JP2004290054A

JP2004290054A - Bioassay equipment

Info

Publication number: JP2004290054A
Application number: JP2003085656A
Authority: JP
Inventors: Hitoshi Iwahashi; 均岩橋; 淳子 ▲高▼橋; Junko Takahashi
Original assignee: Daikin Industries Ltd; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: Daikin Industries Ltd; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2003-03-26
Filing date: 2003-03-26
Publication date: 2004-10-21
Anticipated expiration: 2023-03-26
Also published as: JP4323844B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide bioassay equipment which can perform a bioassay for checking the quality of water without using a microorganism-immobilizing membrane. <P>SOLUTION: This bioassay equipment is formed by disposing a supply tank for stably storing microorganisms at a low temperature, supplying the microorganisms to a disposably flowing passage at a constant flow rate, and flowing the supplied microorganisms in the disposably flowing passage under conditions for stably growing the microorganisms. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物固定膜を用いない、水質検査を行うためのバイオアッセイ方法および装置に関する。
【０００２】
【従来の技術および解決課題】
これまで、河川・湖沼等の環境水および下水、排水中に含まれている化学物質等の水質検査を行う、連続的に検査できかつ微生物を指標としているバイオアッセイ装置は、微生物固定膜を利用、即ち微生物を膜に固定してその呼吸活性を計測する（特許文献１、２および３）。しかし、微生物固定膜は微生物の応答が維持できる期間を超えると、微生物固定膜の交換が必要である。また、強い毒性を有する試料に曝されると、微生物が回復不可能なダメージを受け、交換時期に達しなくても微生物固定膜を交換する必要が生じる。そして、装置が水源に設置されている場合は、特に膜交換が困難となる。さらに、微生物を膜に固定した場合、微生物の応答を酸素電極を用いて酸素消費量により計測することは可能であるが、微生物細胞を破壊して測定する必要のある酵素活性の比色による測定や、蛍光、燐光等による測定には不向きである。
【０００３】
【特許文献１】
特開平７−６３７２５
【特許文献２】
特開平１１−３７９６９
【特許文献３】
特開２０００−２０６０８７
【０００４】
【課題解決手段】
そこで、微生物固定膜を用いない、水質検査を行うためのバイオアッセイを鋭意研究した結果、低温で安定的に生存する微生物の存在を明らかにできたので、低温で安定的に微生物を保存する供給槽を設け、そこから一定の流速度で微生物を掛流し流路に供給し、微生物が安定に生育する条件で掛流し流路中を流すことで、水質検査を行うためのバイオアッセイが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【０００５】
即ち、本発明は、
（１）検水中の有害物質混入の有無を検定する方法であって、微生物を保存している微生物供給槽から微生物を掛流し流路に供給し、前記掛流し流路中を移動している非固定化微生物に対して検水を負荷し、負荷される検水に対する微生物応答を測定し、検水中に有害物質が混入した場合に引き起こされる微生物応答の変化を検出することを特徴とする方法；
好ましくは、掛流し流路中、培地とともに非固定化微生物が一定の流速度で移動する方法；さらに好ましくは、検水を負荷する前に微生物を前培養して対数増殖期とし、次いで検水を負荷しつつ試験培養を行う方法；および
【０００６】
（２）掛流し流路、それに連結している微生物供給槽、掛流し流路に検水を注入するための検水注入装置、および微生物供給槽から供給される微生物の応答を検出するための微生物応答検出装置を含む、検水中の有害物質混入の有無を検定するための装置；
好ましくは、ａ）掛流し流路中では、培地が一定の流速度で流れており、その培地は掛流し的に排出され、
ｂ）微生物供給槽は微生物を保存しており、微生物を掛流し流路へ供給し、
ｃ）掛流し流路中の微生物は培地とともに排出されるまで一定の流速度で移動し、
ｄ）検水注入装置は、掛流し流路中を移動している微生物が対数増殖期となるに充分な移動距離を与える位置にて掛流し流路と連結し、
ｅ）微生物応答検出装置は、検水中に有害物質が混入した場合に微生物応答の変化が引き起こされるに充分な移動距離を与える位置に配置されている装置；さらに好ましくは、検水注入装置が連結していない点以外は同じ掛流し流路を対照掛流し流路としてさらに含む装置；に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
（１）バイオアッセイ方法
本発明は要するに、低温で安定的に微生物を保存する供給槽を設け、そこから一定の流速度で微生物を掛流し流路に供給し、微生物が安定に生育する条件で掛流し流路中を流し、途中、水質検査の対象となる検水を加えてさらに生育させ、検水負荷前と負荷後の微生物の応答を測定し比較することにより、検水中の有害物質の有無の検定を行う。これにより、微生物固定膜を用いずに水質検査を行うためのバイオアッセイが可能となった。
【０００８】
本発明において「検水」とは、河川・湖沼等の環境水および下水、排水から供給される検体試料水であり、これらは有害物質が混入されていないか、水質検査が常に必要な試料水である。
【０００９】
「掛流し流路」では、培地保存槽から供給される培地が一定の流速度で流れており、その培地は掛流し的に排出される。培地保存槽からの培地の供給は通常ポンプ等を用いる。本発明では、培地が流れている掛流し流路に対し、微生物を微生物供給槽から供給する。よって、本発明では、微生物は掛流し流路中を培地とともに流れるのに任せて放置し、１回の検定を行った後、微生物および培地は排出される。培地は、用いる微生物に応じて変動し、通常は新しい培地を使用する。新しい培地とは微生物生育に未だ使用していない培地である。新しい培地としては、微生物が酵母の場合、通常ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、ブドウ糖２％）、またはＳＤ培地（ｙｅａｓｔｎｉｔｒｏｇｅｎｂａｓｅｗｉｔｈｏｕｔａｍｉｎｏａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ．０９１９−１５−３））にグルコース、アミノ酸を加えたものを用いる。
【００１０】
微生物供給槽は、微生物保存液を低温で保存したものであり、ここに微生物保存液とは、培地中に微生物を懸濁させて得られた懸濁液である。保存温度は、凍結せずかつ休眠状態を維持する温度であり、望ましい温度は０℃から１５℃、さらに望ましい温度は４℃である。微生物保存液の培地は、使用する微生物の休眠状態を維持するのに適した培地である。具体的には、この培地は培地保存槽から掛流し流路に供給される培地と同じであっても異なっていてもよい。
【００１１】
微生物供給槽における細胞濃度は特に限定されないが、微生物を休眠状態で保存するのに適当な濃度でありかつ微生物応答を検出するのに十分な濃度を掛流し流路へ供給するのに可能な濃度である。供給槽の容量は、掛流し流路に微生物を供給する速度と微生物が保存可能である期間により規定される。例えば、６ヶ月間、流速０．００１ｍｌ／分で微生物保存液を供給する場合、５００ｍｌ程度の容量が必要となる。
【００１２】
微生物供給槽における微生物の保存は、細胞が休眠状態で維持するのに適当な条件が好ましい。温度が低温で一定であることに加え、培地は、使用する微生物の至適ｐＨを維持し、微生物が細胞外に放出する老廃物を除去する機構等を有すること、細胞が均一に分布するよう攪拌されていることが好ましい。
