JP2003534814A

JP2003534814A - 熱帯熱マラリア原虫環状体期感染赤血球の細胞接着に関与しているタンパク質、該タンパク質と結合する抗体、及び感染、感染期を検出する方法、並びに感染から防御するためのワクチン

Info

Publication number: JP2003534814A
Application number: JP2002500932A
Authority: JP
Inventors: ギシン，ユルク; プーヴェル，ブルーノ; シェルフ，アルトゥール; ビュフェ，ピエール
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille
Priority date: 2000-05-31
Filing date: 2001-05-30
Publication date: 2003-11-25
Also published as: WO2001092321A3; AU2001277513B2; WO2001092321A2; US20050054828A1; AU7751301A; US20040018569A1; US20020055183A1; CA2410051A1; EP1284995A2; US7431936B2; US20060240491A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、赤血球の環状体期感染中の熱帯熱マラリア原虫の細胞接着に関与しているＲＳＰ−１タンパク質及びＲＳＰ−２タンパク質、該タンパク質と結合する抗体、熱帯熱マラリア原虫感染のスクリーニング法、熱帯熱マラリア原虫の感染期を決定する方法、及びマラリア原虫種感染から個体を防御するためのワクチンを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景発明の分野本発明は、赤血球の環状体期感染における熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium f
alciparum）の細胞接着に関与しているＲＳＰ−１タンパク質及びＲＳＰ−２タ
ンパク質、該タンパク質と結合する抗体、熱帯熱マラリア原虫感染のスクリーニ
ング法、熱帯熱マラリア原虫の感染期を決定する方法、並びにマラリア原虫種感
染から個体を防御するためのワクチンを提供する。

【０００２】背景の説明熱帯熱マラリア原虫感染に特徴的な一般的な病理学的特徴は、成熟期感染赤血
球（ＩＥ）の、宿主の内皮及び栄養膜合胞体層への細胞接着である。脳微小血管
又は胎盤におけるＩＥの大量蓄積は、重症型マラリアと強く相関している¹。Ｉ
Ｅの胎盤ＣＳＡとの広範囲の結合は、妊娠中の生理病理学と関連している^2,3。
ＩＥの接着表現型は、赤血球表面のＰＯＥＭＰ１の出現と相関しており（メロゾ
イト侵入のおよそ１６時間後）、従って末梢血中には、初期血中期（環状体期）
ＩＥのみが見られる。ここで、本発明者らは、血中期ＩＥ生物学の既存の見解を
覆す結果を記載する。本発明者らは、初期環状体期における、脳及び肺に由来す
る内皮細胞系、並びに胎盤栄養膜合胞体層へのＩＥの特異的接着を証明する。こ
れらＩＥの血中期発達の後期には、栄養体が、排他的なコンドロイチン硫酸Ａ（
ＣＳＡ）細胞接着表現型へと転換する。従って、個々の内皮細胞又は栄養膜合胞
体層への接着は、血中期サイクルの間中起こることができ、このことは、マラリ
ア患者には非循環（潜在性）寄生体亜集団が存在することを示唆している。本発
明者らは、環状体期ＩＥ表面上の２つの新規な寄生体タンパク質を検出した。こ
れらのタンパク質は、ＰｆＥＭＰ１により媒介される接着の開始直後に消失する
。これらのデータは、疫学研究、寄生体組織親和性、及びマラリア疾患の結果に
とって重要な意義を有している。

【０００３】発明の概要従って、本発明の目的は、内皮細胞への熱帯熱マラリア原虫環状体期接着を媒
介し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定されるサイズがお
よそ２００キロダルトンである、単離されたＲＳＰ−１タンパク質である。

【０００４】本発明のもう一つの目的は、内皮細胞への熱帯熱マラリア原虫環状体期接着を
媒介し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定されるサイズが
およそ４０キロダルトンである、単離されたＲＳＰ−２タンパク質である。

【０００５】本発明のもう一つの目的は、ＲＳＰ−１又はＲＳＰ−２と結合する抗体である
。

【０００６】本発明のもう一つの目的は、試料をＲＳＰ−１抗体又はＲＳＰ−２抗体と接触
させること、及び抗体と試料中のマラリア原虫種との間の相互作用を同定し、該
相互作用をマラリア原虫種の存在の指標とすることを含む、試料中のマラリア原
虫種の存在を検出する方法（ここで、好ましくは、マラリア原虫種は熱帯熱マラ
リア原虫である）である。

【０００７】本発明のもう一つの目的は、試料を単離されたＲＳＰ−１タンパク質又はＲＳ
Ｐ−２タンパク質と接触させること；及びタンパク質と試料中のマラリア原虫抗
体との間の相互作用を同定し、該相互作用をマラリア原虫の存在の指標とするこ
とを含む、試料中のマラリア原虫抗体の存在を検出する方法（ここで、好ましく
は、マラリア原虫種は熱帯熱マラリア原虫である）である。

【０００８】本発明のもう一つの目的は、個体から生物学的試料を得ること；該試料をＲＳ
Ｐ−１抗体及び／又はＲＳＰ−２抗体と接触させること；並びに抗体と該試料中
の抗原との間の相互作用を同定し、該相互作用を環状体期感染の指標とすること
を含む、熱帯熱マラリア原虫に感染していると推測される個体において熱帯熱マ
ラリア原虫血中期サイクルを診断する方法である。

【０００９】本発明のもう一つの目的は、個体から生物学的試料を得ること；該試料をＲＳ
Ｐ−１タンパク質又はＲＳＰ−２タンパク質と接触させること；並びにタンパク
質と該試料中の抗体との間の相互作用を同定し、該相互作用を環状体期感染の指
標とすることを含む、熱帯熱マラリア原虫に感染していると推測される個体にお
いて熱帯熱マラリア原虫血中期サイクルを診断する方法である。

【００１０】本発明のもう一つの目的は、単離されたＲＳＰ−１タンパク質及び／又はＲＳ
Ｐ−２タンパク質と、医薬的に許容される担体とを含む免疫原性組成物であり、
さらなる目的は、ワクチンであるそのような免疫原性組成物である。

【００１１】本発明のもう一つの目的は、個体において免疫応答を誘導するのに十分な量の
ＲＳＰ−１及び／又はＲＳＰ−２を個体へ投与することを含む、熱帯熱マラリア
原虫から個体を防御する方法である。

【００１２】発明の詳細な説明本明細書において言及された特許及び出版物は、全て、本発明と共に使用され
うる、その中に報告されたタンパク質、酵素、ベクター、宿主細胞、及び方法論
の記載及び開示の目的のため、法律的に可能な程度に、参照として本明細書に組
み込まれる。しかしながら、それらは、本発明が、先行発明のため、そのような
開示に先行している権利を有しないことの承認として解釈されるべきではない。

【００１３】本発明のＲＳＰ−１タンパク質及びＲＳＰ−２タンパク質は、硫安のような物
質による選択的な沈殿、カラムクロマトグラフィー、免疫精製法等を含む、当分
野において周知の標準的な技術によって実質的な純度にまで精製されうる。例え
ば、R.Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Ve
rlag: New York(1982) を参照のこと。

【００１４】さらに、本発明の精製されたタンパク質が与えられれば、当業者は、アミノ酸
配列を得、それからＲＳＰ−１タンパク質及びＲＳＰ−２タンパク質をコードす
るポリヌクレオチド配列を得ることができるであろう。タンパク質配列決定及び
ポリヌクレオチド配列単離のための方法は、当分野において既知であり、精製さ
れたタンパク質のアミノ酸配列に由来するプライマーを使用したポリヌクレオチ
ド増幅を含む。これら及びその他の方法は、Greene Publishing Associates, In
c.とJohn Wiley&Sons, Incとの共同出版である、Current Protocols in Molecula
r Biology, F.M.Ausebel et al.編, Current Protocols(2000)、及びManiatis et
al.Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 19
88に開示されている。

【００１５】ＲＳＰ−１タンパク質及びＲＳＰ−２タンパク質をコードするポリヌクレオチ
ド配列が得られた後は、トランスフェクトされた細胞における遺伝子の発現のた
めの組換え発現ベクター中にポリヌクレオチド配列が構築されうる。これらの目
標を達成するための分子クローニング技術は、当分野において既知である。組換
え核酸の構築に適した極めて多様なクローニング及びin vitro増幅の方法が、当
業者に周知である。多くのクローニング演習を通して当業者を指導するために十
分なこれらの技術及び説明の例は、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cl
oning Techniques, Methods in Enzymology, 第152巻, Academic Press, inc.,
San Diego, Calif.(Berger);及びGreene Publishing Associates, Inc.とJohn W
iley&Sons, Incとの共同出版である、Current Protocols in Molecular Biology,
F.M.Ausebel et al.編, Current Protocols(2000)に見出される。

