JP2003533217A - 分裂促進因子および内分泌調節因子としての新規な二重オキシダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、反応性酸素中間物の生成に関連する、そして細胞分裂、甲状腺のホルモン生合成および組織線維症を含む生物学的機能に影響を及ぼす過酸化的な反応に関連する、新規なタンパク質の生成をコードする新しい遺伝子に関する。本発明はまた、これらの遺伝子を含むベクター、これらのベクターによってトランスフェクトされた細胞、これらの新規なタンパク質に対して惹起された抗体、これらの遺伝子およびタンパク質の検出、局在化および測定のためのキット、ならびに本発明のタンパク質の活性に影響を及ぼす薬物の活性を決定する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 米国政府は、特許所有者が合理的条件上の国立衛生研究所補助金ＨＬ３８２０
６の条件によって提供されるように他を認可することを必要とするために限られ
た状況の本発明および右の支払済みの許可を有するＨＬ５８０００、そして、Ｃ
Ａ８４１３８。

【０００２】 （発明の技術分野） 本発明は甲状腺のホルモン生合成に対する、そして、線虫表皮生物発生説に対
する特定の分裂促進的な規則において、通常で異常な細胞成長の分野に関する。
本発明は、以下を提供する：甲状腺のホルモン生合成に触媒作用を及ぼして、線
虫において表皮の生物発生説に触媒作用を及ぼす分裂促進的なレギュレータであ
る酵素の生成をコードするヌクレオチド配列；これらの酵素のアミノ酸配列；こ
れらのヌクレオチド配列を含んでいるベクター；これらの酵素を生産するベクタ
ーを有する細胞をトランスフェクションさせる方法；そして、これらの酵素のレ
ベルを検出して、測るために、そして、これらの酵素の細胞外エピトープを所有
している細胞に縛るために役立つこれらの酵素に対する抗体。

【０００３】 （発明の背景） 反応性酸素中間物（ＲＯＩ）は、酸素の部分的な減少製品である：１つの電子
は０２を形式過酸化物（２）に下げる、そして、２つの電子は２を形式過酸化水
素（Ｈ２Ｏ２）に下げる。ＲＯＩは、酸素の代謝の副産物として、そして、毒物
的なメカニズムによって発生する。様々な細胞のＨ２Ｏ２へのその転換が、０２
−ａｎｄの管理された酵素の生成の証拠を育ててある。０２−ｔｏ Ｈ２Ｏ２の
転換は、自発的に起こるが、過酸化物ｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ＳＯＤ）によって、
著しく速められる。ＲＯＩの高いレベルは、生体分子（例えばＤＮＡ、生体膜お
よびタンパク質）に、損害と関連する。最近の証拠は、通常の細胞条件のＲＯＩ
および信号を送ることまでの位置の生成および０２−ａｎｄ Ｈ２Ｏ２のための
代謝役割を示す。

【０００４】 生物学的いくつかのシステムは、反応性酸素を生成する。好中球のような食細
胞の細胞は、殺菌のメカニズムのそれらのバッテリの一部として大きい多量のＲ
ＯＩを生成する。バクテリアに対するまたはホルミルＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅま
たはホルボール・エステルのようなさまざまな可溶な仲裁者に対する好中球の露
出は酸素の大きい消費を活性化する。そして、Ｈ２Ｏ２、ＨＯＣ１および水酸基
の第２の生成については、まず最初に過酸化物を生成するために、呼吸の爆発と
呼ばれる。この酸素消費に対して責任がある酵素は、呼吸の爆発オキシダーゼ（
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸−短縮形（ＮＡＤＰＨ）オキシダ
ーゼ）である。

【０００５】 特に細胞増殖に関する状況において、ＲＯＩの生成の証拠は、非食細胞の細胞
によって成長している。加えて、甲状腺のような若干の組織において、ＲＯＩ生
成は、甲状腺のホルモンの生合成のような代謝転換に関係する。Ｈ２Ｏ２（Ｏ２
−）の重大な世代または、両方とも若干の細胞タイプにおいて有名だった。線維
芽細胞および人間の内皮細胞は、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１または腫瘍壊死要
因（ＴＮＦ）のようなサイトカインに応答して、過酸化物の増加する発表を示す
（マイヤーほか（１９８９の）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ２６３，５３９−５４５
．；松原ほか（１９８６の）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ． １３７，３２９５−３２９８）
。ラース−変わる線維芽細胞は、制御線維芽細胞と比較して増加する過酸化物リ
リースを示す（イラン人、その他（１９９７の）サイエンス２７５，１６４９−
１６５２）。脈管の平滑筋細胞が示すネズミは、ＰＤＧＦに応答してＨ２Ｏ２リ
リースを増加した（Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎその他（１９９５の）サイエンス２７
０，２９６−２９９）、そして、アンギオテンシンＩＩ（Ｇｒｉｅｎｄｌｉｎｇ
その他（１９９４の）Ｃｉｒｃ．物件。７４，１１４１−１１４８； 福井ほか（１９９７の）Ｃｉｒｃ．物件。８０、４５−５１；ウシオ−Ｆｕｋａ
ｉその他（１９９６）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃ｝ｌｅ７７１． ２７１，２３３１
７−２３３２１）、そして、これらの細胞のＨ２Ｏ２は、増加する増殖率と関連
する。様々な細胞タイプのＲＯＩの出来事は、表１（Ｂｕｒｄｏｎ、Ｒ．（１９
９５の）ＦｒｅｅＲａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １８、７７５−７９
４から適応した）において要約される。

【０００６】 表１ Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ 人間の線維芽細胞 Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞 人間の内皮細胞 ネズミ膵臓セル 人間／ネズミ平滑筋細胞 ネズミｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ 人間の分厚い細胞 ウサギ軟骨細胞 人間骨細胞 人間腫瘍細胞 ＢＨＫ−２１細胞 細胞を太らすと 人間の結腸の上皮細胞。

【０００７】 ＲＯＩが好中球によって生成した３Ｔ３ ＬＩ細胞が細胞障害性効果がある。
ＲＯＩが通常そうな、ＲＯＩがまた、組織損害を誘導することができることを侵
入している微生物で指令する（ｅ。扇動的な状況（例えば関節炎、ショック、肺
病および扇動的な腸病）において、ｇ．）、または、腫瘍開始または、ＤＮＡに
対する効果に損害を与えることのために、促進の含むことができる。ネーサン（
Ｓｚａｔｒｏｗｓｋｉほか（１９９１の）Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ． ５１，７９４−
７９８）腫瘍細胞のＲＯＩの世代が腫瘍に示すｈｙｐｅｒｍｕｔａｂｉｌｉｔｙ
に貢献することができて、したがって、腫瘍異質性、侵入および転移に貢献する
ことができることを提案する。細胞障害性で突然変異誘発性役割に加えて、ＲＯ
Ｉが信号分子として理想的な特性を有すること：１）、それらは上流の信号に応
答して制御方法で発生する；２）、信号はＳＯＤおよびカタラーゼによる０２−
ａｎｄ Ｈ２Ｏ２／ペルオキシダーゼの速い代謝によって終了されることができ
る；３）、彼らは目標分子に対する下流の効果を引き出す。ｅに、ｇ．、ＮＦカ
ッパＢおよびＡＰ−１のようなレドックスに敏感な規定するタンパク質（Ｓｃｈ
ｒｅｃｋほか（１９９１の）ＥＭＢＯ Ｊ． １０，２２４７−２２５８； シュミットほか（１９９５の）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ及びＢｉｏｌｏｇｙ ２，１
３−２２）。０２−およびＨ２Ｏ２のようなオキシダントはバクテリアの比較的
かなり定義済みの信号を送っている役割を有する。そして、コピーを管理するた
めにＳｏｘＩ／ＩＩ ｒｅｇｕｌｏｎを経て作動する。ＲＯＩは、細胞分裂を管
理する際の直接の役割を有するように見えて、成長に関連した病理学の状況の分
裂促進的な信号として機能することができる。これらの状況は、ガンおよび心臓
血管の病気を含む。サイトカインに応答して内皮細胞において発生する０２−ｉ
ｓおよび力は、血管形成で役割を演ずる（松原ほか（１９８６の）Ｊ． Ｉｍｍ
ｕｎ．１３７，３２９５−３２９８）．０２−ａｎｄ２０２は、また、機能ａｓ
”ｌｉｆｅ−信号に申し込まれる」。そして、細胞がアポトーシス（松原ほか（
１９８６の）Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． １３７，３２９５３２９８）を経るのを防止
する。上記のように、多くの細胞は、発育因子に応答する（ｅ。ｇ．、小板引き
出された発育因子（ＰＤＧＦ）、表皮の引き出された発育因子（ＥＧＦ）、アン
ギオテンシンＩＩ、そして、多様なサイトカイン）Ｏｚ’／Ｈ２Ｏ２の増加する
生成および増加する増殖を有する。ＲＯＩ生成の抑制は、分裂促進的な反応を防
ぐ。ｅｘｏｇｅｎｏｕｓｌｙな生成された０２−ａｎｄ Ｈ２Ｏ２への露出は、
細胞増殖の増加に結果としてなる。応答する細胞タイプの部分的なリストは、表
２に示される（Ｂｕｒｄｏｎ（Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌ．がＭｅｄ
したＲ．（１９９５））から適応した。１８，７７５−７９４）．ハムスター線
維芽細胞マウス表皮の細胞人間平滑筋細胞ネズミ結腸の上皮細胞ネズミ脈管の平
滑筋ネズミ脈管の平滑筋細胞細胞Ｗｈｉｌｅ非変わる細胞がそうすることができ
る。

【０００８】 表２ Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ過酸化物 人間（ハムスター線維芽細胞マウスｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｉｃな細胞Ｂａｌｂ／
３Ｔ３細胞Ｂａｌｂ／人間のｈｉｓｔｉｏｃｙｔｉｃな３Ｔ３セル白血病ネズミ
）はＲＯＩの生成を有する発育因子およびサイトカインに応答する。

【０００９】 そして、腫瘍細胞は抑制できない方法のＲＯＩを生産するように見える。 一連の人間の腫瘍細胞は、非腫瘍細胞（Ｓｚａｔｒｏｗｓｋｉほか（１９９１の
）Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ５１，７９４−７９８）と比較して、大量の過酸化水
素を生産した。細胞が生成したラース−変わるＮＩＨ ３Ｔ３は過酸化物の量を
上げた、そして、いくつかのメカニズムによる過酸化物生成の抑制はａ”ｎｏｒ
ｍａｌ”ｇｒｏｗｔｈ発現型への復帰に結果としてなった。０２−ｈａｓ黒色腫
を含んでいるガン細胞、胸癌、線維肉腫およびｖｉｒａｌｌｙな変わる腫瘍細胞
の変わる発現型のメンテナンスの関係させる。ＳＯＤ（ＭｎＳＯＤ）のマンガン
種類の減少されたレベルはガン細胞および試験管内の変わる細胞系において測ら
れた。そして、増加する０２−レベル（Ｂｕｒｄｏｎ、Ｒ．（１９９５の）Ｆｒ
ｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １８、７７５−７９４）を予測
した。頻繁に黒色腫において消失する染色体６ｑ２５に、ＭｎＳＯＤはコード化
される。黒色腫および他のガン細胞のＭｎＳＯＤのＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ（全米科学アカデミー９０（３１１３−３１１７）教会のほか（１９９３の）
会報；フェルナンデス−Ｐｏｌほか（１９８２の）Ｃａｎｃ．物件。４２，６０
９−６１７；Ｙａｎほか（１９９６の）Ｃａｎｅ． Ｒｅｓ． ５６，２８６４
−２８７１）変わる発現型の抑制の結果としてなる。

【００１０】 ＲＯＩは、血管形成の後、高血圧、アテローム性動脈硬化症およびｒｅｓｔｅ
ｎｏｓｉｓと関連する脈管の平滑筋の成長に関係する。０２−生成は、ウサギ大
動脈の外膜（Ｐａｇａｎｏほか（１９９７の）会報全米科学アカデミー９４，１
４４８３−１４４８８）に示す。脈管の内皮細胞は、サイトカイン（松原ほか（
１９８６の）Ｊ：Ｉ７ｎ７ｎｚｍ． １３７，３２９５−３２９８）への０２−
ｉｎ反応をリリースする。また、細胞肥大を誘発するアンギオテンシンＩＩによ
って、培養および増加する０２−世代の大動脈の平滑筋細胞によって発生する０
２−ｉｓは、刺激される。ネズミ・モデル・システムの、アンギオテンシンＩＩ
の注入がその後単離された大動脈の組織の０２−生成を増加したのと同様に、高
血圧につながること（ウシオ−Ｆｕｋａｉほか（１９９６の）Ｊ． Ｂｉｏｌ．
化学２７１，２３３１７−２３３２１．；Ｙｕほか（１９９７の）Ｊ． Ｂｉｏ
ｌ．化学２７２，２７２８８−２７２９４）。それが脈管構造に局所化するＳＯ
Ｄの種類または０２−廃品回収業者防がれたアンギオテンシンＩＩの注入の静脈
の注入は、高血圧を誘発して、ＲＯＩ生成を禁止した（福井ほか（１９９７の）
Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ． ８０，４５−５１）。好中球ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ま
た、食細胞呼吸の爆発オキシダーゼとして公知の）は、方法を専門酵素のＲＯＩ
−生成システムの研究のために用意する。この広く周到な酵素は、ＮＡＤＰＨを
酸化させて、酸素をＮＡＤＰＨオキシダーゼが成る形式２ｅに直す多数のタンパ
ク質、そして、ｃｙｔｏｓｏｌｉｃなおよび膜部品の組立てによって管理する。
触媒作用の半分はｆｌａｖｏｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂ５５８から成る。そして
、必要不可欠な原形質膜酵素が２つの構成要素から成る：ｇｐ９１ｐｈｏｘ（ｇ
ｐは、グリコプロテインに関連する；ｐｈｏｘはワード食細胞およびオキシダー
ゼの省略形である）、そして、ｐ２２ｐｈｏｘ（ｐは、タンパク質に関連する）
。ｇｐ９１ｐｈｏｘは部位を結合しているＮＡＤＰＨと同様に１つのフラビンア
デニンジヌクレチオド（ＦＡＤ）および２つのヘムを含む。ｐ２２ｐｈｏｘはｃ
ｙｔｏｓｏｌｉｃな規定するタンパク質の結合する場所として役立つＣ−末端・
プロリンの豊富な配列を有する。２つのシトクロム・サブユニット、ｇｐ９１ｐ
ｈｏｘおよびｐ２２ｐｈｏｘは、いずれのサブユニットもの遺伝する不調の慢性
ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｕｓな病気（ＣＧＤ）がパートナー・サブユニット（Ｙ
ｕほか（１９９７の）Ｊ． Ｂｉｏｌ．化学２７２，２７２８８２７２９４）の
非存在下で起こるように遺伝子の欠如から、お互いを安定させるように見える。
基本的ｃｙｔｏｓｏｌｉｃなタンパク質は２つのｉｓｏｆｏｒｍｓ． ｐ４７ｐ
ｈｏｘがあるｐ４７ｐｈｏｘ（ｐ６７ｐｈｏｘおよび小さいＧＴＰａｓｅ Ｒａ
ｃ）を含む、そして、ｐ６７ｐｈｏｘは両方とも起動の間、オキシダーゼ部品の
組立てを決定しているタンパク質相互作用に参加するＳＨ３領域およびｐｒｏｌ
ｉｎｅ−ｒｉｃｈ領域を含む。ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇしているタンパク質Ｒａ
ｃを活性化するためにグアニン・ヌクレオチド交換によって同程度よく、好中球
酵素は、ｐ４７ｐｈｏｘおよびおそらく他の構成要素のリン酸化によって、バク
テリアの食菌作用またはｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃな信号に応答して管理される。
非食細胞の組織のＲＯＩの起源は証明されていない、しかし、食細胞オキシダー
ゼ構成要素の出来事はｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌな方法、ノーザンしみおよ
び逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によっていくつかのシス
テムで評価された。０２−生成ができる細胞タイプがｇｐ９１ｐｈｏｘを含んで
いるｐｈｏｘ構成要素の全てを含むために示されたＲａｃｌ． Ｓｅｖｅｒａｌ
のためのそれが表３の下記を要約されていているように、ｐ２２ｐｈｏｘのため
のメッセージは広く表される。これらの細胞タイプは、内皮細胞、大動脈の外膜
およびリンパ球を含む。

【００１１】 表３ Ｔｉｓｓｕｅ ｇ９ｌｐｈｏｘ ｐ２２ｐｈｏｘ ｐ４７ｐｈｏｘ ｐ６７ｐｈ
ｏｘ好中球＋１ Ｚ ＋１ ｚ ＋１、２ ＋ｌ、ｚ大動脈の外膜＋ｌ ＋ｌ
＋ｌ ＋ｌリンパ球＋２ ＋２ ＋１、２ ＋１、２内皮細胞＋２ ＋２ ＋１
、２ ＋１、２ ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｍｅｓａｎｇｉａｌな＋１、２ ＋１
、２ ＋１、２細胞線維芽細胞−＋２ ＋１、２ ＋２大動脈のｓｍ． ｍｕｓ
ｃｌｅ−＋１（２） 示される１＝タンパク質発現。 示される２＝ ｍＲＮＡ発現。

【００１２】 明確に異なるパターンは、ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｍｅｓａｎｇｉａｌな細胞
、ネズミ大動脈の平滑筋および線維芽細胞を含む表３に示される他のいくつかの
細胞タイプに示す。これらの細胞において、ｐ２２ｐｈｏｘおよび場合によって
はｃｙｔｏｓｏｌｉｃなｐｈｏｘ構成要素があることを証明されると共に、ｇｐ
９１ｐｈｏｘの現れは不在である。ｇｐ９１ｐｈｏｘおよびｐ２２ｐｈｏｘが好
中球のお互いを安定させるので、若干の分子（おそらくｇｐ９１ｐｈｏｘに関す
る）がｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｍｅｓａｎｇｉａｌな細胞、ネズミ大動脈の平滑
筋および線維芽細胞のＲＯＩ生成を説明する多くの推測があって、（ウシオ−Ｆ
ｕｋａｉほか（１９９６の）Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｌａｉｍ． ２７１，２３３１
７−２３３２１）。ｇｐ９１ｐｈｏｘの遺伝子の欠如をもつ患者からの線維芽細
胞の調査は、ｇｐ９１ｐｈｏｘサブユニットがこれらの細胞（Ｅｍｍｅｎｄｏｒ
ｆｆｅｒほか（１９９３の）Ｅｕｒ． ｌ． Ｈａｅｙｎａｔｏｌ． ５１，２
２３−２２７）のＲＯＩ生成に、関係していないという証明を提供する。アンチ
センスの方法を使用している脈管の平滑筋からのｐ２２ｐｈｏｘの減少は、検出
可能なｇｐ９１ｐｈｏｘ（ウシオ−Ｆｕｋａｉほか（１９９６の）Ｊ． Ｂｉｏ
ｌ．化学２７１，２３３１７−２３３２１）の欠如にもかかわらず、このサブユ
ニットがこれらの細胞のＲＯＩ生成に参加することを示した。甲状腺のホルモン
はミトコンドリア一呼吸上のｅｎｄｅｆｆｅｃｔｓによる基礎の代謝率を管理す
る、そして、ｕｎｄｅｒ−ｏｒ生産過剰の条件は臨床的に重要である。甲状腺の
ホルモンの生合成を管理する薬の開発は医学的に重要な目的である、そして、こ
の経路の酵素の識別はｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙな関連した目標を開
発することの鍵である。甲状腺は独自にヨウ化物に集中する。そして、それはチ
ログロブリン（ＴＧ）上のチロシン残留物をｉｏｄｉｎａｔｅするために用いる
。 ＴＧは６７のｔｙｒｏｓｙｌ残留物を含む大きいタンパク質（６６０ｋＤａ
）である。そして、その幾つかはｉｏｄｉｎａｔｉｏｎの優先の場所である。Ｔ
ＧのチロシンのＩｏｄｉｎａｔｉｏｎは、甲状腺のペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）
（原形質膜ヘムタンパク質）によって触媒作用を及ぼされる。Ｉｏｄｉｎａｔｉ
ｏｎは、Ｈ２Ｏ２の以前に未確認の酵素の出所を必要とする。第２のステップは
タンパク質提携のチロキシン（Ｔ４）を形成する２つのｄｉｉｏｄｏｔｙｒｏｓ
ｉｎｅｓ（ＤＩＴ）の連結である。そして、それは自由なＴ４を自由にするため
にその後ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙにＴＧから隔離される。必要であるこ
とは、甲状腺のＨＺＯＺを生成する、そして、カップリング反応および甲状腺の
ホルモン生合成を調整するためにその組成物を使用する方法に触媒作用を及ぼす
酵素をコード化する遺伝子の組成物である。この種の情報は、甲状腺の機能の変
調のための薬の開発に役立つ。この種の変調は、甲状腺機能亢進の治療に役立つ
かもしれない。最近の証拠は、刺激される発育因子のチロシンの中で酸性にクロ
スリンクすることに関係しているその酵素に線維芽細胞がｆｉｂｒｏｔｉｃな損
害に至ることができることを示唆する。肺線維症は、この状態で苦しめられる個
人に対する特に損傷である。薬が、特に肺において、軽減するかまたはｆｉｂｒ
ｏｔｉｃな損害を防ぐように設計されていてもよいために、この種の酸性のクロ
ス連結している反応に関係している酵素をコード化している遺伝子の識別が必要
である。

