JP2004205481A

JP2004205481A - Method for manufacturing particle for diagnostic product

Info

Publication number: JP2004205481A
Application number: JP2003077547A
Authority: JP
Inventors: Ichiro Ozaki; 一郎尾崎; Satoshi Katayose; 聡片寄; Mikio Hikata; 幹雄日方; Kakun Han; 可君范; Mitsuhiro Murata; 充弘村田
Original assignee: JSR Corp
Current assignee: JSR Corp
Priority date: 2002-03-25
Filing date: 2003-03-20
Publication date: 2004-07-22
Anticipated expiration: 2023-03-20
Also published as: JP3738847B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for manufacturing particles for diagnostic products capable of easily and efficiently preparing the particles for the diagnostic products having a uniform particle diameter in which magnetic particulates do not come off or substances such as iron ions derived from magnetic components do not elute. <P>SOLUTION: The method of this invention for manufacturing the particles for the diagnostic products includes a process for forming a polymer layer on a magnetic layer by polymerization in the presence of base particles. In the base particles, magnetic layers are formed on the surfaces of nucleus particles. The magnetic layer contains at least either Fe<SB>2</SB>O<SB>3</SB>or Fe<SB>3</SB>O<SB>4</SB>. The average particle diameter of the nucleus particles is 0.4-200 μm. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生化学・医薬品分野での診断薬用粒子の製造方法に関する。
【０００２】
【背景技術】
粒子径分布が比較的均一でかつ磁性体を複合化させる粒子の製造法としては、モノマーに磁性体を分散させその存在下で懸濁重合もしくはミニエマルジョン重合を行い、磁性体を粒子内に取り込ませ、この粒子をさらに分級する方法がある。しかし、この方法では、重合終了時に得られた粒子の粒子径分布は非常に広く、複数回の分級を繰り返さなければ目的の均一な粒子径を得ることができず、さらに分級を繰り返すことにより収量が減る結果となり、作業効率、収率のバランスに欠ける。また、水中で粒子上に金属化合物を析出させる方法として、Ｆｅ塩を中和し、水酸化鉄としてＮＨ_２、ＮＯ_２基を持つ多孔粒子に析出させて酸化する方法（特公平５−１０８０８号公報）が提案されている。しかし、この方法は、製造工程が極めて煩雑でありかつ大量生産には不適切であった。また、ヘテロ凝集を利用する方法（米国特許第５，６４８，１２４号）が提案されている。しかし、この方法では、反対電荷物質投入時の凝集コントロールが困難であり、複合化を優先させるために多くの場合凝集反応が過剰となるため、できあがった粒子は再分散が困難な程度にまで凝集体を形成しており、粒子径の均一性に欠ける。さらに、ポリマーコア粒子表面において、モノマーと磁気的に応答する金属酸化物を同時に重合させてポリマー粒子に磁性体を導入する方法（特許第２７３６４６７号公報）が提案されている。しかし、この方法では、磁性体導入後の粒子は完全にポリマーコートされておらず、粒子表面に磁性体が存在している構造であることから、磁性体の脱落、鉄イオンなどの磁性体成分に由来する物質の溶出などの問題があった。この問題は、該粒子を診断薬用の担体に用いたときに特に悪影響として働くことが知られている。生化学分野の分析方法である酵素免疫測定法（ＥＩＡ：ＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）において、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）のようなある種の発色基質を測定に用いた場合、Ｆｅが干渉物質として働き、測定のバックグランドを押し上げて測定値を誤らせる原因となることが報告されている。（Ｒｅｖ．ｅｓｐ．Ｆｉｓｉｏｌ．，４５（１），４１‐４６，１９８９）そこで、表面に磁性体が存在せず、磁性体の脱離、鉄イオンの溶出などの問題のない、ＥＩＡ法などの診断薬用担体としても利用可能な磁性粒子が望まれていた。
【０００３】
【特許文献１】
特許第２７３６４６７号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、磁性体の脱落、鉄イオンなどの磁性体成分に由来する物質の溶出がなく、均一粒子径を有した診断薬用粒子を簡便かつ効率的に製造することを目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の診断薬用粒子の製造方法は、核粒子の表面に磁性体層が形成された母粒子であって、該磁性体層は、Ｆｅ_２Ｏ_３およびＦｅ_３Ｏ_４の少なくとも一方を含み、該核粒子の平均粒子径が０．４〜２００μｍである該母粒子の存在下で重合により該磁性体層上にポリマー層を形成する工程を含む。
【０００６】
本発明で使用する核粒子は、基本的に非磁性物質であり、有機物質および無機物質のいずれも使用可能であり、診断薬用粒子の使用目的などによって適宜選択することができる。
【０００７】
有機物質の代表例としては、例えばポリマーを挙げることができる。かかるポリマーとしては、特に、ビニル系ポリマーが好ましく、その製造に使用するビニル系モノマーとしては、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレン、ジビニルベンゼンなどの芳香族ビニル単量体、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニルなどのビニルエステル類、アクリロニトリルなどの不飽和ニトリル、メチルアクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ラウリルアクリレート、ラウリルメタクリレート、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレートなどのエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステルなどを例示することができる。このビニル系ポリマーは単独重合体であっても、あるいは上記ビニル系モノマーから選ばれた２種以上のモノマーからなる共重合体であってもよい。また、上記ビニル系モノマーとブタジエン、イソプレンなどの共役ジオレフィン、アクリル酸、メタクリル酸、アクリルアミド、メタクリルアミド、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ジアリルフタレート、アリルアクリレート、アリルメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレートなどの共重合可能なモノマーとの共重合体も使用することができる。
【０００８】
上述した特定範囲の平均粒子径を有する核粒子としてのポリマー粒子は、例えば上記のビニル系モノマーの懸濁重合、あるいはポリマーバルクの粉砕によって得ることもできる。均一な粒子径を有する核粒子の作製法としては、特公昭５７−２４３６９号公報記載の膨潤重合法、ジャーナルオブポリマーサイエンスポリマーレターエディション（Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，ＰｏｌｙｍｅｒＬｅｔｔｅｒＥｄ．）記載の重合方法、あるいは本発明者らが先に提案した重合方法（特開昭６１−２１５６０２号、同６１−２１５６０３号、同６１−２１５６０４号）によって容易に製造することができる。
【０００９】
本発明で使用する核粒子の平均粒子径は、０．４〜２００μｍ、好ましくは０．８〜１００μｍ、さらに好ましくは１．０〜５０μｍである。核粒子のＣＶ（ＣｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｆＶａｒｉａｔｉｏｎ）値は、２０％以下、好ましくは１５％以下、より好ましくは１０％以下である。核粒子の平均粒子径が１μｍ未満では、たとえば粒子の高速撹拌による衝突エネルギーが不十分で磁性体微粒子の吸着が困難になる。一方、核粒子の平均粒子径が２００μｍを超えると、微粒子としての特性が失われてしまう。また、ＣＶ値が上記範囲をはずれると、得られる磁性体複合粒子の粒子径の均一性が不十分となる。
【００１０】
本発明において核粒子の材質は、複合化の際の加工性、軽量性の観点からポリマーなどの有機物質が好ましい。なお、本発明における平均粒子径および粒子径分布は、電子顕微鏡写真上にて１００個の粒子の粒子径を無作意に測定して求めたものである。
【００１１】
本発明で使用する磁性体層を構成する磁性体微粒子としては、酸化鉄系の物質が代表的であり、ＭｎＦｅ_２Ｏ_４（Ｍｎ＝Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｌｉ_０．５Ｆｅ_０．５等）で表現されるフェライト、Ｆｅ_３Ｏ_４で表現されるマグネタイト、あるいはγ−Ｆｅ_２Ｏ_３が挙げられ、飽和磁化が強く、かつ残留磁化が少ないγ−Ｆｅ_２Ｏ_３およびＦｅ_３Ｏ_４のいずれか一方を含むことが必要である。
【００１２】
本発明で使用する磁性体微粒子の平均粒子径は、好ましくは核粒子の平均粒子径の１／５以下であり、より好ましくは１／１０以下であり、さらに好ましくは１／２０以下である。磁性体微粒子の平均粒子径が核粒子の平均粒子径の１／５を超えると核粒子表面に均一かつ十分な厚みを持った被覆層を形成することができにくい。
【００１３】
本発明での核粒子と磁性体微粒子との比（核粒子：磁性体微粒子）は、重量比で９５：５〜２０：８０が好ましい。磁性体微粒子がこの範囲の量より少ないと、複合化効果が少なくなる。磁性体微粒子がこの範囲の量より多いと、核粒子の対する量が過剰となり、複合化されない磁性体微粒子が多くなる。
【００１４】
本発明で使用する磁性体微粒子は、核粒子と後工程で使用する単量体モノマーとの親和性、相溶性との観点から表面が疎水化されたものが望ましい。磁性体微粒子の表面の疎水化処理方法としては、磁性体微粒子と極めて親和性の高い部分と疎水性の部分とを分子内に有する化合物を磁性体微粒子に接触させて結合させる方法を挙げることができる。このような親和性の高い部分と疎水性の部分とを分子内に有する化合物としては、シランカップリング剤に代表されるシラン化合物を挙げることができる。
シラン化合物により磁性体微粒子を疎水化することによって、薬品耐性、特にアルカリ耐性に優れ、診断薬として使用中に磁性体微粒子が核粒子から剥離し磁気性能が低下する問題、あるいは脱離した磁性体微粒子が診断薬反応液中に浮遊する事により生じる汚染物混入を効果的に防止することができる。
本発明においては、疎水化された磁性体微粒子が、たとえばトルエンに良好に分散することができる場合に、十分に疎水化されているということができる。
【００１５】
シランカップリング剤に代表されるシラン化合物としては、ビニルトリクロロシラン、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリス（β−メトキシエトキシ）シラン、β−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、γ−グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン、γ−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−β（アミノエチル）−γ−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−β（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、ドデシルトリメトキシシラン、ヘキシルトリメトキシシラン、メチルトリメトキシシラン、メチルトリエトキシシラン、フェニルトリメトキシシラン、ドデシルトリクロロシラン、ヘキシルトリクロロシラン、メチルトリクロロシラン、フェニルトリクロロシランなどがある。
【００１６】
これらのシラン化合物を磁性体微粒子に結合させる方法としては、例えば、磁性体微粒子と、シラン化合物とを水などの無機媒質またはアルコール、エーテル、ケトン、エステルなどの有機媒質中で混合し、撹拌しながら加熱した後、磁性体微粒子をデカンテーションなどにより分離して減圧乾燥により無機媒質または有機媒質を除去する手段を挙げることができる。また、磁性体微粒子とシラン化合物とを直接混合し加熱させて両者を結合させてもよい。これらの手段において、加熱温度は通常３０〜１００℃であり、加熱温度は０．５〜２時間程度である。また、シラン化合物の使用量は、磁性体微粒子の表面積によって適宜定められているが、通常磁性体微粒子１００重量部に対して１〜５０重量部、好ましくは２〜３０重量部である。
【００１７】
本発明において核粒子の表面に磁性体微粒子の被覆する磁性体層を形成するには、先ず核粒子と磁性体微粒子とを混合し、核粒子の表面に磁性体微粒子を物理的に吸着させる。本発明で述べる物理的吸着法とは、化学反応を伴わない吸着法、結合法を指すものである。
【００１８】
核粒子の表面に磁性体微粒子を吸着させるには、物理的に強い力を外部から加えることにより複合化を実現させる方法も有効である。例えば乳鉢、自動乳鉢、ボールミル、ブレード加圧式粉体圧縮法、メカノフュージョン法のようなメカノケミカル効果を利用するもの、あるいはジェットミル、ハイブリダイザーなど高速気流中衝撃法を利用するものが挙げられる。
効率よくかつ強固に複合化を実施するには物理的吸着力が強いことが望ましい。その方法としては攪拌翼付き容器中で攪拌翼の周速度が好ましくは１５ｍ／秒以上、より好ましくは３０ｍ／秒以上、さらに好ましくは４０〜１５０ｍ／秒で実施することが挙げられる。撹拌翼の周速度が１５ｍ／秒より低いと、被覆層を形成する十分なエネルギーを得ることができないことがある。なお、撹拌翼の周速度の上限については、特に制限はないが、使用する装置、エネルギー効率などの点から自ずと決定される。
本発明において、核粒子の表面に形成された磁性体層の厚さは０．００５〜２０μｍ、好ましくは０．０１〜５μｍであり、厚みは均一であることが好ましい。磁性体層の厚さが、０．００５μｍより小さい場合、磁性体含有量が小さくなり、充分な磁気分離性が得られず、２０μｍを超える場合は、磁性体層の強度が低下し、磁性体層がこわれるおそれがある。
また、核粒子の表面は完全に磁性体層で被覆されていることが好ましく、核粒子表面の少なくとも９０％以上は磁性体層で被覆されていることが必要である。
【００１９】
次に、上記のようにして製造された母粒子の表面に形成するポリマー層（以下、「第１コーティングポリマー層」ともいう）について述べる。
【００２０】
かかるポリマー層は、母粒子の存在下で、主原料としての共重合性モノマーと、副原料である重合開始剤、乳化剤、分散剤、界面活性剤、電解質、架橋剤、分子量調節剤などが必要に応じて添加され液体中で重合を行うことにより形成される。このようにポリマー層を重合によって形成することにより、当該ポリマー層の表面に所望の官能基を導入することができるなど、表面加工性にすぐれる。