【００１６】本発明において使用されうる細胞培養物は、細胞系を含み、組織又は血液試料
に由来する培養細胞は当分野において周知である。Freshney(Culture of Animal
Cells, a Manual of Basic Technique, 第3版, Wiley-Liss, New York(1994))
及びその中に引用された参照は、細胞の培養に関する一般的な指針を与える。

【００１７】組換えＤＮＡ技術によって作製されたタンパク質は、当業者に周知の標準的な
技術によって精製されうる。これらのタンパク質は、直接発現させられてもよい
し、又は融合タンパク質として発現されられてもよい。次いで、細胞溶解（例え
ば、超音波処理）とアフィニティクロマトグラフィとの組み合わせにより、タン
パク質が精製されうる。融合産物の場合、その後の適当なタンパク分解酵素によ
る融合タンパク質の消化が、ＲＳＰ−１タンパク質配列又はＲＳＰ−２タンパク
質配列を放出する。

【００１８】本発明のタンパク質は、ＲＳＰ−１又はＲＳＰ−２に特異的なモノクローナル
抗体を作製するために使用されうる。抗体は、マラリア感染の診断のため、又は
メロゾイトの赤血球との結合を阻害する治療剤として、使用されうる。所望の抗
原に対するモノクローナル抗体の作製は、当業者に周知である。従って、様々な
免疫グロブリン分子の作製及び操作のための当業者に利用可能な多数の技術が、
結合を阻害するために容易に適用されうる。本明細書において使用されるように
、「免疫グロブリン」及び「抗体」という用語は、免疫グロブリン遺伝子によっ
て実質的にコードされた１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質をさす。免
疫グロブリンは、抗体に加えて、例えばＦｖ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ）₂を含む
様々な形態で、そして単鎖として存在してもよい。

【００１９】本発明のタンパク質と結合する抗体は、多様な手段によって作製されうる。非
ヒト、例えば、マウス、ウサギ、ウマ等のモノクローナル抗体の作製は周知であ
り、例えば、ポリペプチドを含有している調製物で動物を免疫感作することによ
り達成されうる。免疫感作された動物から得られた抗体産生細胞が、不死化され
スクリーニングされる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を作製する
方法は、当業者に既知である。例えば、Coligan(1991)Current Protocols in Im
munology Wiley/Greene, N.Y.; 及びHarlow and Lane(1989)Antibodies: A Labo
ratory Manual Cold Spring Harbor Press, N.Y.を参照のこと。特異的なモノク
ローナル抗体及びポリクローナル抗体は、通常、少なくとも約０．1mM、より一
般的には少なくとも約１μM、より好ましくは少なくとも約０．１μM、又はそれ
未満のＫｄで結合するであろう。

【００２０】本発明は、ハイブリドーマ、特に２００１年２月２３日に受託番号Ｉ−２６３
５の下でＣＮＣＭ（Paris, France）に寄託されたＰｆ２６Ｇ１／Ｂ４という名
称のハイブリドーマにも関する。

【００２１】このハイブリドーマは、コンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳＡ）細胞接着表現型に特
異的である。それは、環状体感染赤血球表面の天然熱帯熱マラリア原虫タンパク
質とは反応するが、成熟した栄養体及び分裂体に感染した赤血球とは反応しない
モノクローナル抗体Ｂ４を分泌する。Ｂ４は、環状体感染赤血球の接着を阻害し
、メロゾイトによる赤血球の再侵入も阻害する。

【００２２】本発明のタンパク質及びポリヌクレオチドは、生物学的試料中のマラリア原虫
寄生体又は核酸の検出のための診断的適用において使用されうる。寄生体の存在
は、免疫学的結果に基づく、いくつかのよく認識されている特異的結合アッセイ
を使用して検出されうる。例えば、発明のポリペプチドに対する標識された抗体
は、生物学的試料中のマラリア原虫を検出するために使用されうる。又は、本発
明の標識されたポリペプチドが、生物学的試料中のＲＳＰ−１又はＲＳＰ−２に
対する抗体の存在を検出するために使用されうる。診断イムノアッセイの一般的
な手法の概説については、Basic and Clinical Immunology, 第7版(D.Stites an
d A.Terr編)1991を参照のこと。

【００２３】さらに、ＲＳＰ−１及びＲＳＰ−２と赤血球との間の相互作用を阻害すること
ができる修飾されたポリペプチド、抗体、又はその他の化合物が、生物学的活性
に関してアッセイされうる。例えば、下記のようにして、ポリペプチドを細胞表
面上に組換え発現させ、細胞の赤血球との結合能を測定することができる。又は
、ペプチド又は抗体が、赤血球とマラリア原虫及び／又はＲＳＰ−１及び／又は
ＲＳＰ−２との間の結合を阻害する能力に関して試験されうる。

【００２４】無細胞アッセイを、ＲＳＰ−１ポリペプチド又はＲＳＰ−２ポリペプチドの結
合を測定するために使用することもでき、例えば、試料を固体表面上に固定化し
、標識されたＲＳＰ−１又はＲＳＰ−２の結合を決定することができる。多くの
アッセイ形式が、標識されたアッセイ成分を利用する。標識システムは、多様な
形態であり得る。標識（検出可能部）は、当分野において周知の方法に従い、所
望のアッセイ成分に直接的又は間接的にカップリングされうる。極めて多様な標
識が使用されうる。成分は、いくつかの方法のうちの任意のものによって標識さ
れうる。最も一般的な検出法は、³Ｈ、¹²⁵Ｉ、³⁵Ｓ、¹⁴Ｃ、又は³²Ｐで標識され
た化合物等を用いたオートラジオグラフィーの使用である。非放射性標識は、標
識された抗体と結合するリガンド、フルオロフォア、化学発光剤、酵素、及び標
識されたリガンドに対する特異的な結合対メンバーとして機能しうる抗体を含む
。標識の選択は、必要とされる感度、化合物との接合の容易さ、安定性要件、及
び利用可能な機器に依存する。

【００２５】診断目的のため核酸を使用する場合には、標準的な核酸ハイブリダイゼーショ
ン技術が、ここで同定された遺伝子ＲＳＰ−１及び／又はＲＳＰ−２の存在を検
出するために使用されうる。所望により、試料中の核酸は、まず、ＰＣＲのよう
な標準的な手法を使用して増幅されうる。適当なプライマー及びプローブを含む
診断キットも、調製されうる。

【００２６】ＲＳＰ−１及びＲＳＰ−２は、マラリア治療のための治療的適用及び予防的適
用において有用である。本発明の医薬組成物は、多様な薬物送達系での使用に適
している。本発明における使用に適した製剤は、Remington' Pharmaceutical Sc
iences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa.,第17版(1985)に見出さ
れる。薬物送達法の簡単な概説については、Langer, Science 249:1527-1533(1990
)を参照のこと。組成物は、単回投与又は複数回投与に適している。複数回投与
される場合、初回投与後の接種は、免疫応答を増強するために与えられ、典型的
にはブースター接種と呼ばれる。

【００２７】本発明の医薬組成物は、非経口投与用、局所投与用、経口投与用、又は局部投
与用でありうる。好ましくは、医薬組成物は、非経口的に、例えば静脈内、皮下
、皮内、又は筋肉内に投与される。従って、本発明は、許容される担体、好まし
くは水性担体の中に溶解又は懸濁させられた、前記の薬剤の溶液を含む、非経口
投与用組成物を提供する。多様な水性担体、例えば水、緩衝された水、０．４％
生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等が使用されうる。これらの組成
物は、従来の周知の滅菌技術によって殺菌されるか、又は滅菌ろ過されうる。得
られた水性溶液は、そのまま使用するためにパッケージングされるか、又は凍結
乾燥させられ、凍結乾燥調製物が、投与前に無菌溶液と組み合わされうる。組成
物は、ｐＨ調整剤及び緩衝液、浸透圧調整剤、湿潤剤等、例えば酢酸ナトリウム
、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウ
リン酸ソルビタン、トリエタノールアミンオレアート（triethanolamine oleate
）等のような生理学的条件に近似させるために必要とされる医薬的に許容される
補助物質を含有していてもよい。