【００１３】 寄生的な病気は、世界的に不健全および死亡率の人間および動物の主な原因で
あって、農業の生産性に対する重大な衝撃も有する。寄生的な病気は、表皮（線
虫のような寄生体の厳しいｅｘｏｓｋｅｌｅｔａｌな構造）の存在のための一部
において、扱うのが困難であると判明した。必要であることは、組成物および、
表皮を有する寄生体によって生じるそれらの寄生的な病気を含むがこれに限らず
、寄生的な病気と戦うために組成物を使用する方法である。

【００１４】 したがって、必要であることは、虫をホスト防衛機構および薬物治療に影響さ
れやすくする表皮の形成を中断させる方法である。また、必要であることは、特
に非食細胞の組織および細胞において、ＲＯＩ生成に関係しているタンパク質の
同一性である。

【００１５】 また、必要であることは、これらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列
およびタンパク質の主要な配列である。

【００１６】 また、これらのタンパク質のためのヌクレオチド符号化を含むように設計され
ているベクターが、必要である。ヌクレオチド配列に由来する調査およびＰＣＲ
プライマーはｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列を検出して、局所化して、測定す
るために必要である。そして、これらのタンパク質の統合に関係している。

【００１７】 加えて、必要であることは、これらのベクターを有する細胞をトランスフェク
ションさせる手段である。

【００１８】 また、必要であることは、これらの分子の生成の発現システムである。 また、局地化を含んでいる様々な使用、発見および測定値のためのこれらの分子
に向けられる抗体が、必要である、そして、受動免疫。

【００１９】 （発明の開示） 本発明はヌクレオチド配列の新しい一系統を提供することによって上記した課
題を解決する、そして、これらのヌクレオチド配列によってコード化されるタン
パク質はｄｕｏｘをタンパク質と呼んだ。

【００２０】 特に、本発明はヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯから成る組成物を提供す
る：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、そして、断片、そして、保守的なそれに
ついて置換それ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯから成るタンパク質の発現のためのコード
化する：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：それぞれ４、そして、断片、そして、そ
れの保守的な置換。好適なタンパク質断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．を含むが、
これに限定されるものではない：３１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２。

【００２１】 以下の記載によって束縛されたくないと共に、これらのタンパク質がＲＯＩ生
成に関係していて、過酸化物生成を刺激するかまたは過酸化的な反応を起こすこ
とができると考えられる。

【００２２】 本発明もこれらのヌクレオチド配列を含んでいるベクターを提供する。そして
、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯから成るタンパク質を生産するこれらのベクターによって
、細胞がトランスフェクションする：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、そして
、断片、そして、それの保守的な置換およびこれらのタンパク質および断片およ
びそれの保守的な置換に対する抗体。

【００２３】 本発明も、方法をＳＥＱ ＩＤ ＮＯから成るタンパク質の生成のためにコー
ド化されるベクターを管理することによって細胞増殖を刺激するために提供する
：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、そして、断片、そして、それの保守的な置
換、本発明もＳＥＱ ＩＤから成るタンパク質を管理することによって細胞増殖
を刺激する方法にＮＯを提供する：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４および断片
および保守的な置換それについて。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯから成るタンパク質：２
およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、そして、断片、そして、それの保守的な置換は
、線虫を含むがこれに限らず外骨格（寄生体の特に表皮）に影響を及ぼすことに
役立つ。

【００２４】 本発明のヌクレオチドおよび抗体は、発見、局地化および本発明のタンパク質
の生成のための、更に、発見、局地化および本発明のタンパク質の寸法のための
核酸符号化の測定に役立つ。これらのヌクレオチドおよび抗体は、発見、局地化
および測定値の目的のためのキットの他の試薬と組み合わせられることができる
。 最も特に、本発明は活性を修正することによる細胞分裂または細胞増殖またはＳ
ＥＱ ＩＤと記述されるｄｕｏｘタンパク質の発現の調整のための方法を含む：
２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４または断片、または、それの保守的な置換。 それらの自然に起こっているか表されたフォームにおいて、これらのタンパク質
は、これらの酵素活性の抑制を観察することによる化学のおよび薬ライブラリの
スクリーニングのための実施例のために、薬開発に役立つと思われる。

【００２５】 この種の化学製品および薬は、たぶんガン、前立腺の肥大、優しい前立腺の肥
大、高血圧、代謝病気、線維症、アテローム性動脈硬化症および異常な細胞成長
または増殖を含んでいる多くの他の不調の治療として有効である、そして、動物
および収穫の下記のように様々な寄生的な病気。全ての表されたタンパク質は、
これらの分析評価に役立ってもよい。抑制または変更態様の目標であってもよい
分子の部分は、ピリジン・ヌクレオチド（ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ）、フラビ
ンタンパク質領域（ほぼＣ−末端２６５のアミノ酸）および／またはフラビンア
デニンジヌクレチオド（ＦＡＤ）の結合するか触媒作用の場所の結合する場所を
含むが、これに限定されるものではない。

【００２６】 本発明の方法が、薬の開発または以下を含むがこれに限らず異常な成長にかか
わる状況の治療のための他の療法のために使われることができる：ガン、線維症
、肺線維症、代謝アンバランス、甲状腺のアンバランス、ｈｙｐｅｒｔｈｒｙｏ
ｉｄｉｓｍ、乾癬、前立腺の肥大、優しい前立腺の肥大、心臓血管の病気、血管
およびリンパ管容器、ａｒｔｅｒｉｏｖｅｎｏｕｓな奇形、目と関連する脈管の
課題、アテローム性動脈硬化症、高血圧および血管形成および寄生的な病気に続
いているｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓを含むがこれに限らず、容器の増殖。

【００２７】 本発明の酵素は、これらの酵素活性を調整することができる薬およびその他因
子の開発の優れた目標である。それは、活性の変調がそうすることができるため
に、理解されるために強化されて中で結果が減少したということである、または
、酵素活性の欠如。異常な成長、代謝不調および線維症にかかわる状況を含むが
これに限らず、これらの酵素活性の変調は、状況の治療に役立ってもよい。ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ．で表されるｄｕｏｘ酵素活性に影響を及ぼす薬：２およびＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：４または断片、または、それの保守的な置換は、また、特定の
状況の治療の他の治療学と組み合わせられることができる。

【００２８】 たとえば、アテローム性動脈硬化症の、そして、ホルモンの作動筋を有する処
理のための薬を下げているコレステロールまたは内分泌の不調（例えば甲状腺の
不調）の治療の敵対者については、高血圧の治療のための抗高血圧剤については
、これらの薬は、ガンの治療の血管形成抑制剤と組み合わせられることができる
。 あることはそれを理解したことは、ある本発明のタンパク質以下から成る制限さ
れない、ために（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４また
は断片、または、それの保守的な置換は、他の組成物（例えば抗寄生虫性の組成
物、農薬、除草剤および肥料）と共に管理されることができる。

【００２９】 したがって、本発明のタンパク質は人間を扱うための他の組成物または家畜、
他の農場動物および家畜を含む動物と協力してか単独で役立ってもよい。そして
、寄生体（特に土線虫）によってプラントおよび収穫を攻撃から保護するために
、そして、寄生体を破壊するために防ぐかまたは寄生的な病気と得るために戦う
ために、ペットを含む。

【００３０】 したがって、本発明の目的はヌクレオチド配列またはそれであるか保守的な断
片にそれの置換、タンパク質の生成のための符号化またはそれであるか保守的な
断片を提供することになっているそれについて置換、ＲＯＩ生成に関係している
か、過酸化物生成を刺激するかまたは過酸化的な反応を起こす。

【００３１】 本発明のもうひとつの目的は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯにおいて代表されるタンパ
ク質を提供することにある。２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：３１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２または断片、または、それの保守的な置
換。

【００３２】 本発明のもうひとつの目的は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯにおいて代表されるタンパ
ク質をコードするヌクレオチド配列を提供することにある。２（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．）：４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２ま
たは断片、または、保守的なそれについて置換、これらのヌクレオチド配列は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯを含む：１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３または断片、または
、それの保守的な置換。

【００３３】 本発明の他の目的は、ｅｘｏｓｋｅｌｅｔａｌな表皮形成を防いで、外骨格ま
たは表皮を有する有機体を害するように設計されている療法の目標として使われ
ることができるｅｘｏｓｋｅｌｅｔａｌな表皮形成において関係するタンパク質
（それの断片またはそれの保守的な置換）（特に寄生体）を提供することである
。

【００３４】 本発明の他の目的は、甲状腺のホルモンの生合成を禁止するように設計されて
いる療法の目標として使われることができる甲状腺のホルモン生合成において関
係するタンパク質（それの断片またはそれの保守的な置換）を提供することであ
る。

【００３５】 本発明のさらに他の目的は、線維症を防ぐように設計されている療法の目標と
して使われることができる組織線維症において関係するタンパク質（それの断片
またはそれの保守的な置換）を提供することである。

【００３６】 本発明のもうひとつの目的は、肺線維症を防ぐように設計されている療法の目
標として使われることができる肺線維症に関係しているタンパク質を提供するこ
とにある。

【００３７】 本発明のもうひとつの目的は、これらのヌクレオチド配列を含んでいるベクタ
ーまたはそれの断片を提供することにある。 さらに、本発明の別の目的は、これらのベクターによってトランスフェクション
する細胞を提供することになっている。

【００３８】 さらに別の本発明の目的は、動物および人間にこれらのベクターによってトラ
ンスフェクションする細胞を管理することになっている。 本発明のもうひとつの目的は、タンパク質またはそれについて断片、ＲＯＩ生成
に関係しているか、過酸化物生成を刺激するかまたは過酸化的な反応を起こすを
提供することにある。

【００３９】 他の本発明の目的がある静寂は単クローンおよび多クローン性抗体を含む抗体
またはそれの断片に提供して、タンパク質またはそれであるか保守的な断片に対
して上げたそれについて置換、ＲＯＩ生成に関係しているか、過酸化物生成を刺
激するかまたは過酸化的な反応を起こす。 この種の抗体は局地化およびタンパク質またはそれの断片の寸法に役立つ。そし
て、ＲＯＩ生成に関係している。

【００４０】 他の本発明の目的はタンパク質またはそれであるか保守的な断片の生成のため
に、ヌクレオチド配列またはそれの断片を含んでいる遺伝子を管理するためにコ
ード化しているそれについて置換、ＲＯＩ生成に関係しているか、過酸化物生成
を刺激するかまたは、動物および人間にとって、更に、動物および人間から得ら
れた細胞にとって、過酸化的な反応を起こす。

【００４１】 他の本発明の目的はヌクレオチド配列を含んでいる遺伝子またはそれであるか
保守的な断片のアンチセンスの賞賛の配列にそれの置換、タンパク質の生成のた
めの符号化またはそれであるか保守的な断片を施すことになっているそれについ
て置換、ＲＯＩ生成に関係しているか、過酸化物生成を刺激するかまたは、動物
および人間にとって、更に、動物および人間から得られた細胞にとって、過酸化
的な反応を起こす。

【００４２】 ＲＯＩ生成に関係している、過酸化物生成を刺激する、または、過酸化的な反
応を、動物および人間にとって、起こすさらに、本発明の別の目的は、それにつ
いてヌクレオチド配列または断片を含んでいるベクターを管理することによって
刺激するかまたは細胞増殖を禁ずる方法にタンパク質の生成またはそれの断片の
ための符号化を提供するためにある。

【００４３】 本発明のまた、目的は、それについてそれについてヌクレオチド配列または断
片のアンチセンスの賞賛の配列を含んでいるベクターにタンパク質または断片の
生成のための符号化を施すことによって刺激するかまたは細胞増殖を禁ずるため
の方法、ＲＯＩ生成に関係しているか、過酸化物生成を刺激するかまたは、動物
および人間にとって、過酸化的な反応を起こすを提供することである。 細胞増殖を刺激するこれらの方法は、様々な目的に役立つ、腫瘍形成、化学療法
に続いている血液髄細胞の刺激的な細胞増殖または放射の動物のモデルを開発し
て、を含むがこれに限らず、または、貧血症の場合には。

【００４４】 ＲＯＩ生成に関係している、過酸化物生成を刺激する、または、過酸化的な反
応を起こすさらに、本発明の別の目的は、発見、局地化およびヌクレオチド配列
またはそれの断片の寸法に役立つヌクレオチド調査にタンパク質の生成またはそ
れの断片のための符号化を提供するためにある。

【００４５】 本発明のもうひとつの目的は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯにおいて代表される核酸を
含んでいる核酸の探知に役立つキットを提供することにある。１およびＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：３またはそれであるか保守的な断片それについて置換、それはタン
パク質またはそれであるか保守的な断片のためにコード化するそれについて置換
、ＲＯＩ生成に関係しているか、過酸化物生成を刺激するかまたは過酸化的な反
応を起こす。

【００４６】 さらに、本発明の別の目的は、発見に役立つキットおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
において代表される核酸を含んでいる核酸の寸法を提供することになっている：
１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはそれについて断片、それはタンパク質ま
たはそれであるか保守的な断片のためにコード化するそれについて置換、ＲＯＩ
生成に関係しているか、過酸化物生成を刺激するかまたは過酸化的な反応を起こ
す。

【００４７】 本発明のもうひとつの目的は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯにおいて代表されるタンパ
ク質を含むタンパク質の探知に役立つキットを提供することにある。２およびＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４またはそれについて断片、ＲＯＩ生成に関係しているか
、過酸化物生成を刺激するかまたは過酸化的な反応を起こす。

【００４８】 さらに、本発明の別の目的は発見に役立つキットおよびタンパク質の寸法を提
供することになっている。そして、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯにおいて代表されるタン
パク質を含む：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４またはそれについて断片、ＲＯ
Ｉ生成に関係しているか、過酸化物生成を刺激するかまたは過酸化的な反応を起
こす。

【００４９】 さらに別の本発明の目的はタンパク質の局地化に役立つキットを提供すること
になっている。そして、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．で表されるタンパク質を含む： ２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４またはそれについて断片、ＲＯＩ生成に関係し
ているか、過酸化物生成を刺激するかまたは過酸化的な反応を起こす。さらに、
本発明の別の目的はあるタンパク質または断片のためのそれについて符号化を発
見、測定値または核酸またはそれの断片の局地化に役立つキットに提供する、Ｒ
ＯＩ生成に関連した異常な細胞増殖の診断および予想ために、ＲＯＩ生成に関係
している。

【００５０】 他の本発明の目的は、あるそれを発見、測定値またはタンパク質またはそれの
断片の局地化に役立つキットに提供する、ＲＯＩ生成に関連した異常な細胞増殖
の診断および予想ために、ＲＯＩ生成の含む。

【００５１】 これらの、そしてまた他の、本発明の目的、特徴および利点は開示された実施
態様および添付の図面の以下の詳細な説明の再考の後、明らかになる。

【００５２】 （発明の詳細な説明） 本発明はヌクレオチド配列の新しい一系統を提供することによって上記した課題
を解決する、そして、タンパク質（これらのヌクレオチド配列によってコード化
される）はｄｕｏｘをタンパク質と呼んだ。ｔｅｒｍ”ｄｕｏｘ”ｒｅｆｅｒｓ
ｔｏ”ｄｕａｌオキシダーゼ」。特に、本発明はヌクレオチド配列ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯから成る新規な組成物を提供する：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、
そして、それであるか保守的な断片それについて置換、それぞれ、それはＳＥＱ
ＩＤから成るタンパク質の発現のために、ＮＯをコード化する：２およびＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：４、そして、それであるか保守的な断片それの置換。

【００５３】 好適なタンパク質断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯを含むが、これに限定されるも
のではない：３１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２．しかし、本願明細書におい
て記載されているｄｕｏｘタンパク質は、ＲＯＩ生成に関係しているｇｐ９１ｐ
ｈｏｘタンパク質に、ｄｕｏｘタンパク質がタンパク質の新しくてはっきりした
一系統から成る効果がある。

【００５４】 本願明細書において記載されているｄｕｏｘタンパク質は、３つのはっきりし
た領域を有する：ペルオキシダーゼ・タンパク質に対する異体同形を有するアミ
ンの末端の領域、ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ（ＣＡＭ）タンパク質に対する異体同形
を有する内部領域およびｍｏｘ（また、ｎｏｘと呼ばれている）タンパク質に対
する異体同形を有するカルボキシ・末端の領域。人間のｄｕｏｘ２のアミノ酸配
列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに示される：２．ｄｕｏｘ２タンパク質をコード化し
ているヌクレオチドは、また、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに示される：１．人間のｄｕ
ｏｘタンパク質に加えて、捜しているＢＬＡＳＴを使用しているゲノム・データ
ベースを有する人間のＤｕｏｘ１および人間のｄｕｏｘ２の配列の比較がＣ．
ｅｌｅｇａｎｓのｄｕｏｘの２つの相同物の識別に結果としてなったこと（Ｃｅ
−Ｄｕｏｘ１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、そして、偽遺伝子Ｃｅ−ｄｕｏｘ２
．ショウジョウバエも、少なくとも一つのｄｕｏｘ相同物を有するように見える
。このように、遺伝子／タンパク質のｄｕｏｘ一系統は、広く多細胞有機体に配
布される。

【００５５】 ｇｐ９ｌｐｈｏｘの高い分子量相同物は、人間（ｈ）およびＣ． ｅｌｅｇａ
ｎｓ（Ｃｅ）において識別されて、それらが両方とも有するＤｕｏｘ ｆｏｒ”
ｄｕａｌ ｏｘｉｄａｓｅ”ｂｅｃａｕｓｅと呼ばれるｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｈ
ｏｍｏｌｏｇｙ領域、そして、ｇｐ９１ｐｈｏｘ領域。Ｃｅ−Ｄｕｏｘは、反応
性酸素を生成するためにｃｙｔｏｓｏｌｉｃなＮＡＤＰＨを使用する。それは、
線虫のｃｕｔｉｃｕｌａｒ細胞外マトリックスの安定化に関係している自由なチ
ロシン・エチル・エステルの中でクロスリンクすることに触媒作用を及ぼす。

【００５６】 以下の記載によって束縛されたくないにもかかわらず、ｄｕｏｘ酵素（たとえ
ばｄｕｏｘ２およびＣｅ−Ｄｕｏｘ１）が二重の酵素の機能を有すると考えられ
る。そして、過酸化物の生成および過酸化的なタイプ反応に触媒作用を及ぼす。
反応の後のクラスは、基板（そして、場合によっては、基板として過酸化物を利
用するために提案された）として、過酸化水素を利用する。

【００５７】 過酸化水素が過酸化物の不均化から自発的に発生するので、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオ
キシダーゼ領域がそれからペルオキシダーゼ領域のための基板として使われるこ
とができる過酸化物および／または水素過酸化物を生成すると考えられる。 この仮説を支持して、細胞外Ｎ−末端・ペルオキシダーゼ領域を有するＣ． ｅ
ｌｅｇａｎｓのｄｕｏｘ２タンパク質のモデルは開発された。そして、膜内外領
域およびＮＡＤＰＨが原形質膜のｃｙｔｏｓｏｌｉｃな表面にある部位を結合し
た。

【００５８】 細胞外過酸化物を生成する好中球ＮＡＤＰＨ−ｏｘｉｄａｓｅから類推して、
それがペルオキシダーゼ領域によって利用されることができる所で、人間のｄｕ
ｏｘ２は細胞外で過酸化物およびその副産物過酸化水素を生成するために予測さ
れる。ペルオキシダーゼ領域は、追加の生物学的機能を授けそうである。共同基
板によって、ペルオキシダーゼはハロゲン化（例えばｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄ
ａｓｅによる次亜塩素酸（ＨＯＣ１）の生成および甲状腺のペルオキシダーゼに
よってチロキシンを形成するチロシンのｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ）を含んでいる様
々な反応に参加することができる。ペルオキシダーゼは、また、不飽和結合の多
い脂肪質の酸の代謝において、そして、コラーゲン（ウニｏｖｏｐｅｒｏｘｉｄ
ａｓｅによって）のチロシンの化学的処理において参加するために文書化された
。

