JP2004261144A

JP2004261144A - Recombinant microorganism, anaerobic digestion method for organic waste

Info

Publication number: JP2004261144A
Application number: JP2003056934A
Authority: JP
Inventors: Kunio Omiya; 邦雄大宮; Kazuo Sakka; 和郎粟冠; Tetsuya Kimura; 哲哉木村; Kenji Morimoto; 兼司森本
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; Mie University NUC
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; Mie University NUC
Priority date: 2003-03-04
Filing date: 2003-03-04
Publication date: 2004-09-24

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To effectively increase the efficiency of cellulose decomposition under such condition that a large amount of readily decomposable carbohydrates, e.g., glucose or starch in the anaerobic digestion of organic waste. <P>SOLUTION: There are provided a recombinant microorganism that is prepared by introducing a gene of cellulose decomposition enzyme that is linked to the promotor region of a gene resistant to the catabolite repression into the anaerobic microorganism. an anaerobic digestion process in which these recombinant microorganisms is used to ferment organic waste under anaerobic conditions, and an anaerobic digestion method by the fermentation of organic waste using the recombinant microorganism under anaerobic conditions. In a preferred embodiment, the fermentation is carried out in separated two steps: the preliminary fermentation step wherein the organic waste is subjected to the hydrogen fermentation and the major fermentation step wherein the preliminarily fermented product is added to the methane fermentation solution whereby the major fermentation can be carried out under an anaerobic condition in high efficiency. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は組み換え微生物及び有機性廃棄物の嫌気性消化方法に関し、更に詳しくは、嫌気性微生物に対してカタボライト抑制を受けない遺伝子のプロモーター領域と連結されたセルロース分解酵素遺伝子を導入した組み換え微生物、及び、かかる組み換え微生物を用いて特にセルロースの分解効率を向上させた有機性廃棄物の嫌気性消化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
家庭等から排出される食品廃棄物、生ゴミ等の有機性廃棄物を処理するに当たり、水素発酵による水素ガス、メタン発酵によるメタンガス等のエネルギー源として有用なガスを回収できる点から、嫌気性消化方法が好ましく採用されており、各種の嫌気性消化方法やそのための処理システムが提案されている。
【０００３】
【特許文献１】特開平８−１８２９９８号公報
上記の特許文献１には、生物処理槽（メタン発酵槽）から採取した消化汚泥を含油培地で嫌気条件下で処理して嫌気性油脂分解菌を分離培養し、培養された嫌気性油脂分解菌を含油排水が投入されるメタン発酵槽で増殖させる、含油排水の油脂分解方法が開示されている。
【０００４】
【特許文献２】特開２００２−２７３４９０号公報
上記の特許文献２には、有機性廃棄物を液状廃棄物と有機性汚泥とに分離し、有機性汚泥を嫌気性消化発酵槽に導入してメタン発酵させる嫌気性消化方法に関し、セルロース分の少ない易分解性物質を最初に投入してメタンガス化菌の活性を増大させることにより、有機性廃棄物の処理能力を低下させることなく嫌気性消化の立ち上げを迅速化する方法が開示されている。
【０００５】
【発明の解決しようとする課題】
有機性廃棄物の嫌気性消化においては、生ゴミ等に含まれる有機物の内、炭水化物は低分子の有機酸やアルコール類に分解され、タンパク質は有機酸を経てアミン、アンモニアに分解される（消化発酵）。このような消化発酵により生成した低分子有機酸は、メタン発酵（狭義のメタン発酵を言う。以下同じ）によりメタンと炭酸ガスに分解される。このような嫌気性消化を行う菌叢は、有機物から水素や低分子の有機酸等を生産する水素生産菌と、これらを最終的にメタン、炭酸ガス等にまで分解するメタン生産菌との複雑なミクロフローラからなる。
【０００６】
このミクロフローラ中のセルロース分解菌、換言すれば、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ等セルロース分解酵素を分泌して有機性廃棄物中のセルロースを分解（低分子化）する菌は、水素生産菌の一種にカテゴリー分けすることが可能であるが、通常の嫌気性消化菌叢においては次のような問題があった。
【０００７】
即ち、生ゴミ等の有機性廃棄物は、難分解性であるセルロースと共に、易分解性であるグルコース、デンプン等の多量に含んでいる。この場合、「カタボライト抑制」として知られる現象が見られる。つまり、セルロース分解菌は易分解性のグルコース、デンプン等をまず分解し、これらが枯渇した後に初めてセルロース分解酵素を生産する性質を持つ。
【０００８】
このため、もともと難分解性であるセルロースの分解が一層遅延し、ひいては有機性廃棄物の嫌気性消化全体の効率が悪化すると言う問題があった。このような問題を解決するため、例えば、生ゴミを予め細かく粉砕したり、アルカリ処理に供したり、所定の酵素を添加したりする等と言う対策が取られているが、効率面やコスト面で必ずしも満足できるものではなかった。
【０００９】
そこで本発明は、有機性廃棄物の嫌気性消化において、易分解性であるグルコース、デンプン等が多量に併存する条件下においてもセルロースの分解効率を有効に向上させることを、解決すべき課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
（第１発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１発明（請求項１に記載の発明）の構成は、嫌気性微生物に対して、カタボライト抑制を受けない遺伝子のプロモーター領域と連結されたセルロース分解酵素遺伝子を導入した、組み換え微生物である。
【００１１】
（第２発明の構成）
上記課題を解決するための本願第２発明（請求項２に記載の発明）の構成は、前記第１発明に係るセルロース分解酵素遺伝子が、以下の（１）〜（３）のいずれかである、組み換え微生物である。
（１）中温性嫌気性細菌クロストリジウム・ジョウスイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｊｏｓｕｉ）由来のセルラーゼＢ遺伝子。
（２）中温性嫌気性細菌クロストリジウム・ジョウスイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｊｏｓｕｉ）由来のセルラーゼＤ遺伝子。
（３）中温性嫌気性細菌ルミノコッカス・アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓａｌｂｕｓ）由来のエンドグルカナーゼＩ遺伝子。
【００１２】
上記（１）のセルラーゼＢ遺伝子の塩基配列をセルラーゼＢのアミノ酸配列と共に配列表の配列番号１に、上記（２）のセルラーゼＤ遺伝子の塩基配列をセルラーゼＤのアミノ酸配列と共に配列表の配列番号２に、上記（３）のエンドグルカナーゼＩ遺伝子の塩基配列をエンドグルカナーゼＩのアミノ酸配列と共に配列表の配列番号３に、それぞれ示す。
【００１３】
（第３発明の構成）
上記課題を解決するための本願第３発明（請求項３に記載の発明）の構成は、前記第１発明又は第２発明に係る嫌気性微生物がクロストリジウム・パラプトリフィカムＭ株であり、前記プロモーター領域が該Ｍ株由来のヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域である、組み換え微生物である。
【００１４】
なお、上記Ｍ株由来のヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列を、そのアミノ酸配列と共に配列表の配列番号４に示す。なお、配列番号４の塩基配列中には、前記のプロモーター領域（塩基番号１〜４６５）も含まれている。
【００１５】
（第４発明の構成）
上記課題を解決するための本願第４発明（請求項４に記載の発明）の構成は、第１発明に係る組み換え微生物を添加して有機性廃棄物を嫌気的条件下に発酵させる、有機性廃棄物の嫌気性消化方法である。
【００１６】
（第５発明の構成）
上記課題を解決するための本願第５発明（請求項５に記載の発明）の構成は、前記第４発明に係る組み換え微生物が、第２発明に係る（１）〜（３）の各遺伝子をそれぞれカタボライト抑制を受けない遺伝子のプロモーター領域と連結された状態で導入した３種類の組み換え微生物から選ばれる１種又は２種以上である、有機性廃棄物の嫌気性消化方法である。
【００１７】
（第６発明の構成）
上記課題を解決するための本願第６発明（請求項６に記載の発明）の構成は、前記第４発明又は第５発明に係る有機性廃棄物に対して、更に、カタボライト抑制を受けないヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと含む嫌気性微生物あるいは嫌気性組み換え微生物を添加する、有機性廃棄物の嫌気性消化方法である。
【００１８】
上記「ヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと含む嫌気性微生物」として、クロストリジウム・パラプトリフィカムＭ株を例示できる。上記「ヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと含む嫌気性組み換え微生物」とは、適宜な嫌気性微生物に対してカタボライト抑制を受けないヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと導入した組み換え体を言う。上記のＭ株に対して、適宜なベクター等を用いて、更にヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと導入した組み換え体も、「ヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと含む嫌気性組み換え微生物」に該当する。
【００１９】
なお、上記した「カタボライト抑制を受けないヒドロゲナーゼ遺伝子」の一例として、クロストリジウム・パラプトリフィカムＭ株に由来するヒドロゲナーゼ遺伝子を例示できる。そのヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列を、そのアミノ酸配列と共に配列表の配列番号４に示す。配列番号４の塩基配列中には、前記のプロモーター領域（塩基番号１〜４６５）も含まれている。