【００２８】固体組成物の場合、例えば医薬的等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステ
アリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコー
ス、ショ糖、炭酸マグネシウム等を含む、従来の非毒性固体担体が使用されうる
。経口投与の場合、前掲の担体のような通常利用されている賦形剤のうちの任意
のものと、一般的には１０〜９５％、より好ましくは２５〜７５％の濃度の活性
要素とを組み込むことにより、医薬的に許容される非毒性の組成物が形成される
。

【００２９】エアロゾル投与の場合、ポリペプチドは、好ましくは、界面活性剤及び噴霧剤
と共に微細に粉砕された形態で供給される。界面活性剤は、当然、非毒性でなけ
ればならず、好ましくは噴霧剤中に可溶性である。そのような薬剤の代表は、カ
プロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸
、リノレン酸、オレステリン（olesteric）酸、及びオレイン酸ような６〜２２
個の炭素原子を含有している脂肪酸の、脂肪族多価アルコール又はその環式無水
物とのエステル又は部分エステルである。混合グリセリド又は天然グリセリドの
ような混合エステルも、利用されうる。所望により、例えば鼻腔内送達のための
レシチンのように、担体が含まれていてもよい。

【００３０】患者へ投与される量は、投与されるもの、患者の状態、及び投与の様式に依っ
て変動するであろう。治療的適用においては、組成物は、赤血球を介した寄生体
の蔓延を阻害し、従って疾患もしくびその合併症の症状を治癒させるか、又は少
なくとも部分的に阻止するのに十分な量で、既にマラリアに罹患している患者に
投与される。これを達成するために充分な量が、「治療的に有効な用量」として
定義される。この使用のために有効な量は、疾患の重度、特定の組成物、並びに
患者の体重及び全身状態に依存するであろう。

【００３１】又は、本発明のポリペプチドは、ワクチンとして予防的に使用されうる。本発
明のワクチンは、活性要素として、免疫学的に有効な量の、本明細書に記載され
た結合ドメインポリペプチド又は組換えウイルスを含有している。免疫応答は、
抗体の生成；ＲＳＰ−１及び／又はＲＳＰ−２に由来するペプチドを提示する細
胞に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化、又は当分野において周知
のその他のメカニズムを含みうる。例えば、免疫応答の説明については、Raven
press New Yorkにより出版されたPaul Fundamental Immunology第2版（参照とし
て本明細書に組み込まれる）を参照のこと。有用な担体は、当分野において周知
であり、例えばチログロブリン、ヒト血清アルブミンのようなアルブミン、破傷
風トキソイド、ポリ（Ｄ−リジン：Ｄ−グルタミン酸）のようなポリアミノ酸、
インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス組換えワ
クチンを含む。ワクチンは、水、リン酸緩衝生理食塩水、又は生理食塩水のよう
な生理学的に容認される（許容される）希釈剤を含有していてもよく、典型的に
は、さらにアジュバントを含む。不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミ
ニウム、水酸化アルミニウム、又はミョウバンのようなアジュバントが、当分野
において周知の材料である。ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドに対す
る免疫応答を得るため、ＲＳＰ−１又はＲＳＰ−２をコードするＤＮＡ又はＲＮ
Ａが患者へ導入されてもよい。

【００３２】本発明のタンパク質、核酸、又はウイルスを含有しているワクチン組成物は、
ポリペプチドに対する防御免疫応答を誘発するために、患者に投与される。「防
御免疫応答」とは、赤血球を介した寄生体の蔓延を防止又は阻害し、従って、疾
患及びその合併症の症状を少なくとも部分的に防止するものである。これを達成
するために十分な量は、「免疫学的に有効な用量」として定義される。この使用
のために有効な量は、組成物、投与の様式、患者の体重及び全身健康状態に依存
するであろう。

【００３３】免疫感作後、特異的溶解活性又は特異的サイトカイン産生によって、又は腫瘍
退行によって評価されるような、抗原を認識する抗体又は免疫細胞の産生によっ
て、ワクチンの効力が評価されうる。当業者は、前述のパラメーターを評価する
ための従来の方法を承知しているであろう。

【００３４】本発明を一般的に説明したが、例示のみの目的のため本明細書に提供され、特
記しない限り、本発明を制限するものではない、いくつかの具体例を参照するこ
とにより、さらなる理解が得られよう。

【００３５】実施例寄生体この研究においては、以下の寄生体単離物を使用した：Ｐａｌｏ−Ａｌｔｏ（
ＦＵＰ）１¹³、ＩＰＬ／ＢＲＥ１¹⁴、ＣＳＡ、ＣＤ３６、及びＩＣＡＭ−１¹⁵に
関してパニングされたＦＣＲ３亜集団、感染ヒト胎盤（４２^CSA及び９３９^CSA3
）から可溶性ＣＳＡを使用してデシーケスター（desequester）された２つの単
離物、並びに末梢血流から収集されたフィールド単離物（field isolate）のＣ
ＳＡ選択された集団（Ａ５３^CSA）。ＩＥを、５％０₂、５％ＣＯ₂、及び９０％
Ｎ₂を含有している湿潤雰囲気中、３７℃で、重炭酸塩、グルタミン、０．２％
グルコース、５０μＭヒポキサンチン、１０g/mlゲンタマイシン、及びＯ^＋赤血
球を含有している１０％ヒトＡＢ^＋血清を含有しているＲＰＭＩ１６４０の中で
培養した。寄生体が赤血球に再侵入するまで（４時間未満）、複数回の５％ソル
ビトール処理を使用して環状体期寄生体を選択することにより、ＩＥ培養物を同
期化した。

【００３６】パニング選択Ｐａｌｏ−Ａｌｔｏ（ＦＵＰ）１、（ＰＡ）、ＩＰＬ／ＢＲＥ１（ＢＲＥ１）
、ＦＣＲ３株、及びＡ５３単離物の亜集団を、ＳＢＥＣ１７¹⁶を使用して、以
前に記載されたような¹⁵、細胞ＣＳＡに関する成熟期ＩＥの３回の連続的なパニ
ングによって選択した。さらに、ＰＡ及びＦＣＲ３の亜集団を、コンドロイチン
化されたＳＢＥＣＣ２及び３Ａ¹⁵を使用して、細胞ＣＤ３６又はＩＣＡＭ−１
に関する成熟期ＩＥの３回の連続的なパニングによって選択した。高度に同期化
された環状体期ＩＥ培養物を、以前に記載されたようにして、ＣＳＡ、ＣＤ３６
、及びＩＣＡＭ−１を発現しているＳＢＥＣ１Ｄにおいてパニングした。非細
胞接着性ＩＥを除去するために細胞を徹底的に洗浄し、次いで環状体期ＩＥが成
熟することを可能にするため、培養培地中で２４時間インキュベートした。以前
に記載されたようにして、ＲＢＣを添加し、培養物を増殖させた。

【００３７】細胞接着及び細胞接着阻害アッセイ成熟期ＩＥのゼラチン濃化調製物を、ｐＨ６．８の細胞接着培地の中に５×１
０⁶ＩＥ／mlの濃度で再懸濁させた。次いで、以前に記載されたようにして^ｌ5、
細胞接着マイクロアッセイを、１２穴ＩＦＡスライド（Institut Pasteur, Pari
s）上で実施した。

【００３８】前記のような内皮細胞、以前に記載されたような胎盤凍結切片¹¹、１〜１０％
の寄生虫血（１×１０⁷ＩＥ/mlの懸濁液）を用いて、環状体期細胞接着アッセイ
を実施した。

【００３９】細胞接着阻害アッセイのため、ＩＥを、２．５μg/mlトロンボスポンジン、０
．１mg/ml可溶性ＣＳＡ、デルマタン硫酸（ＣＳＢ）、コンドロイチン−６−硫
酸（ＣＳＣ）、ケラチン硫酸（Ｋｅｒ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヘパリン（Ｈ
ｅｐ）（Fluka, France）の存在下でＳＢＥＣと共にインキュベートするか、又
は１U/ml ＣａｓｅＡＢＣ（Fluka, France）、１〜１０U/mlへパリナーゼIII
（HepaseIII）（Sigma, France）、又は５μg/ml抗ＣＤ３６ＦＡ６−１５２Ｍ
ａｂ（Edelman博士より譲り受けた）と共に３７℃で１時間予めインキュベート
されたＳＢＥＣと共にインキュベートした。地方性マラリアの区域に住むセネガ
ル及びカメルーンの患者から得られた血清の存在下でも、阻害アッセイを実施し
た。初妊婦及び経妊婦、男性の成人及び小児から血清を得、Ｏ^＋ヒト血液及びＳ
ＢＥＣＩＤへと吸収させ、１／２０の希釈率で試験した。結果を、マラリアと
接触した経験のない有志者に由来する対照血清プールの１／２０希釈物の存在下
での細胞接着の結果と比較した。

