JP2004000176A - 光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法 - Google Patents
光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004000176A JP2004000176A JP2003084694A JP2003084694A JP2004000176A JP 2004000176 A JP2004000176 A JP 2004000176A JP 2003084694 A JP2003084694 A JP 2003084694A JP 2003084694 A JP2003084694 A JP 2003084694A JP 2004000176 A JP2004000176 A JP 2004000176A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- saccharomyces
- hydroxyketone
- optically active
- yeast
- pyruvate decarboxylase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】微生物を用いてより高収率で経済的に、光学活性α−ヒドロキシケトンを製造する。
【解決手段】本発明の課題は微生物に酵母のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子を組み込み、高発現させた微生物を培養して、ピルビン酸と式（１）
Ｒ１−ＣＨＯ ・・・（１）
（ここで、Ｒ１ は、水素、炭素数１から１０のアルキル基、アリール基、アルケニル基を表す。）
で表されるアルデヒドを培養液中に添加することを特徴とする
式（２）
Ｒ１−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＯ−ＣＨ３ ・・・（２）
（ここで、Ｒ１ は、水素、炭素数１から１０のアルキル基、アリール基、アルケニル基を表す。）
で表わされる光学活性α−ヒドロキシケトンを高効率に製造することによって解決される。
【選択図】なし
【解決手段】本発明の課題は微生物に酵母のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子を組み込み、高発現させた微生物を培養して、ピルビン酸と式（１）
Ｒ１−ＣＨＯ ・・・（１）
（ここで、Ｒ１ は、水素、炭素数１から１０のアルキル基、アリール基、アルケニル基を表す。）
で表されるアルデヒドを培養液中に添加することを特徴とする
式（２）
Ｒ１−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＯ−ＣＨ３ ・・・（２）
（ここで、Ｒ１ は、水素、炭素数１から１０のアルキル基、アリール基、アルケニル基を表す。）
で表わされる光学活性α−ヒドロキシケトンを高効率に製造することによって解決される。
【選択図】なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法に関する。光学活性α−ヒドロキシケトンは、各種医農薬、香料などの重要な合成原料であり、さらに安価に製造し得れば、種々の合成原料に使用され得る。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性α−ヒドロキシケトンに含まれる、Ｌ−フェニルアセチルカルビノールは、古くはベンズアルデヒドからパン酵母により生成するノイベルグ法や、ベンズアルデヒドとアセトアルデヒドまたはピルビン酸からサッカロマイセス属及びキャンディダ属などの酵母やザイモモナス属の細菌などにより、生成することが知られている。（ＷＯ９００４６３１，Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ，１（４），３２１−３１（１９８８）など）。
【０００３】
ザイモモナス属のピルビン酸脱炭酸酵素の改変酵素を用いたアシロインの生成方法については、特表平１１−５０５７１０号公報に開示されている。また、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのピルビン酸脱炭酸酵素の遺伝子（ＰＤＣ遺伝子）を発現ベクターを用いて増強たという報告（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９８ ２１３３−４０）があるが、これらの微生物を用いて光学活性α−ヒドロキシケトンを製造したという報告はない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
かかる従来法は収率、収量の点で満足いくものではなかった。本発明の課題は、酵母のピルビン酸脱炭酸酵素を発現ベクターを用いて増強することによって、得られた微生物によるα−ヒドロキシケトンの高効率な工業的製造方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題点を解決するため、さらに生産性の高い光学活性α−ヒドロキシケトンの製法について鋭意研究した結果、微生物に酵母由来のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子を組み込むことにより、α−ヒドロキシケトンの蓄積濃度、生成収率が著しく向上することを見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明は酵母のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子を導入した微生物と、ピルビン酸及び／又はピルビン酸塩、及び式（１）
Ｒ１−ＣＨＯ ・・・（１）
（ここで、Ｒ１ は、水素、炭素数１から１０のアルキル基、アリール基、アルケニル基を表す。）
で表されるアルデヒドを用いることを特徴とする
式（２）
Ｒ１−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＯ−ＣＨ３ ・・・（２）
（ここで、Ｒ１ は、水素、炭素数１から１０のアルキル基、アリール基、アルケニル基を表す。）
で表わされる光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法。
【０００６】
【発明の実施の形態】
ピルビン酸とα−ケト酸からはピルビン酸脱炭酸酵素の縮合作用により、α−ヒドロキシケトンが生成する。
【０００７】
本発明で用いられるピルビン酸及び／又はピルビン酸塩は、それらの純品乃至は混合物を添加しても良いし、本発明の製造方法過程で、他の成分から生成するものであっても良い。例えば、培養液中の栄養分を元に当該微生物乃至はその他の微生物の作用やその他の物理・化学的作用により誘導されるものであっても良い。又、ピルピン酸塩とは、特に限定されるものではないが、その陽イオンは、好ましくは金属元素（より好ましくはアルカリ金属又はアルカリ土類金属、更に好ましくはナトリウム、カリウム、マグネシウム）であるものである。
【０００８】
