JP2004073123A - Lipase cs2 gene - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵母由来のリパーゼＣＳ２遺伝子に関するものである。更に詳細には、本発明は、リパーゼＣＳ２のアミノ酸配列、それをコードする遺伝子ＤＮＡの塩基配列の決定にも成功したものである。これらの配列は、いずれも従来未知の新規配列であり、本発明は、これらの配列が明らかにされたことによって、組み換えＤＮＡ技術の利用が可能となり、その結果、脂質分解だけではなく、バイオディーゼル燃料の生産、ポリ乳酸等プラスチックの分解といった各種のしかも新規な工業用途を有するリパーゼＣＳ２の大量生産を可能とするものである。
【０００２】
【従来の技術】
本発明者らは、酵母、クリプトコッカス エスピー．Ｓ−２（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｓ−２）の培養物から新規リパーゼＣＳ２を製造する技術を先に開発したところである（特開２００１−２５２０７２）。
【０００３】
本酵素は、油脂分解能が高いだけでなく有機溶媒に安定であるという特性を有しているため、薬品、飲食品、化粧品、洗剤等従来からのリパーゼの用途に加え、有機溶媒存在下でのエステル交換やエステル合成といった分解の逆反応である合成反応への利用も可能であって、例えば、植物油など天然の再生産可能な原料から作られ、しかもクリーンな燃料であるバイオディーゼル燃料の生産に用いることも本発明者らによって提案されている。
【０００４】
更にまた、本酵素はすぐれたプラスチック分解能を有し、例えば、農業用フィルムや包装フィルムその他各種用途に広く利用されているポリ乳酸（ＰＬＡ）を効率的に分解することができ、環境汚染防止にきわめて有効であることも、本発明者らによって新たに見出された。
しかしながら、本酵素をコードする遺伝子については、従来何も報告されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記したように数多くのしかも非常にすぐれた用途を有するリパーゼＣＳ２について、組換えＤＮＡ技術による工業的大量生産等に資するため、その遺伝子を解明する目的でなされたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
リパーゼＣＳ２は、本発明者らによって開発された新規酵素であって、下記の理化学的性質を有し、クリプトコッカス属に属する酵母、例えばクリプトコッカス エスピー．Ｓ−２（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． Ｓ−２）（ＦＥＲＭ Ｐ−１５１５５）の培養物から分離、採取することができる（特開２００１−２５２０７２）。
【０００７】
本酵素の理化学的性質は、次のとおりである。
【０００８】
（１）作用
油脂分解性を有し、トリグリセリドに作用して、グリセリンと脂肪酸に加水分解する。
【０００９】
（２）基質特異性
トリプチリン、トリカプリリン、トリパルミチン、トリオレインをよく分解する。トリアセチン、トリカプリン、トリラウリンは中程度に分解する。トリミリスチン、トリステアリンに対する分解力は弱い。
【００１０】
（３）位置特異性
トリオレインに作用せしめると、オレイン酸と少量の１，２（２，３）−ジオレインが生成し、１，３−ジオレインとモノオレインは検出されない。
【００１１】
（４）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲
至適ｐＨ：７．０
安定ｐＨ範囲：５〜９
【００１２】
（５）反応最適温度及び温度による失活の条件
反応最適温度：３７℃
温度による失活の条件：温度上昇による活性の失活は緩やかであり、６０℃、３０分の熱処理においても活性を維持している。
【００１３】
（６）有機溶媒に対する安定性、活性化
有機溶媒に安定であり、更に、ジメチルスルホキシド、ジエチルエーテルによって活性が上昇する。
【００１４】
（７）分子量
２２ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【００１５】
本発明は、前記目的を達成するためになされたものであって、鋭意研究の結果、上記したリパーゼＣＳ２をコードする遺伝子のクローニング及びその塩基配列の決定にも成功し、本発明の完成に至ったものである。
以下、本発明について詳述する。
【００１６】
精製したリパーゼＣＳ２をタンパク質分解酵素（リシルエンドペプチダーゼ）で処理し断片化した後、そのいくつかの断片につきアミノ酸配列を決定した。そのいくつかの断片につきアミノ酸配列を決定したその部分配列をもとにＤＮＡプライマー（混合プライマー）を設計し、リパーゼＣＳ２遺伝子の内部配列の決定に用いた。
【００１７】
リパーゼＣＳ２遺伝子をクローニングするために、先ず、液体培養したＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｓ−２の菌体よりｍＲＮＡを調整し、逆転写によりｃＤＮＡの合成を行った。このｃＤＮＡをテンプレートに、上記プライマーを用いてリパーゼＣＳ２遺伝子の内部配列（約１８０塩基）をまず決定した。その決定した内部配列を利用し新たなプライマーを設計し、それを用いて３’−及び５’−ＲＡＣＥ法によりリパーゼＣＳ２遺伝子のｃＤＮＡ配列を決定した。このようにして決定したリパーゼＣＳ２遺伝子の全塩基配列を配列番号２（図１）に示し、この塩基配列から推定されるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１（図１）に示す。
