JP4323844B2

JP4323844B2 - Bioassay device

Info

Publication number: JP4323844B2
Application number: JP2003085656A
Authority: JP
Inventors: 均岩橋; 淳子 ▲高▼橋
Original assignee: Daikin Industries Ltd; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: Daikin Industries Ltd; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2003-03-26
Filing date: 2003-03-26
Publication date: 2009-09-02
Anticipated expiration: 2023-03-26
Also published as: JP2004290054A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物固定膜を用いない、水質検査を行うためのバイオアッセイ方法および装置に関する。
【０００２】
【従来の技術および解決課題】
これまで、河川・湖沼等の環境水および下水、排水中に含まれている化学物質等の水質検査を行う、連続的に検査できかつ微生物を指標としているバイオアッセイ装置は、微生物固定膜を利用、即ち微生物を膜に固定してその呼吸活性を計測する（特許文献１、２および３）。しかし、微生物固定膜は微生物の応答が維持できる期間を超えると、微生物固定膜の交換が必要である。また、強い毒性を有する試料に曝されると、微生物が回復不可能なダメージを受け、交換時期に達しなくても微生物固定膜を交換する必要が生じる。そして、装置が水源に設置されている場合は、特に膜交換が困難となる。さらに、微生物を膜に固定した場合、微生物の応答を酸素電極を用いて酸素消費量により計測することは可能であるが、微生物細胞を破壊して測定する必要のある酵素活性の比色による測定や、蛍光、燐光等による測定には不向きである。
【０００３】
【特許文献１】
特開平７−６３７２５
【特許文献２】
特開平１１−３７９６９
【特許文献３】
特開２０００−２０６０８７
【０００４】
【課題解決手段】
そこで、微生物固定膜を用いない、水質検査を行うためのバイオアッセイを鋭意研究した結果、低温で安定的に生存する微生物の存在を明らかにできたので、低温で安定的に微生物を保存する供給槽を設け、そこから一定の流速度で微生物を掛流し流路に供給し、微生物が安定に生育する条件で掛流し流路中を流すことで、水質検査を行うためのバイオアッセイが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【０００５】
即ち、本発明は、
（１）検水中の有害物質混入の有無を検定する方法であって、微生物を保存している微生物供給槽から微生物を掛流し流路に供給し、前記掛流し流路中を移動している非固定化微生物に対して検水を負荷し、負荷される検水に対する微生物応答を測定し、検水中に有害物質が混入した場合に引き起こされる微生物応答の変化を検出することを特徴とする方法；
好ましくは、掛流し流路中、培地とともに非固定化微生物が一定の流速度で移動する方法；さらに好ましくは、検水を負荷する前に微生物を前培養して対数増殖期とし、次いで検水を負荷しつつ試験培養を行う方法；および
【０００６】
（２）掛流し流路、それに連結している微生物供給槽、掛流し流路に検水を注入するための検水注入装置、および微生物供給槽から供給される微生物の応答を検出するための微生物応答検出装置を含む、検水中の有害物質混入の有無を検定するための装置；
好ましくは、ａ）掛流し流路中では、培地が一定の流速度で流れており、その培地は掛流し的に排出され、
ｂ）微生物供給槽は微生物を保存しており、微生物を掛流し流路へ供給し、
ｃ）掛流し流路中の微生物は培地とともに排出されるまで一定の流速度で移動し、
ｄ）検水注入装置は、掛流し流路中を移動している微生物が対数増殖期となるに充分な移動距離を与える位置にて掛流し流路と連結し、
ｅ）微生物応答検出装置は、検水中に有害物質が混入した場合に微生物応答の変化が引き起こされるに充分な移動距離を与える位置に配置されている装置；さらに好ましくは、検水注入装置が連結していない点以外は同じ掛流し流路を対照掛流し流路としてさらに含む装置；に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
（１）バイオアッセイ方法
本発明は要するに、低温で安定的に微生物を保存する供給槽を設け、そこから一定の流速度で微生物を掛流し流路に供給し、微生物が安定に生育する条件で掛流し流路中を流し、途中、水質検査の対象となる検水を加えてさらに生育させ、検水負荷前と負荷後の微生物の応答を測定し比較することにより、検水中の有害物質の有無の検定を行う。これにより、微生物固定膜を用いずに水質検査を行うためのバイオアッセイが可能となった。
【０００８】
本発明において「検水」とは、河川・湖沼等の環境水および下水、排水から供給される検体試料水であり、これらは有害物質が混入されていないか、水質検査が常に必要な試料水である。
【０００９】
「掛流し流路」では、培地保存槽から供給される培地が一定の流速度で流れており、その培地は掛流し的に排出される。培地保存槽からの培地の供給は通常ポンプ等を用いる。本発明では、培地が流れている掛流し流路に対し、微生物を微生物供給槽から供給する。よって、本発明では、微生物は掛流し流路中を培地とともに流れるのに任せて放置し、１回の検定を行った後、微生物および培地は排出される。培地は、用いる微生物に応じて変動し、通常は新しい培地を使用する。新しい培地とは微生物生育に未だ使用していない培地である。新しい培地としては、微生物が酵母の場合、通常ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、ブドウ糖２％）、またはＳＤ培地（yeast nitrogen base without amino acids (Difco.0919-15-3)）にグルコース、アミノ酸を加えたものを用いる。
【００１０】
微生物供給槽は、微生物保存液を低温で保存したものであり、ここに微生物保存液とは、培地中に微生物を懸濁させて得られた懸濁液である。保存温度は、凍結せずかつ休眠状態を維持する温度であり、望ましい温度は０℃から１５℃、さらに望ましい温度は４℃である。微生物保存液の培地は、使用する微生物の休眠状態を維持するのに適した培地である。具体的には、この培地は培地保存槽から掛流し流路に供給される培地と同じであっても異なっていてもよい。
【００１１】
微生物供給槽における細胞濃度は特に限定されないが、微生物を休眠状態で保存するのに適当な濃度でありかつ微生物応答を検出するのに十分な濃度を掛流し流路へ供給するのに可能な濃度である。供給槽の容量は、掛流し流路に微生物を供給する速度と微生物が保存可能である期間により規定される。例えば、６ヶ月間、流速０．００１ｍｌ／分で微生物保存液を供給する場合、５００ｍｌ程度の容量が必要となる。
【００１２】
微生物供給槽における微生物の保存は、細胞が休眠状態で維持するのに適当な条件が好ましい。温度が低温で一定であることに加え、培地は、使用する微生物の至適ｐＨを維持し、微生物が細胞外に放出する老廃物を除去する機構等を有すること、細胞が均一に分布するよう攪拌されていることが好ましい。
使用する微生物は有害物質応答性を有するとともに、長期間低温で保持した後も、十分な生存率を有する種類を選択することが望ましい。例えば、酵母細胞は保存期間が４ヶ月後において１０％以上の生存率を有する（図７）。
本発明は、このように微生物が低温において安定的に生存することを見出し、完成されたものであり、微生物供給槽を用いるバイオアッセイはこの知見を基礎としている。
【００１３】
本発明では、「検水の負荷」は間欠的であっても連続的であってもよい。間欠的に検水を負荷する場合、検水は異なる場所から採取した試料水であってよく、同じ場所から異なる時間に採取した試料水であってよい。間欠的に検水を負荷する場合、検水の１回の負荷量は掛流し流路の径に依存するが、例えば径が１−３ｍｍであれば、通常、検水０．００１−５ｍｌを負荷する。
「検水の負荷」を連続的に行う場合、本発明により、検水の経時的な水質検査が可能となる。よって、この態様では、本発明は、検水中の有害物質混入の有無を経時的にモニターする方法であって、微生物を保存している微生物供給槽から微生物を掛流し流路に供給し、前記掛流し流路中を移動している非固定化微生物に対して連続的に検水を負荷し、連続的に負荷される検水に対する微生物応答を連続的に測定し、検水中に有害物質が混入した場合に引き起こされる微生物応答の変化を経時的に検出することを特徴とする方法を提供する。ここに、検水の経時的な水質検査は、任意にモニターしたい時間行うことができる。通常は、数時間から数日、あるいは数ヶ月である。基本的には、モニター時間は、微生物供給槽中の微生物の応答性に依存する。連続的に検水を負荷する場合、検水の掛流し流路への通水量は、掛流し流路の径に依存するが、例えば径が１−３ｍｍであれば、通常、検水０．００１−１ｍｌ／分である。
【００１４】
本発明に用いる微生物は、「掛流し流路中を移動する非固定化微生物」であり、固定膜に固定化されていない。ここに使用される微生物は天然に存在する野生株または野生型株、例えばヒト、マウスその他の哺乳類由来の動物細胞および動物細胞の樹立株、これまでバイオアッセイに用いられている魚類、線虫等の細胞、昆虫細胞、酵母等の真菌細胞、および大腸菌等の細菌細胞の何れであっても良い。野生株は天然に存在する組換えを行っていない微生物である。野生型株は注目する遺伝子に手をつけていない微生物である。樹立株は動物細胞で継代培養できるもの、例えばガン細胞などの組換えが施されていないものも含む。
【００１５】
「微生物応答」とは、天然に存在する野生株または野生型株の場合、微生物細胞数、生細胞数、呼吸量、ＡＴＰ量等である。また、有害物質の存在下に変動する遺伝子のｍＲＮＡレベルであることができる。ｍＲＮＡレベルは、ノーザンブロット法（緒方宣邦、野島博：遺伝子工学キーワードブック改定第２版、羊土社、2000, pp299-301）、逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）（中別府雄作、他：細胞工学別冊 Tipsシリーズ改定PCR Tips, 秀潤社、1999, pp25-43）等によって測定できる。
ここに、「有害物質の存在下に変動する遺伝子」は、酵母細胞の場合、公共のデータベース（例えば、ドイツのＭＩＰＳ：Munich Information Center for Protein Sequence、米国のＳＧＤ：Saccharomyces Genome Database）に開示されている酵母遺伝子の中から適宜選択し、これらはインターネットを介して知ることができる。好ましい遺伝子は、ミトコンドリアタンパク質、遺伝子修復系タンパク質、エネルギー系タンパク質、トランスポート促進タンパク質、ストレスタンパク質、代謝系タンパク質、脱毒性タンパク質および機能未知の遺伝子である。例えば、YLR303W、YLL057C、YOR382W、YCR102C、YKL071W等である。
【００１６】