又、本発明で用いられるアルデヒドとは、前記式（１）の構造を有し、Ｒ１ は、水素、炭素数１から１０のアルキル基、アリール基、又はアルケニル基、或いはそれらが組み合わされたもので表されるアルデヒドならば特に限定されるものではなく、所望する光学活性α−ヒドロキシケトンに対応するものを用いる。例えば、ベンズアルデヒド、ヒドロキシベンズアルデヒド、アニスアルデヒド、プロピオンアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、ケイ皮アルデヒド、フラフールなどが挙げられる。
【０００９】
本発明の製造方法により得られる光学活性α−ヒドロキシケトンとは、式（２）で表され、Ｒ１ は、水素、炭素数１から１０のアルキル基、アリール基、又はアルケニル基、或いはそれらが組み合わされたもので表されるケトンならば特に限定されるものではない。
【００１０】
なお、本発明で得られる光学活性α−ヒドロキシケトンの立体配置は、通常、Ｒ１ がフェニル基の場合のＬ−フェニルアセチルカルビノールと同じ立体配置であるＬ体（旋光度マイナス）である。
【００１１】
本発明に使用する宿主微生物は、遺伝子導入が可能な微生物であるならば特に制限はない。好ましくは、酵母または細菌があげられる。
【００１２】
酵母としては、特に、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母が好ましい。さらに好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり、これ以外にもサッカロマイセス・エリプソイデウス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ）またはサッカロマイセス・ディアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）である。
【００１３】
細菌としては、特に、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の細菌が好ましい。さらに好ましくは、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。これらの菌は、主ベクター系が確立されており、遺伝子の発現効率が高いなどの特徴がある。
【００１４】
また、他に薬剤に対する耐性、栄養要求性などの性質があってもよく、遺伝子導入が可能な微生物はすべて本発明に含まれる。
【００１５】
宿主に組み込むべきピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子は、宿主によって発現され、ピルビン酸脱炭酸酵素としての活性が保持されるならば特に制限はないが、酵母由来のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子が好ましい。酵母のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子としてはサッカロマイセス属が好ましく、特に好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・エリプソイデウス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ）、サッカロマイセス・ディアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）などの遺伝子があげられる。
【００１６】
ピルビン酸脱炭酸酵素の取得方法としては特に制限はなく、ＰＣＲ法、ゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニング法などが用いられる。
【００１７】
取得した遺伝子は適当な発現ベクターに組み込み、宿主内に導入する。導入方法としては特に制限はないが、例えば酵母の場合はプロトプラスト法、塩化リチウム法、エレクトロポレーション法などが用いられる。また、大腸菌の場合は塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００１８】
用いられる発現ベクターのタイプについては宿主細胞中で安定に維持されるものであれば特に制限はない。例えば酵母においては、酵母内在性の２μプラスミドの複製起点を持つＹＥｐ型ベクター、酵母染色体の複製起点を持つＹＲｐ型ベクター、酵母染色体の複製起点及びセントロメア配列を持つＹＣｐ型ベクター、酵母染色体の複製起点及びテロメア配列を持つＹＬｐ型ベクター、酵母中での複製起点を持たないＹＩｐ型ベクターなどが適宜用いられるが、発現ベクターを安定に保持するためにはＹＩｐ型ベクターを用いることが好ましい。また、大腸菌の場合はｐＢＲ３２２及びそれに派生するｐＵＣベクターなどが挙げられる。
【００１９】
ピルビン酸脱炭酸酵素を発現させるためのプロモーターについては、宿主細胞においてピルビン酸脱炭酸酵素が発現される限り特に制限はない。例えば酵母においてはアルコール脱水素酵素１（ＡＤＨ１）遺伝子、抑制性酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５）遺伝子等があげられる。構成的に発現するプロモーターを用いても良いし、誘導性プロモーターを用いることも可能である。また大腸菌においてはβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７）遺伝子等があげられる。
【００２０】
なお、組み込む遺伝子の由来菌株と、組み込まれる宿主菌株が同一であっても、α−ヒドロキシケトンの生産性は向上する。これは、遺伝子導入により、元から宿主菌体にあった遺伝子と合わせて、遺伝子数が増加するため、遺伝子により産出されるピルビン酸脱炭酸酵素の生産が増大するためであると推定される。
【００２１】
本発明における培養方法について説明する。培地は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を含有する通常の培地である。
【００２２】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、糖蜜などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸のごとき有機酸、メタノール、エタノール、グリセロールのごときアルコール類などを１〜１５％、窒素源として、酢酸アンモニウムのごとき有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウムのごとき無機アンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア水、尿素等を０．１〜４．０％、有機微量成分としては、ビオチン等の被要求性物質が０．００００００１％〜０．１％、また必要に応じて、コーンスティープリカー、ペプトン、酵母エキス等０〜５％をそれぞれ適当に含有する培地が用いられる。これらの他に、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸第１鉄、等が微量成分として添加される。さらに、必要に応じてチアミン、ナイアシン、ピリドキシン、ビオチンなどの要求ビタミン、またはこれらを含有する酵母エキス、コーンスチープリカー、その他の天然物を添加した培地を使用すればよい。好ましくは消泡剤なども添加し、培養条件の安定化をはかる。培養は通常、好気条件で行う。
