JP2004340574A - アレイにおけるスポットの均一性評価方法 - Google Patents
アレイにおけるスポットの均一性評価方法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】ＤＮＡマイクロアレイにおけるスポットの均一性を評価する極めて簡便な方法を提供する。
【解決手段】ターゲットＤＮＡと標識されたプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより特異的に発光する複数のスポットを有するＤＮＡマイクロアレイにおいて、次のようにバックグランドデータに周期性を有するパターンが発現するか否かでスポットの均一性を評価する。１．ＤＮＡマイクロアレイの単色発光イメージをスキャンして得た画像に解析ソフトを適用し、各スポットに対応するバックグラウンドデータを得る。２．各スポットに対応するターゲットＤＮＡのプレートプレートＮｏ．（α）とプレート位置（β，γ）を求める。３．各バックグラウンドデータにプレートプレートＮｏ．（α）とプレート位置（β，γ）を対応付ける。４．バックグランドデータを、プレートＮｏ．（α）とプレート位置（β，γ）の順に並べた数列ＢＧを得る。
【選択図】なし
【解決手段】ターゲットＤＮＡと標識されたプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより特異的に発光する複数のスポットを有するＤＮＡマイクロアレイにおいて、次のようにバックグランドデータに周期性を有するパターンが発現するか否かでスポットの均一性を評価する。１．ＤＮＡマイクロアレイの単色発光イメージをスキャンして得た画像に解析ソフトを適用し、各スポットに対応するバックグラウンドデータを得る。２．各スポットに対応するターゲットＤＮＡのプレートプレートＮｏ．（α）とプレート位置（β，γ）を求める。３．各バックグラウンドデータにプレートプレートＮｏ．（α）とプレート位置（β，γ）を対応付ける。４．バックグランドデータを、プレートＮｏ．（α）とプレート位置（β，γ）の順に並べた数列ＢＧを得る。
【選択図】なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アレイ上にプリントされたスポットの均一性を評価する方法であり、ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ、プロテインアレイ等のように基板上にスポットが２次元に配置されたアレイの解析過程を支援する技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトゲノムプロジェクトに代表されるように遺伝子情報解析研究の進展は、世界レベルで加速的に進んでおり、それとともに生体内における遺伝子レベルでの発現を効率よく解析できる新しい方法論の必要性が高まっている。
ＤＮＡマイクロアレイは、スライドガラス上に数百から数万のＤＮＡをマトリックス状のスポットに整列・固定させ、ターゲット細胞から抽出・調整されたｍＲＮＡ（ターゲット）を、ＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせることにより、それぞれの細胞における遺伝子発現レベルを測定する新しい方法である。
【０００３】
基本的には、ＤＮＡマイクロアレイを用いた測定は二蛍光標識来が主流である。二蛍光標識法とは、二種類の細胞（例えば正常細胞とガン細胞）に由来するｍＲＮＡを抽出・精製し、それぞれの細胞を異なる励起波長を持つ蛍光物質（ＣＹ３，ＣＹ５）で標識した後、ＤＮＡマイクロアレイ上の同一スポットで競合的ハイブリダイゼーションを行い、アレイ上の各スポットからそれぞれ異なるＣＹ３とＣＹ５の励起波長における蛍光強度を二つのチャンネル（ＣＨ１，ＣＨ２）から測定することにより、２種類の細胞における遺伝子レベルでの発現量比を計測するものである。実際には、それぞれの蛍光シグナルを計測後、各々の計測結果を重ね合わせて擬似色調解析を行う。
通常、ＣＹ３，ＣＹ５の各データは以下の関係式に基づいて算出され、基本的にはＬｏｇ（Ｒ／Ｇ）の値が遺伝子発現データとして使用される。
【０００４】
【数１】
【０００５】
＊注１）ＣＨ１（チャンネル１）及びＣＨ２（チャンネル２）はレーザース キャナーによるスポットの蛍光強度計測値（赤、緑を別々に計測す るためのチャンネル１，２）
＊注２）ＣＨ１Ｂ（チャンネル１のバックグランドデータ）及びＣＨ２Ｂ （チャンネル２のバックグランドデータ）は、レーザースキャナー によるスポットのバックグランドデータ
【０００６】
サンプルＡで遺伝子発現量の多い遺伝子のスポットは赤色、サンプルＢで発現量の多いものは緑色、ほぼ等量ずつ発現しているものは黄色を示すことになる。
即ち、ＲとＧの比により、スポットは以下の色を示す。
Ｒ／Ｇ＞１ 赤色
Ｒ／Ｇ＝１ 黄色
Ｒ／Ｇ＜１ 緑色
【０００７】
現在、ＤＮＡマイクロアレイデータを基に、遺伝子間の周期性解析、遺伝子発現ネットワーク、遺伝子転写制御のカスケードの研究が次世代の研究として、数理情報的方法を基軸により精度を高めるべく展開されつつあり、ＤＮＡマイクロアレイのデータに対する高い信頼性が求められている。
また、遺伝子発現データに基づきガンの診断がなされる場合、高精度のデータが必要となる。
【０００８】
しかし、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子解析はまだ始まったばかりであり、再現性において解決されなければならない課題が多い。
