JP2004173679A - ウイルス由来二重鎖rna及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるシグナル伝達タンパク質及びその遺伝子 - Google Patents
ウイルス由来二重鎖rna及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるシグナル伝達タンパク質及びその遺伝子 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】 ウイルス由来二重鎖RNA及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするDNA、及び該DNAによって発現されるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質からなる。また、本発明は、該DNA及びタンパク質の変異体DNA及び変異体タンパク質、本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体、本発明の遺伝子を染色体上で欠損させた非ヒト動物、及び該抗体や非ヒト動物及び本発明の遺伝子プローブを用いた細胞の免疫賦活機能の判定及びインターフェロン誘導シグナル伝達活性物質のスクリーニング方法、からなる。
【選択図】 なし
Description
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルス由来二重鎖RNA及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質、からなる変異遺伝子を含む。該変異遺伝子を取得するには、本発明の配列表の遺伝子配列情報により、適宜公知の遺伝子工学の手法により変異させて、取得することができる。
材料と方法
(免疫沈降と免疫ブロット)
293細胞に、発現ベクターに表示されたDNA断片を挿入したプラスミドをトランスフェクションし、一過性発現させた。細胞を0.15%NP−40、20mM トリス−HCL(pH7.5)、150mM NaCl、1mM EDTA、10%グリセロール、10mM β−グリセロリン酸塩、1mM Na3VO4、及びプロテアーゼ阻害剤(混合物:Roche Diagnostics社製)を含む溶菌バッファー中で溶解した。細胞溶解液をProtein G-sepharose(Amersham社製)で前精製を1時間行い、次に2μgの抗Flag M2抗体(Sigma社製)、2μgの抗Myc PL14抗体(MBL社製)もしくは1μgの抗ヒトIRF−3抗体(SantaCruz社製)及びProtein G-sepharose(Amersham社製)で2時間免疫沈降した。
(TRIFの同定)
MyD88と、TIR領域のTIRAP以外の分子がTLRを介したシグナル経路に関与していると予測し、TIRドメインを有する配列をexpressed sequence tag(EST)データベース上で検索し、新規のヒトcDNAクローン(アクセッション番号:BC009860、配列番号1)を同定し、TRIFと命名した。この遺伝子はNCBIに登録されているTIR領域(smart00255 TIR)と非常に類似していた(図1a)。この断片をプローブとして、この遺伝子の完全長cDNAを同定した。MyD88(296アミノ酸をコード)とTIRAP/Mal(235アミノ酸)と比較すると、この遺伝子には2136bpの長いオープンリーディングフレームがあり、712アミノ酸(配列番号2)をコードしていた(図1b)。
MyD88及びTIRAPの強制発現が、293細胞においてNF−κBの活性を誘導することを、ヒトELAM−1遺伝子のNF−κB応答性プロモーター(配列番号5)のルシフェラーゼ活性を測定することにより解析した。(図3a、左)。TRIFの発現はMyD88或いはTIRAPを介する誘導と比較して低水準ではあるが、NF−κBの活性化を誘導した。LPS(TLR4リガンド)及び二重鎖RNA(dsRNA)(TLR3リガンド)は、MyD88非依存的にIFN−βの発現を誘導した(Nat. Immunol. 3, 392, 2002、J. Immunol. 162, 374, 2002、Nature 413, 732, 2001)。次にマウスIFN−βプロモーター(配列番号6)活性をルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いて観察した(図3a、右)。レポータープラスミドと共に誘導されたMyD88或いはTIRAPの発現が誘導されたときは、プロモーター活性は観察されなかった。しかしながら、TRIFの発現は、IFN−βのプロモーター活性を劇的に誘導した。
