JP2003533215A - 新規の７回膜貫通タンパク質および前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 複数のGタンパク質共役受容体のヌクレオチドとアミノ酸配列が記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、参照により本明細書に任意の目的で組み入れられる2000年5月12日
に出願された米国特許出願第60/203,875号、および2000年5月30日に出願された
米国特許出願第60/207,932号の優先権を主張する。

【０００２】発明の分野 本発明は、膜関連タンパク質と受容体をコードする新規ヒトポリヌクレオチド
の発見、同定および特性決定に関する。本発明は、記載したポリヌクレオチド、
宿主細胞発現系、コードされたタンパク質、融合タンパク質、ポリペプチドおよ
びペプチド、コードされたタンパク質およびペプチドに対する抗体、ならびに開
示した遺伝子を欠くかもしくは開示した遺伝子を過剰発現する遺伝子操作された
動物、または該タンパク質のアンタゴニストおよびアゴニスト、ならびに開示し
た遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性をモジュレートす
る他の化合物を包含し、これらは診断、医薬スクリーニング、臨床試験モニタリ
ング、および／または生理学的もしくは行動障害の治療に利用することができる
。

【０００３】発明の背景 膜受容体タンパク質は細胞機構の構成成分として、細胞の環境を感知して細胞
ホメオスタシスと機能を維持する役割を果たすことができる。従って、膜受容体
タンパク質はしばしば、細胞生理学、化学コミュニケーション、および遺伝子発
現を制御するシグナル伝達経路に関わる。膜受容体の特に重要なクラスは、典型
的には、非保存の親水性ループによって相互接続された7つの保存された膜貫通
ドメインの存在によって特徴付けられる。そのような「7TM受容体」はGタンパク
質共役型受容体（GPCR）として知られる受容体スーパーファミリーを含む。GPCR
は、典型的には、Gタンパク質もしくはPPGタンパク質が関わるシグナル伝達経路
に関わる。そのようなGPCRファミリーは、治療薬に対する薬物標的となることが
知られる多くの受容体を含んでなる。

【０００４】発明の概要 本発明は、新規GPCRをコードするヌクレオチド、および対応する新規GPCR（NG
PCR）アミノ酸配列の発見、同定、および特性決定に関する。本明細書に初めて
記載されたNGPCRは、細胞膜をまたがってリガンド結合後のシグナル伝達に関わ
る膜貫通タンパク質である。記載したNGPCRは、7TM受容体ファミリーに見られる
構造モチーフである。記載したNGPCRの発現は、ヒト胎児脳、脳、下垂体、小脳
、脊髄、胸腺、脾臓、リンパ節、骨髄、気管、肺、腎臓、胎児肝臓、肝臓、前立
腺、精巣、甲状腺、副腎、膵臓、唾液腺、胃、小腸、大腸、骨格筋、心臓、子宮
、胎盤、乳腺、脂肪、皮膚、食道、膀胱、頚部、直腸、心膜、卵巣、胎児腎臓、
および胎児肺細胞（配列番号1-5）、またはヒト心臓および精巣（配列番号6およ
び7）に検出される。本明細書に記載した新規ヒトGPCR配列は、長さで994、826
、および335個のアミノ酸のタンパク質（それぞれ配列番号2、4、および7を参照
）をコードする。記載したNGPCRは、7TMタンパク質の特徴である多重膜通過領域
（ほぼ20-30個のアミノ酸の）ならびに複数の予測される細胞質領域を有する。

【０００５】 さらに意図するのは、通常の方法を用いて遺伝子操作した「ノックアウト」ES
細胞である（例えば、本明細書に参照により組み入れられる1998年2月20日に出
願したPCT出願PCT/US98/03243を参照）。遺伝子トラップしたノックアウトES細
胞系が記載のヒト配列のマウス相同体で生産されている。従って、本発明のさら
なる態様として、遺伝子操作による突然変異を本明細書に記載のNGPCRをコード
する遺伝子に有するノックアウト細胞および動物が挙げられる。

【０００６】 本発明は、配列表に提示したヌクレオチド配列、そのようなヌクレオチド配列
を発現する宿主細胞、およびそのようなヌクレオチド配列の発現産物、ならびに
：（a）特に記載したヒトNGPCRを含む、記載したNGPCRの哺乳類相同体をコード
するヌクレオチド配列、およびヒトNGPCR遺伝子産物；（b）機能性ドメインに対
応するNGPCRの1以上の部分をコードするヌクレオチド配列、およびそのようなヌ
クレオチド配列によって規定される、限定されるものでないが、記載した細胞外
ドメインECD、本明細書で初めて開示された1以上の膜貫通ドメイン（TM）、およ
び細胞質ドメイン（CD）の新規領域を含むポリペプチド産物；（c）記載したNGP
CRの全てもしくは少なくともドメインの1つが欠失もしくは改変された、遺伝子
操作されたもしくは天然の、突然変異体をコードする単離ヌクレオチド配列、な
らびに、そのようなヌクレオチドにより規定される、限定されるものでないが、
TMの全てもしくは部分が欠失された可溶性受容体、およびCDの全てもしくは部分
が欠失された非機能性受容体を含むポリペプチド産物；ならびに（d）NGPCRから
のコード領域を含有する融合タンパク質、または他のペプチドもしくはポリペプ
チドと融合したそのドメインの1つ（例えば、ECD）をコードする、ヌクレオチド
を包含する。

【０００７】 本発明はまた、天然NGPCRと競合する小分子、大分子、突然変異NGPCRタンパク
質、またはそれらの部分、および抗体を含む、NGPCRのアゴニストとアンタゴニ
ストの他に、記載されているNGPCRの発現を阻害する（例えば、アンチセンスお
よびリボザイム分子、ならびに遺伝子または調節配列置換構築物）ためかまたは
記載されているNGPCRの発現を増強する（例えば、記載されている遺伝子を強い
プロモーター系の制御下に置く発現構築物）ために利用し得るヌクレオチド配列
、ならびにNGPCRトランスジーンを発現するトランスジェニック動物かまたは機
能性NGPCRを発現しない「ノックアウト」も包含する。

【０００８】 さらに、本発明はまた、NGPCR遺伝子発現および／またはNGPCR遺伝子産物活性
をモジュレートする、すなわちアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する
化合物を同定するために、記載されているNGPCR遺伝子および／またはNGPCR遺伝
子産物を利用する方法にも関する。そのような化合物は、生物学的障害または失
調症（imbalance）の様々な症状を治療する治療薬として利用できる。

【０００９】配列表の簡単な説明 配列表は、ある特定の記載されているNGPCR ORFの配列、それによってコード
されたアミノ酸配列、ならびに周囲の5'および3'領域を伴うORF（配列番号5）を
提供する。

【００１０】特定の実施形態の説明 初めて本明細書に記載したヒトNGPCRは、ヒト細胞に発現される新規の受容体
タンパク質である。ヒトNGPCR配列は、ヒト腎臓およびリンパ節cDNAライブラリ
ーから単離した遺伝子トラップしたヒト細胞、ゲノムDNA、およびcDNAクローン
からの配列を用いて得た（配列番号1-5）か、または骨格筋cDNAライブラリーを
用いて配列番号6-7を作製した（Edge Biosystems, Gaithersburg, MD、およびCl
ontech, Palo Alto, CA）。記載されているNGPCRは、受容体の7TMタンパク質フ
ァミリーに分類される膜貫通タンパク質である。他のGPCRのように、リガンドが
受容体に結合すると、シグナル伝達がトリガーされる。自然リガンドの結合を妨
害するか、またはリガンドを中和するかもしくは除去するか、またはそのNGPCR
との結合を妨害すると、NGPCRが介在するシグナル伝達に影響を与えうる。7TM、
特にGPCRタンパク質は生物学的に重要であるので、科学的／商業的に深く精査さ
れている（例えば、両方とも本明細書に参照により記載したNGPCRに関わる応用
、利用およびアッセイについての全文が組み入れられる1997年3月19日出願の米
国特許出願第08/820,521号、および1997年4月17日出願の第08/833,226号を参照
すること）。

【００１１】 本発明は、記載されているNGPCRヌクレオチド、NGPCRタンパク質およびペプチ
ド、ならびにNGPCRに対する（例えば、NGPCRアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用し得る）抗体、好ましくは、ヒト化モノクローナル抗体、または結合断
片、ドメイン、またはそれらの融合タンパク質、受容体活性または発現を阻害す
るアンタゴニスト、または受容体活性を活性化またはその発現を増加するアゴニ
ストの、疾患の診断および治療における利用を包含する。

【００１２】 ある特定の実施形態によれば、本発明に包含されるヌクレオチド配列は、染色
体マッピングに有用である。例えば、配列番号1、3、5および6に記したヌクレオ
チド配列は、ヒトゲノムの2p24.1の染色体2に見出される。ある特定の実施形態
においては、これらの配列は、染色体のどの領域が実際にタンパク質をコードす
るかを示す高度に特異的なプローブとして作用し得る。従って、ある特定の実施
形態においては、これらの配列は、染色体2の2p24.1位置内のタンパク質コード
領域のマッピング情報を提供し得る。ある特定の実施形態においては、これらの
配列はエキソンの同定およびスプライス接続部位の立証を可能にする。ある特定
の実施形態においては、これらの配列はまた、マウスのNGPCRのゲノム位置の同
定を可能にする。この情報は、このタンパク質の発現が廃止される「ノックアウ
ト」マウスを作製するために有用である。

【００１３】 特に、本発明は、NGPCRの機能性ドメインに対応するNGPCRポリペプチドもしく
はペプチド（例えば、ECD、TMまたはCD）、突然変異、末端切断または欠失NGPCR
（例えば、ΔECD、ΔTMおよび／もしくはΔCDなどの1以上の機能性ドメインまた
はその部分を喪失したNGPCR）、NGPCR融合タンパク質（例えば、免疫グロブリン
定常部、すなわちIgFcなどの無関係のタンパク質もしくはペプチドと融合したNG
PCRまたはECDなどのNGPCRの機能性ドメイン）、そのような産物をコードするヌ
クレオチド配列、ならびにそのようなNGPCR産物を産生することができる宿主細
胞発現系を包含する。

