JP2004290170A - Use of gene associated with disease - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a preventing/treating agent of neurodegenerative diseases, i.e., a method for screening a compound adjusting the activity of a product which is a gene expression product of a gene of which expression is enhanced when an un-differentiated nerve cell differentiates to a cholinergic neuron at the onset of the neurodegenerative diseases, and a compound obtained by the screening. <P>SOLUTION: The preventing/treating agents of neurodegenerative diseases are a compound or its salt, adjusting the activity of a protein having the same or substantially the same amino acid sequence with the amino acid sequence expressed by sequence number: 14 (in the specification), a compound adjusting the expression of the protein, the protein or its partial peptide, a DNA encoding the protein or its partial peptide, etc. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、疾患関連遺伝子の用途に関する。さらに詳しくは、神経変性疾患の予防・治療剤および診断薬など；あるいは神経変性疾患関連遺伝子（対応するＤＮＡを含む）、該疾患関連遺伝子産物（タンパク質、その部分ペプチドを含む）、該疾患関連遺伝子形質転換細胞などを用いて行う薬剤のスクリーニング方法など；に関する。
【０００２】
【従来の技術】
通常、中枢神経細胞は損傷を受けると再生することはない。しかしながら多くの末梢の感覚神経は日常的に再生が可能なものが多い。これは感覚器の中に、分裂、増殖が可能な未分化な細胞が存在するからである。脳の中の神経組織ではそのような細胞は存在しないと長く考えられてきた。しかし、最近、成熟個体の脳内でも一部の場所には、分裂、増殖を行う神経幹細胞が存在することがわかり、これを用いた中枢神経の再生が試みられている。現在主に考えられているのは、パーキンソン病を対象とし、神経幹細胞または分化させた神経細胞を線条体に移植するというものである。これは臨床での中絶胎児脳の移植実験により移植医療の有効性が示されていることと、ｉｎ ｖｉｔｒｏで神経幹細胞がパーキンソン病において変性するドーパミン作動性ニューロンに分化しやすいことが示されているからである。しかし、ドーパミン作動性ニューロン以外の神経の分離法は確立されたものがないため、他の神経変性疾患に対してはほとんど再生治療の試みはされていない。現段階では、各神経細胞への分化機構の解明が神経変性疾患における神経細胞の再生を可能にすると考えられる。
アルツハイマー病では、最も初期に変性が見られるのは中隔野や海馬におけるコリン作動性ニューロンである。コリン作動性ニューロンは記憶、学習といったアルツハイマー病において障害の見られる行動にかかわっているとされている。現在の治療法はアセチルコリンを介した神経伝達経路を増強する対症療法がほとんどであり、再生医療をはじめとする新しい医療法が求められている。しかし、ドーパミン作動性ニューロンと異なりコリン作動性ニューロンは胎児脳や神経幹細胞からの分離方法が確立されておらず、また、分化機構もあまりわかっていない。そのため、再生医療への応用がおくれている。そこで、コリン作動性ニューロンの分化機構が解明できれば、移植用や内在性の神経幹細胞の分化を促進することでアルツハイマー病の再生医療が可能になると考えられる。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ｂｃ０２４６１７
【特許文献１】
ＷＯ２００１−５７１９０
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、未分化な神経細胞をコリン作動性ニューロンへ分化させるという観点からのアルツハイマー病などの神経変性疾患治療薬開発を念頭に置いており、その探索ターゲットの発掘を目的として、神経変性疾患発症時などに未分化な神経細胞がコリン作動性ニューロンへ分化する時に発現が上昇する遺伝子を同定し、その遺伝子産物であるタンパク質の活性を調節する化合物のスクリーニング方法、該スクリーニング方法で得られる化合物などを提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、マウスＥＣ（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞であるＰ１９細胞を用いた神経細胞分化誘導系で発現上昇が見られる遺伝子を見出し、この知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。即ち、Ｐ１９細胞がコリン作動性ニューロンに分化するときに発現が増加するｍＲＮＡをジーンチップ解析から見出した。このｍＲＮＡはその塩基配列からＮＣＢＩ（ジーンバンク）に登録された既知のマウス遺伝子（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ， ｃｌｏｎｅ ＭＧＣ：２８５１３ ＩＭＡＧＥ：４１９０４８０， ｍＲＮＡ， ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ ｇｉ｜１９３５３１８０｜ｇｂ｜ＢＣ０２４６１７．１｜［１９３５３１８０］）であると判明した。該ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡは配列番号：１で表される塩基配列を有するが、当該ｍＲＮＡの発現プロファイルを詳細に検討した結果、このｍＲＮＡは、マウス神経幹細胞を用いたコリン作動性ニューロンへの分化誘導系で培養１日目から４日目まで発現が上昇することが明らかとなった。これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
（１）配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩（好ましくは、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩；配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩；配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩；など）の活性（好ましくは、神経細胞分化活性；さらに好ましくは、コリン作動性ニューロンへの分化活性）を調節（好ましくは促進）する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防・治療剤（好ましくは、神経細胞分化促進剤；さらに好ましくは、コリン作動性ニューロンへの分化促進剤）；
（２）配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩（好ましくは、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩；配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩；配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩；など）の遺伝子の発現を調節（好ましくは促進）する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防・治療剤好ましくは、神経細胞分化促進剤；さらに好ましくは、コリン作動性ニューロンへの分化促進剤）；
（３）配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチド（好ましくは、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；など）をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド；
（４）上記（３）記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬；
（５）神経細胞分化抑制剤（好ましくは、コリン作動性ニューロンへの分化抑制剤）である上記（４）記載の医薬；
（６）配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（好ましくは、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩；など）またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体；
（７）上記（６）記載の抗体を含有してなる医薬；
（８）神経細胞分化抑制剤（好ましくは、コリン作動性ニューロンへの分化抑制剤）である上記（７）記載の医薬；
（９）上記（６）記載の抗体を含有してなる診断薬；
（１０）神経変性疾患の診断薬である上記（９）記載の診断薬；
（１１）配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（好ましくは、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；など）またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる神経変性疾患の診断薬；
（１２）配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（好ましくは、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩；など）もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を調節（好ましくは促進）する化合物またはその塩のスクリーニング方法；
（１３）配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（好ましくは、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩；など）もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を調節（好ましくは促進）する化合物またはその塩のスクリーニング方法；
（１４）配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（好ましくは、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩；など）もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を調節（好ましくは促進）する化合物またはその塩のスクリーニング用キット；
（１５）配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（好ましくは、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩；など）もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を調節（好ましくは促進）する化合物またはその塩のスクリーニング用キット；
（１６）上記（１２）もしくは（１３）記載のスクリーニング方法または上記（１４）もしくは（１５）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩；
（１７）上記（１６）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬；
（１８）神経変性疾患の予防・治療剤（好ましくは、神経細胞分化促進剤；さらに好ましくは、コリン作動性ニューロンへの分化促進剤）である上記（１７）記載の医薬；
（１９）配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（好ましくは、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；など）またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を調節（好ましくは促進）する化合物またはその塩のスクリーニング方法；
（２０）配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（好ましくは、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；など）またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を調節（好ましくは促進）する化合物またはその塩のスクリーニング方法；
（２１）配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（好ましくは、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；など）またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を調節（好ましくは促進）する化合物またはその塩のスクリーニング用キット；
（２２）配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（好ましくは、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；など）またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を調節（好ましくは促進）する化合物またはその塩のスクリーニング用キット；
（２３）上記（１９）もしくは（２０）記載のスクリーニング方法または上記（２１）もしくは（２２）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩；
（２４）上記（２３）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬；
（２５）神経変性疾患の予防・治療剤（好ましくは、神経細胞分化促進剤；さらに好ましくは、コリン作動性ニューロンへの分化促進剤）である上記（２４）記載の医薬；
（２６）配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（好ましくは、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩；など）またはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進することを特徴とする神経変性疾患の予防・治療方法；
（２７）配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（好ましくは、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩；など）またはその部分ペプチドの遺伝子の発現を促進することを特徴とする神経変性疾患の予防・治療方法；
（２８）配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする神経変性疾患の予防・治療方法；
（２９）配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする神経変性疾患の予防・治療方法；
（３０）神経変性疾患の予防・治療剤の製造のための配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の使用；
（３１）神経変性疾患の予防・治療剤の製造のための配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩の使用；
（３２）配列番号：２７で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩；
（３３）上記（３２）記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩；
（３４）上記（３２）記載のタンパク質または上記（３３）記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（３５）ＤＮＡである上記（３４）記載のポリヌクレオチド；
（３６）配列番号：２６で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（３７）配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩（好ましくは、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩；配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩；配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩；など）を含有してなる神経変性疾患の予防・治療剤（好ましくは、神経細胞分化促進剤；さらに好ましくは、コリン作動性ニューロンへの分化促進剤）；
（３８）配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド（好ましくは、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；など）をコードするポリヌクレオチドを含有してなる神経変性疾患の予防・治療剤（好ましくは、神経細胞分化促進剤；さらに好ましくは、コリン作動性ニューロンへの分化促進剤）；
などに関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられる配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、本発明のタンパク質または本発明で用いられるタンパク質と称することもある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。ここで言う「アミノ酸配列の相同性」は、例えば、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ ＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）などを用いて計算することができる。
配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質（例えば、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；など）などが好ましい。
【０００８】
実質的に同質の活性としては、例えば、未分化な神経細胞をコリン作動性ニューロンへ分化させる活性（以下、神経細胞分化活性と称することがある。）などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、神経細胞分化活性などが同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
神経細胞分化活性の測定は、例えばマウスＥＣ（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞であるＰ１９細胞を用いた神経細胞分化誘導系などで測定することができる。
具体的には、後述の実施例に記載の方法などに準じて行えばよい。
【０００９】
また、本発明で用いられるタンパク質としては、例えば、（ｉ）配列番号：１４で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：１４で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：１４で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：１４で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
【００１０】
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１４もしくは配列番号：２６または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明で用いられるタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列を含有するマウス由来のタンパク質；配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を含有するマウス由来のタンパク質；配列番号：１６で表されるアミノ酸配列を含有するヒト由来のタンパク質；などがあげられる。
【００１１】
本発明のタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本発明のタンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記した本発明のタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。
本発明のタンパク質が構成するアミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
また、本発明で用いられる部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
【００１２】
また、本発明で用いられる部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様に、Ｃ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有しているもの、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いることができる。
【００１３】
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１４】
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、またはそのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００１５】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００１６】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００１７】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００１８】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
【００１９】
本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用いられる部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｖ）に記載された方法が挙げられる。
（ｉ）Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ および Ｍ．Ａ． Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス （Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）， Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９６６年）（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９６５年）
（ｉｉｉ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善（株） （１９７５年）
（ｉｖ）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 １、 タンパク質の化学ＩＶ、 ２０５、（１９７７年）
（ｖ）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００２０】
本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接 Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１５もしくは配列番号：２７または配列番号：１８で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１５もしくは配列番号：２７または配列番号：１８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：１４もしくは配列番号：２６または配列番号：１６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
【００２１】
配列番号：１５もしくは配列番号：２７または配列番号：１８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１５もしくは配列番号：２７または配列番号：１８で表される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， １９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１５で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。また、配列番号：１６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１８で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。また、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２７で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２２】
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）としては、前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１５もしくは配列番号：２７または配列番号：１８で表される塩基配列を含有するＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：１５もしくは配列番号：２７または配列番号：１８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：１５もしくは配列番号：２７または配列番号：１８で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
【００２３】
本発明で用いられるタンパク質、部分ペプチド（以下、これらをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， １９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲ、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００２４】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、アデノウイルス、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００２５】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００２６】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ），６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。
【００２７】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ， Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ Ｖｉｖｏ），１３， ２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，マウスＡＴＤＣ５細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。さらに、ヒト癌細胞由来細胞株（ＤＬＤ−１細胞、ＨＣＴ−１５細胞、ＳＷ−４８０細胞、ＬｏＶｏ細胞、ＨＣＴ−１１６細胞、ＷｉＤｒ細胞、ＨＴ−２９細胞、ＬＳ−１７４Ｔ細胞、ＳＮＵ−Ｃ１細胞、ＳＮＵ−Ｃ４細胞、ＳＮＵ−Ｃ２Ａ細胞、ＣＸ−１細胞、ＧＩ−１１２細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｒａｊｉ細胞、Ｇ３６１細胞、Ｓ３細胞）なども用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Ｇｅｎｅ），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００２８】
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６， ４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。このようにして、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００２９】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ， Ｋ． Ｌ． ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ），７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ， Ｇ． Ａ． ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ， Ｔ．Ｃ．Ｃ．，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。
【００３０】
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００３１】
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより測定することができる。
【００３２】
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、抗体の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明のタンパク質を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６、４９５ （１９７５）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
【００３３】
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００３４】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００３５】
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ（以下、アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、これらのＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する場合がある））の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレオチドとしては、本発明のＤＮＡの塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであってもよいが、アンチセンスＤＮＡが好ましい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、（イ）翻訳阻害を指向したアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、本発明のタンパク質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが、（ロ）ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解を指向するアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、イントロンを含む本発明のＤＮＡの全塩基配列の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドがそれぞれ好適である。
具体的には、配列番号：１５もしくは配列番号：２７または配列番号：１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド、好ましくは例えば、配列番号：１５もしくは配列番号：２７または配列番号：１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列に相補な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド（より好ましくは、配列番号：１５もしくは配列番号：２７または配列番号：１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列に相補な塩基配列の一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド）などが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、１０〜４０個程度、好ましくは１５〜３０個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換されていてもよい。また、各ヌクレオチドの糖（デオキシリボース）は、２’−Ｏ−メチル化などの化学修飾糖構造に置換されていてもよいし、塩基部分（ピリミジン、プリン）も化学修飾を受けたものであってもよく、配列番号：１５もしくは配列番号：２７または配列番号：１８で表わされる塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするものであればいずれのものでもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
【００３６】
本発明に従えば、本発明のタンパク質遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンス・ポリヌクレオチドを、クローン化した、あるいは決定されたタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。かかるポリヌクレオチド（核酸）は、本発明のタンパク質遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいは本発明のタンパク質関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明のタンパク質関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明のタンパク質関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（蛋白質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（蛋白質）のアミノ酸を通常指している。タンパク質遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、対象物と「アンチセンス」であるということができる。アンチセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、例えば Ｊ． Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ Ｔｅｃｈ Ｊａｐａｎ， Ｖｏｌ． ８， ｐｐ．２４７， １９９２； Ｖｏｌ． ８， ｐｐ．３９５， １９９２； Ｓ． Ｔ． Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ． ｅｄ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３ などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発明のタンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
【００３７】
以下に、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）、本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある））、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）、および本発明のＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド（以下、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドと略記する場合がある）の用途を説明する。
【００３８】
本発明のタンパク質は、神経組織において発現が多く見られるので、疾患マーカーとして利用することが出来る。すなわち、神経系疾患における早期診断、症状の重症度の判定、疾患進行の予測のためのマーカーとして有用である。また、本発明のタンパク質は、神経細胞分化因子（未分化な神経細胞をコリン作動性ニューロンへ分化させる因子）として機能し、神経組織において発現が多く見られる。よって、本発明のタンパク質をコードする遺伝子のアンチセンスポリヌクレオチド、本発明のタンパク質の活性または発現を阻害する化合物もしくはその塩または本発明のタンパク質に対する抗体を含有する医薬は、例えば神経細胞分化抑制剤などとして使用することができる。さらに、本発明のタンパク質をコードする遺伝子、本発明のタンパク質をコードする遺伝子のアンチセンスポリヌクレオチドまたは本発明のタンパク質に対する抗体（好ましくは、本発明のタンパク質をコードする遺伝子、本発明のタンパク質に対する抗体）は、神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、脊髄損傷、てんかん、精神分裂病、うつ病など）などの診断薬として使用することができる。好ましくは神経変性疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群など）の診断薬などである。
【００３９】
（１）本発明のタンパク質が関与する各種疾病の予防・治療剤
本発明のタンパク質は、神経細胞分化因子（未分化な神経細胞をコリン作動性ニューロンへ分化させる因子）として機能し、神経組織において発現が多く見られる。したがって、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡに異常があったり、欠損している場合あるいは本発明のタンパク質の発現量が減少している場合には、例えば、神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、脊髄損傷、てんかん、精神分裂病、うつ病など）などが発症する。
したがって、本発明のタンパク質および本発明のＤＮＡは、例えば、神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、脊髄損傷、てんかん、精神分裂病、うつ病など）などの予防・治療剤などの医薬として使用することができる。好ましくは神経変性疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群など）の予防・治療剤などである。さらに、本発明のタンパク質の活性または発現を促進する化合物もしくはその塩は、例えば、神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、脊髄損傷、てんかん、精神分裂病、うつ病など）などの予防・治療剤などの医薬として使用することができる。好ましくは神経変性疾患の予防・治療剤などである。
例えば、生体内において本発明のタンパク質が減少あるいは欠損しているために、神経細胞分化調節が十分に、あるいは正常に発揮されない患者がいる場合に、（イ）本発明のＤＮＡをその患者に投与し、生体内で本発明のタンパク質を発現させることによって、（ロ）細胞に本発明のＤＮＡを挿入し、本発明のタンパク質を発現させた後に、その細胞を患者に移植することによって、または（ハ）本発明のタンパク質をその患者に投与することなどによって、その患者における本発明のタンパク質の役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。本発明のＤＮＡを上記の予防・治療剤として使用する場合は、本発明のＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたはその他の温血動物に投与することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
本発明のタンパク質を上記の予防・治療剤として使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
本発明のタンパク質は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のタンパク質等を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
本発明のＤＮＡが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、温血動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
本発明のタンパク質の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、アルツハイマー病の治療目的で本発明のタンパク質等を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該タンパク質を約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該タンパク質等の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、アルツハイマー病の治療目的で本発明のタンパク質等を注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該タンパク質等を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のタンパク質は未分化な神経幹細胞からコリン作動性ニューロンへの分化の段階で発現が上昇するので、コリン作動性ニューロンに関わる疾患マーカーとして利用することができる。すなわち、神経系疾患における早期診断、症状の重症度の判定、疾患進行の予測のためのマーカーとして有用である。よって、本発明のタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド、本発明のタンパク質の活性を調節（促進または阻害、好ましくは促進）する化合物もしくはその塩、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を調節（促進または阻害、好ましくは促進）する化合物もしくはその塩または本発明のタンパク質を含有する医薬は、例えば、神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、脊髄損傷、てんかん、精神分裂病、うつ病など）などの治療・予防剤として使用することができる。好ましくは神経変性疾患の予防・治療剤などである。
（２）疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質は未分化な神経幹細胞からコリン作動性ニューロンへの分化の段階で発現が上昇するので、本発明のタンパク質の活性を調節（促進または阻害、好ましくは促進）する化合物もしくはその塩、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を調節（促進または阻害、好ましくは促進）する化合物もしくはその塩は、例えば、神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、脊髄損傷、てんかん、精神分裂病、うつ病など）などの治療・予防剤として使用することができる。好ましくは神経変性疾患の予防・治療剤などである。
