JP2004143138A - Platelet aggregation inhibitor and health food effective for inhibiting platelet aggregation - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は血小板凝集抑制剤、特にナットウキナーゼを有効成分とする血小板凝集抑制剤、その保健食品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、ナットウキナーゼは血栓溶解酵素として知られており、ナットウキナーゼの血栓溶解能力は血栓症の予防だけでなく治療においても優れていることが知られている（高岡晋作：ジャパンフードサイエンス、３９ （９）、５５−６０、２０００）。
【０００３】
ナットウキナーゼは大豆には含まれず、納豆菌が大豆に作用し、醗酵する過程でつくられるものであるが、このナットウキナーゼは血液凝固因子のビタミンＫ２が同時に含まれているので、血栓予防等を目的として、血栓溶解酵素であるナットウキナーゼを含む納豆あるいは納豆菌培養エキスを摂取すると、ビタミンＫ２も同時に摂取することになり、ビタミンＫ依存性凝固因子合成抑制剤の効果が打ち消される、という問題があったのでこのビタミンＫ２の含有量を１μｇ／ｇ乾燥重量以下にした納豆菌培養エキスを製造する技術が開発されている（特開２００１−２９９２７７号参照）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者等は、ナットウキナーゼは血栓溶解作用の他にも人体に有用な作用があるのではないかと考え、鋭意研究した結果、ナットウキナーゼに血小板凝集抑制作用があることを見出した。血小板凝集抑制剤、即ち、抗血小板剤として臨床的に実用されている例としては、アスピリンやチクロピジンなどが経口に使用されている例があるが、これらの薬剤には副作用が存在する。例えば、アスピリンの場合、胃腸障害やアスピリン喘息などが見られ、チクロピジンの場合には血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、無顆粒球症、重篤な肝障害などが知られている。
【０００５】
そこで、本発明は、副作用のない血小板凝集抑制剤及び血小板凝集抑制に有効な保健食品を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するため、本発明の血小板凝集抑制剤は、ナットウキナーゼを有効成分とするものであり、又ビタミンＫ２の含有量が１μｇ／ｇ乾燥重量以下であるナットウキナーゼ高含有納豆菌培養エキスを有効成分とするものである。
【０００７】
又、本発明の血小板凝集抑制に有効な保健食品は、ナットウキナーゼを主成分とするものであり、又ビタミンＫ２の含有量が１μｇ／ｇ乾燥重量以下であるナットウキナーゼ高含有納豆菌培養エキスを主成分とするものである。
【０００８】
ナットウキナーゼは納豆として、何百年も前から食されており、その安全性は経験上証明されているが、納豆菌培養エキス（粉末タイプ）においても、マウスを用いた急性毒性試験で一般状態に何ら影響は見られず、ＬＤ５０は２，０００ｍｇ／ｋｇ以上とされている。また復帰突然変異試験も陰性であることが証明されている（高岡晋作：ジャパンフードサイエンス、３９ （９）、５５−６０、２０００）。
【０００９】
又、ナットウキナーゼにおけるビタミンＫ２の含有量が１μｇ／ｇ乾燥重量以下である場合はビタミンＫ２による前記の障害も生じない。
ナットウキナーゼはこのように安全性が証明されているため、薬剤としてだけでなく食品（保健食品）としても用いることが出来る。
【００１０】
このように本発明によれば副作用等の問題が生じない血小板凝集抑制剤、及び安全な血小板凝集抑制に有効な保健食品を提供することが出来、本発明を使用することにより、血管内に血栓が出来にくくなり、また、血栓の成長が抑えられることから心筋梗塞や脳梗塞の治療および予防をすることが出来るものである。
【００１１】
【実施例】
以下、製造例、加工例、実施例について述べる。
【００１２】
ビタミンＫ２の含有量が１μｇ／ｇ乾燥重量以下であるナットウキナーゼ高含有納豆菌培養エキスの製造例は以下の通りである。
（製造例）
大豆を主原料とした液体培地に納豆菌を摂取し培養することで、ナットウキナーゼを高含有する培養液を製造する。その後、キトサン溶液を用いた凝集沈澱ろ過により、納豆菌およびＫ２を取り除く、そして、メンブランフィルターにより無菌ろ過した培養液を、乾燥し、粉末加工する。
【００１３】
（加工例）
前記納豆菌培養エキスは、カプセル、錠剤、ドリンク、顆粒、ペーストなどの形態に加工できるものであり、以下加工実施例を示す。
【００１４】
ソフトカプセルは、例えば、納豆菌培養エキス粉末（２００００ＦＵ／ｇ）を３６．７ｍｇ、大豆レシチンを１０ｍｇ、大豆油を１３３．３ｍｇ、ミツロウを１５ｍｇ、グリセリン脂肪酸エステルを１５ｍｇの計２１０ｍｇを混合乳化したものを内容液とし、ゼラチン１００ｍｇ、グリセリン３０ｍｇの計１３０ｍｇで構成された皮膜に充てんし、総重量３４０ｍｇのソフトカプセルが出来る。これを１日あたり、３〜６粒飲めば、市販納豆１〜２パック（５０〜１００ｇ）のナットウキナーゼを摂取したことになる。
【００１５】
同様にハードカプセルの場合、納豆菌培養エキス粉末（２００００ＦＵ／ｇ）を３６．７ｍｇ、デキストリンを２０９．８ｍｇ、ショ糖脂肪酸エステルを１３．５ｍｇの計２６０ｍｇを混合したものを内容物とし、２号ゼラチンハードカプセル（７０ｍｇ）に充てんし、総重量３３０ｍｇのハードカプセルが出来る。これを１日あたり、３〜６粒飲めば、市販納豆１〜２パック（５０〜１００ｇ）のナットウキナーゼを摂取したことになる。