【００１４】 本発明はまた、NGPCRの抗体および抗イディオタイプ抗体（Fabフラグメントを
含む）、アンタゴニストおよびアゴニスト、ならびにNGPCR遺伝子の発現を阻害
する（転写因子インヒビター、アンチセンスおよびリボザイム分子、または遺伝
子または調節配列置換構築物）、またはNGPCRの発現を促進する（例えば、NGPCR
コード配列がプロモーター、プロモーター／エンハンサーなどの発現制御エレメ
ントと機能しうる形で結合した）化合物またはヌクレオチド構築物を包含する。
本発明はまた、遺伝子操作されてヒトNGPCR（またはその突然変異体）を発現す
るまたは動物の内因性NGPCR遺伝子の発現を阻害するかもしくは「ノックアウト
」する宿主細胞および動物に関する。

【００１５】 ある特定の実施形態においては、NGPCRタンパク質またはペプチド、NGPCR融合
タンパク質、NGPCRヌクレオチド配列、抗体、アンタゴニストおよびアゴニスト
は、疾患の診断のために突然変異NGPCRまたは不適当に発現されたNGPCRの検出に
有用であり得る。ある特定の実施形態においては、NGPCRタンパク質またはペプ
チド、NGPCR融合タンパク質、NGPCRヌクレオチド配列、宿主細胞発現系、抗体、
アンタゴニスト、アゴニストおよび遺伝子操作した細胞および動物を利用して、
身体のNGPCRの正常な機能を乱す症候または表現型の発現を治療するのに有効な
薬物をスクリーニング（またはコンビナトリアルライブラリーの高処理スクリー
ニング）できる。ある特定の実施形態においては、遺伝子操作した宿主細胞およ
び／または動物の利用は、そのような系がNGPCRのECDと結合する化合物の同定を
可能にするだけでなく、活性化NGPCRによって伝達されるシグナルに影響を与え
る化合物を同定できる利点を提供する。

【００１６】 最後に、ある特定の実施形態においては、NGPCRタンパク質産物（特に、NGPCR
ECDに対応するペプチドなどの可溶性誘導体、または1以上のTMドメインを欠く
末端切断ポリペプチド）および融合タンパク質産物（特に、NGPCR-Ig融合タンパ
ク質、すなわち、NGPCR、またはNGPCRのドメイン、例えばECD、ΔTMとIgFcとの
融合体）、抗体および抗イディオタイプ抗体（Fabフラグメントを含む）、アン
タゴニストまたはアゴニスト（NGPCR介在シグナル伝達経路の下流標的に作用し
うるシグナル伝達をモジュレートする化合物を含む）をそのような疾患を治療す
るために利用することができる。例えば、ある特定の実施形態においては、可溶
性NGPCR ECD、ΔTM、またはECD-IgFc融合タンパク質またはNGPCR ECDを模倣する
抗イディオタイプ抗体（またはそのFab）の有効量を投与することによって、内
因性NGPCRリガンドを「掃除（mop up）」または「中和」して、結合および受容
体活性化を防止または低下することができる。ある特定の実施形態においては、
そのようなNGPCR産物をコードするヌクレオチド構築物を利用して宿主細胞を遺
伝子操作し、そのような産物をin vivoで発現させることが可能であって；これ
らの遺伝子操作した細胞は、NGPCRリガンドを「掃除」または中和するNGPCR、NG
PCRペプチド、可溶性ECDまたはΔTMまたはNGPCR融合タンパク質の連続的供給を
送達する体内の「バイオリアクター」として機能する。ある特定の実施形態にお
いては、機能性NGPCR、突然変異NGPCR、ならびにアンチセンスおよびリボザイム
分子をコードするヌクレオチド構築物は、NGPCR発現をモジュレートするための
「遺伝子治療」手法に利用することができる。従って、本発明はまた、生物学的
障害を治療するための製薬製剤および方法を包含する。

【００１７】 本発明の様々な態様を、以下の小節においてさらに詳細に説明する。

【００１８】NGPCRポリヌクレオチド 記載されているヒトNGPCRのcDNA配列および推定アミノ酸配列を、配列表に提
示した。次の2つの多形を同定した：例えば、配列番号1のヌクレオチド2091で表
される位置における翻訳上サイレントな、または、例えば、配列番号2の対応す
るアミノ酸位置529にserまたはglyの存在をもたらす配列番号1のヌクレオチド位
置1,587におけるAまたはG転位である。

【００１９】 本発明のNGPCRは：（a）配列表に提示されたヒトDNA配列、ならびに、連続し
たおよび機能性NGPCRオープンリーディングフレーム（ORF）をコードする任意の
さらに意図するヌクレオチド配列であって、配列表に提示されたDNA配列の相補
体と高度にストリンジェントな条件、例えば、フィルターに結合したDNAと0.5M
NaHP0₄、7%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、1mM EDTA中で65℃にてのハイブリ
ダイゼーションおよび0.1xSSC/0.1% SDSで68℃にての洗浄（Ausubel F. M.ら編,
1989, 「分子生物学の現行プロトコル（Current Protocols in Molecular Biol
ogy）」, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc.およびJohn Wiley & son
s, Inc., New York, p.2.10.3）のもとでハイブリダイズし、そして機能的に同
等の遺伝子産物をコードする前記ヌクレオチド配列を含む。さらに意図するのは
、配列表に提示されたアミノ酸配列をコードして、発現するDNA配列の相補体と
中度のストリンジェントな条件、例えば、0.2xSSC/0.1% SDSで42℃にての洗浄（
Ausubelら, 1989, 前掲）のもとでハイブリダイズし、そしてなお機能的に同等
のNGPCR遺伝子産物をコードする任意のヌクレオチド配列である。NGPCRの機能的
同等物は、他の種に存在する天然のNGPCR、および天然のまたは遺伝子操作した
突然変異NGPCRを含む。本発明はまた、開示した配列の縮重変異体も含む。

【００２０】 さらに意図するのは、NGPCR ORFをコードするポリヌクレオチド、または、そ
れらの機能的同等物であって配列表に記載のポリヌクレオチドの対応領域とほぼ
99、95、90、またはほぼ85%類似したまたは同一である（BLAST配列比較分析によ
り、例えば、デフォールトパラメーターを使いGCG配列分析パッケージを用いて
測定して）ポリヌクレオチド配列によってコードされた前記機能的同等物である
。

【００２１】 ある特定の実施形態においては、本発明はまた、記載したNGPCRヌクレオチド
配列とハイブリダイズする、従ってその相補体である核酸分子、好ましくはDNA
分子を含む。そのようなハイブリダイゼーション条件は、前記のように、高度に
ストリンジェンなまたは中度にストリンジェント（より高度ではないストリンジ
ェント）であってもよい。ある特定の実施形態においては、核酸分子がデオキシ
オリゴヌクレオチド（「DNAオリゴ」）である場合、そのような分子（ある特定
の実施形態においては、本発明の配列表に初めて開示された配列の連続領域に結
合する、ほぼ16〜ほぼ100塩基長、ほぼ20〜ほぼ80塩基長、もしくはほぼ34〜ほ
ぼ45塩基長の分子、または長さが少なくとも300塩基の分子、または前記サイズ
の任意の変化または組合せ）をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）と共に、ライブラ
リーをスクリーニングし、クローンを単離し、ならびにクローニングおよび配列
決定テンプレートなどを調製するために利用することができる。ある特定の実施
形態においては、これらのDNAオリゴは、少なくとも22ヌクレオチドを含んでな
る。ある特定の実施形態においては、これらのDNAオリゴは少なくとも30ヌクレ
オチドを含んでなる。

【００２２】 ある特定の実施形態においては、オリゴヌクレオチドは単一でまたはチップフ
ォーマットでハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。例
えば、ある特定の実施形態においては、1系列の記載したNGPCRオリゴヌクレオチ
ド配列、またはその相補体を利用して、記載されているNGPCRの全てまたは部分
を示してもよい。ある特定の実施形態においては、長さでほぼ16〜ほぼ40ヌクレ
オチド（または述べた範囲内の任意の数全て）のオリゴヌクレオチドが部分的に
お互いにオーバーラップしてもよく／またはNGPCR配列を、オーバーラップしな
いオリゴヌクレオチドを用いて示してもよい。従って、ある特定の実施形態にお
いては、NGPCRポリヌクレオチド配列は、典型的には、記載した配列表にそれぞ
れ初めて開示された、長さで少なくとも18ヌクレオチドの少なくとも2つまたは3
つの別のオリゴヌクレオチド配列を含んでなる。そのようなオリゴヌクレオチド
配列は、配列表の配列内に存在するいずれのヌクレオチドで始まり、記載の配列
に対してセンス（5'から3'）方向またはアンチセンス方向に進行してもよい。オ
リゴヌクレオチドプローブに対して、高度にストリンジェントな条件は、例えば
、6xSSC/0.05%ピロリン酸ナトリウム中で、温度37℃（14塩基オリゴに対して）
、48℃（17塩基オリゴについて）、55℃（20塩基オリゴについて）、および60℃
（23塩基オリゴについて）にての洗浄を意味する。

【００２３】 ある特定の実施形態においては、記載したオリゴヌクレオチドはNGPCRアンチ
センス分子をコードするか、または、NGPCRアンチセンス分子をコードとして作
用し得、例えば、NGPCR遺伝子調節に（NGPCR遺伝子核酸配列の増幅反応において
アンチセンスプライマー用に、および／または、として）有用である。NGPCR遺
伝子調節について、ある特定の実施形態においては、そのような技術を、生物学
的機能を調節するために利用できる。さらに、ある特定の実施形態においては、
そのような配列を、NGPCR遺伝子調節にも有用であるリボザイムおよび／または
三重らせん体配列の部分として利用してもよい。