特に、スポットの形状と大きさは、プリンティング、ハイブリダイゼーション、スライド表面処理等により変動し易く、スポットの位置は、プリンティングピン或いはプラットホームの微小な変位や振動等のスポッティング工程における機械的影響により変動し易いことが知られている。
【０００９】
【本発明が解決しようとする課題】
ＤＮＡマイクロアレイ上のスポットの均一性は、シグナルデータの精度を左右する重要な因子であるが、この均一性を評価する方法が見当たらない。
本発明は、極めて簡便な方法により、ＤＮＡマイクロアレイにおけるスポットの均一性を評価する方法を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現データは、スタンフォード大学のＤＮＡマイクロアレイデータベースを始めとして、ＭＩＴ、ハーバード大学を中心に研究者用に一部公開されている。特にスタンフォード大学のブラウン教授のグループは、１９９７年世界で初めてイースト菌の全遺伝子（６４００遺伝子）の発現解析を成し遂げた（そのデータも公開されている。）
発明者は遺伝子発現量に関して何らかの規則性があるのではないかという観点から、スタンフォード大学のＤＮＡアレイデータベースの中で公開されているイースト菌の全遺伝子の発現データ（ＴＵＰ１）を入手し、染色体順、遺伝子順に発現データを並び替え、その遺伝子発現データを解析した。
その結果、２の倍数のところに弱い周期性があることを確認することができた。しかしながら、この周期は遺伝子発現レベルに起因するものではなく、バックグランドデータの影響によるものであった。
【００１１】
本発明者は、蛍光強度の補正データとして使用されるバックグランドデータそのものに周期性が存在していることが、スポットの不均一性と関係があり、延いては遺伝子発現データの解析に重要な影響を及ぼすことを見出した。また、このような知見は、ＤＮＡマイクロアレイに止まらず、ＤＮＡチップ、プロテインアレイ等のように基板上にスポットが２次元に配置されたアレイ全般に対して適用可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本発明は、ターゲット物質と標識されたプローブ物質とのハイブリダイゼーションにより特異的に発光する複数のスポットを有するアレイにおいて、下記のようにして得られるバックグランドデータからなる数列ＢＧにおいて周期性を有するパターンが発現するか否かにより、スポットの均一性を評価する方法である。
【００１３】
［数列ＢＧの作成方法］
１．アレイの単色発光イメージをスキャンして得られた画像に対して解析ソフトを適用し、各スポットに対応するバックグラウンドデータを得る。
２．各スポットに対応するターゲット物質のプレートＮｏ．（α）とプレートにおける位置（β，γ）を求める。但し、αはプレートを識別する記号又は番号であり、β、γはプレートの穴が形成するマトリックスの行と列である。
３．各バックグラウンドデータにプレートＮｏ． （α）とプレート位置（β，γ）を対応付ける。
４．バックグランドデータを、プレートＮｏ． （α）（第一優先順位）とプレート位置（β，γ）（第二優先順位）の順に並べた数列ＢＧを得る。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下本発明を詳細に説明する。
【００１５】
以下、ＤＮＡマイクロアレイを例にして説明する。
ＤＮＡマイクロアレイを用いるシグナルデータの一般的な解析フローは図１の通りである。
【００１６】
【００１７】
バックグランドデータ
ハイブリダイゼーションを終えたスライドのスキャンを行い、スライド上の各スポットにおける発色状況を画像データとして記録する。その後、前記画像データを解析ソフトにより処理してスポットの発色データを取得する。具体的には、スキャンにより得た画像の上から、各スポットが１個づつ割り当てられるような桝目の中にスポットの形状と同じグリッド画像を重ね、各桝目の中のシグナルデータ及びバックグランドデータを取得する（図２）。
【００１８】
一般に、シグナルデータは長軸と短軸を指定した楕円状スポットの発色強度として計測され、バックグランドデータは、スポットを囲む桝目内であり、且つスポットの外側に当たる領域の強度として計測される。
バックグランドデータは、全てのスポットが鮮明であり且つ発光強度が飽和にならない程度の明るさで発光させたときのデータが望ましい。具体的な操作は、スキャン装置における発光シグナルの検出条件や解析ソフトにおけるスポットの抽出方法により多少変化するが、本発明の方法は、スキャン装置及び解析ソフトの種類に影響を受けるものではない。
【００１９】
好ましいスキャン装置はＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ａ、ＧｅｎｅＴＡＣＬＳＩＶ、ＧＴＭＡＳＳ、ＧＭＳ４１８ＡｒｒａｙＳｃａｎｎｅｒ、ＡｖａｌａｎｃｈｅＭｉｃｒｏｓｃａｎｎｅｒ、ＣｈｉｐＲｅａｄｅｒ、ＧｅｎｅＴＡＣ２０００、ＣＲＢＩＯ、ＳｃａｎＡｒｒａｙ３０００，４０００，５０００等があり、好ましい解析ソフトとしてＳｃａｎＡｌｙｚｅ、ＡｒｒａｙＡｎａｌｙｚｅｒ、ＩｍａＧｅｎｅ、ＡｕｔｏＧｅｎｅ、ＱｕａｎｔＡｒｒａｙ、ＱｕａｎｔａｒｒａｙＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ、ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙＳｕｉｔｅ、ＡｒｒａｙＶｉｓｉｏｎ、ＡｒｒａｙＧａｕｇｅ及びＧｅｎｅＰｉｘＰｒｏ等がある。
【００２０】
数列ＢＧの作成方法
