JP2004198405A - 安息香酸の定量分析方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】溶液中の安息香酸分子を選択的に捕捉することによって、これを定量し、または溶液中から安息香酸分子を選択的に除去して他の成分の定量を容易にする分析方法を提供する。
【解決手段】安息香酸分子と機能性モノマーとの複合体を形成し、その周囲を架橋剤で重合し、安息香酸分子を除去することによって得られる安息香酸分子の鋳型を有する高分子。
【選択図】なし
【解決手段】安息香酸分子と機能性モノマーとの複合体を形成し、その周囲を架橋剤で重合し、安息香酸分子を除去することによって得られる安息香酸分子の鋳型を有する高分子。
【選択図】なし
Description
本発明は、安息香酸の定量法に関し、さらに詳しくは安息香酸分子の鋳型を有する高分子を用いて溶液中の安息香酸分子を選択的に捕捉し、安息香酸を定量分析する方法に関する。
栄養ドリンク剤等の液体状の医薬品や食品には、種々の成分が配合されているが、その中には防腐剤として安息香酸が配合されていることが多い。この安息香酸そのものは主薬成分ではないが、ドリンク剤等の長期保存に不可欠な成分であり、品質管理上その含有量を確認しておく必要がある。
しかし、シリカゲル等を充填剤とした高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による定量分析法は、多くの配合成分を同時定量するのに適しているが、安息香酸とピークが重なる成分が配合されている場合には、安息香酸については別の方法で定量する等の措置が必要であった。そして、このことは、配合成分の種類によって、換言すれば、製品毎に定量試験の方法が異なるという事態を招来し、ドリンク剤等の多種成分を配合した液体状製品の定常的な品質管理業務を遂行する上で障害となっていた。
また、最近、ＨＰＬＣのための充填剤として、より高い分離能をもち、選択性に優れたものが開発されており、その中の一つにモレキュラーインプリンティング法を用いて調製したカラム充填剤があり、文献等で紹介されている（特許文献１、非特許文献１、非特許文献２参照。）。
本発明は、溶液中の安息香酸分子を選択的に捕捉することによって、これを定量し、または溶液中から安息香酸分子を選択的に除去して他の成分の定量を容易にする分析方法を提供することを課題とする。
発明者らは、かかる課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、安息香酸分子を鋳型分子とするカラム充填剤を形成し、これに安息香酸を含有する溶液を通過させて安息香酸分子を選択的に捕捉し、定量できることを見出した。また、かかるカラム充填剤を用いて安息香酸分子を選択的に除去しうるため、安息香酸とピークが重なり、安息香酸が定量を妨害している成分を迅速に定量しうることをも見出した。
かかる知見に基づき完成した本発明の態様の一つは、安息香酸分子と機能性モノマーとの複合体を形成し、その周囲を架橋剤で重合し、安息香酸分子を除去することによって得られる安息香酸分子の鋳型を有する高分子である。
本発明により、ドリンク剤等に配合された安息香酸のみを選択的に捕捉し、これを定量すること、又は安息香酸を除去して他の成分の定量を容易にすることが可能となった。
本発明の他の態様は、前記安息香酸分子の鋳型を有する高分子を用いて溶液中の安息香酸分子を選択的に捕捉し、安息香酸を定量する方法である。
本発明の他の態様は、前記安息香酸分子の鋳型を有する高分子をカラムに充填し、安息香酸を含有する溶液を展開させて、安息香酸を選択的に定量する方法である。
本発明の他の態様は、前記安息香酸分子の鋳型を有する高分子を用いて安息香酸を含有する溶液から安息香酸を選択的に除去する方法である。
本発明の「安息香酸の鋳型を有する高分子」（以下、適宜「安息香酸モレキュラーインプリントポリマー」、又は「安息香酸ＭＩＰ（ Molecularly Imprinted Polymer ）」と略記する。）とは、安息香酸分子と機能性モノマーとの複合体を形成させ、その周囲を架橋剤で重合し、安息香酸分子を除去することによって得られる、安息香酸分子の認識部位を有する高分子である。
「安息香酸モレキュラーインプリントポリマー」は、多段階膨潤重合法により調製され（非特許文献参照１及び２参照。）、その形状はＨＰＬＣ用カラム充填剤に適するように球形で、レーザー回折／散乱式粒度分布測定装置（HORIBA LA-920）で測定した平均粒子径は約７μｍである。
「安息香酸モレキュラーインプリントポリマー」は主にカラム充填剤として用いられ、安息香酸が分析対象となる場合はその選択的な分離検出のためのカラム充填剤として、安息香酸が妨害物質となる場合はその選択的除去のためのカラム充填剤として機能する。