【００４０】環状体期ＩＥ細胞接着のプロテアーゼ感受性を、濃縮ＰＡ^CSAＩＥ（侵入８時
間後）５μlを使用して分析した。ＩＥを、１０もしくは１００μg/mlのトリプ
シンＴＰＣＫ（Signa）、又は１００g/mlの −キモトリプシンＴＬＣＫ（Sigma
）と共に、３７℃で３０分間インキュベートした。１０％ヒト血清を含有してい
る培養培地を添加することにより、消化を停止させた。次いで、未処理のＰＡ^CS ^A を対照として使用して、以前に記載されたようにして、細胞を細胞接着培地で
洗浄し、ＳＢＥＣＩＤへと細胞接着させた。

【００４１】ＩＥの表面免疫標識地方性マラリアの区域に住むセネガル及びカメルーンの患者に由来する５つの
血清のプール１００μlを、３７℃で１回、室温で１回、Ｏ^＋ヒト血液３０lへと
吸着させた。高度に同期化された環状体期又は栄養体期のＰＡ^CSAＩＥ５μmを、
細胞接着培地で１／１０に希釈された血清プール１００μlと共に氷上で４５分
間インキュベートした。ＩＥを、細胞接着培地で３回洗浄し、ＦＩＴＣ結合抗ヒ
ト免疫ＩｇＧ（Sigma, F-6380）と共に氷上で４５分間インキュベートした。最
終洗浄の後、ＩＥを、ＥＰＲ顕微鏡検（CELLscan, Scanalytics, Billerica, MA¹⁷ ）によって観察した。

【００４２】ＩＥの表面ヨウ素化及び代謝的標識受容体パニング法¹⁸によってＣＳＡ及びＣＤ３６に関して予め選択された同期化
された成熟期ＩＥを、ゼラチン技術によって＞７５％にまで濃化し、次いで次の
サイクルでおよそ２０％の環状体期形態を得るために新鮮な赤血球で希釈した。
表面ヨウ素化は、再侵入から７、１４、２１、及び３２時間後に、ラクトペルオ
キシダーゼ法⁷を使用して実施した。代謝的標識は、分裂体期後期に、２ｍＣi ³⁵ Ｓ−メチオニンを５ml培養フラスコへ添加することにより実施した。再侵入か
ら１４時間後に培養を停止させた。１％トリトンＸ−１００、次いで２％ＳＤＳ
による連続的な抽出を実施し、続いてプロテアーゼ処理（以前に記載されたよう
なＴＰＣＫで処理されたトリプシン、及び−キモトリプシンＴＬＣＫ（Sigma, L
t.Louis)）を実施した。ヨウ素化又は代謝的標識された試料を、５〜１７．５％
勾配アクリルアミドゲルで分離し、次いでそれを乾燥させ、Kodak Bio Max MS1
フィルムに対して置いた。予備染色されたタンパク質マーカーは、Life Technol
ogies, Gaithersburg, Maryland及びNew England BioLabs Inc., Beverly, MAよ
り購入した。

【００４３】統計分析ＩＥ接着アッセイ、細胞接着アッセイ、及び細胞接着阻害アッセイの結果は、
平均±ＳＥとして表される。細胞接着阻害アッセイからのデータの統計的有意性
の評価、及び細胞接着レベルの比較には、マンホイトニー（Mann-Whitney）検定
を使用した。

【００４４】

【表１】

【００４５】データは、ＳＢＥＩＤ単層１mm²当たりの細胞接着性ＩＥの平均数（±ＳＤ
）である（４連スポットの平均）。Ｎｄ：未実施。影付きの値は、ＰｆＥＭＰ１
により媒介された細胞接着に相当する。

【００４６】結果熱帯熱マラリア原虫に感染した妊婦の末梢血は、ＩＥの胎盤ＣＳＡへの大量の
結合にも関わらず、循環する環状体期ＩＥを欠いているか^4,5、又はＣＳＡ結合
表現型をほとんど、もしくは全く有しないＩＥを含有している可能性がある^2,3
。このことから、本発明者らは、妊婦に由来する環状体期ＩＥが、末梢血中の循
環を回避することができるか否かを調査することとした。本発明者らは、胎盤及
び様々な細胞型への環状体期接着を試験した。in vitroで調製され、ＣＳＡとの
結合に関して選択された、熱帯熱マラリア原虫単離物Palo-Alto（ＦＵＰ）¹の高
度に同期化された若い環状体期ＩＥ（ＰＡ^CSA）は、胎盤凍結切片の栄養膜合胞
体層及び培養リスザル脳内皮細胞（ＳＢＥＣ）の単層へと接着した（図１Ａ、Ｂ
、及びＣ）。結合は、メロゾイト再侵入直後に観察され、環状体期サイクルの間
中、継続された（表１）。環状体期ＩＥのＳＢＥＣＩＤ及び黒色腫Ｃ３２細胞
（およそ７０ＩＥ/mm²）への高度の特異的結合が存在した。ヒト脳内皮細胞（Ｈ
ＢＥＣ）、ヒト肺内皮細胞（ＨＬＥＣ）、及びＣＨＯ細胞との結合のレベルは、
低かったが、有意であった（細胞単層１mm²当たり５個以上のＩＥ）（図１Ｃ）
。最後に、環状体期ＩＥのヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、第一（ｐｒｉｍｏ
）外植片）及びヒト皮膚内皮細胞（ＨＭＥＣ−１）との細胞接着は検出されなか
った。本発明者らは、遺伝学的に異なるさらなるＣＳＡ結合単離物を調査した。
小児末梢血に由来するもの（Ａ５３^CSA）、２つの胎盤単離物９３９^CSA及び４２^CSA 、並びにin vitro培養された２つの単離物（ＦＣＲ３^CSA及びＢｒｅ１^CSA）
。得られた結果は、内皮細胞と結合した環状体期ＩＥを確認した（表１）。

【００４７】環状体期接着は、栄養体期におけるＣＤ３６又はＩＣＡＭ−１との結合に関し
て選択されたＰＡ寄生体及びＦＣＲ３寄生体においては検出されなかった（ＳＢ
ＥＣ１Ｄ１mm²当たり１個未満の結合ＩＥ）。これらのデータは、ＣＳＡ結合
表現型が、未知のメカニズムによって環状体期接着と関係していることを示唆し
ている。本発明者らは、ＣＳＡ及びＣＤ３６との結合に関して選択された、高度
に同期させられた環状体期ＩＥ（再侵入から８時間後）を等しい数、混合し、こ
れらをＳＢＥＣ１Ｄの単層と結合させることにより、これを調査した。結合し
た環状体期ＩＥを培養し、栄養体期に、表現型特異的な接着阻害剤（可溶性ＣＳ
Ａ、ＣＤ３６に対するｍＡｂ）に対する感受性を測定することにより、それらの
表現型を評価した。栄養体結合はほぼ全てＣＳＡ依存性であり、未選択のＩＥの
組み合わせは、両阻害剤によって類似の阻害を受けた（図１Ｄ）。ＣＳＡ及びＩ
ＣＡＭ−１と結合するＩＥ亜集団の混合物を試験した場合には、ＣＳＡへの成熟
ＩＥの結合に関して、類似の選択が観察された（データは示していない）。従っ
て、試験された３つの表現型について、栄養体期より前の細胞接着能は、成熟Ｉ
ＥのＣＳＡ結合表現型と厳密に連動していた。