したがって、本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質の活性を調節（促進または阻害、好ましくは促進）する化合物もしくはその塩、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を調節（促進または阻害、好ましくは促進）する化合物もしくはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
すなわち本発明は、本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発明のタンパク質の活性（例えば、▲１▼コリン作動性ニューロン分化促進活性あるいは▲２▼ドーパミン作動性ニューロン分化抑制活性などの神経細胞分化）を調節（促進または阻害、好ましくは促進）する化合物、あるいは本発明のタンパク質の遺伝子の発現を調節（促進または阻害、好ましくは促進）する化合物のスクリーニング方法を提供する。より具体的には、上記スクリーニング方法においては、例えば、（１）試験化合物存在下と（２）試験化合物非存在下の場合における、本発明のタンパク質の遺伝子発現量を測定して、比較することを特徴とするものである。
更に（３）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞あるいは本発明のタンパク質をコードするｃＤＮＡを導入した細胞を致死的な条件下で培養を行った場合、具体的には血清除去下あるいは神経細胞に比較的毒性の強いアドリアマイシンなどの抗癌剤を加えて培養した場合と（４）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞あるいは本発明のタンパク質をコードするｃＤＮＡを導入した細胞と試験化合物の混合物とを致死的な条件下で培養を行った場合、具体的には血清除去下あるいは神経細胞に比較的毒性の強いアドリアマイシンなどの抗癌剤を加えて培養した場合との比較を行うことを特徴とする調節薬のスクリーニング方法を提供する。上記スクリーニング方法においては、例えば、（１）と（２）の場合における、神経細胞保護作用と本発明のタンパク質の遺伝子発現量を測定して、比較することを特徴とするものである。
更に遺伝子産物によって発現が制御されると考えうる遺伝子などのプロモーターを用いたレポーター・ジーン・アッセイにおいてその活性の調節を特徴とするスクリーニング法を提供する。より具体的には初代神経細胞あるいはＰ１９細胞株あるいは配列番号：１５もしくは配列番号：２７または配列番号：１８で示される遺伝子を導入した初代神経細胞あるいはＰ１９細胞株を宿主細胞としてレポーター・ジーン・アッセイを行う。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、生体由来非ペプチド性化合物（糖質、脂質など）、合成化合物、微生物培養物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適した培地を用いて培養する。培地は、本発明のタンパク質の遺伝子発現に影響を与えないものであればいずれでもよい。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタンパク質を細胞に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。本発明のタンパク質を発現し得る細胞の培養方法は、前記した本発明の形質変換体の培養法と同様である。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられる。
【００４０】
本発明のタンパク質の活性を促進する活性を有する化合物は、本発明のタンパク質の作用を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のタンパク質の活性を阻害する活性を有する化合物は、本発明のタンパク質の生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物である。該化合物の塩としては、前記した本発明のペプチドの塩と同様のものが用いられる。
【００４１】
さらに、本発明のタンパク質をコードする遺伝子も、神経組織において発現が多く見られるので、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節（促進または阻害、好ましくは促進）する化合物またはその塩も、例えば、神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、脊髄損傷、てんかん、精神分裂病、うつ病など）などの予防・治療剤として使用することができる。好ましくは神経変性疾患の予防・治療剤などである。
したがって、本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節（促進または阻害、好ましくは促進）する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
スクリーニング方法としては、（ｉｉｉ）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合と、（ｉｖ）試験化合物の存在下、本発明で用いられるタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合との比較を行うことを特徴とするスクリーニング方法が挙げられる。
上記方法において、（ｉｉｉ）と（ｉｖ）の場合における、前記遺伝子の発現量（具体的には、本発明のタンパク質量または前記タンパク質をコードするｍＲＮＡ量）を測定して、比較する。
試験化合物および本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、上記と同様のものが挙げられる。
タンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、本発明のタンパク質を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
本発明の遺伝子発現量は、自体公知の方法、例えば、ノーザンブロッティングやＲｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）やＴａｑＭａｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎなどの方法あるいはそれに準じる方法にしたがって測定することができる。
例えば、上記（ｉｖ）の場合における遺伝子発現量を、上記（ｉｉｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害するあるいは増強する試験化合物を本発明のタンパク質の活性を阻害するあるいは増強する化合物として選択することができる。
【００４２】
本発明のスクリーニング用キットは、本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、または本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドを産生する能力を有する細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物またはその塩であり、本発明のタンパク質の活性（例、神経細胞分化活性など）あるいは本発明のタンパク質の遺伝子の発現を調節（促進または阻害、好ましくは促進）する化合物またはその塩である。
該化合物の塩としては、前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用いられる。
本発明のタンパク質の活性を調節（促進または阻害、好ましくは促進）する化合物またはその塩、および本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節（促進または阻害、好ましくは促進）する化合物またはその塩はそれぞれ、例えば、神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、脊髄損傷、てんかん、精神分裂病、うつ病など）などの予防・治療剤として有用である。好ましくは神経変性疾患の予防・治療剤などである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の治療・予防剤として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
【００４３】
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
【００４４】
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、アルツハイマー病の治療の目的で本発明のタンパク質の活性を調節（好ましくは促進）する化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、アルツハイマー病の治療の目的で本発明のタンパク質の活性を調節（好ましくは促進）する化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度をアルツハイマー病変部に注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４５】
（２ａ）本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の定量
本発明のタンパク質に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）は、本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のタンパク質の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のタンパク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法、および
（ｉｉ）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法を提供する。
上記（ｉｉ）の定量法においては、一方の抗体が本発明のタンパク質のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質のＣ末端部に反応する抗体であることが望ましい。
【００４６】
また、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある）を用いて本発明のタンパク質の定量を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２ 、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
【００４７】
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク質量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク質のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
【００４８】
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００４９】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」 Ｖｏｌ． ７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ａ））、 同書 Ｖｏｌ． ７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｂ））、 同書 Ｖｏｌ． ７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｃ））、 同書 Ｖｏｌ． ８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、 同書 Ｖｏｌ． ９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ））、 同書 Ｖｏｌ． １２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のタンパク質を感度良く定量することができる。
さらには、本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質の濃度を定量することによって、本発明のタンパク質の濃度の増加または減少が検出された場合、例えば神経系疾患などである、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパク質を検出するために使用することができる。また、本発明のタンパク質を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のタンパク質の検出、被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのために使用することができる。
【００５０】
（３）遺伝子診断薬
本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジーなど）における本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。
本発明のＤＮＡを用いる上記遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ），第５巻，８７４〜８７９頁、１９８９年、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ），第８６巻，２７６６〜２７７０頁、１９８９年）などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより発現過多または減少が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によりＤＮＡの突然変異が検出された場合は、例えば、神経系疾患などである可能性が高いと診断することができる。
【００５１】
（４）アンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬
本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を調節することができるアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のタンパク質または本発明のＤＮＡの機能を調節（好ましくは抑制）することができるので、例えば、神経細胞分化抑制剤として使用することができる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記の剤として使用する場合、自体公知の方法にしたがって製剤化し、投与することができる。
例えば、該アンチセンスポリヌクレオチドを用いる場合、該アンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエイテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段にしたがって、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンスポリヌクレオチドはそのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリポゾームなどの担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下、関節腔内、アルツハイマー病変部等に投与してもよい。
さらに、該アンチセンスポリヌクレオチドは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡ、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイム、本発明のタンパク質が結合するＤＮＡ配列に対するデコイオリゴヌクレオチドなども、本発明の遺伝子の発現を抑制することができ、生体内における本発明で用いられるタンパク質または本発明で用いられるＤＮＡの機能を抑制することができるので、例えば、神経細胞分化抑制剤などとして使用することができる。
二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Ｎａｔｕｒｅ， ４１１巻， ４９４頁， ２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザイムは、公知の方法（例、ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ７巻， ２２１頁， ２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得る本発明のＲＮＡ上の切断部位に近接した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられる。
デコイオリゴヌクレオチドは、公知の方法（例、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ， １０６巻， １０７１頁， ２０００年）に準じて、本発明のタンパク質が結合するＤＮＡの配列を基に設計して製造することができる。具体的には、該デコイオリゴヌクレオチドとしては、本発明のタンパク質が結合するＤＮＡの配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のタンパク質が結合し得るものであれば何れのものでもよい。本発明のタンパク質が結合するＤＮＡの配列とハイブリダイズできる塩基配列としては、例えば、本発明のタンパク質が結合するＤＮＡの配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが用いられる。
上記の二重鎖ＲＮＡ、リボザイムまたはデコイオリゴヌクレオチドを上記剤として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
【００５２】
（５）本発明の抗体を含有する医薬
本発明のタンパク質の活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、例えば神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、脊髄損傷、てんかん、精神分裂病、うつ病など）などの診断薬として使用することができる。また、神経細胞分化抑制剤などとして使用してもよい。
本発明の抗体を含有する上記剤は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、関節内投与）に投与することができる。
【００５３】
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与（例、関節内投与）に適する剤形として提供される。好ましくは吸入剤として提供される。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【００５４】
（６）ＤＮＡ転移動物
本発明は、外来性の本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
【００５５】
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のタンパク質を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
【００５６】
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、▲１▼ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳がんウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、▲２▼各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネーターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられる。
【００５７】
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
【００５８】
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能亢進症や、本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
【００５９】
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正常タンパク質の機能阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ作用）を解明するモデルとなる。また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の減少症状を有することから、本発明のタンパク質または機能不活性型不応症に対する予防・治療剤、例えば神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、脊髄損傷、てんかん、精神分裂病、うつ病など）などの予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。好ましくは神経変性疾患の予防・治療剤のスクリーニング試験である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
▲１▼組織培養のための細胞源としての使用、
▲２▼本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたペプチド組織を分析することによる、本発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するペプチドとの関連性についての解析、
▲３▼ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
▲４▼上記▲３▼記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
▲５▼本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
【００６０】
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症などを含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のタンパク質産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のタンパク質が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
【００６１】
（７）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第（１）項記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である第（１）項記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）項記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである第（４）項記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである第（８）項記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）第（７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【００６２】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
【００６３】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 ＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
【００６４】
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１〜１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０．００１〜０．５％トリプシン／０．１〜５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０．１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔Ｍ． Ｊ． Ｅｖａｎｓ及びＭ． Ｈ． Ｋａｕｆｍａｎ， ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２９２巻、１５４頁、１９８１年；Ｇ． Ｒ． Ｍａｒｔｉｎ プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．）第７８巻、７６３４頁、１９８１年；Ｔ． Ｃ． Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第８７巻、２７頁、１９８５年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。
【００６５】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
【００６６】
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のタンパク質により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【００６７】
（８ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病、例えば神経系疾患などに対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【００６８】
神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、脊髄損傷、てんかん、精神分裂病、うつ病など）など、好ましくは神経変性疾患に対して治療・予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、試験化合物非投与群と神経系疾患の発症度合いの違いや神経系疾患の治癒度合いの違いを上記組織で経時的に観察する。
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の上記疾患症状が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上改善した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）のアルツハイマー病患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）のアルツハイマー病患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００６９】
（８ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のタンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【００７０】
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害（好ましくは、促進）する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現の調節（好ましくは、促進）、該タンパク質の機能を調節（好ましくは、促進）することができるので、神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、脊髄損傷、てんかん、精神分裂病、うつ病など）などの予防・治療剤、好ましくは神経変性疾患の予防・治療剤として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）のアルツハイマー病患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）のアルツハイマー病患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療剤の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのタンパク質を合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のタンパク質そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
【００７１】
本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ ：グリシン
Ａｌａ ：アラニン
Ｖａｌ ：バリン
Ｌｅｕ ：ロイシン
Ｉｌｅ ：イソロイシン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｔｈｒ ：スレオニン
Ｃｙｓ ：システイン
Ｍｅｔ ：メチオニン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ ：リジン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ｈｉｓ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ ：チロシン
Ｔｒｐ ：トリプトファン
Ｐｒｏ ：プロリン
Ａｓｎ ：アスパラギン
Ｇｌｎ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
Ｓｅｃ ：セレノシステイン（ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）
【００７２】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ ：メチル基
Ｅｔ ：エチル基
Ｂｕ ：ブチル基
Ｐｈ ：フェニル基
ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ ：ホルミル
Ｂｚｌ ：ベンジル
Ｃｌ２−Ｂｚｌ ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル
Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ ：ジニトロフェニル
Ｔｒｔ ：トリチル
Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ ：３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ ：１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド
ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
【００７３】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
実施例３で得られたマウス由来のｃＤＮＡの配列を示す。
〔配列番号：２〕
実施例２で用いられたＣｈＡＴプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
実施例２で用いられたＣｈＡＴプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
実施例２で用いられたＷｎｔ−１プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
実施例２で用いられたＷｎｔ−１プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
実施例２で用いられたＭａｓｈ−１プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
実施例２で用いられたＭａｓｈ−１プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
実施例２で用いられたＣｈＡＴプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
実施例２で用いられたＷｎｔ−１プローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
実施例２で用いられたＭａｓｈ−１プローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
実施例４で用いられた配列番号１から作製したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
実施例４で用いられた配列番号１から作製したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
実施例４で用いられた配列番号１から作製したプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
配列番号：１５で示されるタンパク質コード領域（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）の塩基配列から推定されるアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１５〕
配列番号：１で示されるマウス由来のｃＤＮＡの配列におけるタンパク質コード領域（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）の塩基配列（配列番号：１で示される配列中の１１１番目から２４７４番目に相当する塩基配列）を示す。
〔配列番号：１６〕
配列番号：１８で示されるタンパク質コード領域（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）の塩基配列から推定されるアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１７〕
実施例３で示されるヒト由来のｃＤＮＡの配列を示す。
〔配列番号：１８〕
配列番号：１７で示されるヒト由来のｃＤＮＡの配列におけるタンパク質コード領域（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）の塩基配列（配列番号：１７で示される配列中の１番目から２３６１番目に相当する塩基配列）を示す。
〔配列番号：１９〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
実施例６で得られたマウス由来のｃＤＮＡの配列を示す。
〔配列番号：２２〕
実施例６で得られたマウス由来のｃＤＮＡの配列を示す。
〔配列番号：２３〕
実施例２で用いられたＭＡＰ２プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２４〕
実施例２で用いられたＭＡＰ２プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕
実施例２で用いられたＭＡＰ２プローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：２６〕
配列番号：２７で示されるタンパク質コード領域（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）の塩基配列から推定されるアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２７〕
配列番号：２２で示されるマウス由来のｃＤＮＡの配列におけるタンパク質コード領域（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）の塩基配列を示す。
【００７４】
【発明の実施の形態】
以下において、実施例により本発明をより具体的にするが、この発明はこれらに限定されるものではない。
【００７５】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキュラークローニング（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， ２ｎｄ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ，１９８９年）に記載されている方法に従った。
【００７６】
実施例１
Ｐ１９細胞のコリン作動性ニューロンへの培養方法
ＡＴＣＣから購入した、Ｐ１９細胞を１ｘ１０５細胞／ｍｌの細胞密度で４日間０．５μＭのレチノイン酸処置下で浮遊培養（ＢＢＲＣ， ２８４， １０９８−１１０３ （２００１））することにより、コリン作動性ニューロンへ分化させた。コリン作動性ニューロンへの分化の確認は抗コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．； ＡＢ１４４Ｐ）を用いた免疫染色法にて行った。細胞を４％パラホルムアルデヒドにて固定し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ（−） （Ｒｏｃｈｅ； １−６６６−７８９）， ５％ ＢＳＡ （Ｓｉｇｍａ； Ａ−７０３０）， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ （ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．； ８０７４２３））にて室温、１時間ブロッキングを行った。その後１次抗体として抗ＣｈＡＴ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．； ＡＢ１４４Ｐ）を４℃、７２時間作用させ、さらに２次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ； Ａ−１１０５５）を室温、１時間反応させ、蛍光顕微鏡にて鏡検した。その結果、分化誘導９日目のＰ１９細胞は約８０％がコリン作動性ニューロンに分化していることが分かった。
【００７７】
実施例２
ジーンチップ解析のためのサンプル調整
実施例１で示されたＰ１９細胞を用いたコリン作動性ニューロンへの分化誘導系でコリン作動性ニューロンへの再生に関連した遺伝子を探索する目的でジーンチップ解析を行い候補遺伝子を選択した。ジーンチップ解析を行う培養日数を決定するためにコリン作動性ニューロンのマーカーであるＣｈＡＴの遺伝子発現及び神経細胞の分化段階で発現することが知られているＷｎｔ−１、Ｍａｓｈ−１の発現について調べた。方法はＰ１９細胞から抽出したＲＮＡ由来のｃＤＮＡを材料にＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、ＴａｑｍａｎＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡを鋳型として使用し、配列番号：２と配列番号：３（ＣｈＡＴ）、配列番号：４と配列番号：５（Ｗｎｔ−１）、配列番号：６と配列番号：７（Ｍａｓｈ−１）のプライマーを各０．４μＭ（最終濃度）、配列番号：８（ＣｈＡＴ）、配列番号：９（Ｗｎｔ−１）、配列番号：１０（Ｍａｓｈ−１）のプローブを各０．２μＭ（最終濃度）、２Ｘ Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １０μｌを加え、２０μｌの液量とした。ＰＣＲ反応は、５０℃・２分・９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分、のサイクルを４０回繰り返して行った。算出されたコピー数は内部コントロールとしてそれぞれのアミノ酸配列を含有するタンパク質遺伝子のコピー数と同様に算出したグリセロール３リン酸脱水酵素のコピー数で補正した。Ｗｎｔ−１、Ｍａｓｈ−１の発現解析の結果から、Ｐ１９細胞を用いた神経細胞への分化誘導系では分化誘導３日目から５日目にかけて神経前駆細胞から神経細胞へ分化していることが考えられた。また、ＣｈＡＴの発現は分化誘導６日目から認められた。このことから、ジーンチップ解析は培養０、３、５、６、８日目のＰ１９細胞由来のＲＮＡに対して行うことに決定した。それぞれの培養日数の時点でＰ１９細胞からＲＮＡを抽出した。
【００７８】
実施例３
ジーンチップ解析
実施例２にて調製したＲＮＡに対してジーンチップ解析を行った。方法はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｍａｎｕａｌに従い、各培養日から調整したＲＮＡからｃＲＮＡを合成し、ＭＧ−Ｕ７４Ａｖ２チップのＡ，Ｂ及びＣチップについてハイブリダイゼーションを行い、その後、洗浄と染色を繰り返して行った。データの解析にはソフトとしてジーンスプリングを用い、各遺伝子のシグナルをノーマライズしサンプル間の発現の比較を行った。実施例２で示した２遺伝子Ｗｎｔ−１、Ｍａｓｈ−１の発現を調べたところ、Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲと同様の発現パターンを示した。候補遺伝子絞り込みの方法としてコントロール、分化誘導３日目より分化誘導５日目で３倍以上発現が上昇している遺伝子で、かつ分化誘導５日目以降に発現が低下していない遺伝子を抽出した。その結果見いだされた１個の既知遺伝子、すなわち、ａｆｆｙ ＩＤ １１４４４３＿ａｔで表されるＥＳＴの塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＷ０４７０３６）を基に公のデータベースであるＧｅｎｂａｎｋデータベースを用いてＢｌａｓｔ検索を行ったところ、本遺伝子断片は配列番号：１（Ｇｅｎｂａｎｋ ｂｃ０２４６１７）で示されるマウス遺伝子であること（そのＯＲＦ（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）は配列番号：１５で示される塩基配列であること）が判明した。さらに、当該マウス遺伝子（ｂｃ０２４６１７）をＧＳＮ（ＧＳＰ）でＢｌａｓｔ検索した結果、該マウス遺伝子（ｂｃ０２４６１７）のヒトカウンターパートは、配列番号：１７（ＷＯ２００１−５７１９０に記載の遺伝子）であること（そのＯＲＦ（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）は配列番号：１８で示される塩基配列であること）が判明した。配列番号：１５および配列番号：１８でそれぞれ示されるタンパク質コード領域（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）の塩基配列から推定されるアミノ酸配列、すなわち、配列番号：１４および配列番号：１６で示されるアミノ酸配列は、９５％の相同性を有する。
【００７９】
実施例４
正常マウスにおける配列番号：１で示される遺伝子の組織分布の解析
正常マウスにおける組織分布を調べるため、ｍｏｕｓｅ ＭＴＣ ｐａｎｅｌ Ｉ（クロンテック社製）のｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号：１１、配列番号：１２のプライマーおよび配列番号：１３のプローブを用いて実施例２の方法でＰＣＲを行った。その結果、配列番号：１で示される遺伝子は脳で非常に高い発現が認められた。
【００８０】
実施例５
マウス神経幹細胞分化誘導系における配列番号：１で示される遺伝子の発現解析マウス神経幹細胞からコリン作動性ニューロンへの分化誘導系における発現について調べた。神経幹細胞はＴＰ１４−１５のＢａｌｂ／ｃマウスの胎仔を用い、ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ法（Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ， １９９７ Ａｐｒ； １４４（２）： ３５０−６０）により調製した。分化誘導は神経幹細胞をＥＣＬコート（ＵＰＳＴＡＴＥ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； ０８−１１０）上で１００ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦ（Ｇｅｎｚｙｍｅ ｔｅｃｈｎｅ； ２２５６）を含む培地（ＤＭＥＭ （Ｇｉｂｃｏ； １１９９５−０６５）， Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ （Ｇｉｂｃｏ； １７５０２−０４８） ）で培養（条件３７℃、５％ ＣＯ２ｉｎｃｕｂａｔｏｒ内）し、分化誘導０日から１日にかけて５μｇ／ｍｌ ＡｒａＣ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ−Ｂ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ； Ｓｉｇｍａ； Ｃ１７６８）処置することにより行った。コリン作動性神経への分化確認のため、分化誘導を行った神経幹細胞から調製したｃＤＮＡを鋳型に、配列番号：４、配列番号：５のプライマーと配列番号：８のプローブを用いて実施例２の方法でＰＣＲを行ったところ、ＣｈＡＴの発現上昇を確認した。配列番号：１１、配列番号：１２のプライマーおよび配列番号：１３のプローブを用いて上記と同様の方法でＰＣＲを行った。その結果、配列番号：１で示される遺伝子は分化誘導を行った神経幹細胞において発現上昇が認められた。
実施例６
配列番号：１で示される遺伝子のクローニング