【００２０】
（第７発明の構成）
上記課題を解決するための本願第７発明（請求項７に記載の発明）の構成は、前記第４発明〜第６発明のいずれかに係る発酵を、以下の（Ａ）予備発酵工程及び（Ｂ）本発酵工程の２段階で行い、かつその際に、少なくとも一方の工程において、第１発明又は第２発明に係る組み換え微生物及び第６発明に係る嫌気性微生物あるいは嫌気性組み換え微生物から選ばれる少なくとも１種の微生物を添加する、有機性廃棄物の嫌気性消化方法である。
（Ａ）有機性廃棄物を嫌気的条件下に水素発酵させて、メタン発酵基質を豊富に含む予備発酵液を準備する予備発酵工程。
（Ｂ）前記予備発酵液の比較的少量を、予備発酵工程を経ていない多量のメタン発酵液に添加し、嫌気的条件下に高効率のメタン発酵を行わせる本発酵工程。
【００２１】
上記の第７発明において、「水素発酵」と「メタン発酵」は次のように区別される。即ち、通常の嫌気的発酵を行う菌叢の存在下において、発酵液量に対して１０湿重量％以上の生ゴミを添加すると、相対的に水素を多く生成する発酵が起こり、本発明ではこれを「水素発酵」と呼ぶ。又、通常の嫌気的発酵を行う菌叢の存在下において、発酵液量に対して１０湿重量％未満（例えば４〜５湿重量％程度）の生ゴミを添加すると、相対的にメタンガスを多く生成する発酵が起こり、本発明ではこれを「メタン発酵」と呼ぶ。従って、「メタン発酵液」とは、発酵液量に対して１０湿重量％未満の有機性廃棄物を含む発酵液を言う。
（第８発明の構成）
上記課題を解決するための本願第８発明（請求項８に記載の発明）の構成は、前記第７発明に係る（Ａ）予備発酵工程において第６発明に係る嫌気性微生物あるいは嫌気性組み換え微生物から選ばれる少なくとも１種の微生物を添加し、前記（Ｂ）本発酵工程において第１発明又は第２発明に係る組み換え微生物から選ばれる少なくとも１種の微生物を添加する、有機性廃棄物の嫌気性消化方法である。
【００２２】
【発明の作用・効果】
（第１発明の作用・効果）
ある遺伝子の発現がカタボライト抑制を受けるか否かは、主として当該遺伝子のプロモーター領域の如何によると考えられる。従って、セルロース分解酵素遺伝子を、カタボライト抑制を受けないことが確認されている遺伝子のプロモーター領域と連結して宿主微生物に導入すれば、その組み換え微生物において、カタボライト抑制を受けることなくセルロース分解酵素遺伝子を発現させ、セルロース分解能力を発揮させることができる。
【００２３】
（第２発明の作用・効果）
上記第１発明の組み換え微生物に導入されるセルロース分解酵素遺伝子の種類は任意であるが、例えば、（１）クロストリジウム・ジョウスイ由来のセルラーゼＢ遺伝子、（２）クロストリジウム・ジョウスイ由来のセルラーゼＤ遺伝子、（３）ルミノコッカス・アルブス由来のエンドグルカナーゼＩ遺伝子等を好ましく例示することができる。
【００２４】
（第３発明の作用・効果）
上記第１発明の組み換えの対象となる嫌気性微生物、及びプロモーター領域の種類は任意であるが、例えば、プロモーター領域としてはクロストリジウム・パラプトリフィカムＭ株由来のヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域を好ましく例示することができる。又、その際、上記クロストリジウム・パラプトリフィカムＭ株由来のプロモーター領域を用いることから、宿主微生物としては当該Ｍ株が特に好適である。
【００２５】
（第４発明の作用・効果）
第４発明によれば、前記第１発明に係る組み換え微生物を添加して有機性廃棄物を嫌気的条件下に発酵させるので、有機性廃棄物中にセルロースと共にグルコースやデンプンを多量に含んでいても、セルロース分解菌はカタボライト抑制を受けない。
【００２６】
その結果、難分解性であるセルロースが順調にオリゴ糖化・単糖化され、生成したグルコース等が更に水素生産菌やメタン生産菌により最終生成物（目的生成物）である水素ガス、メタンガス等に迅速に分解されるため、有機性廃棄物の嫌気性消化全体の効率も向上する。
【００２７】
なお、水分が多く液体状態の有機性廃棄物であれば、そのまま発酵槽中で発酵させれば、嫌気的条件下の発酵となる。水分の不足した有機性廃棄物であれば、発酵槽中で水に浸漬した状態として発酵させれば、嫌気的条件下の発酵となる。嫌気的条件を特に徹底させたい場合には、例えば、発酵槽中の空気を窒素ガス等で置換すれば良い。
【００２８】
（第５発明の作用・効果）
有機性廃棄物に添加する組み換え微生物としては、第２発明の（１）〜（３）に列挙したセルロース分解酵素遺伝子をそれぞれカタボライト抑制を受けない遺伝子のプロモーター領域と連結された状態で導入した組み換え微生物３種の内の１種又は２種以上が、特に好ましい。
【００２９】
（第６発明の作用・効果）
有機性廃棄物に添加する組み換え微生物として、上記３種の組み換え微生物の内の１種又は２種以上に加えて、カタボライト抑制を受けないヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと含む嫌気性微生物あるいは嫌気性組み換え微生物を更に用いると、有機性廃棄物全体の消化促進に一層有効である。
【００３０】
（第７発明の作用・効果）
前記したように、有機性廃棄物の嫌気性消化は、全体的には、水素生産菌とメタン生産菌を主体とする菌叢によって行われる。そして水素生産菌はメタン生産菌よりも格段に生育が速いため、一般的には水素生産菌叢が優勢となってｐＨが極度に低下し、好適なｐＨが中性付近であるメタン生産菌叢の活動が抑制される傾向がある。この点に関しては、第７発明のように、嫌気的条件下での有機性廃棄物の発酵を、前記（Ａ）の予備発酵工程と、（Ｂ）の本発酵工程との２段階で行うことが好ましい。
【００３１】
（Ａ）の予備発酵工程においては、前記したように発酵液に対して所定量以上の有機性廃棄物を添加することにより、水素発酵を行わせる。この水素発酵によれば、メタン生産菌の活動は抑制されるが、メタン発酵の基質である低分子有機酸等（特に、酢酸が好ましい）が豊富に蓄積される。次に（Ｂ）の本発酵工程として、上記（Ａ）に係る比較的少量の予備発酵液を予備発酵工程を経ていない多量の本発酵液（有機性廃棄物量が発酵液量に対して１０湿重量％未満とされたメタン発酵液である）に添加すると、嫌気的条件下に高効率のメタン発酵が行われる。その理由は必ずしも明確ではないが、本発酵液に対して、メタン発酵の基質である低分子有機酸等が予備発酵液によって豊富に供給される点が関係していると考えられる。
【００３２】
そして、（Ａ）の予備発酵工程、及び／又は（Ｂ）の本発酵工程において前記したような各種の組み換え微生物等を添加することにより、有機性廃棄物の嫌気性消化が一層強力に行われる。
【００３３】
（第８発明の作用・効果）
発酵液に添加する微生物としては、（Ａ）の予備発酵工程においてヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと含む嫌気性微生物あるいは嫌気性組み換え微生物を添加し、（Ｂ）の本発酵工程においてセルロース分解酵素遺伝子を導入した組み換え微生物の１種以上、とりわけ３種全部を添加することが、特に好ましい。
【００３４】
【発明の実施の形態】
次に、第１発明〜第８発明の実施の形態について説明する。以下において単に「本発明」と言うときは、第１発明〜第８発明を一括して指している。
【００３５】
〔セルロース分解酵素遺伝子〕
本発明で宿主微生物に導入するセルロース分解酵素遺伝子の種類は任意である。好ましくは、（１）中温性嫌気性細菌クロストリジウム・ジョウスイ由来のセルラーゼＢ遺伝子、（２）中温性嫌気性細菌クロストリジウム・ジョウスイ由来のセルラーゼＤ遺伝子、（３）中温性嫌気性細菌ルミノコッカス・アルブス由来のエンドグルカナーゼＩ遺伝子のいずれかを導入する。
【００３６】
なお、クロストリジウム・ジョウスイの菌株は、ＦＥＲＭＰ−９６８４として産業技術総合研究所・特許生物寄託センターに寄託されている。
【００３７】
〔プロモーター領域〕
宿主微生物にセルロース分解酵素遺伝子と連結して導入されるプロモーター領域は、カタボライト抑制を受けないことが確認されている遺伝子のプロモーター領域である限りにおいて限定されないが、好ましくはクロストリジウム・パラプトリフィカムＭ株由来のヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域である。
【００３８】
このＭ株由来のヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域は、配列表の配列番号４の塩基配列中における塩基番号１〜４６５の領域に相当し、カタボライト抑制を受けずにヒドロゲナーゼ遺伝子の転写を強く促進するプロモーター領域であることが確認されている。セルロース分解酵素遺伝子をこのプロモーター領域に連結しておくと、セルロース分解酵素遺伝子の転写が促進され、セルロース分解酵素遺伝子の発現がカタボライト抑制を受けることなく強化される。
【００３９】
〔組み換え微生物〕
本発明の組み換え微生物は、宿主である嫌気性微生物に対してセルロース分解酵素遺伝子を導入したものであり、かつ、そのセルロース分解酵素遺伝子がカタボライト抑制を受けないことが確認されている遺伝子のプロモーター領域と連結されて導入されているものである。
【００４０】
宿主である嫌気性微生物は適宜に選ばれるが、例えば嫌気性細菌が好ましい。特に好ましい宿主の一例として、クロストリジウム・パラプトリフィカムＭ株が挙げられる。このＭ株は、ＦＥＲＭＰ−１６３９０として、産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００４１】
その他にも、絶対嫌気性細菌では、Ｃ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、ＭｅｇａｓｏｈａｅｒａｅｌｓｄｅｎｉｉＬＣ１、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、ＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍΔＨ等が例示され、更に、ＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｖｕｌｇａｒｉｓＨｉｌｄｅｎｂｏｒｏｕｇｈ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｇｉｇａｓ、ＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｖｕｌｇａｒｉｓＭｉｙａｚａｋｉＦ、ＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓＮｏｒｗａｙ、ＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓＡＴＣＣ２７７７４等が例示される。
【００４２】
通性嫌気性細菌では、ＰｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓＳ５０３、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＭＲＥ６００等が例示される。好気性細菌では、ＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓＨ−１６、Ｎｏｃａｒｄｉａｏｐａｃａ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ等が例示される。
【００４３】
組み換え微生物の作製に当たり、カタボライト抑制を受けない遺伝子のプロモーター領域と連結されたセルロース分解酵素遺伝子は、そのまま宿主微生物に導入することもできるし、宿主微生物との適合性を考慮した適宜なベクターに組み込んで導入することもできる。これらの遺伝子又は組み換えベクターの宿主微生物への導入に当たり、公知の各種の遺伝子導入法、例えばカルシウム処理法、遺伝子注入（トランスフェクション）法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法等を任意に利用することができる。
【００４４】
上記の組み換えベクターには、上記プロモーター領域の他、ターミネーター領域、抗生物質耐性遺伝子等の選抜用の各種マーカー遺伝子等を含ませることができる。ベクターの好ましい具体例として、プラスミドベクターであるｐＪＩＲ７５１、ｐＪＩＲ７５０、ｐＪＩＲ４１８等を挙げることができる。