【００２１】
ポリマー層の成分としては特に、ビニル系ポリマーが好ましく、その製造に使用するビニル系モノマーとしては、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレン、ジビニルベンゼンなどの芳香族ビニル単量体、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニルなどのビニルエステル類、アクリロニトリルなどの不飽和ニトリル、メチルアクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ラウリルアクリレート、ラウリルメタクリレート、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレートなどのエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステル、アクロレインなどを例示することができる。このビニル系ポリマーは単独重合体であっても、あるいは上記ビニル系モノマーから選ばれた２種以上のモノマーからなる共重合体であってもよい。
【００２２】
また、上記ビニル系モノマーとブタジエン、イソプレンなどの共役ジオレフィン、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、無類マレイン酸、クロトン酸などのモノまたはジカルボン酸化合物、アクリルアミド、メタクリルアミド、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロールモノアクリレート、グリセロールモノメタクリレート、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、連鎖数２〜４０のポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、ジアリルフタレート、アリルアクリレート、アリルメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、スチレンスルホン酸およびそのナトリウム塩、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸およびそのナトリウム塩、イソプレンスルホン酸およびそのナトリウム塩などの共重合可能なモノマーとの共重合体も使用することができる。
【００２３】
重合開始剤としては、水への溶解性の観点から分類すると、油溶性重合開始剤が好ましい。水溶性の重合開始剤を用いると複合粒子表面での重合でなく、磁性体被覆粒子を含まない疎水性重合重合モノマーのみが重合した新粒子が多量に生じる傾向がある。
【００２４】
油溶性重合開始剤としては、ベンゾイルペルオキシド、ラウロイルペルオキシド、ターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート、３，５，５−トリメチルヘキサノイルペルオキシド、アゾビスイソブチロニトリル等の過酸化化合物、アゾ化合物などを挙げることができる。
【００２５】
水溶性開始剤としては、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、過硫酸ナトリウム等の過硫酸塩、過酸化水素、２−２アゾビス（２−アミノプロパン）鉱酸塩、アゾビスシアノ吉草酸およびそのアルカリ金属塩およびアンモニウム塩等があげられ、また、過硫酸塩、過酸化水素塩と重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、塩化第一鉄等を組み合わせたレドックス開始剤もあげられ、中でも過硫酸塩が好適に用いられる。これらの重合開始剤のモノマー全体に対する割合は０．０１〜８重量％の範囲が好適に用いられる。
【００２６】
乳化剤としては、通常使用されている陰イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤等、を単独もしくは組み合わせて用いることができる。例えば反応性陰イオン性界面活性剤としては、高級アルコール硫酸エステルのアルカリ金属塩、アルキルベンゼンスルホン酸のアルカリ金属塩、コハク酸ジアルキルエステルスルホン酸のアルカリ金属塩、アルキルジフェニルエーテルジスルホン酸のアルカリ金属塩、ポリオキシエチレンアルキル（またはアルキルフェニル）エーテルの硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキル（またはアルキルフェニル）エーテルのリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ナトリウムのホルマリン縮合物などの陰イオン性界面活性剤の他、ラテムルＳ−１８０Ａ（花王（株）製）、エレミノールＪＳ−２（三洋化成（株）製）、アクアロンＨＳ−１０（第一工業製薬（株）製）、アデカリアソープＳＥ−１０Ｎ（旭電化工業（株）製）などを挙げることができる。
【００２７】
また、非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルなどのほか、アクアロンＲＳ−２０（第一工業製薬（株）製）、アデカリアソープＮＥ−２０（旭電化工業（株）製）などの反応性非イオン性界面活性剤を挙げることができる。
【００２８】
ポリマー層の形成におけるモノマーの重合系への添加方法は、とくに制限されず、一括方式、分割方式あるいは連続添加方式のいずれであっても良い。重合温度は重合開始剤によって異なるが、通常１０〜９０℃好ましくは３０〜８５℃であり、重合に要する時間は通常１〜３０時間程度である。
【００２９】
また、ポリマー層形成後、エチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステルのアルカリ加水分解、ビニルエステルのアルカリけん化などの方法により官能基を改変することも可能である。
【００３０】
本発明において、ポリマー層の厚さは０．００５〜２０μｍ、好ましくは０．０１〜５μｍである。また、ポリマー層は磁性体層を完全に被覆していることが好ましい。
【００３１】
上記のようにポリマー層を形成した粒子は、そのまま診断薬用粒子として用いることが可能であるが、さらに診断薬用粒子として好適な粒子表面を形成するために、コーティングポリマー層に、再度ポリマー層を形成することも可能である（以下、再度形成されたポリマー層を「第２コーティングポリマー層という）。この場合、第１コーティングポリマー層は、磁性体層を被覆することを主目的とし、第２コーティングポリマー層は、診断薬用粒子として好適な粒子表面を形成するための官能基導入を主目的とできるので、それぞれのポリマー層の形成を最適な条件で行うことが可能であり、診断薬用粒子の製造法として好ましい。
【００３２】
第２コーティングポリマー層の形成方法は、第１コーティングポリマー層の形成方法と基本的には同様に行なうことができ、第１コーティングポリマー層が形成された粒子の存在下で、主原料としての共重合性モノマーと、副原料である重合開始剤、乳化剤、分散剤、界面活性剤、電解質、架橋剤、分子量調節剤などが必要に応じて添加され液体中で重合を行うことにより形成される。
【００３３】
第２コーティングポリマー層の成分としては特に、ビニル系ポリマーが好ましく、その製造に使用するビニル系モノマーとしては、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレン、ジビニルベンゼンなどの芳香族ビニル単量体、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニルなどのビニルエステル類、アクリロニトリルなどの不飽和ニトリル、メチルアクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ラウリルアクリレート、ラウリルメタクリレート、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレートなどのエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステルなどを例示することができる。このビニル系ポリマーは単独重合体であっても、あるいは上記ビニル系モノマーから選ばれた２種以上のモノマーからなる共重合体であってもよい。
【００３４】
また、上記ビニル系モノマーとブタジエン、イソプレンなどの共役ジオレフィン、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、無類マレイン酸、クロトン酸などのモノまたはジカルボン酸化合物、アクリルアミド、メタクリルアミド、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロールモノアクリレート、グリセロールモノメタクリレート、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、連鎖数２〜４０のポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、ジアリルフタレート、アリルアクリレート、アリルメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、スチレンスルホン酸およびそのナトリウム塩、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸およびそのナトリウム塩、イソプレンスルホン酸およびそのナトリウム塩などの共重合可能なモノマーとの共重合体も使用することができる。
【００３５】
重合開始剤としては、水への溶解性の観点から分類すると、油溶性重合開始剤が好ましい。水溶性の重合開始剤を用いると複合粒子表面での重合でなく、磁性体被覆粒子を含まない疎水性重合重合モノマーのみが重合した新粒子が多量に生じる傾向がある。
【００３６】
油溶性重合開始剤としては、ベンゾイルペルオキシド、ラウロイルペルオキシド、ターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート、３，５，５−トリメチルヘキサノイルペルオキシド、アゾビスイソブチロニトリル等の過酸化化合物、アゾ化合物が挙げられる。
【００３７】
水溶性開始剤としては、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、過硫酸ナトリウム等の過硫酸塩、過酸化水素、２−２アゾビス（２−アミノプロパン）鉱酸塩、アゾビスシアノ吉草酸およびそのアルカリ金属塩およびアンモニウム塩等があげられ、また、過硫酸塩、過酸化水素塩と重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、塩化第一鉄等を組み合わせたレドックス開始剤もあげられ、中でも過硫酸塩が好適に用いられる。これらの重合開始剤のモノマー全体に対する割合は０．０１〜８重量％の範囲が好適に用いられる。
【００３８】
乳化剤としては、通常使用されている陰イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤等、を単独もしくは組み合わせて用いることができる。例えば陰イオン性界面活性剤としては、高級アルコール硫酸エステルのアルカリ金属塩、アルキルベンゼンスルホン酸のアルカリ金属塩、コハク酸ジアルキルエステルスルホン酸のアルカリ金属塩、アルキルジフェニルエーテルジスルホン酸のアルカリ金属塩、ポリオキシエチレンアルキル（またはアルキルフェニル）エーテルの硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキル（またはアルキルフェニル）エーテルのリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ナトリウムのホルマリン縮合物などの陰イオン性界面活性剤の他、ラテムルＳ−１８０Ａ（花王（株）製）、エレミノールＪＳ−２（三洋化成（株）製）、アクアロンＨＳ−１０（第一工業製薬（株）製）、アデカリアソープＳＥ−１０Ｎ（旭電化工業（株）製）などの反応性イオン界面活性剤を挙げることができる。
【００３９】
また、非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルなどのほか、アクアロンＲＳ−２０（第一工業製薬（株）製）、アデカリアソープＮＥ−２０（旭電化工業（株）製）などの反応性非イオン性界面活性剤を挙げることができる。
【００４０】
第２コーティングポリマー層の形成におけるモノマーの重合系への添加方法は、とくに制限されず、一括方式、分割方式あるいは連続添加方式のいずれであっても良い。重合温度は重合開始剤によって異なるが、通常１０〜９０℃好ましくは３０〜８５℃であり、重合に要する時間は通常１〜３０時間程度である。
【００４１】
また、第２コーティングポリマー層を形成した後、エチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステルのアルカリ加水分解、ビニルエステルのアルカリけん化などの方法により官能基を改変することも可能である。
【００４２】
本発明において、第２コーティングポリマー層の厚さは、第１コーティングポリマー層に比較して薄くすることが可能であり、０．００５〜５μｍ、好ましくは０．００５〜１μｍである。
【００４３】
本発明の方法により得られる診断薬用粒子は、粒子からの不純物の溶出、あるいは磁性体そのものの溶出あるいは磁性体からの不純物の溶出がないので診断薬用担体として好適である。このような診断薬用担体用途においては、ポリマー層の表面の特性を目的に応じて選択することができる。
診断薬用担体としての利用方法として、本発明の方法により得られる診断薬用担体粒子にタンパク質等の抗原あるいは抗体を結合し、測定対象である抗体あるいは抗原との抗原抗体反応に基づく受身凝集反応による溶液の濁度変化を利用した定量・定性検出用途、担体に抗体を結合し抗原であるウイルス・細菌・細胞・ホルモン・ダイオキシン類等の化学物質、などを結合して回収・濃縮する用途、担体にＤＮＡなどの核酸アナログを結合して、核酸のハイブリダイゼーションを利用した核酸の回収・検出や、核酸に結合するタンパク質や色素等の化学物質を回収・検出する用途、担体にアビジンまたはビオチンを結合してビオチンあるいはアビジンを有する分子を回収して検出する用途、担体に抗体や抗原を結合し、比色法や化学発光を利用した酵素免疫測定法用の担体としての用途があげられる。従来、９６穴プレート等を担体として用いていた診断項目であれば、本発明の方法により得られる診断薬用粒子を用いることによって、磁性を利用した自動分析機に置き換えて使用できる。診断の対象となる物質としては、生体由来のタンパク質、黄体形成ホルモン、甲状腺刺激ホルモン等のホルモン、各種ガン細胞や、前立腺特異マーカー、膀胱ガンマーカー等のガンのマーカーとなるタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルスなどのウイルス、淋菌、ＭＲＳＡ等の細菌、カンジダ、クリプトコックス等の真菌、トキソプラズマ等の原虫・寄生虫、あるいはそれらウイルス・細菌・真菌・原虫・寄生虫などの構成要素であるタンパク質や核酸、ダイオキシン類等の環境汚染物質、抗生物質や抗てんかん剤など医薬品等の化学物質、などがあげられる。
【００４４】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
【００４５】
１．核粒子の作製
特公昭５７−２４３６９号公報記載の膨潤重合法、ジャーナルオブポリマーサイエンスポリマーレターエディション（Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，ＰｏｌｙｍｅｒＬｅｔｔｅｒＥｄ．）記載の重合方法、あるいは本発明者らが先に提案した重合方法（特開昭６１−２１５６０２、同６１−２１５６０３、同６１−２１５６０４）を参考に以下の粒子を作製した。核粒子１〜５は平均粒子径、ＣＶ値とも本願発明の範囲内のものであり、核粒子６はＣＶ値が本願発明の範囲より大きく、かつ不均一な粒子である。下記核粒子は、重合後遠心分離により粒子のみ取り出したものをさらに水洗し、乾燥、粉砕した。
【００４６】