マウス脳由来のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を鋳型とし、配列番号：１９および配列番号：２０のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡを鋳型として使用し、配列番号：１９、配列番号：２０のプライマーを各０．４ μＭ（最終濃度）、ｄＮＴＰ（ＴＡＫＡＲＡ）を０．２ ｍＭ、１０Ｘ Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ （ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ６００２５０） ２μｌ、 ＰｆｕＴｕｒｂｏ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ６００２５０） ２．５ Ｕを加え、２０μｌの液量とした。ＰＣＲ反応は、９５℃・２分の後、９５℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・３分のサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃・１０分の伸長反応を行った。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−ＨｉｓＴＯＰＯ ＴＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社Ｋ４８００−０１）のプロトコールに従いプラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−ＨｉｓＴＯＰＯ ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社Ｋ４８００−０１）へクローニングした。これを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社Ｋ４８００−０１）に導入し、ｃＤＮＡを持つクローンをアンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、配列番号：１と同一のＯＲＦを含む配列番号：２１とバリアントと想定される配列番号：１のＯＲＦより３塩基少ない（配列番号：１の４９８−５００ ｂｐ欠損）配列番号：２２のｃＤＮＡ配列を得た。（配列番号：２２のｃＤＮＡにおけるタンパク質コード領域（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）の塩基配列を配列番号：２７として、配列番号：２７で示されるタンパク質コード領域（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）の塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号：２６として示す。）
実施例７
Ｐ１９細胞における配列番号：１で示される遺伝子の機能解析
配列番号：１で示される遺伝子の機能を調べるため、Ｐ１９細胞に配列番号：２２で示される遺伝子の導入を行い、神経細胞マーカーであるＭＡＰ２（Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）およびコリン作動性神経マーカーＣｈＡＴ（ｃｈｏｌｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の発現について調べた。遺伝子導入はプロトコールに従いＦＵＧＥＮＥ （Ｒｏｃｈｅ ｃａｔ．１８１４４４３）で行った。発現ベクターには実施例６で構築した配列番号：２２で示される遺伝子（以下、１１４４４３遺伝子と称することがある）を発現するｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−ＨｉｓＴＯＰＯ ベクターを用いた。１０ｃｍ ｄｉｓｈに５．０×１０５ 個／ｄｉｓｈで播種したＰ１９細胞に、ＦＵＧＥＮＥ ３０μｌ、発現ベクター ５μｇを加え遺伝子導入を行った。遺伝子導入後６−８時間後より実施例１に示した分化誘導を２日間行い、その後ＡｒａＣ非存在下で３日間培養を行った。分化誘導後より経時的にＲＮＡを調製し、そのｃＤＮＡを鋳型とし配列番号：２３、配列番号：２４（ＭＡＰ２）、配列番号：２、配列番号：３（ＣｈＡＴ）のプライマー及び配列番号：２５（ＭＡＰ２）、配列番号：８（ＣｈＡＴ）のプローブを用いて実施例２の方法でＰＣＲを行った。その結果コントロールと比較し、１１４４４３遺伝子導入により分化誘導後３日で、ＣｈＡＴの発現は１．９倍、 ＭＡＰ２の発現は１．５倍増加した。このことから、１１４４４３遺伝子はＰ１９細胞においてコリン作動性神経への分化を促進していることが示唆された。
【００８１】
【発明の効果】
本発明で用いられるタンパク質は、神経系疾患の診断マーカーであり、したがって、該タンパク質の活性や遺伝子発現を促進する化合物またはその塩、は、例えば神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、脊髄損傷、てんかん、精神分裂病、うつ病など）などの予防・治療剤として使用することができる。また、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明で用いられるタンパク質の発現を促進することができ、例えば、神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、脊髄損傷、てんかん、精神分裂病、うつ病など）などの予防・治療剤として使用することができる。従って、本遺伝子の発現や遺伝子産物の機能を調節する薬剤を適切に用いることによって神経変性疾患の新たな治療法が開拓できると考えられる。
【００８２】
【配列表】

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【００８３】
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【００８４】
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【００８５】
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【００８６】
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【００８７】
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【００８８】
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【００８９】
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【００９０】
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【００９１】
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【００９２】
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【００９３】
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【００９４】
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【００９５】
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【００９６】
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【００９７】
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【００９８】
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【００９９】
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【０１００】
【図面の簡単な説明】
【図１】配列番号：１４で示されるアミノ酸配列を１文字表記で示したアミノ酸配列を示す。
【図２】配列番号：１５で示されるタンパク質コード領域（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）の塩基配列を示す。
【図３】配列番号：１５で示されるタンパク質コード領域（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）の塩基配列を示す。（〔図２のつづき〕）[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to uses of disease-related genes. More specifically, a prophylactic / therapeutic agent and a diagnostic agent for a neurodegenerative disease; a neurodegenerative disease-related gene (including the corresponding DNA); a disease-related gene product (including a protein and a partial peptide thereof); A method for screening a drug using transformed cells and the like.
[0002]
[Prior art]
Normally, central nerve cells do not regenerate when damaged. However, many peripheral sensory nerves can be regenerated on a daily basis. This is because undifferentiated cells that can divide and proliferate exist in the sensory organs. It has long been thought that such cells do not exist in neural tissue in the brain. However, recently, it has been found that neural stem cells that divide and proliferate exist in some places even in the brain of mature individuals, and attempts have been made to regenerate the central nervous system using these stem cells. Currently, the main idea is to transplant neural stem cells or differentiated neural cells into the striatum for Parkinson's disease. This indicates that transplantation of aborted fetal brain in clinical trials shows the efficacy of transplantation medicine, and that neural stem cells tend to differentiate in vitro into dopaminergic neurons that degenerate in Parkinson's disease Because. However, since there is no established method for isolating nerves other than dopaminergic neurons, almost no regenerative treatment has been attempted for other neurodegenerative diseases. At this stage, it is thought that elucidation of the mechanism of differentiation into each nerve cell will enable regeneration of nerve cells in neurodegenerative diseases.
In Alzheimer's disease, the earliest degeneration occurs in cholinergic neurons in the septum and hippocampus. Cholinergic neurons are implicated in impaired behaviors such as memory and learning in Alzheimer's disease. Most of the current treatments are symptomatic treatments that enhance acetylcholine-mediated neurotransmission pathways, and new medical treatments including regenerative medicine are required. However, unlike dopaminergic neurons, a method of separating cholinergic neurons from fetal brain and neural stem cells has not been established, and the mechanism of differentiation is poorly understood. Therefore, application to regenerative medicine is delayed. Therefore, if the mechanism of differentiation of cholinergic neurons can be elucidated, regenerative medicine for Alzheimer's disease will be possible by promoting the differentiation of transplantable and endogenous neural stem cells.
[0003]
[Non-patent document 1]
Genbank accession No. bc024617
[Patent Document 1]
WO 2001-57190
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention is aimed at developing a therapeutic agent for a neurodegenerative disease such as Alzheimer's disease from the viewpoint of differentiating undifferentiated neurons into cholinergic neurons. A screening method for a compound that increases the expression when an undifferentiated neuron differentiates into a cholinergic neuron at the time of onset and the like, and regulates the activity of a protein that is a gene product thereof, a compound obtained by the screening method And so on.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above problems, and as a result, have found a gene whose expression is increased in a nerve cell differentiation induction system using P19 cells which are mouse EC (embryonal carcinoma) cells, As a result of further studies based on this finding, the present invention has been completed. That is, mRNA whose expression increased when P19 cells were differentiated into cholinergic neurons was found from gene chip analysis. This mRNA is a known mouse gene (Mus musculus, clone MGC: 28513 IMAGE: 4190480, mRNA, complete cds gi | 193353180 | gb | BC02467.11 | [193353180]) that is a known mouse gene registered in NCBI (Gene Bank) from its base sequence. Turned out to be. The cDNA corresponding to the mRNA has the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. As a result of detailed examination of the expression profile of the mRNA, this mRNA was differentiated into cholinergic neurons using mouse neural stem cells. It was revealed that the expression increased in the induction system from day 1 to day 4 of culture. As a result of further study based on these findings, the present invention has been completed.
[0006]
That is, the present invention
(1) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or a partial peptide thereof or a salt thereof (preferably, consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 A protein or a salt thereof; a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 or a salt thereof; a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 or a salt thereof; and the like; Activity; more preferably, a prophylactic / therapeutic agent for a neurodegenerative disease comprising a compound or a salt thereof that regulates (preferably promotes) differentiation activity to cholinergic neurons (preferably, a neuronal cell differentiation promoting agent; More preferably, an agent for promoting differentiation into cholinergic neurons);
(2) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or a partial peptide thereof or a salt thereof (preferably, consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 A protein or a salt thereof; a protein or a salt thereof comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16; a protein or a salt thereof comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26; A prophylactic / therapeutic agent for a neurodegenerative disease comprising a compound or a salt thereof, preferably a nerve cell differentiation promoting agent; more preferably a differentiation promoting agent for cholinergic neurons);
(3) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or a partial peptide thereof (preferably, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16; a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26; etc.) or a nucleotide sequence complementary or substantially complementary to the nucleotide sequence of the polynucleotide encoding An antisense polynucleotide containing a portion thereof;
(4) a medicine comprising the antisense polynucleotide according to (3);
(5) the medicament according to the above (4), which is a nerve cell differentiation inhibitor (preferably, a differentiation inhibitor to cholinergic neurons);
(6) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (preferably, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 or a salt thereof; or a partial peptide thereof or an antibody thereof;
(7) a medicine comprising the antibody of (6) above;
(8) the medicament according to the above (7), which is a nerve cell differentiation inhibitor (preferably, a differentiation inhibitor to cholinergic neurons);
(9) a diagnostic agent comprising the antibody of (6) above;
(10) The diagnostic agent according to (9), which is a diagnostic agent for a neurodegenerative disease;
(11) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (preferably, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26; or a diagnostic agent for a neurodegenerative disease comprising a polynucleotide encoding a partial peptide thereof;
(12) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (preferably, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 or a salt thereof; or a partial peptide thereof or a salt thereof; A method for screening a compound or a salt thereof that regulates (preferably enhances) the activity of the salt;
(13) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (preferably, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 or a salt thereof; or a partial peptide thereof or a salt thereof; A method for screening for a compound or a salt thereof that regulates (preferably promotes) the expression of a salt gene;
(14) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (preferably, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 or a salt thereof; or a partial peptide thereof or a salt thereof. Or a screening kit for a compound or a salt thereof that regulates (preferably enhances) the activity of the salt thereof;
(15) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (preferably, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 or a salt thereof; or a partial peptide thereof or a salt thereof. Or a kit for screening a compound or a salt thereof that regulates (preferably promotes) the expression of a gene of the salt thereof;
(16) a compound or a salt thereof obtainable by using the screening method according to (12) or (13) or the screening kit according to (14) or (15);
(17) a medicament comprising the compound according to (16) or a salt thereof;
(18) The medicament according to the above (17), which is a prophylactic / therapeutic agent for a neurodegenerative disease (preferably, a neuronal cell differentiation promoting agent; more preferably, an agent for promoting differentiation into cholinergic neurons);
(19) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (preferably, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26; or a polynucleotide encoding the partial peptide thereof, or the partial peptide or the partial peptide thereof. A method for screening a compound or a salt thereof that regulates (preferably enhances) the activity of a salt;
(20) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (preferably, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26; or a polynucleotide encoding the partial peptide thereof, or the partial peptide or the partial peptide thereof. A method for screening a compound or a salt thereof that regulates (preferably promotes) the expression of a salt gene;
(21) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (preferably, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26; or a polynucleotide encoding the partial peptide thereof, or the partial peptide or the partial peptide thereof. A kit for screening a compound that modulates (preferably enhances) the activity of a salt or a salt thereof;
(22) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (preferably, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26; or a polynucleotide encoding the partial peptide thereof, or the partial peptide or the partial peptide thereof. A kit for screening a compound or a salt thereof that regulates (preferably promotes) the expression of a salt gene;
(23) a compound or a salt thereof obtainable by using the screening method according to (19) or (20) or the screening kit according to (21) or (22);
(24) a medicament comprising the compound according to (23) or a salt thereof;
(25) the medicament according to the above (24), which is a prophylactic / therapeutic agent for a neurodegenerative disease (preferably, a neuronal cell differentiation promoting agent; more preferably, an agent for promoting differentiation into cholinergic neurons);
(26) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (preferably, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 or a salt thereof; or a partial peptide thereof or a salt thereof, thereby preventing a neurodegenerative disease. ·Method of treatment;
(27) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (preferably, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 or a salt thereof; or a partial peptide thereof; Method of treatment;
(28) an effective amount of a compound or a salt thereof that promotes the activity of a protein or a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 in a mammal; A method for preventing or treating a neurodegenerative disease characterized by administering;
(29) An effective amount of a compound or a salt thereof that promotes the expression of a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or a partial peptide thereof or a gene thereof, A method for preventing or treating a neurodegenerative disease, which comprises administering to an animal;
(30) Activity of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or a partial peptide thereof or a salt thereof for the production of a prophylactic / therapeutic agent for a neurodegenerative disease Use of a promoting compound or a salt thereof;
(31) a protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 for producing a prophylactic / therapeutic agent for a neurodegenerative disease, or a gene of a salt thereof Use of a compound or a salt thereof that promotes expression;
(32) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 or a salt thereof;
(33) a partial peptide of the protein according to (32) or a salt thereof;
(34) a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding the protein of (32) or the partial peptide of (33);
(35) the polynucleotide according to (34), which is DNA;
(36) a polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 26;
(37) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or a partial peptide thereof or a salt thereof (preferably, consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14) Protein or a salt thereof; a protein or a salt thereof comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16; a protein or a salt thereof comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26; etc.). A prophylactic / therapeutic agent (preferably, an agent for promoting neuronal differentiation; more preferably, an agent for promoting differentiation into cholinergic neurons);
(38) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or a partial peptide thereof (preferably, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; (A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26; a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26; etc.); , A nerve cell differentiation promoter; more preferably, a cholinergic neuron differentiation promoter);
And so on.
[0007]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 used in the present invention (hereinafter, sometimes referred to as the protein of the present invention or the protein used in the present invention) is Cells of humans and warm-blooded animals (eg, guinea pig, rat, mouse, chicken, rabbit, pig, sheep, cow, monkey, etc.) (eg, hepatocytes, spleen cells, nerve cells, glial cells, pancreatic β cells, bone marrow) Cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, Natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, osteocytes, osteoblasts, osteoclasts , Mammary gland cells, hepatocytes or stromal cells, or precursors of these cells, stem cells or cancer cells) or any tissue in which those cells are present, for example, the brain, various parts of the brain (eg, olfactory bulb, amygdala, Basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum), spinal cord, pituitary, stomach, pancreas, kidney, liver, gonad, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract (Eg, large intestine, small intestine), blood vessels, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, prostate, testes, ovaries, placenta, uterus, bones, joints, proteins derived from skeletal muscle, etc. It may be a synthetic protein.
The amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 is about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14. And more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology. The "homology of amino acid sequences" mentioned here can be calculated using, for example, a homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool).
Examples of the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 include, for example, a protein having the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 described above. A protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (eg, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; represented by SEQ ID NO: 16) A protein comprising an amino acid sequence; a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26; and the like).
[0008]
Examples of the substantially equivalent activity include an activity of differentiating undifferentiated neurons into cholinergic neurons (hereinafter sometimes referred to as a neuronal differentiation activity). Substantially homogenous indicates that the properties are homogenous (eg, physiologically or pharmacologically). Therefore, it is preferable that the nerve cell differentiation activity and the like are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times). Quantitative factors, such as the degree of molecular weight and protein molecular weight, may be different.
The nerve cell differentiation activity can be measured by, for example, a nerve cell differentiation induction system using P19 cells, which are mouse EC (embryonal carcinoma) cells.
Specifically, the method may be performed according to a method described in an example described later.
