JP2004073198A - ポリ(adp−リボース)グリコヒドロラーゼ活性欠損胚性幹細胞株 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 ポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼ遺伝子のいずれか一方または双方が不活化されていることを特徴とする胚性幹細胞株及び非ヒト哺乳動物。
【選択図】 なし
Description
(1) ポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼ遺伝子の遺伝子対のいずれか一方または双方が不活化していることを特徴とする胚性幹細胞株。
(2) ポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼ遺伝子の遺伝子対のいずれか一方もしくは双方またはその発現制御領域に外来遺伝子が挿入されていることを特徴とする胚性幹細胞株。
(3) ポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼ遺伝子の遺伝子対のいずれか一方もしくは双方またはその発現制御領域の少なくとも一部が欠失していることを特徴とする胚性幹細胞株。
(4) ポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼ遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする非ヒト哺乳動物。
(5) げっ歯類である、上記(4)に記載の非ヒト哺乳動物。
(6) マウスである、上記(5)に記載の非ヒト哺乳動物。
(7) 上記(4)に記載の非ヒト哺乳動物の作製方法であって、
(a)上記(1)〜(3)のいずれかに記載の細胞株を、妊娠した雌から得た胚に注入し、キメラ胚を作製する工程、及び
(b)該キメラ胚を偽妊娠させた雌の子宮に移植する工程、
を含む方法。
(8) 非ヒト哺乳動物がげっ歯類である、上記(7)に記載の方法。
(9) 非ヒト哺乳動物がマウスである、上記(8)に記載の方法。
(i)上記(1)〜(3)のいずれかに記載の細胞株及び対照の野生型胚性幹細胞株を培養する工程、
(ii)抗がん剤を用いて工程(i)で得られた細胞を処理する工程、及び
(iii)細胞障害性を、両細胞株間で比較する工程、
を含んでなる、抗がん剤の評価方法。
(i)上記(4)〜(6)のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物及び野生型非ヒト哺乳動物に発がん剤を投与し担がん動物を作製する工程、
(ii)抗がん剤を用いて工程(i)で得られた動物を処理する工程、及び
(iii)がんの大きさを経時的に測定し縮退効果を、両個体間で比較する工程、
を含んでなる、非ヒト哺乳動物を用いた抗がん剤の評価方法。
(i)上記(1)〜(3)のいずれかに記載の細胞株及び対照の野生型胚性幹細胞株を培養する工程、
(ii)被験物質の存在下で抗がん剤を用いて工程(i)で得られた細胞を処理する工程、及び
(iii)細胞障害性を、両細胞株間で比較する工程、
を含んでなる、抗がん剤増幅薬のスクリーニング方法。
(i)上記(4)〜(6)のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物及び野生型非ヒト哺乳動物に発がん剤を投与し担がん動物を作製する工程、
(ii)被験物質の存在下及び非存在下で抗がん剤を用いて工程(i)で得られた動物を処理する工程、及び
(iii)がんの大きさを経時的に測定し縮退効果を、3群の個体間で比較する工程、
を含んでなる、非ヒト哺乳動物を用いた抗がん剤増幅薬のスクリーニング方法。
(i)上記(1)〜(3)のいずれかに記載の細胞株及び対照の野生型胚性幹細胞株を培養する工程、
(ii)被験物質の存在下及び非存在下で、ラジカル発生剤によって工程(i)で得られた細胞を処理する工程、及び
(iii)細胞生存率を、両細胞株間で比較する工程、
を含んでなる、虚血性疾患治療薬のスクリーニング方法。
(i)野生型非ヒト哺乳動物に対して虚血再灌流を誘導する工程、
(ii)被験物質を工程(i)で得られた動物に投与する工程、及び
(iii)細胞死を、上記(4)〜(6)のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物と比較する工程、
を含んでなる、非ヒト哺乳動物を用いた虚血性疾患治療薬のスクリーニング方法。
本発明において、「Parg遺伝子欠損」とは、ポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼ遺伝子の遺伝子対のいずれか一方または双方が不活化していることを意味する。
本発明のES細胞株を利用して、更にParg遺伝子欠損非ヒト哺乳動物を作製することができる。