本発明において、バックグランドデータの特徴を顕在化するための指標として数列ＢＧを以下のようにして作成する。
１．ＤＮＡマイクロアレイの単色発光イメージをスキャンして得られた画像に対して解析ソフトを適用し、各スポットに対応するバックグラウンドデータを得る。
２．各スポットに対応するターゲットＤＮＡのプレートＮｏ．（α）とプレートにおける位置（β，γ）を求める。但し、αはプレートを識別する記号又は番号であり、β、γはプレートの穴が形成するマトリックスの行と列である。
３．各バックグラウンドデータにプレートＮｏ． （α）とプレート位置（β，γ）を対応付ける。
４．バックグランドデータを、プレートＮｏ． （α）（第一優先順位）とプレート位置（β，γ）（第二優先順位）の順に並べた数列ＢＧを得る。
【００２１】
数列ＢＧにおけるパターンの表示方法
本発明における表示方法は、数列ＢＧにおいて周期性を有するパターンが存在するか否かを判定することできるものであれば、特に制限はない。
好ましい表示方法は、以下の方法である。
（表示方法）
方法１． 数列全体から所定の個数ごとに抽出した１以上の要素からなる部分数列に対して、数列に含まれる各数を、数の種ごとに決められた色相、明度、彩度またはこれらの組合せからなるカラードットとし、該カラードットを更にマトリクス状に配置したカラードットマトリクスを順次出力し、該カラードットマトリクスを出力することで得られる色彩パターンによって、内在する規則性を顕在化させる方法。
方法２． 数列を複数の部分数列に分割し、分割された部分数列に含まれる各数を数の種ごとに決められた色相、明度、彩度またはこれらの組合せで表示した部分カラードット列とし、該部分カラードット列を並列配置することでカラードットをマトリクス状に配置したカラードットマトリクスを出力し、該カラードットマトリクスを出力することで得られる色彩パターンによって、数列に潜む特徴を顕在化する方法。
【００２２】
より好ましい方法は、以下の方法３である。
即ち、上記方法１または方法２の表示方法において、数列をＩｊ （ｊ＝１〜ｍ）としたときに、数列を構成する各数を下記の配置パターン、すなわち、
（ただし、ｋは２以上の整数であり、ｎはｎｋ＋１≦ｍ≦ｎｋ＋ｋの自然数である）
に従って配置してカラードットマトリクスを出力することを特徴とする、数列に潜む特徴を顕在化する方法。
【００２３】
更に好ましい方法４は、ｐをｍ未満の任意の自然数、ｒを任意の自然数としたときに、ｋ＝ｐ，ｐ＋ｒ，ｐ＋２ｒ，ｐ＋３ｒ，・・・・と置き換えながら、方法３の表示方法を実施し、ｐ列のカラードットマトリクス、ｐ＋ｒ列のカラードットマトリクス、以下同様に、ｐ＋２ｒ， ｐ＋３ｒ・・・列のカラードットマトリクスの全体を並列配置したカラードットマトリクス群を出力して数列に潜む特徴を顕在化する方法である。
方法４は、繰り返し単位が全く不明である場合、或いは繰り返し領域が数列の一部にしか存在しない場合に特に有効である。
図３において、方法４により数列Ｉｊ（ｊ＝１〜１００）の各要素を、ｋ＝１，ｋ＝２，ｋ＝３，ｋ＝４，…及びｋ＝２０のマトリックスからなるマトリックス群として配置する方法を模式的に示した。
【００２４】
スポットの均一性を評価する方法
適当な表示方法により数列ＢＧを表示したときに周期性を有するパターンが存在するか否かを検証し、周期性を有するパターンが存在する場合にＤＮＡマイクロアレイにおけるスポットの均一性が低いと判断することができる。
但し、数列ＢＧにおいて存在する周期性を有するパターンには種々のタイプがあり、数列ＢＧ全体にわたって一定の繰り返し又は複数の種類の繰り返しが存在する場合、或いは数列ＢＧの一部に繰り返しが存在する場合等がある。
もしも、数列ＢＧにおいて周期性を有するパターンが存在しない場合、スポットは均一にプリントされたと判断できるので、高精度のデータ解析が可能となる。一方、数列ＢＧにおいて一部であっても周期性を有するパターンが存在する場合、スポットのプリント状況が不均一であるから、シグナルデータの信頼性が低い上、補正項であるバックグランドデータの周期性を有するパターンの影響が出てしまうため、周期性を有するパターンを示したスポットのシグナルデータを精密に解析することが困難となる。
【００２５】
【実施例】
以下、本発明の方法を更に具体的に説明する。
［実施例１］
（イースト菌ＤＮＡマイクロアレイ）
スタンフォード大学が公開しているＤＮＡマイクロアレイデータの中からイースト菌ＤＮＡマイクロアレイデータを入手した（Ｇｅｏｍｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｃｈａｎｇｅｓ ，Ａｒｒａｙ Ｄａｔａ Ｆｉｌｅ：ｙ１１ｎ１２１（ｖａｒｉａｂｌｅ ｈｅａｔ ２１Ｃ） ）。
【００２６】
【表１】
入手したデータの概要を表１に示した。表１において、「ＣＨ１Ｂ」はチャンネル１のバックグランドデータであり、「ＣＨ２Ｂ」はチャンネル２のバックグランドデータである。「ＣＨ１Ｄ」及び「ＣＨ２Ｄ」は下記の数２の式により補正をしたスポットのシグナルデータである。
【００２７】
【数２】
【００２８】
また、表１において、「ＰＬＡＴ」はプレートを識別する記号又は番号であり、「ＰＲＯＷ」は各プレートにおける行を表す記号であり、「ＰＣＯＬ」は各プレートにおける列を表す数である。
【００２９】
表１において、特定のターゲットＤＮＡに関するデータは行単位で表示され、「ＮＡＭＥ」の欄に表示された各ターゲットＤＮＡのバックグランドデータ（「ＣＨ１Ｂ」，「ＣＨ２Ｂ」）に対して、プレートＮｏ．（「ＰＬＡＴ」）及びプレートにおける位置（「ＰＲＯＷ」，「ＰＣＯＬ」）が対応付けされている。各データは、先ずプレートＮｏ．単位で並べられ、次にプレートの行単位で並べられ、最後にプレートの列で並べられている。従って、表１の上から下に向かう順は、本発明における数列ＢＧの作成方法４に基づく順となっている。