使用する微生物は有害物質応答性を有するとともに、長期間低温で保持した後も、十分な生存率を有する種類を選択することが望ましい。例えば、酵母細胞は保存期間が４ヶ月後において１０％以上の生存率を有する（図７）。
本発明は、このように微生物が低温において安定的に生存することを見出し、完成されたものであり、微生物供給槽を用いるバイオアッセイはこの知見を基礎としている。
【００１３】
本発明では、「検水の負荷」は間欠的であっても連続的であってもよい。間欠的に検水を負荷する場合、検水は異なる場所から採取した試料水であってよく、同じ場所から異なる時間に採取した試料水であってよい。間欠的に検水を負荷する場合、検水の１回の負荷量は掛流し流路の径に依存するが、例えば径が１−３ｍｍであれば、通常、検水０．００１−５ｍｌを負荷する。
「検水の負荷」を連続的に行う場合、本発明により、検水の経時的な水質検査が可能となる。よって、この態様では、本発明は、検水中の有害物質混入の有無を経時的にモニターする方法であって、微生物を保存している微生物供給槽から微生物を掛流し流路に供給し、前記掛流し流路中を移動している非固定化微生物に対して連続的に検水を負荷し、連続的に負荷される検水に対する微生物応答を連続的に測定し、検水中に有害物質が混入した場合に引き起こされる微生物応答の変化を経時的に検出することを特徴とする方法を提供する。ここに、検水の経時的な水質検査は、任意にモニターしたい時間行うことができる。通常は、数時間から数日、あるいは数ヶ月である。基本的には、モニター時間は、微生物供給槽中の微生物の応答性に依存する。連続的に検水を負荷する場合、検水の掛流し流路への通水量は、掛流し流路の径に依存するが、例えば径が１−３ｍｍであれば、通常、検水０．００１−１ｍｌ／分である。
【００１４】
本発明に用いる微生物は、「掛流し流路中を移動する非固定化微生物」であり、固定膜に固定化されていない。ここに使用される微生物は天然に存在する野生株または野生型株、例えばヒト、マウスその他の哺乳類由来の動物細胞および動物細胞の樹立株、これまでバイオアッセイに用いられている魚類、線虫等の細胞、昆虫細胞、酵母等の真菌細胞、および大腸菌等の細菌細胞の何れであっても良い。野生株は天然に存在する組換えを行っていない微生物である。野生型株は注目する遺伝子に手をつけていない微生物である。樹立株は動物細胞で継代培養できるもの、例えばガン細胞などの組換えが施されていないものも含む。
【００１５】
「微生物応答」とは、天然に存在する野生株または野生型株の場合、微生物細胞数、生細胞数、呼吸量、ＡＴＰ量等である。また、有害物質の存在下に変動する遺伝子のｍＲＮＡレベルであることができる。ｍＲＮＡレベルは、ノーザンブロット法（緒方宣邦、野島博：遺伝子工学キーワードブック改定第２版、羊土社、２０００，ｐｐ２９９−３０１）、逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）（中別府雄作、他：細胞工学別冊Ｔｉｐｓシリーズ改定ＰＣＲＴｉｐｓ，秀潤社、１９９９，ｐｐ２５−４３）等によって測定できる。
ここに、「有害物質の存在下に変動する遺伝子」は、酵母細胞の場合、公共のデータベース（例えば、ドイツのＭＩＰＳ：ＭｕｎｉｃｈＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒｆｏｒＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅ、米国のＳＧＤ：ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓＧｅｎｏｍｅＤａｔａｂａｓｅ）に開示されている酵母遺伝子の中から適宜選択し、これらはインターネットを介して知ることができる。好ましい遺伝子は、ミトコンドリアタンパク質、遺伝子修復系タンパク質、エネルギー系タンパク質、トランスポート促進タンパク質、ストレスタンパク質、代謝系タンパク質、脱毒性タンパク質および機能未知の遺伝子である。例えば、ＹＬＲ３０３Ｗ、ＹＬＬ０５７Ｃ、ＹＯＲ３８２Ｗ、ＹＣＲ１０２Ｃ、ＹＫＬ０７１Ｗ等である。
【００１６】
本発明で使用される微生物にはまた、上記天然に存在する細胞の組換え体、即ち形質転換体が含まれる。本発明に用いる形質転換体は、上記「有害物質の存在下に変動する遺伝子」のプロモーターのポリヌクレオチド配列に、マーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結して得られるポリヌクレオチド構築物を含むベクターを上記天然に存在する細胞に導入することにより調製できる。プロモーターにタンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結する方法は周知である（例えばＲ．Ｗ．オールド、Ｓ．Ｂ．プリムローズ遺伝子操作の原理原書第５版，培風館，ｐｐ１３８−１６５，ｐｐ．２３４−２６３，２０００を参照）。プロモーターの配列は、例えば酵母の場合、公共のデータベース（ＳＣＰＤ：ＴｈｅＰｒｏｍｏｔｅｒＤａｔａｂａｓｅｏｆＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に開示されている。マーカータンパク質の例としてはＧＦＰ（ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰｒｏｔｅｉｎ）（Ｈｅｉｍ，Ｒ．，Ｃｕｂｉｔｔ，Ａ．Ｂ．ａｎｄＴｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ３７３，６６３−６６４；Ｈｅｉｍ，Ｒ．，ＰｒａｓｈｅｒＤＣ．ａｎｄＴｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１，１２５０１−１２５０４；Ｗａｒｇ，Ｓ．ａｎｄＨａｚｅｒｉｇｇ，Ｔ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ６３９，４００−４０３；Ｙｏｕｖａｎ，Ｄ．Ｃ．ａｎｄＭｉｃｈｅｌ−Ｂｅｙｅｒｌｅ，Ｍ．Ｅ．（１９９６）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４１２１９−１２２０；Ｃｈａｌｆｉｅ，Ｍ．，Ｔｕ，Ｙ．，Ｅｕｓｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇ．，Ｗａｒｄ，Ｗ．Ｗ．ａｎｄＰｒａｓｈｅｒ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６３，８０２−８０５）、β−ガラクトシダーゼ（ＣａｎｅｓｔｒｏＣ，ＡｌｂａｌａｔＲ，ＥｓｃｒｉｖａＨ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−ＤｕａｒｔｅＲ．Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎａｍｐｈｉｏｘｕｓ：ａｕｓｅｆｕｌｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｍａｒｋｅｒｆｏｒｔｈｅｄｉｇｅｓｔｉｖｅｓｙｓｔｅｍ．ＤｅｖＧｅｎｅｓＥｖｏｌ２００１Ｍａｒ２１１（３）：１５４−６）、ルシフェラーゼ（ＡｒｃｈＴｏｘｉｃｏｌ２００２Ｊｕｎ；７６（５−６）：２５７−６１、ＥｓｔｒｏｇｅｎｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＵＶｆｉｌｔｅｒｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙａｎｉｎｖｉｔｒｏｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅａｓｓａｙａｎｄａｎｉｎｖｉｖｏｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｚｅｂｒａｆｉｓｈａｓｓａｙ．ＳｃｈｒｅｕｒｓＲ，ＬａｎｓｅｒＰ，ＳｅｉｎｅｎＷ，ＶａｎＤｅｒＢｕｒｇＢ．）、及びアセチルトランスフェラーゼ（ＪＲｅｃｅｐｔＳｉｇｎａｌＴｒａｎｓｄｕｃｔＲｅｓ２００１Ｆｅｂ；２１（１）：７１−８４，Ａｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒｌａｒｇｅｓｃａｌｅｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｉｔｓｕｓｅｉｎｓｔｕｄｉｅｓｏｆｓｔｅｒｏｉｄｓａｎｄｓｔｅｒｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．ＺｈａｎｇＳ，ＬｕＪ，ＩｙａｍａＫ，ＬｏＳＣ，ＤａｎｉｅｌｓｅｎＭ．）等が挙げられる。
【００１７】