ここに、「機能性モノマー」とは、鋳型分子と相互作用を有する重合可能な有機分子であって、例えば、ビニルピリジンが挙げられる。また、「複合体」とは鋳型分子と前記機能性モノマーが相互作用により結合したものであり、「架橋剤」とは、２つ以上のビニル基等の重合性基を有する、前記複合体を架橋反応により重合させることができる有機分子であって、例えば、エチレングリコールジメチルアクリレート、ジビニルベンゼンが挙げられる。そして、「安息香酸分子を除去する」には、安息香酸を溶解する性質を有する溶媒、例えば、メタノール、テトラヒドロフランによって、重合体を洗浄すればよい。
本発明における「安息香酸の鋳型を有する高分子」は下のように多段階膨潤重合法を用いて調製する。
（１）第一次膨潤操作として、フタル酸ジブチル等の膨潤助剤をドデシル硫酸ナトリウム等の界面活性剤の水溶液に微分散させ、そこへ水に分散させた種粒子（例えば、粒子径約１μｍのポリスチレン種粒子）を加えて、膨潤助剤の微分散液滴を種粒子に吸着させ、膨潤させる。
なお、ポリスチレン種粒子は、公知の方法から調製できる（非特許文献３参照）。
なお、ポリスチレン種粒子は、公知の方法から調製できる（非特許文献３参照）。
（２）第二次膨潤操作として、重合開始剤（例えば、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル））をトルエン等の希釈剤に溶解した後、水と分散安定剤（例えば、ポリビニルアルコール）の混液中に微分散させる。この操作によって、一次膨潤液滴に重合開始剤の溶解した希釈剤の微分散液滴が取り込まれ膨潤する。
（３）第三次膨潤操作として、安息香酸をエチレングリコールジメタクリレート等の架橋剤に溶かし、４−ビニルピリジン等の機能性モノマーを加えた溶液を水と分散安定化剤（例えば、ポリビニルアルコール）の混液中に分散させ、これを第二段階膨潤操作が終了した液滴に加えて、三次膨潤液滴を形成させる。
（４）三次膨潤液滴をアルゴン等の不活性ガス雰囲気下で重合させ、重合物をメタノール等の低級アルコールに分散させる。その後、重合物を水とテトラヒドロフラン等の有機溶媒で安息香酸分子を除去し、安息香酸の鋳型を有する高分子を得る。これが、安息香酸モレキュラーインプリントポリマーである。
本発明の「安息香酸分子の鋳型を有する高分子」は、安息香酸分子を選択的に捕捉する性質を有し、この性質を利用して安息香酸を含有する溶液中の安息香酸を定量することができる。また、安息香酸が妨害成分として作用する場合には、これを予め選択的に除去し、目的成分の定量を行うこともできる。
例えば、安息香酸モレキュラーインプリントポリマーをカラムに充填し、安息香酸を含む溶液を通過させると、安息香酸分子が選択的に保持され、これを通常の方法で検出し、そのピーク面積から溶液中の安息香酸の濃度が測定できる。また、安息香酸が妨害成分として作用していた場合には安息香酸ＭＩＰを通過した溶液を分析すれば目的成分をスムースに定量できる。
以下に、実施例及び試験例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１ 安息香酸ＭＩＰの調製とその評価
（１）安息香酸ＭＩＰの調製
安息香酸ＭＩＰを公知の方法（非特許文献５参照）を参考に調製した。
（１）安息香酸ＭＩＰの調製
安息香酸ＭＩＰを公知の方法（非特許文献５参照）を参考に調製した。
ポリスチレン（平均粒子径１μｍ）を使用したシード重合によって、すなわち、ポリスチレン、膨潤助剤（フタル酸ジブチル）、ドデシル硫酸ナトリウム及び水に、エチレングリコールジメタクリレート：４−ビニルピリジン：安息香酸（モル比２５：６：２）、重合開始剤（２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（以下、「Ｖ−６５」と略記する。））、ポリビニルアルコール、ドデシル硫酸ナトリウム、トルエン、水を均一に分散したものを添加し、反応させた。
調製に使用した安息香酸（鋳型分子）、４−ビニルピリジン（機能性モノマー、以下「ＶＰＹ」と略記する。）及びエチレングリコールジメタクリレート（架橋剤、以下「ＥＤＭＡ」と略記する。）の構造を以下に示す。
（２）安息香酸ＭＩＰの調製手順
安息香酸ＭＩＰは以下のように多段階膨潤重合法を用いて調製する。
安息香酸ＭＩＰは以下のように多段階膨潤重合法を用いて調製する。
まず、第一次膨潤操作として、膨潤助剤としてフタル酸ジブチル０．４８ｍＬを、超音波発生機（（株）トミー精工製、ＵＤ−２０１）を用いてドデシル硫酸ナトリウム溶液（２ｍｇ／ｍＬ）１０ｍＬ中に微分散させ、そこへ水に分散させた粒子径約１μｍのポリスチレン種粒子（０．４９７ｇ／ｍＬ）０．１７ｍＬを加えた。ここでフタル酸ジブチルの微分散液滴が、ポリスチレン種粒子に吸着し、膨潤する。この一段階目の膨潤操作は室温でスターラーを用いて１２５ｒｐｍで攪拌しながら、フタル酸ジブチルの微分散液滴がなくなるまで行った（約１５時間）。