MyD88及びTIRAPの場合と同様に、TRIFのTIR領域(△N△C)の発現はドミナント阻害因子(dominant inhibitor)として作用した。全長TRIFが誘導したNF−κB及びIFN−βプロモーターの活性化はTRIF△N△Cの発現により顕著に抑制された(図4a)。TRIF△N△Cを用いて、TRIFがTLR依存性シグナル伝達経路であるかどうかを解析した。293細胞におけるTLR4/MD−2の発現は、この細胞がLPSに応答してNF−κBレポーターを活性化することを可能にした。TRIF△N△Cの共発現は、TLR4−に依存したNF−κBの活性化を阻害(inhibit)した(図4b)。さらに、TLR−2及びTLR−7に依存したNF−κBの活性化は、TRIF△N△Cの発現により抑制(prohibit)された(図4c、d)。MyD88及びTIRAPの強制発現は、NF−κBのリガンド非依存的な活性化をもたらした。TRIF△N△Cの共発現は、MyD88及びTIRAPを介したNF−κBの活性化を顕著に阻害した(図4e、f)。これらの結果により、TRIFがMyD88及びTIRAPの下流で多くのTLR仲介シグナル伝達経路に関与していることが示唆された。
TRIFが、TLR3或いはTLR2を認識するかどうかを解析した。ヒト腎細胞293細胞に7μgのFlag−TLR2(FlagがタグされたTLR2:Flag-tagged TLR2)若しくはFlag−TLR3(FlagがタグされたTLR3:Flag-tagged TLR3)と、3μgのMyc−TRIF(MycがタグされたTRIF:Myc-tagged TRIF)をトランスフェクションし、一過性発現させた。mock(対照)群においては、空のベクターを10μgトランスフェクションしたものを用いた。トランスフェクションの36時間後、細胞を0.15%NP−40、20mM Tris−HCl(pH7.5)、150mM NaCl、1mM EDTA、10%グリセロール、10mM β−グリセロリン酸塩、1mM Na3VO4、及びプロテアーゼ阻害剤(混合物はRoche Diagnostics社製)を含む溶菌バッファー中で溶解した。
本実験において、TIR領域を含む新規アダプター分子を同定してTRIFと命名し、解析を行った。TRIFの過剰発現は、ELAM−1遺伝子のNF−κB応答性プロモーターと同様、IFN−β遺伝子のプロモーターを活性化した。既に公知であるアダプター分子であるMyD88やTIRAPとは異なり、TRIFはNF−κB応答性プロモーターと比較してIFN−βプロモーターを優位的に活性化させた。注目すべき点は、TRIFの抑制型は、MyD88或いはTIRAPではなく、完全にTLR3を介したシグナルを阻害したことである。このことは、TLR3シグナルにおけるTRIFの特異的な役割を示している。さらに、TRIFの抑制型は、TLR2、TLR4、或いはTLR7を介したNF−κB活性を阻害することから、他のTLRシグナル経路において何らかの役割が存在することが示唆される。それぞれのTLR応答におけるTRIFの機能的役割がノックアウトマウスの発生の過程で観察されたとしても、TRIFが優位的にIFN−βプロモーターを活性化させ、TRIFがIRF−3と認識するということは、TRIFがTLR3シグナルのMyD88非依存的経路においてTRIFが関与していることを示している。
材料と方法
(TRIF欠損マウスの作製)
ES細胞(E14.1)のゲノムDNAから、PCR法で、Takara LA TaqTM(TaKaRa社製)を使用して、Trif遺伝子を単離した。TRIF ORF全体をコードする2.1Kb断片をネオマイシン耐性遺伝子カセット(neo)で置換して、ターゲティングベクターを構築した。負の選択のために、PGKプロモーターにより促進された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼを、ゲノム断片に挿入した(図1a)。ターゲティングベクターをES細胞に挿入した後、G418及びgancyclovir二重耐性コロニーを選択し、PCR法及びサザンブロット法でスクリーニングした。相同的な組替え体をC57BL/6メスのマウスに注入し、ヘテロF1子をインタークロスして、TRIF欠損マウスを作製した。TRIF欠損マウスとそれらをインタークロスした野生型の同腹子とを実験に使用した。
R−484は株式会社ジャパンエナジー、医薬バイオ研究所から提供された。CpGオリゴデオキシヌクレオチドを、文献記載に準じて調製した。サルモネラ内毒素Re595からのLPSを、フェノールクロロフォルム石油エーテル抽出過程により調製した。S.aureus(黄色ブドウ球菌)からのPGN及びポリ(I:C)は、それぞれFluka社及びAmersham社から購入した。抗phosphoJNK抗体及び抗ERK1/2抗体は、Cell Signaling社より購入した。抗JNK1抗体は、Santa Cruz社から購入した。免疫沈降又は免疫ブロット用に、TRIFマウスのアミノ酸672〜684又は718〜732に対するポリクロナール抗TRIF抗体を、それぞれ産出した。IFR−3マウスのアミノ酸131〜144に対するポリクロナール抗IRF3抗体を産出した。FACS分析を行った抗IgM抗体は、Jackson ImmunoResearch Laboratoryから購入した。
胎児の繊維芽細胞及び肺繊維芽細胞(1×106)を、10μg/mlのLPS、50μg/mlのポリ(I:C)及び10ng/mlTNF−αで、示された時間刺激した。細胞から核抽出物を精製し、NF−κB DNA結合部位用の特異のプローブとインキュベートし、電気泳動し、文献記載に準じて、オートラジオグラフィで視覚化した(Immunity 9:143,1998)。