ベクターの調製は、例えば酵母細胞の場合、酵母において複製可能なプラスミドを選択し、これにマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入し、次いでプロモーター配列を含むポリヌクレオチドをマーカー遺伝子の上流部分に挿入することにより行うことができる。
形質転換体は周知の手法により調製できる。例えば、酵母細胞を形質転換する方法は、ＫａｉｓｅｒＣ，ＭｉｃｈａｅｌｉｓＳ，ＭｉｔｃｈｅｌｌＡ：ＡＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｕｒｓｅＭａｎｕａｌ１９９４ｅｄｉｔｉｏｎ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）ｐｐ．１３３−１３４，１９９４に記載されている。
【００１８】
形質転換体を用いた場合、本発明に使用される「微生物応答」はマーカータンパク質の発現レベルである。マーカータンパク質の発現レベルは、形質転換体を粉砕しタンパク質抽出液を得、この液中のマーカータンパク質量を測定することにより得られる。例えばマーカータンパク質がＧＦＰの場合、タンパク質抽出液の蛍光量を蛍光分光光度計により計測する。また、マーカータンパク質の発現レベルは、形質転換体を粉砕しなくても直接、蛍光顕微鏡、レーザー顕微鏡による画像処理、フローサイトメトリーによる計測、エバネッセント光による計測、さらに比色計などを用いた検出方法により、細胞の蛍光（ＧＦＰ）もしくはもしくは発色（β−ｇａｌ）を測定できる場合もある。好ましい形質転換体は、酵母遺伝子のプロモーターをマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したポリヌクレオチドを含むベクターによって形質転換されている酵母、または染色体のＯＲＦをマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドで置換するように形質転換されている酵母であり、さらに好ましくは、その酵母遺伝子がミトコンドリアタンパク質、遺伝子修復系タンパク質、エネルギー系タンパク質、トランスポート促進タンパク質、ストレスタンパク質、代謝系タンパク質、脱毒性タンパク質および機能未知の遺伝子のなかから選ばれるものである。
【００１９】
本発明では、検水中に有害物質が混入した場合に引き起こされる微生物応答の変化を検出する。検水に有害物質が存在する場合、掛流し流路中の微生物が検水と接触すると、生育阻害、呼吸量低下等の影響を受ける。加えて微生物が組換え体である場合、レポーター遺伝子の発現が起きる。
【００２０】
本発明では上記の通り、微生物供給槽から微生物を掛流し流路中に供給し、掛流し的に排出される。そのため、本発明において測定できる「微生物応答」として、酸素消費量等の可逆的な応答のみならず、微生物の死滅を伴う生細胞数および細胞を破壊して測定する細胞内の酵素活性などの不可逆的な応答も利用できる。
【００２１】
掛流し流路に微生物を供給した直後に検水の負荷を行うことが可能である。しかし、微生物を供給するための微生物供給槽では微生物は休眠状態にある。よって、本発明では好ましくは、検水を負荷する前に微生物を前培養し、次いで検水を負荷しつつ試験培養を行う。この態様では、掛流し流路から供給される微生物を一定時間流路中で保持し、それにより休眠状態の微生物の活性を回復させる前培養を行い、次いで検水の負荷を行う。前培養ではさらに、微生物の化学物質感受性を上げるため、可能な限り、細胞周期のすべてのステージの細胞を含む状態である対数増殖期とすることが望ましい。そこで、前培養では、新しい培地が流れている掛流し流路内にて微生物供給槽由来の微生物を希釈培養し、それにより微生物が対数増殖期になるように温度および時間を制御する。具体的には、酵母の場合、前培養の条件は２５−３０℃、２時間から十数時間である。時間に応じて、掛流し流路の長さを調節する。即ち、検水注入は、掛流し流路中を移動している微生物が対数増殖期となるに充分な移動距離を与える位置にて行う。
【００２２】
ここに、検水負荷が連続的でも間欠的でもよいことは上述の通りである。試験培養は、検出すべき微生物の応答により異なるが、数１０分から数時間である。時間に応じて、掛流し流路の長さを調節する。即ち、微生物応答検出は、検水中に有害物質が混入した場合に微生物応答の変化が引き起こされるに充分な移動距離を与える位置にて行う。
【００２３】
（２）バイオアッセイ装置
本発明は別の態様として、本発明のバイオアッセイ方法を実施するための装置を提供する。詳細には、微生物供給槽、それに連結している掛流し流路、掛流し流路に検水を注入するための検水注入装置、および微生物供給槽から供給される微生物の応答を検出するための微生物応答検出装置を含む、検水中の有害物質混入の有無を検定するための装置である。
本発明における典型的な装置を図１に示す。
【００２４】
対照掛流し流路を備えた本発明の装置を図２に示す。微生物の応答を検出する場合、対照となる状態との差をとることにより、より正確な応答を把握することができる。そこで、検水を加えない対照区として別の掛流し流路を設け、検出区と同様にモニタリングする。
【００２５】
微生物供給槽を複数備えた本発明の装置を図３に示す。
微生物供給槽を複数用いることで、応答を検出する微生物を複数にすることができる。微生物供給槽各々に、それに連結している掛流し流路、掛流し流路に検水を注入するための検水注入装置、微生物検出装置を配する。微生物検出装置は１台で必要に応じて掛流し流路を切り替えて用いることも可能である。このようにして、同一の検水について複数種類の微生物応答を計測し、その応答を比較することによって、検水中の有害物質を推定することが可能となる。例えば、微生物として酵母遺伝子ＹＬＬ０５７Ｃのプロモーターアッセイ細胞および酵母遺伝子ＹＢＲ０７２Ｗのプロモーターアッセイ細胞を保存したそれぞれ２つの微生物供給槽用いた場合、検水にペンタクロロフェノールが含まれるとＹＬＬ０５７Ｃ細胞のみが応答し、２−４−ジクロロフェノールまたはｐ−ノニルフェノールが含まれるとＹＢＲ０７２Ｗ細胞のみが応答する。また、亜ヒ酸塩が検水に含まれると、ＹＬＬ０５７Ｃ細胞およびＹＢＲ０７２Ｗ細胞の両方が応答する。
【００２６】
本発明は別の態様として、掛流し流路を流れる非固定化微生物を採取するためのサンプリング路サンプリング路をさらに備えた本発明の装置を提供する。具体的には、微生物供給槽、それに連結している掛流し流路、掛流し流路に検水を注入するための検水注入装置、掛流し流路を流れる非固定化微生物を採取するためのサンプリング路、サンプリング路から供給される微生物の応答を検出するための微生物応答検出装置、およびサンプリング路から採取されなかった残りの微生物および検水を排出するための排液口を含む、検水中の有害物質混入の検出するための装置である。この態様の装置を図４−６に示す。
【００２７】
【実施例】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００２８】
実施例１
１．低温保存持の酵母細胞の生存率
ＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、ブドウ糖２％）に酵母（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳ２８８Ｃ（α ＳＵＣ２ｍａｌｍｅｌｇａｐ２ＣＵＰ１））を４℃で１２ヶ月保存した。保存時はスターラーで培地を常に攪拌した。
生菌数の測定は、次の様に行った。先ず、培養液１．０ｍＬをマイクロピペットで無菌的に計り取り、滅菌生理食塩水などの希釈水で１０倍段階希釈し、菌数溶液を作製する。各１０倍段階希釈した菌数溶液をＹＰＤ寒天培地（ＹＰＤ培地に１０％の寒天を加えてオートクレーブで加熱滅菌し、シャーレに注ぎ、固まらせた固体）に播種し、３日後に生育したコロニー数を計測し、ＣＦＵ（コロニー形成単位）を得た。
得られた結果を図７に示す。図７は、４℃程度の低温保存において微生物が次第に損傷を受け死滅することを示している。具体的には、保存期間が４ヶ月でも生細胞数は１０％以上となっている。これにより、酵母は長期間低温で保持した後も、十分な生存率を有することが示された。
【００２９】
２．生育の計測による毒性物質の検出
凍結保存した酵母ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＷ３０３株（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＡＴＣＣ２００１２３９）を選択培地（ＳＤ培地：ｙｅａｓｔｎｉｔｒｏｇｅｎｂａｓｅｗｉｔｈｏｕｔａｍｉｎｏａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ．０９１９−１５−３）＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ウラシル、ロイシン））にて２５℃において振盪培養することにより定常状態になるように増殖させた。
