JP2004150854A

JP2004150854A - 薄膜状のスライスゲルの重畳システムによる電気泳動方法とその装置

Info

Publication number: JP2004150854A
Application number: JP2002313947A
Authority: JP
Inventors: Koichi Nishigaki; 功一西垣; Masateru Mori; 正輝森; Seiichi Sato; 清一佐藤; Eiichi Kanaumi; 榮一金海
Original assignee: Taitec Corp
Current assignee: Taitec Corp
Priority date: 2002-10-29
Filing date: 2002-10-29
Publication date: 2004-05-27

Abstract

【目的】本発明は薄膜状のスライスゲルの重畳システムによる電気泳動方法とその装置を新規に提供することを目的とするものである。
【構成】本発明は薄膜状に形成したスライスゲルの重畳にてなる分離層と、該分離層の一方の極側に分離・解析を目的とする試料を収納したサンプル層を配置し、該サンプル層の試料を前記分離層に向けて電気泳動させるようにしたことを特徴とする薄膜状のスライスゲルの重畳システムによる電気泳動方法およびその実施装置にある。
【選択図】図５

Description

【０００１】
【発明が属する技術分野】
この発明は薄膜状のスライスゲルの重畳システムによる電気泳動方法とその装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来の電気泳動法は図９に示すように２０ｃｍ角等の大きさの１枚形に作製された薄板ゲルの一端側に試料群を収容し、該薄板ゲルに電場を生成することにより試料群をゲル内で電気泳動させて、試料群の分離を行うようにしている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記の電気泳動法では分離・反応が画一的なものになるという課題がある。濃度勾配を持たせたゲルを調製したり、温度制御装置により温度勾配を設けるなどした電気泳動法も既にあるが、いずれも狭い応用範囲内にとどまっていて、並列・微量・多種試料を幾段にも同時処理することはできないという課題があった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は薄膜状に形成したスライスゲルの重畳にてなる分離層と、該分離層の一方の極側に分離・解析を目的とする試料を収納したサンプル層を配置し、該サンプル層の試料を前記分離層に向けて電気泳動させるようにし、またトラッピング層，フィルタリング層，反応層，ブロッティング層などとして特定の機能や作用性を有す属性を持たせるように調製した属性スライスゲルを別途形成し、該属性スライスゲルの一種または数種を分離層の一部に挿入するようにし、電気泳動を終えた分離層中の属性スライスゲルを含む任意のスライスゲルを容易に取出して外部で反応解析または処理をしたり、処理後に分離層内に戻して再度電気泳動させるなどするようにして、かかる課題を解決しようとするものである。
【０００５】
本発明は多数の試料を平面状態で一斉に分離・解析することを可能とするものであり、予め物質情報を把握している微量のＤＮＡや他の生体物質を平板上に配置する（ｍ×ｎ）ドットのマイクロアレイでの反応産物をそのまま平面状態で一斉に泳動し、自動解析装置等を用いたハイスループット方式により包括的且つ高速にて検出し処理することができるものとするものである。薄膜状に形成したスライスゲルを重畳する方式により任意の位置のゲルを容易に取出し得るようにし、分離後、全部のまたは目的とする試料を含む層のスライスゲルを重畳体の中から取り出して次段の処理にまわすことができるようにしたものである。また高分子に対する高い拡散抵抗性に由来するゲルの物性に着目して、分離層として重畳する一部のスライスゲルにトラッピング層、フィルタリング層や反応層などとしての属性を持たせておいて泳動することで、泳動試料に対して目的に応じた多種の作用を生じさせることを可能にし、そしてこれらを適宜組み合わせ利用することで、これまでにない多様な分離・解析の用途に用いることができるものとなる。
【０００６】
【発明の実施の形態】