【００２３】
培養中は、ｐＨの低下が起こるので炭酸カルシウム、苛性ソーダ、苛性カリなどのアルカリでｐＨ３〜８．５に調節することが有効である。
【００２４】
この培養液、培養液から得られた菌体、もしくはそれらの処理物に前記式（１）で表されるアルデヒドを、好ましくは０．５〜５重量％、さらに好ましくは１〜２重量％，及びピルビン酸を１〜５重量％、さらに好ましくは１〜２重量％を添加する。その後、好ましくは５〜７２時間、さらに好ましくは５〜３０時間反応する。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。なお、各実施例では、形質転換の効果を確認するために遺伝子組み替え前の宿主の評価結果も付記した。
【００２６】
実施例１
（１）ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子のクローニング
宿主細胞のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子のクローニングを行った。
【００２７】
公知となっているピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子の塩基配列はデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）の配列を元に、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）用のＰＣＲプライマーを設計した。ＰＣＲに用いたプライマーの配列は配列表１、配列表２に示した。
【００２８】
これらのプライマーを用い、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＩＦＯ１１３６株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、１６７１塩基対の増幅断片を得た。
【００２９】
（２）発現ベクターの作製
前項（１）で増幅したＤＮＡ断片を酵母中で発現するＡＤＨプロモーターに連結し、市販の酵母用ベクターであるｐＡＵＲ１２３（宝酒造社製）のＳｍａＩ切断部位に導入し、ピルビン酸脱炭酸酵素発現ベクターｐＥＮ５０１を作製した（図１）。挿入した増幅断片の塩基配列を確認した結果、この増幅断片が実際にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子をコードしていることを確認した。
【００３０】
（３）宿主への発現ベクターの導入
前項（２）で作製した発現ベクターｐＥＮ５０１をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＩＦＯ１１３６株（ＡＴＣＣ２６１０８）に酢酸リチウム法を用いて導入した。
【００３１】
発現ベクターを導入後、組換え酵母の選択は抗生物質であるオーレオバシジン耐性を指標に行い、形質転換体を得た。この形質転換株をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＥＮ５０１−１７株と命名した。
【００３２】
（４）形質転換株によるピルビン酸脱炭酸酵素の発現
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＩＦＯ１１３６株、およびこの形質転換株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＥＮ５０１−１７株を各々ＬＢ培地〔トリプトン １０ｇ／ｌ 酵母エキス ５ｇ／ｌ ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ〕５ｍｌに一白金耳植菌し、３０℃で、２４時間振とうして前培養した。予め１１５℃１０分蒸気滅菌したＧＰ培地〔組成：ブドウ糖 ２０ｇ、酵母エキス ２ｇ、硫酸マグネシウム ０．５ｇ、ポリペプトン（カゼイン製ペプトン） ５ｇ、リン酸二水素カリウム １ｇ、蒸留水 １Ｌ、ｐＨ５．６〜５．８〕
５０ｍｌを含む５００ｍｌ容の三角フラスコ２本に植え継ぎ、１８０ｒｐｍ、振幅３０ｃｍの条件下で２４時間培養した。その後遠心分離を用いて菌体を回収し、以下の実験に用いた。
【００３３】
上記の遠心分離した菌体の懸濁液を調整し、終濃度が以下の組成、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド１００ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム２００ｍＭ、チアミンピロリン酸０．１ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０５ｍＭであり、リン酸二水素カリウム緩衝液によりｐＨ６．５に調製した１００ｍｌの酵素反応液を調整し、３０℃で１０時間反応させた。反応液中のｐ−ヒドロキシフェニルアセチルカルビノールの濃度をＨＰＬＣで分析した結果を表１に示す。
実施例２
ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドのかわりにｍ−メトキシベンズアルデヒドを用いる以外は、実施例１と同様に実験し、生成しｍ−メトキシフェニルアセチルカルビノールの濃度をＨＰＬＣで分析した結果を表２に示す。
実施例３
ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドのかわりにｐ−メチルベンズアルデヒドを用いる以外は、実施例１と同様に実験し、生成しｐ−メチルフェニルアセチルカルビノールの濃度をＨＰＬＣで分析した結果を表１示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】
（得られたα−ヒドロキシケトンはいずれもＬ体のみであった。）
実施例４
（１）ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子のクローニング
配列表３，４で表される配列を有するプライマーを使用して実施例１と同様にして増幅したＤＮＡ断片を得た。
【００３６】
（２）発現ベクターの作製
前項（１）で増幅したＤＮＡ断片を酵母中で発現するＴ７プロモーターに連結し、市販の酵母用ベクターであるｐＥＴ１６−ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ切断部位に導入し、ピルビン酸脱炭酸酵素発現ベクターｐＥＮ５０９を作製した（図２）。
【００３７】
（３）宿主への発現ベクターの導入
前項（２）で作製した発現ベクターｐＥＮ５０９をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１株（宝酒造株式会社）に塩化カルシウム法を用いて導入した。
【００３８】
発現ベクターを導入後、組換え体の選択は抗生物質であるアンピシリン耐性を指標に行い、形質転換体を得た。この形質転換株をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＥＮ５０９−３０株と命名した。
【００３９】
４）形質転換株によるピルビン酸脱炭酸酵素の発現