本発明で使用される微生物にはまた、上記天然に存在する細胞の組換え体、即ち形質転換体が含まれる。本発明に用いる形質転換体は、上記「有害物質の存在下に変動する遺伝子」のプロモーターのポリヌクレオチド配列に、マーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結して得られるポリヌクレオチド構築物を含むベクターを上記天然に存在する細胞に導入することにより調製できる。プロモーターにタンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結する方法は周知である（例えばR.W.オールド、S.B.プリムローズ遺伝子操作の原理原書第５版, 培風館, pp138-165, pp.234-263, 2000を参照）。プロモーターの配列は、例えば酵母の場合、公共のデータベース（SCPD：The Promoter Database of Saccharomyces cerevisiae）に開示されている。マーカータンパク質の例としてはGFP（Green Fluorescence Protein）（Heim, R., Cubitt, A. B. and Tsien, R. Y.（1995） Nature 373, 663-664；Heim, R., Prasher DC. and Tsien, R. Y.（1994） Proc. Natl. Acad. Sci., 91, 12501-12504；Warg, S. and Hazerigg, T.（1994）Nature 639, 400-403；Youvan, D.C. and Michel-Beyerle, M.E.（1996）Nature Biotechnology 14 1219-1220；Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W. and Prasher, D.C.（1994）Science 263, 802-805）、β-ガラクトシダーゼ（Canestro C, Albalat R, Escriva H, Gonzalez-Duarte R. Endogenous beta-galactosidase activity in amphioxus: a useful histochemical marker for the digestive system.Dev Genes Evol 2001 Mar 211(3):154-6）、ルシフェラーゼ（Arch Toxicol 2002 Jun;76(5-6):257-61、Estrogenic activity of UV filters determined by an in vitro reporter gene assay and an in vivo transgenic zebrafish assay.Schreurs R, Lanser P, Seinen W, Van Der Burg B.)、及びアセチルトランスフェラーゼ（J Recept Signal Transduct Res 2001 Feb;21(1):71-84, A simplified method for large scale quantification of ranscriptional activity and its use in studies of steroids and steroid receptors. Zhang S, Lu J, Iyama K, Lo SC, Danielsen M.)等が挙げられる。
【００１７】
ベクターの調製は、例えば酵母細胞の場合、酵母において複製可能なプラスミドを選択し、これにマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入し、次いでプロモーター配列を含むポリヌクレオチドをマーカー遺伝子の上流部分に挿入することにより行うことができる。
形質転換体は周知の手法により調製できる。例えば、酵母細胞を形質転換する方法は、Kaiser C, Michaelis S, Mitchell A: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual 1994 edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press) pp.133-134,1994に記載されている。
【００１８】
形質転換体を用いた場合、本発明に使用される「微生物応答」はマーカータンパク質の発現レベルである。マーカータンパク質の発現レベルは、形質転換体を粉砕しタンパク質抽出液を得、この液中のマーカータンパク質量を測定することにより得られる。例えばマーカータンパク質がＧＦＰの場合、タンパク質抽出液の蛍光量を蛍光分光光度計により計測する。また、マーカータンパク質の発現レベルは、形質転換体を粉砕しなくても直接、蛍光顕微鏡、レーザー顕微鏡による画像処理、フローサイトメトリーによる計測、エバネッセント光による計測、さらに比色計などを用いた検出方法により、細胞の蛍光（GFP）もしくはもしくは発色（β-gal）を測定できる場合もある。好ましい形質転換体は、酵母遺伝子のプロモーターをマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したポリヌクレオチドを含むベクターによって形質転換されている酵母、または染色体のORFをマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドで置換するように形質転換されている酵母であり、さらに好ましくは、その酵母遺伝子がミトコンドリアタンパク質、遺伝子修復系タンパク質、エネルギー系タンパク質、トランスポート促進タンパク質、ストレスタンパク質、代謝系タンパク質、脱毒性タンパク質および機能未知の遺伝子のなかから選ばれるものである。
【００１９】
本発明では、検水中に有害物質が混入した場合に引き起こされる微生物応答の変化を検出する。検水に有害物質が存在する場合、掛流し流路中の微生物が検水と接触すると、生育阻害、呼吸量低下等の影響を受ける。加えて微生物が組換え体である場合、レポーター遺伝子の発現が起きる。
【００２０】
本発明では上記の通り、微生物供給槽から微生物を掛流し流路中に供給し、掛流し的に排出される。そのため、本発明において測定できる「微生物応答」として、酸素消費量等の可逆的な応答のみならず、微生物の死滅を伴う生細胞数および細胞を破壊して測定する細胞内の酵素活性などの不可逆的な応答も利用できる。
【００２１】
掛流し流路に微生物を供給した直後に検水の負荷を行うことが可能である。しかし、微生物を供給するための微生物供給槽では微生物は休眠状態にある。よって、本発明では好ましくは、検水を負荷する前に微生物を前培養し、次いで検水を負荷しつつ試験培養を行う。この態様では、掛流し流路から供給される微生物を一定時間流路中で保持し、それにより休眠状態の微生物の活性を回復させる前培養を行い、次いで検水の負荷を行う。前培養ではさらに、微生物の化学物質感受性を上げるため、可能な限り、細胞周期のすべてのステージの細胞を含む状態である対数増殖期とすることが望ましい。そこで、前培養では、新しい培地が流れている掛流し流路内にて微生物供給槽由来の微生物を希釈培養し、それにより微生物が対数増殖期になるように温度および時間を制御する。具体的には、酵母の場合、前培養の条件は２５−３０℃、２時間から十数時間である。時間に応じて、掛流し流路の長さを調節する。即ち、検水注入は、掛流し流路中を移動している微生物が対数増殖期となるに充分な移動距離を与える位置にて行う。
【００２２】
ここに、検水負荷が連続的でも間欠的でもよいことは上述の通りである。試験培養は、検出すべき微生物の応答により異なるが、数１０分から数時間である。時間に応じて、掛流し流路の長さを調節する。即ち、微生物応答検出は、検水中に有害物質が混入した場合に微生物応答の変化が引き起こされるに充分な移動距離を与える位置にて行う。
【００２３】
（２）バイオアッセイ装置
本発明は別の態様として、本発明のバイオアッセイ方法を実施するための装置を提供する。詳細には、微生物供給槽、それに連結している掛流し流路、掛流し流路に検水を注入するための検水注入装置、および微生物供給槽から供給される微生物の応答を検出するための微生物応答検出装置を含む、検水中の有害物質混入の有無を検定するための装置である。
本発明における典型的な装置を図１に示す。
【００２４】
対照掛流し流路を備えた本発明の装置を図２に示す。微生物の応答を検出する場合、対照となる状態との差をとることにより、より正確な応答を把握することができる。そこで、検水を加えない対照区として別の掛流し流路を設け、検出区と同様にモニタリングする。
【００２５】
微生物供給槽を複数備えた本発明の装置を図３に示す。
微生物供給槽を複数用いることで、応答を検出する微生物を複数にすることができる。微生物供給槽各々に、それに連結している掛流し流路、掛流し流路に検水を注入するための検水注入装置、微生物検出装置を配する。微生物検出装置は１台で必要に応じて掛流し流路を切り替えて用いることも可能である。このようにして、同一の検水について複数種類の微生物応答を計測し、その応答を比較することによって、検水中の有害物質を推定することが可能となる。例えば、微生物として酵母遺伝子YLL057Cのプロモーターアッセイ細胞および酵母遺伝子YBR072Wのプロモーターアッセイ細胞を保存したそれぞれ２つの微生物供給槽用いた場合、検水にペンタクロロフェノールが含まれるとYLL057C細胞のみが応答し、2-4-ジクロロフェノールまたはp-ノニルフェノールが含まれるとYBR072W細胞のみが応答する。また、亜ヒ酸塩が検水に含まれると、YLL057C細胞およびYBR072W細胞の両方が応答する。
【００２６】
本発明は別の態様として、掛流し流路を流れる非固定化微生物を採取するためのサンプリング路サンプリング路をさらに備えた本発明の装置を提供する。具体的には、微生物供給槽、それに連結している掛流し流路、掛流し流路に検水を注入するための検水注入装置、掛流し流路を流れる非固定化微生物を採取するためのサンプリング路、サンプリング路から供給される微生物の応答を検出するための微生物応答検出装置、およびサンプリング路から採取されなかった残りの微生物および検水を排出するための排液口を含む、検水中の有害物質混入の検出するための装置である。この態様の装置を図４−６に示す。
【００２７】
【実施例】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００２８】
実施例１
１．低温保存持の酵母細胞の生存率
ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、ブドウ糖２％）に酵母（Saccharomyces cerevisiae S288C(α SUC2mal mel gap2 CUP1)）を４℃で１２ヶ月保存した。保存時はスターラーで培地を常に攪拌した。
生菌数の測定は、次の様に行った。先ず、培養液1.0mLをマイクロピペットで無菌的に計り取り、滅菌生理食塩水などの希釈水で10倍段階希釈し、菌数溶液を作製する。各10倍段階希釈した菌数溶液をＹＰＤ寒天培地（YPD培地に10%の寒天を加えてオートクレーブで加熱滅菌し、シャーレに注ぎ、固まらせた固体）に播種し、３日後に生育したコロニー数を計測し、CFU（コロニー形成単位）を得た。
得られた結果を図７に示す。図７は、４℃程度の低温保存において微生物が次第に損傷を受け死滅することを示している。具体的には、保存期間が４ヶ月でも生細胞数は１０％以上となっている。これにより、酵母は長期間低温で保持した後も、十分な生存率を有することが示された。
【００２９】
２．生育の計測による毒性物質の検出
凍結保存した酵母Saccharomyces cerevisiae W303株 (American Type Culture Collection ATCC 2001239)を選択培地（SD培地：yeast nitrogen base without amino acids (Difco.0919-15-3)＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ウラシル、ロイシン））にて２５℃において振盪培養することにより定常状態になるように増殖させた。
定常状態にある酵母を４℃にて１週間保存し、次いで上記同じ培地で１０倍希釈し、２５℃にて２時間、前培養を行った。その後、被検試料を添加しさらに４時間、２５℃にて培養した。これと同条件で化学物質を添加せずに培養して対照区とした。600nmの吸光度を測定することにより、細胞の増殖を計測した。化学物質の添加により、いずれも細胞増殖の阻害が確認された。
【表１】