【００３０】
先ず、バックグランドデータ（ＣＨ１Ｂ）について、表１の列「ＣＨ１Ｂ」における最上行〜最下行の順に並べた数列を数列ＢＧとして、これを上記表示方法５によって表示させた。その結果、数列ＢＧにおいて３８４の繰り返し構造が存在することが判明した。数列ＢＧにおける各数を、上記表示方法３（但し、ｋ＝３８４）によりマトリックス状に表示した結果を図４に示した。
同様にして、バックグランドデータ（ＣＨ２Ｂ）について数列ＢＧの各数を上記表示方法３によりマトリックス状に表示した結果を図５に示した。
これらの図から、ＣＨ１Ｂ及び ＣＨ２Ｂの各バックグランドデータの数列ＢＧにおいて、３８４を繰り返し単位として周期的に変動する明確な周期性を有するパターンが存在することがわかる。
【００３１】
チャンネル１のシグナルデータ「ＣＨ１Ｄ」を、数値の大小に応じて色に変換したＤＮＡマイクロアレイ図を図６に示した。又、チャンネル２のシグナルデータ「ＣＨ２Ｄ」について同様に処理したＤＮＡマイクロアレイ図を図７に示した。これらのＤＮＡマイクロアレイ図は実際のスキャンイメージと必ずしも同じではないが、スキャンイメージにおけるスポットの発光強度を模式的に示すものである。これらの図６と図７からは到底スポットの不均一性を認識することはできないが、図４と図５からはバックグランドデータにおける明確な繰り返し性を認識できるので、スポットの不均一が伺われる。
【００３２】
ＤＮＡマイクロアレイの遺伝子発現データは、バックグランドデータを蛍光強度の補正数値として利用しているため、バックグランドデータそのものに周期性があるならば、その遺伝子発現データには必然的にバックグランドデータに起因する周期性が存在することになる。このようなバックグランドデータの周期性は、ＤＮＡマイクロアレイデータの信頼性に影響するものであるから、データ解析時には注意が必要である。
【００３３】
［実施例２］
（メラノーマＤＮＡマイクロアレイ）
スタンフォード大学が公開しているＤＮＡマイクロアレイデータの中からメラノーマＤＮＡマイクロアレイデータを入手した（ＮＣＩ６０ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｐｒｏｊｅｃｔ）。
【００３４】
実施例１と同様にして、バックグランドデータ（ＣＨ１Ｂ）について、数列ＢＧを作成して、これを上記表示方法４によって表示させた。その結果、数列ＢＧにおいて９６の繰り返し構造が存在することが判明した。数列ＢＧにおける各数を、上記表示方法３（但し、ｋ＝９６）によりマトリックス状に表示した結果を図８に示した。
同様にして、バックグランドデータ（ＣＨ２Ｂ）について数列ＢＧの各数を上記表示方法３によりマトリックス状に表示した結果を図９に示した。
これらの図において多数の縦縞（即ち、９６単位の繰り返し）が明確に表示されており、ＣＨ１Ｂ 及びＣＨ２Ｂの数列ＢＧにおいて周期性を有するパターンが存在することがわかる。
【００３５】
実施例１と同様にして、チャンネル１のシグナルデータ「ＣＨ１Ｄ」及びチャンネル２のシグナルデータ「ＣＨ２Ｄ」について、ＤＮＡマイクロアレイ図を図１０，図１１に示した。これらの図１０，図１１からは到底スポットの不均一性を認識することはできないが、図８と図９からはバックグランドデータにおける明確な繰り返し性を認識できるので、スポットの不均一性が伺われる。
【００３６】
【発明の効果】
本発明によれば、極めて簡便に、ＤＮＡマイクロアレイ等のアレイにおけるスポットの均一性を評価することができる。
本発明の方法によりスポットの均一性を事前に評価することにより、ＤＮＡマイクロアレイ等のアレイから得られたシグナルデータを高い精度で解析することできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＮＡマイクロアレイを用いるシグナルデータの一般的な解析フロー。
【図２】１個のスポットを割り付けた桝目内の一般的分布を示す図。
【図３】数例Ｉｊ（ｊ＝１〜１００）をマトリックス群で表示した例を示す。
【図４】イースト菌ＤＮＡマイクロアレイデータのバックグランドデータ（ＣＨ１Ｂ）を、着色したマトリックスで表示した例。ＣＨ１Ｂと色彩の関係を下欄に示す。
【図５】イースト菌ＤＮＡマイクロアレイデータのバックグランドデータ（ＣＨ２Ｂ）を、着色したマトリックスで表示した例。ＣＨ２Ｂと色彩の関係を下欄に示す。
【図６】ＣＨ１Ｂの数例を、マイクロアレイのマトリックスに復元した図。
【図７】ＣＨ２Ｂの数例を、マイクロアレイのマトリックスに復元した図。
【図８】メラノーマＤＮＡのバックグランドデータ（ＣＨ１Ｂ）を、着色したマトリックスで表示した例。ＣＨ１Ｂと色彩の関係を下欄に示す。
【図９】メラノーマＤＮＡのバックグランドデータ（ＣＨ２Ｂ）を、着色したマトリックスで表示した例。ＣＨ１Ｂと色彩の関係を下欄に示す。
【図１０】ＣＨ１Ｂの数例を、マイクロアレイのマトリックスに復元した図。
【図１１】ＣＨ２Ｂの数例を、マイクロアレイのマトリックスに復元した図。
【発明の属する技術分野】