【００４８】環状体期接着に関与している宿主受容体を同定するため、本発明者らは、サイ
クルの間中のＣＳＡの阻害活性を試験した。本発明者らは、環状体期ＩＥ^CSA細
胞接着が、侵入から１６時間後までは、０．１mg. mlのＣＳＡに対して非感受性
であり、１U/mlのコンドロイチナーゼＡＢＣ（ＣａｓｅＡＢＣ）による標的細
胞の前処理に対して非感受性であることを観察した（図２Ａ）。この時点で、突
起（knob）形成及びｖａｒ^CSA遺伝子の表面発現の開始と共に、ＣＳＡ及びＣａ
ｓｅＡＢＣの結合に対する阻害効果が最初に見られた。阻害は２４時間目に最
大となった。従って、全てのＩＥ^CSAが、血中期サイクルの間中、細胞接着し、
侵入から１６時間後に、ＣＳＡ非依存性受容体相互作用からＣＳＡ依存性表現型
へと転換した。本発明者らは、様々な成熟期ＩＥ接着受容体の可能性のある関与
を試験した。トロンボスポンジンは、ＩＥのＳＢＥＣ１Ｄとの結合に対する効
果を有していなかった（データは示していない）。表面にＣＤ３６、ＩＣＡＭ−
ｌ、ＶＣＡＭ、又はＥ−セレクチンを発現しているトランスフェクトされたＣＨ
Ｏ７４５（ＣＳＡ^-）は、ＣＨＯ−７４５対照細胞と類似している環状体期ＩＥ
の非特異的細胞接着を示した（１mm²当たり２個以下の結合ＩＥ）。本発明者ら
は、様々なグリコサミノグリカン、及びそれらの対応する酵素の可能性のある阻
害効果も調査した（図２Ｂ）。ＣａｓｅＡＢＣ及びＣａｓｅＢは有意な阻害
活性を有していなかったため、デルマタン硫酸（ＣＳＢ）で得られた阻害は特異
的ではなかった。ヒアルロン酸は活性を有していなかったが、ヒアルロン酸リア
ーゼは、おそらくはヘパリン及びヘパラン硫酸を消化するその第２の能力により
、低レベルの阻害活性を有していた。ヘパリン（１００m/ml）及びへパリナーゼ
は、約５０％の阻害を与え、ＳＢＥＣＩＤは、表面にヘパリンを発現していな
い。その代わり、それらはヘパラン硫酸プロテオグリカンを発現しており⁶、ヘ
パリン及びへパリナーゼIIが部分的に環状体期細胞接着を阻害するのは、おそら
くは、ＳＢＥＣ１Ｄヘパラン硫酸による完成又はその消化による。本発明者ら
は、環状体期ＩＥ^CSA細胞接着の阻害を試験するため、現在、ＳＢＥＣ１Ｄヘ
パラン硫酸を精製中である。

【００４９】環状体期ＩＥ^CSA接着はＣＳＡによって媒介されないため、本発明者らは、初
期血中期寄生体においては、新規な寄生体表面分子が、内皮細胞及び栄養膜合胞
体層との結合を媒介している可能性が高いと考えた。ＦＣＲ３^CSA環状体期ＩＥ
の表面ヨウ素化は、対照赤血球には存在しない、本明細書において「環状体表面
タンパク質−１」（ＲＳＰ−１）と呼ばれるおよそ２００kDaの分子を同定した
（図３）。本発明者らは、カメルーンの経妊婦に由来する血清プールを使用して
、表面ヨウ素化された環状体期ＩＥ抽出物を免疫沈降させた。使用された血清は
、２００kDaの分子、及びＲＳＰ−２と名付けられた、およそ４０kDaの第二の分
子を認識した。未感染赤血球においては強く標識されたバンドと共移動するため
、ＲＳＰ−２は全寄生体抽出物中に検出不可であった。ＲＳＰ−１及びＲＳＰ−
２とサイズが同一の寄生体タンパク質は、Ｓ−メチオニンで標識された環状体期
ＩＥに由来するタンパク質抽出物中に見い出された。ＲＳＰ−１及びＲＳＰ−２
は、２％ＳＤＳで効率的に抽出され、トリプシン（１００μm/ml）又は −キモ
トリプシン（１００g/ml）による処理によって分解された（図３Ａ及びＢ、デー
タは示していない）。環状体期１Ｅ接着は、１００μg/mlのプロテアーゼ濃度で
実質的に阻害され（図３Ｃ）、これは、接着過程へのＲＳＰ−１及びＲＳＰ−２
の関与と一致している。両分子は、若い環状体期ＩＥの表面に検出されたが、い
ずれも成熟栄養体には存在しなかった。栄養体ＩＥにおいては、およそ４００kD
aというサイズの大きな分子が、接着表現型の転換と一致した時点で、ＩＥ表面
に検出された（侵入から１４〜２１時間後、図３Ａ及びＢ）。ＦＣＲ３^CSA Ｉ
Ｅの４００kDaの分子は、以前の研究において、成熟型のＣＳＡへの接着を媒介
するｖａｒ遺伝子産物として同定されていた。ＲＰＳ−１、ＲＰＳ−２、及びＶ
ＡＲ^CSA分子は、天然に、免疫原性を有しており、妊婦に由来する８つの血清に
よって効率的に免疫沈降した（図３Ｂ、データは示していない）。これらの血清
は、環状体期ＩＥ及び栄養体期ＩＥの表面と反応する（図３Ｅ）。カメルーン／
セネガルのマラリア患者（妊婦、男性の成人及び小児）に由来する血清は、環状
体期ＩＥの内皮細胞への細胞接着を遮断した（図３Ｆ）。

【００５０】本発明者らの成果は、熱帯熱マラリア原虫の血中期生物学に関する現在の見解
を覆すものである。一般的に、環状体期ＩＥは血中を循環しており、接着特性は
、侵入からおよそ１４〜１６時間後のＩＥ表面のＰｆＥＭＰ１分子の発現により
出現すると認識されている。ここで、本発明者らは、脳及び肺のような重大な標
的器官に由来する内皮細胞及び栄養膜合胞体層への、若い環状体ＩＥの特異的接
着を初めて記載する。胎盤寄生虫血と末梢血寄生虫血との間の差違、感染した妊
婦において観察された表現型分布は、本発明者らの所見によって説明されうる。
本発明者らは、胎盤栄養膜合胞体層への環状体期ＩＥの接着が、成熟期ＩＥのＣ
ＳＡ結合に先行し、この接着表現型を有する寄生体の潜在性、又は少なくとも部
分的に潜在性の生活環をもたらすことを提唱する。環状体期ＩＥが妊婦以外の患
者において細胞接着しうるという証拠は、ヒト脳における熱帯熱マラリア原虫の
分離に関する最近の研究から得られる⁸。脳性マラリアによって死亡した患者の
脳血管には、全ての発達期が観察された。いくつかの血管は、明らかに、多数の
環状体期ＩＥを含有してたが、相互作用の性質は未知である。ＣＳＡは脳微小血
管系に存在しているため^9-11、ＩＥ亜集団は、血中期サイクルの間中、同じ宿主
細胞に接着しうる。明らかに、血流中の特異的な侵襲性の接着表現型の欠如又は
過少表現は、末梢血中期寄生体に基づく臨床的研究に対する多大の影響を有する
。組織親和性における環状体期接着の役割も調査されるべきである。胎盤におい
て観察されたＣＳＡ結合寄生体の大量蓄積は、例えば、初期の環状体結合による
と推測することができよう。

【００５１】内皮細胞への環状体期接着のレベルは、栄養体結合のそれより著しく低い。こ
れは、リガンド受容体ペア間の相互作用の強さが異なること、又は環状体期接着
受容体がＣＳＡ分子より少ないことによるのかもしれない。血流に基づくアッセ
イにおいて得られた予備データは、環状体期と成熟期との間の相互作用強度の大
きな違いを示している。環状体期接着は、おそらく、血流がその他の血管床より
もはるかに低い胎盤において最大である。

【００５２】４８時間血中期サイクル中の２つの異なる接着表現型間の転換は、熱帯熱マラリ
ア原虫の生物学における全く新しい現象である。血中期サイクルの間中のＩＥ表
面分子の発現パターンは、接着表現型の観察された変化と一致しており、従って
、このことは、環状体期ＩＥ接着におけるＲＳＰ−１及び／又はＲＳＰ−２の役
割を示唆している。環状体期接着を示さない寄生体（ＣＤ３６表現型）において
、ＲＳＰ−１及びＲＳＰ−２の分子量と類似している分子量を有する表面分子が
検出された（データは示していない）。ＲＳＰ−１及びＲＳＰ−２が一つのファ
ミリーのメンバーであるか否か、又はＩＥ表面分子の表現型特異的な翻訳後修飾¹² が、環状体の接着特質の差違の原因であるか否かは不明である。

【００５３】最後に、新規な環状体期ＩＥ表面分子ＲＳＰ−１及びＲＳＰ−２は、環状体期接
着を遮断することができる、抗体により媒介される免疫応答の天然の標的である
。従って、これらの抗原は、この主要な疾患の重度を低下させうる潜在的なワク
チン候補である。

【００５４】明らかに、上記の教示を考慮することにより、本発明に対する多数の修飾及び改
変が可能である。従って、添付の特許請求の範囲の範囲内で、本明細書に具体的
に記載されたもの以外にも、本発明が実施されうることを理解されたい。