定常状態にある酵母を４℃にて１週間保存し、次いで上記同じ培地で１０倍希釈し、２５℃にて２時間、前培養を行った。その後、被検試料を添加しさらに４時間、２５℃にて培養した。これと同条件で化学物質を添加せずに培養して対照区とした。６００ｎｍの吸光度を測定することにより、細胞の増殖を計測した。化学物質の添加により、いずれも細胞増殖の阻害が確認された。
【表１】

【００３０】
以上の結果より、検水負荷の４時間後における掛流し流路中の検体の吸光度を測定することにより、検水中の有害物質の有無が検定できることが明らかとなる。
【００３１】
実施例２
レポーター・ジーン・アッセイによる有害物質の検出
１．酵母遺伝子ＹＬＬ０５７Ｃプロモーターアッセイ細胞作成
酵母遺伝子ＹＬＬ０５７Ｃのプロモーター配列を含むオリゴヌクレオチド（配列番号１）をＰＣＲにより増幅するためのプライマーを作成した。プライマーはプライマー設計用のソフトウェアであるＯｌｉｇｏ４．０−Ｓ，Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ_Ｉマッキントッシュ版を用いて設計し、アッパープライマーの塩基配列は
ＧＣＴＡＡＣＧＡＡＣＡＧＧＡＴＧＧＴＡＴＴＧＡ（配列番号２）
であり、ロウワープライマーの塩基配列は、
ＡＴＴＴＴＡＡＣＴＧＧＧＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴ（配列番号３）
とした。ＰＣＲはテンプレートとして酵母の染色体（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳ２８８Ｃ，Ｃａｔ．４０８０２，ＲｅｓｅｒｃｈＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を用い試薬は市販のキット（ＫＯＤＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ；コードＫＯＤ−１０１、Ｔｏｙｏｂｏ）を使用した。
【００３２】
使用するベクターは大腸菌と酵母の両方で複製されるＹＥｐ型シャトルベクターであるｐＹＥＳ２（ｐＹＥＳ２，Ｃａｔｎｏ：Ｖ８２５−２０，ＩｎｖｉｒｔｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）（Ｒ．Ｗ．オールド、Ｓ．Ｂ．プリムローズ遺伝子操作の原理原書第５版，培風館，ｐｐ．２３４−２６３，２０００））を用いた。また、マーカータンパク質ＧＦＰをコードするポリヌクレオチド（配列番号４）はベクターｐＱＢＩ６３（Ｃａｔｎｏ．５４−００８２，和光純薬工業（株））のＧＦＰの部分を用いた。まず、ｐＹＥＳ２の多重クローニング部位（ｍｕｌｔｉｐｌｅｃｌｏｎｉｎｇｓｉｔｅ）の中にＧＦＰのオリゴヌクレオチドを挿入したベクターを作成した。その後、ｐＹＥＳ２のＧＡＬ１プロモーターの部分を目的とする酵母遺伝子であるＹＬＬ０５７Ｃのプロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドで置換した。ＧＦＰおよびプロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドの挿入の操作は、適当な制限酵素を選択して行った。
【００３３】
ベクターで酵母を形質転換する手順を以下に示す。
１）酵母細胞Ｗ３０３を２００ｍｌのＳＤ培地でＯＤ６６０が０．５になるまで振とう培養する。
２）集菌して５ｍｌのＴＥ−ｂｕｆｆｅｒにけん濁する。
３）２．５Ｍのリチウムアセテイト２５０μＬを添加する。
４）３００μｌずつ分注し１０μｌのプラスミドベクターを添加し、３０℃３０分培養する。
５）７００μｌの５０％ＰＥＧ４０００を付加し、３０℃６０分振とう培養する。
６）ヒートショック（４２℃、５分）後、急冷する。
７）１Ｍソルビト−ルで２回洗浄する。
８）最小栄養培地で作成した寒天プレートに播種する。
形質転換の確認は選択培地（ＳＤ培地）＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ロイシン）により行った。選択培地の寒天プレートに生育したコロニーはさらに、アミノ酸の栄養要求性を確認した。
【００３４】
２．酵母遺伝子ＹＢＲ０７２Ｗのプロモーターアッセイ細胞作成
酵母遺伝子ＹＢＲ０７２Ｗのプロモーター配列を含むオリゴヌクレオチド（配列番号７）をＰＣＲにより増幅し、そのためのプライマーとして、アッパープライマー：
ＧＣＡＧＴＣＡＡＣＧＡＧＧＡＧＣＧＡＡＴＣＡＧ（配列番号５）、
ロウワープライマー：
ＧＴＴＡＡＴＴＴＧＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＴＴＧ（配列番号６）、を用いる以外は、上記１．と同様に処理し、目的の形質転換体を作成した。
【００３５】
３．生育の計測による毒性物質の検出
得られた形質転換体を選択培地（ＳＤ培地）＋グルコース＋アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、ロイシン）にて２５℃において振盪培養することにより定常状態になるように増殖させた。
定常状態の形質転換体を４℃にて１週間保存し、次いで上記同じ培地で１０倍希釈し、前培養を２５℃にて１５時間行った。その後、被検試料を添加しさらに４時間培養した。これと同条件で化学物質を添加せずに培養して対照区とした。サンプルを採取し、フローサイトメトリー（ＥＰＩＣＳＸＬ：ベックマンコールター）で蛍光を計測した。化学物質を負荷しない場合の蛍光強度を予め測定し、その１．５倍以上の蛍光強度を有するものを蛍光検出有りとして＋と表示した。
【００３６】
【表２】

【００３７】
表２は、検水にペンタクロロフェノールが含まれるとＹＬＬ０５７Ｃ細胞のみが応答し、２−４−ジクロロフェノールまたはｐ−ノニルフェノールが含まれるとＹＢＲ０７２Ｗ細胞のみが応答し、そして検水に亜ヒ酸塩が含まれると、ＹＬＬ０５７Ｃ細胞およびＹＢＲ０７２Ｗ細胞の両方が応答することを示している。
これにより、複数のプロモーターアッセイ細胞の培養槽を用いることにより、化学物質の推定が可能となることが示された。
【００３８】
【発明の効果】
本発明により奏される効果を以下に列挙する。
１．従来の微生物固定膜は他の微生物混入、有害物質による過度な障害により微生物の損傷を受けた場合、微生物固定膜の交換の必要があった。本発明では、微生物供給槽を用いることで、膜交換が不要となる。
２．本発明では、微生物供給槽の生育維持可能な期間であれば、微生物供給槽を交換することなく毒性評価が可能であるため、長期間生育が維持できる微生物を用いることにより、培養槽を交換する期間が長くなる。
３．本発明では、掛流し流路から検出装置へ掛流し的に微生物を提供するため、酸素消費量等の可逆的な微生物応答の測定のみならず、微生物の死滅を伴う生細胞数および細胞を破壊して測定する細胞内の酵素活性などの不可逆的な微生物応答の計測をも用いることができる。また、細胞を膜に固定していない為、個々の細胞をフローサイトメトリーで計測するという方法を用いることも可能となる。
４．微生物固定膜の場合は繰り返しまたは連続的に膜上の細胞をモニタするので、細胞状態をある程度一定に保つ必要がある。しかし、掛流しの場合は細胞状態を一定に保つ必要が無いので、細胞数の増加を計測するなどの、微生物応答の測定において極めて標準的な計測法を用いることも可能である。
５．化学物質の影響は、微生物においては対数増殖期に特に顕著に現れる。掛流し流路で微生物を増殖させ、被検物質を対数増殖期にするように温度および時間を制御することにより、より化学物質感受性を上げることが可能となる。
【００３９】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】微生物供給槽、掛流し流路、検水注入装置および微生物応答検出装置を含む、検水中の有害物質混入の有無を検出するための装置の概念図である。
【図２】対照掛流し流路をさらに備えた本発明の装置である。
【図３】微生物供給槽を複数備えた本発明の装置である。
【図４】微生物供給槽、掛流し流路、検水注入装置、サンプリング路、微生物応答検出装置および排液口を含む、検水中の有害物質混入の有無を検出するための装置の概念図である。
【図５】対照掛流し流路をさらに備えた本発明の装置である。
【図６】微生物供給槽を複数備えた本発明の装置である。
【図７】酵母の生存試験結果を示すグラフである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a bioassay method and apparatus for performing a water quality test without using a microorganism-fixed membrane.
