JP2004089189A - Insecticidal protein toxin from photorhadbus - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an insecticidal protein capable of being easily administered, to provide a method for expressing a toxin in a different species, and to provide a drug delivery method for the insecticidal toxin, having functionality of acting on many insect orders and more effective than ever. <P>SOLUTION: This protein toxin and its variant each have a specified amino acid sequence derived from a Photorhadbus worm. The nucleic acid molecule encodes the protein. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

（括弧内の配列はトリプシン消化で得られた内部アミノ酸配列を示す）
【００１９】
上記に挙げた配列はゲノム領域でグループ分けされている。ｔｃｂＡ遺伝子は、実施例で説明するように２つのタンパクフラグメントＴｃｂＡおよびＴｃｂＡ_ｉｉｉとして大腸菌で発現された。いくつかの配列をタンパク質分解によって切り取って、遺伝子導入用市販品のためにより高い活性をもつ毒素を得ることは有益であろう。
【００２０】
本明細書で開示する毒素は、当該毒素が機能的な活性（これが昆虫制御戦略の開発の鍵であるが）を有するという点において極めて特異的である。昆虫制御略の開発では、生物の消化管を避けて当該生物に直接タンパク質を注射してタンパク分解過程を遅らせまたは妨害することが可能である。そのような場合には、該生物に投与されるタンパク質は、変性、非特異的分解または高等生物の免疫系による排除までその機能を保持するであろう。殺虫性毒素の昆虫への注射は実験室でのみ応用が可能で、さらに容易に注射できる大型の昆虫について可能である。本明細書で開示する殺虫性タンパク毒素は、経口消化または毒素との接触後にその毒性活性を表すという観察は、該タンパク毒素を昆虫の餌に取り込ませることの可能性を専らあてにする昆虫制御計画の開発を可能にする。そのような計画の結果は昆虫の毒餌であろう。
【００２１】
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓの毒素は昆虫に精製形で投与してもよい。この毒素はまた約１から約１００ｍｇ／リットルブロスの量で薬剤分布させてもよい。これは、製剤の条件、接種源の条件、毒素分離技術などにしたがって変動するであろう。この毒素は異種原核細胞または真核細胞宿主で初めに発現された滲出分泌物または細胞タンパク質として投与してもよい。細菌は、典型的には当該タンパク質が発現される宿主である。真核細胞宿主には植物、昆虫および酵母が含まれるが、これらに限られるものではない。また別にはこの毒素は、細菌により、または野外で遺伝子導入植物により、またはバキュロウイルスベクターにより昆虫で産生させてもよい。典型的にはこの毒素は、昆虫の餌に１種または２種以上の毒素を混ぜることによって昆虫に導入されるであろう。
【００２２】
摂食昆虫に対する完全致死率は有用であるが、有意義な毒性を達成するためには要求されない。もし昆虫が毒素を避けるかまたは摂食を中止するならば、たとえ毒素の効果が致死量以下であったとしてもこの回避行動は幾つかの応用例で有用であろう。例えば、昆虫耐性遺伝子導入作物植物を所望する場合、昆虫が当該植物を接触するのをためらうことは該昆虫に対する致死的毒性と同様に有用である。なぜならば、究極の目的は該植物の保護であって当該昆虫を死滅させることではないからである。
毒素を昆虫の餌に混ぜるために他の多くの方法がある。一例として、本明細書に開示したようにタンパク質溶液を噴霧して当該毒素タンパク質を幼虫の摂食源に混ぜることが可能である。また別には、精製タンパク質を無害な細菌に遺伝子工学によって導入し、続いてこれを培養して増殖させ、さらに摂食源に用いるかまたは該昆虫を撲滅しようとする地域の土壌に定着させる。また、該タンパク質を昆虫の摂食源に遺伝子工学的に直接導入することもできる。例えば、多くの昆虫の幼虫の主要な摂食源は植物成分である。
【００２３】
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ毒素の殺虫特性をコードする遺伝成分を、特定の害虫が摂食する植物のゲノムに組み込むことによって、該摂食用植物を食べた後で成虫または幼虫は死滅するであろう。単子葉および双子葉に属する多くの植物が形質転換された。遺伝子導入農作物は果物および野菜とともに商業的に重要である。そのような作物にはトウモロコシ、コメ、ダイズ、カノラ（ｃａｎｏｌａ）、ヒマワリ、アルファルファ、モロコシ、コムギ、綿花、ピーナツ、トマト、ジャガイモなどが含まれるが、これらに限られるものではない。外来遺伝成分を植物細胞に導入し、さらに該導入遺伝子を安定的に維持し発現させるためにはいくつかの技術がある。そのような技術には、微粒子上に被覆された遺伝物質の直接細胞導入の促進が含まれる（米国特許４９４５０５０号（Ｃｏｒｎｅｌｌ）および同５１４１１３１号（ＤｏｗＥｌａｎｃｏ））。植物はアグロバクテリウム関連技術を用いて形質転換できる（米国特許５１７７０１０号（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｐｌｅｄｏ）、同５１０４３１０号（Ｔｅｘａｓ　Ａ＆Ｍ）、欧州特許出願公開公報第０１３１６２４Ｂ１号、欧州特許出願公開公報第１２０５１６号、同１５９４１８Ｂ１号および同１７６１１２号（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔ）、米国特許５１４９６４５号、同５４６９９７６号、同５４６４７６３号および同４９４０８３８号、並びに同４６９３９７６号（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔ）、欧州特許出願公開公報第１１６７１８号１２９０７９９号、３２０５００号（全てＭａｘＰｌａｎｃｋ）、欧州特許出願公開公報第６０４６６２号および６２７７５２号（Ｊａａｐａｎ　Ｔｏｂａｃｃｏ）、欧州特許出願公開公報第０２６７１５９号および０２９２４３５号並びに米国特許５２３１０１９号（全てＣｉｂａ　Ｇｅｉｇｙ）、米国特許５４６３１７４号および４７６２７８５号（ともにＣａｉｇｅｎｅ）、米国特許５００４８６３号および５１５９１３５号（ともにＡｇｒａｃｅｔｕｓ）を参照のこと）。他の形質転換技術にはウィスカー（Ｗｈｉｓｋｅｒｓ）の技術（米国特許５３０２５２３号および５４６４７６５号（ともにＺｅｎｅｃａ）を参照のこと）が含まれる。電気穿孔術（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）もまた植物の形質転換に用いられた（ＷＯ８７／０６６１４号（Ｂｏｙｃｅ　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、同５４７２８６９号および５３８４２５３号（ともにＤｅｋａｌｂ）、ＷＯ９２０９６９５号およびＷＯ９３２１３３５号（ともにＰＧＳ）を参照のこと）。
【００２４】
これらの形質転換に関する特許および刊行物は参照により本明細書に含まれる。植物を形質転換させる多くの技術だけでなく、外来遺伝子と接触する組織の種類も同様に変化をもたせることができる。そのような組織には胎児性組織、カルス組織Ｉ型およびＩＩ型、ヒポコチル、メリステムなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。ほとんど全ての植物組織は、当技術分野の適切な技術を用いて分化中に形質転換させることができる。
また別の変動因子は、選別マーカーの選択てある。具体的マーカーとして何を選択するかは当業者の自由裁量であるが、以下の選別マーカーのいずれも使用することができ、さらに、本明細書に挙げられていない選別マーカーとして機能しえる他の何れの遺伝子も用いることができる。そのような選別マーカーには、トランスポゾンＴｎ５（ＡｐｈＩＩ）のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（これは、抗生物質（カナマイシン、ネオマイシンおよびＧ４１８）に対する耐性をコードする）とともに、グリホセート；ヒグロマイシン；メトトレキセート；ホスフィノスリシン（ビアロホス）；イミダゾリノン、スルホニルウレアおよびトリアゾロピリミジン除草剤（例えばクロロスルフロン）；ブロモキシニル、ダラポンなどに対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
選別マーカーの他に、レポーター遺伝子を用いることが望ましい。いくつかの例では、選別マーカーを使用しないでレポーター遺伝子を用いることができる。レポーター遺伝子は、受容生物または組織には典型的には存在しないかまたは発現されない遺伝子である。レポーター遺伝子は典型的には、何らかの表現型の変化または酵素特性を提供するタンパク質をコードする。そのような遺伝子の例は文献に記載されている（Ｋ．Ｗｅｉｓｉｎｇら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２２：４２１（１９８８）、この文献は参照により本明細書に含まれる）。好ましいルポーター遺伝子はグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子である。
形質転換技術に関係なく、植物プロモーターをベクターに包含させることによって植物細胞でＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ毒素を発現できるように適応させた遺伝子伝達ベクターに好ましくは当該遺伝子を取り込ませる。植物プロモーターの他に、種々の起源のプロモーターが、外来遺伝子を発現させるために植物細胞で有効に用いられる。例えば、細菌由来のプロモーター（例えばオクトピンシンセターゼプロモーター、ノパリンシンセターゼプロモーター、マンノピンシンセターゼプロモーター）、ウイルス由来プロモーター（例えばカリフラワーモザイクウイルス（３５Ｓおよび１９Ｓ））などを用いることができる。植物プロモーターには、リブロース−１，６−ビスホスフェート（ＲＵＢＰ）カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）、ベータ−コングリシニンプロモーター、ファセオリンプロモーター、ＡＤＨプロモーター、熱ショックプロモーターおよび組織特異的プロモーターが含まれるが、これらに限られるものではない。プロモーターはまた、転写効率を改良することができるある種のエンハンサー配列成分を含むことができる。典型的なエンハンサーにはＡｄｈ−イントロン１およびＡｄｈ−イントロン６が含まれるが、これらに限定されない。構成的プロモーターも用いることができる。構成的プロモーターは、全ての細胞型で常に連続的な遺伝子発現を誘導する（例えばアクチン、ユビキチン、ＣａＭＶ３５Ｓ）。組織特異的プロモーターも例えば葉または種子のような特定の細胞または組織型での遺伝子発現をもたらし（例えばゼイン、オレオシン、ナピン、ＡＣＰ）、これらのプロモーターもまた使用できる。プロモーターは、植物組織および器官で活性を有するのと同様に植物の発育時の一定段階でもまた活性を有する。そのようなプロモーターの例には花粉特異的、胎児特異的、トウモロコシの穂の毛特異的、綿花繊維特異的、根特異的、種子エンドスパーム（ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ）特異的プロモーターなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
ある種の環境下では、誘導可能なプロモーターを用いることが望ましいであろう。誘導可能なプロモーターは、特異的シグナル（例えば生理的シグナル（熱ショック遺伝子）、光（ＲＵＢＰカルボキシラーゼ）、ホルモン（Ｅｍ）、代謝物およびストレス）に反応して遺伝子の発現をもたらす。植物で機能する他の望ましい転写および翻訳成分も用いることができる。植物特異的な多くの遺伝子伝達ベクターが当技術分野で知られている。
さらに、植物で細菌遺伝子の高い発現を得るためには、細菌遺伝子が植物の細胞質でより効果的に発現するようにそれらを再操作することが好ましいことが知られている。トウモロコシは、形質転換の前に細菌遺伝子を再操作して植物での毒素の発現レベルを高めることが好ましい植物の１つである。再操作の理由の１つは、天然の細菌遺伝子のＧ＋Ｃ含有量が極めて低い（Ａ＋Ｔ含有量が高いという結果になる）ということである。この結果は、Ａ＋Ｔが極めて豊富であることが知られている植物遺伝子制御配列を模倣するまたは複製する配列の作製であろう。植物内に導入される遺伝子のＤＮＡ内にＡ＋Ｔに富むいくつかの配列（例えば遺伝子プロモーターに通常見出されるＴＡＴＡボックス領域）が存在するということは、遺伝子の異常な転写をもたらす可能性がある。他方、転写ｍＲＮＡに存在する他の調節配列（例えばポリアデニル化シグナル配列（ＡＡＵＡＡＡ）または前駆体ｍＲＮＡのスプライシングに必要な小型の核ＲＮＡ）の存在は、ＲＮＡの不安定性につながるかもしれない。したがって、再操作した細菌遺伝子デザイン（より好ましくは植物最適化遺伝子と称される）の目標の１つは、より高いＧ＋Ｃ含有量をもつＤＮＡ配列、および好ましくは代謝酵素をコードする植物遺伝子のそれに近いものを作製することである。植物最適化遺伝子のデザインのまた別の目標は、Ｇ＋Ｃ含有量が高いというだけでなく、その配列変化を修飾（変更）することによって翻訳を妨げないＤＮＡ配列を作製することである。
【００２７】
高Ｇ＋Ｃ含有量を有する植物の例はトウモロコシである。下記の表は、Ｇ＋Ｃ含有量がトウモロコシでどのように高いかを示している。トウモロコシの場合のように、他の植物のＧ＋Ｃ含有量もまた高いと考えられる。
【００２８】
【表２】
表１．

ａ　遺伝子類の数は括弧内に示す。
ｂ　標準偏差は括弧内に示す。
ｃ　統合群の平均は全体の平均の計算では無視した。
【００２９】
表１のデータについては、遺伝子のコード領域はＧｅｎＢａｎｋ（レリース７１）の登録から抽出し、塩基組成はマックベクター（登録商標）プログラム（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ^ＴＭ，ＩＢＩ，Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ，コネチカット）を用いて計算した。イントロン配列は計算では無視した。Ｉ群およびＩＩ群の貯蔵タンパク遺伝子配列はそれらの塩基組成における顕著な相違で区別した。
遺伝暗号の余剰性（すなわちいくつかのアミノ酸は１つ以上のコドンによって特定される）によって許容される柔軟性のゆえに、異なる生物または異なる種類のゲノムの進化は余剰コドンの異なる用い方をもたらした。この”コドンの偏り”はタンパクコード領域の平均塩基組成に現れる。例えば、比較的低いＧ＋Ｃ含有量をもつ生物は余剰コドンの第三位にＡまたはＴを有するコドンを利用し、一方、高いＧ＋Ｃ含有量をもつものは第三位にＧまたはＣを有するコドンを利用する。遺伝子のｍＲＮＡ内に”マイナー”コドンが存在することによって、特に該マイナーコドンに対応する稼働ｔＲＮＡの相対的なゆとりが低い場合は当該ｍＲＮＡの絶対翻訳率が低下すると考えられる。これを拡大すれば、個々のマイナーコドンによる翻訳率の低下は、多数のマイナーコドンについて少なくとも累積的であるということである。したがって、マイナーコドンの含有量が比較的高いｍＲＮＡはそれに対応して翻訳率が低いであろう。この翻訳率は、該当コードタンパク質の低レベルの合成によって体現される。
【００３０】
細菌遺伝子の再操作のために植物のコドンの偏りを決定する。コドンの偏りは、植物がそのタンパク質をコードするために用いる統計的コドン分布である。この偏りを求めた後で対象遺伝子のコドンの％頻度を求める。植物が好んで用いる主要コドンが、第二および第三の好ましいコドンとともに求められるべきであろう。対象タンパク質のアミノ酸配列を逆に翻訳し、その結果、生じた核酸配列が天然の細菌遺伝子と同じタンパク質をコードするが、生じた核酸配列は所望の植物の第一の好ましいコドンに対応するようにした。新規な配列は、変更によってつくり出された制限酵素部位に関して分析される。さらに第二または第三の好ましい選択コドンで当該コドンを置換することによって、この特定した部位を変更する。対象遺伝子の転写または翻訳に影響を与える配列内のその他の部位は、エクソン：イントロン５’または３’結合部、ポリＡ付加シグナル、またはＲＮＡポリメラーゼ終結シグナルである。さらにこの配列を分析し、ＴＡまたはＧＣ対の頻度を減少させるために修飾する。これらの対の他に、約４つ以上の同じ残基を有するＧまたはＣ配列ブロックも当該配列の転写に影響を与える。したがって、これらのブロックもまた第一または第二の選択コドンなどをその次に好ましい選択コドンで置換することによって変更される。好ましくは、この植物最適化遺伝子は、約６３％の第一の選択コドンを、約２２％から約３７％の第二の選択コドンを、さらに１５％から０％の第三の選択コドンを含み、ここで百分率の合計は１００％である。最も好ましくは、植物最適化遺伝子は、約６３％の第一の選択コドンを、少なくとも約２２％の選択コドンを、約７．５％の第三の選択コドンを、さらに約７．５％の第四の選択コドンを含み、ここで百分率の合計は１００％である。上記に述べた方法は、当業者が、特定の植物にとって外来性である遺伝子を修飾し、その結果該遺伝子を植物内で最適に発現させることを可能にする。本方法は、現在審査中の条件付き米国特許出願６０／００５４０５号（１９９５年１０月１３日出願、この文献は参照により本明細書に含まれる）でさらに詳述されている。
【００３１】
したがって、植物最適化遺伝子をデザインするために、形質転換される特定の植物についての遺伝子ＤＮＡ配列に関して編集したコドンの偏り表から確定した非余剰性遺伝暗号を用いて、該毒素のアミノ酸配列をＤＮＡに逆翻訳する。得られたＤＮＡ配列（これはコドンの用い方においては完全に均質である）をさらに修飾して、より高いコドンの多様性を有するという他に、計画的な制限酵素部位の配置、所望の塩基組成、および遺伝子の転写または生成ｍＲＮＡの翻訳に干渉するおそれのある配列の除去を図る。
細菌遺伝子がプラスチドで発現される場合には、該細菌遺伝子はもっと容易に植物で発現されるであろうという学説がある。したがって、遺伝子を植物発現に最適にすることなく細菌遺伝子を植物で発現させ、タンパク質の高発現を得ることは可能かもしれない（例えば米国特許４７６２７８５号、５４５１５１３号および５５４５８１７号を参照のこと、これらの文献は参照により本明細書に含まれる）。
【００３２】
商品として遺伝子導入植物を開発するための課題の１つは耐性の管理である。
これはＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素に関して特にいえる。商業的にＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを開発している企業は多く、耐性Ｂｔ毒素に関してはこれまで懸念が多かった。昆虫の耐性に関する管理についてのこれまでの戦略はＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓによって産生される毒素を例えばＢｔのような草食性昆虫タンパク毒素（Ｃｉｂａ　Ｇｅｉｇｙ）または他の毒素と混ぜることであろう。噴霧可能なようにこの組み合わせを製剤化するか、または分子として組み合わせることができるであろう。植物は、昆虫毒素を産生するＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ遺伝子および他の昆虫毒素遺伝子（例えばＢｔ）で形質転換できるであろう。
欧州特許出願公開公報第０４００２４６Ａ１は、２種のＢｔ（この２種の遺伝子は何でもよい）による１つの植物の形質転換を開示する。１種以上の昆虫耐性遺伝子を含む遺伝子導入植物を製造するまた別の方法は、各植物が１つの昆虫耐性遺伝子を含む２種の植物を製造することである。これらの植物を慣習的な交配技術を用いて戻し交配し、１種以上の昆虫耐性遺伝子を含む植物を製造する。
【００３３】
植物最適化遺伝子を含む形質転換植物の製造に加えて、細菌遺伝子の再操作にとって望ましいと思われる他の薬剤送達系が存在する。同じように摂食源として昆虫誘因性をもつ分子と毒素の殺虫活性とを融合させた、遺伝学的に操作して容易に分離可能なタンパク毒素を作出し、標準的で周知の技術を用いて細菌または真核細胞で発現させることができる。研究室で精製した後、”はめ込み式”毒餌を含むそのような毒素薬剤は標準的な昆虫補足用ハウジングに梱包できる。
別の薬剤送達系はバキュロウイルスベクターに毒素の遺伝物質を取り込ませることである。バキュロウイルスは、特定の昆虫宿主（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ毒素の好ましい標的である昆虫を含む）に感染する。Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ毒素の発現構築物を含む感染性バキュロウイルスを昆虫被害地域に導入し、それによって感染昆虫を毒で汚染させる。
【００３４】
殺虫特性の伝達には、タンパク発現ベクターに組み込まれたＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ毒素のアミノ酸配列をコードする核酸配列が必要である。当該ベクターはそれが生存する宿主にとって適切なものでなければならない。殺虫特性を有するタンパク質をコードする核酸配列を得る方法の１つは、毒素のアミノ酸配列（その大部分は下記で詳述する）から推定される情報を用いて、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓから該毒素を産生する天然の遺伝物質を分離することである。下記で説明するように、毒素活性をもたらすタンパク質を精製する方法もまた開示する。
下記に述べるようにＮ−末端アミノ酸情報を用いて、当該毒素の最初のアミノ酸をコードするＤＮＡ塩基の全て（または部分）に対して相補的なオリゴヌクレオチドを構築することができる。これらのオリゴヌクレオチドを放射能標識して、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株から分離した遺伝物質から構築したゲノム遺伝子ライブラリーから当該遺伝物質を分離するために分子プローブとして用いることができる。この遺伝子ライブラリーは、プラスミド、コスミド、ファージまたはファージミドベクターでクローニングできる。このライブラリーで大腸菌を形質転換し、毒素に対して作製した抗体または昆虫毒素のための直接アッセイを用いて、形質転換細胞による毒素産生についてスクリーニングすることができるであろう。
【００３５】
このアプローチはオリゴヌクレオチド一式の産生を必要とする。なぜならば、縮退遺伝暗号のために、１つのアミノ酸は数個の３ヌクレオチドの組み合わせによってコードされえるからである。例えば、アミノ酸のアルギニンは核酸トリプレット、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ、ＡＧＡおよびＧＧによってコードされえる。どのトリプレットが毒素遺伝子のその位置で用いられるかを予想することはできないので、可能性のあるトリプレットの各々を用いてオリゴヌクレオチドを調製する必要がある。経口毒素を完成させるために必要なタンパクサブュニットの全てを回収するためには、１つのタンパクサブユニットに対応する１つ以上のＤＮＡ分子が、充分な数のオリゴヌクレオチドプローブを構築するために必要であろう。
【００３６】
精製タンパク質のアミノ酸配列から、毒素の生産に必要な遺伝物質は容易に分離することができ、さらに分子生物学の技術分野で習熟した者にとって周知のいくつかの技術の何れかを用いて発現ベクターに全体または部分をクローニングすることができる。典型的な発現ベクターはＤＮＡプラスミドであるが、コスミド、ファージミドおよびファージを含む（ただしこれらに限定されない）他の伝達手段もまた用いることができる。ブラスミドの複製のために必要なまたは望ましい特性（例えは複製起点および抗生物質耐性または他の形態の選別マーカー（例えばＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓまたはＶｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓのｂａｒ遺伝子））に加えて、タンパク発現ベクターは通常発現カセットを必要とする。これは、対象の遺伝子の転写および翻訳に必要なｃｉｓ−作動性配列を含んでいる。原核細胞での発現に必要なｃｉｓ−作動性配列は、真核細胞および植物で必要とされるものとは異なっている。
【００３７】
真核細胞発現カセットは、対象の遺伝子に対して上流（５’）に転写プロモーター、転写終結領域（例えばポリＡ付加部位）および対象の遺伝子の最初のコドンの上流にリボソーム結合部位を必要とする。細菌細胞の場合にベクターに含むことができる有用な転写プロモーターは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ結合プロモーターである。本明細書で先に述べたように、プロモーターはｍＲＮＡの転写を効果的に促進することが知られている。また対象の遺伝子から上流に、該ベクターはシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含むことができるが、これは、宿主細胞の特定の部分（例えば細胞表面）に共有結合によって連結されたタンパク質を誘導することが分かっている。
昆虫ウイルスまたはバキュロウイルスは、ある種の昆虫に感染または悪い影響を与えることが知られている。昆虫に対するウイルスのこの影響は緩徐で、ウイルスは昆虫の摂食を停止させない。したがって、ウイルスは害虫制御剤として有用なようには見えない。Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ毒素遺伝子をバキュロウイルスベクターに結合させることによって、ウイルスの致死性を高めながら当該毒素を伝達する有効な方法が提供される。さらに、異なるバキュロウイルスは異なる昆虫に対して特異性を有するので、特定の毒素を用いて特定の害虫を選択的に標的とすることが可能である。該毒素遺伝子に対して特に有用なベクターは核多角体病ウイルスである。このウイルスを用いる伝達ベクターは既に記載され、外来遺伝子を昆虫に伝達するために選択されるベクターとなっている。ウイルス−毒素遺伝子リコンビナントは、経口的に伝達可能な形態として構築できる。通常、バキュロウイルスは中腸の腸管粘液を介して昆虫に感染する。強力なウイルスのコートタンパクプロモーターの後ろに挿入された毒素遺伝子は発現されて迅速に感染昆虫を殺すであろう。
【００３８】
昆虫ウイルスもしくはバキュロウイルスまたは本発明のタンパク毒素のための遺伝子導入植物による薬剤送達系の他に、このタンパク質は、例えば米国特許４６９５４５５号、４６９５４６２号、４８６１５９５号（ただしこれらに限定されない）（これらの文献は参照により本明細書に含まれる）のＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ被包化技術を用いて被包化できる。本発明のタンパク毒素のまた別の薬剤送達系は毒餌マトリックスへの該タンパク質の製剤化である。この製剤は続いて地上または地下昆虫毒餌ステーションで用いることができる。そのような技術の例にはＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／２３９８９号（この文献は参照により本明細書に含まれる）が含まれるが、ただしこれに限定されない。
上記で述べたように、当該タンパク質を本来の宿主ではない宿主で発現させる場合は、該タンパク質をコードする配列を変更することが必要となるかもしれない。なぜならば、他の宿主で好んで使用されるコドンはＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓの場合と異なる可能性があるからである。そのような場合には、該コード配列に対して埋め合わせとなる変更が行われないかぎり、新しい宿主での翻訳は極めて効率が悪いであろう。さらに、新しい宿主のタンパク質との抑制性交差反応を避けるために、または新しい宿主での該タンパク質の殺虫特性を高めるために、アミノ酸配列に対する変更が望ましいであろう。遺伝子的に修飾された毒素遺伝子は、例えば毒性強化もしくは低下、昆虫の耐性発達の変化、安定性の変化または標的種特異性の変化を示す毒素をコードするかもしれない。
【００３９】
該毒素をコードするＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ遺伝子の他に、本発明は、該毒素タンパク質と相同なアミノ酸バイオポリマーをコードし、さらに経口消化の後で昆虫種においてＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓタンパク質の毒性効果を保持する関連核酸配列を含むことを意図する。
例えば、本発明で用いられる毒素は、結果として死がもたらされる前に先ず幼虫の摂食を抑制するように思える。Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ毒素の核酸配列またはその制御配列を操作することによって、毒素遺伝子を植物に配置した遺伝子工学技術者は、例えば摂食抑制活性を保ち、その一方で幼虫に対する絶対的な毒性を取り除くために当該タンパク質の能力またはその作用態様を調節することができるであろう。この変化によって、全ての標的昆虫を根絶させるという環境系に対する不必要で劇的な影響を与えることなく、形質転換植物が収穫まで残存することが可能となろう。該毒素をコードする遺伝子のそのような変更の全て、または該遺伝子によってコードされるタンパク質のそのような変更の全てか本発明の範囲内に包含される。
【００４０】
包含される他の核酸の変更には、該毒素の有効性を改善するために昆虫の幼虫の特定の部分に毒素を誘導するために照準用配列を付加することが含まれる。
ＡＴＣＣ５５３９７、４３９４８、４３９４９、４３９５０、４３９５１、４３９５２株はアメリカ菌培養収集所（１２３０１，Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ　２０８５２　ＵＳＡ）に寄託された。Ｗ−１４天然毒素（ＡＴＣＣ５５３９７）のアミノ酸および核酸配列データは下記に提示する。毒素のゲノムＤＮＡの細菌宿主からの分離は本明細書で例証する。
標準的技術および分子生物的技術を用い、さらにそれらは本明細書で開示される。更なる情報は、分子クローニング：実験室マニュアル（コールドスプリングハーバー研究所出版部（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ　＆　Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９））で見出される（この文献は参照により本明細書に含まれる）。
以下の略語は実施例を通して用いられる：Ｔｒｉｓ＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン；ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム；ＥＤＴＡ＝エチレンジアミンテトラ酢酸；ＩＰＴＧ＝イソプロピルチオ−β−ガラクトシド；Ｘ−ｇａｌ＝５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトシド；ＣＴＡＢ＝臭化セチルトリメチルアンモニウム；ｋｂｐ＝キロ塩基対；ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、Ｉ＝それぞれアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびイノシンの２’−デオキシヌクレオシド５’−三燐酸塩；ＡＴＰ＝アデノシン５’三燐酸塩。
【００４１】
【実施例】
実施例１ 　Ｐ ． ｌｕｍｌｎｅｓｃｅｎｓ 由来毒素の精製と精製毒素の経口的薬剤送達後の毒性の証明
本発明の殺虫性タンパク毒素は、Ｐ ． ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓＷ−１４株（ＡＴＣＣ　Ａｃｃｅｓｓ　＃５５３９７）から精製された。Ｐ ． ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓのストック培養を１．５％寒天に２％プロテオースペプトン＃３（すなわちＰＰ３、Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，デトロイト、ミシガン）を含むペトリ皿で２５℃で保温し毎週継代して維持した。細菌の一次形態コロニーを１リットルフラスコ中の０．５％のポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（トゥイーン６０、Ｓｉｇｎｌａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，セントルイス、ミズーリ）補充２００ｍｌのＰＰ３ブロスに摂取した。回転シェーカーで３０℃で７２時間ブロス培養を増殖させた。毒素タンパク質をトゥイーンの非存在下または存在下で増殖させた培養から回収することかできる。しかしながらトゥイーンの非存在下では増殖細菌の形態および該細菌によって産生されるタンパクプロフィールは影響を受ける。トゥイーンの非存在下では、種々のシフトが生じ、少なくとも特定された１つの毒素サブユニットの分子量に関するかぎり約２００ｋＤａから約１８５ｋＤａへとシフトする。
【００４２】
この７２時間培養を１００００×ｇで３０分遠心して細胞と残屑を除去した。殺虫活性を含む上清分画を傾けて流し出し、適切な容量の１．０ＭのＫ_２ＨＰＯ_４を添加して５０ｍＭ　Ｋ_２ＨＰＯ_４とする。水酸化カリウムを添加してｐＨを８．６に調整した。続いてこの上清分画を、５０ｍＭ　Ｋ_２ＨＰＯ_４で平衡化したＤＥＡＥ−セファセル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と混合した。この毒性活性をＤＥＡＥ樹脂に吸着させた。続いてこの混合物を２．６×４０ｃｍカラムに注入し、５０ｍＭ　Ｋ_２ＨＰＯ_４で室温で流速３０ｍｌ／時間で洗浄して、溶出液を安定した２８０ｎｍＵＶ吸収基準ラインに到達させた。続いて溶出液が再び安定した２８０ｎｍ基準ラインに達するまでカラムを１５０ｍＭ　ＫＣｌで洗浄した。最後にカラムを３００ｍＭ　ＫＣｌで洗浄し、分画を採集した。
【００４３】
毒素を含む分画を集め、０．２ミクロン孔の膜フィルターを用いて濾過滅菌した。続いて毒素を濃縮し、さらに分子量カットオフが１００ｋＤａの限外濾過膜（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ　１００，Ａｍｉｃｏｎ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ−Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて４℃で１００ｍＭ　ＫＰＯ_４（ｐＨ６．９）に平衡化した。毒素濃縮物の３ｍｌを２．６×９５ｃｍのセファシルＳ−４００ＨＲゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の上部に積載した。溶離液は１００ｍＭＫＰＯ_４（ｐＨ６．９）で、これを１７ｍｌ／時間の流速で４℃で流した。溶出液を２８０ｎｍでモニターした。
分画を集め毒素活性について調べた。クロマトグラフィーの分画の毒性をＭａｎｄｕｃａ　ｓｅｘｔａの幼虫を用いて生物学的アッセイで調べた。分画を直接昆虫の食餌（マイマイガ用コムギ麦芽餌、ＩＣＮ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ−ＩＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）に適用するか、または第４もしくは第５齢幼虫の第一前肢から５μｌのサンプルを３０ゲージ注射針を用いて血体腔注射によって投与した。処置群の各幼虫の体重は２４時間間隔で記録した。昆虫が摂食を停止し、処置した昆虫餌を消費し数日以内に死んだ場合、または分画を注射して２４時間以内に死んだ場合に毒性があったと推定した。
【００４４】
毒性分画を集め、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１００を用いて濃縮し、続いて７．５ｍｍ×６０ｃｍのＴＳＫ−ＧＥＬＧ−４０００ＳＷゲル透過カラムを用い１００ｍＭ燐酸カリウム（ｐＨ６．９）溶離液を０．４ｍｌ／分で流しながらＨＰＬＣで分析した。この分析によって、毒素タンパク質は約３３．６分の保持時間でカラムから溶出する単一のシャープなピークに含まれることが明らかにされた。この保持時間は概算分子量１０００ｋＤａに相当する。ピーク分画を更なる精製のために集め、一方このタンパク質を含まない分画は廃棄した。ＨＰＬＣから溶出したピークは２１８および２８０ｎｍでＵＶ光を吸収したが４０５ｎｍでは吸収しなかった。４０５ｎｍの吸収は、ゼノラブジン（ｘｅｎｏｒｈａｂｄｉｎ）抗生物質化合物の属性であることが示された。
集めたピーク分画の非変性アガロースゲル（Ｍｅｔａｐｈｏｒ　Ａｇａｒｏｓｅ，ＦＭＣ　ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）での電気泳動によって、２つのタンパク複合体が当該ピークに存在することが示された。このピーク材料（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で緩衝）を、１．５％アガロースの積載用ゲル（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で緩衝）および１．９％アガロースの解析用ゲル（２００ｍＭトリスーホウ酸塩（ｐＨ８．３）で緩衝）で標準的緩衝液条件（陽極緩衝液１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；陰極緩衝液０．０２５Ｍトリス、０．１９２Ｍグリシン）下で分離した。フェノールレッドの追跡用色素がゲル端に達するまで、ゲルに１３ｍＡの定常電流を１５℃で流した。クマシーブリリアントブルー染色を用いて２本のタンパクバンドをアガロースゲルで可視化させた。
【００４５】
より遅く移動するバンドを”タンパクバンド１”と呼び、より速く移動するバンドを”タンパクバンド２”と呼んだ。２本のタンパクバンドはほぼ等量で存在した。クマシー染色アガロースゲルは、ゲルの未染色部分から２本のタンパクバンドを正確に切り出すためのガイドとして用いた。タンパクバンドを含む切り出した細片をふやかし、少量の滅菌水を加えた。コントロールとして、タンパク質を含まないゲルの一部分もまた切り出し、タンパク質を含むゲルと同じ態様で処理した。１００ｍＭトリス−ホウ酸塩（ｐＨ８．３）に１００ボルト（定常電圧）で２時間電気泳動してゲル片からタンパク質を回収した。また別に、タンパク質は、等容量の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）をゲル片に加え、続いて３０℃で１６時間保温することによってゲル片から受動的に溶出させた。これによってタンパク質は緩衝液中に拡散させられ続いてこのタンパク質を採集した。
【００４６】
ＨＰＬＣ精製毒素（３３．６分ピーク）およびアガロースゲル精製毒素を用いた昆虫毒素テストの結果は抽出物の毒性を明示した。１．５μｇのＨＰＬＣ精製タンパク質の注射は２４時間以内の死亡をもたらした。アガロースから受動的溶出または電気泳動溶出で回収したタンパクバンド１および２は両方とも注射では致死的であった。これらのサンプルについての概算タンパク質濃度は５０ｎｇ／幼虫未満であった。タンパクバンド１または２を注射された幼虫群間での体重増加と死亡率の比較によって、タンパクバンド１は注射による送達ではより毒性が強いことが示された。
ＨＰＬＣ精製毒素を幼虫の餌に７．５μｇ／幼虫の濃度で適用したとき、幼虫の体重増加の停止をもたらした（調べた２４匹の幼虫で）。幼虫は摂食を始めたが、毒素処理餌の極めて少しの部分を消費した後、幼虫は毒素によって誘発された病理兆候を示し始め、摂食を停止した。昆虫の糞粒は変色し、大半の幼虫は下痢の症状を示した。７−１０日間にわたって餌にそれぞれ５μｇ毒素を適用したとき有意の死亡率が得られた。
【００４７】
アガロース分離タンパクバンド１は、２００ｎｇ／幼虫の投与量で顕著に幼虫の体重増加を抑制した。同様な濃度のタンパクバンド２を与えた幼虫では抑制されず、コントロールの幼虫と同じ率で体重は増加した。１２匹の幼虫には溶出タンパク質を与え、４５匹の幼虫にはタンパク質含有アガロース片を与えた。これら２組のデータは、タンパクバンド１はＭａｎｄｕｃａ　ｓｅｘｔａに対して経口的に毒性を有することを示した。この実験では、タンパクバンド２はＭａｎｄｕｃａ　ｓｅｘｔａには毒性をもたないようであった。
変性条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパクバンド１および２の更なる分析によって、各バンドはいくつかのより小さなタンパクサブユニットを含むことが示された。タンパク質をクマシーブリリアントブルー染色で可視化し、その後最大の感度を達成するために銀染色を施した。
【００４８】
２本のバンドのタンパクサブユニットは非常に類似していた。タンパクバンド１は８個のタンパクサブユニット（２５．１、５６．２、６０．８、６５．６、１６６、１７１、１８４および２０８ｋＤａ）を含む。タンパクバンド２は、２５．１、６０．８および６５．６ｋＤａタンパク質が存在しないという点を除いて同一のプロフィールを有していた。５６．２、６０．８、６５．６および１８４ｋＤａタンパク質がタンパクバンド１の複合体中にほぼ等しい濃度で存在し、当該複合体の全タンパク質含有量の８０％またはそれ以上を占めていた。
天然のＨＰＬＣ精製毒素をさらに以下のように性状を調べた。毒素は易熱性で、６０℃（２５０゜Ｆ）で１５分加熱した後、Ｍ ． ｓｅｘｔａの幼虫に注射または餌として与えたとき死亡させまたは体重増加を抑制させるその能力を失った。リパーゼ、Ｃ型ホスホリパーゼ、ヌクレアーゼ、または赤血球細胞溶血活性を検出するためにアッセイをデザインし、精製毒素を用いて実施した。これらの活性のいずれも存在しなかった。抗生物質ゾーン抑制アッセイもまた実施した。精製毒素はグラム陰性もしくは陽性細菌、酵母または糸状菌の増殖を抑制することができなかった。このことはこの毒性はゼノラブジン抗生物質ではないことを示唆している。
天然のＨＰＬＣ精製毒素を、Ｍ ． ｓｅｘｔａ以外の昆虫を殺す能力について調べた。表２では、この実験でＨＰＬＣ精製Ｐ ． ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ毒素によって殺される昆虫が列挙されている。
【００４９】
【表３】
表２．Ｐ．　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ毒素により死亡する昆虫

【００５０】
実施例２殺虫剤の効用
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓの効用及び毒性を、更に特徴づけた。Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（菌株Ｗ−１４）培養ブロスは、下記に従って調製した。生産培地は、ミリ−Ｑ（登録商標）脱イオン水を溶媒とする、２％バクト・プロテオース・ペプトン（登録商標）＃３（ＰＰ３、ディフコラボラトリー社、デトロイト、ミシガン）であった。播種培養フラスコは、デロング（Ｄｅｌｏｎｇ）首を備えた５００ｍｌの３枚板（ｔｒｉｂａｆｆｉｅ）フラスコ中の培地１７５ｍｌからなり、カプット（Ｋａｐｕｔ）で覆い、温度１２１℃（２５０゜Ｆ）で、２０分間高圧滅菌した。生産フラスコは、デロング首を備えた５００ｍｌの３枚仕切り板フラスコ中の２．８リットル中５０ｍｌからなり、シンエツ（Ｓｈｉｎｅｔｓｕ）シリコーンフォームクロージャーで覆った。これらは、温度１２１℃（２５０゜Ｆ）で、４５分間高圧滅菌した。播種培養は、振幅５．０８ｃｍ（２インチ）で旋回振盪しているインキュベーターにおいて、２８℃、１５０ｒｐｍでインキュベートした。１６時間増殖した後、この播種培地の１％を、該生産フラスコ中に入れ、収穫前に２４時間増殖した。毒素の産生は、対数増殖期に明らかであった。この微生物のブロスを、１リットルの遠心管に移し、かつ細胞バイオマスをペレットとした（４℃、２５００ｒｐｍで、３０分間［Ｒ．Ｃ．Ｆ．＝〜１６００］、ＨＧ−４ＬローターＲＣ３、ソルバル（Ｓｏｒｖａｌ）遠心機、ヂュポン社、ウィルミントン、デラウェア）。最初のブロスを、４℃で、８〜１６時間冷却し、少なくとも２時間再度遠心分離し（前述の条件）、放置時に沈殿したムコ多糖類と推定されるものを除去することによって、更にブロスを透明にした。（別の加工法は、両方の工程を組合わせ、かつ前述と同じ条件で、１６時間の透明化遠心分離を使用した。）。その後、このブロスを、バイオアッセイ又はろ過の前に、４℃で貯蔵した。
【００５１】
このブロスから精製されたＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロス及びタンパク質の毒素（複数）は、多くの昆虫に対して活性（死亡及び／又は成長阻害、羽化の低下）を示した。更に詳細に述べると、昆虫目のコレオプテラ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）の一員である、ハムシモドキ（幼虫及び成虫）、コロラドジャガイモハムシ、及び芝の地虫（ｔｕｒｆ　ｇｒｕｂｓ）に対する活性が認められた。コレオプテラ目の他の一員は、コメツキムシ、花粉の甲虫（ｐｏｌｌｅｎ　ｂｅｅｔｌｅ）、トビハムシ、種子の甲虫（ｓｅｅｄ　ｂｅｅｔｌｅ）、及びゾウムシを含んだ。同様にホモプテラ（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）目の一員である、アスターヨコバイに対する活性も認められた。ホモプテラ目の他の一員は、多くの宿主に特異的なアブラムシ種に加え、プラントヨコバイ（ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ）、ヨーロッパナシキジラミ、リンゴサッカ（ａｐｐｌｅ　ｓｕｃｋｅｒ）、カイガラムシ、コナジラミ及びアワフキを含んだ。前述のブロス及び精製された分画も、同じくシロイチモンジヨウトウガ、イラクサキンウワバ、黒色ネキリムシ、タバコの芽食虫（ｂｕｄｗｏｒｍ）、ヨーロッパアワノメイガ、オオタバコガ及びヒメハマキに対して活性を示した。
【００５２】
この目の他の典型的一員は、イガ、インディアンミールモス（Ｉｎｄｉａｎ　ｍｅａｌｍｏｔｈ）、ハマキムシ、アオムシ、ワタキロバガ、ミノムシ、束部テンマクケムシ、芝のガ（ｓｏｄ　ｗｅｂｗｏｒｍ）、及びシロナガヤであった。活性は、ディプテラ（Ｄｉｐｔｅｒａ）目の一員であるミバエ及び力の幼虫に対しても認められた。ディプテラ目の他の一員は、エンドウのユスリカ、ニンジンのハエ、キャベツ根のハエ、キスジノハムシ、タマネギのハエ、ガガンボ、イエバエ及び各種の力種である。同じくフシアリ、オデロウスイエアリ（ｏｄｅｒｏｕｓ　ｈｏｕｓｅ　ａｎｔ）、及び小クロアリ（ｌｉｔｔｌｅ　ｂｌａｃｋａｎｔ）を含む目の一員である、オオアリ及びアルゼンチンアリ（Ａｒｇｅｎｔｉｎｅ　ａｎｔ）に対する活性も認められた。
【００５３】
前述のブロス／分画は、昆虫の個体数を減少するために有用であり、かつ昆虫の個体数を阻害する方法において使用した。この方法は、前述の活性物を、昆虫を不活性化するのに十分な量、昆虫の場所（ｌｏｃｕｓ）に塗布することを含むことができる。結果を表３に示した。
ハムシモドキ幼虫に対する活性を、下記の方法で試験した。Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓル培養ブロス（ろ過滅菌し、細胞を含まない）又は精製したＨＰＬＣ分画を、それぞれ、対照培地又は１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０に希釈した後の３０μｌアリコートを、人工飼料０．２５ｍｌの表面（〜１．５ｃｍ^２）に、直接塗布した。この飼料プレートを、滅菌フローフード中で風乾し、かつこれらのウェルには、不稔卵からふ化した一匹の新生虫ディアブロティカ・ウンデシムプンクタタ・ホワルディ（ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎ　ｈｏｗａｒｄｉ）（南部ハムシモドキ、ＳＣＲ）、人工飼料で成長した第２齢のＳＣＲ、又はメトロミックス（登録商標）中で生育したトウモロコシ苗木で飼育した第２齢のディアブロティカ・ビルジフェラ・ビルジフェラ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　ｖｉｒｇｉｆｅｒａ　ｖｉｒｕｇｉｆｅｒａ）（西部ハムシモドキ、ＷＣＲ）を群らがらせた。第２齢の幼虫は、飼料投与前に秤量した。これらのプレートに封をし、湿らせた生育用チャンバーに置き、適当な期間２７℃に保った（ＳＣＲ新生虫及び成虫については４日間、ＷＣＲ幼虫については２〜５日間、第２齢のＳＣＲについては７〜１４日間）。死亡率及び測定体重は、指示されたようにスコア化した。一般に、全ての試験において、１処置について１６匹の虫を使用した。対照の死亡率は、下記のものである：新生幼虫については＜５％、甲虫成虫については５％。
【００５４】
コロラドジャガイモハムシに対する活性を、下記の方法で試験した。Ｐｈｏｔｏｒｈａ ｂｄｕｓ培養ブロス又は対照培地を、２４ウェルの組織培養プレートのウェル中に保持された、標準人工飼料１．５ｍｌの表面（〜２．０ｃｍ^２）に塗布した。各ウェルに、５０μｌの処置を行い、風乾した。次に、個々の第２齢のコロラドジャガイモハムシ（レプチノタルサ・デセムリネアタ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ　ｄｅｃｅｌｉｍｅａｔａ）、ＣＰＢ）幼虫を、この飼料の上に置き、かつ４日後の死亡率をスコア化した。全ての試験について、１処置につき１０匹の幼虫を用いた。対照の死亡率は３．３％であった。
マメコガネの地虫（Ｊａｐａｎｅｓｅ　ｂｅｅｔｌｅ　ｇｒｕｂ）及び甲虫に対する活性は、下記の方法で試験した。芝の地虫（ポピィア・ジャポニカ（Ｐｏｐｉｌｌｉａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）、第２〜３齢）を、群生した芝から採取し、実験室内で、土壌／ピート混合物で、追加食餌としてニンジンのスライスを与え、養った。芝の甲虫は、局所的なフェロモンで捕獲し（ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ−ｔｒａｐｐｅｄ）、かつ実験室内では、プラスティックの容器で、食餌としてカエデの葉を与えて養った。未希釈のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロス又は対照培地を、ハムシモドキの人工飼料（３０μｌ／１．５４ｃｍ^２、甲虫）又はニンジンのスライス（幼虫）に塗布した後、両ステージを飼料ウェル中に単独で配置し、死亡率及び摂食を観察した。両方とも、摂食（及び糞排泄）量の明らかな減少が認められた。
【００５５】
カの幼虫に対する活性は、下記の方法で試験した。このアッセイは、９６個のウェルの微量滴定プレートで行った。各ウェルは、水溶液（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロス、対照培地又は水）２００μｌ、及び約２０匹の、１日齢の幼虫（アエデス・アエギプチ（Ａｅｄｅｓ　ａｅｇｙｐｔｉ））を含んだ。１処置につき６個のウェルを実施した。結果を、群生の２時間後に調べ、かつ３日間の観察期間にわたり変化しなかった。対照の死亡率は、調べなかった。
ミバエに対する活性を、下記の方法で調べた。購入したドロソフィア・メラノガステル（Ｄｒｏｓｏｐｈｉａ　ｍｅｇａｎｏｇａｓｔｅｒ）培地を、乾燥培地５０％、及び水、対照培地又はＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロスのいずれかの液体５０％を用いて調製した。これは、１処置につき３個の飼育バイアルの各々の中に、乾燥培地８．０ｍｌを入れ、及び適当な液体８．０ｍｌを加えることによって達成した。その後、１０日後期（ｌａｔｅ）齢のドロソフィア・メラノガステルのうじを、各バイアルに加えた。これらのバイアルは、室温で、天井に蛍光灯のついた実験用ベンチの中に置いた。さなぎ又は成虫の数を、暴露の３，７及び１０日後に測定した。ミバエさなぎ用飼料へのＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロスの混合物では、１０日目の羽化が、水又は対照培地（３％減少）と比べ、わずか（１７％）であるが有意の減少を示した。
【００５６】
アスターヨコバイに対する活性を、下記の方法で試験した。アスターヨコバイ（マクロステレス・セベリニ（Ｍａｃｒｏｓｔｅｌｅｓ　ｓｅｖｅｒｉｎｉ））に関する摂取アッセイは、外部と接触せずに、この活性物を摂取することができるようにデザインした。この活性物／”食品”溶液の容器は、３５×１０ｍｍのペトリ皿の底面の中央に２個の穴があるように製造した。５ｃｍ（２インチ）四方のパラフィルムＭ（登録商標）を、この皿の表面を覆うように置き、かつ”Ｏ”型リングでしっかり締めた。次に、２８．３ｇ（ｌｏｚ．）のプラスティックカップに、約７匹のヨコバイを群がらせ、このカップの頂上に前述の容器を配置し、パラフィルムをはずした。その後試験溶液を、穴を通じてこの容器に入れた。未希釈のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロスを使用する試験においては、このブロス及び対照培地を、水に対して透析し、対照の死亡率を低下した。死亡率は、対照死亡率が２６．５％であった２日目について報告した。精製した分画（２００ｍｇタンパク質／ｍｌ）を使用する試験において、ショ糖の５％の最終濃度を、全ての処置において用い、アスターヨコバイの生存率を高めた。このアッセイは、照射間隔が１６／８である、２８℃で、相対湿度が７０％のふ化器において行った。このアッセイは、７２時間後の死亡率について等級付けした。対照の死亡率は、５．５％であった。
【００５７】
アルゼンチンアリに対する活性を、下記の方法で試験した。１００％Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロス、対照培地又は水の１．５ｍｌアリコートを、２．０ｍｌの透明なガラスバイアルにピペットで移した。これらのバイアルを、適当な処置で湿らせた歯科用綿芯で栓をした。各バイアルを、８〜１２匹のアルゼンチンアリ（リネピセマ・フミレ（ＬｉｎｅＰｉｔｈｅｆｍａ　ｈｕｍｉｌｅ））の成虫を入れた、個別の６０×１６ｍｍのペトリ皿に置いた。１処置にっいて３個を試験した。バイオアッセイプレートを、室温で、天井に蛍光灯がついた実験用ベンチに置いた。死亡率は、暴露の５日後に読み取った。対照の死亡率は、２４％であった。
【００５８】
オオアリに対する活性は、下記の方法で試験した。黒色オオアリの働きアリ（カンポノタス・ペンシルバニカス（Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ　ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓ））を、インディアナポリス（ＩＮ）のダウエランコ（ＤｏｗＥｌａｎｃｏ）農場の木から採取した。Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロスによる試験は、下記の方法で実施した。プラスティックのバイオアッセイ容器（１８．１ｃｍ×７．６ｃｍ（７１／８”×３”））の各々に、１５匹の働きアリ、紙製隠れ家、及びプラスティックの一口用グラスに入れたブロス又は対照１０ｍｌを置いた。一口用グラスのふたに開けた穴を通して、綿芯を伝って、アリに処置が届くようにした。全ての処置は、５％ショ糖を含んだ。バイオアッセイは、暗所、室温で行い、かつ１９日目に等級付けした。対照の死亡率は、９％であった。アリの人工飼料に利用したアッセイ用に送達する精製した分画は、前述の処置（精製した分画又は対照溶液）と、プラスティック試験管の中で、処置０．２ｍｌ／飼料２．０ｇの割合で混合した。精製された分画の最終的なタンパク質濃度は、１０１μｇ／飼料ｇ未満であった。１処置につきアリ１０匹、水、隠れ家及び処理した飼料を、封をしたプラスティック容器に入れ、かつ加湿したふ化器の中で、暗所、２７℃で養った。１０日目に、死亡率をスコア化した。対照の死亡率は調べなかった。
【００５９】
様々な鱗翅類の幼虫に対する活性を、下記の方法で試験した。Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロス又は精製した分画は、標準の人工飼料０．２５ｍｌの表面（〜１．５ｃｍ^２）に、それぞれ対照培地又は１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．０のいずれかに希釈した後の３０μｌアリコートで、直接塗布した。これらの飼料プレートは、滅菌したフローフード中で風乾し、かつこれらのウェルに、１匹の新生幼虫を群がらせた。ヨーロッパアワノメイガ（オストリニア・ヌビラリス（Ｏｓｔｒｉｎｉａ　ｎｕｂｉｌａｌｉｓ））及びオオタバコガ（ヘリコベルパ・ゼア（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ　ｚｅａ））の卵は、商業的供給源から入手し、かつ社内でふ化したが、シロイチモンジョウトウガ（スポドプテラ・エキシグア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｅｘｉｇｕａ））、イラクサキンウワバ（トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ））、タバコの芽食虫（ヘリオチス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓｖｉｒｅｓｃｅｎｓ））、ヒメハマキ（ラスペイレシア・ポモネラ（Ｌａｓｐｅｙｒｅｓｉａ　ｐｏｍｏｎｅｌｌａ））及び黒色ネキリムシ（アグロチス・イプシロン（Ａｇｒｏｔｉｓ　ｉｐｓｉｌｏｎ））の幼虫は、社内で調達した。幼虫を群がらせた後、飼料プレートに封をし、加湿した生育用チャンバーの中に置き、暗所、２７℃で、適当な期間養った。死亡率及び体重測定は、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロスについては５〜７日目に、及び精製した分画については４〜７日目に、スコア化した。一般に、全実験において、１処置につき昆虫１６匹を使用した。対照培地に関する対照死亡率は、４〜１２．５％の範囲であり、かつＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓバッファーに関しては１０％未満であった。
【００６０】
【表４】
表３．様々な昆虫目／種の死亡率及び成長阻害に対するＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（菌株Ｗ−１４）培養ブロス及び精製した毒素分画の作用

Ｍｏｒｔ＝　死亡率、Ｇ．Ｉ．＝成長阻害、ｎａ＝適用できず、ｎｔ＝試験せず、ａ．ｆ．＝抗摂食
【００６１】
実施例３　土壌への適用に関する殺虫剤の効用
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（菌株Ｗ−１４）培養ブロスを、土壌又は土壌混合物（メトロミックス（登録商標））に直接適用した場合の、ハムシモドキに対する活性を示した。メトロミックス（登録商標）中の新生ＳＣＲ及ＷＣＲに対する活性を、下記の方法で試験した（表４）。試験は、６日間、光をあてた、湿ったフィルターペーパー上で発芽した、トウモロコシの苗木（ユナイティッドアグリシード銘柄のＣＬ６１４）を用いて行った。根が約３〜６ｃｍに伸びた後、１個の穀粒／苗木を、乾燥メトロミックス（登録商標）５０ｇを入れた、５９１ｍｌの透明なプラスティックカップに、植えた。その後、２０匹の新生ＳＣＲ又はＷＣＲを、この苗木の根に直接置き、かつメトロミックス（登録商標）で覆った。群生する間に、この苗木に、希釈したブロス溶液全量５０ｍｌを散布（ｄｒｅｎｃｈ）した。散布した後、このカップに封をして、かつ明所、室温で、７日間放置した。その後、この苗木を洗浄し、メトロミックス（登録商標）を完全に除去し、根を切断して、秤量した。対照の根に対するトウモロコシ根の残存率、及び摂食によって引き起こされた葉の損傷について、活性を等級付けした。葉の損傷は、目で見てスコア化し、かつ−、＋、＋＋、又は＋＋＋のいずれかに等級付けし、損傷のないものを−、及び重度の損傷を＋＋＋で表した。
【００６２】
土壌中の新生ＳＣＲに対する活性を、下記の方法て試験した（表５）。この試験は、６日間、光をあてた、湿ったフィルターペーパー上で発芽した、トウモロコシの苗木（ユナイティッドアグリシード銘柄のＣＬ６１４）を用いて行った。根が約３〜６ｃｍに伸びた後、１個の穀粒／苗木を、レバノン（ＩＮ）の前年トウモロコシを栽培した畑から採取した土壌１５０ｇを入れた、５９１ｍｌの透明なプラスティックカップに、植えた。この土壌は、それまで殺虫剤処理を行っていない。２０匹の新生ＳＣＲを、この苗木の根に直接置き、かつ土壌で覆った。群生後に、この苗木に、希釈したブロス溶液全量５０ｍｌを散布した。散布した後、封をしないカップを、相対湿度が高い（８０％）チャンバーで、２５℃（７８゜Ｆ）でインキュベートした。その後、この苗木を洗浄し、土壌を完全に除去し、根を切断して、秤量した。対照の根に対するトウモロコシ根の残存率、及び摂食によって引き起こされた葉の損傷について、活性を等級付けした。葉の損傷は、目で見てスコア化し、かつ−、＋、＋＋、又は＋＋＋に等級付けし、損傷のないものを−、及び重度の損傷を＋＋＋で表した。
【００６３】
【表５】
表４．群生後に散布した後のハムシモドキに対するＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（菌株Ｗ−１４）培養ブロスの作用（メトロミックス（登録商標））

【００６４】
【表６】
表５．群生後に散布した後のハムシモドキに対するＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（菌株Ｗ−１４）培養ブロスの作用（土壌）

【００６５】
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（菌株Ｗ−１４）培養ブロスの、メトロミックス（登録商標）中の第２齢の芝の地虫に対する活性を、下記の方法で行った試験で観察した（表６）。５９１ｍｌの透明なプラスティックカップに、乾燥メトロミックス（登録商標）約５０ｇを入れた。その後このメトロミックス（登録商標）を、５０容量％希釈したＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓブロス溶液全量５０ｍｌを散布した。粗ブロスの希釈は、水で行い、５０％ブロスは、粗ブロス２５ｍｌに、水２５ｍｌを加えて、総量５０ｍｌとした。
通常の培地濃度を５０％希釈したものである、プロテオースペプトン＃３（ＰＰ３）の１重量／容量％溶液を、ブロス対照として使用した。散布した後、５匹の第２齢の芝地虫を、湿らせたメトロミックス（登録商標）の表面に置いた。元気な芝地虫の幼虫は、メトロミックス（登録商標）の中に、即座に穴を掘って潜り込んだ。
１時間以内に穴を掘って潜らなかった幼虫は、除外し、新たな幼虫と交換した。
このカップに封をして、かつ暗所、２８℃のふ化器に入れた。７日後、メトロミックス（登録商標）から幼虫を取り出し、死亡率をスコア化した。活性は、対照に対する死亡率の割合で示した。
【００６６】
【表７】
表６．群生前に散布した後の芝の地虫に対するＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（菌株Ｗ−１　４）培養ブロスの作用（メトロミックス（登録商標））

