JP2004041210A - サッカロミセスセレビシアエによるジスルフィド結合をもつ組換えタンパク質の産生を増加させる方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)酵素は分泌及び細胞表面タンパク質におけるジスルフィド結合の形成を触媒する。ここでは、ヒトPDI又は酵母PDIを調節的に過剰産生する酵母Saccharomyces cerevisiaeの組換え株の構築を開示する。これらの株は、治療面で潜在的に重要なジスルフィド結合をもつタンパク質を極めて多量に分泌する。これらの株は、ジスルフィド結合をもつ種々のタンパク質の産生を増加させる可能性を有する。
【選択図】なし
Description
ヒト及び酵母タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)をコードするDNAを単離し、プロモーターと転写ターミネーターとを含む発現カセット又はベクターにクローニングする。PDIをコードするDNAを含む発現カセット又はベクターを宿主細胞内にトランスファーすると、該細胞はPDIタンパク質を過剰産生する。これらのPDI過剰産生細胞を、ジスルフィド結合をもつタンパク質の発現のための組換え宿主として使用する。ジスルフィド結合をもつタンパク質の分泌は、PDI過剰産生宿主細胞では、通常レベルのPDIを産生する宿主細胞と比べて実質的に増加する。
酵母におけるタンパク質の折り畳み及び分泌のプロセスは極めて複雑であり、遺伝子研究に基づいて言えば、30以上の遺伝子産物が関与している(Franzusoff,A.ら,1991,Methods Enzymology,194,pp.662−674)。これらの産物としては、ペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼ、PDI及び他のチオレドキシン様タンパク質、BiP、種々の分子シャペロン(molecular chaperone)(hsp70、hsp60等)、シグナルペプチダーゼ、シグナル認識タンパク質、E.R.への前駆体のトランスロケーションに関与する種々のタンパク質、ERの種々の構造及び機能成分、ゴルジ(Golgi)、並びにまだ特徴が解明されていない分泌小胞及び多くのタンパク質が挙げられる(Franzuoff,A.ら,1991,前出引用文献;Rothman,J.E.及びOrci L.,1992,Nature,355,pp.409−415;Gething,M.G.及びSambrook,G.,1992,Nature,355,pp.33−45)。このような複雑さに鑑みて、単一の成分(即ちPDI)の量が増加するだけで特定の異種タンパク質の分泌が実質的に増加するという可能性は、当業者には極めて想到しにくいことと思われる。そこで本発明は、PDIの量が増加しただけで、例えばアンチスタシンのような分泌タンパク質の量が有意に且つ実質的に増加するという極めて意外な結果を提示した。これは、タンパク質の折り畳み及び/又はジスルフィド結合形成の促進に関連していると思われる現象である。
(i)予測された59kDaの分子量と、哺乳動物PDIに特徴的なpI(4.1)とを有していた;
(ii)該アミノ酸配列は、BESTFITソフトウェア(UWGCG,University of Wisconsin)によって決定されたように、先に報告された哺乳動物及び鳥類のPDI配列に対して、30〜32%の全体的同一性と、53〜56%の全体的類似性とを示した;
(iii)該アミノ酸配列中の位置58〜65及び403〜410に「チオレドキシン様」活性部位の二つのコピーを含んでいた。また、これらの配列は、哺乳動物PDI内の重複a/a’領域に対して高度のアミノ酸同一性を示す約100アミノ酸のより大きい内部重複(internal duplication)の一部分であった(第2図)。酵母及び哺乳動物PDI配列を並べると(alignment)、a及びa’領域の外側に、大きな相同を示す別の領域が存在することも明らかになった(第2図)。
Saccharomyces cerevisiae株MD40/4C(MATα、leu2−3−112、ura2、his3−11、−15、trp1)及びAS3324(MATα/MAT“a”his3/his3、leu2/leu2、ura3/ura3、trp1/trp1)を、YEPD(1%バクトペプトン、1%酵母抽出物、2%グルコース)又はpH5.8緩衝最少培地(0.67%アミノ酸無含有酵母窒素ベース、2%グルコース、1%コハク酸、0.6% NaOH、50μg/mlメソ−イノシトール)に必要な塩基及びアミノ酸を加えたものの中で30℃で増殖させた。
制限ヌクレアーゼ消化及びDNA連結を、酵素製造業者(BCL、BRL)の指示に従って実施した。E.coli形質転換の棲準的プロトコル(Cohenら,1972,P.N.A.S.USA,69,pp.2110−9)及びS.cerevisiae形質転換の標準的プロトコル(Beggs,1978 Nature,275,pp.104−9;Itoら,1983,J.Bacteriol.,153,pp.163−8)を実施した。Holmらの方法(1986,Gene,42,pp.169−73)でS.cerevisiaeからゲノムDNAを製造した。