[0009]
Examples of the protein used in the present invention include, for example, (i) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (eg, about 1 to 100, preferably about 1 to 30, Is an amino acid sequence in which about 1 to 10, more preferably a number (1 to 5) amino acids have been deleted, and (ii) one or more (for example, 1 to 2) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 An amino acid sequence to which about 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably a number (1 to 5) amino acids have been added; (iii) represented by SEQ ID NO: 14 An amino acid having one or more amino acids (eg, about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to 5) in the amino acid sequence Sequence, (iv) 1 or 2 or more (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to 10) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14. So-called muteins such as a protein containing an amino acid sequence in which (1 to 5) amino acids are substituted with another amino acid, or (v) an amino acid sequence obtained by combining the amino acid sequences are also included.
When the amino acid sequence is inserted, deleted or substituted as described above, the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
[0010]
In the protein in this specification, the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (carboxyl terminus) in accordance with the convention of peptide labeling. The protein used in the present invention, including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 16, has a carboxyl group (-COOH) and a carboxylate (- COO − ), Amide (-CONH 2 )) Or an ester (—COOR).
Here, as R in the ester, for example, C, such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, etc. 1-6 Alkyl groups such as C, cyclopentyl, cyclohexyl, etc. 3-8 Cycloalkyl groups such as phenyl, α-naphthyl and the like; 6-12 Aryl groups, for example phenyl-C such as benzyl, phenethyl, etc. 1-2 An alkyl group or α-naphthyl-C such as α-naphthylmethyl 1-2 C such as an alkyl group 7-14 An aralkyl group, a pivaloyloxymethyl group and the like are used.
When the protein used in the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, a protein in which the carboxyl group is amidated or esterified is also included in the protein used in the present invention. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
Furthermore, in the protein used in the present invention, the amino group of the N-terminal amino acid residue (eg, a methionine residue) has a protecting group (for example, a formyl group, an acetyl group or the like). 1-6 C such as alkanoyl 1-6 Acyl group), N-terminal glutamine residue generated by cleavage in vivo, pyroglutamine oxidation, substituent on the side chain of amino acid in the molecule (eg, -OH, -SH , An amino group, an imidazole group, an indole group, a guanidino group, etc.) are suitable protecting groups (for example, formyl group, acetyl group, etc.). 1-6 C such as alkanoyl group 1-6 (Eg, an acyl group), or a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound.
Specific examples of the protein used in the present invention include, for example, a mouse-derived protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; a mouse-derived protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26; A human-derived protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16; and the like.
[0011]
The partial peptide of the protein of the present invention is the partial peptide of the protein of the present invention described above, and preferably any peptide having the same properties as the above-described protein of the present invention.
Peptides having an amino acid sequence of at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 70 or more, more preferably 100 or more, and most preferably 200 or more of the amino acid sequences constituting the protein of the present invention. Used.
In the partial peptide used in the present invention, one or more (preferably about 1 to 10, more preferably a number (1 to 5)) amino acids in the amino acid sequence are deleted, or One or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and still more preferably, about 1 to 5) amino acids are added to the amino acid sequence, or the amino acid One or two or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and still more preferably, about 1 to 5) amino acids are inserted into the sequence, or in the amino acid sequence, One or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, even more preferably about 1 to 5) amino acids may be substituted with another amino acid.
[0012]
In the partial peptide used in the present invention, the C-terminus has a carboxyl group (—COOH) and a carboxylate (—COO). − ), Amide (-CONH 2 )) Or an ester (—COOR).
Further, similar to the protein used in the present invention, the partial peptide used in the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) in addition to the C-terminal, and the N-terminal amino acid residue (eg, , A methionine residue) in which the amino group is protected by a protecting group, a glutamine residue produced by cleavage of the N-terminal side in vivo and pyroglutamine oxidation, and a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule. Also included are those protected with an appropriate protecting group, and complex peptides such as so-called glycopeptides to which sugar chains are bonded.
The partial peptide used in the present invention can also be used as an antigen for preparing an antibody.
[0013]
As the salt of the protein or partial peptide used in the present invention, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid, an organic acid) or a base (eg, an alkali metal salt) is used. Are preferred. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used.
The protein or its partial peptide or its salt used in the present invention can be produced from the aforementioned human or warm-blooded animal cells or tissues by a known protein purification method, or contains a DNA encoding the protein. It can also be produced by culturing a transformant. Further, it can be produced according to the peptide synthesis method described later.
When producing from human or mammalian tissues or cells, after homogenizing human or mammalian tissues or cells, extraction is performed with an acid or the like, and the extract is subjected to chromatography such as reverse phase chromatography or ion exchange chromatography. Can be purified and isolated.
[0014]
For the synthesis of the protein or partial peptide or a salt thereof, or an amide thereof used in the present invention, a commercially available resin for protein synthesis can be generally used. Examples of such a resin include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, and 4-hydroxymethylmethyl. Phenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin, and the like. it can. Using such a resin, an amino acid having an α-amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods. At the end of the reaction, the protein or partial peptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.In addition, an intramolecular disulfide bond formation reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target protein or partial peptide or an amide thereof. I do.
For the condensation of the above protected amino acids, various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable. As the carbodiimides, DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide and the like are used. For activation by these, the protected amino acid was directly added to the resin together with a racemization inhibitor additive (for example, HOBt, HOOBt), or the protected amino acid was previously activated as a symmetric acid anhydride or HOBt ester or HOOBt ester. It can be added later to the resin.
[0015]
The solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction. For example, acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol, and dimethyl sulfoxide. Sulfoxides, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, and appropriate mixtures thereof are used. The reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about -20 ° C to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess. As a result of the test using the ninhydrin reaction, when the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When sufficient condensation cannot be obtained even by repeating the reaction, unreacted amino acids can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole to prevent the subsequent reaction from being affected.
[0016]
Examples of the protecting group for the amino group of the raw material include, for example, Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl , Phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like.
The carboxyl group may be, for example, a linear, branched or cyclic alkyl ester such as an alkyl esterified ester (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl). ), Aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarbonylhydrazide, t-butoxy It can be protected by carbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
The hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification. Suitable groups for this esterification include, for example, lower (C 1-6 A) Groups derived from carbonic acid such as an aroyl group such as an alkanoyl group and a benzoyl group, and a benzyloxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group. Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
Examples of the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bzl, Cl 2 -Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, t-butyl and the like are used.
As the imidazole protecting group for histidine, for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
[0017]
Examples of the activated carboxyl group of the raw material include, for example, a corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol, Cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and an ester with HOBt). As the activated amino group of the raw material, for example, a corresponding phosphoric amide is used.
As a method for removing (eliminating) the protecting group, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, trifluoromethane, etc. Acid treatment with dichloromethane, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, and the like are also used. The elimination reaction by the above acid treatment is generally performed at a temperature of about -20 ° C to 40 ° C. In the acid treatment, for example, anisole, phenol, thioanisole, metacresol, paracresol, dimethylsulfide, 1,4 -Addition of a cation scavenger such as butanedithiol, 1,2-ethanedithiol and the like is effective. Further, the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group of tryptophan is the above 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane. In addition to deprotection by acid treatment in the presence of dithiol or the like, it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia or the like.
[0018]
The protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw materials, the protective group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
As another method for obtaining an amide form of a protein or a partial peptide, for example, after amidating and protecting the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid, a peptide (protein) chain is added to the amino group side to a desired chain length. After the elongation, a protein or partial peptide from which only the protecting group for the N-terminal α-amino group of the peptide chain has been removed and a protein or partial peptide from which only the protecting group for the C-terminal carboxyl group has been removed, and these are produced. The protein or peptide is condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein or peptide obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method to obtain a desired crude protein or peptide. This crude protein or peptide is purified by various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired protein or peptide.
In order to obtain an ester of a protein or peptide, for example, after condensing the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, the desired protein or An ester of the peptide can be obtained.
[0019]
The partial peptide or a salt thereof used in the present invention can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the protein used in the present invention with an appropriate peptidase. As a method for synthesizing a peptide, for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the partial peptide or amino acid that can constitute the partial peptide used in the present invention is condensed with the remaining portion, and when the product has a protecting group, the protecting group is eliminated to produce the target peptide. it can. Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following (i) to (v).
(I) M.I. Bodanszky and M.A. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966) (ii) Schroeder and Luebke, The Peptide (The Peptide, Academic Year, 65 years).
(Iii) Nobuo Izumiya et al., Basics and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975)
(Iv) Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara, Laboratory of Biochemistry 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977)
(V) Supervised by Haruaki Yajima, Development of Continuing Drugs, Volume 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten
After the reaction, the partial peptide used in the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization. When the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when the partial peptide obtained by a salt is a known method or analogous method It can be converted into a free form or another salt by a method.
[0020]
The polynucleotide encoding the protein used in the present invention may be any polynucleotide as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the protein used in the present invention. Preferably it is DNA. The DNA may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cells / tissues, cDNA library derived from the aforementioned cells / tissues, and synthetic DNA.
The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, amplification can be carried out directly by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the above-described cells / tissues.
As the DNA encoding the protein used in the present invention, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 18, or SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 27 Or an amino acid sequence containing a nucleotide sequence hybridizable with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18 under high stringency conditions, and represented by the aforementioned SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 16 Any DNA may be used as long as it encodes a protein having substantially the same properties as a protein containing.
[0021]
Examples of the DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 18 under high stringency conditions include, for example, SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: And about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more. DNA containing a base sequence having the above homology is used.
Hybridization can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, a method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). . When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be carried out under high stringent conditions.
The high stringent conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable.
More specifically, as the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 or the like is used. Further, as the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 18 or the like is used. In addition, as the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 27, or the like is used.
[0022]
The polynucleotide (eg, DNA) encoding the partial peptide used in the present invention may be any polynucleotide containing the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide used in the present invention. In addition, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the aforementioned cells / tissues, cDNA library derived from the aforementioned cells / tissues, and synthetic DNA may be used.
As the DNA encoding the partial peptide used in the present invention, for example, a DNA having a part of the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 18, or SEQ ID NO: It encodes a protein comprising a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 18, and having substantially the same activity as the protein of the present invention. DNA containing a part of the DNA to be used is used.
DNAs capable of hybridizing with the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 18 have the same significance as described above.
The same hybridization method and high stringency conditions as described above are used.
[0023]
Means for cloning a DNA that completely encodes the protein or partial peptide used in the present invention (hereinafter, in the description of the cloning and expression of the DNA encoding the same, these may be simply abbreviated as the protein of the present invention) Amplification by a PCR method using a synthetic DNA primer having a part of the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention, or encoding a DNA incorporated into an appropriate vector into a part or the entire region of the protein of the present invention. And a DNA fragment labeled with a DNA fragment or a synthetic DNA. Hybridization can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
Conversion of the base sequence of DNA is performed by PCR, a known kit, for example, Mutan. TM -Super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM Using -K (Takara Shuzo Co., Ltd.) or the like, it can be carried out according to a method known per se such as the ODA-LA PCR method, the Gapped Duplex method, the Kunkel method, or a method similar thereto.
The DNA encoding the cloned protein can be used as it is depending on the purpose, or can be used after digesting with a restriction enzyme or adding a linker, if desired. The DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
The expression vector for the protein of the present invention is, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the protein of the present invention, and (b) ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. It can be manufactured by the following.
[0024]
Examples of the vector include Escherichia coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), λ phage, and the like. In addition to animal viruses such as bacteriophage, adenovirus, retrovirus, vaccinia virus, and baculovirus, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo, and the like are used.
The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression. For example, when an animal cell is used as a host, SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
Of these, it is preferable to use a CMV (cytomegalovirus) promoter, SRα promoter, or the like. When the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, λP L Promoter, lpp promoter, T7 promoter, etc., when the host is Bacillus, SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter, etc., and when the host is yeast, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc. Is preferred. When the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
[0025]
In addition to the above, an expression vector containing an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), and the like may be used, if desired. it can. Examples of the selectable marker include a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance] and an ampicillin resistance gene (hereinafter Amp). r Neomycin resistance gene (hereinafter Neo). r G418 resistance). In particular, when the dhfr gene is used as a selection marker using dhfr gene-deficient Chinese hamster cells, the target gene can also be selected using a thymidine-free medium.
If necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein of the present invention. When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, a PhoA signal sequence, an OmpA signal sequence, or the like is used. When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, an α-amylase signal sequence, a subtilisin signal sequence, or the like is used. In some cases, MFα signal sequence, SUC2 signal sequence, etc., and when the host is an animal cell, insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. can be used.
A transformant can be produced using the vector containing the DNA encoding the protein of the present invention thus constructed.
[0026]
As the host, for example, Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
Specific examples of the genus Escherichia include, for example, Escherichia coli K12.DH1 [Procedures of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular biology (Journal of Molecular biology)]. Biology), 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetic Genetics, Vol. 39, 440 (1954)].
Examples of Bacillus spp. Include, for example, Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)]. )] Is used.
Examples of yeast include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R − , NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia pastoris KM71 and the like.
[0027]
When the virus is AcNPV, for example, when the virus is AcNPV, a cell line derived from a larva of night roth moth (Spodoptera frugiperda cell; Sf cell), MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, and Hig derived from Trichoplusia ni egg. TM Cells, cells derived from Mamestra brassicae, cells derived from Estigmena acrea, and the like are used. When the virus is BmNPV, a silkworm-derived cell line (Bombyx mori N cell; BmN cell) or the like is used. As the Sf cells, for example, Sf9 cells (ATCC CRL 1711), Sf21 cells (Vaughn, JL, et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like are used. .
As insects, for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
Examples of animal cells include monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO cells), and dhfr gene-deficient Chinese hamster cells CHO (hereinafter CHO (dhfr). − ) Cells), mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, mouse ATDC5 cells, rat GH3, human FL cells, and the like. Furthermore, human cancer cell-derived cell lines (DLD-1 cells, HCT-15 cells, SW-480 cells, LoVo cells, HCT-116 cells, WiDr cells, HT-29 cells, LS-174T cells, SNU-C1 cells, SNU-C4 cells, SNU-C2A cells, CX-1 cells, GI-112 cells, HL-60 cells, Raji cells, G361 cells, S3 cells) and the like are also used.
In order to transform Escherichia sp., For example, Procesings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 69, 2110 ( 1972) and Gene, Vol. 17, 107 (1982).
[0028]
Transformation of Bacillus spp. Can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, Vol. 168, 111 (1979).
To transform yeast, for example, Methods in Enzymology, Vol. 194, 182-187 (1991), Processings of the National Academy of Sciences of Science -The USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), vol. 75, 1929 (1978).
Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
To transform animal cells, for example, see Cell Engineering Separate Volume 8, New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha) and Virology, Vol. 52, 456 (1973). Thus, a transformant transformed with the expression vector containing the DNA encoding the protein can be obtained.
When culturing a transformant whose host is a genus Escherichia or Bacillus, a liquid medium is suitable as a medium used for the culturing, and among them, a carbon source necessary for growth of the transformant, Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are contained. As a carbon source, for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc., as a nitrogen source, for example, ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract and the like Examples of the inorganic or organic substance and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride. In addition, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5 to 8.
[0029]
Examples of a medium for culturing Escherichia include, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics]. , 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]. If necessary, an agent such as 3β-indolylacrylic acid can be added in order to make the promoter work efficiently. When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added.
When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
When culturing a transformant in which the host is yeast, for example, Burkholder's minimum medium [Bostian, K. et al. L. Procurings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 77, 4505 (1980)] and 0.5% casamino acid. SD medium containing [Bitter, G .; A. Processing of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 81, 5330 (1984)]. Preferably, the pH of the medium is adjusted to about 5-8. The cultivation is usually performed at about 20 ° C. to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and if necessary, aeration or stirring is added.
When culturing an insect cell or a transformant whose host is an insect, the culture medium is immobilized on Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)). For example, those to which an additive such as 10% bovine serum or the like is appropriately added are used. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. The cultivation is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and if necessary, aeration and / or agitation are added.
When culturing a transformant in which the host is an animal cell, examples of the medium include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], a DMEM medium. [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], 199 medium. [Proceding of the Society for the Biological Medicine, Vol. 73, 1 (1950) [Proceding of the Society for the Biological Medicine] ], Such as is used. Preferably, the pH is between about 6 and 8. The cultivation is usually carried out at about 30 ° C. to 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and if necessary, aeration or stirring is added.
As described above, the protein of the present invention can be produced in the cells, in the cell membrane, or outside the cells of the transformant.
[0030]
The protein of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
When extracting the protein of the present invention from cultured cells or cells, the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and subjected to sonication, lysozyme and / or freeze-thawing. After the cells or cells are destroyed by the method, a method of obtaining a crude extract of the protein by centrifugation or filtration is used as appropriate. In a buffer, a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or Triton X-100 is used. TM And the like. When the protein is secreted into the culture solution, after completion of the culture, the supernatant is separated from the cells or cells by a method known per se, and the supernatant is collected.
Purification of the protein contained in the culture supernatant or extract thus obtained can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods. These known separation and purification methods include methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight. Method using difference in charge, method using charge difference such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, and use of difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography A method utilizing a difference between isoelectric points, such as an isoelectric focusing method, is used.
[0031]
When the protein thus obtained is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when the protein obtained is a salt, a method known per se or analogous thereto Can be converted to a free form or another salt.
The protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein modifying enzyme before or after purification. As the protein modifying enzyme, for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
The presence of the protein of the present invention thus produced can be measured by an enzyme immunoassay using a specific antibody, Western blotting, or the like.
[0032]
The antibody against the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention.
An antibody against a protein or a partial peptide or a salt thereof (hereinafter, these may be simply referred to as the protein of the present invention) used in the present invention uses the protein of the present invention as an antigen and is known per se. Can be produced according to the method for producing an antibody or antiserum described in (1).
[Preparation of monoclonal antibody]
(A) Preparation of monoclonal antibody-producing cells
The protein of the present invention is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier and a diluent at a site capable of producing an antibody upon administration. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. The administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of the warm-blooded animal used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
When producing monoclonal antibody-producing cells, a warm-blooded animal immunized with an antigen, for example, an individual having an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization and contained therein. By fusing the antibody-producing cells thus obtained with myeloma cells of the same or different species, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared. The antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of a labeling agent bound to the antibody. The fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Koehler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)]. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
[0033]
Examples of myeloma cells include myeloma cells of warm-blooded animals such as NS-1, P3U1, SP2 / 0, and AP-1, but P3U1 is preferably used. The preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is added at a concentration of about 10 to 80%. By incubating at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes, cell fusion can be carried out efficiently. Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) on which a protein antigen is directly or adsorbed together with a carrier, and then radioactive substances or A method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding an anti-immunoglobulin antibody labeled with an enzyme or the like (an anti-mouse immunoglobulin antibody is used when cells used for cell fusion are mice) or protein A; A method in which a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase to which globulin antibodies or protein A is adsorbed, a protein labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like is added, and a monoclonal antibody bound to the solid phase is detected.
Selection of the monoclonal antibody can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added. As a selection and breeding medium, any medium can be used as long as the hybridoma can grow. For example, RPMI 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal calf serum, GIT medium containing 1-10% fetal calf serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or serum-free for hybridoma culture A culture medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) or the like can be used. The culturing temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. The culturing time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. The culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
[0034]
(B) Purification of monoclonal antibody
The monoclonal antibody can be separated and purified by a method known per se, for example, an immunoglobulin separation and purification method [eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)] Adsorption-desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification method of collecting antibody only with an active adsorbent such as protein A or protein G and dissociating the bond to obtain the antibody] Can be.