次に、Ｖ−６５（重合開始剤）０．３７５ｇをトルエン５ｍＬに溶かし、超音波発生機を用いて水１２．５ｍＬと４．８質量％ポリビニルアルコール溶液１０ｍＬの混液中に微分散させ、これを一段階目の膨潤操作が終了した溶液に加えた。ここで一次膨潤液滴に重合開始剤の溶解したトルエンの微分散液滴が取り込まれ膨潤する。この二段階目の膨潤操作も１２５ｒｐｍで攪拌しながら、室温で重合開始剤の溶解したトルエンの微分散液滴がなくなるまで（約２時間）行った。
続いて、安息香酸０．２４４ｇをＥＤＭＡ５ｍＬに溶かし、ＶＰＹ０．６４ｍＬを加えた溶液を同様に超音波発生機を用いて水１２．５ｍＬとポリビニルアルコール溶液１０ｍＬの混液中に微分散させ、これを二段階目の膨潤操作が終了した溶液に加え、微分散液滴がなくなるまで室温で三段階目の膨潤操作を行った（約２時間）。
三段階目の膨潤操作終了後、溶液を重合用のリアクターに移し、１２５ｒｐｍで攪拌しながらアルゴンガスで２０分間バブリングを行った。その後、攪拌を続けながら５０℃の油浴上で加熱し、重合反応を行った（２４時間）。
反応終了後、重合させた粒子をメタノール２５０ｍＬ中に分散させた。粒子が沈降したら上澄み液を捨て、同様の操作を順次メタノール、水、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を用いて各２回ずつ行いポリマー粒子を洗浄した。最後に得られたポリマー粒子をメンブランフィルター上に回収し、ＴＨＦ及びアセトンで洗浄し、室温で風乾させた。得られたポリマーの収量は約５ｇであった。
（３）試薬
ＶＰＹ、ＥＤＭＡは東京化成より購入し、精製を行わずにそのまま使用した。ポリスチレン種粒子は公知の方法（非特許文献３参照）を参考にして調製したもの（０．４９７ｇ／ｍＬ）を使用した。安息香酸、Ｖ−６５はナカライテスク（株）、和光純薬（株）よりそれぞれ購入した。
ＶＰＹ、ＥＤＭＡは東京化成より購入し、精製を行わずにそのまま使用した。ポリスチレン種粒子は公知の方法（非特許文献３参照）を参考にして調製したもの（０．４９７ｇ／ｍＬ）を使用した。安息香酸、Ｖ−６５はナカライテスク（株）、和光純薬（株）よりそれぞれ購入した。
比較例１ ブランクポリマーの調製
実施例１と同様にして安息香酸を含まないブランクポリマー（以下、「ＢＰ」と略記する。）を調製した。ここで、ＢＰを調製する場合には、安息香酸を添加せずに、ＥＤＭＡ５ｍＬ及びＶＰＹ０．６４ｍＬを微分散させた。
実施例１と同様にして安息香酸を含まないブランクポリマー（以下、「ＢＰ」と略記する。）を調製した。ここで、ＢＰを調製する場合には、安息香酸を添加せずに、ＥＤＭＡ５ｍＬ及びＶＰＹ０．６４ｍＬを微分散させた。
試験例１ ポリマーの物性評価
（１）ポリマー形状の光学顕微鏡による観察
得られたポリマーの形状を光学顕微鏡で観察したところ、安息香酸ＭＩＰとＢＰで形状の差はなく、両ポリマーともに粒子径の揃った球形のポリマーであった。
（１）ポリマー形状の光学顕微鏡による観察
得られたポリマーの形状を光学顕微鏡で観察したところ、安息香酸ＭＩＰとＢＰで形状の差はなく、両ポリマーともに粒子径の揃った球形のポリマーであった。
（２）元素分析
安息香酸ＭＩＰ及びＢＰの元素分析を行い、それぞれの窒素含量を比較することで、それぞれのポリマーへの４−ビニルピリジン導入量の差の有無を確認した。
安息香酸ＭＩＰ及びＢＰの元素分析を行い、それぞれの窒素含量を比較することで、それぞれのポリマーへの４−ビニルピリジン導入量の差の有無を確認した。
結果を表１に示す。安息香酸ＭＩＰとＢＰの窒素含有量のはいずれもほぼ一致し、各ポリマーへのピリジル基導入量に差はないことが確認された。また、理論値と実測値とにわずかに差が認められるが、これはポリマーに取り込まれている水分によるものと推察されたため、炭素含有量と窒素含有量との比を算出し理論値と実測値とを比較したところ、両者は一致した。このことから、モノマーの仕込比に準じた共重合が行われていると考えられる。
（３）粒度分布測定
レーザー回折／散乱式粒度分布測定装置（（株）堀場製作所製 ＬＡ−９２０）を用いて、合成した各ポリマーの粒子径及び粒度分布を測定した。なお、分散媒としてエタノールを用いた。
レーザー回折／散乱式粒度分布測定装置（（株）堀場製作所製 ＬＡ−９２０）を用いて、合成した各ポリマーの粒子径及び粒度分布を測定した。なお、分散媒としてエタノールを用いた。
安息香酸ＭＩＰとＢＰの粒度分布測定結果を図１に示す。
平均粒子径は安息香酸ＭＩＰでは７．０５μｍ（４回の繰り返し測定結果の相対標準偏差＝０．３％）であり、ＢＰでは７．０４μｍであり、ほぼ同等であることを確認した。また、粒度分布についても、粒度のバラツキの度合いには差がないことを確認した。
以上の結果より、安息香酸ＭＩＰとＢＰとでは、調製時における安息香酸の添加の有無の点で違いがあるが、得られたポリマーの形状、官能基導入量、粒子径などの諸物性がいずれも同等であることが確認された。
試験例２ ポリマーの性能評価
（１）安息香酸保持性能