本発明は、アレイ上にプリントされたスポットの均一性を評価する方法であり、ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ、プロテインアレイ等のように基板上にスポットが２次元に配置されたアレイの解析過程を支援する技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトゲノムプロジェクトに代表されるように遺伝子情報解析研究の進展は、世界レベルで加速的に進んでおり、それとともに生体内における遺伝子レベルでの発現を効率よく解析できる新しい方法論の必要性が高まっている。
ＤＮＡマイクロアレイは、スライドガラス上に数百から数万のＤＮＡをマトリックス状のスポットに整列・固定させ、ターゲット細胞から抽出・調整されたｍＲＮＡ（ターゲット）を、ＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせることにより、それぞれの細胞における遺伝子発現レベルを測定する新しい方法である。
【０００３】
基本的には、ＤＮＡマイクロアレイを用いた測定は二蛍光標識来が主流である。二蛍光標識法とは、二種類の細胞（例えば正常細胞とガン細胞）に由来するｍＲＮＡを抽出・精製し、それぞれの細胞を異なる励起波長を持つ蛍光物質（ＣＹ３，ＣＹ５）で標識した後、ＤＮＡマイクロアレイ上の同一スポットで競合的ハイブリダイゼーションを行い、アレイ上の各スポットからそれぞれ異なるＣＹ３とＣＹ５の励起波長における蛍光強度を二つのチャンネル（ＣＨ１，ＣＨ２）から測定することにより、２種類の細胞における遺伝子レベルでの発現量比を計測するものである。実際には、それぞれの蛍光シグナルを計測後、各々の計測結果を重ね合わせて擬似色調解析を行う。
通常、ＣＹ３，ＣＹ５の各データは以下の関係式に基づいて算出され、基本的にはＬｏｇ（Ｒ／Ｇ）の値が遺伝子発現データとして使用される。
【０００４】
【数１】
＊注１）ＣＨ１（チャンネル１）及びＣＨ２（チャンネル２）はレーザース キャナーによるスポットの蛍光強度計測値（赤、緑を別々に計測す るためのチャンネル１，２）
＊注２）ＣＨ１Ｂ（チャンネル１のバックグランドデータ）及びＣＨ２Ｂ （チャンネル２のバックグランドデータ）は、レーザースキャナー によるスポットのバックグランドデータ
【０００６】
サンプルＡで遺伝子発現量の多い遺伝子のスポットは赤色、サンプルＢで発現量の多いものは緑色、ほぼ等量ずつ発現しているものは黄色を示すことになる。
即ち、ＲとＧの比により、スポットは以下の色を示す。
Ｒ／Ｇ＞１ 赤色
Ｒ／Ｇ＝１ 黄色
Ｒ／Ｇ＜１ 緑色
【０００７】
現在、ＤＮＡマイクロアレイデータを基に、遺伝子間の周期性解析、遺伝子発現ネットワーク、遺伝子転写制御のカスケードの研究が次世代の研究として、数理情報的方法を基軸により精度を高めるべく展開されつつあり、ＤＮＡマイクロアレイのデータに対する高い信頼性が求められている。
また、遺伝子発現データに基づきガンの診断がなされる場合、高精度のデータが必要となる。
【０００８】
しかし、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子解析はまだ始まったばかりであり、再現性において解決されなければならない課題が多い。
特に、スポットの形状と大きさは、プリンティング、ハイブリダイゼーション、スライド表面処理等により変動し易く、スポットの位置は、プリンティングピン或いはプラットホームの微小な変位や振動等のスポッティング工程における機械的影響により変動し易いことが知られている。
【０００９】
【本発明が解決しようとする課題】
ＤＮＡマイクロアレイ上のスポットの均一性は、シグナルデータの精度を左右する重要な因子であるが、この均一性を評価する方法が見当たらない。
本発明は、極めて簡便な方法により、ＤＮＡマイクロアレイにおけるスポットの均一性を評価する方法を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現データは、スタンフォード大学のＤＮＡマイクロアレイデータベースを始めとして、ＭＩＴ、ハーバード大学を中心に研究者用に一部公開されている。特にスタンフォード大学のブラウン教授のグループは、１９９７年世界で初めてイースト菌の全遺伝子（６４００遺伝子）の発現解析を成し遂げた（そのデータも公開されている。）
発明者は遺伝子発現量に関して何らかの規則性があるのではないかという観点から、スタンフォード大学のＤＮＡアレイデータベースの中で公開されているイースト菌の全遺伝子の発現データ（ＴＵＰ１）を入手し、染色体順、遺伝子順に発現データを並び替え、その遺伝子発現データを解析した。
その結果、２の倍数のところに弱い周期性があることを確認することができた。しかしながら、この周期は遺伝子発現レベルに起因するものではなく、バックグランドデータの影響によるものであった。
【００１１】
本発明者は、蛍光強度の補正データとして使用されるバックグランドデータそのものに周期性が存在していることが、スポットの不均一性と関係があり、延いては遺伝子発現データの解析に重要な影響を及ぼすことを見出した。また、このような知見は、ＤＮＡマイクロアレイに止まらず、ＤＮＡチップ、プロテインアレイ等のように基板上にスポットが２次元に配置されたアレイ全般に対して適用可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本発明は、ターゲット物質と標識されたプローブ物質とのハイブリダイゼーションにより特異的に発光する複数のスポットを有するアレイにおいて、下記のようにして得られるバックグランドデータからなる数列ＢＧにおいて周期性を有するパターンが発現するか否かにより、スポットの均一性を評価する方法である。
【００１３】
［数列ＢＧの作成方法］
１．アレイの単色発光イメージをスキャンして得られた画像に対して解析ソフトを適用し、各スポットに対応するバックグラウンドデータを得る。