【００４５】
〔組み換え微生物の好適な実施形態〕
今回、組み換え微生物の好ましい実施形態として、クロストリジウム・パラプトリフィカムＭ株にセルロース分解酵素遺伝子を導入するためのシャトルベクターを開発し、このシャトルベクターによって所定のプロモーター領域とセルロース分解酵素遺伝子を導入した組み換え微生物を作製した。
【００４６】
即ち、プラスミドベクターであるｐＪＩＲ７５１のマルチクローニング部位を改変し、制限酵素部位ＥｃｏＲ１、ＢａｍＨ１、Ｓａｌ１、Ｘｈｏ１、ＢｓｓＨＩ１、ＨｉｎｄＩＩＩの順へ置換した。これをプラスミドｐＪＩＲ７５１−Ｍと呼ぶ。そして上記Ｍ株由来のヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域をＰＣＲ法で増幅した後に、ｐＪＩＲ７５１−Ｍの制限酵素部位ＢａｍＨ１−Ｓａｌ１間に連結させた。これをｐＪＩＲ７５１−ｈｙｄ−ｐｒｏと呼ぶ。
【００４７】
更に、このように構築したｐＪＩＲ７５１−ｈｙｄ−ｐｒｏの制限酵素部位Ｘｈｏ１−ＢｓｓＨＩ１間に、前記第２発明に係る３種類のセルロース分解酵素遺伝子（セルラーゼＢ遺伝子、セルラーゼＤ遺伝子、エンドグルカナーゼＩ遺伝子）をＰＣＲ法で増幅した後に挿入した。そして、エレクトロポレーション法によって、これらをそれぞれ別個のクロストリジウム・パラプトリフィカムＭ株に導入した。
【００４８】
〔有機性廃棄物の嫌気性消化方法〕
有機性廃棄物の嫌気性消化は、その有機性廃棄物を特に好気的な条件に置かない限り、自然に行うことができる。水分が多く液体状態の有機性廃棄物であれば、そのまま発酵槽中で発酵させれば嫌気的条件下の発酵となる。水分の不足した有機性廃棄物であれば、発酵槽中で水に浸漬した状態として発酵させれば、嫌気的条件下の発酵となる。嫌気的条件を特に徹底させたい場合には、例えば、発酵槽中の空気を窒素ガス等で置換すれば良い。
【００４９】
嫌気的なメタン発酵を行うには、一般的には３７°Ｃ程度で行う中温発酵法と、５５°Ｃ程度で行う高温発酵法が知られている。本発明の有機性廃棄物の嫌気性消化は中温発酵法で行っても良いし、高温発酵法で行っても良い。但し、組み換え微生物の宿主としてクロストリジウム・パラプトリフィカムＭ株を用いる場合、その生育至適温度が３７°Ｃ程度であるため中温発酵法が適当であるが、２０〜４５°Ｃ程度の温度域での発酵も可能である。
【００５０】
本発明に係る有機性廃棄物の嫌気性消化方法において、用いる有機性廃棄物の種類は限定されない。例えば、家庭、レストラン、ホテルの厨房等から排出される各種食材を含む生ゴミ、各種の農産廃棄物（例えば、稲わら等のセルロース系物質を含む廃棄物）、河川の土手等での刈草で発生する植物性廃棄物等が限定なく含まれる。
【００５１】
本発明において、これらの有機性廃棄物は上記の組み換え微生物を添加したもとで嫌気的条件下での発酵に供される。組み換え微生物としては、前記第２発明に係る（１）〜（３）の各遺伝子をそれぞれ導入した３種類の組み換え微生物の１種又は２種以上、特に３種全部を一緒に添加することが好ましい。有機性廃棄物に対して、更に、カタボライト抑制を受けないヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと含む嫌気性微生物あるいは嫌気性組み換え微生物を添加することが、とりわけ好ましい。
【００５２】
有機性廃棄物を嫌気的条件下に発酵させるに当たり、添加する組み換え微生物等は別にしても、通常は有機性廃棄物自体が一応の嫌気的発酵を行い得る菌叢を伴っている。但し、メタン発酵性能の良い適当な菌叢を別途準備し、有機性廃棄物に対して添加することも、好ましい。
【００５３】
〔２段階式嫌気性消化方法〕
有機性廃棄物の嫌気性消化を、以下の（Ａ）予備発酵工程及び（Ｂ）本発酵工程の２段階で行うことが、特に好ましい。その際、添加すべき前記第１発明、第２発明又は第６発明に係る組み換え微生物等の１種以上が、（Ａ），（Ｂ）の少なくとも一方の工程において添加される。特に好ましくは、（Ａ）予備発酵工程においてヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと含む嫌気性微生物あるいは嫌気性組み換え微生物を添加し、（Ｂ）本発酵工程においてセルロース分解酵素遺伝子を導入した組み換え微生物の１種以上（より好ましくは３種類の全部）を添加する。
【００５４】
（Ａ）有機性廃棄物を、発酵液に対して１０湿重量％以上添加することにより、嫌気的条件下に主に水素発酵させて、メタン発酵基質を豊富に含む予備発酵液を準備する予備発酵工程。
【００５５】
（Ｂ）比較的少量の予備発酵液を、予備発酵工程を経ていない多量のメタン発酵液に添加し、嫌気的条件下に高効率のメタン発酵を行わせる本発酵工程。
【００５６】
予備発酵工程を切り上げるべき時期は、例えば予備発酵工程における水素発酵に伴う水素ガス等の発生量、蓄積される有機酸の濃度等に基づき、適宜に判定することができる。予備発酵液の本発酵工程への投入量は、相対的に少量であれば良いが、予めラボスケールの実験を行って本発酵工程でのメタン発酵状況を把握し、これに基づいて予備発酵液の投入量を決定しても良い。
【００５７】
【実施例】
〔実施例１：メタン発酵菌叢及び生ゴミ試料の調製〕
メタン発酵菌叢の菌叢としては、本発明に係る組み換え微生物が安定して維持、定着される限りにおいて、水田土壌、海底汚泥、既存のメタン発酵槽の菌叢等を任意に使用できるが、今回は、三重県鈴鹿市在住の石田氏が所有するメタン発酵菌叢を用いた。
【００５８】
生ゴミ試料として、家庭から排出される炭水化物性（穀類、野菜等）、タンパク質性（魚肉、畜肉等）及び脂質性の残飯や調理屑等が混在する通常の生ゴミを採集した。そして、これらを市販のディスポーザーを用いて粉砕した後、遠心分離（１００００×ｇ、１０分）して得た固形物を用いた。
【００５９】
〔実施例２：メタン発酵条件の探索〕
まず、以下のようにして、組み換え微生物を添加しない条件で、生ゴミからのメタン発酵の良好な条件を探った。
【００６０】
通常の嫌気性発酵液１０００ｍＬに対して生ゴミ１００ｇ（湿重量）を添加し、予備発酵工程としての水素発酵を行わせて、予備発酵液を調製した。次いで、この予備発酵液を、１０湿重量％以下の生ゴミを投入したメタン発酵液１０００ｍＬに対して、図１に示す投入パターンに従って間欠的に投入した。
【００６１】
即ち、図１は横軸に上記のメタン発酵開始後の経過時間を示すが、図の矢印１で示す第１期間中は、馴致期間として、４８時間当たり１度ずつ、１０〜５０ｍＬの範囲内で徐々に増量させながら、所定液量のメタン発酵液の上清を抜き取り、かつ同量の予備発酵液を投入した。次に、図の矢印２で示す第２期間中は、４８時間当たり１度ずつ、メタン発酵液の上清１００ｍＬを抜き取り、かつ同量の予備発酵液を投入した。図の矢印３で示す第３期間中は、４８時間当たり１度ずつ、メタン発酵液の上清１５０ｍＬを抜き取り、かつ同量の予備発酵液を投入した。図の矢印４で示す第４期間中は、４８時間当たり１度ずつ、メタン発酵液の上清２００ｍＬを抜き取り、かつ同量の予備発酵液を投入した。
【００６２】
図１は、縦軸にメタン発酵液全体からの１時間当たりの総ガス発生量を示す。総ガス発生量を示すグラフが上下に大きく変動しているのは、上記の予備発酵液の間欠投入の影響であると考えられる。総ガス発生量は、（株）シナガワ製の湿式ガスメーターＷ−ＮＫＤａ−０．５Ａで測定した。又、そのガス組成をガスクロマトグラフィー等によって調べたが、メタンガス、水素ガス、二酸化炭素等が含まれていた。
【００６３】
図１によれば、総ガス発生量は第２期間中に最高値を記録し、その後の第３期間や第４期間と大差がない。従って、メタン発酵液に対する予備発酵液の投入量が概ね「１００〜２００ｍＬ／Ｌ／４８時間」である場合に、最も活発なガス発生（メタン発酵）を期待できることが分かった。
【００６４】
〔実施例３：組み換え微生物の作出〕
（実施例３−１：プラスミドの構築と遺伝子導入）
基本的遺伝子操作はＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８２）に従って行った。宿主には、クロストリジウム・パラプトリフィカムＭ株を用いた。遺伝子導入用ベクターは、オーストラリア・モナッシュ大学（ＭｏｎａｓｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のジュリアン・ルード（ＪｕｒｉａｎＩ．Ｒｕｄｅ）より提供されたシャトルベクターであるｐＪＩＲ７５１を用いた。これはエリスロマイシン耐性遺伝子を含み、大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍの間で有効なシャトルベクターである。
【００６５】
ところで、上記のＭ株において、ベクターｐＪＩＲ７５１を用いて異種微生物由来の遺伝子を発現させるためには、発現を制御するプロモーターをＭ株由来のものに変更しておきたい。又、発明の目的からして、このベクターｐＪＩＲ７５１に、カタボライト抑制を受けない遺伝子のプロモーター領域を設定しておきたい。この目的のプロモーターとして、上記Ｍ株由来の前記ヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域を用いた。
【００６６】
このプロモーター部分を、配列番号５に示す塩基配列の合成ｆｗｄ．プライマー及び配列番号６に示す塩基配列の合成ｒｅｖ．プライマーを用いて鋳型ＤＮＡからＰＣＲ法にて増幅し、得られた約４００塩基対の塩基配列を確認後、これをｐＪＩＲ７５１のマルチクローニングサイトを目的に沿って変更したｐＪＩＲ７５１−ＭのＢａｍＨ１−Ｓａｌ１部位に連結することにより、図２に示すようにｐＪＩＲ７５１−ｈｙｄ−ｐｒｏを構築した。
【００６７】
次に、宿主に導入する構造遺伝子として、前記中温性嫌気性細菌クロストリジウム・ジョウスイ由来のセルラーゼＢ遺伝子及びセルラーゼＤ遺伝子、中温性嫌気性細菌ルミノコッカス・アルブス由来のエンドグルカナーゼＩ遺伝子を、それぞれ用いた。
【００６８】
セルラーゼＢ遺伝子については配列番号７に示す塩基配列の合成ｆｗｄ．プライマー及び配列番号８に示す塩基配列の合成ｒｅｖ．プライマーを、セルラーゼＤ遺伝子については配列番号９に示す塩基配列の合成ｆｗｄ．プライマー及び配列番号１０に示す塩基配列の合成ｒｅｖ．プライマーを、エンドグルカナーゼＩ遺伝子については配列番号１１に示す塩基配列の合成ｆｗｄ．プライマー及び配列番号１２に示す塩基配列の合成ｒｅｖ．プライマーを、それぞれ用いて各々の鋳型となる染色体ＤＮＡからＰＣＲ法にて増幅させた。
【００６９】
得られた３種のＤＮＡ断片を別個にｐＪＩＲ７５１−ｈｙｄ−ｐｒｏのＸｈｏ１−ＢｓｓＨ１部位にそれぞれ連結し、セルラーゼＢ遺伝子を発現可能なｐＪＩＲ７５１−ｈｙｄ−ｐｒｏ−ｃｅｌＢ、セルラーゼＤ遺伝子を発現可能なｐＪＩＲ７５１−ｈｙｄ−ｐｒｏ−ｃｅｌＤ、エンドグルカナーゼＩ遺伝子を発現可能なｐＪＩＲ７５１−ｈｙｄ−ｐｒｏ−ｅｇＩの各プラスミドを、図３に示すように、構築した。
【００７０】
これらの各プラスミドを、それぞれ、宿主微生物としての前記Ｍ株と共に適宜な媒体液中に懸濁させて冷却し、別途に予め冷却しておいた幅０．１ｃｍのジーンパルサー用キュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）に移し、同社製のジーンパルサーを用いて、４００Ω、０．５ｋＶ、２５μＦの条件でエレクトロポレーション法による遺伝子導入を行った。その際のパルス電圧の周波数と印加時間は、上記ジーンパルサーに組み込まれた設定に従った。
【００７１】
（実施例３−２：セルラーゼ活性の確認）
得られた３種類の組み換え微生物をそれぞれＧＳ培地（炭素源：１％Ｎ−アセチルグルコサミン）にて純粋培養し、それらの培養上清について、公知文献である「Ｓａｋｋａ，Ｋ．，Ｓｈｉｍａｎｕｋｉ，Ｔ．，ａｎｄＳｈｉｍａｄａ，Ｋ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅ０ｆｃｅｌＣ３０７ｅｎｃｏｄｉｎｇｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅＣ３０７ｏｆＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｐ．ＳｔｒａｉｎＦ１．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５５，３４７−３５０」を参照して、ＤＮＰ法により活性の確認を行った。その結果を表１に示す。
【００７２】
【表１】