高コピー数LEU2−d、2ミクロンベースベクターpMA3a(Crouzet及びTuite,1987,前出引用文献)のBamHI部位にクローニングしたS.cerevisiae株SKQ2n[α/a adel/+ade2/+his1/+;Gasionら、前出引用文献]に由来するDNAの部分的Sau3Aフラグメントを含む酵母ゲノムライブラリーを、PDI1遺伝子についてのスクリーニングに使用した。30マーオリゴヌクレオチド(5’CTTACAGTGACCACACCATGGAGCGTAGAA3’)(配列番号:5)を、高度に保存されている「チオレドキシン様」活性部位(FYAPWCGHCK)(配列番号:4)に対して、但し酵母コドンバイアスを用いて(Sharpら,1986,前出引用文献)合成した。
配列決定に適した大きさのフラグメントを同定するために、クローンC7を一連の制限酵素で消化し、1%アガロースゲル上でフラグメントを分離し、真空プロッティング装置(Hybaid Ltd.)を用いてGenescreen Plusメンブラン(DuPont)にトランスファーした。次いで、Maniatisらの方法(1982、前出引用文献)に実質的に従ってフィルターを予備ハイブリダイズし、その後、前述のように末端標識し変性した30マーオリゴヌクレオチドプローブを加えた。ハイブリダイゼーションを6×SSC中43℃で24時間実施し、次いで2回の洗浄を200mlの2×SSC中室温で5分間行い、更に2回の洗浄を200mlの2×SSC、0.1%SDS中65℃で1時間行い、最後に500mlの0.1×SSC中で室温で1回洗浄した。次いでフィルターを−70℃で48時間オートラジオグラフイーにかけた。
株MD40/4cの指数増殖細胞(5×106〜1×107細胞/ml)又は定常期細胞(2×108細胞/ml)から完全RNAを製造した。30分間の熱衝撃(30℃〜42℃)にかけたMD40/4cの指数増殖細胞からもRNAを抽出した。完全RNAは、本質的にDobsonらの方法(1983,Nucleic Acids Res.,11,2287−2302)に従って抽出した。
HIS3遺伝子を有する1.8kbのBamHIフラグメントをプラスミドpMA700から放出させ(Montielら,1984、前出引用文献)、1%低融点アガロース(Sigma)上で精製した。該フラグメントのBamHI付着末端を、Maniatisらの方法(1982、前出引用文献)で、dNTPsとDNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントとを用いて充填した。次いでPDI1遺伝子の1.2kb DraI−BgllIIIフラグメントを、プラスミドpUC19のポリリンカー内のSmaI−BamHI部位にサブクローニングした。最後に、HIS3遺伝子を含む充填したBamHIフラグメントを、PDI1コーディング領域内の単一のEcoRV部位に連結した(第3図)。得られたpdi1::HIS3対立遺伝子を3.0kbのSal1−EcoRIフラグメント上に遊離させ、低融点アガロ−ス上で精製し、Itoらの酢酸リチウム形質転換プロトコル(1983、前出引用文献)を用いて二倍体株AS3324をHis+プロトトロフィ(prototrophy)に形質転換するのに使用した。
全タンパク質抽出物におけるPDI活性のアッセイを、Hillsoらの方法(1984,Methods Enzymol.,107,pp.281−92)で実施した。
スクランブルリボヌクレアーゼ(scrambled ribonuclease)は、ランダムに形成されたジスルフィド結合を含む完全に酸化した混合物である。これは、市販の(Sigma)ウシ膵臓リボヌクレアーゼAから下記の方法で調製する。
リボヌクレアーゼを、50mMトリス−HCl緩衝液、pH8.6、8.9M尿素、130mMジチオトレイトール(還元可能ジスルフィド結合に対して約15倍モル過剰なジチオトレイトール)中30mg/ml(約2.2mM)で、室温で18時間〜20時間、又は35℃で1時間インキュベートする。
基質、スクランブルリボヌクレアーゼは、約2%の天然リボヌクレアーゼ活性を有する高分子量RNAの加水分解開裂では本質的に不活性である。スクランブルリボヌクレアーゼ中の分子間及び分子内ジスルフィドの交換の触媒におけるPDIの作用は、天然ジスルフィド結合、天然配座を回復させ、RNAに対するリボヌクレアーゼ活性を随伴的に回復させる(concomitant return)。このようにして、PDIの活性を、処理中にアリコートが採取されるタイムコース(time−course)インキュベーションによってアッセイし、RNAに対するリボヌクレアーゼ活性を測定する。
LYS2での組込みのためのベクターを下記の手順で構築した。プラスミドpUC19をHindIIIで消化し、線形ベクターフラグメントをゲル精製した。次いでこのフラグメントをEcoRIで消化し、得られた2.7kbpのEcoRI−HindIIIベクターフラグメントをゲル精製した。該精製フラグメントを下記の合成オリゴヌクレオチドと連結した:
5′AATTGCGGCCGCAAGCTTGCGGCCGC−3′(配列番号:6)
3′−CGCCGGCGTTCGAACGCCGGCGTCGA−5′(配列番号:7)