図１に示すように５ｍｍ乃至３０ｍｍ角等の小形で１ｍｍ厚などの薄膜状に形成したスライスゲル１を作製し、該スライスゲル１を数枚から数十枚に積み重ね重畳して分離層２を作製する。スライスゲル１は大きく作製したゲル薄板を断截して作製するようにするほか、図２（ａ）に示すように厚さ方向の中間に中くぼみ３ａを設けたゲル枠３と該ゲル枠３をフィルム４を挟んで多数並列して容器５内のゲル材料液６中に浸漬し、ゲル材料液６のゲル枠３内への流れ込み凝固と、凝固後にフィルム４の抜外しにて図２（ｂ）に示すように枠付ゲル７を同時に多数成形することもできる。ゲル枠３に中くぼみ３ａを設けたのでゲルと枠とが一体に固定されることとなる。このように作製した枠付きゲル７を使用するときは後述する取出し等のいろいろな操作を行なうに当って利便性が高いものとなる。
【０００７】
スライスゲル１を重畳した分離層２の一面に多数の試料Ｓを個別の試料収容部８ａに収容するサンプル層８を接面重ねする。サンプル層８の作製方法としては、ひとつに図３（ａ）に示すように、収容部８ａを形成するようにした鋳型９ａ，９ｂを準備して、この鋳型９ａ内に金属、ガラス、高分子等の材料Ｏを流し込んで成形するレプリカ法がある。レプリカ法にて作製したサンプル層８は都度洗浄することで何回でも繰返し使用することができるものとなる。また図３（ｂ）は特定の光線に反応して重合するゲル溶液を用いてサンプル層８を作製する光重合法による作製方法を示すもので、一例としてはリボフラビン存在下のゲル溶液が紫外線下で重合を開始する原理を利用して、試料収容部８ａを形成する部分に紫外線の遮断部１０ａを設けたマスク１０を用意しておいて、予め重合したゲル板１１ａ上にリボフラビン混入のゲル溶液１１ｂを重ねて、その上にマスク１０を配置し、マスク１０の外側から紫外線を照射して照射部分を重合凝固させた後、非凝固部分を排除して試料収容部８ａを備えたサンプル層８を作製するものである。この方法によれば紫外線を遮断して穴を作製するためのマスク１０のパターンを変えるだけで様々な形状のサンプル層を容易に作製することができる。さらに図３（ｃ）は試料収容部８ａとなる多数の透孔１２ａを設けたブラスチックの成形板（ＭＭＶ＝Ｍｕｌｔｉ−ｍｉｃｒｏＶｅｓｓｅｌ）１２の両面を半透膜１３で被覆して容器形状として用いるノンゲル法による作製方法を示すもので、半透膜１３などでの濾過または磁気ビーズなどを使うことによって液相反応系、固相反応系の使い分けや、溶液の出し入れが容易にでき、操作の上で柔軟性をもつ構成となるものである。
【０００８】
重畳した分離層２とサンプル層８を図４に示すように一面１４ａを取外し自在に形成するゲル枠１４内に収納し、サンプル層８の上にマイナス電極１５ａを取付け、それらをプラス電極１５ｂを底面に取付けた泳動槽外枠１６内に入れ所定量のバッファ液１６を充填し電気泳動装置１７を構成して電流を流すものである。電場作用によりサンプル層８の試料収容部８ａ内の試料Ｓは経時泳動して各分子サイズの相違によって分離されることとなる。なお電気泳動は分離層２およびサンプル層８の重ね方向を横向きにして行うこともできる。さらに試料によっては電極のプラス，マイナスを反転して用いることもある。
【０００９】
本発明は以上のようにしてスライスゲルを幾枚も積み重ねて分離層２として利用する重畳方式としたので、スライスゲル１の各葉の出し入れが容易となる。そのため、電気泳動後に任意のスライスゲル１を取り外して別の場で反応解析することができ、また任意のスライスゲル１の１枚に異なる属性を導入することやスライスゲルに特別な細工をすることも容易となる。
【００１０】
また平面での泳動であるため通常の電気泳動に要請する機能（鎖長分離）を、多数の試料で行なうことができる。例えば次に述べるような３種類のサンプルをそれぞれの層に鎖長で分離することができる。
【００１１】
（実験例１、多検体１Ｄ−ＥＰ解析）
９６穴マイクロプレートの面積に換算すると約１万個になるように設計したサンプル層８としてのアクリル板（約２０ｍｍ角、厚さ１．０ｍｍ）に１０×１０の１００個の試料収容部８ａ（Ｐｉｔｃｈ＝０．９ｍｍ、φ＝０．６ｍｍ）を形成し、鎖長の異なる３種類のｓｓＤＮＡ（７６ｍｅｒ、４６ｍｅｒ、２３ｍｅｒ）を試料Ｓとして、１枚のサンプル層８にそれぞれを組み合わせて７６ｍｅｒＤＮＡで“Ｍ”、４６ｍｅｒＤＮＡで“Ｍ”、２３ｍｅｒＤＮＡで“Ｖ”の文字になるようピペッティングを行ない、このサンプル層８より電気泳動させ、泳動後銀染色によりバンドの検出を行なって図６のような結果を得ることができた。
