitable for microbial growth, adjusted in pH, and sterilized as necessary or free from various bacteria. For example, those obtained after filtering the waste liquid from the suspension outlet to remove microorganisms, and those whose pH is adjusted to be optimal for growth are included. The medium suitable for microbial growth is described in detail, for example, in Ryuichi Sudo: Environmental Microorganism Experiment Method, Kodansha, 1999, pp20, pp262-273.
[0016]
In order to carry out the culture method of the present invention, first, microorganisms are supplied to a circulation channel. In the present invention, a certain amount of microorganisms is supplied to the circulation channel at one time. The microorganisms to be supplied may be any of those stored frozen, those stored freeze-dried, those stored refrigerated, and those stored at room temperature.
[0017]
Since the circulation channel of the present invention is a closed system, if the culture is continued while circulating, the cell concentration will increase and the growth curve will be in a stationary state. Therefore, in the present invention, preferably, a predetermined amount of the microorganism suspension circulating in the circulation channel is discharged, and a medium having the same amount as the predetermined amount of the discharged suspension is supplied. By performing this periodically, the concentration of microorganisms in the microorganism suspension in the circulation channel is kept constant. This is the meaning of “regulating the microorganism concentration periodically” in the present invention.
[0018]
The frequency of the “periodic” and the predetermined amount of the suspension to be discharged and the replenishment amount of the medium are determined by the increase amount of the microorganisms in the circulation channel. For example, when the number of microorganisms has doubled, half of the microorganism suspension in the circulation channel is discharged, and the same amount of medium is added. When the number of cells becomes 10 times, 9/10 of the microorganism suspension in the circulation channel is discharged, and the same amount of medium is added. If the culture conditions such as temperature and culture medium are constant, the doubling time inherent to the microorganism species can be predicted to some extent. The discharge amount of the microorganism suspension and the supply amount of the culture medium can be determined from the predicted value and the length, the inner diameter, and the flow velocity of the circulation channel. For example, when the doubling time of a certain microorganism is 1 hour, the flow path length of the circulation flow path is 60 cm, the inner diameter is 1 mm, and the flow rate is 0.0785 ml / min. , And supply an equivalent amount of medium. The concentration of microorganisms can be monitored by a sensor that measures the absorbance, oxygen consumption, and the like of the circulating microorganism suspension, and the discharge amount and supply amount can be determined based on the monitored values.
[0019]
The discharge of the microbial suspension and the replenishment of the medium can be performed "constantly". Here, “constant” means that the air is constantly circulating in the circulation channel. When constantly discharging the microorganism suspension and replenishing the medium, the medium to be replenished is preferably one after filtering the waste liquid from the suspension outlet and removing the microorganisms.
[0020]
More specifically, for example, after performing a preculture for restoring the cell activity of a dormant state to yeast cells Saccharomyces cerevisiae W303 (ATCC 201239), the cells are diluted with a medium, shaken at 25 ° C. at OD660 = 0.01. After culturing, the OD660 becomes 2.500 after 24 hours, and the cell number increases about 250-fold. From this, it is calculated that the doubling time of the yeast cell W303 is about 3 hours. Therefore, when this yeast cell is used as a microorganism, if the discharge of the suspension and the supply of the medium are controlled so that 1/2 of the cell suspension is replaced with the medium every three hours of the doubling time, the system becomes: The cell concentration is always kept constant, and the cells can always maintain the logarithmic growth phase.
[0021]
In the method of the present invention, it is important to keep the concentration of microorganisms in the circulation channel constant, but any means may be used. A preferred microorganism concentration is a concentration that maintains logarithmic growth, for example, OD660 of about 0.1-3 in the case of yeast cell W303. In order to maintain a constant cell concentration, the cell concentration in the flow channel is monitored, such as by constantly measuring OD660.
[0022]
The direction of circulation of the microbial suspension in the circulation channel may be in a fixed direction or may be reversed at predetermined time intervals. The microbial suspension in the circulation channel need not always be flowing, but can be interrupted intermittently and then flowed forward or backward at predetermined time intervals. By reversing the flow, a turbulent flow is generated in the flow channel, and the effect of preventing the sedimentation of cells can be expected due to the stirring action of the turbulent flow. In this case, the circulation channel can be non-annular. A pump is used for circulation of the microorganism suspension as necessary.
[0023]
The conditions for circulating and / or culturing the microorganisms in the circulation channel vary depending on the microorganisms used. In general, it is preferable that the cells be circulated while being stirred so that the cells are uniformly distributed, in addition to the constant temperature. This can be achieved by installing a baffle plate in the flow path or by vibrating the flow path itself. The temperature is a temperature suitable for the growth of microorganisms, preferably 25-30 ° C for yeast, 30-37 ° C for Escherichia coli, and 37 ° C for animal cells. The flow rate of the suspension in the circulation varies depending on the diameter of the channel.
[0024]