【００５５】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１ａ】様々な細胞及び組織への環状体期ＩＥ^CSA細胞接着。高度に同期化された培養
物に由来するＩＥ^CSAは、（Ａ）液体窒素で急速凍結させた未感染ヒト胎盤生検
試料の凍結切片（Ｒ、環状体期、Ｔ、栄養体期）、又は（Ｂ）ＳＢＥＣＩＤ単
層（ＮｉｋｏｎＥ８００、×１０００）へ細胞接着した。（Ｃ）ＳＢＥＣＩ
Ｄ、ＨＵＶＥＣ、ＨＬＥＣ第一外植片、ＨＭＥＣ、Ｃ３２、及びＣＨＯ細胞の単
層、並びに液体窒素で急速凍結させた未感染ヒト胎盤生検試料への、侵入から８
時間後の、同期化されたＰＡ^CSA ＩＥの細胞接着。徹底的な洗浄の後、各試料
の表面全体の、４つのランダムな視野（０．２５mm²の面積、×３００倍率、Ｏ
ｌｙｍｐｕｓＣＫ２）で計数された、胎盤凍結切片の高倍率視野１個当たりの
、又は細胞単層１mm²当たりの細胞接着性ＩＥの数を決定した。各実験の値を、
５％寄生虫血に対して規準化し、結果を細胞接着の平均値±ＳＤとして表した。
（Ｄ）ＰＡ^CSA及びＰＡ^ＣＤ36 ＩＥの高度に同期化された集団を、サイクルの
８時間目に混合して、初期集団を得、その表現型分布を、細胞接着阻害マイクロ
アッセイにより２４時間後に決定した。混合物の残りは、ＳＢＥＣＩＤの細胞
接着による選択に直ちに供した。細胞接着性ＩＥを培養し、得られた集団の表現
型分布を決定した。各阻害剤について、細胞接着率（％）を得た。ＣＳＡ（黒四
角）及び抗ＣＤ３６ＦＡ６−１５２モノクローナル抗体（）は、ＩＥ集団中の
各表現型の反比例を与える。

【図１ｂ】様々な細胞及び組織への環状体期ＩＥ^CSA細胞接着。高度に同期化された培養
物に由来するＩＥ^CSAは、（Ａ）液体窒素で急速凍結させた未感染ヒト胎盤生検
試料の凍結切片（Ｒ、環状体期、Ｔ、栄養体期）、又は（Ｂ）ＳＢＥＣＩＤ単
層（ＮｉｋｏｎＥ８００、×１０００）へ細胞接着した。（Ｃ）ＳＢＥＣＩ
Ｄ、ＨＵＶＥＣ、ＨＬＥＣ第一外植片、ＨＭＥＣ、Ｃ３２、及びＣＨＯ細胞の単
層、並びに液体窒素で急速凍結させた未感染ヒト胎盤生検試料への、侵入から８
時間後の、同期化されたＰＡ^CSA ＩＥの細胞接着。徹底的な洗浄の後、各試料
の表面全体の、４つのランダムな視野（０．２５mm²の面積、×３００倍率、Ｏ
ｌｙｍｐｕｓＣＫ２）で計数された、胎盤凍結切片の高倍率視野１個当たりの
、又は細胞単層１mm²当たりの細胞接着性ＩＥの数を決定した。各実験の値を、
５％寄生虫血に対して規準化し、結果を細胞接着の平均値±ＳＤとして表した。
（Ｄ）ＰＡ^CSA及びＰＡ^ＣＤ36 ＩＥの高度に同期化された集団を、サイクルの
８時間目に混合して、初期集団を得、その表現型分布を、細胞接着阻害マイクロ
アッセイにより２４時間後に決定した。混合物の残りは、ＳＢＥＣＩＤの細胞
接着による選択に直ちに供した。細胞接着性ＩＥを培養し、得られた集団の表現
型分布を決定した。各阻害剤について、細胞接着率（％）を得た。ＣＳＡ（黒四
角）及び抗ＣＤ３６ＦＡ６−１５２モノクローナル抗体（）は、ＩＥ集団中の
各表現型の反比例を与える。

【図１ｃ】様々な細胞及び組織への環状体期ＩＥ^CSA細胞接着。高度に同期化された培養
物に由来するＩＥ^CSAは、（Ａ）液体窒素で急速凍結させた未感染ヒト胎盤生検
試料の凍結切片（Ｒ、環状体期、Ｔ、栄養体期）、又は（Ｂ）ＳＢＥＣＩＤ単
層（ＮｉｋｏｎＥ８００、×１０００）へ細胞接着した。（Ｃ）ＳＢＥＣＩ
Ｄ、ＨＵＶＥＣ、ＨＬＥＣ第一外植片、ＨＭＥＣ、Ｃ３２、及びＣＨＯ細胞の単
層、並びに液体窒素で急速凍結させた未感染ヒト胎盤生検試料への、侵入から８
時間後の、同期化されたＰＡ^CSA ＩＥの細胞接着。徹底的な洗浄の後、各試料
の表面全体の、４つのランダムな視野（０．２５mm²の面積、×３００倍率、Ｏ
ｌｙｍｐｕｓＣＫ２）で計数された、胎盤凍結切片の高倍率視野１個当たりの
、又は細胞単層１mm²当たりの細胞接着性ＩＥの数を決定した。各実験の値を、
５％寄生虫血に対して規準化し、結果を細胞接着の平均値±ＳＤとして表した。
（Ｄ）ＰＡ^CSA及びＰＡ^ＣＤ36 ＩＥの高度に同期化された集団を、サイクルの
８時間目に混合して、初期集団を得、その表現型分布を、細胞接着阻害マイクロ
アッセイにより２４時間後に決定した。混合物の残りは、ＳＢＥＣＩＤの細胞
接着による選択に直ちに供した。細胞接着性ＩＥを培養し、得られた集団の表現
型分布を決定した。各阻害剤について、細胞接着率（％）を得た。ＣＳＡ（黒四
角）及び抗ＣＤ３６ＦＡ６−１５２モノクローナル抗体（）は、ＩＥ集団中の
各表現型の反比例を与える。

【図１ｄ】様々な細胞及び組織への環状体期ＩＥ^CSA細胞接着。高度に同期化された培養
物に由来するＩＥ^CSAは、（Ａ）液体窒素で急速凍結させた未感染ヒト胎盤生検
試料の凍結切片（Ｒ、環状体期、Ｔ、栄養体期）、又は（Ｂ）ＳＢＥＣＩＤ単
層（ＮｉｋｏｎＥ８００、×１０００）へ細胞接着した。（Ｃ）ＳＢＥＣＩ
Ｄ、ＨＵＶＥＣ、ＨＬＥＣ第一外植片、ＨＭＥＣ、Ｃ３２、及びＣＨＯ細胞の単
層、並びに液体窒素で急速凍結させた未感染ヒト胎盤生検試料への、侵入から８
時間後の、同期化されたＰＡ^CSA ＩＥの細胞接着。徹底的な洗浄の後、各試料
の表面全体の、４つのランダムな視野（０．２５mm²の面積、×３００倍率、Ｏ
ｌｙｍｐｕｓＣＫ２）で計数された、胎盤凍結切片の高倍率視野１個当たりの
、又は細胞単層１mm²当たりの細胞接着性ＩＥの数を決定した。各実験の値を、
５％寄生虫血に対して規準化し、結果を細胞接着の平均値±ＳＤとして表した。
（Ｄ）ＰＡ^CSA及びＰＡ^ＣＤ36 ＩＥの高度に同期化された集団を、サイクルの
８時間目に混合して、初期集団を得、その表現型分布を、細胞接着阻害マイクロ
アッセイにより２４時間後に決定した。混合物の残りは、ＳＢＥＣＩＤの細胞
接着による選択に直ちに供した。細胞接着性ＩＥを培養し、得られた集団の表現
型分布を決定した。各阻害剤について、細胞接着率（％）を得た。ＣＳＡ（黒四
角）及び抗ＣＤ３６ＦＡ６−１５２モノクローナル抗体（）は、ＩＥ集団中の
各表現型の反比例を与える。