【００１２】
分離層２のスライスゲル１の７番と８番に“Ｍ”、分離層２の１０番と１１番に“Ｍ”、スライスゲル１の１５番と１６番に“Ｖ”の文字が見られ、これを移動度から算出するとスライスゲル１の７番と８番の層が７６ｍｅｒ、１０番と１１番の層が４６ｍｅｒ、１５番と１６番の層が２３ｍｅｒという結果が得られた。分離層２のスライスゲル１の１５番、１６番にわたって泳動された２３ｍｅｒＤＮＡも文字となっていることから、スライスゲル１間の隙間での拡散は極めて小さいものと考えられる。また各スライスゲル１の文字を構成しているドットの平面中央と外縁とで濃淡差が小さいことから、平面の中央と周辺で移動速度の異なる現象（いわゆるスマイリング現象）は顕著ではないと考えられる。
【００１３】
また、ゲルの優れた物性として電場の働かない状態では極めて低い分子拡散場となっていることが挙げられる。この物性を利用して分離層２中の任意のスライスゲル１に特別な細工を施すことにより、種々な反応場（レイヤ）を形成することが可能となる。すなわち予め分離層２の一部のスライスゲル１に図７に示すようにある作用属性を持たせておき、その場まで泳動により導き込むことで、特定の試料に対してある種の作用を仕掛けることが可能となる。また拡散場としての物性は、ゲルの種類（アクリルアミド濃度、ビス添加濃度、あるいは材質をアガロース，デンプン，セルロース，マンナン他にするなど）を変えることで柔軟に調製可能となる。以下に泳動反応解析の応用例を説明する。
【００１４】
先づ、例えばスライスゲル１の１枚に目的のあるいは目的外の試料Ｓをトラップさせる材料を予め包埋してトラップ層Ｔを作製して挟入しておくと、試料Ｓが泳動してその層Ｔにかかった試料Ｓはトラップ層内にとどまるものと、通過するものに分けられる。一例としては分離層の一枚のスライスゲル１にアビジンを結合してアビジン包埋ゲル（トラップ層Ｔ）を作製して挿入しておくと、ビオチン修飾されている試料Ｓがトラップされることとなる。また同様にしてＮｉ−ＮＴＡを結合したＮｉ−ＮＴＡ包埋ゲル（トラップ層Ｔ）を挿入しておくと、ヒスチジンタグのある試料だけがＮｉ−ＮＴＡと結合してトラップされ、あるいは新規機能性タンパク質を探索するにあたって目的の特異性（関心）を有す酵素の作用を受けて化学変化をする物質である基質を結合もしくは包埋固定した基質包埋ゲル（トラップ層Ｔ）を挿入しておくと、その基質に対して作用するタンパク質をトラップすることが可能となるのである。
【００１５】
また、予めスライスゲル１の１枚をフィルタリング作用をもつ材料を包埋したフィルタリング層Ｆに作製して分離層２内に挿入しておくと、この層Ｆを試料が通過するときに作用を及ぼし種々な試料をフィルタリングすることができるものとなる。具体例としては一本鎖ＤＮＡ断片を調製したフィルタリング層Ｆを作製して挿入しておくと、試料ＤＮＡ／ＲＮＡがこのフィルタリング層Ｆに達すると該層Ｆに固定されているＤＮＡと相互作用し、その強さに応じて泳動遅延効果が生ずることとなる。またポアサイズ（網目の大きさ）の異なるゲル（特に細かいポアサイズのもの）を分子篩層として分離層２中にフィルタリング層Ｆとして挿入しておくことで、通過する試料Ｓは緩衝作用を受けて分子サイズの相違による分離を効果的に行えることができることとなる。
【００１６】
さらに別の例としては、予め分離層２のスライスゲル１の１枚に反応用の材料を混合して反応層Ａを作製し分離層２の中間に挿入しておいて試料Ｓを泳動させると、試料Ｓは反応層Ａにて反応し、さらに通過した試料Ｓ１は分離層２により分離され検出することができる。この際の反応処理には▲１▼ｉｎｓｉｔｕ法（その場で反応させる方法）と▲２▼ｉｎｖｉｔｒｏ法（取り出して別の容器で反応させる方法）の２つの方法があり、具体例としては、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅを含んだ反応層Ａを作製し挿入して通過させることで試料Ｓ中のＤＮＡやＲＮＡを分解してさらに分離することができ、また分離層２の一部のゲルを制限酵素の入っている反応層Ａにして用いると、制限酵素の認識するカッティングサイト（その制限酵素が結合してカットする特定のＤＮＡの塩基サイト）を持つ試料Ｓは元の鎖長より短くなって検出され、持っていない試料ｓは同じ鎖長のまま検出されることとなって試料のカッティングサイトの有無を検出することができるものとなる。