該オリゴヌクレオチドは、EcoRI付着末端と、NotI部位と、HindIII部位と、NotI部位と、HindIII付着末端とをこの順序で含む。得られたプラスミドpUC−Notは、両端でNotI部位に直接フランキングされた単一のHindIII部位を含む。
ヒトPDIコーディング配列源は、Pihlajaniemiら(1987、前出引用文献)によって記載されている重複部分的cDNAクローン、p210及びp1であった。ヒトPDI cDNAの5’末端を有するp210に由来する0.45kbpのEcoRI−PstIフラグメントをpUC18にクローニングして、プラスミドpUKC150を得た。次いで該プラスミドpUKC150をEcoRI及びAvaIで消化した(AvaIは成熟ヒトPDIをコードする配列の第三のアミノ酸に対応する位置で切断する)。得られた3.1kbpのベクター主鎖(backbone)フラグメントをゲル精製し、下記の構造のオリゴヌクレオチドアダプターと連結した:
5′−AATTCGTTGACGCCC−3′(配列番号:8)
3′−GCAACTGCGGGGGCT−5′(配列番号:9)
該アダプターは成熟PDIコーディング配列の5末端を再構築し、所望の分泌リーダー配列への成熟ヒトPDI配列の正確な融合を可能にするような位置にHindIII部位を含む。
− ヒトPDI発現カセットを有する2.8kbpのEcoRI−HindIIIフラグメントをゲル精製し、T4 DNAポリメラーゼでの処理によって平滑末端化した。前記平滑末端化pNLベクターフラグメントと該発現カセットフラグメントとを互いに連結し、該連結混合物を用いてE.coli株ATCC 35691を形質転換した。所期の構造を有するプラスミドを含むものについて形質転換体をスクリーニングし、得られたプラスミドpNL−MFα1−hPDIを多量に製造した。pNL−MFα1−hPDIをNotIで消化すると、両端でLYS2 DNA配列にフランキングされた6.2kbpの発現カセットが得られる。消化したDNAを用いて、スフェロプラスト法で(Hinnen A.ら,1978,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,75,pp.1929−1933)、S.cerevisiae株BJ1995及びJRY188を形質転換した。NotI末端はターゲッティングデバイスとして作用しながら発現カセットを染色体LYS2座に向かわせ、該座で前記カセットが相同組換えを介して組込まれた。形質転換体を、アルファアミノアジピン酸含有固体培地で増殖するものについてスクリーニングした(Chattoo,B.B.ら,1979,Genetics,93,pp.51;Barnes及びThorner,1986,前出参考文献)。このような増殖は、株がlys−であることを意味する。LYS2プローブを用いて行ったクローン単離体のサザンブロット分析で、発現カセットがLYS2座に組込まれたことが確認された。BglIIで消化した染色体DNA調製物は、LYS2プローブとハイブリダイズするバンドについて、5.0から7.8kbpへの所期のサイズ変化を示した。その結果得られた、組込み発現カセットを含むBJ1995及びJRY188関連株を、それぞれBJ1995/アルファ−hPDI及びJRY188/アルファ−hPDI(株#1072A)と命名した。
PDI cDNAクローンp1(Pihlajaniemiら,1987,前出引用文献)をPstIで消化し、ヒトPDI cDNAの3’領域を有する1.5kbpのPstI−PstIフラグメントをゲル精製した。次いで該フラグメントをpUKC150(前記実施例9に記載)のPstI部位に挿入してプラスミドpUKC151を得た。該プラスミドは、完全な全長ヒトPDI cDNAを含んでいる。該pUKC151をHindIIIで消化し、適当なオリゴヌクレオチドアダプター(EcoRI認識配列を含む)と連結して、PDI cDNAの3’末端に位置するHindIII部位をEcoRI部位に変換した。得られたプラスミドpUKC153は、2.1kbpのEcoRIフラグメント上の完全ヒトPDIコーディング配列を含んでいる。該プラスミドpUKC153をEcoRI及びPstIで消化した。その結果得られた、ヒトPDI配列の5’部分及び3’部分をそれぞれ有する0.47kbpのEcoRI−PstIフラグメント及び1.7kbpのPstI−EcoRIフラグメントをゲル精製した。pUC19をEcoRI及びPstIで消化し、2.7kbpのベクターフラグメントをゲル精製し、次いで前述の0.47kbpのEcoRI−PstIフラグメントに連結した。該連結混合物を用いてE.coli ATCC 35691を形質転換した。所期の構造を有するプラスミドを含む形質転換体からプラスミドDNAを製造した。該DNAをAvaI及びPstIで消化し、ヒトPDI配列の5’部分を有する0.38kbpフラグメントをゲル精製した。
小胞体内に常在する酵母タンパク質は通常、小胞体内での保持のためのシグナルであるC末端HDELアミノ酸配列を含む(Pelhamら,1988,前出引用文献)。これに対し、ヒトPDIは、酵母内でのER保持に関しては余り機能しないことが明らかにされた(Lewis,M.J.ら,1990,Cell,61,pp.1359−1363)C末端KDEL配列(Pihlajaniemiら,1987,前出引用文献)を有する。従って、C末端KDELがHDELに変化している改変ヒトPDIを構築することが望まれた。これは下記の方法で達成された。