上記で得られた安息香酸ＭＩＰ及びＢＰ約１．３ｇをメタノール：２−プロパノール＝２：１（ｖ／ｖ）の混合液１５ｍＬ中に超音波洗浄機を用いて充分懸濁させた後、パッカーを介してステンレスカラム（内径４．６ｍｍ、長さ５ｃｍ）へ導入した。次に、メタノールを充填圧力９．８１×１０６Ｐａで３０分間流した。次にパッカーを外し、蓋をした後、水／メタノール＝１：１（ｖ／ｖ）の混合液を０．２ｍＬ／ｍｉｎで１２時間流して洗浄した。実施例１等で得られた安息香酸ＭＩＰ及びＢＰカラムを使用して、安息香酸に対する保持性能をＨＰＬＣ法にて評価した。
（１）安息香酸保持性能
上記で得られた安息香酸ＭＩＰ及びＢＰ約１．３ｇをメタノール：２−プロパノール＝２：１（ｖ／ｖ）の混合液１５ｍＬ中に超音波洗浄機を用いて充分懸濁させた後、パッカーを介してステンレスカラム（内径４．６ｍｍ、長さ５ｃｍ）へ導入した。次に、メタノールを充填圧力９．８１×１０６Ｐａで３０分間流した。次にパッカーを外し、蓋をした後、水／メタノール＝１：１（ｖ／ｖ）の混合液を０．２ｍＬ／ｍｉｎで１２時間流して洗浄した。実施例１等で得られた安息香酸ＭＩＰ及びＢＰカラムを使用して、安息香酸に対する保持性能をＨＰＬＣ法にて評価した。
（２）ＨＰＬＣ条件
カラム：安息香酸ＭＩＰカラム ４．６ｍｍ（I.D.）×５０ｍｍ
ＢＰカラム ４．６ｍｍ（I.D.）×５０ｍｍ
流量 ：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
温度 ：３０℃
検出器：ＵＶ２２０ｎｍ
移動相：２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ3.0）／アセトニトリル（６０：４０）
カラム：安息香酸ＭＩＰカラム ４．６ｍｍ（I.D.）×５０ｍｍ
ＢＰカラム ４．６ｍｍ（I.D.）×５０ｍｍ
流量 ：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
温度 ：３０℃
検出器：ＵＶ２２０ｎｍ
移動相：２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ3.0）／アセトニトリル（６０：４０）
（３）結果及び考察
得られたクロマトグラムを図２に示す。
得られたクロマトグラムを図２に示す。
クロマトグラムから算出した各ポリマー充填カラムの安息香酸の保持係数（k安息香酸）及び選択係数（kMIP/kBP）を表２に示す。なお、保持係数 k は、アセトンを用いてｔ0を求め、k ＝（ｔ安息香酸−ｔ0）／ｔ0から算出した。
その結果、安息香酸の k は安息香酸ＭＩＰとＢＰとで差があり、選択係数は１．４であった。選択係数１．４とは、安息香酸ＭＩＰの安息香酸に対する保持能力がＢＰのそれよりも１．４倍大きいことを意味する。安息香酸ＭＩＰとＢＰは、形状、官能基導入量及び粒子径などの諸物性が同等であるため、この保持係数の差はポリマーの物性の差に起因するものではなく、安息香酸ＭＩＰの網目構造に構築された認識部位に安息香酸が選択的に保持される効果によるものである。
以上の結果から、調製した安息香酸ＭＩＰは安息香酸に対する選択的認識部位を有することが確認された。
試験例３ 安息香酸ＭＩＰカラムを用いたＨＰＬＣ法による安息香酸ナトリウム試薬の含量測定−市販ＯＤＳカラムとの比較
前記実施例１と同様の方法で調製した安息香酸ＭＩＰカラムと市販のＯＤＳカラム（ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ：東ソー（株）製）を使用して、安息香酸ナトリウム試薬の含量測定をＨＰＬＣ法にて行った。
前記実施例１と同様の方法で調製した安息香酸ＭＩＰカラムと市販のＯＤＳカラム（ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ：東ソー（株）製）を使用して、安息香酸ナトリウム試薬の含量測定をＨＰＬＣ法にて行った。
（１）ＨＰＬＣ条件
カラム：安息香酸ＭＩＰカラム ４．６ｍｍ（I.D.）×１００ｍｍ
ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ ４．６ｍｍ（I.D.）×１５０ｍｍ
流量 ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
温度 ：５０℃
検出器：ＵＶ２３０ｎｍ
移動相：メタノール：水：リン酸＝５５０：４５０：１（ｖ／ｖ／ｖ）
カラム：安息香酸ＭＩＰカラム ４．６ｍｍ（I.D.）×１００ｍｍ
ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ ４．６ｍｍ（I.D.）×１５０ｍｍ
流量 ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
温度 ：５０℃
検出器：ＵＶ２３０ｎｍ
移動相：メタノール：水：リン酸＝５５０：４５０：１（ｖ／ｖ／ｖ）
（２）試験方法