【００５９】 この記載によって束縛されたくないにもかかわらず、ｄｕｏｘ２の予測された
膜内外性質が形成のその機能または細胞外マトリックスまたは基底膜の変更態様
を容易にすると考えられる。細胞外マトリックスが腫瘍細胞成長、侵入および転
移で重要な役割を演ずるので、ｄｕｏｘタイプ酵素がこの種の状況で病原性の役
割を演ずると考えられる。上記したヌクレオチド配列に加えて、本発明もそれに
ついてこれらのヌクレオチド配列およびそれの断片を含んでいるベクターまたは
保守的な置換にＳＥＱ ＩＤから成るタンパク質を生産するこれらのベクターに
よってトランスフェクションする細胞を提供すること：２およびＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：４、そして、それであるか保守的な断片それの置換、そして、これらのタ
ンパク質およびそれの断片に抗体。

【００６０】 本発明も方法をベクターを管理することによる刺激的な細胞増殖またはベクタ
ーを含んでいる細胞のために用意する。そして、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯから成るタ
ンパク質の生成のためにコード化される：２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４および
それの断片。

【００６１】 本発明のヌクレオチドおよび抗体は、発見、局地化および本発明のタンパク質
の生成のための、更に、発見、局地化および本発明のタンパク質の寸法のための
核酸符号化の測定に役立つ。これらのヌクレオチドおよび抗体は、発見、局地化
および測定値の目的のためのキットの他の試薬と組み合わせられることができる
。これらのキットは診断に役立つ、そして、細胞増殖を含んでいる状況の予想は
反応性酸素中間物の生成と関連した。

【００６２】 本発明は、ヌクレオチド配列ＳＥＱから成る組成物にＩＤいいえを提供するこ
とによって上記した課題を解決する：１およびそれの断片およびそれの保守的な
置換。

【００６３】 本発明も、ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯから成る組成物を提供する：
３およびそれの断片およびそれの保守的な置換。

【００６４】 本発明は、タンパク質ＳＥＱ ＩＤ ＮＯから成る組成物を提供する：２、そ
して、断片、そして、保守的な置換は、それについてヌクレオチド配列ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯによって、コード化した：１および断片および保守的な置換それにつ
いて。

【００６５】 本発明は、タンパク質ＳＥＱ ＩＤ ＮＯから成る組成物を提供する：４およ
び断片および保守的な置換は、それについてヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤによ
ってＮＯをコード化した：３および断片および保守的な置換それについて。好適
なタンパク質断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯを含むが、これに限定されるものでは
ない：３１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２．本発明も、ヌクレオチド配列ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯを含んでいるベクターを提供する：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：３またはそれの断片。

【００６６】 本発明も、これらのベクターによってトランスフェクションする細胞を提供す
る。加えて、本発明はヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯによって、安定して
トランスフェクションする細胞を提供する：１またはそれの断片。

【００６７】 本発明も、ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯによって、安定してトランス
フェクションする細胞を提供する：３またはそれの断片。

【００６８】 本発明は、ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯによって、安定してトランス
フェクションする細胞を提供する：１または断片、または、保守的なそれについ
て置換、それはタンパク質ＳＥＱ ＩＤ ＮＯを生産する：２または断片、また
は、それの保守的な置換。

【００６９】 加えて、本発明はヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯによって、安定してト
ランスフェクションする細胞を提供する：３または断片、または、それの保守的
な置換、それはタンパク質ＳＥＱ ＩＤ ＮＯを生産する：４または断片、また
は、それの保守的な置換。

【００７０】 本発明は、方法をヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．によって、安定して
トランスフェクションする細胞を管理することによって成長を刺激するために提
供する：１または断片、または、それの保守的な置換、それはタンパク質ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯを生産する：２または断片、または、それの保守的な置換。

【００７１】 本発明も、方法をヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯによって、安定してト
ランスフェクションする細胞を管理することによって成長を刺激するために提供
する：３または断片、または、保守的なそれについて置換、それはタンパク質Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯを生産する：４または断片、または、それの保守的な置換。具
体的には、本発明は方法をヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯによって、安定
してトランスフェクションする細胞を管理することによって腫瘍形成を刺激する
ために提供する：１またはそれについて断片、それはタンパク質ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯを生産する：２またはそれの断片。

【００７２】 本発明も、方法をヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯによって、安定してト
ランスフェクションする細胞を管理することによって腫瘍形成を刺激するために
提供する：３またはそれについて断片、それはタンパク質ＳＥＱ ＩＤ ＮＯを
生産する：４またはそれの断片。本発明は、また、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯにアンチ
センスのヌクレオチド配列を開発するために用いてもよい：１およびＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：３またはそれの断片。これらのアンチセンスの分子は、ヌクレオチド
配列（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）の翻訳のじゃまをするために用いてもよい：
１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはそれについて断片、それはＳＥＱ ＩＤ
ＮＯのようなタンパク質のためにコード化する：２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：
４またはそれの断片。これらのアンチセンスの分子の内閣または、人間および動
物にとって、反感覚分子のためのベクター符号化は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯのよう
なタンパク質の生成のじゃまをする：２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．）：４またはそ
れの断片（ＲＯＩおよび禁じている細胞増殖のこのことにより減少している生成
）。

【００７３】 これらの方法は、腫瘍の進行、表皮形成および脈管の成長の、そして、生体内
に腫瘍成長、脈管の成長および表皮形成に影響を及ぼすための処理の効力の研究
のための研究ために、動物のモデルを生産することに役立つ。本発明も方法を薬
の高いスループット・スクリーニングおよび本発明または断片の酵素またはそれ
の保守的な置換の増殖的な活性を調整する化学製品のために用意する。そして、
それによって細胞分裂、代謝活性、表皮形成、線維症および酸性の反応を含んで
いる他の生物学的機能に影響を及ぼす。

【００７４】 これらの酵素の増殖的な活性または酸性の活性を調整する化学製品のために、
組合せの化学のライブラリは、隠されることができる。薬および化学製品は表さ
れるか内部から発生するタンパク質の酵素活性を調整するそれらの能力に基づい
て評価されることができる。そして、それらの表されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯを含
む：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４または断片、または、それの保守的な置換
。内部から発生するタンパク質は、多くの異なる組織または細胞（例えば結腸細
胞）から得られることができる。

【００７５】 薬は、また、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯによって表される表されるか内部から発生す
るタンパク質に縛るそれらの能力に基づいて評価されることができる：２および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４または断片、または、それの保守的な置換。酵素活性は
、ＮＡＤＨに依存する過酸化物世代がｈｏｌｏｐｒｏｔｅｉｎによって触媒作用
を及ぼしたＮＡＤＰＨ−ｏｒであってもよい。酵素活性は、また、ＮＡＤＨに依
存するジアホラーゼ活性がｈｏｌｏｐｒｏｔｅｉｎかフラビンタンパク質領域に
よって触媒作用を及ぼしたＮＡＤＰＨ−ｏｒであってもよい。フラビンタンパク
質によって、領域はほぼＳＥＱ ＩＤ ＮＯに示される酵素のＣｔｅｒｍｉｎａ
ｌ半分を定められる：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４または断片、または、そ
れの（ほぼＣ−末端２６５のアミノ酸）保守的な置換。ｇｐ９１ｐｈｏｘのこの
断片は、シトクロムｃ、ｎｉｔｒｏｂｌｕｅｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍおよび他の
染料の方へＮＡＤＰＨに依存する還元酵素活性を有する。

【００７６】 表されたタンパク質またはそれの断片が、既存の組合せの化学のライブラリの
ロボットのスクリーンのために使われることができる。以下の記載によって束縛
されたくないと共に、部位を結合している部位およびＦＡＤを結合しているＮＡ
ＤＰＨまたはＮＡＤＨがｄｕｏｘ酵素または断片に縛る薬および他の組成物の能
力またはそれの保守的な置換を評価することに役立つと考えて、または、それら
の酵素活性を調整すること。ｈｏｌｏｐｒｏｔｅｉｎの使用またはＣ−末端半分
または端領域は、高いスループット薬スクリーンを開発するために好まれる。そ
の上、ｄｕｏｘ領域（ペルオキシダーゼ領域）のＮ−末端３分の１は、また、ペ
ルオキシダーゼ活性を禁止して、高いスループットの更なる開発のために、スク
リーンに薬を混ぜるために薬および他の組成物の能力を評価するために用いても
よい。

【００７７】 本発明も、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯのような酸性の酵素の方向を目指す抗体を提供
する：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、そして、断片、または、それの保守的
な置換。好適なタンパク質断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯを含むが、これに限定さ
れるものではない：３１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２．本発明の抗体は、局
地化を含んでいる様々な目的、発見およびタンパク質ＳＥＱ ＩＤ ＮＯの測定
に役立つ：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、そして、断片、または、それの保
守的な置換。抗体は、これらの目的を達成するためにキットで使用されることが
できる。これらの抗体は、また、細胞の選択された殺害のための細胞障害性薬品
に結合されることができる。項抗体は、抗体（例えばＩｇＧ、ＩｇＭおよび他の
クラス）のいかなるクラスも含むはずである。Ｆａｂ断片およびＦａｂ ＋ Ｆ
ｃ断片を含むがこれに限らず、項抗体も、完全に完全な抗体、更にはそれの断片
を含む。

【００７８】 本発明も、ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯを提供する：１およびＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．：３、そして、断片、または、それの保守的な置換。これらのヌ
クレオチドは、局地化を含んでいる様々な目的、発見およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
であると述べられるタンパク質の統合に関係しているメッセンジャＲＮＡの測定
に役立つ：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、そして、断片、または、それの保
守的な置換。これらのヌクレオチドが、また、局地化、発見およびメッセンジャ
ＲＮＡのような核酸の寸法のためのラベルをつけられた調査のまたは代わりにＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯに示されるヌクレオチド配列を含んでいるより大きいヌクレオ
チド配列の隔離のための構造において使われることができる：１およびＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：３または断片、または、それの保守的な置換。これらのヌクレオチ
ド配列は、相応する岸を従来技術において当業者にとって公知の技術を使用して
いる他の種から分離するために用いてもよい。これらのヌクレオチド配列は、ま
た、調査および相補的な岸を作るために用いてもよい。

【００７９】 最も特に、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯであると述べられるタンパク質を修正
することによって成長の変調のための方法を含む：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
．：４または断片、または、それの保守的な置換。作用するいかなる分子も細胞
分裂に影響を及ぼすと定めるために本願明細書において用いられるｔｅｒｍ”ｍ
ｉｔｏｇｅｎｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ”ｉｓ。男女両方の人間を意味するた
めに本願明細書において用いられるｔｅｒｍ”ａｎｉｍａｌ”ｉｓおよび人間以
外の動物。

【００８０】 文脈が不適当でない限り、本願明細書において用いられるｔｅｒｍｓ”ａ」，
ａｎ”ａｎｄ”ｔｈｅ”ａｓは一つ以上を意味して、複数を含むために定義さ
れる。

【００８１】 「タンパク質」、ペプチド、ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ”ａｎｄ「アルファ・
カーボンが１つのアミノ酸のアルファ・カーボンのカルボキシル基およびアミン
のグループの他のアミノ酸のアルファ・カーボン間の凝結反応によって形成され
るペプチド結合で結合されるアミノ酸（概してＬ−アミノ酸）のｏｌｉｇｏｐｅ
ｐｔｉｄｅｓ”ａｒｅ連鎖。

【００８２】 鎖（ｉ． ｅ．（アミンの末端））の一端の末端のアミノ酸は、自由なアミン
のグループを有する。その一方で、鎖の他端で末端のアミノ酸（ｉ． ｅ．、カ
ルボキシ・末端）自由なカルボキシル基を有する。

【００８３】 このように、ｔｅｒｍ”ａｍｉｎｏ終点」（Ｎｔｅｒｍｉｎｕｓを略記した）
は、タンパク質のアミンの末端でまたはタンパク質の範囲内の他のいかなる場所
でものアミノ酸のアルファ−アミノ基（ペプチド結合に参加するときに、ｉｍｉ
ｎｏは集まる）にアミノ酸上の自由なアルファ−アミノ基に関連する。

【００８４】 同様に、ｔｅｒｍ”ｃａｒｂｏｘｙ終点」（Ｃ−終点を略記した）は、アミノ
酸上の自由なカルボキシル基に関連するカルボキシ・タンパク質のまたはタンパ
ク質の範囲内の他のいかなる場所でものアミノ酸のカルボキシル基に終点。

【００８５】 概して、タンパク質をやめているアミノ酸は、命令、アミンの末端の出発およ
び増加すること際に番号をつけられる方向のの方へカルボキシ・タンパク質の末
端。１つのアミノ酸が前記ｔｏ”ｆｏｌｌｏｗ”ａｎｏｔｈｅｒであるときに、
そのアミノ酸が閉じるものを配置されて、このようにカルボキシ・タンパク質の
末端前のアミノ酸に。それをアミノ酸（ＤまたはＬ）または模倣のアミノ酸に委
託するために本願明細書において用いられるｔｅｒｍ”ｒｅｓｉｄｕｅ”ｉｓは
、アミド結合によってタンパク質に組み込まれる。このように、アミノ酸は自然
に起こっているアミノ酸であってもよいかまたは一方、制限されない限り、自然
に起こっているアミノ酸（ｉ． ｅ．（アミノ酸擬似））と同様の方法で機能す
る自然のアミノ酸の周知のアナログを含むことができる。さらに、模倣のアミド
結合は、当業者にとって周知のペプチド・バックボーン変更態様を含む。

【００８６】 さらに、上記したように、技術のうちの１つは、それを認識する；個々の置換
、削除またはコード化された配列のアミノ酸（概して５％（より概して１％未満
の）未満の）の単一のアミノ酸または少ないパーセンテージを変えるか、加える
かまたは削除する加算は、変更が化学的に類似したアミノ酸を有するアミノ酸の
置換に結果としてなる保守的に修正されたバリエーションである。機能的に類似
したアミノ酸を提供している保守的な置換テーブルは、公知技術である。

【００８７】 以下の６つのグループは、各々お互いのための保守的な置換であるアミノ酸を
含む： １） アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）； ２） アスパラギン酸（Ｄ）（グルタミン酸（Ｅ））； ３） アスパラギン（Ｎ）（グルタミン（Ｑ））； ４） アルギニン（Ｒ）（リジン（Ｋ））； ５） イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）
； そして、 ６）Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ （Ｆ）、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ（Ｙ）、Ｔｒｙｐ
ｔｏｐｈａｎ（Ｗ）。

【００８８】 ペプチドが長さ（ｉ． ｅ．（約５０未満のアミノ酸））に比較的不足してい
るときに、それらは標準の化学のペプチド統合技術を使用して、しばしば合成さ
れる。配列のＣ−末端・アミノ酸が配列の残留するアミノ酸の連続した追加が続
く不溶性のサポートに取り付けられる強力なフェーズ合成は、本願明細書におい
て記載されている抗原性のエピトープの化学の統合のための好適な方法である。
強力なフェーズ合成の技術は、当業者にとって公知である。あるいは、本願明細
書において記載されている抗原性のエピトープは、再結合物核酸方法論を使用し
て合成される。通常、これはペプチドまたはタンパク質をコード化する核酸配列
をつくることを含む。そして、特定のプロモータの管理下の発現カセットの核酸
を配置して、ホストのペプチドまたはタンパク質を表して、表されたペプチドま
たはタンパク質を分離して、必要な場合、ペプチドまたはタンパク質をｒｅｎａ
ｔｕｒｉｎｇする。この種の手順による技術のうちの１つを導くのに十分な技術
は、文学において見つかる。所望のいくつかのタンパク質断片またはペプチドが
ベクターに組み込まれるヌクレオチド配列においてコード化されるときに、技術
のうちの１つはタンパク質断片またはペプチドが一つ以上のアミノ酸からなる間
隔保持装置分子（例えばペプチド）によって分離されることができると従来技術
において認める。通常、間隔保持装置は所望のタンパク質断片またはペプチドを
結び付けるかまたは最小限のある距離またはそれらとの他の空間の関係を保存す
るより、別の特定の生物学的活性を有しない。しかし、間隔保持装置の組成のア
ミノ酸は、分子（例えば折りたたみ、ネット負担または疎水性）の若干の特性に
影響するのに選ばれることができる。表された再結合物タンパク質の浄化に役立
ってもよい残留物の生成をコードするヌクレオチド配列は、ベクターに組み込ま
れることができる。

【００８９】 この種の配列は、従来技術において周知である。たとえば、ボリエステル繊維
ヒスチジン・配列をコードするヌクレオチド配列は、ニッケル・コラム上の表さ
れた再結合物タンパク質の浄化を容易にするためにベクターに加えられることが
できる。一旦表されると、再結合物ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質は
従来技術において当業者にとって公知の標準の手順によって精製されることがで
きる。そして、硫酸アンモニウム沈殿、類似性コラム、コラム・クロマトグラフ
ィ、ゲル電気泳動などを含む。９９％の均質性に対する約５０の実質的に純粋な
組成物は好まれる、そして、９５％またはより大きい均質性に対する８０は治療
的な因子としての用途のために最も好適である。技術のうちの１つは、化学の統
合、生物学的発現または浄化の後、所望のタンパク質、それの断片およびペプチ
ドが実質的に異なる形態を所有することができると従来技術において認識するタ
ンパク質、それの断片およびペプチドの自国の形態に。この場合、それはしばし
ばタンパク質を特性を奪って、減らすのに必要でそれからｒｅ−ｆｏｌｄにタン
パク質が生じるために好適な形態に夢中である。減少して、タンパク質の特性を
奪って、ｒｅ−ｆｏｌｄｉｎｇすることを誘導する方法は、従来技術において技
術のそれらにとって周知である。

【００９０】 本発明の遺伝子の構造物は、それについて異なるタンパク質、断片およびペプ
チドのための符号化配列を含む。遺伝子の構造物も、浄化または表されたタンパ
ク質の探知を許可するように選ばれるエピトープまたは領域を含む。この種のエ
ピトープまたは領域は、グルタチオンＳ−転移酵素、ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎ
ｅ、ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ、赤血球凝集素抗原、タンパク質を結合しているマ
ルトースおよび従来技術において技術のうちの１つにとって共通に公知の他から
領域を結合しているグルタチオンをコード化しているＤＮＡ配列を含む。好適な
遺伝子の構造物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯのヌクレオチド配列を含む：１およびＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：３または断片、または、それの保守的な置換。

【００９１】 追加であるか他のヌクレオチド配列が以下のためにコード化する命令の遺伝子
の構造物に含まれることができると理解されることになっている：多数のａ）は
、それについて所望のタンパク質、断片またはペプチドの中でコピーする；所望
のタンパク質、それについて断片またはペプチドのｂ）さまざまな組合せ；そし
て、所望のタンパク質、それの断片またはペプチドのｃ）保守派変更態様、そし
て、それの組合せ。

【００９２】 本発明の好適なさらに、別のタンパク質は、人間のｄｕｏｘ２である（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２）タンパク質、そして、断片、または、それの保守的な置換Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯによってコード化されるように：１、そして、断片、または、
それの保守的な置換。本発明の好適な他のタンパク質は、Ｃｅ Ｄｕｏｘ １（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）タンパク質であるか断片であるか保守的であるそれの
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯによってコード化されるように置換：３、そして、断片、ま
たは、それの保守的な置換。

【００９３】 本発明のヌクレオチド配列は、また、たとえば、代わりとして継がれたメッセ
ージの探知を許可する高い厳しさ状況の下で、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド
配列のような核酸に雑種を産むために使用されることができる。遺伝子の構造物
は、再結合物タンパク質を生産するためにｐｃＤＮＡ−３本のベクター（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の再結合物配列を使用しているＮＩ
Ｈ ３Ｔ３細胞において、例えば発現システムで表される。好適な発現システム
はコス−７つの細胞を含むが、これに限定されるものではない。そして、昆虫細
胞が再結合物ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓおよびイーストを使用する。従来技術にお
いて技術のうちの１つにとって公知の他の発現システムが本発明の遺伝子の構造
物の現れのために使われることができると理解されることになっている。本発明
の好適なタンパク質は、本願明細書において人間のｄｕｏｘ２または断片と称さ
れるかまたは保守的であるそれについて置換、それはＳＥＱ ＩＤ ＮＯに記載
されるアミノ酸配列を有する：かなり逆方法の再結合物タンパク質の機能を変え
ない定義において定義したアミノ酸置換を有する２またはアミノ酸配列。本発明
の好適な他のタンパク質は、Ｃｅ Ｄｕｏｘ １である（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．
：４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯによってコード化されるように、断片またはそれの保
守的な置換をまたは：３、そして、断片、または、それの保守的な置換。 Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ａｓが本願明細書において記載されて、ＳＥＱに記載
のアミノ酸配列から成るタンパク質に対するｔｅｒｍ”ｈｕｍａｎ ｄｕｏｘ２
”ｒｅｆｅｒｓは、いいえの身元を確認する：２または断片、または、保守的な
それについて置換、そして、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯにて説明したように、ヌクレオ
チド配列によってコード化した：１または断片、または、それの保守的な置換。
Ｃｅ ｄｕｏｘは、Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓまたは断片からのｄｕｏｘまたはそれ
の保守的な置換に関連する。Ｒｅｃｏｍｂｉ７ｌａｎｔ遺伝子の構造 所望の遺伝子は転送ベクター（例えばｐｃＤＮＡ３）に結さつされる、そして
、再結合物はコス−７つの細胞のような宿主細胞を変えるために用いる。共通に
、従来技術において当業者にとって公知であるように、異なる転送ベクター、宿
主細胞およびトランスフェクション方法が使用されることができると理解される
ことになっている。トランスフェクションに用いられる２つの所望の遺伝子は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに示される：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３．たとえば、
トランスフェクションをｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄして、
活発な相応する組換えにおいて３Ｔ３セルＤｕｏｘ１遺伝子をＮＩＨにもたらす
ために用いる。合成遺伝子はクローンをつくられる、そして、ｄｕｏｘ遺伝子を
含んでいる再結合物構造物が生じて、コス−７つの細胞系の合流する単分子層培
養において発達する。好ましくは類似性クロマトグラフィ技術を使用して、表さ
れた再結合物タンパク質はそれから精製される、そして、その純度および特性は
周知の方法によって決定した。様々な発現システムは、再結合物タンパク質の発
現のために使用されることができる。この種の発現方法は、以下を含むが、これ
に限定されるものではない：それらが大腸菌およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓを利用することを含むバクテリアの発現システム；ウイルス・システム
； イースト発現システム；培養された昆虫および哺乳類の細胞；そして、従来技術
において当業者にとって公知の他の発現システム。