Circulation conditions also vary depending on whether the microorganism used is anaerobic or aerobic. When aerobic cultivation is required, a gas-permeable tube is used as the material of the circulation channel, or a culture solution mixed with compressed air is jetted through a nozzle to the perforated plate to dissolve oxygen efficiently (registered 11332673). ) Or a method of exchanging gas with a hollow fiber passed through a flow path. When anaerobic cultivation is necessary, oxygen in the medium in the medium supply tank is removed, and a gas-impermeable tube is used. In addition, the entire operation is installed in the anaerobic chamber.
[0025]
(2) Microorganism culture device
As another aspect, the present invention relates to an apparatus for performing the culture method of the present invention. In particular, it includes a circulation channel through which the microorganism suspension in the medium circulates, b) a suspension outlet connected to the circulation channel, c) a medium supply tank connected to the circulation channel, A device for culturing microorganisms, preferably d) a device further provided with a sampling port for removing a part of the microorganism suspension in the circulation channel when the microorganisms are required.
[0026]
"In a circulation flow path, the microorganism suspension can flow in a certain direction or reverse at predetermined time intervals." Or reverse at predetermined time intervals, wherein the microbial suspension in the circulation channel need not be constantly flowing, but may be interrupted intermittently and then It can flow forward or backward at time intervals.
[0027]
The form of the circulation channel may be annular or non-annular. The circulation channel is usually tubular, but may have any shape. In the case of a tubular shape, the inner diameter is usually several tens μm to several mm, usually 1 mm, and the flow path length of the entire closed system is several cm to several m, usually 2 m. A microcircuit having a width of several tens to several hundreds of μm called “μTAS (Lab-on-a-chip)” can be used (Chemical Industry Vol. 52, No. 11, 2001.11. P.p1-51). ).
[0028]
The channel may be made of any material suitable for culturing microorganisms, but silicon, PTFE, and PFA are preferably used. Further, assuming a plurality of types of microorganism culture, there may be a plurality of flow paths. Further, in consideration of the case where the type of microorganism to be used is changed, it is preferable that the circulation channel has a disposable structure in which the entire channel can be replaced.
[0029]
The suspension outlet is equipped with a valve that can vary the flow rate. The medium supply tank is connected to the circulation channel via the medium inlet. The medium inlet is provided with a valve capable of changing the flow rate. The outlet and inlet valves regulate and control the amount of discharge and supply, which are determined based on the rate of increase of the microorganisms predicted by the microorganism species, flow path length, flow rate and temperature. Such adjustment and control can be performed using a controller that also serves as a valve. The control can also be performed based on the monitoring of the concentration of microorganisms by a sensor that measures the absorbance, oxygen consumption, and the like in the circulating microorganism suspension, and based on the values. The valve used here is preferably one that can be opened and closed and does not flow backward. Pumps are used for discharge and injection as necessary.
The apparatus of the present invention can further include a sampling port for removing a part of the microorganism suspension in the circulation channel when the microorganism is required.
FIGS. 1 and 2 show an apparatus having a circular circulation channel in the culture apparatus of the present invention.
[0030]
(3) Method to detect the presence of harmful substances
As still another aspect of the present invention, there is provided a method for detecting the presence or absence of harmful substance contamination in a test water, comprising collecting microorganisms moving in a circulation channel, and loading the collected microorganisms with a water sample. A method of measuring a microbial response to a test water to be loaded, and detecting a change in a microbial response caused when a harmful substance is mixed in the test water. In short, this method is to grow the microorganisms circulating in the circulation channel by adding the test water to be subjected to the water quality test, and by measuring and comparing the responses of the microorganisms before and after the test load, It detects the presence or absence of harmful substances in the test water. This enables a bioassay for performing a water quality test without using a microorganism-immobilized membrane.
[0031]
In the present invention, the term "sample" refers to sample water supplied from environmental water such as rivers and lakes, sewage, and wastewater. These water samples are free of harmful substances and are always required to be tested for water quality. It is.
[0032]
The “test water load” is performed on the collected microorganisms by collecting the microorganisms moving in the circulation channel. The microorganisms used here are preferably those cultured by the method or apparatus of the present invention. In the present invention, the “water detection load” may be intermittent or continuous. When the sample is intermittently loaded, the sample may be sample water collected from different locations or sample water collected from the same location at different times. When the "load of the water sample" is performed continuously, the present invention enables the water quality test of the water sample over time. Therefore, in this aspect, the present invention is a method for monitoring the presence or absence of contamination with harmful substances in a test water over time, wherein microorganisms moving in the circulation channel are constantly collected, and the collected microorganisms are collected. The method is characterized by continuously loading the test sample, measuring the microbial response to the sample test, and detecting the change in the microbial response caused when harmful substances are mixed in the test sample over time. Provide a method. Here, the water quality test over time can be arbitrarily performed for a time period to be monitored. It is usually from hours to days or even months. Basically, the monitoring time depends on the responsiveness of the microorganism.
In the detection method of the present invention, the microorganism used for measuring the microorganism response is discharged as it is.