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１株、および形質転換株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＥＮ５０９−３０株を培養した。すなわち、これらの菌株をＬＢ培地５ｍｌに１白金耳植菌し、３０℃で１６時間振とうして前培養した。
【００４０】
次に、ＬＢ培地５０ｍｌを含む５００ｍｌの三角フラスコに入れ、予め１２０℃、２０分間蒸気滅菌した。この培地に前培養した上記菌株を植え継ぎ、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で５時間培養後、遺伝子発現誘導物質ＩＰＴＧを加１０時間培養した。その後遠心分離を用いて菌体を回収し、以下の実験に用いた。
【００４１】
遠心分離した菌体の懸濁液を調整し、終濃度が以下の組成、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド５０ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム１００ｍＭ、チアミンピロリン酸０．１ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０５ｍＭであり、リン酸二水素カリウム緩衝液によりｐＨ６．５に調製した１００ｍｌの酵素反応液を調整し、３０℃で６時間反応させた。反応液中のｐ−ヒドロキシフェニルアセチルカルビノールの濃度をＨＰＬＣで分析した結果を表２に示す。
実施例５
ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドのかわりにｍ−メトキシベンズアルデヒドを用いる以外は、実施例４と同様に実験し、生成しｍ−メトキシフェニルアセチルカルビノールの濃度をＨＰＬＣで分析した結果を表２に示す。
実施例６
ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドのかわりに２，６−ジクロロベンズアルデヒドを用いる以外は、実施例４と同様に実験し、生成し２，６−ジクロロフェニルアセチルカルビノールの濃度をＨＰＬＣで分析した結果を表２に示す。
【００４２】
【表２】
【００４３】
（得られたα−ヒドロキシケトンはいずれもＬ体のみであった。）
実施例７〜９
ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドのかわり表３に示すベンズアルデヒド誘導体を各々用いる以外は、実施例１と同様に実験し、生成したフェニルアセチルカルビノール誘導体の濃度をＨＰＬＣで分析した結果を表３に示す。
【００４４】
【表３】
【００４５】
（得られたα−ヒドロキシケトンはいずれもＬ体のみであった。）
実施１０〜１２
ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドのかわり表４に示すベンズアルデヒド誘導体を各々用いる以外は、実施例４と同様に実験し、生成したフェニルアセチルカルビノール誘導体の濃度をＨＰＬＣで分析した結果を表４に示す。
【００４６】
【表４】
【００４７】
（得られたα−ヒドロキシケトンはいずれもＬ体のみであった。）
【００４８】
【発明の効果】
本発明の微生物を用い、α−ヒドロキシケトンを生産すると、既存の方法に比較してより経済的なα−ヒドロキシケトンの生産が可能となる。
【００４９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ピルビン酸脱炭酸酵素発現ベクターｐＥＮ５０１のフィジカルマップを示す図である。
【図２】ピルビン酸脱炭酸酵素発現ベクターｐＥＮ５０９のフィジカルマップを示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法に関する。光学活性α−ヒドロキシケトンは、各種医農薬、香料などの重要な合成原料であり、さらに安価に製造し得れば、種々の合成原料に使用され得る。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性α−ヒドロキシケトンに含まれる、Ｌ−フェニルアセチルカルビノールは、古くはベンズアルデヒドからパン酵母により生成するノイベルグ法や、ベンズアルデヒドとアセトアルデヒドまたはピルビン酸からサッカロマイセス属及びキャンディダ属などの酵母やザイモモナス属の細菌などにより、生成することが知られている。（ＷＯ９００４６３１，Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ，１（４），３２１−３１（１９８８）など）。
【０００３】
ザイモモナス属のピルビン酸脱炭酸酵素の改変酵素を用いたアシロインの生成方法については、特表平１１−５０５７１０号公報に開示されている。また、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのピルビン酸脱炭酸酵素の遺伝子（ＰＤＣ遺伝子）を発現ベクターを用いて増強たという報告（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９８ ２１３３−４０）があるが、これらの微生物を用いて光学活性α−ヒドロキシケトンを製造したという報告はない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
かかる従来法は収率、収量の点で満足いくものではなかった。本発明の課題は、酵母のピルビン酸脱炭酸酵素を発現ベクターを用いて増強することによって、得られた微生物によるα−ヒドロキシケトンの高効率な工業的製造方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題点を解決するため、さらに生産性の高い光学活性α−ヒドロキシケトンの製法について鋭意研究した結果、微生物に酵母由来のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子を組み込むことにより、α−ヒドロキシケトンの蓄積濃度、生成収率が著しく向上することを見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明は酵母のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子を導入した微生物と、ピルビン酸及び／又はピルビン酸塩、及び式（１）
Ｒ１−ＣＨＯ ・・・（１）
（ここで、Ｒ１ は、水素、炭素数１から１０のアルキル基、アリール基、アルケニル基を表す。）
で表されるアルデヒドを用いることを特徴とする
式（２）
Ｒ１−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＯ−ＣＨ３ ・・・（２）
（ここで、Ｒ１ は、水素、炭素数１から１０のアルキル基、アリール基、アルケニル基を表す。）
で表わされる光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法。
【０００６】
【発明の実施の形態】
ピルビン酸とα−ケト酸からはピルビン酸脱炭酸酵素の縮合作用により、α−ヒドロキシケトンが生成する。
【０００７】