【００４７】
２．核粒子への磁性体の被覆（磁性体層の形成）
被覆方法１；
油性磁性流体「ＦＶ５５」［松本油脂（株）製］にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系の超常磁性体（平均粒子径：０．０１μｍを得た。なおこの磁性体は界面活性剤により疎水化処理された表面を有するものである。得られた磁性体をトルエン／水（重量比１：１）に添加し、十分に攪拌した後静置したところ、磁性体はトルエンのみに分散されており、表面が疎水化されたことを確認した。ついで、核粒子５ｇに、疎水化された磁性体を５ｇ混合し、この混合物をハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−０型（奈良機械製作所（株）製）を使用して、羽根（撹拌翼）の周速度１００ｍ／秒（１６２００ｒｐｍ）で３分間処理した。
【００４８】
被覆方法２；
油性磁性流体「ＦＶ５５」［松本油脂（株）製］にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系の超常磁性体（平均粒子径：０．０１μｍを得た。なおこの磁性体は界面活性剤により疎水化処理された表面を有するものである。この界面活性剤を除去すべく、大量の２００ｍＭのＮａＯＨ水溶液で磁性体を洗浄し、ついで蒸留水で余剰のＮａＯＨを取り除いて乾燥させた。次に、この乾燥磁性体１０ｇにイソブチルトリメトキシシラン１００ｇを添加し、５０℃において８時間混合させて表面の疎水化処理を行い、磁性体を得た。この磁性体を回収し乾燥させた。得られた磁性体をトルエン／水（重量比１：１）に添加し、十分に攪拌した後静置したところ、磁性体はトルエンのみに分散されており、表面が疎水化されたことを確認した。
【００４９】
ついで、核粒子５ｇに、疎水化された磁性体を５ｇ混合し、この混合物をハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−０が他（奈良機械製作所（株）製）を使用して、羽根（撹拌翼）の周速度１００ｍ／秒（１６２００ｒｐｍ）で３分間処理した。
【００５０】
３．母粒子の表面のコーティング重合（コーティングポリマー層の形成）
表面コーティング重合１（第１コーティングポリマー層の形成）；
被覆方法１、２で得られた磁性体被覆粒子３０ｇと、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液９００ｇとを１Ｌセパラブルフラスコに投入し充分に分散させた。これに、モノマーとしてシクロヘキシルメタクリレート６ｇ、メタクリル酸１．５ｇ、重合開始剤としてターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート（日本油脂社製；パーブチルＯ）０．６ｇを添加し、イカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ_２ガス気流下８０℃で８時間反応させた。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。
【００５１】
表面コーティング重合２（第１コーティングポリマー層の形成）；
被覆方法１、２で得られた磁性体被覆粒子３０ｇと、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液９００ｇとを１Ｌセパラブルフラスコに投入し充分に分散させた。ついで、イカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ_２ガス気流下６０℃とした。これに、モノマーとしてシクロヘキシルメタクリレート３０ｇ、メタクリル酸１．５ｇ、重合開始剤としてターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート（日本油脂社製；パーブチルＯ）１．５ｇの混合物を２時間にわたり連続添加して反応させた。その後、さらに温度を８０℃とし３時間継続し反応を完結させた。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。
【００５２】
表面コーティング重合３（第１コーティングポリマー層の形成）；
表面コーティング重合２のシクロヘキシルメタクリレートをスチレンとした以外は全て表面コーティング重合２の方法に基づいて実施した。
【００５３】
表面コーティング重合４（第１コーティングポリマー層の形成）；
被覆方法１、２で得られた磁性体被覆粒子３０ｇと、分散剤としてポリビニルアルコール（ＰＶＡ）「ゴーセノールＧＬ−０３」（日本合成化学製；ケン化度８６．５〜８９．０ｍｏｌ％、重合度３００〜４００）の０．５％水溶液７５０ｇとを１Ｌセパラブルフラスコに投入し充分に分散させた。ついで、イカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ_２ガス気流下６０℃とした。これに、モノマーとしてシクロヘキシルメタクリレート３０ｇ、メタクリル酸１．５ｇ、重合開始剤としてターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート（日本油脂社製；パーブチルＯ）１．５ｇ、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液１５０ｇの混合物を１０℃以下において超音波微分散により乳化させて、２時間にわたり連続添加して反応させた。その後、さらに温度を８０℃とし３時間継続し反応を完結させた。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。
【００５４】
表面コーティング重合５（第１コーティングポリマー層の形成）；
被覆方法１、２で得られた磁性体被覆粒子３０ｇと、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液３７５ｇと、アニオン性乳化剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５％水溶液３７５ｇとを１Ｌセパラブルフラスコに投入し充分に分散させた。ついで、イカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ_２ガス気流下６０℃とした。これに、モノマーとしてシクロヘキシルメタクリレート３０ｇ、メタクリル酸１．５ｇ、ジビニルベンゼン０．６ｇ、重合開始剤としてターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート（日本油脂社製；パーブチルＯ）１．５ｇ、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液７５ｇおよびアニオン性乳化剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５％水溶液７５ｇの混合物を１０℃以下において超音波微分散により乳化させて、２時間にわたり連続添加して反応させた。その後、さらに温度を８０℃とし３時間継続し反応を完結させた。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。
【００５５】
表面コーティング重合６（第１コーティングポリマー層の形成）；
表面コーティング重合５のシクロヘキシルメタクリレートをスチレンとした以外は全て表面コーティング重合５の方法に基づいて実施した。
【００５６】
表面コーティング重合７（第１コーティングポリマー層の形成）；
表面コーティング重合６のメタクリル酸をアクリル酸とした以外は全て表面コーティング重合６の方法に基づいて実施した。
【００５７】
表面コーティング重合８（第１コーティングポリマー層の形成）；
被覆方法１、２で得られた磁性体被覆粒子３０ｇと、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液３７５ｇと、アニオン性乳化剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５％水溶液３７５ｇとを１Ｌセパラブルフラスコに投入し充分に分散させた。ついで、イカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ_２ガス気流下６０℃とした。これに、モノマーとしてスチレン、メタクリル酸１．５ｇ、ジビニルベンゼン０．６ｇ、重合開始剤としてターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート（日本油脂社製；パーブチルＯ）１．５ｇ、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液７５ｇおよびアニオン性乳化剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５％水溶液７５ｇの混合物を１０℃以下において超音波微分散により乳化させて添加して反応させた。その後、さらに温度を８０℃とし３時間継続し反応を完結させた。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。
【００５８】
表面コーティング重合９（第２コーティングポリマー層の形成）；
表面コーティング重合２で得られた第１コーティングポリマー層に覆われた粒子３０ｇと、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液９００ｇとを１Ｌセパラブルフラスコに投入し充分に分散させた。これに、モノマーとしてシクロヘキシルメタクリレート６ｇ、メタクリル酸１．５ｇ、重合開始剤としてターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート（日本油脂社製；パーブチルＯ）０．６ｇを添加し、イカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ_２ガス気流下８０℃で８時間反応させた。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。
【００５９】
表面コーティング重合１０（第２コーティングポリマー層の形成）；
表面コーティング重合３で得られた第１コーティングポリマー層に覆われた粒子３０ｇ（固形分）と、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液９００ｇとを１Ｌセパラブルフラスコに投入し充分に分散させた。これに、モノマーとしてスチレン６ｇ、メタクリル酸１．５ｇ、重合開始剤としてターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート（日本油脂社製；パーブチルＯ）０．６ｇを添加し、イカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ_２ガス気流下８０℃で８時間反応させた。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。
【００６０】
表面コーティング重合１１（第２コーティングポリマー層の形成）；
表面コーティング重合５で得られた第１コーティングポリマー層に覆われた粒子３０ｇ（固形分）と、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液９００ｇとを１Ｌセパラブルフラスコに投入し充分に分散させた。これに、モノマーとしてシクロヘキシルメタクリレート３ｇ、ジビニルベンゼン０．２ｇ、メタクリル酸０．５ｇ、ポリエチレングリコール（ｎ＝９）モノメタクリレート０．５ｇ、重合開始剤としてターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート（日本油脂社製；パーブチルＯ）０．６ｇを添加し、イカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ_２ガス気流下８０℃で８時間反応させた。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。
【００６１】
表面コーティング重合１２（第２コーティングポリマー層の形成）；
表面コーティング重合８で得られた第１コーティングポリマー層に覆われた粒子３０ｇ（固形分）と、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液９００ｇとを１Ｌセパラブルフラスコに投入し充分に分散させた。これに、モノマーとしてスチレン３ｇ、アクリル酸０．２ｇ、重合開始剤としてターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート（日本油脂社製；パーブチルＯ）０．６ｇを添加し、イカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ_２ガス気流下８０℃で８時間反応させた。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。
【００６２】
表面コーティング重合１３（第２コーティングポリマー層の形成）；
表面コーティング重合８で得られた第１コーティングポリマー層に覆われた粒子３０ｇ（固形分）と、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液９００ｇとを１Ｌセパラブルフラスコに投入し充分に分散させた。これに、モノマーとしてスチレン３ｇ、グリシジルメタクリレート０．５ｇ、重合開始剤としてターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート（日本油脂社製；パーブチルＯ）０．６ｇを添加し、イカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ_２ガス気流下８０℃で８時間反応させた。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。
【００６３】
表面コーティング重合１４（第２コーティングポリマー層の形成）；
表面コーティング重合８で得られた第１コーティングポリマー層に覆われた粒子３０ｇ（固形分）と、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液９００ｇとを１Ｌセパラブルフラスコに投入し充分に分散させた。これに、モノマーとしてスチレン３ｇ、メタクリル酸０．５ｇ、グリセロールモノメタクリレート０．５ｇ、重合開始剤としてターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート（日本油脂社製；パーブチルＯ）０．６ｇを添加し、イカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ_２ガス気流下８０℃で８時間反応させた。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。
【００６４】
参考例１（重合により磁性体層およびコーティングポリマー層を同時に形成する方法）；
油性磁性流体「ＦＶ５５」［松本油脂（株）製］にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、得られた超常磁性体粉体４．８ｇを０．５％ラウリル硫酸ナトリウム４２０ｇに分散させ、さらにスチレン４．２ｇを添加しイカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ_２ガス気流下５５℃で１時間撹拌した。この混合物に過硫酸カリウム８ｇと０．５％ラウリル硫酸ナトリウム５６０ｇに分散させた核粒子１（ポリスチレン；平均粒子径２．１μｍ、ＣＶ値１．５％）３０ｇを添加した。さらに６時間後にスチレン４．２ｇと過硫酸カリウム７ｇを添加しさらに１５時間撹拌した。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。得られた粒子５ｇ（固形分）を０．５％ラウリル硫酸ナトリウム１５０ｇに分散させ、スチレン２ｇ、メタクリル酸１ｇ過硫酸カリウム１ｇを添加しイカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ_２ガス気流下５５℃で４時間撹拌した。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。
【００６５】
実施例１〜１２よび比較例１〜３；
上記の核粒子の作製方法、核粒子への磁性体の被覆方法、磁性体被覆粒子の表面コーティング重合方法を表１（実施例）および表２（比較例）に示すとおり組み合わせて診断薬用粒子を製造した。得られた粒子につき以下の評価を行った。
【００６６】
評価１；磁気捕捉率の評価
得られた診断薬用粒子を分散媒である水に分散させ、１重量％の試験液が得られるよう調整した。この試験液の１ｍｌをエッペンドルフチューブに入れ、撹拌後に横方向から４０００ガウスの磁気を１分間かけた場合の磁気捕捉率を測定した。
【００６７】
評価２；ＥＩＡ用担体としての評価
実施例１〜１４および比較例１〜３で得られた診断薬用粒子の２．０ｍｇをテストチューブに取り分けた。ここへ、基質反応液（ｏ−フェニレンジアミン：１３ｍｇ，０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）：５０ｍＬ，３０％過酸化水素：１５μＬ）を０．５ｍＬ加え、遮光下、室温で１時間反応させた。その後、遠心分離で粒子を除き、上澄みの吸光度（波長４４６ｎｍ）を測定した。
【００６８】
結果１；磁気捕捉率の評価結果
実施例の診断薬用粒子は、いずれも磁気捕捉率が９９重量％以上であった。これは粒径分布が狭く磁気応答性が均一であることが理由として挙げられる。
【００６９】
一方、比較例の診断薬用粒子は、いずれも磁気捕捉率９９重量％以上が得られなかった。比較例１，２においては診断薬用粒子の粒径分布が広く磁気応答性が不均一であることが、比較例３においては磁性体含量が１１％と低いことに起因している事が理由としてあげられる。
【００７０】
結果２；ＥＩＡ用担体としての評価結果
ＥＩＡ用担体として粒子を用いる場合、粒子自身は分析結果を妨げないよう、基質溶液と一切相互作用せず、発色等の影響を示さない必要がある。実施例のいずれの粒子も総じて吸光度が低く、異常な発色を示さなかった。これは、粒子表面への磁性体の露出、あるいは粒子からの磁性体あるいは鉄イオンの溶出が極めて少ないためである。この結果は、これら粒子が、ＥＩＡ法等を利用した診断薬用担体として用いた場合、測定値に悪影響を与えることがないため、好適であることを示している。
【００７１】
一方、比較例３は異常に高い発色を示した。この方法（参考例１）で造られた粒子は磁性体のポリマーコーティングが不完全で磁性体の露出が原因であると推察される。この結果は、これら粒子が分析のバックグランド値を押し上げる原因となり、測定感度の低下をもららし、診断薬用担体としては不適であることを示している。
【００７２】
【表１】