(Preparation of polyclonal antibody)
The polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, a immunizing antigen (protein antigen) itself or a complex thereof with a carrier protein is formed, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody. It can be produced by collecting a substance and separating and purifying the antibody.
Regarding the complex of an immunizing antigen and a carrier protein used to immunize a warm-blooded animal, the type of the carrier protein and the mixing ratio of the carrier and the hapten are such that the antibody is efficiently cross-linked to the hapten immunized by crosslinking the carrier. If possible, any material may be cross-linked at any ratio. For example, bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, hemocyanin, etc. are used in a weight ratio of about 0.1 to 20, preferably about 1 to 20, relative to hapten 1. A method of coupling at a rate of ~ 5 is used.
Various coupling agents can be used for coupling the hapten and the carrier. For example, glutaraldehyde, carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
The condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. Administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total.
The polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, or the like, preferably from the blood of a warm-blooded animal immunized by the above method.
The measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above. The separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-mentioned separation and purification of the monoclonal antibody.
[0035]
The nucleotide sequence of a polynucleotide encoding a protein or a partial peptide used in the present invention (eg, DNA (hereinafter, these DNAs may be abbreviated as the DNA of the present invention in the description of antisense polynucleotide)) As an antisense polynucleotide having a complementary or substantially complementary base sequence or a part thereof, a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of the DNA of the present invention or a part thereof is used. Any antisense polynucleotide may be used as long as it has a portion and has an action of suppressing the expression of the DNA, but antisense DNA is preferable.
The nucleotide sequence substantially complementary to the DNA of the present invention is, for example, about 70% of the total nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention). % Or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more. In particular, in the case of an antisense polynucleotide directed to translation inhibition in the entire base sequence of the complementary strand of the DNA of the present invention, the base sequence of the portion encoding the N-terminal site of the protein of the present invention (for example, An antisense polynucleotide having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more with a complementary strand of a base sequence near a codon, etc.) B) In the case of an antisense polynucleotide which directs RNA degradation by RNase H, it is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% with the complementary strand of the entire base sequence of the DNA of the present invention including introns. As described above, most preferably, antisense polynucleotides each having about 95% or more homology are suitable.
Specifically, a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 18, or a part thereof is An antisense polynucleotide having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 18, or a part thereof Nucleotides (more preferably, an antisense polynucleotide having a part of a base sequence complementary to the base sequence of DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 18); .
The antisense polynucleotide is usually composed of about 10 to 40, preferably about 15 to 30 bases.
In order to prevent degradation by a hydrolase such as nuclease, a phosphate residue (phosphate) of each nucleotide constituting the antisense DNA may be, for example, a chemically modified phosphate residue such as phosphorothioate, methylphosphonate, or phosphorodithionate. It may be substituted. In addition, the sugar (deoxyribose) of each nucleotide may be substituted with a chemically modified sugar structure such as 2′-O-methylation, and the base portion (pyrimidine, purine) may also be chemically modified. Or any one that hybridizes to the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 27, or SEQ ID NO: 18. These antisense polynucleotides can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
[0036]
According to the present invention, an antisense polynucleotide capable of inhibiting the replication or expression of the protein gene of the present invention is designed based on the nucleotide sequence information of a cloned or determined DNA encoding a protein, Can be synthesized. Such a polynucleotide (nucleic acid) can hybridize with the RNA of the protein gene of the present invention and inhibit the synthesis or function of the RNA, or through the interaction with the protein-related RNA of the present invention. Thus, the expression of the protein gene of the present invention can be regulated and controlled. Polynucleotides that are complementary to a selected sequence of the protein-associated RNA of the present invention, and that can specifically hybridize with the protein-associated RNA of the present invention, can be used in vivo and in vitro to produce the protein gene of the present invention. It is useful for regulating and controlling the expression of, and also useful for treating or diagnosing diseases and the like. The term "corresponding" means having homology or being complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes. "Corresponding" between a nucleotide, base sequence or nucleic acid and a peptide (protein) usually refers to the amino acid of the peptide (protein) as directed by the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement. . 5 'end hairpin loop of protein gene, 5' end 6-base pair repeat, 5 'end untranslated region, polypeptide translation initiation codon, protein coding region, ORF translation termination codon, 3' end untranslated region, 3 ' The terminal palindrome region and the 3'-end hairpin loop may be selected as preferred regions of interest, but any region within the protein gene may be selected as a target.
The relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide that is complementary to at least a part of the target region and can hybridize can be said to be “antisense” with the target. Antisense polynucleotides include polydeoxyribonucleotides containing 2-deoxy-D-ribose, polyribonucleotides containing D-ribose, and other types of polynuclei that are N-glycosides of purine or pyrimidine bases. Other polymers with nucleotides or non-nucleotide backbones (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special bonds, provided that the polymers are found in DNA or RNA Base pairs and nucleotides having a configuration that allows base attachment). They can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and also DNA: RNA hybrids, and can be unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides), or even known. Such as labeled, capped, methylated, one or more naturally-occurring nucleotides replaced by analogs, intramolecular nucleotides Modified, such as those having uncharged bonds (eg, methylphosphonates, phosphotriesters, phosphoramidates, carbamates, etc.), charged or sulfur-containing bonds (eg, phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.) ), Such as proteins (nucleases, nuclease inhibitors, toxic , Antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.), sugars (eg, monosaccharides), etc., having side chain groups, interacting compounds (eg, acridine, psoralen, etc.), chelates Those containing compounds (eg, metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc.), those containing alkylating agents, those having modified bonds (eg, α-anomeric nucleic acids, etc.) It may be. Here, "nucleoside", "nucleotide", and "nucleic acid" may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced by halogens, aliphatic groups, etc., or by functional groups such as ethers, amines, etc. It may have been converted.
The antisense polynucleotide of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA). Specific examples of the modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives and thiophosphate derivatives of nucleic acids, and those that are resistant to degradation of polynucleoside amides and oligonucleoside amides. The antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to make the antisense nucleic acid more cell permeable, to have a greater affinity for the target sense strand, and to be more toxic if it is toxic. Minimize the toxicity of sense nucleic acids.
Thus, many modifications are known in the art, for example, as described in Kawakami et al. , Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp. 247, 1992; Vol. 8, pp. 395, 1992; T. Crooke et al. ed. , Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993.
The antisense nucleic acid of the present invention may contain altered or modified sugars, bases or bonds, may be provided in a special form such as liposomes or microspheres, may be applied by gene therapy, It could be provided in an added form. Thus, in the form of addition, polycations such as polylysine which acts to neutralize the charge of the phosphate skeleton, lipids which enhance the interaction with the cell membrane or increase the uptake of nucleic acids ( For example, hydrophobic substances such as phospholipid and cholesterol can be mentioned. Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chloroformate, cholic acid, etc.). These can be attached to the 3 'end or 5' end of the nucleic acid, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond. Other groups include cap groups specifically arranged at the 3 ′ end or 5 ′ end of a nucleic acid for preventing degradation by nucleases such as exonuclease and RNase. Such capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
The inhibitory activity of the antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the protein of the present invention. The nucleic acid can be applied to cells by various methods known per se.
[0037]
Hereinafter, the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter, sometimes abbreviated as the protein of the present invention), a polynucleotide encoding the protein or partial peptide of the present invention (eg, DNA (hereinafter, referred to as the present invention) DNA)), an antibody against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter, may be abbreviated as the antibody of the present invention), and an antisense polynucleotide of the DNA of the present invention (hereinafter, may be referred to as “antibody”). (May be abbreviated as the antisense polynucleotide of the present invention).
[0038]
Since the protein of the present invention is frequently expressed in nerve tissue, it can be used as a disease marker. That is, it is useful as a marker for early diagnosis of nervous system diseases, determination of the severity of symptoms, and prediction of disease progression. Further, the protein of the present invention functions as a nerve cell differentiation factor (factor that differentiates undifferentiated nerve cells into cholinergic neurons), and is frequently expressed in nerve tissues. Therefore, antisense polynucleotides of the gene encoding the protein of the present invention, a compound that inhibits the activity or expression of the protein of the present invention or a salt thereof, or a medicament containing an antibody against the protein of the present invention include, for example, a neuronal cell differentiation inhibitor. And so on. Furthermore, a gene encoding the protein of the present invention, an antisense polynucleotide of the gene encoding the protein of the present invention, or an antibody against the protein of the present invention (preferably, a gene encoding the protein of the present invention, an antibody against the protein of the present invention) ) Can be used as a diagnostic for nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia, depression, etc.). Preferred are diagnostic agents for neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.).
[0039]
(1) Agent for preventing or treating various diseases related to the protein of the present invention
The protein of the present invention functions as a nerve cell differentiation factor (factor that differentiates undifferentiated nerve cells into cholinergic neurons), and is frequently expressed in nerve tissue. Therefore, when the DNA encoding the protein of the present invention is abnormal or defective, or when the expression level of the protein of the present invention is reduced, for example, nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease) Syndrome, spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia, depression, etc.).
Therefore, the protein of the present invention and the DNA of the present invention can be used as a medicament such as a prophylactic / therapeutic agent for nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia, depression, etc.). Can be used. Preferable are agents for preventing / treating neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.). Furthermore, the compound or its salt that promotes the activity or expression of the protein of the present invention can be used, for example, to prevent or prevent nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia, depression, etc.). It can be used as a medicament such as a therapeutic agent. Preferred are agents for preventing / treating neurodegenerative diseases.
For example, when there is a patient in which the regulation of nerve cell differentiation is not sufficiently or normally exerted due to the decrease or deletion of the protein of the present invention in vivo, (a) administering the DNA of the present invention to the patient (B) inserting the DNA of the present invention into cells, expressing the protein of the present invention, and then transplanting the cells into a patient by expressing the protein of the present invention in vivo, or ( C) By administering the protein of the present invention to the patient, the role of the protein of the present invention in the patient can be sufficiently or normally exerted. When the DNA of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, the DNA of the present invention is used alone or after being inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, etc. Can be administered to humans or other warm-blooded animals according to The DNA of the present invention can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an auxiliary agent for promoting uptake, using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
When the protein of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it is preferable to use a protein purified to at least 90%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more. preferable.
The protein of the present invention can be used, for example, as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule, orally, or aseptic with water or other pharmaceutically acceptable liquids. It can be used parenterally in the form of injections, such as solutions or suspensions. For example, the protein or the like of the present invention is mixed with physiologically acceptable carriers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in a unit dosage form generally required for the practice of pharmaceutical preparations. Can be manufactured. The amount of the active ingredient in these preparations is such that a proper dosage in the specified range can be obtained.
Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the preparation unit form is a capsule, a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like.
Examples of aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.), and suitable solubilizing agents. For example, alcohols (eg, ethanol, etc.), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80) TM , HCO-50, etc.). Examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol. Also, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), You may mix | blend with a preservative (for example, benzyl alcohol, phenol etc.), an antioxidant, etc. The prepared injection is usually filled in an appropriate ampoule.
The vector into which the DNA of the present invention has been inserted is also formulated as described above, and is usually used parenterally.
The preparation obtained in this way is safe and low toxic, and thus, for example, is useful for warm-blooded animals (eg, human, rat, mouse, guinea pig, rabbit, bird, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey). , Chimpanzees, etc.).
The dosage of the protein of the present invention varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like. For example, when the protein or the like of the present invention is orally administered for the purpose of treating Alzheimer's disease, generally the adult (body weight 60 kg) is used. )), The protein is administered at about 0.1 mg to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. When administered parenterally, the single dose of the protein or the like varies depending on the administration subject, target disease and the like. For example, for the purpose of treating Alzheimer's disease, the protein or the like of the present invention is administered to an adult ( (As a body weight of 60 kg), about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the protein or the like is injected into the affected area per day. It is convenient to administer by In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
Since the expression of the protein of the present invention increases at the stage of differentiation of undifferentiated neural stem cells into cholinergic neurons, it can be used as a disease marker relating to cholinergic neurons. That is, it is useful as a marker for early diagnosis of nervous system diseases, determination of the severity of symptoms, and prediction of disease progression. Therefore, nucleotides of the gene encoding the protein of the present invention, compounds or salts thereof that regulate (promote or inhibit, preferably promote) the activity of the protein of the present invention, and regulate (promote or inhibit) the expression of the gene of the protein of the present invention Pharmaceuticals containing the compound of the present invention or a salt thereof or the protein of the present invention include, for example, nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia, depression, etc.) It can be used as a therapeutic / prophylactic agent. Preferred are agents for preventing / treating neurodegenerative diseases.
(2) Screening of drug candidate compounds for disease
Since the expression of the protein of the present invention increases at the stage of differentiation of undifferentiated neural stem cells into cholinergic neurons, a compound or a salt thereof that regulates (promotes or inhibits, preferably promotes) the activity of the protein of the present invention, Compounds that regulate (enhance or inhibit, preferably enhance) the expression of the gene of the protein of the present invention or salts thereof include, for example, nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia, depression) Disease or the like). Preferred are agents for preventing / treating neurodegenerative diseases.
Therefore, the protein of the present invention modulates (promotes or inhibits, preferably promotes) the activity of the protein of the present invention or a salt thereof, and regulates (promotes or inhibits, preferably promotes) the expression of the gene of the protein of the present invention. Useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof.
That is, the present invention provides an activity of the protein of the present invention characterized by using the protein of the present invention (for example, a neuronal cell having a cholinergic neuron differentiation promoting activity or (2) a dopaminergic neuron differentiation inhibiting activity). A method for screening a compound that regulates (promotes or inhibits, preferably promotes) differentiation or a compound that regulates (promotes or inhibits, preferably promotes) the expression of the gene of the protein of the present invention is provided. More specifically, in the above screening method, for example, the gene expression level of the protein of the present invention in the presence of (1) a test compound and in the absence of a test compound is measured and compared. It is characterized by the following.
(3) When cells having the ability to produce the protein of the present invention or cells transfected with cDNA encoding the protein of the present invention are cultured under lethal conditions, specifically, When cells are cultured with a relatively toxic anticancer agent such as adriamycin, and (4) a mixture of cells having the ability to produce the protein of the present invention or cells into which cDNA encoding the protein of the present invention has been introduced, and a test compound And culturing under lethal conditions, specifically comparing with culturing under serum removal or adding an anticancer agent such as adriamycin which is relatively toxic to nerve cells. Methods for screening for modulators are provided. The above-mentioned screening method is characterized in that, for example, in the cases (1) and (2), the neuronal protective effect and the gene expression level of the protein of the present invention are measured and compared.
Furthermore, the present invention provides a screening method characterized by regulation of its activity in a reporter gene assay using a promoter of a gene or the like whose expression is considered to be controlled by a gene product. More specifically, a reporter gene assay using a primary neuron or P19 cell line or a primary neuron or P19 cell line into which the gene represented by SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 18 has been introduced as a host cell I do.
Examples of the test compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds derived from living organisms (such as carbohydrates and lipids), synthetic compounds, microorganism cultures, cell extracts, plant extracts, and animal tissue extracts. The compound may be a novel compound or a known compound.
In order to carry out the above-mentioned screening method, cells having the ability to produce the protein of the present invention are cultured in a medium suitable for screening. The medium may be any as long as it does not affect the gene expression of the protein of the present invention.
As a cell having the ability to produce the protein of the present invention, for example, a host (transformant) transformed with a vector containing the DNA encoding the protein of the present invention described above is used. As a host, for example, animal cells such as COS7 cells, CHO cells, and HEK293 cells are preferably used. For the screening, for example, a transformant in which the protein of the present invention is expressed in cells by culturing by the above-described method is preferably used. The method for culturing cells capable of expressing the protein of the present invention is the same as the method for culturing the transformant of the present invention described above.
Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.
[0040]
The compound having the activity of promoting the activity of the protein of the present invention is useful as a safe and low-toxic drug for enhancing the action of the protein of the present invention.
The compound having the activity of inhibiting the activity of the protein of the present invention is useful as a safe and low-toxic drug for suppressing the physiological activity of the protein of the present invention.
Compounds or salts thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts And compounds selected from plasma and the like. As the salt of the compound, those similar to the aforementioned salts of the peptide of the present invention are used.
[0041]
Furthermore, since the gene encoding the protein of the present invention is frequently expressed in nerve tissue, a compound or a salt thereof that regulates (promotes or inhibits, preferably promotes) the expression of the gene encoding the protein of the present invention, For example, it can be used as a prophylactic / therapeutic agent for nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia, depression, etc.). Preferred are agents for preventing / treating neurodegenerative diseases.
Therefore, the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that regulates (promotes or inhibits, preferably promotes) the expression of a gene encoding the protein of the present invention. .
The screening method includes (iii) culturing cells capable of producing the protein of the present invention and (iv) culturing cells capable of producing the protein used in the present invention in the presence of a test compound. A screening method characterized by performing a comparison with the case.
In the above method, in the cases (iii) and (iv), the expression level of the gene (specifically, the amount of the protein of the present invention or the amount of the mRNA encoding the protein) is measured and compared.
Examples of the test compound and cells having the ability to produce the protein of the present invention include the same cells as described above.
The protein amount is measured by a known method, for example, using an antibody recognizing the protein of the present invention, and measuring the protein present in a cell extract or the like according to a method such as Western analysis or ELISA method or a method analogous thereto. can do.
The gene expression level of the present invention can be measured according to a method known per se, for example, a method such as Northern blotting, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) or TaqMan polymerase chain reaction, or a method analogous thereto.
For example, a test compound that inhibits or enhances the gene expression level in the case of the above (iv) by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more compared to the case of the above (iii). It can be selected as a compound that inhibits or enhances the activity of the protein of the present invention.
[0042]
The screening kit of the present invention contains the protein or partial peptide used in the present invention or a salt thereof, or a cell capable of producing the protein or partial peptide used in the present invention.
Compounds or salts thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention are test compounds described above, for example, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts. , A compound selected from animal tissue extract, plasma and the like, or a salt thereof, which regulates (promotes or inhibits, inhibits, promotes or inhibits the activity of the protein of the present invention (eg, neural cell differentiation activity) or the expression of the gene of the protein of the present invention. (Preferably promoting) or a salt thereof.
As the salt of the compound, those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention are used.
Compounds or salts thereof that regulate (promote or inhibit, preferably promote) the activity of the protein of the present invention, and compounds or salts thereof that regulate (promote or inhibit, preferably promote) the expression of a gene encoding the protein of the present invention Are useful as prophylactic / therapeutic agents for nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia, depression, etc.). Preferred are agents for preventing / treating neurodegenerative diseases.
When a compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, it can be formulated into a preparation according to a conventional method.
[0043]
For example, compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules). Syrup, emulsion, suspension and the like. Such a composition is produced by a method known per se and contains a carrier, diluent or excipient commonly used in the field of formulation. For example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
As compositions for parenteral administration, for example, injections, suppositories and the like are used. Dosage forms such as agents. Such injections are prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid commonly used for injections. As an aqueous liquid for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents and the like are used, and suitable solubilizing agents, for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) add-on of hydro- genated castor oil)) and the like may be used in combination. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil, or the like is used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol, or the like may be used in combination as a solubilizing agent. The prepared injection is usually filled in an appropriate ampoule. Suppositories to be used for rectal administration are prepared by mixing the above antibody or a salt thereof with a conventional suppository base.