【００１８】
上記のように、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｓ−２より本酵素のｃＤＮＡを取得後、クローニングを行った。そのＤＮＡ配列から推定アミノ酸配列が決定できた。なお、上記に取得したｃＤＮＡをＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ用発現ベクターｐＧ−１（ＧＰＤプロモータ、ＰＧＫターミネータ、ＴＲＰ１マーカー）のＢａｍＨＩクローニングサイトに挿入して組換えベクターを作製した。得られた組換えベクターは、ＣＳ２Ｌｉｐａｓｅ ｃＤＮＡ＊ｐＧ−１と命名し、これを独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１８９３９として寄託した。
【００１９】
上記に取得した組換えプラスミドＣＳ２Ｌｉｐａｓｅ ｃＤＮＡ＊ｐＧ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９３９）を、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ４９９株に形質転換したところ、トリブチレンを１％濃度で懸濁させたＹＰＤ（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）プレート上で、形質転換株はトリブチレン分解により生じるハローを形成した。このことで取得したｃＤＮＡが確かに目的のリパーゼＣＳ２をコードするものであり、しかもＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにより活性のあるものとして発現、分泌されることを確認した。
【００２０】
本発明に係るクリプトコッカス属由来のリパーゼＣＳ２は、油脂分解に利用できることはもちろんのこと、試薬、医薬成分、特定保健用飲食品成分、洗剤、化粧品その他広範囲な用途に利用することができ、また、特に有機溶媒に安定であるという特質から、エステル交換反応やエステル合成にも利用でき、バイオディーゼル燃料の合成も可能とするものであり、そして更に、本発明者らの最近の研究により、プラスチック、特にポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）等の生分解性プラスチックを効率的に分解することがはじめて見出され、このような有益な用途に各種利用することができるものであるが、今回、本酵素遺伝子、アミノ酸配列が明らかになったことにより、これらを利用した組換えＤＮＡ技術によって、本酵素を効率的に工業生産することができる。
【００２１】
以下、本発明の実施例について述べる。
【００２２】
【実施例１】
（１）酵母エキス０．５％、ＫＨ２ＰＯ４ １％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、トリオレイン１％、ラクトース０．５％を含む液体培地に前培養した酵母Ｓ−２菌（ＦＥＲＭ Ｐ−１５１５５）を１％（ｖ／ｖ）接種し、２５℃、１００ｒｐｍの振とう培養を行った。得られた菌体からｍＲＮＡを抽出し、このｍＲＮＡをもとにｃＤＮＡライブラリーを構築した。
【００２３】
（２）なお、酵素の精製は次のようにして行った。上記により液体培養した培養物から酵母菌体を除いて培養液を得た。このようにして得た培養液を８，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ遠心分離し、０．４５μｍのメンブランフィルターにて濾過後、限外濾過により濃縮した。陽イオン交換樹脂ＴＳＫ−ｇｅｌ ＳＰ−５ＰＷカラムによる高速液体クロマトグラフ（ｐＨ７．０リン酸バッファ、およびそれに０．５％ＮａＣｌ添加したものによるグラジエント溶出）によってリパーゼを精製した。活性は１７．１倍、収量は１１．４％であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で単バンドとなり、分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより２２ｋダルトンであることが判明した。
【００２４】
（３）精製したリパーゼＣＳ２をタンパク質分解酵素（リシルエンドペプチダーゼ）で処理し断片化した後、そのいくつかの断片につきそのアミノ酸配列を決定した。その部分配列をもとにＤＮＡプライマー（混合プライマー）を設計し、リパーゼＣＳ２遺伝子の内部配列の決定に用いた。
【００２５】
（４）リパーゼＣＳ２遺伝子をクローニングするために、先ず、液体培養したＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｓ−２の菌体よりｍＲＮＡを調整し、逆転写によりｃＤＮＡの合成を行った。上記プライマーを用いてリパーゼＣＳ２遺伝子の内部配列（約１８０塩基）をまず決定した。その決定した内部配列を利用し新たなプライマーを設計し、それを用いて３’−及び５’−ＲＡＣＥ法によりリパーゼＣＳ２遺伝子のｃＤＮＡ配列を決定した。このようにして決定したリパーゼＣＳ２遺伝子の全塩基配列を配列番号２（図１）に示し、この塩基配列から推定されるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１（図１）に示す。
【００２６】