【００７３】
【表２】

【００７４】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、従来になく均一粒子径を有した診断薬用粒子を簡便かつ効率的に作製することができる。この診断薬用粒子は診断薬用担体などの生化学用担体、応用例としては医療用診断薬用途、特に自動測定器対応粒子に応用が可能である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing diagnostic particles in the fields of biochemistry and pharmaceuticals.
[0002]
[Background]
The particle size distribution is relatively uniform, and the method of producing particles that combine magnetic materials is to disperse the magnetic material in the monomer and perform suspension polymerization or miniemulsion polymerization in the presence of the magnetic material to incorporate the magnetic material into the particles. There is a method of further classifying the particles. However, in this method, the particle size distribution of the particles obtained at the end of the polymerization is very wide, and the desired uniform particle size cannot be obtained unless the classification is repeated a plurality of times. As a result, work efficiency and yield are not balanced. In addition, as a method of precipitating a metal compound on the particles in water, the Fe salt is neutralized and NH is used as iron hydroxide. ₂ , NO ₂ A method of oxidizing by depositing on porous particles having a group (Japanese Patent Publication No. 5-10808) has been proposed. However, this method has a very complicated manufacturing process and is not suitable for mass production. A method using heteroaggregation (US Pat. No. 5,648,124) has been proposed. However, in this method, it is difficult to control the aggregation at the time of charging the oppositely charged substance, and in many cases the agglutination reaction is excessive in order to prioritize the compounding. Aggregates are formed and the particle size is not uniform. Furthermore, a method of introducing a magnetic substance into polymer particles by simultaneously polymerizing a monomer and a magnetically responsive metal oxide on the surface of the polymer core particles (Japanese Patent No. 2736467) has been proposed. However, in this method, the particles after the introduction of the magnetic substance are not completely polymer-coated, and the magnetic substance is present on the particle surface. There were problems such as elution of substances derived from This problem is known to act as an adverse effect particularly when the particles are used as a carrier for a diagnostic agent. In an enzyme immunoassay (EIA), which is an analysis method in the biochemical field, when a certain chromogenic substrate such as o-phenylenediamine (OPD) is used for measurement, Fe acts as an interference substance and the measurement is performed. It has been reported that it may cause measurement errors by pushing up the background. (Rev. esp. Fisioll., 45 (1), 41-46, 1989) Therefore, there is no magnetic material on the surface, and there is no problem such as detachment of the magnetic material and elution of iron ions. Magnetic particles that can also be used as a carrier for diagnostic agents have been desired.
[0003]
[Patent Document 1]
Japanese Patent No. 2736467
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to easily and efficiently produce diagnostic medicinal particles having a uniform particle size without causing the magnetic substance to drop off or to elute substances derived from magnetic substance components such as iron ions. .
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The method for producing diagnostic particles of the present invention is a mother particle in which a magnetic layer is formed on the surface of a core particle, and the magnetic layer is Fe ₂ O ₃ And Fe ₃ O ₄ And a step of forming a polymer layer on the magnetic layer by polymerization in the presence of the mother particles having an average particle diameter of 0.4 to 200 μm.
[0006]
The core particles used in the present invention are basically non-magnetic substances, and any of organic substances and inorganic substances can be used, and can be appropriately selected depending on the purpose of use of the diagnostic drug particles.
[0007]
As a typical example of the organic substance, for example, a polymer can be mentioned. As such a polymer, a vinyl polymer is particularly preferable, and as a vinyl monomer used for the production thereof, aromatic vinyl monomers such as styrene, α-methylstyrene, halogenated styrene, divinylbenzene, vinyl acetate, propion are used. Vinyl esters such as vinyl acid, unsaturated nitriles such as acrylonitrile, methyl acrylate, ethyl acrylate, ethyl methacrylate, butyl acrylate, butyl methacrylate, 2-ethylhexyl acrylate, 2-ethylhexyl methacrylate, lauryl acrylate, lauryl methacrylate, ethylene glycol diacrylate Ethylenically unsaturated carboxylic acid alkyls such as ethylene glycol dimethacrylate, cyclohexyl acrylate, cyclohexyl methacrylate, etc. It can be exemplified esters and the like. This vinyl polymer may be a homopolymer or a copolymer composed of two or more monomers selected from the vinyl monomers. Also, the above vinyl monomers and conjugated diolefins such as butadiene and isoprene, acrylic acid, methacrylic acid, acrylamide, methacrylamide, glycidyl acrylate, glycidyl methacrylate, N-methylol acrylamide, N-methylol methacrylamide, 2-hydroxyethyl acrylate, A copolymer with a copolymerizable monomer such as 2-hydroxyethyl methacrylate, diallyl phthalate, allyl acrylate, allyl methacrylate, trimethylolpropane triacrylate, trimethylolpropane trimethacrylate, or the like can also be used.
[0008]
The polymer particles as the core particles having the average particle diameter in the specific range described above can also be obtained, for example, by suspension polymerization of the above-mentioned vinyl monomer or pulverization of the polymer bulk. Examples of a method for producing core particles having a uniform particle size include swelling polymerization described in JP-B-57-24369, and polymerization described in Journal of Polymer Science, Polymer Letter Edition (J. Polym. Sci., Polymer Letter Ed.). Or a polymerization method previously proposed by the present inventors (Japanese Patent Laid-Open Nos. 61-215602, 61-215603, and 61-215604).
[0009]
The average particle diameter of the core particles used in the present invention is 0.4 to 200 μm, preferably 0.8 to 100 μm, and more preferably 1.0 to 50 μm. The CV (Coefficient of Variation) value of the core particle is 20% or less, preferably 15% or less, more preferably 10% or less. If the average particle diameter of the core particles is less than 1 μm, for example, the collision energy due to high-speed stirring of the particles is insufficient, and it becomes difficult to adsorb magnetic fine particles. On the other hand, when the average particle diameter of the core particles exceeds 200 μm, the characteristics as fine particles are lost. On the other hand, if the CV value is out of the above range, the uniformity of the particle diameter of the obtained magnetic composite particles becomes insufficient.
[0010]
In the present invention, the material of the core particles is preferably an organic substance such as a polymer from the viewpoints of processability and lightness when combined. The average particle size and particle size distribution in the present invention are obtained by randomly measuring the particle size of 100 particles on an electron micrograph.
[0011]
As the magnetic fine particles constituting the magnetic layer used in the present invention, iron oxide-based substances are typical, and MnFe ₂ O ₄ (Mn = Co, Ni, Mg, Cu, Li _0.5 Fe _0.5 Etc.) ₃ O ₄ Or magnetite expressed by γ-Fe ₂ O ₃ Γ-Fe with strong saturation magnetization and low residual magnetization ₂ O ₃ And Fe ₃ O ₄ It is necessary to include one of these.
[0012]
The average particle size of the magnetic fine particles used in the present invention is preferably 1/5 or less, more preferably 1/10 or less, and further preferably 1/20 or less of the average particle size of the core particles. When the average particle diameter of the magnetic fine particles exceeds 1/5 of the average particle diameter of the core particles, it is difficult to form a coating layer having a uniform and sufficient thickness on the core particle surface.
[0013]
In the present invention, the ratio between the core particles and the magnetic fine particles (core particles: magnetic fine particles) is preferably 95: 5 to 20:80 by weight. When the amount of magnetic fine particles is less than this range, the composite effect is reduced. When the amount of magnetic fine particles is larger than this range, the amount of the core particles becomes excessive, and the number of magnetic fine particles that are not combined increases.
[0014]
The magnetic fine particles used in the present invention are preferably those whose surface is hydrophobized from the viewpoint of the affinity and compatibility between the core particles and the monomer used in the subsequent step. Examples of the method for hydrophobizing the surface of the magnetic fine particles include a method in which a compound having an extremely high affinity portion and a hydrophobic portion in the molecule is brought into contact with and bonded to the magnetic fine particles. it can. Examples of the compound having such a high affinity portion and a hydrophobic portion in the molecule include silane compounds represented by silane coupling agents.
By hydrophobizing magnetic particles with silane compounds, it has excellent chemical resistance, especially alkali resistance, and the magnetic particles are peeled off from the core particles during use as a diagnostic agent. It is possible to effectively prevent contamination from occurring due to fine particles floating in the diagnostic reagent reaction solution.
In the present invention, it can be said that the hydrophobized magnetic fine particles are sufficiently hydrophobized when they can be well dispersed in, for example, toluene.
[0015]
Examples of silane compounds represented by silane coupling agents include vinyltrichlorosilane, vinyltrimethoxysilane, vinyltris (β-methoxyethoxy) silane, β- (3,4-epoxycyclohexyl) ethyltrimethoxysilane, and γ-glycid. Oxypropyltrimethoxysilane, γ-methacryloxypropyltrimethoxysilane, N-β (aminoethyl) -γ-aminopropylmethyldimethoxysilane, N-β (aminoethyl) -γ-aminopropyltrimethoxysilane, dodecyltrimethoxy Silane, hexyltrimethoxysilane, methyltrimethoxysilane, methyltriethoxysilane, phenyltrimethoxysilane, dodecyltrichlorosilane, hexyltrichlorosilane, methyltrichlorosilane, phenyltrichlorosilane, etc. There is.
[0016]
As a method for bonding these silane compounds to magnetic fine particles, for example, magnetic fine particles and a silane compound are mixed in an inorganic medium such as water or an organic medium such as alcohol, ether, ketone, ester, and stirred. After heating, the magnetic fine particles are separated by decantation or the like and the inorganic medium or the organic medium is removed by drying under reduced pressure. Alternatively, the magnetic fine particles and the silane compound may be directly mixed and heated to bond them together. In these means, the heating temperature is usually 30 to 100 ° C., and the heating temperature is about 0.5 to 2 hours. The amount of the silane compound used is appropriately determined depending on the surface area of the magnetic fine particles, but is usually 1 to 50 parts by weight, preferably 2 to 30 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the magnetic fine particles.
[0017]
In order to form a magnetic layer coated with magnetic fine particles on the surface of the core particles in the present invention, first, the core particles and the magnetic fine particles are mixed, and the magnetic fine particles are physically adsorbed on the surface of the core particles. The physical adsorption method described in the present invention refers to an adsorption method and a bonding method that do not involve a chemical reaction.
[0018]
In order to adsorb the magnetic fine particles on the surface of the core particle, a method of realizing the composite by applying a physically strong force from the outside is also effective. For example, a mortar, an automatic mortar, a ball mill, a blade pressurizing powder compression method, a mechanochemical effect such as a mechanofusion method, or a jet mill, a hybridizer, or the like using a high-speed air current impact method.
It is desirable that the physical adsorption force is strong in order to efficiently and firmly perform the composite. As the method, the peripheral speed of the stirring blade is preferably 15 m / second or more, more preferably 30 m / second or more, and further preferably 40 to 150 m / second in a vessel with a stirring blade. If the peripheral speed of the stirring blade is lower than 15 m / second, sufficient energy for forming the coating layer may not be obtained. In addition, although there is no restriction | limiting in particular about the upper limit of the circumferential speed of a stirring blade, It determines automatically from points, such as an apparatus to be used and energy efficiency.
In the present invention, the thickness of the magnetic layer formed on the surface of the core particle is 0.005 to 20 μm, preferably 0.01 to 5 μm, and the thickness is preferably uniform. When the thickness of the magnetic layer is smaller than 0.005 μm, the content of the magnetic body is decreased, and sufficient magnetic separation property cannot be obtained. When the thickness exceeds 20 μm, the strength of the magnetic layer is decreased, and the magnetic body The layer may be broken.
The surface of the core particle is preferably completely covered with the magnetic layer, and at least 90% or more of the surface of the core particle needs to be covered with the magnetic layer.
[0019]
Next, a polymer layer (hereinafter also referred to as “first coating polymer layer”) formed on the surface of the mother particle produced as described above will be described.
[0020]
Such a polymer layer requires a copolymerizable monomer as a main raw material, a polymerization initiator as an auxiliary raw material, an emulsifier, a dispersant, a surfactant, an electrolyte, a crosslinking agent, a molecular weight regulator, etc. in the presence of mother particles. And is formed by polymerization in a liquid. By forming the polymer layer by polymerization in this way, it is possible to introduce a desired functional group on the surface of the polymer layer, and the surface processability is excellent.
[0021]