【００１６】
腸溶カプセル（耐酸性コートを含む）は、例えば、納豆菌培養エキス粉末（２００００ＦＵ／ｇ）を３６．７ｍｇ、大豆レシチンを１０ｍｇ、大豆油を１３３．３ｍｇ、ミツロウを１５ｍｇ、グリセリン脂肪酸エステルを１５ｍｇの計２１０ｍｇを混合乳化したものを内容液とし、ゼラチン１００ｍｇ、グリセリン３０ｍｇの計１３０ｍｇで構成された皮膜に充てんし、総重量３４０ｍｇのソフトカプセルを作成する。これに、ゼインを３０ｍｇコーティングし、総重量３７０ｍｇの腸溶カプセルを作成する。これを１日あたり、３〜６粒飲めば、市販納豆１〜２パック（５０〜１００ｇ）のナットウキナーゼを摂取したことになる。
【００１７】
その他、打錠品、ドリンク、顆粒、ペースト等に応用出来る。
【００１８】
（実施例１）
実験方法：
健常人、男：１を対象に前記加工例によるソフトカプセルを６粒（納豆２パック分、１００ｇに相当するナットウキナーゼの力価）服用前、服用後２時間、４時間後、６時間後、８時間後に採血して血小板凝集能を測定した。血液採取はいずれも３．８％クエン酸ナトリウム加チューブを用い、２１Ｇ針にて上腕正中静脈より行った。採血量は１回１１ ｍｌ、計５５ ｍｌである。実際に服用される状況に近い状態での血小板凝集能を知るために、あえて絶食としなかったが、検査の性質上、朝食後２時間以上経過していることを条件とした。得られた血液検体は１８０×ｇ、１０分間遠心分離し、その上清を多血小板血漿（ＰＲＰ）とし、残りの検体は１６００×ｇ、１５分間遠心分離して、乏血小板血漿（ＰＰＰ）とした。ＰＲＰをＰＰＰにて希釈し、血小板数２５±３×１０４／μｌに調整して検体とした。凝集惹起剤にはコラーゲン［エム・シー・メディカル（株）］とＡＤＰ［エム・シー・メディカル（株）］を使用し、コラーゲンの最終濃度は１μｇ／ｍｌと２μｇ／ｍｌ、ＡＤＰの最終濃度は２μＭとした。
血小板凝集能測定には、レーザー散乱光を用いた粒子計測型血小板凝集能測定装置［ＰＡ−２０：興和（株）］を用いた。ＰＡ−２０は、直進する光が細かい粒子にあたって生じる散乱光強度が、粒子径の２乗に比例して増大するという原理を応用して開発された装置で、血小板凝集率のほか血小板凝集塊の大きさとその生成数も算定できる。また、従来の吸光度法では数千個の血小板からなる凝集塊が形成されてはじめて吸光度が低下したが、この装置では、血小板数１０個からなる小凝集塊でも測定でき検出感度に優れる。なお、血小板凝集塊サイズは散乱光強度により、２５ｍＶ＜小凝集塊（粒径９〜２５μｍ）＜２００ｍＶ、２００ｍＶ＜中凝集塊（粒径２５〜５０μｍ）＜６００ｍＶ、６００ｍＶ＜大凝集塊（粒径５０〜７０μｍ） ＜２，０４７ｍＶの３つに分類した［Ｈｏｓｈｉ Ｋ．，Ｚｈｏｕ Ｘ．，Ｔｅｒａｚｏｎｏ Ｍ．， Ｓａｔｏｕ Ｙ．，Ｙａｍａｚａｋｉ Ｍ．， Ｍｉｙａｋｅ Ｆ．， Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ．， ３２， ２２３−２３０（２００１）］。
次の式を用い血小板抑制率を計算した。
血小板抑制率（％）＝（１−Ｘ／Ｙ）×１００
Ｘ：ナットウキナーゼ摂取後のＡＤＰ又はコラーゲンを添加した散乱強度又はＯＤ（吸光度）
Ｙ：ナットウキナーゼ摂取前のＡＤＰ又はコラーゲンを添加した散乱強度又はＯＤ
実験結果：
摂取後４時間後から強い抑制作用が、コラーゲン１．０μｇ／ｍｌを凝集剤として添加したケースに見られた。（図１）また、血小板の凝集塊のサイズも８時間後には最も小さくなり、ナットウキナーゼ血小板の抑制作用が見られた（下記の表１Ａ，１Ｂ，１Ｃ）。
（実施例２）
実験方法：
健常人、男：１を対象に前記加工例によるソフトカプセルを６粒（納豆２パック分、１００ｇに相当するナットウキナーゼの力価）服用前、服用後２時間、４時間後、６時間後、８時間後に採血して血小板凝集能を測定した。血液採取はいずれも３．８％クエン酸ナトリウム加チューブを用い、２１Ｇ針にて上腕正中静脈より行った。採血量は１回１１ ｍｌ、計５５ ｍｌである。実際に服用される状況に近い状態での血小板凝集能を知るために、あえて絶食としなかったが、検査の性質上、朝食後２時間以上経過していることを条件とした。得られた血液検体は１８０×ｇ、１０分間遠心分離し、その上清を多血小板血漿（ＰＲＰ）とし、残りの検体は１６００×ｇ、１５分間遠心分離して、乏血小板血漿（ＰＰＰ）とした。ＰＲＰをＰＰＰにて希釈し、血小板数２５±３×１０４／μｌに調整して検体とした。凝集惹起剤にはコラーゲン［エム・シー・メディカル（株）］とＡＤＰ［エム・シー・メディカル（株）］を使用し、コラーゲンの最終濃度は２μｇ／ｍｌ、ＡＤＰの最終濃度は２μＭと５μＭとした。
血小板凝集能測定には、レーザー散乱光を用いた粒子計測型血小板凝集能測定装置［ＰＡ−２０：興和（株）］を用いた。ＰＡ−２０は、直進する光が細かい粒子にあたって生じる散乱光強度が、粒子径の２乗に比例して増大するという原理を応用して開発された装置で、血小板凝集率のほか血小板凝集塊の大きさとその生成数も算定できる。また、従来の吸光度法では数千個の血小板からなる凝集塊が形成されてはじめて吸光度が低下したが、この装置では、血小板数１０個からなる小凝集塊でも測定でき検出感度に優れる。なお、血小板凝集塊サイズは散乱光強度により、２５ｍＶ＜小凝集塊（粒径９〜２５μｍ）＜２００ｍＶ、２００ｍＶ＜中凝集塊（粒径２５〜５０μｍ）＜６００ｍＶ、６００ｍＶ＜大凝集塊（粒径５０〜７０μｍ） ＜２，０４７ｍＶの３つに分類した［Ｈｏｓｈｉ Ｋ．，Ｚｈｏｕ Ｘ．，Ｔｅｒａｚｏｎｏ Ｍ．， Ｓａｔｏｕ Ｙ．，Ｙａｍａｚａｋｉ Ｍ．， Ｍｉｙａｋｅ Ｆ．， Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ．， ３２， ２２３−２３０（２００１）］。