なお、表１中において、セルラーゼＤ遺伝子を導入した組み換え微生物が殆ど活性を示していないが、セルラーゼには種々の作用機構のものが存在し、その内セルラーゼＤは、セルラーゼＢやエンドグルカナーゼＩに比較して、ＤＮＰ法による活性確認に用いたカルボキシメチルセルロースに対して活性を示し難いことが知られている。詳細は述べないが、これとは別に活性染色法による活性の確認も行っており、その結果では、セルラーゼＤ遺伝子を導入した組み換え微生物は、他の２種の組み換え微生物と同様にセルラーゼ活性が確認されている。
【００７３】
以上のように、３種類の組み換え微生物のいずれもが、グルコースのアナログとしてのＮ−アセチルグルコサミンの存在下でセルラーゼ活性を発現した。従って、これらの組み換え微生物は、カタボライト抑制を受けない遺伝子のプロモーター領域と連結されたセルロース分解酵素遺伝子を導入したことにより、易分解性であるグルコース、デンプン等が併存する条件下においても、セルロースの分解効率を有効に向上させ得ることが確認された。
【００７４】
〔実施例４：組み換え微生物の添加によるメタン発酵の促進〕
（実施例４−１：予備発酵工程としての水素発酵）
第１の水素発酵槽を準備した。この水素発酵槽においては通常のメタン発酵液１００ｍＬに対して、生ゴミ３０ｇと、上記３種の組み換え微生物をそれぞれ純粋培養したＧＳ培地の各１０ｍＬと、前記第６発明に係る「カタボライト抑制を受けないヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと含む嫌気性微生物」としてのクロストリジウム・パラプトリフィカムＭ株とを添加し、更に水道水を加えて、全量を２００ｍＬに調整した。これを３７°Ｃで２晩培養し、予備発酵工程としての水素発酵を行わせた。
【００７５】
上記とは別に、第２の水素発酵槽を準備した。この水素発酵槽においては通常のメタン発酵液１００ｍＬに対して生ゴミ３０ｇを添加し、更に水道水を加えて全量を２００ｍＬに調整した。これを３７°Ｃで２晩培養し、予備発酵工程としての水素発酵を行わせた。
【００７６】
両者の水素発酵槽において生成するガスを分析したところ、詳しいデータは示さないが、第１の水素発酵槽においては、第２の水素発酵槽に比較して、水素発生量が数％向上することが認められた。この点は、第１の水素発酵槽にクロストリジウム・パラプトリフィカムＭ株を添加した結果である、と考えられる。
【００７７】
一方、両者の水素発酵槽における固形残差（生ゴミ）の減少量には大きな差異が認められなかった。従って水素発酵の状態においては、セルロース分解酵素遺伝子を導入した組み換え微生物が必ずしも有効に機能していないと考えられる。但し、下記の実施例４−２の結果から、これがカタボライト抑制によるものとは考えられない。よって、セルロース分解酵素遺伝子を導入した組み換え微生物は、水素発酵槽に添加するのではなく、下記のメタン発酵液に添加する方が効率的である、とも考えられる。
【００７８】
又、水素発酵によって生成する各種の低分子有機酸はメタン発酵における良好な基質となるが、酢酸が特にメタン変換率が高く、好ましいと一般的に言われている。そして第１の水素発酵槽において生成した有機酸を分析したところ、酢酸の生成率が高かった。
【００７９】
（実施例４−２：組み換え微生物の添加によるメタン発酵への影響）
前記実施例２における、「メタン発酵液に対する予備発酵液の投入量が１００〜２００ｍＬ／Ｌ／４８時間である場合に最も活発なメタン発酵を期待できる」と言う知見に基づき、上記の予備発酵液の所定量を、本発酵液としてのメタン発酵液に投入した。
【００８０】
即ち、それぞれ１０湿重量％以下の生ゴミを添加した１０００ｍＬの通常のメタン発酵液を収容した２基のメタン発酵槽を準備した。そして、第１のメタン発酵槽には上記第１の水素発酵槽中の予備発酵液の全量を添加し、第２のメタン発酵槽には上記第２の水素発酵槽中の予備発酵液の全量を添加した。
【００８１】
そして第１及び第２のメタン発酵槽を３７°Ｃに維持し、それぞれメタン発酵を行わせて、実施例２と同様の方法で、経時的に総ガス発生量とメタンガス発生量とを測定した。それらの測定結果を図４及び図５に示す。
【００８２】
図４において、●でプロットする「改良前」とは第２のメタン発酵槽における成績を示し、▲でプロットする「組換え菌添加」とは第１のメタン発酵槽における成績を示す。両メタン発酵槽間に有意な総ガス発生量の差異が認められた。
【００８３】
図５において、「改良前」とは第２のメタン発酵槽における成績を示し、「組換え体」とは第１のメタン発酵槽における成績を示す。図５の下片における数字の表記は、予備発酵液添加後におけるメタン発酵の経過時間を示し、例えば図５の下片の左端に、縦方向に沿って「５」、「４」、「８」の数字が並んでいるのは、「５４８時間経過後」を意味する。図５によれば、両メタン発酵槽間に有意なメタンガス発生量の差異が認められた。
【００８４】
更に両メタン発酵槽における固形残差（生ゴミ）の分解率を分析したところ、メタン発酵開始後１２００時間経過時点において、第２のメタン発酵槽では約８０％であり、第１のメタン発酵槽では９０％以上であった。
【００８５】
（実施例４の評価）
▲１▼カタボライト抑制を受けない遺伝子のプロモーター領域と連結された状態でセルラーゼ遺伝子を導入した組み換え微生物を添加して、有機性廃棄物を嫌気的条件下に発酵させることの効果が確認された。
【００８６】
▲２▼その際、更に、カタボライト抑制を受けないヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと含む嫌気性微生物あるいは嫌気性組み換え微生物を添加することの効果が確認された。
【００８７】
▲３▼これらの発酵を、（Ａ）有機性廃棄物を嫌気的条件下に水素発酵させて、メタン発酵基質を豊富に含む予備発酵液を準備する予備発酵工程と、（Ｂ）予備発酵液の比較的少量を、予備発酵工程を経ていない多量のメタン発酵液に添加し、嫌気的条件下に高効率のメタン発酵を行わせる本発酵工程とに分けて行い、上記の組み換え微生物等をその少なくとも一方の工程において添加することの、特に好ましい効果が確認された。
【００８８】
▲４▼上記の（Ａ）予備発酵工程において上記ヒドロゲナーゼ遺伝子をそのプロモーター領域ごと含む嫌気性微生物等を添加し、（Ｂ）本発酵工程において上記のセルラーゼ遺伝子を導入した組み換え微生物を添加することの、とりわけ好ましい効果が確認された。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】実施例における本発酵液への予備発酵液の投入パターンを示す図である。
【図２】実施例におけるｐＪＩＲ７５１−ｈｙｄ−ｐｒｏの構築を示す図である。
【図３】実施例におけるｐＪＩＲ７５１−ｈｙｄ−ｐｒｏ−ｃｅｌＢ、ｐＪＩＲ７５１−ｈｙｄ−ｐｒｏ−ｃｅｌＤ、及びｐＪＩＲ７５１−ｈｙｄ−ｐｒｏ−ｅｇＩの構築を示す図である。
【図４】実施例における総ガス発生量の推移を示す図である。
【図５】実施例におけるメタンガス発生量の推移を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for anaerobic digestion of recombinant microorganisms and organic waste, more specifically, a recombinant microorganism into which a cellulolytic enzyme gene linked to a promoter region of a gene that is not subjected to catabolite suppression for anaerobic microorganisms, Further, the present invention relates to a method for anaerobic digestion of organic waste, in which the efficiency of decomposing cellulose is particularly improved by using such a recombinant microorganism.
[0002]
[Prior art]
In treating organic waste such as food waste and garbage discharged from households, etc., anaerobic digestion is possible because it can recover useful gases such as hydrogen gas from hydrogen fermentation and methane gas from methane fermentation. The method is preferably adopted, and various anaerobic digestion methods and treatment systems therefor have been proposed.
[0003]
[Patent Document 1] JP-A-8-182998
Patent Document 1 mentioned above discloses that digested sludge collected from a biological treatment tank (methane fermentation tank) is treated with an oil-containing medium under anaerobic conditions to separate and culture anaerobic lipolytic bacteria. A method for decomposing oil and fat in oil-containing wastewater, wherein the method is propagated in a methane fermentation tank into which oil-containing wastewater is charged.
[0004]
[Patent Document 2] JP-A-2002-273490
Patent Document 2 described above relates to an anaerobic digestion method in which organic waste is separated into liquid waste and organic sludge, and the organic sludge is introduced into an anaerobic digestion fermenter and methane fermentation is performed. Disclosed is a method for rapidly starting up anaerobic digestion without lowering the processing capacity of organic waste by increasing the activity of methane gasifiers by first injecting less readily degradable substances. .
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
In anaerobic digestion of organic waste, carbohydrates are decomposed into low-molecular organic acids and alcohols, and proteins are decomposed into amines and ammonia via organic acids. fermentation). The low-molecular-weight organic acid generated by such digestive fermentation is decomposed into methane and carbon dioxide by methane fermentation (hereinafter, methane fermentation in a narrow sense). The flora that performs such anaerobic digestion is a complex of hydrogen-producing bacteria that produce hydrogen and low-molecular-weight organic acids from organic matter, and methane-producing bacteria that eventually decompose them to methane, carbon dioxide, etc. Microflora.
[0006]
Cellulose-degrading bacteria in this microflora, in other words, bacteria that secrete cellulose-degrading enzymes such as cellulase and endoglucanase to degrade (decrease the molecular weight) of cellulose in organic waste are a category of hydrogen-producing bacteria. Although it is possible to divide the anaerobic digestive flora, there are the following problems.
[0007]
That is, organic waste such as garbage contains a large amount of easily decomposable glucose, starch, and the like together with cellulose that is hardly decomposable. In this case, a phenomenon known as "catabolite suppression" is observed. In other words, cellulolytic bacteria have the property of degrading readily degradable glucose, starch and the like, and producing cellulolytic enzymes only after these are depleted.
[0008]
For this reason, there has been a problem that the decomposition of cellulose, which is originally difficult to decompose, is further delayed, and the efficiency of the entire anaerobic digestion of organic waste is deteriorated. In order to solve such problems, for example, measures have been taken to grind the garbage in advance, to subject the garbage to alkali treatment, to add a predetermined enzyme, and the like. Was not always satisfactory.
[0009]
Therefore, the present invention is to solve the problem to be solved effectively in the anaerobic digestion of organic waste, to effectively improve the decomposition efficiency of cellulose even under conditions where glucose, starch, etc., which are easily decomposed, coexist in a large amount. I do.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
(Configuration of the first invention)
The first invention of the present application (the invention according to claim 1) for solving the above-mentioned problem is to introduce a cellulolytic enzyme gene linked to a promoter region of a gene not subject to catabolite suppression into an anaerobic microorganism. It is a recombinant microorganism.
[0011]
(Structure of the second invention)
According to a second aspect of the invention (an invention according to a second aspect) for solving the above-mentioned problem, the cellulose-degrading enzyme gene according to the first aspect is any one of the following (1) to (3). , A recombinant microorganism.
(1) Cellulase B gene derived from the mesophilic anaerobic bacterium Clostridium josui.
(2) Cellulase D gene derived from the mesophilic anaerobic bacterium Clostridium josui.
(3) Endoglucanase I gene derived from the mesophilic anaerobic bacterium Luminococcus albus.
[0012]
The nucleotide sequence of the cellulase B gene of (1) above is shown in SEQ ID NO: 1 together with the amino acid sequence of cellulase B, and the nucleotide sequence of the above cellulase D gene (2) is shown in SEQ ID NO: 2 together with the amino acid sequence of cellulase D. The nucleotide sequence of the endoglucanase I gene (3) is shown in SEQ ID NO: 3 together with the amino acid sequence of endoglucanase I in the sequence listing.
[0013]
(Structure of the third invention)
The configuration of the third invention of the present application (the invention according to claim 3) for solving the above-mentioned problem is that the anaerobic microorganism according to the first invention or the second invention is a Clostridium paraptorificum M strain, A recombinant microorganism wherein the promoter region is a promoter region of a hydrogenase gene derived from the M strain.
[0014]
The nucleotide sequence of the hydrogenase gene derived from the M strain is shown in SEQ ID NO: 4 together with its amino acid sequence. The base sequence of SEQ ID NO: 4 also includes the above-described promoter region (base numbers 1 to 465).
[0015]
(Structure of the fourth invention)
In order to solve the above-mentioned problem, a fourth invention (an invention according to claim 4) of the present invention is characterized in that an organic waste is fermented under anaerobic conditions by adding the recombinant microorganism according to the first invention. Anaerobic digestion of waste.
[0016]
(Structure of the fifth invention)
The configuration of the fifth invention of the present application (the invention described in claim 5) for solving the above-mentioned problem is that the recombinant microorganism according to the fourth invention is capable of encoding each of the genes (1) to (3) according to the second invention. An anaerobic digestion method for organic waste, which is one or more selected from three types of recombinant microorganisms introduced in a state linked to the promoter region of a gene not subject to catabolite suppression.
[0017]
(Structure of the sixth invention)
The structure of the sixth invention of the present application (the invention according to claim 6) for solving the above-mentioned problem is that the organic waste according to the fourth invention or the fifth invention further comprises a hydrogenase that is not subject to catabolite suppression. This is an anaerobic digestion method for organic waste, in which an anaerobic microorganism or an anaerobic recombinant microorganism containing a gene together with its promoter region is added.
[0018]
An example of the above "anaerobic microorganism containing a hydrogenase gene together with its promoter region" is Clostridium paraptorificum M strain. The "anaerobic recombinant microorganism containing a hydrogenase gene together with its promoter region" refers to a recombinant obtained by introducing a hydrogenase gene, which is not subject to catabolite suppression to an appropriate anaerobic microorganism, together with its promoter region. Recombinants in which a hydrogenase gene has been introduced into the above-described M strain using an appropriate vector and the like, and further the hydrogenase gene has been introduced together with its promoter region also fall under the category of "anaerobic recombinant microorganism containing a hydrogenase gene together with its promoter region".
[0019]
In addition, as an example of the above-mentioned "hydrogenase gene not subject to catabolite suppression", a hydrogenase gene derived from Clostridium paraptorificum M strain can be exemplified. The nucleotide sequence of the hydrogenase gene is shown in SEQ ID NO: 4 together with its amino acid sequence. The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 also contains the aforementioned promoter region (base numbers 1 to 465).
[0020]
(Structure of the seventh invention)
The configuration of the seventh invention of the present application (the invention described in claim 7) for solving the above-mentioned problem is that the fermentation according to any of the fourth invention to the sixth invention is performed by the following (A) preliminary fermentation step and B) Performed in two stages of the main fermentation step, and in that case, at least one step is selected from the recombinant microorganism according to the first invention or the second invention and the anaerobic microorganism or the anaerobic recombinant microorganism according to the sixth invention. An anaerobic digestion method of organic waste, wherein at least one microorganism is added.