As a component of the polymer layer, a vinyl polymer is particularly preferable, and vinyl monomers used for the production thereof are aromatic vinyl monomers such as styrene, α-methylstyrene, halogenated styrene, divinylbenzene, vinyl acetate, Vinyl esters such as vinyl propionate, unsaturated nitriles such as acrylonitrile, methyl acrylate, ethyl acrylate, ethyl methacrylate, butyl acrylate, butyl methacrylate, 2-ethylhexyl acrylate, 2-ethylhexyl methacrylate, lauryl acrylate, lauryl methacrylate, ethylene glycol di Ethylenically unsaturated carboxylic acid alkyls such as acrylate, ethylene glycol dimethacrylate, cyclohexyl acrylate, cyclohexyl methacrylate, etc. Esters, and the like can be exemplified acrolein. This vinyl polymer may be a homopolymer or a copolymer composed of two or more monomers selected from the vinyl monomers.
[0022]
In addition, vinyl monomers and conjugated diolefins such as butadiene and isoprene, mono- or dicarboxylic acid compounds such as acrylic acid, methacrylic acid, itaconic acid, maleic acid, and crotonic acid, acrylamide, methacrylamide, glycidyl acrylate, glycidyl methacrylate, N-methylolacrylamide, N-methylolmethacrylamide, N-isopropylacrylamide, 2-hydroxyethyl acrylate, 2-hydroxyethyl methacrylate, 2-hydroxyethyl acrylate, 2-hydroxyethyl methacrylate, glycerol monoacrylate, glycerol monomethacrylate, ethylene glycol Diacrylate, ethylene glycol dimethacrylate, polyethylene glycol having 2 to 40 chains, or (Meth) acrylate having polypropylene glycol as a side chain, diallyl phthalate, allyl acrylate, allyl methacrylate, trimethylolpropane triacrylate, trimethylolpropane trimethacrylate, styrenesulfonic acid and its sodium salt, 2-acrylamido-2-methylpropanesulfone Copolymers with copolymerizable monomers such as acid and its sodium salt, isoprene sulfonic acid and its sodium salt can also be used.
[0023]
The polymerization initiator is preferably an oil-soluble polymerization initiator from the viewpoint of solubility in water. When a water-soluble polymerization initiator is used, there is a tendency that not only polymerization on the surface of the composite particles, but a large amount of new particles in which only a hydrophobic polymerization monomer not containing magnetic material-coated particles is polymerized are generated.
[0024]
Examples of oil-soluble polymerization initiators include benzoyl peroxide, lauroyl peroxide, tertiary butyl peroxy 2-ethylhexanate, 3,5,5-trimethylhexanoyl peroxide, peroxide compounds such as azobisisobutyronitrile, azo compounds, etc. Can be mentioned.
[0025]
Water-soluble initiators include potassium persulfate, ammonium persulfate, persulfates such as sodium persulfate, hydrogen peroxide, 2-2 azobis (2-aminopropane) mineral acid salt, azobiscyanovaleric acid and its alkali metal salts, and Examples thereof include ammonium salts, and redox initiators in which persulfate, hydrogen peroxide salt and sodium bisulfite, sodium thiosulfate, ferrous chloride, etc. are combined. Among them, persulfate is preferably used. . The ratio of these polymerization initiators to the whole monomer is preferably in the range of 0.01 to 8% by weight.
[0026]
As the emulsifier, a commonly used anionic surfactant or nonionic surfactant can be used alone or in combination. For example, reactive anionic surfactants include alkali metal salts of higher alcohol sulfates, alkali metal salts of alkylbenzene sulfonic acids, alkali metal salts of succinic acid dialkyl ester sulfonic acids, alkali metal salts of alkyl diphenyl ether disulfonic acids, In addition to anionic surfactants such as sulfuric acid ester salt of oxyethylene alkyl (or alkylphenyl) ether, phosphoric acid ester salt of polyoxyethylene alkyl (or alkylphenyl) ether, formalin condensate of sodium naphthalene sulfonate, etc. S-180A (manufactured by Kao Corporation), Eleminol JS-2 (manufactured by Sanyo Chemical Co., Ltd.), Aqualon HS-10 (manufactured by Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.), Adekaria Soap SE-10N (Asahi Denka Kogyo Co., Ltd.) Inc.) Door can be.
[0027]
Examples of the nonionic surfactant include polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkyl phenyl ether, Aqualon RS-20 (manufactured by Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.), Adekari Soap NE-20 ( Reactive nonionic surfactants such as Asahi Denka Kogyo Co., Ltd.).
[0028]
The method for adding the monomer to the polymerization system in the formation of the polymer layer is not particularly limited, and may be any of a batch method, a division method, or a continuous addition method. The polymerization temperature varies depending on the polymerization initiator, but is usually 10 to 90 ° C, preferably 30 to 85 ° C, and the time required for the polymerization is usually about 1 to 30 hours.
[0029]
Further, after the polymer layer is formed, the functional group can be modified by a method such as alkali hydrolysis of ethylenically unsaturated carboxylic acid alkyl ester or alkali saponification of vinyl ester.
[0030]
In the present invention, the thickness of the polymer layer is 0.005 to 20 μm, preferably 0.01 to 5 μm. The polymer layer preferably completely covers the magnetic layer.
[0031]
Particles with a polymer layer formed as described above can be used as diagnostic drug particles as they are. However, in order to form a particle surface suitable for diagnostic drug particles, a polymer layer is formed again on the coating polymer layer. (Hereinafter, the re-formed polymer layer is referred to as a “second coating polymer layer”.) In this case, the first coating polymer layer is mainly used to cover the magnetic layer, and the second coating polymer layer is used as the second coating polymer layer. The main purpose of the polymer layer is to introduce functional groups to form a particle surface suitable as a particle for a diagnostic agent. Therefore, it is possible to form each polymer layer under optimum conditions. Preferred as a method.
[0032]
The method for forming the second coating polymer layer can be performed basically in the same manner as the method for forming the first coating polymer layer. In the presence of the particles on which the first coating polymer layer is formed, the second coating polymer layer is used as a main raw material. A polymerizable monomer and a polymerization initiator, an emulsifier, a dispersant, a surfactant, an electrolyte, a cross-linking agent, a molecular weight regulator, and the like, which are auxiliary materials, are added as necessary, and polymerization is performed in a liquid.
[0033]
As a component of the second coating polymer layer, a vinyl polymer is particularly preferable, and as a vinyl monomer used for the production, aromatic vinyl monomers such as styrene, α-methylstyrene, halogenated styrene, divinylbenzene, Vinyl esters such as vinyl acetate and vinyl propionate, unsaturated nitriles such as acrylonitrile, methyl acrylate, ethyl acrylate, ethyl methacrylate, butyl acrylate, butyl methacrylate, 2-ethylhexyl acrylate, 2-ethylhexyl methacrylate, lauryl acrylate, lauryl methacrylate, Ethylenic unsaturation such as ethylene glycol diacrylate, ethylene glycol dimethacrylate, cyclohexyl acrylate, cyclohexyl methacrylate The like can be exemplified carboxylic acid alkyl ester. This vinyl polymer may be a homopolymer or a copolymer composed of two or more monomers selected from the vinyl monomers.
[0034]
In addition, vinyl monomers and conjugated diolefins such as butadiene and isoprene, mono- or dicarboxylic acid compounds such as acrylic acid, methacrylic acid, itaconic acid, maleic acid, crotonic acid, acrylamide, methacrylamide, glycidyl acrylate, glycidyl methacrylate, N-methylolacrylamide, N-methylolmethacrylamide, N-isopropylacrylamide, 2-hydroxyethyl acrylate, 2-hydroxyethyl methacrylate, 2-hydroxyethyl acrylate, 2-hydroxyethyl methacrylate, glycerol monoacrylate, glycerol monomethacrylate, ethylene glycol Diacrylate, ethylene glycol dimethacrylate, polyethylene glycol having 2 to 40 chains or (Meth) acrylate having polypropylene glycol as a side chain, diallyl phthalate, allyl acrylate, allyl methacrylate, trimethylolpropane triacrylate, trimethylolpropane trimethacrylate, styrenesulfonic acid and its sodium salt, 2-acrylamido-2-methylpropanesulfone Copolymers with copolymerizable monomers such as acid and its sodium salt, isoprene sulfonic acid and its sodium salt can also be used.
[0035]
The polymerization initiator is preferably an oil-soluble polymerization initiator from the viewpoint of solubility in water. When a water-soluble polymerization initiator is used, there is a tendency that not only polymerization on the surface of the composite particles, but a large amount of new particles in which only a hydrophobic polymerization monomer not containing magnetic material-coated particles is polymerized are generated.
[0036]
Examples of oil-soluble polymerization initiators include benzoyl peroxide, lauroyl peroxide, tertiary butyl peroxy 2-ethylhexanate, 3,5,5-trimethylhexanoyl peroxide, azobisisobutyronitrile and other peroxide compounds and azo compounds. Can be mentioned.
[0037]
Water-soluble initiators include potassium persulfate, ammonium persulfate, persulfates such as sodium persulfate, hydrogen peroxide, 2-2 azobis (2-aminopropane) mineral acid salt, azobiscyanovaleric acid and its alkali metal salts, and Examples thereof include ammonium salts, and redox initiators in which persulfate, hydrogen peroxide salt and sodium bisulfite, sodium thiosulfate, ferrous chloride, etc. are combined. Among them, persulfate is preferably used. . The ratio of these polymerization initiators to the whole monomer is preferably in the range of 0.01 to 8% by weight.
[0038]
As the emulsifier, a commonly used anionic surfactant or nonionic surfactant can be used alone or in combination. For example, anionic surfactants include alkali metal salts of higher alcohol sulfates, alkali metal salts of alkylbenzene sulfonic acids, alkali metal salts of succinic acid dialkyl ester sulfonic acids, alkali metal salts of alkyl diphenyl ether disulfonic acids, polyoxyethylene In addition to anionic surfactants such as sulfate esters of alkyl (or alkylphenyl) ethers, phosphate esters of polyoxyethylene alkyl (or alkylphenyl) ethers, formalin condensates of sodium naphthalenesulfonate, 180A (manufactured by Kao Corporation), Eleminol JS-2 (manufactured by Sanyo Chemical Co., Ltd.), Aqualon HS-10 (manufactured by Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.), Adekaria Soap SE-10N (Asahi Denka Kogyo Co., Ltd.) Reactive ions such as It can be given a surface active agent.
[0039]
Examples of the nonionic surfactant include polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkyl phenyl ether, Aqualon RS-20 (manufactured by Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.), Adekari Soap NE-20 ( Reactive nonionic surfactants such as Asahi Denka Kogyo Co., Ltd.).
[0040]
The method for adding the monomer to the polymerization system in the formation of the second coating polymer layer is not particularly limited, and may be any of a batch method, a division method, or a continuous addition method. The polymerization temperature varies depending on the polymerization initiator, but is usually 10 to 90 ° C, preferably 30 to 85 ° C, and the time required for the polymerization is usually about 1 to 30 hours.
[0041]
In addition, after the second coating polymer layer is formed, the functional group can be modified by a method such as alkali hydrolysis of ethylenically unsaturated carboxylic acid alkyl ester or alkali saponification of vinyl ester.
[0042]
In the present invention, the thickness of the second coating polymer layer can be made thinner than that of the first coating polymer layer, and is 0.005 to 5 μm, preferably 0.005 to 1 μm.
[0043]
The diagnostic drug particles obtained by the method of the present invention are suitable as a diagnostic drug carrier because they do not elute impurities from the particles, elute the magnetic substance itself, or elute impurities from the magnetic substance. In such diagnostic carrier use, the surface characteristics of the polymer layer can be selected according to the purpose.
As a method for use as a carrier for a diagnostic agent, an antigen such as a protein or an antibody is bound to the carrier particle for a diagnostic agent obtained by the method of the present invention, and a solution by passive agglutination based on an antigen-antibody reaction with an antibody or antigen to be measured Quantitative and qualitative detection using changes in turbidity, use to bind and recover / concentrate chemical substances such as antigens such as viruses, bacteria, cells, hormones, dioxins, etc. Nucleic acid analogs such as DNA are bound to recover and detect nucleic acids using nucleic acid hybridization, and are used to recover and detect chemical substances such as proteins and dyes that bind to nucleic acids, and avidin or biotin is bound to a carrier. In order to recover biotin- or avidin-containing molecules and detect them, bind antibodies and antigens to carriers, and use colorimetric methods and chemiluminescence. Use as the carrier for the enzyme immunoassay method. Conventionally, if it is a diagnostic item that uses a 96-well plate or the like as a carrier, it can be used in place of an automatic analyzer utilizing magnetism by using diagnostic particles obtained by the method of the present invention. Substances to be diagnosed include biologically derived proteins, hormones such as luteinizing hormone and thyroid stimulating hormone, various cancer cells, proteins serving as cancer markers such as prostate-specific markers and bladder cancer markers, and hepatitis B virus Viruses such as hepatitis C virus and herpes simplex virus, bacteria such as Neisseria gonorrhoeae and MRSA, fungi such as Candida and cryptocox, protozoa and parasites such as Toxoplasma, or viruses, bacteria, fungi, protozoa and parasites Constituents such as proteins, nucleic acids, environmental pollutants such as dioxins, chemical substances such as pharmaceuticals such as antibiotics and antiepileptics, and the like.
[0044]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not restrict | limited by these.
[0045]
1. Production of nuclear particles
The swelling polymerization method described in JP-B-57-24369, the polymerization method described in Journal of Polymer Science, Polymer Letter Edition (J. Polym. Sci., Polymer Letter Ed.), Or the polymerization method previously proposed by the present inventors The following particles were prepared with reference to Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 61-215602, 61-215603, and 61-215604. The core particles 1 to 5 have both average particle diameter and CV value within the range of the present invention, and the core particle 6 is a non-uniform particle having a CV value larger than the range of the present invention. The following core particles were further washed with water after being polymerized by centrifugation, dried and pulverized.
[0046]