本発明のES細胞株及び非ヒト哺乳動物は、例えばDNAを標的とする抗がん剤や虚血性疾患治療薬の作用、副作用の高感度の検出系やDNA修復機序や細胞内NAD枯渇を伴うDNA損傷に誘発される細胞死の機序の解析系に利用できる。
本発明の細胞株(Parg+/-及びParg-/-)と、対照となる野生型(Parg+/+)ES細胞株とを培養し、マイトマイシンC、ブレオマイシン、カンプトテシン、シクロフォスファミド、シスプラチン等の抗がん剤の処理や、放射線照射を行う。そしてこれらの処理を行った細胞について、コロニー形成能やMTT assay等で細胞障害性を検討する。本発明の細胞株でのみ顕著な有効性が認められれば、それらの抗がん剤にポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼ阻害剤を併用することで抗がん剤の効果が増強できる。このことを利用することにより、本発明は、以下の工程(i)、(ii)及び(iii)を含む抗がん剤の評価方法を提供する:
(i)上記の本発明の細胞株及び対照のES細胞株を培養する工程、
(ii)抗がん剤を用いて工程(i)で得られた細胞を処理する工程、及び
(iii)細胞障害性を、両細胞株間で比較する工程。
(i)上記の本発明の非ヒト哺乳動物及び野生型非ヒト哺乳動物に発がん剤を投与し担がん動物を作製する工程、
(ii)抗がん剤を用いて工程(i)で得られた動物を処理する工程、及び
(iii)がんの大きさを経時的に測定し縮退効果を、両個体間で比較する工程。
ポリ(ADP-リボース)合成酵素阻害剤が放射線療法や化学療法の増幅剤として有用な例がこれまで数多く報告されている。一方、ポリ(ADP-リボース)分解の主要な酵素であるポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼの阻害剤は、ポリ(ADP-リボース)代謝回転を遅延させることができる。これにより、抗がん剤の増幅効果を出すことができると考えられる。
(i)上記の本発明の細胞株及び対照のES細胞株を培養する工程、
(ii)被験物質の存在下で抗がん剤を用いて工程(i)で得られた細胞を処理する工程、及び
(iii)細胞障害性を、両細胞株間で比較する工程。
(i)上記の本発明の非ヒト哺乳動物及び野生型非ヒト哺乳動物に発がん剤を投与し担がん動物を作製する工程、
(ii)被験物質の存在下及び非存在下で抗がん剤を用いて工程(i)で得られた動物を処理する工程、及び
(iii)がんの大きさを経時的に測定し縮退効果を、3群の個体間で比較する工程。
ポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼ阻害剤が、脳梗塞の際に発生するラジカル等の酸化ストレスにより起きる神経細胞死を阻害することが報告されている。しかし、その作用点がポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼであるかどうかの評価が困難である。本発明の細胞株を用いれば作用点の同定が可能になる。具体的には、本発明の細胞株及び野生型ES細胞株を培養し、ポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼ阻害剤の存在下、SIN-1等のラジカル発生剤で細胞を処理し、両細胞の生存率を比較し、上記阻害剤の効力の差を調べる。ここで、候補薬剤となる被験物質を添加した場合に、対照となる野生型ES細胞がポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼ欠損細胞と同程度の細胞死耐性を示せば、その薬剤がポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼを作用点とすることが判る。このようにして、本発明は、以下の工程(i)、(ii)及び(iii)を含む、虚血性疾患治療薬のスクリーニング方法を提供する:
(i)上記の本発明の細胞株及び対照のES細胞株を培養する工程、
(ii)被験物質の存在下及び非存在下で、ラジカル発生剤によって工程(i)で得られた細胞を処理する工程、及び
(iii)細胞生存率を、両細胞株間で比較する工程。
これらの評価は更に両細胞株をSDIA(stromal cell-derived inducing activity)法で神経細胞に分化させた状態でも行える(Neuron, 28, 31-40 (2000))。また、線維芽細胞においてラジカル等の酸化ストレスにより起きる細胞死を阻害できる薬剤は神経細胞においても同様の効果を持つと期待される。そこで本発明の非ヒト哺乳動物及び野生型非ヒト哺乳動物の胚より線維芽細胞を調製し、野生型線維芽細胞に候補薬剤を添加し、上記のようにラジカル発生剤で細胞を処理後の生存率を比較する。