(A) A preliminary fermentation step in which an organic waste is subjected to hydrogen fermentation under anaerobic conditions to prepare a preliminary fermentation solution rich in methane fermentation substrate.
(B) A main fermentation step in which a relatively small amount of the preliminary fermentation liquid is added to a large amount of methane fermentation liquid that has not been subjected to the preliminary fermentation step, and highly efficient methane fermentation is performed under anaerobic conditions.
[0021]
In the seventh invention, "hydrogen fermentation" and "methane fermentation" are distinguished as follows. That is, in the presence of a flora that performs normal anaerobic fermentation, if garbage in an amount of 10% by weight or more based on the amount of fermentation liquor is added, fermentation that produces relatively large amounts of hydrogen occurs. Is called "hydrogen fermentation". In addition, in the presence of the microflora that performs normal anaerobic fermentation, if garbage of less than 10% by weight (for example, about 4 to 5% by weight) is added to the amount of fermentation liquor, methane gas is relatively increased. The resulting fermentation occurs and is referred to in the present invention as "methane fermentation". Therefore, "methane fermentation liquor" refers to a fermentation liquor containing less than 10% by weight of organic waste relative to the amount of fermentation liquor.
(Configuration of the eighth invention)
The configuration of the eighth invention of the present application (the invention according to claim 8) for solving the above-mentioned problems is as follows: (A) The anaerobic microorganism or the anaerobic recombinant microorganism according to the sixth invention in the (A) preliminary fermentation step according to the seventh invention. Anaerobic organic waste, wherein at least one microorganism selected from the group consisting of the recombinant microorganisms according to the first or second invention is added in the (B) main fermentation step. Digestion method.
[0022]
[Action and Effect of the Invention]
(Operations and effects of the first invention)
Whether or not the expression of a gene is subject to catabolite repression will depend mainly on the promoter region of the gene. Therefore, if the cellulolytic enzyme gene is linked to the promoter region of a gene that has been confirmed not to undergo catabolite repression and is introduced into a host microorganism, the cellulolytic enzyme gene can be transfected without catabolite repression in the recombinant microorganism. It can be expressed to exert the cellulose decomposing ability.
[0023]
(Operation and effect of the second invention)
The type of the cellulolytic enzyme gene to be introduced into the recombinant microorganism of the first invention is arbitrary. For example, (1) a cellulase B gene derived from Clostridium josui, (2) a cellulase D gene derived from Clostridium josui, 3) Luminococcus albus-derived endoglucanase I gene and the like can be preferably exemplified.
[0024]
(Operation and Effect of Third Invention)
The anaerobic microorganism to be recombined in the first invention and the type of promoter region are arbitrary. For example, the promoter region is preferably a promoter region of a hydrogenase gene derived from a Clostridium paraptorificum M strain. be able to. In this case, since the promoter region derived from the above-mentioned Clostridium paraptorificum M strain is used, the M strain is particularly suitable as a host microorganism.
[0025]
(Operation and effect of the fourth invention)
According to the fourth invention, since the organic waste is fermented under anaerobic conditions by adding the recombinant microorganism according to the first invention, the organic waste contains a large amount of glucose and starch together with cellulose in the organic waste. Also, cellulolytic bacteria are not subject to catabolite suppression.
[0026]
As a result, cellulose, which is hardly degradable, is smoothly oligo- and mono-saccharified, and the produced glucose and the like are further rapidly converted into final products (target products) such as hydrogen gas and methane gas by hydrogen-producing bacteria and methane-producing bacteria. As a result, the efficiency of the entire anaerobic digestion of organic waste is improved.
[0027]
In addition, if the organic waste is in a liquid state with a large amount of water, if it is fermented in a fermenter as it is, the fermentation will be performed under anaerobic conditions. If the organic waste is insufficient in moisture, it is fermented under anaerobic conditions when fermented in a state of being immersed in water in a fermenter. If anaerobic conditions are required to be particularly thorough, for example, the air in the fermenter may be replaced with nitrogen gas or the like.
[0028]
(Function / Effect of Fifth Invention)
The recombinant microorganism to be added to the organic waste is a recombinant microorganism in which the cellulose degrading enzyme gene listed in (1) to (3) of the second invention is introduced in a state linked to the promoter region of a gene not subject to catabolite suppression. One or more of the three microorganisms are particularly preferred.
[0029]
(Operation and effect of the sixth invention)
As the recombinant microorganism to be added to the organic waste, in addition to one or more of the above three recombinant microorganisms, an anaerobic microorganism or anaerobic recombinant containing a hydrogenase gene not subject to catabolite suppression together with its promoter region Further use of microorganisms is more effective in promoting digestion of the whole organic waste.
[0030]
(Operation and effect of the seventh invention)
As described above, the anaerobic digestion of organic waste is performed by a flora mainly composed of hydrogen-producing bacteria and methane-producing bacteria. And since hydrogen-producing bacteria grow much faster than methane-producing bacteria, generally the hydrogen-producing flora becomes dominant and the pH drops extremely, and the methane-producing flora whose preferred pH is near neutrality Activity tends to be suppressed. In this regard, as in the seventh invention, the fermentation of the organic waste under anaerobic conditions is performed in two stages of the preliminary fermentation step (A) and the main fermentation step (B). Is preferred.
[0031]
In the preliminary fermentation step (A), hydrogen fermentation is performed by adding a predetermined amount or more of organic waste to the fermentation liquor as described above. According to this hydrogen fermentation, the activity of methane-producing bacteria is suppressed, but low-molecular-weight organic acids and the like (particularly, acetic acid is preferable), which are substrates of methane fermentation, are accumulated abundantly. Next, as the main fermentation step (B), a relatively small amount of the preliminary fermentation liquid according to the above (A) is applied to a large amount of the main fermentation liquid that has not undergone the preliminary fermentation step (the amount of organic waste is 10 wet (A methane fermentation liquor of less than 10% by weight) provides highly efficient methane fermentation under anaerobic conditions. Although the reason for this is not necessarily clear, it is thought to be related to the fact that low molecular weight organic acids and the like, which are substrates for methane fermentation, are supplied abundantly by the preliminary fermentation liquid.
[0032]
In the preliminary fermentation step (A) and / or the main fermentation step (B), the anaerobic digestion of the organic waste is performed more strongly by adding various recombinant microorganisms as described above. .
[0033]
(Operation and effect of the eighth invention)
As microorganisms to be added to the fermentation liquor, an anaerobic microorganism or an anaerobic recombinant microorganism containing a hydrogenase gene together with its promoter region in the preliminary fermentation step (A) is added, and the cellulolytic enzyme gene is added in the main fermentation step (B). It is particularly preferred to add one or more, especially all three, of the introduced recombinant microorganisms.
[0034]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Next, embodiments of the first to eighth inventions will be described. In the following, the term “the present invention” simply refers to the first to eighth inventions collectively.
[0035]
(Cellulase degrading enzyme gene)
The type of the cellulolytic enzyme gene introduced into the host microorganism in the present invention is arbitrary. Preferably, (1) the cellulase B gene derived from the mesophilic anaerobic bacterium Clostridium josui, (2) the cellulase D gene derived from the mesophilic anaerobic bacterium Clostridium josui, and (3) the derived from the mesophilic anaerobic bacterium Luminococcus albus. Any of the endoglucanase I genes is introduced.
[0036]
The strain of Clostridium josui has been deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology and the Patent Organism Depositary as FERM P-9684.
[0037]
[Promoter region]
The promoter region to be introduced into the host microorganism in connection with the cellulolytic enzyme gene is not limited as long as it is the promoter region of a gene that has been confirmed not to be subject to catabolite suppression, but is preferably Clostridium paraptolyticum M It is a promoter region of a hydrogenase gene derived from a strain.
[0038]
The promoter region of the hydrogenase gene derived from the M strain corresponds to the region of base numbers 1 to 465 in the base sequence of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, and a promoter region that strongly promotes the transcription of the hydrogenase gene without catabolite suppression. Has been confirmed. When a cellulolytic enzyme gene is linked to this promoter region, transcription of the cellulolytic enzyme gene is promoted, and expression of the cellulolytic enzyme gene is enhanced without being subjected to catabolite suppression.
[0039]
[Recombinant microorganism]
The recombinant microorganism of the present invention has a cellulolytic enzyme gene introduced into an anaerobic microorganism as a host, and the promoter region of a gene whose cellulolytic enzyme gene has been confirmed not to be subjected to catabolite suppression. It is introduced in conjunction with
[0040]
An anaerobic microorganism serving as a host is appropriately selected, and for example, an anaerobic bacterium is preferable. An example of a particularly preferred host is Clostridium paraptorificum M strain. This M strain has been deposited as FERM P-16390 with the Patent Organism Depositary of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
[0041]
In addition, among anaerobic bacteria, C. pasteurianum, Megasohaela elsdenii LC1, C.I. Acetobutyricum, is Methanobacterium ThermoautotrophicumderutaH etc. exemplified further, Desulfovibrio vulgaris Hildenborough, Desulfovibrio gigas, Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F, Desulfovibrio desulfuricans Norway, etc. Desulfovibrio desulfuricans ATCC27774 are exemplified.
[0042]
Examples of facultative anaerobic bacteria include Proteus mirabilis S503, Escherichia coli MRE600, and the like. Examples of the aerobic bacteria include Alcaligenes eutrophus H-16, Nocardia opaca, Paracoccus denitrificans, and the like.
[0043]
In producing a recombinant microorganism, the cellulolytic enzyme gene linked to the promoter region of a gene that is not subject to catabolite suppression can be directly introduced into a host microorganism, or incorporated into an appropriate vector considering compatibility with the host microorganism. Can also be introduced. In introducing these genes or recombinant vectors into a host microorganism, various known gene introduction methods such as a calcium treatment method, a gene injection (transfection) method, a particle gun method, and an electroporation method are optionally used. Can be.
[0044]
The above-mentioned recombinant vector may contain, in addition to the above-mentioned promoter region, a terminator region, various marker genes for selection of an antibiotic resistance gene and the like. Preferred specific examples of the vector include plasmid vectors such as pJIR751, pJIR750, and pJIR418.
[0045]
(Preferred embodiment of recombinant microorganism)
This time, as a preferred embodiment of the recombinant microorganism, a shuttle vector for introducing a cellulolytic enzyme gene into Clostridium paraptolyticum M strain was developed, and a predetermined promoter region and a cellulolytic enzyme gene were introduced by the shuttle vector. A recombinant microorganism was produced.
[0046]