【００９４】 細胞のトランスフェクション 本発明のベクターがいかなる所望の細胞もまたは細胞系にトランスフェクション
することができると理解されることになっている。細胞の悪および試験管内のト
ランスフェクションは、本発明の一部として活発に熟慮される。トランスフェク
ションのための好適な細胞は、以下を含むが、これに限定されるものではない：
線維芽細胞（おそらく、高まることは治療するおよび皮膚形成を巻いた）、顆粒
白血球（エイズおよび無形成性貧血に示すように障害を生じる免疫性のシステム
の機能を増やす可能な利点）、筋肉細胞、神経芽細胞、幹細胞、骨髄細胞、骨芽
細胞、Ｂリンパ球およびＴリンパ球。

【００９５】 細胞は、従来技術において当業者にとって公知の様々な方法によってトランス
フェクションすることができて、以下を含むが、これに限定されるものではなく
なることができる：ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ、遺伝子銃、リン酸カルシ
ウム、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅおよび、アデノウイルス・トランスフェクシ
ョン・システムと同じく、ｆｕｇｅｎｅ。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯにおいて代表され
る核酸によってトランスフェクションする宿主細胞：１およびＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ．：３または断片、または、それの保守的な置換は、タンパク質ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯを表すために用いる：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：それぞれ、４または
断片またはそれの保守的な置換。これらの表されたタンパク質は、抗体を上げる
ために用いる。これらの抗体が、表皮形成に影響を及ぼすために、そして、発見
、局地化およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯに示されるタンパク質の寸法のために、ｄｕ
ｏｘタンパク質のうちの１つを表しているガンに対して、免疫治療を含むがこれ
に限らず様々なアプリケーションのために使われることができる：２およびＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：４または断片、または、それの保守的な置換。

【００９６】 （表されたタンパク質の浄化および特徴描写） 本発明のタンパク質は、ボリエステル繊維ヒスチジン構成要素を有する融合タ
ンパク質として表されることができるヘキサ・ヒスチジン、そして、ニッケルを
使用している金属類似性コラムまたはコバルト類似性マトリックスに縛ることに
よって浄化する。タンパク質は、また、グルタチオンＳ−転移酵素を有する融合
タンパク質として表されることができて、グルタチオン・アガロース・マトリッ
クスを使用している類似性クロマトグラフィによって浄化した。タンパク質は、
また、赤血球凝集素抗原を有する実施例のために、融合タンパク質としてそれを
表すことによってｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙクロマトグラフィによって精製
されることができる。陰イオンおよび陽イオン交換クロマトグラフィを含む従来
のクロマトグラフィおよび浄化方法によって、表されるか自然に起こっているタ
ンパク質はまた、精製されることができる。そして、ゲル除外クロマトグラフィ
、ｈｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｉｔｅクロマトグラフィ、クロマトグラフィを結合
している染料、硫酸アンモニウム沈殿、有機溶媒の沈殿または他の技術が従来技
術において共通に技術のうちの１つにとって公知である。

【００９７】 （表されたタンパク質の活性を査定する方法） 異なる方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯであると述べられるタンパク質を含むがこ
れに限らず、本発明の表されたタンパク質の活性を査定することに利用できる：
２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、それの置換されたアナログ、そして、断片、
または、それの保守的な置換。１． ｈｏｌｏｐｒｏｔｅｉｎの分析評価および
過酸化物生成のためにそれの断片： Ａ．一般的な考慮。 これらの分析評価は、本発明の酵素活性を調整するように設計されている薬の効
力を査定することに役立つ。ｈｏｌｏｐｒｏｔｅｉｎは、３Ｔ３セル、ＣＯＳ−
７つの細胞、ＮＩＨ、昆虫細胞（ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌな技術を使用すること
）または従来技術において技術のうちの１つにとって公知の方法を使用している
他の細胞において表されることができる。膜分数または精製されたタンパク質が
、分析評価のために使われる。分析評価は、要求することができるかまたは潜在
的に他の未確認の要因と同様に他の細胞タンパク質（例えばｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ
６７ｐｈｏｘおよびＲａｃｌ）によって増やされることができる（ｅ。ｇ．、キ
ナーゼまたは他の規定するタンパク質）。

【００９８】 Ｂ． Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ減少 約１００ｔｔＭの集中において、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨが減少している基
板として使われる。シトクロムｃの減少は５５０ナノメートルで吸光度の増加に
よって分光測光法でモニタされる。そして、絶滅を２１のｍＭ’ｌｃｍ’１の係
数とみなす。分析評価は、不在および約１０の水差し過酸化物ｄｉｓｍｕｔａｓ
ｅの存在において実行される。過酸化物に依存する減少は、過酸化物ｄｉｓｍｕ
ｔａｓｅがある場合には、それなしで過酸化物ｄｉｓｍｕｔａｓｅの非存在下で
シトクロムｃ減少として定義される（Ｕｈｌｉｎｇｅｒその他（１９９１の）Ｊ
． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｎｚ． ２６６，２０９９０−２０９９７）。Ａｃｅｔ
ｙｌａｔｅｄされたシトクロムｃがまた、使われることができる。これは、次の
ことの故である。ａｃｅｔｙｌａｔｅｄされたシトクロムｃの減少は過酸化物だ
けを経てあると思われる。

【００９９】 Ｃ． Ｎｉｔｒｏｂｌｕｅテトラゾリウム減少 ｎｉｔｒｏｂｌｕｅテトラゾリウム（ＮＢＴ）減少のために、同じ一般的なプ
ロトコルが使われる。但し、次の場合は除く−ＮＢＴがシトクロムｃの代わりに
使われる。一般に、酸化するＮＢＴは、青（シグマ、セントルイス、ＭＯ）がハ
ンクス・緩衝液において加えられるフィルターをかけられた０．２５の％ ｎｉ
ｔｒｏｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍのまたは過酸化物ｄｉｓｍｕｔａｓｅ（シグマ）
およびサンプルの約６００のＵｎｉｔｓを有する１ｍＬについて、ほぼ３７のＣ
．で培養されてある減少するＮＢＴが青くて不溶性である間、明白である。 不溶性の製品は遠心分離によって集められる、そして、ペレットは約１ｍＬのピ
リジン（シグマ）の中に再懸濁されて、減少するＮＢＴを可溶性にするために１
００Ｃで約１０分間熱くなった。減少するＮＢＴの集中は５１０ナノメートルで
吸光度を測定することによって決定される。そして、１１，０００のＭ’ｌｃｍ
’１の絶滅係数を使用する。非処理のウェルは、細胞番号を決定するために用い
る。

【０１００】 Ｄ．発光 過酸化物生成は、また、ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ（ビスＮｍｅｔｈｙｌａｃｒｉｄ
ｉｎｉｕｍ硝酸塩、シグマ、セントルイス、ＭＯ）を利用している化学ルミネセ
ンス発見システムでモニタされることができる。サンプルは、約１５０ｎＬハン
クス溶液の量の約１００ｕＭ ＮＡＤＰＨ（シグマ、セントルイス、ＭＯ）およ
び１０ｊｕＭ ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ（シグマ、セントルイス、ＭＯ）を混ぜ合わ
せられる。発光は、約５分の合計のためのほぼ１分の間隔で、０．５の秒／読み
込みのためのＬｕｍｉＣｏｕｎｔｅｒ（パッカード、Ｄｏｗｎｅｒｓグローヴ、
ＩＬ）を使用している９６−ウェルプレートにおいてモニタされる；各々のデー
タセットの最も高い安定した価値が、比較のために使われる。上のように、過酸
化物ｄｉｓｍｕｔａｓｅは、発光が過酸化物から起こるということを証明するた
めに若干のサンプルに加えられる。空白の緩衝液は、各々の読み込みから減じら
れる（ウシオ−Ｆｕｋａｉその他（１９９６の）Ｊ． Ｂｉｏｌ．化学２７１，
２３３１７−２３３２１）。

【０１０１】 完全な細胞のＥ． Ａｓｓａｙｓ 過酸化物生成のための分析評価は、３Ｔ３セル完全な細胞（たとえばｄｕｏｘ
−トランスフェクションするＮＩＨ）を使用して実行されることができる。 原則として、上記の分析評価のいずれでも、使って３Ｔ３セル完全な細胞（たと
えばｄｕｏｘ−トランスフェクションするＮＩＨ）を使用している過酸化物生成
を評価する。ＮＢＴ減少は、好適な分析評価方法である。

【０１０２】 ２． 以下の記載によって束縛されたくないと共に、頭を切って短くされたタ
ンパク質の分析評価がほぼＣ−末端２６５のアミノ酸残留物から成って、ほぼＣ
ｔｅｒｍｉｎａｌな２６５のアミノ酸残留物から成る頭を切って短くされたタン
パク質は過酸化物を生成すると思われない、したがって、過酸化物ｄｉｓｍｕｔ
ａｓｅは頭を切って短くされたタンパク質の分析評価において加えられない。基
本的には、類似した分析評価は確立される、そして、ＮＢＴ、シトクロムｃ、ｄ
ｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｎｄｏｐｈｅｎｏｌ、フェリシアン化物またはｒ
ｅｄｏｘ−ａｃｔｉｖｅな他の染料の過酸化物から独立した減少は調べられる。

【０１０３】 ヌクレオチドおよび核酸調査 ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：それぞ
れ、断片またはそれの保守的な置換としてのウェルおよびＰＣＲプライマーとし
てしたがって、３が局地化、発見およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯに関する核酸の寸法
のために使われることができる：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：断片またはそれ
の保守的な置換と同じく、３。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １は、また、本出願の人間
のｄｕｏｘ２をコード化しているヌクレオチド配列として公知である。ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：３は、また、本出願のＣｅ ｄｕｏｘ １をコード化しているヌク
レオチド配列として公知である。ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ）：断片またはそれの保守的な置換と同じく、３はヌクレオチ
ド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯを含んでいるより大きいヌクレオチド配列を分離する
ために調査をつくるために用いてもよい：１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：それぞれ
、３。 ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：断片または
それの保守的な置換と同じく、３はまた、他の種のｄｕｏｘタンパク質を識別し
て、分離するために調査をつくるために用いてもよい。

【０１０４】 本願明細書において記載されている核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯの生成のため
のメッセンジャＲＮＡ符号化を含む：２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４およびそれ
の断片。この種の核酸は、ｃＤＮＡ調査を含むが、これに限定されるものではな
い。これらの調査は、従来技術において当業者にとって公知の様々な方法でラベ
ルをつけられることができる。この種の方法は、含むが、これに限定されるもの
ではないアイソトープで非アイソトープのラベルをつけている。これらの調査が
、原位置にＳＥＱ ＩＤ ＮＯのためのｍＲＮＡ符号化のような核酸の局地化の
ための交雑のために使われることができる：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、
そして、断片、または、それの保守的な置換。局地化は、従来技術において当業
者にとって公知の技術を使用している解像度の超構造で軽い微細なレベルで、原
位置に交雑を使用して実行されることができる。これらの調査は、また、溶液交
雑を含むがこれに限らず技術の当業者にとって公知の技術を使用している核酸お
よびｍＲＮＡレベルの検出して、量をはかるために使用されることができる。

【０１０５】 抗体生成 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．で示されるタンパク質：２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４
つのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２または断片、ま
たは、それの保守的な置換は、製薬組成物を生産する薬学的に受け入れられるキ
ャリアまたは車両と組み合わせられて、従来技術において当業者にとって公知の
方法を使用している多クローン性抗体の生成のための動物に貢献した。抗体生成
のための好適な動物は、ウサギおよびマウスである。他の動物は、これらのタン
パク質を有する免疫またはそれの断片のために使用されることができる。この種
の動物は、以下を含むが、これに限定されるものではない；羊、馬、ブタ、ロバ
、牛、猿および齧歯動物（例えばモルモットおよびネズミ）。

【０１０６】 受け入れられるキャリアまたは薬学的に受け入れられるｖｅｈｉｃｌｅ”ａｒ
ｅが水または生理食塩水を含むがこれに限らずいかなる液体も、油、ゲル、塗剤
、溶媒、希釈剤、流体軟膏ベース、リポソーム、ミセル、巨大なミセル、などを
意味するために本願明細書において使用した、逆生理的反応が生じることのない
生きている動物性であるか人間のティッシュと接触して、使用に適している、そ
して、有害な方法の組成物の他の構成要素と、相互に作用しないｔｅｒｍｓ”ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ。製薬組成物は、装置投薬形式において便利に
示されることができて、従来の製薬技術によって準備されることができる。この
種の技術は、関連に活性成分および医薬にキャリア（ｓ）または賦形剤（ｓ）を
持ってくるステップを含む。一般に、公式化は一様に備えられて、関連に個人的
に液体キャリアを有する活性成分を持ってきている。非経口の管理に適している
公式化は、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤および公式化が意図された受取人の血液
によって等張になる溶質を含むことができる水で非水の不毛な注入溶液を含む；
そして、因子を懸架して、因子を厚くすることを含むことができる水で非水の不
毛なサスペンション。公式化は、装置−服用か複数の服用コンテナ（たとえば密
封されたアンプルおよび小びん）において示されることができて、直ちに使用よ
り重要な不毛な流動運送業者（たとえば注入のための水）に、加算だけを要求し
ているｆｒｅｅｚｅｄｒｉｅｄされた（凍結乾燥された）状態に格納されること
ができる。即座の注入溶液およびサスペンションは不毛な粉から準備されること
ができる。そして、微粒およびタブレットが従来技術において共通に当業者によ
って使われる。好適な装置投薬公式化は、服用または装置を含んでいるそれらま
たは、管理された成分の中で、それの適当な一部分である。成分（特に上で言及
される）に加えて本発明の公式化が従来技術において当業者によって共通して使
う他の因子を含むことができると理解されなければならない。鼻で、筋内で、皮
下で、皮内で局所の製薬組成物が、直腸の、非経口の異なるルート（例えば口の
、含んでいるｂｕｃｃａｌおよび舌下腺）（エアゾール）によって管理されてあ
ってもよい。溶液、エマルジョンおよびサスペンションを含むがこれに限らず、
本発明の組成物が別に管理されることができる医薬は、ミクロスフェア、分子、
ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ、ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓおよびリポソーム
を形成する。約１から７まで投薬が免疫摂生につき必要であることができること
を思われる。最初の注入は、約０から変動することができる。８００の水差しに
対する約１つのＡｇの好適な範囲については、１ｍｇまでｚｕｇ、そして、より
好適な範囲の５００の水差しに対するほぼ２５のギャグから。ブースタ注入は、
０から変動することができる。１ｍｇまでｚｕｇ、好適な範囲を有するのほぼ、
ｍｇ ８００ｐ． ｇおよび５００のｊ−ｔｇ．に対する約１０の水差しのより
好適なシリーズに。管理の体積は、管理のルートおよび受取人の大きさに従い変
化する。たとえば、筋内注射は約０．１ｍｌから１．０ｍｌまで変動することが
できる。 製薬組成物がそうすることができる約４Ｃ ｔｏ−１００ Ｃ．からも、組成物
が温度で格納されることができる医薬は、室温を含んでいる異なる温度で凍結乾
燥された状態に格納される。製薬組成物は、従来技術において当業者にとって公
知の従来の手段によって殺菌されることができる。この種の手段は、濾過、放射
および熱を含むが、これに限定されるものではない。

【０１０７】 本発明の製薬組成物は、また、静菌剤代理人（例えば従来技術において当業者
にとって公知のアジュバントのＡバラエティが製薬組成物のタンパク質とともに
、施されることができるバクテリアの成長Ａｄｊｕｖａｎｔｓを禁止するチメロ
サール）と組み合わせられることができる。この種のアジュバントは、以下を含
むが、これに限定されるものではない：ブロック共重合体を含む重合体（ｐｏｌ
ｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｐｏｌｙｏｘｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ共重合体のよう
な共同重合体）；重合体Ｐ１００５；フロイントの完全なアジュバント（動物の
ための）；フロイントの不完全なアジュバント；ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅなｓｏｒ
ｂｉｔａｎ；スクアレン；ＣＲＬ８３００アジュバント；ミョウバン；ＱＳ ２
１（ｍｕｒａｍｙｌジペプチド）；トレハロース；ミコバクテリウム抜粋を含む
バクテリアの抜粋；ｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄされた内毒素；膜脂質；またはそれの
組合せ。

【０１０８】 モノクロナール抗体が、当業者にとって周知の方法に従ってハイブリドーマ技
術を使用して生じることができる。抗体が、調査または診断上の試薬として有効
であるかまたは受動免疫のために使われることができる。組成物は、任意にアジ
ュバントを含むことができる。調査または診断上の試薬として有効な多クローン
性および単クローン抗体は、発見およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．の寸法のために使
用されることができる：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２、そして、断片、または、それの保守的な置
換。この種の抗体は、サンプル（例えば細胞、細胞抜粋、組織、組織抜粋、生検
、腫瘍および生物学的流体）を含むがこれに限らず、生物学的サンプルにこれら
のタンパク質を認めるために用いてもよい。

【０１０９】 この種の発見能力は、診断および予想を容易にして、可能な処理選択肢を提案
するためにこれらのタンパク質に関連した病気の発見に役立つ。共通に、従来技
術において当業者にとって公知であるように、発見は免疫細胞化学、ＥＬＩＳＡ
、標識免疫検定法または他の分析評価の使用で成し遂げられることができる。本
発明または断片のｈｄｕｏｘ２およびＣｅ−ｄｕｏｘタンパク質を含むｄｕｏｘ
タンパク質、または、以下を含むがこれに限らず、それの保守的な置換は、共通
に周知の方法でラベルをつけられることができる：放射性同位元素で識別する（
染料）、磁気分子、ビオチン−アビディン、蛍光性の分子は分子およびシステム
をｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔする。そして、フェリチン、コロイド金お
よび他の方法がタンパク質にラベルをつける技法の技術のうちの１つにとって公
知である。抗体がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．として示されるタンパク質に、向けたＡ
ｄｆｎｉｎｉｓｔａｔｉｏｎ ｏｆＡｆｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：２、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３２、または
、断片または保守派にそれの置換がまた、直接受動免疫方法の人間および動物に
与えられることができると指令した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯの細胞外部分の方向を
目指す抗体：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４は、これらの細胞外エピトープに
縛る。これらの抗体に対するラベルの付着は、縛る部位の局地化および視覚化を
容易にする。リシンのような分子またはこれらの抗体に対する他の細胞毒素の付
着は、選択的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯを表している細胞を損傷を与えるかまたは殺
すのを助ける：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４またはそれの断片。