＊は、幼虫の死亡／生存の比を示す。
【００６７】
実施例４　葉への適用に関する殺虫剤の効用
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓブロスのヨーロッパアワノメイガに対する活性を、ブロスをトウモロコシの葉の表面に直接塗布した場合について調べた（表７）。このアッセイにおいて、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓブロスを、培養培地で１００倍希釈し、かつ切り採ったトウモロコシの葉の表面に、葉表面の〜６．０μｌ／ｃｍ^２の割合で、手で塗布した。これらの葉を、風乾し、等しい大きさの細片（約５×５ｃｍ（約２×２インチ））に切断した。これらの葉を丸め、ペーパークリップで固定し、底面に２％寒天を０．６３ｃｍ（０．２５インチ）入れた、２８ｇ（ｌｏｚ）の一口用プラスチックグラスの中に置き、湿らせた。その後、新生ヨーロッパアワノメイガ１２匹を、前述の丸めた葉の上に置き、カップに封をした。５日間、暗所、２７℃でインキュベートした後、これらの試料を、摂食による損傷及び回収された幼虫について、スコア化した。
【００６８】
【表８】
表７．切り採ったトウモロコシ葉に群生前に塗布した後のヨーロッパアワノメイガに対するＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（菌株Ｗ−１４）培養ブロスの作用

【００６９】
新生タバコの芽食虫（ヘリオチス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ））に対する前述の培養ブロスの活性を、葉の浸漬法を用いて明らかにした。新鮮な綿の葉を、植物から切り採り、かつ葉のディスクを、１８．５ｍｍのコルクの穴あけ器で切断した。このディスクを、対照培地（ＰＰ３）、又は１０ｋＤａフィルターを備えたアミコン社（ビバリー、ＭＡ）のプロフラックスＭ１２接線方向のろ過システムを用いて、約１０倍に濃縮したＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（菌株Ｗ−１４）培養ブロスに、個々に浸漬した。過剰な液体を取り除き、かつ真っ直ぐにしたペーパークリップで、該ディスクの中心を貫通させた。その後、このペーパークリップを、１％寒天を２．０ｍｌ含む２８ｇ（ｌｏｚ）の一口用プラスチックグラスの中に、打ち込んだ。これは、葉が寒天の上方に吊り下げられた状態にした。この葉ディスクを乾燥した後、１匹の新生タバコのハマキガの幼虫を、該ディスクの上に置き、カップに蓋をした。その後このカップを、ポリ袋内に入れ封をし、かつ暗所、２７℃のふ化器に、５日間放置した。この時点で、残っている幼虫及び葉材料を秤量し、葉の損傷を測定した（表８）。
【００７０】
【表９】
表８．綿葉の浸漬アッセイにおけるタバコの芽食虫に対するＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（菌株Ｗ−１４）培養ブロスの作用

【００７１】
実施例５　パートＡ
毒素ペプチド成分の特徴
引き続き行われた分析において、実施例１で単離されたバンドの毒素タンパク質のサブユニットを、３０：０．８の比（アクリルアミド：ＢＩＳ−アクリルアミド）の７％ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲル上で分解した。このゲルマトリックスは、比較的大きいタンパク質の分解をより容易にする。実施例１において、バンド１及びバンド２のサブユニットの分子量を推定するのに用いたゲルシステムは、３８：０．１８の比（アクリルアミド：ＢＩＳ−アクリルアミド）の１８％ゲルであり、これは、広範な領域で大きさによる分離ができるが、高分子量成分については、分解能が低い。
【００７２】
この分析においては、８個ではなく１０個のタンパク質バンドに分解された。表９は、１０個の分解されたバンドの計算上の分子量を示し、かつこれらの条件下で推定された分子量を、先の実施例の分子量と直接比較している。追加のバンドが、本実施例で使用された異なる分離条件下で検出されたことは、驚くべきことではない。前述の分子量推定値及び新たな推定値の間の変動も、分解条件の差異によってもたらされたと予想される。本実施例の分析において、改善された分解能の結果、比較的大きい分子量の推定値は、実施例１よりもより正確であると考えられる。しかしながら、これらは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を基に推定され、この方法は典型的には分析としては正確ではなく、かつペプチドの推定値をもたらし、かつこれは、翻訳後修飾又は翻訳時修飾のために、更に代わり得る。
【００７３】
アミノ酸配列は、１０個の分解されたペプチド中の５個のＮ−末端について決定した。表９は、これらのタンパク質の分子量及び同定された配列を、相互に関連付けている。配列番号２において、ある分析は、５位のプロリン残基は、アスパラギン（ａｓｎ）でありうることを示した。配列番号３において、ある分析は、１３及び１４位のアミノ酸残基は、いずれもアルギニン（ａｒｇ）であることを示した。配列番号４において、ある分析は、６位のアミノ酸残基は、アラニン（ａｌａ）又はセリン（ｓｅｒ）のいずれかであることを示した。配列番号５において、ある分析は、３位のアミノ酸残基は、アスパラギン酸（ａｓｐ）であることを示した。
【００７４】
【表１０】
表９．

＊新たな推定値は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを基にしたもので、遺伝子配列を基にしたものではない。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、分析としては正確ではない。
【００７５】
実施例５、パートＢ
毒素ペプチド成分の特徴
新たなＮ−末端配列である配列番号１５、Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｔｈｒは、前記実施例５パートＡにおいて説明された天然のＨＰＬＣで精製された毒素から単離されたペプチドを更にＮ−末端配列決定することによって得られた。ＴｃａＡ_ｉｉと称されるこのペプチドは、２５４位に始まり、かつ４９１位に至り、ここでＴｃａＡ_ｉｉペプチドは、配列番号４を開始する。遺伝子配列を基にして推定されたこのペプチドの大きさは、２５，２４０Ｄａである。
【００７６】
実施例６　毒素ペプチド成分の特徴
更に別の分析において、この毒素タンパク質複合体は、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓの増殖培地（ツイーンを含まずに培養した後）から、１０〜８０％の硫酸アンモニウムにより沈殿させ、その後のイオン交換クロマトグラフィー工程（モノＱ）及び２種の分子サイジングクロマトグラフィー工程により、再び単離した。これらの条件は、実施例１で使用したものと類似していた。最初の分子サイジング工程において、第二の生物学的活性のピークは、約１００±１０ｋＤａに認められた。タンパク質測定を基に、この分画は、約８６０±１００ｋＤａ（天然）のより大きい、又は第一の活性ピークよりも、２０〜５０倍活性が低かった。この単離実験の間に、出発時の生物学的活性のかなりの部分を保持した約３２５±５０ｋＤａのより小さい活性ピークも、分解された。この３２５ｋＤａのピークは、前述の８６０ｋＤａのピークに、関連、もしくは由来したと考えられた。
【００７７】
この分析においては、５６ｋＤａタンパク質が分解された。このタンパク質のＮ−末端配列を、配列番号６に示した。注目すべきは、このタンパク質が、配列番号５のＮ−末端と、著しい同一性及び保存性を共有することであり、これは、これら２種が、ある遺伝子ファミリーの別個の一員によってコードされ得ること、及び各遺伝子によって産生されたタンパク質が、この殺虫性毒素複合体において両方を操作することができるように十分類似していることを示唆している。
二番目に顕著な１８５ｋＤａタンパク質は、表９のタンパク質３と同等の量、一貫して存在するので、これは同じタンパク質又はタンパク質断片であろう。この１８５ｋＤａタンパク質のＮ−末端は、配列番号７に示した。
【００７８】
追加のＮ−末端アミノ酸配列のデータが、同じく単離されたタンパク質から得られた。決定されたＮ−末端配列はいずれも、表９で同定されたタンパク質とは一致しなかった。他のタンパク質が、単離された調製物中に存在した。このようなタンパク質の１種は、推定分子量が１０８ｋＤａであり、かつ配列番号８に示したＮ−末端配列を有した。二番目のこのようなタンパク質は、推定分子量が８０ｋＤａであり、かつ配列番号９に示したＮ−末端配列を有した。
ほぼ３２５ｋＤａに活性ピークを伴うこのタンパク質物質を、大きさで分析すると、ほぼ５１、３１、２８及び２２ｋＤａのバンドが認められた。いずれも分子量を電気泳動の移動度で決定したので、これらの分子量は、バッファーのイオン強度の差、電気泳動の電位差などに起因した誤差作用を受けた。当業者は、明確な分子量値は、これらの標準的方法を用いては決定することができないこと、及び各々が変動をうけやすいことを、理解するであろう。このような大きさのタンパク質は、より大きい最初の毒素複合体において認められた、より大きいタンパク質種（約２００ｋＤａの大きさ）の分解産物であると仮定された。
【００７９】
最後に、いくつかの調製物は、配列番号１０に示されたＮ−末端配列を有するタンパク質を含んでいた。この配列は、巨大なタンパク質複合体の構造形成機能が知られている補助（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ）タンパク質である、公知のシャペロニンタンパク質との相同性が強かった。本出願人は、このような構造形成機能か、配列番号１０に同定されたタンパク質に起因するとはみなさないが、これは、その構造形成にシャペロンタンパク質が関連しているような、説明された毒素タンパク質複合体の存在と矛盾しない。更に、このようなタンパク質は、毒性を有することが直接示唆されることはないが、このタンパク質にとって、タンパク質毒素全体の構造的性質を決定することは重要であり、その結果、経口的デリバリー後のｉｎ　ｖｉｖｏにおける、該複合体の毒性又は耐用度に貢献するであろう。
引き続きプロテイナーゼＫに対する該タンパク質毒素複合体の安定性の分析を行った。該複合体を、プロテイナーゼＫが１０倍モル過剰量存在する条件で、２４時間インキュベートした後、活性はほとんど失活した（経口投与の死亡率は、約５％に低下した。）ことが結論づけられた。これらのデータは、前述の毒素がタンパク質性であることを裏付けている。
この毒性は、更に透析膜によっても保持され、天然の毒素複合体の大きさが大きいことが再度裏付けられた。
【００８０】
実施例７　 Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ 毒素の単離、特徴及び部分的アミノ酸配列決定単離及び Ｎ− 末端アミノ酸配列決定：
実施例５及び６に平行して行われた１組の実験において、典型的には２〜３リットルのＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓブロスに、最終濃度が１０又は２０％のいずれかになるように結晶硫酸アンモニウムをゆっくり添加し調節することによって、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓタンパク質の硫酸アンモニウム沈殿を行った。４℃で１時間攪拌した後、この材料を１２，０００×ｇで、３０分間遠心分離した。上清を８０％硫酸アンモニウムで調節し、４℃で１時間攪拌し、かつ１２，０００×ｇで、６０分間遠心分離した。このペレットを、その容量の１／１０量の１０ｍＭ　Ｎａ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．０中で再懸濁し、同じリン酸バッファーで、４℃で一晩透析した。透析された材料を、１２，０００×ｇで、１時間遠心分離し、イオン交換クロマトグラフィーにかけた。
【００８１】
ＨＲ　１６／５０　Ｑセファロース（ファルマシア社）陰イオン交換カラムを、１０ｍＭ　Ｎａ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．０で平衡にした。遠心分離し、透析した硫酸アンモニウムペレットを、このＱセファロースカラムに、１．５ｍｌ／分の速度で加え、かつ光学濃度（Ｏ．Ｄ．２８０）が０．１００未満に達するまで、平衡化バッファーを、３．０ｍｌ／分で大量に流し洗浄した。次に、６０分間かけて、０から０．５ＭまでのＮａＣｌ勾配を３ｍｌ／分で、もしくは６０分間にわたり、０．１Ｍ、０．４Ｍ及び最後は１．０ＭのＮａＣｌを用いる一連の溶出工程のいずれかを、各々該カラムに流した。分画を収集し、セントリプレップ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ）１００を用いて濃縮した。あるいは、タンパク質を、０．１Ｍ　ＮａＣｌで溶出せずに、単一の０．４Ｍ　ＮａＣｌ洗浄液で溶出することができる。
【００８２】
濃縮したＱセファロースの２ｍｌアリコート試料を、１０ｍＭ　Ｎａ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．０で平衡にしたＨＲ　１６／５０スペロース１２（ファルマシア社）ゲルろ過カラム上に、０．５ｍｌ／分で加えた。このカラムを、同じバッファーで、２４０分間、０．５ｍｌ／分で洗浄し、かつ２分間ずつ試料を収集した。間隙容量の物質を収集し、かつセントリプレップ１００を用いて濃縮した。濃縮したスペロース１２の試料の２ｍｌのアリコートを、１０ｍＭ　Ｎａ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．０で平衡にしたＨＲ　１６／５０セファロース４Ｂ−ＣＬ（ファルマシア社）ゲルろ過カラム上に、０．５ｍｌ／分で加えた。このカラムを、同じバッファーで、０．５ｍｌ／分で、２４０分間洗浄し、２分間ずつ試料を収集した。
【００８３】
溶出されたタンパク質のピークを、セファロースＣＬ−４Ｂ樹脂を使用したゲルろ過カラムに適用することによって、２回目の分画を施し、〜３０ｋＤａから１０００ｋＤａの範囲のタンパク質を分離した。この分画を、２種のピークについて分解し；小さいピークが間隙容量（＞１０００ｋＤａ）で、及び大きいピークが、見かけの分子量約８６０ｋＤａで溶出した。１週間以上、連続的に試料をゲルろ過に晒したところ、前述の大きいピークから生じるように見え、おそらく限定的タンパク質分解によると思われる、第三のピーク（約３２５ｋＤａ）の段階的出現が認められた。これらの３種のピークに関して行ったバイオッセイは、この間隙ピークは活性を持たないが、８６０ｋＤａの毒素複合体が高い活性を有し、かつ３２５ｋＤａのピークは、かなり可能性はあるが、より活性が少ないことを示した。異なる発酵生成物に由来するセファロースＣＬ−４Ｂの毒素複合体のピークのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、”Ｐ”及び”Ｓ”と称される、２種の異なるペプチドパターンを明らかにした。これら２種のパターンは、分子量、及びそれらの分画中のペプチド成分濃度の差が際立っていた。”Ｓ”パターンは、最も頻繁に産生され、４個の高分子量ペプチド（＞１５０ｋＤａ）を有する一方で、”Ｐ”パターンは、３個の高分子量ペプチドを有した。これに加え、”Ｓ”ペプチド分画は、ヨーロッパアワノメイガに対して、２〜３倍より強い活性が認められた。この偏りは、接種の虫齢及び／又は年数を経た培養（ａｇｅｄｃｕｌｔｕｒｅ）の増殖因子を基にした他の因子に起因した、タンパク質発現の変動に関連するであろう。
【００８４】
”Ｐ”及び”Ｓ”ペプチドパターンと定義されたピーク毒素複合体分画のミリグラム量に、分取的ＳＤＳ−ＰＡＧＥを施し、かつトリスーグリシン（セプラバフ（登録商標））で、ＰＶＤＦ膜（プロブロット（登録商標）、アプライドバイオシステム社）に、３〜４時間かけて、ブロットを写し取った。ブロットは、アミノ酸分析及びＮ−末端アミノ酸配列決定のために、それぞれ、ハーバードマイクロケム社及びケンブリッジプロケム社に送った。”Ｓ”パターン中の３種のペプチドは、前述の例において同定された配列と比較して、独特のＮ−末端アミノ酸配列を有した。下記配列番号１３で説明された２０１ＫＤａ（ＴｃｄＡ_ｉｉ）ペプチドは、配列番号１（ＴｃｂＡ_ｉｉ）と、３３％のアミノ酸同一性及び５０％の類似性を共有した（表１０、表１０において縦の線は、アミノ酸の同一性を示し、かつ点線はアミノ酸の同類置換を意味した。）。
【００８５】
配列番号１４の１９７ｋＤａの第二のペプチド（ＴｃｄＢ）は、配列番２（ＴｃａＣ）と、４２％の同一性及び５８％の相同性を有した。更に、第三のペプチド２０５ｋＤａは、ＴｃｄＡ_ｉｉを意味した。これに加え、限定されたＮ−末端アミノ酸配列である配列番号１６（ＴｃｂＡ）は、少なくとも２３５ｋＤａのペプチドであるが、これはクローン化された配列番号１１の遺伝子（ｔｃｂＡ）から推定された、配列番号１２のアミノ酸配列と、相同性が同じであり、配列番号１（ＴｃｂＡ_ｉｉ）に相当する推定されたアミノ酸配列を有した。これは、より大きい２３５＋ｋＤａペプチドが、発酵時に、タンパク質分解的に、２０１ｋＤａペプチド（ＴｃｂＡ_ｉｉ）（配列番号１）へと処理され、おそらく該分子の活性化を生じることを示している。更に別の配列において、前述の実施例５で報告された配列番号５（ＴｃａＢ_ｉｉ）として最初に報告された配列は、３位に、グリシン（Ｇｌｙ）ではなくアスパラギン酸残基（Ａｓｐ）を、並びに８及び９位に、それぞれ、２個の追加のアミノ酸Ｇｌｙ及びＡｓｐを含むことがわかった。更に別の２種の配列、配列番号２（ＴｃａＣ）及び配列番号３（ＴｃａＢ_ｉ）においては、追加のアミノ酸配列が得られた。Ｎ−末端分析に送られた”Ｓ”調製物と同一である試料を用いて、デンシトメーターによる定量を行った。この分析は、２０１ｋＤａ及び１９７ｋＤａペプチドが、それぞれ、”Ｓ”パターン中のクマーシーブリリアントブルーで染色されたタンパク質全体の７．０％及び７．２％であり、かつ他の豊富なペプチドに匹敵する量で存在することを示した。これらのペプチドが、他の細菌性毒素、例えば様々なＣｒｙｌ　Ｂｔ毒素などで認められた状況に対し、タンパク質相同体、類似体を表すことが推測された。これらのタンパク質は、そのＮ−末端アミノ酸配列で、４０〜９０％相同性が変動し、これは毒性断片を包含している。
【００８６】
内部アミノ酸配列決定：毒素ペプチド遺伝子のクローニングを促進するために、選択されたペプチドの内部アミノ酸配列を、下記の方法で得た。”Ｐ”又は”Ｓ”ペプチドパターンであると決定されたピーク２Ａ分画のミリグラム量に、分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥを施し、かつトリス−グリシン（セプラバフ（登録商標））で、ＰＶＤＦ膜（プロブロット（登録商標）、アプライドバイオシステム社）に、３〜４時間かけて、ブロットを写しとった。ブロットは、アミノ酸分析及びＮ−末端アミノ酸配列決定のために、それぞれ、ハーバードマイクロケム社及びケンブリッジプロケム社に送った。ＴｃｂＡ_ｉｉ（配列番号１を含む）、ＴｃｄＡ_ｉｉ及びＴｃａＢ_ｉ（配列番号３を含む）と称される３種のペプチドに、ハーバードマイクロケム社でトリプシン消化を施し、その後ＨＰＣＬクロマトグラフィーで、個々のペプチドを分離した。Ｎ−末端アミノ酸分析は、選択されたトリプシンペプチド断片について行った。ペプチドＴｃａＢ_ｉ（２０５ｋＤａペプチド）について配列決定された、２個の内部ペプチドは、ＴｃａＢ_ｉ−ＰＴ１１１（配列番号１７）及びＴｃａＢ_ｉ−ＰＴ７９（配列番号１８）と称される。ペプチドＴｃａＢ_ｉ（６８ｋＤａペプチド）について配列決定された、２種の内部ペプチドは、ＴｃａＢ_ｉ−ＰＴ１５８（配列番号１９）及びＴｃａＢ_ｉ−ＰＴ１０８（配列番号２０）と称される。ペプチドＴｃｂＡ_ｉｉ（２０１ｋＤａペプチド）について配列決定された、４種の内部ペプチドは、ＴｃｂＡ_ｉｉ−ＰＴ１０３（配列番号２１）、ＴｃｂＡ_ｉｉ−ＰＴ５６（配列番号２２）、ＴｃｂＡ_ｉｉ−ＰＴ８１（ａ）（配列番号２３）、及びＴｃｂＡ_ｉｉ−ＰＴ８１（ｂ）（配列番号２４）と称される。
【００８７】
【表１１】
表１０．

【００８８】
実施例８ Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓＷ−１４ ゲノム ＤＮＡ のコスミドライブラリーの作製、及び毒性タンパク質調製物を含むペプチドをコードしている遺伝子を単離するためのスクリーニング
異種宿主における、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓの昆虫毒性タンパク質の生成、及び他の使用のための必須条件として、これらのペプチドをコードしている遺伝子を、単離し、かつ特徴づけることが必要である。この目的は、平行して詳細に調べられる。ひとつの方法では、後述するように、その後発現ライブラリーからのクローンの単離に使用されるような、精製された毒素に対して生じた、モノクローナル及びポリクローナル抗体の使用を基にしている。別の方法は、本実施例において説明したように、ＰＣＲ増幅に使用するための縮重オリゴヌクレオチドを設計するための、Ｎ−末端及び内部のアミノ酸配列データの使用を基にしている。いずれの方法も、各遺伝子の単離、及びそれらのＤＮＡ塩基配列の決定を可能にするために、該ペプチドをコードしている遺伝子を含むＤＮＡクローンの同定に使用することができる。
【００８９】
ゲノム ＤＮＡ の単離：Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓの菌株Ｗ−１４（ＡＴＣＣ寄託番号５５３９７）を、２％プロテオースペプトン＃３寒天（ディフコラボラトリー社、デトロイト、ＭＩ）上で増殖し、かつ殺虫性毒素の受容能（ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ）を、前記実施例１の方法を用いて、通過後に反復されたバイオアッセイにより維持した。振盪培養物５０ｍｌを、２％プロテオースペプトン＃３培地を含む、１７５ｍｌの仕切り付きフラスコ中で作製し、２８℃かつ１５０ｒｐｍで、約２４時間増殖した。この培養物１５ｍｌをペレット化し、かつＤＮＡ単離のために解凍するまで、その培地中で、−２０℃で凍結した。この解凍した培養物を、遠心分離し（７００×ｇ、３０分間）、かつ浮遊しているオレンジ色のムコ多糖物質を除去した。残りの細胞物質を、遠心分離し（２５，０００×ｇ、１５分間）、細菌細胞をペレット化し、かつこの培地を取り除いた。
【００９０】
分子生物学における最近のプロトコール（Ａｕｓｂｅｌらの編集、ジョン・ウィリー・ソン社（１９９４））の２．４．１節に記載されたＣＴＡＢ法を適用して、ゲノムＤＮＡを単離した（塩ショック（ｓａｌｔ　ｓｈｏｃｋ）を含み、及び全ての容量を１０倍に増量した点を変更した。）。ペレット化した細菌細胞を、ＴＦバッファー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で再懸濁し、最終容量を１０ｍｌにし、その後５Ｍ　ＮａＣｌを１２ｍｌ添加し；この混合物を、１５，０００×ｇで、２０分間遠心分離した。得られたペレットを、ＴＥ　５．７ｍｌ中で再懸濁し、かつこの懸濁液に、１０％ＳＤＳ　３００ｍｌ及び２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ　６０ｍｌ（ギブコＢＲＴプロダクツ社、グランド・アイランド、；滅菌蒸留水を溶媒とする）を添加した。この混合物を、３７℃で１時間インキュベートし；その後、リゾチーム１０ｍｇ（ウォーシングトン・バイオケミカル社、フリーホールド、ＮＪ）を添加した。添加の４５分後に、５Ｍ　ＮａＣｌ　１ｍｌ及びＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液８００ｍｌ（１０重量／容量％ＣＡＴＢ及び０．７Ｍ　ＮａＣｌ）を添加した。この調製物を、６５℃で１０分間インキュベートし、次に緩やかに攪拌し、更にインキュベートし、かつ約２０分間攪拌し、細胞物質が透明化するのを補助した。クロロホルム／イソアミルアルコール溶液（２４：１、容量／容量）を等量添加し、緩徐に混合し、かつ遠心分離した。等量のＰＣＩ（フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、５０：４９：１、容量／容量／容量、１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で平衡にした；インターマウンティンサイエンティフィック社、カイスビル、ＵＴ）で２回抽出した後、このＤＮＡを、イソプロパノール０．６容量で沈殿した。
【００９１】
このＤＮＡ沈殿物を、ガラス棒でゆっくり取り出し、７０％エタノールで２回洗浄し、乾燥し、かつ２ｍｌ　ＳＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解した。この調製物は、２６０ｎｍで光学濃度を測定したところ（すなわちＯＤ_２６０）、ＤＮＡを２．５ｍｇ／ｍｌ含有していた。
この単離されたゲノムＤＮＡの分子の大きさの範囲は、ライブラリーの作製に適すると評価した。ＣＨＥＦゲル分析を、パルスウェーブ７６０変換器を備えたバイラドＣＨＥＦ−ＤＲ　ＩＩ装置（バイオラドラボラトリー社、リッチモンド、ＣＡ）上で、０．５×ＴＢＥバッファー（４４．５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、４４．５ｍＭ　Ｈ_３ＢＯ_３、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）を用い、１．５％アガロース（シーケム（登録商標）ＬＥ、ＦＭＣバイオプロダクツ社、ロックランド、ＭＥ）ゲル中で行った。この操作パラメーターは：初期Ａ時間、３秒；最終Ａ時間、１２秒；２００ボルト；操作温度、４〜１８℃；操作時間、１６．５時間であった。臭化エチジウムで染色し、紫外線下でこのゲルを検査し、このＤＮＡの大きさが３０〜２５０ｋｂｐの範囲であることが示された。
【００９２】
ライブラリーの作製：このＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓゲノムＤＮＡ調製物を、部分的Ｓａｕ３Ａ　１で消化した。この方法は、Ａｕｓｂｅｌ（前掲）の３．１．３節に基づいた。ほとんど最適の結果が得られるまで、様々な条件下で、より小さい規模で反応を実行することで適合させた。様々な条件で、規模拡大したいくつかの大量反応を行い、結果を、ＣＨＥＦゲル上で分析し、かつ最良の大規模調製物のみについて、先に進めた。最適な場合、ＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓゲノムＤＮＡ２００μｌを、Ｓａｕ３Ａ　１（ニューイングランド・バイオラボ社、”ＮＥＢ”、ビバリー、ＭＡ）１．５ユニットと共に、全量２ｍｌの１Ｘ　ＮＥＢ４バッファー（該製造業者から１０×で供給）中で、３７℃で、１５分間、インキュベートした。この反応を、ＰＣＩ　２ｍｌを添加することによって停止し、かつ８０００×ｇで１０分間、遠心分離した。上清に、５Ｍ　ＮａＣｌを２００μｌと、氷冷したエタノール６ｍｌを添加した。この調製物を、−２０℃で３０分間冷却し、その後１２，０００×ｇで１５分間、遠心分離した。上清を除去し、かつ沈殿を４０℃の真空炉で乾燥し、その後ＳＴＥ　４００μｌに再懸濁した。
【００９３】
分光光度学的アッセイは、投入したＤＮＡの約４０％を回収したことを示した。消化されたＤＮＡは、ＣＰＭＢの５．３．２節（前掲）に従い、ショ糖密度勾配上で大きさで分画した。１０％から４０％（重量／容量）の直線状のショ糖密度勾配を、ウルトラ−クリアー（登録商標）チューブ（ベックマンインスツルメンツ社、パロアルト、ＣＡ）中で、勾配作製器を用いて調製し、かつ該ＤＮＡ試料を、最上部に乗せた。遠心分離（２６，０００ｒｐｍ、１７時間、ベックマンＳＷ４１ローター、２０℃）後、分画（約７５０μｌ）を、この勾配の最上部から採取し、かつＣＨＥＦゲル電気泳動（前述）で分析した。大きさが２０〜４０ｋｂｐのＳａｕ３Ａ　１断片を含有する分画を選択し、かつＡｕｓｂｅｌ（前掲）の５．３．３節の方法を変更して（全ての溶液の量を、約６．３倍に増量）、ＤＮＡを沈殿した。一晩沈殿した後、ＤＮＡを、遠心分離（１７，０００×ｇ、１５分間）により収集し、乾燥し、ＴＥに再度溶解し、最終容積８０μｌとし、かつ３Ｍ酢酸ナトリウム８μｌ及びエタノール２２０μｌを添加して、再沈殿した。前述の遠心分離により収集されたペレットを、ＴＥ　１２μｌ中で再懸濁した。ＤＮＡ濃度を、ホウファ−ＴＫ０１００蛍光光度計（ホウファーサイエンティフィックインスツルメンツ社、サンフランシスコ、ＣＡ）を用いて、ヘキスト３３２５８染料（ポリサイエンス社、ワーリントン、ＰＡ）蛍光定量法で測定した。大きさで分画されたＤＮＡの約２．５μｌが、回収された。
【００９４】
コスミドｐＷＥ１５　ＤＮＡ（ストラータジーン社、ラホラ、ＣＡ）３０μｇを、制限酵素ＢａｍＨ　１（ＮＥＢ）１００ユニットで、製造業者のバッファー（最終容量が２００μｌ、３７℃、１時間）を溶媒として、完全に消化した。この反応物を、ＰＣＩ　１００μｌで抽出し、かつＤＮＡを、３Ｍ酢酸ナトリウム及び−２０℃の無水エタノール５５０μｌを添加することによって、水相から沈殿した。−７０℃で２０分間放置した後、このＤＮＡを、遠心分離（１７，０００×ｇ、１５分間）により収集し、真空で乾燥し、かつ１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１８０μｌに溶解した。これに、１０×ＣＩＰバッファー（１００ｍｌトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３；１０ｍＭ　ＺｎＣｌ_２；１０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２）２０μｌを添加し、かつ１：４に希釈した仔ウシの腸のアルカリホスファターゼ（ベーリンガーマンハイム社、インディアナポリス、ＩＮ）１μｌ（０．２５ユニット）を添加した。３７℃で３０分放置後、下記を添加し：０．５Ｍ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８．０を２μｌ；１０％ＳＤＳを１０μｌ；２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（前述）を０．５μｌであり、引き続き５５℃で３０分間インキュベートした。ＰＣＩ　１００μｌ及びフェノール（インターマウンティンサイエンティフィック社、１Ｍトリス−ＨＣｌで平衡化、ｐＨ８．０）１００μｌで連続抽出した後、脱リン酸化したＤＮＡを、７．５Ｍ酢酸アンモニウム７２μｌ及び−２０℃のエタノール５５０μｌの添加により沈殿し、氷上で３０分間インキュベートし、前述のように遠心分離した。沈殿したＤＮＡを、−２０℃の７０％エタノール５００μｌで１回洗浄し、真空で乾燥し、かつＴＥバッファ−２０μｌに溶解した。
【００９５】
大きさで分画したＳａｕ３Ａ　１断片の、ＢａｍＨ　１で消化しかつリン酸化したｐＷＥ１５ベクターへのライゲーションを、Ａｕｓｂｅｌの３．３節のプロトコールを変更（すなわち、製造業者によって供給された、予備混合した１０×ライゲーションバッファーを使用）して、Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ）を用いて達成した。ライゲーションは、総量２０μｌについて、１５℃で一晩行い、引き続き−２０℃で貯蔵した。
ＤＮＡ約１μｇを含有する、コスミドＤＮＡライゲーション反応物４μｌを、市販のパッケージングエクストラクト（ギガパック（登録商標）ＩＩＩゴールドパッケージングエクストラクト、ストラータジーン社）を用いて、製造業者の指示に従って、λバクテリオファージにパッケージした。パッケージした調製物は、使用時まで４℃で貯蔵した。下記のギガパック（登録商標）ＩＩＩゴールドプロトコール（コスミドライブラリーのタイタリング（ｔｉｔｅｒｉｎｇ））に従い、このパッケージしたコスミド調製物を、エシェリキア・コリＸＬ１ブルーＭＲ細胞（ストラータジーン社）への導入に使用した。ＸＬ１ブルーＭＲ細胞を、０．２重量／容量％マルトースと１０ｍＭ　ＭｇＳＯ_４を含有する、ＬＢ培地（ｇ／Ｌ：バクト−トリプトンが１０；バクト酵母抽出物が５；バクト寒天が１５；ＮａＣｌが５（ディフコラボラトリー社、デトロイト、Ｍ　Ｉ））中で、３７℃で増殖した。
【００９６】
５時間増殖した後、細胞を、７００×ｇ（１５分間）でペレット化し、１０ｍＭ　ＭｇＳＯ_４　６ｍｌ中に再懸濁した。培養物の濃度を、１０ｍＭ　ＭｇＳＯ_４で、ＯＤ_６００＝０．５に調節した。パッケージしたコスミドライブラリーを、滅菌したＳＭ培地（０．１Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＭｇＳＯ_４、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．０１重量／容量％ゼラチン）で１：１０又は１：２０に希釈し、かつ希釈した調製物２５μｌを、希釈したＸＬ１ブルーＭＲ細胞２５μｌと混合した。この混合物を、２５℃で３０分間インキュベートし（振盪せず）、その後ＬＢブロス２００μｌを添加し、かつインキュベーションを、時々緩く攪拌しながら、約１時間継続した。この培養物のアリコート（２０〜４０μｌ）を、アンピシリンを１００ｍｇ／ｌ含む、ＬＢ寒天プレート（すなわちＬＢ−Ａｍｐ_１００）上に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。増幅せずにこのライブラリーを保存するために、単一のクローンを採取し、かつ滅菌した９６ウェルのマイクロウェルプレートの個々のウェルに接種し；各ウェルには、テリフィックブロス（ＴＢ培地：バクトトリプトンが１２ｇ／ｌ、バクト酵母抽出物が２４ｇ／ｌ、０．４容量％グリセロール、１７ｍＭ　Ｈ_２ＰＯ_４、７２ｍＭ　Ｋ_２ＨＰＯ_４）７５μｌと、アンピシリン１００ｍｇ／ｌ（すなわちＴＢ−Ａｍｐ_１００）を入れ、かつ一晩、３７℃でインキュベートした（振盪せず）。
【００９７】
９６ウェルプレートを、コピープレートに複写した後、フィルター滅菌したＴＢ：グリセロール（１：１、容量／容量、アンピシリン１００ｍｇ／ｌは有又は無）を７５μｌ／ウェルずつ、このプレートに添加し、これを手短に１００ｒｐｍ、３７℃で振盪し、その後パラフィルム（登録商標）（アメリカンナショナル社、グリニッジ、ＣＴ）で封をし、−７０℃のフリーザーに静置貯蔵した。コピープレートを、マスタープレートと同じように増殖処理した。全部で４０個のこのようなマスタープレート（及びそれらのコピー）を調製した。
【００９８】
放射標識した ＤＮＡ プローブによるライブラリースクリーニング：放射性標識したプローブでプロービングするためのコロニーフィルターを調製するために、前述のライブラリーの９６ウェルプレート１０個を、２５℃で解凍した（ベンチ表面は室温）。９６の先が尖った部分を備えたレプリカプレーティング器具を用いて、ＴＢ−Ａｍｐ_１００を７５μｌ／ウェル含む、新たな９６ウェルコピープレートに接種した。このコピープレートを、３７℃で一晩増殖し（静置）、その後１００ｒｐｍ、３７℃で、約３０分間振盪した。増殖しなかったものを分離するために、全部で８００のコロニーを、このコピープレート上に出現させた。前記レプリカ器具を用いて、バイオアッセイプラスチックディッシュ（Ｎｕｎｃ、２４３×２４３×１８ｍｍ；カーティンマティソンサイエンティフィック社、ウッドデールＩＬ）中の、固形ＬＢ−Ａｍｐ_１００（１００ｍｌ／ディッシュ）上に配置した、マグナＮＴ；（ＭＳＩ社、ウェストボロ、ＭＡ）ナイロン膜（０．４５μｍ、２２０×２５０ｍｍ）の上に、この９６ウェルアレーのデュプリケートの痕跡（ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）を接種した。これらのコロニーを、前述の膜の上で、３７℃で、約３時間増殖した。
【００９９】
陽性対照コロニー（ＧＺ４配列インサートを含む細菌クローン、下記参照）を、クロラムフェニコール３５ｍｇ／ｌを補充したＬＢ培地（すなわちＬＢ−Ｃａｍ_３５）について、セパレートのマグナＮＴ膜（Ｎｕｎｃ．、０．４５μｍ、８２ｍｍの円形）上で増殖し、かつこのライブラリーコロニー膜に沿って処理した。膜上の細菌コロニーを溶菌し、かつゲニウス（登録商標）システムユーザーガイド２．０版（ベーリンガーマンハイム、インディアナポリス、ＩＮ）のプロトコールに従って、ＤＮＡを、変性かつ中和した。０．５Ｎ　ＮａＯＨと１．５Ｍ　ＮａＣｌに１５分間浸漬したフィルターペーパー上に、膜をコロニー側が上になるように置いて、変性し、かつ１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１．５Ｍ　ＮａＣｌに１５分間浸漬したフィルターペーパー上で中和した。ストラータジーン社のＵＶストラタリンカーを自動架橋（ａｕｔｏ　ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ）に設定して用いて、ＵＶ架橋した後、この膜を、乾燥状態２５℃で、使用時まで保存した。膜を、単一の９６ウェルプレートのデュプリケートの痕跡を含む細片に切り揃え、その後ＣＰＭＢ（前掲）６．４．１節の方法で、広く洗浄した：３×ＳＳＣ、０．１重量／容量％ＳＤＳ中で、２５℃で３時間洗浄した後、同じ溶液で、６５℃で１時間洗浄し、次にハイブリダイゼーション工程（２０×ＳＳＣ＝３Ｍ　ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）のための調製物中の、２×ＳＳＣで洗い流した。
【０１００】
ｔｃａＣ 遺伝子の特異的ゲノム断片の増幅：精製したＴａｃＣペブチド分画に関して決定されたＮ−末端アミノ酸配列（ここでは配列番号２として示す）を基に、縮重オリゴヌクレオチドのプール（プールＳ４Ｐｓｈ）を、アプライドバイオシステムＡＢＩ３９４　ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー社、フォスターシティー、ＣＡ）で、標準的βシアノエチル化学により合成した。これらのオリゴヌクレオチドを、８時間、５５℃で脱保護し、水に溶解し、分光光度計による測定で定量し、かつ使用するために希釈した。このプールは、ＴａｃＣペプチドのＮ−末端の決定されたアミノ酸配列と一致した。決定されたアミノ酸配列及び対応する縮重したＤＮＡ配列を、下記に示し、ここでＡ、Ｃ、Ｇ及びＴは、標準のＤＮＡ塩基であり、Ｉはイノシンを表す：

縮重オリゴヌクレオチドの別のセットを、合成し（プールＰ２．３．５Ｒ）、配列番号１７の決定されたアミノ酸配列に関するコード鎖の完全性を示した：

【０１０１】
これらのオリゴヌクレオチドは、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ菌株Ｗ−１４（前記参照）から調製されたゲノムＤＮＡ由来の特異的ＤＮＡ断片を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ（登録商標）、ロッシュモレキュラーシステム社、ブランチュバーグ、ＮＪ）のプライマーとして使用した。
【０１０２】
典型的な反応物（５０μｌ）は、各プライマープールＰ２Ｐｓｈ及びＰ２．３．５Ｒを１２５ｐｍｏｌ、ゲノム鋳型ＤＮＡを２５３ｎｇ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを各々１０ｎｍｏｌ、１×ゲネアンプ（登録商標）ＰＣＲバフッファー、並びにアムプリタック（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを２．５ユニット（両方ともロシュモレキュラーシステム社から入手；１０×ゲネアンプ（登録商標）バッファーは、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５００ｍＭ　ＫＣｌ、０．０１重量／容量％ゼラチン）を含有した。増幅は、９４℃（１．０分間）、５５℃（２．０分間）、７２℃（３．０分間）、その後７．０分間７２℃の伸長期間の３５サイクルを用い、パーキンエルマーセタスＤＮＡサーマルサイクラー（パーキンエルマー社、フォスターシティー、ＣＡ）中で行った。増幅生成物は、ＴＥＡバッファー（４０ｍＭトリス−酢酸、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で、２重量／容量％ヌシーヴ（登録商標）３：１アガロース（ＦＭＣバイオプロダクツ社）を通す電気泳動で分析した。このゲルを臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍｌ）で染色し、紫外線下て検出することにより、大きさが２５０ｂｐと推定される特異的生成物が多くの他の増幅生成物中に認められた。
【０１０３】
およそ２５０ｂｐ生成物を含有しているゲルの部分を切り、小さいプラグ（直径０．５ｍｍ）を取り出し、ＰＣＲ増幅（４０サイクル）用の鋳型の供給に使用した。この反応物（５０μｌ）は、ゲノム鋳型ＤＮＡを除いて、前述と同じ内容物を含有した。増幅後、この断片の末端を平滑にし、かつ１ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、１ｎｍｏｌ　ＡＴＰ、及び２．１５ユニットのＴ４キナトゼ（ファルマシアバイオテク社、ピスケートウェイ、ＮＪ）と共に、２５℃で２０分間、インキュベートすることによって、リン酸化した。
ＤＮＡ断片は、ＴＥＡを溶媒とする１重量／容量％ＧＴＧ（登録商標）アガロース（ＦＭＣ）を通す電気泳動により、残留するプライマーから分離した。見かけの大きさ２５０ｂｐの断片を有するゲル切片を切り取り、かつそのＤＮＡを、キアエックスキット（キアゲン社、チャストウォース、ＣＡ）を用いて抽出した。
【０１０４】
この抽出されたＤＮＡ断片を、制限酵素Ｓｍａ　１で完全に消化したプラスミドベクターｐＢＣ　ＫＳ（＋）（ストラータジーン社）にライゲートし、かつ前述のｐＷＥ１５　ＤＮＡプローブに関して説明したのと同様の方法で抽出した。典型的なライゲーション反応物（１６．３μｌ）は、１×ライゲーションバッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２；１０ｍＭジチオスレイトール；１ｍＭスペルミジン；１ｍＭ　ＡＴＰ；１００ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）を溶媒として、消化されたｐＢＣＫＳ（＋）ＤＮＡを１００ｎｇ、２５０ｂｐ　ＤＮＡ断片を７０ｎｇ、１ｎｍｏｌ［Ｃｏ（ＮＨ_３）_６］Ｃｌ、及びＴ４　ＤＮＡリガーゼを３．９　Ｗｅｉｓｓユニット（コラボラチブバイオメディカルプロダクト社、ベッドフォード、ＭＡ）を含有した。
【０１０５】
１４℃で一晩インキュベートした後、供給者の指示に従って、ライゲーションした生成物を、凍結したコンピテントエシェリキア・コリＤＨ５α（ギブコＢＲＬ）に形質転換し、ＩＰＴＳ（１１９μｇ／ｍｌ）及びＸ−ガル（５０μｇ／ｍｌ）を含有する、ＬＢ−Ｃａｍ_３５プレート上に配置した。独立した白色コロニーを採取し、かつプラスミドＤＮＡを、変更されたアルカリ溶解／ＰＥＧ沈殿法（ＰＲＩＳＭ（登録商標）簡易反応ダイデオキシ（登録商標）ターミネーターサイクル配列決定キットのプロトコール；ＡＢＩ／パーキンエルマー社）により、調製した。このインサートＤＮＡの両方の鎖のヌクレオチド配列を、Ｔ７プライマー［ｐＢＣ　ＫＳ（＋）塩基６０１−６２３：ＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＧ］及びＬａｃＺプライマー［ｐＢＣ　ＫＳ（＋）塩基７９２−８１６：ＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＧＣＧＣｌ、及びＰＲＩＳＭ（登録商標）配列決定キット（ＡＢＩ／パーキンエルマー社）のプロトコールを用いて決定された。組込まれていない染色したターミネーターであるジデオキシリボヌクレオチドは、セントリーセップ１００カラム（プリンストンセパレーション社、アデルフィア、ＮＪ）を、製造業者の指示に従って通すことによって、除去した。このＤＮＡ配列は、ＡＢＩモデル３７３Ａ　ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ／パーキネルマー社）を用いて、これらの試料を分析することによって得られた。２種の単離体ＧＺ４及びＨＢ１４のＤＮＡ配列は、図１に詳細に説明したものが認められた。
【０１０６】
この配列は、下記の特徴を持つ：ｉ）塩基１−２０は、Ｓ４Ｐｓｈ縮重オリゴヌクレオチドの６４の可能性のある配列のひとつを表す、ｉｉ）アミノ酸１−３及び６−１２の配列は、ＴａｃＣのＮ−末端について決定されたもの（配列番号２）と正確に一致する、ｉｉｉ）コードされた４番目のアミノ酸は、セリン残基ではなく、システイン残基であり、この差異は、セリンコドンの縮重内でコードされている（前記参照）、ｉｖ）コードされた５番目のアミノ酸は、プロリンであり、配列番号２で示されたＴｃａＣ　Ｎ−末端配列に対応している、Ｖ）塩基２５７−２７６は、縮重プールにデザインされた１９２の可能性のある配列のひとつをコードしている、Ｖｉ）塩基２６８−２７０に導入されたＴＧＡ終結コドンは、対応する位置で該オリゴヌクレオチドプールに組込まれた縮重に対する相補性の結果であり、かつ対応する遺伝子の短い読み枠を示すものではない。
【０１０７】
ＴｃａＣ ペプチド遺伝子特異性プローブの標識
夫々１００ｐモルのＰ２Ｐｓｈプライマー及びＰ２．３．５Ｒプライマー、鋳型としてのプラスミドＧＺ４またはＨＥ１４　１０ｎｇ、夫々２０ｎモルのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、Ａｍｐｌｉｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ５単位、１ｘ濃度のＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）緩衝液を上記と同じ温度レジメのもとに使用して、上記２７６塩基に相当するＤＮＡフラグメントを１００μｌの反応容積でＰＣＲ（登録商標）により増幅した（３５サイクル）。増幅産物をＱｉａｅｘキットにより１％ＧＴＧ（登録商標）アガロースゲルから抽出し、フルオロメトリーにより定量した。
プラスミドＨＢ１４鋳型から抽出された増幅産物（約４００ｎｇ）を５つのアリコートに分け、製造業者の指示に従ってハイ・プライム・ラベリング・ミックス（ベーリンガー・マンハイム）を使用して^３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識した。とり込まれなかった放射性同位元素を供給業者の指示に従ってＮｕｃＴｒａｐプローブ精製カラム（ストラタゲン）中の通過により除去した。標識されたＤＮＡ産物の比活性をシンチレーションカウントにより測定したところ、３．１１×１０^８ｄｐｍ／μｇであった。この標識されたＤＮＡを使用してゲノムライブラリーの８００の員から調製された膜を探査した。
【０１０８】
ＴｃａＣ ペプチド遺伝子特異性プローブによるスクリーニング
放射能標識されたＨＢ１４プローブを約１０分間沸騰させ、次いで”最小ｈｙｂ”溶液に添加した［注：”最小ｈｙｂ”方法をＣＥＲＥＳプロトコル；”制限酵素断片長多型研究マニュアルバージョン４．０”，節４−４０及び４−４７；ＣＥＲＥＳ／ＮＰＩ，Ｓａｌｔ　Ｌａｋｅ　Ｃｉｔｙ，ＵＴから採用する。ＮＰＩは現存していないが、その継承者がＬｉｎｋａｇｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓとして運用している］。”最小ｈｙｂ”溶液は１０％ｗ／ｖのＰＥＧ（ポリエチレングリコール、Ｍ．Ｗ．約８０００）、７％ｗ／ｖのＳＤＳ、０．６ＸのＳＳＣ、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（９５ｇ／ｌのＮａＨ_２ＰＯ_４・１Ｈ_２Ｏ及び８４．５ｇ／ｌのＮａ_２ＨＰＯ_４・７Ｈ_２Ｏを含む１Ｍの原液から）、５ｍＭのＥＤＴＡ、及び１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む。膜を素早く乾燥ブロットし、次いで、プレハイブリダイゼーションを用いないで、膜の５ストリップを、”最小ｈｙｂ”７５ｍｌ及び２．６ｎｇ／ｍｌの放射能標識されたＨＢ１４プローブを含む二つのプラスチックボックスの夫々に入れた。これらを６０℃で徐々に振とうしながら一夜インキュベートした。フィルターを夫々約１０分間にわたって２５℃で”最小ｈｙｂ洗浄液”（０．２５ＸのＳＳＣ、０．２％のＳＤＳ）中で３回洗浄し、続いて同溶液中で６０℃で徐々に振とうしながら２回の３０分間の洗浄を行った。
【０１０９】
フィルターをライト−タイト・オートラジオグラフィーカセット中でサランラップ^Ｒ（ダウ・ブランド、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で覆われた紙の上に置き、４時間にわたって−７０℃で２種のデュポン・クロネックス・ライトニング・エンハンサー＋Ｃ１エンハンサー（シグマ・ケミカル社，Ｓｔ．Ｌｏｉｓ，ＭＯ）を用いてＸ−Ｏｍａｔ　Ｘ線フィルム（コダック，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に露出した。現像（通常の写真操作）後に、有意なシグナルが更に弱く、更に不規則なシグナルのハイバックグラウンドの間で両方の反復試験で明らかであった。再度、フィルターを約４時間にわたって６８℃で”最小ｈｙｂ洗浄液”中で洗浄し、次いで再度カセットに入れ、フィルムを−７０℃で一夜露出した。１２の可能な陽性を二重の９６ウェル・コロニー陥凹の両方について強いシグナルにより同定した。シグナルは陰性の対照膜（ｐＷＥ１５を含むＸＬ１ブルーＭＲ細胞のコロニー）では見られず、非常に強いシグナルが実験サンプルで同時に処理された陽性の対照膜（ＰＣＲ産物のＧＺ４分離物を含むＤＨ５α細胞）で見られた。
【０１１０】
１２の推定ハイブリダイゼーション−陽性コロニーを凍結された９６ウェルライブラリープレートから回収し、固体ＬＢ−Ａｍｐ_１００培地で３７℃で一夜増殖させた。次いでそれらを固体ＬＢ−Ａｍｐ_１００にパッチした（３／プレート、＋３種の陰性対照：ｐＷＥ１５ベクターを含むＸＬ１ブルーＭＲ細胞）。膜（マグナＮＴナイロン、０．４５ミクロン）の二つの組をハイブリダイゼーションのために調製した。フィルターをパッチプレートのコロニーの上に直接置き、次いでそれを付着バクテリア細胞とともに除去し、以下のようにして処理することにより第一組を調製した。第二組のフィルターをＬＢ−Ａｍｐ_１００培地を含むプレートに入れ、次いで細胞をパッチプレートからフィルターに移すことにより接種した。３７℃で一夜増殖後に、フィルターをプレートから除去し、処理した。
【０１１１】
フィルターのバクテリア細胞を溶解し、夫々のフィルターをプラスチックプレート中の０．５ＮのＮａＯＨのプール（１．０ｍｌ）に３分間にわたってコロニー面を上にして置くことによりＤＮＡを変性した。フィルターをペーパータオルで乾燥ブロットし、次いでそのプロセスを新しい０．５ＮのＮａＯＨで繰り返した。乾燥ブロッティング後に、フィルターを夫々１Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５の１．０ｍｌのプールに３分間入れることにより中和し、乾燥ブロットし、新しい緩衝液で再度中和した。これに続いて０．５Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５＋１．５ＭのＮａＣｌのプールで２回の同様のソーキング（夫々５分間）を行った。乾燥ブロッティング後に、そのＤＮＡをフィルター（上記のとおり）にＵＶ架橋し、フィルターを３Ｘ　ＳＳＣ約１００ｍｌ＋０．１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ中で洗浄した（２５℃、１００ｒｐｍ）（４回、夫々の洗浄について夫々新しい溶液で３０分間）。次いでそれらを２時間にわたって６５℃、５０ｒｐｍで最小容積のプレハイブリダイゼーション溶液［６Ｘ　ＳＳＣ＋夫々１％ｗ／ｖのフィコール４００（ファーマシア）、ポリビニルピロリドン（平均Ｍ．Ｗ．３６０，０００；シグマ）及びウシ血清アルブミンフラクションＶ；（シグマ）］に入れた。プレハイブリダイゼーション溶液を除去し、ライブラリー膜の先のハイブリダイゼーションから保存されており、９５℃で５分間変性されたＨＢ１４　^３２Ｐ標識プローブで置換した。５０ｒｐｍで振とうしなからハイブリダイゼーションを６０℃で１６時間行った。
【０１１２】
標識プローブ溶液の除去後に、膜を２５℃（５０ｒｐｍ、１５分間）で３Ｘ　ＳＳＣ（夫々約１５０ｍｌの洗浄液）中て３回洗浄した。次いてそれらを０．２５Ｘ　ＳＳＣ＋０．２％のＳＤＳ（最小ｈｙｂ洗浄液）中で６８℃で３時間洗浄し（５０ｒｐｍ）、１．５時間にわたって２５℃で上記のＸ線フィルムに露出した（無エンハンサースクリーン）。この露出はコスミド分離物２２Ｇ１２、２５Ａ１０、２６Ａ５、及び２６Ｂ１０について非常に強いハイブリダイゼーションシグナルを明らかにし、またコスミド分離物８Ｂ１０では非常に弱いシグナルを明らかにした。シグナルは陰性対照（ｐＷＥ１５）コロニーでは見られず、非常に強いシグナルが実験サンプルで同時に処理された陽性対照膜（ＰＣＲ産物のＧＺ４分離物を含むＤＨ５α細胞）で見られた。
【０１１３】
ｔｃａＢ 遺伝子の特定のゲノムフラグメントの増幅
精製されたＴｃａＢ_ｉペプチドフラクションについて決定されたＮ末端アミノ酸配列（本明細書中配列番号３として開示される）に基いて、縮重オリゴヌクレオチドのプール（プールＰ８Ｆ）をペプチドＴｃａＣについて記載されたようにして合成した。決定されたアミノ酸配列及び相当する縮重ＤＮＡ配列を以下に示し、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴは通常のＤＮＡ塩基であり、Ｉはイノシンを表す。

縮重オリゴヌクレオチドの別の組を合成し（プールＰ８．１０８．３Ｒ）、ＴｃａＢ_ｉ−ＰＴ１０８内部ペプチドの決定されたアミノ酸配列（本明細書中配列番号２０として開示される）についてコードストランドの相補物に相当した。

【０１１４】
ホットスタート５０チューブＴＭ（モレキュラー・パイオープロダクツ社，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用してこれらのオリゴヌクレオチドをＰＣＲのプライマーとして使用してフォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）株Ｗ−１４（上記を参照のこと）から調製されたゲノムＤＮＡから特定のＤＮＡフラグメントを増幅した。典型的な反応液（５０μｌ）は、１ｘＧｅｎｅＡｍｐ^Ｒ緩衝液中にそれぞれ２ｎモルのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰとともに夫々２５ｐモルのプライマープールＰ８Ｆ及びＰ８．１０８．３Ｒ（下層）、並びに１ｘＧｅｎｅｍＡＭｐ^Ｒ緩衝液中にゲノム鋳型ＤＮＡ２３０ｎｇ、それぞれ８ｎモルのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、および２．５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ^Ｒポリメラーゼ（上層）を含んでいた。増幅をＴｃａＣペプチドについて記載されたようにして３５サイクルにより行った。増幅産物をＴＥＡ緩衝液中で０．７％ｗ／ｖのシーケム^ＲＬＥアガロース（ＦＭＣ）による電気泳動により分析した。推定サイズ１６００ｂｐの特定産物を観察した。
４種のこのような反応液をプールし、増幅されたＤＮＡをＴｃａＣペプチドについて記載されたようにしてＱｉａｅｘキットにより１．０％のシーケム^ＲＬＥゲルから抽出した。Ｐ８Ｆプライマープール及びＰ８．１０８．３Ｒプライマープールを使用して、抽出されたＤＮＡを配列決定（ＰＲＩＳＭ^ＴＭ配列決定キット）の鋳型として直接使用した。
【０１１５】
夫々の反応液は鋳型ＤＮＡ約１００ｎｇ及び２５ｐモルの一種のプライマープールを含み、ＴｃａＣペプチドについて記載されたようにして通常のプロトコルに従って処理した。Ｐ８Ｆプライマーの延長から誘導された配列の分析は短いＤＮＡ配列（及びコードされたアミノ酸配列）を明らかにした。