[0033]
In the present invention, the term "microbial response" refers to the number of microbial cells, the number of viable cells, the amount of respiration, the amount of ATP, and the like in the case of a naturally occurring wild type or wild type strain. It can also be the mRNA level of a gene that fluctuates in the presence of a harmful substance. mRNA levels were determined by Northern blotting (Nobukun Ogata, Hiroshi Nojima: Genetic Engineering Keyword Book Revised 2nd Edition, Yodosha, 2000, pp 299-301), reverse transcription PCR (RT-PCR) (Yusaku Nakabetsu, etc.) It can be measured by Cell Engineering Separate Volume Tips Series Revised PCR Tips, Shujunsha, 1999, pp25-43).
Here, in the case of yeast cells, “genes that fluctuate in the presence of harmful substances” are disclosed in public databases (eg, MIPS: Munich Information Center for Protein Sequence in Germany, SGD: Saccharomyces Genome Database in the United States). The yeast genes can be selected appropriately from the available yeast genes, and these can be known via the Internet. Preferred genes are mitochondrial proteins, gene repair proteins, energy proteins, transport facilitating proteins, stress proteins, metabolic proteins, detoxicating proteins and genes of unknown function. For example, YLR303W, YLL057C, YOR382W, YCR102C, YKL071W, and the like.
[0034]
The microorganism used in the present invention also includes a recombinant, that is, a transformant of the above-described naturally occurring cell. The transformant used in the present invention includes a polynucleotide construct obtained by operably linking a polynucleotide encoding a marker protein to the polynucleotide sequence of the promoter of the “gene that fluctuates in the presence of a harmful substance”. It can be prepared by introducing a vector into the naturally occurring cells described above. Methods for operably linking a polynucleotide encoding a protein to a promoter are well known (for example, RW Old, SB Primrose, Principles of Genetic Manipulation, 5th ed., Baifukan, pp. 138-165, pp. 139-163). 234-263, 2000). For example, in the case of yeast, the sequence of the promoter is disclosed in a public database (SCPD: The Promoter Data of Saccharomyces cerevisiae). Examples of marker proteins include GFP (Green Fluorescence Protein) (Heim, R., Cubitt, AB and Tsien, RY (1995) Nature 373, 663-664; Heim, R., Prasher DC. An. Tsien, RY (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., 91, 12501-12504; Warg, S. and Hazerigg, T. (1994) Nature 639, 400-403; Yuvan, DC and. Michel-Beyerle, ME (1996) Nature Biotechnology 14 1219-1220; Chalffie, M., Tu, Y., Euskiren, G .; Ward, WW and Prasher, DC (1994) Science 263, 802-805), β-galactosidase (Canestro C, Albalat R, Escriva H, Gonzalez-Duartai satogenes auxiogensagos engai satogena giogens auxiogens auxiogens auxiogens auxiogens auxiogens auxiogens auxiegos). a useful histochemical marker for the digestive system. Dev Genes Evol 2001 Mar 211 (3): 154-6), luciferase (Arch Toxicol 2002Jun; Nin vitro reporter gene assay and an in vivo transgenic zebrafish assay. Schreurs R, Lanser P, Seinen W, Van Der Burg T., and acetyltransferase. , A simplified method for large scale quantification of transcriptional activity and it's use in studies of sternoids. Zhang S, Lu J, Iyama K, Lo SC, Danielsen M. ) And the like.
[0035]
For preparing a vector, for example, in the case of a yeast cell, a plasmid capable of replicating in yeast is selected, a polynucleotide encoding a marker protein is inserted into the plasmid, and then a polynucleotide containing a promoter sequence is inserted into an upstream portion of the marker gene. It can be done by doing.
Transformants can be prepared by well-known techniques. For example, a method for transforming yeast cells is described in Kaiser C, Michaelis S, Mitchell A: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual 1994 edition (Cold Spring Harbor Laboratory.). 133-134, 1994.
[0036]
When a transformant is used, the "microbial response" used in the present invention is the expression level of the marker protein. The expression level of the marker protein can be obtained by pulverizing the transformant to obtain a protein extract and measuring the amount of the marker protein in the liquid. For example, when the marker protein is GFP, the amount of fluorescence of the protein extract is measured by a fluorescence spectrophotometer. In addition, the expression level of the marker protein can be directly measured without crushing the transformant by image processing using a fluorescence microscope or laser microscope, measurement using flow cytometry, measurement using evanescent light, and detection using a colorimeter. In some cases, fluorescence (GFP) or color development (β-gal) of cells can be measured. Preferred transformants are yeast which have been transformed with a vector comprising a polynucleotide operably linked to a yeast gene promoter with a polynucleotide encoding a marker protein, or a chromosomal ORF with a polynucleotide encoding a marker protein. Yeast that has been transformed to replace, more preferably, the yeast gene is a mitochondrial protein, a gene repair system protein, an energy system protein, a transport promoting protein, a stress protein, a metabolic system protein, a detoxifying protein and It is selected from genes whose functions are unknown.
[0037]
In the detection method of the present invention, a change in microbial response caused when a harmful substance is mixed in the test water is detected. When harmful substances are present in the test water, when microorganisms collected from the circulation channel come into contact with the test water, they are affected by growth inhibition, respiratory volume reduction, and the like. In addition, when the microorganism is recombinant, expression of the reporter gene occurs.
[0038]
In the present invention, as described above, microorganisms are collected from the circulation channel and discharged as they are. Therefore, the "microbial response" that can be measured in the present invention includes not only a reversible response such as oxygen consumption, but also an irreversible response such as the number of viable cells accompanying the death of microorganisms and the enzyme activity in cells measured by destroying cells Response is also available.
[0039]