（５）上記に取得したｃＤＮＡをＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ用発現ベクターｐＧ−１（ＧＰＤプロモータ、ＰＧＫターミネータ、ＴＲＰ１マーカー）のＢａｍＨＩクローニングサイトに挿入して、組換えプラスミドＣＳ２Ｌｉｐａｓｅ ｃＤＮＡ＊ｐＧ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９３９）を作成した。
【００２７】
（６）上記に取得した組換えプラスミドを用いてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ４９９株を形質転換した。得られた形質転換株は、トリブチレンを１％濃度で懸濁させたＹＰＤ（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）プレート上で、トリブチレン分解により生じるハローを形成した。このことで取得したｃＤＮＡが確かに目的のリパーゼＣＳ２をコードするものであり、しかもＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにより活性のあるものとして発現、分泌されることを確認した。
【００２８】
（７）上記のとおり、リパーゼＣＳ２遺伝子の全塩基配列（１の位置（ＡＴＧ）〜７２０の位置（ＴＡＡ）まで）を決定した（配列番号２：図１）。また、この塩基配列から推定されるタンパク質は、２３９残基であることが明らかとなった。
【００２９】
（８）このようにして、ＤＮＡ配列からリパーゼＣＳ２の推定アミノ酸配列（配列番号１：図１）が決定された。このアミノ酸配列より計算される分子量は、本精製酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析による結果と矛盾しないものであった。本酵素のアミノ酸配列と既知のタンパク質配列データベースとの相同性をＢＬＡＳＴを用いて解析した結果、脂質分解酵素であるリパーゼの１種であるクチナーゼとの類似性が確認され、本発明に係るリパーゼＣＳ２は、既述の理化学的性質を有し、また、アミノ酸配列より、クチナーゼであることも確認された。また、今回決定された本発明酵素のアミノ酸配列及び塩基配列は、従来知られておらず、全く新規であることも判明した。
【００３０】
【発明の効果】
本発明によって、リパーゼＣＳ２について、遺伝子レベルでの解析が行われ、そのアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子のＤＮＡ配列がはじめて明らかにされた。これらの配列はいずれも新規であるが、そのアミノ酸配列を解析したところ、本酵素は、クチナーゼとの類似性が確認され、クチナーゼの１種であることが判った。
【００３１】
また、本発明に係るリパーゼＣＳ２（すなわち、クチナーゼ）遺伝子のＤＮＡは、その酵素のアミノ酸配列及び／又はその理化学的性質（作用も包含する）が変化しないようにその塩基配列の塩基を置換することも可能であるし、その塩基配列の一部について、塩基の置換、削除、挿入、転移の少なくともひとつを行ってもよい。
【００３２】
本発明によってリパーゼＣＳ２（クチナーゼ）について、遺伝子の解析、それを含む組換えベクター及び形質転換体の作成にはじめて成功したので、組換えＤＮＡ技術による本酵素の効率的工業生産に途が拓け、その結果、薬品、飲食品、洗剤といった油脂分解能に基づく従来からのリパーゼとしての用途のほか、エステル交換やエステル合成作用に基づくバイオディーゼル燃料の工業的製造、更には、本発明者らがはじめて発見したクチナーゼとしての作用に基づくポリ乳酸等のプラスチック、特に従来リパーゼでは分解できなかった生分解性プラスチックの分解剤への用途といった数多くの有用な用途に広く利用することができる。
【００３３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】リパーゼＣＳ２のアミノ酸配列（下段）及びそれをコードするＤＮＡの塩基配列（上段）を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a yeast-derived lipase CS2 gene. More specifically, the present invention has succeeded in determining the amino acid sequence of lipase CS2 and the nucleotide sequence of gene DNA encoding the same. Each of these sequences is a novel sequence which has not been known so far, and the present invention makes it possible to use recombinant DNA technology by elucidating these sequences. As a result, not only lipolysis but also biodiesel The present invention enables mass production of lipase CS2 having various and novel industrial uses such as fuel production and decomposition of plastics such as polylactic acid.