96well plateで、PGN、LPS、R−848又はCpG DNAの示された濃度で、チオグリコール酸が誘出した腹腔マクロファージを培養した(well毎に5×104細胞)。腹腔マクロファージが産出したTNF−α、IL−6、IL−12p40を、製造者の指示に従って、ELISAで測定した(Genzyme社製)。
96well plateで、ポリ(I:C)、LPS、R−848又はCpG DNAの示された濃度で、24時間脾細胞(1×105)を培養した。1マイクロキュリーの[3H]チミジンを、後半の12時間パルスし、次に[3H]摂取量を、βシンチレーション計数器(Packard社製)で測定した。
200万の脾細胞を、50μg/mlのポリ(I:C)、10μg/mlのLPS又は10μg/mlの抗IgM抗体で培養した。36時間の培養後、細胞を収集し、PE共役抗B220抗体及びビオチン共役抗CD69抗体、抗CD86抗体、抗I−Ab抗体、その後ストレプトアビジンFITCで染色した。染色した細胞はCellQuest software(Becton Dickison 社製)を使用して、FACS Caliburで分析した。
肺繊維芽細胞(1×106)を、10μg/mlのLPSで、示された時間刺激した。次に、1.0% Nonidet-P 40、150mMのNaCl、20mMのTris−Cl(pH7.5)、1mMのEDTA及びプロテアーゼ抑制カクテル(Roche社製)を含む溶解緩衝液内で、細胞を溶解した。細胞溶解物を、SDS−PAGE法(ポリアクリルアミドゲル電気泳動)で分解し、PVDF細胞膜(BioRad社製)上に移動した。細胞膜は、抗phosphoJNK抗体又は抗JNK1抗体でブロットし、強化された化学発光システムにより視覚化した(NEN Life Science Product社製)。
マウスの肺を切除し、PBS内で洗浄し、小さく切断し、攪拌し、30分間37℃で酵素消化した。消化緩衝液(10ml/肺)は、400nMのEDTAを含む0.25%のトリプシン溶液である。生じた細胞懸濁液に、冷えた完全DMEM培地を加えた。遠心分離(1100rpm、5分間)した後、ペレットを完全培地に再び懸濁し、その後皿で培養した。切除から10日で、肺繊維芽細胞を各実験に使用した。
肺繊維芽細胞(1×106)及び腹腔マクロファージ(5×106)を、それぞれ50μg/mlのポリ(I:C)及び1μg/mlのLPSで、示された期間刺激し、その後溶解した。native−PAGEサンプル緩衝液内の細胞溶解物(62.5mMのTris−Cl、pH6.8、15%のグリセロール及び1%のデオキシコラーテ)を、native−PAGEで単離し、その後文献記載に準じて、抗IRF−3抗体で免疫ブロットした(Int. Immunol. 14, 783, 2002)。
Toll-like receptor(TLR)は、微生物の構成成分の特異なパターンを認識し、MyD88、TIRAP及びTRIF等のToll/IL−1レセプター(TIR)ドメインを有するアダプターを経由した、シグナル伝達経路の活性化を通じて、自然免疫反応を誘発する(Annu. Rev. Immunol. 20:197,2002; Annu. Rev. Immunol. 21:335,2003)。MyD88は、全てのTLRに共通のアダプターであるが、TIRAPはTLR2及びTLR4を介したシグナル経路に特異的に関与している(Nat. Immunol. 2, 675, 2001、Nature 420, 324, 2002、Nature 420, 329, 2002)。共通のMyD88依存経路に加えて、TLR3及びTLR4は、IRF−3の活性化とIFN―βの誘導を導くMyD88非依存経路を使用している(J. Immunol. 167, 5887, 2001、Int. Immunol. 14, 1225, 2002、Immunity 17, 251, 2002)。IFN−βを誘導するTIRドメインを有するアダプター(TRIF)が、IFN−βプロモーターを活性化し、TLR3と関連する、TIRドメインを有する、第3のアダプターであると同定した(J. Immunol. 169, 6668, 2002、Nat. Immunol. 4, 161, 2003)。
図6は、突然変異Trif遺伝子の標的欠損について示す図である。
(A)Trif遺伝子、ターゲッティングベクター、及び予測した欠損遺伝子の構造。塗りつぶしたボックスは、コードしたエクソンを示す。制限酵素:H、Hinc II。
(B)ヘテロ接合体をインタークロスして出生した子のサザンブロットによる分析。ゲノムDNAを、マウス尾部から抽出し、Hinc IIで消化し、電気泳動し、aで示したラジオラベルしたプローブとハイブリダイズした。サザンブロット分析したところ、野生型(+/+)では、単一の3.8kbバンドを、ホモ接合体(−/−)では、6.1kbバンドを、又、ヘテロ接合型(+/−)では両方を生じた。
(C)胎児繊維芽細胞のノーザンブロット分析。胎児の繊維芽細胞から抽出した全RNA(10μg)を電気泳動し、ナイロン細胞膜に移動し、TRIF断片をプローブとして、ハイブリダイズした。同じ細胞膜を、β−アクチンプローブで再度ハイブリダイズした。