[0002]
[Prior art and solutions]
Until now, bioassay systems that perform continuous tests and use microorganisms as indicators have been used to test the quality of water in rivers, lakes, and other environmental waters, sewage, and chemicals contained in wastewater. That is, the microorganisms are immobilized on a membrane and the respiratory activity is measured (Patent Documents 1, 2, and 3). However, when the microorganism fixed membrane exceeds the period in which the response of the microorganism can be maintained, the microorganism fixed membrane needs to be replaced. In addition, when exposed to a highly toxic sample, the microorganisms are irreparably damaged, and it is necessary to replace the microorganism-fixed membrane even before the replacement time is reached. When the apparatus is installed in a water source, it is particularly difficult to replace the membrane. Furthermore, when microorganisms are immobilized on a membrane, it is possible to measure the response of the microorganisms by oxygen consumption using an oxygen electrode, but colorimetric measurement of enzyme activity that requires measurement by destroying the microorganism cells It is not suitable for measurement by fluorescence or phosphorescence.
[0003]
[Patent Document 1]
JP-A-7-63725
[Patent Document 2]
JP-A-11-37969
[Patent Document 3]
JP 2000-206077
[0004]
[Problem solving means]
Therefore, as a result of intensive research on a bioassay for performing water quality tests without using a microorganism-immobilized membrane, we were able to clarify the existence of microorganisms that stably survive at low temperatures. A bioassay for water quality inspection is possible by installing a tank, flowing microorganisms from there at a constant flow rate and supplying it to the flow path, and flowing it in the flow path under conditions where microorganisms grow stably. The inventors have found that the present invention has been completed.
[0005]
That is, the present invention
(1) A method for examining the presence or absence of contamination of harmful substances in a test water, wherein microorganisms are supplied from a microorganism supply tank storing microorganisms to a flowing channel, and are moved in the flowing channel. A method comprising applying a test sample to non-immobilized microorganisms, measuring a microbial response to the test sample, and detecting a change in the microbial response caused when a harmful substance is mixed in the test sample. ;
Preferably, a method in which the non-immobilized microorganisms move at a constant flow rate together with the medium in the flowing channel; more preferably, the microorganisms are pre-cultured to a logarithmic growth phase before loading the test sample, and then the test sample Carrying out test culture under a load; and [0006]
(2) A hanging flow path, a microorganism supply tank connected thereto, a test water injection device for injecting a test water into the flowing flow path, and detecting a response of microorganisms supplied from the microorganism supply tank. Equipment for testing for the presence of harmful substances in the test water, including a microbial response detector;
Preferably, a) in the flowing channel, the medium is flowing at a constant flow velocity, and the medium is discharged in a flowing manner,
b) The microorganism supply tank stores the microorganisms, and supplies the microorganisms to the flowing channel,
c) The microorganisms in the flowing channel move at a constant flow rate until they are discharged together with the culture medium,
d) the sample injection device is connected to the flowing channel at a position that provides a sufficient moving distance for the microorganisms moving in the flowing channel to enter the logarithmic growth phase;
e) The microbial response detection device is a device that is disposed at a position that provides a sufficient moving distance to cause a change in microbial response when a harmful substance is mixed in the test water; An apparatus further comprising the same overflow channel as a control overflow channel, except that the flow channel is not provided.
[0007]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
(1) Bioassay method In short, the present invention provides a supply tank for stably storing microorganisms at a low temperature, from which the microorganisms are flown at a constant flow rate and supplied to a flow path, under conditions where the microorganisms grow stably. It flows through the flowing channel, adds water to be tested for water quality, and grows further.Measuring and comparing the response of microorganisms before and after loading the test water, the harmful substances in the test water are measured. Test for presence or absence. Thus, a bioassay for performing a water quality test without using a microorganism-immobilized membrane has become possible.
[0008]
In the present invention, the term "sample" refers to sample water supplied from environmental water such as rivers and lakes, sewage, and wastewater. These water samples are free of harmful substances and are always required to be tested for water quality. It is.
[0009]
In the “flow channel”, the medium supplied from the medium storage tank flows at a constant flow rate, and the medium is discharged in a flowing manner. The supply of the culture medium from the culture medium storage tank usually uses a pump or the like. In the present invention, microorganisms are supplied from the microorganism supply tank to the flowing channel in which the medium flows. Therefore, in the present invention, the microorganisms are allowed to flow and flow in the flow path together with the culture medium, and the microorganisms and the culture medium are discharged after one test. The medium varies depending on the microorganism used, and a fresh medium is usually used. A fresh medium is a medium that has not yet been used for microbial growth. As a new medium, when the microorganism is yeast, usually YPD medium (yeast extract 1%, polypeptone 2%, glucose 2%) or SD medium (yeast nitrogen base with amino acids (Difco. 0919-15-3)) Use glucose and amino acids.
[0010]
The microorganism supply tank stores a microorganism preservation solution at a low temperature, and the microorganism preservation solution is a suspension obtained by suspending microorganisms in a medium. The storage temperature is a temperature that does not freeze and maintains a dormant state, and a desirable temperature is 0 ° C. to 15 ° C., and a more desirable temperature is 4 ° C. The medium of the microorganism preservation solution is a medium suitable for maintaining the dormant state of the microorganism used. Specifically, this medium may be the same as or different from the medium supplied from the medium storage tank to the flow path.
[0011]
The cell concentration in the microorganism supply tank is not particularly limited, but is a concentration suitable for storing the microorganisms in a dormant state, and a concentration sufficient to flow the concentration sufficient to detect the microbial response and to supply the microorganism to the flow path. It is. The capacity of the supply tank is determined by the speed at which the microorganisms are supplied to the flowing channel and the period during which the microorganisms can be stored. For example, when supplying a microorganism preservation solution at a flow rate of 0.001 ml / min for 6 months, a volume of about 500 ml is required.