本発明で用いられるピルビン酸及び／又はピルビン酸塩は、それらの純品乃至は混合物を添加しても良いし、本発明の製造方法過程で、他の成分から生成するものであっても良い。例えば、培養液中の栄養分を元に当該微生物乃至はその他の微生物の作用やその他の物理・化学的作用により誘導されるものであっても良い。又、ピルピン酸塩とは、特に限定されるものではないが、その陽イオンは、好ましくは金属元素（より好ましくはアルカリ金属又はアルカリ土類金属、更に好ましくはナトリウム、カリウム、マグネシウム）であるものである。
【０００８】
又、本発明で用いられるアルデヒドとは、前記式（１）の構造を有し、Ｒ１ は、水素、炭素数１から１０のアルキル基、アリール基、又はアルケニル基、或いはそれらが組み合わされたもので表されるアルデヒドならば特に限定されるものではなく、所望する光学活性α−ヒドロキシケトンに対応するものを用いる。例えば、ベンズアルデヒド、ヒドロキシベンズアルデヒド、アニスアルデヒド、プロピオンアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、ケイ皮アルデヒド、フラフールなどが挙げられる。
【０００９】
本発明の製造方法により得られる光学活性α−ヒドロキシケトンとは、式（２）で表され、Ｒ１ は、水素、炭素数１から１０のアルキル基、アリール基、又はアルケニル基、或いはそれらが組み合わされたもので表されるケトンならば特に限定されるものではない。
【００１０】
なお、本発明で得られる光学活性α−ヒドロキシケトンの立体配置は、通常、Ｒ１ がフェニル基の場合のＬ−フェニルアセチルカルビノールと同じ立体配置であるＬ体（旋光度マイナス）である。
【００１１】
本発明に使用する宿主微生物は、遺伝子導入が可能な微生物であるならば特に制限はない。好ましくは、酵母または細菌があげられる。
【００１２】
酵母としては、特に、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母が好ましい。さらに好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり、これ以外にもサッカロマイセス・エリプソイデウス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ）またはサッカロマイセス・ディアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）である。
【００１３】
細菌としては、特に、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の細菌が好ましい。さらに好ましくは、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。これらの菌は、主ベクター系が確立されており、遺伝子の発現効率が高いなどの特徴がある。
【００１４】
また、他に薬剤に対する耐性、栄養要求性などの性質があってもよく、遺伝子導入が可能な微生物はすべて本発明に含まれる。
【００１５】
宿主に組み込むべきピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子は、宿主によって発現され、ピルビン酸脱炭酸酵素としての活性が保持されるならば特に制限はないが、酵母由来のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子が好ましい。酵母のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子としてはサッカロマイセス属が好ましく、特に好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・エリプソイデウス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ）、サッカロマイセス・ディアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）などの遺伝子があげられる。
【００１６】
ピルビン酸脱炭酸酵素の取得方法としては特に制限はなく、ＰＣＲ法、ゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニング法などが用いられる。
【００１７】
取得した遺伝子は適当な発現ベクターに組み込み、宿主内に導入する。導入方法としては特に制限はないが、例えば酵母の場合はプロトプラスト法、塩化リチウム法、エレクトロポレーション法などが用いられる。また、大腸菌の場合は塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００１８】
用いられる発現ベクターのタイプについては宿主細胞中で安定に維持されるものであれば特に制限はない。例えば酵母においては、酵母内在性の２μプラスミドの複製起点を持つＹＥｐ型ベクター、酵母染色体の複製起点を持つＹＲｐ型ベクター、酵母染色体の複製起点及びセントロメア配列を持つＹＣｐ型ベクター、酵母染色体の複製起点及びテロメア配列を持つＹＬｐ型ベクター、酵母中での複製起点を持たないＹＩｐ型ベクターなどが適宜用いられるが、発現ベクターを安定に保持するためにはＹＩｐ型ベクターを用いることが好ましい。また、大腸菌の場合はｐＢＲ３２２及びそれに派生するｐＵＣベクターなどが挙げられる。
【００１９】
ピルビン酸脱炭酸酵素を発現させるためのプロモーターについては、宿主細胞においてピルビン酸脱炭酸酵素が発現される限り特に制限はない。例えば酵母においてはアルコール脱水素酵素１（ＡＤＨ１）遺伝子、抑制性酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５）遺伝子等があげられる。構成的に発現するプロモーターを用いても良いし、誘導性プロモーターを用いることも可能である。また大腸菌においてはβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７）遺伝子等があげられる。
【００２０】
なお、組み込む遺伝子の由来菌株と、組み込まれる宿主菌株が同一であっても、α−ヒドロキシケトンの生産性は向上する。これは、遺伝子導入により、元から宿主菌体にあった遺伝子と合わせて、遺伝子数が増加するため、遺伝子により産出されるピルビン酸脱炭酸酵素の生産が増大するためであると推定される。
【００２１】
本発明における培養方法について説明する。培地は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を含有する通常の培地である。