【０１１０】 本発明が抗体、核酸、核酸調査、ラベルをつけられた抗体、ラベルをつけられ
たタンパク質または発見、局地化および測定値のためにそれの断片によって役立
つキットを含むキットＳＥＱ ＩＤ：１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ）：３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４または組合せ、そして、断片また
はそれの保守的な置換。キットが免疫細胞化学のために使われることができる。
そして、交雑、溶液交雑、標識免疫検定法、ＥＬＩＳＡ、西洋のしみ、量的ＰＣ
Ｒおよび発見、局地化およびこれらの核酸、タンパク質または断片の寸法のため
の他の分析評価がそれについて原位置に従来技術において技術のうちの１つにと
って公知の技術を使用する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに示されるヌクレオチド配列：
１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３または断片が、それについてまた、代わりとし
て検出することはＳＥＱ ＩＤ ＮＯに関するメッセージを継いだという高い厳
しさ状況の下で使われることができる：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３または
、それぞれ、それの断片。診断上のキットは、本願明細書において記載されてい
るｄｕｏｘタンパク質の相関的な発現を測定することができるかまたは検出する
ことができる（ｉ． ｅ。人間的なＤｕｏｘ１および／または人間的なｄｕｏｘ
２、そして、ｃｅ−ｄｕｏｘ）。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．の断片：１およびＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：３（関連した雑種を産んでいる配列がチップ配列の表層の上へ合
成されることができることを含むこと）。ＲＮＡサンプル。ｅに、腫瘍から、ゴ
ールキーパはそれからｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌｙにタグを付けられて、発見の
ためのチップの上へ交雑した。この方法は、診断によって腫瘍タイプを特徴づけ
て、処理を合わせておよび／または前兆の情報を提供するために用いてもよい。
この種の前兆の情報は、病気進行および寿命に関する予言の値を有することがで
きて、また、療法の選択に影響を及ぼすことができる。本発明は更に以下の実施
例で例示される。そして、それはいかなる形であれそれの範囲に限界を賦課する
こととして解釈されることになっていない。これに反して、リゾートがそれにつ
いてさまざまな他の実施態様、変更態様および均等物に有されることができると
明らかに理解されることになっている。そして、本願明細書において説明を読ん
だ後に、それは本発明の趣旨から逸脱することなく、それ自身を当業者に提案す
ることができる。表された配列・タグのｏｆｃＤＮＡｆｏｒ人間のＤｕｏｘ ２
つのＡ ５３５−ベース部分をＣｌｏｎｉｎｇしているＥＸＡＭＰＬＥ １（Ｅ
ＳＴ ｚｃ９２ｈＯ３． ｒｌ；Ｇｅｎｂａｎｋ継承ｎｏ． Ｗ５２７５０）、
Ｂｌａｓｔ検索の質問として人間のｇｐ９１ｐｈｏｘのアミノ酸配列を使用する
ことは、人間の膵臓の小島から識別された。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−ベ
クターのＥＳＴ配列ｚｃ９２ｈＯ３． ｒｌを含んでいるバクテリアの緊張＃５
９５７５８は、ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ（ＭＤ））から購入された。ＤＮ
Ａは、Ｔ７およびＴ３ベクター・プロモータに配列に特有の内部プライマーと同
様にプライマーを使用して配列された。ＥＳＴは２４．４％の識別をｇｐ９１ｐ
ｈｏｘに示している４４０のアミンの酸性の部分的なｃＤＮＡをコード化した。
そして、ｇｐ９１ｐｈｏｘのＣ−終点に対応する中止コドンを含んだ。５’−ａ
ｎｄ ３」レースは、ｃＤＮＡ端版２．０（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）の速い拡大のための５’ＲＡＣＥキットを有する人間の成
人のすい臓ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、ＣＡ）を使用して、実行
された。ＰＣＲは、特定のプライマーでされた：５’−ＲＡＣＥ：プライマー１
，５’ＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＧＡＧＧＣＧＡＡＧＡＣＡＴＡ−３」（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：５）；プライマー２，５’−ＣＣＴＧＴＣＡＴＡＣＣＴＧＧＧＡＣＧ
ＧＴＣＴＧＧ−３」（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）；プライマー３，５’−ＧＡＧ
ＣＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＧＣＣＴＧＴＴＣＡＧ−３」（ＳＥＱ ＩＤＮｏ：７）
；プライマー４，５’−ＧＧＡＡＧＧＣＡＧＣＡＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＡＴＧ−
３」（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）；プライマー５（５’−ＡＧＧＴＧＧＧＡＴＧ
ＣＧＧＡＴＧＴＴＧＡＧ−３）」（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）（入れ子にされた
ＰＣＲのための）；３’−ＲＡＣＥ Ｐｒｉｍｅｒ ６，５’ＡＣＡＴＣＴＧＣ
ＧＡＧＣＧＧＣＡＣＴＴＣＣＡＧＡ−３」（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）；プラ
イマー７，５’−ＡＧＣＴＣＧＴＣＡＡＣＡＧＧＣＡＧＧＡＣＣＧＡＧＣ−３」
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１） ；プライマー８，５’−ＴＣＴＣＣＡＴＣＡＧ
ＡＡＴＣＣＡＣＣＴＴＡＧＧＣ−３」（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）（入れ子に
されたＰＣＲのための）。配列（５）を完了するために」ＲＡＣＥがプライマー
３およびアダプタプライマーＡＰ１を有する人間の甲状腺のＭａｒａｔｈｏｎ−
手早いｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、ＣＡ）およびプライマー５を
使用して、実行されたこと、そして、アダプタプライマーＡＰ２．これらの手順
は、追加の３．７ｋｂの５’ｒｅｇｉｏｎおよび１．５ｋｂの３’ｒｅｇｉｏｎ
に結果としてなった。ｈ−Ｄｕｏｘ２のためのｃＤＮＡは、予測されるフレーム
（遺伝子銀行＃ＡＦ２６７９８１）を読み込んで開いた４６４７の塩基対が１５
４８のアミノ酸（１７５ｋＤａ）のタンパク質をコード化することを示して、コ
ンセンサスＫｏｚａｋ配列を含んだ、ＧＧＣＡＴＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：
１３、翻訳スタート・コドンで）。

【０１１１】 Ｄｕｏｘ２ ｃＤＮＡ配列は、甲状腺のＮＡＤＰＨ−ｏｘｉｄａｓｅと以前に
確認されるｇｐ９ｌｐｈｏｘ相同物のより大きい種類であって、ｐｌ３８ＴをＸ
と呼んだ；後の配列は、含まなかったペルオキシダーゼ異体同形領域（Ｄｕｐｕ
ｙほか（１９９９））。ｈ−Ｄｕｏｘ１およびｈ Ｄｕｏｘ２は、７７％、アミ
ンの酸性のレベルで同一だった。Ｃｅ−Ｄｕｏｘ１および、染色体の端の近くで
両方ともＣ． ｅｌｅｇａｎｓのゲノム・配列の人間のｇｐ９１ｐｈｏｘ識別さ
れた２つの推定の相同物（Ｇｅｎｂａｎｋ ＃ｓ ＡＦ０４３６９７およびＡＦ
００３１３０）のｃＤＮＡ配列を使用しているＣｅ−Ｄｕｏｘ１ Ａ ＢＬＡＳ
Ｔ検索のためのｃＤＮＡの中でＣｌｏｎｉｎｇして、Ｃｅ−Ｄｕｏｘ２のための
ｇｅｒａｅｓのＥＸＡＭＰＬＥ ２ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ私、そして
、分離された副６ Ｋｂ。遺伝子配列に基づいて、ＰＣＲプライマーはＣｅ−Ｄ
ｕｏｘ１遺伝子の２つの重なり合う部分を拡大するように設計されていた。そし
て、５’ｅｎｄおよび１から伸びているものが３’ｅｎｄから伸びた。プライマ
ーは、５’ＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＡＴＧＣＧＣＴＣＡＡＡＡＣＡＴＧＴＧＣ
ＴＧＴ−３であった」（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、そして、５’−ＡＡＣＴ
ＴＴＧＴＧＧＡＴＣＡＡＡＧＴＴＡＧＣＧ−３」（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）
５’ｒｅｇｉｏｎおよび５のための」ＴＴＧＧＡＴＴＡＧＣＡＴＴＴＴＧＣＴＡ
ＴＧＧＡＡ−３’ａｎｄ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６） ５’ＧＡＧＣＧＧＣＣ
ＧＣＧＡＡＣＧＴＴＴＣＡＡＡＧＣＧＡＴＧＴＧＣＡ−３」（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ：１７）３’ｒｅｇｉｏｎ．のためのＰＣＲは、以下の状況の下でＩＡＣＴ（
Ｒ． Ｂａｒｓｔｅａｄ（オクラホマＭｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏ
ｕｎｄａｔｉｏｎ）から得られて）のランダムな満たされたＣ． ｅｌｅｇａｎ
ｓ ｃＤＮＡライブラリを使用して、実行された：３０秒の間の９５のＣでの変
性；３０秒の間の５９Ｃでアニール化されること；１分の間の７２のＣでの拡張
。５’ｐｉｅｃｅおよび３’ｐｉｅｃｅは、Ｄｒａ ＩＩＩによって消化されて
、全長Ｃｅ−Ｄｕｏｘ１ ｃＤＮＡを生産するために結さつされた。全長Ｃｅ−
Ｄｕｏｘ１ ｃＤＮＡは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−ベクターに嵌入され
て、Ｔ７およびＴ３てベクターてプライマーて配列特定のプライマーを使用して
配列された。

【０１１２】 Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ．のＤｕｏｘ相同物 質問としてｇｐ９ｌｐｈｏｘのタンパク質配列を使用しているＣ． ｅｌｅｇａ
ｎｓゲノム・データベースのＢＬＡＳＴ検索は、ｃｏｓｍｉｄｓ Ｆ５６Ｃ１１
およびＦ５３Ｇ１２に含まれる２つの相応する遺伝子を識別した。１９人の近衛
伍長を含んで、１５０６のアミノ酸のタンパク質をコード化するために、概念上
の反訳記録（遺伝子銀行＃ ＡＦ０４３６９７）が予測されるＣｅ−Ｄｕｏｘ１
は、８１９７ｂｐ前に、継いでいる。Ｃｅ−Ｄｕｏｘ１（遺伝子銀行＃ＡＦ２２
９８５５）のためのｃＤＮＡのクローニングは４４９１ｂｐ（１４９７のアミノ
酸）のｃＤＮＡを明らかにした。そして、それはいくぶん予測されたイントロン
−エクソン接合の不正確のために、遺伝子構造から得られる概念上のｃＤＮＡと
異なった。１６人の近衛伍長を含んで、１３１３のアミノ酸タンパク質をコード
化するために、反訳記録（Ｃｅ−Ｄｕｏｘ２（遺伝子銀行＃ＡＦ０４３６９７）
）が予測される第二は、５３０８ｂｐ前に、継いでいる。Ｄｕｏｘ１の第２で第
３のエクソンに、非常に相応したＤｕｏｘ２の第１の予測されたエクソンでなく
、しかし、Ｄｕｏｘ１のｅｘｏｎｌに相応するＤｕｏｘ２の近衛伍長がそうする
ことができたＣｅ−Ｄｕｏｘ１てＣｅ−Ｄｕｏｘ２識別された２人の新任の近衛
伍長５’ｏｆのゲノム・配列の異体同形による配置は、異体同形によって識別さ
れる。Ｃｅ−Ｄｕｏｘ１およびＣｅ−Ｄｕｏｘ２の予測されたアミノ酸配列は、
ｈ−Ｄｕｏｘ１およびｈ−Ｄｕｏｘ２（図１および２Ａ）を有するほぼ３０％の
識別を示す。Ｃｅ−Ｄｕｏｘ１も、ｈ−Ｄｕｏｘ１／２（下記参照）と同じ領域
を含んで、粗く同じサイズである。しかし、Ｃｅ−Ｄｕｏｘ２はタンパク質の極
端なＣ−末端部分を除去しなければならない中止コドンを含む。そして、それは
部位を結合しているピリジン・ヌクレオチドの部分を含む。

【０１１３】 このように、Ｃｅ−Ｄｕｏｘ２が完全なペルオキシダーゼおよびｃａｌｍｏｄ
ｕｌｉｎのような領域を含まなければならないと共に、機能しているＮＡＤＰＨ
−ｏｘｉｄａｓｅ領域（図１を見る）をコード化することは予測されない。この
Ｃｔｅｒｍｉｎａｌ領域を除いて、Ｃｅ−Ｄｕｏｘ２は、９４％、アミンの酸性
のレベルでＣｅ−Ｄｕｏｘ１と同一である。Ｃｅ−Ｄｕｏｘ１およびＣｅ−Ｄｕ
ｏｘ２は染色体の端の近くに位置する。そして、私は６ｋｂだけ、そして、対向
するオリエンテーションにおいて分かれた。染色体の終わり間近の両方ともの場
所と同様に配列識別の高い程度およびイントロン構造（示されないデータ）の保
持は、最近の遺伝子重複と整合している。

【０１１４】 主要な構造のＥＸＡＭＰＬＥ ３つのＡｎａｌｙｓｉｓ； Ｄｏｍａｉｎ ＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎおよびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｒｎｐ
ａｒｉｓｏｎｓ Ａｍｏｙａｇ ｇｐ９ｌｐｈｏｘ、ｈ−Ｄｕｏｘ２、Ｃｅ−Ｄ
ｕｏｘ１およびＣｅ−Ｄｕｏｘ２．輸出信号配列は、ニールセンその他によって
予測された、１９９７。膜内外アルファ螺旋は、Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒその他に
よって予測された、１９９８。両方の方法は、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓのためのセンターでインターネットで利用可能であ
る（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ． ｄｔｕ． ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／）
。 多数の配列配置系統発生の分析は、Ｍｅｇａｌｉｇｎソフトウェア（ＤＮＡＳＴ
ＡＲ）を用いて、ｃｌｕｓｔａｌな方法を使用して、実行された。ｇｐ９ｌｐｈ
ｏｘ、ｈ−Ｄｕｏｘ１、ｈＤｕｏｘ２、Ｃｅ−Ｄｕｏｘ１およびＣｅ−Ｄｕｏｘ
２の領域構造および膜内外領域は、図１において図解される。Ｄｕｏｘ酵素は、
それらのＣ−終点のｇｐ９１ｐｈｏｘに相応する（ｈｔｔｐを参照のこと：／／
ｗｗｗ．生化学ｅｍｏｒｙ． ｅｄｕ／Ｌａｍｂｅｔｈ／これらの領域の配置の
ためのｇｐ９１〜ｈｏｍｏｌｏｇｙ． ｐｄｆ）。あるより、Ｎｏｘｌ（Ｓｕｈ
ほか（１９９９））（それはｇｐ９１ｐｈｏｘと同じサイズである）はｇｐ９１
ｐｈｏｘ（５４％同一の）に密接に関連しているｈＤｕｏｘ１またはｈＤｕｏｘ
２（−２６％ ｇｐ９１ｐｈｏｘと同一の）のＮＡＤＰＨ−ｏｘｉｄａｓｅ領域
。 しかし、ｈ−Ｄｕｏｘ１およびｈＤｕｏｘ２は、ＮＡＤＰＨ−ｏｘｉｄａｓｅ領
域（−３９％同一の）の中で、より密接にＣｅ−Ｄｕｏｘ１に関する。領域を結
合している推定のＦＡＤおよび領域を結合しているＮＡＤＰＨの範囲内で、相同
物はかなりより高い異体同形を共有する。そして、領域に従い、６０％から９０
％まで変動する。これは、螺旋ＧＸＧＸＸＰを結合している標準的なジヌクレオ
チドを含む（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）．ｇｐ９１ｐｈｏｘ、Ｎｏｘｌ、ｈ−
Ｄｕｏｘ１およびｈ−Ｄｕｏｘ２においてこの配列の後にＦ（それは多くのＮＡ
ＤＰＨに特有のフラビンタンパク質に存在する）が続く。その一方で、Ｃ． ｅ
ｌｅｇａｎｓタンパク質において、Ｆは保守的にＹと取り替えられる。

【０１１５】 Ｄｕｏｘタンパク質は、ｇｐ９１ｐｈｏｘに存在しない追加の領域を有する。
中心領域は、図１に示す配列を結合している２つのＥＦ手カルシウムを含む。 カルシウムくくることに関係している標準的な残留物はｈ−Ｄｕｏｘ１およびｈ
−Ｄｕｏｘ２においてかなり節約されるが、Ｃｅ−Ｄｕｏｘ１およびＣｅ−Ｄｕ
ｏｘ２において不十分に節約される。そして、この地域の機能が線虫において縛
っているカルシウムから離れて展開することができたことを示唆する。 驚くべきことに、Ｄｕｏｘタンパク質のＮ−末端第３は、ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘ
ｉｄａｓｅ、好酸球ペルオキシダーゼ、甲状腺のペルオキシダーゼ、ｌａｃｔｏ
ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅおよびウニｏｖｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓ（図２Ａおよび
２Ｂ）を含むペルオキシダーゼに相応する。全体的に、全ての領域の中のペルオ
キシダーゼを有する識別はほぼ２０％である、しかし、小区域はかなりより高い
異体同形を示す。Ｄｕｏｘ酵素はペルオキシダーゼ族（図２Ｂ）の範囲内で、は
っきりしたグループを代表する、そして、ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙに
、このグループはわずかにより密接にウニｏｖｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓに関す
る。 ペルオキシダーゼ異体同形領域の中で、６つの内部鎖二硫化物結合（それは４つ
の相応する哺乳類のペルオキシダーゼにおいて節約される）に関係している１２
のシステイン残留物のうちの２つだけは、Ｄｕｏｘタンパク質（図示せず）に存
在する。