[0047]
2. Coating of magnetic material on core particles (formation of magnetic layer)
Coating method 1;
A ferrite superparamagnetic substance (average) having a hydrophobized surface is obtained by adding acetone to the oil-based magnetic fluid “FV55” (manufactured by Matsumoto Yushi Co., Ltd.) to precipitate and precipitate particles. A particle size of 0.01 μm was obtained, which has a surface hydrophobized with a surfactant and added to toluene / water (weight ratio 1: 1). When the mixture was allowed to stand after sufficient stirring, it was confirmed that the magnetic substance was dispersed only in toluene and the surface was hydrophobized, and then 5 g of the hydrophobized magnetic substance was mixed with 5 g of the core particles. The mixture was treated for 3 minutes at a peripheral speed of 100 m / sec (16200 rpm) of a blade (stirring blade) using a hybridization system NHS-0 type (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.).
[0048]
Coating method 2;
A ferrite superparamagnetic substance (average) having a hydrophobized surface is obtained by adding acetone to the oil-based magnetic fluid “FV55” (manufactured by Matsumoto Yushi Co., Ltd.) to precipitate and precipitate particles. The particle diameter was 0.01 μm, and this magnetic substance has a surface hydrophobized with a surfactant.To remove this surfactant, the magnetic substance was removed with a large amount of 200 mM NaOH aqueous solution. Then, after removing excess NaOH with distilled water and drying, 100 g of isobutyltrimethoxysilane was added to 10 g of the dried magnetic material and mixed at 50 ° C. for 8 hours to hydrophobize the surface. The magnetic material was collected and dried, and the obtained magnetic material was added to toluene / water (weight ratio 1: 1), and after sufficiently stirring, the magnetic material was allowed to stand. Toluene only are dispersed in was confirmed that the surface was hydrophobized.
[0049]
Next, 5 g of the hydrophobized magnetic material is mixed with 5 g of the core particles, and this mixture is mixed with the periphery of the blade (stirring blade) using the hybridization system NHS-0 (Nara Machinery Co., Ltd.). The treatment was performed at a speed of 100 m / sec (16200 rpm) for 3 minutes.
[0050]
3. Coating polymerization of mother particle surface (formation of coating polymer layer)
Surface coating polymerization 1 (formation of first coating polymer layer);
30 g of the magnetic material-coated particles obtained by the coating methods 1 and 2 and 900 g of a 0.5% aqueous solution of a nonionic emulsifier “Emulgen 150” (manufactured by Kao) as a dispersant are put into a 1 L separable flask and sufficiently dispersed. It was. To this, 6 g of cyclohexyl methacrylate and 1.5 g of methacrylic acid are added as monomers, and 0.6 g of tertiary butyl peroxy 2-ethylhexanate (manufactured by NOF Corporation; Perbutyl O) is added as a polymerization initiator, followed by stirring at 200 rpm. , N ₂ The reaction was carried out at 80 ° C. for 8 hours under a gas stream. Then, it cooled to room temperature and removed the coarse thing with the 500 mesh stainless steel net | network, and also removed the nonmagnetic component in the magnetic refinement | purification.
[0051]
Surface coating polymerization 2 (formation of first coating polymer layer);
30 g of the magnetic material-coated particles obtained by the coating methods 1 and 2 and 900 g of a 0.5% aqueous solution of a nonionic emulsifier “Emulgen 150” (manufactured by Kao) as a dispersant are put into a 1 L separable flask and sufficiently dispersed. It was. Then, squid type stirring blade 200 rpm stirring, N ₂ The temperature was 60 ° C. under a gas stream. A mixture of 30 g of cyclohexyl methacrylate and 1.5 g of methacrylic acid as a monomer and 1.5 g of tertiary butyl peroxy 2-ethylhexanate (manufactured by NOF Corporation; Perbutyl O) as a polymerization initiator was continuously added over 2 hours. Reacted. Thereafter, the temperature was further raised to 80 ° C. and continued for 3 hours to complete the reaction. Then, it cooled to room temperature and removed the coarse thing with the 500 mesh stainless steel net | network, and also removed the nonmagnetic component in the magnetic refinement | purification.
[0052]
Surface coating polymerization 3 (formation of first coating polymer layer);
All the steps were performed based on the method of surface coating polymerization 2 except that cyclohexyl methacrylate of surface coating polymerization 2 was changed to styrene.
[0053]
Surface coating polymerization 4 (formation of first coating polymer layer);
30 g of the magnetic material-coated particles obtained by the coating methods 1 and 2 and polyvinyl alcohol (PVA) “GOHSENOL GL-03” (manufactured by Nippon Gosei Kagaku; saponification degree: 86.5-89.0 mol%, polymerization degree) 750 g of a 0.5% aqueous solution of 300-400) was put into a 1 L separable flask and sufficiently dispersed. Then, squid type stirring blade 200 rpm stirring, N ₂ The temperature was 60 ° C. under a gas stream. To this, 30 g of cyclohexyl methacrylate, 1.5 g of methacrylic acid, 1.5 g of tertiary butyl peroxy 2-ethylhexanate (manufactured by NOF Corporation; Perbutyl O) as a polymerization initiator, and nonionic emulsifier “Emulgen 150” as a dispersant A mixture of 150 g of 0.5% aqueous solution (made by Kao) was emulsified by ultrasonic fine dispersion at 10 ° C. or lower, and continuously added for 2 hours to react. Thereafter, the temperature was further raised to 80 ° C. and continued for 3 hours to complete the reaction. Then, it cooled to room temperature and removed the coarse thing with the 500 mesh stainless steel net | network, and also removed the nonmagnetic component in the magnetic refinement | purification.
[0054]
Surface coating polymerization 5 (formation of first coating polymer layer);
30 g of magnetic material-coated particles obtained by the coating methods 1 and 2, 375 g of a 0.5% aqueous solution of a nonionic emulsifier “Emulgen 150” (manufactured by Kao) as a dispersant, and 0 of an anionic emulsifier sodium lauryl sulfate (SDS) 375 g of a 5% aqueous solution was put into a 1 L separable flask and sufficiently dispersed. Then, squid type stirring blade 200 rpm stirring, N ₂ The temperature was 60 ° C. under a gas stream. To this, 30 g of cyclohexyl methacrylate, 1.5 g of methacrylic acid, 0.6 g of divinylbenzene, 1.5 g of tertiary butyl peroxy 2-ethylhexanate (manufactured by NOF Corporation; Perbutyl O) as a polymerization initiator, and as a dispersant A mixture of 75 g of a 0.5% aqueous solution of nonionic emulsifier “Emulgen 150” (manufactured by Kao) and 75 g of a 0.5% aqueous solution of anionic emulsifier sodium lauryl sulfate (SDS) was emulsified at 10 ° C. or less by ultrasonic fine dispersion. The reaction was continuously added over 2 hours. Thereafter, the temperature was further raised to 80 ° C. and continued for 3 hours to complete the reaction. Then, it cooled to room temperature and removed the coarse thing with the 500 mesh stainless steel net | network, and also removed the nonmagnetic component in the magnetic refinement | purification.
[0055]
Surface coating polymerization 6 (formation of first coating polymer layer);
All the steps were performed based on the method of surface coating polymerization 5 except that cyclohexyl methacrylate of surface coating polymerization 5 was changed to styrene.
[0056]
Surface coating polymerization 7 (formation of first coating polymer layer);
The surface coating polymerization 6 was carried out based on the method of the surface coating polymerization 6 except that methacrylic acid was changed to acrylic acid.
[0057]
Surface coating polymerization 8 (formation of first coating polymer layer);
30 g of magnetic material-coated particles obtained by the coating methods 1 and 2, 375 g of a 0.5% aqueous solution of a nonionic emulsifier “Emulgen 150” (manufactured by Kao) as a dispersant, and 0 of an anionic emulsifier sodium lauryl sulfate (SDS) 375 g of a 5% aqueous solution was put into a 1 L separable flask and sufficiently dispersed. Then, squid type stirring blade 200 rpm stirring, N ₂ The temperature was 60 ° C. under a gas stream. To this, 1.5 g of styrene, methacrylic acid as a monomer, 0.6 g of divinylbenzene, 1.5 g of tertiary butyl peroxy 2-ethylhexanate (manufactured by NOF Corporation; Perbutyl O) as a polymerization initiator, and nonionic properties as a dispersant A mixture of 75 g of 0.5% aqueous solution of emulsifier “Emulgen 150” (manufactured by Kao) and 75 g of 0.5% aqueous solution of anionic emulsifier sodium lauryl sulfate (SDS) was added by emulsification by ultrasonic fine dispersion at 10 ° C. or less. And reacted. Thereafter, the temperature was further raised to 80 ° C. and continued for 3 hours to complete the reaction. Then, it cooled to room temperature and removed the coarse thing with the 500 mesh stainless steel net | network, and also removed the nonmagnetic component in the magnetic refinement | purification.
[0058]
Surface coating polymerization 9 (formation of second coating polymer layer);
30 g of particles covered with the first coating polymer layer obtained by surface coating polymerization 2 and 900 g of 0.5% aqueous solution of nonionic emulsifier “Emulgen 150” (manufactured by Kao) as a dispersing agent are put into a 1 L separable flask. And fully dispersed. To this, 6 g of cyclohexyl methacrylate and 1.5 g of methacrylic acid are added as monomers, and 0.6 g of tertiary butyl peroxy 2-ethylhexanate (manufactured by NOF Corporation; Perbutyl O) is added as a polymerization initiator, followed by stirring at 200 rpm. , N ₂ The reaction was carried out at 80 ° C. for 8 hours under a gas stream. Then, it cooled to room temperature and removed the coarse thing with the 500 mesh stainless steel net | network, and also removed the nonmagnetic component in the magnetic refinement | purification.