次の式を用い血小板抑制率を計算した。
血小板抑制率（％）＝（１−Ｘ／Ｙ）×１００
Ｘ：ナットウキナーゼ摂取後のＡＤＰ又はコラーゲンを添加した散乱強度又はＯＤ
Ｙ：ナットウキナーゼ摂取前のＡＤＰ又はコラーゲンを添加した散乱強度又はＯＤ
実験結果：
摂取後４時間後から強い抑制作用が、コラーゲン１．０μｇ／ｍｌを凝集剤として添加したケースに見られた（図２）。
【００２０】
（実施例３）
実験方法：
健常人、女：１を対象に前記加工例によるソフトカプセルを６粒（納豆２パック分、１００ｇに相当するナットウキナーゼの力価）服用前、服用後２時間、４時間後、６時間後、８時間後に採血して血小板凝集能を測定した。血液採取はいずれも３．８％クエン酸ナトリウム加チューブを用い、２１Ｇ針にて上腕正中静脈より行った。採血量は１回１１ ｍｌ、計５５ ｍｌである。実際に服用される状況に近い状態での血小板凝集能を知るために、あえて絶食としなかったが、検査の性質上、朝食後２時間以上経過していることを条件とした。得られた血液検体は１８０×ｇ、１０分間遠心分離し、その上清を多血小板血漿（ＰＲＰ）とし、残りの検体は１６００×ｇ、１５分間遠心分離して、乏血小板血漿（ＰＰＰ）とした。ＰＲＰをＰＰＰにて希釈し、血小板数２５±３×１０４／μｌに調整して検体とした。凝集惹起剤にはコラーゲン［エム・シー・メディカル（株）］とＡＤＰ［エム・シー・メディカル（株）］を使用し、コラーゲンの最終濃度は１μｇ／ｍｌと２μｇ／ｍｌ、ＡＤＰの最終濃度は２μＭと５μＭとした。
血小板凝集能測定には、レーザー散乱光を用いた粒子計測型血小板凝集能測定装置（ＰＡ−２０：興和（株））を用いた。ＰＡ−２０は、直進する光が細かい粒子にあたって生じる散乱光強度が、粒子径の２乗に比例して増大するという原理を応用して開発された装置で、血小板凝集率のほか血小板凝集塊の大きさとその生成数も算定できる。また、従来の吸光度法では数千個の血小板からなる凝集塊が形成されてはじめて吸光度が低下したが、この装置では、血小板数１０個からなる小凝集塊でも測定でき検出感度に優れる。なお、血小板凝集塊サイズは散乱光強度により、２５ｍＶ＜小凝集塊（粒径９〜２５μｍ）＜２００ｍＶ、２００ｍＶ＜中凝集塊（粒径２５〜５０μｍ）＜６００ｍＶ、６００ｍＶ＜大凝集塊（粒径５０〜７０μｍ） ＜２，０４７ｍＶの３つに分類した［Ｈｏｓｈｉ Ｋ．，Ｚｈｏｕ Ｘ．，Ｔｅｒａｚｏｎｏ Ｍ．， Ｓａｔｏｕ Ｙ．，Ｙａｍａｚａｋｉ Ｍ．， Ｍｉｙａｋｅ Ｆ．， Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ．， ３２， ２２３−２３０（２００１）］。
次の式を用い血小板抑制率を計算した。
血小板抑制率（％）＝（１−Ｘ／Ｙ）×１００
Ｘ：ナットウキナーゼ摂取後のＡＤＰ又はコラーゲンを添加した散乱強度又はＯＤ
Ｙ：ナットウキナーゼ摂取前のＡＤＰ又はコラーゲンを添加した散乱強度又はＯＤ
実験結果：
摂取後４時間後から強い抑制作用が、コラーゲン１．０μｇ／ｍｌを凝集剤として添加したケースに見られた。（図３）また、血小板の凝集塊のサイズも８時間後には最も小さくなり、ナットウキナーゼ血小板の抑制作用が見られた（下記の表２Ａ、２Ｂ）。
（実施例４）
実験方法：
健常人、男：１を対象に前記加工例によるナットウキナーゼ腸溶カプセルを６粒（納豆２パック分、１００ｇに相当するナットウキナーゼの力価）服用前、服用後２時間、４時間後、６時間後、８時間後に採血して血小板凝集能を測定した。血液採取はいずれも３．８％クエン酸ナトリウム加チューブを用い、２１Ｇ針にて上腕正中静脈より行った。採血量は１回１１ ｍｌ、計５５ ｍｌである。実際に服用される状況に近い状態での血小板凝集能を知るために、あえて絶食としなかったが、検査の性質上、朝食後２時間以上経過していることを条件とした。得られた血液検体は１８０×ｇ、１０分間遠心分離し、その上清を多血小板血漿（ＰＲＰ）とし、残りの検体は１６００×ｇ、１５分間遠心分離して、乏血小板血漿（ＰＰＰ）とした。ＰＲＰをＰＰＰにて希釈し、血小板数２５±３×１０４／μｌに調整して検体とした。凝集惹起剤にはコラーゲン［エム・シー・メディカル（株）］とＡＤＰ［エム・シー・メディカル（株）］を使用し、コラーゲンの最終濃度は０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌと２μｇ／ｍｌ、ＡＤＰの最終濃度は２μＭとした。
血小板凝集能測定には、レーザー散乱光を用いた粒子計測型血小板凝集能測定装置［ＰＡ−２０：興和（株）］を用いた。ＰＡ−２０は、直進する光が細かい粒子にあたって生じる散乱光強度が、粒子径の２乗に比例して増大するという原理を応用して開発された装置で、血小板凝集率のほか血小板凝集塊の大きさとその生成数も算定できる。また、従来の吸光度法では数千個の血小板からなる凝集塊が形成されてはじめて吸光度が低下したが、この装置では、血小板数１０個からなる小凝集塊でも測定でき検出感度に優れる。なお、血小板凝集塊サイズは散乱光強度により、２５ｍＶ＜小凝集塊（粒径９〜２５μｍ）＜２００ｍＶ、２００ｍＶ＜中凝集塊（粒径２５〜５０μｍ）＜６００ｍＶ、６００ｍＶ＜大凝集塊（粒径５０〜７０μｍ） ＜２，０４７ｍＶの３つに分類した［Ｈｏｓｈｉ Ｋ．，Ｚｈｏｕ Ｘ．，Ｔｅｒａｚｏｎｏ Ｍ．， Ｓａｔｏｕ Ｙ．，Ｙａｍａｚａｋｉ Ｍ．， Ｍｉｙａｋｅ Ｆ．， Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ．， ３２， ２２３−２３０（２００１）］。