【００２２】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、糖蜜などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸のごとき有機酸、メタノール、エタノール、グリセロールのごときアルコール類などを１〜１５％、窒素源として、酢酸アンモニウムのごとき有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウムのごとき無機アンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア水、尿素等を０．１〜４．０％、有機微量成分としては、ビオチン等の被要求性物質が０．００００００１％〜０．１％、また必要に応じて、コーンスティープリカー、ペプトン、酵母エキス等０〜５％をそれぞれ適当に含有する培地が用いられる。これらの他に、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸第１鉄、等が微量成分として添加される。さらに、必要に応じてチアミン、ナイアシン、ピリドキシン、ビオチンなどの要求ビタミン、またはこれらを含有する酵母エキス、コーンスチープリカー、その他の天然物を添加した培地を使用すればよい。好ましくは消泡剤なども添加し、培養条件の安定化をはかる。培養は通常、好気条件で行う。
【００２３】
培養中は、ｐＨの低下が起こるので炭酸カルシウム、苛性ソーダ、苛性カリなどのアルカリでｐＨ３〜８．５に調節することが有効である。
【００２４】
この培養液、培養液から得られた菌体、もしくはそれらの処理物に前記式（１）で表されるアルデヒドを、好ましくは０．５〜５重量％、さらに好ましくは１〜２重量％，及びピルビン酸を１〜５重量％、さらに好ましくは１〜２重量％を添加する。その後、好ましくは５〜７２時間、さらに好ましくは５〜３０時間反応する。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。なお、各実施例では、形質転換の効果を確認するために遺伝子組み替え前の宿主の評価結果も付記した。
【００２６】
実施例１
（１）ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子のクローニング
宿主細胞のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子のクローニングを行った。
【００２７】
公知となっているピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子の塩基配列はデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）の配列を元に、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）用のＰＣＲプライマーを設計した。ＰＣＲに用いたプライマーの配列は配列表１、配列表２に示した。
【００２８】
これらのプライマーを用い、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＩＦＯ１１３６株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、１６７１塩基対の増幅断片を得た。
【００２９】
（２）発現ベクターの作製
前項（１）で増幅したＤＮＡ断片を酵母中で発現するＡＤＨプロモーターに連結し、市販の酵母用ベクターであるｐＡＵＲ１２３（宝酒造社製）のＳｍａＩ切断部位に導入し、ピルビン酸脱炭酸酵素発現ベクターｐＥＮ５０１を作製した（図１）。挿入した増幅断片の塩基配列を確認した結果、この増幅断片が実際にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子をコードしていることを確認した。
【００３０】
（３）宿主への発現ベクターの導入
前項（２）で作製した発現ベクターｐＥＮ５０１をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＩＦＯ１１３６株（ＡＴＣＣ２６１０８）に酢酸リチウム法を用いて導入した。
【００３１】
発現ベクターを導入後、組換え酵母の選択は抗生物質であるオーレオバシジン耐性を指標に行い、形質転換体を得た。この形質転換株をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＥＮ５０１−１７株と命名した。
【００３２】
（４）形質転換株によるピルビン酸脱炭酸酵素の発現
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＩＦＯ１１３６株、およびこの形質転換株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＥＮ５０１−１７株を各々ＬＢ培地〔トリプトン １０ｇ／ｌ 酵母エキス ５ｇ／ｌ ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ〕５ｍｌに一白金耳植菌し、３０℃で、２４時間振とうして前培養した。予め１１５℃１０分蒸気滅菌したＧＰ培地〔組成：ブドウ糖 ２０ｇ、酵母エキス ２ｇ、硫酸マグネシウム ０．５ｇ、ポリペプトン（カゼイン製ペプトン） ５ｇ、リン酸二水素カリウム １ｇ、蒸留水 １Ｌ、ｐＨ５．６〜５．８〕
５０ｍｌを含む５００ｍｌ容の三角フラスコ２本に植え継ぎ、１８０ｒｐｍ、振幅３０ｃｍの条件下で２４時間培養した。その後遠心分離を用いて菌体を回収し、以下の実験に用いた。
【００３３】
上記の遠心分離した菌体の懸濁液を調整し、終濃度が以下の組成、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド１００ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム２００ｍＭ、チアミンピロリン酸０．１ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０５ｍＭであり、リン酸二水素カリウム緩衝液によりｐＨ６．５に調製した１００ｍｌの酵素反応液を調整し、３０℃で１０時間反応させた。反応液中のｐ−ヒドロキシフェニルアセチルカルビノールの濃度をＨＰＬＣで分析した結果を表１に示す。
実施例２
ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドのかわりにｍ−メトキシベンズアルデヒドを用いる以外は、実施例１と同様に実験し、生成しｍ−メトキシフェニルアセチルカルビノールの濃度をＨＰＬＣで分析した結果を表２に示す。
実施例３
ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドのかわりにｐ−メチルベンズアルデヒドを用いる以外は、実施例１と同様に実験し、生成しｐ−メチルフェニルアセチルカルビノールの濃度をＨＰＬＣで分析した結果を表１示す。
【００３４】
【表１】
（得られたα−ヒドロキシケトンはいずれもＬ体のみであった。）
実施例４
（１）ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子のクローニング
配列表３，４で表される配列を有するプライマーを使用して実施例１と同様にして増幅したＤＮＡ断片を得た。
【００３６】
（２）発現ベクターの作製
前項（１）で増幅したＤＮＡ断片を酵母中で発現するＴ７プロモーターに連結し、市販の酵母用ベクターであるｐＥＴ１６−ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ切断部位に導入し、ピルビン酸脱炭酸酵素発現ベクターｐＥＮ５０９を作製した（図２）。
【００３７】
（３）宿主への発現ベクターの導入
前項（２）で作製した発現ベクターｐＥＮ５０９をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１株（宝酒造株式会社）に塩化カルシウム法を用いて導入した。