[0012]
Preservation of the microorganisms in the microorganism supply tank is preferably performed under conditions suitable for maintaining the cells in a dormant state. In addition to the temperature being constant at low temperature, the culture medium should maintain the optimal pH of the microorganisms used, have a mechanism to remove waste products released by the microorganisms outside the cells, etc. It is preferable that stirring is performed.
It is desirable to select a type of microorganism to be used that has a harmful substance response and has a sufficient survival rate even after being kept at a low temperature for a long time. For example, yeast cells have a viability of 10% or more after a storage period of 4 months (FIG. 7).
The present invention has been completed by finding that microorganisms can stably survive at low temperatures, and a bioassay using a microorganism supply tank is based on this finding.
[0013]
In the present invention, the “water detection load” may be intermittent or continuous. When the sample is intermittently loaded, the sample may be sample water collected from different locations or sample water collected from the same location at different times. In the case of intermittently loading the test water, the amount of one load of the test water depends on the diameter of the flowing channel, but for example, if the diameter is 1-3 mm, usually 0.001-5 ml of the test water is used. Load.
When the "load of the water sample" is performed continuously, the present invention enables the water quality test of the water sample over time. Therefore, in this aspect, the present invention is a method for monitoring the presence or absence of harmful substance contamination in the test water over time, wherein the microorganisms are supplied from a microorganism supply tank storing the microorganisms to the flow channel, The test sample is continuously loaded on the non-immobilized microorganisms moving in the flowing channel, and the microbial response to the continuously loaded test sample is continuously measured. Provided is a method characterized by detecting a change in a microbial response caused by contamination over time. Here, the water quality test over time can be arbitrarily performed for a time period to be monitored. It is usually from hours to days or even months. Basically, the monitoring time depends on the responsiveness of the microorganism in the microorganism supply tank. When the sample is continuously loaded, the amount of water flowing into the flowing channel of the sample depends on the diameter of the flowing channel. 001-1 ml / min.
[0014]
The microorganism used in the present invention is a “non-immobilized microorganism moving in a flowing channel” and is not immobilized on a fixed membrane. The microorganism used herein may be a naturally occurring wild type or wild type strain, for example, animal cells derived from humans, mice, and other mammals, and established animal cell lines, fish, nematodes, etc., which have been used in bioassays. Cells, insect cells, fungal cells such as yeast, and bacterial cells such as Escherichia coli. A wild strain is a naturally occurring, non-recombinant microorganism. A wild-type strain is a microorganism that does not touch the gene of interest. Established strains include those that can be subcultured with animal cells, for example, those that have not been recombined, such as cancer cells.
[0015]
The term "microbial response" refers to the number of microbial cells, the number of viable cells, the amount of respiration, the amount of ATP, etc. in the case of a naturally occurring wild type or wild type strain. It can also be the mRNA level of a gene that fluctuates in the presence of a harmful substance. mRNA levels were determined by Northern blotting (Nobukun Ogata, Hiroshi Nojima: Genetic Engineering Keyword Book Revised 2nd Edition, Yodosha, 2000, pp 299-301), reverse transcription PCR (RT-PCR) (Yusaku Nakabetsu, etc.) It can be measured by Cell Engineering Separate Volume Tips Series Revised PCR Tips, Shujunsha, 1999, pp25-43).
Here, in the case of yeast cells, “genes that fluctuate in the presence of harmful substances” are disclosed in public databases (eg, MIPS: Munich Information Center for Protein Sequence in Germany, SGD: Saccharomyces Genome Database in the United States). The yeast genes can be selected appropriately from the available yeast genes, and these can be known via the Internet. Preferred genes are mitochondrial proteins, gene repair proteins, energy proteins, transport facilitating proteins, stress proteins, metabolic proteins, detoxicating proteins and genes of unknown function. For example, YLR303W, YLL057C, YOR382W, YCR102C, YKL071W, and the like.
[0016]
The microorganism used in the present invention also includes a recombinant, that is, a transformant of the above-described naturally occurring cell. The transformant used in the present invention includes a polynucleotide construct obtained by operably linking a polynucleotide encoding a marker protein to the polynucleotide sequence of the promoter of the “gene that fluctuates in the presence of a harmful substance”. It can be prepared by introducing a vector into the naturally occurring cells described above. Methods for operably linking a polynucleotide encoding a protein to a promoter are well known (for example, RW Old, SB Primrose, Principles of Genetic Manipulation, 5th ed., Baifukan, pp. 138-165, pp. 139-163). 234-263, 2000). For example, in the case of yeast, the sequence of the promoter is disclosed in a public database (SCPD: The Promoter Data of Saccharomyces cerevisiae). Examples of marker proteins include GFP (Green Fluorescence Protein) (Heim, R., Cubitt, AB and Tsien, RY (1995) Nature 373, 663-664; Heim, R., Prasher DC. An. Tsien, RY (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., 91, 12501-12504; Warg, S. and Hazerigg, T. (1994) Nature 639, 400-403; Yuvan, DC and. Michel-Beyerle, ME (1996) Nature Biotechnology 14 1219-1220; Chalffie, M., Tu, Y., Euskiren, G .; Ward, WW and Prasher, DC (1994) Science 263, 802-805), β-galactosidase (Canestro C, Albalat R, Escriva H, Gonzalez-Duartai satogenes auxiogensagos engai satogena giogens auxiogens auxiogens auxiogens auxiogens auxiogens auxiogens auxiegos). a useful histochemical marker for the digestive system. Dev Genes Evol 2001 Mar 211 (3): 154-6), luciferase (Arch Toxicol 2002Jun; Nin vitro reporter gene assay and an in vivo transgenic zebrafish assay. Schreurs R, Lanser P, Seinen W, Van Der Burg T., and acetyltransferase. , A simplified method for large scale quantification of transcriptional activity and it's use in studies of sternoids. Zhang S, Lu J, Iyama K, Lo SC, Danielsen M. ) And the like.
[0017]
For preparing a vector, for example, in the case of a yeast cell, a plasmid capable of replicating in yeast is selected, a polynucleotide encoding a marker protein is inserted into the plasmid, and then a polynucleotide containing a promoter sequence is inserted into an upstream portion of the marker gene. It can be done by doing.
Transformants can be prepared by well-known techniques. For example, a method for transforming yeast cells is described in Kaiser C, Michaelis S, Mitchell A: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual 1994 edition (Cold Spring Harbor Laboratory.). 133-134, 1994.
[0018]
When a transformant is used, the "microbial response" used in the present invention is the expression level of the marker protein. The expression level of the marker protein can be obtained by pulverizing the transformant to obtain a protein extract and measuring the amount of the marker protein in the liquid. For example, when the marker protein is GFP, the amount of fluorescence of the protein extract is measured by a fluorescence spectrophotometer. In addition, the expression level of the marker protein can be directly measured without crushing the transformant by image processing using a fluorescence microscope or laser microscope, measurement using flow cytometry, measurement using evanescent light, and detection using a colorimeter. In some cases, fluorescence (GFP) or color development (β-gal) of cells can be measured. Preferred transformants are yeast which have been transformed with a vector comprising a polynucleotide operably linked to a yeast gene promoter with a polynucleotide encoding a marker protein, or a chromosomal ORF with a polynucleotide encoding a marker protein. Yeast that has been transformed to replace, more preferably, the yeast gene is a mitochondrial protein, a gene repair system protein, an energy system protein, a transport promoting protein, a stress protein, a metabolic system protein, a detoxifying protein and It is selected from genes whose functions are unknown.