(D)TRIFの内因性発現。胎児の繊維芽細胞から調製した細胞溶解物を、抗TRIF抗体で、免疫沈殿した。次に、免疫沈澱物を別の抗TRIF抗体で、免疫ブロットした。タンパク質発現を調べるために、ERK1/2に対する抗体で、同じ溶解物にブロットした。
図7は、TRIF欠損細胞内のポリ(I:C)応答の欠陥について示す図である。
(A)腹腔マクロファージを、50μg/mlのポリ(I:C)で、示された時間刺激した。全RNA(5μg)を抽出し、IFN−β、IP−10、RANTES及びMCP−1の発現を調べるために、ノーザンブロット分析を行った。同じ細胞膜を、β−アクチンプローブで再度ハイブリダイズした。
(B)ポリ(I:C)又はCpG DNAで刺激した脾細胞の増殖。ポリ(I:C)又はCpG DNAの示された濃度で、脾細胞を24時間培養した。[3H]チミジン(1μCi)を後半の12時間パルスした。[3H]チミジン取り込みを、シンチレーション計数器(Packard社製)で測定した。
(C)脾臓B220+細胞を、50μg/mlのポリ(I:C)又は10μg/mlの抗IgM抗体と共に培養した。36時間の培養後、細胞を収集し、ビオチン共役抗CD69抗体若しくは抗CD86抗体で、又は抗I−Ab抗体に続いてストレプトアビジンPEで染色した。Cell Quest softwareを使用して、FACS Caliburで染色した細胞を分析した。
(A)胎児の繊維芽細胞を、10μg/mlのLPSで、示された時間刺激した。全RNA(10μg)を抽出し、IP−10、RANTES及びMCP−1の発現を調べるために、ノーザンブロット分析を行った。同じ組織膜をβ−アクチンプローブで再度ハイブリダイズした。
(B)TRIF欠損マウス又は野生型のマウスからの腹腔マクロファージを、刺激しない状態にしたか、又は10μg/mlのペプチドグリカン(PGN)、100ng/mlのLPS、100nMのR−848、30ng/mlのIFN-γの存在下の1μMのCpG DNAで刺激した。ELISAによるIL−12p40分析のために、24時間後に、上澄みを収集した。表示値は、平均値±標準偏差の3倍である。
(C)腹腔マクロファージを、30ng/mlのIFN−γの存在下、示されたLPS濃度で、24時間刺激し、上澄みにELISAを行い、TNF−α、IL−6及びIL−12p40を測定した。表示値は、平均値±標準偏差の3倍である。
(D)LPS又はCpG DNAで刺激した脾細胞の増殖。脾細胞を、LPS又はCpG DNAの示された濃度で、24時間培養した。[3H]チミジン(1μCi)を後半の12時間パルスした。[3H]チミジン取り込みを、シンチレーション計数器(Packard社製)で測定した。
(E)脾細胞B220+を、10μg/mlのLPS又は10μg/mlの抗IgM抗体で培養した。36時間培養した時点で、細胞を収穫し、ビオチン共役抗CD69抗体又はCD86抗体で染色し、続いてストレプタビジンPEで染色した。Cell Quest softwareを使用して、FACS Caliburで、染色した細胞を分析した。
肺繊維芽細胞(A)又は腹腔マクロファージ(B)を、(A)50μg/mlのポリ(I:C)又は(B)1μg/mlのLPSで、示された時間刺激した。細胞可溶物を調製し、native-PAGEを行った。ウェスタンブロット法により、IRF−3の単量体(矢印)又は、二量体(矢頭)を検出した。
(C及びD)(C)50μg/mlポリ(I:C)及び(D)10μg/mlのLPSで、繊維芽細胞を、示された時間刺激した。核抽出物を調製し、NF−κB特異プローブを使用して、EMSAで、NF−κB DNA結合活性化を測定した。矢印及び米印は、誘導されたNF−κB複合体及び非特異バンドを、それぞれ示している(上パネル)。細胞抽出物に対する抗phosphoJNK特異抗体を使用して、LPS刺激細胞のJNK活性化を、ウエスタンブロット法で、測定した(下パネル)。(F)野生型及びTRIF/MyD88DKOマウスの胎児の繊維芽細胞を、10μg/mlのLPSで、示された時間刺激した。全RNA(10μg)を抽出し、IP−10、RANTES及びMCP−1の発現を調べるために、ノーザンブロット法で分析した。同じ細胞膜をβ―アクチンプローブで、再度ハイブリダイズした。
Claims (24)
- ウイルス由来二重鎖RNA及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするDNA。
- インターフェロン誘導シグナル伝達活性が、インターフェロンβの誘導シグナル伝達活性であることを特徴とする請求項1記載のインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードするDNA。
- 配列表の配列番号1に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むことを特徴とする請求項1又は2記載のDNA。
- 配列表の配列番号3に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むことを特徴とする請求項1又は2記載のDNA。