【００３８】
発現ベクターを導入後、組換え体の選択は抗生物質であるアンピシリン耐性を指標に行い、形質転換体を得た。この形質転換株をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＥＮ５０９−３０株と命名した。
【００３９】
４）形質転換株によるピルビン酸脱炭酸酵素の発現
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１株、および形質転換株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＥＮ５０９−３０株を培養した。すなわち、これらの菌株をＬＢ培地５ｍｌに１白金耳植菌し、３０℃で１６時間振とうして前培養した。
【００４０】
次に、ＬＢ培地５０ｍｌを含む５００ｍｌの三角フラスコに入れ、予め１２０℃、２０分間蒸気滅菌した。この培地に前培養した上記菌株を植え継ぎ、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で５時間培養後、遺伝子発現誘導物質ＩＰＴＧを加１０時間培養した。その後遠心分離を用いて菌体を回収し、以下の実験に用いた。
【００４１】
遠心分離した菌体の懸濁液を調整し、終濃度が以下の組成、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド５０ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム１００ｍＭ、チアミンピロリン酸０．１ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０５ｍＭであり、リン酸二水素カリウム緩衝液によりｐＨ６．５に調製した１００ｍｌの酵素反応液を調整し、３０℃で６時間反応させた。反応液中のｐ−ヒドロキシフェニルアセチルカルビノールの濃度をＨＰＬＣで分析した結果を表２に示す。
実施例５
ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドのかわりにｍ−メトキシベンズアルデヒドを用いる以外は、実施例４と同様に実験し、生成しｍ−メトキシフェニルアセチルカルビノールの濃度をＨＰＬＣで分析した結果を表２に示す。
実施例６
ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドのかわりに２，６−ジクロロベンズアルデヒドを用いる以外は、実施例４と同様に実験し、生成し２，６−ジクロロフェニルアセチルカルビノールの濃度をＨＰＬＣで分析した結果を表２に示す。
【００４２】
【表２】
（得られたα−ヒドロキシケトンはいずれもＬ体のみであった。）
実施例７〜９
ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドのかわり表３に示すベンズアルデヒド誘導体を各々用いる以外は、実施例１と同様に実験し、生成したフェニルアセチルカルビノール誘導体の濃度をＨＰＬＣで分析した結果を表３に示す。
【００４４】
【表３】
（得られたα−ヒドロキシケトンはいずれもＬ体のみであった。）
実施１０〜１２
ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドのかわり表４に示すベンズアルデヒド誘導体を各々用いる以外は、実施例４と同様に実験し、生成したフェニルアセチルカルビノール誘導体の濃度をＨＰＬＣで分析した結果を表４に示す。
【００４６】
【表４】
（得られたα−ヒドロキシケトンはいずれもＬ体のみであった。）
【００４８】
【発明の効果】
本発明の微生物を用い、α−ヒドロキシケトンを生産すると、既存の方法に比較してより経済的なα−ヒドロキシケトンの生産が可能となる。
【００４９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ピルビン酸脱炭酸酵素発現ベクターｐＥＮ５０１のフィジカルマップを示す図である。
【図２】ピルビン酸脱炭酸酵素発現ベクターｐＥＮ５０９のフィジカルマップを示す図である。
Claims (9)
- 酵母のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子を導入した微生物と、ピルビン酸及び／又はピルビン酸塩、及び式（１）
Ｒ１−ＣＨＯ ・・・（１）
（ここで、Ｒ１ は、水素、炭素数１から１０のアルキル基、アリール基、アルケニル基を表す。）
で表されるアルデヒドを用いることを特徴とする
式（２）
Ｒ１−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＯ−ＣＨ３ ・・・（２）
（ここで、Ｒ１ は、水素、炭素数１から１０のアルキル基、アリール基、アルケニル基を表す。）
で表わされる光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法。 - 請求項１記載の微生物において、その培養液もしくは得られた菌体、またはそれらの処理物を用いることにより前記式（２）で表わされる光学活性α−ヒドロキシケトンを採取することを特徴とする光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法。
- ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子を導入した微生物がサッカロマイセス属に属する酵母である請求項１又は２に記載の光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法。
- 該サッカロマイセス属に属する酵母がサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・エリプソイデウス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ）またはサッカロマイセス・ディアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）であるところの請求項３に記載の光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法。
- ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子を導入した微生物が細菌であることを特徴とする請求項１または２に記載の光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法。
- 該細菌がエシェリシア属に属する細菌であるところの請求項５に記載の光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法
- 該エシェリシア属に属する細菌がエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）であるところの請求項６に記載の光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法