【００２４】 さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの改変された塩
基部分を含んでなってもよく、限定されるものでないが、前記塩基部分は、5-フ
ルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒ
ポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-（カルボキシヒドロキシル
メチル）ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カル
ボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルキ
ューオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メ
チルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、
3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メ
チルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マ
ンノシルキューオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウ
ラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸（v
）、ワイブトキソシン（wybutoxosine）、シュードウラシル、キューオシン、2-
チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5
-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ
酢酸（v）、5-メチル-2-チオウラシル、3-（3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピ
ル）ウラシル、（acp3）w、および2,6-ジアミノプリンを含む群から選択される
。

【００２５】 アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、少なくとも1つの改変された糖部分
を含んでなってもよく、前記糖部分は、限定されるものでないが、アラビノース
、2-フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースを含む群から選択
される。

【００２６】 さらに他の実施形態においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくと
も1つの改変されたリン酸主鎖を含んでなってもよく、前記リン酸主鎖は、ホス
ホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホラミドチオアート、ホスホラミ
ダート、ホスホルジアミダート、メチルホスホナート、アルキルホスホトリエス
テル、およびホルムアセタールまたはそれらの類似体からなる群から選択される
。

【００２７】 さらに他の実施形態においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドはα-アノ
マーオリゴヌクレオチドである。α-アノマーオリゴヌクレオチドは、通常のβ
ユニットとは逆に、相補的RNAと鎖がお互いに平行に走る特異的な二本鎖ハイブ
リッドを形成する（Gautierら., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641）。そ
のオリゴヌクレオチドは2'-O-メチルリボヌクレオチド（Inoueら, 1987, Nucl.
Acids Res. 15:6131-6148）、またはキメラRNA-DNA類似体（Inoue ら, 1987, FE
BS Lett. 215:327-330）である。

【００２８】 本発明のある特定の実施形態のオリゴヌクレオチドは、当業界で周知の標準的
方法、例えば自動DNA合成器（Biosearch, Applied Biosystemsなどから市販され
ている）を使用して合成することができる。ある特定の実施形態の例として、ホ
スホロチオアートオリゴヌクレオチドはSteinら（1988, Nucl. Acids Res. 16:3
209）の方法によって合成することができるし、メチルホスホナートオリゴヌク
レオチドは制御した多孔質ガラスポリマー支持体（Sarinら, 1988, Proc. Natl.
Acad. Sci. U. S. A. 85: 7448-7451）を利用して調製することができる、など
が挙げられる。

【００２９】 低ストリンジェンシー条件は、当業者によく知られており、ライブラリーおよ
び標識した配列が誘導された特定の生物に依存して予測できるように変化しうる
。そのような条件のガイダンスは、例えば、Sambrookら, 1989, 「分子クローニ
ング、研究室マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」（およ
びその定期改定版）, Cold Springs Harbor Press, N. Y.；およびAusubelら, 1
989, 「分子生物学の現行プロトコル（Current Protocols in Molecular Biolog
y）」, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.を参照す
ること。

【００３０】 あるいは、ある特定の実施形態においては、適当に標識したNGPCRヌクレオチ
ドプローブを利用し、適当にストリンジェントな条件を用いてまたはPCRによっ
て、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。ある特定の実
施形態においては、ヒトゲノムクローンの同定と特性決定は、多形を同定し、所
与の遺伝子座／対立遺伝子のゲノム構造を決定し、および／または診断試験を設
計するために役立つ。ある特定の実施形態においては、例えば、ヒト遺伝子のイ
ントロン／エキソン境界に隣接した領域から誘導された配列を利用して、エキソ
ン、イントロン、スプライス部位（例えば、スプライスアクセプターおよび／ま
たはドナー部位）などの突然変異を検出する増幅アッセイに使用するプライマー
を設計することができ、これらは診断および薬理ゲノム研究に利用することがで
きる。

【００３１】 さらに、ある特定の実施形態においては、本明細書に開示したNGPCR遺伝子産
物内のアミノ酸配列に基づいて設計した2つの縮重オリゴヌクレオチドプライマ
ープールを使用してPCRを実施することによって、NGPCR遺伝子同族体を目的の生
物の核酸から単離することができる。反応用のテンプレートは、例えば、NGPCR
遺伝子対立遺伝子を発現することが既知のまたは疑われるヒトまたは非ヒト細胞
系または組織から調製した全RNA、mRNA、および／またはmRNAの逆転写によって
得たcDNAであってもよい。

【００３２】 ある特定の実施形態においては、PCR産物をサブクローニングして配列決定し
、増幅配列が所望のNGPCR遺伝子の配列を表すことを確認することができる。あ
る特定の実施形態においては、次いでPCR断片を利用して、様々な方法によって
全長cDNAを単離することができる。例えば、増幅断片を標識して利用し、バクテ
リオファージcDNAライブラリーなどのcDNAライブラリーをスクリーニングしても
よい。ある特定の実施形態においては、標識した断片を利用して、ゲノムライブ
ラリーのスクリーニングを経由してゲノムクローンを単離することができる。

【００３３】 ある特定の実施形態においては、PCR技術を利用して全長cDNA配列を単離する
こともできる。例えば、ある特定の実施形態においては、標準方法に従って、適
当な細胞または組織源（すなわち、NGPCR遺伝子を発現することが既知のまたは
疑われる）からRNAを単離することができる。ある特定の実施形態においては、
第一鎖合成のプライミングに増幅断片の最5'末端に特異的なオリゴヌクレオチド
プライマーを使用し、RNAの逆転写（RT）反応を実施することができる。ある特
定の実施形態においては、得られるRNA／DNAハイブリッドを次いで標準の末端ト
ランスフェラーゼ反応を利用して「末端を切断し（tailed）」、そのハイブリッ
ドをRNアーゼHによって消化し、そして次いで第2鎖合成を相補的プライマーによ
ってプライミングすることができる。従って、ある特定の実施形態においては、
増幅断片上流のcDNA配列を容易に単離することができる。利用しうるクローニン
グ方法のレビューについては、例えば、Sambrookら,1989,前掲を参照すること。

【００３４】 ある特定の実施形態においては、突然変異NGPCR遺伝子のcDNAを、例えばPCRを
利用して単離することができる。ある特定の実施形態においては、第1のcDNA鎖
は、オリゴ-dTオリゴヌクレオチドを突然変異NGPCR対立遺伝子を担持すると推定
される個体において発現されることが既知のまたは疑われる組織から単離したmR
NAにハイブリダイズし、その新しい鎖を逆転写酵素を用いて伸長することによっ
て、合成してもよい。ある特定の実施形態においては、次に、第2のcDNA鎖は、
正常な遺伝子の5'末端と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを利用
して合成する。これらの2つのプライマーを用いて、次いで産物をPCRを経由して
増幅し、場合によっては適当なベクター中にクローニングして、当業者に周知の
方法を通して、DNA配列分析にかける。ある特定の実施形態においては、突然変
異NGPCR対立遺伝子のDNA配列を正常なNGPCR対立遺伝子のそれと比較することに
よって、突然変異NGPCR遺伝子産物の機能の消失もしくは改変の原因である突然
変異を確認することができる。

【００３５】 あるいは、ある特定の実施形態においては、突然変異NGPCR対立遺伝子を担持
すると疑われるかまたは既知である個体から得たDNAを用いてゲノムライブラリ
ーを構築するか、または突然変異NGPCR対立遺伝子を発現すると疑われるまたは
既知である組織から得たRNAを用いてcDNAライブラリーを構築することができる
。正常なNGPCR遺伝子、または任意のその適当な断片を次いで標識して、そのよ
うなライブラリー中の対応する突然変異NGPCR対立遺伝子を同定するプローブと
して利用することができる。突然変異NGPCR遺伝子を含有するクローンを次いで
精製して、当業者に周知の方法によって配列分析にかけることができる。

【００３６】 さらに、ある特定の実施形態においては、発現ライブラリーを、例えば、突然
変異NGPCR対立遺伝子を担持すると疑われるまたは既知である個体の突然変異NGP
CR対立遺伝子を発現すると疑われるまたは既知である組織から単離したRNAから
合成したcDNAを用いて構築することができる。この方法で、突然変異したと推定
される組織によって作られた遺伝子産物を発現して、標準の抗体スクリーニング
技術を正常NGPCR遺伝子産物に対して産生される抗体と一緒に用いて、以下の5.3
節に記載のようにスクリーニングすることができる（スクリーニング技術につい
ては、例えば、Harlow, E.およびLane編, 1988,「抗体：研究室マニュアル（Ant
ibodies: A Laboratory Manual）」, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring
Harborを参照）。

【００３７】 さらに、ある特定の実施形態においては、スクリーニングは、例えば、AP-NGP
CRまたはNGPCR-AP融合タンパク質などの標識したNGPCR融合タンパク質を用いる
スクリーニングによって実施することができる。NGPCR突然変異が改変した機能
（例えば、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異の結果として）をもつ遺伝
子産物の発現をもたらす場合には、多分NGPCRに対するポリクローナル抗体セッ
トが突然変異NGPCR遺伝子産物と交差反応しうる。これらとそのような標識した
抗体との反応を介して検出されるライブラリークローンを精製して、当業者に周
知の方法によって配列分析にかけることができる。