２．各スポットに対応するターゲット物質のプレートＮｏ．（α）とプレートにおける位置（β，γ）を求める。但し、αはプレートを識別する記号又は番号であり、β、γはプレートの穴が形成するマトリックスの行と列である。
３．各バックグラウンドデータにプレートＮｏ． （α）とプレート位置（β，γ）を対応付ける。
４．バックグランドデータを、プレートＮｏ． （α）（第一優先順位）とプレート位置（β，γ）（第二優先順位）の順に並べた数列ＢＧを得る。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下本発明を詳細に説明する。
【００１５】
以下、ＤＮＡマイクロアレイを例にして説明する。
ＤＮＡマイクロアレイを用いるシグナルデータの一般的な解析フローは図１の通りである。
【００１６】
【００１７】
バックグランドデータ
ハイブリダイゼーションを終えたスライドのスキャンを行い、スライド上の各スポットにおける発色状況を画像データとして記録する。その後、前記画像データを解析ソフトにより処理してスポットの発色データを取得する。具体的には、スキャンにより得た画像の上から、各スポットが１個づつ割り当てられるような桝目の中にスポットの形状と同じグリッド画像を重ね、各桝目の中のシグナルデータ及びバックグランドデータを取得する（図２）。
【００１８】
一般に、シグナルデータは長軸と短軸を指定した楕円状スポットの発色強度として計測され、バックグランドデータは、スポットを囲む桝目内であり、且つスポットの外側に当たる領域の強度として計測される。
バックグランドデータは、全てのスポットが鮮明であり且つ発光強度が飽和にならない程度の明るさで発光させたときのデータが望ましい。具体的な操作は、スキャン装置における発光シグナルの検出条件や解析ソフトにおけるスポットの抽出方法により多少変化するが、本発明の方法は、スキャン装置及び解析ソフトの種類に影響を受けるものではない。
【００１９】
好ましいスキャン装置はＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ａ、ＧｅｎｅＴＡＣＬＳＩＶ、ＧＴＭＡＳＳ、ＧＭＳ４１８ＡｒｒａｙＳｃａｎｎｅｒ、ＡｖａｌａｎｃｈｅＭｉｃｒｏｓｃａｎｎｅｒ、ＣｈｉｐＲｅａｄｅｒ、ＧｅｎｅＴＡＣ２０００、ＣＲＢＩＯ、ＳｃａｎＡｒｒａｙ３０００，４０００，５０００等があり、好ましい解析ソフトとしてＳｃａｎＡｌｙｚｅ、ＡｒｒａｙＡｎａｌｙｚｅｒ、ＩｍａＧｅｎｅ、ＡｕｔｏＧｅｎｅ、ＱｕａｎｔＡｒｒａｙ、ＱｕａｎｔａｒｒａｙＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ、ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙＳｕｉｔｅ、ＡｒｒａｙＶｉｓｉｏｎ、ＡｒｒａｙＧａｕｇｅ及びＧｅｎｅＰｉｘＰｒｏ等がある。
【００２０】
数列ＢＧの作成方法
本発明において、バックグランドデータの特徴を顕在化するための指標として数列ＢＧを以下のようにして作成する。
１．ＤＮＡマイクロアレイの単色発光イメージをスキャンして得られた画像に対して解析ソフトを適用し、各スポットに対応するバックグラウンドデータを得る。
２．各スポットに対応するターゲットＤＮＡのプレートＮｏ．（α）とプレートにおける位置（β，γ）を求める。但し、αはプレートを識別する記号又は番号であり、β、γはプレートの穴が形成するマトリックスの行と列である。
３．各バックグラウンドデータにプレートＮｏ． （α）とプレート位置（β，γ）を対応付ける。
４．バックグランドデータを、プレートＮｏ． （α）（第一優先順位）とプレート位置（β，γ）（第二優先順位）の順に並べた数列ＢＧを得る。
【００２１】
数列ＢＧにおけるパターンの表示方法
本発明における表示方法は、数列ＢＧにおいて周期性を有するパターンが存在するか否かを判定することできるものであれば、特に制限はない。
好ましい表示方法は、以下の方法である。
（表示方法）
方法１． 数列全体から所定の個数ごとに抽出した１以上の要素からなる部分数列に対して、数列に含まれる各数を、数の種ごとに決められた色相、明度、彩度またはこれらの組合せからなるカラードットとし、該カラードットを更にマトリクス状に配置したカラードットマトリクスを順次出力し、該カラードットマトリクスを出力することで得られる色彩パターンによって、内在する規則性を顕在化させる方法。
方法２． 数列を複数の部分数列に分割し、分割された部分数列に含まれる各数を数の種ごとに決められた色相、明度、彩度またはこれらの組合せで表示した部分カラードット列とし、該部分カラードット列を並列配置することでカラードットをマトリクス状に配置したカラードットマトリクスを出力し、該カラードットマトリクスを出力することで得られる色彩パターンによって、数列に潜む特徴を顕在化する方法。
【００２２】
より好ましい方法は、以下の方法３である。
即ち、上記方法１または方法２の表示方法において、数列をＩｊ （ｊ＝１〜ｍ）としたときに、数列を構成する各数を下記の配置パターン、すなわち、
に従って配置してカラードットマトリクスを出力することを特徴とする、数列に潜む特徴を顕在化する方法。
【００２３】
更に好ましい方法４は、ｐをｍ未満の任意の自然数、ｒを任意の自然数としたときに、ｋ＝ｐ，ｐ＋ｒ，ｐ＋２ｒ，ｐ＋３ｒ，・・・・と置き換えながら、方法３の表示方法を実施し、ｐ列のカラードットマトリクス、ｐ＋ｒ列のカラードットマトリクス、以下同様に、ｐ＋２ｒ， ｐ＋３ｒ・・・列のカラードットマトリクスの全体を並列配置したカラードットマトリクス群を出力して数列に潜む特徴を顕在化する方法である。