【００３０】
以上の結果より、検水負荷の４時間後における掛流し流路中の検体の吸光度を測定することにより、検水中の有害物質の有無が検定できることが明らかとなる。
【００３１】
実施例２
レポーター・ジーン・アッセイによる有害物質の検出
１．酵母遺伝子YLL057Cプロモーターアッセイ細胞作成
酵母遺伝子YLL057Cのプロモーター配列を含むオリゴヌクレオチド（配列番号１）をPCRにより増幅するためのプライマーを作成した。プライマーはプライマー設計用のソフトウェアであるOligo4.0-S，Sequencher_Iマッキントッシュ版を用いて設計し、アッパープライマーの塩基配列は
GCTAACGAACAGGATGGTATTGA （配列番号２）
であり、ロウワープライマーの塩基配列は、
ATTTTAACTGGGTTACTGTGCT （配列番号３）
とした。PCRはテンプレートとして酵母の染色体（Saccharomyces cerevisiae S288C, Cat.40802，Reserch Genetics, Inc.）を用い試薬は市販のキット（KOD DNA Polymerase；コードKOD-101、Toyobo）を使用した。
【００３２】
使用するベクターは大腸菌と酵母の両方で複製されるYEp型シャトルベクターであるｐYES2（pYES2, Cat no:V825-20, Invirtogen Corporation, USA）（R.W.オールド、S.B.プリムローズ遺伝子操作の原理原書第５版, 培風館, pp.234-263, 2000））を用いた。また、マーカータンパク質ＧＦＰをコードするポリヌクレオチド（配列番号４）はベクターpQBI 63（Cat no.54-0082, 和光純薬工業(株)）のGFPの部分を用いた。まず、ｐYES2の多重クローニング部位（multiple cloning site）の中にＧＦＰのオリゴヌクレオチドを挿入したベクターを作成した。その後、ｐYES2のGAL1プロモーターの部分を目的とする酵母遺伝子であるＹＬＬ０５７Cのプロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドで置換した。ＧＦＰおよびプロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドの挿入の操作は、適当な制限酵素を選択して行った。
【００３３】
ベクターで酵母を形質転換する手順を以下に示す。
１）酵母細胞W303を200mlのSD培地でOD660が０．５になるまで振とう培養する。
２）集菌して５ｍｌのTE-bufferにけん濁する。
３）2.5Mのリチウムアセテイト250μLを添加する。
４）300μｌずつ分注し10μlのプラスミドベクターを添加し、３０℃３０分培養する。
５）700μｌの５０％PEG4000を付加し、３０℃６０分振とう培養する。
６）ヒートショック（４２℃、５分）後、急冷する。
７）１Mソルビト−ルで２回洗浄する。
８）最小栄養培地で作成した寒天プレートに播種する。
形質転換の確認は選択培地（ＳＤ培地)＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ロイシン）により行った。選択培地の寒天プレートに生育したコロニーはさらに、アミノ酸の栄養要求性を確認した。
【００３４】
２．酵母遺伝子ＹBR０７２Wのプロモーターアッセイ細胞作成
酵母遺伝子ＹBR０７２Wのプロモーター配列を含むオリゴヌクレオチド（配列番号７）をPCRにより増幅し、そのためのプライマーとして、アッパープライマー：
GCAGTCAACGAGGAGCGAATCAG （配列番号５）、
ロウワープライマー：
GTTAATTTGTTTAGTTTGTTTG （配列番号６）、を用いる以外は、上記１．と同様に処理し、目的の形質転換体を作成した。
【００３５】
３．生育の計測による毒性物質の検出
得られた形質転換体を選択培地（ＳＤ培地)＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ロイシン）にて２５℃において振盪培養することにより定常状態になるように増殖させた。
定常状態の形質転換体を４℃にて１週間保存し、次いで上記同じ培地で１０倍希釈し、前培養を２５℃にて１５時間行った。その後、被検試料を添加しさらに４時間培養した。これと同条件で化学物質を添加せずに培養して対照区とした。サンプルを採取し、フローサイトメトリー（EPICS XL：ベックマンコールター）で蛍光を計測した。化学物質を負荷しない場合の蛍光強度を予め測定し、その１．５倍以上の蛍光強度を有するものを蛍光検出有りとして＋と表示した。
【００３６】
【表２】