【図２ａ】血中期サイクルの間中の細胞接着は接着表現型の転換によって媒介される。（
Ａ）サイクルの間中の４時間毎の、高度に同期化されたＰＡ^CSA ＩＥのＳＢＥ
Ｃ１Ｄの細胞接着に対するＣＳＡ（黒四角）及びコンドロイチナーゼＡＢＣ（
白四角）の阻害活性の決定。（Ｂ）デルマタン硫酸（ＣＳＢ）、コンドロイチン
−６−硫酸（ＣＳＣ）、ケラタン硫酸（Ｋｅｒ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヘパ
リン（Ｈｅｐ）の存在下、又はコンドロイチナーゼＡＢＣ（Case ABC）及びＢコ
ンドロイチナーゼ（Case B）、ヒアルロン酸リアーゼ（H Lyase）、並びにへパ
リナーゼII（Hepase）による標的細胞の処理の後の、侵入から８時間後の、ＳＢ
ＥＣＩＤへの環状体期ＰＡ^CSA ＩＥの細胞接着。

【図２ｂ】血中期サイクルの間中の細胞接着は接着表現型の転換によって媒介される。（
Ａ）サイクルの間中の４時間毎の、高度に同期化されたＰＡ^CSA ＩＥのＳＢＥ
Ｃ１Ｄの細胞接着に対するＣＳＡ（黒四角）及びコンドロイチナーゼＡＢＣ（
白四角）の阻害活性の決定。（Ｂ）デルマタン硫酸（ＣＳＢ）、コンドロイチン
−６−硫酸（ＣＳＣ）、ケラタン硫酸（Ｋｅｒ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヘパ
リン（Ｈｅｐ）の存在下、又はコンドロイチナーゼＡＢＣ（Case ABC）及びＢコ
ンドロイチナーゼ（Case B）、ヒアルロン酸リアーゼ（H Lyase）、並びにへパ
リナーゼII（Hepase）による標的細胞の処理の後の、侵入から８時間後の、ＳＢ
ＥＣＩＤへの環状体期ＰＡ^CSA ＩＥの細胞接着。

【図３ａ】接着性環状体期ＩＥは、免疫応答の標的である新規な環状体期特異的表面分子
を発現する。（Ａ）環状体期ＩＥ上の高分子量¹²⁵Ｉ標識表面抗原の同定。メロ
ゾイト侵入後の様々な時点（７、１４、２１、及び３２時間後）の、ヨウ素化表
面ＦＣＲ３^CSAのＳＤＳ抽出物の分離が示されている。およそ２００kDaの単一の
標識されたバンド（ＲＳＰ−１）は、環状体期初期（７時間後）から栄養体期初
期（２１時間後）にかけて検出される。およそ４００kDaの第二の標識されたバ
ンドは、１４時間後に出現し、サイクルの最後まで検出される。³⁵Ｓで標識され
た環状体期ＩＥ抽出物は、ＲＳＰ−１と共移動する２００kDaのバンドを示す。
２００kDa及び４００kDaのバンドは対照赤血球には見られない（データは示して
いない）。（Ｂ）妊婦（カメルーン）に由来する免疫血清プールは、およそ２０
０kDa及び４０kDaの２つの主要なプロテアーゼ感受性タンパク質を免疫沈殿させ
た。生活環後期に、ｖａｒ^CSA分子（４００kDa）が免疫精製される。レーン１：
感染から３２時間後の栄養体期。レーン２：¹²⁵Ｉ標識された若い環状体期。レ
ーン３：１０μg/mlトリプシン（ｔｒｙｐ）処理後の免疫沈降。レーン４：１０
０μg/mlトリプシン（ｔｒｙｐ）処理後の免疫沈降。レーン５：１００μg/mlα
−キモトリプシン（ｃｈｙｍｏ）処理後の免疫沈降。レーン６：血清プールで免
疫沈降させられた³⁵Ｓメチオニンで標識された環状体期ＩＥＳＤＳ抽出物。（
Ｃ）異なる濃度のトリプシン又はα−キモトリプシンによる環状体期ＩＥの処理
に対する細胞接着の感受性。（Ｄ）地方性マラリアの区域に住むセネガル及びカ
メルーンの患者に由来する５つの血清のプールによる、環状体期（Ｒ）及び栄養
体期（Ｔ）のＰＡ^CSA ＩＥの免疫標識。ＩＥ表面の抗体をＦＩＴＣ結合抗ヒト
ＩｇＧで検出し、ＥＰＲ顕微鏡検（ＣＥＬＬｓｃａｎ）により観察した。（Ｅ）
初妊婦（１）、経妊婦（２５及び４６）、小児（６１）、及び男性成人（１６１
３）から得られた血清による細胞接着阻害。マラリアと接触した経験のない有志
者に由来する血清プールを用いて実施された対照と、各血清の存在下で得られた
結合を比較することにより細胞接着率（％）を得た。

【図３ｂ】接着性環状体期ＩＥは、免疫応答の標的である新規な環状体期特異的表面分子
を発現する。（Ａ）環状体期ＩＥ上の高分子量¹²⁵Ｉ標識表面抗原の同定。メロ
ゾイト侵入後の様々な時点（７、１４、２１、及び３２時間後）の、ヨウ素化表
面ＦＣＲ３^CSAのＳＤＳ抽出物の分離が示されている。およそ２００kDaの単一の
標識されたバンド（ＲＳＰ−１）は、環状体期初期（７時間後）から栄養体期初
期（２１時間後）にかけて検出される。およそ４００kDaの第二の標識されたバ
ンドは、１４時間後に出現し、サイクルの最後まで検出される。³⁵Ｓで標識され
た環状体期ＩＥ抽出物は、ＲＳＰ−１と共移動する２００kDaのバンドを示す。
２００kDa及び４００kDaのバンドは対照赤血球には見られない（データは示して
いない）。（Ｂ）妊婦（カメルーン）に由来する免疫血清プールは、およそ２０
０kDa及び４０kDaの２つの主要なプロテアーゼ感受性タンパク質を免疫沈殿させ
た。生活環後期に、ｖａｒ^CSA分子（４００kDa）が免疫精製される。レーン１：
感染から３２時間後の栄養体期。レーン２：¹²⁵Ｉ標識された若い環状体期。レ
ーン３：１０μg/mlトリプシン（ｔｒｙｐ）処理後の免疫沈降。レーン４：１０
０μg/mlトリプシン（ｔｒｙｐ）処理後の免疫沈降。レーン５：１００μg/mlα
−キモトリプシン（ｃｈｙｍｏ）処理後の免疫沈降。レーン６：血清プールで免
疫沈降させられた³⁵Ｓメチオニンで標識された環状体期ＩＥＳＤＳ抽出物。（
Ｃ）異なる濃度のトリプシン又はα−キモトリプシンによる環状体期ＩＥの処理
に対する細胞接着の感受性。（Ｄ）地方性マラリアの区域に住むセネガル及びカ
メルーンの患者に由来する５つの血清のプールによる、環状体期（Ｒ）及び栄養
体期（Ｔ）のＰＡ^CSA ＩＥの免疫標識。ＩＥ表面の抗体をＦＩＴＣ結合抗ヒト
ＩｇＧで検出し、ＥＰＲ顕微鏡検（ＣＥＬＬｓｃａｎ）により観察した。（Ｅ）
初妊婦（１）、経妊婦（２５及び４６）、小児（６１）、及び男性成人（１６１
３）から得られた血清による細胞接着阻害。マラリアと接触した経験のない有志
者に由来する血清プールを用いて実施された対照と、各血清の存在下で得られた
結合を比較することにより細胞接着率（％）を得た。