方法４は、繰り返し単位が全く不明である場合、或いは繰り返し領域が数列の一部にしか存在しない場合に特に有効である。
図３において、方法４により数列Ｉｊ（ｊ＝１〜１００）の各要素を、ｋ＝１，ｋ＝２，ｋ＝３，ｋ＝４，…及びｋ＝２０のマトリックスからなるマトリックス群として配置する方法を模式的に示した。
【００２４】
スポットの均一性を評価する方法
適当な表示方法により数列ＢＧを表示したときに周期性を有するパターンが存在するか否かを検証し、周期性を有するパターンが存在する場合にＤＮＡマイクロアレイにおけるスポットの均一性が低いと判断することができる。
但し、数列ＢＧにおいて存在する周期性を有するパターンには種々のタイプがあり、数列ＢＧ全体にわたって一定の繰り返し又は複数の種類の繰り返しが存在する場合、或いは数列ＢＧの一部に繰り返しが存在する場合等がある。
もしも、数列ＢＧにおいて周期性を有するパターンが存在しない場合、スポットは均一にプリントされたと判断できるので、高精度のデータ解析が可能となる。一方、数列ＢＧにおいて一部であっても周期性を有するパターンが存在する場合、スポットのプリント状況が不均一であるから、シグナルデータの信頼性が低い上、補正項であるバックグランドデータの周期性を有するパターンの影響が出てしまうため、周期性を有するパターンを示したスポットのシグナルデータを精密に解析することが困難となる。
【００２５】
【実施例】
以下、本発明の方法を更に具体的に説明する。
［実施例１］
（イースト菌ＤＮＡマイクロアレイ）
スタンフォード大学が公開しているＤＮＡマイクロアレイデータの中からイースト菌ＤＮＡマイクロアレイデータを入手した（Ｇｅｏｍｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｃｈａｎｇｅｓ ，Ａｒｒａｙ Ｄａｔａ Ｆｉｌｅ：ｙ１１ｎ１２１（ｖａｒｉａｂｌｅ ｈｅａｔ ２１Ｃ） ）。
【００２６】
【表１】
【００２７】
【数２】
また、表１において、「ＰＬＡＴ」はプレートを識別する記号又は番号であり、「ＰＲＯＷ」は各プレートにおける行を表す記号であり、「ＰＣＯＬ」は各プレートにおける列を表す数である。
【００２９】
表１において、特定のターゲットＤＮＡに関するデータは行単位で表示され、「ＮＡＭＥ」の欄に表示された各ターゲットＤＮＡのバックグランドデータ（「ＣＨ１Ｂ」，「ＣＨ２Ｂ」）に対して、プレートＮｏ．（「ＰＬＡＴ」）及びプレートにおける位置（「ＰＲＯＷ」，「ＰＣＯＬ」）が対応付けされている。各データは、先ずプレートＮｏ．単位で並べられ、次にプレートの行単位で並べられ、最後にプレートの列で並べられている。従って、表１の上から下に向かう順は、本発明における数列ＢＧの作成方法４に基づく順となっている。
【００３０】
先ず、バックグランドデータ（ＣＨ１Ｂ）について、表１の列「ＣＨ１Ｂ」における最上行〜最下行の順に並べた数列を数列ＢＧとして、これを上記表示方法５によって表示させた。その結果、数列ＢＧにおいて３８４の繰り返し構造が存在することが判明した。数列ＢＧにおける各数を、上記表示方法３（但し、ｋ＝３８４）によりマトリックス状に表示した結果を図４に示した。
同様にして、バックグランドデータ（ＣＨ２Ｂ）について数列ＢＧの各数を上記表示方法３によりマトリックス状に表示した結果を図５に示した。
これらの図から、ＣＨ１Ｂ及び ＣＨ２Ｂの各バックグランドデータの数列ＢＧにおいて、３８４を繰り返し単位として周期的に変動する明確な周期性を有するパターンが存在することがわかる。
【００３１】
チャンネル１のシグナルデータ「ＣＨ１Ｄ」を、数値の大小に応じて色に変換したＤＮＡマイクロアレイ図を図６に示した。又、チャンネル２のシグナルデータ「ＣＨ２Ｄ」について同様に処理したＤＮＡマイクロアレイ図を図７に示した。これらのＤＮＡマイクロアレイ図は実際のスキャンイメージと必ずしも同じではないが、スキャンイメージにおけるスポットの発光強度を模式的に示すものである。これらの図６と図７からは到底スポットの不均一性を認識することはできないが、図４と図５からはバックグランドデータにおける明確な繰り返し性を認識できるので、スポットの不均一が伺われる。
【００３２】
ＤＮＡマイクロアレイの遺伝子発現データは、バックグランドデータを蛍光強度の補正数値として利用しているため、バックグランドデータそのものに周期性があるならば、その遺伝子発現データには必然的にバックグランドデータに起因する周期性が存在することになる。このようなバックグランドデータの周期性は、ＤＮＡマイクロアレイデータの信頼性に影響するものであるから、データ解析時には注意が必要である。
【００３３】
［実施例２］
（メラノーマＤＮＡマイクロアレイ）
スタンフォード大学が公開しているＤＮＡマイクロアレイデータの中からメラノーマＤＮＡマイクロアレイデータを入手した（ＮＣＩ６０ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｐｒｏｊｅｃｔ）。
【００３４】
実施例１と同様にして、バックグランドデータ（ＣＨ１Ｂ）について、数列ＢＧを作成して、これを上記表示方法４によって表示させた。その結果、数列ＢＧにおいて９６の繰り返し構造が存在することが判明した。数列ＢＧにおける各数を、上記表示方法３（但し、ｋ＝９６）によりマトリックス状に表示した結果を図８に示した。
同様にして、バックグランドデータ（ＣＨ２Ｂ）について数列ＢＧの各数を上記表示方法３によりマトリックス状に表示した結果を図９に示した。