【０１１６】 加えて、ＭＰＯで見つけられるアスパラギンにリンクされたグリコシル化部位
は、Ｃｅ−Ｄｕｏｘ１またはＣｅ−Ｄｕｏｘ２に存在しない。ＭＰＯの部位を結
合しているカルシウム（アスパラギン酸塩２６３、そして、３４１まで残留物３
３５（図２Ａの優れた複縦線））、Ｄｕｏｘ系統において節約されるウェルは、
残留物（三角形を満たした）をｌｉｇａｎｄｉｎｇしている４つの候補カルシウ
ムのうちの３つを含んで、タンパク質である（ＺｅｎｇおよびＦｅｎｎａ（１９
９２））。Ｃｅ−Ｄｕｏｘ１の極端なＮ−末端２１アミノ酸分泌する信号のペプ
チド・配列（図１）を含むシトソルに経膜的であるコンパートメントにおいて、
Ｎｔｅｒｍｉｎａｌペルオキシダーゼ領域があることを意味する（ｅ。ｇ．、細
胞外、または、分泌する小嚢の範囲内で）。加えて、水治療法プロット線は、タ
ンパク質がｇｐ９１ｐｈｏｘのＮ−末端第３に対応する非常に疎水性の領域を含
むことを明らかにする。この領域は、図１に示す６つの膜内外アルファ螺旋のク
ラスタとして立体感を与えられることができる。追加の膜内外螺旋形の領域は、
ペルオキシダーゼ異体同形領域およびｃａｌｍｏｄｕｌｉｎのような領域の間で
ある。Ｈｕｍａｎ Ｄｕｏｘ（ｈＤｕｏｘ ｍＲＮＡのＴｉｓｓｕｅ Ｄｉｓｔ
ｒｉｂｕｔｉｏｎ）のためのｍＲＮＡのＥＸＡＭＰＬＥ ４つのＰＣＲ Ｄｅｔ
ｅｃｔｉｏｎ。クローンをつくられたｈ−Ｄｕｏｘ１およびｈＤｕｏｘ２ ｃＤ
ＮＡ配列に基づいて、我々が特定のプライマーを設計したこと（Ｄｕｏｘ１：５
’−ＧＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＣＣＴＧＣＡＣＴＣＴＣ−３」（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１９）；５’ＣＴＧＣＣＡＴＣＴＡＣＣＡＣＡＣＧＧＡＴＣＴＧＣ−３
」（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）；Ｄｕｏｘ２：５’−ＧＣＣＣＴＣＡＡＣＣＴ
ＡＡＧＣＡＧＣＴＣＡＣＡＡＣＴＧ−３」（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）；５’
−ＧＡＧＣＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＧＣＣＴＧＴＴＣＡＧ−３」）（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．：２２）、それは人間の多数の組織ＰＣＲパネルおよび人間の甲状腺マ
ラソン−手早いｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、ＣＡ）を使用してい
るＤｕｏｘ１およびＤｕｏｘ２の組織発現パターンを決定するために用いた。Ｐ
ＣＲ状況は、以下の通りであった３０ｓ、２０ｓのための６５のＣ、３０ｓのた
めの７２のＣ、３５のサイクルの間の９５ Ｃ。胎盤、精巣およびすい臓および
心臓の検出可能な発現を有する前立腺にまた、示す重大な発現を有する肺および
甲状腺の以外最も高い発現については、ｈ−Ｄｕｏｘ１ ｍＲＮＡは様々な成人
の組織に配布された。それが肺で豊富だった胎児の組織において、ｈ−Ｄｕｏｘ
１ ｍＲＮＡはまた、広く表された。加えて、腎臓、肝臓、肺、すい臓の検出可
能な発現については、我々は様々な胎児の組織の、そして、成人のコロンの重大
な発現を観察した前立腺、そして、精巣。コロンの最も高い発現については、ｈ
−Ｄｕｏｘ２ ｍＲＮＡは様々な成人の組織に配布された精巣、すい臓、そして
、甲状腺。それが肺、肝臓、腎臓で豊富で心臓で甲状腺だった胎児の組織におい
て、ｈ−Ｄｕｏｘ２ｍＲＮＡはまた、広く表された。我々も、胎児の骨格の筋肉
および胸腺の重大な発現を観察した。簡潔なＲＮＡｉ Ｃｅ−Ｄｕｏｘ動物Ｔｏ
が洞察に得させるＣ．のＣ． ｅｌｅｇａｎｓ ＰｈｅｎｏｔｙｐｅｓのＥＸＡ
ＭＰＬＥ ５つのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）がＤｕｏｘ酵素の生物学的機能に注意
して、我々は逆の遺伝子のツール、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、Ｃ． ｅｌｅｇａ
ｎｓ（火ほか（１９９８））のｔｏ”ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ”Ｄｕｏｘを使用した
。この技術は、Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ野生のタイプ両性具有者の性腺に、Ｃｅ−
Ｄｕｏｘ１またはＣｅ−Ｄｕｏｘ２の部分をコード化している倍の足止めされる
ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の注入を含む。注射された動物はそれから卵を敷設するこ
とができた、収穫された卵は発達することができた、そして、後継者は発現型の
ために観察された。この手順は、具体的には、重要な遺伝子の発現を減らすかま
たは除去する。ＲＮＡは、いずれのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔからも写された。Ｄ
ｕｏｘ２（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ．）Ｅ１７Ｄｕｏｘ１またはｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ．Ｅ１８＋１９Ｄｕｏｘ１．ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ．のためのＤｕｏ
ｘ２、Ｃｅ−Ｄｕｏｘ２のエクソン１０は、ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって拡
大された前のプライマー５」ＧＣＴＡＧＡＧＣＴＣＴＴＣＡＧＴＴＴＧＣＴＡＴ
ＧＧＡＡＴＴＧＧＣ−３」（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、そして、逆のプライ
マー５’−ＣＡＴＡＡＡＧＧＡＴＧＡＧＧＡＧＡＡＴＴＣＴＧＴＧ−３」（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２４）。発生する４５７ｂｐ断片は、ＳｓｔＩおよびＥｃｏＲ
Ｉによって消化されて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにｓｕｂｃｌｏｎｅｄした。ｐ
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ．のためのＥ１７Ｄｕｏｘ１、Ｄｕｏｘ１のエクソン１７
は、ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって拡大された前のプライマー５’−ＧＣＴＡ
ＧＡＧＣＴＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＴＴＧＴＴＧＧＡＣＣ−３」（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２５）、そして、逆のプライマー５」ＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＣＴ
ＴＧＴＧＧＡＡＣＧＴＣＴＧＡＧＴＧＡＣ−３」（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）
．発生する６５９ｂｐ断片はＳｓｔＩおよびＥｃｏＲＩによって消化された、そ
して、サブはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローンをつくった。ｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ．のためのＥ１８＋１９Ｄｕｏｘ１、Ｅｘｏｎｓ １８およびＣｅ−Ｄｕ
ｏｘ１のうちの１９は、前のプライマー５’−ＧＣＴＡＧＡＧＣＴＣＡＣＡＴＴ
ＴＧＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＴＴＣＣＧ−３を使用しているランダムに満たされた
Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ ｃＤＮＡライブラリ（Ｒ． Ｂａｒｓｔｅａｄ（オクラ
ホマＭｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）から得られて
）から、ＰＣＲによって拡大された」（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）、そして、
逆のプライマー５’−ＧＴＧＴＧＡＡＴＴＣＡＧＣＧＡＴＧＴＧＣＡＡＡＴＧＡ
ＡＧＧＡＧＣ−３」（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）．発生する２６６ｂｐ断片は
、ＳｓｔＩおよびＥｃｏＲＩによって消化されて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにｓ
ｕｂｃｌｏｎｅｄした。プラスミドはＳｓｔｌかＥｃｏＲｌによって線形にされ
た、そして、コピーは別々の反応のＴ３およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）を使用して、運び出された。感覚およびアンチセンスのシングルの
要素をもつＲＮＡは同等の集中において結合されて、倍の座礁されたＲＮＡ（ｄ
ｓＲＮＡ）を形成するために３７のＣで３０分インキュベーションが続く６８の
Ｃで、１０分間卵を抱いた。ｄｓＲＮＡｓはＩｎｊｅｃｔｅｄされた動物が回復
することができた以下のパラグラフの詳細にて説明したように、Ｎ２両性具有者
Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓの性腺に注射されて、注入（個々のプレートへ移されて、
第２の２４のｈ期間の間の卵を敷設することができる）の後、卵ｆｏｒ〜２０
ｈを敷設する。敷設している卵のこの第２の期間から生じているＦ１後継者は、
評価された。発現型は、Ｆ１動物の９０％、＞において観察された。Ｃｅ−Ｄｕ
ｏｘ１およびＤｕｏｘ２の３つのはっきりした領域に対応するＣｅ−Ｄｕｏｘ
ａｎｉｎｚａｌｓ ｄｓＲＮＡが使われたＰｌｚｅｒａｏｔｙｐｅｓｏｆ Ｃ．
ｅｌｅｇａｎｓ ＲＮＡｉは、実験を切り離す。第１の二つは、Ｃｅ−Ｄｕｏ
ｘ１およびＣｅ−Ｄｕｏｘ２間の識別の領域と一致して、Ｄｕｏｘの両方の種類
の現れを遮断するために予測される。第３のｄｓＲＮＡはＣｅ−Ｄｕｏｘ１の極
端なＣ−終点と一致する。そして、それはＣｅ−Ｄｕｏｘ２の対応する物を有し
なくて、したがって、Ｃｅ−Ｄｕｏｘ１の現れだけを遮断する。全ての３枚のｄ
ｓＲＮＡ書式は、発現型の同じ範囲に結果としてなった。複製実験において、い
かなる与えられた発現型も呈している動物のパーセンテージは、いくぶん変数（
おそらくＲＮＡｉの量または注入の部位の違いによる）であった。 しかし、典型的実験において、動物の９０％を超えるは、一つ以上の発現型によ
って影響を受けた。典型的実験の、発現型が大きい表面的な水ぶくれの存在を含
んだこと（−５０％の動物）、そして、短いｏｒ”ｄｕｍｐｙ”ａｎｉｍａｌｓ
（−３５％の動物）、そして、保持された卵または幼虫（図示せず）をもつ動物
。 加えて、野生のタイプ動物が暗い外観を示すと共に、８０％以上のＲＮＡｉ
動物は半透明だった。ＲＮＡｉの半分のまわりで、動物は不能が通常の蛇行する
方法のプレートの上に移動することを示した：影響を受ける動物は完全に麻痺し
ているかまたは前の領域だけを移動した。そして、頭の近くで局所化された帯か
ら大腸菌を取り除いた。Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓの類似した発現型は、以前に記載
されていて、コラーゲンｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃな経路の変化にかかわる（ほ
か（１９９３）を徴集する；クレイマー（１９９７）；ジョンストン、２０００
）。変化するときに、表皮コラーゲンをコード化するいくつかの遺伝子がＢｌｉ
（「水ぶくれ）、Ｄｐｙ（「ずんぐりした」、短い太った虫）、Ｒｏｌ（シヌソ
イドに関する「ローラー」（平面の代わりに螺旋形の運動）は、合図する）また
はＳｑｔに結果としてなって（「しゃがむ」（一般に成人としての幼虫および足
の短い鶏としてのローラー））発現型。この過程の遺伝学は、若干の遺伝子のた
めの同じ遺伝子の異なる変化が異なる発現型を引き起こした時から、複雑で時々
発現型である結合する（ｅ。ｇ．ずんぐりしたローラー」）。線虫、他のタンパ
ク質が表皮の主要構成要素に提供するいくつかと一緒のコラーゲン、外骨格とし
て作用する細胞外マトリックスで。オリゴヌクレオチド配列（丘ほか（２０００
））を使用している全てのＣ． ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子の発現の大域的分析にお
いて、Ｃｅ−Ｄｕｏｘ１は、ステージに特有の方法の低レベル（ｈｙｐｏｄｅｒ
ｍａｌな細胞のその排他的な発現と整合した）で表された。発現は胎児ステージ
の間、そして、３６時間にピークに達している周期的パターンで起こった。そし
て、コラーゲン／表皮生合成（ｃｏｌ−１４、ｄｐｙ−２、−７、−１０および
ｓｑｔ−３）に関する他の遺伝子（ジョンストン、Ｉ． Ｌ．、２０００）のピ
ークの発現と一致した。ｃｏｌｌａｇｅｎ／ｃｕｔｉｃｌｅに関連した遺伝子（
ｂｌｉ−１、−２、ｃｏｌ−２、−６、−１７、−３５、−３６、−３７、−４
１、ｄｙｐ−１３、ｓｑｔ−１およびｒｏｌ−６（−８））の中でもセットされ
る１秒は、３６時間にピーク発現を示す。Ｃｅ−Ｄｕｏｘ２の重大な現れは、い
かなるステージでも見られなかった。このように、これらのデータは、表皮生物
発生説のＣｅ−Ｄｕｏｘ１の機能と整合している。ｐＰＤ９６．６２ＰＲＯＤｕ
ｏｘ１ＢからＣｅ−Ｄｕｏｘ１発現ＤＮＡを研究するトランスジェニックの線虫
のＥＸＡＭＰＬＥ ６つのＧｅｎｅｒａｔｉｏｎは、ｍｙｏ−３つのＧＦＰ Ｄ
ＮＡ（優しく、Ａ． Ｆｉｒｅ、ＥｍｂｒｙｏｌｏｇｙのカーネギーＩｎｓｔｉ
ｔｕｔｅ、ボルチモア、ＭＤによって提供されて）を混ぜ合わせられて、野生の
タイプまたはｒｏｌ−６人の（ｓｕｌＯ０６）ヤングアダルト両性具有者（Ｍｅ
ｌｌｏおよびＦｉｒｅ（１９９５））に注射された。Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ
ｓは、緑の体壁筋肉のための顕微鏡を解剖している蛍光の下で、Ｆ１後継者を審
査することによって識別された。これらの緑の白熱した動物は、汚された−、下
記のように、ガラクトシダーゼ発現。ｐＰＤ９６．６２がｎ−ガラクトシダーゼ
て緑の蛍光性のタンパク質（ＧＦＰ）発現を駆動したと思われたにもかかわらず
、蛍光は体壁筋肉（目印Ｍｙｏ−３−ＧＦＰの現れの部位）の外側に観察されな
かった。ｐＰＤ９６．６２ＰＲＯＤｕｏｘ１Ｂは、次のように準備された： ３３８９のｂｐ断片は、前のプライマー５’−ＡＧＴＣＧＡＡＧＣＴＴＡＧＣＡ
ＴＧＴＣＡＡＡＧＴＣＣＧＧＡＧＴＴＣＡＧＴ−３を使用しているＣ． ｅｌｅ
ｇａｎｓゲノムＤＮＡから、長い範囲ＰＣＲによって拡大された」（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：２９）、そして、逆のプライマー５’−ＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＧＣ
ＡＴＴＧＣＴＣＧＴＧＣＧＣＣＴＴＡＧＡＧＴＴＴ−３」（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：３０）．断片は、Ｃｅ−Ｄｕｏｘ１および５’ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ配列
のスタート・メチオニンを含んだ。断片は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩに
よって消化されて、それからｐＰＤ９６．６２にｓｕｂｃｌｏｎｅｄした。この
構造物はＣｅ−Ｄｕｏｘ１プロモータ領域（３３８９ｂｐ）に結果としてなる、
そして、挿入された５’ｏｆ大腸菌ｌａｃＺ遺伝子であることは緑の蛍光タンパ
ク質（ＧＦＰ）に、溶かしたスタート・メチオニンは遺伝子を報告した。／３−
Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｔａｉｎｉｎｇは、ｇｆｐ
の現れを検出するために用いた：ｐＰＤ９６．６２ＰＲＯＤｕｏｘ１Ｂ．を運ん
でいるトランスジェニックの虫のｌａｃＺ融合タンパク質Ｆｉｒｅ（１９９３）
によって記載されているように、試薬準備および固定は実行された。Ｎ−終点で
核の局地化ペプチドをまた、取り入れられるベクター（３−ガラクトシダーゼ。
これは、細胞を表す核において支配的に汚れることを許して、それらの識別を容
易にする。線虫は８つのウェル顕微鏡スライドｗｉｔｈ−１５ ｊｊの個々の源
に配置された蒸留水のｌ、そして、２−３つの最小限度のための真空の下で乾燥
させる。Ａｃｅｔｏｎｅは２分の間の乾燥した動物の上へ、連続的にしたたった
。そして、スライドはおおいのない湿気室に置かれるが、乾いておかれた。１０
ｊｕｌの）、３−ガラクトシダーゼ汚れ（火（１９９３））は、アセトンが完全
に蒸発した、そして、湿気室に対するふたが交換されたとすぐに、よい各々の上
へ階層化された。線虫は、それからいくつかの時間室温で、培養されて、いくつ
かの項目をリン酸塩緩衝された生理食塩水で洗って、それから複合顕微鏡で観察
した。Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓのＣｅ−Ｄｕｏｘ１の細胞場所が決定されたＣｅ−
Ｄｕｏｘ１の移動電話現れは、Ｃｅ−Ｄｕｏｘ１に対する、そして、ミオシンＡ
（体壁筋肉細胞のための目印）に対する抗体によって汚れることを二倍にする。

【０１１７】 Ｃｅ−Ｄｕｏｘ１は、筋肉細胞をＡ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇしているミオシン
の直ちに上に横たわっている細胞のｈｙｐｏｄｅｒｍａｌな層の幼虫の動物に示
して、筋肉四分円の上に横たわらなかったｈｙｐｏｄｅｒｍａｌな細胞において
、かすかに検出可能なだけだった。成人の動物において、Ｃｅ−Ｄｕｏｘ１は、
不十分に検出（図示せず）であった。幼虫の動物に示す強い信号は、Ｃｅ−Ｄｕ
ｏｘ１ペプチドによってｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｅｄされた反対のＣｅ Ｄｕｏｘ
１抗体を使用して除去された。

【０１１８】 実施例７つの抗体生成および浄化 Ｃｅ−Ｄｕｏｘ１の残留物３４０−３５５に対応する１６のアミノ酸ペプチドは
、鍵穴カサガイ・ヘモシアニン（ＫＬＨ）に、Ｅｍｏｒｙ Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙおよび被結合使用しているｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈ
ｙｄｅによって合成された。ラビット抗体は、標準のプロトコルを使用している
Ｌａｍｐｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｉｐｅ
ｒｓｖｉｌｌｅ（ＰＡ））によって、ＫＬＨ−活用されたペプチドに対して準備
された。ペプチド（３０ｍｇ）は、１ｍｌの抗体ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎのためのＡｆｆｉ−Ｇｅｌ １０（バイオＲａｄ）に連結した；２ｍｌ
の血清は、ＰＢＳに対して透析されて、ＰＢＳによってｐｒｅｅｑｕｉｌｉｂｒ
ａｔｅｄされるＡｆｆｉ−Ｇｅｌコラムに積まれた。コラムは、１ＭのＮａＣｌ
を含んでいる１０ｍｌのＰＢＳによって洗われた。抗体の０．５ｍｌの派閥は、
０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ ２．４）によって抜き取られて、ＴＲＩＳ
（ｐＨ ９）によって直ちに中性化された。タンパク質の最も高い濃度を含んで
いる分数が、免疫蛍光検査法実験において使われた。

【０１１９】 実施例８つの西洋のしみ 線虫は、Ｍ９緩衝液によって洗われて、０．５ｍｌの超音波処理緩衝液（１０
ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣ１、ｐＨ ７．４，１ ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭのｐｈｅ
ｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌフッ化物）において停止して、２０ｓ、
４つのｘを超音波で破壊した。タンパク質は、標準としてウシ血清アルブミンを
使用しているブラッドフォード分析評価によって決定された。１０ｉｇの全部の
動物性抽出物は、それからイモビロン−Ｐ膜（ミリポア）へ移された１０％のＳ
ＤＳｐａｇｅゲルに積まれた。しみはＰＢＳの脂肪を含まない５％の粉乳および
０．０５％のＴｗｅｅｎの溶液の１時間遮断された。Ｃｅ Ｄｕｏｘ１に対する
抗体は加えられた１、解釈を妨げることに関する１５の最小限度のための３つの
時間は２０００の希薄、培養された前夜および膜に流された。しみは、それから
ピアス（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ（Ｉｌ．））からＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌなＣｈｅｍ
ｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔキットを使用して開発された。Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ
タンパク質抜粋の西のしみは、分子量ｏｆ−１８０（０００（示されないデータ
））を有する単一のバンドを示した。

【０１２０】 実施例９つの間接的なＩ７ｎ７ｎｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．Ｂｅｎｉ
ａｎその他のＣ． ｅｌｅｇａｎｓの中で汚れている免疫蛍光検査法は実行され
た、１９９６。Ｍｙｏｓｉｎ Ａに対するマウス抗体は、Ｄ．ミラー（ミラーほ
か（１９８３））からの贈り物であった。ヤギ反ウサギは抗体をｒｈｏｄａｍｉ
ｎｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄした、そして、ヤギ反マウスＦＩＴＣ−活用された
抗体がそれぞれＣｅ−Ｄｕｏｘ１およびＭｙｏｓｉｎ Ａの探知のための第２の
抗体として使われた。Ｃｅ−Ｄｕｏｘ１抗体の非特異性の締め具を決定するため
に、Ｃｅ−Ｄｕｏｘ１ペプチドのモル１０倍の過剰は、抗体を中和するために加
えられた。顕微鏡検査は、ｃｏｎｆｏｃａｌな顕微鏡を走査しているツァイス５
１０のレーザーを使用して、実行された。Ａｂｄｅｌｒａｈｉｍその他の標準の
ｄｉｔｙｒｏｓｉｎｅ標準ＤｉｔｙｒｏｓｉｎｅのＥＸＡＭＰＬＥ １０のＰｒ
ｅｐａｒａｔｉｏｎは合成されて、浄化された、軽微な変更態様を有する１９９
７。反応製品は酸性化されたメタノールにおいて溶かされて、濾過されて、直接
ＣＰ−１１のセルロース・リン酸塩にあてはまった。そして、回転蒸発ステップ
を除去した。ｄｉｔｙｒｏｓｉｎｅに特有の吸収特性を有するサンプルは、プー
ルされて、乾燥させて凍る。質量分析のために、ｄｉｔｙｒｏｓｉｎｅ標準（０
．７７のｍｇ／ｍｌ）の１つのｍｌは、１ｍｌのメタノールに加えられた：酢の
０．１％の酸の水（１：１）。ｄｉｔｙｒｏｓｉｎｅおよびｔｒｉｔｙｒｏｓｉ
ｎｅ Ｎｅｍａｔｏｄｅｓの分析は、Ｍ９緩衝液によって洗われて、０．５ｍｌ
の超音波処理緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣ１、ｐＨ ７．４，１ ｍＭ
ＥＤＴＡ、１ｍＭのｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌフッ化物）に
おいて停止して、２０ｓ、４つのｘを超音波で破壊した。タンパク質は、標準と
してウシ血清アルブミンを使用しているブラッドフォード分析評価によって決定
された。全部の虫抽出物は、凍結乾燥されて、６Ｎ ＨＣ１の中に再懸濁された
。サンプルは、真空の下の１１０のＣでの２４ｈ加水分解されて、真空の下で乾
燥して、Ｄｉｏｎｅｘ ＡＧＰ−１つのＨＰＬＣ計測器を使用しているＣ１８コ
ラム（０．４６×２６ｃｍ、フィッシャー）上の高性能な流動クロマトグラフィ
（ＨＰＬＣ）によって、分析のための移動フェーズの中に再懸濁された。移動フ
ェーズは、１つのｍｌ／分の流速で、０．１Ｍのリン酸を有するｐＨ ３．８に
合う０．１ＭのＫＨ２ＰＯ４から成った。コラム溶離剤は、３０５３９５ナノメ
ートルの帯域通過フィルタおよび放出が４０ナノメートルの帯域通過を有する４
５０ナノメートルで、フィルターをかける刺激を有する蛍光によってモニタされ
た。ｄｉｔｙｒｏｓｉｎｅの同一性を検査するために、標準の確実なｄｉｔｙｒ
ｏｓｉｎｅは若干のサンプルに加えられた、そして、推定のｄｉｔｙｒｏｓｉｎ
ｅバンドの強度の増加は観察された（示されないデータ）。ｄｉ−ａｎｄ ｔｒ
ｉｔｙｒｏｓｉｎｅ．の分光器の特性ＨＰＬＣはｄｉｔｙｒｏｓｉｎｅのサンプ
ルを浄化した、そして、反応をクロスリンクしている両方のＣ．簡潔な抜粋およ
びペルオキシダーゼ領域からのｔｒｉｔｙｒｏｓｉｎｅは凍結乾燥されて、いず
れの０．１のＭ ＨＣ１（３ｍｌ）もまたは０．１ＭのＮａＯＨ（３ｍｌ）にお
いてｒｅｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｄした。蛍光刺激および放出スペクトルは、Ｐｅ
ｒｋｉｎ−エルマーＬＳ−５Ｂ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ
ｅｔｅｒによって得られた。３０００台の３倍の四重極質量分析計がｔｕｒｂｏ
ｉｏｎｓｐｒａｙソースを備えたＰＥ ｓｃｉｅｘ ＡＰＩに、質量分析ミサ分
光測定法は、予め形成された。乾燥したｄｉｔｙｒｏｓｉｎｅ標準（２０ｍｇ）
は、２００ｕｌのＨ２０において再構成された。これの５０ｕｌ約数は、ＭｅＯ
Ｈおよび酢の１％の酸の５ｍＭのアンモニウム酢酸塩の９５０ｕｌを有する１ｍ
ｌの最終的な体積に薄められた。それぞれ、ｉｏｎｓｐｒａｙが縫う５つの１つ
のｍｉｎ〜ｌ．の流速で、注がれるこの溶液は、正および負のイオン分析のため
の＋５５０Ｖのａｎｄ−４５００Ｖで保たれた。予測されるように、これらの実
験はそれぞれｍ／ｚ ３６１．３および３５９．３である標準の単独でｐｒｏｔ
ｏｎａｔｅｄされ（陽イオン・モード）てｄｅｐｒｏｔｏｎａｔｅｄされた（否
定のイオン・モード）種を識別した。Ｃ． ｅｌｅｇａｆａｓからの標準で全タ
ンパク質酸加水分解物は、逆のフェーズＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析された。
サンプルの５０のｇｌ量は、３００のユト最小限度の流速で、１５ １ ｃｍ×
２．１ｍｍのＳｕｐｅｌｃｏディスカバリーＣ１８コラムの上へ吹き込まれた」
、￥ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ａは、９９であった：１つのＨ２０／酢の酸性で溶解力
があるＢは、９９であった：５ｍＭのアンモニウム酢酸塩を両方とも含んでいる
１つのＭｅＯＨ／酢の酸。コラムは、直接陽イオン・モードにおいて作動してい
る質量分析計のイオン出所に吹き込まれた。コラムは、予めサンプル注入が続く
６つの最小限度のための１００％のＡによって釣り合わせた。コラムは、それか
ら４分１００％のＡによって洗われて、１００％のＢに対する線形１分勾配によ
って、抜き取って、１００％のＢ． Ｆｏｒを有する４分洗浄によって、続いた
両方ともこれらの実験先駆者イオン（ｄｉｔｙｒｏｓｉｎｅのための上記として
；ｔｒｉｔｙｒｏｓｉｎｅのためのｉｎｌｚ ５４０．４／５３８．４）、そし
て、構造的に特徴的な故障イオンモニタした。ｄｉｔｙｒｏｓｉｎｅのためにモ
ニタされる移行は、両方のカルボキシル基の中立のロス、カルボキシル基および
１つのアミンのグループの中立のロスおよびカルボキシル基および両方のアミン
のグループ（２６９．４，２５２．２および２３５．０だけそれぞれ）の中立の
ロスであった。ｔｒｉｔｙｒｏｓｉｎｅのために、モニタされる移行は、カルボ
キシルのロスが集める中立、カルボキシル基および１つのアミンのグループの中
立のロス、２つのＣ−終点の中立のロスおよび２つのカルボキシル基および２つ
のアミンのグループ（４９４．３，４７７．２，４４８．２および４３１．２だ
けそれぞれ）の中立のロスであった。＊ ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓな構造を
橋渡しをして、安定させるｄｉ−ａｎｄ三チロシン結合で、ＲＩＶ、コラーゲン
の中でクロスリンクしている４ｉ線虫および線虫の他の表皮タンパク質のｔｖｒ
ｏｓｉｙｚｅクロスｌｉｎｋｉｔｉｇの欠如は、起こる（Ｆｅｔｔｅｒｅｒほか
（１９９３）；Ｆｅｔｔｅｒｅｒ、そして、Ｒｈｏａｄｓ、１９９０）。ウニｏ
ｖｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅおよび人間のｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅのよう
なペルオキシダーゼがこの反応を実行する、（ＭａｌａｎｉｋおよびＬｅｄｖｉ
ｎａ（１９７９）；ＬａＢｅｌｌａほか（１９６８）；Ｄｅｉｔｓその他、１９
８４）、我々はＣｅ−Ｄｕｏｘ１の機能がチロシン・クロスリンクを生成するこ
とになっている、そして、Ｃｅ−Ｄｕｏｘ ＲＮＡｉ動物の不完全な表皮がチロ
シン・クロスリンクを形成することができないことによると仮定した。活性をク
ロスリンクしているチロシンがペルオキシダーゼ抑制剤４−アミンの２，３，４
アミノトリアゾール、ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅおよびＮ−アセチル・チ
ロシン（Ｆｅｔｔｅｒｅｒほか（１９９３））を使用して禁じられた研究に基づ
いて、Ａｓｃａｒｉｓにおいてクロスリンクしているチロシンの未知のペルオキ
シダーゼのための役割は、以前に提案された。