次の式を用い血小板抑制率を計算した。
血小板抑制率（％）＝（１−Ｘ／Ｙ）×１００
Ｘ：ナットウキナーゼ摂取後のＡＤＰ又はコラーゲンを添加した散乱強度又はＯＤ
Ｙ：ナットウキナーゼ摂取前のＡＤＰ又はコラーゲンを添加した散乱強度又はＯＤ
実験結果：
摂取後４時間後から強い抑制作用が、コラーゲン１．０μｇ／ｍｌを凝集剤として添加したケースに見られた。（図４）また、血小板の凝集塊のサイズも８時間後には最も小さくなり、ナットウキナーゼ血小板の抑制作用が見られた（下記の表３Ａ、３Ｂ）。
【図面の簡単な説明】
【図１】コラーゲン及びＡＤＰを惹起剤として使用した、ナットウキナーゼ摂取後の血小板抑制率の経時変化を示す図である。
【図２】図１とは濃度の異なったコラーゲン及びＡＤＰを惹起剤として使用した、ナットウキナーゼ摂取後の血小板抑制率の経時変化を示す図である。
【図３】図１、図２とは濃度の異なったコラーゲン及びＡＤＰを惹起剤として使用した、ナットウキナーゼ摂取後の血小板抑制率の経時変化を示す図である。
【図４】図１、図２、図３とは濃度の異なったコラーゲン及びＡＤＰを惹起剤として使用した、ナットウキナーゼ摂取後の血小板抑制率の経時変化を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a platelet aggregation inhibitor, particularly a platelet aggregation inhibitor containing nattokinase as an active ingredient, and health foods thereof.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, nattokinase is known as a thrombolytic enzyme, and it is known that nattokinase's thrombolytic ability is excellent not only in the prevention but also in the treatment of thrombosis (Takusaku Takaoka: Japan Food Science, 39 (9 ), 55-60, 2000).
[0003]
Nattokinase is not contained in soybeans, but is produced by the process of natto bacteria acting on soybeans and fermenting, but this nattokinase is also included in the blood coagulation factor vitamin K 2 for the purpose of thrombus prevention, etc. as, when ingested natto or Bacillus natto culture extract containing nattokinase a thrombolytic enzymes, vitamins K 2 also will be ingested at the same time, the effect of vitamin K dependent coagulation factors synthesis inhibitor is canceled, there is a problem that Therefore, a technology for producing a Bacillus natto culture extract having a vitamin K 2 content of 1 μg / g dry weight or less has been developed (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-299277).
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
The present inventors thought that nattokinase may have a useful effect on the human body in addition to the thrombolytic action, and as a result of intensive studies, it was found that nattokinase has a platelet aggregation inhibitory action. Examples of clinically practical use as a platelet aggregation inhibitor, that is, an antiplatelet agent, include aspirin and ticlopidine, which are used orally, but these drugs have side effects. For example, in the case of aspirin, gastrointestinal disorders and aspirin asthma are seen, and in the case of ticlopidine, thrombocytopenic purpura (TTP), agranulocytosis, severe liver damage and the like are known.