【００３８】 本発明はまた、突然変異NGPCR、NGPCRのペプチド断片、末端切断NGPCR、およ
びNGPCR融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列も包含する。これらは、
限定されるものでないが、以下に記載した突然変異NGPCRをコードするヌクレオ
チドを含む；NGPCRの1以上のECD、TMおよび／またはCDドメインまたはこれらの
ドメインの部分に対応するポリペプチドまたはペプチド；ドメインの1つもしく
は2つが欠失した末端切断NGPCR、例えば、TMもしくはTMとCD領域の両方を欠く可
溶性NGPCR、またはCD領域の全てもしくは一部分を欠く末端切断、非機能性NGPCR
。融合タンパク質をコードするヌクレオチドは、限定されるものでないが、例え
ばNGPCR ECDを細胞膜に固定する膜貫通配列；生じる融合タンパク質の血流中の
安定性および半減期を増加するIgFcドメイン（例えば、NGPCR-Ig）；またはマー
カーとして利用できる酵素、蛍光タンパク質、発光タンパク質などの、無関係な
タンパク質もしくはペプチドと融合した全長NGPCR配列、末端切断NGPCR、または
NGPCRのペプチド断片をコードするヌクレオチドを含む。

【００３９】 本発明はまた、（a）以上のNGPCRをコードする配列および／またはそれらの相
補体（すなわち、アンチセンス）のいずれかを含有するDNAベクター；（b）コー
ド配列の発現を指令する調節エレメントと機能しうる形で結合した前記のNGPCR
コード配列のいずれかを含有するDNA発現ベクター；および（c）宿主細胞におけ
るコード領域の発現を指令する調節エレメントと機能しうる形で結合した前記の
NGPCRコード配列のいずれかを含有する遺伝子操作した宿主細胞を包含する。本
明細書に記載の調節配列は、限定されるものでないが、誘導および非誘導プロモ
ーター、エンハンサー、オペレーターおよび当業者にとって周知の発現を調節す
る他のエレメントが挙げられる。そのような調節エレメントは、限定されるもの
でないが、サイトメガロウイルスhCMV最初期遺伝子、SV40アデノウイルスの調節
可能なウイルス（特にレトロウイルスLTRプロモーター）初期もしくは後期プロ
モーター、lac系、trp系、tet系、TAC系、TRC系、ファージAの主要オペレーター
およびプロモーター領域、fdコートタンパク質の制御領域、3-ホスホグリセリン
酸キナーゼ（PGK）用プロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター、および
酵母α接合因子のプロモーターが挙げられる。

【００４０】NGPCRタンパク質およびポリペプチド NGPCRタンパク質、ポリペプチドおよびペプチド断片、NGPCRの突然変異型、末
端切断型もしくは欠失型および／またはNGPCR融合タンパク質は、様々な使用の
ために調製することができ、それらの使用としては、限定されるものでないが、
抗体の作製、診断アッセイにおける試薬としての使用、NGPCRに関係する他の細
胞遺伝子産物の同定、精神的、生物学的もしくは医学的障害（すなわち、心拍速
度、不適当な血圧など）および疾患の治療的処置に有用な医療用試薬として使用
しうる化合物のスクリーニングアッセイにおける試薬としての使用が挙げられる
。

【００４１】 配列表は、ある特定のNGPCR遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を開示
する。NGPCRは、DNA配列文脈中に翻訳開始部位と一致するイニシエーターメチオ
ニンを有し、その後に、膜関連タンパク質に典型的な疎水性シグナル配列を有す
る。本明細書に提示した配列データは、NGPCRの選択的スプライス型が存在する
（組織特異的であるかまたはないかもしれない）ことを示す。

【００４２】 本発明のNGPCR配列は、配列表に提示したヌクレオチドおよびアミノ酸配列な
らびにそれらの類似体および誘導体を含む。さらに、他の種由来の対応するNGPC
R相同体が本発明に包含される。実際、上記に記載のNGPCRヌクレオチド配列によ
ってコードされたいずれのNGPCRタンパク質も、配列表に提示したアミノ酸配列
の全てまたはいずれかの新規部分をコードするいずれの新規ポリヌクレオチド配
列とも同様に、本発明の範囲内にある。遺伝子コードの縮重性は周知であり、従
って、配列表に提示されたそれぞれのアミノ酸は、そのアミノ酸をコードし得る
周知の核酸「トリプレット」コドン、または多くの事例では複数コドン、を包括
して表す。そのように、本明細書で意図するように、配列表に提示したアミノ酸
配列は、遺伝子コード（例えば、本明細書に参照により組み入れられる「分子細
胞生物学（Molecular Cell Biology）」, 1986, J. Darnellら編, Scientific A
merican Books, New York, NYの109頁の表4-1を参照）を一緒に参照して、その
ようなアミノ酸配列をコードし得る核酸配列の様々な順列と組合せの全てを包括
して表す。

【００４３】 本発明はまた、多数の判定基準のいずれかにより判定して記載したヌクレオチ
ド配列によってコードされたNGPCRと機能的に同等であるタンパク質を包含する
のであって、前記判定基準としては、限定されるものでないが、NGPCRに対する
リガンドと結合する能力、同一もしくは相補的なシグナル伝達経路に影響を与え
る能力、細胞代謝の変化（例えば、イオン流出、チロシンリン酸化など）、また
はNGPCR同等物が適当な細胞型に存在するときの表現型の変化（例えば、生化学
的、生物物理学的または顕性表現型の改善、阻止または遅延）が挙げられる。そ
のような機能的に同等なNGPCRタンパク質としては、限定されるものでないが、
上記に記載したNGPCRヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列内の
アミノ酸残基の付加または置換であって、しかしサイレント変化をもたらすこと
によって機能的に同等な遺伝子産物を産生するものが挙げられる。例えば、ある
特定の実施形態においては、含まれる残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水
性および／または両親媒性の性質における類似性に基づいて行われうる1以上の
保存的アミノ酸置換を使用することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ
酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニル
アラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられ；極性中性アミノ酸と
しては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン
、およびグルタミンが挙げられ；正荷電（塩基性）アミノ酸としてはアルギニン
、リシンおよびヒスチジンが挙げられ;ならびに負荷電（酸性）アミノ酸として
はアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。

【００４４】 NGPCR DNAにランダム突然変異を行うことができ（当業者に周知のランダム突
然変異誘発技術を用いて）、得られる突然変異体NGPCRを活性について試験する
が、ある特定の実施形態においては、NGPCRコード配列の部位特異的突然変異を
遺伝子操作して（当業者に周知の部位特異的突然変異誘発技術を用いて）、増加
した機能、例えば標的リガンドに対するより高い結合親和性、および／またはよ
り大きいシグナリング能力；または減少した機能、および／または減少したシグ
ナル伝達能力をもつ突然変異体NGPCRを作製することができる。ある特定の実施
形態においては、そのような分析の1つの出発点は、異なる種間で保存されるア
ミノ酸モチーフを同定する目的で、開示したヒト配列を、例えば他の哺乳類由来
の対応する遺伝子／タンパク質配列とアラインメントすることによる。ある特定
の実施形態においては、可変な位置で非保存的変化を遺伝子操作し、機能、シグ
ナル伝達能力、またはそれらの両方を改変してもよい。さらに、機能の改変が所
望である場合、ある特定の実施形態においては、保存領域（すなわち、同一のア
ミノ酸）の欠失または非保存的改変を遺伝子操作してもよい。

【００４５】 ある特定の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、配列番号2、4、お
よび7に記載のポリペプチドと少なくとも85%同一、または少なくとも95%同一で
ありうる。配列同一性パーセントは、それぞれ2配列の最適アラインメントを生
じる2つのポリペプチドのアミノ酸位置の類似性を比較するために通常使われる
標準的方法によって決定することができる。説明すると、BLASTまたはFASTAなど
のコンピュータープログラムを用いて、2つのポリペプチドを、それらのそれぞ
れのアミノ酸が（1つもしくは両方の配列の全長に沿って、または1つもしくは両
方の配列の予め規定した部分に沿って）最適対合するようにアラインメントする
。プログラムは「デフォルト」オープニング・ペナルティおよび「デフォルト」
ギャップ・ペナルティ、ならびにPAM250などのスコアリング・マトリックスを提
供する。標準のスコアリング・マトリックスはコンピュータープログラムと一緒
に使用できる；任意の目的で参照により本明細書に組み入れられる、Dayhoffら,
「タンパク質配列と構造の地図（Atlas of Protein Sequence and Structure）
」, 第5巻,補遺3 （1978）を参照。ある特定の実施形態においては、置換は保存
的であって、タンパク質の全実効電荷、極性、または疎水性に少ししかまたは全
く影響を与えないであろう。

【００４６】 ある特定の実施形態においては、記載のNGPCRポリヌクレオチド配列は、例え
ばポリヌクレオチド・シャッフリングまたは関連する方法論を用いて、記載した
新規配列によって少なくとも部分的にコードされたタンパク質の分子突然変異誘
発／進化に使用することができる。そのような手法は、任意の目的でその全体が
参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,830,721号および第5,837,458
号に記載されている。

【００４７】 ある特定の実施形態においては、記載の配列は、全てが任意の目的でその全体
が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第60/110,906号、第60/106
,300号、第60/094,879号、および第60/121,851号に記載の方法および適用を使用
して、細胞アッセイおよび遺伝子操作した動物に使用する構成的「オン（on）」
変異体の遺伝子操作に使用することができる。

【００４８】 ある特定の実施形態においては、NGPCRコード配列を突然変異させて、選択し
た宿主細胞における発現、スケールアップなどにより適したNGPCRを作製するこ
とができる。例えば、ある特定の実施形態においては、ジスルフィド架橋を排除
するためにシステイン残基を欠失させるかまたは別のアミノ酸に置換してもよい
し；ある特定の実施形態においては、例えばN結合型部位を過グリコシル化する(
hyperglycosylate)ことが知られている酵母宿主からより容易に回収しかつ精製
される均一な産物の発現を達成するために、N結合型グリコシル化部位を改変ま
たは排除してもよい。この目的では、ECDに存在する任意の1以上のグリコシル化
認識配列（N-X-SまたはN-X-T）の第1または第3アミノ酸位置の1つまたは両方に
おける様々なアミノ酸置換、および/またはECDの任意の1以上のそのような認識
配列の第2位置におけるアミノ酸欠失は、改変したトリペプチド配列におけるNGP
CRのグリコシル化を防止しうる（例えば、Miyajimaら, 1986, EMBO J. 5 （6）:
1193-1197を参照）。