これは配列番号３（ＴｃａＢ_ｉ）として開示されたＮ末端ペプチド配列の一部に相当する。
【０１１６】
ＴｃａＢ _ｉ ペプチド遺伝子特異性プローブの標識
ゲル精製されたＴｃａＢ_ｉ　ＤＮＡフラグメント約５０ｎｇを上記のようにして^３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識し、取り込まれなかった放射性同位元素をＮＩＣＫカラム^Ｒ（ファルマシア）中の通過により除去した。標識されたＤＮＡの比活性を測定したところ、６ｘ１０^９ｄｐｍ／μｇであった。この標識されたＤＮＡを使用してＴｃａＣ−ペプチド特異性プローブにハイブリッドを形成したゲノムライブラリーの員から調製されたコロニー膜を探査した。
ＴｃａＣ−プローブライブラリースクリーン（上記を参照のこと）で同定された１２のコロニーを含む膜を毎回約３０分間で１リットルの０．１Ｘ　ＳＳＣ＋０．１％のＳＤＳ中で２回沸騰することにより放射性ＴｃａＣ−特異性標識からストリッピングした。放射性標識の除去を６時間のフィルム露出でチェックした。次いでストリッピングされた膜を先に調製したＴｃａＢ_ｉペプチド特異性プローブとともにインキュベートした。標識ＤＮＡを１０分間の沸騰により変性し、次いで６０℃で”最小ｈｙｂ”溶液１００ｍｌ中で１時間インキュベートされたフィルターに添加した。この温度で一夜のハイブリダイゼーション後に、プローブ溶液を除去し、フィルターを以下のようにして洗浄した（全て、０．３Ｘ　ＳＳＣ＋０．１％のＳＤＳ中）。２５℃で５分間にわたって１回、新しい溶液中で６０℃で１時間にわたって１回、そして新しい溶液中で６３℃で１時間にわたって１回。通常の操作によるＸ線フィルムへの１．５時間の露出後に、４つの強くハイブリッドを形成するコロニーを観察した。これらは、ＴｃａＣ−特異性プローブによれば、分離物２２Ｇ１２、２５Ａ１０、２６Ａ５、及び２６Ｂ１０であった。
同ＴｃａＢ_ｉプローブ溶液を等容積（約１００ｍｌ）の”最小ｈｙｂ”溶液で希釈し、次いでゲノムライブラリーの８００の員を含む膜をスクリーニングするのに使用した。
上記のようなハイブリダイゼーション、洗浄、そしてＸ線フィルムへの露出後に、４種のコスミドクローン２２Ｇ１２、２５Ａ１０、２６Ａ５、及び２６Ｂ１０のみがこのプローブに強くハイブリッドを形成することがわかった。
【０１１７】
ＴｃａＣ ペプチド及び ＴｃａＢ _ｉ ペプチドをコードする遺伝子を含むサブクローンの単離、及びそのＤＮＡ塩基配列の決定
株ＸＬ１ブルーＭＲ中の３種のハイブリダイゼーション陽性コスミドを３０℃でＴＢ−Ａｍｐ_１００中で一夜振とう（２００ｒｐｍ）しながら増殖させた。細胞を遠心分離により回収した後、製造業者のプロトコルに従って市販のキット（ＢＩＧｐｒｅｐ^ＴＭ、５プライム３プライム社，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）を使用してコスミドＤＮＡを調製した。一種のコスミド、２６Ａ５のみをこの操作により成功裏に単離した。制限酵素ＥｃｏＲ　１（ＮＥＢ）で消化し、ゲル電気泳動により分析した時、およそのサイズ１４、１０、８（ベクター）、５、３．３、２．９、及び１．５ｋｂｐのフラグメントを検出した。３種の同株からコスミドＤＮＡを単離しようとする第二の試み（８ｍｌの培養；ＴＢ−Ａｍｐ_１００、３０℃）は沸騰ミニプレプ方法（ＥｖａｎｓＧ．及びＧ．Ｗａｈｌ．，１９８７，”Ｃｏｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｗａｌｋｉｎｇ　ａｎｄ　ｒａｐｉｄｒｅｓｔｒｉ−ｃｔｉｏｎ　ｍａｐｐｉｎｇ”，Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ，１５２巻，Ｓ．Ｂｅｒｇｅｒ及びＡ．Ｋｉｍｍｅｌ編集，６０４−６１０頁）を利用した。
【０１１８】
一種のコスミド、２５Ａ　１０のみをこの方法により成功裏に単離した。制限酵素ＥｃｏＲ　１（ＮＥＢ）で消化し、ゲル電気泳動により分析した時、このコスミドはコスミド２６Ａ５で先に見られたのと同じ断片化パターンを示した。
２６Ａ５コスミドＤＮＡ０．１５μｇのサンプルを供給業者のプロトコルによりＥ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α細胞（ギブコＢＲＬ）５０ｍｌを形質転換するのに使用した。その株の単一コロニー分離物をＴＢ−Ａｍｐ_１００　４ｍｌに接種し、３７℃で８時間増殖させた。クロラムフェニコールを２２５μｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、インキュベーションを更に２４時間続け、次いで細胞を遠心分離により回収し、−２０℃で凍結した。２６Ａ５コスミドＤＮＡの単離は全ての容積を５０％増加し、夫々の工程でボルテックスではなく攪拌または軽い混合を用いることにより改良された通常のアルカリ溶解ミニプレプ（Ｍａｎｉａｔｉｓらの上記引用文献、３８２頁）によるものであった。ＤＮＡペレットを７０％のエタノール中で洗浄した後、それを２５μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ（ベーリンガー・マンハイム）を含むＴＥに溶解した。
【０１１９】
ＧＺ４ 誘導プローブ及び ＴｃａＢ _ｉ ブローブにハイブリッドを形成する ＥｃｏＲ　１ フラグメントの同定
コスミド２５Ａ１０（ＸＬ１ブルーＭＲ細胞から）約０．４μｇ及びコスミド２６Ａ５（クロラムフェニコール増幅されたＤＨ５α細胞から）約０．５μｇを約１５単位のＥｃｏＲ　１（ＮＥＢ）で８５分間にわたって夫々消化し、一夜凍結し、次いで６５℃で５分間加熱し、０．７％のアガロースゲル中で電気泳動にかけた（シーケム^ＲＬＥ、１ｘＴＥＡ、８０ボルト、９０分間）。そのＤＮＡを上記のようにして臭化エチジウムで染色し、紫外線のもとに写真撮影した。コスミド２５Ａ１０のＥｃｏＲ　１消化産物は完全消化であったが、コスミド２６Ａ５のサンプルはこれらの条件下で部分消化されたにすぎなかった。ＤＮＡフラグメントを含むアガロースゲルをデプリネーション（ｄｅｐｕｒｉｎａｔｉｏｎ）、変性及び中和にかけ、続いて全てＡｕｓｕｂｅｌら（ＣＰＭＢ）上記引用文献）の節２．９に記載されたようにして高塩（２０Ｘ　ＳＳＣ）プロトコルを使用してマグナＮＴナイロン膜にサザンブロッティングした。次いで移入されたＤＮＡを前記のようにしてナイロン膜にＵＶ架橋した。
【０１２０】
プラスミド分離物ＧＺ４のインサートに相当するＴｃａＣペプチド特異性ＤＮＡフラグメントを上記のようにして１００ｍｌの反応容積でＰＣＲにより増幅した。３種のこのような反応からの増幅産物をプールし、上記のようにしてＱｉａｅｘキットにより１％のＧＴＧＲアガロースゲルから抽出し、フルオロメトリーにより定量した。上記のようにしてハイ・プライム・ラベリング・ミックス（ベーリンガー・マンハイム）を使用して、ゲル精製されたＤＮＡ（１００ｎｇ）を６．３４ｘ１０^８ｄｐｍ／μｇの比活性に^３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識した。
^３２Ｐ標識されたＧＺ４プローブを１０分間沸騰し、次いで”最小ｈｙｂ”緩衝液に添加し（１ｎｇ／ｍｌで）、消化されたコスミドＤＮＡフラグメントを含むサザンブロット膜を添加し、５０ｒｐｍで穏やかに振とうしながら６０℃で４時間インキュベートした。次いで膜を夫々約５分間で２５℃で３回洗浄し（最小ｈｙｂ洗浄液）、続いて夫々３０分間にわたって６０℃で２回洗浄した。ブロットを約３０分間にわたって−７０℃でフィルム（エンハンサースクリーンを使用）に露出した。ＧＺ４プローブはこれらの２種のコスミド、２６Ａ５及び２５Ａ１０の両方の５．０ｋｂｐ（見掛サイズ）ＥｃｏＲ　１フラグメントに強くハイブリッドを形成した。
【０１２１】
膜を０．１Ｘ　ＳＳＣ＋０．１％のＳＤＳ中て約３０分間沸騰することにより放射能をストリッピングし、放射性標識の不在をフィルムへの露出によりチェックした。次いでそれをコロニー膜（上記）をスクリーニングするのに先に使用された”最小ｈｙｂ”緩衝液中で６０℃で３．５時間にわたって（変性）ＴｃａＢ_ｉプローブとハィブリッドを形成し、前記のようにして洗浄し、二つのエンハンサースクリーンを使用して−７０℃で４０分間にわたってフィルムに露出した。両方のコスミドでは、ＴｃａＢ_ｉプローブが約５．０ｋｂｐのＥｃｏＲ　１フラグメントと軽くハイブリッドを形成し、約２．９ｋｂｐのフラグメントと強くハイブリッドを形成した。
前記のコスミド２６Ａ５　ＤＮＡ（ＤＨ５α細胞から）のサンプルをＤＮＡの起源（これから関係するバンドをサブクローン化する）として使用した。このＤＮＡ（２．５μｇ）を３０μｌの合計容積で１．５時間にわたって約３単位のＥｃｏＲＩ　１（ＮＥＢ）で消化して、ゲル電気泳動により確認して部分消化産物を得た。ｐＢＣ　ＫＳ（＋）ＤＮＡ（ストラタゲン）１０μｇを２０μｌの合計容積で１．５時間にわたって２０単位のＥｃｏＲＩ　１で消化して、電気泳動により確認して完全消化をもたらした。両方のＥｃｏＲＩ　１切断ＤＮＡ製剤を水で５０μｌに希釈し、夫々に等容積のＰＣＩを添加し、その懸濁液を穏やかに混合し、小型遠心分離機中で回転させ、水性上澄みを回収した。ＤＮＡをエタノール１５０μｌにより沈殿させ、その混合物を−２０℃で一夜置いた。遠心分離及び乾燥後に、ＥｃｏＲ１消化したｐＢＣ　ＫＳ（＋）をＴＥ１００μｌに溶解した。部分消化された２６Ａ５をＴＥ２０μｌに溶解した。ＤＮＡ回収をフルオロメトリーによりチェックした。
【０１２２】
別々の反応において、ＥｃｏＲ　１消化したｐＢＣ　ＫＳ（＋）ＤＮＡ約６０ｎｇを部分消化されたコスミド２６Ａ５　ＤＮＡ約１８０ｎｇまたは２７０ｎｇとつないだ。Ｔ４リガーゼ及びニュー・イングランド・バイオラブズからの緩衝液を使用して、結合を２０μｌの容積で１５℃で５時間行った。無菌ＴＥで１００μｌに希釈された結合混合物を供給業者の指示に従って凍結したコンピテントＤＨ５α細胞（ギブコＢＲＬ）を形質転換するのに使用した。種々の量（２５〜２００μｌ）の形質転換された細胞を、１ｍＭのＩＰＴＧ及び５０ｍｇ／ｌのＸ−ｇａｌを含む新たに調製した固体ＬＢ−Ｃａｍ_３５培地に塗布した。プレートを３７℃で約２０時間インキュベートし、次いで約３時間にわたって暗所で冷却して挿入選択のために着色を強化し。白色のコロニーを同組成のパッチプレートに取り、３７℃で一夜インキュベートした。
選択されたパッチプレートの夫々の２種のコロニーリフトを以下のようにして調製した。白色のコロニーを新しいプレートに取った後、円形のマグナＮＴナイロン膜をパッチプレートに押しつけ、膜を持ち上げ、ライブラリーコロニー膜について上記されたようにして変性、中和及びＵＶ架橋にかけた。過剰の細胞デブリをティッシュで軽くふき取ることを含み、架橋されたコロニーリフトを激しく洗浄した。”最小ｈｙｂ”プロトコルに従って、一つの組を前記ＧＺ４（ＴｃａＣ）プローブ溶液とハイブリッドを形成し、他の組を前記ＴｃａＢ_ｉプローブ溶液とハイブリッドを形成し、続いてライブラリーコロニー膜について記載されたようにして洗浄し、フィルムに露出した。ＧＺ４プローブのみ、ＧＺ４プローブ及びＴｃａＢ_ｉプローブの両方、またはＴｃａＢ_ｉプローブのみとハイブリダイゼーションシグナルを示すコロニーを更なる研究のために選択し、細胞を前記のＩＰＴＧ及びＸ−ｇａｌを含むＬＢ−Ｃａｍ_３５培地に単一コロニー単離のためにストリーキングした。
【０１２３】
１６種の異なる分離物からの約３５の単一コロニーを液体ＬＢ−Ｃａｍ_３５培地に取り、３７℃で一夜増殖させた。細胞を遠心分離により回収し、プラスミドＤＮＡをＭａｎｉａｔｉｓら（上記引用文献、３６８頁）に従って通常のアルカリ溶解ミニプレプにより単離した。ＤＮＡペレットをＴＥ＋２５μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡに溶解し、ＤＮＡ濃度をフルオロメトリーにより測定した。ＥｃｏＲ　１消化パターンをゲル電気泳動により分析した。下記の分離物を有益なものとして採取した。分離物Ａ１７．２は再度つながれたｐＢＣ　ＫＳ（＋）のみを含み、（陰性）対照に使用した。分離物Ｄ３８．３及びＣ４４．１は夫々ｐＢＣ　ＫＳ（＋）に挿入された２．９ｋｂｐのＴｃａＢ_ｉとハイブリッドを形成するＥｃｏＲ　１フラグメントのみを含む。ｐＤＡＢ２０００及びｐＤＡＢ２００１と称されるこれらのプラスミドが夫々図２に示される。
分離物Ａ３５．３はｐＢＣ　ＫＳ（＋）に挿入された約５ｋｂｐのＧＺ４とハイブリッドを形成するＥｃｏＲ　１フラグメントのみを含む。このプラスミドをｐＤＡＢ２００２と称した（また、図２に示される）。これらの分離物はＤＮＡ配列決定の鋳型を与えた。
前記ＢＩＧｐｒｅｐ^ＴＭキットを使用して、プラスミドｐＤＡＢ２０００及びｐＤＡＢ２００１を調製した。培養物（３０ｍｌ）をＴＢ−Ｃａｍ_３５中で２のＯＤ_６００まで一夜増殖し、次いでプラスミドを製造業者の指示に従って単離した。ＤＮＡペレットを夫々１００μｌのＴＥに再度溶解し、サンプル保全性をＥｃｏＲ　１消化及びゲル電気泳動分析によりチェックした。
【０１２４】
配列決定反応を二重反復試験で実験し、一つの反復試験は鋳型としてｐＤＡＢ２０００ＤＮＡを使用し、他の反復試験は鋳型としてｐＤＡＢ２００１　ＤＮＡを使用した。ＧＺ４／ＨＢ１４　ＤＮＡの配列決定について上記されたように、ジデオキシ色素ターミネーターサイクル配列決定方法を使用して、反応を行った。初期配列決定実験はプライマーとして上記ＬａｃＺプライマー及びＴ７プライマー、＋ＴｃａＢ_ｉ　ＰＣＲ増幅産物の決定された配列をベースとするプライマー（ＴＨ１＝ＡＴＴＧＣＡＧＡＣＴＧＣＣＡＡＴＣＧＣＴＴＣＧＧ、ＴＨ１２＝ＧＡＧＡＧＴＡＴＣＣＡＧＡＣＣＧＣＧＧＡＴＧＡＴＣＴＧ）を使用した。　夫々の配列決定アウトプットの整列及び編集後に、夫々をパーキン・エルマー・アプライド・バイオシステムズ部門ＳｅｑＥｄ　６７５ソフトウェアにより解読されるようなクロマトグラフィーデータの積分に応じて２５０〜３５０塩基にトランケートした。新規プライマーに適した配列を選択することにより、その後の配列決定”工程”を行った。二三の例外があるが、プライマー（上記のようにして合成した）は５０％　Ｇ＋Ｃ組成を有し、長さが２４塩基であった。この方法による配列決定を約２．９ｋｂｐのＥｃｏＲ　１フラグメントの両方のストランドについて行った。
【０１２５】
ＤＮＡ配列決定の鋳型として更に利用するために、分離物ｐＤＡＢ２００２からのプラスミドＤＮＡをＢＩＧｐｒｅｐ^ＴＭキットにより調製した。上記のようにして配列決定反応を行い、分析した。初期に、Ｔ３プライマー（ｐＢＳ　ＳＫ（＋）塩基７７４−７９６：ＣＧＣＧＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ）及びＴ７プライマー（ｐＢＳ　ＳＫ（＋）塩基６２１−６４３：ＧＣＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ）を使用して隣接ベクター配列からインサートＤＮＡまて読み取る配列決定反応を開始した。プライマーの別の組（ＧＺ４Ｆ：ＧＴＡＴＣＧＡＴＴＡＣＡＡＣＧＣＴＧＴＣＡＣＴＴＣＣＣ；ＴＨ１３：ＧＧＧＡＡＧＴＧＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＡＡＴＣＧＡＴＡＣ；ＴＨ１４：ＡＴＧＴＴＧＧＧＴＧＣＧＴＣＧＧＣＴＡＡＴＧＧＡＣＡＴＡＡＣ；及びＬＷ−１−２０４：ＧＧＧＡＡＧＴＧＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＡＡＴＣＧＡＴＡＣ）をつくって内部配列から開始し、これらをサブクローン化ＴｃａＣ−ペプチドＰＣＲ産物の縮重オリゴヌクレオチド媒介配列決定により前もって決定した。配列決定の初期ラウンド中に生じたデータから、プライマーの新規な組を設計し、約５ｋｂｐのフラグメントの完全長をウォーク（ｗａｌｋ）するのに使用した。合計５５オリゴプライマーを使用して、連続配列の合計４８３２ｂｐの同定を可能にした。
【０１２６】
ｐＤＡＢ２００２のＥｃｏＲ　１フラグメントインサートのＤＮＡ配列をｐＤＡＢ２０００／ｐＤＡＢ２００１分離物の決定された配列の一部と組み合わせる場合、合計６００５ｂｐの連続配列を生じた（本明細書中、配列番号２５として開示される）。長い読み取り枠を相当するアミノ酸に翻訳した場合、その配列はメチオニン残基（翻訳の開始）の直後に塩基１９−７５によりコードされたＴｃａＢ_ｉ　Ｎ末端ペプチド（配列番号３として開示される）を明らかに示す。上流に潜在的リボソーム結合部位（塩基１−９）があり、下流に、ＴｃａＢ_ｉ−ＰＴ１５８内部ペプチド（本明細書中、配列番号１９として開示される）が塩基１６６−２２８でコードされる。更に下流に、同読み取り枠中に、塩基１７３８−１７７３で、ＴｃａＢ_ｉ−ＰＴ１０８内部ペプチドをコードする配列（本明細書中、配列番号２０として開示される）が存在する。また、同読み取り枠中に、塩基１８９７−１９２３で、ＴｃａＢ_ｉｉＮ末端ペプチド（本明細書中、配列番号５として開示される）がコードされ、読み取り枠がヌクレオチド３５８６−３５８８にある翻訳終止コドンまで中断されないで存続する。
【０１２７】
ＴｃａＢ_ｉ−ＰＴ１０８をコードする配列の末端とＴｃａＢ_ｉｉコード領域の開始の間のイン−フレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）終止コドンの欠如、及びＴｃａＢ_ｉｉコード領域の直ぐ上流の認識できるリボソーム結合部位の欠如は、ペプチドＴｃａＢ_ｉｉ及びＴｃａＢ_ｉが配列番号２５中の塩基対１６で開始する３５６７ｂｐの単一読み取り枠によりコードされ、おそらく後翻訳開裂により１１８９アミノ酸（１３１，５８６ダルトン；本明細書中、配列番号２６として開示される）の単一の一次遺伝子産物から誘導されることを示す。ＴｃａＢ_ｉｉＮ末端ペプチドに直ぐに先行するアミノ酸がペプチドＴｃａＢ_ｉのＣ末端アミノ酸に相当する場合、ＴｃａＢ_ｉｉ（６２７アミノ酸）の予想質量はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより観察されたサイズ（６８ｋＤａ）より若干高く、７０，８１４ダルトンである（本明細書中、配列番号２８として開示される）。このペプチドは１８８１塩基対の連続ストレッチ（本明細書中、配列番号２７として開示される）によりコードされるであろう。ＴｃａＢ_ｉの天然Ｃ末端はＴｃａＢ_ｉ−ＰＴ１０８のＣ末端に若干近くにあるものと考えられる。ＰＴ１０８の分子量［３．４３８ｋＤａにのペプチドのＮ末端アミノ酸配列分析中に測定］は３０アミノ酸のサィズを予測する。ＴｃａＢ_ｉコード領域のＣ末端［配列番号２８の位置６０４にあるＧｌｕ］を指示するのにこのペプチドのサイズを使用して、ＴｃａＢ_ｉの誘導サイズは、更に実験上の観察と一致して、６０４アミノ酸または６８，４６３ダルトンであることが測定される。
【０１２８】
１６８６塩基対のＴｃａＢ_ｉｉペプチドコード領域（本明細書中、配列番号２９として開示される）の翻訳は６０，７８９ダルトンの予想質量を有する５６２アミノ酸（本明細書中、配列番号３０として開示される）のタンパク質を生じ、これは観察された６１ｋＤａと良く一致する。
潜在的リボソーム結合部位（塩基３６３３−３６３８）はｔｃａＢ読み取り枠の終止コドンの４８ｂｐ下流に見られる。塩基３６４５−３６７７に、ペプチドＴｃａＣのＮ末端をコードする配列（配列番号２として開示される）が見られる。このＮ末端ペプチドにより開始される読み取り枠は塩基６００５まで中断されないで存続する（２３６１塩基対、本明細書中、配列番号３１の最初の２３６１塩基対として開示される）。完全ＴｃａＣペプチド（見掛サイズ約１６５ｋＤａ；約１５００アミノ酸）をコードする遺伝子（ｔｃａＣ）は約４５００ｂｐを含むであろう。
また、コスミド２６Ａ５のクローン化ＥｃｏＲ　１フラグメントを含む別の分離物、Ｅ２０．６を前記ＧＺ４プローブ及びＴｃａＢ_ｉプローブに対するその相同性により同定した。この株により宿されたプラスミド（ｐＤＡＢ２００４、図２）のＤＮＡのＥｃｏＲ　１消化産物のアガロースゲル分析は推定サイズ２．９、５、及び３．３ｋｂｐのインサートフラグメントを明らかにした。プラスミドｐＤＡＢ２００２の配列から指示されたプライマーから開始されたＤＮＡ配列分析は、ｐＤＡＢ２００４の３．３ｋｂｐのＥｃｏＲ　１フラグメントがｐＤＡＢ２００２に代表された５ｋｂｐのＥｃｏＲ　１フラグメントに隣接して存在することを明らかにした。
【０１２９】
ｐＤＡＢ２００２中に発見された２３６１塩基対読み取り枠はｐＤＡＢ２００４中の別の２０９４塩基［本明細書中、配列番号３１の塩基対２３６２〜４４５８として開示される）について中断されないで存続する。親コスミド２６Ａ５　ＤＮＡを鋳型として使用するＤＮＡ配列分析がその読み取り枠の連続性を確認した。要するに、その読み取り枠（ＴｃａＣ配列番号３１）は４４５５塩基対を含み、かつ１４８５アミノ酸［本明細書中、配列番号３２として開示される］のタンパク質（ＴｃａＣ）をコードする。１６６，２１４ダルトンの計算分子サイズはＴｃａＣペプチドの推定サイズ（１６５ｋＤａ）と一致し、誘導アミノ酸配列はＴｃａＣ　Ｎ末端配列［配列番号２］について開示されたものと正確に適合する。
発見された配列中の縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを設計するのに使用された配列番号１７に相当するアミノ酸配列の欠如は、分離物ＧＺ４及びＨＢ１４（これらは初期ライブラリースクリーンにおいてプローブとして使用された）中に見られるＰＣＲ産物の発生がその縮重プール中のプライマーの一つによる逆ストランドプライミングにより偶発的に生じたことを示す。更に、誘導タンパク質配列は本明細書中配列番号１８として開示された内部フラグメントを含まない。これらの配列は、プラスミドｐＤＡＢ２００４がＴｃａＣペプチドの完全コード領域を含むことを明らかにする。
【０１３０】
実施例９　ＴｃｂＡ _ｉｉ ペプチドをコードする遺伝子のフォトラブダス 　 ゲノムライブラリーのスクリーニング
この実施例はＴｃｂＡ_ｉｉペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡクローンを同定するのに使用した方法、その遺伝子の単離、及びその部分ＤＮＡ塩基配列の決定を記載する。
プライマー及び ＰＣＲ 反応　昆虫活性製剤のＴｃｂＡ_ｉｉポリペプチドは約２０６ｋＤａである。このペプチドのＮ末端のアミノ酸配列が配列番号１として開示される。このアミノ酸配列の一部をコードするために、縮重オリゴヌクレオチドプライマーの４種のプール（”フォワード（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー”：ＴＨ−４、ＴＨ−５、ＴＨ−６、及びＴＨ−７）を実施例８に記載されたようにして合成し、以下に示す。
【０１３１】
【表１２】
表１１．

【０１３２】
加えて、内部ペプチド製剤（ＴｃｂＡ_ｉｉ−ＰＴ８１）の一次配列（”ａ”）及び二次配列（”ｂ”）を決定し、夫々、本明細書中、配列番号２３及び配列番号２４として開示する。以下に示されるように、配列番号２３のペプチドの−部をコードする配列の逆補体をコードするために、縮重オリゴヌクレオチドの４種のプール（”リバース（Ｒｅ−ｖｅｒｓｅ）プライマー”：ＴＨ−８、ＴＨ−９、ＴＨ−１０及びＴＨ−１１）を同様に設計し、合成した。
【０１３３】
【表１３】
表１２．

【０１３４】
これらのプライマーの組をＰＣＲ反応に使用して、実施例６で調製されたゲノム　フォトラブダス・ルミネセンスＷ−１４　ＤＮＡからＴｃｂＡ_ｉｉをコードする遺伝子フラグメントを増幅した。ＡｍｐｌｉＷａｘ^ＴＭゲム（ｇｅｍｓ）並びにその他のパーキン・エルマー試薬及びプロトコルを使用して、全てのＰＣＲ反応を”ホット・スタート”技術を用いて行った。典型的には、ＭｇＣｌ_２、ｄＮＴＰ、１０ｘＧｅｎｅＡｍｐ^Ｒ　ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、及び、プライマーの混合物（全容積１１μｌ）を、単一ワックスビードを含む管に添加した［１０　ｘＧｅｎｅＡｍｐ^Ｒ　ＰＣＲ緩衝液ＩＩは１００ｍＭは１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、および５００ｍＭのＫＣｌを含む。管を２分間にわたって８０℃に加熱し、冷却した。ワックスシールの上に１０　ｘ　ＧｅｎｅＡｍｐ^Ｒ　ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、ＤＮＡ鋳型、及びＡｍｐｌｉＴａｑ^Ｒ　ＤＮＡポリメラーを含む溶液を添加した。ワックスシールの融解及び熱サイクルによる成分の混合後に、最終反応条件は、５０μｌの容積、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、夫々２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、１．２５ｍＭの単一フォワードプライマープール、１．２５μＭの単一リバースプライマープール、１．２５単位のＡｍｐｌｉＴＡｑ　ＤＮＡポリメラーゼ、及び１７０ｎｇの鋳型ＤＮＡであった。
反応液をサーモサイクラー（実施例８と同様）に入れ、下記のプログラムで実験した。
【０１３５】
【表１４】
表１３．

【０１３６】
縮重プライマープールを使用して、一連の増幅を三つの異なるアニーリング温度（５５℃、６０℃、６５℃）で行った。６５℃におけるアニーリングによる反応はアガロース電気泳動後に目視できる増幅産物を有していなかった。６０℃のアニーリングレジメを有し、プライマーＴＨ−５＋ＴＨ−１０を含む反応は、２．９ｋｂｐに相当する移動度を有する増幅産物を生じた。更に少ない量の２．９ｋｂｐの産物をプライマーＴＨ−７＋ＴＨ−１０を用いるこれらの条件下で生じた。反応を５５℃でアニールした場合、これらのプライマー対は更に多くの２．９ｋｂｐの産物を生じ、またこの産物をプライマー対ＴＨ−５＋ＴＨ−８及びＴＨ−５＋ＴＨ−１１により生じた。付加的な非常に不鮮明な２．９Ｋｂｐのバンドがプライマー対ＴＨ−７＋ＴＨ−８、ＴＨ−９、ＴＨ−１０、またはＴＨ−１１からの増幅産物を含むレーン中で見られた。
クローニング及びＤＮＡ配列決定に充分なＰＣＲ増幅産物を得るために、プライマーＴＨ−５＋ＴＨ−１０を使用して１０の別々のＰＣＲ反応を設定し、５５℃のアニーリング温度で上記条件を使用して行った。全ての反応液をプールし、２．９ｋｂｐの産物を上記のようにしてアガロースゲルからＱｉａｅｘ抽出により精製した。
ＴｃｂＡ_ｉｉ内部ペプチドについて決定された付加的な配列が本明細書中配列番号２１及び配列番号２２として開示される。前記のように、これらのペプチドのアミノ酸配列の一部をコードする配列の逆補体に相当する縮重オリゴヌクレオチド（リバースプライマーＴＨ−１７及びＴＨ−１８）をつくった。
【０１３７】
【表１５】
表１４．

【０１３８】
【表１６】
表１５

【０１３９】
縮重オリゴヌクレオチドＴＨ−１８及びＴＨ−１７を、鋳型としてのフォトラブダス・ルミネセンスＷ−１４　ＤＮＡ及び５−（フォワード）プライマーとしてのＴＨ−４、ＴＨ−５、ＴＨ−６、またはＴＨ−７を用いる増幅実験に使用した。これらの反応は夫々約４ｋｂｐ及び４．５ｋｂｐの産物を増幅した。これらのＤＮＡをアガロースゲルからナイロン膜に移し、ＴＨ−５＋ＴＨ−１０プライマー対により増幅された２．９ｋｂｐの産物から調製された^３２Ｐ−標識プローブ（上記のとおり）とハイブリッドを形成した。４ｋｂｐ及び４．５ｋｂｐの増幅産物の両方が２．９ｋｂｐのプローブに強くハイブリッドを形成した。これらの結果を使用して図３に示されたようなＴｃｂＡ_ｉｉ内部ペプチド配列を規制する地図をつくった。プライマー間のおよその距離を図３にヌクレオチド数で示す。
【０１４０】
２．９ｋｂｐ の ＴｃｂＡ _ｉｉ をコードするフラグンントのＤＮＡ配列
精製した２．９ｋｂｐのフラグメント（先に調製した）約２００ｎｇをエタノールで沈殿させ、水１７ｍｌに溶解した。２５ｐモルのＴＨ−５プールをプライマーとして用いて、この半分を配列決定鋳型として使用し、別の半分をＴＨ−１０プライミングの鋳型として使用した。配列決定反応は実施例８に示されたとおりであった。ＴＨ−１０プライマープールを使用して、信頼できる配列を生じなかった。しかしながら、ＴＨ−５プライマープールとの反応は、以下に開示された配列を生じた。

この配列に基いて、配列決定プライマー（ＴＨ−２１、５’−ＣＣＧＧＧＣＧＡＣＧＴＴＴＡＴＣＴＡＧＧ−３’）を設計し、補体塩基１２０−１３９を反転し、ゲル精製した２．９ｋｂｐのＴｃｂＡ_ｉｉをコードするＰＣＲフラグメントの５’末端（即ち、ＴＨ−５末端）に向かって重合を開始した。決定された配列を以下に示し、ＴｃｂＡ_ｉｉ配列番号１の生化学的に決定されたＮ末端ペプチド配列と比較する。
【０１４１】
ＴｃｂＡ _ｉｉ ２．９ｋｂｐ　ＰＣＲ フラグメント配列確認
［下線を施したアミノ酸＝縮重オリゴヌクレオチドによりコードされる］

生化学的に決定されたアミノ酸配列に対する誘導アミノ酸配列の相同性から、２．９ｋｂｐ　ＰＣＲフラグメントがＴｃｂＡコード領域に相当することが明らかである。次いでこの２．９ｋｂｐフラグメントをハイブリダイゼーションプローブとして使用してＴｃｂＡ_ｉｉをコードする遺伝子を含むコスミドについて実施例８で調製されたフォトラブダスＷ−１４ゲノムライブラリーをスクリーニングした。
【０１４２】
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ コスミドライブラリーのスクリーニング
実施例８に記載されたようなベーリンガー・マンハイムのハイ・プライム標識キットを使用して、２．９ｋｂｐのゲル精製したＰＣＲフラグメントを^３２Ｐで標識した。コスミドライブラリーからの約８００のコロニーのレムナント（ｒｅｍｎａｎｔ）を含むフィルターを前記（実施例８）のようにしてスクリーニングし、陽性クローンを単離コロニーについてストリーキングし、再度スクリーニングした。３種のクローン（８Ａ１１、２５Ｇ８、及び２６Ｄ１）は幾つかのスクリーニング工程及び結合工程により陽性結果を生じた。ＴｃｂＡ_ｉｉ特異性プローブのハイブリダイゼーションが実施例８で同定された４種のコスミド（これらはｔｃａＢ遺伝子及びｔｃａＣ遺伝子を含む）のいずれでも観察されなかった。コスミド８Ａ１１、２５Ｇ８、及び２６Ｄ１からのＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ（単独または互いの組み合わせ）で消化し、フラグメントをアガロースゲルで分離し、実施例８に記載されたようにしてナイロン膜に移した。
【０１４３】
膜を４．５ｋｂｐフラグメント（プライマーＴＨ−５＋ＴＨ−１７によるＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓゲノムＤＮＡの増幅により生成した）から調製された^３２Ｐ標識プローブとハイブリッドを形成した。コスミドＤＮＡ８Ａ１１及び２６Ｄ１から生じたパターンは同膜について同様に切断されたゲノムＤＮＡで生じたパターンと同一であった。コスミド８Ａ１１及び２６Ｄ１はゲノムＴｃｂＡ_ｉｉをコードする遺伝子座の正確な代表であることが結論される。しかしながら、コスミド２５Ｇ８はゲノムＤＮＡよりわずかに大きい単一ＢｇｌＩＩフラグメントを有する。これはベクター内のインサートの位置決めに由来し得る。
【０１４４】
ｔｃｂＡ をコードする遺伝子のＤＮＡ配列
コスミド２６Ｄ１の膜ハイブリダイゼーション分析は、４．５ｋｂｐプローブが単一の大きいＥｃｏＲ　１フラグメント（９ｋｂｐより大きい）にハイブリッドを形成することを明らかにした。このフラグメントをゲル精製し、実施例８に記載されたようにしてｐＢＣ　ＫＳ（＋）のＥｃｏＲ　１部位につないでプラスミドｐＢＣ−Ｓ１／Ｒ１を生成した。実施例８に記載された操作を使用して、このプラスミドのインサートＤＮＡの部分ＤＮＡ配列を隣接ベクター配列からの”プライマーウォーキング”により決定した。更に別の配列を先に決定された配列から設計された新規なオリゴヌクレオチドからの延長により生じた。別法により同定されたｔｃｂＡ遺伝子について決定されたＤＮＡ配列（下記の実施例１２に記載されたように本明細書中配列番号１１として開示される）と比較した時に、完全相同性がヌクレオチド１−２７２、３１９−８２６、２５７８−３０３６、及び３０６８−３５４０（合計塩基＝１７１２）について見られた。両方のアプローチがＴｃｂＡ_ｉｉペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを同定するのに使用し得ることが結論された。
【０１４５】
ｔｃｂＡ 遺伝子の誘導アミノ酸配列の分析
配列番号１１として同定されたＤＮＡフラグメントの配列は、誘導アミノ酸配列が本明細書中配列番号１２として開示されるタンパク質をコードする。幾つかの特徴がＴｃｂＡ_ｉｉタンパク質をコードする配列としてのその遺伝子の同定を証明する。ＴｃｂＡ_ｉｉＮ末端ペプチド（配列番号１：Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｌａ）はアミノ酸８８−１００としてコードされる。ＴｃｂＡ_ｉｉ内部ペプチドＴｃｂＡ_ｉｉ−ＰＴ８１（ａ）（配列番号２３）はアミノ酸１０６５−１０７７としてコードされ、ＴｃｂＡ_ｉｉ−ＰＴ８１（ｂ）（配列番号２４）はアミノ酸１５７１−１５９２としてコードされる。更に、内部ペプチドＴｃｂＡ_ｉｉ−ＰＴ５６（配列番号２２）はアミノ酸１４７４−１４８８としてコードされ、内部ペプチドＴｃｂＡ_ｉｉ−ＰＴ１０３（配列番号２４）はアミノ酸１６１４−１６３９としてコードされる。この遺伝子はＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ・ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ株Ｗ−１４の殺虫剤タンパク質製剤から単離されるようなＴｃｂＡ_ｉｉペプチドをコードする真正クローンであることが自明である。
【０１４６】
ペプチドＴｃｂＡ_ｉｉとして単離されたタンパク質は、更に長いペプチドの開裂から誘導される。この証拠は、ＴｃｂＡ_ｉｉＮ末端ペプチド配列番号１をコードするヌクレオチドが更に長い読み取り枠の２６１塩基（配列番号１１）（８７Ｎ末端近位アミノ酸をコードする）により先行されるという事実により与えられる。この読み取り枠は大きいペプチドＴｃｂＡのＮ末端配列に相当し、かつ本明細書中配列番号１６として開示されるアミノ酸配列Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕをコードするヌクレオチドで開始する。ＴｃｂＡはＴｃｂＡ_ｉｉの前駆体タンパク質であると考えられる。
【０１４７】
ｔｃｂＡ 遺伝子、 ｔｃａＢ 遺伝子及び ｔｃａＣ 遺伝子の関係
ｔｃａＢ遺伝子及びｔｃａＣ遺伝子は密接に関連し、単一ｍＲＮＡとして転写し得る（実施例８）。ｔｃｂＡ遺伝子は、ｔｃａＢクラスター及びｔｃａＣクラスターを宿しているコスミドと明らかに重ならないコスミドで産生される。何となれば、夫々のゲノムライブラリースクリーンが異なるコスミドを同定したからである。しかしながら、ｔｃｂＡ遺伝子とのｔｃａＢ遺伝子及びｔｃａＣ遺伝子によりコードされたアミノ酸配列の比較は相同性の実質的な程度を明らかにする。アミノ酸保存（マックベクター^ＴＭ配列分析ソフトウェアのタンパク質アラインメントモード、スコアリングマトリックスｐａｍ２５０、ハッシュ値＝２；コダック・サイエンティフィック・イメージング・システムズ，Ｒ−ｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）が図４に示される。図４中の夫々のパネルのスコアラインについて、上カラット（＾）は相同性または保存アミノ酸変化を示し、また下カラット（ｖ）は非相同性を示す。
【０１４８】
この分析は、残基１７３９から１８９４までのＴｃｂＡペプチドのアミノ酸配列がＴｃａＢ_ｉペプチドのアミノ酸４４１−６０３（Ｐ８の全６２７アミノ酸の１６２；配列番号２８）に高度に相同であることを示す。加えて、ＴｃｂＡアミノ酸１９３２−２４５９の配列はペプチドＴｃａＢ_ｉｉのアミノ酸１２−５３１（全５６２アミノ酸の５２０；配列番号３０）に高度に相同である。ＴｃｂＡペプチド（配列番号１２）が２５０５アミノ酸を含むことを考慮すると、それのＣ近位末端にある合計６８４アミノ酸（２７％）はＴｃａＢ_ｉペプチドまたはＴｃａＢ_ｉｉペプチドに相同であり、その相同性が推定ＴｃａＢプレプロテイン（配列番号２６）の配置に共直線状に配置される。ＴｃｂＡ相同性中のサイザブル（ｓｉｚｅａｂｌｅ）ギャップはＴｃａＢプレプロテインのＴｃａＢ_ｉ部分とＴｃａＢ_ｉｉ部分の間の結合と一致する。明らかに、ＴｃｂＡ遺伝子産物及びＴｃａＢ遺伝子産物は進化的に関連し、それらがＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ中で或る種の共通の機能を共有することが提案される。
【０１４９】
実施例 １０　Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ブロース中の亜鉛−メタロプロテアーゼの特性決定：プロテアーゼ抑制、分類、及び精製
プロテアーゼ抑制アッセイ及び分類アッセイ：基質として水に溶解したＦＩＴＣ−カゼイン（０．０８％最終アッセイ濃度）を使用して、プロテアーゼアッセイを行った。タンパク質分解反応をＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓブロース２５μｌを含む適当な緩衝液中で２５℃で１時間行った（合計反応容積１５０μｌ）。また、サンプルをジチオスレイトールの存在下及び不在下で分析した。インキュベーション後、等容積の１２％のトリクロロ酢酸を添加して未消化のタンパク質を沈殿させた。０．５時間の沈殿及びその後の遠心分離後に、上澄み１００μｌを９６ウェル・ミクロタイタプレートに入れ、その溶液のｐＨを等容積の４ＮのＮａＯＨの添加により調節した。次いで夫々４８５ｎｍ及び５３８ｎｍの励起波長及び発光波長でフルオロスキャンＩＩフルオロメトリー・プレートリーダーを使用してタンパク質分解を定量した。プロテアーゼ活性をｐＨ５．０−１０．０の範囲で０．５単位の増分で試験した。下記の緩衝液を５０ｍＭの最終濃度で使用した：酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０−６．５）；トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０−８．０）；及びビス−トリスプロパン（ｐＨ８．５−１０．０）。観察された一種以上のプロテアーゼのクラスを同定するために、粗ブロースを種々のプロテアーゼインヒビター（最終濃度０．５μｇ／μｌ）で処理し、次いで上記基質を使用してｐＨ８．０でプロテアーゼ活性について試験した。使用したプロテアーゼインヒビターはＥ−６４（Ｌ−トランス−エポキシサクシニルロイシルアミノ［４−，−グアニジノ］−ブタン）、３，４−ジクロロイソクマリン、ロイペプチン、ペプスタチン、アマスタチン、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）及び１，１０フェナントロリンを含んでいた。
【０１５０】
ｐＨ範囲にわたって行われたプロテアーゼアッセイは、実際に約８．０のｐＨで最大活性を示す一種以上のプロテアーゼが存在することを明らかにした（表１６）。ＤＴＴの添加はプロテアーゼ活性に影響しなかった。次いで粗ブロースを種々のプロテアーゼインヒビターで処理した（表１７）。上記インヒビターによる粗ブロースの処理は１，１０フェナントロリンが５０μｇの最終濃度で添加された時に全プロテアーゼ活性の完全な抑制を生じることを明らかにした。ＩＣ_５０は２ｍｇ／ｍｌの粗ブロース溶液１００μｌ中５μｇであった。これらのデータは、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓブロース中に見られる最も多い一種以上のプロテアーゼが酵素の亜鉛−メタロプロテアーゼクラスからのものであることを示す。
【０１５１】
【表１７】
表１６．Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ　（株Ｗ−１４）　の１日目の産生に見られるプロテアーゼ活性に関するｐＨの効果

ａ．Ｆｌｕ．単位＝蛍光単位（最大＝約２８，０００；　バックグラウンド＝約２２００）
ｂ．％はｐＨ８．０　における最大に対する活性である。
【０１５２】
【表１８】
表１７．Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ　（株Ｗ−１４）　の１日目の産生に見られるｐＨ８におけるプロテアーゼ活性に関する異なるプロテアーゼインヒビターの効果

ａ．修正Ｆｌｕ．単位＝蛍光単位−バックグラウンド（２２００　ｆｌｕ．単位）
ｂ．抑制％はｐＨ８．０　におけるプロテアーゼ活性に対するものである
ｃ．インヒビターをメタノールに溶解した。
ｄ．インヒビターをＤＭＳＯに溶解した。
【０１５３】
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ毒素について実施例５に記載されたようにして透析された１０−８０％の硫酸アンモニウムを５０ｍＭのＮａ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．０で平衡にされたＱセファロースカラムに適用することにより、亜鉛−メタロプロテアーゼの単離を行った。徹底的な洗浄後に、０−０．５ＭのＮａＣｌ勾配を使用して毒素タンパク質を溶離した。生物活性及びタンパク質の大半を０．１５〜０．４５ＭのＮａＣｌで溶離した。しかしながら、タンパク質分解活性の大半が０．２５−０．３５ＭのＮａＣｌフラクション中に存在し、若干の活性が０．１５−０．３５ＭのＮａＣｌフラクション中に存在することが観察された。０．２５−０．３５ＭのＮａＣｌフラクションのＳＤＳ　ＰＡＧＥ分析は約６０ｋＤａの主要ペプチドバンドを示した。０．１５−０．２５ＭのＮａＣｌフラクションは同様の６０ｋＤａのバンドを含んでいたが、低い相対タンパク質濃度であった。スペロース１２ＨＲ　１６／５０カラムを使用するこのフラクションのその後のゲル濾過はＳＤＳ　ＰＡＧＥ分析により主として（合計の染色タンパク質の９０％より大）５８．５ｋＤａバンドを含む５７．５ｋＤａで移動する主要ピークを生じた。上記の種々のプロテアーゼインヒビターを使用するこのフラクションの付加的な分析は、プロテアーゼが亜鉛−メタロプロテアーゼであることを測定した。醗酵１日目のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓブロース中に存在するプロテアーゼ活性の殆ど全てが約５８ｋＤａの亜鉛−メタロプロテアーゼに相当した。
【０１５４】
一種以上の亜鉛−メタロプロテアーゼの第二の単離において、３日間にわたって増殖されたＷ−１４Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓブロースを採取し、Ｓｃｈｒｒｌｉｄｔ，Ｔ．Ｍ．，Ｂｌｅａｋｌｅｙ，Ｂ．及びＮｅａｌｓｏｎ，Ｋ．Ｍ．１９８８に記載されたようにしてゼラチンと組み合わされたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用してプロテアーゼ活性を視覚化した。ＳＤＳランニングゲル（５．５ｘ８ｃｍ）を、０．１％のゼラチン最終濃度（バイオラドＥＩＡ銘柄試薬；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ　ＣＡ）を水に溶解後に混入した１２．５％のポリアクリルアミド（アクリルアミド／ビス−アクリルアミドの４０％原液；シグマ・ケミカル社，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でつくった。ＳＤＳ−スタッキングゲル（１．０ｘ８ｃｍ）を０．１％のゼラチンとまた組み合わされた５％のポリアクリルアミドでつくった。典型的には、試験すべきタンパク質２．５μｇをジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含まないＳＤＳ−ＰＡＧＥ装填緩衝液０．０３ｍｌ中で希釈し、ゲルに装填した。タンパク質をＳＤＳ運転緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．１９７０，Ｎａｔｕｒｅ　２２７，６８０）中で０℃で８ｍＡで電気泳動にかけた。
【０１５５】
電気泳動が完結した後、ゲルを２時間にわたって２．５％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ−１００中で洗浄した。次いでゲルを１時間にわたって３７℃で０．１Ｍのグリシン（ｐＨ８．０）中でインキュベートした。インキュベーション後、ゲルを固定し、メタノール−酢酸−水（３０：１０：６０、ｖｏｌ．／ｖｏｌ．／ｖｏｌ．；シグマ・ケミカル社）中０．１％のアミドブラックで一夜にわたって染色した。プロテアーゼ活性をタンパク質分解及びその後のとり込まれたゼラチンの拡散のために暗色のアミドブラック染色されたバックグラウンドに対する明るい領域として視覚化した。５８ｋＤａ、４１ｋＤａ、及び３８ｋＤａのタンパク質分解活性により生じた少なくとも三つの異なるバンドが観察された。
【０１５６】
Ｗ−１４の３日培養ブロース中の異なるプロテアーゼの活性アッセイを、基質としての水に溶解されたＦＩＴＣ−カゼイン（０．０２％の最終アッセイ濃度）を使用して行った。タンパク質分解実験を３７℃で０−０．５時間にわたって０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で０．１５ｍｌの全容積中の異なるタンパク質フラクションで行った。反応を水に溶解された１２％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）の等容積の添加により停止した。室温で０．２５時間のインキュベーション後に、サンプルを１０，０００ｘｇで０．２５時間にわたって遠心分離し、アリコート０．１０ｍｌを除去し、９６ウェル・ミクロタイタプレートに入れた。次いでその溶液を等容積の２Ｎの水酸化ナトリウムの添加により中和し、続いて夫々４８５ｎｍ及び５３８ｎｍの励起波長及び発光波長でフルオロスキャンＩＩフルオロメトリープレートリーダーを使用して定量した。ＦＩＴＣ−カゼインを異なるプロテアーゼ濃度で３７℃で０〜１０分間使用して、活性測定を行った。活性の単位を１０００の蛍光単位／分を生じるのに必要とされる酵素の量と任意に定義し、また比活性をプロテアーゼ１ｍｇ当たりの単位と定義した。
【０１５７】
２種の亜鉛−メタロプロテアーゼインヒビター；１，１０フェナントロリン及びＮ−（ａ−ラムノピラノシルオキシヒドロキシホスフィニル）−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（ホスホルアミドン）を使用して抑制研究を行い、夫々１００％のエタノール及び水に溶解したインヒビターの原液を使用した。原液濃度は典型的には１，１０フェナントロリン及びホスホルアミドンの夫々について１０ｍｇ／ｍｌ及び５ｍｇ／ｍｌであり、インヒビターの最終濃度は反応当たり０．５−１．０ｍｇ／ｍｌであった。全ての亜鉛メタロプロテアーゼのインヒビターである１，１０フェナントロリンによる３日目のＷ−１４粗ブロースの処理は全てのプロテアーゼ活性の完全な排除をもたらし、一方、サーモリシン様プロテアーゼ（Ｗｅａｖｅｒ，Ｌ．Ｈ．，Ｋｅｓｔｅｒ，Ｗ．Ｒ．，及びＭａｔｔｈｅｗｓ，Ｂ．Ｗ．１９７７．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１４，１１９−１３２）のインヒビターであるホスホルアミドンによる処理はプロテアーゼ活性の約５６％低下をもたらした。残留タンパク質分解活性を追加のホスホルアミドンで更に低下することができなかった。
【０１５８】
３日目のＷ−１４Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓブロースのプロテアーゼを以下のようにして精製した。アミコンＭ−１２濾過装置に取り付けられたアミコンらせん形限外濾過カートリッジ型ＳＩＹ１００を使用して、ブロース４．０リットルを濃縮した。アミコンＭ−１２濾過装置に取り付けられたアミコンらせん形限外濾過カートリッジ型ＳＩＹ１００を使用して、サイズ１００ｋＤａ未満の天然タンパク質を有するフロースルー物質（３．８Ｌ）を０．３７５Ｌに濃縮した。レテンテート（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）物質は１０−１００ＫＤａのサイズの範囲のタンパク質を含んでいた。この物質を、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で平衡化されたパーセプチブ・バイオシステム（Ｆｒａｍｉｇｔｏｎ、ＭＡ）ボロス^Ｒ５０ＨＱ強陰イオン交換パッキングを詰め込まれたファーマシアＨＲ１６／１０カラムに装填した。タンパク質を５ｍｌ／分の流量でカラムに装填し、続いてＡ_２８０＝０．００まで未結合タンパク質を洗浄した。その後、４０分で０−１．０ＭのＮａＣｌのＮａＣｌ勾配を使用して７．５ｍｌ／分の流量でタンパク質を溶離した。フラクションを上記のようにしてプロテアーゼ活性について分析し、活性フラクションをプールした。タンパク質分解活性フラクションを５０％（ｖ／ｖ）の１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、１０ｍＭのリン酸ナトリウムで平衡にされたファーマシアＨＲ１０／１０モノＱカラムに装填した。カラムをＡ_２８０＝０．００まで緩衝液で洗浄した後、１時間にわたって０−０．５ＭのＮａＣｌのＮａＣｌ勾配を使用して２．０ｍｌ／分の流量でタンパク質を溶離した。
【０１５９】
フラクションをプロテアーゼ活性について分析した。最大量のホスホルアミドン感受性プロテアーゼ活性を有するフラクションをプールした（ホスホルアミドン感受性活性は下記のように４１／３８ｋＤａのプロテアーゼのためである）。これらのフラクションは０．１５−０．２５ＭのＮａＣｌの範囲で溶離することがわかった。また、優性のホスホルアミドン非感受性プロテアーゼ活性を含むフラクション、５８ｋＤａのプロテアーゼをプールした。これらのフラクションは０．２５−０．３５ＭのＮａＣｌの範囲で溶離することがわかった。次いでホスホルアミドン感受性プロテアーゼフラクションをミリポア・ウルトラフリー^Ｒ−１５遠心分離フィルター装置バイオマックス−５Ｋ　ＮＭＷＬ膜を使用して０．７５ｍｌの最終容積に濃縮した。この物質を、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）／０．１ＭのＮａＣｌ中で平衡にされたファーマシア・セファデックスＧ−５０で詰め込まれたファーマシアＨＲ１０／３０カラムに０．５ｍｌ／分の流量で適用した。次いで最高のホスホルアミドン感受性プロテアーゼ活性を有するフラクションをプールし、ミリポア・ウルトラフリー^Ｒ−１５遠心分離フィルター装置バイオマックス−５０Ｋ　ＮＭＷＬ膜で遠心分離した。上記のタンパク質分解活性分析は、この物質がホスホルアミドン感受性プロテアーゼ活性のみを有することを示した。ホスホルアミドン非感受性プロテアーゼ、５８ｋＤａのタンパク質をプールし、続いて、ミリポア・ウルトラフリー^Ｒ−１５遠心分離フィルター装置バイオマックス−５０Ｋ　ＮＭＷＬ膜中で濃縮し、ファーマシア・スーパーデックス−７５カラムで更に分離した。プロテアーゼを含むフラクションをプールした。
【０１６０】
精製された５８ｋＤａ及び４１／３８ｋＤａの精製されたプロテアーゼの分析は、両方の型のプロテアーゼが１，１０フェナントロリンで完全に抑制されるが、４１／３８ｋＤａのプロテアーゼのみがホスホルアミドンで抑制されることを明らかにした。粗ブロースの更なる分析は、１日目のＷ−１４ブロースのプロテアーゼ活性が４１／３８ｋＤａのプロテアーゼのために全プロテアーゼ活性の２３％を有し、３日目のＷ−１４ブロースで４４％に増大することを示した。
タンパク質純度を試験し、アミノ末端配列を得るための通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、インテグレーテッド・セパレーション・システムズ（Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）から購入した４−２０％の勾配ミニプラス・セプラゲルズを使用して行った。アミノ末端配列決定すべきタンパク質を下記の精製後にＰＶＤＦ膜にブロットし（プロブロット^ＴＭ膜；アプラィド・バイオシステムズ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、０．１％のアミドブラックで視覚化し、切除し、配列決定のためにケンブリッジ・プロケム（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に送った。
【０１６１】
３日経過したＷ−１４ブロースからの５８ｋＤａ（配列番号４５）及び４１／３８ｋＤａ（配列番号４４）のプロテアーゼの演繹アミノ末端配列は夫々ＤＶ−ＧＳＥＫＡＮＥＫＬＫ（配列番号４５）及びＤＳＧＤＤＤＫＶＴＮＴＤＩＨＲ（配列番号４４）であった。
４１／３８ｋＤａのプロテアーゼの配列決定は幾つかのアミノ末端を明らかにし、夫々の末端がタンパク質分解により除去される付加的なアミノ酸を有する。３８ｋＤａ及び４１ｋＤａのポリペプチドに関する一次配列、二次配列、三次配列及び四次配列の試験は先に示された配列の演繹を可能にし、これらの２種のプロテアーゼが相同であることを明らかにした。
【０１６２】
実施例 １１ 、パートＡ
ＴｃｂＡ ペプチドをコードする遺伝子に関する抗体の使用による Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ゲノムライブラリーのスクリーニング
上記配列決定と平行して、好適な探査及び配列決定をＴｃｂＡ_ｉｉペプチド（配列番号１）に基いて行った。上記実施例１及び２に記載されたようにしてバクテリア培養ブロースを調製し、その毒素を精製することにより、この配列決定を行った。
ゲノムＤＮＡをグレースの昆虫組織培地中で増殖したＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ・ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ株Ｗ−１４から単離した。バクテリアを２５０ｍｌの三角フラスコ中で２８℃で２５０ｒｐｍで約２４時間にわたって培地５ｍｌ中で増殖した。培地１００ｍｌからのバクテリア細胞を５０００ｘｇで１０分間にわたってペレットにした。上澄みを捨て、次いで細胞ペレットをゲノムＤＮＡ単離に使用した。
Ａｕｓｕｂｅｌ（上記文献）の節２．４．３に記載陛れたＣＴＡＢ方法の改良を使用して、ゲノムＤＮＡを単離した。工程６中に”バクテリアゲノムＤＮＡの大規模ＣｓＣｌ　ｐｒｅｐ”と題する節に従った。この時点で、付加的なクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）抽出を行い、続いてフェノール／クロロホルム／イソアミル（２５：２４：１）抽出工程及び最後のクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）抽出を行った。
【０１６３】
ＤＮＡを０．６容積のイソプロパノールの添加により沈殿させた。沈殿したＤＮＡをフッキングし、曲げたガラス棒の端部のわまりに巻付け、最終洗浄液としての７０％のエタノールに素早く浸漬し、ＴＥ緩衝液３ｍｌに溶解した。
２８０／２６０ｎｍにおける光学密度により推定したＤＮＡ濃度は約２ｍｇ／ｍｌであった。
このゲノムＤＮＡを使用して、ライブラリーを調製した。
ゲノムＤＮＡ約５０μｇをＳａｕ３Ａ１で部分消化した。次いでＮａＣｌ密度勾配遠心分離を使用して部分消化されたＤＮＡフラグメントをサイズ分別した。アガロースゲル電気泳動により測定して１２ｋｂ以上の平均サイズを有するＤＮＡフラグメントを含むフラクションをプラスミドＢｌｕＳｃｒｉｐｔ（ストラタゲン，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）につなぎ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５αまたはＤＨＢ１０株に形質転換した。
別に、そのタンパク質の精製アリコートをタンパク質に対するモノクローナル抗体の産生についてウィスコンシン大学（Ｍａｄｉｓｏｎ）にあるバイオテクノロジーハイブリドーマセンターに送った。送られた物質は６５℃で変性された天然バンド１及び２を含むＨＬＰＣ精製フラクションであり、その２０μｇを４匹のマウスの夫々に注射した。未免疫マウスからの脾臓細胞を安定なミエローマ細胞系と融合した後、安定なモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系を回収した。モノクローナル抗体をハイブリドーマから回収した。
【０１６４】
別に、天然アガロースゲル精製バンド１（実施例１を参照のこと）を採取することによりポリクローナル抗体を生じ、次いでそのタンパク質を使用してニュージーランド白ウサギを免疫した。バンドを天然アガロースゲルから切除し、ゲル片を６５℃に素早く加熱してアガロースを融解し、アジュバントで直ちに乳化することによりタンパク質を調製した。フロイント完全アジュバントを一次免疫化に使用し、フロイント不完全を１ケ月間隔で３回の追加の注射に使用した。夫々の注射について、タンパク質５０〜１００マイクログラムを含む乳化バンド１約０．２ｍｌを多皮下注射によりウサギの背中に送出した。最初の注射の１０日後に血清を得、追加の採血を３週間にわたって毎週行った。血清補体を５６℃で１５分間加熱することにより不活化し、次いで−２０℃で貯蔵した。
次いでモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を使用して、エピトープにより検出し得る抗原の発現についてゲノムライブラリーをスクリーニングした。陽性クローンをニトロセルロースフィルターコロニーリフトで検出した。陽性クローンのイムノブロット分析を試みた。
【０１６５】
イムノブロット及びサザン分析の両方により特定されたクローンの分析はクローンの５種のクラスの暫定的な分析をもたらした。
クローンの第一クラス中に、ここでＴｃｂＡ_ｉｉと称されるペプチドをコードする遺伝子があった。この遺伝子の完全ＤＮＡ配列（ＴｃｂＡ）を得た。それが配列番号１１として示される。その配列が配列番号１の内部配列をコードするという確認は、配列番号１１の読み取り枠により生じた演繹アミノ酸配列からアミノ酸番号８８にある配列番号１の存在により実証される。これは配列番号１２を参照することにより確認でき、これは配列番号１１により生じた演繹アミノ酸配列である。
毒素ペプチドの第二クラスはＴｃａＢ_ｉ、ＴｃａＢ_ｉｉ及びＴｃａＣと上記されたセグメントを含む。ポリクローナル抗血清によるライブラリーのスクリーニング後に、毒素遺伝子のこの第二クラスを異なるサイズのタンパク質を産生する幾つかのクローンにより同定し、これらの全てがイムノブロットでポリクローナル抗体と交差反応し、またサザンブロットでＤＮＡ相同性を共有することがわかった。配列比較は、それらが上記ＴｃａＢ及びＴｃａＣと称される遺伝子複合体に属することを明らかにした。
【０１６６】
また、抗体毒素クローンの三つのその他のクラスをポリクローナルスクリーンで単離した。これらのクラスはポリクローナル抗体と交差反応するタンパク質を産生し、またサザンブロッティングにより測定されるようにこれらのウラスとＤＮＡ相同性を共有した。これらのクラスがクラスＩＩＩ、クラスＩＶ及びクラスＶと称された。また、クラスＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶと交差反応したモノクローナルを同定することが可能であった。これは、全てが高いタンパク質相同性の領域を有することを示唆する。こうして、Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ細胞外タンパク質遺伝子は進化的に関連している遺伝子のファミリーに相当する。
この生物中に含まれる毒素ペプチドに進化的に関連する変化があり得るという概念を更に押し進めるために、二つのアプローチを試みて関連タンパク質の存在についてＰ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓのその他の株を試験した。これをゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅並びにポリクローナル抗体及び及びモノクローナル抗体を使用するイムノブロット分析の両方により行った。
結果は、関連タンパク質がＰ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ株ＷＸ−２、ＷＸ−３、ＷＸ−４、ＷＸ−５、ＷＸ−６、ＷＸ−７、ＷＸ−８、ＷＸ−１１、ＷＸ−１２、ＷＸ−１５及びＷ−１４により産生されることを示す。
【０１６７】
実施例 １１ 、パートＢ
クラス ＩＩＩ 毒素クローン −ｔｃｃ の配列及び分析
更なるＤＮＡ配列決定を実施例１１、パートＡに記載されたクラスＩＩＩ　Ｅ．ｃｏｌｉクローンから単離されたプラスミドについて行った。ヌクレオチド配列はこのゲノム遺伝子座で三つの近くに結合された読み取り枠であることが示された。この遺伝子座をｔｃｃと称し、三つの読み取り枠をｔｃｃＡ配列番号５６、ｔｃｃＢ配列番号５８及びｔｃｃＣ配列番号６０と称する（図６Ｂ）。
ｔｃｃＡ読み取り枠からの演繹アミノ酸は、その遺伝子が１０５，４５９Ｄａのタンパク質をコードすることを示す。このタンパク質をＴｃｃＡと称した。このタンパク質の最初の１２アミノ酸は、毒素複合体の一部として先に同定された、１０８ｋＤａのタンパク質、配列番号７から得られたＮ末端配列と適合する。
ｔｃｃＢ読み取り枠からの演繹アミノ酸は、この遺伝子が１７５，７１６Ｄａのタンパク質をコードすることを示す。このタンパク質をＴｃｃＢと称した。このタンパク質の最初の１１アミノ酸は、１８５ｋＤａの推定分子量を有するタンパク質、配列番号８から得られたＮ末端配列と適合する。
ｔｃｃＣの演繹アミノ酸配列は、この読み取り枠が１１１，６９４Ｄａのタンパク質をコードすることを示し、そのタンパク質産物をＴｃｃＣと称した。
【０１６８】
実施例 １２
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ 株の特性決定
本明細書に記載されたコレクションがｒｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株を含むことを証明するために、これらの株をＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓの特徴であり、かつそれをその他の腸内細菌科及びキセノラブダスｓｐｐ．（Ｆａｒｍｅｒ，Ｊ．Ｊ．１９８４．Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍｌｃ　Ｂａｃｔｅ−ｒｉｏｌｏｇｙ，１巻，５１０−５１１頁（ＫｒｅｉｇＮ．Ｒ．及びＨｏｌｔ，Ｊ．Ｇ．編集）．Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ．；Ａｋｈｕｒｓｔ及びＢｏｅｍａｒｅ，１９８８，Ｂｏｅｆｒｌａｒｅら，１９９３）から区別する認識された微生物学的形質に関して評価した。これらの特徴的な形質は以下のとおりである。グラム染色陰性ロッド、幅０．５−２μｍ及び長さ２−１０μｍの生物サイズ、赤色／黄色のコロニー着色、結晶性封入体の存在、カタラーゼの存在、硝酸塩を還元できないこと、生物発光の存在、成長培地から色素を吸収できること、プロテアーゼ産生について陽性、３７℃未満の成長温度範囲、嫌気性条件下の生存及び積極的な運動（表１８）。基準のエシェリキア・コリ株、キセノラブダス株及びＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株を比較のために全ての試験に入れた。総合の結果は、全ての株が腸内細菌科及びＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ属の一部であることと合致する。
【０１６９】
ルミノメーターを使用して夫々の株の生物発光を証明し、発色の定量的かつ相対的測定を得た。相対的な発光単位の測定について、夫々の株からのブロース（細胞及び培地）を培養液中の接種後の三つの時間間隔（６、１２、及び２４時間）で測定し、バックグラウンド明度（未接種の培地及び水）と比較した。種々のブロースからの発光の測定の前に、シパー（ｓｉｐｐｅｒ）セルを使用するギルフォード・システムズ（Ｏｂ−ｅｒｌｉｎ，ＯＨ）スペクトロメーター中で吸光度（５６０ｎＭ）を測定することにより細胞密度を確かめた。次いで明度を測定する前に適当な希釈を行った（光学密度を１．０単位に基準化するため）。次いで希釈したブロースのアリコートをキュベット（夫々３００μｌ）に入れ、バイオーオービット１２５１ルミノメーター（Ｂｉｏ−Ｏｒｂｉｔ　Ｏｙ，Ｔｗｉｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）中で読み取った。夫々のサンプルに関する組込み時間は４５秒であった。サンプルを連続的に混合（じゃま板付きキュベット中で回転させた）し、その間に読み取って酸素利用能を得た。陽性試験をバックグラウンドルミネセンスの５倍以上（約５−１０単位）であると決めた。加えて、コロニー明度を写真フィルムオーバーレイで検出し、暗室中の適合後に目視で検出した。夫々の株のグラム染色特性を、グラム染色コントロールスライド（フィッシャー・サイエンティフィック，Ｐｉｔｔｓ−ｂｕｒｇｈ，ＰＡ）と一緒に使用した市販のグラム染色キット（ＢＢＬ，Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で確かめた。
【０１７０】
次いでツァイス顕微鏡（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）１００Ｘオイル浸漬対物レンズ（１０Ｘ接眼倍率及び２Ｘ本体倍率）を使用して顕微鏡評価を行った。生物サイズ、細胞の記載及び封入体（対数期増殖後の封入体）に関する個々の株の顕微鏡試験を、オイル浸漬による湿潤取付けスライド（１０Ｘ接眼倍率、２Ｘ本体倍率及び４０Ｘ対物倍率）及びマイクロメーターを含む位相差顕微鏡（Ａｋｈｕｒｓｔ，Ｒ．Ｊ．及びＢｏｅｍａｒｅ，Ｎ．Ｅ．１９９０．Ｅｎｔｏｍｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　Ｎｅｍａｔｏｄｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｇａｕｇｌｅｒ，Ｒ．及びＫａｙａ，Ｈ．編集）．７５−９０頁．ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，ＵＳＡ．；Ｂａｇｈｄｉ−ｇｕｉａｎ　Ｓ．，Ｂｏｙｅｒ−Ｇｉｇ１ｉｏＭ．Ｈ．，Ｔｈａｌｅｒ，Ｊ．Ｏ．，Ｂｏｎｎｏｔ　Ｇ．，Ｂｏｅｍａｒｅ，Ｎ．１９９３．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ　７９，１７７−１８５）を使用して行った。コロニー着色をラベル指示により調製されたバクト栄養寒天（ジフコ・ラボラトリーズ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）に接種後に観察した。インキュベーションが２８℃で起こり、５−７日後に記載を生じた。酵素カタラーゼの存在について試験するために、試験生物のコロニーを栄養寒天プレートから小さいプラグで除去し、ガラス試験管の底部に入れた。家庭用過酸化水素溶液１ｍｌを管の側面を下に穏やかに添加した。気泡（推定上、酸素）が直ちにまたは５秒以内に現れた時に陽性反応を記録した。
【０１７１】
また、未接種栄養寒天及び過酸化水素溶液の対照を試験した。硝酸塩還元について試験するために、夫々の培養物をバクトニトレートブロース［ジフコ・ラボラトリーズ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ］１０ｍｌに接種した。２８℃で２４時間のインキュベーション後に、亜硝酸塩生成を２滴のスルファニル酸試薬及び２滴のα−ナフチルアミン試薬の添加により試験した（ジフコ・マニアル、第１０編、ジフコ・ラボラトリーズ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，１９８４を参照のこと）。明瞭なピンク色または赤色の発生が硝酸塩からの亜硝酸塩の生成を示す。成長培地から色素を吸収する夫々の株の能力を色素ニュートラル・レッドを含むバクト・マッコンキィ寒天；色素ブロモチモール・ブルーを含むバクト・タージトール−７寒天及び色素エオシン−Ｙを含むバクトＥＭＢ寒天（ジフコ・ラボラトリーズ，Ｄｅｔｒｏｌｔ，ＭＩからの寒天、全てをラベル指示に従って調製した）で試験した。これらの培地への接種後に、色素吸収を２８℃で５日のインキュベーション後に記録した。これらの後者の培地における成長が腸内細菌科の員に特徴的である。夫々の株の運動性を、ラベル指示に従って調製されたバクト運動性試験培地（ジフコ・ラボラトリーズ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）の溶液を使用して試験した。バット−スタブ（ｂｕｔｔ−Ｓｔａｂ）接種を夫々の株を用いて行い、運動性を接種物のラインから広がる成長の拡散ゾーンにより巨視的に判断した。多くの場合、運動性をまた湿潤取付けスライドのもとに培養液から顕微鏡で観察した。
【０１７２】
夫々の株に関する生化学的栄養評価を、ＢＢＬエンテロチューブＩＩ（ベントン、ディキンソン、ドイツ）を使用して行った。インキュベーションを２８℃で５日おこなった以外は製品指示に従った。結果はＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓに関する先の引用論文と一致した。プロテアーゼの産生を、ラベル指示に従ってつくられたバクトゼラチン（ジフコ・ラボラトリーズ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）プレートを使用してゼラチンの加水分解を観察することにより試験した。培養物を接種し、プレートを２８℃で５日間インキュベートした。異なる温度における成長を評価するために、寒天プレート［脱イオン水中２％のバクト寒天（ジフコ、Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）を含む２％のプロテオースペブトン＃３］を接種物の共通の源からストリーキングした。プレートをネスコ^Ｒフィルムでシールし、３週間までにわたって２０℃、２８℃及び３７℃でインキュベートした。３７℃で成長を示さないプレートは２８℃のインキュベーターに１週間移した後に細胞生存度を示さなかった。Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株に関する酸素要求を下記の方法で試験した。液体チオグリコレートブロース培地（ジフコ、Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）へのバット−スタブ接種を行った。管を室温で１週間インキュベートし、次いで培養物を成長の型及び程度について試験した。指示薬レサズリンは培地酸化のレベルまたは好気生活ゾーンを示す（ジフコ・マニュアル、第１０編、ジフコ・ラボラトリーズ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）。試験したＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株について得られた成長ゾーン結果は条件的嫌気性微生物の結果と一致した。
【０１７３】
【表１９】
表１８ホトルハブダス株の分類学的形質
評価した形質^＊