【００３７】
表２は、検水にペンタクロロフェノールが含まれるとYLL057C細胞のみが応答し、2-4-ジクロロフェノールまたはp-ノニルフェノールが含まれるとYBR072W細胞のみが応答し、そして検水に亜ヒ酸塩が含まれると、YLL057C細胞およびYBR072W細胞の両方が応答することを示している。
これにより、複数のプロモーターアッセイ細胞の培養槽を用いることにより、化学物質の推定が可能となることが示された。
【００３８】
【発明の効果】
本発明により奏される効果を以下に列挙する。
１．従来の微生物固定膜は他の微生物混入、有害物質による過度な障害により微生物の損傷を受けた場合、微生物固定膜の交換の必要があった。本発明では、微生物供給槽を用いることで、膜交換が不要となる。
２．本発明では、微生物供給槽の生育維持可能な期間であれば、微生物供給槽を交換することなく毒性評価が可能であるため、長期間生育が維持できる微生物を用いることにより、培養槽を交換する期間が長くなる。
３．本発明では、掛流し流路から検出装置へ掛流し的に微生物を提供するため、酸素消費量等の可逆的な微生物応答の測定のみならず、微生物の死滅を伴う生細胞数および細胞を破壊して測定する細胞内の酵素活性などの不可逆的な微生物応答の計測をも用いることができる。また、細胞を膜に固定していない為、個々の細胞をフローサイトメトリーで計測するという方法を用いることも可能となる。
４．微生物固定膜の場合は繰り返しまたは連続的に膜上の細胞をモニタするので、細胞状態をある程度一定に保つ必要がある。しかし、掛流しの場合は細胞状態を一定に保つ必要が無いので、細胞数の増加を計測するなどの、微生物応答の測定において極めて標準的な計測法を用いることも可能である。
５．化学物質の影響は、微生物においては対数増殖期に特に顕著に現れる。掛流し流路で微生物を増殖させ、被検物質を対数増殖期にするように温度および時間を制御することにより、より化学物質感受性を上げることが可能となる。
【００３９】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】微生物供給槽、掛流し流路、検水注入装置および微生物応答検出装置を含む、検水中の有害物質混入の有無を検出するための装置の概念図である。
【図２】対照掛流し流路をさらに備えた本発明の装置である。
【図３】微生物供給槽を複数備えた本発明の装置である。
【図４】微生物供給槽、掛流し流路、検水注入装置、サンプリング路、微生物応答検出装置および排液口を含む、検水中の有害物質混入の有無を検出するための装置の概念図である。
【図５】対照掛流し流路をさらに備えた本発明の装置である。
【図６】微生物供給槽を複数備えた本発明の装置である。
【図７】酵母の生存試験結果を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a bioassay method and apparatus for performing a water quality test without using a microorganism fixed membrane.
[0002]
[Prior art and solutions]
Up to now, bioassay devices that can continuously inspect environmental water such as rivers and lakes, sewage, and chemical substances contained in wastewater, and that can be continuously tested using microorganisms as an indicator, have used microorganism fixed membranes. That is, a microorganism is fixed to a membrane and its respiratory activity is measured (Patent Documents 1, 2, and 3). However, when the microorganism-fixed membrane exceeds the period in which the response of microorganisms can be maintained, the microorganism-fixed membrane needs to be replaced. In addition, when exposed to a highly toxic sample, the microorganism is damaged irreparably, and it is necessary to replace the microorganism-fixed membrane without reaching the replacement period. And when an apparatus is installed in the water source, especially membrane exchange becomes difficult. In addition, when microorganisms are immobilized on a membrane, the response of microorganisms can be measured by oxygen consumption using an oxygen electrode, but colorimetric measurement of enzyme activity that needs to be measured by destroying microorganism cells In addition, it is not suitable for measurement by fluorescence, phosphorescence or the like.
[0003]
[Patent Document 1]
JP-A-7-63725
[Patent Document 2]
JP-A-11-37969
[Patent Document 3]
JP2000-206087
[0004]
[Problem solving means]
Therefore, as a result of diligent research on a bioassay for water quality testing without using a microorganism-fixed membrane, we have clarified the existence of microorganisms that can stably survive at low temperatures. A bioassay for water quality testing is possible by installing a tank, supplying microorganisms at a constant flow rate from there, supplying them to the flow path, and flowing them through the flow path under conditions where the microorganisms grow stably. As a result, the present invention was completed.
[0005]
That is, the present invention
(1) A method for examining the presence or absence of harmful substances in the test water, in which microorganisms are sprinkled from a microorganism supply tank in which microorganisms are stored, supplied to the flow path, and moved in the flow path. A method comprising: loading test water on a non-immobilized microorganism, measuring a microbial response to the loaded test water, and detecting a change in the microbial response caused when a harmful substance is mixed in the test water. ;
Preferably, a method in which non-immobilized microorganisms move together with the culture medium in the flow channel at a constant flow rate; more preferably, the microorganisms are pre-cultured in the logarithmic growth phase before loading the test water, and then the test water A test culture while loading with; and
(2) A flowing channel, a microorganism supply tank connected to the flowing channel, a test water injection device for injecting test water into the flowing channel, and a response for detecting a response of microorganisms supplied from the microorganism supply tank A device for testing the presence or absence of harmful substances in the sample water, including a microbial response detection device;
Preferably, a) the medium is flowing at a constant flow rate in the flow channel, and the medium is discharged in a flow manner,
b) The microorganism supply tank stores microorganisms, suspends microorganisms and supplies them to the flow path,
c) The microorganisms in the flow channel move at a constant flow rate until they are discharged together with the medium,
d) The test water injection device is connected to the flow-in flow channel at a position that gives a sufficient travel distance for the microorganisms moving in the flow channel to enter the logarithmic growth phase,
e) The microbial response detection device is a device that is disposed at a position that provides a sufficient movement distance to cause a change in microbial response when a harmful substance is mixed in the test water; more preferably, a test water injection device is connected. The apparatus further includes the same flow channel as a control flow channel, except that it is not.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
(1) Bioassay method In short, the present invention is provided with a supply tank for stably storing microorganisms at a low temperature, from which the microorganisms are sprinkled at a constant flow rate and supplied to the flow path, so that the microorganisms grow stably. By flowing through the flow channel and adding test water to be subjected to water quality inspection along the way, it is further grown, and by measuring and comparing the response of microorganisms before and after the test water load, Existence test is performed. Thereby, a bioassay for performing a water quality test without using a microorganism-fixed membrane has become possible.
[0008]
In the present invention, “sample water” refers to sample water supplied from environmental water such as rivers and lakes, sewage, and wastewater. These are sample water that is not contaminated with toxic substances and always requires a water quality test. It is.
[0009]
In the “flowing channel”, the medium supplied from the medium storage tank flows at a constant flow rate, and the medium is discharged in a flowing manner. A medium is usually supplied from the medium storage tank using a pump or the like. In the present invention, microorganisms are supplied from a microorganism supply tank to a flow channel in which a culture medium is flowing. Therefore, in the present invention, the microorganisms are poured and left to flow in the flow path together with the medium, and after performing one test, the microorganisms and the medium are discharged. The medium varies depending on the microorganism used, and a new medium is usually used. A new medium is a medium that has not yet been used for microbial growth. As the new medium, when the microorganism is yeast, usually YPD medium (1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% glucose) or SD medium (yeast nitrogen base without amino acids (Difco.0919-15-3)) Glucose and amino acid added are used.
[0010]
The microorganism supply tank stores a microorganism preservation solution at a low temperature, and the microorganism preservation solution is a suspension obtained by suspending microorganisms in a medium. The storage temperature is a temperature that does not freeze and maintains a dormant state. A desirable temperature is 0 ° C. to 15 ° C., and a more desirable temperature is 4 ° C. The culture medium of the microorganism preservation solution is a medium suitable for maintaining the dormant state of the microorganism to be used. Specifically, this medium may be the same as or different from the medium supplied from the medium storage tank to the flow path.
[0011]
The cell concentration in the microorganism supply tank is not particularly limited, but is a concentration that is suitable for storing microorganisms in a dormant state and that is sufficient to suspend and supply a sufficient concentration to detect a microorganism response to the flow path. It is. The capacity of the supply tank is defined by the speed at which the microorganisms are supplied to the flow channel and the period during which the microorganisms can be stored. For example, when supplying the microorganism preservation solution at a flow rate of 0.001 ml / min for 6 months, a capacity of about 500 ml is required.
[0012]
Preservation of microorganisms in the microorganism supply tank is preferably performed under conditions suitable for maintaining cells in a dormant state. In addition to the temperature being constant at a low temperature, the medium maintains the optimum pH of the microorganism used, has a mechanism for removing waste products released by the microorganism outside the cell, and so that the cells are evenly distributed. It is preferable that it is stirred.
It is desirable to select a type of microorganism that has a toxic substance responsiveness and has a sufficient survival rate even after being kept at a low temperature for a long time. For example, yeast cells have a survival rate of 10% or more after a storage period of 4 months (FIG. 7).
The present invention has been completed by finding that microorganisms survive stably at a low temperature as described above, and a bioassay using a microorganism supply tank is based on this finding.
[0013]
In the present invention, the “load of test water” may be intermittent or continuous. When the test water is intermittently loaded, the test water may be sample water collected from different places or sample water collected from the same place at different times. When the test water is intermittently loaded, the load amount of the test water once depends on the diameter of the flow-through channel. For example, if the diameter is 1-3 mm, usually 0.001-5 ml of the test water is used. To load.
When “loading of test water” is continuously performed, the present invention enables water quality inspection over time of the test water. Therefore, in this aspect, the present invention is a method for monitoring the presence or absence of contamination of harmful substances in test water over time, supplying microorganisms from a microorganism supply tank storing microorganisms to the flow path, The test water is continuously loaded to the non-immobilized microorganisms moving in the flow channel, and the microbial response to the continuously loaded water sample is continuously measured. A method is provided for detecting changes in microbial response caused by contamination over time. Here, the time-lapse water quality inspection of the test water can be arbitrarily performed for a desired monitoring time. Usually, it is several hours to several days or months. Basically, the monitoring time depends on the responsiveness of the microorganisms in the microorganism supply tank. When the test water is continuously loaded, the amount of water flowing into the flowing water flow path depends on the diameter of the flowing water flow path. 001-1 ml / min.
[0014]
The microorganisms used in the present invention are “non-immobilized microorganisms that move in the flow channel” and are not immobilized on the fixed membrane. The microorganisms used here are naturally occurring wild-type or wild-type strains, such as animal cells derived from humans, mice and other mammals, and established strains of animal cells, fish, nematodes, etc. that have been used in bioassays so far. Any of these cells, insect cells, fungal cells such as yeast, and bacterial cells such as Escherichia coli may be used. Wild strains are naturally occurring microorganisms that have not undergone recombination. Wild-type strains are microorganisms that have not touched the gene of interest. Established strains include those that can be subcultured with animal cells, such as those that have not undergone recombination, such as cancer cells.
[0015]
“Microbial response” refers to the number of microbial cells, the number of living cells, the amount of respiration, the amount of ATP, etc. in the case of a naturally occurring wild strain or wild type strain. Moreover, it can be the mRNA level of a gene that fluctuates in the presence of harmful substances. The mRNA level was determined by Northern blot method (Nobuhiko Ogata, Hiroshi Nojima: Second edition of Genetic Engineering Keyword Book, Yodosha, 2000, pp299-301), reverse transcription PCR method (RT-PCR) (Yakusaku Nakabetsu, etc .: Cell engineering separate volume Tips series Revised PCR Tips, Shujunsha, 1999, pp25-43).