That is, the multicloning site of the plasmid vector pJIR751 was modified and replaced with restriction enzyme sites EcoR1, BamH1, Sal1, Xho1, BssHI1, and HindIII in this order. This is called plasmid pJIR751-M. Then, the promoter region of the hydrogenase gene derived from the M strain was amplified by the PCR method, and ligated between the restriction enzyme sites BamH1-Sal1 of pJIR751-M. This is called pJIR751-hyd-pro.
[0047]
Further, between the restriction enzyme sites Xho1-BssHI1 of the thus constructed pJIR751-hyd-pro, the three types of cellulose-degrading enzyme genes (cellulase B gene, cellulase D gene, and endoglucanase I gene) according to the second invention are inserted. It was inserted after amplification by the PCR method. These were introduced into separate Clostridium paraptolyticum M strains by electroporation.
[0048]
(Anaerobic digestion of organic waste)
Anaerobic digestion of organic waste can occur spontaneously, unless the organic waste is subjected to particularly aerobic conditions. If the organic waste is in a liquid state with a large amount of water, it is fermented under anaerobic conditions if fermented in a fermenter as it is. If the organic waste is insufficient in moisture, it is fermented under anaerobic conditions when fermented in a state of being immersed in water in a fermenter. If anaerobic conditions are required to be particularly thorough, for example, the air in the fermenter may be replaced with nitrogen gas or the like.
[0049]
In order to perform anaerobic methane fermentation, a medium temperature fermentation method generally performed at about 37 ° C. and a high temperature fermentation method performed at about 55 ° C. are known. Anaerobic digestion of the organic waste of the present invention may be performed by a medium temperature fermentation method or a high temperature fermentation method. However, when Clostridium paraptorificum M strain is used as a host of the recombinant microorganism, the medium temperature fermentation method is appropriate because the optimal growth temperature is about 37 ° C., but the temperature range is about 20 to 45 ° C. Fermentation is also possible.
[0050]
In the method for anaerobic digestion of organic waste according to the present invention, the type of organic waste used is not limited. For example, garbage containing various ingredients discharged from homes, restaurants, hotel kitchens, etc., various agricultural wastes (for example, wastes containing cellulosic substances such as rice straw), grass cutting on river banks, etc. Generated vegetable wastes are included without limitation.
[0051]
In the present invention, these organic wastes are subjected to fermentation under anaerobic conditions with the addition of the above-mentioned recombinant microorganisms. As the recombinant microorganisms, it is preferable to add together one or more, particularly all three, of three types of recombinant microorganisms into which the respective genes (1) to (3) according to the second invention are introduced. . It is particularly preferable to further add an anaerobic microorganism or an anaerobic recombinant microorganism containing a hydrogenase gene which is not subject to catabolite suppression to the organic waste, together with its promoter region.
[0052]
In fermenting organic waste under anaerobic conditions, the organic waste itself usually has a flora capable of performing anaerobic fermentation to some extent, apart from recombinant microorganisms to be added. However, it is also preferable to separately prepare an appropriate flora having good methane fermentation performance and add it to organic waste.
[0053]
[Two-stage anaerobic digestion method]
It is particularly preferable that the anaerobic digestion of the organic waste is performed in the following two stages: (A) a preliminary fermentation step and (B) a main fermentation step. At this time, at least one of the recombinant microorganisms or the like according to the first invention, the second invention or the sixth invention to be added is added in at least one of the steps (A) and (B). It is particularly preferable to add (A) an anaerobic microorganism or an anaerobic recombinant microorganism containing a hydrogenase gene together with its promoter region in the preliminary fermentation step, and (B) one of the recombinant microorganisms into which the cellulolytic enzyme gene has been introduced in the main fermentation step. The above (more preferably all three) are added.
[0054]
(A) Preparing a preliminary fermentation liquor rich in methane fermentation substrate by adding organic waste to the fermentation liquor in an amount of 10% by weight or more relative to the fermentation liquor to cause hydrogen fermentation mainly under anaerobic conditions. Fermentation process.
[0055]
(B) A main fermentation step in which a relatively small amount of a pre-fermentation liquid is added to a large amount of a methane fermentation liquid that has not been subjected to the pre-fermentation step, and highly efficient methane fermentation is performed under anaerobic conditions.
[0056]
The time to round up the preliminary fermentation step can be determined as appropriate based on, for example, the amount of hydrogen gas or the like generated during the hydrogen fermentation in the preliminary fermentation step, the concentration of the accumulated organic acid, and the like. The input amount of the preliminary fermentation liquid to the main fermentation step may be a relatively small amount, but a lab-scale experiment is performed in advance to grasp the methane fermentation state in the main fermentation step, and based on this, the preliminary fermentation liquid is May be determined.
[0057]
【Example】
[Example 1: Preparation of methane fermentation flora and garbage sample]
As the flora of the methane fermentation flora, as long as the recombinant microorganism according to the present invention is stably maintained and established, paddy soil, seabed sludge, the flora of an existing methane fermentation tank and the like can be used arbitrarily. This time, we used the methane fermentation flora owned by Mr. Ishida who lives in Suzuka City, Mie Prefecture.
[0058]
As the raw garbage sample, ordinary raw garbage, which is mixed with carbohydrate properties (cereals, vegetables, etc.), protein (fish meat, livestock meat, etc.), lipid residues, cooking waste, etc., was collected. Then, after pulverizing them using a commercially available disposer, a solid obtained by centrifugation (10000 × g, 10 minutes) was used.
[0059]
[Example 2: Search for methane fermentation conditions]
First, good conditions for methane fermentation from garbage were searched for under the conditions in which no recombinant microorganisms were added, as follows.
[0060]
100 g (wet weight) of garbage was added to 1000 mL of a normal anaerobic fermentation liquid, and hydrogen fermentation was performed as a pre-fermentation step to prepare a pre-fermentation liquid. Next, this preliminary fermentation liquid was intermittently charged into 1000 mL of methane fermentation liquid into which garbage of 10% by weight or less was charged according to the charging pattern shown in FIG.
[0061]
That is, FIG. 1 shows the elapsed time after the start of the above-mentioned methane fermentation on the horizontal axis. During the first period shown by the arrow 1 in the figure, as the adaptation period, once every 48 hours, within a range of 10 to 50 mL. While gradually increasing the volume of the supernatant, a predetermined amount of the supernatant of the methane fermentation liquid was withdrawn, and the same amount of the preliminary fermentation liquid was charged. Next, during the second period indicated by the arrow 2 in the figure, 100 mL of the supernatant of the methane fermentation liquid was withdrawn once every 48 hours, and the same amount of the preliminary fermentation liquid was charged. During the third period indicated by arrow 3 in the figure, 150 mL of the supernatant of the methane fermentation liquid was withdrawn once every 48 hours, and the same amount of the preliminary fermentation liquid was charged. During the fourth period indicated by arrow 4 in the figure, 200 mL of the supernatant of the methane fermentation liquid was withdrawn once every 48 hours, and the same amount of the preliminary fermentation liquid was charged.
[0062]
In FIG. 1, the vertical axis shows the total amount of gas generated per hour from the entire methane fermentation liquid. It is considered that the graph showing the total gas generation amount fluctuates greatly up and down due to the above-mentioned intermittent input of the preliminary fermentation liquid. The total gas generation amount was measured by a wet gas meter W-NK Da-0.5A manufactured by Shinagawa Corporation. Further, the gas composition was examined by gas chromatography or the like, and it was found that methane gas, hydrogen gas, carbon dioxide and the like were contained.
[0063]
According to FIG. 1, the total gas generation amount recorded the highest value during the second period, and there is no great difference from the subsequent third and fourth periods. Therefore, it was found that the most active gas generation (methane fermentation) can be expected when the input amount of the preliminary fermentation liquid to the methane fermentation liquid is approximately “100 to 200 mL / L / 48 hours”.
[0064]
[Example 3: Production of recombinant microorganism]
(Example 3-1: Construction of plasmid and gene transfer)
Basic genetic manipulation is described in Maniatis, E .; F. Fritsch, J .; Performed according to Sambrook, "Molecular Cloning" (1982). Clostridium paraptorificum M strain was used as a host. The vector for gene transfer used was pJIR751, a shuttle vector provided by Julian I. Rude of Monash University, Australia. It is a shuttle vector containing the erythromycin resistance gene and effective between E. coli, Bacillus subtilis, and Clostridium acetobutylicum.
[0065]
By the way, in the above-mentioned M strain, in order to express a gene derived from a heterologous microorganism using the vector pJIR751, it is necessary to change the promoter controlling expression to that derived from the M strain. For the purpose of the present invention, it is desirable to set a promoter region of a gene that is not subject to catabolite suppression in this vector pJIR751. As a promoter for this purpose, the promoter region of the hydrogenase gene derived from the M strain was used.
[0066]
This promoter portion was synthesized with the synthetic fwd. Synthesis of primer and base sequence shown in SEQ ID NO: 6 rev. Amplification was performed by PCR from the template DNA using primers, and after confirming the obtained base sequence of about 400 base pairs, the BamH1-Sal1 site of pJIR751-M was modified by changing the multicloning site of pJIR751 according to the purpose. As shown in FIG. 2, pJIR751-hyd-pro was constructed.
[0067]
Next, as the structural genes to be introduced into the host, the cellulase B gene and cellulase D gene derived from the mesophilic anaerobic bacterium Clostridium josui and the endoglucanase I gene derived from the mesophilic anaerobic bacterium Luminococcus albus were used, respectively. .
[0068]
Regarding the cellulase B gene, a synthetic fwd. Synthesis of primer and base sequence shown in SEQ ID NO: 8 rev. The primer was used as the synthetic fwd. Base sequence represented by SEQ ID NO: 9 for the cellulase D gene. Synthesis of primer and base sequence shown in SEQ ID NO: 10 rev. The primer was used for the synthesis of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 for the endoglucanase I gene. Synthesis of primer and base sequence shown in SEQ ID NO: 12 rev. Primers were used to amplify each template from chromosomal DNA as a template by PCR.
[0069]
The obtained three types of DNA fragments were separately ligated to the Xho1-BssH1 site of pJIR751-hyd-pro, respectively, to express pJIR751-hyd-pro-celB capable of expressing cellulase B gene and pJIR751- capable of expressing cellulase D gene. Hyd-pro-celD and pJIR751-hyd-pro-egI plasmids capable of expressing the endoglucanase I gene were constructed as shown in FIG.
[0070]
Each of these plasmids was suspended in an appropriate medium solution together with the M strain as a host microorganism, cooled, and then separately cooled in a 0.1 cm-wide cuvette for Gene Pulser (Bio-Rad). And gene transfer was performed by electroporation under the conditions of 400Ω, 0.5 kV, and 25 μF using Gene Pulser manufactured by the company. The frequency and application time of the pulse voltage at that time were in accordance with the settings incorporated in the Gene Pulser.
[0071]
(Example 3-2: Confirmation of cellulase activity)
The resulting three types of recombinant microorganisms were each purely cultured in a GS medium (carbon source: 1% N-acetylglucosamine), and the culture supernatants thereof were disclosed in the known literature “Sakka, K., Shimanuki, T .; , And Shimada, K. (1991) Nucleotide sequence 0f celC307 encoding endoglucanase C307 of Clostridium sp. Table 1 shows the results.
[0072]
[Table 1]