When the microorganisms supplied to the circulation channel are cryopreserved, freeze-dried, or refrigerated, the microorganisms are in a dormant state. Therefore, in the present invention, preferably, before loading the test sample, the microorganisms collected from the circulation channel are grown and cultured in the circulation channel for a certain period of time, thereby pre-culturing to recover the activity of the dormant microorganism. After that, test water is loaded and test culture is performed. In the pre-culture, in order to increase the sensitivity of the microorganism to chemical substances, it is desirable to set the logarithmic growth phase, which includes cells in all stages of the cell cycle, as much as possible. In the pre-culture, the microorganisms circulating in the circulation channel are discharged in a predetermined amount, and the culture is diluted by supplying a culture medium, whereby the temperature and time are controlled so that the microorganisms enter the logarithmic growth phase. Specifically, in the case of yeast, the conditions for the pre-culture are 25-30 ° C. for 2 hours to more than 10 hours. The test cultivation takes several tens of minutes to several hours, depending on the response of the microorganism to be detected.
[0040]
(4) Equipment for detecting the presence of harmful substances
The present invention provides, as yet another aspect, an apparatus for performing the detection method of the present invention. In detail, a) a circulation channel through which the microbial suspension in the medium circulates, b) a suspension outlet connected to the circulation channel, c) a medium supply tank connected to the circulation channel, d) a test flow path branched from the circulation flow path, through which a certain amount of microorganism suspension flows, e) a test water injection device for injecting a test water into the test flow path, and f) a test water load. Further, it is a device for detecting the presence or absence of harmful substance contamination in the test water, including a microbial response detection device for detecting a response of a microorganism flowing in the test channel. In this device, a part of the microbial suspension in the circulation channel is taken out from a sampling port provided in the test channel, a test sample is added thereto, and test culture is further performed. (Measured by absorbance) In the case of a promoter assay, fluorescence or color development is measured to detect the presence or absence of harmful substances in the sample.
[0041]
Preferably, the microbial suspension is flowing at a constant flow velocity in the circulation channel (a), and the suspension outlet (b) constantly discharges a predetermined amount of the microbial suspension. The supply tank (c) constantly replenishes the same amount of medium as the predetermined amount of the suspension discharged from the suspension discharge port, thereby periodically controlling the concentration of microorganisms in the microorganism suspension in the circulation channel. To adjust. Then, in the test channel (d), a certain amount of the microorganism suspension from the circulation channel flows at a constant flow velocity. The test channel branches off from the circulation channel via a sampling port. The test channel is usually tubular, but can be of any shape. Other features are the same as those of the circulation channel. The length of the entire test channel is a length that provides sufficient microbial migration time for detecting a microbial response, and is usually several minutes to several hours. For example, if the microorganism response time is 1 hour and the flow rate is 1 cm / min, the length should be 60 cm or more.
[0042]
The test water injection device (e) applies a test water to the logarithmically growing microorganisms moving in the test channel. When the load of the test water is intermittently performed, the amount of one load of the test water depends on the diameter of the test channel. For example, if the diameter is 1-3 mm, the test water is usually 0.001-5 ml. Load. When the load of the test water is continuously applied, the flow rate of the test water through the test flow path depends on the diameter of the test flow path. -5 ml / min.
[0043]
A microbial response detection device (f) is arranged in the test channel at a position sufficient for test culture, that is, a position that gives a sufficient transit time to cause a change in microbial response when a harmful substance is mixed in the test water. . The test cultivation takes several tens of minutes to several hours, depending on the response of the microorganism to be detected. Adjust the length of the test channel according to the time.
In a typical apparatus of the present invention, FIG. 3 shows an embodiment in which the circulation channel is annular, and FIG. 4 shows an embodiment in which the circulation channel is non-annular.
[0044]
The detection device of the present invention may further include the same test channel as a control channel except that the sample injection device is not connected. The device according to the invention with a control channel is shown in FIG. When detecting a response of a microorganism, a more accurate response can be grasped by taking a difference from a control state. Therefore, another test channel is provided as a control section to which no water sample is added, and monitoring is performed in the same manner as the detection section.
[0045]
By using a plurality of circulation channels, a plurality of microorganisms can be detected for response. Each of the circulation channels is provided with a suspension outlet, a medium supply tank, a test channel, a test water injection device, and a microorganism response detection device connected thereto. A single microbial response detection device can be used by switching the circulation flow path as needed. In this way, it is possible to estimate a harmful substance in the sample by measuring a plurality of types of microbial responses for the same sample and comparing the responses. For example, when two circulation channels are used, each of which circulates a yeast gene YLL057C promoter assay cell and a yeast gene YBR072W promoter assay cell as microorganisms, when pentachlorophenol is contained in the test sample, only the YLL057C cell responds. , 2-4-dichlorophenol or p-nonylphenol, only YBR072W cells respond. Also, when arsenite is included in the test, both YLL057C cells and YBR072W cells respond.