【００１７】
また他の応用例としてはブロッティング応用例がある。スライスゲルを２つの副次ゲルごとに分けて重合させてブロッティング層Ｂ、すなわち図８に示すように高濃度ゲル（例えば２０％アクリルアミドゲル）１ａを予め重合した後にその上にて低濃度ゲル（例えば１％アガロースゲル）１ｂを重合させて調製したブロッティング層Ｂを作製して分離層２内に挿入しておくことにより、低濃度／高濃度ゲルの境界に試料Ｓをブロッティング（吸い取り）することができる。２次元平面上に展開された試料Ｓを含むスライスゲル１もしくは平面状にチャージされた試料を含有するスライスゲル１を短時間電場におくことでブロッティング層Ｂに移すことが可能となる。なおブロッティング層を作製する別方法としては半透膜をブロッティング層として用いることもできる。
【００１８】
さらなる応用例としてはプロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ＝プロテオーム／ｐｒｏｔｅｏｍｅの構造と機能に関する大規模研究の総称、ゲノムの各遺伝子に対応する全ての蛋白質を指している）への利用が可能である。蛋白質解析において従来のゲルによる２次元展開産物をさらに第三の分離原理、例えばリン酸化、メチル化、アセチル化により３次元分析する解析方法（３Ｄ−ＥＰ）への応用の道も拓けている。試料は生体分子以外でも電荷をもつものであれば何でもよく、ウィルスや細胞、さらには無機物質，有機化合物をも含むものである。用途は通常の生化学、分子生物実験の解析ツールに利用できる他に進化分子工学にも利用することができる。
【００１９】
【発明の効果】
本発明は以上のようにして、薄膜状に形成したスライスゲルの重畳にてなる分離層と、該分離層の一方の極側に分離・解析を目的とする試料を収納したサンプル層を配置し、該サンプル層の試料を前記分離層に向けて電気泳動させるようにしたので、多数の試料を平面状態で一斉に分離・解析することを可能とし、予め物質情報を把握している微量のＤＮＡや他の生体物質を平板上に配置するマイクロアレイでの反応産物をそのまま平面状態で一斉に泳動し、自動解析装置等を用いたハイスループット方式により包括的且つ高速にて検出し処理することができるものとすることができるという効果を生ずる。
【００２０】
任意の位置のスライスゲルを容易に取出し得、分離後、全部のまたは目的とする試料を含む層のスライスゲルを重畳体の中から容易に取り出して次段の処理にまわすことができるという効果を生ずる。
【００２１】
分離層として重畳する一部のスライスゲルにトラッピング層、フィルタリング層や反応層およびブロッティング層などとしての属性を持たせておいて泳動することにより、泳動試料に対して目的に応じた多種の作用を生じさせることを可能にし、さらにこれらを適宜組み合わせ利用することで、これまでにない多様な分離・解析の用途に用いることができるという効果を生ずる。
【図面の簡単な説明】
【図１】スライスゲルの重畳にてなる分離層とサンプル層とを示す斜視図
【図２】スライスゲルの他の作製例を示すもので、（ａ）は作製しつつある状態の斜視図、（ｂ）は作製されたスライスゲルの重畳体の断面図
【図３】サンプル層の作製例を示すもので、（ａ）はレプリカ法、（ｂ）は光重合法、（ｃ）はノンゲル法による作製方法の各説明図
【図４】（ａ）は電気泳動装置の組立前の状態にて示す斜視図、（ｂ）は同、使用状態の正面図
【図５】電気泳動の方向を示す説明図
【図６】実験例の結果を示すため分離層のスライスゲルを並列して示す平面図
【図７】分離層内にトラップ層，フィルタリング層，反応層およびブロッティング層のひとつを挿入した状態の一例を示す正面図
【図８】ブロッティング層の作製例を示す説明図
【図９】従来の薄板ゲルを示す斜視図
【符号の説明】
１はスライスゲル
２は分離層
３はゲル枠
３ａは中くぼみ
４はフィルム
５は容器
６はゲル材料
８はサンプル層
８ａは試料収容部
９ａ，９ｂは鋳型
１０はマスク
１０ａは遮断部
１１ａは通常に重合したゲル板
１１ｂはリボフラビン混入のゲル溶液
１２は成形板
１２ａは透孔
１３は半透膜
１４はゲル枠
１４ａは取外し自在の一面
１４ｂは上面ネット
１４ｃは下面ネット
１５ａ，１５ｂは電極
１６はゲル外枠
１７はバッファー液
１８は電気泳動装置