プラスミドpUKC161(第4図)をBamHI及びClaIで消化し、アルファ因子プレプロリーダー配列とhPDIの5’−セグメントとを有する0.7kbpのBamHI−ClaIフラグメントをゲル精製した。プラスミドpUC−ySP−hPDI(HDEL)(実施例11に記載)をClaI及びEcoRIで消化し、C末端HDEL改変を有するhPDIの3’セグメントを含む1.0kbpのClaI−EcoRIフラグメントをゲル精製した。pUC19をBamHI及びEcoRIで消化し、得られたベクターフラグメントを、0.7kbpのBamHI−ClaIフラグメント及び1.0kbpのClaI−EcoRIフラグメントの両方と連結してプラスミドpUC−MFα1−hPDI(HDEL)を得た。該プラスミドをBamHIで消化し、PDIカセットを有する1.7kbpのBamHI−BamHIフラグメントをゲル精製し、プラスミドp401(第6図)のBamHI部位に挿入して、プラスミドpGAL−MFα1−hPDI(HDEL)を得た。次いで該プラスミドを酵素SmaI、SphI及びPvuIで消化し、その結果得られた、発現カセットを有する2.6kbpのSmaI−SphIフラグメントをゲル精製し、平滑末端化した。pUC13−LYS2ベクターをXhoIで消化し、平滑末端化し、次いで前述の2.6kbp平滑末端化フラグメントに連結した。得られたプラスミドpLYS2−MFα1−hPDI(HDEL)をHpaI及びEcoRVで消化し、次いで株JRY188及びBJ1995の形質転換に使用した。得られた形質転換体を(実施例9に記載のように)ゲノムDNAのサザンブロットで評価し、所望の発現カセットがLYS2座に組込まれていることを確認した。JRY188形質転換体を株#1279と命名した。
完全酵母PDI1遺伝子を有するプラスミドC7(実施例4に記載)をEcoRVで消化し、酵母PDI読取り枠(ORF)のC末端部分(アミノ酸223からORFの末端まで)と3’非翻訳配列とを含む1.3kbpのEcoRV−EcoRVフラグメントをゲル精製し、プラスミドpAT153[Twigg,A.G.及びSherratt,D.,1980,Nature,283,pp.216−218]のEcoRV部位に挿入して、pUK169を得た。次いでプラスミドC7をBanI及びEcoRVで消化し、酵母PDI ORFのアミノ酸6〜222をコードする0.67kbpのBanI−EcoRVフラグメントをゲル精製し、下記の合成オリゴヌクレオチドアダプターと連結した:
5′−GATCCACAAAACAAAATGAAGTTTTCTGCTG−3′(配列番号:16)
3′−GTGTTTTGTTTTACTTCAAAAGACGACCACG−5′(配列番号:17)
該オリゴヌクレオチドアダプターはそれぞれBamHI及びBanI付着末端を有し、酵母PDI ORFのアミノ酸1〜5と12塩基対の酵母5’非翻訳リーダー配列とをコードする。(ATG開始コドンは下線で示されている)。得られた0.7kbpのBamHI−EcoRVフラグメントをゲル精製し、次いで、予めEcoRV及びBamHIで消化しておいたpAT153にサブクローニングして、プラスミドpUKC170を得た。
プラスミドpUC−Not−URA3(実施例8)をApaI及びNcoIで消化し(URA3遺伝子の一部分を欠失させるため)、平滑末端化した。プラスミドpUC18−GAL10p−yPDI−ADH1tをEcoRI、ScaI及びSphIで消化し、GAL10p−yPDI−ADH1t発現カセットを有する2.8kbpのEcoRI−SphIフラグメントをゲル精製し、平滑末端化し、前記ベクターフラグメントと連結して、プラスミドpNU−GAL10p−yPDIを得た。NotIでの消化により、pNU−GAL10p−yPDIからURA3−GAL10p−yPDI−ADH1t−URA3組込みカセットを切り出した。得られた線形フラグメントを用いて酵母株KHY107を形質転換した。5−フルオロ−オロト酸含有固体培地上で(Boekeら,1984,Mol.Gen.Genet.,197,pp.345)、ura−形質転換体を選択した。得られたura−形質転換体に由来するゲノムDNAをBg1IIで消化し、GAL10p−yPDI−ADH1tカセット由来の放射性標識したEcoRI−PvuIIフラグメントをプローブとして用いて、サザンブロットにより評価した。所望のGAL10p−yPDI−ADH1t発現カセットをURA3に組込んだ単離体が同定された。単離体K−Y1は、URA3に組込まれた複数のコピーを有していた(株#1136)。単離体K−Y3は、URA3に組込まれたコピーを一つだけ有していた(株#1137)。
酵母株を、3×YEPD液体培地で、23℃で24時間増殖させた。24時間が経過した後、培養物にガラクトースを最終濃度4.8%まで加えた。次いで培養物を23℃で更に24時間再インキュベートした。あるいは、酵母株を3×YEPDで30℃で24時間培養した。細胞を回収し、無菌冷水で洗浄し、同量の3×YEPD−ガラクトース培地に再懸濁させた。酵母株を更に16〜25時間インキュベートし、その後回収し、タンパク質を抽出方法2(下記)で抽出した。
本質的にMellorらの方法(1983,Gene,24,pp.1〜14)に従い、ガラスビーズ破壊法を用いて、指数増殖細胞又は定常期細胞からタンパク質を抽出した。