野生型線維芽細胞がポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼ欠損細胞と同程度の耐性を示せば、その薬剤がポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼを作用点とすることが判る。また、これらの方法により絞り込んだポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼを作用点とする虚血性疾患治療薬の候補薬剤を野生型非ヒト哺乳動物に投与し、脳や心臓等の組織における虚血再灌流誘導後の細胞死をポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼ欠損非ヒト哺乳動物と比較する。脳においては中大動脈一時閉塞を行い、脳切片を作製後、梗塞領域を2,3,5-triphenyltetrazolium chlorideを用いて染色し、梗塞領域の面積を測定する。候補薬剤を投与した野生型非ヒト哺乳動物が非投与の野生型非ヒト哺乳動物に比較してポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼ欠損非ヒト哺乳動物と同程度の梗塞面積の減少を示し、細胞死に対する耐性が認められれば、その薬剤がin vivoにおいてもポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼを作用点とすることが判る。したがって、本発明はまた、以下の工程(i)、(ii)及び(iii)を含む、非ヒト哺乳動物を用いた虚血性疾患治療薬のスクリーニング方法を提供する:
(i)野生型非ヒト哺乳動物に対して虚血再灌流を誘導する工程、
(ii)被験物質を工程(i)で得られた動物に投与する工程、及び
(iii)細胞死を、上記の本発明の非ヒト哺乳動物と比較する工程。
マウスES細胞J1(Parg+/+ ES細胞株)(国立がんセンター研究所 落谷孝広博士より御供与)は、DMEM(Gibco)+20%牛胎児血清培地でCO2インキュベーターを用いて37℃にて培養を行った。
ネオマイシン及びピューロマイシン耐性を獲得した細胞クローンについて、ゲノムDNAを制限酵素Pst Iで消化後、相同組み換えが起きる領域に隣接するDNA断片をプローブとして、サザンブロット法による遺伝子型解析を行った。その結果、図1に示したように、野生型ES細胞J1(Parg+/+ ES細胞株)では、野生型アレルに由来する13kbのDNA断片のみが検出されるのに対し、ネオマイシン耐性細胞クローン(図1中「+/-」で示される)では、野生型アレルに由来する13kbのDNA断片とneor変異型アレルに由来する10kbのDNA断片が検出された。また、ネオマイシン及びピューロマイシン耐性細胞クローン(図1中「-/-」で示され、D79及びD122として表される)では、野生型アレルに由来する13kbのDNA断片が消失し、neor及びpuror変異型アレルに由来する10kbのDNA断片がそれぞれ検出された。これらの結果により、ネオマイシン耐性細胞クローンはParg+/- ES細胞株であり、ネオマイシン及びピューロマイシン耐性細胞クローンはParg-/- ES細胞株であることが確認された。
Parg+/- ES細胞クローン(B609)及びParg-/- ES細胞クローン(D79及びD122)について、Parg cDNAプローブを用いてノーザンブロット法によるParg mRNAの発現解析を行った。その結果、図2に示したように、Parg+/+ ES細胞クローン(J1)で検出された約4kbのParg mRNAは、Parg+/- ES細胞クローン(B609)では約2倍に増加し、Parg-/-ES細胞クローン(D79及びD122)ではParg+/+ ES細胞クローン(J1)の約1/6に低下していた。
スクレーパーで回収した細胞をPBSで洗浄後、Extraction buffer (20 mM potassium-phosphate (pH7.5)、2 mM EDTA、10 mM β-mercaptoethanol、0.1% Triton X-100にprotease inhibitor mixを添加したもの)を加えた。4℃でblenderにより30分間振とうし、13,000 x gで15分間遠心し、上清を粗抽出液とした。タンパク質量は、Protein assay kit(Bio-rad)で定量した。ポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼはポリ(ADP-リボース)を基質としてADP-リボースに分解する。そこで、ポリ(ADP-リボース)からADP-リボースへの分解を以下のように測定した。