[0002]
[Prior art]
The present inventors have proposed a yeast, Cryptococcus sp. A technique for producing a novel lipase CS2 from a culture of S-2 (Cryptococcus sp. S-2) has just been developed (JP-A-2001-252072).
[0003]
This enzyme has the property of being not only highly degradable in fats and oils but also stable in organic solvents, so it can be used in the presence of organic solvents in addition to conventional lipase uses such as drugs, foods and drinks, cosmetics, and detergents. It can be used for synthetic reactions that are reverse reactions of decomposition, such as transesterification and ester synthesis.For example, it can be used for the production of biodiesel fuel, which is made from natural renewable raw materials such as vegetable oils and is a clean fuel. Its use has also been proposed by the present inventors.
[0004]
Furthermore, this enzyme has excellent plastic degradability, and can efficiently decompose polylactic acid (PLA), which is widely used in agricultural films, packaging films and other various applications, for example, to prevent environmental pollution. It is newly found by the present inventors to be extremely effective.
However, nothing has been reported on the gene encoding this enzyme.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made for the purpose of elucidating the genes of lipase CS2, which has many and very excellent uses as described above, in order to contribute to industrial mass production by recombinant DNA technology and the like.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
Lipase CS2 is a novel enzyme developed by the present inventors and has the following physicochemical properties and is a yeast belonging to the genus Cryptococcus, such as Cryptococcus sp. S-2 (Cryptococcus sp. S-2) (FERM P-15155) can be separated and collected from the culture (JP-A-2001-252072).
[0007]
The physicochemical properties of this enzyme are as follows.
[0008]
(1) It has an action of decomposing fats and oils, acts on triglycerides, and hydrolyzes to glycerin and fatty acids.
[0009]
(2) Substrate specificity Well decomposes triptyline, tricaprylin, tripalmitin and triolein. Triacetin, tricaprin and trilaurin degrade moderately. Degrading power for trimyristin and tristearin is weak.
[0010]
(3) When acting on regiospecific triolein, oleic acid and a small amount of 1,2 (2,3) -diolein are formed, and 1,3-diolein and monoolein are not detected.
[0011]
(4) Optimum pH and stable pH range Optimum pH: 7.0
Stable pH range: 5-9
[0012]
(5) Optimal reaction temperature and deactivation conditions depending on temperature Optimal reaction temperature: 37 ° C
Conditions for deactivation by temperature: The deactivation of the activity by the temperature rise is moderate, and the activity is maintained even at a heat treatment of 60 ° C. for 30 minutes.
[0013]
(6) Stability to an organic solvent, activation It is stable to an organic solvent, and its activity is increased by dimethyl sulfoxide and diethyl ether.