アンチスタシンは血液凝固因子Xaの強力なタンパク質阻害物質である。アンチスタシン(ATS)は、メキシコヒルHaementeria officinalisの唾液腺から単離された(Nutt,E.ら,1988,J.Biol.Chem.,263,pp.10162−10167)。その後、ATSをコードするcDNAがHan,J.H.らにより単離され、特徴が解明された(1989,Gene,75,pp.47−57)。ATSは、組換え酵母によって分泌された異種タンパク質中の折り畳み及び適当なジスルフィド結合の形成に対する高レベルのPDI活性の影響を評価する上で理想的なリポータータンパク質である。なぜならATSは、タンパク質が生物学的活性を有するようにするために正確な対を形成しなければならない10個のジスルフィド結合を有するからである。
1. 5′−ATATGGATCCTGTCTTTGGATAAAAGACAAGGACCATTTGGACCCGGGTGT−3′ (配列番号:18)
2. 5′−TATAGGATCCTTATGATAAGCGTGGGATAAGCTT−3′ (配列番号:19)
これらのプライマーは両方とも、PCR産物のサブクローニングを容易にするためにBamHI部位を含む。第一のプライマーは、酵母KEX2 yscFエンドプロテアーゼ開裂部位(Lys−Arg)N末端を、成熟ATSの第一アミノ酸残基に挿入する(酵母yscFエンドプロテアーゼは該配列中のLys−Arg部位のC末端側で開裂する)。PCR産物をBamHIで消化し、ゲル精製し、次いでBamHI消化pKH4α2に連結して、pKH4α2/ATS(K991)(第8図)を得た。次いでこの発現ベクターを用いて、スフェロプラスト法(Hinnenら,1978,前出引用文献)で、表1に示す酵母宿主株を形質転換した。
K991形質転換親JRY188株と、酵母もしくはヒトPDIを過剰産生する種々の形質転換誘導体とを、下記の方法でアンチスタシンの分泌に関して評価した。指示された株を−70℃冷凍グリセロールストックからロイシン無含有合成寒天プレート上にストリークし、30℃で3日間増殖させた。5mlの3xYEHD[60g Difco酵母抽出物、30g HySoyペプトン、48gグルコース/l]培地を入れた培養管(18×150mm)に小ループ一杯の細胞を接種し、組織培養ローラードラム上で23℃で約18時間インキュベートした。この段階で、ガラクトースを最終濃度4.8%(w/v)で加えて細胞を誘導し、培養物を23℃で更に5日間インキュベートした。次いで、遠心分離で細胞を回収し、清澄化培地上清をアンチスタシン活性のアッセイのために保持し、該活性を因子Xa活性の阻害によって測定した[Nutt,E.ら,1988,前出引用文献]。該実験は三つ組みで実施した。結果を要約して表2に示す。
K991形質転換JRY188と、三つの異なる分泌リーダーを有するHDEL突然変異体形ヒトPDIを過剰産生する形質転換誘導体株とを実施例17に記載のように増殖し、清澄化培地上清を、実施例17に記載のように因子Xa阻害アッセイで分泌ATSレベルについて評価した。結果は表3に示す。
K991形質転換KHY107と、酵母PDIを過剰産生する該株の形質転換誘導体とを増殖し、清澄化培地上清を、実施例17に記載のように因子Xa阻害アッセイで分泌ATSレベルについて評価した。結果は表4に要約して示す。
多重コピー酵母シャトルベクターYEp24(Botstein,D.ら,1979,Gene,8,pp.17−24)は、酵母2ミクロンDNA複製起点と、ウラシル無含有合成培地で選択するための酵母URA3遺伝子とを含む。YEp24をBamHIで消化し、得られた7.8kbpのBamHIベクターフラグメントをゲル精製した(フラグメントa)。プラスミドpUC18−GAL10p−yPDI−ADH1t(#1015)をEcoRI、SphI及びScaIで消化した。その結果得られた、GAL10p−yPDI−ADH1t発現カセットを有する2.8kbpのEcoRI−SphIフラグメントをゲル精製した(フラグメントb)。プラスミドpUKC161をEcoRI及びHindIIIで消化し、GAL1p−−MFα1プレプロ−−ヒトPDI発現カセットを有する2.8kbpのEcoRI−HindIIIフラグメントをゲル精製した(フラグメントc)。前記三つのフラグメントを平滑末端化し、次いで下記の手順で互いに連結した:(1)ベクターフラグメントa及びフラグメントbを互いに連結してプラスミドYEp24−GAL10p−yPDI(第9図)を得る:(2)ベクターフラグメントa及びフラグメントcを互いに連結してプラスミドYEp24−GAL1p−MFα−hPDI(第10図)を得る。得られた前記二つのプラスミドDNAの大規模CsC1製造を行った。二つの別個の形質転換反応で、酵母株JRY188をATS発現ベクターK991(実施例16)及びYEp24−GAL10p−yPDIもしくはYEp24−GAL1p−MFα−hPDIで同時形質転換した。両方のプラスミドを含む形質転換体を、ロイシン及びウラシルの両方を欠失した合成培地で選択し、単離した単集落(single colony)を同一培地上で再ストリークしてクローン単離体を選択した。