[0046]
(5) Method for keeping microorganisms in logarithmic growth phase
As yet another aspect, the present invention relates to a method for maintaining a microorganism in a logarithmic growth phase, wherein the microorganism is proliferatively cultured while circulating the microorganism suspension in a culture medium through a circulation channel, and an apparatus therefor. The details of this method and apparatus are the same as those of the above-described culture method and culture apparatus of the present invention.
If the microorganism is maintained in the logarithmic growth phase, for example, when performing a reporter gene assay in which the product of the reporter gene is very stable, if the culturing time or storage time is long, high levels of proteins will be stored in the cells before the induction of the gene. There is a problem of accumulation. According to the culture method of the present invention, a microbial suspension having a small proportion of cells such as a quiescent phase (G0 phase), senescence and apoptosis, and a large proportion of cells in G1, S, G2, and M phases. Is always supplied, so that it is possible to save time and effort for obtaining cells in a logarithmic growth phase such as preculture and main culture, which is particularly useful in this respect.
[0047]
(6) Method for preparing logarithmic growth phase microorganism
As yet another aspect, the present invention relates to a method for preparing a logarithmically growing microorganism and a device therefor, wherein the microorganism is proliferatively cultured while circulating a microorganism suspension in a culture medium through a circulation channel. The details of this method and apparatus are the same as those of the above-described culture method and culture apparatus of the present invention.
The microorganism obtained by the preparation method of the present invention is in a logarithmic growth phase.
[0048]
(7) A method for detecting the presence or absence of contamination with harmful substances using a microorganism cultured in a proliferative manner and an apparatus therefor
As another aspect, the present invention relates to a method for detecting the presence or absence of contamination of a harmful substance in a test water, wherein the test is performed on microorganisms that are proliferatingly cultured, and the microbial response to the loaded test water is measured. The present invention relates to a method for measuring and detecting a change in a microbial response caused when a harmful substance is mixed in a test water, and an apparatus for carrying out the method.
As described above, microorganisms retained during the logarithmic growth phase have a lower percentage of reporter gene expression compared to steady state cells, for example, when used in a reporter gene assay where the reporter gene product is very stable. When gene expression is high without harmful substance loading, even if the gene is induced by harmful substance loading, it is difficult to detect the difference. Furthermore, in the steady state, harmful substance sensitivity is considered to be low. From these facts, a bioassay device having a culture mechanism for maintaining the logarithmic growth phase is considered to be useful.
[0049]
The culture mechanism that maintains the logarithmic growth phase is an apparatus that can perform the above-described method using the circulation channel of the present invention.
[0050]
In this context, the present invention relates to a) a culture device having a culture mechanism capable of supplying a microorganism that is proliferatively cultured, b) a collection device for collecting microorganisms from the culture device, and c) a collected microorganism. And f) a microbial response detector for detecting the response of microorganisms loaded with the test water, for detecting the presence of harmful substances in the test water. Equipment related. The apparatus can further include means for detecting a microbial response of the proliferatively cultured microorganism, which is not loaded with a test sample.
[0051]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
Example 1
Continuous culture of yeast cells
A cryopreserved yeast Saccharomyces cerevisiae W303 strain (ATCC 2001239) was transformed into a selective medium (SD medium: yeast nitrogen base with amino acids (Difco.0919-15-3) + glucose + amino acid (adenine, histidine, histidine, histidine, histidine, histidine, histidine). The culture was shake-cultured at 25 ° C. and grown for a period of time until it reached a steady state.The same selective medium was added to the culture and diluted to an OD660 of 0.5, 20 ml of which was placed in a 50 ml tube. The culture was further shake-cultured at 25 ° C. Every 3 hours of the doubling time, half of the culture was discarded, an equal amount of the above-mentioned selective medium was added, and this was repeated, during which time the OD660 of the culture was measured over time. The results obtained As shown in FIG.
The results in FIG. 6 show that one half of the cell suspension is drained every doubling time and that the cell concentration is kept constant by periodically adjusting the concentration of the cell suspension by supplying an equal volume of medium. Indicates that it can be held.
[0052]
Example 2
Detection of toxic substances by measuring growth
The yeast Saccharomyces cerevisiae W303 strain (American Type Culture Collection ATCC 2001239) which had been cryopreserved was used as a selective medium (SD medium: yeast nitrogen base with thiamine, thiamine, thiamine, thiamine, thiamine, thiamine, thiamine, thiamine, thiamine, thiamine, thiamine, thiamine, thiamine, thiamine, thiamine), and (selective medium). , Leucine)) at 25 ° C. with shaking culture to grow to a steady state.
The yeast in a steady state was stored at 4 ° C. for 1 week, then diluted 10-fold with the same medium, and pre-cultured at 25 ° C. for 2 hours. Thereafter, a test sample was added, and the cells were further cultured at 25 ° C. for 4 hours. The cells were cultured under the same conditions without adding any chemical substance, and used as a control. Cell proliferation was measured by measuring absorbance at 600 nm. In all cases, the inhibition of cell growth was confirmed by the addition of the chemical substance.
[Table 1]