[0014]
(7) Molecular weight 22 kDa (SDS-PAGE)
[0015]
The present invention has been made to achieve the above-mentioned object, and as a result of intensive studies, the cloning of the gene encoding lipase CS2 and the determination of the nucleotide sequence thereof have also been successful, leading to the completion of the present invention. It is a thing.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0016]
After treating the purified lipase CS2 with a protease (lysyl endopeptidase) and fragmenting it, the amino acid sequence of some of the fragments was determined. DNA primers (mixed primers) were designed based on the partial sequences whose amino acid sequences were determined for some of the fragments, and used to determine the internal sequence of the lipase CS2 gene.
[0017]
In order to clone the lipase CS2 gene, first, liquid-cultured Cryptococcus sp. MRNA was prepared from the cells of S-2, and cDNA was synthesized by reverse transcription. Using this cDNA as a template, the internal sequence (about 180 bases) of the lipase CS2 gene was first determined using the above primers. A new primer was designed using the determined internal sequence, and the cDNA was determined for the lipase CS2 gene by the 3′- and 5′-RACE using the primer. The entire nucleotide sequence of the lipase CS2 gene thus determined is shown in SEQ ID NO: 2 (FIG. 1), and the amino acid sequence of the protein deduced from this nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 1 (FIG. 1).
[0018]
As described above, Cryptococcus sp. After obtaining cDNA of the present enzyme from S-2, cloning was performed. A deduced amino acid sequence could be determined from the DNA sequence. The cDNA obtained above was inserted into the BamHI cloning site of the expression vector pG-1 (GPD promoter, PGK terminator, TRP1 marker) for Saccharomyces cerevisiae to prepare a recombinant vector. The obtained recombinant vector was designated as CS2 Lipase cDNA * pG-1 and deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary as FERM P-18939.
[0019]
When the recombinant plasmid CS2 Lipase cDNA * pG-1 (FERM P-18939) obtained above was transformed into Saccharomyces cerevisiae strain YPH499, YPD (yeast extract 1%, peptone 2) in which tributyrene was suspended at a concentration of 1% was obtained. %, Glucose 2%) on the plate, the transformants formed halos resulting from tribubutylene degradation. The cDNA obtained in this way certainly encodes the desired lipase CS2, cerevisiae was confirmed to be expressed and secreted as active.
[0020]
The lipase CS2 derived from the genus Cryptococcus according to the present invention can be used not only for decomposing fats and oils, but also for reagents, pharmaceutical components, food and drink components for specified health uses, detergents, cosmetics and other wide-ranging applications, In particular, because of its property of being stable to organic solvents, it can be used for transesterification and ester synthesis, and can also be used for biodiesel fuel synthesis. In particular, it has been found for the first time that biodegradable plastics such as polylactic acid (PLA), polybutylene succinate (PBS), and polycaprolactone (PCL) are efficiently decomposed, and various uses for such beneficial uses are made. Although the enzyme gene and amino acid sequence have been elucidated this time, By recombinant DNA techniques, it can be the enzyme efficiently industrial production.
[0021]
Hereinafter, examples of the present invention will be described.
[0022]
Embodiment 1
(1) 0.5% yeast extract, KH 2 PO 4 1%, MgSO 4 · 7H 2 O, triolein 1% yeast S-2 bacteria were precultured in liquid medium containing 0.5% lactose (FERM P -15155) at 1% (v / v) and shaking culture at 25 ° C. and 100 rpm. MRNA was extracted from the obtained cells, and a cDNA library was constructed based on the mRNA.
[0023]
(2) The enzyme was purified as follows. A culture solution was obtained by removing the yeast cells from the culture liquid-cultured as described above. The culture solution thus obtained was centrifuged at 8,000 rpm for 10 minutes, filtered through a 0.45 μm membrane filter, and then concentrated by ultrafiltration. The lipase was purified by high performance liquid chromatography using a cation exchange resin TSK-gel SP-5PW column (gradient elution with a pH 7.0 phosphate buffer and 0.5% NaCl added thereto). The activity was 17.1 times and the yield was 11.4%. A single band was obtained on SDS-PAGE, and the molecular weight was found to be 22 kDalton by SDS-PAGE.