安息香酸ナトリウム試薬３０ｍｇを量り取り、水を加えて溶かし、５０ｍＬとする。この液から１ｍＬを量り取り、移動相を加えて５０ｍＬとする。これを試料溶液とする。また、別途、標準品（安息香酸ナトリウム）を１１０℃で４時間乾燥し、その中から３０ｍｇを量り取り、水を加えて溶かし、５０ｍＬとする。この液から１ｍＬを量り取り、移動相を加えて５０ｍＬとする。これを標準溶液とする。標準溶液及び試料溶液５０μＬにつき、前記条件で液体クロマトグラフ法によって試験を行い、安息香酸のピーク面積ＡＴ及びＡＳを求める。
安息香酸ナトリウム試薬３０ｍｇを量り取り、水を加えて溶かし、５０ｍＬとする。この液から１ｍＬを量り取り、移動相を加えて５０ｍＬとする。これを試料溶液とする。また、別途、標準品（安息香酸ナトリウム）を１１０℃で４時間乾燥し、その中から３０ｍｇを量り取り、水を加えて溶かし、５０ｍＬとする。この液から１ｍＬを量り取り、移動相を加えて５０ｍＬとする。これを標準溶液とする。標準溶液及び試料溶液５０μＬにつき、前記条件で液体クロマトグラフ法によって試験を行い、安息香酸のピーク面積ＡＴ及びＡＳを求める。
安息香酸ナトリウム試薬含量（％）＝標準品の採取量（ｍｇ）×(ＡＴ／ＡＳ)×（１／安息香酸試薬採取量（ｍｇ））×１００
（３）試薬
安息香酸ナトリウム試薬は試薬特級品の室温保存品であり、乾燥せずにそのまま試験に用いた。安息香酸ナトリウム標準品は、住化ファインケム（株）より購入し、第１４改正日本薬局方の安息香酸ナトリウムの定量法に準じて試験を行い、定量値が１００．０％のものを用いた。その他の試薬はすべて試薬特級品をそのまま使用した。
安息香酸ナトリウム試薬は試薬特級品の室温保存品であり、乾燥せずにそのまま試験に用いた。安息香酸ナトリウム標準品は、住化ファインケム（株）より購入し、第１４改正日本薬局方の安息香酸ナトリウムの定量法に準じて試験を行い、定量値が１００．０％のものを用いた。その他の試薬はすべて試薬特級品をそのまま使用した。
（４）測定結果
安息香酸ＭＩＰカラムと市販のＯＤＳカラムによる安息香酸ナトリウム試薬の含量測定結果を表３に示す。また、各カラムでの安息香酸ナトリウムの標準溶液と試料溶液のクロマトグラムを図３に示す。安息香酸ＭＩＰカラムでは、安息香酸に対する保持性能が強いため、市販のＯＤＳカラムと比較してピークの広がりを生じるが、両カラムによる安息香酸ナトリウム試薬の含量定量結果は一致し、３回のくり返し試験結果の相対標準偏差もともに１％以下でほぼ同等であった。安息香酸ナトリウム試薬の含量測定において、安息香酸ＭＩＰカラムは、市販ＯＤＳカラムと同等の定量値を示し、分析カラムとして充分に機能することを確認した。
安息香酸ＭＩＰカラムと市販のＯＤＳカラムによる安息香酸ナトリウム試薬の含量測定結果を表３に示す。また、各カラムでの安息香酸ナトリウムの標準溶液と試料溶液のクロマトグラムを図３に示す。安息香酸ＭＩＰカラムでは、安息香酸に対する保持性能が強いため、市販のＯＤＳカラムと比較してピークの広がりを生じるが、両カラムによる安息香酸ナトリウム試薬の含量定量結果は一致し、３回のくり返し試験結果の相対標準偏差もともに１％以下でほぼ同等であった。安息香酸ナトリウム試薬の含量測定において、安息香酸ＭＩＰカラムは、市販ＯＤＳカラムと同等の定量値を示し、分析カラムとして充分に機能することを確認した。
試験例４ 安息香酸ＭＩＰによるドリンク製剤中の安息香酸ナトリウムの定量
前記試験例２で得られた安息香酸ＭＩＰカラムを使用して、市販ドリンク製剤中の安息香酸ナトリウムの定量をＨＰＬＣ法で行った。
前記試験例２で得られた安息香酸ＭＩＰカラムを使用して、市販ドリンク製剤中の安息香酸ナトリウムの定量をＨＰＬＣ法で行った。
（１）ＨＰＬＣ条件
カラム：安息香酸ＭＩＰカラム ４．６ｍｍ（I.D.）×５０ｍｍ
流量 ：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
温度 ：５０℃
検出器：ＵＶ２３０ｎｍ
移動相：メタノール：水：リン酸＝５５０：４５０：１（ｖ／ｖ／ｖ）
カラム：安息香酸ＭＩＰカラム ４．６ｍｍ（I.D.）×５０ｍｍ
流量 ：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
温度 ：５０℃
検出器：ＵＶ２３０ｎｍ
移動相：メタノール：水：リン酸＝５５０：４５０：１（ｖ／ｖ／ｖ）
（２）定量方法
試料の一定量（安息香酸ナトリウム０．６ｍｇを含む量）を量り取り、水／メタノール／リン酸（５００：５００：１）混液を加えて５０ｍＬとする。これを試料溶液とする。また、別途、標準品（安息香酸ナトリウム）を１１０℃で４時間乾燥し、その中から３０ｍｇを量り取り、水を加えて溶かし、５０ｍＬとする。この液から１ｍＬを量り取り、水／メタノール／リン酸（５００：５００：１）混液を加えて５０ｍＬとする。これを標準溶液とする。標準溶液及び試料溶液５０μＬにつき、前記条件で液体クロマトグラフ法によって試験を行い、安息香酸のピーク面積ＡＴ及びＡＳを求める。