【図３ｃ】接着性環状体期ＩＥは、免疫応答の標的である新規な環状体期特異的表面分子
を発現する。（Ａ）環状体期ＩＥ上の高分子量¹²⁵Ｉ標識表面抗原の同定。メロ
ゾイト侵入後の様々な時点（７、１４、２１、及び３２時間後）の、ヨウ素化表
面ＦＣＲ３^CSAのＳＤＳ抽出物の分離が示されている。およそ２００kDaの単一の
標識されたバンド（ＲＳＰ−１）は、環状体期初期（７時間後）から栄養体期初
期（２１時間後）にかけて検出される。およそ４００kDaの第二の標識されたバ
ンドは、１４時間後に出現し、サイクルの最後まで検出される。³⁵Ｓで標識され
た環状体期ＩＥ抽出物は、ＲＳＰ−１と共移動する２００kDaのバンドを示す。
２００kDa及び４００kDaのバンドは対照赤血球には見られない（データは示して
いない）。（Ｂ）妊婦（カメルーン）に由来する免疫血清プールは、およそ２０
０kDa及び４０kDaの２つの主要なプロテアーゼ感受性タンパク質を免疫沈殿させ
た。生活環後期に、ｖａｒ^CSA分子（４００kDa）が免疫精製される。レーン１：
感染から３２時間後の栄養体期。レーン２：¹²⁵Ｉ標識された若い環状体期。レ
ーン３：１０μg/mlトリプシン（ｔｒｙｐ）処理後の免疫沈降。レーン４：１０
０μg/mlトリプシン（ｔｒｙｐ）処理後の免疫沈降。レーン５：１００μg/mlα
−キモトリプシン（ｃｈｙｍｏ）処理後の免疫沈降。レーン６：血清プールで免
疫沈降させられた³⁵Ｓメチオニンで標識された環状体期ＩＥＳＤＳ抽出物。（
Ｃ）異なる濃度のトリプシン又はα−キモトリプシンによる環状体期ＩＥの処理
に対する細胞接着の感受性。（Ｄ）地方性マラリアの区域に住むセネガル及びカ
メルーンの患者に由来する５つの血清のプールによる、環状体期（Ｒ）及び栄養
体期（Ｔ）のＰＡ^CSA ＩＥの免疫標識。ＩＥ表面の抗体をＦＩＴＣ結合抗ヒト
ＩｇＧで検出し、ＥＰＲ顕微鏡検（ＣＥＬＬｓｃａｎ）により観察した。（Ｅ）
初妊婦（１）、経妊婦（２５及び４６）、小児（６１）、及び男性成人（１６１
３）から得られた血清による細胞接着阻害。マラリアと接触した経験のない有志
者に由来する血清プールを用いて実施された対照と、各血清の存在下で得られた
結合を比較することにより細胞接着率（％）を得た。

【図３ｄ】接着性環状体期ＩＥは、免疫応答の標的である新規な環状体期特異的表面分子
を発現する。（Ａ）環状体期ＩＥ上の高分子量¹²⁵Ｉ標識表面抗原の同定。メロ
ゾイト侵入後の様々な時点（７、１４、２１、及び３２時間後）の、ヨウ素化表
面ＦＣＲ３^CSAのＳＤＳ抽出物の分離が示されている。およそ２００kDaの単一の
標識されたバンド（ＲＳＰ−１）は、環状体期初期（７時間後）から栄養体期初
期（２１時間後）にかけて検出される。およそ４００kDaの第二の標識されたバ
ンドは、１４時間後に出現し、サイクルの最後まで検出される。³⁵Ｓで標識され
た環状体期ＩＥ抽出物は、ＲＳＰ−１と共移動する２００kDaのバンドを示す。
２００kDa及び４００kDaのバンドは対照赤血球には見られない（データは示して
いない）。（Ｂ）妊婦（カメルーン）に由来する免疫血清プールは、およそ２０
０kDa及び４０kDaの２つの主要なプロテアーゼ感受性タンパク質を免疫沈殿させ
た。生活環後期に、ｖａｒ^CSA分子（４００kDa）が免疫精製される。レーン１：
感染から３２時間後の栄養体期。レーン２：¹²⁵Ｉ標識された若い環状体期。レ
ーン３：１０μg/mlトリプシン（ｔｒｙｐ）処理後の免疫沈降。レーン４：１０
０μg/mlトリプシン（ｔｒｙｐ）処理後の免疫沈降。レーン５：１００μg/mlα
−キモトリプシン（ｃｈｙｍｏ）処理後の免疫沈降。レーン６：血清プールで免
疫沈降させられた³⁵Ｓメチオニンで標識された環状体期ＩＥＳＤＳ抽出物。（
Ｃ）異なる濃度のトリプシン又はα−キモトリプシンによる環状体期ＩＥの処理
に対する細胞接着の感受性。（Ｄ）地方性マラリアの区域に住むセネガル及びカ
メルーンの患者に由来する５つの血清のプールによる、環状体期（Ｒ）及び栄養
体期（Ｔ）のＰＡ^CSA ＩＥの免疫標識。ＩＥ表面の抗体をＦＩＴＣ結合抗ヒト
ＩｇＧで検出し、ＥＰＲ顕微鏡検（ＣＥＬＬｓｃａｎ）により観察した。（Ｅ）
初妊婦（１）、経妊婦（２５及び４６）、小児（６１）、及び男性成人（１６１
３）から得られた血清による細胞接着阻害。マラリアと接触した経験のない有志
者に由来する血清プールを用いて実施された対照と、各血清の存在下で得られた
結合を比較することにより細胞接着率（％）を得た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 16/20 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ギシン，ユルクフランス国、エフ−83640 サン−ザシャリ、ル・デギエール (72)発明者プーヴェル，ブルーノフランス国、エフ−83470 サン−マキシマン、ラ・ヴィロンヌ、シュマン・ジ・ドゥ・ピエール・ヴィエイユ (72)発明者シェルフ，アルトゥールフランス国、エフ−75015 パリ、リュ・マチュラン・レニエ 42 (72)発明者ビュフェ，ピエールフランス国、エフ−75020 パリ、ブルヴァール・ダブ 157 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA53 DA02 GA03 HA15 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA15 4B065 AA91X AA93X AB05 AC14 4C085 AA03 BA02 BB11 CC21 DD32 DD38 DD86 FF01 FF02 FF03 4H045 AA11 CA20 DA75 DA76 DA86 FA72

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】内皮細胞への熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum
）環状体期接着を媒介し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決
定されるサイズがおよそ２００キロダルトンである、単離されたタンパク質。
【請求項２】内皮細胞への熱帯熱マラリア原虫環状体期接着を媒介し、Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定されるサイズがおよそ４０
キロダルトンである、単離されたタンパク質。
【請求項３】請求項１又は２の単離されたタンパク質と結合する抗体。
【請求項４】モノクローナル抗体である、請求項３の抗体。
【請求項５】ポリクローナル抗体である、請求項４の抗体。
【請求項６】試料中のマラリア原虫種の存在を検出する方法であって、該試料を請求項３〜５のいずれかに記載の抗体と接触させること；及び該試料中の抗体とマラリア原虫種との間の、マラリア原虫種の存在を示す相互作
用を同定することを含む方法。
【請求項７】マラリア原虫種が熱帯熱マラリア原虫である、請求項６の方
法。
【請求項８】抗体が検出可能部と結合している、請求項６の方法。
【請求項９】試料が、マラリアを有すると推測されるヒト患者から得られ
る、請求項６の方法。
【請求項１０】試料中のマラリア原虫抗体の存在を検出する方法であって
、該試料を請求項１又は請求項２の単離されたタンパク質と接触させること；及び
該試料中のタンパク質とマラリア原虫抗体との間の、マラリア原虫の存在を示す
相互作用を同定することを含む方法。
【請求項１１】マラリア原虫が熱帯熱マラリア原虫である、請求項１０の
方法。
【請求項１２】タンパク質が検出可能部と結合している、請求項１０の方
法。
【請求項１３】試料が、マラリアを有すると推測されるヒト患者から得ら
れる、請求項１０の方法。
【請求項１４】熱帯熱マラリア原虫に感染していると推測される個体にお
いて熱帯熱マラリア原虫血中期サイクルを診断する方法であって、該個体から生物学的試料を得ること；該試料を請求項３〜５のいずれかに記載の抗体と接触させること；及び抗体と該試料中の抗原との間の、環状体期感染を示す相互作用を同定することを
含む方法。
【請求項１５】熱帯熱マラリア原虫に感染していると推測される個体にお
いて熱帯熱マラリア原虫血中期サイクルを診断する方法であって、該個体から生物学的試料を得ること；該試料を請求項１又は２のタンパク質と接触させること；及びタンパク質と該試料中の抗体との間の、環状体期感染を示す相互作用を同定する
ことを含む方法。
【請求項１６】単離されたタンパク質ＲＳＰ−１及びＲＳＰ−２のうちの
少なくとも１つと、医薬的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項１７】免疫原性組成物である、請求項１６の組成物。
【請求項１８】ワクチンである、請求項１６の組成物。
【請求項１９】個体において熱帯熱マラリア原虫感染から個体を防御する
ための免疫応答を誘導するのに十分な量の、単離されたタンパク質ＲＳＰ−１及
びＲＳＰ−２のうちの少なくとも１つを含む組成物。
【請求項２０】アジュバントをさらに含む、請求項１９の組成物。
【請求項２１】投与が１回以上実施される、請求項１９の組成物。
【請求項２２】２００１年２月２３日に受託番号Ｉ−２６３５の下でＣＮ
ＣＭに寄託されたＰｆ２６Ｇ１／Ｂ４なる名称のハイブリドーマ細胞。