二つの元の同時形質転換の各々について5個の前記クローン単離体を、培養管内の5mlの3xYEHD培地に接種し、組織培養ローラードラムで23℃で24時間インキュベートした。24時間が経過した後、ガラクトースを最終濃度4.8%で加え、培養物を23℃で更に5日間インキュベートした。遠心分離によって細胞を回収し、清澄化培地上清を因子Xa阻害アッセイでATS活性レベルについてアッセイした。YEp24−GAL10p−yPDIプラスミド及びATS発現ベクターを含む同時形質転換体は、ATS発現ベクターのみを含む親JRY188株と比べると、単離体に応じて3〜26倍の分泌ATS活性レベルを示した。YEp24−GAL1p−MFα−hPDIプラスミドとATS発現ベクターとを含む同時形質転換体は、ATS発現ベクターのみを含む親JRY188株と比べて、2〜3倍の分泌ATS活性レベルを示した。
S.cerevisiae GAL1及びGAL10遺伝子を、分岐型(divergent)GAL1及びGAL10プロモーターとこれら二つのプロモーターのTATAボックスの間に位置する共通GAL4結合ドメインとを含む二つの構造遺伝子の間の領域から分岐的に(divergently)転写した。プラスミドpBM272(Johnston,M.及びDavis,R.,1984,Mol.Cell.Biol.,4,pp.1440)は、この分岐型酵母GAL1−GAL10プロモーターを0.85kbpのEcoRI−HindIIIフラグメント上に含む(HindIII部位に隣接した内部BamHI部位も有する)。このプロモーターフラグメントを使用して、分岐型プロモーターカセットベクターpUC−GAL1/10を構築した。該ベクターは次の特性を有する:非反復EcoRI及びSmaI部位により、この順序で、酵母ADH1転写ターミネーター(0.35kbp HindIII−SphIフラグメント)から分離した酵母GAL10プロモーター。非反復BamHI及びHindIII部位によりADH1転写ターミネーターの第二のコピーから分離した酵母GAL1プロモーター。二つのADH1ターミネーターエレメントの3’末端は、分岐型プロモーター発現カセット全体をSphフラグメントとして単離できるように、SphI部位によってフランキングされている。このプラスミド内のベクター主鎖は、ポリリンカーの代わりに前記発現カセットを有するpUC18である。
アンチスタシン発現ベクターpKH4α2/ATS及びYEp24−GAL1p−MFα−hPDIもしくはYEp24−GAL10p−yPDIで同時形質転換した株JRY188の選択した単離体を、23℃又は30℃での増殖後にアンチスタシン分泌について評価した。アンチスタシン発現ベクターのみで形質転換した親株JRY188を平行して増殖した。3xYEHD培地で23℃又は30℃で一晩増殖した後、ガラクトースを最終濃度4.8%で加えて細胞培養物を誘導し、23℃又は30℃の適当な温度で更に5日間増殖した。誘導後3〜5日で採取した培地試料を、因子Xa阻害アッセイにより分泌アンチスタシンレベルについて評価した。表6の結果から明かなように、アンチスタシン発現は、PDIを過剰発現する総ての単離体について、誘導後3日目及び5日目の両方で、温度を30℃にした時よりも23℃にした時の方が遥かに大きかった。
マダニ抗凝血ペプチド(TAP)は、血液凝固因子Xaの強力な高選択性阻害物質である[Waxman,L.ら,1990,Science,248,pp.593−596)。TAPはマダニOrnithidoros moubataから単離された新規のセリンプロテアーゼ阻害物質である。TAPは、6個のシステイン残基を含む60個のアミノ酸からなる(Waxmanら,1990,前出引用文献)。TAPは、ガラクトース誘導性GAL10プロモーターと、TAPをコードする合成遺伝子にインフレーム融合した酵母MFα1プレプロ分泌リーダー配列とを含む発現ベクターpKH4−TAPを用いて、酵母内で発現された(Neeper,M.ら,1990,J.Biol.Chem.,265,pp.17746−17752)。このベクターは、プレプロリーダーのアミノ酸79の位置に配置されたBamHIクローニング部位の存在に起因して、少し改変されたMFα1プレプロリーダー配列を含む(Neeperら,1990,前出引用文献)。
5′−TACAACCGTC TGTGCATCAA−3′(配列番号:20)及び
5′−ACTGGATCCG AATTCAAGCT TAGATGCAAG CGT−3′(配列番号:21)
を用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で、DNA鋳型として使用した。
Claims (41)
- ジスルフィド結合をもつ組換えタンパク質のin vivo製造方法であって、
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子を含む一つ以上の組換え発現カセットから組換えタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを過剰発現させること、および
組換え宿主細胞細胞内で組換え発現カセットからタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ以外のジスルフィド結合をもつ一つ以上のタンパク質をコードする一つ以上の組換え遺伝子を過剰発現させること