試料の一定量（安息香酸ナトリウム０．６ｍｇを含む量）を量り取り、水／メタノール／リン酸（５００：５００：１）混液を加えて５０ｍＬとする。これを試料溶液とする。また、別途、標準品（安息香酸ナトリウム）を１１０℃で４時間乾燥し、その中から３０ｍｇを量り取り、水を加えて溶かし、５０ｍＬとする。この液から１ｍＬを量り取り、水／メタノール／リン酸（５００：５００：１）混液を加えて５０ｍＬとする。これを標準溶液とする。標準溶液及び試料溶液５０μＬにつき、前記条件で液体クロマトグラフ法によって試験を行い、安息香酸のピーク面積ＡＴ及びＡＳを求める。
試料中の安息香酸ナトリウム濃度（ｍｇ／ｍＬ）＝標準品の採取量（ｍｇ）×（ＡＴ／ＡＳ）×０．０２／試料採取量（ｍＬ）
（３）試薬
安息香酸ナトリウム標準品は、試験例２で用いたものを使用した。その他の試薬はすべて特級品をそのまま使用した。
安息香酸ナトリウム標準品は、試験例２で用いたものを使用した。その他の試薬はすべて特級品をそのまま使用した。
（４）試料
試料として市販の製剤（栄養ドリンク剤）Ａ〜Ｃを使用した。製剤Ａは洋薬８成分、製剤Ｂは生薬１７種類に洋薬４成分、製剤Ｃは生薬１種類に洋薬７成分をそれぞれ配合した製剤であり、防腐剤として安息香酸ナトリウムをそれぞれ配合したものである。
試料として市販の製剤（栄養ドリンク剤）Ａ〜Ｃを使用した。製剤Ａは洋薬８成分、製剤Ｂは生薬１７種類に洋薬４成分、製剤Ｃは生薬１種類に洋薬７成分をそれぞれ配合した製剤であり、防腐剤として安息香酸ナトリウムをそれぞれ配合したものである。
（５）直線性の評価
安息香酸ＭＩＰカラムを用い、前記（１）のＨＰＬＣ条件にて安息香酸ナトリウム標準溶液の直線性を評価した。
安息香酸ＭＩＰカラムを用い、前記（１）のＨＰＬＣ条件にて安息香酸ナトリウム標準溶液の直線性を評価した。
その結果、安息香酸ナトリウム１２．８８〜３８．６４μｇ／ｍＬの濃度範囲において、相関係数０．９９９９以上のほぼ原点を通る良好な直線性を示した（図４）。
（６）安息香酸ＭＩＰカラムによる製剤Ａ中の安息香酸ナトリウムの定量法の検討−特異性及び添加回収率の評価
安息香酸ＭＩＰカラムを用いて（１）のＨＰＬＣ条件下に、製剤Ａ中の安息香酸ナトリウムの定量法検討として、特異性及び添加回収率の評価を行った。
安息香酸ＭＩＰカラムを用いて（１）のＨＰＬＣ条件下に、製剤Ａ中の安息香酸ナトリウムの定量法検討として、特異性及び添加回収率の評価を行った。
その結果、安息香酸ナトリウム抜き試料溶液の安息香酸の溶出位置に妨害ピークは認められず、特異性は良好であった（図５(ｃ)）。
また、安息香酸ナトリウム抜き試料溶液に安息香酸ナトリウムを添加した試料溶液を調製し、添加回収試験を実施した。その結果、回収率は１００．１％（３回のくり返し試験結果の相対標準偏差＝０．３％）と良好であった。
以上の結果より、設定した分析条件は製剤Ａ中の安息香酸の定量分析条件として良好であることが確認できた。
さらに、図５(ｄ)に示すように、今回の試料溶液の希釈溶媒として用いた水／メタノール／リン酸（５００：５００：１）混液１０μＬを注入した場合でも、安息香酸の溶出位置にピークは認められなかった。ＭＩＰは鋳型分子に対する吸着力が強いため、認識部位に鋳型分子が残存し、それが分析時に妨害ピークとなることがある。しかし、今回は、そのような妨害ピークはなく、問題のないことが確認できた。
（７）ＢＰカラムによる製剤Ａ中の安息香酸ナトリウムの定量法の検討−特異性及び添加回収率の評価
前記（６）と同じ条件でＢＰカラム（カラムサイズ：４．６ｍｍ(I.D.)×５０ｍｍ）を用いて同様の試験を行った。
前記（６）と同じ条件でＢＰカラム（カラムサイズ：４．６ｍｍ(I.D.)×５０ｍｍ）を用いて同様の試験を行った。
その結果、ＢＰカラムでも安息香酸は保持されるが、保持係数が安息香酸ＭＩＰに比して小さいため、夾雑成分のピーク（香料成分由来のものと推察される。）との分離が不十分であり（図６(ｃ)）、添加回収率が１００％とならず、高値を示すことがわかった。安息香酸ＭＩＰに比してＢＰでは他の成分との分離選択性が劣るため、以後の検討では安息香酸ＭＩＰを用いた。
（８）安息香酸ＭＩＰカラムによる製剤中の安息香酸ナトリウムの定量
前記（１）のＨＰＬＣ条件で、製剤Ａ、Ｂ及びＣ中の安息香酸ナトリウムの定量を試みた。
前記（１）のＨＰＬＣ条件で、製剤Ａ、Ｂ及びＣ中の安息香酸ナトリウムの定量を試みた。
その結果、何れの製剤においても設定した分析条件でほぼ理論値通りの定量値が得られた（下表４）。各製剤の試料溶液を注入したときのクロマトグラムを図７に示す。このように安息香酸ＭＩＰカラムを用いることにより、処方の異なる複数のドリンク剤から安息香酸を簡易に、かつ精度よく分析できることが確認された。
（９）市販ＯＤＳカラムによる製剤Ｂ中の安息香酸ナトリウムの分析
前記（１）のＨＰＬＣ条件において、カラムサイズ４．６ｍｍ（I.D.）×１５０ｍｍの市販ＯＤＳカラム（ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ）を用いて、流量１．０ｍＬ／ｍｉｎで製剤Ｂ中の安息香酸ナトリウムの定量を試みた。