[0044]
The above-mentioned oral or parenteral pharmaceutical composition is conveniently prepared in a unit dosage form so as to be compatible with the dosage of the active ingredient. Examples of such dosage unit dosage forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories and the like. It is preferable that other dosage forms contain 10 to 250 mg of the above antibody.
Each of the above-mentioned compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the antibody.
The preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, human or warm-blooded animals (eg, mouse, rat, rabbit, sheep, pig, cow, horse, bird, cat, dog, monkey, chimpanzee, etc.) ) Can be administered orally or parenterally.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, subject to be administered, administration route and the like. For example, the activity of the protein of the present invention is regulated (preferably promoted) for the purpose of treating Alzheimer's disease. When a compound or a salt thereof is orally administered, the compound or a salt thereof is generally used in an adult (with a body weight of 60 kg) per day in an amount of about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 50 mg. Is administered at about 1.0-20 mg. When administered parenterally, the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, the target disease, and the like. For example, the activity of the protein of the present invention is regulated (preferably, for the purpose of treating Alzheimer's disease). When a compound or a salt thereof is administered to an adult (with a body weight of 60 kg) usually in the form of an injection, the compound or a salt thereof is about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 30 mg per day. It is convenient to administer by injection about 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg, to the Alzheimer's lesion. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
[0045]
(2a) Quantification of the protein of the present invention, its partial peptide or its salt
An antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) can specifically recognize the protein of the present invention. It can be used for quantification by sandwich immunoassay and the like.
That is, the present invention
(I) reacting the antibody of the present invention with a test solution and a labeled protein of the present invention competitively, and measuring the ratio of the labeled protein of the present invention bound to the antibody; A method for quantifying the protein of the present invention in a test solution, and
(Ii) After reacting a test solution with the antibody of the present invention immobilized on a carrier and another labeled antibody of the present invention simultaneously or continuously, the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier is measured. A method for quantifying the protein of the present invention in a test solution is provided.
In the quantification method (ii), it is desirable that one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of the protein of the present invention and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the protein of the present invention.
[0046]
The protein of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and can also be detected by tissue staining or the like. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, and the F (ab ') 2 , Fab ′ or Fab fraction may be used.
The method for quantifying the protein of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited. Any measurement method may be used as long as the amount is detected by chemical or physical means and the amount is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephelometry, a competitive method, an immunometric method, and a sandwich method are preferably used, but in terms of sensitivity and specificity, it is particularly preferable to use a sandwich method described later.
As a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. As the radioisotope, for example, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C] is used. As the above enzyme, a stable enzyme having a large specific activity is preferable. For example, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used. As the fluorescent substance, for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used. As the luminescent substance, for example, luminol, a luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used. Further, a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
[0047]
For the insolubilization of an antigen or an antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing a protein or an enzyme may be used. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
In the sandwich method, the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction). By measuring the activity of the labeling agent, the amount of the protein of the present invention in the test solution can be determined. The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times. The labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above. In the immunoassay by the sandwich method, the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving the measurement sensitivity and the like. You may.
In the method for measuring the protein of the present invention by the sandwich method of the present invention, as the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction, an antibody having a different site to which the protein of the present invention binds is preferably used. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein of the present invention, the antibody used in the primary reaction is preferably An antibody that recognizes, for example, the N-terminal other than the C-terminal is used.
[0048]
The monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, a nephrometry, or the like.
In the competition method, after the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated. (B / F separation), the amount of any of B and F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified. In this reaction method, a soluble antibody is used as the antibody, B / F separation is performed using polyethylene glycol, a liquid phase method using a second antibody against the antibody, or a solid phase antibody is used as the first antibody. As the first antibody, a soluble antibody is used, and an immobilization method using an immobilized antibody as the second antibody is used.
In the immunometric method, the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction against a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. And an excess amount of the labeled antibody, and then immobilized antigen is added to bind unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in any phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
In nephelometry, the amount of insoluble precipitates generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
[0049]
In applying these individual immunoassays to the quantification method of the present invention, no special conditions, operations, and the like need to be set. The protein measurement system of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews, books, and the like.
For example, Hiroe Irie, "Radio Immunoassay" (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie, "Radio Immunoassay" (Kodansha, published in 1974), Eiji Ishikawa et al., "Enzyme Immunoassay" (Medical Shoin, Showa Ed. Ishikawa et al., “Enzyme Immunoassay” (2nd edition) (Issue Shoin, 1982), Eiji Ishikawa et al. “Enzyme Immunoassay” (Third Edition), 3rd edition (Medical Shoin, Showa) 62)), "Methods in ENZYMOLOGY" Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), ibid., Vol. 73 (Immunochemical Technologies (Part B)), ibid., Vol. 74 (Immunochemical Technologies (Part C)), ibid., Vol. 84 (Immunochemical Technologies (Part D: Selected Immunoassays)), ibid., Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibid., Vol. 121 (Immunochemical Technologies (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (all published by Academic Press) can be referred to.
As described above, the protein of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
Furthermore, when an increase or decrease in the concentration of the protein of the present invention is detected by quantifying the concentration of the protein of the present invention using the antibody of the present invention, the disease is, for example, a nervous system disease or will be affected in the future. It can be diagnosed that the probability is high.
Further, the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue. Further, for preparation of an antibody column used for purifying the protein of the present invention, detection of the protein of the present invention in each fraction at the time of purification, analysis of the behavior of the protein of the present invention in test cells, etc. Can be used.
[0050]
(3) Gene diagnostics
The DNA of the present invention can be used, for example, as a probe to produce a human or warm-blooded animal (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, bird, sheep, pig, cow, horse, dog, cat, monkey, chimpanzee, etc.). Can detect abnormalities (genetic abnormalities) in DNA or mRNA encoding the protein or partial peptide of the present invention in, for example, damage, mutation or reduced expression of the DNA or mRNA, and increase in the DNA or mRNA Alternatively, it is useful as a diagnostic agent for gene expression such as overexpression.
The above-mentioned genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be carried out, for example, by the known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879, 1989, Proceedings of the Society). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, pp. 2766-2770, 1989), and the like can be performed by the National Academy of Sciences of USA (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America).
For example, when overexpression or decrease is detected by Northern hybridization, or when DNA mutation is detected by PCR-SSCP method, for example, it can be diagnosed that the possibility of nervous system disease is high. .
[0051]
(4) Drug containing antisense polynucleotide
Antisense polynucleotides that complementarily bind to the DNA of the present invention and can regulate the expression of the DNA have low toxicity, and regulate the function of the protein of the present invention or the DNA of the present invention in vivo (preferably, Can be used as, for example, a neuronal cell differentiation inhibitor.
When the above antisense polynucleotide is used as the above agent, it can be formulated and administered according to a method known per se.
For example, when the antisense polynucleotide is used, the antisense polynucleotide is inserted alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like. It can be administered orally or parenterally to mammals (eg, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). The antisense polynucleotide can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and can be administered using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter. Alternatively, they can be aerosolized and administered locally into the trachea as an inhalant. Furthermore, for the purpose of improving pharmacokinetics, prolonging half-life, and improving the efficiency of intracellular uptake, the antisense polynucleotide is formulated alone or together with a carrier such as liposome (injection), and is intravenously, subcutaneously, or joint cavity. Of these, it may be administered to Alzheimer's lesions and the like.
Further, the antisense polynucleotide can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence of the DNA of the present invention in tissues or cells and the state of expression thereof.
Similarly to the above-mentioned antisense polynucleotide, a double-stranded RNA containing a part of the RNA encoding the protein of the present invention, a ribozyme containing a part of the RNA encoding the protein of the present invention, and a protein of the present invention are bound. Decoy oligonucleotides for the DNA sequence to be used can also suppress the expression of the gene of the present invention, and can suppress the function of the protein used in the present invention or the DNA used in the present invention in vivo, for example, It can be used as a nerve cell differentiation inhibitor and the like.
The double-stranded RNA can be produced by designing based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, Nature, 411, 494, 2001).
A ribozyme can be designed and produced based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 7, pp. 221, 2001). For example, it can be produced by linking a known ribozyme to a part of RNA encoding the protein of the present invention. As a part of the RNA encoding the protein of the present invention, a portion (RNA fragment) close to a cleavage site on the RNA of the present invention, which can be cleaved by a known ribozyme, can be mentioned.
The decoy oligonucleotide can be designed and manufactured based on a DNA sequence to which the protein of the present invention binds, according to a known method (eg, The Journal of Clinical Investigation, 106, 1071, 2000). . Specifically, the decoy oligonucleotide has a base sequence that hybridizes under high stringent conditions with the sequence of the DNA to which the protein of the present invention binds, as long as the protein of the present invention can bind thereto. Any one may be used. The base sequence capable of hybridizing with the sequence of the DNA to which the protein of the present invention binds may be, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% with the sequence of the DNA to which the protein of the present invention binds. As described above, most preferably, a nucleotide sequence having about 95% or more homology is used.
When the above double-stranded RNA, ribozyme or decoy oligonucleotide is used as the above agent, it can be formulated and administered in the same manner as the antisense polynucleotide.
[0052]
(5) Drug containing the antibody of the present invention
The antibody of the present invention having an activity of neutralizing the activity of the protein of the present invention can be used as a diagnostic agent for, for example, nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia, depression, etc.). Can be used. Further, it may be used as a nerve cell differentiation inhibitor or the like.
The above-mentioned agent containing the antibody of the present invention has low toxicity, and can be used as it is as a liquid or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form in humans or mammals (eg, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs). , Monkeys, etc.) can be administered orally or parenterally (eg, intra-articular administration).
[0053]
The antibodies of the present invention can be administered as such or as a suitable pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition used for the administration contains the antibody or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient. Such compositions are provided in dosage forms suitable for oral or parenteral administration (eg, intra-articular administration). It is preferably provided as an inhalant.
Each of the above-mentioned compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the antibody.
[0054]
(6) DNA transfer animal
The present invention relates to a non-protein having a DNA encoding an exogenous protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention). A human mammal is provided.
That is, the present invention
(1) a non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof,
(2) the animal according to (1), wherein the non-human mammal is a rodent;
(3) The animal according to (2), wherein the rodent is a mouse or a rat, and
(4) It is intended to provide a recombinant vector containing the exogenous DNA of the present invention or its mutant DNA and capable of being expressed in mammals.
Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof (hereinafter abbreviated as the DNA-transferred animal of the present invention) can be used for non-fertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, and the like. And preferably at the stage of embryonic development in non-human mammal development (more preferably at the stage of single cells or fertilized eggs and generally before the 8-cell stage), the calcium phosphate method, the electric pulse method, the lipofection method, the agglutination method, It can be produced by transferring a target DNA by a microinjection method, a particle gun method, a DEAE-dextran method, or the like. In addition, the exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like by the DNA transfer method, and can be used for cell culture, tissue culture, and the like. The DNA-transferred animal of the present invention can also be produced by fusing the above-mentioned germ cells with a cell fusion method known per se.
As the non-human mammal, for example, cow, pig, sheep, goat, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, mouse, rat and the like are used. Among them, rodents, which are relatively short in ontogeny and biological cycle in terms of preparation of disease animal model systems, and are easy to breed, especially mice (for example, hybrids such as C57BL / 6 strain and DBA2 strain as pure strains) B6C3F as a system 1 System, BDF 1 System, B6D2F 1 Strain, BALB / c strain, ICR strain, etc.) or rat (eg, Wistar, SD etc.) is preferred.
"Mammals" in a recombinant vector that can be expressed in mammals include humans in addition to the above-mentioned non-human mammals.
[0055]
The exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by non-human mammals, but to the DNA of the present invention once isolated and extracted from the mammal.
As the mutant DNA of the present invention, those having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, base addition, deletion, substitution with another base, etc. The resulting DNA and the like are used, and also include abnormal DNA.
The abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal protein of the present invention, and for example, a DNA that expresses a protein that suppresses the function of the normal protein of the present invention is used.
The exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal that is the same or different from the animal of interest. In transferring the DNA of the present invention to a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a DNA construct linked downstream of a promoter capable of being expressed in animal cells. For example, when the human DNA of the present invention is transferred, DNA derived from various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) having the DNA of the present invention having high homology thereto is expressed. Highly expressing the DNA of the present invention by microinjecting a DNA construct (eg, a vector, etc.) in which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters that can be made into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg. DNA-transferring mammals can be created.
[0056]
Examples of the expression vector of the protein of the present invention include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, bacteriophages such as λ phage, retroviruses such as Moloney leukemia virus, animal viruses such as vaccinia virus or baculovirus. Are used. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast is preferably used.
Examples of the promoter that regulates the DNA expression include, but are not limited to, (1) a promoter of a DNA derived from a virus (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moloney leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, polio virus, etc.); ▼ Promoters derived from various mammals (human, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.), for example, albumin, insulin II, uroplakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acid Protein, glutathione S-transferase, platelet-derived growth factor β, keratins K1, K10 and K14, collagen types I and II, cyclic AMP-dependent protein kinase βI subunit, dyst Lophine, tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor tyrosine kinase (commonly abbreviated as Tie2), sodium potassium adenosine 3 kinase (Na, K-ATPase), neurofilament light chain, metallothionein I and IIA, metalloproteinase 1 tissue inhibitor, MHC class I antigen (H-2L), H-ras, renin, dopamine β-hydroxylase, thyroid peroxidase (TPO), peptide chain elongation factor 1α (EF-1α), β actin , Α and β myosin heavy chain, myosin light chain 1 and 2, myelin basic protein, thyroglobulin, Thy-1, immunoglobulin, heavy chain variable region (VNP), serum amyloid P component, myoglobin, troponin C, smooth muscle α Kuching, pre-pro-enkephalin A, such as a promoter, such as vasopressin is used. Among them, a cytomegalovirus promoter capable of high expression throughout the body, a human peptide chain elongation factor 1α (EF-1α) promoter, human and chicken β-actin promoters and the like are preferable.
The vector preferably has a sequence (generally called a terminator) that terminates transcription of the messenger RNA of interest in a DNA-transferred mammal. A simian virus SV40 terminator or the like is preferably used.
[0057]
In addition, a splicing signal of each DNA, an enhancer region, a part of an intron of a eukaryotic DNA, and the like are placed 5 ′ upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or between the translation region for the purpose of further expressing the desired foreign DNA. It is also possible to connect 3 ′ downstream of the above depending on the purpose.
The normal translation region of the protein of the present invention can be obtained from liver, kidney, thyroid cells, fibroblast-derived DNA derived from humans or various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) and commercially available DNAs. From the various genomic DNA libraries described above, or as a starting material, a complementary DNA prepared by a known method from RNA derived from liver, kidney, thyroid cells, and fibroblasts. In addition, a translation region obtained by mutating a translation region of a normal protein obtained from the above-described cells or tissues by a point mutagenesis method can be used for the exogenous abnormal DNA.
The translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transposed animal by a conventional DNA engineering technique in which it is ligated downstream of the above-mentioned promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer means that all the progeny of the produced animal retain the exogenous DNA of the present invention in all of the germinal cells and somatic cells. means. The progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
The non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred can be subcultured in a normal breeding environment as a DNA-carrying animal by confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating. .
Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal. Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in germ cells of a produced animal after DNA transfer means that all offspring of the produced animal have an excessive amount of the exogenous DNA of the present invention in all of their germ cells and somatic cells. Means Progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
By obtaining a homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes and mating the male and female animals, all offspring can be bred to have the DNA in excess.
[0058]
The non-human mammal having the normal DNA of the present invention expresses the normal DNA of the present invention at a high level, and eventually promotes the hyperactivity of the protein of the present invention by promoting the function of endogenous normal DNA. Occasionally, it can be used as a disease model animal. For example, using the normal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of hyperactivity of the protein of the present invention and diseases associated with the protein of the present invention, and to examine a method for treating these diseases. It is possible.
On the other hand, a non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating. Furthermore, the target foreign DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material. The DNA construct with the promoter can be prepared by a usual DNA engineering technique. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. The progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the abnormal DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells. A homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing these male and female animals, it is possible to breed so that all progeny have the DNA.
[0059]
The non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention, in which the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, inhibits the function of the endogenous normal DNA, and finally the functionally inactive form of the protein of the present invention. It can be refractory and can be used as a model animal for the disease. For example, using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the protein of the present invention and to examine a method for treating this disease.
Further, as a specific possibility, the abnormal DNA-highly expressing animal of the present invention exhibits a function of inhibiting the normal protein function (dominant negative action) by the abnormal protein of the present invention in the inactive refractory disease of the protein of the present invention. A model to elucidate. In addition, since the mammal to which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has a reduced symptom of the free protein of the present invention, a preventive / therapeutic agent for the protein of the present invention or a functionally inactive refractory disease, for example, a nervous system It can also be used for screening tests for prophylactic / therapeutic agents for diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia, depression, etc.). Preferred is a screening test for a prophylactic / therapeutic agent for a neurodegenerative disease.
In addition, other possible uses of the above two kinds of DNA transgenic animals of the present invention include, for example,
(1) Use as a cell source for tissue culture,
(2) A peptide specifically expressed or activated by the protein of the present invention by directly analyzing DNA or RNA in the tissue of the DNA-transferred animal of the present invention or analyzing a peptide tissue expressed by the DNA Analysis of the relationship with
{Circle around (3)} The cells of a tissue having DNA are cultured by standard tissue culture techniques, and these are used to study the function of cells from tissues that are generally difficult to culture.
(4) screening for a drug that enhances the function of the cell by using the cell described in (3) above, and
{Circle around (5)} Isolation and purification of the mutant protein of the present invention and production of its antibody can be considered.
[0060]
Furthermore, using the DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to examine clinical symptoms of a disease associated with the protein of the present invention, including a functionally inactive refractory disease of the protein of the present invention. More detailed pathological findings in each organ of a disease model related to the disease can be obtained, which can contribute to the development of a new treatment method, and further to the research and treatment of a secondary disease caused by the disease.
In addition, it is possible to take out each organ from the DNA-transferred animal of the present invention, cut it into small pieces, and then use a protease such as trypsin to obtain the released DNA-transferred cells, culture them, or systematize the cultured cells. . Furthermore, it is possible to identify the protein-producing cell of the present invention, examine its relevance to apoptosis, differentiation or proliferation, or investigate the signal transduction mechanism thereof, and investigate their abnormalities. It is an effective research material for
Further, in order to develop a therapeutic agent for a disease associated with the protein of the present invention, including a functionally inactive refractory disease of the protein of the present invention, using the DNA-transferred animal of the present invention, It is possible to provide an effective and rapid screening method for a therapeutic agent for the disease by using a method or the like. In addition, using the transgenic animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention, it is possible to examine and develop a DNA treatment method for diseases associated with the protein of the present invention.