In Table 1, the recombinant microorganism into which the cellulase D gene has been introduced shows almost no activity. However, cellulases have various action mechanisms, of which cellulase D is a cellulase B or endoglucanase I. In comparison, it is known that the carboxymethylcellulose used for confirming the activity by the DNP method has less activity. Although not described in detail, the activity was also confirmed separately by an activity staining method. As a result, the cellulase activity of the recombinant microorganism into which the cellulase D gene was introduced was confirmed in the same manner as the other two recombinant microorganisms. Have been.
[0073]
As described above, all three types of recombinant microorganisms expressed cellulase activity in the presence of N-acetylglucosamine as a glucose analog. Therefore, these recombinant microorganisms, by introducing a cellulolytic enzyme gene linked to the promoter region of a gene that is not subject to catabolite suppression, even under conditions in which glucose, starch, etc., which are easily degradable, coexist in cellulose. It was confirmed that the decomposition efficiency could be effectively improved.
[0074]
[Example 4: Promotion of methane fermentation by addition of recombinant microorganism]
(Example 4-1: Hydrogen fermentation as preliminary fermentation step)
A first hydrogen fermenter was prepared. In this hydrogen fermenter, 30 g of garbage and 10 mL of each of the GS media in which the above three kinds of recombinant microorganisms were pure-cultured with respect to 100 mL of a normal methane fermentation liquor were subjected to the “catabolite suppression” according to the sixth invention. An anaerobic microorganism containing no hydrogenase gene together with its promoter region "was added, and the total amount was adjusted to 200 mL by adding tap water. This was cultured at 37 ° C. for 2 nights, and hydrogen fermentation was performed as a preliminary fermentation step.
[0075]
Separately from the above, a second hydrogen fermenter was prepared. In this hydrogen fermentation tank, 30 g of garbage was added to 100 mL of ordinary methane fermentation liquid, and tap water was further added to adjust the total amount to 200 mL. This was cultured at 37 ° C. for 2 nights, and hydrogen fermentation was performed as a preliminary fermentation step.
[0076]
When the gas generated in both hydrogen fermenters is analyzed, detailed data is not shown, but the amount of hydrogen generated in the first hydrogen fermenter is several% higher than that in the second hydrogen fermenter. Was observed. This is considered to be the result of the addition of Clostridium paraptorificum M strain to the first hydrogen fermenter.
[0077]
On the other hand, no significant difference was observed in the amount of reduction in solid residue (garbage) in both hydrogen fermenters. Therefore, it is considered that in the state of hydrogen fermentation, the recombinant microorganism into which the cellulolytic enzyme gene has been introduced does not always function effectively. However, from the results of Example 4-2 below, it is not considered that this is due to catabolite suppression. Therefore, it is considered that it is more efficient to add the recombinant microorganism into which the cellulolytic enzyme gene has been introduced to the following methane fermentation solution, instead of adding it to the hydrogen fermenter.
[0078]
Also, various low molecular organic acids produced by hydrogen fermentation are good substrates in methane fermentation, but acetic acid is generally said to be particularly preferable because of its high methane conversion rate. And when the organic acid produced | generated in the 1st hydrogen fermentation tank was analyzed, the production rate of acetic acid was high.
[0079]
(Example 4-2: Effect on methane fermentation by addition of recombinant microorganism)
Based on the finding in Example 2 that "the most active methane fermentation can be expected when the input amount of the preliminary fermentation liquid to the methane fermentation liquid is 100 to 200 mL / L / 48 hours", the above preliminary fermentation liquid is used. Was charged into a methane fermentation broth as a main fermentation broth.
[0080]
That is, two methane fermentation tanks each containing 1000 mL of ordinary methane fermentation liquid to which garbage of 10% by weight or less was added were prepared. Then, the entire amount of the preliminary fermentation liquid in the first hydrogen fermentation tank is added to the first methane fermentation tank, and the total amount of the preliminary fermentation liquid in the second hydrogen fermentation tank is added to the second methane fermentation tank. Was added.
[0081]
Then, the first and second methane fermentation tanks were maintained at 37 ° C., and methane fermentation was performed, respectively, and the total gas generation amount and the methane gas generation amount were measured with time in the same manner as in Example 2. . The measurement results are shown in FIGS.
[0082]
In FIG. 4, “before improvement” plotted with ● indicates the results in the second methane fermentation tank, and “addition of recombinant bacteria” plotted with ▲ indicates the results in the first methane fermentation tank. A significant difference in total gas generation between the two methane fermenters was observed.
[0083]
In FIG. 5, “before improvement” indicates the results in the second methane fermentation tank, and “recombinant” indicates the results in the first methane fermentation tank. The numerical notation in the lower part of FIG. 5 indicates the elapsed time of the methane fermentation after the addition of the pre-fermented liquid, and for example, “5”, “4”, “8” at the left end of the lower part of FIG. "" Means "after 548 hours". According to FIG. 5, a significant difference in the amount of methane gas generated between the two methane fermentation tanks was recognized.
[0084]
Further, when the decomposition rate of solid residue (garbage) in both methane fermentation tanks was analyzed, it was about 80% in the second methane fermentation tank after 1200 hours from the start of methane fermentation. Was 90% or more.
[0085]
(Evaluation of Example 4)
{Circle around (1)} The effect of adding a recombinant microorganism into which a cellulase gene has been introduced in a state linked to the promoter region of a gene not subject to catabolite suppression and fermenting organic waste under anaerobic conditions was confirmed.
[0086]
{Circle around (2)} At that time, the effect of adding an anaerobic microorganism or an anaerobic recombinant microorganism containing a hydrogenase gene not subject to catabolite suppression together with its promoter region was confirmed.
[0087]
{Circle around (3)} These fermentations are performed by (A) hydrogen fermentation of organic waste under anaerobic conditions to prepare a pre-fermentation liquid rich in methane fermentation substrate, and (B) a pre-fermentation liquid. Is added to a large amount of methane fermentation solution that has not been subjected to the preliminary fermentation step, and is separately performed from the main fermentation step of performing methane fermentation with high efficiency under anaerobic conditions. A particularly favorable effect of adding in at least one step was confirmed.
[0088]
(4) adding (A) an anaerobic microorganism containing the hydrogenase gene together with its promoter region in the preliminary fermentation step, and (B) adding a recombinant microorganism having the cellulase gene introduced in the main fermentation step. Particularly favorable effects were confirmed.
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a pattern of feeding a preliminary fermentation liquid to a main fermentation liquid in an example.
FIG. 2 is a diagram showing the construction of pJIR751-hyd-pro in Examples.
FIG. 3 shows the construction of pJIR751-hyd-pro-celB, pJIR751-hyd-pro-celD, and pJIR751-hyd-pro-egI in Examples.
FIG. 4 is a diagram showing a transition of a total gas generation amount in the embodiment.
FIG. 5 is a diagram showing a transition of a methane gas generation amount in the embodiment.