[0005]
Therefore, an object of the present invention is to provide a platelet aggregation inhibitor having no side effects and a health food effective for inhibiting platelet aggregation.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
To achieve the above object, a platelet aggregation inhibitor of the present invention has an active ingredient nattokinase, also the content of vitamin K 2 is nattokinase rich natto culture extract or less 1 [mu] g / g dry weight The active ingredient.
[0007]
Further, effective health food platelet aggregation-inhibiting of the present invention is mainly composed of nattokinase, also mainly nattokinase rich natto culture extract content of vitamin K 2 is equal to or less than 1 [mu] g / g dry weight Ingredients.
[0008]
Nattokinase has been eaten as natto for hundreds of years, and its safety has been proven by experience. However, even in the natto fungus culture extract (powder type), there is nothing in the general state in acute toxicity tests using mice. No effect is seen, and LD 50 is 2,000 mg / kg or more. The reverse mutation test has also been proved to be negative (Takaoka Sakusaku: Japan Food Science, 39 (9), 55-60, 2000).
[0009]
Further, when the content of vitamin K 2 in nattokinase is 1 μg / g dry weight or less, the above-mentioned obstacle due to vitamin K 2 does not occur.
Since nattokinase is thus proven to be safe, it can be used not only as a drug but also as a food (health food).
[0010]
Thus, according to the present invention, it is possible to provide a platelet aggregation inhibitor that does not cause problems such as side effects, and a health food that is effective for the safe suppression of platelet aggregation. In addition, since thrombus growth is suppressed, myocardial infarction and cerebral infarction can be treated and prevented.
[0011]
【Example】
Hereinafter, production examples, processing examples, and examples will be described.
[0012]
A production example of a nattokinase-rich natto fungus culture extract having a vitamin K 2 content of 1 μg / g dry weight or less is as follows.
(Production example)
A nattokinase-rich culture solution is produced by ingesting and cultivating natto bacteria in a liquid medium containing soybean as the main raw material. Then, the coagulating sedimentation filtration using a chitosan solution, removing the Bacillus natto and K 2, and the culture solution was aseptically filtered through a membrane filter, dried and powder processing.