[0053]
From the above results, it was clarified that the presence or absence of a harmful substance in the test water can be detected by measuring the absorbance of the sample in the circulation channel 4 hours after the test load.
[0054]
Example 3
Detection of harmful substances by the reporter gene assay
1. Yeast gene YLL057C promoter assay cell preparation
Primers for amplifying the oligonucleotide (SEQ ID NO: 1) containing the promoter sequence of the yeast gene YLL057C by PCR were prepared. The primers are Oligo 4.0-S, a sequencer, a software for primer design. _I Design using Macintosh version, base sequence of upper primer
GCTAACGAACAGGATGGTATTGA (SEQ ID NO: 2)
And the base sequence of the lower primer is
ATTTTAACTGGGTTACTGTGCT (SEQ ID NO: 3)
And For PCR, a yeast chromosome (Saccharomyces cerevisiae S288C, Cat. 40802, Research Genetics, Inc.) was used as a template, and a commercially available kit (KOD DNA Polymerase; code KOD-101, Toyobo) was used as a reagent.
[0055]
The vector used is pYES2 (pYES2, Cat no: V825-20, Invirtogen Corporation, USA), a YEp-type shuttle vector that is replicated in both E. coli and yeast (RW Old, SB Primrose Gene Manipulation). Principle of the original 5th edition, Baifukan, pp.234-263, 2000)) was used. As the polynucleotide (SEQ ID NO: 4) encoding the marker protein GFP, the GFP portion of the vector pQBI63 (Cat no. 54-0082, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used. First, a vector was prepared in which a GFP oligonucleotide was inserted into the multiple cloning site of pYES2. Thereafter, the GAL1 promoter portion of pYES2 was replaced with an oligonucleotide containing the promoter sequence of YLL057C, a yeast gene of interest. The operation of inserting an oligonucleotide containing GFP and a promoter sequence was performed by selecting an appropriate restriction enzyme.
[0056]
The procedure for transforming yeast with the vector is shown below.
1) The yeast cells W303 are shake-cultured in 200 ml of SD medium until the OD660 becomes 0.5.
2) Harvest cells and suspend in 5 ml of TE-buffer.
3) Add 250 μL of 2.5 M lithium acetate.
4) Dispense 300 μl each, add 10 μl of plasmid vector, and incubate at 30 ° C. for 30 minutes.
5) Add 700 μl of 50% PEG4000 and shake culture at 30 ° C. for 60 minutes.
6) After heat shock (42 ° C, 5 minutes), cool rapidly.
7) Wash twice with 1M sorbitol.
8) Seeding on agar plates made with minimal nutrient media.
Transformation was confirmed using a selection medium (SD medium) + glucose + amino acids (adenine, histidine, tryptophan, leucine). Colonies that grew on the agar plate of the selection medium were further confirmed for auxotrophy for amino acids.
[0057]
2. Preparation of promoter assay cell for yeast gene YBR072W
An oligonucleotide (SEQ ID NO: 7) containing the promoter sequence of the yeast gene YBR072W was amplified by PCR, and an upper primer:
GCAGTCAACGAGGAGCGAATCAG (SEQ ID NO: 5),
Lower primer:
Except that GTTAATTTGTTTAGTTTGTTTG (SEQ ID NO: 6) is used. To obtain the desired transformant.
[0058]
3. Detection of toxic substances by measuring growth
The resulting transformant was grown in a selective medium (SD medium) + glucose + amino acid (adenine, histidine, tryptophan, leucine) at 25 ° C. with shaking to grow to a steady state.
Then, the mixture was diluted 500-fold with the same medium, and pre-cultured at 25 ° C. for 15 hours. Thereafter, a test sample was added, and the cells were further cultured for 4 hours. The cells were cultured under the same conditions without adding any chemical substance, and used as a control. A sample was collected, and the fluorescence was measured by flow cytometry (EPICS XL: Beckman Coulter). The fluorescence intensity when no chemical substance was loaded was measured in advance, and those having a fluorescence intensity 1.5 times or more of that were indicated as + with fluorescence detected.
[0059]
[Table 2]