を含む前記製造方法であって、
正確に折り畳まれたジスルフィド結合をもつタンパク質の生成量が、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼの過剰発現がないときに生成される正確に折り畳まれたジスルフィド結合をもつタンパク質の量よりも多いことを特徴とし、ただしタンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子がヒト血清アルブミンプレプロ配列をコードするDNAと連結した遺伝子ではなく、組換え宿主細胞が原核細胞ではないことを特徴とする、前記製造方法。 - タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする発現カセットが宿主細胞ゲノムに組込まれる、請求項1に記載の方法。
- タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする発現カセットが自律的複製プラスミド上に含まれている、請求項1に記載の方法。
- 組換えタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子が、一つ以上のプラスミドに含まれる一つ以上の発現カセット内に含まれ、ジスルフィド結合をもつ一つ以上のタンパク質をコードする組換え遺伝子が一つ以上のプラスミドに含まれる、請求項1に記載の方法。
- 組換えタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子が一つ以上のプラスミドに含まれる一つ以上の発現カセット内に含まれ、ジスルフィド結合をもつ一つ以上のタンパク質をコードする組換え遺伝子が、宿主細胞ゲノムに組込まれる、請求項1に記載の方法。
- ジスルフィド結合をもつ一つ以上のタンパク質をコードする組換え遺伝子が宿主細胞ゲノムに組込まれる、請求項1に記載の方法。
- タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする組換え発現カセットおよび組換え遺伝子が同じプラスミドに含まれる、請求項1に記載の方法。
- 組換え宿主細胞が哺乳動物である請求項1に記載の方法。
- 組換え宿主細胞が酵母である請求項1に記載の方法。
- 組換え遺伝子がアンチスタシンである請求項1に記載の方法。
- 組換え遺伝子がマダニ抗凝血タンパク質である請求項1に記載の方法。
- タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子が酵母タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子である、請求項1に記載の方法。
- タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子が哺乳動物のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子である、請求項1に記載の方法。
- タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子が酵母タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子である、請求項9に記載の方法。
- 酵母がSaccharomycetaceaeまたはCryptococcaceae科の種の株である、請求項9に記載の方法。
- タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子がヒトタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子である請求項13に記載の方法。
- 酵母がSacchromyces属の種である請求項15に記載の方法。
- タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子が酵母タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子である請求項15に記載の方法。
- 酵母がSacchromyces cerevisiaeである請求項17に記載の方法。
- タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子が、酵母タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子である、請求項17に記載の方法。
- タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子が、酵母タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子である請求項19に記載の方法。
- ジスルフィド結合をもつ分泌される組換えタンパク質のin vivo製造方法であって、
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子を含む組換え発現カセットから組換えタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを過剰発現させること、および