- 請求項3又は4記載の遺伝子を構成するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする請求項1又は2記載のDNA。
- インターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質が、以下の(a)又は(b)のタンパク質であることを特徴とする請求項1又は2記載のDNA。
(a)配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質 - インターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質が、以下の(a)又は(b)のタンパク質であることを特徴とする請求項1又は2記載のDNA。
(a)配列表の配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列表の配列番号4に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質 - ウイルス由来二重鎖RNA及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質。
- インターフェロン誘導シグナル伝達活性が、インターフェロンβの誘導シグナル伝達活性であることを特徴とする請求項8記載のインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質。
- 配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項8又は9記載のタンパク質。
- 配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質。
- 配列表の配列番号4に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項8又は9記載のタンパク質。
- 配列表の配列番号4に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質。
- 請求項1〜7のいずれか記載のDNAを、発現用ベクターに組込んだことを特徴とするインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質発現組換えベクター。
- 請求項14記載のインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質発現組換えベクターを宿主細胞へ導入したことを特徴とする形質転換細胞。
- 請求項8〜13のいずれか記載のタンパク質と特異的に結合する抗体。
- 抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項16記載の抗体。
- ウイルス由来二重鎖RNA及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したことを特徴とする非ヒト動物。
- 非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする請求項18記載のインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したことを特徴とする非ヒト動物。
- ウイルス由来二重鎖RNA及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した細胞に、請求項1〜7のいずれか記載のDNAを導入することを特徴とするインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質を発現する細胞の調製方法。
- 請求項1〜7のいずれか記載のDNA又はその部分からなることを特徴とする、ウイルス由来二重鎖RNA及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子検出用プローブ。
- 請求項21記載の遺伝子検出用プローブを用いて遺伝子を検出し、判定することを特徴とする細胞のウイルス由来二重鎖RNA及びエンドトキシンによる免疫賦活機能の判定方法。
- 請求項16又は17記載の抗体を用いて、細胞のウイルス由来二重鎖RNA及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質の発現状態を検出することを特徴とする、細胞のウイルス由来二重鎖RNA及びエンドトキシンによる免疫賦活機能の判定方法。
- 請求項18記載のウイルス由来二重鎖RNA及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物に、被検物質を投与し、該非ヒト動物のインターフェロン誘導活性を測定・評価することを特徴とする、細胞のウイルス由来二重鎖RNA及びエンドトキシンによる免疫賦活に関わるインターフェロン誘導シグナル伝達活性物質のスクリーニング方法。
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