【０１７４】
【表２０】
表１８．つづき

＊　−　Ａ＝グラム染色、Ｂ＝結晶性封入体、Ｃ＝生物発光性、Ｄ＝細胞形態、Ｅ＝運動性、Ｆ＝硝酸塩還元、Ｇ＝カタラーゼの存在、Ｈ＝ゼラチン加水分解、Ｉ＝色素吸収、Ｊ＝着色、Ｋ＝ＥＭＢ寒天における成長、Ｌ＝マッコンキィ寒天における成長、Ｍ＝タージトール−７寒天における成長、Ｎ＝条件的嫌気性、Ｏ＝２０℃における成長、Ｐ＝２８℃における成長、Ｑ＝３７度における成長、ａ：＋　＝形質について陽性、−　＝形質について陰性，ｒｄ＝棒状、Ｓ＝属ディスクリプター内のサイズ、ＲＯ＝赤色−オレンジ、ＬＲ＝明るい赤色、Ｒ＝赤色、Ｏ＝オレンジ、Ｙ＝黄色、Ｔ＝褐色、ＬＹ＝明るい黄色、ＹＴ＝黄褐色およびＬＯ＝明るいオレンジについて陽性または陰性
【０１７５】
細胞脂肪酸分析は属レベル及び種レベルでバクテリア特性決定について認められた手段であり（Ｔｏｒｎａｂｅｎｅ，Ｔ．Ｇ．１９８５．Ｌｉｐｉｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｔｏ　Ｃｈｅｍｏｔａｘｏｎｏｍｙ　ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１８巻，２０９−２１４．；Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，Ｍ．及びＯ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ａ．Ｇ．１９９３．Ｒｏｏｔｓ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ　ｉｎ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆＮｅｗ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，Ｍ．及びＯ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ａ．Ｇ．編集）３−５４頁Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｔｄ．）（これらの文献が参考として本明細書に含まれる）、これらを使用して本発明者らのコレクションが属レベルで関連することを確かめた。培養物を、微生物ＩＤ（ＭＩＤＩ，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ，ＵＳＡ）微生物同定系（ＭＩＳ）を使用する脂肪酸メチルエステル分析（ＦＡＭＥ）のために外部の契約研究所に輸送した。ＭＩＳ系は２５ｍｍｘ０．２ｍｍの５％のメチルフェニルシリコーン石英シリカキャピラリーカラムを備えたヒューレット・パッカードＨＰ５８９０Ａガスクロマトグラフからなる。水素をキャリヤーガスとして使用し、炎イオン化検出器が自動サンプラー、インテグレーター及びコンピューターと協力して機能する。コンピューターはサンプル脂肪酸メチルエステルを微生物脂肪酸ライブラリー及び既知脂肪酸の較正混合物と比較する。契約研究所により選択されたように、株を分析の前にトリプチカーゼ大豆寒天で２８℃で２４時間増殖した。サンプルの抽出を通常のＦＡＭＥ方法に従って契約研究所により行った。Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ以外のｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓバクテリアグループについて株の直接の同定がなかった。クラスター分析（これは分離物のグループの脂肪酸プロフィールを比較する）を行った時、株脂肪酸プロフィールが属レベルで関連していた。
【０１７６】
本発明者らのコレクション中のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株の進化上の多様性を、夫々の株からのゲノムＤＮＡを使用してＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）媒介ゲノムフィンガープリンティングの分析により測定した。この技術は種々のバクテリア種のゲノム中に存在する反復ＤＮＡ配列のファミリーに基いている（Ｖｅｒｓａｌｏｖｉｃ，Ｊ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｍ．，ＤＥＢｒｕｉｊｎ，Ｆ．Ｊ．及びＬｕｐｓｋｉ，Ｊ．Ｒ．１９９４．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５，２５−４０に概説されている）。これらの三つ、反復遺伝子外パリンドーム配列（ＲＥＰ）、腸内細菌の反復遺伝子内コンセンサス（ＥＲＩＣ）及びＢＯＸ要素がバクテリアゲノムの編成に重要な役割を果たすものと考えられる。ゲノム編成は選択により成形されるものと考えられ、密接に関連するバクテリア株のゲノム内のこれらの要素の差別的な分散がこれらの株を区別するのに使用し得る（例えば、Ｌｏｕｗｓ，Ｆ．Ｊ．，Ｆｕｌｂｒｉｇｈｔ，Ｄ．Ｗ．，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｃ．Ｔ．及びＤＥＢｒｕｉｊｎ，Ｆ．Ｊ．１９９４．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ．６０，２２８６−２２９５．）。Ｒｅｐ−ＰＣＲはこれらの反復配列に相補性のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してそれらの間にある可変サイズのＤＮＡフラグメントを増幅する。得られた産物を電気泳動により分離して夫々の株についてＤＮＡ”フィンガープリント”を確立する。
【０１７７】
本発明者らの株からゲノムＤＮＡを単離するために、細胞ペレットをＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で最終容積１０ｍｌに再度懸濁させ、次いで５ＭのＮａＣｌ　１２ｍｌを添加した。この混合物を１５，０００ｘｇで２０分間遠心分離した。得られるペレットをＴＥ５．７ｍｌ中で再度懸濁させ、１０％のＳＤＳ３００μ１及び２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（ギブコＢＲＬプロダクツ，Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）６０μｌを添加した。この混合物を３７℃で１時間インキュベートし、次いでリゾチーム約１０ｍｇを添加し、その混合物を更に４５分間インキュベートした。次いで５ＭのＮａＣｌ　１ｍｌ及びＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液（１０％ｗ／ｖのＣＴＡＢ、０．７ＭのＮａＣｌ）８００μｌを添加し、その混合物を６５℃で１０分間にわたって穏やかに攪拌してインキュベートし、次いで更に２０分間にわたってインキュベートし、攪拌して細胞物質の透明化を助けた。等容積のクロロホルム／イソアミルアルコール溶液（２４：１、ｖ／ｖ）を添加し、穏やかに混合し、次いで遠心分離した。次いで２回の抽出を等容積のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（５０：４９：１）を用いて行った。ゲノムＤＮＡを０．６容積のイソプロパノールで沈殿させた。沈殿したＤＮＡをガラス棒で除去し、７０％のエタノールで２回洗浄し、乾燥させ、ＳＴＥ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）２ｍｌに溶解した。
【０１７８】
次いでＤＮＡを２６０ｎｍにおける光学密度により定量した。ＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓゲノムＤＮＡのｒｅｐ−ＰＣＲ分析を行うために、下記のプライマーを使用した。ＲＥＰ１Ｒ−Ｉ；５’−ＩＩＩＩＣＧＩＣＧＩＣＡＴＣＩＧＧＣ−３’及びＲＥＰ２−Ｉ；５’−ＩＣＧＩＣＴＴＡＴＣＩＧＧＣＣＴＡＣ−３’。下記の２５μｌの反応液を使用してＰＣＲを行った。７．７５μｌのＨ_２Ｏ、２．５μｌの１０Ｘ　ＬＡ緩衝液（パンベラ・コーポレーション，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、１６μｌのｄＮＴＰ混合物（夫々２．５ｍＭ）、１μｌの夫々のプライマー（５０ｐＭ／μｌ）、１μｌのＤＭＳＯ、１．５μｌのゲノムＤＮＡ（０．０７５−０．４８０μｇ／μｌの範囲の濃度）及び０．２５μｌのタカラＥＸ　Ｔａｑ（パンベラ・コーポレーション，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。
【０１７９】
下記の条件を使用してＰＣＲ増幅をパーキン・エルマーＤＮＡサーマル・サイクラー（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）中で行った。９５℃／７分、次いて９４℃／１分、４４℃／１分、６５℃／８分、続いて６５℃で１５分の３５サイクル。サイクル後に、反応液２５μｌを６Ｘゲル装填緩衝液（Ｈ_２Ｏ中０．２５％のブロモフェノールブルー、４０％ｗ／ｖの蔗糖）５μｌに添加した。次いで１５ｘ２０ｃｍの１％アガロースゲルを、夫々の反応液８μｌを使用してＴＢＥ緩衝液（０．０９Ｍのトリス−ボレート、０．００２ＭのＥＤＴＡ）中で実験した。ゲルを４５ｖで約１６時間実験した。次いでゲルを２０μｇ／ｍｌの臭化エチジウム中で１時間にわたって染色し、ＴＢＥ緩衝液中で約３時間にわたって脱色した。次いでゲルのポラロイド（登録商標）写真をＵＶ照明下で撮影した。夫々の株に関する特定サイズのバンドの存在または不在を写真からスコアに付け、数値分類学ソフトウェアプログラム、ＮＴＳＹＳ−ｐｃ（エクセター・ソフトウェア、Ｓｅｔａｕｋｅｔ，ＮＹ）に類似性マトリックスとして入力した。
【０１８０】
同時に評価したＥ．ｃｏｌｉ株ＨＢ１０１及びキサントモナス・オリザエ ｐｖ ．オリザエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｏｒｙｚａｅ　ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ）の対照は公表された論文（Ｖｅｒｓａｌｏｖｉｃ，Ｊ．，Ｋｏｅｕｔｈ，Ｔ．及びＬｕｐｓｋｉ，Ｊ．Ｒ．１９９１．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９，６８２３−６８３１；Ｖｅｒａ　Ｃｒｕｚ，Ｃ．Ｍ．，Ｈａｌｄａ−Ａｌｉｊａ，Ｌ．，Ｌｏｕｗｓ，Ｆ．，Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｄ．Ｚ．，Ｇｅｏｒｇｅ，Ｍ．Ｌ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．，ＤＥ　Ｂｒｕｉｊｎ，Ｆ．Ｊ．，Ｒｉｃｅ，Ｃ．及びＬｅａｃｈ，Ｊ．Ｅ．１９９５．Ｉｎｔ．Ｒｉｃｅ　Ｒｅｓ．Ｎｏｔｅｓ，２０，２３−２４；Ｖｅｒａ　Ｃｒｕｚ，Ｃ．Ｍ．，Ａｒｄａｌｅｓ，Ｅ．Ｙ．，Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｄ．Ｚ．，Ｔａｌａｇ，Ｊ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｌｏｕｗｓ，Ｆ．Ｊ．，Ｌｅｕｎｇ，Ｈ．，Ｍｅｗ，Ｔ．Ｗ．及びＬｅａｃｈ，Ｊ．Ｅ．１９９６．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（夫々、印刷中））に一致するＰＣＲ”フィンガープリント”を生じた。次いでＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株からのデータをＮＴＳＹＳ−ｐｃ内の一連のプログラム；ＳＩＭＱＵＡＬ（定性データに関する類似性）で分析して類似性係数（ジャカード係数を使用する）及びＳＡＨＮ（連続の凝集性のヘアアーチカル（Ｈｅｉｒａｒｃｈｉｃａｌ）かつ巣状（Ｎｅｓｔｅｄ））クラスタリング［ＵＰＧＭＡ（算術平均による未計量のペアーグループ方法）方法を使用する］のマトリックス（これは関連株をグルーピングし、フェノグラム（図５）として表し得る）を生じた。ＣＯＰＨ（コフェネチック（ｃｏｐｈｅｎｅｔｉｃ）値）プログラム及びＭＸＣＯＭＰ（マトリックス比較）プログラムを使用してコフェネチック値マトリックスを生じ、これとクラスタリングが基いている初期のマトリックスの間の相関関係を比較した。得られる基準化マンテル統計値（ｒ）を生じ、これはクラスター分析の適合度の目安である（ｒ＝０．８−０．９は非常に良好な適合を表す）。本発明者らの場合、ｒは０．９１９である。それ故、本発明者らのコレクションはＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ属の代表的な容易に区別できる株の多様なグループを含む。
【０１８１】
実施例 １３ 　　種々の Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ 株により産生された一種以上の毒素の殺虫剤実用性
種々のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株の初期の”種子”培養物を、２％のプロテオースペプトン＃３（ＰＰＳ）（ジフコラボラトリーズ、Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）液体培地１７５ｍｌにカプット（Ｋａｐｕｔ）で覆われたデロング（Ｄｅｌｏｎｇ）口を有する三つのじゃま板付きフラスコ５００ｍｌ中で一次変異体サブクローンを接種することにより生じた。夫々の種子培養の接種物はオイル−オーバーレイ寒天スラント培養物またはプレート培養物に由来した。接種後に、これらのフラスコをロータリー・シェーカーで１６時間にわたって２８℃で１５０ｒｐｍでインキュベートした。次いでこれらの種子培養物を夫々の株の所定の醗酵のための一様な接種源として使用した。更に、後対数期の種子培養物を無菌鉱油でオーバーレイし、将来の再懸濁のために無菌マグネチック攪拌棒を加え、培養物を暗所で室温で貯蔵して、毒素応答状態で接種物の長期保存を得た。
【０１８２】
生産ブロースを、新しい２％のＰＰ３培地に１％の活発に成長している種子培養物（例えば、新しい培地１７５ｍｌ当たり１．７５ｍｌ）を添加することにより接種した。ブロースの生産は５００ｍｌの三つのじゃま板付きフラスコ（上記を参照のこと）、またはシリコンフォームクロージャーで覆われた２８００ｍｌのじゃま板付き凸形底部のフラスコ（体積５００ｍｌ）中で起こった。生産フラスコを上記条件下で２４〜４８時間インキュベートした。インキュベーション後に、ブロースを無菌の１Ｌのポリエチレンびんに分配し、１０℃で１時間にわたって２６００ｘｇで回転させ、細胞及びデブリペレットからデカントした。次いで液体ブロースをワッマンＧＦ／Ｄ（２．７μＭ保持）及びＧＦ／Ｂ（１．０ｐＭ保持）ガラスフィルターにより真空濾過してデブリを除去した。更なるブロース浄化を、０．５μＭのオープンーチャンネルフィルターを使用して接線方向の流れの微量濾過装置（ポール・フィルトロン、Ｎｏｒｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）で得た。必要な場合、付加的な浄化を、ブロースを（４℃に）冷却し、数時間にわたって２６００ｘｇで遠心分離することにより得ることができた。これらの操作後に、０．２μＭのニトロセルロース膜フィルターを使用してブロースをフィルター滅菌した。次いで無菌ブロースを生物学的アッセイ、生化学的分析に直接使用し、または１０，０００ＭＷカット−オフのＭ１２限外濾過装置（アミコン，Ｂｅｖｅｒｌｙ　ＭＡ）または１０，０００ＭＷ孔サイズを有する遠心分離濃縮機（ミリポア，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ及びポール・フィルトロン、Ｎｏｒｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を使用して濃縮した。遠心分離濃縮機の場合、ブロースを約２時間にわたって２０００ｘｇで回転させた。１０，０００ＭＷの透過物を相当する保持物に添加して１０，０００ＭＷより大きい成分の所望の濃縮を得た。処理されたブロースサンプルの熱不活化を、サンプルを１０分間にわたって砂充填加熱ブロック中で１００℃で加熱することにより得た。
【０１８３】
異なるＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株からの一種以上のブロース及び一種以上の毒素複合体は昆虫の集団を減少するのに有益であり、昆虫の遺伝子座に有効な昆虫不活化量の活性な記載された物質を適用することを含む昆虫集団の抑制方法に使用された。上記のようにして醗酵されたＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株の選択されたグループのブロースから観察された殺虫活性の幅の実証が表１９に示される。付加的な殺虫活性はブロースの増大された濃度により、または異なる醗酵方法を使用することによりこれらの株で検出し得ることが可能である。タンパク質と関連する活性と一致して、試験した全ての株の殺虫活性は熱不安定であった（上記を参照のこと）。
【０１８４】
種々のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株からの一種以上の培養ブロースは幾つかの昆虫に対し異なる殺虫活性（死亡率及び／または成長抑制、減少された成体発生）を示す。更に詳しくは、その活性はコーン・ルートワーム（ｃｏｒｎ　ｒｏｏｔｗｏｒｍ）幼虫及びボール・ウィービル（ｂｏｌｌ　ｗｅｅｖｉｌ）幼虫（これらは昆虫目コレオプテラ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）の員である）に対して見られる。コレオプテラのその他の員として、コメツキムシ幼虫、花粉カブトムシ、ノミハムシ、種子カブトムシ及びコロラド・ジャガイモカブトムシが挙げられる。また、活性がアスター・リーフホッパー（ａｓｔｅｒ　ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ）及びコーン・プラント・ホッパー（ｃｏｒｎ　ｐｌａｎｔ　ｈｏｐｐｅｒ）に対し観察され、これらはホモプテラ（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）目の員である。ホモプテラのその他の員として、プラントホッパー（ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ）、ピア・プシラ（ｐｅａｒ　ｐｓｙｌｌａ）、アップル・サッカー（ａｐｐｌｅ　ｓｕｃｋｅｒ）、カイガラムシ、コナジラミ、スピトル・バッグ（ｓｐｉｔｔｌｅ　ｂｕｇｓ）並びに多数の宿主特異性アリマキ種が挙げられる。また、ブロース及び一種以上の精製毒素複合体はタバコ・バッドワーム（ｂｕｄｗｏｒｍ）、タバコ・ホーンワーム（ｈｏｒｎｗｏｒｍ）及びヨーロピアン・コーン・ボラー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　ｃｏｒｎ　ｂｏｒｅｒ）（これらはレピドプテラ（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）目の員である）に対し活性である。この目のその他の典型的な員はビート・アーミィワーム（ｂｅｅｔ　ａｒｍｙｗｏｒｍ）、キャベツルーパー（ｃａｂｂａｇｅ　ｌｏｏｐｅｒ）、ブラック・カットワーム（ｂｌａｃｋ　ｃｕｔｗｏｒｍ）、コーンイアーワーム（ｃｏｒｎ　ｅａｒｗｏｒｍ）、コドリング・モス（ｃｏｄｌｉｎｇ　ｍｏｔｈ）、イガ、インディアン・ミールモス（Ｉｎｄｉａｎ　ｍｅａｌｍｏｔｈ）、ハマキムシ、アオムシ、コットン・ボールワーム（ｃｏｔｔｏｎ　ｂｏｌｌｗｏｒｍ）、ミノムシ、イースタン・テント・キャタピラー（Ｅａｓｔｅｒｎ　ｔｅｎｔ　ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ）、ソッド・ウェブワーム（ｓｏｄ　ｗｅｂｗｏｒｍ）及びフォール・アーミィワーム（ｆａｌｌ　ａｒｍｙｗｏｒｍ）である。また、活性がミバエ幼虫及び蚊幼虫（これらはジプテラ（Ｄｉｐｔｅｒａ）目の員である）に対して見られる。ジブテラ目のその他の員はピー・ミッジ（ｐｅａ　ｍｉｄｇｅ）、カラット・フライ（ｃａｒｒｏｔ　ｆｌｙ）、キャベツ・ルート・フライ（ｃａｂｂａｇｅ　ｒｏｏｔ　ｆｌｙ）、カブ・ルート・フライ（ｔｕｒｎｉｐｒ−ｏｏｔ　ｆｌｙ）、タマネギ・フライ（ｏｎｉｏｎ　ｆｌｙ）、ガガンボ及びイエバエ並びに種々の蚊種である。また、一種以上のブロース及び一種以上の毒素複合体による活性が２斑点クモダニに対して見られ、これはアカリナ（Ａｃａｒｉｎａ）目の一員であり、これはストロベリークモダニ、ブロードマイト（ｂｒｏａｄ　ｍｉｔｅｓ）、シトラス・レッド・マイト（Ｃｉｔｒｕｓｒｅｄ　ｍｉｔｅ）、ヨーロピアン・レッド・マイト（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　ｒｅｄｍｉｔｅ）、ピアー・ラストマイト（ｐｅａｒ　ｒｕｓｔ　ｍｉｔｅ）及びトマト・ラセット・マイト（ｔｏｍａｔｏ　ｒｕｓｓｅｔ　ｍｉｔｅ）を含む。
【０１８５】
コーン・ルートワーム幼虫に対する活性を以下のようにして試験した。一種以上のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロース（０−１５倍に濃縮、フィルター滅菌）、２％のプロテオースペプトン＃３、一種以上の精製毒素複合体［０．２３ｍｇ／ｍｌ］または１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０を４０μｌのアリコート中の人工食（Ｒｏｓｅ，Ｒ．Ｉ．及びＭｃＣａｂｅ，Ｊ．Ｍ．（１９７３）．Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．６６，（３９８−４００））の表面（約１．５ｃｍ^２）に直接適用した。毒素複合体を１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０中で希釈した。食事プレートを無菌フロー−フード中で空気乾燥させ、ウェルに表面滅菌卵から研化された単一の新生子ジアブロチカ・ウンデシムプンクタタ・ホワルジ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ　ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ　ｈｏｗａｒｄｉ）（サザン・コーン・ルートワーム（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｃｏｒｎ　ｒｏｏｔｗｏｒｍ，ＳＣＲ））を発生させた。プレートをシールし、保湿成長チャンバーに入れ、適当な期間（３〜５日）にわたって２７℃に保った。次いで死亡率及び幼虫重量測定をスコアにつけた。一般に、処理当たり１６匹の昆虫を全ての研究に使用した。対照死亡率は一般に５％未満であった。
【０１８６】
ボール・ウィービル（アントモナス・グランジス（Ａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｇｒａｎｄｉｓ）に対する活性を以下のようにして試験した。濃縮（１〜１０倍）Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓブロース、対照培地（２％のプロテオースペプトン＃３）、一種以上の精製毒素複合体［０．２３ｍｇ／ｍｌ］または１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０を６０μｌのアリコート中で人工食（ストーンビル・イエロー・レピドプテラン（Ｓｔｏｎｅｖｉｌｌｅ　Ｙｅｌｌｏｗ　ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）食）０．３５ｇの表面に適用し、乾燥させた。単一の１２〜２４時間のボール・ウィービル幼虫を食事に入れ、ウェルをシールし、２５℃で５０％ＲＨで５日間保った。次いで死亡率及び幼虫重量を評価した。対照死亡率は０〜１３％の範囲であった。
【０１８７】
蚊幼虫に対する活性を以下のようにして試験した。そのアッセイを９６ウェル・ミクロタイタプレート中で行った。夫々のウェルは２００μｌの水溶液（１０倍濃縮した一種以上のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロース、対照培地（２％のプロテオースペプトン＃３）、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、一種以上の毒素複合体０．２３ｍｇ／ｍｌまたはＨ_２Ｏ）及び約２０匹の生後１日の幼虫（アエデス・アエギプチ（Ａｅｄｅｓ　ａｅｇｙｐｔｉ））を含んでいた。処理当たり６のウェルがあった。結果を発生後３〜４日に読み取った。対照死亡率は０〜２０％であった。
【０１８８】
ミバエに対する活性を以下のようにして試験した。５０％の乾燥培地及び５０％の水、対照培地（２％のプロテオースペプトン＃３）、１０倍に濃縮した一種以上のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロース、一種以上の精製毒素複合体［０．２３ｍｇ／ｍｌ］または１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０を使用して、購入したドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）培地を調製した。乾燥培地４．０ｍｌを処理当たり３個の育成バイアルの夫々に入れ、適当な液体４．０ｍｌを添加することによりこれを行った。次いで１０匹の後期虫齢のドロソフィラ・メラノガスターうじを夫々２５ｍｌのバイアルに加えた。バイアルを蛍光天井ライトのもとに室温で実験ベンチで保持した。さなぎまたは成体カウントを露出の１５日後に行った。成体発生を水及び対照培地と比較した（０〜１６％の減少）。
【０１８９】
アスター・リーフホッパー成体（マクロステルス・セベリニ（Ｍａｃｒｏｓｔｅｌｅｓ　ｓｅｖｅｒｉｎｉ））及びコーン・プラントホッパー若虫（ペレグリヌス・マイジス（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｓ　ｍａｉｄｉｓ））に対する活性を、その他の外部接触なしに活性物質の摂取を可能にするように設計した摂取アッセイで試験した。活性物質／”食物”溶液の溜を３５Ｘ１０ｍｍのペトリ皿の底部の中央に２つの孔をつくることによりつくる。２インチのパラフィルムＭ^Ｒ正方形を皿の上部を横切って置き、“Ｑ”リングで固定する。次いで１オンスのプラスチックカップに約７匹のホッパーを発生させ、溜をカップの上にパラフィルムを下にして置く。次いで試験液を孔を通って溜に添加する。１０倍濃縮した一種以上のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロースを使用する試験において、ブロース及び対照培地（２％のプロテオースペプトン＃３）を１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０に対して透析し、蔗糖（５％まで）を得られる溶液に添加して対照死亡率を低下した。また、一種以上の精製毒素複合体［０．２３ｍｇ／ｍｌ］または１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０を試験した。死亡率を３日目に報告する。アッセイを１６／８光期間で２８℃、７０％ＲＨでインキュベーター中に保った。アッセイを７２時間で死亡率について等級付けした。対照死亡率は６％未満であった。
【０１９０】
レピドプテラン幼虫に対する活性を以下のようにして試験した。一種以上の濃縮（１０倍）Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロース、対照培地（２％のプロテオースペプトン＃３）、一種以上の精製毒素複合体［０．２３ｍｇ／ｍｌ］または１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０を４０μｌのアリコート中で通常の人工レピドプテラン食（ストーンビル・イエロー食）の表面（約１．５ｃｍ^２）に直接適用した。食物プレートを無菌フロー−フード中で空気乾燥させ、単一の新生子幼虫を発生させた。ヨーロピアン・コーン・ボラー（オストリニア・ヌビラリス（Ｏｓｔｒｉｎｉａ　ｎｕｂｉｌａｌｉｓ））及びタバコ・ホーンワーム（マンジュカ・セクスタ（Ｍａｎｄｕｃａ　ｓｅｘｔａ））を市販源から入手し、ハウス内で孵化し、一方、タバコ・バッドワーム（ヘリオジス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ））幼虫を内部で供給した。幼虫を発生させた後、食物プレートをシールし、保湿成長チャンバーに入れ、適当な期間にわたって２７℃で暗所に保った。死亡率及び体重測定を５日目にスコアにつけた。一般に、処理当たり１６匹の昆虫を全ての研究に使用した。対照死亡率は対照培地について一般に４〜１２．５％の範囲であり、リン酸緩衝液について１０％未満であった。
【０１９１】
２斑点クモダニ（テトラニカス・ウルチカエ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ　ｕｒｔｉｃａｅ））に対する活性を以下のようにして試験した。若いカボチャ植物を単一子葉にトリミングし、一種以上の１０倍濃縮ブロース、対照培地（２％のプロテオースペプトン＃３）、一種以上の精製毒素複合体［０．２３ｍｇ／ｍｌ］または１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で噴霧して流下させた。乾燥後、植物にクモダニの混合集団を発生させ、７２時間にわたって実験温度及び湿度に保った。次いで生存ダニをカウントして防除のレベルを測定した。
【０１９２】
【表２１】
表１９　異なるＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株からのブロースの観察された殺虫スペクトル

【０１９３】
【表２２】
表１９　つづき

＊　＝対照に対し２５％以上の死亡率及び／または成長抑制
＊＊＝１；タバコ・バッドワーム、２；ヨーロピアン・コーン・ボラー、３；タバコ・ホーンワーム、４；サザン・コーン・ルートワーム、５；ボール・ウィービル、６；蚊、７；ミバエ、８；アスター・リーフホッパー、９；コーン・プラントホッパー、１０；２斑点クモダニ
【０１９４】
実施例 １４　非 Ｗ−１４Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ 株：　精製、特性決定及び活性スペクトル精製
以下のプロトコルはＷ−１４の精製について開発されたものと同様であり、バイオアッセイ（実施例１３を参照のこと）で測定してサザン・コーン・ルートワーム（ＳＣＲ）に対し最も活性を有するフラクションを精製することに基いて確立された。典型的には、実施例１３に記載されたようにして濾過されたブロース４〜２０Ｌを受け取り、アミコンＭ−１２濾過装置に取り付けられたアミコンらせん形限外濾過カートリッジ型ＳＩＹ１００を使用して濃縮した。保持物は１００ｋＤａより大きい分子サイズからなる天然タンパク質を含み、一方、フロースルー物質は１００ｋＤａ未満のサイズの天然タンパク質を含んでいた。ＳＣＲに対する活性の大半が１００ｋＤａ保持物中に含まれていた。次いで保持物を、濾液がＡ_２８０＜０．１００に達するまで１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．０）で連続的に透析濾過した。特にことわらない限り、この時点からの全ての操作を１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で特定されるような緩衝液中で行った。
【０１９５】
次いで保持物を約０．２０Ｌの最終容積まで濃縮し、０．４５ｍｍのナルゲン^ＴＭフィルムウェア無菌濾過ユニットを使用して濾過した。濾過された物質をパーセプチブ・バイオシステム・スプリント^ＲＨＰＬＣ系を使用して緩衝液中で平衡化されたパーセプチブ・バイオシステム・ポロス^Ｒ５０ＨＱ強イオン交換マトリックスで詰め込まれたファーマシアＨＲ１６／１０カラムに７．５ｍｌ／分で装填した。装填後、Ａ_２８０＜０．１００に達するまでカラムを緩衝液で洗浄した。次いでタンパク質を５０ｍｌの全容積について２０分間にわたって０．４ＭのＮａＣｌを含む緩衝液を使用して２．５ｍｌ／分でカラムから溶離した。１．０ＭのＮａＣｌを含む緩衝液を使用してカラムを同流量で更に２０分間にわたって洗浄した（最終容積＝５０ｍｌ）。０．４Ｍ及び１．０ＭのＮａＣｌで溶離したタンパク質を別々の透析バッグ（スペクロタ／ポー^Ｒ膜ＭＷＣＯ：２０００）に入れ、１２Ｌの緩衝液中で４℃で一夜透析した。ＳＣＲに対する活性の大半が０．４Ｍのフラクション中に含まれていた。０．４Ｍのフラクションを、０．７５ｍｌ／分の流量を使用してセファロースＣＬ４Ｂ（ファーマシア）で予め詰め込まれたファーマシアＸＫ　２６／１００カラムへの２０ｍｌの適用により更に精製した。フラクションをＡ_２８０ピークプロフィールに基づいてプールし、ミリポア・ウルトラフリー^Ｒ１５遠心分離フィルター装置バイオマックス−５０Ｋ　ＮＭＷＬ膜を使用して０．７５ｍｌの最終容積まで濃縮した。標準物質としてウシγグロブリンを用いるバイオラド・タンパク質アッセイキットを使用してタンパク質濃度を測定した。
【０１９６】
特性決定
ＳＣＲ毒素複合体の天然分子量を、緩衝液中でセファロースＣＬ４Ｂで予め詰め込まれたファーマシアＨＲ　１６／５０を使用して測定した。次いで既知分子サイズのタンパク質を使用してカラムを較正し、それにより毒素のおよその天然分子サイズの計算を可能にした。表２０に示されるように、毒素複合体の分子サイズは株Ｈｂで７７７ｋＤａから株ＷＸ−１４で１，９００ｋＤａまでの範囲であった。また、毒素複合体の収率は０．８ｍｇ／Ｌを産生する株ＷＸ−１２から７．０ｍｇ／Ｌを産生する株則まで変化した。
毒素複合体に見られるタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を使用して個々のポリペプチドサイズについて試験した。典型的には、夫々の株からの毒素複合体のタンパク質２０ｍｇを２〜１５％のポリアクリルアミドゲル（インテグレーテッド・セパレーション・システムズ）に装填し、バイオラドＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液中で２０ｍＡで電気泳動にかけた。電気泳動の完結後に、ゲルをバイオラド・クーマシーブルーＲ−２５０（メタノール：酢酸：水；４０：１０：４０ｖ／ｖ／ｖ）中０．２％）中で一夜染色した。続いて、ゲルをメタノール：酢酸：水；４０：１０：４０（ｖ／ｖ／ｖ）中で脱色した。次いでゲルを１５分間にわたって水ですすぎ、モレキュラー・ダイナミクス・パーソナル・レーザー・デンシトメーター^Ｒを使用してスキャンした。レーンを定量し、分子サイズをバイオラド高分子量標準物質と比較して計算し、これは２００−４５ｋＤａの範囲であった。
【０１９７】
夫々の株からのＳＣＲ毒素複合体を含む個々のポリペプチドのサイズを表２１にリストする。個々のポリペプチドのサイズは株ＷＸ−１で２３０ｋＤａから株ＷＸ−７で見られるような１６ｋＤａのサイズまでの範囲であった。株Ｈｂを除く夫々の株は１６０−２３０ｋＤａ範囲、１００−１６０ｋＤａ範囲、及び５０−８０ｋＤａ範囲である毒素複合体を含むポリペプチドを有していた。これらのデータは、毒素複合体が株によりペプチド組成及び成分を変化し得るが、全ての場合に毒素特性が大きいオリゴマータンパク質複合体からなることが明らかであることを示す。
【０１９８】
【表２３】
表２０．

ａ　セファロースＣＬ４Ｂを詰め込んだファーマシアＨＲ　１６／５０カラムを使用して測定された天然分子量
ｂ　培養ブロースから回収された毒素複合体の量
【０１９９】
活性スペクトル
表２１に示されるように、株Ｈｍ及びＨ９から精製された毒素複合体を種々の昆虫に対する活性について試験した。株Ｗ−１４からの毒素複合体は比較のためであった。アッセイを実施例１３に記載されたようにして行った。全ての３種の株からの毒素複合体はタバコ・バッドワーム、ヨーロピアン・コーン・ボラー、サザン・コーン・ルートワーム、及びアスター・リーフホッパーに対し活性を示した。更に、株Ｈｍ及びＷ−１４からの毒素複合体がまた２斑点クモダニに対し活性を示した。加えて、Ｗ−１４からの毒素複合体が蚊幼虫に対し活性を示した。これらのデータは、毒素複合体が、昆虫の或る種の目の間に活性の類似性を有するとともに、昆虫のその他の目に対し異なる活性を示し得ることを示す。
【０２００】
【表２４】
表２１　Ｗ−１４　Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓからの精製毒素複合体中のペプチドの推定サイズ（ｋＤａ）

【０２０１】
【表２５】
表２２．

＊　＝２５％より大きい死亡率または成長抑制
＊＊＝１；タバコ・バッドワーム、２；ヨーロピアン・コーン・ボラー、３；サザン・コーン・ルートワーム、４；蚊、５；２斑点クモダニ、６；アスター・リーフホッパー、７；ミバエ、８；ボール・ウィービル
【０２０２】
実施例 １５　Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ タンパク質毒素複合体のサブ−フラクション
Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓタンパク質毒素複合体を実施例１４に記載されたようにして単離した。次に、毒素約１０ｍｇを１ｍｌ／分の流量で２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０で平衡にされたモノＱ５／５カラムに適用した。２８０ｎｍにおける光学密度が基準線吸光度に戻るまで、カラムを２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０で洗浄した。カラムに結合したタンパク質を１ｍｌ／分で３０分間にわたって２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０中０〜１．０ＭのＮａＣｌの線形勾配で溶離した。フラクション１ｍｌを集め、サザン・コーン・ルートワーム（ＳＣＲ）バイオアッセイ（実施例１３を参照のこと）にかけた。活性のピークをＳＣＲバイオアッセイで夫々のフラクションの一連の希釈液により測定した。ＳＣＲに対する二つの活性ピークを観察し、Ａ（約０．２〜０．３ＭのＮａＣｌで溶離した）及びＢ（０．３〜０．４ＭのＮａＣｌで溶離した）と称した。活性ピークＡ及びＢを別々にプールし、下記の３工程操作を使用して両方のピークを更に精製した。
【０２０３】
固体（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を上記タンパク質フラクションに１．７Ｍの最終濃度まで添加した。次いでタンパク質を１ｍｌ／分で５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７中１．７Ｍの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４で平衡にされたフェニル−スペロース５／５カラムに適用した。カラムに結合したタンパク質を０．５ｍｌ／分で１．７Ｍの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０％のエチレングリコール、５０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０〜２５％のエチレングリコール、２５ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０（（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４なし）の線形勾配で溶離した。フラクションを１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０に対し一夜透析した。ＳＣＲに対する夫々のフラクション中の活性をバイオアッセイにより測定した。
最高の活性を有するフラクションをプールし、１ｍｌ／分で２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０で平衡にされたモノＱ５／５カラムに適用した。カラムに結合したタンパク質を２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０中０〜１ＭのＮａＣｌの線形勾配により１ｍｌ／分で溶離した。
【０２０４】
精製の最終工程について、上記の最も活性なフラクション（ＳＣＲバイオアッセイにより測定した）をプールし、第二のフェニルースペロース５／５カラムにかけた。固体（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を１．７Ｍの最終濃度まで添加した。次いでその溶液を１ｍｌ／分で５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７中１．７Ｍの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４で平衡にされたそのカラムに装填した。カラムに結合したタンパク質を１．７Ｍの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、５０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０〜１０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０の線形勾配で０．５ｍｌ／分で溶離した。フラクションを１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０に対し一夜透析した。ＳＣＲに対する夫々のフラクション中の活性をバイオアッセイにより測定した。
ピークＡからの上記の３工程操作による最終精製タンパク質を毒素Ａと称し、ピークＢからの最終精製タンパク質を毒素Ｂと称した。
【０２０５】
毒素Ａ及び毒素Ｂの特性決定及びアミノ酸配列決定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中に、毒素Ａ及び毒素Ｂの両方は２種の主要（全クーマシー染色タンパク質の９０％より大）ペプチド：１９２ｋＤａ（夫々Ａ１及びＢ１と称する）及び５８ｋＤａ（夫々Ａ２及びＢ２と称する）を含んでいた。毒素Ａ及び毒素Ｂの両方は天然ＰＡＧＥ中に唯一の主要バンドを明らかにし、Ａ１及びＡ２が一種のタンパク質複合体のサブユニットであり、かつＢ１及びＢ２が一種のタンパク質複合体のサブユニットであることを示した。更に、毒素Ａ及び毒素Ｂの両方の天然分子量はゲル濾過クロマトグラフィーにより８６０ｋＤａであることが測定された。Ａ１対Ａ２の相対モル濃度はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリー分析により測定して１対１の当量であると判断された。同様に、Ｂ１ペプチド及びＢ２ペプチドは同じモル濃度で存在した。
【０２０６】
毒素Ａ及び毒素Ｂを１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で電気泳動にかけ、ＰＶＤＦ膜にトランスブロットした。ブロットを夫々ハーバード・ミクロケム及びケンブリッジ・プロケムにアミノ酸分析及びＮ末端アミノ酸配列決定のために送った。Ｂ１のＮ末端アミノ酸配列は配列番号１、ｔｃｂＡ遺伝子のＴｃｂＡ_ｉｉ領域（配列番号１２、位置８７−９９）と同一であることが決定された。特異なＮ末端配列をペプチドＢ２について得た（配列番号４０）。ペプチドＢ２のＮ末端アミノ酸配列はｔｃｂＡ遺伝子の誘導アミノ酸配列のＴｃｂＡ_ｉｉｉ領域（配列番号１２、位置１９３５−１９４５）と同一であった。それ故、Ｂ毒素は主として２種のペプチド、ＴｃｂＡ_ｉｉ及びＴｃｂＡ_ｉｉｉを含み、これらが同じ遺伝子産物、ＴｃｂＡから誘導されることが観察された。
Ａ２のＮ末端配列（配列番号４１）はＴｃｂＡ_ｉｉｉペプチド及びその他のペプチドと比較して特異であった。Ａ２ペプチドをＴｃｄＡ_ｉｉｉと称した（実施例１７を参照のこと）。配列番号６はアミノ酸配列配列番号４０及び配列番号４１の混合物であることが決定された。
【０２０７】
更に、ペプチドＡ１及びＡ２を内部アミノ酸配列決定にかけた。内部アミノ酸配列決定について、毒素Ａ１０μｇを１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で電気泳動にかけ、ＰＶＤＦ膜にトランスブロットした。ブロットをアミドブラックで染色した後、夫々ＴｃｄＡ_ｉｉ及びＴｃｄＡ_ｉｉｉと称されるペプチドＡ１及びＡ２をブロットから切除し、ハーバード・ミクロケム及びケンブリッジ・プロケムに送った。ペプチドをトリプシン消化、続いてＨＰＬＣクロマトグラフィーにかけて個々のペプチドを分離した。Ｎ末端アミノ酸分析を選択されたトリプシンペプチドフラグメントについて行った。ペプチドＡ１の二つの内部アミノ酸配列（ＴｃｄＡ_ｉｉ−ＰＫ７１、配列番号３８及びＴｃｄＡ_ｉｉ−ＰＫ４４、配列番号３９）はｔｃｂＡ遺伝子のＴｃｂＡ_ｉｉ領域の演繹アミノ酸配列（配列番号１２）と有意な相同性を有することがわかった。同様に、ペプチドＡ２のＮ末端配列（配列番号４１）及び二つの内部配列（ＴｃｄＡ_ｉｉｉ−ＰＫ５７、配列番号４２及びＴｃｄＡ_ｉｉｉ−ＰＫ２０、配列番号４３）はまたｔｃｂＡ遺伝子のＴｃｂＡ_ｉｉｉ領域の演繹アミノ酸配列（配列番号１２）と有意な相同性を示した。
【０２０８】
上記結果を要約すると、毒素複合体はＳＣＲに対し少なくとも二つの活性タンパク質毒素複合体、毒素Ａ及び毒素Ｂを有する。毒素Ａ及び毒素Ｂはそれらの天然分子量及びサブユニット分子量が同様であるが、それらのペプチド組成が異なる。毒素Ａは主要ペプチドとしてＴｃｄＡ_ｉｉ及びＴｃｄＡ_ｉｉｉを含み、また毒素Ｂは主要ペプチドとしてＴｃｂＡ_ｉｉ及びＴｃｂＡ_ｉｉｉを含む。
【０２０９】
実施例 １６　ＴｃｂＡ ペプチドの開裂及び活性化
毒素Ｂ複合体において、ペプチドＴｃｂＡ_ｉｉ及びＴｃｂＡ_ｉｉｉは単一遺伝子産物ＴｃｂＡに由来する（実施例１５）。ＴｃｂＡペプチドからＴｃｂＡ_ｉｉ及びＴｃｂＡ_ｉｉｉへのプロセシングはおそらく一種以上のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓプロテアーゼ、そしておそらく実施例１０に記載されたメタロプロテアーゼの作用によるものである。或る場合には、ＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓＷ−１４ブロースをプロセシングした時、ＴｃｂＡペプチドが、ペプチドＴｃｂＡ_ｉｉ及びＴｃｂＡ_ｉｉｉに加えて主要成分として毒素Ｂ複合体中に存在することが注目された。毒素Ｂ複合体の精製について記載された（実施例１５）のと同じ操作を使用してＷ−１４ブロースの毒素複合体フラクションからペプチドＴｃｂＡを濃縮した。最終精製物質を４−２０％の勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分析し、主要ペプチドをデンシトメトリーにより定量した。ＴｃｂＡ、ＴｃｂＡ_ｉｉ及びＴｃｂＡ_ｉｉｉは全タンパク質の夫々５８％、３６％、及び６％を構成することが測定された。これらのペプチドの同定をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びモノ特異性抗体を使用するウェスタンブロット分析でそれらの夫々の分子サイズにより確認した。このフラクションの天然分子量を測定したところ、８６０ｋＤａであった。
【０２１０】
上記精製物質を精製された３８ｋＤａ及び５８ｋＤａのＷ−１４Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓメタロプロテアーゼ（実施例１０）、及び対照酵素としてのトリプシン（シグマ，ＭＯ）で処理することにより、ＴｃｂＡの開裂を評価した。標準反応液は１００μｌの合計容積中に上記精製フラクション１７．５μｇ、１．５単位のプロテアーゼ、及び０．１Ｍのトリス緩衝液、ｐＨ８．０からなっていた。対照反応について、プロテアーゼを省いた。その反応混合物を３７℃で９０分間インキュベートした。反応の終了時に、２０μｌを採取し、４−２０％の勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中の電気泳動分析のために直ちにＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液とともに沸騰させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥから、３８ｋＤａ及び５８ｋＤａのプロテアーゼ処理の両方において、ペプチドＴｃｂＡ_ｉｉ及びＴｃｂＡ_ｉｉｉの量が約３倍増加し、一方、ＴｃｂＡペプチドの量が比例して減少したことが測定された（表２３）。選択されたペプチドの相対減少及び増強をウェスタンブロット分析により確かめた。更に、開裂された物質のゲル濾過は、複合体の天然分子量が同じままであったことを明らかにした。トリプシン処理後に、ペプチドＴｃｂＡ及びＴｃｂＡ_ｉｉを小さいペプチドに非特異的に消化した。これは、３８ｋＤａ及び５８ｋＤａのＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓプロテアーゼがペプチドＴｃｂＡをペプチドＴｃｂＡ_ｉｉ及びＴｃｂＡ_ｉｉｉに特異的にプロセシングし得ることを示した。
【０２１１】
残りの８０μｌの反応混合物のプロテアーゼ処理対照及び未処理対照を１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で連続希釈し、ＳＣＲバイオアッセイにより分析した。幾つかの希釈液中の活性を比較することにより、３８ｋＤａのプロテアーゼ処理はＳＣＲ殺虫活性を約３〜４倍に増加することが測定された。プロテアーゼ処理における残存昆虫の成長抑制はまた対照よりも苛酷であった（表２３）。
【０２１２】
【表２６】
表２３．プロテアーゼ処理によるペプチドＴｃｂＡからペプチドＴｃｂＡ_ｉｉ及びＴｃｂＡ_ｉｉｉ　への変換及び活性化

＊　：　アッセイ中の給餌の５日後に生存昆虫の平均体重を測定することによる成長抑制の指標
【０２１３】
実施例 １７ 　 ＴｃｄＡ _ｉｉ ペプチドをコードする遺伝子のライブラリーのスクリーニング
配列番号１７（内部ペプチドＴｃｄＡ_ｉｉ−ＰＴ１１１Ｎ末端配列）及び配列番号１８（内部ペプチドＴｃｄＡ_ｉｉ−ＰＴ７９Ｎ末端配列）として記載されたＴｃｄＡ_ｉｉペプチドをコードする遺伝子のクローニング及び特性決定を完結した。配列番号１７（表２４）及び配列番号１８（表２５）のアミノ酸配列並びにこれらの配列の逆補体をコードするするように設計された縮重オリゴヌクレオチドの２種のプールを実施例８に記載されたようにして合成した。オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を以下に示す。
【０２１４】
【表２７】
表２４．配列番号１７のための縮重オリゴヌクレオチド

【０２１５】
【表２８】
表２４　続き

【０２１６】
【表２９】
表２５．配列番号１８のための縮重オリゴヌクレオチド

【０２１７】
【表３０】
表２５．つづき

＊　ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢに従い、ヌクレオチドに対するコードは、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｈ＝Ａ、Ｃ、またはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｒ＝ＡまたはＧ、およびＭ＝ＡまたはＣ。
【０２１８】
全てのフォワード／リバース組み合わせにおいて、フォワードプライマーとしてＰ２．３．６．ＣＢまたはＰ２．３．５．を使用し、リバースプライマーとしてＰ２．７９．Ｒ．１またはＰ２．７９Ｒ．ＣＢを使用し、鋳型としてＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓＷ−１４ゲノムＤＮＡを使用して、実質的に実施例８に記載されたようにしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。反応の別の組において、全てのフォワード／リバース組み合わせにおいて、プライマーＰ２．７９．２またはＰ２．７９．３をフォワードプライマーとして使用し、またＰ２．３．５Ｒ、Ｐ２．３．５ＲＩ、及びＰ２．３Ｒ．ＣＢをリバースプライマーとして使用した。リバースプライマーとしてのＰ２．７９．Ｒ．１またはＰ２．７９Ｒ．ＣＢと組み合わせたフォワードプライマーとしてのＰ２．３．６．ＣＢを含む反応のみにおいて、２５００塩基対の推定サイズ（アガロースゲルにおける移動度）の非人工増幅産物が見られた。この増幅産物を得るのに使用したプライマーの順序は、ペプチドフラグメントＴｃｄＡ_ｉｉ−ＰＴ１１１がペプチドフラグメントＴｃｄＡ_ｉｉ−ＰＴ７９にアミノ近位にあることを示す。
【０２１９】
２５００ｂｐ　ＰＣＲ産物を供給業者の指示に従ってプラスミドベクターｐＣＲ^ＴＭＩＩ（インビトロゲン，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）につなぎ、２種の分離物（ＨＳ２４及びＨＳ２７）のインサートフラグメントの末端を横切るＤＮＡ配列を、供給業者の推奨したプライマー及び前記配列決定方法を使用して測定した。両方の単離物の配列は同じであった。新規プライマーを決定された配列に基いて合成し、付加的な配列決定反応を開始するのに使用してインサート［配列番号３６］の合計２５５７塩基を得た。配列番号３６によりコードされた部分ペプチドの翻訳が配列番号３７として開示された８４５アミノ酸配列を生じる。ＴｃｄＡ_ｉｉペプチドフラグメントのこの部分のタンパク質相同性分析はタンパク質ＴｃｂＡ［配列番号１２］の残基５４２−１３９０に対する実質的なアミノ酸相同性（６８％の類似性；５３％の同一性）を明らかにする。それ故、配列番号３６により一部表される遺伝子が同様のタンパク質を産生するが、ＴｃｂＡと同一のアミノ酸配列を産生しないことが明らかであり、それはおそらくＴｃｂＡタンパク質と同様であるが、同一ではない生物活性を有する。
【０２２０】
更に別の場合、配列番号９（内部ペプチドＴｃｄＡ_ｉｉ−ＰＫ４４配列）、及び配列番号４１（ＴｃｄＡ_ｉｉｉ５８ｋＤａＮ末端ペプチド配列）として記載されたペプチドＴｃｄＡ_ｉｉ−ＰＫ４４及びＴｃｄＡ_ｉｉｉ５８ｋＤａＮ末端ペプチドをコードする遺伝子を単離した。配列番号３９（表２７）及び配列番号４１（表２６）、並びにこれらの配列の逆補体をコードするように設計された縮重オリゴヌクレオチドの２種のプールを実施例８、及びそれらのＤＮＡ配列に記載されたようにして合成した。
【０２２１】
【表３１】
表２６．配列番号４１のための縮重オリゴヌクレオチド