Here, “genes that fluctuate in the presence of harmful substances” are disclosed in public databases (eg, MIPS: Munich Information Center for Protein Sequence, SGD: Saccharomyces Genome Database, USA) in the case of yeast cells. The yeast genes are appropriately selected from the existing yeast genes, and these can be known through the Internet. Preferred genes are mitochondrial protein, gene repair system protein, energy system protein, transport promoting protein, stress protein, metabolic system protein, detoxification protein and gene of unknown function. For example, YLR303W, YLL057C, YOR382W, YCR102C, YKL071W, etc.
[0016]
The microorganism used in the present invention also includes a recombinant of the above-mentioned naturally occurring cell, that is, a transformant. The transformant used in the present invention includes a polynucleotide construct obtained by operably linking a polynucleotide encoding a marker protein to a polynucleotide sequence of a promoter of the above-mentioned “gene that fluctuates in the presence of harmful substances”. It can be prepared by introducing the vector into the naturally occurring cells. Methods for operably linking a protein-encoding polynucleotide to a promoter are well known (eg, RW Old, SB Primrose, Principles of Gene Manipulation, 5th Edition, Baifukan, pp138-165, pp.234-263, 2000). reference). For example, in the case of yeast, the promoter sequence is disclosed in a public database (SCPD: The Promoter Database of Saccharomyces cerevisiae). Examples of marker proteins include GFP (Green Fluorescence Protein) (Heim, R., Cubitt, AB and Tsien, RY (1995) Nature 373, 663-664; Heim, R., Prasher DC. And Tsien, RY (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., 91, 12501-12504; Warg, S. and Hazerigg, T. (1994) Nature 639, 400-403; Youvan, DC and Michel-Beyerle, ME (1996) Nature Biotechnology 14 1219 -1220; Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, WW and Prasher, DC (1994) Science 263, 802-805), β-galactosidase (Canestro C, Albalat R, Escriva H, Gonzalez -Duarte R. Endogenous beta-galactosidase activity in amphioxus: a useful histochemical marker for the digestive system.Dev Genes Evol 2001 Mar 211 (3): 154-6), Luciferase (Arch Toxicol 2002 Jun; 76 (5-6): 257-61, Estrogenic activity of UV filters determined by an in vitro reporter gene assay and an in vivo transgenic zebrafish assay.Schreurs R, Lanser P, Seinen W, Van Der Burg B.), and acetyltransferase (J Recept Sig nal Transduct Res 2001 Feb; 21 (1): 71-84, A simplified method for large scale quantification of ranscriptional activity and its use in studies of steroids and steroid receptors.Zhang S, Lu J, Iyama K, Lo SC, Danielsen M .) And the like.
[0017]
For example, in the case of yeast cells, a vector is prepared by selecting a plasmid capable of replicating in yeast, inserting a polynucleotide encoding a marker protein into this, and then inserting a polynucleotide containing a promoter sequence into the upstream part of the marker gene. Can be done.
A transformant can be prepared by a known technique. For example, a method for transforming yeast cells is described in Kaiser C, Michaelis S, Mitchell A: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual 1994 edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press) pp. 133-134, 1994.
[0018]
When a transformant is used, the “microbial response” used in the present invention is the expression level of the marker protein. The expression level of the marker protein can be obtained by pulverizing the transformant to obtain a protein extract and measuring the amount of the marker protein in this solution. For example, when the marker protein is GFP, the fluorescence amount of the protein extract is measured with a fluorescence spectrophotometer. In addition, the expression level of the marker protein can be detected directly using fluorescence microscope, laser microscope image processing, flow cytometry measurement, evanescent light measurement, colorimeter, etc. without disrupting the transformant. In some cases, cell fluorescence (GFP) or color development (β-gal) can be measured. Preferred transformants are yeast transformed with a vector comprising a polynucleotide operably linked to a yeast gene promoter to a polynucleotide encoding a marker protein, or a chromosomal ORF with a polynucleotide encoding a marker protein. Yeast that has been transformed to replace, more preferably, the yeast gene is a mitochondrial protein, gene repair system protein, energy system protein, transport promoting protein, stress protein, metabolic system protein, detoxification protein and It is selected from genes whose functions are unknown.
[0019]
In the present invention, a change in microbial response caused when a harmful substance is mixed into the test water is detected. When harmful substances are present in the sample water, if microorganisms in the flow-through channel come into contact with the sample water, they are affected by growth inhibition, respiration rate reduction, and the like. In addition, when the microorganism is recombinant, expression of the reporter gene occurs.
[0020]
In the present invention, as described above, microorganisms are sprinkled from the microorganism supply tank, supplied into the flow path, and discharged in a sprinkling manner. Therefore, the “microorganism response” that can be measured in the present invention includes not only reversible responses such as oxygen consumption, but also irreversible factors such as the number of living cells accompanying the death of microorganisms and intracellular enzyme activity measured by destroying cells. Response is also available.
[0021]
It is possible to load test water immediately after supplying microorganisms to the flow channel. However, in the microorganism supply tank for supplying microorganisms, the microorganisms are in a dormant state. Therefore, in the present invention, preferably, the microorganism is pre-cultured before loading the test water, and then the test culture is performed while loading the test water. In this embodiment, the microorganisms supplied from the flow channel are held in the channel for a certain period of time, thereby performing pre-culture to recover the activity of the dormant microorganisms, and then loading the test water. Furthermore, in the preculture, in order to increase the chemical sensitivity of the microorganism, it is desirable to set the logarithmic growth phase, which is a state including cells at all stages of the cell cycle, as much as possible. Therefore, in the pre-culture, the microorganisms derived from the microorganism supply tank are diluted and cultured in a flow channel in which a new medium is flowing, and the temperature and time are controlled so that the microorganisms are in the logarithmic growth phase. Specifically, in the case of yeast, the preculture conditions are 25-30 ° C. and 2 hours to a few dozen hours. The length of the flow channel is adjusted according to the time. That is, the sample water injection is performed at a position that gives a sufficient movement distance for the microorganisms moving in the flow channel to enter the logarithmic growth phase.
[0022]
As described above, the test water load may be continuous or intermittent. The test culture is several tens of minutes to several hours depending on the response of the microorganism to be detected. The length of the flow channel is adjusted according to the time. That is, the microbial response detection is performed at a position that gives a sufficient travel distance to cause a change in the microbial response when a harmful substance is mixed into the test water.
[0023]
(2) Bioassay device As another aspect, the present invention provides a device for carrying out the bioassay method of the present invention. More specifically, a microorganism supply tank, a flow channel connected to the microorganism, a test water injection device for injecting test water into the flow channel, and a response of a microorganism supplied from the microorganism supply tank It is an apparatus for examining the presence or absence of harmful substances in the sample water, including the microbial response detection apparatus.
A typical apparatus in the present invention is shown in FIG.
[0024]
A device of the present invention with a control flow channel is shown in FIG. When detecting a response of a microorganism, a more accurate response can be grasped by taking a difference from a control state. Therefore, another flow channel is provided as a control zone to which no test water is added, and monitoring is performed in the same manner as the detection zone.
[0025]
An apparatus of the present invention having a plurality of microorganism supply tanks is shown in FIG.
By using a plurality of microorganism supply tanks, a plurality of microorganisms can be detected for response. Each microbe supply tank is provided with a flow channel connected thereto, a test water injection device for injecting test water into the flow channel, and a microbe detection device. It is also possible to use a single microorganism detection device by switching the flow channel as necessary. In this way, it is possible to estimate harmful substances in the test water by measuring a plurality of types of microbial responses for the same test water and comparing the responses. For example, when using two microorganism supply tanks each storing a promoter assay cell of the yeast gene YLL057C and a promoter assay cell of the yeast gene YBR072W as microorganisms, only YLL057C cells respond when pentachlorophenol is contained in the test water, Only YBR072W cells respond when -4-dichlorophenol or p-nonylphenol is included. In addition, when arsenite is included in the test water, both YLL057C cells and YBR072W cells respond.
[0026]
As another aspect, the present invention provides the apparatus of the present invention further comprising a sampling path sampling path for collecting non-immobilized microorganisms flowing through the flow channel. Specifically, a microorganism supply tank, a flow channel connected thereto, a test water injection device for injecting test water into the flow channel, and a method for collecting non-immobilized microorganisms flowing through the flow channel A sample detection path, a microorganism response detection device for detecting the response of microorganisms supplied from the sampling path, and a drainage port for discharging remaining microorganisms and sample water not collected from the sampling path It is a device for detecting contamination of harmful substances. An apparatus of this embodiment is shown in FIGS. 4-6.
[0027]
【Example】
EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to examples below, but the present invention is not limited to these examples.
[0028]
Example 1
1. Yeast cell viability with cryopreservation Yeast (Saccharomyces cerevisiae S288C (α SUC2mal mel gap2 CUP1)) was stored at 4 ° C. for 12 months in YPD medium (yeast extract 1%, polypeptone 2%, glucose 2%). During storage, the medium was always stirred with a stirrer.
The number of viable bacteria was measured as follows. First, 1.0 mL of the culture solution is aseptically measured with a micropipette, and diluted 10-fold with dilution water such as sterile physiological saline to prepare a bacterial count solution. Number of colonies grown after 3 days after each 10-fold diluted bacterial count solution was inoculated on YPD agar medium (solids solidified by adding 10% agar to YPD medium, autoclaving and pouring into petri dish) And CFU (colony forming unit) was obtained.
The obtained results are shown in FIG. FIG. 7 shows that microorganisms are gradually damaged and killed during low-temperature storage at about 4 ° C. Specifically, the number of viable cells is 10% or more even when the storage period is 4 months. This indicated that the yeast had a sufficient survival rate even after being kept at a low temperature for a long time.
[0029]
2. Detection of toxic substances by measuring growth Saccharomyces cerevisiae W303 (American Type Culture Collection ATCC 2001239) cryopreserved in selective medium (SD medium: yeast nitrogen base without amino acids (Difco.0919-15-3) + glucose + amino acids (Adenine, histidine, tryptophan, uracil, leucine)) was grown to a steady state by shaking culture at 25 ° C.
Yeast in a steady state was stored at 4 ° C. for 1 week, then diluted 10-fold with the same medium, and pre-cultured at 25 ° C. for 2 hours. Thereafter, the test sample was added and further cultured at 25 ° C. for 4 hours. A control group was cultured under the same conditions without adding chemical substances. Cell proliferation was measured by measuring absorbance at 600 nm. In each case, inhibition of cell proliferation was confirmed by the addition of chemical substances.
[Table 1]