[0059]
Surface coating polymerization 10 (formation of second coating polymer layer);
30 g (solid content) of particles covered with the first coating polymer layer obtained in the surface coating polymerization 3 and 900 g of 0.5% aqueous solution of nonionic emulsifier “Emulgen 150” (manufactured by Kao) as a dispersing agent It was put into a bull flask and sufficiently dispersed. To this, 6 g of styrene as a monomer, 1.5 g of methacrylic acid, 0.6 g of tertiary butyl peroxy 2-ethylhexanate (manufactured by NOF Corporation; Perbutyl O) as a polymerization initiator, N ₂ The reaction was carried out at 80 ° C. for 8 hours under a gas stream. Then, it cooled to room temperature and removed the coarse thing with the 500 mesh stainless steel net | network, and also removed the nonmagnetic component in the magnetic refinement | purification.
[0060]
Surface coating polymerization 11 (formation of second coating polymer layer);
30 g (solid content) of particles covered with the first coating polymer layer obtained in the surface coating polymerization 5 and 900 g of 0.5% aqueous solution of nonionic emulsifier “Emulgen 150” (manufactured by Kao) as a dispersing agent It was put into a bull flask and sufficiently dispersed. To this, 3 g of cyclohexyl methacrylate, 0.2 g of divinylbenzene, 0.5 g of methacrylic acid, 0.5 g of polyethylene glycol (n = 9) monomethacrylate, and tertiary butyl peroxy 2-ethylhexanate (Nippon Yushi) as a polymerization initiator Made by the company; Perbutyl O) 0.6g, Ikari type stirring blade 200rpm stirring, N ₂ The reaction was carried out at 80 ° C. for 8 hours under a gas stream. Then, it cooled to room temperature and removed the coarse thing with the 500 mesh stainless steel net | network, and also removed the nonmagnetic component in the magnetic refinement | purification.
[0061]
Surface coating polymerization 12 (formation of second coating polymer layer);
30 g (solid content) of particles covered with the first coating polymer layer obtained by surface coating polymerization 8 and 900 g of 0.5% aqueous solution of nonionic emulsifier “Emulgen 150” (manufactured by Kao) as a dispersing agent It was put into a bull flask and sufficiently dispersed. To this was added 3 g of styrene as a monomer, 0.2 g of acrylic acid, and 0.6 g of tertiary butyl peroxy 2-ethylhexanate (manufactured by NOF Corporation; Perbutyl O) as a polymerization initiator, N ₂ The reaction was carried out at 80 ° C. for 8 hours under a gas stream. Then, it cooled to room temperature and removed the coarse thing with the 500 mesh stainless steel net | network, and also removed the nonmagnetic component in the magnetic refinement | purification.
[0062]
Surface coating polymerization 13 (formation of second coating polymer layer);
30 g (solid content) of particles covered with the first coating polymer layer obtained by surface coating polymerization 8 and 900 g of 0.5% aqueous solution of nonionic emulsifier “Emulgen 150” (manufactured by Kao) as a dispersing agent It was put into a bull flask and sufficiently dispersed. To this was added 3 g of styrene as a monomer, 0.5 g of glycidyl methacrylate, and 0.6 g of tertiary butyl peroxy 2-ethylhexanate (manufactured by NOF Corporation; Perbutyl O) as a polymerization initiator, and stirring with an icari type stirring blade at 200 rpm. N ₂ The reaction was carried out at 80 ° C. for 8 hours under a gas stream. Then, it cooled to room temperature and removed the coarse thing with the 500 mesh stainless steel net | network, and also removed the nonmagnetic component in the magnetic refinement | purification.
[0063]
Surface coating polymerization 14 (formation of second coating polymer layer);
30 g (solid content) of particles covered with the first coating polymer layer obtained by surface coating polymerization 8 and 900 g of 0.5% aqueous solution of nonionic emulsifier “Emulgen 150” (manufactured by Kao) as a dispersing agent It was put into a bull flask and sufficiently dispersed. To this, 3 g of styrene as a monomer, 0.5 g of methacrylic acid, 0.5 g of glycerol monomethacrylate, and 0.6 g of tertiary butyl peroxy 2-ethyl hexanate (manufactured by NOF Corporation; Perbutyl O) as a polymerization initiator were added. Squid type stirring blade 200rpm stirring, N ₂ The reaction was carried out at 80 ° C. for 8 hours under a gas stream. Then, it cooled to room temperature and removed the coarse thing with the 500 mesh stainless steel net | network, and also removed the nonmagnetic component in the magnetic refinement | purification.
[0064]
Reference Example 1 (Method of simultaneously forming a magnetic layer and a coating polymer layer by polymerization);
Acetone is added to the oil-based magnetic fluid “FV55” (manufactured by Matsumoto Yushi Co., Ltd.) to precipitate and precipitate particles, and then dried to obtain 4.8 g of the obtained superparamagnetic powder of 0.5%. Disperse in 420 g of sodium lauryl sulfate and add 4.2 g of styrene. ₂ The mixture was stirred at 55 ° C. for 1 hour under a gas stream. To this mixture was added 30 g of core particles 1 (polystyrene; average particle diameter 2.1 μm, CV value 1.5%) dispersed in 8 g of potassium persulfate and 560 g of 0.5% sodium lauryl sulfate. After 6 hours, 4.2 g of styrene and 7 g of potassium persulfate were added, and the mixture was further stirred for 15 hours. Then, it cooled to room temperature and removed the coarse thing with the 500 mesh stainless steel net | network, and also removed the nonmagnetic component in the magnetic refinement | purification. 5 g (solid content) of the obtained particles are dispersed in 150 g of 0.5% sodium lauryl sulfate, 2 g of styrene, 1 g of methacrylic acid and 1 g of potassium persulfate are added, and the stirring of the squid type stirring blade is performed at 200 rpm, N ₂ The mixture was stirred at 55 ° C. for 4 hours under a gas stream. Then, it cooled to room temperature and removed the coarse thing with the 500 mesh stainless steel net | network, and also removed the nonmagnetic component in the magnetic refinement | purification.
[0065]
Examples 1-12 and Comparative Examples 1-3;
Combining the preparation method of the above core particles, the method of coating the core material with the magnetic material, and the surface coating polymerization method of the magnetic material-coated particles as shown in Table 1 (Example) and Table 2 (Comparative Example) Manufactured. The following evaluation was performed on the obtained particles.
[0066]
Evaluation 1: Evaluation of magnetic capture rate
The obtained diagnostic drug particles were dispersed in water as a dispersion medium and adjusted so that a 1 wt% test solution was obtained. 1 ml of this test solution was placed in an Eppendorf tube, and the magnetic capture rate was measured when 4000 gauss magnetism was applied for 1 minute from the lateral direction after stirring.
[0067]
Evaluation 2: Evaluation as a carrier for EIA
2.0 mg of the diagnostic drug particles obtained in Examples 1 to 14 and Comparative Examples 1 to 3 were placed in a test tube. To this, 0.5 mL of a substrate reaction solution (o-phenylenediamine: 13 mg, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 5.0): 50 mL, 30% hydrogen peroxide: 15 μL) was added, and 1 at room temperature under light shielding. Reacted for hours. Thereafter, the particles were removed by centrifugation, and the absorbance (wavelength 446 nm) of the supernatant was measured.
[0068]
Result 1: Evaluation result of magnetic capture rate
The diagnostic drug particles of the examples all had a magnetic capture rate of 99% by weight or more. This is because the particle size distribution is narrow and the magnetic response is uniform.
[0069]
On the other hand, none of the diagnostic drug particles of the comparative examples had a magnetic capture rate of 99% by weight or more. In Comparative Examples 1 and 2, the particle size distribution of diagnostic particles is wide and the magnetic responsiveness is non-uniform. In Comparative Example 3, the reason is that the magnetic substance content is as low as 11%. can give.
[0070]
Result 2: Evaluation results as a carrier for EIA
When using particles as a carrier for EIA, the particles themselves do not interact with the substrate solution at all so as not to interfere with the analysis result, and need not show an influence such as color development. None of the particles in the examples generally had low absorbance, and did not exhibit abnormal color development. This is because the exposure of the magnetic substance to the particle surface or the elution of the magnetic substance or iron ions from the particle is extremely small. This result shows that these particles are suitable when used as a carrier for a diagnostic agent using the EIA method or the like because they do not adversely affect the measured value.
[0071]
On the other hand, Comparative Example 3 showed an abnormally high color development. The particles produced by this method (Reference Example 1) are presumed to be caused by incomplete polymer coating of the magnetic material and exposure of the magnetic material. This result indicates that these particles cause an increase in the background value of analysis, resulting in a decrease in measurement sensitivity, and are unsuitable as a diagnostic drug carrier.
[0072]
[Table 1]