アルキル化剤メチルメタンスルフォネート(MMS)及びガンマ線照射に対するES細胞の感受性を、コロニー形成能によって検討した。3種類のES細胞(Parg+/+(J1)、Parg+/-(B609)、Parg-/-(D79及びD122))をトリプシンで処理した後、計数し、一定数のES細胞を、フィーダー細胞をあらかじめ播種した6穴プレートに植え込んだ。MMSで処理後あるいはガンマ線照射後、CO2インキュベーターで7日間培養し、生じたコロニー数より生存率を計算した。この結果を図5及び図6に示す。図5及び図6に示すようにParg-/- ES細胞(D79及びD122)はParg+/- ES細胞(B609)及びParg+/+ ES細胞(J1)に比較して、MMS及びガンマ線照射に高い致死感受性を示した。
アルキル化剤MMS処理後の細胞内のポリ(ADP-リボース)量の変化をHPLC法により調べた。その結果を図7に示した。Parg+/+ (J1)及びParg+/- ES細胞クローン(B609)では、MMS処理後のポリ(ADP-リボース)量に変化は認められなかった。一方、Parg-/- ES細胞クローン(D79及びD122)では、MMS処理1時間後よりポリ(ADP-リボース)量が顕著に増加し、その蓄積は、24時間後まで観察された。
アルキル化剤MMS処理後に生じるParg欠損ES細胞のアポトーシスの経時変化を調べた。Parg+/+ (J1)及びParg-/- ES細胞クローン(D79)をMMS(0.3 mM)で処理し、12及び24時間後にフローサイトメトリーで分析したところ、Parg-/- ES細胞クローン(D79)では2N以下にDNA含量が減少したアポトーシス細胞の割合が野生株に比較して早期から増加することが観察された(図8参照)。
相同組み換えが確認されたES細胞クローンについて、C57BL/6J系マウスの胚盤胞をホスト胚としてキメラ胚を作製し、それを偽妊娠マウスの子宮角に移植して産仔を得た。ホスト胚の採取は、妊娠2日目に100μM EDTAを添加したWhitten's培地で、卵管と子宮を潅流することによって行った。8細胞期胚または桑実胚を24時間Whitten's培地で培養し、得られた胚盤胞を注入に用いた。注入に用いたES細胞の培養は、ダルベッコ修正イーグル培養液(GIBCO DMEM 11965-029)に終濃度15%の牛胎仔血清、終濃度2mMのL-グルタミン(GIBCO)、終濃度50U/mLのペニシリンと終濃度50μg/mLのストレプトマイシンを添加したES細胞用培地を用い、マイトマイシンC処理したSTO細胞のフィーダー細胞上で行った。ES細胞を融解あるいは継代してから2日ないし3日目にトリプシン-EDTA処理により単一細胞に分散させ、顕微操作に供するまで4℃で静置した。
実施例8に記載のキメラマウスをC57BL/6J系マウスと交配させ、ES細胞由来の産仔が得られるか否かを検定した。キメラマウスの生殖細胞がES細胞に由来していれば、娩出される産仔の毛色は、野生色を呈し、C57BL/6J系マウスの胚盤胞に由来していればブラック色を呈することとなる。C57BL/6J系マウスとの交配を行った14匹の雄キメラマウスのうち5匹から産仔が得られた。これら5匹の雄キメラマウスのうち、クローンG266ES細胞由来のキメラマウス(個体番号1)、および、クローンG565ES細胞由来のキメラマウス(個体番号1)において、ES細胞の生殖系列への伝達が確認された。野生色を呈した産仔数/得られた産仔数は、それぞれ、5/5、1/5であった。これらの成績を表2に示した。次に、これらの野生色のマウス6匹について尾の一部からDNAを抽出し、サザンブロッティングにより変異Pargアレルが伝達されているかを調べた。その結果、図10に示すように、クローンG266ES細胞由来の産仔5匹のうち2匹において変異型アレルが伝達されていることが確認された。
一方のアレルに変異Parg遺伝子が伝達されたマウス(以下、「ヘテロマウス」という)同士を交配することにより、両アレルとも変異Pargを持つマウス(以下、「ホモマウス」という)の作出を試みた。得られたマウスの遺伝子型解析は、PCR (Polymerase Chain Reaction)法により行った。PCRの反応液組成は、マウスゲノムDNA 1μL, 2 x GC buffer I (TaKaRa) 25μL, dNTPミクスチャー(各2.5mM) 8μL, プライマー (mPG2061S: 5'-CTC GGC CGT GGC CGC GAC AAG C-3' (配列番号1), mPG2318A:5'-CCT CCG CTC GGC AGC AGG GAG C-3' (配列番号2), neo628A: 5'-CGC CAA TGA CAA GAC GCT GGG CGG G-3' (配列番号3)各10μM) 3μL, LA Tag(5units/μL, TaKaRa) 0.5μL, H2O 13.5μLとし、サイクル反応は94℃ 2分後、94℃ 30秒、 69℃ 3分を36サイクル、72℃ 5分処理後、4℃ 保存とした。この条件で行ったPCR産物5μLを、2% アガロースゲルで電気泳動した。図11に各プライマーの遺伝子上の位置を示す。図11に示したように、マウスが野生型Pargアレルを持つ場合には258bpのバンドが、変異Pargアレルを持つ場合には360bpのバンドが確認できるので、これにより遺伝子型判定を行った。