【００４９】 NGPCRの1以上のドメインに対応するペプチド（例えば、ECD、TM、CD、など）
、末端切断または欠失したNGPCR（例えば、ECD、TMおよび/またはCDが欠失したN
GPCR）、ならびに全長NGPCR、NGPCRペプチド、または末端切断NGPCRが無関係な
タンパク質と融合したことを特徴とする融合タンパク質もまた本発明の範囲内に
あって、本明細書で開示したNGPCRヌクレオチドおよびNGPCRアミノ酸配列に基づ
いて設計することができる。そのような融合タンパク質としては、限定されるも
のでないが、NGPCRタンパク質またはペプチドを安定化してin vivoでの半減期を
延長するIgFc融合物；または融合タンパク質を細胞膜に固定してECDが細胞表面
に現われるようにすることを可能にする任意のアミノ酸配列との融合物；または
マーカー機能を与える酵素、蛍光タンパク質もしくは発光タンパク質との融合物
が挙げられる。

【００５０】 NGPCRポリペプチドおよびペプチドは化学的に合成できるが（例えば、Creight
on, 1983, 「タンパク質：構造と分子原理（Proteins: Structures and Molecul
ar Principles）」, W. H. Freeman & Co., N. Y.を参照）、ある特定の実施形
態においては、NGPCR遺伝子配列および/またはコード配列を含有する核酸配列を
発現するために、組換えDNA技術により、当業界で周知の技術を用いてNGPCRから
誘導される大きいポリペプチドおよび全長NGPCRを有利に産生することができる
。ある特定の実施形態においては、そのような方法を用いて、本明細書に記載し
たNGPCRヌクレオチド配列ならびに適当な転写および翻訳制御シグナルを含有す
る発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、in v
itro組換えDNA技術、合成技術およびin vivo遺伝子組換えが挙げられる。例えば
、Sambrookら, 1989,前掲およびAusubelら, 1989,前掲に記載された技術を参照
すること。ある特定の実施形態においては、NGPCRヌクレオチド配列によってコ
ードされた転写物の全てまたは部分に対応するRNAを、例えば、合成器を使用し
て化学的に合成することができる。例えば、参照により本明細書にその全体が組
み入れられる、「オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide Synthesis）」, 1
984, Gait, M.J.編, IRL Press, Oxfordに記載の技術を参照すること。

【００５１】 様々な実施形態に従えば、様々な宿主発現ベクター系を使用して本発明のNGPC
Rヌクレオチド配列を発現することができる。ある特定の実施形態においては、N
GPCRペプチドまたはポリペプチドが可溶性誘導体（例えば、ECDに対応するNGPCR
ペプチド；TMおよび/またはCDが欠失された末端切断または欠失NGPCR）である場
合、NGPCRペプチドまたはポリペプチドが分泌されない事例ではペプチドまたは
ポリペプチドは培養物から、すなわち宿主細胞から回収することができ、そして
NGPCRペプチドまたはポリペプチドが細胞によって分泌される事例では培地から
回収することができる。しかし、そのような発現系はまた、in situ、すなわち
細胞膜に固定されたNGPCRまたは機能的同等物を発現する遺伝子操作した細胞も
包含する。ある特定の実施形態においては、そのような発現系からのNGPCRの精
製または濃縮は、適当な界面活性剤および脂質ミセルならびに当業者に周知の方
法を用いて達成することができる。しかし、ある特定の実施形態においては、NG
PCRの構造的かつ機能的な特性を保持するだけでなく、例えば薬物スクリーニン
グアッセイにおける生物学的活性を評価することが重要である状況では、そのよ
うな遺伝子操作した宿主細胞自身を使用することができる。

【００５２】 ある特定の実施形態においては、本発明の目的に使用し得る発現系としては、
限定されるものでないが、NGPCRヌクレオチド配列を含有する組換えバクテリオ
ファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターを用いて形質転換
される細菌（例えば大腸菌（E.coli）、枯草菌（B. subtilis））などの微生物
；NGPCRヌクレオチド配列を含有する組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換
される酵母（例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）、ピキア（Pichia））
；NGPCR配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイル
ス）で感染される昆虫細胞系；NGPCRヌクレオチド配列を含有する組換えウイル
ス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイ
クウイルス、TMV）で感染されるかまたは組換えプラスミド発現ベクター（例え
ば、Tiプラスミド）を用いて形質転換される植物細胞系；または哺乳類細胞のゲ
ノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺
乳類ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；
ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を含有する組換え発現構築物を有する哺
乳類細胞系（例えば、COS、CHO、BHK、293、3T3）が挙げられる。

【００５３】 細菌系においては、NGPCR遺伝子産物が発現されることを意図する用途に応じ
て、多数の発現ベクターを有利に選択できる。例えば、NGPCRタンパク質の医薬
組成物を作製するためにまたはNGPCRタンパク質に対する抗体を産生するために
そのようなタンパク質を大量生産しようとするときは、例えば、容易に精製され
る融合タンパク質産物の高レベルの発現を指令するベクターが所望されうる。そ
のようなベクターとしては、限定されるものでないが、NGPCRコード配列がlacZ
コード領域と共にフレーム内にベクターと個々に連結され、融合タンパク質を産
生することができる大腸菌（E.coli）発現ベクターpUR278（Rutherら, 1983, EM
BO J. 2:1791）；pINベクター（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 1
3:3101-3109；Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509）
；などが挙げられる。またpGEXベクターを使用して、グルタチオンS-トランスフ
ェラーゼ（GST）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現することも
できる。典型的には、そのような融合タンパク質は可溶性であるので、溶解処理
した細胞からグルタチオン-アガロースビーズへの吸着と次いで遊離グルタチオ
ンの存在のもとでの溶出によって、容易に精製することができる。PGEXベクター
をトロンビンまたは第Xa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計して、クロ
ーニングした標的遺伝子産物をGST部分から遊離させることができる。

【００５４】 昆虫系においては、オートグラファ核多角体ウイルス（Autographa californi
ca nuclear polyhidrosis virus）（AcNPV）を外来遺伝子を発現するためのベク
ターとして使用することができる。このウイルスは、スポドプテラ・フルギペル
ダ（Spodoptera frugiperda）細胞内で増殖する。NGPCR遺伝子コード配列をウイ
ルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）中に個々にクローニングして、
AcNPVプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下におくことが
できる。NGPCR遺伝子コード配列の挿入に成功すると、ポリヘドリン遺伝子は不
活化されて、非閉塞組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子がコードす
るタンパク質コート(proteinaceous coat)を欠くウイルス）が産生されるだろう
。次に、これらの組換えウイルスを用いて、挿入した遺伝子を発現させるスポド
プテラ・フルギペルダ細胞に感染させる（例えば、Smithら, 1983, J. Virol. 4
6:584；Smith,米国特許第4,215,051号を参照）。

【００５５】 哺乳類宿主細胞においては、多数のウイルスに基づく発現系を使用することが
できる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、目的のNGPCRヌク
レオチド配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーター
およびトリパータイトリーダー配列（tripartite leader sequence）と連結する
ことができる。次いでこのキメラ遺伝子を、in vitroまたはin vivo組換えによ
って、アデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須
領域（例えば、領域E1またはE3）への挿入によって、感染宿主内で生存可能であ
りかつNGPCR遺伝子産物を発現できる組換えウイルスが得られるだろう（例えば
、Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659を参照）。
また挿入したNGPCRヌクレオチド配列の効率的な翻訳のために、特定の開始シグ
ナルを使用することもできる。これらのシグナルとしては、ATG開始コドンおよ
び隣接配列が挙げられる。それ自身の開始コドンと隣接配列を含めた全NGPCR遺
伝子またはcDNAを適当な発現ベクターに挿入する場合、追加の翻訳制御シグナル
を使用しなくてもよい。しかし、NGPCRコード配列の一部分だけを挿入する場合
、ある特定の実施形態においては、例えばATG開始コドンを含む外因性翻訳制御
シグナルを与えてもよい。さらに開始コドンは典型的には所望のコード配列のリ
ーディングフレームと一致することで、全インサートの翻訳を確実なものとする
。これらの外因性翻訳制御シグナルと開始コドンは天然および合成の両方の様々
な起源であってよい。発現の効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写
ターミネーターなどを包含することによって増強することができる（Bitterら,
1987, Methods in Enzymol. 153:516-544を参照）。

【００５６】 さらに、挿入配列の発現をモジュレートするか、または遺伝子産物を特定の所
望の様式で修飾しかつプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。タ
ンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（
例えば、切断）はタンパク質の機能にとって重要である。様々な宿主細胞は、タ
ンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に対して特徴があり
かつ特定の機構を有する。適当な細胞系または宿主系を選択することで、発現さ
れる外来タンパク質の正しい修飾とプロセシングを確実なものにすることができ
る。この目的には、一次転写物の適当なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル
化およびリン酸化のための細胞機構を持つ真核生物宿主細胞を使用することがで
きる。そのような哺乳類宿主細胞としては、限定されるものでないが、CHO、VER
O、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、およびWI38細胞系が挙げられる。