[0013]
(Processing example)
The Bacillus natto culture extract can be processed into capsules, tablets, drinks, granules, pastes, and the like, and processing examples will be shown below.
[0014]
The soft capsule is, for example, a mixture and emulsified of 210 mg of total natto bacteria extract powder (20000FU / g), 36.7 mg, soy lecithin 10 mg, soy bean oil 133.3 mg, beeswax 15 mg, and glycerin fatty acid ester 15 mg. A soft capsule with a total weight of 340 mg can be made by filling a film composed of a total of 130 mg of
[0015]
Similarly, in the case of a hard capsule, the content of a mixture of 260 mg (36.7 mg of Natto fungus culture extract powder (20000 FU / g), 209.8 mg of dextrin, and 13.5 mg of sucrose fatty acid ester is used as the contents. Hard capsules (70 mg) are filled into hard capsules with a total weight of 330 mg. If you drink 3 to 6 tablets per day, you have ingested 1-2 packs (50 to 100 g) of nattokinase.
[0016]
Enteric capsules (including acid-resistant coat) are, for example, 36.7 mg of Natto bacillus culture extract powder (20000FU / g), 10 mg of soybean lecithin, 133.3 mg of soybean oil, 15 mg of beeswax, 15 mg of glycerin fatty acid ester A total emulsified amount of 210 mg is mixed and emulsified into a content solution, which is filled into a film composed of a total of 130 mg of
[0017]
In addition, it can be applied to tablets, drinks, granules, pastes, etc.
[0018]
(Example 1)
experimental method:
6 healthy capsules according to the above-mentioned processing examples for healthy persons and men (2 packs of natto, nattokinase titer equivalent to 100 g) before taking, 2 hours, 4 hours, 6 hours and 8 hours after taking Later, blood was collected to measure the platelet aggregation ability. All blood samples were collected from the midline brachial vein with a 21G needle using a 3.8% sodium citrate tube. The amount of blood collected is 11 ml at a time, for a total of 55 ml. In order to know the platelet aggregation ability in a state close to the actual state of taking it, we did not dare to fast, but due to the nature of the test, it was required that 2 hours or more had passed since breakfast. The obtained blood sample is centrifuged at 180 × g for 10 minutes, the supernatant is platelet rich plasma (PRP), and the remaining sample is centrifuged at 1600 × g for 15 minutes to obtain platelet poor plasma (PPP). did. PRP was diluted with PPP and adjusted to a platelet count of 25 ± 3 × 10 4 / μl to prepare a specimen. Collagen [MC Medical Co., Ltd.] and ADP [MC Medical Co., Ltd.] were used as the aggregation inducer, and the final concentrations of collagen were 1 μg / ml and 2 μg / ml, and the final concentration of ADP was 2 μM.
For measuring the platelet aggregation ability, a particle measurement type platelet aggregation ability measurement apparatus [PA-20: Kowa Co., Ltd.] using laser scattered light was used. PA-20 is a device developed based on the principle that the intensity of scattered light generated when light traveling straight on fine particles increases in proportion to the square of the particle diameter. The size and number of generations can also be calculated. In addition, in the conventional absorbance method, the absorbance is reduced only after an aggregate composed of several thousand platelets is formed. However, this apparatus can measure even a small aggregate composed of 10 platelets and has excellent detection sensitivity. The platelet aggregate size depends on the scattered light intensity: 25 mV <small aggregate (particle size 9 to 25 μm) <200 mV, 200 mV <medium aggregate (particle size 25 to 50 μm) <600 mV, 600 mV <large aggregate (particle size) 50 to 70 μm) <2,047 mV [Hoshi K. , Zhou X. Terazono M. , Sato Y. Yamazaki M .; , Miyake F. et al. , Jpn. J. et al. Clin. Pharmacol. Ther. , 32, 223-230 (2001)].
The platelet inhibition rate was calculated using the following formula.
Platelet inhibition rate (%) = (1−X / Y) × 100
X: Scattering intensity or OD (absorbance) with addition of ADP or collagen after ingestion of nattokinase
Y: Scattering intensity or OD added with ADP or collagen before nattokinase intake
Experimental result:
A strong inhibitory action was observed in the case where 1.0 μg / ml of collagen was added as a flocculant after 4 hours from the ingestion. (FIG. 1) In addition, the size of platelet aggregates became the smallest after 8 hours, and nattokinase platelet inhibitory action was observed (Tables 1A, 1B, and 1C below).