Claims

薄膜状に形成したスライスゲルの重畳にてなる分離層と、該分離層の一方の極側に分離・解析を目的とする試料を収納したサンプル層を配置し、該サンプル層の試料を前記分離層に向けて電気泳動させるようにしたことを特徴とする薄膜状のスライスゲルの重畳システムによる電気泳動方法。
トラッピング層，フィルタリング層，反応層，ブロッティング層などとして特定の機能や作用性を有す属性を持たせるように調製した属性スライスゲルを別途形成し、該属性スライスゲルの一種または数種を分離層の一部に挿入した請求項１に記載の電気泳動方法。
電気泳動を終えた分離層中の任意のスライスゲルを取出して外部で反応解析または処理をする請求項１または２に記載の電気泳動方法を利用した分離・解析方法。
取出したスライスゲルに外部で処理を施した後に分離層内に戻して再度電気泳動させる請求項３に記載の電気泳動方法を利用した分離・解析方法。
スライスゲルは厚さ方向の中間に中くぼみを設けたゲル枠と該ゲル枠をフィルムを挟んで多数並列した状態でゲル材料液中に浸漬し、ゲル材料液のゲル枠内への流れ込み凝固とフィルムの抜外しにて枠付ゲルを同時に多数成形する請求項１に記載のスライスゲルの作製方法。
サンプル層は試料収容部の成形部を設けた鋳型に金属，ガラスまたは高分子の材料を流し込みするレプリカ法にて成形する請求項１記載のサンプル層の作製方法。
サンプル層は特定の光線に反応して重合するゲル溶液の一面に試料収容部形成用の光線遮断マスクを配置し、該マスクの外側から前記ゲル溶液に向けて前記特定の光線を照射して、マスク遮断による非重合の試料収容部部分のゲルを排除する光重合法にて成形する請求項１に記載のサンプル層の作製方法。
サンプル層は試料収容部としての多数の透孔を設けたブラスチックの成形板の両面を半透膜にて被覆するノンゲル法にて成形する請求項１に記載のサンプル層の作製方法。
ブロッティング層は重合した高濃度スライスゲル上にて低濃度スライスゲルを重合して二層一体のスライスゲルを成形する請求項２に記載の属性スライスゲルの作製方法。
薄膜状に形成したスライスゲルの重畳にてなる分離層と、該分離層の一面に配置するサンプル層および一方の電極板とを収容する一面を開放自在としたゲル枠と、底面上に他方の電極板を敷入れ、該ゲル枠およびバッファー液を収納する泳動槽外枠とからなる電気泳動装置。