【００５７】 組換えタンパク質を長期間、高収率で産生するために、安定した発現を使用す
ることができる。例えば、安定して上記のNGPCR配列を発現する細胞系を遺伝子
操作することができる。ある特定の実施形態においては、ウイルスの複製起点を
含有する発現ベクターを使用するよりもむしろ適当な発現制御エレメント（例え
ば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部
位、など）によって制御されるDNAおよび選択マーカーを用いて宿主細胞を形質
転換してもよい。外来DNAの導入後、遺伝子操作した細胞を1〜2日間、富化した
培地で増殖させることができ、次いで選択培地に切り替える。組換えプラスミド
中の選択マーカーは選択に対する耐性を与えかつ細胞が安定してプラスミドをそ
の染色体中に組み込んで増殖して増殖巣（foci）を形成することを可能にするの
で、それらを順にクローニングして細胞系へと拡大することができる。この方法
を有利に使用して、NGPCR遺伝子産物を発現する細胞系を遺伝子操作することが
できる。そのような遺伝子操作した細胞系は、特に、NGPCR遺伝子産物の内因性
活性に影響を与える化合物のスクリーニングと評価に有用でありうる。

【００５８】 多数の選択系を使用することができ、限定されるものでないが、単純ヘルペス
ウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら, 1977, Cell 11:223）、ヒポキサンチン-
グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, 1962, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026）、およびアデニンホスホリボシルトラン
スフェラーゼ（Lowyら, 1980, Cell 22:817）遺伝子が挙げられ、これらはそれ
ぞれ、tk^-, hgprt^-またはaprt^-細胞において使用することができる。また、ある
特定の実施形態においては、抗代謝産物耐性を以下の遺伝子の選択の基準として
使用することができる：メトトレキセートに対する耐性を与えるdhfr（Wiglerら
, 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567；O'Hareら, 1981, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 78:1527）；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるgpt（Mulligan &
Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072）；アミノグリコシドG-418
に対する耐性を与えるneo（Colberre-Garapinら, 1981, J. Mol. Biol. 150:1）
；およびハイグロマイシンに対する耐性を与えるhygro（Santerreら, 1984, Gen
e 30:147）。

【００５９】 ある特定の実施形態においては、融合タンパク質を発現される融合タンパク質
に特異的な抗体を用いて容易に精製することができる。例えば、Janknechtらが
記載した系は、ヒト細胞系に発現される非変性融合タンパク質の即時精製を可能
にする（Janknechtら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-8976）。こ
の系においては、遺伝子のオープンリーディングフレームが6つのヒスチジン残
基を有するアミノ末端タグと翻訳によって融合されるように、目的の遺伝子をワ
クシニア組換えプラスミド中にサブクローニングする。組換えワクシニアウイル
スを用いて感染した細胞から得る抽出物をNi²⁺ニトリロ酢酸-アガロースカラム
にローディングし、ヒスチジンタグ付けタンパク質をイミダゾール含有バッファ
ーを用いて選択的に溶出する。

【００６０】 ある特定の実施形態においては、またNGPCR遺伝子産物をトランスジェニック
動物に発現させることもできる。限定されるものでないが、蠕虫（worms）、マ
ウス、ラット、ウサギ、モルモット、げっ歯類、ブタ、ミニブタ（micro-pig）
、鳥類、ヤギ、農場動物、および非ヒト霊長類、例えばヒヒ、サル、およびチン
パンジーを含む任意の種の動物を様々な実施形態において使用してNGPCRトラン
スジェニック動物を作製することができる。

【００６１】 トランスジェニック動物の創始者(founder)系統を産生するために、当業界で
知られるいずれの技術を使用してNGPCRトランスジーンを動物中に導入してもよ
い。そのような技術としては、限定されるものでないが、前核マイクロインジェ
クション（Hoppe, P. C.およびWagner, T.E., 1989, 米国特許第4,873,191号）
；レトロウイルスが介在する生殖細胞系への遺伝子導入（Van der Puttenら, 19
85, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152）；胚幹細胞の遺伝子ターゲッ
ティング（Thompsonら, 1989, Cell 56:313-321）；胚のエレクトロポレーショ
ン（Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3:1803-1814）；および精子が介在する遺伝子
導入（Lavitranoら, 1989, Cell 57:717-723）；などが挙げられる。そのような
技術の概説は、参照により本明細書にその全体が組み入れられるGordon, 1989,
Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115:171-229を参照すること。

【００６２】 本発明は、全細胞内にNGPCRトランスジーンを有するトランスジェニック動物
、ならびに全細胞ではないが若干数の細胞にトランスジーンを有する動物、すな
わちモザイク動物または体細胞トランスジェニック動物を提供する。トランスジ
ーンは、単一トランスジーンとしてまたはコンカテマー、例えば、ヘッド・ツー
・ヘッド（head-to-head）タンデムまたはヘッド・ツー・テール（head-to-tail
）タンデムで組み込んでもよい。トランスジーンをまた、例えば、Laskoら, 199
2, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236の教示に従って、特定の細胞型に
選択的に導入して活性化してもよい。そのような細胞型特異的活性化に必要な調
節配列は、目的の特定の細胞型に依存しうるのであって、当業者には明白であろ
う。

【００６３】 NGPCRトランスジーンを内因性NGPCR遺伝子の染色体部位に組み込むことが所望
されるときは、ある特定の実施形態においては、遺伝子ターゲッティングを使用
することができる。簡単に説明すると、そのような技術を使用するある特定の実
施形態においては、染色体配列との相同組換えを介して内因性NGPCR遺伝子のヌ
クレオチド配列中に組み込み、そしてその機能を破壊する（すなわち、「ノック
アウト」動物）目的で、内因性NGPCR遺伝子と相同的な複数のヌクレオチド配列
を含有するベクターを設計する。

【００６４】 ある特定の実施形態においては、また例えば、Guら, 1994, Science, 265:103
-106の教示に従って、トランスジーンを選択的に特定の細胞型に導入して、その
細胞型だけで内因性NGPCR遺伝子を不活化することもできる。そのような細胞型
特異的不活化のための調節配列は、典型的には目的の特定の細胞型に依存しうる
のであって、当業者には明らかであろう。

【００６５】 トランスジェニック動物が作製されると、組換えNGPCR遺伝子の発現は標準的
技術を用いてアッセイすることができる。最初のスクリーニングはサザンブロッ
ト分析またはPCR技術によって達成することができ、動物組織を分析してトラン
スジーンの組み込みが起こっているか否かをアッセイすることができる。またト
ランスジェニック動物の組織中のトランスジーンのmRNA発現のレベルを、限定さ
れるものでないが、動物から得た組織サンプルのノーザンブロット分析、in sit
uハイブリダイゼーション分析、およびRT-PCRを含む技術を用いて評価すること
もできる。またNGPCR遺伝子発現組織のサンプルを、NGPCRトランスジーン産物に
特異的な抗体を用いて免疫細胞化学的に評価することもできる。

【００６６】NGPCRタンパク質に対する抗体 NGPCRの1以上のエピトープ、またはNGPCRの保存変異体のエピトープ、またはN
GPCRのペプチド断片を特異的に認識する抗体も本発明に包含される。そのような
抗体としては、限定されるものでないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル
抗体（mAbs）、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F（ab
'）₂フラグメント、Fab発現ライブラリーによって産生されたフラグメント、抗
イディオタイプ（抗ld）抗体、および以上のいずれかのエピトープ結合フラグメ
ントが挙げられる。

【００６７】 ある特定の実施形態においては、本発明の抗体は、例えば、生物学的サンプル
中のNGPCRの検出に使用することができ、従って、患者を異常量のNGPCRについて
試験することができる診断もしくは予後の技術の部分として使用することができ
る。ある特定の実施形態においては、抗体は、試験化合物のNGPCR遺伝子産物の
発現および/または活性に対する効果を評価するために、例えば以下に記載の化
合物スクリーニングスキームと一緒に使用することができる。ある特定の実施形
態においては、抗体は、例えば正常および/または遺伝子操作したNGPCR発現細胞
を患者に導入する前に評価するために、遺伝子治療と一緒に使用することができ
る。ある特定の実施形態においては、抗体はさらに、異常なNGPCR活性を阻害す
る方法として使用することができる。ある特定の実施形態においては、従って、
抗体を体重障害治療法の部分として使用することができる。

【００６８】 抗体を産生するためには、様々な宿主動物を、NGPCR、NGPCRペプチド（例えば
、ECD、TMまたはCDなどの受容体の機能性ドメインに対応するペプチド）、末端
切断NGPCRポリペプチド（1以上のドメイン、例えばTMまたはCDを欠失しているNG
PCR）、NGPCRの機能的同等物、またはNGPCRの突然変異体を用いる注射によって
、免疫感作してもよい。そのような宿主動物としては、限定されるものでないが
、少数を挙げると、ウサギ、マウス、およびラットが挙げられる。宿主種に応じ
て、様々なアジュバントを使用して免疫応答を増加することができ、限定される
ものでないが、フロイント（Freund）アジュバント（完全および不完全）、水酸
化アルミニウムなどの無機(mineral)ゲル、リゾレシチン、プルロニック-ポリオ
ール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘ
モシアニン（keyhole limpet hemocyanin）、ジニトロフェノール、ならびにBCG
（bacille Calmette-Guerin）およびコリネバクテリウム・パルブム（Corynebac
terium parvum）などの潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられる。ポリク
ローナル抗体は、免疫感作動物の血清由来の不均一な抗体分子集団である。

【００６９】 特定抗原に対する抗体の均一な集団であるモノクローナル抗体は、培養におけ
る連続細胞系による抗体分子の産生を提供するいずれの技術によっても得ること
ができる。これらの技術としては、限定されるものでないが、KohlerおよびMils
tein（1975, Nature 256:495-497；および米国特許第4,376,110号）のハイブリ
ドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kosborら, 1983, Immunology Toda
y 4: 72；Coleら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030）、および
EBV-ハイブリドーマ技術（Coleら, 1985, 「モノクローナル抗体と癌治療（Mono
clonal Antibodies And Cancer Therapy）」, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96）
が挙げられる。そのような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよびそれらのサ
ブクラスを含むいずれの免疫グロブリンクラスであってもよい。本発明のmAbを
産生するハイブリドーマをin vitroまたはin vivoで培養してもよい。高力価mAb
のin vivo産生は、本発明の好ましい産生方法である。