[0019]
In the present invention, a change in the microbial response caused when a harmful substance is mixed in the test water is detected. When harmful substances are present in the test sample, if microorganisms in the flowing channel come into contact with the test sample, they are affected by growth inhibition, respiratory volume reduction, and the like. In addition, when the microorganism is recombinant, expression of the reporter gene occurs.
[0020]
In the present invention, as described above, microorganisms are flown from the microorganism supply tank and supplied into the flow path, and are discharged in a flowing manner. Therefore, the "microbial response" that can be measured in the present invention includes not only a reversible response such as oxygen consumption, but also an irreversible response such as the number of viable cells accompanying the death of microorganisms and the enzyme activity in cells measured by destroying cells Response is also available.
[0021]
It is possible to load the test water immediately after supplying the microorganisms to the flowing channel. However, microorganisms are dormant in a microorganism supply tank for supplying microorganisms. Therefore, in the present invention, preferably, the microorganism is pre-cultured before loading the test sample, and then the test culture is performed while loading the test sample. In this embodiment, the microorganism supplied from the hanging flow path is held in the flow path for a certain period of time, whereby preculture is performed to restore the activity of the dormant microorganism, and then a test sample is loaded. Further, in the pre-culture, in order to increase the sensitivity of the microorganism to chemical substances, it is desirable that the logarithmic growth phase, which includes cells at all stages of the cell cycle, be performed as much as possible. Therefore, in the pre-culture, the microorganisms derived from the microorganism supply tank are diluted and cultured in the flowing channel in which a new medium flows, whereby the temperature and time are controlled so that the microorganisms enter the logarithmic growth phase. Specifically, in the case of yeast, the conditions for the pre-culture are 25-30 ° C. for 2 hours to more than 10 hours. The length of the flowing channel is adjusted according to the time. That is, the test sample injection is performed at a position that gives a moving distance sufficient for the microorganisms moving in the flowing channel to enter the logarithmic growth phase.
[0022]
Here, it is as described above that the water sampling load may be continuous or intermittent. The test cultivation takes several tens of minutes to several hours, depending on the response of the microorganism to be detected. The length of the flowing channel is adjusted according to the time. That is, the detection of the microbial response is performed at a position that provides a sufficient moving distance to cause a change in the microbial response when a harmful substance is mixed in the test water.
[0023]
(2) Bioassay Device As another aspect, the present invention provides an apparatus for performing the bioassay method of the present invention. In detail, a microorganism supply tank, a flowing channel connected thereto, a test water injection device for injecting a test water into the flowing channel, and for detecting a response of microorganisms supplied from the microorganism supply tank For detecting the presence or absence of harmful substances in the test water, including the microbial response detection device.
A typical device according to the present invention is shown in FIG.
[0024]
The device according to the invention with a control overflow channel is shown in FIG. When detecting a response of a microorganism, a more accurate response can be grasped by taking a difference from a control state. Therefore, another flowing channel is provided as a control section to which no water sample is added, and monitoring is performed in the same manner as the detection section.
[0025]
FIG. 3 shows an apparatus of the present invention provided with a plurality of microorganism supply tanks.
By using a plurality of microorganism supply tanks, a plurality of microorganisms can be detected for response. Each of the microorganism supply tanks is provided with a flowing channel connected thereto, a sample injection device for injecting water into the flowing channel, and a microorganism detecting device. A single microorganism detection device can be used by switching the flow channel as needed. In this way, it is possible to estimate a harmful substance in the sample by measuring a plurality of types of microbial responses for the same sample and comparing the responses. For example, when two microorganism supply tanks each storing a yeast gene YLL057C promoter assay cell and a yeast gene YBR072W promoter assay cell are used as microorganisms, if pentachlorophenol is contained in the test sample, only the YLL057C cell responds. Only YBR072W cells respond when -4-dichlorophenol or p-nonylphenol is included. Also, when arsenite is included in the test, both YLL057C cells and YBR072W cells respond.
[0026]
As another aspect, the present invention provides the device of the present invention, further comprising a sampling path for collecting non-immobilized microorganisms flowing in the hanging flow path. Specifically, a microorganism supply tank, a flowing channel connected thereto, a sample injection device for injecting a test water into the flowing channel, and for collecting non-immobilized microorganisms flowing in the flowing channel. Including a sampling path, a microbial response detection device for detecting a response of microorganisms supplied from the sampling path, and a drainage port for discharging remaining microorganisms and test water not collected from the sampling path. This is a device for detecting contamination of harmful substances. The device of this embodiment is shown in FIGS.
[0027]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
[0028]
Example 1
1. Yeast (Saccharomyces cerevisiae S288C (α SUC2mal mel gap2 CUP1)) was preserved in a YPD medium (1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% dextrose) at 4 ° C. for 12 months at a low temperature. During storage, the medium was constantly stirred with a stirrer.
The viable cell count was measured as follows. First, 1.0 mL of the culture solution is aseptically measured with a micropipette, and serially diluted 10-fold with dilution water such as sterile physiological saline to prepare a bacterial count solution. Each 10-fold serially diluted bacterial count solution was seeded on a YPD agar medium (solids obtained by adding 10% agar to the YPD medium, sterilizing by heating in an autoclave, pouring into a petri dish, and solidifying), and growing 3 days later. Was measured to obtain CFU (colony forming unit).
FIG. 7 shows the obtained results. FIG. 7 shows that microorganisms are gradually damaged and die when stored at a low temperature of about 4 ° C. Specifically, the number of viable cells is 10% or more even when the storage period is 4 months. This indicates that the yeast has a sufficient viability even after being kept at a low temperature for a long time.
[0029]
2. Detection of Toxic Substances by Measurement of Growth The frozen and preserved yeast Saccharomyces cerevisiae W303 strain (American Type Culture Collection ATCC 2001239) was used as a selective medium (SD medium: yeast nitrogen base with nitrosamine-dactylamine-dino-titamin. (Adenine, histidine, tryptophan, uracil, leucine)) at 25 ° C. with shaking culture to grow to a steady state.
The yeast in a steady state was stored at 4 ° C. for 1 week, then diluted 10-fold with the same medium, and pre-cultured at 25 ° C. for 2 hours. Thereafter, a test sample was added, and the cells were further cultured at 25 ° C. for 4 hours. The cells were cultured under the same conditions without adding any chemical substance, and used as a control. Cell proliferation was measured by measuring absorbance at 600 nm. In all cases, the inhibition of cell growth was confirmed by the addition of the chemical substance.
[Table 1]

[0030]
From the above results, it becomes clear that the presence or absence of harmful substances in the test water can be tested by measuring the absorbance of the sample in the flowing channel 4 hours after the test load.
[0031]
Example 2
Detection of harmful substances by reporter gene assay Yeast Gene YLL057C Promoter Assay Preparation of Cells Primers were prepared for amplifying by PCR the oligonucleotide (SEQ ID NO: 1) containing the promoter sequence of yeast gene YLL057C. The primers were designed using Oligo 4.0-S, Sequencher _I Macintosh version, which is software for primer design, and the base sequence of the upper primer was GCTAACGAACAGGATGGTATTGA (SEQ ID NO: 2).
And the base sequence of the lower primer is
ATTTTAACTGGGTTACTGTGCT (SEQ ID NO: 3)
And For PCR, a yeast chromosome (Saccharomyces cerevisiae S288C, Cat. 40802, Research Genetics, Inc.) was used as a template, and a commercially available kit (KOD DNA Polymerase; code KOD-101, Toyobo) was used as a reagent.