【０２２２】
【表３２】
表２６．つづき

【０２２３】
【表３３】
表２７．配列番号３９のための縮重オリゴヌクレオチド

【０２２４】
【表３４】
表２７．つづき

【０２２５】
全てのフォワード／リバース組み合わせにおいて、フォワードプライマーとしてＡ１．４４．１またはＡ１．４４．２を使用し、リバースプライマーＡ２．３ＲまたはＡ２．４Ｒを使用し、鋳型としてＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓＷ−１４ゲノムＤＮＡを使用して、実質的に実施例８に記載されたようにしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。反応の別の組において、全てのフォワード／リバース組み合わせにおいて、プライマーＡ２．１またはＡ２．２をフォワードプライマーとして使用し、またＡ１．４４．１Ｒ及びＡ１．４４．２Ｒをリバースプライマーとして使用した。リバースプライマーとしてのＡ２．３Ｒと組み合わせたフォワードプライマーとしてのＡ１．４４．１またはＡ１．４４．２を含む反応のみにおいて、１４００塩基対の推定サイズ（アガロースゲルにおける移動度）の非人工増幅産物が見られた。この増幅産物を得るのに使用したプライマーの順序は、ペプチドフラグメントＴｃｄＡ_ｉｉ−ＰＫ４４がＴｃｄＡ_ｉｉｉの５８ｋＤａペプチドフラグメントにアミノ近位にあることを示す。
【０２２６】
１４００ｂｐ　ＰＣＲ産物を供給業者の指示に従ってプラスミドベクターｐＣＲ^ＴＭＩＩにつないだ。４種の分離物のインサートフラグメントの末端を横切るＤＮＡ配列を、供給業者の推奨したプライマーと配列の似ているプライマーを使用し、また前記配列決定方法を使用して測定した。全ての分離物の核酸配列は縮重プライマー配列に相当する領域において予想されたように異なっていたが、これらのデータから演繹されたアミノ酸配列は先に決定されたペプチドに関する実際のアミノ酸配列（配列番号４１及び配列番号３９）と同じであった。
先に調製したＤＮＡ（配列番号３６）を含む放射能標識プローブによる実施例８に記載されたＷ−１４ゲノムコスミドライブラリーのスクリーニングは５種のハイブリッド形成性コスミド分離物、即ち、１７Ｄ９、２０Ｂ１０、２１Ｄ２、２７Ｂ１０、及び２６Ｄ１を同定した。これらのコスミドは配列番号１１または配列番号２５として記載された遺伝子に相当するプローブで先に同定されたものとは異なった。制限酵素分析及びＤＮＡブロットハイブリダイゼーションは、配列番号３６のＤＮＡを含む領域をスパンするおよそのサイズ３．７、３．７、及び１．１ｋｂｐの３種のＥｃｏＲ　Ｉフラグメントを同定した。この実施例で調製された放射能標識された１．４ｋｂｐのＤＮＡフラグメントをプローブとして使用するＷ−１４ゲノムコスミドライブラリーのスクリーニングは同じ５種のコスミド（１７Ｄ９、２０Ｂ１０、２１Ｄ２、２７Ｂ１０、及び２６Ｄ１）を同定した。また、ＥｃｏＲ　Ｉ消化コスミドＤＮＡに関するＤＮＡブロットハイブリダイゼーションは２．５ｋｂｐのＴｃｄＡ_ｉｉ遺伝子プローブで見られたのと同じＥｃｏＲ　Ｉフラグメントのサブセットに関するハイブリダイゼーションを示し、両方のフラグメントがゲノムＤＮＡでコードされることを示した。
【０２２７】
クローン化ＥｃｏＲ　ＩフラグメントのＤＮＡ配列決定は２５１６アミノ酸（配列番号４７）の２８２．９ｋＤａをコードする７５５１塩基対（配列番号４６）の中断されない読み取り枠を明らかにした。このタンパク質のアミノ酸配列の分析はペプチドＴｃｄＡ_ｉｉの全ての予想された内部フラグメント（配列番号１７、１８、３７、３８及び３９）及びＴｃｄＡ_ｉｉｉペプチドＮ末端（配列番号４１）並びに全てのＴｃｄＡ_ｉｉｉ内部ペプチド（配列番号４２及び４３）を明らかにした。ＴｃｄＡ_ｉｉ及びＴｃｄＡ_ｉｉｉとして単離され、同定されたペプチドは、配列番号４６として開示されたｔｃｄＡと称される読み取り枠の夫々の産物である。更に、配列番号４７は位置８９で開始することを示し、配列番号１３として開示された配列（これは約２０１ｋＤａのサイズのペプチドのＮ末端配列である）は配列番号４６から生じた初期タンパク質が配列番号１２について先に開示されたタンパク質と同様の方法でプロセシングされることを示す。加えて、そのタンパク質は更に開裂されて、配列番号４８によりコードされ、配列番号４９（ＴｃｄＡ_ｉｉペプチド）として開示されたサイズ２０９．２ｋＤａの産物、及び配列番号５０によりコードされ、配列番号５１（ＴｃｄＡ_ｉｉｉペプチド）として開示されたサイズ６３．６ｋＤａの産物を生じる。
【０２２８】
こうして、配列番号４６の産物から誘導された毒素Ａ（実施例１５）として同定された殺虫活性は、配列番号４７として開示された２８２．９ｋＤａの完全長タンパク質により例示されるように、プロセシングされて配列番号４９及び５１として開示されたペプチドを生じるものと考えられる。毒素Ｂ（実施例１５）として同定された殺虫活性は、配列番号１２として開示された２８０．６ｋＤａのタンパク質により例示されるように、配列番号１１の産物に由来するものと考えられる。このタンパク質はタンパク質分解処理されて配列番号５３として開示された２０７．６ｋＤａのタンパク質（これは配列番号５２によりコードされる）、及び配列番号４０として開示され、更に配列番号５５として開示されたＮ末端配列を有する６２．９ｋＤａのペプチド（これは配列番号５４によりコードされる）を生じる。
配列番号１２及び配列番号４７として開示されたタンパク質のアミノ酸配列比較は、それらが６９％の類似性及び５４％の同一性を有することを明らかにする。進化的関係のこの高い程度はこれらのペプチドの全アミノ酸配列中で一様ではないが、タンパク質のカルボキシ末端に向かって高い。何となれば、配列番号５１（配列番号４７から誘導された）及び配列番号５５（配列番号１２から誘導された）として開示されたペプチドは７６％の類似性及び６４％の同一性を有するからである。
【０２２９】
実施例 １８ 　　 Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ （株 Ｗ−１４ ）ブロースの噴霧適用によるトウモロコシ植物に関するヨーロピアン・コーンボラー誘発葉損傷の防除
昆虫幼虫により生じる植物損傷を軽減する一種以上のＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ毒素の能力を、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓブロースで処理されたトウモロコシ植物に発生されるヨーロピアン・コーンボラー（オストリニア・ヌビラリス（Ｏｓｔｒｉｎｉａ　ｎｕｂｉｌａｌｉｓ））により生じる葉損傷を測定することにより実証した。Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株Ｗ−１４からの醗酵ブロースを生産し、実施例１３に記載されたようにして限外濾過（１０，０００ＭＷ細孔サイズ）を使用して約１０倍に濃縮した。次いで得られる濃縮ブロースを、０．２ミクロンのニトロセルロース膜フィルターを使用してフィルター滅菌した。未接種の２％プロテオースペプトン＃３の同様に調製したサンプルを対照目的で使用した。トウモロコシ植物（ダウエランコ（ＤｏｗＥｌａｎｃｏ）所有の同系繁殖系）を温室（日中２７℃；夜間２２℃、約５０％ＲＨ、１４時間の日の長さ、必要により散水／施肥）中で無土壌混合物を含むポット中で種子から栄養成長期７または８まで育成した。
【０２３０】
試験植物を日中約２２℃；夜間１８℃の温度で、人工光を使用しないて、部分遮蔽し、約５０％のＲＨで必要により散水／施肥して温室中でランダム化完全ブロック設計（３レプ／処理、６植物／処理）で配置した。処理（未接種培地及び濃縮Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓブロース）をシリンジスプレーで適用し、２．０ｍｌを渦巻きで直接（約６インチ）適用し、追加の２．０ｍｌを渦巻きの上約１フィートから円形運動で適用した。加えて、植物の１グループは処理を受けなかった。処理が乾燥した後（約３０分間）、１２の新生子のヨーロピアン・コーン・ボラー幼虫（市販源から卵を入手し、室内で誘化させた）を渦巻きに直接適用した。１週間後、改良グスリースケール（Ｇｕｔｈｒｉｅ　Ｓｃａｌｅ）（Ｋｏｚｉｅｌ，Ｍ．Ｇ．，Ｂｅｌａｎｄ，Ｇ．Ｌ．，Ｂｏｗｍａｎ，Ｃ．，Ｃａｒｏｚｚｉ，Ｎ．Ｂ．，Ｃｒｅｎｓｈａｗ．Ｒ．，Ｃｒｏｓｓｌａｎｄ，Ｌ．，Ｄａｗｓｏｎ，Ｊ．，Ｄｅｓａｉ，Ｎ．，Ｈｉｌｌ．，Ｍ．，Ｋａｄｗｅｌｌ，Ｓ．，Ｌａｕｎｉｓ，Ｋ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｋ．，Ｍａｄｄｏｘ，Ｄ．，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｋ．，Ｍｅｇｈｊｉ，Ｍ．Ｚ．，Ｍｅｒｌｉｎ，Ｅ．，Ｒｈｏｄｅｓ，Ｒ．，Ｗａｒｒｅｎ，Ｇ．Ｗ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｍ．及びＥｖｏｌａ，Ｓ．Ｖ．１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１，１９４−１９５）を使用して、植物を葉への損傷についてスコアをつけ、スコアを統計上比較した［Ｔテスト（ＬＳＤ）ｐ＜０．０５及びタキィスチューデント化レンジ（ＨＳＤ）テストｐ＜０．１］。結果を表２８に示す。参考として、１のスコアは損傷なしを表し、２のスコアはピンホール侵入のない巻かれていない葉に対する”ウィンドーパン”損傷を表し、また５のスコアは三つより多い葉について明らかな細長い病変及び／または中ろくフィーディング（ｆｅｅｄｉｎｇ）を有する葉侵入（病変＜１インチ（２．５４ｃｍ））を表す。これらのデータは、フラクションを含むブロースまたはその他のタンパク質が噴霧可能な配合で送出された時またはタンパク質もしくはその部分をコードする遺伝子またはその誘導体がトランスジェニック植物または微生物を介して送出される時に特定の昆虫ペストに対する保護を与え得ることを示す。
【０２３１】
【表３５】
表２８．トウモロコシに対するヨーロピアン・コーン・ボラー誘発葉損傷に関するＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ培養ブロースの効果

異なる文字を有する平均は統計上異なる（ｐ＜０．０５またはｐ＜０．１）
【０２３２】
実施例 １９　Ｅ．ｃｏｌｉ 中の発現のための遺伝子の遺伝子操作
構築の要約
一連のプラスミドを構築してエシェリキア・コリ中でＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓＷ−１４のｔｃｂＡ遺伝子を発現した。プラスミドのリストを表２９に示す。夫々の構築並びに得られたＥ．ｃｏｌｉ発現データの要約を以下に簡単に記載する。
【０２３３】
【表３６】
表２９．ｔｃｂＡ遺伝子の発現プラスミド

略号：Ｋａｎ＝カナマイシン、Ｃｈｌ＝クロラムフェニコール、Ａｍｐ＝アンピシリン
【０２３４】
ｐＤＡＢ６３４ の構築
実施例９に、ＴｃｂＡ_ｉｉプローブにハイブリッドを形成する大きいＥｃｏＲ　Ｉフラグメントが記載される。このフラグメントをｐＢＣ（ストラタゲン，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ　ＣＡ）にサブクローン化した。配列分折は、このフラグメントが８８１６塩基対であることを示す。そのフラグメントは位置５７１に開始ＡＴＧを有し、位置８０８６に終止ＴＡＡを有するｔｃｂＡ遺伝子をコードする。それ故、そのフラグメントはＡＴＧの上流にＰｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓＤＮＡの５７０塩基対を有し、ＴＡＡの下流に７３０塩基対を有する。
【０２３５】
プラスミド ｐＡｃＧＰ６７Ｂ／ｔｃｂＡ の構築
下記のプライマーを使用してｔｃｂＡ遺伝子をＰＣＲ増幅した。５’プライマー（Ｓ１Ａｃ５１）５’ＴＴＴ　ＡＡＡ　ＣＣＡ　ＴＧＧ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　ＣＡＴ　ＴＡＴ　ＣＡＡ　ＧＣＡ　ＣＴＡ　ＴＣ３’及び３’プライマー（Ｓ１Ａｃ３１）５’ＴＴＴ　ＡＡＡ　ＧＣＧ　ＧＣＣ　ＧＣＴ　ＴＡＡ　ＣＧＧ　ＡＴＧ　ＧＴＡ　ＴＡＡ　ＣＧＡ　ＡＴＡ　ＴＧ　３’。下記の反応でパンベラ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）からのタカラＬＡ　ＰＣＲキットを使用して、ＰＣＲを行った。５７．５ｍｌの水、１０ｍｌの１０Ｘ　ＬＡ緩衝液、１６ｍｌのｄＮＴＰ（夫々２．５ｍＭの原液）、２０ｍｌの夫々のプライマー（１０ｐモル／ｍｌ）、３００ｎｇのＷ−１４　ｔｃｂＡ遺伝子を含むプラスミドｐＤＡＢ６３４及び１ｍｌのタカラＬＡ　Ｔａｑポリメラーゼ。サイクル条件は３０サイクルについて９８℃／２０秒、６８℃／５分、７２℃／１０分であった。予想される約７５２６ｂｐのＰＣＲ産物をＴＢＥ（１００ｍＭのトリス、９０ｍＭのホウ酸、１ｍＭのＥＤＴＡ）緩衝液中０．８％のアガロースゲル中で単離し、キアゲン（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）からのＱｌａｅｘ　ＩＩキットを使用して精製した。精製ｔｃｂＡ遺伝子をＮｃｏ　Ｉ及びＮｏｔ　Ｉで消化し、バキュロウイルス移入ベクターｐＡｃＧＰ６７Ｂ（ファーミンゲン（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））につなぎ、ＤＨ５　αＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。次いでｔｃｂＡ遺伝子をｐＡｃＧＰ６７Ｂから切断し、ｐＥＴ２７ｂに移入してプラスミドｐＤＡＢ６３５をつくった。ｔｃｂＡ遺伝子中のミスセンス突然変異をｐＤＡＢ６３５中で修復した。
【０２３６】
修復されたｔｃｂＡ遺伝子は配列番号１１に示された配列からの二つの変化；アスパラギン７１をセリン７１に変化する２１２におけるＡ＞Ｇ及びアラニン７７をスレオニン７７に変化する２２９におけるＧ＞Ａを含む。これらの変化は両方とも提案されたＴｃｂＡ_ｉｉＮ末端の上流である。
ｐＥＴ１５−ｔｃｂＡ の構築
ｐＤＡＢ６３５のｔｃｂＡコード領域をベクターｐＥＴ１５ｂに移入した。ショットガン結合を使用してこれを行い、ＤＮＡを制限酵素Ｎｃｏ　Ｉ及びＸｈｏ　Ｉで切断した。得られた組換え体をｐＥＴ１５−ｔｃｂＡと称する。
【０２３７】
プラスミド ｐＥＴ１５−ｔｃｂＡ から Ｅ．ｃｏｌｉ 中の ＴｃｂＡ の発現
Ｅ．ｃｏｌｉ中のｔｃｂＡの発現を、Ｓｔｕｄｉｅｒら（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．，Ｄｕｎｎ，Ｊ．，及びＤｕｂｅｎ−ｄｏｒｆｆ，Ｊ．，（１９９０）クローン化遺伝子の発現を誘導するためのＴ７ＲＮＡポリメラーゼの使用Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８５：６０−８９）により既に記載された方法の改良により得た。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞株ＢＬ２１（ＤＥ３）をプラスミドｐＥＴ１５−ｔｃｂＡで形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び４０ｍＭのグルコースを含むＬＢ寒天に塗布した。形質転換細胞を数百の単離コロニー／プレートの密度まで塗布した。３７℃一夜のインキュベーション後に、細胞をプレートからこすり落とし、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢブロース中で懸濁させた。典型的な培養容積は２００−５００ｍｌであった。０時に、培養密度（ＯＤ６００）は実験に応じて０．０５−０．１５であった。０．１５−０．５の密度が得られるまで、培養物を三つの温度（２２℃、３０℃または３７℃）の一つで振とうし、その時点でそれらを１ｍＭのイソプロピルチオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。培養物を指定温度で４〜５時間インキュベートし、次いで処理するまで４℃に移した（１７〜７２時間）。
【０２３８】
プラスミド ｐＥＴ１５−ｔｃｂＡ から Ｅ．ｃｏｌｉ 中で発現された ＴｃｂＡ の精製及び特性決定
ＴｃｂＡペプチドを発現するＥ．ｃｏｌｉ培養物を以下のようにして処理した。細胞を１７，０００ｘＧで遠心分離により回収し、培地をデカントし、別の容器中で保存した。Ｍ１２（アミコン，Ｂｅｖｅｒｌｙ　ＭＡ）濾過系及び１００ｋＤ分子量カット−オフフィルターを使用して、培地を約８倍に濃縮した。濃縮培地を陰イオン交換カラムに装填し、結合したタンパク質を１．０ＭのＮａＣｌで溶離した。１．０ＭのＮａＣｌ溶離ピークはサザン・コーン・ルートワーム（ＳＣＲ）幼虫に対し死亡を生じることがわかった（表３０）。１．０ＭのＮａＣｌフラクションを１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０に対し透析し、濃縮し、セファロースＣＬ−４Ｂ（ファーマシア，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）によるゲル濾過にかけた。天然Ｗ−１４毒素複合体としての計算分子量（約９００ｋＤａ）に相当するＣＬ−４Ｂ溶離プロフィールの領域を回収し、濃縮し、幼虫に対しバイオアッセイを行った。
【０２３９】
回収した９００ｋＤａのフラクションは殺虫活性を有することがわかり（表３０を参照のこと）、症候解滅（ｓｙｍｐｔｏｍｏｌｏｇｙ）が天然Ｗ−１４毒素複合体により生じた症候解滅と同様であった。このフラクションをプロテイナーゼＫ及び熱処理にかけ、両方の場合の活性を排除または低下し、その活性が性質上タンパク様であるという証拠を得た。加えて、試験した活性フラクションは抗ＴｃｂＡ_ｉｉモノクローナル抗体で試験した時にイムノブロットアッセイでＴｃｂＡペプチド及びＴｃｂＡ_ｉｉｉペプチドについて免疫学的に陽性であった。
【０２４０】
【表３７】
表３０．イムノブロットアッセイ及びＳＣＲバイオアッセイの結果

ＰＫ＝　プロテイナーゼＫ処理２時間；熱処理＝１００　℃で１０分間；　ＮＤ＝　検出されず；ＮＴ＝　試験せず。対照サンプルと比較した死亡率及び成長抑制に関するスコアリング系；　５−２４％＝“＋”、２５−４９　％＝“＋＋”　、５０−１００％＝“＋＋＋”
【０２４１】
細胞ペレットを１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＝７．０に再度懸濁させ、バイオーネブ^ＴＭ細胞ネブライザー（グラスーコル社，Ｔｅｒｒａ　Ｈａｕｔｅ，ＩＮ）中の通過により溶解した。ペレットをＤＮａｓｅで処理してＤＮＡを除去し、１７，０００ｘｇで遠心分離して細胞ペレットを細胞上澄みから分離した。上澄みフラクションをデカントし、０．２ミクロンのフィルターで濾過して大きい粒子を除去し、陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。結合したタンパク質を１．０ＭのＮａＣｌで溶離し、透析し、５０，０００ダルトンの分子量カット−オフでバイオマックス^ＴＭ（ミリポア・コーポレーション，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）濃縮装置を使用して濃縮した。濃縮フラクションを、セファロースＣＬ−４Ｂビードマトリックスを使用してゲル濾過クロマトグラフィーにかけた。このようにして調製した物質に関するバイオアッセイを表３０に示し、”ＴｃｂＡ細胞Ｓｕｐ”と称する。
【０２４２】
多量の物質を取り扱う別法において、細胞ペレットを１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＝７．０に再度懸濁させ、コンテス・グラス社（Ｖｉｎｅｌａｎｄ，ＮＪ）の４０ｍｌの組織粉砕機を使用することにより充分に均一にした。細胞デブリを２５，０００ｘｇで遠心分離によりペレット化し、細胞上澄みをデカントし、０．２ミクロンのフィルターに通し、ポロスＨＱ５０ビーズを詰め込んだファーマシア１０／１０カラムを使用して陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。０．０〜１．０ＭのＮａＣｌ勾配を行うことにより結合したタンパク質を溶離した。ＴｃｂＡタンパク質を含むフラクションを合わせ、５０ｋＤａ濃縮装置を使用して濃縮し、ファーマシアＣＬ−４Ｂビードマトリックスを使用してゲル濾過クロマトグラフィーにかけた。約９００ｋＤａの分子量のＴｃｂＡオリゴマーを含むフラクションを回収し、２０ｍＭのトリス緩衝液ｐＨ＝７．３で平衡にしたファーマシアモノＱ１０／１０カラムを使用して陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。
【０２４３】
０．０〜１．０ＭのＮａＣｌの勾配を使用して組換えＴｃｂＡタンパク質を溶離した。組換えＴｃｂＡは約０．３−０．４ＭのＮａＣｌの塩濃度でカラムから溶離し、同じモル濃度で天然ＴｃｂＡオリゴマーがモノＱ１０／１０カラムから溶離される。組換えＴｃｂＡオリゴマーは表３０中の実験と同様のバイオアッセイ実験でＳＣＲ死亡率を生じることがわかった。
【０２４４】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の毒素の配列遺伝子の一部として用いたクローン化ＤＮＡ分離物の対合を示す。
【図２】配列決定工程で用いた３つのプラスミドのマップである。
【図３】幾つかの部分ＤＮＡフラグメント間の関係を示すマップである。
【図４Ａ】ＴｃｂＡ_ｉｉおよびＴｃａＢ_ｉｉタンパク質のタンパク配列間の相同性分析を示す。
【図４Ｂ】ＴｃｂＡ_ｉｉおよびＴｃａＢ_ｉｉタンパク質のタンパク配列間の相同性分析を示す。
【図５】Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株の樹状図である。Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ株の関係はｒｅｐ−ＰＣＲで規定された。図５の上部の軸は、ｒｅｐ−ＰＣＲの得点に基づく株間の％類似性を示す（すなわち、０．０（類似性なし）から１．０（１００％類似性））。右軸の数字と文字は調べた種々の株を示す。すなわち、１４＝Ｗ−１４、Ｈｍ＝Ｈｍ、Ｈ９＝Ｈ９、７＝ＷＸ−７、１＝ＷＸ−１、２＝ＷＸ−２、８８＝ＨＰ８８、ＮＣ−１＝ＮＣ−１、４＝ＷＸ−４、９＝ＷＸ−９、８＝ＷＸ−８、１０＝ＷＸ−１０、ＷＩＲ＝ＷＩＲ、３＝ＷＸ−３、１１＝ＷＸ−１１、５＝ＷＸ−５、６＝ＷＸ−６、１２＝ＷＸ−１２、ｘ１４＝ＷＸ−１４、１５＝ＷＸ−１５、Ｈｂ＝Ｈｂ、Ｂ２＝Ｂ２、４８から５２＝ＡＴＣＣ４３９４８からＡＴＣＣ４３９５２。水平線を分けている垂直の線は水平線ベースにある株または株群の間の関係の度合い（例えば株Ｗ−１４は株Ｈ９およびＨｍと約６０％類似である）を示している（これは上部の軸と垂直線との外挿交点から読む）。
【図６Ａ】Ｗ−１４株のゲノムマップである。
【図６Ｂ】Ｗ−１４株のゲノムマップである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to toxins isolated from bacteria and the use of said toxins as insecticides.
[0002]
[Prior art]
Many insects are widely regarded as pests to homeowners, picnicers, gardeners, farmers, and other people whose investment in crops is often destroyed or reduced as a result of insect damage to crops. You. Significant insect damage to growers, especially in short growing seasons, means a loss of all benefits and a dramatic decrease in crop yield. Undersupply of certain agricultural products always results in high costs for food processors and subsequently for the end consumers of edible plants and products derived from these plants.
Preventing insect damage to crops and flower boats and eliminating troublesome pests typically relies on strong organic pesticides and pesticides with a wide range of toxicity. These synthetic products have been subject to public attacks because they were too harsh to the environment and to those exposed to such drugs. Similarly, in non-agricultural situations, homeowners will be pleased with keeping insects away from their homes and not having to kill insects for eating outdoors.
[0003]
The widespread use of chemical pesticides has raised environmental and health concerns for farmers, businesses that manufacture such pesticides, government agencies, public interest groups and the general public. Less invasive pest control methods have been driven both by concerns about the social environment and by advances in biological tools to elucidate insect control mechanisms. Biological control agents offer a promising option for chemical pesticides.
At each stage of evolution, organisms gain a variety of means to enhance their survival and survival. The use of biological molecules as a means of defense and attack is known throughout the animal and plant kingdoms. In addition, relatively new means of genetic engineering allow the modification of biological pesticides and provide specific solutions to specific problems.
[0004]
One such drug,Bacillus thuringiensis(Bt) is an effective insecticidal agent and is widely used industrially. In fact, Bt bacterial insecticides are proteins with limited toxicity and can be used as human food crops on the day of harvest. For non-targeted organisms; the Bt toxin is a digestible non-toxic protein.
Another class of already known biological insect control agents is the class of nematodes known as vectors of insecticidal bacterial symbiotes. Nematodes, including insecticidal bacteria, invade insect larvae. The bacteria then kill the larvae and the nematodes multiply in the larval carcasses. Subsequently, the nematode child eats the corpse from the body. The offspring of the bacteria-containing nematode thus produced can subsequently invade another new larva.
[0005]
So farSteinernemaandHeterorhabditisA genus insecticidal nematode was used as an insect control agent. Clearly, each genus of nematodes hosts a particular bacterium.HeterorhabditisIn nematodes of the genus, symbiotic bacteria arePhotorhabdus luminescensIt is.
Although these nematodes are effective insect control agents, they are currently expensive and difficult to manufacture and maintain, and to disperse the nematodes for insect control.
In the art, Hotahabudasperluminescence (Photorhabdus luminescensIt is known that pesticidal toxins can be separated from P.). This toxin is only active when injected into larvae of Lepidoptera and Coleoptera. This makes effective development of the insecticidal properties of nematodes or their commensal bacteria impossible. What would be important would be a more practical, non-labor-intensive method of drug delivery of insecticidal toxins that retain their biological properties after application. Have oral activityPhotorhabdusIt is highly desirable to find toxins produced by the genus. Separation and use of these toxins is desirable because they are effective. Until Applicants discovered, these toxins had never been isolated and characterized.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
Natural toxinsPhotorhabdusOf particular interest are protein complexes produced and secreted by growing bacterial cells of the genusPhotorhabdus luminescensA protein produced by a species. A protein complex having a molecular weight size of about 1000 kDa can be separated into a number of component proteins by SDS-PAGE gel analysis. This toxin does not contain hemolysin, lipase, type C phospholipase or nuclease activity. This toxin shows significant toxicity when exposed to a large number of insects.
The present invention provides for expression of the toxin in a heterologous system with an easily administrable insecticidal protein.
The present invention also provides a more effective method of drug delivery of insecticidal toxins with activity that functions against many insect orders.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present invention relates to a polynucleotide operably linked to a heterologous promoter, which encodes a protein having oral toxicity to insects, and a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 46. A polynucleotide having a complementary sequence of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 46, and capable of maintaining hybridization after washing and washing. The polynucleotide, wherein the polynucleotide is performed under 3xΔSSC, 0.1% ΔSDS. The present invention is also a transgenic plant cell comprising or capable of expressing such a polynucleotide.
Further, the present invention is a recombinant protein having oral toxicity to insects, wherein the protein is a mutant of a protein having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 47, The nucleotides encoding the variant can maintain hybridization after hybridization and washing with a complementary sequence of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 46, wherein said hybridization is performed at 25 ° C., 3 × SSC, said protein performed under 0.1% ＳＣSDS. The present invention is also a transgenic plant cell containing or capable of expressing such a protein.
[0008]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Objects, advantages and features of the present invention will become apparent from the following specification.
The present invention has oral toxicity to insectsPhotorhabdusThe aim is to discover extremely rare insecticidal toxins from the genus.PhotorhabdusIs an intrinsic property of its bioluminescence.PhotorhabdusCan be separated from various sources. One such source is nematodes, more specificallyHeterorhabditisIt is a nematode of the genus. Yet another source is from clinical samples obtained from human wounds (see, eg, Farmer et al., J. Clin. Microbiol. 27: 1594-1600 (1998)). These dead parasites have been deposited with the American Type Culture Collection (Rockville, MD) as ATCC # 43948, 43949, 43950, 43952, which is incorporated herein by reference. Others also produce pesticidal toxinsPhotorhabdusMay contain bacteria. Such sources in the environment could be of terrestrial or aqueous origin.
PhotorhabdusThe genus is taxonomically defined as a member of the family Enterobacteriaceae, but has certain atypical characteristics with respect to this family. For example, strains of this genus are negative for nitrate reduction, yellow and red chromogenic, and bioluminescent. This latter feature is not known in the Enterobacteriaceae.PhotorhabdusRecentlyXenorhabdus(Boemare et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 43: 249-255 (1993)). This difference can be attributed to DNA-DNA hybridization experiments, phenotypic differences (e.g., the presence or absence of catalase andPhotorhabdus)Nothing(Xenorhabdus)), The type of nematode host (Xenorhabdus; (Steinernematidae),Photorhabdus; (Heterorhabditidae)). Comparative analysis of cellular fatty acids (Janse et al., Lett. Appl. Microbiol. 10: 131-135 (1990); Suzuki et al., J. Gen. Appl. Microbiol. 36: 393-401 (1990))PhotorhabdusofXenorhabdusSupports separation from
[0009]
The collection of strains disclosed hereinPhotorhabdusTo make sure it containsPhotorhabdusAnd other Enterobacteriaceae andXenorhabdusThe nature of these strains was examined based on perceived characteristics to distinguish them from species (Farmer, Bergy's {Manual of of Systemic Bacteriology, Vol. 1, 510-511; Akhurst & Boemare, J. Gen. Microbiol. 134: 1835-1845 (1988); Boemale et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 43: 249-255 (1993), which are incorporated herein by reference). The characteristics examined were as follows: Gram-stained negative bacilli, microbial size, colony pigmentation, inclusion bodies, presence of catalase, nitrate reducing ability, biological luminescence, dye uptake, gelatin lysis, growth in selective media , Growth temperature, survival and motility under anaerobic conditions. Fatty acid analysis showed that all strains herein were singlePhotorhabdusIt was used to confirm that it belongs to the genus.
[0010]
at present,PhotorhabdusGenus bacteria are a single limited species,Photohabdus luminescence(ATCC standard strain # 29999, Poinar et al., Nematologica $ 23: 97-102 (1977)). Various related strains have been described in the literature (Akhhurst et al., J. Gen. Microbiol. 134: 1835-1845 (1988); Boerare et al., Int. J. Sys. Bacteriol. 43: 249-255 (1993); Putz). Et al., Appl. Environ. Microbiol. 56: 181-186 (1990)). In this specification, the properties of a number of strains were investigated. Such strains are listed in Table 18 in the Examples. at presentPhotorhabdusOnly one species (luminesence) Only, soluminesenceSpecies characteristics were used as characteristics of the strains herein. As can be seen in FIG. 5, these strains are very diverse.luminesenceHas some of the characteristics of the species and at the momentPhotohabdus luminescenceOthers with some different attributes that are not recognized as features ofPhotorhabdusIt is not unexpected that species will appear in the future. However, the scope of the present invention is not limited to any of the features and properties that produce proteins having functional activity as insect control agents.PhotorhabdusIncluding species or strains.
[0011]
Furthermore, as embodied herein,PhotorhabdusBacteria of the genus produce proteins with functional activity as defined herein. Of particular interest are:Photohabdus luminescenceA protein produced by a species. The invention herein should in no way be limited to the strains disclosed herein. These strainsPhotorhabdusDemonstrate, for the first time, that the proteins produced by the various isolates are toxic when exposed to insects. Therefore, included in the present invention, together with strains having the characteristics set forth herein and all mutants thereof, have the functional activity disclosed herein.PhotorhabdusAny strain or species of the genus.
[0012]
There are a number of terms that have particular meanings and are used herein, which are as follows:
As used herein, "functional activity" means that the protein toxin is orally active, has toxic effects, or interferes with or stops feeding (to kill insects). Irrespective of whether it causes or not), it means functioning as an insect control agent. When an insect is contacted with an effective amount of toxin provided by the expression of a transgenic plant, a formulated protein composition, a sprayable protein composition, a bait matrix or other drug delivery system, the repelling result typically is Or the insects cannot eat the bait that makes the toxins available to the insects.
[0013]
"PhotorhabdusWhen using the term "toxin," the termPhotorhabdusRefers to any protein produced by a microorganism strain that has functional activity against insects, in this case,PhotorhabdusThe toxin may be formulated as a sprayable composition, expressed by a transgenic plant, formulated as a bait matrix, distributed via a baculovirus, or any other available It is distributed using a host or drug delivery system.
The protein toxins discussed herein are typically referred to as "pesticides". As used herein, "pesticide" means that the protein has "functional activity" and is used as an insect control agent, as further defined herein.
[0014]
The term "oligonucleotide" refers to a macromolecule consisting of short strands of either RNA or DNA. Such chains are at least one nucleotide in length, but typically range from about 10 to 12 nucleotides. Determining the length of an oligonucleotide is well known in the art and should not be limited herein. Thus, oligonucleotides may be less than 10 or greater than 12.
As used herein, the term "toxic" or "toxic" refers toPhotorhabdusMeans that the toxin produced by has a "functional activity" as defined herein.
As used herein, "genetic material" is meant to include all genes, nucleic acids, DNA and RNA.
[0015]
Using the fermentation broth of the selected strain reported in Table 18,PhotorhabdusThe range of pesticidal toxin production by the genus, the insecticidal spectrum of these toxins, and the starting material for purification of toxin conjugates are provided. The strains characterized here have been shown to be orally toxic to the diverse eyes of insects. In such insect eyes,Coleoptera,Homoptera,Lepidoptera,Diptera,Acarina,HymenopteraandDictopteraBut are not limited to these.
For other bacterial toxins, the mutation rate within this bacterial population results in many related toxins that differ slightly from the existing sequence. The toxins of interest herein are those that, upon exposure, produce protein complexes that are toxic to a variety of insects as disclosed herein. Preferably, the toxin isColeoptera,Homoptera,Lepidoptera,Diptera,Acarina,HymenopteraandDictopteraHas activity against The present invention relates to a protein toxin produced by the strains herein and any derivative strains thereof,PhotorhabdusIt is intended to include all protein toxins produced by the same type of protein toxin. These homologous proteins may differ in sequence, but do not differ in function from these toxins described herein. Allogeneic toxins include protein complexes between 300 kDa and 2000 kDa, and are intended to include at least two subunits. In this case, one subunit is a peptide, which may be the same or different from the other subunits. Various protein subunits have been identified and disclosed in the examples herein. Typically, the protein subunit is from about 18 kDa to about 230 kDa, from about 160 kDa to about 230 kDa, from about 100 kDa to about 160 kDa, from about 80 kDa to about 100 kDa, and from about 50 kDa to about 80 kDa.
[0016]
As discussed above, somePhotorhabdusThe strain was isolated from the nematode. Some nematodes (elongated tubular parasites of the nematode phylum) have evolved their ability to utilize insect larvae as a favorable growth environment. Insect larvae provide a source of feeding and an environment for propagation for growing nematodes. One of the dramatic effects following larval infestation by certain nematodes is larval death. Larval death occurs in some nematodes due to the presence of bacteria that produce insecticidal toxins. This toxin restricts larval growth and suppresses feeding ability.
Interestingly, insect parasite nematodes appear to be hosts for certain bacterial species that exhibit unique adaptations for symbiotic growth with the nematodes. For a while after starting this research, bacterialXenorhabdusIs calledXenorhabdusandPhotorhabdusReclassified as
[0017]
PhotorhabdusGenus bacteriaHeterorhabditusIt has the property of being a symbiotic bacterium of nematodes, whileXenorhabdusSeedsSteinernemaSpecies are symbiotic bacteria. Although this change in nomenclature is reflected herein, this change in nomenclature has no effect on the scope of the invention disclosed herein.
The peptides and genes disclosed herein are described in Named in accordance with the recently published guidelines in Bacteriology, "Instructions @ to @ Authors" (i-xii page, January 1996), which is hereby incorporated by reference. did. The following peptides and genesPhotorhabdusIsolated from strain W-14.
[0018]
[Table 1]

(The sequence in parentheses indicates the internal amino acid sequence obtained by trypsin digestion)
[0019]
The sequences listed above are grouped by genomic region. The tcbA gene has two protein fragments, TcbA and TcbA, as described in the Examples._iiiAs expressed in E. coli. It may be advantageous to trim some sequences by proteolysis to obtain a more active toxin for commercial products for gene transfer.
[0020]
The toxins disclosed herein are very specific in that they have functional activity, which is key to the development of insect control strategies. In the development of insect control strategies, it is possible to inject proteins directly into an organism, avoiding the digestive tract of the organism, to slow or prevent the proteolytic process. In such a case, the protein administered to the organism will retain its function until denaturation, non-specific degradation or elimination by the higher organism's immune system. Injection of insecticidal toxins into insects is only applicable in the laboratory, and is also possible for large insects that can be easily injected. The observation that the pesticidal protein toxins disclosed herein exhibit their toxic activity after oral digestion or contact with the toxin indicates that insect control relies solely on the possibility of incorporating the protein toxin into insect food. Enable the development of plans. The result of such a plan would be insect bait.
[0021]
PhotorhabdusMay be administered to insects in purified form. The toxin may also be drug distributed in an amount of about 1 to about 100 mg / liter broth. This will vary according to formulation conditions, inoculum conditions, toxin separation techniques, and the like. The toxin may be administered as an exudate or cellular protein originally expressed in a heterologous prokaryotic or eukaryotic host. Bacteria are typically hosts in which the protein is expressed. Eukaryotic host cells include, but are not limited to, plants, insects, and yeast. Alternatively, this toxin may be produced in insects by bacteria, or by transgenic plants in the field, or by baculovirus vectors. Typically, the toxin will be introduced into the insect by mixing the insect feed with one or more toxins.
[0022]
Complete mortality against feeding insects is useful but not required to achieve meaningful toxicity. If the insects avoid the toxin or stop feeding, this avoidance behavior may be useful in some applications, even if the effect of the toxin is sublethal. For example, if an insect resistant transgenic crop plant is desired, hesitating the insect to contact the plant is as useful as lethal toxicity to the insect. Because the ultimate purpose is protection of the plant, not killing the insect.
There are many other ways to mix toxins into insect food. As an example, a protein solution can be sprayed as disclosed herein to mix the toxin protein with the larval feeding source. Alternatively, the purified protein is introduced into harmless bacteria by genetic engineering, which is then cultured and propagated, and then used as a feed source or settled on the soil of the area where the insect is to be eradicated. Further, the protein can be directly introduced into an insect feeding source by genetic engineering. For example, a major source of larvae of many insects is plant components.
[0023]
PhotorhabdusBy incorporating the genetic component encoding the insecticidal properties of the toxin into the genome of the plant that a particular pest feeds on, adults or larvae will die after eating the feeding plant. Many plants belonging to monocots and dicots have been transformed. Transgenic crops are of commercial importance along with fruits and vegetables. Such crops include, but are not limited to, corn, rice, soybean, canola, sunflower, alfalfa, sorghum, wheat, cotton, peanuts, tomatoes, potatoes, and the like. There are several techniques for introducing a foreign genetic component into plant cells and for stably maintaining and expressing the transgene. Such techniques include the promotion of direct cell transfer of genetic material coated on microparticles (US Pat. Nos. 4,945,050 (Cornell) and 5,141,131 (DowElanco)). Plants can be transformed using Agrobacterium-related techniques (U.S. Pat. Nos. 5,177,010 (University @ of @ Tpledo), 5104310 (Texas @ A & M), European Patent Application Publication No. 0131624B1, European Patent Application Publication No. 120516, Nos. 159418B1 and 176112 (Schhilperot), U.S. Pat. Nos. 5,149,645, 5,469,976, 5,546,763 and 4,940,838, and 4,693,976 (Schilperoot); All of MaxPlanck), European Patent Application Publication Nos. 604662 and 627752 (Japan @ Tobacco), European Patent Application Publication The 0267159 Nos and 0292435 Patent and U.S. Patent No. 5231019 (all Ciba Geigy), U.S. Pat. 5,463,174 and EP 4762785 (both Caigene), U.S. Patent 5,004,863 and EP 5159135 (both Agracetus) see). Other transformation techniques include Whiskers (US Pat. Nos. 5,302,523 and 5,464,765 (both to Zeneca)). Electroporation technology has also been used for plant transformation (WO 87/06614 (Boyce Thompson Institute), 5472869 and 5384253 (both Dekalb), WO9209695 and WO931335 (both WO9313935). That).
[0024]
Patents and publications relating to these transformations are incorporated herein by reference. Not only many techniques for transforming plants, but also the types of tissues that come into contact with foreign genes can be varied as well. Such tissues include, but are not limited to, fetal tissue, callus tissue type I and II, hypocotyl, meristem, and the like. Almost any plant tissue can be transformed during differentiation using appropriate techniques in the art.
Another variable is the selection of a selection marker. What to select as a specific marker is at the discretion of the skilled artisan, but any of the following selectable markers can be used, and other selectable markers not listed herein that can function as selectable markers: Any gene can be used. Such selectable markers include the transposon Tn5 (AphII) aminoglycoside phosphotransferase gene, which encodes resistance to antibiotics (kanamycin, neomycin and G418), as well as glyphosate; hygromycin; methotrexate; phosphinothricin ( Bialophos); imidazolinone, sulfonylurea and triazolopyrimidine herbicides (eg, chlorosulfuron); and genes encoding resistance or resistance to bromoxynil, dalapon, and the like.
[0025]
It is desirable to use a reporter gene in addition to the selection marker. In some cases, a reporter gene can be used without a selection marker. Reporter genes are genes that are typically not present or expressed in the recipient organism or tissue. Reporter genes typically encode proteins that provide some phenotypic change or enzymatic properties. Examples of such genes have been described in the literature (K. Weising et al., Ann. Rev. Genetics # 22: 421 (1988), which is incorporated herein by reference). A preferred reporter gene is the glucuronidase (GUS) gene.
Regardless of the transformation technique, inclusion of a plant promoter in the vectorPhotorhabdusThe gene is preferably incorporated into a gene transfer vector adapted to express the toxin. In addition to plant promoters, promoters of various origins are effectively used in plant cells to express foreign genes. For example, bacterial promoters (eg, octopine synthetase promoter, nopaline synthetase promoter, mannopine synthetase promoter), virus-derived promoters (eg, cauliflower mosaic virus (35S and 19S)) and the like can be used. Plant promoters include ribulose-1,6-bisphosphate (RUBP) carboxylase small subunit (ssu), beta-conglycinin promoter, phaseolin promoter, ADH promoter, heat shock promoter and tissue specific promoter, It is not limited to these. A promoter can also include certain enhancer sequence components, which can improve transcription efficiency. Exemplary enhancers include, but are not limited to, Adh-intron 1 and Adh-intron 6. Constitutive promoters can also be used. Constitutive promoters always induce continuous gene expression in all cell types (eg, actin, ubiquitin, CaMV35S). Tissue-specific promoters also provide for gene expression in particular cells or tissue types, such as leaves or seeds (eg, zein, oleosin, napin, ACP), and these promoters can also be used. Promoters are active at certain stages during plant development as well as in plant tissues and organs. Examples of such promoters include pollen specific, fetal specific, corn ear hair specific, cotton fiber specific, root specific, seed endosperm specific promoters, and the like. It is not limited.
[0026]
Under certain circumstances, it may be desirable to use an inducible promoter. Inducible promoters cause gene expression in response to specific signals (eg, physiological signals (heat shock genes), light (RUBP carboxylase), hormones (Em), metabolites and stress). Other desirable transcription and translation components that function in plants can also be used. Many plant-specific gene transfer vectors are known in the art.
Furthermore, in order to obtain high expression of bacterial genes in plants, it is known that it is preferable to re-engineer the bacterial genes so that they are more effectively expressed in the cytoplasm of the plant. Maize is one of the plants where it is preferred to re-engineer bacterial genes prior to transformation to increase the level of toxin expression in the plant. One reason for the re-engineering is that the G + C content of the native bacterial gene is very low (resulting in a high A + T content). The result of this would be the generation of sequences that mimic or replicate plant gene regulatory sequences that are known to be very rich in A + T. The presence of several A + T-rich sequences (eg, the TATA box region commonly found in gene promoters) in the DNA of a gene introduced into a plant can result in abnormal transcription of the gene. On the other hand, the presence of other regulatory sequences present in the transcribed mRNA, such as the polyadenylation signal sequence (AAUAAA) or the small nuclear RNA required for splicing of the precursor mRNA, may lead to RNA instability. Thus, one of the goals of the reengineered bacterial gene design (more preferably referred to as a plant-optimized gene) is that DNA sequences with a higher G + C content, and preferably those of plant genes encoding metabolic enzymes It is to make something close. Another goal of the design of a plant-optimized gene is to create a DNA sequence that not only has a high G + C content, but also does not interfere with translation by modifying (altering) its sequence changes.
[0027]
An example of a plant having a high G + C content is corn. The table below shows how the G + C content is higher in corn. As in the case of corn, the G + C content of other plants is also considered to be high.
[0028]
[Table 2]
Table 1.

The number of a genes is shown in parentheses.
b Standard deviation is shown in parentheses.
The mean of the c integrated group was ignored in the calculation of the overall mean.
[0029]
For the data in Table 1, the coding region of the gene was extracted from the GenBank (Release 71) registry and the base composition was determined using the MacVector® program (MacVector).^TM, IBI, New @ Haven, Connecticut). Intron sequences were ignored in the calculations. The storage protein gene sequences of groups I and II were distinguished by significant differences in their base composition.
Due to the flexibility allowed by the redundancy of the genetic code (ie, some amino acids are specified by one or more codons), the evolution of different organisms or different types of genomes has resulted in different uses of extra codons . This "codon bias" appears in the average base composition of the protein coding region. For example, organisms with relatively low G + C content utilize codons with A or T in the third position of extra codons, while those with high G + C content use codons with G or C in the third position. Use. It is believed that the presence of a "minor" codon in the mRNA of a gene reduces the absolute translation rate of the mRNA, particularly if the relative clearance of the active tRNA corresponding to the minor codon is low. To extend this, the reduction in translation rate due to individual minor codons is at least cumulative for many minor codons. Thus, an mRNA having a relatively high minor codon content will have a correspondingly lower translation rate. This translation rate is embodied by the low level synthesis of the encoding protein of interest.
[0030]
Determine codon bias in plants for re-engineering of bacterial genes. Codon bias is the statistical codon distribution that plants use to encode their proteins. After determining this bias, the% frequency of the codon of the target gene is determined. The major codons preferred by the plant will be sought along with the second and third preferred codons. Reverse translation of the amino acid sequence of the protein of interest such that the resulting nucleic acid sequence encodes the same protein as the native bacterial gene, but the resulting nucleic acid sequence corresponds to the first preferred codon of the desired plant. did. The new sequence is analyzed for restriction sites created by the alteration. The specified site is altered by further replacing the codon with a second or third preferred codon of choice. Other sites in the sequence that affect transcription or translation of the gene of interest are exon: intron 5 'or 3' junctions, poly A addition signals, or RNA polymerase termination signals. This sequence is further analyzed and modified to reduce the frequency of TA or GC pairs. In addition to these pairs, G or C sequence blocks having about 4 or more of the same residues also affect the transcription of the sequence. Thus, these blocks are also altered by replacing the first or second selection codon, etc., with the next preferred codon. Preferably, the plant optimization gene comprises about 63% of the first selection codon, about 22% to about 37% of the second selection codon, and also 15% to 0% of the third selection codon. , Where the sum of the percentages is 100%. Most preferably, the plant optimization gene has about 63% of the first selection codon, at least about 22% of the selection codon, about 7.5% of the third selection codon, and about 7.5% of the third selection codon. Includes a fourth selection codon, where the sum of the percentages is 100%. The methods described above allow one skilled in the art to modify a gene that is exogenous to a particular plant so that the gene is optimally expressed in the plant. The method is described in further detail in the currently pending conditional US patent application Ser. No. 60/00545, filed Oct. 13, 1995, which is incorporated herein by reference.
[0031]
Therefore, to design a plant-optimized gene, the amino acid sequence of the toxin was converted to DNA using the non-redundant genetic code determined from the codon bias table compiled for the gene DNA sequence for the particular plant to be transformed. Back-translate to The resulting DNA sequence, which is completely homogenous in codon usage, is further modified to have higher codon diversity, as well as deliberate placement of restriction sites, desired bases. The composition and the removal of sequences that may interfere with the transcription of the gene or the translation of the produced mRNA are aimed at.
It is theorized that if a bacterial gene is expressed in plastids, it will be more easily expressed in plants. Thus, it may be possible to express bacterial genes in plants without optimizing the genes for plant expression and to obtain high expression of the protein (see, for example, US Pat. Nos. 4,762,785, 5451513 and 5545817; Is hereby incorporated by reference).
[0032]
One of the challenges for developing transgenic plants as commodities is the management of resistance.
this isBacillus thuringiensisThis is especially true for toxins. CommerciallyBacillus thuringiensisMany companies have been developing, and there have been many concerns about resistant Bt toxins. Previous strategies for managing insect resistance are:PhotorhabdusWould be mixed with herbivorous insect protein toxins such as Bt (Ciba @ Geigy) or other toxins. The combination could be formulated so as to be sprayable or combined as a molecule. Plants produce insect toxinsPhotorhabdusThe gene and other insect toxin genes (eg, Bt) could be transformed.
EP-A-0 420 246 A1 discloses the transformation of one plant with two Bt (the two genes may be any). Another method of producing transgenic plants containing one or more insect resistance genes is to produce two plants, each plant containing one insect resistance gene. These plants are backcrossed using conventional crossing techniques to produce plants containing one or more insect resistance genes.
[0033]
In addition to producing transformed plants containing plant-optimized genes, there are other drug delivery systems that may be desirable for re-engineering of bacterial genes. Similarly, a genetically engineered protein toxin that is easily separable by fusing an insect-inducing molecule with the insecticidal activity of the toxin as a source of food is produced using standard and well-known techniques. And can be expressed in bacteria or eukaryotic cells. After purification in the lab, such toxin agents, including "set-in" baits, can be packaged in standard insect trapping housings.
Another drug delivery system is to incorporate the genetic material of the toxin into a baculovirus vector. Baculovirus is a specific insect host (Photorhabdus(Including insects, which are preferred targets for toxins).PhotorhabdusAn infectious baculovirus containing an expression construct for the toxin is introduced into the insect affected area, thereby contaminating the infected insect with the poison.
[0034]
For transmission of insecticidal properties, it was incorporated into a protein expression vector.PhotorhabdusA nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence of the toxin is required. The vector must be appropriate for the host in which it will live. One method of obtaining a nucleic acid sequence encoding a protein having pesticidal properties is to use information deduced from the amino acid sequence of the toxin, most of which are detailed below,PhotorhabdusFrom the natural genetic material that produces the toxin. As described below, methods for purifying proteins that result in toxin activity are also disclosed.
Using the N-terminal amino acid information as described below, oligonucleotides complementary to all (or portions) of the DNA bases encoding the first amino acid of the toxin can be constructed. Radiolabeling these oligonucleotides,PhotorhabdusIt can be used as a molecular probe to isolate the genetic material from a genomic gene library constructed from the genetic material isolated from the strain. This gene library can be cloned into a plasmid, cosmid, phage or phagemid vector. E. coli could be transformed with this library and screened for toxin production by transformed cells using antibodies directed against the toxin or direct assays for insect toxins.
[0035]
This approach requires the production of a set of oligonucleotides. This is because for the degenerate genetic code, one amino acid can be encoded by a combination of several three nucleotides. For example, the amino acid arginine can be encoded by the nucleic acid triplet, CGA, CGC, CGG, CGT, AGA and GG. Since it is not possible to predict which triplet will be used at that position in the toxin gene, it is necessary to prepare an oligonucleotide with each of the possible triplets. In order to recover all of the protein subunits required to complete the oral toxin, one or more DNA molecules corresponding to one protein subunit are required to construct a sufficient number of oligonucleotide probes. Would be necessary.
[0036]
From the amino acid sequence of the purified protein, the genetic material required for the production of the toxin can be easily separated and further expressed using any of several techniques well known to those skilled in the art of molecular biology. Can be cloned in whole or in part. A typical expression vector is a DNA plasmid, but other means of transfer including, but not limited to, cosmids, phagemids and phages can also be used. Properties required or desirable for replication of the brasmid (eg, origin of replication and antibiotic resistance or other forms of selectable markers (eg,Streptomyces hygroscopicusOrViridochromogenesIn addition to the bar gene)), protein expression vectors usually require an expression cassette. It contains cis-acting sequences necessary for the transcription and translation of the gene of interest. The cis-acting sequences required for expression in prokaryotes are different from those required in eukaryotes and plants.
[0037]
Eukaryotic expression cassettes require a transcriptional promoter upstream (5 ') to the gene of interest, a transcription termination region (eg, a polyA addition site), and a ribosome binding site upstream of the first codon of the gene of interest. . A useful transcription promoter that can be included in the vector in the case of bacterial cells is a T7 RNA polymerase binding promoter. As mentioned earlier herein, promoters are known to effectively promote transcription of mRNA. Also upstream from the gene of interest, the vector may include a nucleotide sequence encoding a signal sequence, which induces a protein covalently linked to a particular portion of the host cell (eg, the cell surface). I know that.
Insect viruses or baculoviruses are known to infect or adversely affect certain insects. This effect of the virus on insects is slow, and the virus does not stop insect feeding. Thus, viruses do not appear to be useful as pest control agents.PhotorhabdusLinking a toxin gene to a baculovirus vector provides an effective method of transmitting the toxin while increasing the lethality of the virus. Furthermore, because different baculoviruses have specificity for different insects, it is possible to selectively target specific pests with specific toxins. A particularly useful vector for the toxin gene is nuclear polyhedrosis virus. Transmission vectors using this virus have been described previously and have become the vector of choice for transmitting foreign genes to insects. A virus-toxin gene recombinant can be constructed in an orally transmissible form. Usually, baculoviruses infect insects through the intestinal mucus of the midgut. The toxin gene inserted behind the strong viral coat protein promoter will be expressed and will kill infected insects quickly.
[0038]
In addition to drug delivery systems by transgenic plants for insect viruses or baculoviruses or the protein toxins of the present invention, this protein may be, for example, but not limited to US Pat. Nos. 4,695,455, 4,695,462, 4,861,595, but not limited thereto. The literature is hereby incorporated by reference)Bacillus thuringiensisIt can be encapsulated using encapsulation techniques. Another drug delivery system for the protein toxins of the invention is the formulation of the protein into a bait matrix. This formulation can then be used at an above or below ground insect bait station. Examples of such techniques include, but are not limited to, PCT patent application WO 93/23989, which is incorporated herein by reference.
As noted above, if the protein is expressed in a host other than the original host, it may be necessary to alter the sequence encoding the protein. Because codons that are preferred in other hosts arePhotorhabdusThis is because it may be different from the case of In such cases, translation in a new host would be extremely inefficient unless compensatory changes were made to the coding sequence. In addition, changes to the amino acid sequence may be desirable to avoid inhibitory cross-reactivity with the protein in the new host or to enhance the insecticidal properties of the protein in the new host. A genetically modified toxin gene may encode a toxin that exhibits, for example, enhanced or reduced toxicity, altered resistance development of insects, altered stability, or altered target species specificity.
[0039]
Encodes the toxinPhotorhabdusIn addition to the gene, the present invention encodes an amino acid biopolymer homologous to the toxin protein, and further, after oral digestion, in insect species.PhotorhabdusIt is intended to include related nucleic acid sequences that retain the toxic effects of the protein.
For example, the toxins used in the present invention seem to first suppress larval feeding before resulting in death.PhotorhabdusBy manipulating the nucleic acid sequence of the toxin or its control sequence, the genetic engineer who placed the toxin gene in the plant could, for example, maintain the protein in order to maintain antifeedant activity while eliminating absolute toxicity to larvae. Or its mode of action could be adjusted. This change will allow the transformed plants to survive harvest without the unnecessary and dramatic impact on the environmental system of eradicating all target insects. All such alterations in the gene encoding the toxin, or all such alterations in the protein encoded by the gene, are included within the scope of the invention.
[0040]
Other nucleic acid alterations that may be involved include the addition of targeting sequences to direct the toxin to specific parts of the insect larva to improve the effectiveness of the toxin.
ATCC 55397, 43948, 43949, 43950, 43951, 43952 strains have been deposited with the American Type Culture Collection (12301, Parklawn Drive, Rockville, MD $ 20852 USA). Amino acid and nucleic acid sequence data for the W-14 natural toxin (ATCC 55397) are provided below. The isolation of the genomic DNA of the toxin from the bacterial host is illustrated herein.
Using standard and molecular biological techniques, they are also disclosed herein. Further information can be found in the Molecular Cloning: Laboratory Manual (J. Sambrook, EF Fritsch & T. Maniatis (1989)), which is hereby incorporated by reference. included).
The following abbreviations are used throughout the examples: Tris = tris (hydroxymethyl) aminomethane; SDS = sodium dodecyl sulfate; EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid; IPTG = isopropylthio-β-galactoside; X-gal = 5-bromo-4 -Chloro-3-indoyl-β-D-galactoside; CTAB = cetyltrimethylammonium bromide; kbp = kilobase pairs; dATP, dCTP, dGTP, dTTP, I = 2 ′ of adenine, cytosine, guanine, thymine and inosine, respectively. -Deoxynucleoside 5'-triphosphate; ATP = adenosine 5 'triphosphate.
[0041]
【Example】
Example 1 P . lumlnescens Purification of derived toxins and demonstration of toxicity after oral drug delivery of purified toxins
The insecticidal protein toxin of the present invention,P . luminescensPurified from strain W-14 (ATCC Access # 55397).P . luminescensStock cultures were maintained on petri dishes containing 2% proteose peptone # 3 (ie, PP3, Difco Laboratories, Detroit, Mich.) On 1.5% agar at 25 ° C. and passaged weekly. Bacterial primary form colonies were ingested in a 1 liter flask in 200 ml of PP3 broth supplemented with 0.5% polyoxyethylene sorbitan monostearate (Tween 60, Signla Chemical Company, St. Louis, Mo.). The broth culture was grown for 72 hours at 30 ° C. on a rotary shaker. Toxin proteins can be recovered from cultures grown in the absence or presence of Tween. However, in the absence of Tween, the morphology of the growing bacteria and the protein profile produced by the bacteria are affected. In the absence of Tween, various shifts occur, shifting from about 200 kDa to about 185 kDa as far as the molecular weight of at least one of the identified toxin subunits is concerned.
[0042]
The 72-hour culture was centrifuged at 10,000 × g for 30 minutes to remove cells and debris. The supernatant fraction containing the insecticidal activity is decanted and flushed with an appropriate volume of 1.0 M K₂HPO₄50 mM５０K₂HPO₄And The pH was adjusted to 8.6 by adding potassium hydroxide. Subsequently, the supernatant fraction was subjected to 50 mM ΔK₂HPO₄Was mixed with DEAE-Sephacel (Pharmacia LKB Biotechnology) equilibrated in the above. This toxic activity was adsorbed on the DEAE resin. Subsequently, the mixture was injected into a 2.6 × 40 cm column and 50 mM ΔK₂HPO₄The eluate was washed at room temperature at a flow rate of 30 ml / hour to reach a stable 280 nm UV absorption reference line. Subsequently, the column was washed with 150 mM @KCl until the eluate again reached the stable 280 nm reference line. Finally, the column was washed with 300 mM @KCl and fractions were collected.
[0043]
Fractions containing the toxin were collected and sterile filtered using a 0.2 micron pore membrane filter. Subsequently, the toxin was concentrated, and the ultrafiltration membrane having a molecular weight cut-off of 100 kDa (Centriprep 100, Amicon Division-WR Grace and Company) was used at 100C KPO at 4 ° C.₄(PH 6.9). 3 ml of the toxin concentrate was loaded on top of a 2.6 × 95 cm Sephacil S-400 HR gel filtration column (Pharmacia LKB Biotechnology). The eluent is 100 mM KPO₄(PH 6.9) at a flow rate of 17 ml / hour at 4 ° C. The eluate was monitored at 280 nm.
Fractions were collected and examined for toxin activity. Toxicity of chromatographic fractionsManduca sextaLarvae were examined in a biological assay. The fractions can be applied directly to the insect diet (malt malt bait, ICN \ Biochemicals-Division-ICN \ Biomedicals, Inc.), or a 5 μl sample from the first forelimb of the fourth or fifth instar larva into a 30 gauge needle. Was administered by intracavitary injection. The weight of each larva in the treatment group was recorded at 24 hour intervals. It was presumed that insects were toxic if they stopped eating and consumed the treated insect diet and died within a few days, or died within 24 hours of injection of the fraction.
[0044]
The toxic fraction was collected and concentrated using Centriprep-100, followed by 0.4 mM / min of 100 mM potassium phosphate (pH 6.9) eluent using a 7.5 mm × 60 cm TSK-GELG-4000SW gel permeation column. It was analyzed by HPLC while flowing. This analysis revealed that the toxin protein was contained in a single sharp peak eluting from the column with a retention time of about 33.6 minutes. This retention time corresponds to an estimated molecular weight of 1000 kDa. The peak fraction was collected for further purification while the fraction without this protein was discarded. The peak eluted from the HPLC absorbed UV light at 218 and 280 nm but not at 405 nm. The absorption at 405 nm was shown to be an attribute of the xenorhabdin antibiotic compound.
Electrophoresis of the collected peak fractions on a non-denaturing agarose gel (Metaphor @ Agarose, FMC @ BioProducts) indicated that two protein complexes were present in the peak. The peak material (buffered with 50 mM Tris-HCl (pH 7.0)) was loaded on a 1.5% agarose loading gel (buffered with 100 mM Tris-HCl (pH 7.0)) and 1.9% agarose analytical gel. (Buffered with 200 mM Tris-borate (pH 8.3)) and separated under standard buffer conditions (anodic buffer 1 M Tris-HCl (pH 8.3); cathodic buffer 0.025 M Tris, 0.192 M glycine). . A constant current of 13 mA was passed through the gel at 15 ° C. until the phenol red tracking dye reached the gel edge. Two protein bands were visualized on an agarose gel using Coomassie brilliant blue staining.
[0045]
The band moving slower was called "protein band 1" and the band moving faster was called "protein band 2". The two protein bands were present in approximately equal amounts. Coomassie stained agarose gel was used as a guide to accurately cut out two protein bands from the unstained portion of the gel. The cut pieces containing the protein band were softened and a small amount of sterile water was added. As a control, a portion of the gel containing no protein was also cut out and treated in the same manner as the gel containing protein. The proteins were recovered from the gel pieces by electrophoresis in 100 mM Tris-borate (pH 8.3) at 100 volts (constant voltage) for 2 hours. Alternatively, proteins were passively eluted from the gel pieces by adding an equal volume of 50 mM Tris-HCl (pH 7.0) to the gel pieces, followed by incubation at 30 ° C. for 16 hours. This allowed the protein to diffuse into the buffer, which was subsequently collected.
[0046]
Insect toxin tests using HPLC purified toxin (33.6 min peak) and agarose gel purified toxin demonstrated the toxicity of the extract. Injection of 1.5 μg of HPLC purified protein resulted in death within 24 hours. Protein bands 1 and 2 recovered from agarose by passive or electrophoretic elution were both lethal upon injection. The estimated protein concentration for these samples was less than 50 ng / larva. Comparison of weight gain and mortality between larval groups injected with protein band 1 or 2 showed that protein band 1 was more toxic for delivery by injection.
Application of the HPLC purified toxin to the larval diet at a concentration of 7.5 μg / larva resulted in cessation of larval weight gain (in the 24 larvae examined). The larva began to feed, but after consuming a very small portion of the toxin-treated diet, the larva began to exhibit toxin-induced pathological signs and stopped feeding. Insect droppings discolored, and most larvae showed signs of diarrhea. Significant mortality was obtained when 5 μg of each toxin was applied to the diet for 7-10 days.
[0047]
The agarose-isolated protein band 1 markedly suppressed the weight increase of the larva at a dose of 200 ng / larva. Larvae fed a similar concentration of protein band 2 were not inhibited and gained weight at the same rate as control larvae. Twelve larvae received the eluted protein and 45 larvae received protein-containing agarose pieces. These two sets of data show that protein band 1Manduca sextaHas oral toxicity. In this experiment, protein band 2Manduca sextaDid not appear to be toxic.
Further analysis of protein bands 1 and 2 by SDS-PAGE under denaturing conditions indicated that each band contained several smaller protein subunits. Proteins were visualized with Coomassie brilliant blue staining, followed by silver staining to achieve maximum sensitivity.
[0048]
The protein subunits of the two bands were very similar. Protein band 1 contains eight protein subunits (25.1, 56.2, 60.8, 65.6, 166, 171, 184 and 208 kDa). Protein band 2 had the same profile except that the 25.1, 60.8 and 65.6 kDa proteins were absent. The 56.2, 60.8, 65.6, and 184 kDa proteins were present at approximately equal concentrations in the complex of protein band 1 and accounted for 80% or more of the total protein content of the complex.
The native HPLC purified toxin was further characterized as follows. The toxin is heat-labile and after heating at 60 ° C (250 ° F) for 15 minutes,M . sextaLarvae lost their ability to kill or suppress weight gain when fed or injected. Assays were designed to detect lipase, type C phospholipase, nuclease, or red blood cell hemolytic activity and were performed with purified toxin. None of these activities were present. Antibiotic zone suppression assays were also performed. The purified toxin was unable to inhibit the growth of Gram-negative or positive bacteria, yeast or filamentous fungi. This suggests that this toxicity is not a xenorabudine antibiotic.
Natural HPLC purified toxinM . sextaThe ability to kill other insects was examined. Table 2 shows that in this experiment the HPLC purificationP . luminescensInsects killed by toxins are listed.
[0049]
[Table 3]
Table 2.P. luminescensInsects that die from toxins