【００７０】 さらに、「キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Morrisonら, 1984
, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855 ；Neubergerら, 1984, Nature, 312:
604-608；Takedaら, 1985, Nature, 314:452-454）であって、適当な抗原特異性
のマウス抗体分子由来の遺伝子を適当な生物活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と
一緒にスプライスすることによる前記技術を使用することができる。キメラ抗体
は、マウスmAb由来の可変部とヒト免疫グロブリン定常部を有するもののように
、様々な部分が様々な動物種に由来する分子である。そのような技術は、参照に
より本明細書にそれらの全体が組み入れられる、米国特許第6,075,181号および
第5,877,397号ならびにそれらのそれぞれの開示に記載されている。

【００７１】 ある特定の実施形態においては、一本鎖抗体の産生について記載した技術（米
国特許第4,946,778号；Bird, 1988, Science 242:423-426；Hustonら, 1988, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；およびWardら, 1989, Nature 341:54
4-546）を、NGPCR遺伝子産物に対する一本鎖抗体を産生するために適合させるこ
とができる。アミノ酸架橋を介してFv領域の重鎖および軽鎖フラグメントを連結
して一本鎖ポリペプチドを得ることによって、一本鎖抗体を形成させる。

【００７２】 特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって作製す
ることができる。例えば、そのようなフラグメントとしては、限定されるもので
ないが、抗体分子のペプシン消化によって産生することができるF（ab'）₂フラ
グメントおよびF（ab'）₂フラグメントのジスルフィド架橋を還元して作製でき
るFabフラグメントが挙げられる。あるいは、所望の特異性をもつモノクローナ
ルFabフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にするFab発現ライブラリーを構
築してもよい（Huseら, 1989, Science, 246:1275-1281）。

【００７３】 次にNGPCRに対する抗体を使用して、所与のNGPCRを「模倣する(mimic)」抗イ
ディオタイプ抗体を、当業者に周知の技術を用いて作製することができる（例え
ば、Greenspan & Bona, 1993, FASEB J 7（5）:437-444；およびNissinoff, 199
1, J. Immunol. 147（8）:2429-2438を参照）。例えば、NGPCR ECDと結合してNG
PCRのリガンドの結合を競合的に阻害する抗体を使用して、NGPCR ECDを「模倣す
る」、従ってリガンドと結合し中和する抗イディオタイプを作製することができ
る。そのような中和化抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイプのFa
bフラグメントは、NGPCRシグナリング経路に関わる治療計画に使用することがで
きる。

【００７４】NGPCRに関連する異常の診断 NGPCR機能に関連する障害の診断および予後の評価に、ならびにそのような障
害の素因をもつ被験者の同定に、様々な方法を使用することができる。

【００７５】 そのような方法は、例えば、本明細書に記載のNGPCRヌクレオチド配列およびN
GPCR抗体などの試薬を使用することができる。特に、そのような試薬は、例えば
、（1）NGPCR遺伝子突然変異の存在の検出、あるいは所与の表現型に関連するNG
PCR mRNAの過剰発現または不足発現(under-expression)の検出；（2）所与の表
現型に関連するNGPCR遺伝子産物の過剰存在度または不足存在度の検出；および
（3）NGPCRが介在するシグナル伝達経路における混乱または異常の検出に使用す
ることができる。

【００７６】 本明細書に記載の方法は、例えば、本明細書に記載の少なくとも1つの特定のN
GPCRヌクレオチド配列またはNGPCR抗体試薬を含んでなるプレパック(pre-packag
ed)診断キットを使用して実施することができ、そして、例えば臨床の場で、体
重障害異常を示す患者を診断するために都合よく使用できる。

【００７７】 NGPCR突然変異の検出のために、いずれの有核細胞もゲノム核酸の出発供給源
として使用できる。NGPCR遺伝子発現またはNGPCR遺伝子産物の検出のために、例
えば、腎臓、胃または脳細胞などの、NGPCR遺伝子が発現されるいずれの細胞型
または組織も使用できる。

【００７８】 核酸に基づく検出技術およびペプチド検出技術を以下に説明する。

【００７９】NGPCR遺伝子およびその転写物の検出 NGPCR遺伝子内の突然変異は、様々な技術を利用して検出することができる。
任意の有核細胞由来の核酸をそのようなアッセイ技術の出発点として利用するこ
とができ、またそれらの核酸は当業者に周知である標準的な核酸調製方法によっ
て単離することができる。

【００８０】 DNAを、点突然変異、挿入、欠失および染色体再配列を含む、NGPCR遺伝子構造
に影響を及ぼす異常を検出する、生物学的サンプルのハイブリダイゼーションま
たは増幅アッセイに利用することができる。そのようなアッセイとしては、限定
されるものでないが、サザン解析、一本鎖立体構造多型分析（SSCP）、およびPC
R分析が挙げられる。

【００８１】 例えばNGPCR遺伝子特異的突然変異を検出するためのそのような診断方法は、
サンプル（例えば患者サンプルまたは他の適当な細胞供給源由来のサンプル）か
ら得た、組換えDNA分子、クローニングした遺伝子またはそれらの縮重変異体を
含む核酸を、本明細書に記載した組換えDNA分子、クローニングした遺伝子また
はそれらの縮重変異体を含む1種以上の標識した核酸試薬と、これらの試薬と所
与のNGPCR遺伝子内のそれらに相補的な配列との特異的アニーリングにとって好
都合な条件下で接触させてインキュベートすることを伴うものであってよい。あ
る特定の実施形態においては、これらの核酸試薬の長さは少なくとも15〜30ヌク
レオチドである。ある特定の実施形態においては、インキュベーション後に、全
てのアニーリングしない核酸を核酸:NGPCR分子ハイブリッドから除去する。もし
ハイブリダイズした核酸が存在すれば、次いでそのような分子の存在が検出され
る。そのような検出スキームを使用して、目的の細胞型または組織から得た核酸
を、例えば、メンブランなどの固体支持体またはマイクロタイタープレートもし
くはポリスチレンビーズのようなプラスチック表面に固定することができる。こ
の場合、インキュベーション後に、アニーリングしなかった本明細書に記載した
型の標識核酸試薬は容易に除去される。残留するアニーリングした標識NGPCR核
酸試薬の検出は、当業者に周知である標準技術を用いて実施される。NGPCR遺伝
子突然変異が存在するかどうかを決定するために、核酸試薬がアニールしたNGPC
R遺伝子配列を、正常なNGPCR遺伝子配列から予想されるアニーリングパターンと
比較することができる。

【００８２】 患者サンプルまたは他の適当な細胞供給源中のNGPCR遺伝子特異的核酸分子を
検出するための別の診断法は、例えばPCRによるそれらの増幅（Mullis, K. B.,
1987, 米国特許第4,683,202号に説明された実験的実施形態）と、その後に行う
当業者に周知である技術を利用する増幅分子の検出とを伴うものであってよい。
NGPCR遺伝子突然変異が存在するかどうかを決定するために、得られる増幅配列
を、増幅される核酸がNGPCR遺伝子の正常なコピーだけを含有する場合に予想さ
れる配列と比較することができる。

【００８３】 さらに、NGPCR遺伝子突然変異を有する個体を同定するために、周知の遺伝子
型決定技術を実施することができる。そのような技術としては、例えば、使用す
る特異的制限酵素に対する認識部位の1つにおける配列変異を伴う、制限断片長
多型（RFLP）の利用が挙げられる。

【００８４】 さらに、NGPCR遺伝子突然変異を同定するために利用し得るDNA多型を分析する
方法の改良が記載されており、その方法は、制限酵素切断部位間に短い縦列反復
DNA配列が様々な数で存在することを利用する。例えば、Weber（本明細書に参照
によりその全文が組み入れられる米国特許第5,075,217号）は、(dC-dA)n-(dG-dT
)nの短い縦列反復配列のブロックにおける長さの多型に基づくDNAマーカーを記
載する。(dC-dA)n-(dG-dT)nブロックの平均分離距離は30,000〜60,000bpと予測
される。そのように密接した間隔のマーカーは高頻度に共遺伝を示すことから、
例えば所与のNGPCR遺伝子内の突然変異などの、遺伝子突然変異の同定ならびにN
GPCR突然変異に関係する疾患および障害の診断に極めて有用である。

【００８５】 また、Caskeyら（本明細書に参照によりその全文が組み入れられる米国特許第
5,364,759号）は、短い3個および4個のヌクレオチド反復配列を検出するDNAプロ
フィールアッセイを記載している。その方法は、NGPCR遺伝子などの目的のDNAを
抽出し、抽出したDNAを増幅し、そして反復配列を標識して個体のDNAの遺伝子型
マップを作ることを含む。

【００８６】 NGPCR遺伝子発現のレベルはまた、NGPCR転写を検出および測定することによっ
てもアッセイできる。例えば、NGPCR遺伝子を発現することが既知のまたは疑わ
れる細胞型または組織に由来するRNAを単離して、上記のようなハイブリダイゼ
ーションまたはPCR技術を使用して試験することができる。単離細胞は、細胞培
養物からまたは患者から得てもよい。培養物から採取した細胞の分析は、細胞に
基づく遺伝子治療技術の一部として利用するか、あるいはNGPCR遺伝子の発現に
対する化合物の作用を試験するための、細胞評価の1ステップであってよい。そ
のような分析は、NGPCR遺伝子発現の活性化または不活化を含む、NGPCR遺伝子の
発現パターンの定量的および定性的両方の態様を表しうる。