【０１２１】 我々は、したがって、野生のタイプてＣｅ−Ｄｕｏｘ１ ＲＮＡｉノックアウ
ト動物にｄｉ−ａｎｄ三チロシン結合がないか調べた。野生のタイプＣ． ｅｌ
ｅｇａｎｓの酸性加水分解物のＨＰＬＣ側面は確実な標準および大規模なスペク
トルの分析を有する比較に基づいて、ｄｉｔｙｒｏｓｉｎｅと確認された第１の
大きいピークを明らかにした、そして、第２のピークはｄｉｔｙｒｏｓｉｎｅお
よび大規模なスペクトルの分析と関連してＨＰＬＣ上のその移動に基づいてｔｒ
ｉｔｙｒｏｓｉｎｅと確認される。ピーク域および僭越な等価イオン化に基づい
て、ｄｉｔｙｒｏｓｉｎｅおよびチロシンは、１の比率に存在した：成人の野生
のタイプ動物の２００。加えて、蛍光刺激／放出最大は、アルカリで酸性のｐＨ
で決定されて、以前に報告された値（ジェイコブ（ほか１９９６））との良い契
約においてあった。ｄｉｔｙｒｏｓｉｎｅもｔｒｉｔｙｒｏｓｉｎｅピークも、
Ｃｅ−Ｄｕｏｘ ＲＮＡｉ線虫の加水分解物に認められなかった。Ｃｕｔｉｃｌ
ｅ ＢｉｏｇｅｎｅｓｉｓのｄｕｏｘのＥＸＡＭＰＬＥ １１のＰａｒｔｉｃｉ
ｐａｔｉｏｎ；コラーゲンおよび表皮生合成において不完全な動物の中の発現型
の類似がＲＮＡｉ Ｄｕｏｘ動物と比較した超構造Ａｎａｌｙｓｉｓは、Ｄｕｏ
ｘが表皮生物発生説に参加することを示唆した。この仮説を確かめるために、電
子顕微鏡検査法はｗｉｌｄｔｙｐｅおよびＲＮＡｉ動物に実行された。野生のタ
イプまたはＲＮＡｉ水ぶくれにされた成人のＣ． ｅｌｅｇａｎｓは、集められ
て、Ｍ９緩衝液によって、そして、それから０．１Ｍのカコジル酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ ７．４）によって最初に洗われた。０．８％のｇｌｕｔａｒａｌｄｅｙｄｅ
の１ｍｌに加えられて、動物は小球をぶつけられた０．７％の四酸化オスミウム
、０．１Ｍのカコジル酸塩ｐＨ ７．４、そして、１．５時間の氷上の卵を抱く
時々の混合。動物は、０．１Ｍのカコジル酸塩緩衝液によって洗われて、ガラス
製のホールスライドに移って、２３本のゲージ針を有する半分に割り込んだ。二
分された動物は、１ｍｌの新しい色留め剤（０．８％のグルタルアルデヒド、０
．７％の四酸化オスミウム、０．１Ｍのカコジル酸塩ｐＨ ７．４）を含んでい
るチューブに変形して、２時間のための氷に卵を抱いた。０．１Ｍのカコジル酸
塩緩衝液によって洗った後に、二分された動物は、一晩０．１Ｍのカコジル酸塩
緩衝液の１％の四酸化オスミウムの氷に取り付けられた。動物は、数回０．１Ｍ
のカコジル酸塩緩衝液で洗われて、酸化プロピレンによる等級分けされたアルコ
ールを使用して脱水状態になって、浸透して、Ｅｍｂｅｄ−８１２に埋められた
（電子Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆｔ．）ワシントン、ＰＡ）
。動物は、１６時間の６０Ｃで重合の前にまつげ調査との平行の取り決めにいじ
められた。断面（０．５ｍｍ）はオリエンテーションのために評価された、そし
て、ｕｌｔｒａｓｅｃｔｉｏｎｓ（厚さ８００Ａ）は２００のメッシュ銅格子に
集められて、ウラニル酢酸塩によって汚れて、クエン酸塩を導く、そして、横断
面はフィリップスＥＭ２０１電子顕微鏡で調べられた。超構造分析で、ＲＮＡｉ
Ｄｕｏｘ動物の表皮が大いに異常であることが分かった。通常の動物において
、３枚の表皮層は、明らかに見られた：皮質（外側の）で、中央で基礎の（内側
の）層以前に記載されている（コックス、Ｇ． Ｎ．、ほか、１９８１）ように
。メジアン層は、これらの層との流体に満ちたすきまについては、皮質で基礎の
層を接続している支柱から成る。ＲＮＡｉ動物は、しばしば分離を示した皮質の
、そして、これらの層にさらに見えた流体空洞および壊れて広げられた支柱の著
しい展開については、基礎の層。これらの分離は、筋繊維の束を通じて主に起こ
って、少しの顕微鏡検査を使用しているのを見られる水ぶくれの形成を説明しそ
うである。このように、表皮構造は、ＲＮＡｉ Ｄｕｏｘ動物において厳格に影
響を受けた。ポリメラーゼ連鎖反応が使われた実施例１２の構造ｏｆＤｕｏｘペ
ルオキシダーゼ領域発現プラスミドは、ｈ−Ｄｕｏｘのペルオキシダーゼ領域を
拡大する（アミノ酸残留物１−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．）：３１）、そし
て、Ｃｅ−Ｄｕｏｘ（アミノ酸残留物１−５９０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３２
）クローンをつくられた全長配列から。プライマーは、私が据え付けるＮ−末端
ＢａｍＨおよび私が据え付けるＣ−末端Ｎｏｔを導くように設計されていた。Ｐ
ＣＲ製品はＢａｍＨによって消化された私、そして、Ｎｏｔ私、そして、Ｎｏｖ
ｏｇｅｎ（マディソン（ＷＩ））からｐＥＴ−３２ａ（＋）ベクターに結さつさ
れる。プラスミドはｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌｒｅｓｉｓｔａｎｔなプラ
スミドｐＴ−ｇｒｏＥ（ヤスカワ、ほか、１９９５）を含んでいるＢＬ２１（Ｄ
Ｅ３）細胞に変わった。そして、それはＴ７プロモータからｃｈａｐｅｒｏｎｉ
ｎｓ ｇｒｏＥＳおよびｇｒｏＥＬを表す。ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞のｐＴｇｒ
ｏＥ発現ベクターは、博士リー−Ｈｏワング（テキサス大学ヘルス・サイエンス
・センタ、ヒューストン、ＴＸ）およびシュンスケ・イシイ博士（Ｐｈｙｓｉｃ
ａｌおよびＣｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、茨城、日本の学会）からの寛
容な贈り物であった。アンピシリンおよびクロラムフェニコールを含んでいるＬ
Ｂ−寒天プレートは、コロニーを分離するために用いた。

【０１２２】 ｈ−ＤｕｏｘまたはＣｅ−Ｄｕｏｘからペルオキシダーゼ領域を有するプラス
ミドを含んでいる細胞のＬＢ夜通しの０．５ｍｌの培養が５０ｍｌ接種するため
に用いたＤｕｏｘペルオキシダーゼ領域Ａの現れは、ｄ−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌ
ｉｎｉｃな０．５ｍＭの酸、１００のｍｇの／ｍｌのアンピシリンおよび２５０
ｍｌのフラスコの２５のｍｇの／ｍｌのクロラムフェニコールを含んでいるＴＢ
媒体（Ｓａｎｄｈｕほか（１９９３））を修正した。細胞密度が６００ナノメー
トルで０．７のＯＤを測定するまで、バクテリアは２００回転数／分でシェーカ
の３７Ｃで育てられた。イソプロピル−ｂ−Ｄ ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒ
ａｎｏｓｉｄｅ（１ｍＭ）は加えられた、そして、培養は１５０回転数／分で２
４時間の２５Ｃで続けられた。細胞は、４，５００のｘ ｇで小球をぶつけられ
て、４−（２ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｆｎｙｌフッ化物（２
ｍＭ）、ｂｅｓｔａｔｉｎ（１３０ｎＭ）、ｔｒａｎｓｅｐｏｘｙｓｕｃｃｉｎ
ｙｌ−Ｌ ｌｅｕｃｙｌ−ａｍｉｄｏ（４−ｇｕａｎｉｄｉｎｏ）ブタン（１．
４ｎＭ）、ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ（１ｎＭ）およびａｐｒｏｔｉｎｉｎ（０．３ｎ
Ｍ）を含んでいるＰＢＳにおいて再懸濁された。細胞懸濁液は、それから氷に超
音波で破壊された。

【０１２３】 Ｃｅの表されたペルオキシダーゼ領域の生化学活性 Ｄｕｏｘ１およびｈ−Ｄｕｏｘ１ Ｃｅ−Ｄｕｏｘのペルオキシダーゼ領域（残
留物１−５９０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．）：３２）、そして、ｈ−Ｄｕｏｘ１（
残留物１−５９３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３１）、上記の通りに、大腸菌の表
した。これらの細胞からの溶解物は、ペルオキシダーゼ活性のために分析された
。結果は、Ｄｕｏｘから人間およびＣ．簡潔なペルオキシダーゼ−異体同形領域
を表して、大腸菌からの溶解物がＴＭＢ（よく特徴づけられたペルオキシダーゼ
基板）の方へ、ペルオキシダーゼ活性を示すことを示した。活性は、ペルオキシ
ダーゼ抑制剤ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｌｙｄｒａｚｉｄｅによって禁止された。 ベクター制御細胞からのそれら以外でない、ｈ−ＤｕｏｘおよびＣｅ−Ｄｕｏｘ
ものペルオキシダーゼ領域を表している大腸菌からの溶解物は、チロシン・エチ
ル・エステルをクロスリンクすることに触媒作用を及ぼした。２つの主な蛍光性
の製品は見られた。そして、そのことはまた、表皮タンパク質の加水分解物に示
した；ピーク１はｄｉｔｙｒｏｓｉｎｅとして確実な材料および大規模なスペク
トルの分析を有するｃｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙによって識別された。そ
の一方で、ピーク２は上記として大規模なスペクトルの分析によって三チロシン
と確認された。ＥＸＡＭＰＬＥ １３のＡｃｔｉｖｉｔｙは、３，３を分析する
」、流動基板系（シグマ、セントルイス、ＭＯ）が使われた５，５−テトラメチ
ルベンジジン（ＴＭＢ）はペルオキシダーゼ活性（オランダほか（１９７４））
を分析する。ＴＭＢ基板系の細胞からの溶解物タンパク質の１００ｍｇ １ｍｌ
の約数に表すどちらか、人間のＤｕｏｘ１ペルオキシダーゼ領域、Ｃｅ−Ｄｕｏ
ｘ１ペルオキシダーゼ領域またはベクター制御は、加えられた。ペルオキシダー
ゼ反応は三つ組の一つにおいて実行された、そして、活性はＢｅｃｋｍａｎ Ｄ
Ｕ６４０Ｂ分光光度計を有する６５５ナノメートルでモニタされた。若干のサン
プルは、３０ｍＭのアミノ安息香酸ヒドラジド（ペルオキシダーゼ抑制剤（ヤカ
ンその他１９９５））を含んだ。クロスリンクしているチロシンを分析するため
に、チロシン・エチル・エステル（２０ｍＭ）は、１０ｍｌの３％のＨ２Ｏ２の
８０ｍｌで補充されるＰＢＳ緩衝液において溶かされた。１ｍｌの約数まで、１
００ｍｇの大腸菌溶解物タンパク質が加えられたこと、サンプルは１時間培養さ
れた、そして、反応は１２ＭのＨＣ１の同等の量を使用して消された。 サンプルは、上記としてｄｉ−ａｎｄ三チロシンのために分析された。

【０１２４】 ＮＡＤＰＨに依存する過酸化物Ｇｅｎｅｒａｔｉｏ７ｌ分析評価 本発明の実施例において、細胞が人間のｄｕｏｘ２遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１）によって、安定してトランスフェクションさせたＮＩＨ ３Ｔ３は、ｌｕ
ｃｉｇｅｎｉｎを使用している過酸化物生成のために分析される（ビスＮｍｅｔ
ｈｙｌａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ発光は、分析する（シグマ、セントルイス、ＭＯ、
Ｌｉその他（１９９８の）Ｊ；生物学Ｃｈｅ７ｎ．２７３，２０１５−２０２３
）．細胞は、冷えたＨＡＮＫＳ’ｓｏｌｕｔｉｏｎによって洗われて、Ｄｏｕｎ
ｃｅホモジェナイザを使用している１５％のサッカロースを含んでいるＨＡＮＫ
Ｓ’ｂｕｆｆｅｒの氷に均質にした。細胞溶解物は、ドライアイス／エタノール
浴槽において直ちに凍る。分析評価のために、３０ｉｇの細胞溶解物は、２００
のＦＭ ＮＡＤＰＨおよび５００のＦＭ ｌｕｃｉｇｅｎｉｎを混ぜ合わせられ
る。発光は３つの連続した１つの分間隔で、ＬｕｍｉＣｏｕｎｔｅｒ（パッカー
ド）を使用してモニタされる、そして、最も高い値が比較のために使われる。タ
ンパク質濃度は、ブラッドフォード方法によって決定される。過酸化物生成は、
いくつかの安定してトランスフェクションする細胞系からの溶解物においてモニ
タされて、ｕｎｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄされたＮＩＨ ３Ｔ３細胞溶解物によっ
て、過酸化物生成と比較された。結果は、トランスフェクションする細胞が過酸
化物生成の最も高い程度に対応する微細な審査によって、形態的な変化の最も高
い程度を所有するショーである。発光の信号は過酸化物ｄｉｓｍｕｔａｓｅおよ
び一般的なフラビンタンパク質抑制剤ｄｉｐｈｅｎｙｌｅｎｅ ｉｏｄｏｎｉｕ
ｍによって禁じられるが、加算再結合物人間のｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘ
およびＲａｃｌ（ＧＴＰ−ｙＳ）に影響を受けない。そして、それは食細胞呼吸
の爆発オキシダーゼのための基本的ｃｙｔｏｓｏｌｉｃな要因である。

【０１２５】 本発明の交互の実施態様において、ｈｄｕｏｘ２（ＹＡ２８）によってまたは
空のベクター（ＮＥＦ２）によって安定してトランスフェクションする細胞は、
ほぼ８０％のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙにＤＭＥＭ、１０％の子牛血清、１００単位
／ｍｌペニシリン、１００のｊｕｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１つのｕｇ
／ｍｌのピューロマイシンを含んでいる媒体の１０ｃｍの組織培養プレートにお
いて発達する。緩衝された生理食塩水（ＰＢＳ）がそれから５ｍＭのＥＤＴＡを
含んでいるＰＢＳを有するプレートから、分離した５ｍｌのリン酸塩によって、
細胞（各セル・タイプの５枚の組織培養プレート）は簡潔に洗われる。細胞は、
１０００のｘ ｇで簡潔にｃｅｎｔｒｉｆｕｇｉｎｇすることによって小球をぶ
つけられる。細胞をｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅするために、凍結解凍渙散は、小
さい孔針による細胞材料の通過が続いて、実行される。上澄みは除去される、そ
して、凍られる細胞は１５分の間の氷を乾燥させる。細胞が解けたあと、Ｓｉｇ
ｍａ（カタログ＃ Ｐ２７１４）からプロテアーゼ抑制剤の混合物を含んでいる
２００のゲル渙散緩衝液（ＨＡＮＫＳ’Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｔ解決手段Ｈ
ＢＢＳ）は加えられる。氷上の細胞は１０回１８本のｇｕａｇｅ針に通される、
そして、２００ｇｌの３４％のサッカロースを含んでいるＨＢＳＳ緩衝液は１７
％のサッカロースの最終的な濃度を生むために加えられた。サッカロースは、倉
庫に安定性を強化するように見える。ｆｒｅｅｚｅ−ｔｈａｗｉｎｇする組合せ
および細胞およびこの材料の全ての渙散の本質的に針結果を通る通路はｔｈｅ”
ｃｅｌｌ溶解物。細胞溶解物が、ＢｉｏＲａｄタンパク質分析評価システムを使
用しているタンパク質濃度のために分析されると呼ばれる。