[0032]
The vector used is pYES2 (pYES2, Cat no: V825-20, Invirtogen Corporation, USA), a YEp-type shuttle vector that is replicated in both E. coli and yeast (RW Old, SB Primrose Gene Manipulation). Principle of the original 5th edition, Baifukan, pp.234-263, 2000)) was used. As the polynucleotide (SEQ ID NO: 4) encoding the marker protein GFP, the GFP portion of the vector pQBI63 (Cat no. 54-0082, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used. First, a vector was prepared in which a GFP oligonucleotide was inserted into the multiple cloning site of pYES2. Thereafter, the GAL1 promoter portion of pYES2 was replaced with an oligonucleotide containing the promoter sequence of YLL057C, a yeast gene of interest. The operation of inserting an oligonucleotide containing GFP and a promoter sequence was performed by selecting an appropriate restriction enzyme.
[0033]
The procedure for transforming yeast with the vector is shown below.
1) The yeast cells W303 are shake-cultured in 200 ml of SD medium until the OD660 becomes 0.5.
2) Harvest cells and suspend in 5 ml of TE-buffer.
3) Add 250 μL of 2.5 M lithium acetate.
4) Dispense 300 μl each, add 10 μl of plasmid vector, and incubate at 30 ° C. for 30 minutes.
5) Add 700 μl of 50% PEG4000 and shake culture at 30 ° C. for 60 minutes.
6) After heat shock (42 ° C, 5 minutes), cool rapidly.
7) Wash twice with 1M sorbitol.
8) Seeding on agar plates made with minimal nutrient media.
Transformation was confirmed using a selection medium (SD medium) + glucose + amino acids (adenine, histidine, tryptophan, leucine). Colonies that grew on the agar plate of the selection medium were further confirmed for auxotrophy for amino acids.
[0034]
2. Promoter assay for yeast gene YBR072W An oligonucleotide (SEQ ID NO: 7) containing the promoter sequence of yeast gene YBR072W was amplified by PCR, and an upper primer:
GCAGTCAACGAGGAGCGAATCAG (SEQ ID NO: 5),
Lower primer:
Except that GTTAATTTGTTTAGTTTGTTTG (SEQ ID NO: 6) is used. To obtain the desired transformant.
[0035]
3. Detection of toxic substances by measurement of growth The obtained transformant was cultured in a selective medium (SD medium) + glucose + amino acid (adenine, histidine, tryptophan, leucine) at 25 ° C. with shaking so that a steady state was obtained. Propagated.
The steady state transformants were stored at 4 ° C. for 1 week, then diluted 10-fold with the same medium described above, and pre-cultured at 25 ° C. for 15 hours. Thereafter, a test sample was added, and the cells were further cultured for 4 hours. The cells were cultured under the same conditions without adding any chemical substance, and used as a control. A sample was collected, and the fluorescence was measured by flow cytometry (EPICS XL: Beckman Coulter). The fluorescence intensity when no chemical substance was loaded was measured in advance, and those having a fluorescence intensity 1.5 times or more of that were indicated as + with fluorescence detected.
[0036]
[Table 2]

[0037]
Table 2 shows that only YLL057C cells responded when pentachlorophenol was included in the test, only YBR072W cells responded when 2-4-dichlorophenol or p-nonylphenol was included, and arsenite was added to the test. Indicates that both YLL057C and YBR072W cells respond.
This indicated that chemical substances can be estimated by using a plurality of promoter assay cell culture tanks.
[0038]
【The invention's effect】
The effects achieved by the present invention are listed below.
1. When the conventional microorganism-fixed membrane is damaged by microorganisms due to contamination of other microorganisms or excessive damage by harmful substances, it is necessary to replace the microorganism-fixed membrane. In the present invention, the use of the microorganism supply tank eliminates the need for membrane exchange.
2. In the present invention, as long as the growth of the microorganism supply tank can be maintained, the toxicity can be evaluated without replacing the microorganism supply tank, so that the culture tank is replaced by using a microorganism capable of maintaining growth for a long time. The period becomes longer.
3. In the present invention, in order to provide microorganisms in a flowing manner from the flowing channel to the detection device, not only measurement of a reversible microbial response such as oxygen consumption, but also the number of living cells and the destruction of cells with the death of microorganisms Measurement of an irreversible microbial response such as intracellular enzyme activity to be measured can also be used. Further, since the cells are not fixed to the membrane, it is possible to use a method of measuring individual cells by flow cytometry.
4. In the case of a microorganism-fixed membrane, the cells on the membrane are monitored repeatedly or continuously, so that it is necessary to keep the cell state constant to some extent. However, in the case of flowing, it is not necessary to keep the cell state constant, so that it is also possible to use a very standard measurement method in measuring the microbial response, such as measuring the increase in the number of cells.
5. The effects of chemicals are particularly pronounced in microorganisms during the logarithmic growth phase. By controlling the temperature and time so that the microorganisms grow in the flowing channel and the test substance enters the logarithmic growth phase, it becomes possible to further increase chemical sensitivity.
[0039]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a conceptual diagram of an apparatus for detecting the presence or absence of harmful substances in a test water, including a microorganism supply tank, a flowing channel, a test water injection device, and a microbe response detecting device.
FIG. 2 shows the device of the present invention further comprising a control overflow channel.
FIG. 3 is an apparatus of the present invention provided with a plurality of microorganism supply tanks.
FIG. 4 is a conceptual diagram of a device for detecting the presence or absence of harmful substances in a test water, including a microorganism supply tank, a flowing channel, a test water injection device, a sampling channel, a microbe response detecting device, and a drain outlet. is there.
FIG. 5 is an apparatus of the present invention further comprising a control overflow channel.
FIG. 6 is an apparatus of the present invention provided with a plurality of microorganism supply tanks.
FIG. 7 is a graph showing the results of a yeast survival test.

Claims

A method for testing for the presence or absence of contamination with harmful substances in a test water, comprising supplying microorganisms from a microorganism supply tank storing microorganisms to a flowing channel, and moving the microorganisms through the flowing channel. A method comprising: loading a test sample on microorganisms, measuring a microbial response to the sample test, and detecting a change in the microbial response caused when a harmful substance is mixed in the test sample.

The method according to claim 1, wherein the non-immobilized microorganism moves at a constant flow rate together with the medium in the flowing channel.

The method according to claim 1 or 2, wherein the microorganism is pre-cultured before applying the test water, and then the test culture is performed while applying the test water.

A hanging flow path, a microorganism supply tank connected thereto, a sample injection device for injecting water into the flowing flow path, and a microorganism response detection for detecting a response of microorganisms supplied from the microorganism supply tank Equipment for testing for the presence of harmful substances in the test water, including equipment.

a) In the flowing channel, the medium flows at a constant flow rate, and the medium is discharged in a flowing manner,
b) The microorganism supply tank stores the microorganisms, and supplies the microorganisms to the flowing channel,
c) The microorganisms in the flowing channel move at a constant flow rate until they are discharged together with the culture medium,
d) the sample injection device is connected to the flowing channel at a position that provides a sufficient moving distance for the microorganisms moving in the flowing channel to enter the logarithmic growth phase;
The device according to claim 4, wherein e) the microbial response detection device is arranged at a position that provides a sufficient moving distance to cause a change in the microbial response when a harmful substance is mixed in the test water.

The device according to claim 4 or 5, further comprising the same flowing channel as a control flowing channel except that the sample injection device is not connected.