これらの図において多数の縦縞（即ち、９６単位の繰り返し）が明確に表示されており、ＣＨ１Ｂ 及びＣＨ２Ｂの数列ＢＧにおいて周期性を有するパターンが存在することがわかる。
【００３５】
実施例１と同様にして、チャンネル１のシグナルデータ「ＣＨ１Ｄ」及びチャンネル２のシグナルデータ「ＣＨ２Ｄ」について、ＤＮＡマイクロアレイ図を図１０，図１１に示した。これらの図１０，図１１からは到底スポットの不均一性を認識することはできないが、図８と図９からはバックグランドデータにおける明確な繰り返し性を認識できるので、スポットの不均一性が伺われる。
【００３６】
【発明の効果】
本発明によれば、極めて簡便に、ＤＮＡマイクロアレイ等のアレイにおけるスポットの均一性を評価することができる。
本発明の方法によりスポットの均一性を事前に評価することにより、ＤＮＡマイクロアレイ等のアレイから得られたシグナルデータを高い精度で解析することできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＮＡマイクロアレイを用いるシグナルデータの一般的な解析フロー。
【図２】１個のスポットを割り付けた桝目内の一般的分布を示す図。
【図３】数例Ｉｊ（ｊ＝１〜１００）をマトリックス群で表示した例を示す。
【図４】イースト菌ＤＮＡマイクロアレイデータのバックグランドデータ（ＣＨ１Ｂ）を、着色したマトリックスで表示した例。ＣＨ１Ｂと色彩の関係を下欄に示す。
【図５】イースト菌ＤＮＡマイクロアレイデータのバックグランドデータ（ＣＨ２Ｂ）を、着色したマトリックスで表示した例。ＣＨ２Ｂと色彩の関係を下欄に示す。
【図６】ＣＨ１Ｂの数例を、マイクロアレイのマトリックスに復元した図。
【図７】ＣＨ２Ｂの数例を、マイクロアレイのマトリックスに復元した図。
【図８】メラノーマＤＮＡのバックグランドデータ（ＣＨ１Ｂ）を、着色したマトリックスで表示した例。ＣＨ１Ｂと色彩の関係を下欄に示す。
【図９】メラノーマＤＮＡのバックグランドデータ（ＣＨ２Ｂ）を、着色したマトリックスで表示した例。ＣＨ１Ｂと色彩の関係を下欄に示す。
【図１０】ＣＨ１Ｂの数例を、マイクロアレイのマトリックスに復元した図。
【図１１】ＣＨ２Ｂの数例を、マイクロアレイのマトリックスに復元した図。
Claims (3)
- ターゲット物質と標識されたプローブ物質とのハイブリダイゼーションにより特異的に発光する複数のスポットを有するアレイにおいて、下記のようにして得られるバックグランドデータからなる数列ＢＧにおいて周期性を有するパターンが発現するか否かにより、スポットの均一性を評価する方法。
［数列ＢＧの作成方法］
１．アレイの単色発光イメージをスキャンして得られた画像に対して解析ソフトを適用し、各スポットに対応するバックグラウンドデータを得る。
２．各スポットに対応するターゲット物質のプレートＮｏ．（α）とプレートにおける位置（β，γ）を求める。但し、αはプレートを識別する記号又は番号であり、β、γはプレートの穴が形成するマトリックスの行と列である。
３．各バックグラウンドデータにプレートＮｏ． （α）とプレート位置（β，γ）を対応付ける。
４．バックグランドデータを、プレートＮｏ． （α）（第一優先順位）とプレート位置（β，γ）（第二優先順位）の順に並べた数列ＢＧを得る。 - ターゲットＤＮＡと標識されたプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより特異的に発光する複数のスポットを有するＤＮＡマイクロアレイにおいて、下記のようにして得られるバックグランドデータからなる数列ＢＧにおいて周期性を有するパターンが発現するか否かにより、スポットの均一性を評価する方法。
［数列ＢＧの作成方法］
１．ＤＮＡマイクロアレイの単色発光イメージをスキャンして得られた画像に対して解析ソフトを適用し、各スポットに対応するバックグラウンドデータを得る。
２．各スポットに対応するターゲットＤＮＡのプレートＮｏ．（α）とプレートにおける位置（β，γ）を求める。但し、αはプレートを識別する記号又は番号であり、β、γはプレートの穴が形成するマトリックスの行と列である。
３．各バックグラウンドデータにプレートＮｏ． （α）とプレート位置（β，γ）を対応付ける。
４．バックグランドデータを、プレートＮｏ． （α）（第一優先順位）とプレート位置（β，γ）（第二優先順位）の順に並べた数列ＢＧを得る。 - 数列ＢＧにおけるパターンを下記の方法１又は方法２の表示方法により表示させて、数列ＢＧにおいて周期性を有するパターンが発現したか否かを判定することを特徴とする請求項１記載の方法。
（表示方法）
方法１． 数列全体から所定の個数ごとに抽出した１以上の要素からなる部分数列に対して、数列に含まれる各数を、数の種ごとに決められた色相、明度、彩度またはこれらの組合せからなるカラードットとし、該カラードットを更にマトリクス状に配置したカラードットマトリクスを順次出力し、該カラードットマトリクスを出力することで得られる色彩パターンによって、内在する規則性を顕在化させる方法。
方法２． 数列を複数の部分数列に分割し、分割された部分数列に含まれる各数を数の種ごとに決められた色相、明度、彩度またはこれらの組合せで表示した部分カラードット列とし、該部分カラードット列を並列配置することでカラードットをマトリクス状に配置したカラードットマトリクスを出力し、該カラードットマトリクスを出力することで得られる色彩パターンによって、数列に潜む特徴を顕在化する方法。
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