[0073]
[Table 2]

[0074]
【The invention's effect】
According to the method of the present invention, it is possible to easily and efficiently produce diagnostic particles having a uniform particle size that has never been obtained. The diagnostic drug particles can be applied to biochemical carriers such as a diagnostic drug carrier, and as an application example to medical diagnostic drugs, in particular, particles for automatic measuring instruments.

Claims

A mother particle in which a magnetic layer is formed on the surface of a core particle, the magnetic layer including at least one of Fe ₂ O ₃ and Fe ₃ O ₄ , and an average particle diameter of the core particle is 0.4. A method for producing diagnostic drug particles, comprising a step of forming a polymer layer on the magnetic layer by polymerization in the presence of the mother particle of ˜200 μm.

In claim 1,
The magnetic material layer has a hydrophobic surface, and is a method for producing diagnostic particles.

In claim 1 or 2,
The thickness of the said magnetic body layer is a manufacturing method of the particle | grains for diagnostic agents which are 0.005-20 micrometers.

In any one of Claims 1-3,
The mother particles are a mixture of the core particles having a CV value of 20% or less and magnetic fine particles containing at least one of Fe ₂ O ₃ and Fe ₃ O ₄ , and the magnetic fine particles are placed on the surface of the core particles. A method for producing diagnostic particles, which is formed by physical adsorption.

In any one of Claims 1-4,
The step of forming the polymer layer includes a step of dispersing the mother particles in an aqueous medium and a step of emulsion polymerization of a polymerizable monomer in the presence of the mother particles.

In any one of Claims 1-5,
The method for producing diagnostic particles, wherein the polymer layer has a thickness of 0.005 to 20 μm.

In any one of Claims 1-6,
Furthermore, the manufacturing method of the particle | grains for diagnostic agents including the process of forming a polymer layer further by superposition | polymerization on the said polymer layer.