[0050]
Example 2 Effect of insecticide
Photorhabdus luminescensWas further characterized.Photorhabdusluminescens(Strain W-14) Culture broth was prepared as follows. The production medium was 2% Bacto Proteose Peptone (R) # 3 (PP3, Diff Laboratories, Detroit, Michigan) with Milli-Q (R) deionized water as solvent. The inoculation culture flask consisted of 175 ml of medium in a 500 ml tribaffie flask with a Delong neck, covered with Kaput, autoclaved at a temperature of 121 ° C. (250 ° F.) for 20 minutes. did. The production flask consisted of 50 ml in 2.8 liters in a 500 ml three-piece flask with a Delong neck and covered with a Shinetsu silicone foam closure. These were autoclaved at a temperature of 250 ° F. for 45 minutes. The inoculum was incubated at 28 ° C., 150 rpm in an orbital shaking incubator with an amplitude of 5.08 cm (2 inches). After 16 hours of growth, 1% of the seeding medium was placed in the production flask and grown for 24 hours before harvesting. Toxin production was evident during the logarithmic growth phase. The microbial broth was transferred to a 1 liter centrifuge tube and the cell biomass pelleted (RCF = ６００1600 at 4 ° C, 2500 rpm for 30 minutes, HG-4L rotor RC3, Solval ( Sorval) centrifuge, DuPont, Wilmington, Del.). The initial broth was cooled at 4 ° C. for 8-16 hours and centrifuged again for at least 2 hours (conditions described above) to remove additional putative mucopolysaccharides upon standing, thereby further removing the broth. Made transparent. (Another processing method used a 16 hour clarification centrifuge combining both steps and under the same conditions as described above.) The broth was then stored at 4 ° C. before bioassay or filtration.
[0051]
Purified from this brothPhotorhabdusThe culture broth and protein toxin (s) have shown activity (mortality and / or growth inhibition, reduced emergence) against many insects. More specifically, activity against members of the group Coleoptera, Coleoptera, larvae and adults, colorado potato beetles, and turf grubs was observed. Other members of the order Coleoptera include click beetles, pollen beetles, flying beetles, seed beetles, and weevil. Similarly, activity against Aster leafhopper, a member of the order of the Homoptera, was also observed. Other members of the order of the Homoptera include aphids species specific to many hosts, as well as plant leafhoppers, European pear lice, apple applesuckers, scale insects, whitefly and whiteflies. The broth and purified fractions described above also showed activity against S. aurelia, A. primrose, black worm, budworm, tobacco budworm, P. aeruginosa, P. aeruginosa and Himahamaki.
[0052]
Other typical members of this eye were Iga, Indian mealmoth, Coleoptera, Green caterpillar, Cottontail bug, Beetle, Bunka tenmokumushi, sod @ webworm, and Shironagaya. Activity was also observed against fruit flies and force larvae, members of the order Diptera. Other members of the order Diptera are peas midge, carrot flies, cabbage root flies, cystine beetles, onion flies, gagbo, houseflies and various species. Activity against giant ants and Argentine ant, also members of the eye, including Fusaria, oderous house ant, and small black ants was also noted.
[0053]
The broth / fraction described above is useful for reducing insect populations and has been used in methods of inhibiting insect populations. The method can include applying the aforementioned active to the insect locus in an amount sufficient to inactivate the insect. The results are shown in Table 3.
The activity against the larvae of the hamster was tested by the following method.PhotorhabdusA 30 μl aliquot of the culture broth (filter-sterilized, cell-free) or purified HPLC fraction, respectively, after dilution in control medium or 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0, was added to 0.25 ml of artificial feed. Surface (~ 1.5cm²) Was applied directly. The feed plate was air-dried in a sterile flow hood and the wells were filled with one neonatal diabrotica undecimpunctatha howardi (Sabricius, SCR) hatched from sterile eggs. ), 2nd instar SCR grown on artificial feed, or 2nd instar Diabrotica virgifera virgifera reared on corn seedlings grown in Metromix (R) (Western Hamshimodoki, WCR) Swarmed. The second instar larvae were weighed before feed administration. The plates were sealed and placed in a moistened growth chamber and kept at 27 ° C for an appropriate period (4 days for SCR neonates and adults, 2-5 days for WCR larvae, 2nd instar SCRs). About 7-14 days). Mortality and measured body weight were scored as indicated. Generally, 16 insects were used per treatment in all studies. Control mortality is as follows: <5% for neonatal larvae and 5% for adult beetles.
[0054]
The activity against Colorado potato beetle was tested by the following method.Photorha bdusCulture broth or control medium was applied to the surface of a 1.5 ml standard artificial diet (〜2.0 cm) held in the wells of a 24-well tissue culture plate.²). Each well was treated with 50 μl and air-dried. Next, individual second instar colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata, CPB) larvae were placed on the diet and mortality after 4 days was scored. For all tests, 10 larvae were used per treatment. The control mortality was 3.3%.
The activity against the beetle beetle (Japanese beetle grub) and the beetle was tested by the following method. Turf grubs (Popilia japonica, 2nd to 3rd ages) were collected from the crowded turf and fed in the laboratory with carrot slices as an additional diet in a soil / peat mixture. Turf beetles were captured pheromone-trapped locally and fed in a laboratory in a plastic container fed with maple leaves. UndilutedPhotorhabdusThe culture broth or the control medium was used as an artificial feed (30 μl / 1.54 cm²After application to carrot slices (beetles) or carrot slices (larvae), both stages were placed alone in feed wells and observed for mortality and feeding. In both cases, there was a clear decrease in food intake (and fecal excretion).
[0055]
The activity against mosquito larvae was tested by the following method. The assay was performed in 96 well microtiter plates. Each well contains an aqueous solution (Photorhabdus200 μl of culture broth, control medium or water), and about 20 one-day-old larvae (Aedes aegypti). Six wells were performed per treatment. The results were examined 2 hours after colonization and did not change over the 3 day observation period. Control mortality was not examined.
The activity against fruit flies was examined by the following method. The purchased Drosophila melanogaster medium was dried with 50% dry medium and water, control medium orPhotorhabdusPrepared using 50% of any liquid in the culture broth. This was accomplished by placing 8.0 ml of dry medium and 8.0 ml of the appropriate liquid in each of three housing vials per treatment. Later, 10-day-old drosofia melanogaster wool was added to each vial. The vials were placed at room temperature in a laboratory bench with fluorescent lights on the ceiling. Puppy or adult numbers were determined 3, 7, and 10 days after exposure. To feed for fruit fly pupaePhotorhabdusThe mixture of culture broths showed a slight (17%) but significant decrease in eclosion on day 10 compared to water or control medium (3% reduction).
[0056]
Activity against aster leafhoppers was tested in the following manner. The uptake assay for Aster leafhopper (Macrosteles @ severini) was designed to be able to ingest this active without external contact. The container of this active / "food" solution was made with two holes in the center of the bottom of a 35 x 10 mm petri dish. A 5 cm (2 inch) square of Parafilm M® was placed over the surface of the dish and fastened with an “O” shaped ring. Next, about 7 leafhoppers were grouped in a 28.3 g (loz.) Plastic cup, the container described above was placed on top of the cup, and the parafilm was removed. The test solution was then placed into the container through the hole. UndilutedPhotorhabdusIn tests using culture broth, the broth and control medium were dialyzed against water to reduce control mortality. Mortality was reported on day 2 when the control mortality was 26.5%. In studies using purified fractions (200 mg protein / ml), a final concentration of 5% of sucrose was used in all treatments to increase the survival of the aster leafhopper. The assay was performed in a hatcher at 28 ° C. and 70% relative humidity with 16/8 irradiation intervals. The assay was graded for mortality after 72 hours. The control mortality was 5.5%.
[0057]
Activity against Argentine ants was tested in the following manner. 100%PhotorhabdusA 1.5 ml aliquot of culture broth, control medium or water was pipetted into a 2.0 ml clear glass vial. The vials were stoppered with dental cotton cores moistened with appropriate measures. Each vial was placed in a separate 60x16 mm petri dish containing 8-12 adult Argentine ants (LinePithefma humile). Three were tested per treatment. The bioassay plate was placed at room temperature on a laboratory bench with fluorescent lights on the ceiling. Mortality was read 5 days after exposure. Control mortality was 24%.
[0058]
Activity against giant ants was tested in the following manner. Black ant workers (Camponotus pennylvanicus) were harvested from trees on the DowElanco farm in Indianapolis (IN).PhotorhabdusThe test using the culture broth was performed by the following method. In each of the plastic bioassay vessels (18.1 cm x 7.6 cm (71/8 "x 3")), 15 working ants, a paper retreat, and 10 ml of broth or control in a plastic bite glass Was placed. Ants were treated through a hole in the lid of a bite glass and down a cotton core to reach the ants. All treatments contained 5% sucrose. Bioassays were performed in the dark at room temperature and graded on day 19. The control mortality was 9%. The purified fraction to be delivered for the assay utilized in the ant artificial diet was treated as described above (purified fraction or control solution) in a plastic tube at a rate of 0.2 ml of treatment / 2.0 g of feed. And mixed. The final protein concentration of the purified fraction was less than 101 μg / g feed. Ten ants per treatment, water, shelter and treated feed were placed in sealed plastic containers and fed in a humidified hatcher at 27 ° C. in the dark. On day 10, mortality was scored. Control mortality was not examined.
[0059]
Activity against various lepidopteran larvae was tested in the following manner.PhotorhabdusCulture broth or purified fractions are applied to the surface (~ 1.5 cm²) Were applied directly in 30 μl aliquots after dilution in either control medium or 10 mM sodium phosphate buffer pH 7.0, respectively. The feed plates were air-dried in a sterile flow hood and the wells were populated with one new larva. Eggs of the European borer, Ostrinia nubilalis and Helicoverpa zea, were obtained from commercial sources and hatched in-house, although Spodoptera exigua (Spodoptera @ exigua), nettle (Trichoplusia ni), tobacco insectivorous insects (Heliotisvirescens), and the Japanese turtle (Raspealesia pomonella). Epsilon (Agrotis @ ipsilon) larvae were procured in-house. After the larvae were swarmed, the feed plate was sealed and placed in a humidified growth chamber and fed at 27 ° C. in the dark for an appropriate period. Mortality and weight measurementsPhotorhabdusCulture broths were scored on days 5-7 and purified fractions on days 4-7. In general, 16 insects were used per treatment in all experiments. The control mortality for the control medium ranges from 4 to 12.5%, andPhotorhabdusLess than 10% for the buffer.
[0060]
[Table 4]
Table 3. Effect of Photorhabdus luminescens (strain W-14) culture broth and purified toxin fraction on mortality and growth inhibition of various insect orders / species

Mort = {mortality, G. I. = Growth inhibition, na = not applicable, nt = not tested, a. f. = Anti-feeding
[0061]
Example 3 Utility of insecticides for application to soil
Photorhabdus luminescens(Strain W-14) showed an activity against ham shimodoki when the culture broth was directly applied to soil or a soil mixture (Metromix (registered trademark)). Activity on the newborn SCR and WCR in Metromix® was tested in the following manner (Table 4). The test was performed using corn seedlings (CL614, United Agriseed brand) germinated on wet, wet filter paper for 6 days. After the roots had grown to about 3-6 cm, one grain / sapling was planted in a 591 ml clear plastic cup containing 50 g of dry Metromix®. Thereafter, 20 newborn SCRs or WCRs were placed directly on the roots of the seedlings and covered with Metromix®. During the growing, the seedlings were sprayed with a total of 50 ml of the diluted broth solution. After spraying, the cup was sealed and left for 7 days at room temperature in the light. After that, the seedlings were washed, Metromix® was completely removed, the roots were cut and weighed. Activity was rated for corn root survival relative to control roots, and for leaf damage caused by feeding. Leaf damage was visually scored and graded as either-, +, ++, or +++, with no damage indicated as-and severe damage as +++.
[0062]
The activity against newborn SCR in soil was tested by the following method (Table 5). The test was performed using corn seedlings (CL614 from United Agriseed) germinated on wet, wet filter paper for 6 days. After the roots had grown to about 3-6 cm, one grain / sapling was planted in a 591 ml clear plastic cup containing 150 g of soil collected from the previous corn field in Lebanon (IN). . This soil has not been previously treated with pesticides. Twenty newborn SCRs were placed directly on the roots of the seedlings and covered with soil. After the grouping, the seedlings were sprayed with a total of 50 ml of the diluted broth solution. After spraying, the unsealed cups were incubated at 25 ° C. (78 ° F.) in a chamber with high relative humidity (80%). Thereafter, the seedlings were washed, the soil was completely removed, the roots were cut and weighed. Activity was rated for corn root survival relative to control roots, and for leaf damage caused by feeding. Leaf damage was visually scored and graded as-, +, ++, or +++, intact without damage as-, and severe damage as +++.
[0063]
[Table 5]
Table 4. Effects of Photorhabdus luminescens (strain W-14) culture broth on ham shimodoki after spraying after colonization (Metromix (registered trademark))

[0064]
[Table 6]
Table 5. Effects of Photorhabdus luminescens (strain W-14) culture broth on ham shimodoki after spraying after colonization (soil)

[0065]
Photorhabdus luminescens(Strain W-14) The activity of the culture broth against the second instar turf worms in Metromix® was observed in a test performed in the following manner (Table 6). Approximately 50 g of dry Metromix® was placed in a 591 ml clear plastic cup. The Metromix® was then diluted 50% by volume.PhotorhabdusA total of 50 ml of the broth solution was sprayed. The crude broth was diluted with water, and a 50% broth was prepared by adding 25 ml of water to 25 ml of crude broth to a total volume of 50 ml.
A 1% w / v solution of Proteose Peptone # 3 (PP3), a 50% dilution of normal medium concentration, was used as a broth control. After spraying, five second instar turf bugs were placed on the moistened Metromix® surface. The energetic turf larva immediately dug a hole into Metromix®.
Larvae that did not burrow within 1 hour were excluded and replaced with new larvae.
The cup was sealed and placed in a 28 ° C hatcher in the dark. After 7 days, larvae were removed from Metromix® and scored for mortality. Activity was expressed as a percentage of mortality relative to control.
[0066]
[Table 7]
Table 6. The effect of Photorhabdus luminescens (strain W-1 4) culture broth on turf grubs after spraying prior to colonization (Metromix®)

* Indicates larval death / survival ratio.
[0067]
Example 4 Effect of insecticide on leaf application
PhotorhabdusThe activity of broth against the European corn borer was examined when broth was applied directly to the surface of corn leaves (Table 7). In this assay,PhotorhabdusThe broth was diluted 100-fold with the culture medium and placed on the surface of the cut corn leaf at 〜6.0 μl / cm of the leaf surface.², And was applied by hand. The leaves were air-dried and cut into equal sized strips (about 2 × 2 inches). The leaves were rolled, secured with paper clips, placed in a 28 g (loz) single-mouth plastic glass with 0.65 cm (0.25 inch) of 2% agar on the bottom and moistened. Thereafter, twelve newborn European Awanomeiga were placed on the rounded leaves described above and sealed in a cup. After 5 days of incubation at 27 ° C in the dark, the samples were scored for feeding damage and recovered larvae.
[0068]
[Table 8]
Table 7. Effect of Photorhabdus luminescens (strain W-14) culture broth on European corn borer after pre-coalescence on cut corn leaves

[0069]
The activity of the above-mentioned culture broth against budworms of newborn tobacco (Heliotis virescens) was revealed using a leaf dipping method. Fresh cotton leaves were cut from the plants and leaf disks were cut with a 18.5 mm cork punch. The disc was concentrated approximately 10-fold using control medium (PP3) or Amicon (Beverly, MA) Proflux M12 tangential filtration system with a 10 kDa filter.Photorhabdus luminescens(Strain W-14) Individually immersed in culture broth. Excess liquid was removed and a straightened paper clip was passed through the center of the disc. Thereafter, the paper clip was driven into a 28g (loz) single-mouth plastic glass containing 2.0 ml of 1% agar. This left the leaves suspended above the agar. After drying the leaf disc, one newborn tobacco oyster larva was placed on the disc and the cup was capped. Thereafter, the cup was sealed in a plastic bag and left in a hatcher at 27 ° C. for 5 days in a dark place. At this point, the remaining larvae and leaf material were weighed and leaf damage was measured (Table 8).
[0070]
[Table 9]
Table 8. Effect of Photorhabdus luminescens (strain W-14) culture broth on budworms of tobacco in cotton dipping assay

[0071]
Example 5 Part A
Characteristics of the toxin peptide component
In a subsequent analysis, the toxin protein subunit of the band isolated in Example 1 was resolved on a 7% SDS polyacrylamide electrophoresis gel in a 30: 0.8 ratio (acrylamide: BIS-acrylamide). did. This gel matrix makes it easier to degrade relatively large proteins. In Example 1, the gel system used to estimate the molecular weight of the band 1 and band 2 subunits was an 18% gel with a 38: 0.18 ratio (acrylamide: BIS-acrylamide), Separation by size can be performed in a wide range, but the resolution is low for high molecular weight components.
[0072]
In this analysis, it was broken down into ten protein bands instead of eight. Table 9 shows the calculated molecular weights of the ten resolved bands, and compares the estimated molecular weight under these conditions directly with the molecular weight of the previous example. It is not surprising that additional bands were detected under the different separation conditions used in this example. Variations between the aforementioned molecular weight estimates and the new estimates are also expected to be caused by differences in degradation conditions. In the analysis of this example, the higher molecular weight estimates are believed to be more accurate than Example 1 as a result of the improved resolution. However, they are estimated based on SDS-PAGE analysis, and the method is typically not analytically accurate and results in an estimate of the peptide, and this may be due to post-translational or translational modifications. In addition, it can be further substituted.
[0073]
The amino acid sequence was determined for the 5 N-termini in the 10 digested peptides. Table 9 correlates the molecular weights of these proteins and the identified sequences. In SEQ ID NO: 2, one analysis showed that the proline residue at position 5 could be asparagine (asn). In SEQ ID NO: 3, one analysis showed that the amino acid residues at positions 13 and 14 were both arginine (arg). In SEQ ID NO: 4, one analysis indicated that the amino acid residue at position 6 was either alanine (ala) or serine (ser). In SEQ ID NO: 5, one analysis indicated that the amino acid residue at position 3 was aspartic acid (asp).
[0074]
[Table 10]
Table 9.

* New estimates are based on SDS-PAGE, not gene sequences. SDS-PAGE is not analytically accurate.
[0075]
Example 5, Part B
Characteristics of the toxin peptide component
A new N-terminal sequence SEQ ID NO: 15, Ala \ Gln \ Asp \ Gly \ Asn \ Gln \ Asp \ Thr \ Phe \ Phe \ Ser \ Gly \ Asn \ Thr was isolated from the natural HPLC purified toxin described in Example 5 Part A above. The obtained peptide was further obtained by N-terminal sequencing. TcaA_iiThis peptide, termed TcaA, starts at position 254 and reaches position 491._iiThe peptide starts with SEQ ID NO: 4. The size of this peptide estimated based on the gene sequence is 25,240 Da.
[0076]
Example 6 Characteristics of Toxin Peptide Component
In yet another analysis, the toxin protein conjugatePhotorhabdus luminescensFrom the growth medium (after culturing without Tween) with 10-80% ammonium sulphate and isolated again by the subsequent ion exchange chromatography step (mono-Q) and two molecular sizing chromatography steps did. These conditions were similar to those used in Example 1. In the first molecular sizing step, a second peak of biological activity was observed at approximately 100 ± 10 kDa. Based on protein measurements, this fraction was 20-50 times less active than the larger, or first, activity peak of about 860 ± 100 kDa (native). During this isolation experiment, a smaller activity peak of about 325 ± 50 kDa, which retained a significant portion of the starting biological activity, was also resolved. This 325 kDa peak was considered to be related to or derived from the aforementioned 860 kDa peak.
[0077]
In this analysis, the 56 kDa protein was degraded. The N-terminal sequence of this protein is shown in SEQ ID NO: 6. Notably, this protein shares significant identity and conservation with the N-terminus of SEQ ID NO: 5, which allows these two to be encoded by distinct members of a gene family. And that the proteins produced by each gene are similar enough to allow both to be engineered in this pesticidal toxin conjugate.
This would be the same protein or protein fragment since the second prominent 185 kDa protein is consistently present in amounts comparable to protein 3 in Table 9. The N-terminus of this 185 kDa protein is shown in SEQ ID NO: 7.
[0078]
Additional N-terminal amino acid sequence data was obtained from the same isolated protein. None of the N-terminal sequences determined were consistent with the proteins identified in Table 9. Other proteins were present in the isolated preparation. One such protein had a predicted molecular weight of 108 kDa and had the N-terminal sequence shown in SEQ ID NO: 8. The second such protein had a predicted molecular weight of 80 kDa and had the N-terminal sequence shown in SEQ ID NO: 9.
Analysis of the protein material with an activity peak at approximately 325 kDa by size showed bands of approximately 51, 31, 28 and 22 kDa. Since the molecular weight was determined by the electrophoretic mobility in each case, these molecular weights were subject to error effects due to differences in buffer ionic strength, electrophoretic potential difference, and the like. One skilled in the art will appreciate that well-defined molecular weight values cannot be determined using these standard methods, and that each is subject to variability. Proteins of this size were hypothesized to be degradation products of the larger protein species (about 200 kDa in size) found in the larger initial toxin complex.
[0079]
Finally, some preparations contained a protein having the N-terminal sequence shown in SEQ ID NO: 10. This sequence was strongly homologous to a known chaperonin protein, which is an accessory protein whose structure-forming function is known to be a large protein complex. Applicants do not attribute such a structure-forming function to the protein identified in SEQ ID NO: 10, but this is due to the described toxin, such as the involvement of the chaperone protein in its structure formation. Consistent with the presence of the protein complex. Furthermore, although such proteins are not directly suggested to be toxic, it is important for the protein to determine the structural properties of the entire protein toxin, and consequently, after oral delivery. It will contribute to the toxicity or tolerability of the conjugate in vivo.
Subsequently, the stability of the protein toxin complex to proteinase K was analyzed. After incubating the complex for 24 hours in the presence of a 10-fold molar excess of proteinase K, it was concluded that activity was almost abolished (oral mortality was reduced to about 5%). Was. These data support that the aforementioned toxins are proteinaceous.
This toxicity was also retained by the dialysis membrane, again confirming the large size of the natural toxin complex.
[0080]
Example 7 Photorhabdus Isolation, characterization and partial amino acid sequencing of the toxin N- Terminal amino acid sequencing:
In one set of experiments performed in parallel to Examples 5 and 6, typically 2-3 litersPhotorhabdusBy slowly adding and adjusting crystalline ammonium sulfate to the broth to a final concentration of either 10 or 20%,PhotorhabdusAmmonium sulfate precipitation of the protein was performed. After stirring at 4 ° C. for 1 hour, the material was centrifuged at 12,000 × g for 30 minutes. The supernatant was adjusted with 80% ammonium sulfate, stirred at 4 ° C. for 1 hour and centrifuged at 12,000 × g for 60 minutes. This pellet is mixed with 1/10 of the volume of 10 mM Na.₂PO₄And resuspended in pH 7.0 and dialyzed against the same phosphate buffer at 4 ° C. overnight. The dialyzed material was centrifuged at 12,000 xg for 1 hour and subjected to ion exchange chromatography.
[0081]
An HR @ 16/50 @ Q Sepharose (Pharmacia) anion exchange column was used for 10 mM Na₂PO₄, PH 7.0. The centrifuged and dialyzed ammonium sulfate pellet is added to the Q Sepharose column at a rate of 1.5 ml / min and the equilibration buffer is added until the optical density (OD 280) reaches less than 0.100. Washing was carried out in a large amount at 3.0 ml / min. Next, a series of elution steps using a NaCl gradient from 0 to 0.5 M at 3 ml / min over 60 minutes or 0.1 M, 0.4 M and finally 1.0 M NaCl over 60 minutes. Either one was applied to the column. Fractions were collected and concentrated using Centriprep 100. Alternatively, proteins can be eluted with a single 0.4 M NaCl wash without eluting with 0.1 M NaCl.
[0082]
A 2 ml aliquot sample of the concentrated Q Sepharose was prepared with 10 mM @Na₂PO₄HR # 16/50 Sperose 12 (Pharmacia) gel filtration column equilibrated at pH 7.0 at 0.5 ml / min. The column was washed with the same buffer for 240 minutes at 0.5 ml / min, and samples were collected for 2 minutes each. The interstitial volume of material was collected and concentrated using Centriprep 100. Aliquots of 2 ml of the concentrated sperose 12 samples were made with 10 mM @Na₂PO₄HR @ 16/50 Sepharose 4B-CL (Pharmacia) gel filtration column equilibrated at pH 7.0 at 0.5 ml / min. The column was washed with the same buffer at 0.5 ml / min for 240 minutes and samples were collected for 2 minutes each.
[0083]
A second fractionation was performed by applying the eluted protein peak to a gel filtration column using Sepharose CL-4B resin to separate proteins ranging from ３０30 kDa to 1000 kDa. The fraction was resolved for two peaks; a small peak eluted at the interstitial volume (> 1000 kDa) and a large peak eluted at an apparent molecular weight of approximately 860 kDa. When the sample was continuously subjected to gel filtration for more than one week, a gradual appearance of a third peak (approximately 325 kDa), which appeared to result from the aforementioned large peak and was probably due to limited proteolysis, was observed. Was done. The bioassay performed on these three peaks shows that the cleft peak has no activity, but the 860 kDa toxin complex has high activity, and the 325 kDa peak is more likely but more active. Showed less. SDS-PAGE analysis of the peak of the toxin complex of Sepharose CL-4B from different fermentation products revealed two different peptide patterns, designated "P" and "S". These two patterns were distinguished by differences in molecular weight and concentration of peptide components in their fractions. The "S" pattern was most frequently produced and had four high molecular weight peptides (> 150 kDa), while the "P" pattern had three high molecular weight peptides. In addition, the "S" peptide fraction was found to be 2-3 times more active against the European corn borer. This bias may be related to variations in protein expression due to other factors based on the growth factors of the aged culture and / or age of inoculation.
[0084]
Milligram quantities of the peak toxin complex fraction defined as the "P" and "S" peptide patterns were subjected to preparative SDS-PAGE and tris-glycine (Sepravaf®) on a PVDF membrane (Prof. The blots were transferred to blots (Applied Biosystems, Inc.) for 3-4 hours. Blots were sent to Harvard MicroChem and Cambridge ProChem for amino acid analysis and N-terminal amino acid sequencing, respectively. The three peptides in the "S" pattern had unique N-terminal amino acid sequences as compared to the sequence identified in the previous example. 201 KDa (TcdA) described in SEQ ID NO: 13 below_ii) Peptide is SEQ ID NO: 1 (TcbA_ii) And 33% amino acid identity and 50% similarity (Table 10, vertical lines in Table 10 indicate amino acid identity, and dotted lines indicate conservative amino acid substitutions).
[0085]
The second 197 kDa peptide of SEQ ID NO: 14 (TcdB) had 42% identity and 58% homology with SEQ ID NO: 2 (TcaC). Furthermore, the third peptide 205 kDa is TcdA_iiMeant. In addition, the restricted N-terminal amino acid sequence SEQ ID NO: 16 (TcbA) is a peptide of at least 235 kDa, which is the sequence deduced from the cloned gene of SEQ ID NO: 11 (tcbA). SEQ ID NO: 1 (TcbA_ii) Had the deduced amino acid sequence. This indicates that the larger 235+ kDa peptide is proteolytically fermented during fermentation to the 201 kDa peptide (TcbA_ii) (SEQ ID NO: 1), possibly resulting in activation of the molecule. In yet another sequence, SEQ ID NO: 5 (TcaB) reported in Example 5 above,_iiThe sequence originally reported as) contains an aspartic acid residue (Asp) at position 3 instead of glycine (Gly), and two additional amino acids Gly and Asp at positions 8 and 9, respectively. I understood. Yet another two sequences, SEQ ID NO: 2 (TcaC) and SEQ ID NO: 3 (TcaB_iIn), an additional amino acid sequence was obtained. Densitometer quantitation was performed using a sample identical to the "S" preparation sent for N-terminal analysis. This analysis shows that the 201 kDa and 197 kDa peptides are 7.0% and 7.2% of the total protein stained with Coomassie brilliant blue in the "S" pattern, respectively, and are comparable to other abundant peptides. In the amount indicated. It has been speculated that these peptides represent protein homologs and analogs in situations found in other bacterial toxins, such as various Cryl @ Bt toxins. These proteins vary in their N-terminal amino acid sequence by 40-90% homology, which encompasses toxic fragments.
[0086]
Internal amino acid sequencing: To facilitate the cloning of the toxin peptide gene, the internal amino acid sequence of the selected peptide was obtained by the following method. Milligram quantities of the peak 2A fraction determined to be of the "P" or "S" peptide pattern were subjected to preparative SDS-PAGE and tris-glycine (Sepravaf®) on a PVDF membrane (pro-blot). (Registered trademark, Applied Biosystems) over 3-4 hours. Blots were sent to Harvard MicroChem and Cambridge ProChem for amino acid analysis and N-terminal amino acid sequencing, respectively. TcbA_ii(Including SEQ ID NO: 1), TcdA_iiAnd TcaB_iThe three peptides, including SEQ ID NO: 3, were subjected to trypsin digestion at Harvard MicroChem and the individual peptides were subsequently separated by HPCL chromatography. N-terminal amino acid analysis was performed on selected tryptic peptide fragments. Peptide TcaB_iThe two internal peptides sequenced for the (205 kDa peptide) are TcaB_i-PT111 (SEQ ID NO: 17) and TcaB_iTermed -PT79 (SEQ ID NO: 18). Peptide TcaB_iThe two internal peptides sequenced for the (68 kDa peptide) are TcaB_i-PT158 (SEQ ID NO: 19) and TcaB_i-Termed PT108 (SEQ ID NO: 20). Peptide TcbA_iiThe four internal peptides sequenced for the (201 kDa peptide) were TcbA_ii-PT103 (SEQ ID NO: 21), TcbA_ii-PT56 (SEQ ID NO: 22), TcbA_ii-PT81 (a) (SEQ ID NO: 23) and TcbA_ii-Termed PT81 (b) (SEQ ID NO: 24).
[0087]
[Table 11]
Table 10.

[0088]
Example 8 Photorhabdus luminescens W-14 genome DNA Of a cosmid library and screening for isolating a gene encoding a peptide containing a toxic protein preparation
In a heterologous host,PhotorhabdusAs a prerequisite for the production of other insect toxic proteins, and for other uses, it is necessary to isolate and characterize the genes encoding these peptides. The purpose is examined in parallel. One method, as described below, is based on the use of monoclonal and polyclonal antibodies raised against the purified toxin, as subsequently used to isolate clones from expression libraries. Another method is based on the use of N-terminal and internal amino acid sequence data to design degenerate oligonucleotides for use in PCR amplification, as described in this example. Either method can be used to identify DNA clones containing the gene encoding the peptide, in order to enable the isolation of each gene and the determination of their DNA base sequence.
[0089]
genome DNA Isolation:Photorhabdus luminescensStrain W-14 (ATCC Deposit No. 55397) was grown on 2% proteose peptone # 3 agar (Diff Laboratories, Detroit, MI) and the insecticidal toxin competence was determined as described above. Maintained by repeated bioassays after passage using the method of Example 1. 50 ml of the shaking culture was made in a 175 ml partitioned flask containing 2% proteose peptone # 3 medium and grown at 28 ° C. and 150 rpm for about 24 hours. 15 ml of this culture was pelleted and frozen in the medium at -20 ° C until thawed for DNA isolation. The thawed culture was centrifuged (700 × g, 30 minutes) and the floating orange mucopolysaccharide material was removed. The remaining cellular material was centrifuged (25,000 xg, 15 minutes) to pellet bacterial cells and remove the medium.
[0090]
Genomic DNA was isolated (salt shock) by applying the CTAB method described in Section 2.4.1 of a recent protocol in molecular biology (edited by Ausbel et al., John Wiley-Son (1994)). (Salt @ shock) and all volumes were increased by a factor of 10.) The pelleted bacterial cells are resuspended in TF buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) to a final volume of 10 ml, followed by the addition of 12 ml of 5M NaCl; And centrifuged for 20 minutes. The pellet obtained is resuspended in 5.7 ml of TE and 300 ml of 10% SDS and 60 ml of 20 mg / ml proteinase K (Gibco BRT Products, Grand Island; sterile distilled water ) Was added. The mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour; 10 mg of lysozyme (Worthington Biochemical, Freehold, NJ) was then added. Forty-five minutes after the addition, 1 ml of 5M NaCl and 800 ml of CTAB / NaCl solution (10% w / v CATB and 0.7M NaCl) were added. The preparation was incubated at 65 ° C. for 10 minutes, then gently agitated, further incubated, and agitated for about 20 minutes to help clear the cellular material. An equal volume of chloroform / isoamyl alcohol solution (24: 1, v / v) was added, mixed gently and centrifuged. Equilibrated with an equal volume of PCI (phenol / chloroform / isoamyl alcohol, 50: 49: 1, v / v / v, 1 M Tris-HCl, pH 8.0; Intermount Scientific, Kaisville, UT). After multiple extractions, the DNA was precipitated with 0.6 volumes of isopropanol.
[0091]
The DNA precipitate was slowly removed with a glass rod, washed twice with 70% ethanol, dried, and dissolved in 2 ml @ STE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 1 mM EDTA). This preparation was measured for optical density at 260 nm (ie, OD₂₆₀), Containing 2.5 mg / ml of DNA.
The range of molecular sizes of the isolated genomic DNA was assessed as suitable for library construction. The CHEF gel analysis was performed using a 0.5 × TBE buffer (44.5 mM Tris-HCl, pH 8.0, on a Bayrad CHEF-DR II instrument (BioRad Laboratories, Richmond, Calif.) Equipped with a pulse wave 760 transducer. 44.5 mM H₃BO₃This was performed in 1.5% agarose (Sechem (registered trademark) LE, FMC Bioproducts, Rockland, ME) gel using 1 mM @EDTA. The operating parameters were: initial A time, 3 seconds; final A time, 12 seconds; 200 volts; operating temperature, 4-18 ° C; operating time, 16.5 hours. The gel was stained with ethidium bromide and examined under UV light and showed that the size of the DNA was in the range of 30-250 kbp.
[0092]
Creating a library:thisPhotorhabdusGenomic DNA preparations were digested partially with Sau3A３1. This method was based on section 3.1.3 of Ausbel (supra). The reaction was adapted to run on a smaller scale under various conditions until almost optimal results were obtained. Several large scale reactions were run under various conditions, the results were analyzed on CHEF gels and proceeded with only the best large scale preparation. When best,Photorhabdus200 μl of genomic DNA was combined with 1.5 units of Sau3AΔ1 (New England Biolabs, “NEB”, Beverly, Mass.) In a total volume of 2 ml of 1 × NEB4 buffer (supplied at 10 × by the manufacturer) at 37 ° C. Incubate for 15 minutes. The reaction was stopped by adding 2 ml of PCI and centrifuged at 8000 × g for 10 minutes. 200 μl of 5M NaCl and 6 ml of ice-cooled ethanol were added to the supernatant. The preparation was cooled at −20 ° C. for 30 minutes and then centrifuged at 12,000 × g for 15 minutes. The supernatant was removed and the precipitate was dried in a vacuum oven at 40 ° C. and then resuspended in 400 μl of STE.
[0093]
Spectrophotometric assay showed that about 40% of the input DNA was recovered. The digested DNA was fractionated by size on a sucrose density gradient according to section 5.3.2 of CPMB (supra). A linear sucrose density gradient of 10% to 40% (weight / volume) was prepared in an Ultra-Clear® tube (Beckman Instruments, Palo Alto, Calif.) Using a gradient maker and The DNA sample was placed on top. After centrifugation (26,000 rpm, 17 hours, Beckman SW41 rotor, 20 ° C.), fractions (approximately 750 μl) were collected from the top of the gradient and analyzed by CHEF gel electrophoresis (described above). A fraction containing the Sau3A 1 fragment of 20-40 kbp in size was selected, and the method of Ausbel (supra), section 5.3.3 was modified (total volume of the solution was approximately 6.3-fold). ), And the DNA was precipitated. After precipitation overnight, the DNA was collected by centrifugation (17,000 × g, 15 minutes), dried, redissolved in TE to a final volume of 80 μl, and added 8 μl of 3M sodium acetate and 220 μl of ethanol. And reprecipitated. The pellet collected by the above centrifugation was resuspended in 12 μl TE. DNA concentration was measured by Hoechst 33258 dye (PolyScience, Warrington, PA) fluorimetry using a Houffer-TK0100 fluorimeter (Houffer Scientific Instruments, San Francisco, CA). About 2.5 μl of the size-fractionated DNA was recovered.
[0094]
30 μg of cosmid pWE15 DNA (Stratagene, La Jolla, Calif.) Was completely digested with 100 units of restriction enzyme BamH 1 (NEB) using the manufacturer's buffer (final volume 200 μl, 37 ° C., 1 hour) as a solvent. . The reaction was extracted with 100 μl of PCI and the DNA was precipitated from the aqueous phase by adding 3M sodium acetate and 550 μl of absolute ethanol at −20 ° C. After standing at −70 ° C. for 20 minutes, the DNA was collected by centrifugation (17,000 × g, 15 minutes), dried in vacuo, and dissolved in 180 μl of 10 mM Tris-HCl, pH 8.0. To this, 10 × CIP buffer (100 ml Tris-HCl, pH 8.3; 10 mM @ ZnCl)₂10 mM MgCl₂) 20 μl and 1 μl (0.25 units) of calf intestinal alkaline phosphatase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) diluted 1: 4. After standing at 37 ° C. for 30 minutes, the following is added: 2 μl of 0.5 M {EDTA} pH 8.0; 10 μl of 10% SDS; 0.5 μl of 20 mg / ml proteinase K (described above), followed by 30 minutes at 55 ° C. Incubated. After continuous extraction with 100 μl of PCI and 100 μl of phenol (Intermountin Scientific, equilibrated with 1 M Tris-HCl, pH 8.0), the dephosphorylated DNA was extracted with 72 μl of 7.5 M ammonium acetate and ethanol at −20 ° C. Precipitated by addition of 550 μl, incubated on ice for 30 minutes and centrifuged as described above. The precipitated DNA was washed once with 500 μl of 70% ethanol at −20 ° C., dried in vacuo and dissolved in 20 μl of TE buffer.
[0095]
The ligation of the size-fractionated Sau3AΔ1 fragment into the BamHΔ1 digested and phosphorylated pWE15 vector was modified by changing the protocol of Ausbel section 3.3 (ie, premixed as supplied by the manufacturer). (Using 10x ligation buffer) using T4 ligase (NEB). Ligations were performed at 15 ° C. overnight for a total volume of 20 μl and subsequently stored at −20 ° C.
4 μl of the cosmid DNA ligation reaction, containing approximately 1 μg of DNA, was prepared using a commercially available packaging extract (Gigapack® III Gold Packaging Extract, Stratagene) according to the manufacturer's instructions according to the manufacturer's instructions. Packaged in phage. Packaged preparations were stored at 4 ° C. until use. This packaged cosmid preparation was used for introduction into Escherichia coli XL1 blue MR cells (Stratagene) according to the following Gigapack® III Gold Protocol (titring of cosmid library). XL1 blue MR cells were prepared with 0.2% w / v maltose and 10 mM MgSO4.₄In LB medium (g / L: 10 bacto-tryptone; 5 bacto yeast extract; 15 bacto agar; 5 NaCl (Diff Laboratories, Detroit, MI) at 37 ° C. Proliferated.
[0096]
After 5 hours of growth, cells were pelleted at 700 xg (15 minutes) and 10 mM @ MgSO4.₄Resuspended in $ 6 ml. The concentration of the culture was adjusted to 10 mM @ MgSO₄And OD₆₀₀= 0.5. The packaged cosmid library was placed in a sterilized SM medium (0.1 M NaCl, 10 mM MgSO).₄Diluted 1:10 or 1:20 with 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.01% w / v gelatin and 25 μl of the diluted preparation were mixed with 25 μl of the diluted XL1 blue MR cells. The mixture was incubated at 25 ° C. for 30 minutes (without shaking), after which 200 μl of LB broth was added and the incubation was continued for about 1 hour with occasional gentle stirring. An aliquot (20-40 μl) of this culture was applied to an LB agar plate (i.e., LB-Amp) containing 100 mg / l ampicillin.₁₀₀) And incubated overnight at 37 ° C. To preserve this library without amplification, a single clone was picked and inoculated into individual wells of a sterile 96-well microwell plate; each well was filled with terrific broth (TB medium: Bactotryptone 12 g / l, Bacto yeast extract 24 g / l, 0.4% by volume glycerol, 17 mM @H₂PO₄, 72 mM K₂HPO₄) 75 μl and ampicillin 100 mg / l (ie TB-Amp₁₀₀) And incubated overnight at 37 ° C. (without shaking).
[0097]
After copying the 96-well plate to a copy plate, 75 μl / well of filter-sterilized TB: glycerol (1: 1, volume / volume, with or without ampicillin 100 mg / l) was added to the plate, and this was added. The mixture was briefly shaken at 100 rpm at 37 ° C., then sealed with Parafilm® (American National, Greenwich, Conn.) And stored in a −70 ° C. freezer. The copy plate was expanded similarly to the master plate. A total of 40 such master plates (and their copies) were prepared.
[0098]
Radiolabeled DNA Library screening with probes: To prepare colony filters for probing with radiolabeled probes, ten 96-well plates of the above library were thawed at 25 ° C (bench surface at room temperature). Using a replica plating instrument with 96 pointed sections, TB-Amp₁₀₀Was inoculated into a new 96-well copy plate containing 75 μl / well. The copy plate was grown overnight at 37 ° C. (static) and then shaken at 100 rpm at 37 ° C. for about 30 minutes. A total of 800 colonies appeared on the copy plate to isolate those that did not grow. Solid LB-Amp in a bioassay plastic dish (Nunc, 243 x 243 x 18 mm; Curtin Matison Scientific, Wooddale IL) using the replica device.₁₀₀(MSI, Westborough, Mass.) Inoculate a duplicate of this 96-well array onto a nylon membrane (0.45 μm, 220 × 250 mm) placed on (100 ml / dish) did. These colonies grew on the aforementioned membrane at 37 ° C. for about 3 hours.
[0099]
Positive control colonies (bacterial clones containing the GZ4 sequence insert, see below) were transformed into LB medium (ie LB-Cam) supplemented with 35 mg / l chloramphenicol.₃₅) Were grown on a separate Magna NT membrane (Nunc., 0.45 μm, 82 mm circle) and processed along the library colony membrane. Bacterial colonies on the membrane were lysed and the DNA was denatured and neutralized according to the protocol of the Genius® System User Guide Version 2.0 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). The membrane was denatured by placing the membrane on a filter paper immersed in 0.5N NaOH and 1.5M NaCl for 15 minutes, with the colony side facing up, and immersed in 1M Tris-HCl, pH 8.0, 1.5M NaCl. Neutralized on filter paper soaked for minutes. After UV crosslinking using a Stratagene UV stratalinker set for automatic crosslinking (auto @ crosslink), the membrane was stored in a dry state at 25 ° C. until use. The membrane was cut into strips containing traces of duplicates from a single 96-well plate, and then washed extensively as described in section 6.4.1 of CPMB (supra): 3 × SSC, 0.1 wt / vol. After washing for 3 hours at 25 ° C. in% SDS, the same solution is used for washing for 1 hour at 65 ° C., and then a hybridization step (20 × SSC = 3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate, pH 7.0) Rinse with 2 × SSC in the preparation for
[0100]
tcaC Amplification of specific genomic fragments of genes: Based on the N-terminal amino acid sequence determined for the purified TacC peptide fraction (shown here as SEQ ID NO: 2), a pool of degenerate oligonucleotides (pool S4Psh) was applied to an Applied Biosystems ABI394 DNA / RNA synthesizer ( (PerkinElmer, Foster City, Calif.) By standard β-cyanoethyl chemistry. These oligonucleotides were deprotected for 8 hours at 55 ° C., dissolved in water, quantified by spectrophotometry and diluted for use. This pool was consistent with the determined amino acid sequence at the N-terminus of the TacC peptide. The determined amino acid sequence and the corresponding degenerate DNA sequence are shown below, where A, C, G and T are standard DNA bases and I represents inosine:

Another set of degenerate oligonucleotides was synthesized (pool P2.3.5R) and showed the integrity of the coding strand for the determined amino acid sequence of SEQ ID NO: 17:

[0101]
These oligonucleotides arePhotorhabdusTo amplify a specific DNA fragment derived from genomic DNA prepared from strain W-14 (see above), as a primer for the polymerase chain reaction (PCR®, Roche Molecular Systems, Blancheberg, NJ) used.
[0102]
A typical reaction (50 μl) contains 125 pmol of each primer pool P2Psh and P2.3.5R, 253 ng of genomic template DNA, 10 nmol of dATP, dCTP, dGTP and dTTP, respectively, 1 × GeneAmp® PCR buffer, And 2.5 units of Amplitac® DNA polymerase (both from Roche Molecular Systems; 10 × GeneAmp® buffer, 100 mM Tris-HCl, pH 8.3, 500 mM @KCl, 0.01 wt / % Gelatin). Amplification was performed using 35 cycles of 94 ° C. (1.0 min), 55 ° C. (2.0 min), 72 ° C. (3.0 min), and then a 7.0 min 72 ° C. extension period, using Perkin Elmer Cetus DNA. Performed in a thermal cycler (PerkinElmer, Foster City, CA). The amplification products were analyzed by electrophoresis in TEA buffer (40 mM Tris-acetate, 2 mM @ EDTA, pH 8.0) through 2% w / v Nusive® 3: 1 agarose (FMC Bioproducts). . The gel was stained with ethidium bromide (0.5 μg / ml) and detected under ultraviolet light, indicating a specific product estimated to be 250 bp in many other amplification products. .
[0103]
A portion of the gel containing the approximately 250 bp product was excised and a small plug (0.5 mm diameter) was removed and used to supply the template for PCR amplification (40 cycles). This reaction (50 μl) contained the same contents as above, except for the genomic template DNA. After amplification, the ends of the fragment were blunted and combined with 1 unit of T4 DNA polymerase (NEB), 1 nmol @ ATP, and 2.15 units of T4 kinatose (Pharmacia Biotech, Piscaway, NJ) at 25 ° C. for 20 minutes. And phosphorylated by incubation.
DNA fragments were separated from residual primers by electrophoresis through 1% w / v GTG® agarose (FMC) in TEA as solvent. Gel sections with apparent 250 bp fragments were excised and the DNA was extracted using a QIAX kit (Qiagen, Chastworth, CA).
[0104]
The extracted DNA fragment was ligated to a plasmid vector pBC @ KS (+) (Stratagene) completely digested with the restriction enzyme Sma # 1, and extracted in the same manner as described above for the pWE15 @ DNA probe. . A typical ligation reaction (16.3 μl) contains 1 × ligation buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 10 mM @MgCl₂10 mM dithiothreitol; 1 mM spermidine; 1 mM ATP; 100 mg / ml bovine serum albumin) as a solvent; 100 ng of digested pBCKS (+) DNA, 70 ng of 250 bp DNA fragment, 1 nmol [Co (NH₃)₆] And T3.9 DNA ligase in a 3.9 Weiss unit (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA).
[0105]
After overnight incubation at 14 ° C., the ligated product was transformed into frozen competent Escherichia coli DH5α (Gibco BRL) according to the supplier's instructions, IPTS (119 μg / ml) and X-gal. LB-Cam containing (50 μg / ml)₃₅Placed on the plate. Independent white colonies were picked and plasmid DNA was subjected to a modified alkaline lysis / PEG precipitation method (protocol of PRISM® Simple Reaction Dideoxy® Terminator Cycle Sequencing Kit; ABI / PerkinElmer) Was prepared. The nucleotide sequences of both strands of this insert DNA were compared with the T7 primer [pBC @ KS (+) bases 601-623: TAAAACGACGGCCATGAGGCCGCG] and LacZ primer [pBC @ KS (+) bases 792-816: ATGACCATGATTACCGCCAAGCGGCCl, and PRISM (registered trademark) sequences. The determination was performed using the protocol of a determination kit (ABI / PerkinElmer). The unincorporated stained terminator, dideoxyribonucleotide, was removed by passing a Sentry Sep 100 column (Princeton Separation, Adelphia, NJ) according to the manufacturer's instructions. This DNA sequence was obtained by analyzing these samples using an ABI model 373A DNA sequencer (ABI / Perkinelmer). The DNA sequences of the two isolates GZ4 and HB14 were found as detailed in FIG.
[0106]
This sequence has the following features: i) bases 1-20 represent one of the 64 possible sequences of the S4Psh degenerate oligonucleotide; ii) the sequence of amino acids 1-3 and 6-12 is: Iii) the encoded fourth amino acid is not a serine residue but a cysteine residue, exactly as determined for the N-terminus of TacC (SEQ ID NO: 2); Iv) The fifth encoded amino acid is proline, encoded within degeneracy (see above), V) base 257, corresponding to the TcaC N-terminal sequence shown in SEQ ID NO: 2. -276 encodes one of 192 possible sequences designed in a degenerate pool. Vi) The TGA stop codon introduced at bases 268-270 is at the corresponding position It is the result of complementarity to the degeneracy built into the oligonucleotide pool, and does not indicate a short open reading frame of the corresponding gene.
[0107]
TcaC Labeling of peptide gene specific probes
100 pmoles of P2Psh and P2.3.5R primers, 10 ng of plasmid GZ4 or HE14 10 ng as template, 20 nmoles of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, 5 units of Amplitaq® DNA polymerase, 1 × concentration of GeneAmp, respectively. The DNA fragment corresponding to the above 276 bases was amplified by PCR® in a reaction volume of 100 μl using 35 buffer under the same temperature regime as above (35 cycles). Amplification products were extracted from 1% GTG® agarose gel with the Qiaex kit and quantified by fluorometry.
The amplified product (about 400 ng) extracted from the plasmid HB14 template was divided into 5 aliquots and using a high prime labeling mix (Boehringer Mannheim) according to the manufacturer's instructions.³²Labeled with P-dCTP. Unincorporated radioisotope was removed by passage through a NucTrap probe purification column (Stratagen) according to the supplier's instructions. When the specific activity of the labeled DNA product was measured by scintillation counting, 3.11 × 10⁸dpm / μg. The labeled DNA was used to probe membranes prepared from 800 members of a genomic library.
[0108]
TcaC Screening with peptide gene specific probe
The radiolabeled HB14 probe was boiled for about 10 minutes and then added to the “minimum hyb” solution [Note: “minimum hyb” method is CERES protocol; “Restriction Fragment Length Polymorphism Study Manual Version 4.0”, Sections 4-40 and 4-47; adopted from CERES / NPI, Salt \ Lake \ City, UT. The NPI does not currently exist, but its successors operate as Linkage @ Genetics.] The "minimum hyb" solution was 10% w / v PEG (polyethylene glycol, MW about 8000), 7% w / v SDS, 0.6X SSC, 10 mM sodium phosphate buffer (95 g / l). NaH₂PO₄・ 1H₂O and 84.5 g / l Na₂HPO₄・ 7H₂5 mM EDTA, and 100 mg / ml denatured salmon sperm DNA) (from a 1 M stock solution containing O). The membranes were quickly dry blotted and then, without pre-hybridization, 5 strips of membrane were used in each of two plastic boxes containing 75 ml of "minimal hyb" and 2.6 ng / ml of radiolabeled HB14 probe. Put in. These were incubated overnight at 60 ° C. with gentle shaking. The filters are each washed three times in “minimum hyb wash” (0.25 × SSC, 0.2% SDS) at 25 ° C. for about 10 minutes, followed by gentle shaking at 60 ° C. in the same solution. Washing was performed twice for 30 minutes.
[0109]
Filter the filter in a light-tight autoradiography cassette^R(Dow Brand, Indianapolis, Ind.) And two DuPont Cronex Lightning Enhancer + C1 Enhancer (Sigma Chemical Co., St. Lois, Mo.) at -70 ° C. for 4 hours. ) Was exposed to X-Omat @ X-ray film (Kodak, Rochester, NY). After development (normal photographic operation), significant signals were weaker and were evident in both replicates, even during a high background of irregular signals. Again, the filters were washed in "minimum hyb wash" at 68C for about 4 hours, then re-cassetted and the film was exposed overnight at -70C. Twelve possible positives were identified by strong signals for both duplicate 96-well colony recesses. No signal was seen on the negative control membrane (colony of XL1 blue MR cells containing pWE15), and a very strong signal was simultaneously treated with the experimental sample on the positive control membrane (DH5α cells containing the GZ4 isolate of the PCR product). Was seen in.
[0110]
Twelve putative hybridization-positive colonies were recovered from frozen 96-well library plates and solid LB-Amp₁₀₀Grow overnight in medium at 37 ° C. Then they are solid LB-Amp₁₀₀(3 / plate, +3 negative controls: XL1 blue MR cells with pWE15 vector). Two sets of membranes (Magna NT nylon, 0.45 micron) were prepared for hybridization. A first set was prepared by placing the filter directly on the colonies of the patch plate, then removing it with the adherent bacterial cells and treating as follows. LB-Amp for the second set of filters₁₀₀Cells were seeded by placing them in plates containing medium and then transferring cells from the patch plates to filters. After overnight growth at 37 ° C., the filters were removed from the plates and processed.
[0111]
The bacterial cells of the filters were lysed and the DNA was denatured by placing each filter on a 0.5N NaOH pool (1.0 ml) in a plastic plate for 3 minutes with the colonies facing up. The filters were blotted dry on a paper towel and the process was then repeated with fresh 0.5N NaOH. After dry blotting, the filters were neutralized by placing each in a 1.0 ml pool of 1 M Tris-HCl, pH 7.5 for 3 minutes, blotted dry and neutralized again with fresh buffer. This was followed by two similar soaks (5 min each) with a pool of 0.5 M Tris-HCl, pH 7.5 + 1.5 M NaCl. After dry blotting, the DNA was UV cross-linked to a filter (as described above) and the filter was washed in approximately 100 ml of 3X@SSC+0.1% (w / v) SDS (25.degree. C., 100 rpm) (4 times, each time). 30 minutes each with fresh solution for washing). They were then incubated for 2 hours at 65 ° C. and 50 rpm in a minimum volume of prehybridization solution [6 × ΔSSC + 1% w / v Ficoll 400 (Pharmacia), polyvinylpyrrolidone (average MW 360,000; Sigma) and Bovine serum albumin fraction V; (Sigma)]. The prehybridization solution was removed and HB14 denatured at 95 ° C for 5 minutes, preserved from the previous hybridization on the library membrane.³²Replaced with a P-labeled probe. Hybridization was performed at 60 ° C. for 16 hours while shaking at 50 rpm.
[0112]
After removal of the labeled probe solution, the membrane was washed three times at 25 ° C. (50 rpm, 15 minutes) in 3 × ΔSSC (about 150 ml of washing solution each). They were then washed in 0.25X@SSC+0.2% SDS (minimum hyb wash) at 68 ° C. for 3 hours (50 rpm) and exposed to the above X-ray film at 25 ° C. for 1.5 hours (no enhancer) screen). This exposure revealed a very strong hybridization signal for cosmid isolates 22G12, 25A10, 26A5, and 26B10, and a very weak signal for cosmid isolate 8B10. No signal was seen in the negative control (pWE15) colonies, and a very strong signal was seen in the positive control membrane (DH5α cells containing the GZ4 isolate of the PCR product) co-treated with the experimental samples.
[0113]
tcaB Amplification of specific genomic fragments of a gene
Purified TcaB_iBased on the N-terminal amino acid sequence determined for the peptide fraction (disclosed herein as SEQ ID NO: 3), a pool of degenerate oligonucleotides (pool P8F) was synthesized as described for peptide TcaC. The determined amino acid sequence and the corresponding degenerate DNA sequence are shown below, where A, C, G and T are normal DNA bases and I represents inosine.