Claims

A recombinant microorganism obtained by introducing a cellulolytic enzyme gene linked to a promoter region of a gene not subject to catabolite suppression to an anaerobic microorganism.

The recombinant microorganism according to claim 1, wherein the cellulolytic enzyme gene is any one of the following (1) to (3).
(1) Cellulase B gene derived from the mesophilic anaerobic bacterium Clostridium josui.
(2) Cellulase D gene derived from the mesophilic anaerobic bacterium Clostridium josui.
(3) Endoglucanase I gene derived from the mesophilic anaerobic bacterium Luminococcus albus.

2. The anaerobic microorganism is Clostridium paraputrificum strain M (FERM P-16390), and the promoter region is a promoter region of a hydrogenase gene derived from the M strain. Or the recombinant microorganism according to claim 2.

An anaerobic digestion method for organic waste, comprising adding the recombinant microorganism according to claim 1 to ferment the organic waste under anaerobic conditions.

One kind selected from three kinds of recombinant microorganisms, wherein the recombinant microorganism is introduced with each of the genes (1) to (3) according to claim 2 linked to a promoter region of a gene not subject to catabolite suppression. 5. The method for anaerobic digestion of organic waste according to claim 4, wherein the method is at least two types.

The anaerobic microorganism or the anaerobic recombinant microorganism containing a hydrogenase gene not subject to catabolite suppression together with its promoter region to the organic waste is further added to the organic waste. Anaerobic digestion of organic waste.

3. The recombinant microorganism according to claim 1 or 2, wherein the fermentation is performed in the following two stages of (A) a preliminary fermentation step and (B) a main fermentation step. The anaerobic digestion of organic waste according to any one of claims 4 to 6, wherein at least one microorganism selected from the group consisting of anaerobic microorganisms and anaerobic recombinant microorganisms according to item 6 is added. Method.
(A) A preliminary fermentation step in which an organic waste is subjected to hydrogen fermentation under anaerobic conditions to prepare a preliminary fermentation solution rich in methane fermentation substrate.
(B) A main fermentation step in which a relatively small amount of the preliminary fermentation liquid is added to a large amount of methane fermentation liquid that has not been subjected to the preliminary fermentation step, and highly efficient methane fermentation is performed under anaerobic conditions.

In the (A) preliminary fermentation step, at least one microorganism selected from the anaerobic microorganisms or the anaerobic recombinant microorganisms according to claim 6 is added, and in the (B) main fermentation step, the microorganism is added to the (1) or (2). The method for anaerobic digestion of organic waste according to claim 7, wherein at least one microorganism selected from the above-mentioned recombinant microorganisms is added.