組換え酵母宿主細胞内で組換え発現カセットからタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ以外のジスルフィド結合をもつ一つ以上のタンパク質をコードする一つ以上の組換え遺伝子を過剰発現させること
を含む前記製造方法であって、
ジスルフィド結合をもつ組換えタンパク質が培地中に分泌され、培地から回収されることを特徴とし、
正確に折り畳まれたジスルフィド結合をもつタンパク質の生成量が、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼの過剰発現がないときに生成した正確に折り畳まれたジスルフィド結合をもつタンパク質の量よりも多いことを特徴とし、ただしタンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子がヒト血清アルブミンプレプロ配列をコードするDNAと連結した遺伝子ではないことを特徴とする、前記方法。 - タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子が、酵母タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子である、請求項22に記載の方法。
- タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子が哺乳動物のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子である、請求項22に記載の方法。
- タンパク質ジスルフィドイソメラーゼを過剰発現する組換え酵母宿主細胞が、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする組換え発現カセットのコピーを一つ以上含む、請求項22に記載の方法。
- タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子が、一つ以上のプラスミド上に含まれている一つ以上の発現カセット内に含まれ、ジスルフィド結合をもつ一つ以上のタンパク質をコードする組換え遺伝子が、一つ以上のプラスミドに含まれている、請求項22に記載の方法。
- ジスルフィド結合をもつ一つ以上のタンパク質を発現させるために、組換え酵母宿主細胞を30℃未満の温度で増殖させる、請求項22に記載の方法。
- 組換え酵母宿主細胞がSaccharomyces属の株である、請求項22に記載の方法。
- 組換え酵母宿主細胞がSaccharomyces cerevisiae種の株である、請求項28に記載の方法。
- 組換え酵母宿主細胞がSacchromyces属の株である、請求項23に記載の方法。
- タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子が、ヒトタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子である、請求項24に記載の方法。
- タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする組換え発現カセットが、酵母宿主細胞ゲノムに組込まれる、請求項25に記載の方法。
- タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする組換え発現カセットが自律的複製プラスミド上に含まれている、請求項25に記載の方法。
- タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする発現カセットおよび組換え遺伝子が同じプラスミドに含まれている、請求項26に記載の方法。
- ジスルフィド結合をもつ一つ以上のタンパク質を発現させるために、組換え酵母宿主細胞を20℃から26℃までの間の温度で増殖させる、請求項27に記載の方法。
- 組換え酵母宿主細胞がSaccharomyces cerevisiaeの株である、請求項30に記載の方法。
- ジスルフィド結合をもつタンパク質がアンチスタシンである、請求項35に記載の方法。
- ジスルフィド結合をもつタンパク質がマダニ抗凝血タンパク質である請求項35に記載の方法。
- 組換え発現カセット中のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子を含み、異なる組換え発現カセットからタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ以外のジスルフィド結合をもつ一つ以上のタンパク質をコードする一つ以上の組換え遺伝子を過剰発現するベクターから組換えタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを過剰発現する酵母Sacchromyces cerevisiaeの株。
- タンパク質ジスルフィドイソメラーゼがヒトタンパク質ジスルフィドイソメラーゼである、請求項39に記載の酵母株。
- タンパク質ジスルフィドイソメラーゼが酵母タンパク質ジスルフィドイソメラーゼである、請求項39に記載の酵母株。
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