- 酵母のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子がサッカロマイセス属由来であるところのピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子である請求項１から７のいずれか１項に記載の光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法。
- ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子がサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはサッカロマイセス・エリプソイデウス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ）またはサッカロマイセス・ディアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）由来であるところの請求項８に記載の光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003084694A JP2004000176A (ja) | 2002-03-29 | 2003-03-26 | 光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002095964 | 2002-03-29 | ||
| JP2003084694A JP2004000176A (ja) | 2002-03-29 | 2003-03-26 | 光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004000176A true JP2004000176A (ja) | 2004-01-08 |
Family
ID=30446400
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003084694A Pending JP2004000176A (ja) | 2002-03-29 | 2003-03-26 | 光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2004000176A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007077141A1 (de) * | 2006-01-06 | 2007-07-12 | Basf Aktiengesellschaft | Verfahren zur herstellung substituierter phenylacetylcarbinole |
-
2003
- 2003-03-26 JP JP2003084694A patent/JP2004000176A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007077141A1 (de) * | 2006-01-06 | 2007-07-12 | Basf Aktiengesellschaft | Verfahren zur herstellung substituierter phenylacetylcarbinole |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7405068B2 (en) | Pyruvate producing yeast strain | |
| US8728780B2 (en) | Process for producing hydroxycarboxylic acid | |
| US20150218600A1 (en) | Biotechnological preparation of 3-hydroxyisobutyric acid | |
| JP2010506585A (ja) | 高収率でグルタミン酸を生産する微生物およびこれを用いたグルタミン酸生産方法 | |
| EP2532751A1 (en) | Use of inducible promoters in the fermentative production of 1,2-propanediol | |
| JP5496356B2 (ja) | アラビノース代謝経路が導入されたキシリトール生産菌株及びそれを用いたキシリトール生産方法 | |
| US20230084966A1 (en) | Cofactor self-sufficient escherichia coli and construction method and application thereof | |
| KR20140094364A (ko) | 재조합 대장균을 이용하여 3-히드록시프로피온산을 고수율로 생산하는 방법 | |
| JP5243546B2 (ja) | 植物由来原料から乳酸を生産する方法及び乳酸生産細菌 | |
| CN110964686A (zh) | 一种重组变形假单胞菌及其构建方法和应用 | |
| EP1669460B1 (en) | Biocatalyst for producing d-lactic acid | |
| JPWO2010032698A6 (ja) | 植物由来原料から乳酸を生産する方法及び乳酸生産細菌 | |
| JP6798494B2 (ja) | システイン誘導体及びシステインスルホキシド誘導体の製造方法 | |
| JP2002136293A (ja) | 微生物およびｄ−乳酸の製造方法 | |
| JP2004000176A (ja) | 光学活性α−ヒドロキシケトンの製造方法 | |
| EP2255004B1 (en) | Genetically transformed microorganism for biomass fermentation | |
| JP2008283917A (ja) | 乳酸の製造方法 | |
| WO2006078132A1 (en) | Escherichia strain capable of converting xmp to gmp and maintaining the inactivated state of gene(s) associated with gmp degradation and methods of using the same | |
| CN114045297A (zh) | 一种硫胺素相关蛋白基因的用途 | |
| JP2005102625A (ja) | Ｄ−乳酸製造法 | |
| JP5929895B2 (ja) | 乳酸の製造方法及び発酵賦活剤 | |
| JP2008301766A (ja) | 乳酸製造用培地及び乳酸の製造方法 | |
| JP5057727B2 (ja) | ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子、ニトリラーゼ遺伝子を含む形質転換体、並びにそれを用いたα−ヒドロキシカルボン酸の製造法 | |
| WO2006109632A1 (ja) | 新規α－ケト酸還元酵素、その遺伝子、およびその利用法 | |
| JP4729919B2 (ja) | 微生物の培養方法及び光学活性カルボン酸の製造方法 |