【０１２６】 細胞溶解物は、ＨＢＳＳ緩衝液を結合することによるＮＡＤＰＨに依存する化
学ルミネセンス、アラキドン酸および分析評価プレート（９６枚のかなりプラス
チック・プレート）の０．０１−１つのｇタンパク質のために分析される。 反応は２００、ｕＭ ＮＡＤＰＨおよび１０ｕＭ ｌｕｃｉｇｅｎｉｎの最終的
な集中を与えるために１．５ｍＭのＮＡＤＰＨおよび７５ｕＭ ｌｕｃｉｇｅｎ
ｉｎを分析評価混合に加えることによって始められる、そして、化学ルミネセン
スは直ちにモニタされる。最終的な分析評価量は、最適のアラキドン酸濃度が５
０−１００のｐＭについてである約１５０のｊｊ． ｌ．である。パッカードＬ
ｕｍｉｃｏｕｎｔ照度計はプレートが６０分連続的にモニタされる３７のＣ．で
、ｌｕｃｉｇｅｎｉｎおよび過酸化物間の反応の化学ルミネセンスを測定するた
めに用いる、そして、各々のサンプルのための最大限の相対的な発光装置（ＲＬ
Ｕ）値はプロットされる。結果は、ＮａＣｌの存在または５０−１５０のｐＭの
集中範囲の中のＫＣ１が最適の活性にとって重要であることを示す。もっと先の
ＭｇＣｌ２（１−５つのｍＭ）は、２−折り目についてによって活性を強化する
。 ｄｕｏｘ２ ＮＡＤＰＨ−ｏｘｉｄａｓｅ活性のためのこのｃｅｌｌｆｒｅｅ分
析評価は、ｄｕｏｘ２酵素のモジュレータ（抑制剤または刺激器）を隠すことに
役立つ。分析評価は、また、検出するために用いてもよい、そして、一般の、そ
して、酵素のｄｕｏｘ一系統のモジュレータ（抑制剤または刺激器）のためのス
クリーンに対するｄｕｏｘ ＮＡＤＰＨ−ｏｘｉｄａｓｅ活性。ＮＩＨ ３Ｔ３
によって発生する過酸化物によるニトロ悲観的なテトラゾリウム換算。完全なセ
ルのそばのＳｕｐｅｒｏｘｉｄｅ世代がｎｉｔｒｏｂｌｕｅテトラゾリウムの過
酸化物ｄｉｓｍｕｔａｓｅ−傷つきやすい減少を使用してモニタされるＤｕｏｘ
２ ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）によって、細胞はＴｒａｎｓｆｅｃｔ
ｅｄした。ＮＥＦ２（単独で制御を一定方向に向ける）ＹＡ２６（ｄｕｏｘ２（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）−トランスフェクションさせる）、そして、ＹＡ２８
（ｄｕｏｘ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）−トランスフェクションさせる）、細
胞はウェルにつき５００，０００の細胞で６枚のウェルプレートにおいてメッキ
をされる。約２４時間後に、媒体は細胞から取り外される、そして、細胞は１ｍ
Ｌのハンクス溶液（シグマ、セントルイス、ＭＯ）を有する一度洗われる。 約１ｍＬの青いテトラゾリウム（ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ））がハンクスにおいて加
えられる０．２５％のナイトロ・フィルターをかけるまたは過酸化物ｄｉｓｍｕ
ｔａｓｅ（シグマ）および細胞の６００台の装置を有する５％のＣ０２．がある
場合には、３７のＣで抱かれる８分以後、細胞はこすられて、１０，０００ｇ以
上で小球をぶつけられる。ペレットは、１ｍＬのピリジン（シグマ）の中に再懸
濁されて、減少するＮＢＴを可溶性にするために１００Ｃで１０分間熱くなった
。減少するＮＢＴの集中は５１０ナノメートルで吸光度を測定することによって
決定される。そして、１１，０００のＭ’ｌｃｍ’１の絶滅係数を使用する。若
干のウェルは、処理されていなくて、細胞番号を決定したものである。データは
、それを示すｄｕｏｘ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）（トランスフェクションす
る細胞生成された重大な多量の過酸化物）。過酸化物ｄｉｓｍｕｔａｓｅが細胞
を通しそうでないので、過酸化物は細胞外で発生しなければならない。これらの
細胞によって発生する過酸化物の量は、活性化された人間の好中球によって発生
するそれの５−１０％についてである。Ｄｕｏｘ２の細胞内構成要素の実施例１
４の変更態様は、細胞をトランスフェクションさせたｄｕｏｘ２によって発生す
る過酸化物がｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ”ｔａｒｇｅｔｓに影響を及ぼすこと
ができるかどうか検査するために」、制御およびｄｕｏｘｔｒａｎｓｆｅｃｔｅ
ｄされた細胞系のアコニターゼ活性は、Ｓｕｈほか（１９９９の）ネイチャー４
０１，７９−８２にて説明したように、方法を使用してモニタされる。

【０１２７】 アコニターゼが、活性のロスに結果としてなって、過酸化物によって変更態様
に非常に影響されやすい４−ｉｒｏｎｓｕｌｐｈｕｒクラスタを含んで、細胞内
過酸化物世代のリポータとして使われた。Ａｃｏｔｉｎａｓｅ活性は、ガードナ
ーほか（１９９５の）Ｊにて説明したように、決定される：生物学化学２７０（
１３３９９−１３４０５）。Ａｃｏｔｉｎａｓｅ活性は、ＹＡ２６、ＹＡ２８お
よびトランスフェクションする制御と比較したＹＡ２１２と称される全ての３つ
のｄｕｏｘ−トランスフェクションする細胞系において、かなり減らされる。差
動の遠心分離に基づいて、これらの細胞のアコニターゼのほぼ５０％はミトコン
ドリアである、そして、ｃｙｔｏｓｏｌｉｃでミトコンドリア形式は両方とも影
響を受ける。鉄の硫黄センターを含まないｃｙｔｏｓｏｌｉｃな制御およびミト
コンドリア酵素は、影響を受けない。ｄｕｏｘ２−トランスフェクションする細
胞において発生する過酸化物は、したがって、細胞内構成要素を化学反応して、
修正することができる。

【０１２８】 細胞を受けているヌードマウスの１５腫瘍代が人間とトランスフェクションさ
せた実施例 ｄｕｏｘ２ ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１） 約２×１０６ ＮＩＨ ３Ｔ３細胞（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯを有するいずれのｈｄ
ｕｏｘ２ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄも：１または細胞は、空のベクターを使用する
ことをトランスフェクションさせた）４−５匹の週旧ヌードマウスの首の横方向
の態様に、ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙに注射する。６匹のマウスに対する３は各々
の３つのＤｕｏｘ１−トランスフェクションする細胞系のために吹き込まれる、
そして、３匹のマウスは空のベクター（制御）によってトランスフェクションす
る電池を注射される。３週に対する２の後、マウスは犠牲にされる。腫瘍は、１
０％のホルマリンに取り付けられて、組織学の分析によって特徴づけられる。腫
瘍は、大きさにおいて１．５のｘ １×１ｃｍを平均して、肉腫タイプ腫瘍を代
表する組織学を示す。加えて、腫瘍は表面的な毛細管によって非常にｖａｓｃｕ
ｌａｒｉｚｅｄされるように見える。ｄｕｏｘ２遺伝子トランスフェクションす
る電池を注射される１２匹のマウスのうちの１１匹は腫瘍を発達させる。その一
方で、３匹の制御動物のどれも腫瘍にならない。

【０１２９】 他の研究において、１５匹のマウスは、３Ｔ３セル、ｄｕｏｘ２ｔｒａｎｓｆ
ｅｃｔｅｄ ＮＩＨを注射される。注射される１５匹のマウスの中で、１４は１
７日の注入の範囲内で大きい腫瘍を示す、そして、腫瘍はＤｕｏｘ１ ｍＲＮＡ
の現れを示す。Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｌｙに、腫瘍は線維肉腫に似ていて、
ラースによって誘発された腫瘍と同様である。このように、ラースおよびｄｕｏ
ｘ２は、ａｔｈｙｍｉｃなマウスのＮＩＨ ３Ｔ３細胞の腫瘍形成性を誘発する
それらの能力において、同様に有力である。非ガンのＧｒｏｗｔ１ｌのＤｕｏｘ
２の役割の実施例１６のデモンストレーション。

【０１３０】 通常の成長の役割は、ｄｕｏｘ２をネズミにアンチセンスに扱うことによって
ネズミ大動脈の脈管の平滑筋細胞において示される。アンチセンスのＤＮＡを有
するトランスフェクションは、過酸化物生成および血清に依存する成長の減少に
結果としてなる。Ｄｕｏｘ２は、したがって、この細胞タイプの通常の成長に関
係する。

【０１３１】 全ての特許、刊行およびアブストラクトは、上記がそれらの全部において本願
明細書に引用したものとするということを引用した。前述のことが本発明の好適
な実施例だけに関すると理解されなければならない、そして、その多数の変更態
様または変更は趣旨および以下の請求項に記載の本発明の範囲から逸脱すること
なく、その中でなされることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１。ｇｐ９ｌｐｈｏｘ．の大きい相同物の構造Ｄｕｏｘタンパク質の領域構
造。分泌する信号のペプチド・配列は灰色の三角形によって示される。その一方
で、予測された膜内外アルファ螺旋はハッシュされた長方形によって示される。
白い卵形は、部位を結合しているＥＦ−手カルシウムを有する異体同形を示して
いる領域を示す。

【図２Ａ】 図２。ｈ−Ｄｕｏｘ、Ｃｅ Ｄｕｏｘ１および周知の若干のペルオキシダーゼ
のペルオキシダーゼ領域の比較。Ａ） 配列配置。省略形は、以下の通りである ＭＰＯ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）；ＴＰＯ（甲状腺のペルオキシダ
ーゼ）；欧州特許庁（好酸球ペルオキシダーゼ）；ＬＰＯ、ｌａｃｔｏｐｅｒｏ
ｘｉｄａｓｅ、Ｐｘｓｎ． ｄｒｏｓ、ショウジョウバエｐｅｒｏｘｉｄａｓｉ
ｎ．全ての７つのタンパク質の中で節約される残留物はブラック・ボックスによ
って示される。その一方で、引き出された共通配列にマッチしているそれらは線
箱に示される。満たされた円は、犬のｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（Ｚｅｎ
ｇおよびＦｅｎｎａ（１９９２））の結晶構造に基づいて、接触にヘムを供給す
るために提案される残留物を示す。ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｅｄされた複縦線は
領域を結合しているカルシウムから成る残留物を示す、そして、満たされた三角
形はカルシウム・イオンに直接縛るために結晶構造に現れる残留物を示す。

【図２Ｂ】 系統発生の関係。追加の配列と同様にＡに示される配列は、示される。省略形
は、以下の通りであるＯＰＯ（ｏｖｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）；ｓｔｒ． ｐｕ
ｒｐ（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅ７ｌｔｒｏｔｕｓ ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ）；ｌ
ｙ．バール（Ｌｙｔｅｃｈｉｎｕｓ ｖａｒｉｅｇａｔｕｓ）；ｈｅｍｉ． ｐ
ｕｌｃｈ；Ｈｅｍｉｃｅｎｔｒｏｔｕｓ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍｕｓ。

【図３】 図３。ｈ Ｄｕｏｘ１、ｈ−Ｄｕｏｘ２およびグリセルアルデヒド３−リン酸
塩デヒドロゲナーゼのためのｈ−Ｄｕｏｘ． ｍＲＮＡのためのｍＲＮＡの組織
現れは、ＲＴ−ＰＣＲによって検出された。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 5/14 Ａ６１Ｐ 9/10 １０１ ４Ｃ０８７ 9/00 9/12 ４Ｈ０４５ 9/10 １０１ 11/00 9/12 13/08 11/00 17/06 13/08 29/00 17/06 35/00 29/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 35/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 16/40 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/02 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/06 1/28 5/10 1/68 Ｚ 9/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/02 5/00 Ａ 1/28 Ｅ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/50 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 グレンドリング， キャシー ケイ． アメリカ合衆国 ジョージア 30087， ストーン マウンテン， カナワ トレイ ル 1819 (72)発明者 アーノルド， レベッカ エス． アメリカ合衆国 ジョージア 30084， タッカー， ブリドル パス コート 4344 (72)発明者 チェン， グアンギジー アメリカ合衆国 ジョージア 30329， アトランタ， ブライアークリフ ロード 2751， アパートメント １ (72)発明者 シャーリング， リサ イギリス国 557 ３ディーエイチ エセ ックス， サンダースリー， ザ チェイ ス， ライムツリー ビラズ ２ (72)発明者 ベニアン， ガイ アメリカ合衆国 ジョージア 30033， ディカター， ウォーターフォード コー ブ 2396 (72)発明者 エデンス， ウィリアム エイ． アメリカ合衆国 ジョージア 30084， タッカー， ハイドアウェイ ドライブ 4171 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA08 CA04 CA20 DA01 DA02 DA05 DA11 DA12 EA04 GA11 HA11 HA17 4B050 CC01 CC03 CC05 DD11 EE01 LL01 LL03 LL05 4B063 QA01 QA05 QQ21 QQ23 QQ41 QQ61 QQ89 QQ95 QR03 QR57 QR77 QR80 QS36 QX01 QX10 4B065 AA01X AA58X AA72X AA91X AA93Y AB01 AC14 AC20 BA02 BA30 CA28 CA43 CA44 CA46 4C084 AA13 AA16 CA18 CA53 DC23 NA14 ZA022 ZA162 ZA362 ZA422 ZA452 ZA592 ZA892 ZB112 ZB262 4C087 BC83 NA14 ZA02 ZA16 ZA36 ZA42 ZA45 ZA59 ZA89 ZB11 ZB26 4H045 AA11 CA40 DA75 EA20 EA50 FA71

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 過酸化物生成を刺激することができるタンパク質またはタン
   パク質であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ
   ＩＤ ＮＯ：３１、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のアミノ酸配列から成る生
   成過酸化的な反応、それの断片またはそれの置換、そこにおいて、タンパク質、
   それの断片またはそれの保守的な置換ができる保守派生成反応性酸素中間物また
   は生成過酸化的な反応。
2. 【請求項２】 過酸化物生成を刺激することができるタンパク質またはタン
   パク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
   Ｏ：３１、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のアミノ酸配列から成る生成過酸化
   的な反応、それの断片またはそれの保守的な置換。
3. 【請求項３】 過酸化物生成を刺激することができるタンパク質またはタン
   パク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
   Ｏ：３１、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のアミノ酸配列から成る生成過酸化
   的な反応、それの削除またはそれに対してアミノ酸配列またはそれの保守的な置
   換の約５％よりそこにおいて、これ以上の加算でない、保守的な置換は、ａ）ア
   ラニン、セリンまたは各々のためのトレオニンの置換から成る；各々のためのｂ
   ）アスパラギン酸またはグルタミン酸；各々のためのｃ）アスパラギンまたはグ
   ルタミン；各々のためのｄ）アルギニンまたはリジン；ｅ）イソロイシン、ロイ
   シン、メチオニンまたは各々のためのバリン；そして、ｆ）フェニルアラニン、
   チロシンまたは各々のためのトリプトファン。
4. 【請求項４】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４、Ｓ
   ＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３２のアミノ酸配列か
   ら成るタンパク質。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１つに詳述したタンパク質（それの
   断片またはそれの保守的な置換）をコードするヌクレオチド配列。
6. 【請求項６】 ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１またはＳＥＱ
   ＩＤ ＮＯ：３、それの断片またはそれの保守的な置換から成る請求項５のヌ
   クレオチド配列。
7. 【請求項７】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３か
   ら成るヌクレオチド配列。
8. 【請求項８】 ベクターが請求項１〜４のいずれか１つに詳述したタンパク
   質それの断片またはそれの保守的な置換をコードするヌクレオチド配列を含むベ
   クター。
9. 【請求項９】 ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１またはＳＥＱ
   ＩＤ ＮＯ：３、それの断片またはそれの保守的な置換から成る請求項８のベ
   クター。
10. 【請求項１０】 ベクターがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１またはＳＥＱ ＩＤ
    ＮＯ：３、それの断片またはそれの保守的な置換から成るヌクレオチド配列を
    含むベクター。
11. 【請求項１１】 請求項８のベクターを含んでいる細胞。
12. 【請求項１２】 請求項１０のベクターを含んでいる細胞。
13. 【請求項１３】 請求項１〜４のいずれか１つのタンパク質に対して発生す
    る抗体。
14. 【請求項１４】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、Ｓ
    ＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のアミノ酸配列に対し
    て発生する抗体。
15. 【請求項１５】 過酸化物形成を刺激する方法であって、インビトロまたは
    、インビボにおいて、生成過酸化的な反応、または、薬学的に受け入れられるキ
    ャリアの請求項１〜４のいずれか１つのタンパク質から成る組成物の投与から成
    る、方法。
16. 【請求項１６】 過酸化物形成を刺激する方法であって、インビトロまたは
    、インビボにおいて、生成過酸化的な反応、または、薬学的に受け入れられるキ
    ャリアの請求項４のタンパク質から成る組成物の投与から成る、方法。
17. 【請求項１７】 過酸化物形成を刺激する方法であって、インビトロまたは
    、インビボにおいて、生成過酸化的な反応、または、薬学的に受け入れられるキ
    ャリアの請求項８のベクターから成る組成物の投与から成る、方法。
18. 【請求項１８】 過酸化物形成を刺激する方法であって、インビトロまたは
    、インビボにおいて、生成過酸化的な反応、または、薬学的に受け入れられるキ
    ャリアの請求項９のベクターから成る組成物の投与から成る、方法。
19. 【請求項１９】 薬の活性を決定する方法または、過酸化物生成を刺激する
    かまたは薬または化学製品の管理に続いている過酸化的な反応を起こすために、
    請求項１〜４のいずれか１つに詳述したタンパク質（それの断片またはそれの保
    守的な置換）の化学の成っている測定酵素活性。
20. 【請求項２０】 薬の活性を決定する方法または過酸化物生成を刺激するか
    または薬または化学製品の管理に続いている過酸化的な反応を起こすために請求
    項４において詳述されるタンパク質の化学の成っている測定酵素活性。
21. 【請求項２１】 酵素活性がテトラメチルベンジジンにＮＡＤＰＨ−依存性
    であるかＮＡＤＨ−依存性の過酸化物世代である請求項１９の方法酸化かチロシ
    ン・クロス連結している。
22. 【請求項２２】 酵素活性がテトラメチルベンジジンにＮＡＤＰＨ−依存性
    であるかＮＡＤＨ−依存性のジアホラーゼ活性である請求項１９の方法酸化かチ
    ロシン・クロス連結している。
23. 【請求項２３】 薬の活性または薬またはタンパク質に化学のものの化学の
    成っている測定締め具を決定する方法、それの断片または、請求項１〜４のいず
    れか１つに詳述したようにも、それの保守的な置換。
24. 【請求項２４】 薬の活性または薬の化学の成っている測定締め具を決定す
    る方法または請求項４において詳述されるタンパク質に化学の。
25. 【請求項２５】 薬の活性または増殖的な活性を調整するために薬または化
    学製品の活性を測ることから成っている化学製品を決定する方法または請求項１
    〜４のいずれか１つに詳述したタンパク質（それの断片またはそれの保守的な置
    換）の過酸化的な活性。
26. 【請求項２６】 薬の活性または増殖的な活性を調整するために薬または化
    学製品の活性を測ることから成っている化学製品を決定する方法または請求項４
    において詳述されるタンパク質の過酸化的な活性。
27. 【請求項２７】 酵素活性が完全な細胞を使用して査定される、それの細胞
    または細胞溶解物をトランスフェクションさせた請求項１９の方法。
28. 【請求項２８】 酵素活性が完全な細胞を使用して査定される請求項２０の
    方法は、それの細胞または細胞溶解物をトランスフェクションさせた。
29. 【請求項２９】 活性が表皮生物発生説であるｄｕｏｘ（それの断片または
    それの保守的な置換）から成るタンパク質の活性に影響を及ぼす組成物の表皮を
    有する有機体の管理から成る表皮生物発生説に影響を及ぼす方法。
30. 【請求項３０】 タンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２、ＳＥＱ ＩＤ
    ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２、のアミ
    ノ酸配列それの断片またはそれの保守的な置換から成る請求項２９の方法。
31. 【請求項３１】 ｄｕｏｘから成るタンパク質、それの断片または、過酸化
    物生成を刺激するかまたは薬または化学製品の管理に続いている過酸化的な反応
    を起こすために、薬の生物学的活性またはｄｕｏｘ、それの断片またはそれの保
    守的な置換の化学の、成っている測定酵素活性を評価するためにそれの保守的な
    置換の使用。
32. 【請求項３２】 ｄｕｏｘタンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２、ＳＥＱ
    ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２
    、それの断片またはそれの保守的な置換のアミノ酸配列から成る請求項３１の使
    用。
33. 【請求項３３】 生物学的活性が表皮生物発生説、甲状腺のホルモン生合成
    または線維症である請求項３１の使用。
34. 【請求項３４】 線維症が肺線維症である請求項３３の使用。