[0030]
From the above results, it becomes clear that the presence or absence of harmful substances in the test water can be verified by measuring the absorbance of the specimen in the flow channel after 4 hours of the test water load.
[0031]
Example 2
Detection of hazardous substances by reporter gene assay Yeast gene YLL057C promoter assay cell preparation Primers for amplifying the oligonucleotide (SEQ ID NO: 1) containing the promoter sequence of the yeast gene YLL057C by PCR were prepared. Primers are designed using Oligo4.0-S, Sequencher _I Macintosh version, which is software for primer design. The base sequence of the upper primer is
GCTAACGAACAGGATGGTATTGA (SEQ ID NO: 2)
The base sequence of the lower primer is
ATTTTAACTGGGTTACTGTGCT (SEQ ID NO: 3)
It was. For PCR, a yeast chromosome (Saccharomyces cerevisiae S288C, Cat. 40802, Research Genetics, Inc.) was used as a template, and a commercially available kit (KOD DNA Polymerase; code KOD-101, Toyobo) was used.
[0032]
The vector used is pYES2 (pYES2, Catno: V825-20, Invirtogen Corporation, USA), a YEp-type shuttle vector that is replicated in both E. coli and yeast (RW Old, SB Primrose) , Baifukan, pp.234-263, 2000)). The polynucleotide encoding the marker protein GFP (SEQ ID NO: 4) was the GFP portion of the vector pQBI 63 (Cat no. 54-0082, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). First, a vector in which a GFP oligonucleotide was inserted into the multiple cloning site of pYES2 was prepared. Thereafter, the GAL1 promoter portion of pYES2 was replaced with an oligonucleotide containing the target yeast gene YLL057C. The operation of inserting an oligonucleotide containing GFP and a promoter sequence was performed by selecting an appropriate restriction enzyme.
[0033]
The procedure for transforming yeast with a vector is shown below.
1) The yeast cells W303 are cultured with shaking in 200 ml of SD medium until OD660 reaches 0.5.
2) Collect bacteria and suspend in 5 ml of TE-buffer.
3) Add 250 μL of 2.5M lithium acetate.
4) Dispense 300 μl each, add 10 μl of plasmid vector, and incubate at 30 ° C. for 30 minutes.
5) Add 700 μl of 50% PEG4000 and incubate with shaking at 30 ° C. for 60 minutes.
6) After heat shock (42 ° C., 5 minutes), cool rapidly.
7) Wash twice with 1M sorbitol.
8) Seed on agar plate made with minimal nutrient medium.
Confirmation of the transformation was performed using a selective medium (SD medium) + glucose + amino acid (adenine, histidine, tryptophan, leucine). The colonies grown on the agar plate of the selective medium were further confirmed for the auxotrophy of amino acids.
[0034]
2. Promoter Assay for Yeast Gene YBR072W Oligonucleotide (SEQ ID NO: 7) containing the promoter sequence of yeast gene YBR072W was amplified by PCR, and an upper primer was used as a primer for that purpose:
GCAGTCAACGAGGAGCGAATCAG (SEQ ID NO: 5),
Lower primer:
GTTAATTTGTTTAGTTTGTTTG (SEQ ID NO: 6) is used except that 1. The target transformant was prepared in the same manner as described above.
[0035]
3. Detection of toxic substances by measurement of growth The obtained transformant is brought into a steady state by shaking culture at 25 ° C. in a selective medium (SD medium) + glucose + amino acid (adenine, histidine, tryptophan, leucine). Allowed to grow.
Steady-state transformants were stored at 4 ° C. for 1 week, then diluted 10-fold with the same medium, and precultured at 25 ° C. for 15 hours. Thereafter, a test sample was added and further cultured for 4 hours. A control group was cultured under the same conditions without adding chemical substances. Samples were collected and fluorescence was measured by flow cytometry (EPICS XL: Beckman Coulter). The fluorescence intensity when no chemical substance was loaded was measured in advance, and those having a fluorescence intensity 1.5 times higher than that were indicated as + with fluorescence detection.
[0036]
[Table 2]