Claims (15)
- ポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼ遺伝子の遺伝子対のいずれか一方または双方が不活化していることを特徴とする胚性幹細胞株。
- ポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼ遺伝子の遺伝子対のいずれか一方もしくは双方またはその発現制御領域に外来遺伝子が挿入されていることを特徴とする胚性幹細胞株。
- ポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼ遺伝子の遺伝子対のいずれか一方もしくは双方またはその発現制御領域の少なくとも一部が欠失していることを特徴とする胚性幹細胞株。
- ポリ(ADP-リボース)グリコヒドロラーゼ遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする非ヒト哺乳動物。
- 上記動物がげっ歯類である、請求項4に記載の非ヒト哺乳動物。
- 上記動物がマウスである、請求項5に記載の非ヒト哺乳動物。
- 請求項4に記載の非ヒト哺乳動物の作製方法であって、
(a)請求項1〜3のいずれか1項に記載の細胞株を、妊娠した雌から得た胚に注入し、キメラ胚を作製する工程、及び
(b)該キメラ胚を偽妊娠させた雌の子宮に移植する工程、
を含む方法。 - 上記動物がげっ歯類である、請求項7に記載の方法。
- 上記動物がマウスである、請求項8に記載の方法。
- 以下の工程(i)、(ii)及び(iii):
(i)請求項1〜3のいずれか1項に記載の細胞株及び対照の野生型胚性幹細胞株を培養する工程、
(ii)抗がん剤を用いて工程(i)で得た細胞を処理する工程、及び
(iii)細胞障害性を、両細胞株間で比較する工程、
を含んでなる、抗がん剤の評価方法。 - 以下の工程(i)、(ii)及び(iii):
(i)請求項4〜6のいずれか1項に記載の非ヒト哺乳動物及び野生型非ヒト哺乳動物に発がん剤を投与し担がん動物を作製する工程、
(ii)抗がん剤を用いて工程(i)で得た動物を処理する工程、及び
(iii)がんの大きさを経時的に測定し縮退効果を、両個体間で比較する工程、
を含んでなる、非ヒト哺乳動物を用いた抗がん剤の評価方法。 - 以下の工程(i)、(ii)及び(iii):
(i)請求項1〜3のいずれか1項に記載の細胞株及び対照の野生型胚性幹細胞株を培養する工程、
(ii)被験物質の存在下で抗がん剤を用いて工程(i)で得られた細胞を処理する工程、及び
(iii)細胞障害性を、両細胞株間で比較する工程、
を含んでなる、抗がん剤増幅薬のスクリーニング方法。 - 以下の工程(i)、(ii)及び(iii):
(i)請求項4〜6のいずれか1項に記載の非ヒト哺乳動物及び野生型非ヒト哺乳動物に発がん剤を投与し担がん動物を作製する工程、
(ii)被験物質の存在下及び非存在下で抗がん剤を用いて工程(i)で得られた動物を処理する工程、及び
(iii)がんの大きさを経時的に測定し縮退効果を、個体間で比較する工程、
を含んでなる、非ヒト哺乳動物を用いた抗がん剤増幅薬のスクリーニング方法。 - 以下の工程(i)、(ii)及び(iii):
(i)請求項1〜3のいずれか1項に記載の細胞株及び対照の野生型胚性幹細胞株を培養する工程、
(ii)被験物質の存在下及び非存在下で、ラジカル発生剤によって工程(i)で得られた細胞を処理する工程、及び
(iii)細胞生存率を、両細胞株間で比較する工程、
を含んでなる、虚血性疾患治療薬のスクリーニング方法。 - 以下の工程(i)、(ii)及び(iii):
(i)野生型非ヒト哺乳動物に対して虚血再灌流を誘導する工程、
(ii)被験物質を工程(i)で得られた動物に投与する工程、及び
(iii)細胞死を、請求項4〜6のいずれか1項に記載の非ヒト哺乳動物と比較する工程、
を含んでなる、非ヒト哺乳動物を用いた虚血性疾患治療薬のスクリーニング方法。
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JP2015083994A (ja) * | 2015-02-03 | 2015-04-30 | 日本光電工業株式会社 | 細胞解析装置及び細胞解析方法 |
US9970872B2 (en) | 2010-08-26 | 2018-05-15 | Nihon Kohden Corporation | Cell analyzer and cell analyzation method |
-
2003
- 2003-08-01 JP JP2003285257A patent/JP2004073198A/ja active Pending
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