[0061]
(7) Knockout animal
The present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated, and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
That is, the present invention
(1) a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated,
(2) the embryonic stem cell according to (1), wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli);
(3) the embryonic stem cell according to (1), which is neomycin-resistant;
(4) the embryonic stem cell according to (1), wherein the non-human mammal is a rodent;
(5) The embryonic stem cell according to (4), wherein the rodent is a mouse,
(6) a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, wherein the DNA is inactivated;
(7) The DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli), and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention (6). The non-human mammal according to the item,
(8) the non-human mammal according to (6), wherein the non-human mammal is a rodent;
(9) The non-human mammal according to (8), wherein the rodent is a mouse, and
(10) A method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits promoter activity on DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to the animal according to (7) and detecting expression of a reporter gene. I will provide a.
[0062]
A non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated is a DNA which is artificially mutated to the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, thereby suppressing the expression ability of the DNA, or By substantially eliminating the activity of the protein of the present invention encoded by the DNA, the DNA does not substantially have the ability to express the protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the knockout DNA of the present invention). ) Non-human mammal embryonic stem cells (hereinafter abbreviated as ES cells).
As the non-human mammal, the same one as described above is used.
The method of artificially mutating the DNA of the present invention can be carried out, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA by a genetic engineering technique. With these mutations, the knockout DNA of the present invention may be prepared, for example, by shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon.
[0063]
Specific examples of the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated (hereinafter abbreviated as the DNA-inactivated ES cells of the present invention or the knockout ES cells of the present invention) include, for example, The DNA of the present invention possessed by a non-human mammal is isolated, and its exon portion is a drug resistance gene represented by a neomycin resistance gene or a hygromycin resistance gene, or lacZ (β-galactosidase gene), cat (chloramphenicol acetyl). A reporter gene or the like typified by a transferase gene) to disrupt the exon function, or insert a DNA sequence that terminates gene transcription into an intron between exons (for example, a polyA addition signal); Inability to synthesize complete messenger RNA Thus, a DNA strand having a DNA sequence constructed so as to eventually destroy the gene (hereinafter abbreviated as a targeting vector) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination, and the resulting ES cells PCR using a DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe and a DNA sequence on a targeting vector and a DNA sequence in a neighboring region other than the DNA of the present invention used for the preparation of the targeting vector as a primer And selecting the knockout ES cells of the present invention.
As the ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like, for example, those already established as described above may be used, or according to the known Evans and Kaufma method. It may be a newly established one. For example, in the case of mouse ES cells, currently, 129-line ES cells are generally used. For example, for the purpose of obtaining ES cells in which BDF is clearly known, for example, BDF in which the number of eggs collected by C57BL / 6 mice or C57BL / 6 has been improved by hybridization with DBA / 2 1 Mouse (F of C57BL / 6 and DBA / 2) 1 ) Can also be used favorably. BDF 1 In addition to the advantage that the number of eggs collected and the eggs are robust, the mice have C57BL / 6 mice as a background, and thus, the ES cells obtained using the C57BL / 6 mice were used to produce C57BL / 6 mice. / 6 mice can be advantageously used in that the genetic background can be replaced by C57BL / 6 mice by backcrossing.
In addition, when ES cells are established, blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used. In addition, a large number of blastocysts can be efficiently obtained by collecting embryos at the 8-cell stage and culturing them until blastocysts are used. Early embryos can be obtained.
Although either male or female ES cells may be used, male ES cells are generally more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce cumbersome culture labor.
[0064]
As a method for determining the sex of ES cells, for example, a method of amplifying and detecting a gene in a sex-determining region on the Y chromosome by a PCR method can be mentioned. If this method is used, it is conventionally necessary to perform about 10 karyotype analyses. 6 Since the number of ES cells is required, the number of ES cells of about 1 colony (approximately 50) is sufficient, so that primary selection of ES cells in the early stage of culture can be performed by discriminating between male and female. In addition, by enabling selection of male cells at an early stage, labor in the initial stage of culture can be significantly reduced.
The secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method. The number of chromosomes in the obtained ES cells is desirably 100% of the normal number. However, when it is difficult due to physical operations at the time of establishment, after knocking out the gene of the ES cells, the cells are knocked out of normal cells (for example, chromosomes in mice). It is desirable to clone again into cells (number 2n = 40).
The embryonic stem cell line obtained in this manner usually has very good growth properties, but it must be carefully subcultured because it tends to lose its ontogenic ability. For example, on a suitable feeder cell such as STO fibroblast in the presence of LIF (1 to 10,000 U / ml) in a carbon dioxide incubator (preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen, 5% The cells are cultured by a method such as culturing at about 37 ° C. in carbon dioxide gas and 90% air. At the time of subculture, for example, trypsin / EDTA solution (usually 0.001 to 0.5% trypsin / 0.1 to 5 mM EDTA, Preferably, a method is used in which cells are converted into single cells by treatment with about 0.1% trypsin / 1 mM EDTA and seeded on newly prepared feeder cells. Such subculture is usually performed every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells and, if any morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
ES cells are differentiated into various types of cells, such as parietal muscle, visceral muscle, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions. [M. J. Evans and M.E. H. Kaufman, Nature, 292, 154, 1981; R. Martin Proc. Of National Academy of Sciences USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 78, 7634, 1981; C. Doetschman et al., Journal of Embryology and Experimental Morphology, Vol. 87, p. 27, 1985], that the DNA-deficient cell of the present invention obtained by differentiating the ES cell of the present invention is characterized by in vitro Is useful in cell biology studies of the protein of the present invention.
[0065]
The non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level.
As the non-human mammal, those similar to the aforementioned can be used.
The non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is, for example, a DNA in which the targeting vector prepared as described above is introduced into mouse embryonic stem cells or mouse egg cells, and the DNA of the targeting vector is inactivated by the introduction. The DNA of the present invention can be knocked out by homologous recombination in which the sequence replaces the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by homologous recombination.
Cells in which the DNA of the present invention has been knocked out can be used as a DNA sequence on a Southern hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, and the DNA of the present invention derived from the mouse used for the targeting vector. The determination can be made by analysis by a PCR method using a DNA sequence of a nearby region other than DNA as a primer. When non-human mammalian embryonic stem cells are used, a cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cells are cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage of non-human mammalian cells. The chimeric embryo is injected into an animal embryo or a blastocyst, and the produced chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal. The produced animal is a chimeric animal composed of both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially mutated DNA locus of the present invention. When a part of the germ cells of the chimeric animal has a mutated DNA locus of the present invention, all tissues are artificially mutated from a population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the added DNA locus of the present invention, for example, by judging coat color or the like. The individual thus obtained is usually an individual with a heterozygous expression of the protein of the present invention, which is crossed with an individual with a heterozygous expression of the protein of the present invention, and homozygous expression of the protein of the present invention from their offspring. Defective individuals can be obtained.
[0066]
When an egg cell is used, for example, a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into a chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into a nucleus of an egg by a microinjection method. Compared to mammals, they can be obtained by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by homologous recombination.
In this manner, the individual in which the DNA of the present invention has been knocked out can be bred in an ordinary breeding environment after confirming that the DNA has been knocked out in the animal individual obtained by mating.
Furthermore, the germline can be obtained and maintained in accordance with a conventional method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, a homozygous animal having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by breeding the mother animal in such a manner that there are one normal animal and one homozygote. By mating male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
The non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are extremely useful for producing a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention.
In addition, since the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the protein of the present invention, a model of a disease caused by inactivation of the biological activity of the protein of the present invention. Therefore, it is useful for investigating the causes of these diseases and examining treatment methods.
[0067]
(8a) A method for screening a compound having a therapeutic / preventive effect on diseases caused by DNA deficiency or damage of the present invention
The non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention can be used for screening for a compound having a therapeutic / preventive effect against diseases caused by deficiency or damage of the DNA of the present invention.
That is, the present invention is characterized by administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention, and observing and measuring a change in the animal. Provided is a method for screening a compound or a salt thereof having a therapeutic / preventive effect on a disease, for example, a nervous system disease.
Examples of the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention used in the screening method include the same ones as described above.
Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, and the like. These compounds are novel compounds. Or a known compound.
Specifically, a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound, compared with an untreated control animal, and tested using changes in each organ, tissue, disease symptoms, etc. of the animal as an index. The therapeutic / preventive effects of the compounds can be tested.
As a method of treating a test animal with a test compound, for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like. The dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
[0068]
When screening for a compound having a therapeutic / preventive effect on a nervous system disease (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia, depression, etc.), preferably a neurodegenerative disease, the present invention A test compound is administered to a non-human mammal deficient in DNA expression, and a difference in the degree of onset of a nervous system disease or a difference in the degree of healing of a nervous system disease is observed in the above-mentioned tissue over time with the test compound non-administration group.
In the screening method, when the test compound is administered to a test animal, if the disease symptom of the test animal is improved by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more, the test compound is administered. It can be selected as a compound having a therapeutic / preventive effect on the above diseases.
The compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and has a therapeutic / preventive effect on a disease caused by deficiency or damage of the protein of the present invention. It can be used as a drug for safe and low toxic prophylactic / therapeutic agents. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
The compound obtained by the screening method may form a salt. Examples of the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkali metals, etc.). And the like, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, For example, salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
A drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention.
Since the preparation thus obtained is safe and low toxic, it can be used, for example, in humans or mammals (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.). Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like. For example, when the compound is orally administered, it is generally used in an adult (assuming a body weight of 60 kg) Alzheimer's disease patient. About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the compound per day. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like. For example, the compound is usually administered in the form of an injection to an adult (with a body weight of 60 kg) Alzheimer's disease patient. When administered, it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound per day by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
[0069]
(8b) Method for screening for a compound that promotes or inhibits the activity of a promoter for the DNA of the present invention
The present invention provides a compound which promotes or inhibits the activity of a promoter for the DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention, and detecting the expression of a reporter gene, or a compound thereof. A method for screening a salt is provided.
In the above-described screening method, the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention may be a non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention in which the DNA of the present invention is inactivated by introducing a reporter gene, A reporter gene that can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention is used.
Examples of the test compound include the same compounds as described above.
As the reporter gene, the same one as described above is used, and a β-galactosidase gene (lacZ), a soluble alkaline phosphatase gene, a luciferase gene and the like are preferable.
In a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention in which the DNA of the present invention is replaced with a reporter gene, since the reporter gene is under the control of the promoter for the DNA of the present invention, the expression of the substance encoded by the reporter gene is traced. By doing so, the activity of the promoter can be detected.
For example, when a part of the DNA region encoding the protein of the present invention is replaced with a β-galactosidase gene (lacZ) derived from Escherichia coli, a tissue that expresses the protein of the present invention should be used instead of the protein of the present invention. Β-galactosidase is expressed. Therefore, for example, the present invention can be easily performed by staining with a reagent serving as a substrate for β-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside (X-gal). Of the protein in an animal body can be observed. Specifically, the protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with glutaraldehyde, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-gal at room temperature or around 37 ° C. After reacting for about 30 minutes to 1 hour, the β-galactosidase reaction may be stopped by washing the tissue specimen with a 1 mM EDTA / PBS solution, and coloration may be observed. Further, mRNA encoding lacZ may be detected according to a conventional method.
The compound or a salt thereof obtained by using the above-mentioned screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity for the DNA of the present invention.
The compound obtained by the screening method may form a salt, and the salt of the compound may be a salt with a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid) or a base (eg, an alkali metal). Are used, and especially preferred are physiologically acceptable acid addition salts. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, For example, salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
[0070]
The compound or a salt thereof that promotes or inhibits (preferably promotes) the promoter activity of the DNA of the present invention regulates (preferably promotes) the expression of the protein of the present invention and regulates (preferably promotes) the function of the protein. ) As a preventive or therapeutic agent for nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia, depression, etc.), preferably as a preventive or therapeutic agent for neurodegenerative diseases Useful.
Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
A drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention or a salt thereof.
Since the preparation thus obtained is safe and low toxic, it can be used, for example, in humans or mammals (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.). Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the disease to be treated, the subject of administration, the administration route, and the like. For example, when the compound of the present invention that promotes the promoter activity for DNA is orally administered, generally the adult (body weight) is used. For an Alzheimer's disease patient (as 60 kg), about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the compound is administered per day. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like. For example, the compound of the present invention that promotes the promoter activity for DNA is usually administered in the form of an injection to an adult ( When administered to an Alzheimer's disease patient (with a body weight of 60 kg), about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound per day is injected intravenously. It is convenient to administer by In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
As described above, the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening for a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter for the DNA of the present invention, It can greatly contribute to the investigation of the cause of various diseases caused or the development of preventive / therapeutic agents.
Further, using a DNA containing the promoter region of the protein of the present invention, genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into egg cells of an animal to produce a so-called transgenic animal (gene-transferred animal). Once created, it will also be possible to specifically synthesize the protein and study its effects in living organisms. Furthermore, if a suitable reporter gene is bound to the above promoter portion, and a cell line that expresses the reporter gene is established, a low-molecular compound having an action of specifically promoting or suppressing the production ability of the protein itself of the present invention in the body. Can be used as a search system.
[0071]
In the present specification, when bases, amino acids, and the like are represented by abbreviations, the abbreviations are based on the abbreviations by IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or the abbreviations commonly used in the art, and examples thereof are described below. When an amino acid can have an optical isomer, the L-form is indicated unless otherwise specified.
DNA: deoxyribonucleic acid
cDNA: complementary deoxyribonucleic acid
A: Adenine
T: Thymine
G: Guanine
C: Cytosine
RNA: ribonucleic acid
mRNA: messenger ribonucleic acid
dATP: deoxyadenosine triphosphate
dTTP: deoxythymidine triphosphate
dGTP: deoxyguanosine triphosphate
dCTP: deoxycytidine triphosphate
ATP: Adenosine triphosphate
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid
SDS: Sodium dodecyl sulfate
Gly: glycine
Ala: Alanine
Val: Valine
Leu: Leucine
Ile: Isoleucine
Ser: Serine
Thr: Threonine
Cys: cysteine
Met: methionine
Glu: glutamic acid
Asp: Aspartic acid
Lys: lysine
Arg: Arginine
His: histidine
Phe: phenylalanine
Tyr: Tyrosine
Trp: Tryptophan
Pro: Proline
Asn: Asparagine
Gln: Glutamine
pGlu: pyroglutamic acid
Sec: selenocysteine
[0072]
Further, substituents, protecting groups and reagents frequently used in the present specification are represented by the following symbols.
Me: methyl group
Et: ethyl group
Bu: butyl group
Ph: phenyl group
TC: thiazolidine-4 (R) -carboxamide group
Tos: p-toluenesulfonyl
CHO: Formyl
Bzl: benzyl
Cl 2 -Bzl: 2,6-dichlorobenzyl
Bom: benzyloxymethyl
Z: benzyloxycarbonyl
Cl-Z: 2-chlorobenzyloxycarbonyl
Br-Z: 2-bromobenzyloxycarbonyl
Boc: t-butoxycarbonyl
DNP: dinitrophenyl
Trt: Trityl
Bum: t-butoxymethyl
Fmoc: N-9-fluorenylmethoxycarbonyl
HOBt: 1-hydroxybenztriazole
HOOBt: 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine
HONB: 1-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide
DCC: N, N'-dicyclohexylcarbodiimide
[0073]
The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
[SEQ ID NO: 1]
3 shows the sequence of mouse-derived cDNA obtained in Example 3.
[SEQ ID NO: 2]
3 shows the base sequence of the ChAT primer used in Example 2.
[SEQ ID NO: 3]
3 shows the base sequence of the ChAT primer used in Example 2.
[SEQ ID NO: 4]
3 shows the nucleotide sequence of the Wnt-1 primer used in Example 2.
[SEQ ID NO: 5]
3 shows the nucleotide sequence of the Wnt-1 primer used in Example 2.
[SEQ ID NO: 6]
3 shows the base sequence of the Mash-1 primer used in Example 2.
[SEQ ID NO: 7]
3 shows the base sequence of the Mash-1 primer used in Example 2.
[SEQ ID NO: 8]
3 shows the base sequence of the ChAT probe used in Example 2.
[SEQ ID NO: 9]
3 shows the nucleotide sequence of the Wnt-1 probe used in Example 2.
[SEQ ID NO: 10]
3 shows the base sequence of the Mash-1 probe used in Example 2.
[SEQ ID NO: 11]
4 shows the base sequence of a primer prepared from SEQ ID NO: 1 used in Example 4.
[SEQ ID NO: 12]
4 shows the base sequence of a primer prepared from SEQ ID NO: 1 used in Example 4.
[SEQ ID NO: 13]
4 shows the nucleotide sequence of a probe prepared from SEQ ID NO: 1 used in Example 4.
[SEQ ID NO: 14]
The amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence of the protein coding region (Open Reading Frame) shown in SEQ ID NO: 15 is shown.
[SEQ ID NO: 15]
2 shows the nucleotide sequence of the protein coding region (Open Reading Frame) in the sequence of the mouse-derived cDNA represented by SEQ ID NO: 1 (the nucleotide sequence corresponding to positions 111 to 2474 in the sequence represented by SEQ ID NO: 1).
[SEQ ID NO: 16]
The amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence of the protein coding region (Open Reading Frame) represented by SEQ ID NO: 18 is shown.
[SEQ ID NO: 17]
2 shows the sequence of the cDNA derived from human shown in Example 3.
[SEQ ID NO: 18]
This shows the nucleotide sequence of the protein coding region (Open Reading Frame) in the human-derived cDNA sequence represented by SEQ ID NO: 17 (the nucleotide sequence corresponding to the 1st to 2361st positions in the sequence represented by SEQ ID NO: 17).
[SEQ ID NO: 19]
14 shows the base sequence of a primer used in Example 6.
[SEQ ID NO: 20]
14 shows the base sequence of a primer used in Example 6.
[SEQ ID NO: 21]
6 shows the sequence of a mouse-derived cDNA obtained in Example 6.
[SEQ ID NO: 22]
6 shows the sequence of a mouse-derived cDNA obtained in Example 6.
[SEQ ID NO: 23]
3 shows the base sequence of the MAP2 primer used in Example 2.
[SEQ ID NO: 24]
3 shows the base sequence of the MAP2 primer used in Example 2.
[SEQ ID NO: 25]
3 shows the base sequence of the MAP2 probe used in Example 2.
[SEQ ID NO: 26]
The amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence of the protein coding region (Open Reading Frame) represented by SEQ ID NO: 27 is shown.
[SEQ ID NO: 27]
This shows the base sequence of the protein coding region (Open Reading Frame) in the sequence of the mouse-derived cDNA represented by SEQ ID NO: 22.
[0074]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be more specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
[0075]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto. Genetic manipulation using Escherichia coli is based on molecular cloning (Molecular cloning, 2). nd , J. et al. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989).