[0060]
Table 2 shows that only YLL057C cells responded when pentachlorophenol was included in the test, only YBR072W cells responded when 2-4-dichlorophenol or p-nonylphenol was included, and arsenite was added to the test. Indicates that both YLL057C and YBR072W cells respond.
Thus, it was shown that chemical substances can be estimated by using a circulation channel of a plurality of promoter assay cells.
[0061]
Example 4
Effect of culture conditions on reporter gene expression
The transformant prepared in Example 3 was grown in a selective medium (SD medium) + glucose + amino acid (adenine, histidine, tryptophan, leucine) at 25 ° C. with shaking to grow to a steady state.
The transformant in the steady state was diluted 500-fold with the same medium, pre-cultured at 25 ° C. for 15 hours, and the fluorescence of cells in the logarithmic growth phase was measured by flow cytometry. Further, fluorescence was measured in the same manner as above after culturing for 48 hours in a steady state. The ratio between the fluorescence intensity in the steady state and the fluorescence intensity in the logarithmic growth phase was determined and defined as the fluorescence intensity ratio. Table 3 shows the obtained results.
[0062]
[Table 3]
Promoter assay cell Fluorescence intensity ratio
YLL057C 1.5
YBR072W 2.3
[0063]
From the results in Table 3, it can be seen that the ratio of cells in the stationary phase (G0 phase) is small as in the logarithmic growth phase and the percentage of cells in the G1, S, G2, and M phases is large. It can be seen that the rate of reporter gene expression is lower than that in cells having more stationary phase (G0 phase). When the expression of the reporter gene is high without loading the harmful substance, even if the reporter gene is induced by the loading of the harmful substance, it is difficult to detect the difference. Furthermore, in the steady state, harmful substance sensitivity is considered to be low. From these facts, a bioassay device having a culture mechanism for maintaining the logarithmic growth phase is considered to be useful.
[0064]
【The invention's effect】
The effects produced by the culture method and the culture device of the present invention are listed below.
1. Generally, the passage of microorganisms involves complicated manual operations such as aseptically diluting a culture solution with a medium. However, according to the present invention, automatic culturing and subculture of microorganisms can be performed by automatically discharging the suspension and automatically supplying the medium. Therefore, the above-mentioned complicated manual work is not required. For example, it can be suitably used for regenerative medicine, ordinary clinical diagnosis, or culture or subculture work in a laboratory or laboratory.
2. A usual method for preserving microorganisms includes freezing or freeze-drying. However, microorganisms, such as animal cells, which are fatally damaged by these treatments and whose survival rate after reconstitution is extremely poor cannot be frozen or freeze-dried. Such microorganisms require maintenance by subculturing. By using the present invention, this can be easily performed, and the present invention is useful from the viewpoint of conservative culture of microorganisms.
[0065]
The effects provided by the detection method and the detection device of the present invention are listed below.
1. When the conventional microorganism-fixed membrane is damaged by microorganisms due to contamination of other microorganisms or excessive damage by harmful substances, it is necessary to replace the microorganism-fixed membrane. In the present invention, microorganisms are proliferatively cultured by using the circulation channel, and membrane exchange is unnecessary.
2. In the present invention, microorganisms are supplied to the detection device via a test channel branched from the circulation channel, and the microorganisms are discharged after the test. Therefore, not only the measurement of reversible microbial responses such as oxygen consumption, but also the measurement of irreversible microbial responses such as the number of viable cells accompanied by microbial death and the enzymatic activity in cells measured by destroying cells. Can be used. Further, since the cells are not fixed to the membrane, it is possible to use a method of measuring individual cells by flow cytometry.
3. In the method of immobilizing microorganisms on a membrane, even if the microorganisms are highly sensitive as a biosensor, the microorganisms whose activity is difficult to maintain cannot be used. However, in the present invention, such relatively short-lived or fragile microorganisms, for example, established cell lines of animal cells such as blood cells, can also be used as target microorganisms.
4. In the case of a microorganism-immobilized membrane, the cells on the membrane are monitored repeatedly or continuously, so that it is necessary to keep the cell state such as the number of living cells and the activity of the cells to a certain degree. However, in the case of the present invention, since it is not necessary to keep the cell state constant, it is also possible to use an extremely standard measurement method in measuring the microbial response, such as measuring the increase in the number of cells.
5. When the promoter assay is used, there is a problem that the marker protein is accumulated in cells and the base is raised. According to the present invention, it is possible to always supply young cells in the exponential growth phase, and such a problem is solved.
6. When performing a reporter gene assay in which the product of the reporter gene is stable, if the culture time or the storage time is long, there is a problem that a high level of protein accumulates in the cells before the induction of the gene. However, if the method for automatically subculturing is used as in the present invention, cells with a short culture time can always be supplied, so that the problem of intracellular accumulation can be avoided, and furthermore, labor and time for preparations can be saved. Can be.
[0066]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a conceptual diagram of an apparatus for culturing microorganisms, including a) a circulation channel, b) a suspension outlet, and c) a medium supply tank.
FIG. 2 is a culture apparatus of the present invention further provided with a controller.
FIG. 3 shows a test system comprising: a) an annular circulation channel, b) a suspension outlet, c) a medium supply tank, d) a test channel, e) a sample injection device, and f) a microbial response detection device. It is a conceptual diagram of the apparatus for detecting the presence or absence of harmful substance contamination in water.
FIG. 4 includes: a) a non-circular circulation channel, b) suspension outlet, c) medium supply tank, d) test channel, e) sample injection device, and f) microbial response detection device. It is a conceptual diagram of the apparatus for detecting the presence or absence of harmful substance contamination in the test water.
FIG. 5 is a detection device of the present invention further provided with a control channel.
FIG. 6 is a time-dependent graph of OD660 of a culture obtained by repeating the operation of discarding half of the culture of the yeast strain W303 every doubling time and adding an equal amount of a selective medium.