[0037]
Table 2 shows that only YLL057C cells respond when pentachlorophenol is included in the sample, only YBR072W cells respond when 2-4-dichlorophenol or p-nonylphenol is included, and arsenite in the sample Is included, indicating that both YLL057C and YBR072W cells respond.
Thus, it was shown that chemical substances can be estimated by using a culture tank of a plurality of promoter assay cells.
[0038]
【The invention's effect】
The effects produced by the present invention are listed below.
1. When the conventional microorganism-fixed membrane is damaged by microorganisms due to excessive contamination by other microorganisms or harmful substances, the microorganism-fixed membrane needs to be replaced. In the present invention, membrane exchange is not required by using the microorganism supply tank.
2. In the present invention, the toxicity can be evaluated without replacing the microorganism supply tank as long as the microorganism supply tank can maintain the growth, so the culture tank is replaced by using a microorganism that can maintain the growth for a long period of time. The period becomes longer.
3. In the present invention, microorganisms are provided in a flow-through manner from the flow-through channel to the detection device, so that not only reversible microbial response measurement such as oxygen consumption but also the number of living cells and cells accompanying the death of microorganisms are destroyed. Measurement of irreversible microbial responses such as intracellular enzyme activity can also be used. Further, since the cells are not fixed to the membrane, it is possible to use a method of measuring individual cells by flow cytometry.
4). In the case of a microorganism-fixed membrane, since the cells on the membrane are monitored repeatedly or continuously, it is necessary to keep the cell state constant to some extent. However, since it is not necessary to keep the cell state constant in the case of flowing, it is also possible to use a very standard measurement method for measuring the microbial response, such as measuring the increase in the number of cells.
5. The effects of chemical substances are particularly prominent in microorganisms during the logarithmic growth phase. By controlling the temperature and time so that the microorganisms are grown in the flow channel and the test substance is in the logarithmic growth phase, it becomes possible to further increase the chemical substance sensitivity.
[0039]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a conceptual diagram of an apparatus for detecting the presence or absence of harmful substances in test water, including a microbe supply tank, a flow channel, a test water injection device, and a microbe response detection device.
FIG. 2 is an apparatus of the present invention further comprising a control flow channel.
FIG. 3 is an apparatus of the present invention provided with a plurality of microorganism supply tanks.
FIG. 4 is a conceptual diagram of an apparatus for detecting the presence or absence of harmful substances in test water, including a microorganism supply tank, a flow channel, a test water injection device, a sampling channel, a microbe response detection device, and a drain port. is there.
FIG. 5 is an apparatus of the present invention further comprising a control flow channel.
FIG. 6 is an apparatus of the present invention provided with a plurality of microorganism supply tanks.
FIG. 7 is a graph showing the results of a yeast survival test.