[0076]
Example 1
Method for culturing P19 cells into cholinergic neurons
1 × 10 P19 cells purchased from ATCC 5 Suspension cultures (BBRC, 284 , 1098-1103 (2001)) to differentiate into cholinergic neurons. The differentiation into cholinergic neurons was confirmed by an immunostaining method using an anti-choline acetyltransferase (ChAT) antibody (Chemicon international, Inc .; AB144P). The cells were fixed with 4% paraformaldehyde, blocking buffer (PBS (-) (Roche; 1-666-789), 5% BSA (Sigma; A-7030), 0.1% Triton X-100 (ICN). Blocking was performed at room temperature for 1 hour with Biomedicals Inc .; Thereafter, an anti-ChAT antibody (Chemicon international, Inc .; AB144P) was allowed to act as a primary antibody at 4 ° C. for 72 hours, and further reacted with a secondary antibody Alexa Fluor 488 (Molecular Probe; A-11055) at room temperature for 1 hour to obtain fluorescence. It was examined under a microscope. As a result, it was found that about 80% of the P19 cells on day 9 of the differentiation induction had differentiated into cholinergic neurons.
[0077]
Example 2
Sample preparation for gene tip analysis
Gene chip analysis was performed for the purpose of searching for a gene associated with regeneration into cholinergic neurons in the system for inducing differentiation into cholinergic neurons using P19 cells described in Example 1, and candidate genes were selected. In order to determine the number of days of culture for gene chip analysis, the expression of ChAT, a marker of cholinergic neurons, and the expression of Wnt-1 and Mash-1, which are known to be expressed at the stage of differentiation of neurons, were examined. Was. The method was a Taqman PCR reaction using cDNA derived from RNA extracted from P19 cells using ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems). The composition of the reaction solution in this reaction was prepared using the above cDNA as a template, and was prepared using SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 (ChAT), SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 (Wnt-1), and SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 6. The primers of No. 7 (Mash-1) were each probed with 0.4 μM (final concentration), SEQ ID NO: 8 (ChAT), SEQ ID NO: 9 (Wnt-1), and SEQ ID NO: 10 (Mash-1). Each 10 μl of 0.2 μM (final concentration) and 2 × Taqman PCR Master Mix was added to make a liquid volume of 20 μl. The PCR reaction was carried out by repeating a cycle of 50 ° C. for 2 minutes, 95 ° C. for 10 minutes, 95 ° C. for 15 seconds, and 60 ° C. for 1 minute 40 times. The calculated copy number was corrected with the copy number of glycerol triphosphate dehydratase, which was calculated in the same manner as the copy number of the protein gene containing each amino acid sequence as an internal control. The results of the expression analysis of Wnt-1 and Mash-1 show that the differentiation induction system for nerve cells using P19 cells differentiates from neural progenitor cells to nerve cells from day 3 to day 5 of differentiation induction. it was thought. In addition, expression of ChAT was observed from day 6 of differentiation induction. From this, it was determined that the gene chip analysis was performed on RNA derived from P19 cells on days 0, 3, 5, 6, and 8 of culture. RNA was extracted from P19 cells at each culture day.
[0078]
Example 3
Gene chip analysis
Gene chip analysis was performed on the RNA prepared in Example 2. According to Affymetrix GeneChip Expression Analysis manual, cRNA was synthesized from RNA prepared from each culture day, hybridization was performed on A, B and C chips of the MG-U74Av2 chip, and then washing and staining were repeated. The data was analyzed by using Genespring as software, normalizing the signal of each gene, and comparing the expression between samples. When the expression of the two genes Wnt-1 and Mash-1 shown in Example 2 was examined, an expression pattern similar to that of Taqman PCR was shown. As a method for narrowing down candidate genes, a control, a gene whose expression was increased 3 times or more on day 5 of differentiation induction from day 3 of differentiation induction, and a gene whose expression did not decrease after day 5 of differentiation induction were extracted. . A Blast search was performed using the Genbank database, which is a public database, based on a single known gene found as a result, that is, the EST base sequence (Genbank AW047036) represented by affy ID 114443_at. The fragment was found to be the mouse gene represented by SEQ ID NO: 1 (Genbank bc024617) (its ORF (Open Reading Frame) was the base sequence represented by SEQ ID NO: 15). Furthermore, as a result of a Blast search of the mouse gene (bc024617) using GSN (GSP), the human counterpart of the mouse gene (bc024617) is SEQ ID NO: 17 (the gene described in WO2001-57190) (ORF thereof). (Open Reading Frame) is the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18.) The amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence of the protein coding region (Open Reading Frame) shown by SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 18, that is, the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 16 is 95 % Homology.
[0079]
Example 4
Analysis of tissue distribution of the gene represented by SEQ ID NO: 1 in normal mice
In order to examine the tissue distribution in normal mice, the method of Example 2 was performed using the cDNA of mouse MTC panel I (manufactured by Clontech) as a template, the primers of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 and the probe of SEQ ID NO: 13. PCR was carried out. As a result, extremely high expression of the gene represented by SEQ ID NO: 1 was observed in the brain.
[0080]
Example 5
Expression analysis of the gene represented by SEQ ID NO: 1 in mouse neural stem cell differentiation-inducing system Expression in the differentiation-inducing system from mouse neural stem cells to cholinergic neurons was examined. Neural stem cells were prepared by the neurosphere method (Exp Neurol, 1997 Apr; 144 (2): 350-60) using a fetus of a TP14-15 Balb / c mouse. To induce differentiation, neural stem cells were cultured on an ECL coat (UPSATE biotechnology; 08-110) containing 100 ng / ml NGF (Genzyme technology; 2256) in a medium (DMEM (Gibco; 11995-065), N2supplement (Gib0; 50); ) (Condition 37 ° C, 5% CO 2) 2 Incubator) and treatment with 5 μg / ml AraC (cytosine-BD-arabinofuranoside; Sigma; C1768) from day 0 to day 1 of induction of differentiation. Example 2 In order to confirm differentiation into cholinergic nerves, Example 2 was carried out using primers of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 and a probe of SEQ ID NO: 8, using as a template cDNA prepared from the induced neural stem cells. When PCR was performed by the method described above, an increase in ChAT expression was confirmed. PCR was performed in the same manner as described above using the primers of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 and the probe of SEQ ID NO: 13. As a result, an increase in the expression of the gene represented by SEQ ID NO: 1 was observed in the differentiation-induced neural stem cells.
Example 6
Cloning of the gene represented by SEQ ID NO: 1
PCR was performed using Marathon-Ready cDNA (Clontech) derived from mouse brain as a template and primers of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20. The composition of the reaction solution used in the reaction was the above cDNA as a template, primers of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 were each 0.4 μM (final concentration), dNTP (TAKARA) was 0.2 mM, and 10 × Pfu. 2 μl of DNA polymerase reaction buffer (Stratagene 600250) and 2.5 U of PfuTurbo DNA Polymerase (Stratagene 600250) were added to make a volume of 20 μL. In the PCR reaction, a cycle of 95 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 3 minutes was repeated 30 times after 95 ° C. for 2 minutes, and an extension reaction was finally performed at 72 ° C. for 10 minutes. It cloned into plasmid vector pcDNA3.1 / V5-HisTOPO vector (Invitrogen K4800-01) according to the protocol of pcDNA3.1 / V5-HisTOPO TA expression kit (Invitrogen K4800-01). This was introduced into Escherichia coli TOP10F '(Invitrogen K4800-01), and a clone having cDNA was selected in LB agar medium containing ampicillin. As a result of analyzing the sequences of the individual clones, SEQ ID NO: 21 containing the same ORF as SEQ ID NO: 1 and 3 bases less than the ORF of SEQ ID NO: 1 assumed to be a variant (498-500 bp of SEQ ID NO: 1) (Deletion) The cDNA sequence of SEQ ID NO: 22 was obtained. (The nucleotide sequence of the protein coding region (Open Reading Frame) in the cDNA of SEQ ID NO: 22 is SEQ ID NO: 27, and the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence of the protein coding region (Open Reading Frame) shown in SEQ ID NO: 27 Is shown as SEQ ID NO: 26.)
Example 7
Functional analysis of the gene represented by SEQ ID NO: 1 in P19 cells
To examine the function of the gene represented by SEQ ID NO: 1, the gene represented by SEQ ID NO: 22 was introduced into P19 cells, and MAP2 (Microtubule-associated protein 2), a neuronal marker, and the cholinergic neuronal marker ChAT (Choline acetyltransferase) was examined. Gene transfer was performed using FUGENE (Roche cat. 1814443) according to the protocol. As an expression vector, a pcDNA3.1 / V5-HisTOPO vector that expresses the gene represented by SEQ ID NO: 22 (hereinafter sometimes referred to as 114443 gene) constructed in Example 6 was used. 5.0 × 10 for 10cm dish 5 30 μl of FUGENE and 5 μg of an expression vector were added to P19 cells seeded at a rate of 10 cells / dish to perform gene transfer. From 6 to 8 hours after the gene transfer, the differentiation induction shown in Example 1 was performed for 2 days, followed by culturing for 3 days in the absence of AraC. RNA was prepared over time after induction of differentiation, and its cDNA was used as a template to obtain primers of SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 (MAP2), SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 (ChAT), and SEQ ID NO: 25 ( PCR was performed by the method of Example 2 using the probe of MAP2) and SEQ ID NO: 8 (ChAT). As a result, the expression of ChAT increased 1.9-fold and the expression of MAP2 increased 1.5-fold 3 days after the induction of differentiation by the introduction of the 114443 gene, as compared to the control. This suggested that the 114443 gene promoted differentiation into cholinergic nerves in P19 cells.
[0081]
【The invention's effect】
The protein used in the present invention is a diagnostic marker for nervous system diseases. Therefore, compounds or salts thereof that promote the activity or gene expression of the protein include, for example, nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord) Injury, epilepsy, schizophrenia, depression, etc.). In addition, the polynucleotide encoding the protein of the present invention can promote the expression of the protein used in the present invention. Examples thereof include nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia) , Depression, etc.). Therefore, it is considered that a new therapeutic method for a neurodegenerative disease can be pioneered by appropriately using a drug that regulates the expression of the present gene and the function of the gene product.
[0082]
[Sequence list]
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[0083]
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[0084]
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[0094]
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[0095]
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[0096]
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[0097]
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[0098]
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[0099]
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[0100]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 in one-letter code.
FIG. 2 shows the nucleotide sequence of the protein coding region (Open Reading Frame) represented by SEQ ID NO: 15.
FIG. 3 shows the nucleotide sequence of the protein coding region (Open Reading Frame) represented by SEQ ID NO: 15. ([Continued from Fig. 2))

Claims (64)

配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防・治療剤。Prevention of a neurodegenerative disease comprising a compound having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or a partial peptide thereof or a compound promoting the activity of a salt thereof or a salt thereof -Therapeutic agents. 配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防・治療剤。A prophylactic / therapeutic agent for a neurodegenerative disease comprising a compound that promotes the activity of a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or a salt thereof or a salt thereof. 配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防・治療剤。A preventive / therapeutic agent for a neurodegenerative disease comprising a compound comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 or a compound promoting the activity of a salt thereof, or a salt thereof. 配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防・治療剤。A preventive / therapeutic agent for a neurodegenerative disease comprising a compound comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 or a compound promoting the activity of a salt thereof, or a salt thereof. 活性が神経細胞分化活性である請求項１ないし４記載の剤。5. The agent according to claim 1, wherein the activity is a nerve cell differentiation activity. 神経細胞分化促進剤である請求項１ないし５記載の剤。6. The agent according to claim 1, which is a nerve cell differentiation promoting agent. 配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防・治療剤。A neurodegenerative disease comprising a compound having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, a partial peptide thereof, or a compound promoting the expression of a gene of a salt thereof, or a salt thereof Prophylactic and therapeutic agents. 配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防・治療剤。A preventive / therapeutic agent for a neurodegenerative disease comprising a compound that promotes the expression of a gene of a protein or a salt thereof consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, or a salt thereof. 配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防・治療剤。A preventive / therapeutic agent for a neurodegenerative disease, comprising a compound or a salt thereof which promotes the expression of a gene of a protein or a salt thereof comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16. 配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防・治療剤。A preventive / therapeutic agent for a neurodegenerative disease comprising a compound which promotes the expression of the gene of the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 or a salt thereof, or a salt thereof. 神経細胞分化促進剤である請求項７ないし１０記載の剤。The agent according to claims 7 to 10, which is a nerve cell differentiation promoting agent. 配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防・治療剤。A preventive / therapeutic agent for a neurodegenerative disease comprising a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, or a partial peptide thereof, or a salt thereof. 配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防・治療剤。A preventive / therapeutic agent for a neurodegenerative disease comprising a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or a salt thereof. 配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防・治療剤。An agent for preventing or treating a neurodegenerative disease, comprising a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 or a salt thereof. 配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防・治療剤。An agent for preventing or treating a neurodegenerative disease, comprising a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 or a salt thereof. 神経細胞分化促進剤である請求項１２ないし１５記載の剤。16. The agent according to claim 12, which is a nerve cell differentiation promoting agent. 配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる神経変性疾患の予防・治療剤。A preventive / therapeutic agent for a neurodegenerative disease comprising a polynucleotide encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or a partial peptide thereof. 配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有してなる神経変性疾患の予防・治療剤。A preventive / therapeutic agent for a neurodegenerative disease comprising a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14. 配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有してなる神経変性疾患の予防・治療剤。A preventive / therapeutic agent for a neurodegenerative disease comprising a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16. 配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有してなる神経変性疾患の予防・治療剤。A preventive / therapeutic agent for a neurodegenerative disease comprising a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26. 神経細胞分化促進剤である請求項１７ないし２０記載の剤。21. The agent according to claim 17, which is a nerve cell differentiation promoting agent. 配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド。A nucleotide sequence complementary or substantially complementary to the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding a protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, or An antisense polynucleotide containing a portion. 配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド。An antisense polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary or substantially complementary to a nucleotide sequence of a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, or a part thereof. 配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド。An antisense polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary or substantially complementary to a nucleotide sequence of a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, or a part thereof. 配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド。An antisense polynucleotide comprising a base sequence complementary to or substantially complementary to a base sequence of a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, or a part thereof. 請求項２２ないし２５記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬。A medicament comprising the antisense polynucleotide according to claim 22. 神経細胞分化抑制剤である請求項２６記載の医薬。The medicament according to claim 26, which is a nerve cell differentiation inhibitor. 配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。An antibody against a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, a partial peptide thereof, or a salt thereof. 配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。An antibody against a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, a partial peptide thereof, or a salt thereof. 配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。An antibody against a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, a partial peptide thereof, or a salt thereof. 配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。An antibody against a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, a partial peptide thereof, or a salt thereof. 請求項２８ないし３１記載の抗体を含有してなる医薬。A medicament comprising the antibody according to claim 28. 神経細胞分化抑制剤である請求項３２記載の医薬。The medicament according to claim 32, which is a nerve cell differentiation inhibitor. 請求項２８ないし３１記載の抗体を含有してなる診断薬。A diagnostic agent comprising the antibody according to claim 28. 神経変性疾患の診断薬である請求項３４記載の診断薬。The diagnostic agent according to claim 34, which is a diagnostic agent for a neurodegenerative disease. 配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる神経変性疾患の診断薬。A diagnostic agent for a neurodegenerative disease, comprising a polynucleotide encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or a partial peptide thereof. 配列番号：１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる神経変性疾患の診断薬。A diagnostic agent for a neurodegenerative disease comprising a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or a partial peptide thereof. 配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる神経変性疾患の診断薬。A diagnostic agent for a neurodegenerative disease comprising a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 or a partial peptide thereof. 配列番号：２６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる神経変性疾患の診断薬。A diagnostic agent for a neurodegenerative disease comprising a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 or a partial peptide thereof. 配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法。Using a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, its partial peptide, or a salt thereof, wherein the activity of the protein, its partial peptide, or its salt is used. For screening a compound or a salt thereof that promotes lipase. 配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法。A gene having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, a partial peptide thereof, or a salt thereof, wherein the gene of the protein, the partial peptide, or a salt thereof is used. A method for screening a compound or a salt thereof that promotes the expression of a compound. 配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。A protein or a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; A screening kit for a compound or salt thereof that promotes activity. 配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。A protein or a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; A kit for screening a compound that promotes gene expression or a salt thereof. 請求項４０もしくは４１記載のスクリーニング方法または請求項４２もしくは４３記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩。A compound or a salt thereof obtainable by using the screening method according to claim 40 or 41 or the screening kit according to claim 42 or 43. 請求項４４記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。A medicament comprising the compound according to claim 44 or a salt thereof. 神経変性疾患の予防・治療剤である請求項４５記載の医薬。The medicament according to claim 45, which is a prophylactic / therapeutic agent for a neurodegenerative disease. 配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法。Using a polynucleotide encoding a protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, or a partial peptide or a salt thereof A method for screening for a compound or a salt thereof that promotes the activity of a compound. 配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法。Using a polynucleotide encoding a protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, or a partial peptide or a salt thereof A method for screening a compound or a salt thereof that promotes the expression of a gene of the present invention. 配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。Using a polynucleotide encoding a protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, or a partial peptide or a salt thereof A kit for screening a compound or a salt thereof that promotes the activity of 配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。Using a polynucleotide encoding a protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, or a partial peptide or a salt thereof A kit for screening a compound or a salt thereof that promotes the expression of a gene of the present invention. 請求項４７もしくは４８記載のスクリーニング方法または請求項４９もしくは５０記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩。A compound or a salt thereof obtainable by using the screening method according to claim 47 or 48 or the screening kit according to claim 49 or 50. 請求項５１記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。A medicament comprising the compound according to claim 51 or a salt thereof. 神経変性疾患の予防・治療剤である請求項５２記載の医薬。53. The medicament according to claim 52, which is a prophylactic / therapeutic agent for a neurodegenerative disease. 配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進することを特徴とする神経変性疾患の予防・治療方法。A method for preventing or treating a neurodegenerative disease, which comprises promoting the activity of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, a partial peptide thereof, or a salt thereof. 配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドの遺伝子の発現を促進することを特徴とする神経変性疾患の予防・治療方法。A method for preventing or treating a neurodegenerative disease, which comprises promoting the expression of a gene of a protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14. 配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする神経変性疾患の予防・治療方法。Administering an effective amount of a compound or a salt thereof that promotes the activity of a protein or a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 to a mammal A method for preventing or treating a neurodegenerative disease, characterized in that: 配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする神経変性疾患の予防・治療方法。Administering to a mammal an effective amount of a compound or a salt thereof which promotes the expression of a protein or a partial peptide thereof or a gene thereof which contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 A method for preventing or treating a neurodegenerative disease. 神経変性疾患の予防・治療剤の製造のための配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の使用。A compound that promotes the activity of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or a partial peptide thereof or a salt thereof for the manufacture of a prophylactic / therapeutic agent for a neurodegenerative disease Or use of its salts. 神経変性疾患の予防・治療剤の製造のための配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩の使用。Promotes gene expression of a protein or a partial peptide thereof or a salt thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 for production of a prophylactic / therapeutic agent for a neurodegenerative disease Use of a compound or a salt thereof. 配列番号：２７で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩。A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 or a salt thereof. 請求項６０記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩。A partial peptide of the protein according to claim 60 or a salt thereof. 請求項６０記載のタンパク質または請求項６１記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。A polynucleotide comprising a polynucleotide encoding the protein according to claim 60 or the partial peptide according to claim 61. ＤＮＡである請求項６２記載のポリヌクレオチド。63. The polynucleotide of claim 62 which is DNA. 配列番号：２６で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド。A polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 26.
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