Claims

A method for culturing microorganisms, comprising culturing microorganisms proliferatively while circulating a microorganism suspension in a culture medium through a circulation channel.

By discharging a predetermined amount of the microbial suspension circulating in the circulation channel and replenishing the same amount of medium as the predetermined amount of the discharged suspension, the microorganisms in the microbial suspension in the circulation channel are The method according to claim 1, wherein the concentration is adjusted periodically, and the microorganism is cultured in a proliferative manner.

By constantly discharging a predetermined amount of the microbial suspension circulating in the circulation flow path and constantly replenishing the same amount of medium as the predetermined amount of the discharged suspension, The method according to claim 1, wherein the microorganisms are cultured proliferatively while maintaining the microorganism concentration of the microorganism suspension constant.

4. The method according to claim 1, wherein the circulation is in one direction.

3. The method according to claim 1, wherein the direction of circulation is reversed at predetermined time intervals.

a) a circulation channel through which the microorganism suspension in the medium circulates; b) a suspension outlet connected to the circulation channel; c) a medium supply tank connected to the circulation channel. Equipment for culturing.

The device according to claim 6, for proliferating culture of microorganisms.

a) in the circulation channel, the microbial suspension can flow in a fixed direction or reverse at predetermined time intervals;
b) the suspension outlet discharges a predetermined amount of the microbial suspension,
c) The culture medium supply tank replenishes the same amount of culture medium as the predetermined amount of the suspension discharged from the suspension discharge port, thereby periodically adjusting the concentration of microorganisms in the microorganism suspension in the circulation channel. The apparatus according to claim 6 or 7, wherein

a) In the circulation channel, the microorganism suspension flows at a constant flow velocity,
b) The suspension outlet constantly discharges a predetermined amount of the microbial suspension,
c) The medium supply tank constantly replenishes the same amount of medium as the predetermined amount of the suspension discharged from the suspension discharge port, thereby keeping the concentration of microorganisms in the microorganism suspension in the circulation channel constant. The apparatus according to claim 6, wherein the microorganism is cultured while being held in the cell.

10. The apparatus according to claim 6, further comprising: d) a sampling port for removing a part of the microorganism suspension in the circulation channel.

This is a method for detecting the presence or absence of contamination of harmful substances in the test water, by collecting microorganisms moving in the circulation channel, loading the collected microorganisms with a test water, and responding to the microbial response to the loaded test water. And detecting a change in a microbial response caused when a harmful substance is mixed in the test water.

The method according to claim 11, wherein the microorganism moving in the circulation channel is cultured by the method according to any one of claims 1 to 5 or the apparatus according to any one of claims 6 to 10.

a) a circulation channel through which the microbial suspension in the culture medium circulates; b) a suspension outlet connected to the circulation channel; c) a medium supply tank connected to the circulation channel; d) a circulation flow. A) a test flow path, through which a certain amount of microbial suspension flows, e) a test water injection device for injecting a test water into the test flow path, and f) a test flow loaded with the test water A device for detecting the presence or absence of harmful substances in a test water, including a microorganism response detection device for detecting a response of a microorganism flowing in a road.

a) in the circulation channel, the microbial suspension can flow in a fixed direction or reverse at predetermined time intervals;
b) the suspension outlet discharges a predetermined amount of the microbial suspension,
c) The culture medium supply tank replenishes the same amount of culture medium as the predetermined amount of the suspension discharged from the suspension discharge port, thereby periodically adjusting the concentration of microorganisms in the microorganism suspension in the circulation channel. And
d) a certain amount of microbial suspension flowing from the circulation channel in the test channel;
e) The test sample injection device loads a test sample on the logarithmically growing microorganisms moving in the test channel,
14. The device of claim 13, wherein the microbial response detection device is located at a position that provides sufficient transit time to cause a change in microbial response when harmful substances are mixed into the test water.

a) In the circulation channel, the microorganism suspension flows at a constant flow velocity,
b) The suspension outlet constantly discharges a predetermined amount of the microbial suspension,
c) The medium supply tank constantly replenishes the same amount of medium as the predetermined amount of the suspension discharged from the suspension outlet, thereby periodically controlling the concentration of microorganisms in the microbial suspension in the circulation channel. To adjust,
d) In the test channel, a certain amount of microbial suspension from the circulation channel is flowing at a constant flow velocity,
e) The test sample injection device loads a test sample on the logarithmically growing microorganisms moving in the test channel,
14. The device of claim 13, wherein the microbial response detection device is located at a position that provides sufficient transit time to cause a change in microbial response when harmful substances are mixed into the test water.

16. Apparatus according to any of claims 13 to 15, further comprising the same test channel as a control channel except that the sample injection device is not connected.

A method of culturing microorganisms proliferatively while circulating a microorganism suspension in a culture medium through a circulation channel, and keeping the microorganisms in a logarithmic growth phase.

A method for preparing a microorganism in a logarithmic growth phase, wherein a microorganism is proliferatively cultured while circulating a microorganism suspension in a medium through a circulation channel.

This is a method for detecting the presence or absence of harmful substance contamination in the test water, by applying a test water to the microorganisms that are proliferating and measuring the microbial response to the loaded test water, A method for detecting a change in a microbial response caused by contaminants.

a) a culturing device having a culturing mechanism capable of supplying microorganisms cultured in a proliferative manner; b) a collecting device for collecting microorganisms from the culturing device; c) a water sample for injecting a test water into the collected microorganisms A device for detecting the presence or absence of harmful substances in the test water, including an injection device and f) a microbial response detection device for detecting the response of the microorganism loaded with the water test.

21. The apparatus of claim 20, further comprising means for detecting a microbial response of a microbe that is being proliferatively cultured and not loaded with a test sample.