Claims

A method for examining the presence or absence of toxic substances in test water, wherein microorganisms are sprinkled from a microorganism supply tank storing microorganisms and supplied to the flow path, and the immobilization is moving in the flow path Including loading test water on a microorganism, measuring a microbial response to the loaded test water, and detecting a change in the microbial response caused when a harmful substance is mixed in the test water , wherein the microorganism Is a yeast .

The method according to claim 1, wherein non-immobilized microorganisms move together with the culture medium at a constant flow velocity in the flow channel.

The method according to claim 1 or 2, wherein the microorganism is pre-cultured before loading the test water, and then the test culture is performed while loading the test water.

The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the measurement of the microbial response is measurement of growth based on turbidity.

The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the measurement of the microbial response is a reporter gene assay.

A flow channel, a microorganism supply tank connected to the flow channel, a test water injection device for injecting test water into the flow channel, and a microbial response detection for detecting the response of microorganisms supplied from the microorganism supply tank An apparatus for testing whether or not a harmful substance is mixed in a sample water in which the microorganism is yeast.

a) In the flow channel, the medium flows at a constant flow velocity, and the medium is discharged in a flowing manner.
  b) The microorganism supply tank stores microorganisms, suspends microorganisms and supplies them to the flow path,
  c) The microorganisms in the flow channel move at a constant flow rate until they are discharged together with the medium,
  d) The test water injection device is connected to the flow-in flow channel at a position that gives a sufficient travel distance for the microorganisms moving in the flow channel to enter the logarithmic growth phase,
  e) The device according to claim 6, wherein the device for detecting a microbial response is disposed at a position that provides a movement distance sufficient to cause a change in the microbial response when a harmful substance is mixed into the test water.

8. The apparatus according to claim 6, further comprising the same flow channel as a control flow channel except that the test water injection device is not connected.

The apparatus according to any one of claims 6 to 8, wherein the detection of the microbial response is measurement of growth based on turbidity.

The apparatus according to any one of claims 6 to 8, wherein the detection of the microbial response is a reporter gene assay. 50100