前記（１）のＨＰＬＣ条件において、カラムサイズ４．６ｍｍ（I.D.）×１５０ｍｍの市販ＯＤＳカラム（ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ）を用いて、流量１．０ｍＬ／ｍｉｎで製剤Ｂ中の安息香酸ナトリウムの定量を試みた。
その結果、製剤Ｂのように配合成分の多い製剤の分析の場合、安息香酸のピークに夾雑成分のピークが重なり、精度の良い分析ができなかった。このときのクロマトグラムを図８に示す。有機溶媒抽出などの前処理を行えば改善できると考えられるが、操作が煩雑であり、有害な試薬を要する点からも問題がある。
このように市販ＯＤＳカラムを用いる従来試験法の場合、製剤の処方によって妨害となる成分が存在することがあり、同じ安息香酸ナトリウムを定量する場合であっても、異なる試験方法で定量を行う必要があった。
これに対して、本発明の方法によれば、１条件でどのような処方の製剤からも安息香酸を選択的に分離できるため、製剤の処方に影響されない統一的な試験方法として利用でき、製品の品質管理試験の方法として有用であると考えられる。
試験例５ 安息香酸ＭＩＰによる安息香酸の選択的除去
（１）実施例１で得られた安息香酸ＭＩＰカラムを、ドリンク製剤中の微量成分のＨＰＬＣ分析において妨害となる安息香酸の除去カラムとして利用した。このような例としてシゴカ流エキスを配合したドリンク剤中のシゴカの分析対象成分であるエレウテロサイドＥの分析において妨害となる安息香酸を除去するため、従来の分析カラムに安息香酸ＭＩＰを充填したカラムを連結し、安息香酸ＭＩＰに安息香酸を選択的に保持させることにより、エレウテロサイドＥと安息香酸の分離を試みた。
（１）実施例１で得られた安息香酸ＭＩＰカラムを、ドリンク製剤中の微量成分のＨＰＬＣ分析において妨害となる安息香酸の除去カラムとして利用した。このような例としてシゴカ流エキスを配合したドリンク剤中のシゴカの分析対象成分であるエレウテロサイドＥの分析において妨害となる安息香酸を除去するため、従来の分析カラムに安息香酸ＭＩＰを充填したカラムを連結し、安息香酸ＭＩＰに安息香酸を選択的に保持させることにより、エレウテロサイドＥと安息香酸の分離を試みた。
（２）ＨＰＬＣ条件
カラム：安息香酸ＭＩＰカラム４．６ｍｍ（I.D.）×１０ｍｍ及びＴＳＫgel
ＯＤＳ−８０Ｔｓ４．６ｍｍ（I.D.）×１５０ｍｍを連結したもの
流量 ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
温度 ：５０℃
検出器：ＵＶ２３０ｎｍ
移動相：２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ３．０）／アセト二トリル（８８０：１２０）
カラム：安息香酸ＭＩＰカラム４．６ｍｍ（I.D.）×１０ｍｍ及びＴＳＫgel
ＯＤＳ−８０Ｔｓ４．６ｍｍ（I.D.）×１５０ｍｍを連結したもの
流量 ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
温度 ：５０℃
検出器：ＵＶ２３０ｎｍ
移動相：２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ３．０）／アセト二トリル（８８０：１２０）
（３）試験方法
試料５ｍＬを量り、水／アセトニトリル混液（９：１）を加えて１０ｍＬとする。これを試料溶液とする。また、別途、標準品（エレウテロサイドＥ）２ｍｇを秤量し、水を加えて溶かし、１０ｍＬとする。この液から１ｍＬを分取し、水を加えて５０ｍＬとする。さらに、この液から２ｍＬを分取し、水／アセトニトリル混液（９：１）を加えて１０ｍＬとする。これを標準溶液とする。標準溶液及び試料溶液６０μＬにつき、前記条件でＨＰＬＣ法によって試験を行う。
試料５ｍＬを量り、水／アセトニトリル混液（９：１）を加えて１０ｍＬとする。これを試料溶液とする。また、別途、標準品（エレウテロサイドＥ）２ｍｇを秤量し、水を加えて溶かし、１０ｍＬとする。この液から１ｍＬを分取し、水を加えて５０ｍＬとする。さらに、この液から２ｍＬを分取し、水／アセトニトリル混液（９：１）を加えて１０ｍＬとする。これを標準溶液とする。標準溶液及び試料溶液６０μＬにつき、前記条件でＨＰＬＣ法によって試験を行う。
（４）試薬
エレウテロサイドＥは、アルプス薬品工業（株）から購入した。その他の試薬はすべて試薬特級をそのまま使用した。
エレウテロサイドＥは、アルプス薬品工業（株）から購入した。その他の試薬はすべて試薬特級をそのまま使用した。
（５）試料
試験に用いた試料は、シゴカ流エキスと安息香酸ナトリウムを配合したモデル製剤Ｄと市販製剤（栄養ドリンク剤）Ｅ及びＦである。
試験に用いた試料は、シゴカ流エキスと安息香酸ナトリウムを配合したモデル製剤Ｄと市販製剤（栄養ドリンク剤）Ｅ及びＦである。
（６）安息香酸ＭＩＰカラム及び市販ＯＤＳカラムを連結したカラムを用いて前記（２）のＨＰＬＣ条件下にモデル製剤Ｄの試料溶液を注入してクロマトグラムを取り、安息香酸ＭＩＰカラムを連結しない市販ＯＤＳカラムのみのクロマトグラムと比較した。