Another set of degenerate oligonucleotides was synthesized (pool P8.18.3R) and TcaB_i-Represented the complement of the coding strand for the determined amino acid sequence of the PT108 internal peptide (disclosed herein as SEQ ID NO: 20).

[0114]
These oligonucleotides were used as primers for PCR using Hot Start 50 Tube TM (Molecular Pio Products, San Diego, Calif.) And Photorabhas strain W-14 (see above). A) specific DNA fragment was amplified from the genomic DNA prepared from the above). A typical reaction (50 μl) is 1 × GeneAmp^R25 pmoles of the primer pools P8F and P8.18.3R (lower layer), respectively, with 2 nmoles of dATP, dCTP, dGTP and dTTP in buffer, respectively, and 1 × GenemAMp^R230 ng of genomic template DNA in buffer, 8 nmole each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP, and 2.5 units of AmpliTaq^RPolymerase (upper layer) was included. Amplification was performed with 35 cycles as described for the TcaC peptide. 0.7% w / v Sechem in TEA buffer^RAnalysis was performed by electrophoresis on LE agarose (FMC). A specific product with an estimated size of 1600 bp was observed.
Four such reactions were pooled and the amplified DNA was combined with the Qiaex kit as described for the TcaC peptide for 1.0% Sechem.^RExtracted from LE gel. The extracted DNA was sequenced using the P8F and P8.18.3R primer pools (PRISM^TMIt was used directly as a template for the sequencing kit.
[0115]
Each reaction contained approximately 100 ng of template DNA and 25 pmol of one kind of primer pool and was processed according to the usual protocol as described for the TcaC peptide. Analysis of the sequence derived from the extension of the P8F primer revealed a short DNA sequence (and the encoded amino acid sequence).

This corresponds to SEQ ID NO: 3 (TcaB_i) Corresponds to a portion of the N-terminal peptide sequence disclosed.
[0116]
TcaB _i Labeling of peptide gene specific probes
Gel purified TcaB_iを About 50ng of DNA fragment³²The radioactive isotope labeled with P-dCTP and not incorporated is used as a NICK column.^R(Pharmacia). When the specific activity of the labeled DNA was measured, 6 × 10⁹dpm / μg. The labeled DNA was used to probe a colony membrane prepared from members of a genomic library that hybridized to a TcaC-peptide specific probe.
The membrane containing the 12 colonies identified by the TcaC-probe library screen (see above) was radioactively boiled twice in 1 liter of 0.1X SSC + 0.1% SDS for about 30 minutes each time. Stripped from TcaC-specific label. Radiolabel removal was checked at 6 hours of film exposure. The stripped membrane was then prepared from the previously prepared TcaB_iIncubated with peptide specific probe. The labeled DNA was denatured by boiling for 10 minutes and then added to the filters incubated at 60 ° C. for 1 hour in 100 ml of “minimal hyb” solution. After overnight hybridization at this temperature, the probe solution was removed and the filters were washed as follows (all in 0.3X@SSC+0.1% SDS). Once at 25 ° C for 5 minutes, once at 60 ° C in a fresh solution for 1 hour and once at 63 ° C in a fresh solution for 1 hour. After 1.5 hours of exposure to X-ray film by conventional procedures, four strongly hybridizing colonies were observed. These were isolates 22G12, 25A10, 26A5, and 26B10 according to the TcaC-specific probe.
TcaB_iThe probe solution was diluted with an equal volume (about 100 ml) of the "minimal hyb" solution and then used to screen a membrane containing 800 members of the genomic library.
After hybridization, washing and exposure to X-ray film as described above, only four cosmid clones, 22G12, 25A10, 26A5, and 26B10, were found to strongly hybridize to this probe.
[0117]
TcaC Peptides and TcaB _i Isolation of subclones containing peptide-encoding genes,And determination of its DNA base sequence
The three hybridization positive cosmids in strain XL1 Blue MR were incubated at 30 ° C with TB-Amp.₁₀₀The cells were grown overnight with shaking (200 rpm). After harvesting the cells by centrifugation, a commercial kit (BIGprep^TMCosmid DNA was prepared using 5 Prime, 3 Prime, Boulder, CO). Only one cosmid, 26A5, was successfully isolated by this procedure. When digested with the restriction enzyme EcoR 1 (NEB) and analyzed by gel electrophoresis, fragments of approximately size 14, 10, 8 (vector), 5, 3.3, 2.9, and 1.5 kbp were detected. . A second attempt to isolate cosmid DNA from the three strains (8 ml culture; TB-Amp)₁₀₀, 30 ° C.) is a boiling miniprep method (Evans G. and G. Wahl., 1987, “Cosmid vectors for genomic walking and rapidrestri-tion-mapping”,Guide to Molecular Cloning Technologies. Meth. Enzymology ,152, S.M. Berger and A.S. Kimmel, pp. 604-610).
[0118]
Only one cosmid, 25A $ 10, was successfully isolated by this method. When digested with the restriction enzyme EcoR 1 (NEB) and analyzed by gel electrophoresis, the cosmid showed the same fragmentation pattern as previously seen with cosmid 26A5.
A 0.15 μg sample of 26A5 cosmid DNA was prepared according to the supplier's protocol. E. coli DH5α cells (Gibco BRL) were used to transform 50 ml. A single colony isolate of the strain was used for TB-Amp₁₀₀4 ml were inoculated and grown at 37 ° C. for 8 hours. Chloramphenicol was added at a final concentration of 225 μg / ml and the incubation continued for a further 24 hours, then the cells were harvested by centrifugation and frozen at -20 ° C. Isolation of 26A5 cosmid DNA increased the overall volume by 50% and improved conventional alkaline lysis minipreps at each step by using agitation or light mixing instead of vortexing (Maniatis et al., Supra, p. 382). It was due to. After washing the DNA pellet in 70% ethanol, it was dissolved in TE containing 25 μg / ml ribonuclease A (Boehringer Mannheim).
[0119]
GZ4 Inductive probe and TcaB _i Form a hybrid in the probe EcoR 1 Fragment identification
About 0.4 μg of cosmid 25A10 (from XL1 blue MR cells) and about 0.5 μg of cosmid 26A5 (from chloramphenicol amplified DH5α cells) were digested with about 15 units of EcoR 1 (NEB) for 85 minutes, respectively. Freeze overnight, then heat at 65 ° C. for 5 minutes and run on a 0.7% agarose gel (Sechem)^RLE, 1xTEA, 80 volts, 90 minutes). The DNA was stained with ethidium bromide as described above and photographed under ultraviolet light. The EcoR 1 digest of cosmid 25A10 was completely digested, whereas the sample of cosmid 26A5 was only partially digested under these conditions. The agarose gel containing the DNA fragments is subjected to depurination, denaturation and neutralization, followed by a high salt (20X @ SSC) protocol as described in section 2.9 of Ausubel et al. (CPMB) cited above. Was used for Southern blotting on a Magna NT nylon membrane. The transferred DNA was then UV cross-linked to a nylon membrane as described above.
[0120]
The TcaC peptide-specific DNA fragment corresponding to the insert of the plasmid isolate GZ4 was amplified by PCR in a 100 ml reaction volume as described above. Amplification products from three such reactions were pooled, extracted from a 1% GTGR agarose gel with the Qiaex kit as described above, and quantified by fluorometry. Using high prime labeling mix (Boehringer Mannheim) as described above, gel-purified DNA (100 ng) was 6.34 x 10⁸dpm / μg specific activity³²Labeled with P-dCTP.
³²The P-labeled GZ4 probe is boiled for 10 minutes, then added to the "minimal hyb" buffer (at 1 ng / ml), the Southern blot membrane containing the digested cosmid DNA fragments is added and gently shaken at 50 rpm. For 4 hours at 60 ° C. The membrane was then washed three times at 25 ° C. for about 5 minutes each (minimum hyb wash), followed by two washes at 60 ° C. for 30 minutes each. The blot was exposed to film (using an enhancer screen) at -70 ° C for about 30 minutes. The GZ4 probe hybridized strongly to the 5.0 kbp (apparent size) EcoR 1 fragment of both of these two cosmids, 26A5 and 25A10.
[0121]
The membrane was stripped of radioactivity by boiling in 0.1X@SSC+0.1% SDS for about 30 minutes and the absence of radiolabel was checked by exposure to film. It was then (denatured) TcaB for 3.5 hours at 60 ° C. in the “minimum hyb” buffer previously used to screen the colony membrane (described above)._iProbes and hybrids were formed, washed as described above, and exposed to film using two enhancer screens at -70 ° C for 40 minutes. For both cosmids, TcaB_iThe probe hybridized lightly with the approximately 5.0 kbp EcoR 1 fragment and strongly hybridized with the approximately 2.9 kbp fragment.
A sample of the above cosmid 26A5 DNA (from DH5α cells) was used as the source of DNA, from which the relevant bands would be subcloned. This DNA (2.5 μg) was digested with approximately 3 units of EcoRI 1 (NEB) in a total volume of 30 μl for 1.5 hours and confirmed by gel electrophoresis to obtain a partially digested product. 10 μg of pBCΔKS (+) DNA (Stratagen) was digested with 20 units of EcoRI 1 in a total volume of 20 μl for 1.5 hours to provide complete digestion as confirmed by electrophoresis. Both EcoRI 1-cleaved DNA formulations were diluted to 50 μl with water, an equal volume of PCI was added to each, the suspension was mixed gently and spun in a small centrifuge to collect the aqueous supernatant. The DNA was precipitated with 150 μl of ethanol and the mixture was kept at −20 ° C. overnight. After centrifugation and drying, EcoR1-digested pBC @ KS (+) was dissolved in 100 μl of TE. The partially digested 26A5 was dissolved in 20 μl of TE. DNA recovery was checked by fluorometry.
[0122]
In a separate reaction, about 60 ng of EcoR 1 digested pBC KS (+) DNA was ligated with about 180 ng or 270 ng of partially digested cosmid 26A5 DNA. Ligation was performed in a volume of 20 μl at 15 ° C. for 5 hours using T4 ligase and buffer from New England Biolabs. The ligation mixture, diluted to 100 μl with sterile TE, was used to transform frozen competent DH5α cells (Gibco BRL) according to the supplier's instructions. Various amounts (25-200 μl) of transformed cells were prepared using freshly prepared solid LB-Cam containing 1 mM IPTG and 50 mg / l X-gal.₃₅The medium was applied. Plates were incubated at 37 ° C. for about 20 hours, then cooled in the dark for about 3 hours to enhance coloration for insertion selection. White colonies were picked on patch plates of the same composition and incubated at 37 ° C. overnight.
Two colony lifts of each of the selected patch plates were prepared as follows. After picking the white colonies into a new plate, a circular Magna NT nylon membrane was pressed against the patch plate, the membrane was lifted and subjected to denaturation, neutralization and UV crosslinking as described above for the library colony membrane. The crosslinked colony lift was washed vigorously, including wiping excess cell debris with tissue. One set hybridized with the GZ4 (TcaC) probe solution and the other set with the TcaB according to the "minimum hyb" protocol._iHybridization with the probe solution was followed by washing and exposure to film as described for the library colony membrane. GZ4 probe only, GZ4 probe and TcaB_iBoth probes, or TcaB_iColonies showing a hybridization signal with the probe alone were selected for further study, and cells were harvested with LB-Cam containing IPTG and X-gal as described above.₃₅The medium was streaked for single colony isolation.
[0123]
Approximately 35 single colonies from 16 different isolates were collected in liquid LB-Cam₃₅Take up in medium and grow overnight at 37 ° C. Cells were harvested by centrifugation and plasmid DNA was isolated by conventional alkaline lysis miniprep according to Maniatis et al. (Cited above, p. 368). The DNA pellet was dissolved in TE + 25 μg / ml ribonuclease A, and the DNA concentration was measured by fluorometry. The EcoR 1 digestion pattern was analyzed by gel electrophoresis. The following isolates were collected as valuable: Isolate A17.2 contained only the reattached pBCΔKS (+) and was used as a (negative) control. Isolates D38.3 and C44.1 were each 2.9 kbp TcaB inserted into pBC @ KS (+)_iOnly the EcoR 1 fragment that hybridizes with These plasmids, designated pDAB2000 and pDAB2001, respectively, are shown in FIG.
Isolate A35.3 contains only the EcoR 1 fragment that hybridizes to the approximately 5 kbp GZ4 inserted into pBC KS (+). This plasmid was called pDAB2002 (also shown in FIG. 2). These isolates provided a template for DNA sequencing.
The BIGprep^TMPlasmids pDAB2000 and pDAB2001 were prepared using the kit. Cultures (30 ml) were transferred to TB-Cam₃₅OD of 2 in₆₀₀Grown overnight until then the plasmid was isolated according to the manufacturer's instructions. The DNA pellet was redissolved in 100 μl of TE each and the sample integrity was checked by EcoR 1 digestion and gel electrophoresis analysis.
[0124]
The sequencing reactions were run in duplicate, with one replicate using pDAB2000 DNA as the template and the other replicate using pDAB2001 @ DNA as the template. Reactions were performed using the dideoxy dye terminator cycle sequencing method as described above for GZ4 / HB14Δ DNA sequencing. Initial sequencing experiments consisted of the above LacZ primer and T7 primer, + TcaB as primers._iプ ラ イ マ ー Primers based on the determined sequence of the PCR amplification product (TH1 = ATTGCAGACTGCCAATCGCTTCGG, TH12 = GAGAGTATCCAGACCGCGGATGATCTG) were used. {After alignment and compilation of each sequencing output, each was truncated to 250-350 bases depending on the integration of the chromatographic data as decoded by the Perkin Elmer Applied Biosystems Division SeqEd # 675 software. Subsequent sequencing "steps" were performed by selecting the appropriate sequence for the new primer. With a few exceptions, the primer (synthesized as described above) had a 50% ΔG + C composition and was 24 bases in length. Sequencing by this method was performed on both strands of the approximately 2.9 kbp EcoR 1 fragment.
[0125]
Plasmid DNA from isolate pDAB2002 was used for BIGprep preparation for further use as a template for DNA sequencing.^TMPrepared by kit. Sequencing reactions were performed and analyzed as described above. Initially, a sequencing reaction to read from the adjacent vector sequence to the insert DNA using the T3 primer (pBS @ SK (+) bases 774-796: CGCGCAATTAACCCTCACTAAAG) and the T7 primer (pBS @ SK (+) bases 621-643: GCCGCGTAATACGACTCACTATAG). Started. Another sequence of primers (GZ4F: GTATCGATTACAACGCTGTCACTTCCC; TH13: GGGAAGTGACAGCGTTGTTAATCGATAC; TH14: AGTTTGGGTGCGTCGGCTAATGGACATAC) Determined previously by nucleotide-mediated sequencing. From the data generated during the initial round of sequencing, a new set of primers was designed and used to walk the full length of the approximately 5 kbp fragment. A total of 55 oligo primers were used to allow identification of a total of 4832 bp of contiguous sequences.
[0126]
Combining the DNA sequence of the EcoRΔ1 fragment insert of pDAB2002 with a portion of the determined sequence of the pDAB2000 / pDAB2001 isolate resulted in a total of 6005 bp contiguous sequence (disclosed herein as SEQ ID NO: 25). When the long open reading frame was translated into the corresponding amino acid, the sequence would be the TcaB encoded by bases 19-75 immediately after the methionine residue (start of translation)._iN-terminal peptide (disclosed as SEQ ID NO: 3) is clearly shown. There is a potential ribosome binding site (bases 1-9) upstream and TcaB downstream_i-A PT158 internal peptide (disclosed herein as SEQ ID NO: 19) is encoded by bases 166-228. Further downstream, in the same open reading frame, bases 1738-1773 and TcaB_iThere is a sequence encoding the PT108 internal peptide (disclosed herein as SEQ ID NO: 20). In addition, in the same reading frame, bases 1897-1923 and TcaB_iiThe N-terminal peptide (disclosed herein as SEQ ID NO: 5) is encoded and the reading frame remains uninterrupted until the translation stop codon at nucleotides 3586-3588.
[0127]
TcaB_iThe end of the sequence encoding PT108 and TcaB_iiLack of in-frame stop codon during start of coding region, and TcaB_iiThe lack of a recognizable ribosome binding site immediately upstream of the coding region was due to the peptide TcaB_iiAnd TcaB_iIs encoded by a single open reading frame of 3567 bp starting at base pair 16 in SEQ ID NO: 25, possibly by post-translational cleavage of 1189 amino acids (131,586 daltons; disclosed herein as SEQ ID NO: 26). Derived from one primary gene product. TcaB_iiThe amino acid immediately preceding the N-terminal peptide is the peptide TcaB_iCorresponds to the C-terminal amino acid of_iiThe predicted mass of (627 amino acids) is slightly higher than the size observed by SDS-PAGE (68 kDa) and is 70,814 daltons (disclosed herein as SEQ ID NO: 28). The peptide will be encoded by a continuous stretch of 1881 base pairs (disclosed herein as SEQ ID NO: 27). TcaB_iThe natural C-terminus of_i-It is thought to be slightly near the C-terminus of PT108. The molecular weight of PT108 [measured during N-terminal amino acid sequence analysis of the peptide to 3.438 kDa] predicts a size of 30 amino acids. TcaB_iUsing the size of this peptide to indicate the C-terminus of the coding region [Glu at position 604 of SEQ ID NO: 28], TcaB_iIs further determined to be 604 amino acids or 68,463 daltons, consistent with experimental observations.
[0128]
TcaB of 1686 base pairs_iiTranslation of the peptide coding region (disclosed herein as SEQ ID NO: 29) results in a protein of 562 amino acids (disclosed herein as SEQ ID NO: 30) with an expected mass of 60,789 daltons; This is in good agreement with the observed 61 kDa.
A potential ribosome binding site (bases 3633-3638) is found 48 bp downstream of the stop codon of the tcaB reading frame. At bases 3645-3677, a sequence encoding the N-terminus of peptide TcaC (disclosed as SEQ ID NO: 2) is found. The open reading frame initiated by this N-terminal peptide persists uninterrupted to base 6005 (2361 base pairs, disclosed herein as the first 2361 base pairs of SEQ ID NO: 31). The gene (tcaC) encoding the complete TcaC peptide (approximately 165 kDa in apparent size; about 1500 amino acids) will contain about 4500 bp.
Another isolate containing the cloned EcoRＥ1 fragment of cosmid 26A5, E20.6, was isolated from the GZ4 probe and TcaB._iIdentified by its homology to the probe. Agarose gel analysis of the EcoR 1 digest of the DNA of the plasmid harbored by this strain (pDAB2004, FIG. 2) revealed insert fragments of putative sizes 2.9, 5, and 3.3 kbp. DNA sequence analysis, initiated with primers indicated from the sequence of plasmid pDAB2002, revealed that the 3.3 kbp EcoR 1 fragment of pDAB2004 was located adjacent to the 5 kbp EcoR 1 fragment represented by pDAB2002.
[0129]
The 2361 base pair open reading frame found in pDAB2002 persists uninterrupted for another 2094 bases in pDAB2004 (disclosed herein as base pair 2362-4458 of SEQ ID NO: 31). DNA sequence analysis using the parent cosmid 26A5 DNA as a template confirmed the continuity of the open reading frame. Briefly, the open reading frame (TcaC SEQ ID NO: 31) contains 4455 base pairs and encodes a protein (TcaC) of 1485 amino acids [disclosed herein as SEQ ID NO: 32]. The calculated molecular size of 166,214 daltons is consistent with the predicted size of the TcaC peptide (165 kDa), and the derived amino acid sequence exactly matches that disclosed for the TcaC N-terminal sequence [SEQ ID NO: 2].
The lack of the amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 17 used to design the degenerate oligonucleotide primer pool in the found sequences was due to the isolates GZ4 and HB14 (these were used as probes in the initial library screen). ) Indicates that the generation of the PCR product seen in (a) occurred accidentally due to reverse strand priming with one of the primers in the degenerate pool. Furthermore, the derived protein sequence does not include the internal fragment disclosed herein as SEQ ID NO: 18. These sequences reveal that plasmid pDAB2004 contains the complete coding region for the TcaC peptide.
[0130]
Example 9 TcbA _ii Photolabdas of the gene encoding the peptide 　 Genome library screening
This example uses TcbA_iiThe method used to identify the DNA clone containing the gene encoding the peptide, the isolation of that gene, and the determination of its partial DNA sequence are described.
Primer and PCR reactionTcbA of insect active preparation_iiThe polypeptide is about 206 kDa. The N-terminal amino acid sequence of this peptide is disclosed as SEQ ID NO: 1. Four pools of degenerate oligonucleotide primers ("Forward primers": TH-4, TH-5, TH-6, and TH-7) were performed to encode a portion of this amino acid sequence. Synthesized as described in Example 8 and shown below.
[0131]
[Table 12]
Table 11.

[0132]
In addition, an internal peptide formulation (TcbA_ii-PT81) was determined as the primary sequence ("a") and the secondary sequence ("b") and are disclosed herein as SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24, respectively. As shown below, four pools of degenerate oligonucleotides ("Re-verse primer": TH) to encode the reverse complement of the sequence encoding the-part of the peptide of SEQ ID NO: 23. -8, TH-9, TH-10 and TH-11) were similarly designed and synthesized.
[0133]
[Table 13]
Table 12.

[0134]
These primer sets were used in a PCR reaction to convert TcbA from the genome {Photolabdas luminescence W-14} DNA prepared in Example 6._iiWas amplified. AmpliWax^TMAll PCR reactions were performed using the "hot start" technique using gems and other Perkin-Elmer reagents and protocols. Typically, MgCl₂, DNTP, 10xGeneAmp^RThe mixture of PCR buffer II and primers (total volume 11 μl) was added to a tube containing a single wax bead [10 xGeneAmp^RPCR buffer II 100 mM contains 100 mM Tris-HCl, pH 8.3, and 500 mM KCl. The tube was heated to 80 ° C. for 2 minutes and cooled. 10x GeneAmp on the wax seal^RPCR buffer II, DNA template, and AmpliTaq^R溶液 A solution containing DNA polymerase was added. After melting the wax seal and mixing the components by thermal cycling, the final reaction conditions were: 50 μl volume, 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl₂200 μM each of dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 1.25 mM single forward primer pool, 1.25 μM single reverse primer pool, 1.25 units of AmpliTAqΔ DNA polymerase, and 170 ng of template DNA.
The reaction solution was placed in a thermocycler (same as in Example 8), and an experiment was performed using the following program.
[0135]
[Table 14]
Table 13.

[0136]
A series of amplifications were performed at three different annealing temperatures (55 ° C, 60 ° C, 65 ° C) using a degenerate primer pool. The reaction by annealing at 65 ° C. had no visible amplification products after agarose electrophoresis. Reactions having a 60 ° C. annealing regime and containing primers TH-5 + TH-10 resulted in an amplification product with a mobility corresponding to 2.9 kbp. A smaller amount of the 2.9 kbp product was produced under these conditions using primers TH-7 + TH-10. When the reaction was annealed at 55 ° C., these primer pairs yielded more 2.9 kbp product, which was generated by the primer pairs TH-5 + TH-8 and TH-5 + TH-11. An additional very fuzzy 2.9 Kbp band was seen in the lanes containing amplification products from the primer pair TH-7 + TH-8, TH-9, TH-10, or TH-11.
To obtain sufficient PCR amplification products for cloning and DNA sequencing, ten separate PCR reactions were set up using primers TH-5 + TH-10 and performed at the annealing temperature of 55 ° C. using the above conditions. . All reactions were pooled and the 2.9 kbp product was purified from agarose gel by Qiaex extraction as described above.
TcbA_iiAdditional sequences determined for the internal peptide are disclosed herein as SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22. As described above, degenerate oligonucleotides (reverse primers TH-17 and TH-18) corresponding to the reverse complement of the sequence encoding part of the amino acid sequence of these peptides were made.
[0137]
[Table 15]
Table 14.

[0138]
[Table 16]
Table 15

[0139]
The degenerate oligonucleotides TH-18 and TH-17 were ligated with Photolabdas luminescence W-14 DNA as template and TH-4, TH-5, TH-6, or TH- as a 5- (forward) primer. 7 was used for amplification experiments. These reactions amplified about 4 and 4.5 kbp products, respectively. These DNAs were transferred from an agarose gel to a nylon membrane and prepared from a 2.9 kbp product amplified with a TH-5 + TH-10 primer pair.³²Hybridized with the P-labeled probe (as described above). Both the 4 kbp and 4.5 kbp amplification products hybridized strongly to the 2.9 kbp probe. Using these results, TcbA as shown in FIG._iiA map was created to regulate internal peptide sequences. The approximate distance between the primers is shown in FIG. 3 in nucleotide numbers.
[0140]
2.9 kbp of TcbA _ii DNA sequence of fragment that encodes
About 200 ng of the purified 2.9 kbp fragment (prepared previously) was precipitated with ethanol and dissolved in 17 ml of water. Using 25 pmol of the TH-5 pool as a primer, one half was used as a sequencing template and the other half as a template for TH-10 priming. The sequencing reaction was as described in Example 8. No reliable sequence was generated using the TH-10 primer pool. However, reaction with the TH-5 primer pool resulted in the sequences disclosed below.

Based on this sequence, a sequencing primer (TH-21, 5'-CCGGGCGACGTTTATCTAGG-3 ') was designed to invert complement bases 120-139 and gel purified 2.9 kbp TcbA._iiBegan polymerization towards the 5 'end of the PCR fragment encoding (i.e., the TH-5 end). The determined sequence is shown below, and TcbA_iiCompare to the biochemically determined N-terminal peptide sequence of SEQ ID NO: 1.
[0141]
TcbA _ii 2.9 kbp PCR Confirmation of fragment sequence
[Underlined amino acid = encoded by degenerate oligonucleotide]

It is clear from the homology of the derived amino acid sequence to the biochemically determined amino acid sequence that the 2.9 kbp @ PCR fragment corresponds to the TcbA coding region. This 2.9 kbp fragment was then used as a hybridization probe to generate TcbA_iiThe Photolabdas W-14 genomic library prepared in Example 8 was screened for a cosmid containing the gene encoding
[0142]
Photorhabdus Cosmid library screening
Using a Boehringer Mannheim high prime labeling kit as described in Example 8, the 2.9 kbp gel purified PCR fragment was³²Labeled with P. Filters containing remnants of about 800 colonies from the cosmid library were screened as described above (Example 8), positive clones were streaked for isolated colonies and screened again. Three clones (8A11, 25G8, and 26D1) produced positive results with several screening and ligation steps. TcbA_iiHybridization of specificity probes was not observed for any of the four cosmids identified in Example 8, which include the tcaB and tcaC genes. DNA from cosmids 8A11, 25G8, and 26D1 is digested with restriction enzymes BglII, EcoRI or HindIII (alone or in combination with each other), the fragments separated on an agarose gel and applied to a nylon membrane as described in Example 8. Moved.
[0143]
Membranes were prepared from a 4.5 kbp fragment (generated by amplification of Photorhabdus genomic DNA with primers TH-5 + TH-17).³²Hybridized with the P-labeled probe. The pattern generated from cosmid DNAs 8A11 and 26D1 was identical to the pattern generated with genomic DNA similarly cut for the same membrane. Cosmids 8A11 and 26D1 are genomic TcbA_iiIt is concluded that it is an accurate representation of the locus encoding However, cosmid 25G8 has a single BglII fragment slightly larger than genomic DNA. This may result from the positioning of the insert in the vector.
[0144]
tcbA DNA sequence of the gene encoding
Membrane hybridization analysis of cosmid 26D1 revealed that the 4.5 kbp probe hybridized to a single large EcoRΔ1 fragment (greater than 9 kbp). This fragment was gel purified and ligated into the EcoR 1 site of pBC KS (+) as described in Example 8 to generate plasmid pBC-S1 / R1. Using the procedure described in Example 8, the partial DNA sequence of the insert DNA of this plasmid was determined by "primer walking" from adjacent vector sequences. Yet another sequence was generated by extension from a novel oligonucleotide designed from the previously determined sequence. When compared to the DNA sequence determined for the otherwise identified tcbA gene (disclosed herein as SEQ ID NO: 11, as described in Example 12 below), the complete homology was at nucleotide 1- 272, 319-826, 2578-3036, and 3068-3540 (total bases = 1712). Both approaches are TcbA_iiIt was concluded that the DNA fragment encoding the peptide could be used to identify it.
[0145]
tcbA Analysis of derived amino acid sequences of genes
The sequence of the DNA fragment identified as SEQ ID NO: 11 encodes a protein whose derived amino acid sequence is disclosed herein as SEQ ID NO: 12. Some features are TcbA_iiDemonstrates the identification of that gene as a sequence encoding a protein. TcbA_iiThe N-terminal peptide (SEQ ID NO: 1 Phe \ Ile \ Gln \ Gly \ Tyr \ Ser \ Asp \ Leu \ Phe \ Gly \ Asn \ Arg \ Ala) is encoded as amino acids 88-100. TcbA_iiInternal peptide TcbA_ii-PT81 (a) (SEQ ID NO: 23) is encoded as amino acids 1065-1077 and comprises TcbA_ii-PT81 (b) (SEQ ID NO: 24) is encoded as amino acids 1571-1592. Furthermore, the internal peptide TcbA_ii-PT56 (SEQ ID NO: 22) is encoded as amino acids 1474-1488 and contains the internal peptide TcbA_ii-PT103 (SEQ ID NO: 24) is encoded as amino acids 1614-1639. This gene is TcbA as isolated from an insecticide protein preparation of Photorhabdus luminescens strain W-14._iiObviously, it is a genuine clone encoding the peptide.
[0146]
Peptide TcbA_iiThe protein isolated as is derived from cleavage of a longer peptide. This evidence indicates that TcbA_iiGiven by the fact that the nucleotides encoding the N-terminal peptide SEQ ID NO: 1 are preceded by a longer open reading frame of 261 bases (SEQ ID NO: 11) (encoding the 87 N-terminal proximal amino acid). This open reading frame corresponds to the N-terminal sequence of the large peptide TcbA and begins with a nucleotide encoding the amino acid sequence Met \ Gln \ Asn \ Ser \ Leu disclosed herein as SEQ ID NO: 16. TcbA is TcbA_iiIs believed to be a precursor protein of
[0147]
tcbA gene, tcaB Genes and tcaC Gene relationships
The tcaB and tcaC genes are closely related and can be transcribed as a single mRNA (Example 8). The tcbA gene is produced in cosmids that do not apparently overlap with the cosmids harboring the tcaB and tcaC clusters. This is because each genomic library screen identified a different cosmid. However, comparison of the amino acid sequences encoded by the tcaB and tcaC genes with the tcbA gene reveals a substantial degree of homology. Amino acid conservation (Mac Vector^TMThe protein alignment mode of the sequence analysis software, scoring matrix pam250, hash value = 2; Kodak Scientific Imaging Systems, R-ochester, NY) is shown in FIG. In the score lines of each panel in FIG. 4, the upper carat (＾) indicates homology or conserved amino acid changes, and the lower carat (v) indicates non-homology.
[0148]
This analysis shows that the amino acid sequence of the TcbA peptide from residue 1739 to 1894 is TcaB_iThis shows that the peptide is highly homologous to amino acids 441 to 603 (162 of all 627 amino acids of P8; SEQ ID NO: 28). In addition, the sequence of TcbA amino acids 1932-2459 corresponds to the peptide TcaB_iiAmino acids 12-531 (520 of all 562 amino acids; SEQ ID NO: 30). Considering that the TcbA peptide (SEQ ID NO: 12) contains 2505 amino acids, a total of 684 amino acids (27%) at the C-proximal end of it are TcaB_iPeptide or TcaB_iiIt is homologous to the peptide and its homology is co-linearly arranged with the arrangement of the putative TcaB preprotein (SEQ ID NO: 26). The sizeable gap in TcbA homology is due to the TcaB preprotein TcaB_iPart and TcaB_iiMatches the bond between the parts. Clearly, the TcbA and TcaB gene products are evolutionarily related, and it is proposed that they share certain common functions in Photorhabdus.
[0149]
Example 10 Photorhabdus Characterization of zinc-metalloproteases in broth: protease inhibition, classification, and purification
Protease Inhibition Assay and Classification Assay: Protease assays were performed using FITC-casein dissolved in water (0.08% final assay concentration) as substrate. The proteolysis reaction was performed in a suitable buffer containing 25 μl of Photorhabdus broth at 25 ° C. for 1 hour (total reaction volume 150 μl). Samples were also analyzed in the presence and absence of dithiothreitol. After incubation, undigested protein was precipitated by adding an equal volume of 12% trichloroacetic acid. After 0.5 hour of precipitation and subsequent centrifugation, 100 μl of the supernatant was placed in a 96-well microtiter plate and the pH of the solution was adjusted by adding an equal volume of 4N NaOH. Proteolysis was then quantified using a Fluoroscan II fluorometry plate reader at excitation and emission wavelengths of 485 nm and 538 nm, respectively. Protease activity was tested in the range of pH 5.0-10.0 in 0.5 unit increments. The following buffers were used at a final concentration of 50 mM: sodium acetate (pH 5.0-6.5); Tris-HCl (pH 7.0-8.0); and bis-trispropane (pH 8.5-10. 0). To identify one or more classes of proteases that were observed, crude broth was treated with various protease inhibitors (0.5 μg / μl final concentration) and then tested for protease activity at pH 8.0 using the above substrate. did. The protease inhibitors used were E-64 (L-trans-epoxysuccinylleucylamino [4-,-guanidino] -butane), 3,4-dichloroisocoumarin, leupeptin, pepstatin, amastatin, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and It contained 1,10 phenanthroline.
[0150]
Protease assays performed over the pH range revealed that there was in fact one or more proteases that exhibited maximal activity at a pH of about 8.0 (Table 16). Addition of DTT did not affect protease activity. The crude broth was then treated with various protease inhibitors (Table 17). Treatment of crude broth with the above inhibitors revealed complete suppression of total protease activity when 1,10 phenanthroline was added at a final concentration of 50 μg. IC₅₀Was 5 μg in 100 μl of a 2 mg / ml crude broth solution. These data indicate that the most common type of protease or proteases found in Photorhabdus broth is from the zinc-metalloprotease class of enzymes.
[0151]
[Table 17]
Table 16. Effect of pH on Protease Activity in Day 1 Production of Photorhabdus {luminescens} (strain W-14)

a. Flu. Unit = fluorescence unit (maximum = about 28,000; background = about 2200)
b. % Is activity against maximum at pH 8.0 °.
[0152]
[Table 18]
Table 17. Effect of different protease inhibitors on protease activity at pH 8 seen in day 1 production of Photorhabdus luminescens {strain W-14)

a. Modified Flu. Unit = fluorescence unit-background (2200 @ flu. Unit)
b. % Inhibition is relative to protease activity at pH 8.0 °
c. The inhibitor was dissolved in methanol.
d. The inhibitor was dissolved in DMSO.
[0153]
10-80% ammonium sulfate dialyzed as described in Example 5 for Photorhabdus toxin with 50 mM Na₂PO₄Isolation of the zinc-metalloprotease was performed by applying to a Q Sepharose column equilibrated at pH 7.0. After extensive washing, the toxin protein was eluted using a 0-0.5M NaCl gradient. Most of the biological activity and protein eluted between 0.15 and 0.45M NaCl. However, it was observed that most of the proteolytic activity was present in the 0.25-0.35M NaCl fraction, and some activity was present in the 0.15-0.35M NaCl fraction. SDS-PAGE analysis of the 0.25-0.35 M NaCl fraction showed a major peptide band of approximately 60 kDa. The 0.15-0.25 M NaCl fraction contained a similar 60 kDa band, but at a lower relative protein concentration. Subsequent gel filtration of this fraction using a Sperose 12HR @ 16/50 column resulted in a major peak migrating at 57.5 kDa with a 58.5 kDa band, mainly by SDS @ PAGE analysis (greater than 90% of total stained protein). . Additional analysis of this fraction using the various protease inhibitors described above determined that the protease was a zinc-metalloprotease. Almost all of the protease activity present in Photorhabdus broth on day 1 of fermentation corresponded to a zinc-metalloprotease of about 58 kDa.
[0154]
In a second isolation of one or more zinc-metalloproteases, W-14 Photorhabdus broth grown for 3 days was harvested and extracted from Schrrlidt, T .; M. Bleakley, B .; And Neilson, K .; M. Protease activity was visualized using sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) combined with gelatin as described in 1988. SDS running gel (5.5 × 8 cm) was mixed with 12.5% polyacrylamide (40% of acrylamide / bis-acrylamide) mixed with 0.1% final gelatin (BioRad EIA brand reagent; Richmond CA) dissolved in water. Stock solution; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). SDS-stacking gels (1.0 × 8 cm) were made with 5% polyacrylamide also combined with 0.1% gelatin. Typically, 2.5 μg of the protein to be tested was diluted in 0.03 ml of SDS-PAGE loading buffer without dithiothreitol (DTT) and loaded on the gel. Proteins were electrophoresed in SDS running buffer (Laemmli, UK 1970, Nature # 227,680) at 0 ° C. and 8 mA.
[0155]
After electrophoresis was completed, the gel was washed in 2.5% (v / v) Triton X-100 for 2 hours. The gel was then incubated for 1 hour at 37 ° C. in 0.1 M glycine, pH 8.0. After incubation, the gel was fixed and stained overnight with 0.1% amide black in methanol-acetic acid-water (30:10:60, vol./vol./vol .; Sigma Chemical). Protease activity was visualized as a light area against a dark amide black stained background for proteolysis and subsequent diffusion of incorporated gelatin. At least three different bands resulting from proteolytic activity at 58 kDa, 41 kDa, and 38 kDa were observed.
[0156]
Activity assays for different proteases in W-14 3-day culture broth were performed using FITC-casein dissolved in water (0.02% final assay concentration) as substrate. Proteolysis experiments were performed on different protein fractions in a total volume of 0.15 ml in 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) at 37 ° C. for 0-0.5 hours. The reaction was stopped by the addition of an equal volume of 12% trichloroacetic acid (TCA) dissolved in water. After a 0.25 hour incubation at room temperature, the samples were centrifuged at 10,000 xg for 0.25 hours, 0.10 ml aliquots were removed and placed in 96-well microtiter plates. The solution was then neutralized by addition of an equal volume of 2N sodium hydroxide, followed by quantification using a Fluoroscan II fluorometry plate reader at excitation and emission wavelengths of 485 nm and 538 nm, respectively. Activity measurements were performed using FITC-casein with different protease concentrations at 37 ° C. for 0-10 minutes. The unit of activity was arbitrarily defined as the amount of enzyme required to produce 1000 fluorescent units / minute, and the specific activity was defined as units per mg of protease.
[0157]
Suppression studies were performed using two zinc-metalloprotease inhibitors; 1,10 phenanthroline and N- (a-rhamnopyranosyloxyhydroxyphosphinyl) -Leu-Trp (phosphoramidone), each with 100 A stock solution of inhibitor dissolved in% ethanol and water was used. Stock concentrations were typically 10 mg / ml and 5 mg / ml for 1,10 phenanthroline and phosphoramidone, respectively, and final inhibitor concentrations were 0.5-1.0 mg / ml per reaction. Treatment of W-14 crude broth on day 3 with 1,10 phenanthroline, an inhibitor of all zinc metalloproteases, resulted in complete elimination of all protease activity, while a thermolysin-like protease (Weaver, LH, Treatment with the phosphoramidone inhibitor of Kester, WR, and Matthews, BW 1977. J. Mol. Biol. 114, 119-132) resulted in an approximately 56% decrease in protease activity. Residual proteolytic activity could not be further reduced with additional phosphoramidone.
[0158]
Day 3 W-14 Photorhabdus broth protease was purified as follows. 4.0 liters of broth were concentrated using an Amicon helical ultrafiltration cartridge type SIY100 attached to an Amicon M-12 filtration device. Using an Amicon helical ultrafiltration cartridge type SIY100 attached to an Amicon M-12 filter, the flow-through material (3.8 L) with the native protein of size less than 100 kDa was concentrated to 0.375 L. The retentate material contained proteins ranging in size from 10-100 KDa. This material was purified from Perceptive Biosystems (Framigton, Mass.) Boros equilibrated in 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0.^RA Pharmacia HR 16/10 column packed with 50HQ strong anion exchange packing was loaded. The protein was loaded onto the column at a flow rate of 5 ml / min.₂₈₀Unbound protein was washed to = 0.00. The protein was then eluted at a flow rate of 7.5 ml / min using a NaCl gradient of 0-1.0 M NaCl in 40 minutes. Fractions were analyzed for protease activity as described above, and active fractions were pooled. The proteolytically active fraction was diluted with 50% (v / v) 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) and loaded on a Pharmacia HR 10/10 Mono Q column equilibrated with 10 mM sodium phosphate. . Column A₂₈₀After washing with buffer to = 0.00, the protein was eluted at a flow rate of 2.0 ml / min using a NaCl gradient of 0-0.5 M NaCl for 1 hour.
[0159]
Fractions were analyzed for protease activity. Fractions with the highest amount of phosphoramidone-sensitive protease activity were pooled (the phosphoramidone-sensitive activity is for the 41/38 kDa protease as described below). These fractions were found to elute in the range 0.15-0.25M NaCl. In addition, the fraction containing the dominant phosphoramidone-insensitive protease activity, the 58 kDa protease, was pooled. These fractions were found to elute in the range of 0.25-0.35M NaCl. The phosphoramidone-sensitive protease fraction was then Millipore Ultrafree^RConcentrated to a final volume of 0.75 ml using a -15 centrifugal filter device Biomax-5K @NMWL membrane. 0.5 ml of this material is loaded onto a Pharmacia HR 10/30 column packed with Pharmacia Sephadex G-50 equilibrated in 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) /0.1 M NaCl. / Min flow rate. The fractions with the highest phosphoramidone-sensitive protease activity are then pooled and Millipore Ultrafree^R-15 Centrifugal separation filter device Centrifugation was performed using Biomax-50K @ NMWL membrane. The proteolytic activity assay described above showed that this material had only phosphoramidone-sensitive protease activity. The phosphoramidone insensitive protease, a 58 kDa protein, was pooled, followed by Millipore Ultrafree^RIt was concentrated in a -15 centrifugal filter device Biomax-50K @NMWL membrane and further separated on a Pharmacia Superdex-75 column. Fractions containing protease were pooled.
[0160]
Analysis of purified 58 kDa and 41/38 kDa purified proteases shows that both types of proteases are completely inhibited by 1,10 phenanthroline, but only the 41/38 kDa protease is inhibited by phosphoramidone. Revealed. Further analysis of the crude broth showed that the protease activity of W-14 broth on day 1 had 23% of the total protease activity for the 41/38 kDa protease and 44% on day 3 W-14 broth. Increased.
Routine SDS-PAGE analysis to test protein purity and obtain amino terminal sequences was performed using a 4-20% gradient Miniplus Sepragels purchased from Integrated Separation Systems (Natick, MA). Was. The protein to be amino-terminal sequenced is blotted onto PVDF membrane after purification as described below (problot^TMMembranes; Applied Biosystems, Foster @ City, CA), visualized with 0.1% amide black, excised, and sent to Cambridge Prochem (Cambridge, Mass.) For sequencing.
[0161]
The deduced amino-terminal sequences of the 58 kDa (SEQ ID NO: 45) and 41/38 kDa (SEQ ID NO: 44) proteases from W-14 broth after 3 days are DV-GSEKANEKLK (SEQ ID NO: 45) and DSGDDDDKVTNTDIHR (SEQ ID NO: 44), respectively. there were.
Sequencing of the 41/38 kDa protease reveals several amino termini, with each terminus having additional amino acids that are removed by proteolysis. Examination of the primary, secondary, tertiary and quaternary sequences for the 38 kDa and 41 kDa polypeptides allowed the deduction of the sequences shown above and revealed that these two proteases were homologous. .
[0162]
Example 11 , Part A
TcbA By using antibodies for the gene encoding the peptide Photorhabdus Genome library screening
In parallel with the above sequencing, suitable probing and sequencing was performed with TcbA_iiPerformed based on the peptide (SEQ ID NO: 1). This sequencing was performed by preparing a bacterial culture broth as described in Examples 1 and 2 above and purifying the toxin.
Genomic DNA was isolated from Photorhabdus luminescens strain W-14 grown in Grace's insect tissue medium. The bacteria were grown in a 250 ml Erlenmeyer flask at 28 ° C. and 250 rpm for about 24 hours in 5 ml of medium. Bacterial cells from 100 ml of medium were pelleted at 5000 xg for 10 minutes. The supernatant was discarded and the cell pellet was used for genomic DNA isolation.
Genomic DNA was isolated using a modification of the CTAB method described in Ausubel, supra, section 2.4.3. During step 6, the section entitled "Large-scale CsCl @ prep of bacterial genomic DNA" was followed. At this point, an additional chloroform / isoamyl alcohol (24: 1) extraction was performed, followed by a phenol / chloroform / isoamyl (25: 24: 1) extraction step and a final chloroform / isoamyl alcohol (24: 1) extraction. went.
[0163]
DNA was precipitated by adding 0.6 volumes of isopropanol. The precipitated DNA was hooked, wrapped around the end of a bent glass rod, quickly immersed in 70% ethanol as the final wash, and dissolved in 3 ml of TE buffer.
The DNA concentration estimated by optical density at 280/260 nm was about 2 mg / ml.
Using this genomic DNA, a library was prepared.
About 50 μg of genomic DNA was partially digested with Sau3A1. The partially digested DNA fragments were then size fractionated using NaCl density gradient centrifugation. Fractions containing DNA fragments having an average size of 12 kb or more as determined by agarose gel electrophoresis were ligated to plasmid BluScript (Stratagen, La Jolla, Calif.). coli DH5α or DHB10 strain.
Separately, purified aliquots of the protein were sent to the Biotechnology Hybridoma Center at the University of Wisconsin (Madison) for production of monoclonal antibodies against the protein. The material sent was a purified HLPC fraction containing native bands 1 and 2 denatured at 65 ° C., 20 μg of which were injected into each of four mice. After fusing spleen cells from unimmunized mice with a stable myeloma cell line, a stable monoclonal antibody producing hybridoma cell line was recovered. Monoclonal antibodies were recovered from the hybridomas.
[0164]
Separately, polyclonal antibodies were generated by collecting native agarose gel purified band 1 (see Example 1), and the protein was then used to immunize New Zealand white rabbits. The protein was prepared by excising the bands from the native agarose gel, quickly heating the gel pieces to 65 ° C. to melt the agarose, and immediately emulsifying with adjuvant. Complete Freund's adjuvant was used for the primary immunization, and incomplete Freund was used for three additional injections at monthly intervals. For each injection, approximately 0.2 ml of an emulsified band containing 50-100 micrograms of protein was delivered to the back of the rabbit by subcutaneous injection. Serum was obtained 10 days after the first injection and additional blood draws were taken weekly for 3 weeks. Serum complement was inactivated by heating at 56 ° C for 15 minutes and then stored at -20 ° C.
Genomic libraries were then screened using monoclonal and polyclonal antibodies for expression of the antigen detectable by the epitope. Positive clones were detected with a nitrocellulose filter colony lift. An immunoblot analysis of positive clones was attempted.
[0165]
Analysis of clones identified by both immunoblot and Southern analysis resulted in preliminary analysis of five classes of clones.
In a first class of clones, where TcbA_iiThere was a gene encoding a peptide called The complete DNA sequence (TcbA) of this gene was obtained. It is shown as SEQ ID NO: 11. Confirmation that the sequence encodes the internal sequence of SEQ ID NO: 1 is demonstrated by the presence of SEQ ID NO: 1 at amino acid 88 from the deduced amino acid sequence generated by the open reading frame of SEQ ID NO: 11. This can be confirmed by reference to SEQ ID NO: 12, which is the deduced amino acid sequence generated by SEQ ID NO: 11.
The second class of toxin peptides is TcaB_i, TcaB_iiAnd TcaC and the segments described above. After screening the library with polyclonal antisera, this second class of toxin genes was identified by several clones producing proteins of different sizes, all of which cross-reacted with the polyclonal antibody in immunoblots and also in Southern blots. Share DNA homology. Sequence comparisons revealed that they belonged to the gene complexes referred to above as TcaB and TcaC.
[0166]
Also, three other classes of antibody toxin clones were isolated on a polyclonal screen. These classes produced proteins that cross-reacted with the polyclonal antibodies and shared DNA homology with these uras as determined by Southern blotting. These classes were designated as Class III, Class IV and Class V. It was also possible to identify monoclonals that cross-reacted with classes I, II, III, and IV. This suggests that all have regions of high protein homology. Thus, P. The luminescens extracellular protein gene represents a family of evolutionarily related genes.
To further push the notion that there may be evolutionarily related changes in the toxin peptides contained in this organism, two approaches have been attempted to determine the presence of related proteins by P. s. Other strains of luminescens were tested. This was done both by PCR amplification of genomic DNA and by immunoblot analysis using polyclonal and monoclonal antibodies.
The results indicate that the relevant protein is P. luminescens strains WX-2, WX-3, WX-4, WX-5, WX-6, WX-7, WX-8, WX-11, WX-12, WX-15 and W-14 Is shown.
[0167]
Example 11 , Part B
class III Toxin clone -Tcc Sequence and analysis
Further DNA sequencing was performed using the class III１１E. Performed on plasmids isolated from E. coli clones. The nucleotide sequence was shown to be three closely linked open reading frames at this genomic locus. This locus is called tcc and the three open reading frames are called tccA SEQ ID NO: 56, tccB SEQ ID NO: 58 and tccC SEQ ID NO: 60 (FIG. 6B).
Deduced amino acids from the tccA open reading frame indicate that the gene encodes a 105,459 Da protein. This protein was called TccA. The first 12 amino acids of this protein are compatible with the N-terminal sequence obtained from the 108 kDa protein previously identified as part of the toxin complex, SEQ ID NO: 7.
Deduced amino acids from the tccB open reading frame indicate that this gene encodes a 175,716 Da protein. This protein was called TccB. The first 11 amino acids of this protein are compatible with the N-terminal sequence obtained from the protein with a predicted molecular weight of 185 kDa, SEQ ID NO: 8.
The deduced amino acid sequence of tccC indicated that this open reading frame encodes a 111,694 Da protein, and the protein product was designated as TccC.
[0168]
Example 12
Photorhabdus Share characterization
In order to demonstrate that the collections described herein include rhotorhabdus strains, these strains were characterized by Photorhabdus and were identified as other Enterobacteriaceae and xenorhabdus spp. (Farmer, JJ. 1984. Bergey's Manual of Systemc Bacte-riology, Vol. 1, pp. 510-511 (edited by Kreig N. R. and Holt, J. G.) Williams & Wilkins, Baltimore, A .; 1988, Boeffrare et al., 1993). These characteristic traits are as follows. Gram stain negative rods, biological size 0.5-2 μm wide and 2-10 μm long, red / yellow colony coloration, presence of crystalline inclusions, presence of catalase, inability to reduce nitrate, presence of bioluminescence, Ability to absorb dye from growth medium, positive for protease production, growth temperature range below 37 ° C, survival under anaerobic conditions and aggressive motility (Table 18). The reference Escherichia coli, Xenolabudas and Photorhabdus strains were included in all tests for comparison. The overall results are consistent with all strains being part of the family Enterobacteriaceae and the genus Photorhabdus.
[0169]
The luminescence of each strain was demonstrated using a luminometer to provide a quantitative and relative measure of color development. For measurement of relative luminescence units, broth (cells and medium) from each strain was measured at three time intervals (6, 12, and 24 hours) after inoculation in culture, and background lightness (not Inoculation medium and water). Prior to the measurement of luminescence from the various broths, cell density was determined by measuring absorbance (560 nM) in a Guilford Systems (Ob-erlin, OH) spectrometer using a sipper cell. Appropriate dilutions were then made before measuring lightness (to normalize the optical density to 1.0 units). Aliquots of the diluted broth were then placed in cuvettes (300 μl each) and read in a Bio-Orbit 1251 Luminometer (Bio-Orbit @ Oy, Twiku, Finland). The integration time for each sample was 45 seconds. The samples were continuously mixed (rotated in a baffled cuvette) while reading to obtain oxygen availability. Positive tests were determined to be more than 5 times background luminescence (about 5-10 units). In addition, colony brightness was detected with a photographic film overlay and visually after fitting in a dark room. The Gram stain properties of each strain were confirmed with a commercial Gram stain kit (BBL, Cockeysville, MD) used with Gram stain control slides (Fisher Scientific, Pitts-burgh, PA).
[0170]
Microscopic evaluation was then performed using a Zeiss microscope (Carl Zeiss, Germany) 100X oil immersion objective (10X eyepiece magnification and 2X body magnification). Microscopic examination of individual strains for organism size, cell description and inclusion bodies (inclusion bodies after log phase growth) were performed using oil mounted wet mounted slides (10X eyepiece magnification, 2X body magnification and 40X objective magnification) and micrometer. Includes phase contrast microscopy (Akhhurst, RJ and Boemare, NE 1990.Entomopathogenic Nematodes in Biological Control(Edited by Gaugler, R. and Kaya, H.). 75-90. CRC Press, Boca Raton, USA. Bagdi-guian @ S. , Boyer-Gig1ioM. H. , Thaler, J. et al. O. , Bonnot @ G. , Boemare, N .; 1993. Biol. Cell # 79, 177-185). Colony staining was observed after inoculation on Bacto Nutrient Agar (Difco Laboratories, Detroit, MI) prepared according to label instructions. Incubation took place at 28 ° C, producing the description after 5-7 days. To test for the presence of the enzyme catalase, a colony of the test organism was removed from the nutrient agar plate with a small plug and placed in the bottom of a glass tube. 1 ml of a household hydrogen peroxide solution was gently added down the side of the tube. A positive reaction was recorded when bubbles (presumably oxygen) appeared immediately or within 5 seconds.
[0171]
Controls of uninoculated nutrient agar and hydrogen peroxide solution were also tested. To test for nitrate reduction, each culture was inoculated into 10 ml of bactonitrate broth [Difco Laboratories, Detroit, MI]. After incubation for 24 hours at 28 ° C., nitrite formation was tested by the addition of two drops of sulfanilic acid reagent and two drops of α-naphthylamine reagent (Difco Manual, Vol. 10, Difco Laboratories, Detroit, MI, 1984). checking). The appearance of a distinct pink or red color indicates the formation of nitrite from nitrate. The ability of each strain to absorb the dye from the growth medium was determined by Bacto-Macconky agar containing the dye Neutral Red; Bacto-Tergitol-7 agar containing the dye bromothymol blue and Bacto EMB agar containing the dye Eosin-Y (Difco. Laboratories, Detrol, MI, all prepared according to label instructions). Following inoculation of these media, dye absorption was recorded after 5 days of incubation at 28 ° C. Growth in these latter media is characteristic of members of the Enterobacteriaceae family. The motility of each strain was tested using a solution of Bacto motility test medium (Difco Laboratories, Detroit, MI) prepared according to the label instructions. Butt-Stab inoculations were performed with each strain and motility was determined macroscopically by the growth diffusion zone extending from the inoculum line. In many cases, motility was also observed microscopically from the culture under wet mounted slides.
[0172]
Biochemical nutritional assessments for each strain were performed using BBL Enterotube II (Benton, Dickinson, Germany). The product instructions were followed except that the incubation was performed at 28 ° C. for 5 days. The results were consistent with the earlier cited article on Photorhabdus. Protease production was tested by observing gelatin hydrolysis using Bacto gelatin (Difco Laboratories, Detroit, MI) plates made according to label instructions. Cultures were inoculated and plates were incubated at 28 ° C. for 5 days. To evaluate growth at different temperatures, agar plates [2% proteose peptone # 3 with 2% Bacto agar (Difco, Detroit, MI) in deionized water] were streaked from a common source of inoculum. . Nesco plate^RSealed with film and incubated at 20 ° C, 28 ° C and 37 ° C for up to 3 weeks. Plates that did not show growth at 37 ° C did not show cell viability after one week in a 28 ° C incubator. The oxygen demand for the Photorhabdus strain was tested in the following manner. Vat-stub inoculation was performed on liquid thioglycolate broth medium (Difco, Detroit, MI). The tubes were incubated for 1 week at room temperature, and the culture was then tested for type and extent of growth. The indicator resazurin indicates the level of medium oxidation or aerobic zone (Gifco Manual, Vol. 10, Gifco Laboratories, Detroit, MI). The growth zone results obtained for the Photorhabdus strains tested were consistent with the results for the conditional anaerobic microorganisms.
[0173]
[Table 19]
Table 18 Taxonomic traits of Hotaruhabudasu strain
Characters evaluated^*