(Example 2)
experimental method:
6 healthy capsules according to the above-mentioned processing examples for healthy persons and men (2 packs of natto, nattokinase titer equivalent to 100 g) before taking, 2 hours, 4 hours, 6 hours and 8 hours after taking Later, blood was collected to measure the platelet aggregation ability. All blood samples were collected from the midline brachial vein with a 21G needle using a 3.8% sodium citrate tube. The amount of blood collected is 11 ml at a time, for a total of 55 ml. In order to know the platelet aggregation ability in a state close to the actual state of taking it, we did not dare to fast, but due to the nature of the test, it was required that 2 hours or more had passed since breakfast. The obtained blood sample is centrifuged at 180 × g for 10 minutes, the supernatant is platelet rich plasma (PRP), and the remaining sample is centrifuged at 1600 × g for 15 minutes to obtain platelet poor plasma (PPP). did. PRP was diluted with PPP and adjusted to a platelet count of 25 ± 3 × 10 4 / μl to prepare a specimen. Collagen [MC Medical Co., Ltd.] and ADP [MC Medical Co., Ltd.] were used as the aggregation inducer, the final collagen concentration was 2 μg / ml, and the final ADP concentrations were 2 μM and 5 μM. did.
For measuring the platelet aggregation ability, a particle measurement type platelet aggregation ability measurement apparatus [PA-20: Kowa Co., Ltd.] using laser scattered light was used. PA-20 is a device developed based on the principle that the intensity of scattered light generated when light traveling straight on fine particles increases in proportion to the square of the particle diameter. The size and number of generations can also be calculated. In addition, in the conventional absorbance method, the absorbance is reduced only after an aggregate composed of several thousand platelets is formed. However, this apparatus can measure even a small aggregate composed of 10 platelets and has excellent detection sensitivity. The platelet aggregate size depends on the scattered light intensity: 25 mV <small aggregate (particle size 9 to 25 μm) <200 mV, 200 mV <medium aggregate (particle size 25 to 50 μm) <600 mV, 600 mV <large aggregate (particle size) 50 to 70 μm) <2,047 mV [Hoshi K. , Zhou X. Terazono M. , Sato Y. Yamazaki M .; , Miyake F. et al. , Jpn. J. et al. Clin. Pharmacol. Ther. , 32, 223-230 (2001)].
The platelet inhibition rate was calculated using the following formula.
Platelet inhibition rate (%) = (1−X / Y) × 100
X: Scattering intensity or OD with ADP or collagen added after nattokinase ingestion
Y: Scattering intensity or OD added with ADP or collagen before nattokinase intake
Experimental result:
A strong inhibitory action was seen in the case where 1.0 μg / ml of collagen was added as a flocculant after 4 hours from ingestion (FIG. 2).
[0020]
(Example 3)
experimental method:
6 healthy capsules according to the above-mentioned process for healthy subjects and women (2 packs of natto, nattokinase titer equivalent to 100 g) Before taking, 2 hours, 4 hours, 6 hours, 8 hours after taking Later, blood was collected to measure the platelet aggregation ability. All blood samples were collected from the midline brachial vein with a 21G needle using a 3.8% sodium citrate tube. The amount of blood collected is 11 ml at a time, for a total of 55 ml. In order to know the platelet aggregation ability in a state close to the actual state of taking it, we did not dare to fast, but due to the nature of the test, it was required that 2 hours or more had passed since breakfast. The obtained blood sample is centrifuged at 180 × g for 10 minutes, the supernatant is platelet rich plasma (PRP), and the remaining sample is centrifuged at 1600 × g for 15 minutes to obtain platelet poor plasma (PPP). did. PRP was diluted with PPP and adjusted to a platelet count of 25 ± 3 × 10 4 / μl to prepare a specimen. Collagen [MC Medical Co., Ltd.] and ADP [MC Medical Co., Ltd.] were used as the aggregation inducer, and the final concentrations of collagen were 1 μg / ml and 2 μg / ml, and the final concentration of ADP was 2 μM and 5 μM.
For the measurement of platelet aggregation ability, a particle measurement type platelet aggregation ability measurement apparatus (PA-20: Kowa Co., Ltd.) using laser scattered light was used. PA-20 is a device developed based on the principle that the intensity of scattered light generated when light traveling straight on fine particles increases in proportion to the square of the particle diameter. The size and number of generations can also be calculated. In addition, in the conventional absorbance method, the absorbance is reduced only after an aggregate composed of several thousand platelets is formed. However, this apparatus can measure even a small aggregate composed of 10 platelets and has excellent detection sensitivity. The platelet aggregate size depends on the scattered light intensity: 25 mV <small aggregate (particle size 9 to 25 μm) <200 mV, 200 mV <medium aggregate (particle size 25 to 50 μm) <600 mV, 600 mV <large aggregate (particle size) 50 to 70 μm) <2,047 mV [Hoshi K. , Zhou X. Terazono M. , Sato Y. Yamazaki M .; , Miyake F. et al. , Jpn. J. et al. Clin. Pharmacol. Ther. , 32, 223-230 (2001)].
The platelet inhibition rate was calculated using the following formula.
Platelet inhibition rate (%) = (1−X / Y) × 100
X: Scattering intensity or OD with ADP or collagen added after nattokinase ingestion
Y: Scattering intensity or OD added with ADP or collagen before nattokinase intake
Experimental result:
A strong inhibitory action was observed in the case where 1.0 μg / ml of collagen was added as a flocculant after 4 hours from the ingestion. (FIG. 3) In addition, the size of platelet aggregates became the smallest after 8 hours, and the inhibitory action of nattokinase platelets was observed (Tables 2A and 2B below).