その結果、市販ＯＤＳカラムのみでは、安息香酸が妨害しエレウテロサイドＥのピーク検出が不可能であるが（図９(a)）、ＭＩＰカラムを市販ＯＤＳカラムに接続することにより、安息香酸の溶出を選択的に遅らせることができ、エレウテロサイドＥと安息香酸のベースライン分離（分離度１．７）が達成できた（図９(b)）。同じ条件で比較例１で得たＢＰ（ブランクポリマー）カラムを市販ＯＤＳカラムに連結したカラムについても検討したところ、ＢＰでは安息香酸の保持能がＭＩＰより小さいため、エレウテロサイドＥと安息香酸の分離は不充分（分離度１．３）であった（図９(c)）。
（７）市販製剤Ｅ、Ｆ中のエレウテロサイドＥの分析
シカゴ流エキスを含む市販製剤を試料として用い、モデル製剤と同条件で分析を行い、エレウテロサイドＥの定量法としての分析法バリデーションを実施した。
シカゴ流エキスを含む市販製剤を試料として用い、モデル製剤と同条件で分析を行い、エレウテロサイドＥの定量法としての分析法バリデーションを実施した。
まず、エレウテロサイドＥ標準液の直線性は、０．４〜１．２μｇ／ｍＬの濃度範囲で相関係数０．９９９９以上の良好な直線性を示すことを確認した（図10）。
次に、特異性と添加回収率を評価した。その結果、シゴカ流エキス抜き試料溶液のクロマトグラムにおいて、エレウテロサイドＥの溶出位置に妨害はなく、フル処方製剤のクロマトグラムにおいて、エレウテロサイドＥと安息香酸とは完全に分離し、エレウテロサイドＥを特異的に検出できることがわかった（図11）。
また、添加回収率は１００．２％（製剤Ｅ）、９９．７％（製剤Ｆ）であり、回収率も良好であった。
さらに、試料溶液連続注入６回のエレウテロサイドＥのピーク面積の再現性も相対標準偏差１．０％以下であり、分析精度も良好であることを確認した。
よって、検討した方法は、製剤中のエレウテロサイドＥの簡便な定量法として利用できることを示した。
以上より、安息香酸ＭＩＰは、製剤中のエレウテロサイドＥをＨＰＬＣ分析する際の妨害成分である安息香酸を効率よく除去するための分離カラムとして利用できることがわかった。また、このように分析妨害成分をインプリントしたＭＩＰが、試料中の分析妨害成分を選択的に除去するための材料として利用できることがわかった。
本発明により、安息香酸をはじめ多くの有効成分を含有するドリンク剤において、安息香酸を簡易かつ迅速に定量分析し、ドリンク剤の定常的な品質管理業務の効率化が期待される。
Claims (4)
- 安息香酸分子と機能性モノマーとの複合体を形成し、その周囲を架橋剤で重合し、安息香酸分子を除去することによって得られる安息香酸分子の鋳型を有する高分子。
- 請求項１記載の安息香酸分子の鋳型を有する高分子を用いて溶液中の安息香酸を選択的に捕捉し、安息香酸を定量する方法。
- 請求項１記載の安息香酸分子の鋳型を有する高分子をカラムに充填し、安息香酸を含有する溶液を通過させて、安息香酸を選択的に定量する方法。
- 請求項１記載の安息香酸分子の鋳型を有する高分子を用いて安息香酸を含有する溶液から安息香酸を選択的に除去する方法。
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| JP2003392332A JP2004198405A (ja) | 2002-12-06 | 2003-11-21 | 安息香酸の定量分析方法 |
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|---|---|---|---|---|
| JP2010100708A (ja) * | 2008-10-22 | 2010-05-06 | Mukogawa Gakuin | 分子インプリントポリマーおよびその製造方法 |
| CN104437431A (zh) * | 2014-11-19 | 2015-03-25 | 辽宁大学 | 一种高效大孔吸附树脂的制备方法 |
| CN107189012A (zh) * | 2017-07-03 | 2017-09-22 | 长江师范学院 | 邻苯二甲酸酯类分子印迹聚合物的制备方法及产品和应用 |
-
2003
- 2003-11-21 JP JP2003392332A patent/JP2004198405A/ja active Pending
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| CN107189012A (zh) * | 2017-07-03 | 2017-09-22 | 长江师范学院 | 邻苯二甲酸酯类分子印迹聚合物的制备方法及产品和应用 |
| CN107189012B (zh) * | 2017-07-03 | 2019-03-22 | 长江师范学院 | 邻苯二甲酸酯类分子印迹聚合物的制备方法及产品和应用 |
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