[0174]
[Table 20]
Table 18. Continued

*-A = Gram stain, B = crystalline inclusions, C = bioluminescent, D = cell morphology, E = motility, F = nitrate reduction, G = presence of catalase, H = gelatin hydrolysis, I = dye Absorption, J = colored, K = growth on EMB agar, L = growth on McConkie agar, M = growth on Tajitol-7 agar, N = conditional anaerobic, O = growth at 20 ° C., P = growth at 28 ° C. Q = growth at 37 degrees, a: + = positive for trait, − = negative for trait, rd = rod, S = size in genus descriptor, RO = red-orange, LR = bright red, R = red, O = Orange, Y = yellow, T = brown, LY = light yellow, YT = tan and LO = positive or negative for light orange
[0175]
Cellular fatty acid analysis is a recognized tool for bacterial characterization at the genus and species levels (Tornabene, TG 1985.Lipid Analysis and the Relationship to Chemotaxonomy in Methods in Microbiology, 18, 209-214. Goodfellow, M .; And O'Donnell, A .; G. FIG. 1993.Roots of Bacterial Systems in Handbook of New Bacterial Systems(Goodfellow, M. and O'Donnell, AG, eds.) P. ) (These references are hereby incorporated by reference) and were used to confirm that our collection was relevant at the genus level. Cultures were transported to an external contract laboratory for fatty acid methyl ester analysis (FAME) using the Microbial ID (MIDI, Newark, DE, USA) Microbial Identification System (MIS). The MIS system consists of a Hewlett-Packard HP5890A gas chromatograph equipped with a 25 mm x 0.2 mm 5% methyl phenyl silicone quartz silica capillary column. Using hydrogen as a carrier gas, a flame ionization detector works in conjunction with an automatic sampler, integrator and computer. The computer compares the sample fatty acid methyl ester to a library of microbial fatty acids and a calibration mixture of known fatty acids. Strains were grown on trypticase soy agar at 28 ° C. for 24 hours prior to analysis, as selected by contract laboratory. Sample extraction was performed by a contract laboratory according to the usual FAME method. There was no direct strain identification for the luminescens bacterial group other than Photorhabdus. When performing a cluster analysis, which compares the fatty acid profiles of the isolate groups, the strain fatty acid profiles were related at the genus level.
[0176]
The evolutionary diversity of Photorhabdus strains in our collection was measured by analysis of PCR (polymerase chain reaction) -mediated genomic fingerprinting using genomic DNA from each strain. This technique is based on a family of repetitive DNA sequences that are present in the genomes of various bacterial species (Versalovic, J., Schneider, M., DE Bruijn, FJ. And Lupski, JR 1994. Methods. Mol. Cell. Biol., 5, 25-40). These three, the repetitive extragenic palindome sequence (REP), the intestinal bacterial repetitive intragenic consensus (ERIC), and the BOX element are thought to play important roles in the organization of the bacterial genome. The genomic organization is thought to be shaped by selection, and the differential variance of these elements within the genome of closely related bacterial strains can be used to distinguish these strains (see, for example, Lows, F. et al. J., Fullright, DW, Stephens, CT and DE Bruijn, FJ 1994. Appl. Environ. Micro. 60, 2286-2295.). Rep-PCR uses oligonucleotide primers complementary to these repeats to amplify the variable size DNA fragment in between them. The resulting products are separated by electrophoresis to establish a DNA "fingerprint" for each strain.
[0177]
To isolate genomic DNA from our strain, the cell pellet was resuspended in TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) to a final volume of 10 ml and then 5 M NaCl 12 ml was added. This mixture was centrifuged at 15,000 xg for 20 minutes. The resulting pellet was resuspended in 5.7 ml of TE and 300 μl of 10% SDS and 60 μl of 20 mg / ml proteinase K (Gibco BRL Products, Grand Island, NY) were added. The mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour, then about 10 mg of lysozyme was added and the mixture was incubated for a further 45 minutes. Then 1 ml of 5 M NaCl and 800 μl of CTAB / NaCl solution (10% w / v CTAB, 0.7 M NaCl) are added, the mixture is incubated at 65 ° C. with gentle agitation for 10 minutes and then an additional 20 minutes Incubated for minutes and agitated to help clear cell material. An equal volume of a chloroform / isoamyl alcohol solution (24: 1, v / v) was added, mixed gently and then centrifuged. Then two extractions were performed with an equal volume of phenol / chloroform / isoamyl alcohol (50: 49: 1). Genomic DNA was precipitated with 0.6 volumes of isopropanol. The precipitated DNA was removed with a glass rod, washed twice with 70% ethanol, dried and dissolved in 2 ml of STE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 1 mM EDTA).
[0178]
The DNA was then quantified by optical density at 260 nm. The following primers were used to perform rep-PCR analysis of Photorhabdus genomic DNA. REP1R-I; 5'-IIIICGICGICATCIGGC-3 'and REP2-I; 5'-ICGICTATTIGGCCCTAC-3'. PCR was performed using the following 25 μl reaction solution. 7.75 μl of H₂O, 2.5 μl of 10 × ΔLA buffer (Panbella Corporation, Madison, Wis.), 16 μl of dNTP mixture (2.5 mM each), 1 μl of each primer (50 pM / μl), 1 μl DMSO, 1.5 μl Genomic DNA (concentration ranging from 0.075-0.480 μg / μl) and 0.25 μl of Takara EX @ Taq (Panbella Corporation, Madison, Wis.).
[0179]
PCR amplification was performed in a Perkin-Elmer DNA thermal cycler (Norwalk, CT) using the following conditions. 95 ° C / 7 minutes, then 94 ° C / 1 minute, 44 ° C / 1 minute, 65 ° C / 8 minutes, followed by 35 cycles of 65 ° C for 15 minutes. After the cycle, 25 μl of the reaction was added to 6X gel loading buffer (H₂5% of 0.25% bromophenol blue in O, 40% w / v sucrose). A 15x20 cm 1% agarose gel was then run in TBE buffer (0.09 M Tris-borate, 0.002 M EDTA) using 8 μl of each reaction. The gel was run at 45v for about 16 hours. The gel was then stained in 20 μg / ml ethidium bromide for 1 hour and destained in TBE buffer for about 3 hours. Polaroid® photographs of the gel were then taken under UV illumination. The presence or absence of specific size bands for each strain was scored from the pictures and entered as a similarity matrix into the numerical taxonomy software program, NTSYS-pc (Exeter Software, Setauket, NY).
[0180]
E. evaluated simultaneously. E. coli strain HB101 andXanthomonas orizae pv . Orizae(Xanthomonas oryzae@pv.oryzae) controls were published papers (Versalovic, J., Koeuth, T. and Lupski, JR 1991. Nucleic Acids Res. 19, 6823-6831; Vera Cruz, Craz. Halda-Alija, L., Lows, F., Skinner, D.Z., George, M.L., Nelson, R.J., DE @ Bruijn, F.J., Rice, C. and Leach, J. Ver. @ Cruz, CM, Ardales, EY, Skinner, D.Z., Talag, J., Nelson, R.E. 1995. Int.Rice@Res.Notes, 20, 23-24. , Lows, FJ, Leu g, H., resulting Mew, T. W., and Leach, J.E.1996.Phytopathology (respectively, in press) the PCR "fingerprint" that matches). The data from the Photorhabdus strain is then analyzed with a series of programs in NTSYS-pc; SIMQUAL (similarity for qualitative data) to analyze similarity coefficients (using Jacquard coefficients) and SAHN (continuous coherent hair archival). ) And nested) clustering [using the UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic mean) method], which resulted in a grouping of related strains and which could be represented as a phenogram (Figure 5). . The COPH (cophenetic value) program and the MXCOMP (matrix comparison) program were used to generate a cophenetic value matrix and compare the correlation between this and the initial matrix on which clustering was based. The resulting scaled Mantel statistic (r) results, which is a measure of the fit of the cluster analysis (r = 0.8-0.9 represents a very good fit). In our case, r is 0.919. Thus, our collection includes a diverse group of representative easily distinguishable strains of the genus Photorhabdus.
[0181]
Example Thirteen Various Photorhabdus Pesticide utility of one or more toxins produced by a strain
Initial "seed" cultures of various Photorhabdus strains were transferred to Delong with 175 ml of 2% Proteose Peptone # 3 (PPS) (Gif Laboratories, Detroit, MI) liquid medium covered with Kaput. Resulted by inoculating the primary mutant subclone in a 500 ml three-necked baffled flask. The inoculum of each seed culture was derived from an oil-overlay agar slant culture or a plate culture. After inoculation, the flasks were incubated at 150 rpm on a rotary shaker at 28 ° C. for 16 hours. These seed cultures were then used as uniform inoculum for a given fermentation of each strain. In addition, the post-log phase seed culture was overlaid with sterile mineral oil, a sterile magnetic stir bar was added for future resuspension, the culture was stored at room temperature in the dark, and the inoculum was toxin-responsive. For long term storage.
[0182]
The production broth was inoculated by adding 1% of an actively growing seed culture (eg, 1.75 ml per 175 ml of fresh medium) to fresh 2% PP3 medium. The production of broth occurred in 500 ml three baffled flasks (see above) or 2800 ml baffled convex bottom flasks (500 ml volume) covered with silicone foam closure. The production flask was incubated under the above conditions for 24-48 hours. After incubation, the broth was dispensed into sterile 1 L polyethylene bottles, spun at 2600 × g for 1 hour at 10 ° C., and decanted from the cells and debris pellet. The liquid broth was then vacuum filtered through a Wattman GF / D (hold 2.7 μM) and GF / B (hold 1.0 pM) glass filters to remove debris. Additional broth clarification was obtained on a tangential flow microfilter (Paul Filtron, Northborough, Mass.) Using a 0.5 μM open-channel filter. If necessary, additional clarification could be obtained by cooling the broth (to 4 ° C.) and centrifuging at 2600 × g for several hours. After these operations, the broth was filter sterilized using a 0.2 μM nitrocellulose membrane filter. The sterile broth is then used directly for biological assays, biochemical analyses, or a 10,000 MW cut-off M12 ultrafiltration device (Amicon, Beverly @ MA) or a centrifugal concentrator with 10,000 MW pore size ( (Millipore, Bedford, Mass. And Paul Filtron, Northborough, Mass.). In the case of a centrifugal concentrator, the broth was spun at 2000 × g for about 2 hours. 10,000 MW of permeate was added to the corresponding retentate to obtain the desired concentration of components greater than 10,000 MW. Thermal inactivation of the treated broth samples was obtained by heating the samples at 100 ° C. in a sand-filled heating block for 10 minutes.
[0183]
One or more broths and one or more toxin complexes from different Photorhabdus strains are beneficial in reducing insect populations, applying an effective insect inactivating amount of the active described substance to the insect locus. Insect populations including: A demonstration of the range of insecticidal activity observed from the broths of selected groups of Photorhabdus strains fermented as described above is shown in Table 19. It is possible that additional pesticidal activity can be detected in these strains by increased concentrations of broth or by using different fermentation methods. Consistent with the activity associated with the protein, the insecticidal activity of all strains tested was thermolabile (see above).
[0184]
One or more culture broths from various Photorhabdus strains show different insecticidal activity (mortality and / or growth inhibition, reduced adult development) against some insects. More specifically, its activity is seen against corn @ rootworm larvae and ball @ weevil larvae, which are members of the insect order Coleoptera. Other members of Coleoptera include click beetles larvae, pollen beetles, flea beetles, seed beetles, and colorado potato beetles. Activity is also observed on the aster reef hopper and the corn plant hopper, which are members of the order Homoptera. Other members of Homoptera include planthopper, peer @ psilla, apple soccer, scale insects, whitefly, white bugs, and many host-specific alimaki species. Can be Also, the broth and one or more purified toxin conjugates include tobacco budworm, tobacco hornworm, and European corn borer (European corn borer), which are members of the order Lepidoptera. ). Other typical members of this eye are the beet armyworm, the cabbage looper, the black cutworm, the cornearworm, the codling moss. , Iga, Indian mealmos, Coleoptera, Amber worm, Cotton ballworm (cotton bollworm), Beetle, Eastern tent caterpillar, Sod webworm and sord webworm (Fall @ armyworm). Activity is also seen against fruit fly larvae and mosquito larvae, which are members of the order Diptera. Other members of the order Gibutella are pear midge, carrot fry, cabbage root fry, cab root fry, turnipr-root fry, onion fry. onion @ fly), crane fly and housefly and various mosquito species. Also, activity by one or more broths and one or more toxin complexes is seen against two-spotted spider mites, a member of the order Acarina, which includes strawberry spider mites, broadmite, Includes citrus red mite, European red mite, European rustmite, peer rustmite and tomato rustset mite.
[0185]
Activity against corn rootworm larvae was tested as follows. One or more Phototorhabdus culture broths (concentrated 0-15 fold, filter sterilized), 2% proteose peptone # 3, one or more purified toxin conjugates [0.23 mg / ml] or 10 mM sodium phosphate buffer, The pH 7.0 was adjusted to the surface (approximately 1.5 cm) of the artificial diet (Rose, RI and McCabe, JM (1973). J. Econ. Entomol. 66, (398-400)) in a 40 μl aliquot.²) Applied directly. The toxin conjugate was diluted in 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0. The meal plate is air-dried in a sterile flow-hood and the wells are single neonatal diablotica undecimpunctata whirldi (Southern corn rootworm) polished from surface-sterilized eggs in wells. corn @ rootworm, SCR)). The plate was sealed, placed in a humidified growth chamber, and kept at 27 ° C. for the appropriate period (3-5 days). The mortality and larval weight measurements were then scored. In general, 16 insects per treatment were used for all studies. Control mortality was generally less than 5%.
[0186]
The activity against Ball Weeville (Anthomonas glandis) was tested as follows: concentrated (1 to 10 times) Phototorhabdus broth, control medium (2% proteose peptone # 3), one or more purified toxins Complex [0.23 mg / ml] or 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0, applied to a surface of 0.35 g of artificial diet (Stoneville Yellow Lepidopteran diet) in 60 μl aliquots A single 12-24 hour Ball Weeville larva was placed on the diet, the wells were sealed and kept at 50% RH at 25 ° C. for 5 days, then mortality and larval weight were evaluated. Control mortality ranges from 0 to 13%. It was.
[0187]
Activity against mosquito larvae was tested as follows. The assay was performed in a 96-well microtiter plate. Each well contains 200 μl of an aqueous solution (one or more 10-fold concentrated Phototorhabdus culture broth, control medium (2% proteose peptone # 3), 10 mM sodium phosphate buffer, one or more toxin conjugate 0.23 mg / ml or H₂O) and about 20 day old larvae (Aedes aegypti). There were 6 wells per treatment. Results were read 3-4 days after occurrence. Control mortality was 0-20%.
[0188]
Activity against fruit flies was tested as follows. 50% dry medium and 50% water, control medium (2% proteose peptone # 3), 10-fold concentrated one or more Phototorhabdus culture broths, one or more purified toxin conjugates [0.23 mg / ml] Alternatively, purchased Drosophila melanogaster medium was prepared using 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0. This was done by placing 4.0 ml of dry medium in each of three growth vials per treatment and adding 4.0 ml of the appropriate liquid. Then 10 late-stage Drosophila melanogaster ridges were added to each 25 ml vial. The vials were kept on a laboratory bench at room temperature under fluorescent ceiling lights. Puppy or adult counts were performed 15 days after exposure. Adult development was compared to water and control medium (0-16% reduction).
[0189]
The activity against adult Aster reef hoppers (Macrosteels severini) and corn plant hopper nymphs (Peregrinus maidis) to allow the uptake of the active substance without other external contact Tested in a designed uptake assay. A reservoir of the active / "food" solution is made by making two holes in the center of the bottom of a 35 x 10 mm petri dish. 2 inch parafilm M^RPlace the square across the top of the dish and secure with a "Q" ring. Approximately 7 hoppers are then generated in a 1 oz plastic cup and the reservoir is placed on the cup with parafilm down. The test liquid is then added to the reservoir through the hole. In tests using one or more 10-fold concentrated Photorhabdus culture broths, broth and control medium (2% proteose peptone # 3) was dialyzed against 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0, and sucrose ( (Up to 5%) was added to the resulting solution to reduce control mortality. Also tested were one or more purified toxin conjugates [0.23 mg / ml] or 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0. Mortality is reported on day 3. The assay was kept in an incubator at 28 ° C., 70% RH for a 16/8 light period. The assay was graded for mortality at 72 hours. Control mortality was less than 6%.
[0190]
Activity against lepidopteran larvae was tested as follows. One or more concentrated (10-fold) Phototorhabdus culture broth, control medium (2% proteose peptone # 3), one or more purified toxin complexes [0.23 mg / ml] or 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0. 0 in a 40 μl aliquot of a conventional artificial lepidopteran diet (Stoneville Yellow diet) (approximately 1.5 cm)²) Applied directly. Food plates were air-dried in a sterile flow-hood to generate single neonatal larvae. European corn bollers (Ostrinia nubularis) and tobacco hornworms (Manduca sexta) were obtained from commercial sources and hatched in houses, while tobacco badworms (Heliodis. Vilesense (Heliothis @ virescens) larvae were fed internally. After larva development, the food plate was sealed, placed in a humidified growth chamber and kept in the dark at 27 ° C for an appropriate period. Mortality and weight measurements were scored on day 5. In general, 16 insects per treatment were used for all studies. Control mortality generally ranged from 4 to 12.5% for control media and less than 10% for phosphate buffer.
[0191]
The activity against two-spotted spider mites (Tetranychus urticae) was tested as follows. Young pumpkin plants are trimmed to single cotyledons, one or more 10-fold concentrated broth, control medium (2% proteose peptone # 3), one or more purified toxin complexes [0.23 mg / ml] or 10 mM phosphorus Sprayed down with sodium acid buffer, pH 7.0 and allowed to flow down. After drying, the plants developed a mixed population of spider mites and were kept at experimental temperature and humidity for 72 hours. Surviving mites were then counted to determine the level of control.
[0192]
[Table 21]
Table 19-Observed insecticidal spectra of broth from different Photorhabdus strains

[0193]
[Table 22]
Table 19 Continued

* = 25% mortality and / or growth inhibition relative to control
** = 1: tobacco badworm, 2: European corn borer, 3: tobacco hornworm, 4: southern corn rootworm, 5: ball weevil, 6: mosquito, 7; fruit fly, 8; Astor leaf hopper, 9; corn plant hopper, 10; two-spotted spider mite
[0194]
Example 14 Non W-14 Photohabdus stock: Purification, characterization and activity spectrum purification
The following protocol is similar to that developed for purification of W-14, the fraction having the most activity against the Southern corn rootworm (SCR) as measured by a bioassay (see Example 13) Was established on the basis of purification. Typically, 4-20 L of broth filtered as described in Example 13 was received and concentrated using an Amicon helical ultrafiltration cartridge type SIY100 attached to an Amicon M-12 filter. . The retentate contained native proteins of molecular size greater than 100 kDa, while the flow-through material contained native proteins of a size less than 100 kDa. Most of the activity against SCR was contained in the 100 kDa retentate. The retentate is then filtered and A₂₈₀Diafiltration was performed continuously with 10 mM sodium phosphate (pH = 7.0) until <0.100 was reached. Unless otherwise stated, all manipulations from this point were performed in a buffer as specified with 10 mM sodium phosphate, pH 7.0.
[0195]
The retentate was then concentrated to a final volume of about 0.20 L and 0.45 mm Nalgene^TMFiltered using a filmware sterile filtration unit. Filtered material into Perceptive Biosystem Sprint^RPerceptive biosystem poross equilibrated in buffer using HPLC system^RA Pharmacia HR 16/10 column packed with a 50HQ strong ion exchange matrix was loaded at 7.5 ml / min. After loading, A₂₈₀The column was washed with buffer until <0.100 was reached. The protein was then eluted from the column at 2.5 ml / min using a buffer containing 0.4 M NaCl for 20 minutes for a total volume of 50 ml. The column was washed with buffer containing 1.0 M NaCl at the same flow rate for a further 20 minutes (final volume = 50 ml). The proteins eluted with 0.4M and 1.0M NaCl were separated into separate dialysis bags (Spectrota / Port).^R(Membrane MWCO: 2000) and dialyzed overnight at 4 ° C. in 12 L of buffer. Most of the activity against SCR was contained in the 0.4 M fraction. The 0.4 M fraction was further purified by applying 20 ml to a Pharmacia XK 26/100 column pre-packed with Sepharose CL4B (Pharmacia) using a flow rate of 0.75 ml / min. Fraction A₂₈₀Pool and Millipore Ultrafree based on peak profile^RConcentrated to a final volume of 0.75 ml using a 15 centrifuge filter device Biomax-50K @NMWL membrane. Protein concentration was measured using a Bio-Rad protein assay kit using bovine gamma globulin as a standard.
[0196]
Characterization
The native molecular weight of the SCR toxin conjugate was measured using Pharmacia HR # 16/50 pre-packed with Sepharose CL4B in buffer. The column was then calibrated using proteins of known molecular size, thereby allowing calculation of the approximate native molecular size of the toxin. As shown in Table 20, the molecular size of the toxin conjugate ranged from 777 kDa for strain Hb to 1,900 kDa for strain WX-14. Also, the yield of toxin conjugate changed from strain WX-12 producing 0.8 mg / L to a strain rule producing 7.0 mg / L.
The proteins found in the toxin complex were tested for individual polypeptide sizes using SDS-PAGE analysis. Typically, 20 mg of toxin conjugate protein from each strain is loaded on a 2-15% polyacrylamide gel (Integrated Separation Systems) and electrophoresed at 20 mA in Bio-Rad SDS-PAGE buffer. Was. After completion of the electrophoresis, the gel was stained overnight in Bio-Rad Coomassie Blue R-250 (0.2% in methanol: acetic acid: water; 40:10:40 v / v / v). Subsequently, the gel was destained in methanol: acetic acid: water; 40:10:40 (v / v / v). The gel is then rinsed with water for 15 minutes, and the Molecular Dynamics Personal Laser Densitometer^RScanned using Lanes were quantified and molecular size was calculated relative to Biorad high molecular weight standards, which ranged from 200-45 kDa.
[0197]
Table 21 lists the sizes of the individual polypeptides containing the SCR toxin conjugate from each strain. The size of individual polypeptides ranged from 230 kDa in strain WX-1 to a size of 16 kDa as found in strain WX-7. Each strain, except strain Hb, had a polypeptide containing a toxin complex that was in the 160-230 kDa range, the 100-160 kDa range, and the 50-80 kDa range. These data indicate that although the toxin conjugate can vary in peptide composition and composition from strain to strain, it is evident that in all cases the toxin profile consists of an oligomeric protein conjugate with high toxin properties.
[0198]
[Table 23]
Table 20.

a Natural molecular weight measured using Pharmacia HR # 16/50 column packed with Sepharose CL4B
b Amount of toxin complex recovered from culture broth
[0199]
Activity spectrum
As shown in Table 21, toxin conjugates purified from strains Hm and H9 were tested for activity against various insects. The toxin conjugate from strain W-14 was for comparison. The assay was performed as described in Example 13. Toxin conjugates from all three strains showed activity against tobacco badworm, European corn borer, southern corn rootworm, and Astor reef hopper. In addition, toxin conjugates from strains Hm and W-14 also showed activity against two-spotted spider mites. In addition, the toxin conjugate from W-14 showed activity against mosquito larvae. These data indicate that the toxin conjugate has activity similarity between certain eyes of insects and may exhibit different activities for other eyes of insects.
[0200]
[Table 24]
Table 21 Estimated size (kDa) of peptides in purified toxin conjugate from {W-14} Photorhabdus

[0201]
[Table 25]
Table 22.

* = Mortality or growth suppression greater than 25%
** = 1: tobacco badworm, 2: European corn borer, 3: Southern corn rootworm, 4: mosquito, 5: two-spotted spider mite, 6: aster reef hopper, 7: fruit fly, 8; Ball Weeville
[0202]
Example Fifteen Photorhabdus Sub-fraction of protein toxin complex
Photorhabdus protein toxin conjugate was isolated as described in Example 14. Next, about 10 mg of toxin was applied at a flow rate of 1 ml / min to a Mono Q5 / 5 column equilibrated with 20 mM Tris-HCl, pH 7.0. The column was washed with 20 mM Tris-HCl, pH 7.0 until the optical density at 280 nm returned to baseline absorbance. The protein bound to the column was eluted with a linear gradient of 0-1.0 M NaCl in 20 mM Tris-HCl, pH 7.0 over 30 minutes at 1 ml / min. One ml fractions were collected and subjected to Southern Corn Root Worm (SCR) bioassay (see Example 13). The peak of activity was determined by a series of dilutions of each fraction in the SCR bioassay. Two activity peaks for the SCR were observed, designated A (eluted at about 0.2-0.3 M NaCl) and B (eluted at 0.3-0.4 M NaCl). Activity peaks A and B were pooled separately and both peaks were further purified using the following three-step procedure.
[0203]
Solid (NH₄)₂SO₄Was added to the protein fraction to a final concentration of 1.7M. The protein was then added at 1 ml / min to 1.7 M (NH 4) in 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.₄)₂SO₄Applied to a Phenyl-Sperose 5/5 column equilibrated in. The protein bound to the column was 0.5 M / min at 1.7 M (NH₄)₂SO₄, 0% ethylene glycol, 50 mM potassium phosphate, pH 7.0-25% ethylene glycol, 25 mM potassium phosphate, pH 7.0 ((NH₄)₂SO₄None) with a linear gradient. Fractions were dialyzed overnight against 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0. Activity in each fraction against SCR was measured by bioassay.
The fractions with the highest activity were pooled and applied at 1 ml / min to a Mono Q5 / 5 column equilibrated with 20 mM Tris-HCl, pH 7.0. The protein bound to the column was eluted at 1 ml / min with a linear gradient of 0-1 M NaCl in 20 mM Tris-HCl, pH 7.0.
[0204]
For the final step of the purification, the most active fractions described above (as determined by SCR bioassay) were pooled and applied to a second phenyl-perose 5/5 column. Solid (NH₄)₂SO₄Was added to a final concentration of 1.7M. The solution was then combined at 1 ml / min with 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7 at 1.7 M (NH₄)₂SO₄The column was equilibrated in. The protein bound to the column was replaced with 1.7M (NH₄)₂SO₄, 50 mM potassium phosphate, pH 7.0-10 mM potassium phosphate, pH 7.0, eluted at 0.5 ml / min. Fractions were dialyzed overnight against 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0. Activity in each fraction against SCR was measured by bioassay.
The final purified protein from peak A following the three-step procedure was referred to as toxin A, and the final purified protein from peak B was referred to as toxin B.
[0205]
Characterization and amino acid sequencing of toxin A and toxin B
During SDS-PAGE, both toxin A and toxin B have two major (greater than 90% of total Coomassie stained proteins) peptides: 192 kDa (designated A1 and B1 respectively) and 58 kDa (designated A2 and B2 respectively). Was included. Both toxin A and toxin B reveal only one major band in native PAGE, A1 and A2 are subunits of a protein complex, and B1 and B2 are subunits of a protein complex That was shown. In addition, the native molecular weight of both Toxin A and Toxin B was determined to be 860 kDa by gel filtration chromatography. The relative molarity of A1: A2 was determined to be 1: 1 equivalent as determined by densitometric analysis of SDS-PAGE gels. Similarly, the B1 and B2 peptides were present at the same molarity.
[0206]
Toxin A and Toxin B were electrophoresed in 10% SDS-PAGE and transblotted to PVDF membrane. Blots were sent to Harvard Microchem and Cambridge Prochem for amino acid analysis and N-terminal amino acid sequencing, respectively. The N-terminal amino acid sequence of B1 is SEQ ID NO: 1, TcbA of the tcbA gene._iiRegion (SEQ ID NO: 12, positions 87-99). A unique N-terminal sequence was obtained for peptide B2 (SEQ ID NO: 40). The N-terminal amino acid sequence of peptide B2 is the derivative amino acid sequence of tcbA gene, TcbA_iiiRegion (SEQ ID NO: 12, positions 1935-1945). Therefore, the B toxin is mainly composed of two peptides, TcbA_iiAnd TcbA_iiiAnd that they were derived from the same gene product, TcbA.
The N-terminal sequence of A2 (SEQ ID NO: 41) is TcbA_iiiSpecific compared to peptide and other peptides. A2 peptide is converted to TcdA_iii(See Example 17). SEQ ID NO: 6 was determined to be a mixture of amino acid sequences SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 41.
[0207]
In addition, peptides A1 and A2 were subjected to internal amino acid sequencing. For internal amino acid sequencing, 10 μg of toxin A was electrophoresed in 10% SDS-PAGE and transblotted to PVDF membrane. After staining the blot with amide black, each was treated with TcdA_iiAnd TcdA_iiiPeptides A1 and A2, referred to as, were excised from the blot and sent to Harvard Microchem and Cambridge Prochem. The peptides were subjected to trypsin digestion followed by HPLC chromatography to separate the individual peptides. N-terminal amino acid analysis was performed on selected tryptic peptide fragments. Two internal amino acid sequences of peptide A1 (TcdA_ii-PK71, SEQ ID NO: 38 and TcdA_ii-PK44, SEQ ID NO: 39) is the TcbA of the tcbA gene._iiIt was found to have significant homology with the deduced amino acid sequence of the region (SEQ ID NO: 12). Similarly, the N-terminal sequence of peptide A2 (SEQ ID NO: 41) and two internal sequences (TcdA_iii-PK57, SEQ ID NO: 42 and TcdA_iii-PK20, SEQ ID NO: 43) is also the TcbA gene of the tcbA gene._iiiIt showed significant homology with the deduced amino acid sequence of the region (SEQ ID NO: 12).
[0208]
To summarize the above results, the toxin conjugate has at least two active protein toxin conjugates for SCR, toxin A and toxin B. Toxin A and toxin B have similar native and subunit molecular weights, but differ in their peptide composition. Toxin A is TcdA as the major peptide_iiAnd TcdA_iiiAnd toxin B has TcbA as the major peptide._iiAnd TcbA_iiiincluding.
[0209]
Example 16 TcbA Cleavage and activation of peptides
In the toxin B complex, the peptide TcbA_iiAnd TcbA_iiiIs derived from the single gene product TcbA (Example 15). TcbA peptide to TcbA_iiAnd TcbA_iiiProcessing is probably due to the action of one or more Photorhabdus proteases, and possibly the metalloproteases described in Example 10. In some cases, when processing Photorhabdus W-14 broth, the TcbA peptide was converted to the peptide TcbA_iiAnd TcbA_iiiIn addition, it was noted that it was present in the toxin B complex as a major component. The peptide TcbA was enriched from the toxin conjugate fraction of W-14 broth using the same procedure described for the purification of toxin B conjugate (Example 15). The final purified material was analyzed in a 4-20% gradient SDS-PAGE and the major peptide was quantified by densitometry. TcbA, TcbA_iiAnd TcbA_iiiWas measured to constitute 58%, 36%, and 6% of the total protein, respectively. The identity of these peptides was confirmed by their respective molecular size by SDS-PAGE and Western blot analysis using monospecific antibodies. When the natural molecular weight of this fraction was measured, it was 860 kDa.
[0210]
TcbA cleavage was assessed by treating the purified material with purified 38 kDa and 58 kDa W-14 Photorhabdus metalloprotease (Example 10) and trypsin (Sigma, MO) as a control enzyme. The standard reaction consisted of 17.5 μg of the above purified fraction, 1.5 units of protease, and 0.1 M Tris buffer, pH 8.0 in a total volume of 100 μl. For control reactions, the protease was omitted. The reaction mixture was incubated at 37 ° C. for 90 minutes. At the end of the reaction, 20 μl was taken and immediately boiled with SDS-PAGE sample buffer for electrophoretic analysis in a 4-20% gradient SDS-PAGE. From SDS-PAGE, the peptide TcbA was detected in both the 38 kDa and 58 kDa protease treatments._iiAnd TcbA_iiiWas measured to increase approximately 3-fold, while the amount of TcbA peptide was proportionally decreased (Table 23). The relative reduction and enhancement of selected peptides was confirmed by Western blot analysis. In addition, gel filtration of the cleaved material revealed that the native molecular weight of the conjugate remained the same. After trypsinization, the peptides TcbA and TcbA_iiWas non-specifically digested into small peptides. This is because the 38 kDa and 58 kDa Photorhabdus proteases convert peptide TcbA to peptide TcbA._iiAnd TcbA_iiiCan be specifically processed.
[0211]
Protease-treated and untreated controls of the remaining 80 μl reaction mixture were serially diluted in 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0 and analyzed by SCR bioassay. By comparing the activity in several dilutions, it was determined that the 38 kDa protease treatment increased the SCR insecticidal activity by about 3-4 fold. Growth inhibition of residual insects on protease treatment was also more severe than controls (Table 23).
[0212]
[Table 26]
Table 23. Peptide TcbA to Peptide TcbA by Protease Treatment_iiAnd TcbA_iiiConversion to and activation

*: A measure of growth inhibition by measuring the average body weight of live insects 5 days after feeding during the assay.
[0213]
Example 17 　 TcdA _ii Screening of a library of peptides-encoding genes
SEQ ID NO: 17 (internal peptide TcdA_ii-PT111 N-terminal sequence) and SEQ ID NO: 18 (internal peptide TcdA_ii-PT79 N-terminal sequence)_iiCloning and characterization of the gene encoding the peptide was completed. The amino acid sequences of SEQ ID NO: 17 (Table 24) and SEQ ID NO: 18 (Table 25) and two pools of degenerate oligonucleotides designed to encode the reverse complement of these sequences are described in Example 8. Synthesized as done. The DNA sequence of the oligonucleotide is shown below.
[0214]
[Table 27]
Table 24. Degenerate oligonucleotide for SEQ ID NO: 17

[0215]
[Table 28]
Table 24 continued

[0216]
[Table 29]
Table 25. Degenerate oligonucleotide for SEQ ID NO: 18

[0219]
[Table 30]
Table 25. Continued

* According to IUPAC-IUB, the codes for nucleotides are Y = C or T, H = A, C, or T, N = A, C, G or T, K = G or T, R = A or G, and M = A or C.
[0218]
In all forward / reverse combinations, P2.3.6. CB or P2.3.5. And P2.79. As a reverse primer. R. 1 or P2.79R. The polymerase chain reaction (PCR) was performed using CB and using Photorhabdus W-14 genomic DNA as a template, essentially as described in Example 8. In another set of reactions, in all forward / reverse combinations, primer P2.79.2 or P2.79.3 was used as the forward primer, and P2.3.5R, P2.3.5RI, and P2.3.5R. 3R. CB was used as a reverse primer. P2.79 as reverse primer. R. 1 or P2.79R. P2.3.6. As forward primer in combination with CB Only reactions containing CB showed non-artificial amplification products with an estimated size of 2500 base pairs (mobility in agarose gel). The order of the primers used to obtain this amplification product was determined by the peptide fragment TcdA_ii-PT111 is a peptide fragment TcdA_ii-Indicates that it is amino-proximal to PT79.
[0219]
2500 bp @ PCR product was transferred to plasmid vector pCR according to the supplier's instructions.^TMII (Invitrogen, San Diego, Calif.) And determine the DNA sequence across the ends of the insert fragments of the two isolates (HS24 and HS27) using the primers recommended by the supplier and the sequencing method described above. did. The sequences of both isolates were identical. A new primer was synthesized based on the determined sequence and used to initiate an additional sequencing reaction to obtain a total of 2557 bases of insert [SEQ ID NO: 36]. Translation of the partial peptide encoded by SEQ ID NO: 36 results in the 845 amino acid sequence disclosed as SEQ ID NO: 37. TcdA_iiProtein homology analysis of this portion of the peptide fragment reveals substantial amino acid homology (68% similarity; 53% identity) to residues 542-1390 of protein TcbA [SEQ ID NO: 12]. Thus, it is clear that the gene represented in part by SEQ ID NO: 36 produces a similar protein but does not produce the same amino acid sequence as TcbA, which is probably similar, but not identical, to the TcbA protein Has biological activity.
[0220]
In yet another case, SEQ ID NO: 9 (internal peptide TcdA_ii-PK44 sequence) and SEQ ID NO: 41 (TcdA_iiiPeptide TcdA described as 58 kDa N-terminal peptide sequence)_ii-PK44 and TcdA_iiiThe gene encoding the 58 kDa N-terminal peptide was isolated. SEQ ID NO: 39 (Table 27) and SEQ ID NO: 41 (Table 26), and two pools of degenerate oligonucleotides designed to encode the reverse complement of these sequences were prepared in Example 8, and their DNA. It was synthesized as described in the sequence.
[0221]
[Table 31]
Table 26. Degenerate oligonucleotide for SEQ ID NO: 41

[0222]
[Table 32]
Table 26. Continued

[0223]
[Table 33]
Table 27. Degenerate oligonucleotide for SEQ ID NO: 39

[0224]
[Table 34]
Table 27. Continued

[0225]
For all forward / reverse combinations, using A1.44.1 or A1.44.2 as forward primer, using reverse primer A2.3R or A2.4R, and using Phototorhabdus W-14 genomic DNA as template. The polymerase chain reaction (PCR) was performed essentially as described in Example 8. In another set of reactions, in all forward / reverse combinations, primer A2.1 or A2.2 was used as the forward primer, and A1.44.1R and A1.44.2R were used as the reverse primer. Only in reactions containing A1.44.1 or A1.44.2 as a forward primer combined with A2.3R as a reverse primer, a non-artificial amplification product of an estimated size of 1400 base pairs (mobility in agarose gel) was obtained. Was seen. The order of the primers used to obtain this amplification product was determined by the peptide fragment TcdA_ii-PK44 is TcdA_iii58 amino acid peptide fragment is amino proximal.
[0226]
The 1400 bp PCR product was transferred to the plasmid vector pCR according to the supplier's instructions.^TMConnected to II. The DNA sequences across the ends of the insert fragments of the four isolates were determined using primers similar in sequence to the supplier's recommended primers and using the sequencing method described above. Although the nucleic acid sequences of all isolates differed as expected in the region corresponding to the degenerate primer sequences, the amino acid sequences deduced from these data indicate that the actual amino acid sequences for the previously determined peptides (sequences No. 41 and SEQ ID NO: 39).
Screening of the W-14 genomic cosmid library described in Example 8 with a radiolabeled probe containing the previously prepared DNA (SEQ ID NO: 36) resulted in five hybridizing cosmid isolates, namely 17D9, 20B10, 21D2, 27B10, and 26D1 were identified. These cosmids differed from those previously identified with probes corresponding to the genes set forth as SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 25. Restriction enzyme analysis and DNA blot hybridization identified three EcoRII fragments of approximate size 3.7, 3.7, and 1.1 kbp spanning the region containing the DNA of SEQ ID NO: 36. Screening of the W-14 genomic cosmid library using the radiolabeled 1.4 kbp DNA fragment prepared in this example as a probe was performed using the same five cosmids (17D9, 20B10, 21D2, 27B10, and 26D1). Was identified. DNA blot hybridization for EcoRII digested cosmid DNA was performed with 2.5 kbp of TcdA._iiHybridization for the same subset of EcoRII fragments as seen with the gene probe was shown, indicating that both fragments were encoded in genomic DNA.
[0227]
DNA sequencing of the cloned EcoRII fragment revealed an uninterrupted open reading frame of 7551 base pairs (SEQ ID NO: 46) encoding 282.9 kDa of 2516 amino acids (SEQ ID NO: 47). Analysis of the amino acid sequence of this protein was performed using the peptide TcdA._iiAll predicted internal fragments (SEQ ID NOs: 17, 18, 37, 38 and 39) and TcdA_iiiPeptide N-terminal (SEQ ID NO: 41) as well as all TcdA_iiiThe internal peptides (SEQ ID NOs: 42 and 43) were revealed. TcdA_iiAnd TcdA_iiiThe peptide isolated and identified as is the product of each of the open reading frames designated tcdA disclosed as SEQ ID NO: 46. In addition, SEQ ID NO: 47 indicates that it starts at position 89, and the sequence disclosed as SEQ ID NO: 13, which is the N-terminal sequence of a peptide of about 201 kDa in size, has the initial protein derived from SEQ ID NO: 46. No. 12 is processed in a manner similar to the protein disclosed above. In addition, the protein was further cleaved and encoded by SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 (TcdA_iiNo. 51 (TcdA) encoded by the product of size 209.2 kDa disclosed as_iiiPeptide), resulting in a product of size 63.6 kDa.
[0228]
Thus, the insecticidal activity identified as Toxin A derived from the product of SEQ ID NO: 46 (Example 15) was processed as exemplified by the 282.9 kDa full length protein disclosed as SEQ ID NO: 47. It is believed to result in the peptides disclosed as SEQ ID NOS: 49 and 51. The insecticidal activity identified as Toxin B (Example 15) is believed to be derived from the product of SEQ ID NO: 11, as exemplified by the 280.6 kDa protein disclosed as SEQ ID NO: 12. This protein was proteolytically processed and a 207.6 kDa protein disclosed as SEQ ID NO: 53 (encoded by SEQ ID NO: 52), and the N-terminus disclosed as SEQ ID NO: 40 and further disclosed as SEQ ID NO: 55 This results in a 62.9 kDa peptide having the sequence, which is encoded by SEQ ID NO: 54.
Amino acid sequence comparison of the proteins disclosed as SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 47 reveals that they have 69% similarity and 54% identity. This high degree of evolutionary relationship is not uniform in the entire amino acid sequence of these peptides, but is higher towards the carboxy terminus of the protein. This is because the peptides disclosed as SEQ ID NO: 51 (derived from SEQ ID NO: 47) and SEQ ID NO: 55 (derived from SEQ ID NO: 12) have 76% similarity and 64% identity. is there.
[0229]
Example 18 　　 Photorhabdus (stock W-14 ) Control of European corn boller-induced leaf damage on corn plants by spray application of broth
To determine the ability of one or more Phototorhabdus toxins to reduce plant damage caused by insect larvae to measure leaf damage caused by European corn borers (Ostrinia nubilalis) generated in corn plants treated with Photorhabdus broth. Proven by Fermentation broth from Photorhabdus strain W-14 was produced and concentrated approximately 10-fold using ultrafiltration (10,000 MW pore size) as described in Example 13. The resulting concentrated broth was then filter sterilized using a 0.2 micron nitrocellulose membrane filter. A similarly prepared sample of uninoculated 2% proteose peptone # 3 was used for control purposes. The corn plants (inbred lines owned by DowElanco) are grown in a greenhouse (27 ° C during the day; 22 ° C at night, about 50% RH, 14 hours day length, watering / fertilizing as needed) and Growing from seeds to vegetative growth stage 7 or 8 in seeding pots.
[0230]
The test plants were randomized in a greenhouse at a temperature of about 22 ° C. during the day; at 18 ° C. at night, without any artificial light, with partial shielding and watering / fertilization as required at about 50% RH in a greenhouse (3). (Rep / treatment, 6 plants / treatment). The treatment (uninoculated medium and concentrated Photorhabdus broth) was applied by syringe spray, 2.0 ml was applied by swirling directly (about 6 inches), and an additional 2.0 ml was applied by circular movement from about 1 foot above the swirl. . In addition, one group of plants did not receive treatment. After the treatment was dry (about 30 minutes), 12 neonatal European corn borer larvae (obtained eggs from commercial sources and attracted indoors) were applied directly to the swirl. One week later, a modified Guthrie @ Scale (Koziel, MG, Belland, GL, Bowman, C., Carozzi, NB, Crenshaw.R., Crossland, L., Dawson) J., J., Desai, N., Hill., M., Kadwell, S., Launis, K., Lewis, K., Maddox, D., McPherson, K., Meghji, M.Z, Merlin, E. , Rhodes, R., Warren, GW, Wright, M. and Evola, SV 1993) Bio / Technology, 11, 194-195) to score plants for damage to leaves. The scores were compared statistically [T test (LSD) p <0.05 and Taki I Student of range (HSD) test p <0.1]. The results are shown in Table 28. As a reference, a score of 1 indicates no damage, a score of 2 indicates "windowpan" damage to unrolled leaves without pinhole invasion, and a score of 5 indicates a clear elongated lesion for more than three leaves. And / or represent leaf invasion with moderate feeding (lesion <1 inch (2.54 cm)). These data indicate that when the broth or other protein containing fractions are delivered in a sprayable formulation or when the gene encoding the protein or portion thereof or derivative thereof is delivered via the transgenic plant or microorganism, Indicates that protection against insect plague can be provided.
[0231]
[Table 35]
Table 28. Effects of Photorhabdus culture broth on European corn boller-induced leaf damage to corn

Means with different letters are statistically different (p <0.05 or p <0.1)
[0232]
Example 19 E. FIG. coli Manipulation of genes for expression in cells
Build Summary
A series of plasmids was constructed to express the tcbA gene of PhotorhabdusW-14 in Escherichia coli. A list of plasmids is provided in Table 29. Each construction and the resulting E. coli. A summary of the E. coli expression data is briefly described below.
[0233]
[Table 36]
Table 29. Expression plasmid for tcbA gene

Abbreviations: Kan = kanamycin, Chl = chloramphenicol, Amp = ampicillin
[0234]
pDAB634 Building
In Example 9, TcbA_iiA large EcoRΔI fragment that hybridizes to the probe is described. This fragment was subcloned into pBC (Stratagen, La Jolla CA). Sequence analysis indicates that this fragment is 8816 base pairs. The fragment encodes a tcbA gene with a start ATG at position 571 and a termination TAA at position 8086. Therefore, the fragment has 570 base pairs of Photorhabdus DNA upstream of ATG and 730 base pairs downstream of TAA.
[0235]
Plasmid pAcGP67B / tcbA Building
The tcbA gene was PCR amplified using the following primers. 5 'Primer (S1Ac51) 5' TTT AAA CCA TGG GAA ACT CAT TAT CAA GCA CTA TC3 'and 3' Primer (S1Ac31) 5 'TTT AAA AGCGGCT GCC GTA GTA GTA GTA GTA. PCR was performed using the Takara LA @ PCR kit from Pan Bella (Madison, Wis.) In the following reaction. 57.5 ml of water, 10 ml of 10 × ΔLA buffer, 16 ml of dNTP (2.5 mM stock solution each), 20 ml of each primer (10 pmol / ml), 300 ng of plasmid pDAB634 containing 300 ng of W-14 @ tcbA gene and 1 ml Takara LA @ Taq polymerase. The cycle conditions were 98 ° C./20 seconds, 68 ° C./5 minutes, 72 ° C./10 minutes for 30 cycles. The expected approximately 7526 bp PCR product was isolated in a 0.8% agarose gel in TBE (100 mM Tris, 90 mM borate, 1 mM EDTA) buffer and a Qlaex II kit from Qiagen (Chatsworth, California). Purified using The purified tcbA gene was digested with Nco I and Not I, ligated into the baculovirus transfer vector pAcGP67B (Pharmingen, San Diego, Calif.) And DH5 αE. E. coli. The tcbA gene was then cut from pAcGP67B and transferred into pET27b to create plasmid pDAB635. A missense mutation in the tcbA gene was repaired in pDAB635.
[0236]
The repaired tcbA gene contains two changes from the sequence shown in SEQ ID NO: 11; A> G at 212 changing asparagine 71 to serine 71 and G> A at 229 changing alanine 77 to threonine 77. Both of these changes correspond to the proposed TcbA_iiIt is upstream of the N-terminus.
pET15-tcbA Building
The tcbA coding region of pDAB635 was transferred into vector pET15b. This was done using shotgun ligation and the DNA was cut with the restriction enzymes NcoII and XhoII. The resulting recombinant is called pET15-tcbA.
[0237]
Plasmid pET15-tcbA From E. FIG. coli In TcbA Expression of
E. FIG. The expression of tcbA in E. coli was determined by the method of Studier et al. Use of the polymerase was obtained by a modification of the method already described by Methods (Enzymol., 185: 60-89). Competent E. E. coli cell line BL21 (DE3) was transformed with plasmid pET15-tcbA and spread on LB agar containing 100 μg / ml ampicillin and 40 mM glucose. Transformed cells were plated to a density of several hundred isolated colonies / plate. After overnight incubation at 37 ° C., cells were scraped off the plate and suspended in LB broth containing 100 μg / ml ampicillin. Typical culture volumes were 200-500 ml. At time 0, the culture density (OD600) was 0.05-0.15 depending on the experiment. Cultures are shaken at one of three temperatures (22 ° C., 30 ° C. or 37 ° C.) until a density of 0.15-0.5 is obtained, at which point they are shaken with 1 mM isopropylthio-β- Induced with galactoside (IPTG). Cultures were incubated at the indicated temperature for 4-5 hours, then transferred to 4 ° C. until processing (17-72 hours).
[0238]
Plasmid pET15-tcbA From E. FIG. coli Expressed in TcbA Purification and characterization
E. coli expressing the TcbA peptide The E. coli culture was treated as follows. Cells were harvested by centrifugation at 17,000 × G, medium was decanted and stored in a separate container. The medium was concentrated approximately 8-fold using an M12 (Amicon, Beverly MA) filtration system and a 100 kD molecular weight cut-off filter. The concentrated medium was loaded on an anion exchange column and the bound proteins were eluted with 1.0 M NaCl. The 1.0 M NaCl elution peak was found to cause mortality to Southern corn rootworm (SCR) larvae (Table 30). The 1.0 M NaCl fraction was dialyzed against a 10 mM sodium phosphate buffer pH 7.0, concentrated, and subjected to gel filtration on Sepharose CL-4B (Pharmacia, Piscataway, NJ). A region of the CL-4B elution profile corresponding to the calculated molecular weight (approximately 900 kDa) as the native W-14 toxin complex was collected, concentrated, and larvae were bioassayed.
[0239]
The collected 900 kDa fraction was found to have insecticidal activity (see Table 30), with symptomology similar to that produced by the native W-14 toxin complex. This fraction was subjected to proteinase K and heat treatment to eliminate or reduce activity in both cases, providing evidence that the activity is proteinaceous in nature. In addition, the active fraction tested was anti-TcbA_iiTcbA peptide and TcbA in immunoblot assays when tested with monoclonal antibodies_iiiIt was immunologically positive for the peptide.
[0240]
[Table 37]
Table 30. Results of immunoblot assay and SCR bioassay

PK = proteinase K treatment 2 hours; heat treatment = 100 ° C. for 10 minutes; ND = not detected; NT = not tested. Scoring system for mortality and growth inhibition compared to control samples; {5-24% = "+", 25-49}% = "++", 50-100% = "++++"
[0241]
The cell pellet was resuspended in 10 mM sodium phosphate buffer, pH = 7.0,^TMThe cells were lysed by passage through a cell nebulizer (Grascol, Terra @ Haute, IN). The pellet was treated with DNase to remove DNA and centrifuged at 17,000 xg to separate the cell pellet from the cell supernatant. The supernatant fraction was decanted, filtered through a 0.2 micron filter to remove large particles, and subjected to anion exchange chromatography. Bound protein was eluted with 1.0 M NaCl, dialyzed and Biomax with a 50,000 dalton molecular weight cut-off.^TM(Millipore Corporation, Bedford, MA). The concentrated fraction was subjected to gel filtration chromatography using Sepharose CL-4B bead matrix. The bioassay for the material thus prepared is shown in Table 30 and is referred to as "TcbA cell Sup".
[0242]
In an alternative method for handling large quantities of material, resuspend the cell pellet in 10 mM sodium phosphate buffer, pH = 7.0 and use a 40 ml tissue grinder from Contes Glass (Vineland, NJ). To make it sufficiently uniform. Cell debris is pelleted by centrifugation at 25,000 xg, the cell supernatant is decanted, passed through a 0.2 micron filter, and subjected to anion exchange chromatography using a Pharmacia 10/10 column packed with Poros HQ50 beads. Was. Bound proteins were eluted by running a 0.0-1.0 M NaCl gradient. Fractions containing the TcbA protein were combined, concentrated using a 50 kDa concentrator, and subjected to gel filtration chromatography using Pharmacia CL-4B bead matrix. Fractions containing a TcbA oligomer with a molecular weight of approximately 900 kDa were collected and subjected to anion exchange chromatography using a Pharmacia Mono Q 10/10 column equilibrated with 20 mM Tris buffer pH = 7.3.
[0243]
The recombinant TcbA protein was eluted using a gradient of 0.0-1.0 M NaCl. Recombinant TcbA elutes from the column at a salt concentration of about 0.3-0.4 M NaCl, and the natural TcbA oligomer elutes from the mono Q10 / 10 column at the same molarity. The recombinant TcbA oligomer was found to produce SCR mortality in a bioassay experiment similar to the experiment in Table 30.
[0244]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the pairing of cloned DNA isolates used as part of the sequence gene of the toxin of the present invention.
FIG. 2 is a map of the three plasmids used in the sequencing step.
FIG. 3 is a map showing the relationship between several partial DNA fragments.
FIG. 4A shows TcbA._iiAnd TcaB_ii1 shows a homology analysis between protein protein sequences.
FIG. 4B: TcbA_iiAnd TcaB_ii1 shows a homology analysis between protein protein sequences.
FIG. 5PhotorhabdusFIG. 2 is a dendrogram of a strain.PhotorhabdusStrain relationships were defined by rep-PCR. The upper axis of FIG. 5 shows% similarity between strains based on rep-PCR scores (ie, 0.0 (no similarity) to 1.0 (100% similarity)). The numbers and letters on the right axis indicate the various strains examined. That is, 14 = W-14, Hm = Hm, H9 = H9, 7 = WX-7, 1 = WX-1, 2 = WX-2, 88 = HP88, NC-1 = NC-1, 4 = WX- 4, 9 = WX-9, 8 = WX-8, 10 = WX-10, WIR = WIR, 3 = WX-3, 11 = WX-11, 5 = WX-5, 6 = WX-6, 12 = WX-12, x14 = WX-14, 15 = WX-15, Hb = Hb, B2 = B2, 48 to 52 = ATCC 43948 to ATCC 43952. The vertical lines separating the horizontal lines indicate the degree of relationship between strains or groups of stocks at the horizontal line base (eg, strain W-14 is approximately 60% similar to strains H9 and Hm) From the extrapolated intersection of the axis with the vertical line).
FIG. 6A is a genome map of strain W-14.
FIG. 6B is a genome map of strain W-14.

Claims (8)

A polynucleotide operably linked to a heterologous promoter, encoding a protein having oral toxicity to insects, and having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 46. A mutant that is capable of maintaining hybridization after hybridization and washing with a complementary sequence of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 46, wherein said hybridization is performed at 25 ° C., 3 × ΔSSC, 0 The polynucleotide is performed under 1% 下 SDS. The polynucleotide according to claim 1, wherein washing in hybridization is performed at 68 ° C with 0.25xΔSSC, 0.2% ΔSDS. A transgenic plant cell comprising the polynucleotide according to claim 1. A transgenic plant cell that expresses the polynucleotide according to claim 1. A recombinant protein having oral toxicity to insects, wherein the protein is a mutant of a protein having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 47, and a nucleotide encoding the mutant Is capable of maintaining hybridization after hybridization and washing with a complementary sequence of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 46, wherein the hybridization is performed at 25 ° C., 3 × ΔSSC, 0.1% The protein, which is performed under SDS. The protein according to claim 5, wherein washing in hybridization is performed at 68 ° C. in 0.25 × SSC, 0.2% ΔSDS. A method for controlling insects, comprising providing the protein according to claim 5. 8. The method of claim 7, wherein the protein is produced by an insect accessible transgenic plant and is present in said transgenic plant.

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