Example 4
experimental method:
6 healthy nattokinase enteric capsules according to the above processed example (2 natto packs, nattokinase equivalent to 100 g) before taking, 2 hours, 4 hours, 6 hours after taking After 8 hours, blood was collected to measure the platelet aggregation ability. All blood samples were collected from the midline brachial vein with a 21G needle using a 3.8% sodium citrate tube. The amount of blood collected is 11 ml at a time, for a total of 55 ml. In order to know the platelet aggregation ability in a state close to the actual state of taking it, we did not dare to fast, but due to the nature of the test, it was required that 2 hours or more had passed since breakfast. The obtained blood sample is centrifuged at 180 × g for 10 minutes, the supernatant is platelet rich plasma (PRP), and the remaining sample is centrifuged at 1600 × g for 15 minutes to obtain platelet poor plasma (PPP). did. PRP was diluted with PPP and adjusted to a platelet count of 25 ± 3 × 10 4 / μl to prepare a specimen. Collagen [MC Medical Co., Ltd.] and ADP [MC Medical Co., Ltd.] are used as the aggregation inducer, and the final collagen concentrations are 0.5 μg / ml, 1 μg / ml and 2 μg / ml. The final concentration of ADP was 2 μM.
For measuring the platelet aggregation ability, a particle measurement type platelet aggregation ability measurement apparatus [PA-20: Kowa Co., Ltd.] using laser scattered light was used. PA-20 is a device developed based on the principle that the intensity of scattered light generated when light traveling straight on fine particles increases in proportion to the square of the particle diameter. The size and number of generations can also be calculated. In addition, in the conventional absorbance method, the absorbance is reduced only after an aggregate composed of several thousand platelets is formed. However, this apparatus can measure even a small aggregate composed of 10 platelets and has excellent detection sensitivity. The platelet aggregate size depends on the scattered light intensity: 25 mV <small aggregate (particle size 9 to 25 μm) <200 mV, 200 mV <medium aggregate (particle size 25 to 50 μm) <600 mV, 600 mV <large aggregate (particle size) 50 to 70 μm) <2,047 mV [Hoshi K. , Zhou X. Terazono M. , Sato Y. Yamazaki M .; , Miyake F. et al. , Jpn. J. et al. Clin. Pharmacol. Ther. , 32, 223-230 (2001)].
The platelet inhibition rate was calculated using the following formula.
Platelet inhibition rate (%) = (1−X / Y) × 100
X: Scattering intensity or OD with ADP or collagen added after nattokinase ingestion
Y: Scattering intensity or OD added with ADP or collagen before nattokinase intake
Experimental result:
A strong inhibitory action was observed in the case where 1.0 μg / ml of collagen was added as a flocculant after 4 hours from the ingestion. (FIG. 4) In addition, the size of platelet aggregates became the smallest after 8 hours, and the inhibitory action of nattokinase platelets was observed (Tables 3A and 3B below).
[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a graph showing the time course of platelet inhibition rate after ingestion of nattokinase using collagen and ADP as inducers.
FIG. 2 is a graph showing the change over time in the platelet inhibition rate after ingestion of nattokinase using collagen and ADP having different concentrations as inducing agents from FIG.
FIG. 3 is a graph showing the change over time in the platelet inhibition rate after ingestion of nattokinase using collagen and ADP having different concentrations from those in FIGS. 1 and 2 as inducers.
FIG. 4 is a graph showing changes over time in the platelet inhibition rate after ingestion of nattokinase using collagen and ADP having different concentrations as inducing agents from those in FIGS.
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| JP2003111081A JP2004143138A (en) | 2002-08-30 | 2003-04-16 | Platelet aggregation inhibitor and health food effective for inhibiting platelet aggregation |
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006325538A (en) * | 2005-05-30 | 2006-12-07 | Asahimatsu Shokuhin Kk | Method for producing bacillus natto kinase and the resultant bacillus natto kinase |
| US8114642B2 (en) | 2004-12-28 | 2012-02-14 | Japan Bio Science Laboratory Co., Ltd. | Method for producing vitamin K2 from culture of Bacillus natto |
| JP2017119683A (en) * | 2015-12-24 | 2017-07-06 | 株式会社日本生物科学研究所 | Blood coagulation inhibitor |
| US11065310B2 (en) | 2016-05-27 | 2021-07-20 | Nattocat, LLC | Compositions and methods for thromboembolism dissolution |
-
2003
- 2003-04-16 JP JP2003111081A patent/JP2004143138A/en active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8114642B2 (en) | 2004-12-28 | 2012-02-14 | Japan Bio Science Laboratory Co., Ltd. | Method for producing vitamin K2 from culture of Bacillus natto |
| US8603552B2 (en) | 2004-12-28 | 2013-12-10 | Japan Bio Science Laboratory Co., Ltd. | Method for producing foods from culture of Bacillus natto |
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