[0024]
(3) The purified lipase CS2 was treated with a proteolytic enzyme (lysyl endopeptidase) to fragment it, and the amino acid sequence of some of the fragments was determined. Based on the partial sequence, a DNA primer (mixed primer) was designed and used for determining the internal sequence of the lipase CS2 gene.
[0025]
(4) In order to clone the lipase CS2 gene, first, liquid-cultured Cryptococcus sp. MRNA was prepared from the cells of S-2, and cDNA was synthesized by reverse transcription. First, the internal sequence (about 180 bases) of the lipase CS2 gene was determined using the above primers. A new primer was designed using the determined internal sequence, and the cDNA was determined for the lipase CS2 gene by the 3′- and 5′-RACE using the primer. The entire nucleotide sequence of the lipase CS2 gene thus determined is shown in SEQ ID NO: 2 (FIG. 1), and the amino acid sequence of the protein deduced from this nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 1 (FIG. 1).
[0026]
(5) The cDNA obtained above was inserted into the BamHI cloning site of the expression vector pG-1 (GPD promoter, PGK terminator, TRP1 marker) for Saccharomyces cerevisiae, and the recombinant plasmid CS2 Lipase cDNA * pG-1 (FERM P-18939) was inserted. )created.
[0027]
(6) Saccharomyces cerevisiae strain YPH499 was transformed using the recombinant plasmid obtained above. The obtained transformant formed a halo generated by tribubutylene degradation on a YPD (yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 2%) plate in which tribubutylene was suspended at a concentration of 1%. The cDNA obtained in this way certainly encodes the desired lipase CS2, cerevisiae was confirmed to be expressed and secreted as active.
[0028]
(7) As described above, the entire nucleotide sequence (from position 1 (ATG) to position 720 (TAA)) of the lipase CS2 gene was determined (SEQ ID NO: 2; FIG. 1). Further, it was revealed that the protein deduced from this nucleotide sequence was 239 residues.
[0029]
(8) In this way, the deduced amino acid sequence of lipase CS2 (SEQ ID NO: 1: FIG. 1) was determined from the DNA sequence. The molecular weight calculated from this amino acid sequence was consistent with the result of SDS-PAGE analysis of the purified enzyme. The homology between the amino acid sequence of the present enzyme and a known protein sequence database was analyzed using BLAST. As a result, similarity to cutinase, a kind of lipase, which is a lipolytic enzyme, was confirmed, and the lipase CS2 according to the present invention was confirmed. Has the above-mentioned physicochemical properties, and was also confirmed to be cutinase from the amino acid sequence. In addition, the amino acid sequence and the base sequence of the enzyme of the present invention determined this time have not been known so far, and it has been found that they are completely novel.
[0030]
【The invention's effect】
According to the present invention, lipase CS2 has been analyzed at the gene level, and its amino acid sequence and the DNA sequence of the gene encoding it have been elucidated for the first time. Each of these sequences is novel, but the amino acid sequence thereof was analyzed. As a result, the enzyme was confirmed to be similar to cutinase, indicating that it was a kind of cutinase.
[0031]
Further, the DNA of the lipase CS2 (ie, cutinase) gene according to the present invention may be obtained by substituting the bases of the base sequence so that the amino acid sequence of the enzyme and / or its physicochemical properties (including the action) do not change. Alternatively, at least one of base substitution, deletion, insertion, and transfer may be performed on a part of the base sequence.
[0032]
According to the present invention, the gene analysis of lipase CS2 (cutinase) and the preparation of a recombinant vector and a transformant containing the gene have been successfully achieved for the first time. As a result, in addition to the conventional use as a lipase based on the ability to decompose fats and oils such as medicines, foods and drinks, and detergents, industrial production of biodiesel fuel based on transesterification and ester synthesis, and further, the present inventors have discovered for the first time. It can be widely used in many useful applications such as use of plastics such as polylactic acid based on the action as cutinase, particularly biodegradable plastics which could not be decomposed by conventional lipase, as degrading agents.
[0033]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the amino acid sequence of lipase CS2 (lower) and the nucleotide sequence of the DNA encoding the same (upper).
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