【００８７】 このような検出スキームのある特定の実施形態においては、目的のRNAからcDN
Aを合成する（例えば、RNA分子のcDNAへの逆転写によって）。次いでcDNA内の配
列を、PCR増幅反応などの核酸増幅反応のテンプレートとして利用する。本方法
の逆転写および核酸増幅ステップにおいて合成開始試薬（例えば、プライマー）
として使用する核酸試薬は、本明細書に記載したNGPCR核酸試薬の中から選ぶこ
とができる。ある特定の実施形態においては、そのような核酸試薬の長さは少な
くとも9〜30ヌクレオチドである。増幅産物を検出するために、核酸増幅は放射
性標識または非放射性標識したヌクレオチドを用いて実施することができる。あ
るいは、十分な増幅産物を作製して、その産物が標準的なエチジウムブロミド染
色によるか、任意の他の適当な核酸染色法を利用することによるか、または配列
決定法により、視覚化できるようにしてもよい。

【００８８】 さらに、そのようなNGPCR遺伝子発現アッセイを、「in situ」で、すなわち、
生検または切除によって得た患者の組織の（固定および/または凍結した）組織
切片上で直接に実施して、核酸精製を必要としないようにすることが可能である
。上記のような核酸試薬を、そのようなin situ手法のためのプローブおよび/ま
たはプライマーとして利用してもよい（例えば、Nuovo, G.J., 1992,「PCR in s
ituハイブリダイゼーション：プロトコルと応用（PCR In Situ Hybridization:
Protocols And Applications）」, Raven Press, NYを参照）。

【００８９】 あるいは、もし十分な量の適当な細胞が得られれば、標準的なノーザン解析を
実施してNGPCR mRNA発現のレベルを決定することができる。

【００９０】NGPCR遺伝子産物の検出 以上考察した、野生型もしくは突然変異型NGPCR遺伝子産物、または保存型変
異体、あるいはそれらのペプチド断片に対する抗体はまた、本明細書に記載した
診断および予後診断にも利用できる。そのような診断法は、NGPCR遺伝子発現の
レベルの異常、あるいはNGPCRの構造、および/または時間的局在、組織局在、細
胞局在、もしくは細胞内小器官局在の異常を検出するために利用でき、それをin
vivoまたは例えば生検組織などのin vitroで実施することができる。

【００９１】 例えば、ある特定の実施形態においては、NGPCR ECDのエピトープに対する抗
体をin vivoで利用して、生体内のNGPCR発現のパターンおよびレベルを検出する
ことができる。そのような抗体は、生体内で発現したNGPCRとの結合を、X線、CA
Tスキャン、またはMRIなどの方法を利用して視覚化する目的で、例えば放射線不
透過性のまたは他の適当な化合物を使って標識して、被験体中に注入してもよい
。ある特定の実施形態においては、標識した抗体フラグメント、例えば、抗体結
合領域の最小部分を含んでなるFabまたは一本鎖抗体をこの目的に使用し、血液
脳関門の通過を促進して脳内に発現されるNGPCRを標識することができる。

【００９２】 さらに、存在を検出可能な任意のNGPCR融合タンパク質またはNGPCRコンジュゲ
ート化タンパク質を投与することができる。例えば、放射線不透過性のまたは他
の適当な化合物を用いて標識したNGPCR融合もしくはコンジュゲート化タンパク
質を投与して、標識した抗体を上に考察したようにin vivoで視覚化することが
できる。さらに、NGPCR-Ap融合タンパク質上のAP-NGPCRとしてのそのようなNGPC
R融合タンパク質を、in vitro診断法に利用することができる。

【００９３】 ある特定の実施形態においては、上記のイムノアッセイまたは融合タンパク質
検出アッセイを生検および剖検サンプルに対してin vitroで用いて、NGPCRの発
現パターンを評価することができる。そのようなアッセイは、NGPCR ECDを特徴
付ける抗体の利用に限定されるものでなく、NGPCRの任意のドメイン（例えば、E
CD、TMおよび/またはCD）のエピトープに対する抗体の利用であってもよい。あ
る特定の実施形態においては、これらの標識した抗体のそれぞれまたは全ての利
用によって、翻訳およびNGPCRの細胞表面への細胞内輸送に関する有用な情報が
得られ、プロセシングにおける欠陥を同定することができる。

【００９４】 分析される組織または細胞型は、典型的には、NGPCR遺伝子を発現することが
既知であるかまたは疑われる細胞型があげられる。ここで使用されるタンパク質
単離方法は、例えば、任意の目的で本明細書に参照によりその全文が組み入れら
れるHarlowおよびLane （Harlow, E.およびLane, D., 1988,「抗体：研究室マニ
ュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」, Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, Cold Spring Harbor, New York）に記載の方法であってもよい。単離
細胞は細胞培養物からまたは患者から得てもよい。培養物から採取した細胞の分
析は、細胞に基づく遺伝子治療技術の一部として利用するか、あるいはNGPCR遺
伝子の発現に対する化合物の作用を試験するための細胞評価の1ステップであっ
てもよい。

【００９５】 例えば、本明細書に記載した、本発明に有用な抗体または抗体のフラグメント
を使用して、NGPCR遺伝子産物もしくは保存型変異体またはそれらのペプチド断
片の存在を定量的または定性的に検出することができる。これは、例えば、蛍光
標識した抗体を用いる免疫蛍光技術（以下の本節を参照）を光学顕微鏡、フロー
サイトメトリーまたは蛍光定量による検出と組み合わせることによって、達成で
きる。ある特定の実施形態においては、もしそのようなNGPCR遺伝子産物が細胞
表面上に発現される場合に、そのような技術を利用する。

【００９６】 本発明に有用な抗体（またはそのフラグメント）またはNGPCR融合もしくはコ
ンジュゲート化タンパク質は、ある特定の実施形態においては、免疫蛍光アッセ
イ、免疫電子顕微鏡アッセイまたは非免疫アッセイ等において、NGPCR遺伝子産
物もしくは保存型変異体またはそれらのペプチド断片のin situ検出用に、また
はNGPCR結合用（標識したNGPCRリガンド融合タンパク質の場合）に、組織学的に
利用することができる。

【００９７】 in situ検出は、組織学的標本を患者から採取してそれに標識した本発明の抗
体または融合タンパク質をアプライすることによって達成できる。ある特定の実
施形態においては、抗体（またはフラグメント）または融合タンパク質は、その
標識した抗体（またはフラグメント）を生物学的サンプル上に上層することによ
ってアプライする。ある特定の実施形態においては、そのような方法を利用する
ことにより、NGPCR遺伝子産物もしくは保存型変異体またはペプチド断片、ある
いはNGPCR結合の存在を決定することができるだけでなく、試験した組織内のそ
の分布も確認することができる。本発明を利用して、様々な組織学的方法（染色
方法など）の任意のものをそのようなin situ検出を達成するように改変できる
ことは、当業者であれば容易に認識するであろう。

【００９８】 ある特定の実施形態においては、NGPCR遺伝子産物もしくは保存型変異体また
はそれらのペプチド断片に対するイムノアッセイおよび非イムノアッセイは、通
常は、体液、組織抽出物、新しく採取した細胞、または細胞培養にてインキュベ
ートしておいた細胞の溶解液などのサンプルを、検出しうるように標識した、NG
PCR遺伝子産物もしくは保存型変異体またはそれらのペプチド断片を同定できる
抗体の存在下でインキュベートし、そして結合した抗体を当業界で周知の様々な
技術の任意のものによって検出することを含んでなる。

【００９９】 ある特定の実施形態においては、生物学的サンプルを、ニトロセルロース、ま
たは細胞、細胞粒子もしくは可溶性タンパク質を固定できる他の固体支持体など
の、固相支持体または担体と接触させてそれに固定してもよい。次に、その支持
体を適当なバッファーを用いて洗浄し、続いて検出しうるように標識したNGPCR
抗体またはNGPCRリガンド融合タンパク質を用いて処理すればよい。次いで固相
支持体について前記バッファーを用いて2回目の洗浄を行い、未結合抗体または
融合タンパク質を除去する。次いで固体支持体上に結合した標識の量は通常の方
法によって検出できる。

【０１００】 「固相支持体または担体」は、抗原もしくは抗体と結合できるいずれの支持体
も意図する。周知の支持体または担体としては、限定されるものでないが、ガラ
ス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、
アミラーゼ、天然および改変セルロース、ポリアクリルアミド、斑レイ岩および
マグネタイトが挙げられる。本発明の目的では、担体の性質はある程度可溶性で
あってもまたは不溶性であってもよい。支持体材料は、結合する分子が抗原また
は抗体と結合できる限り、実質的に任意の可能な構造的形状を有してもよい。従
って、支持体形状は、ビーズのような球状、または試験管の内面もしくは棒の外
表面のような円筒形であってもよい。あるいは、その表面はシート、試験紙など
のように平面であってもよい。好ましい支持体としては、限定されるものでない
が、ポリスチレンビーズが挙げられる。当業者であれば、抗体もしくは抗原を結
合するために適切な多数の他の担体を知っているだろうし、または日常的な実験
を行うことによってそのような担体を確かめることもできる。

【０１０１】 特定のロットのNGPCR抗体もしくはNGPCRリガンド融合タンパク質の結合活性は
、周知の方法によって測定できる。当業者であれば、日常的実験を用いてそれぞ
れの測定のための操作および最適アッセイ条件を決定できるであろう。

【０１０２】 抗体について、NGPCR抗体を検出しうるように標識する方法の1つは、前記抗体
を酵素と連結して酵素イムノアッセイ（EIA）に利用することである（Voller, A
.,「酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）（The Enzyme Linked Immunosorbent A
ssay （ELISA））」, 1978, Diagnostic Horizons 2:1-7, Microbiological Ass
ociates Quarterly Publication, Walkersville, MD；Voller, A.ら, 1978, J.
Clin. Pathol. 31:507-520；Butler, J.E., 1981, Meth. Enzymol. 73:482-523
；Maggio, E.（編）, 1980, 「酵素イムノアッセイ（Enzyme Immunoassay）」,
CRC Press, Boca Raton, FL；Ishikawa, E.ら（編）, 1981, 「酵素イムノアッ
セイ（Enzyme Immunoassay）」, Kgaku Shoin, Tokyo）。抗体と結合する酵素を
適当な基質、好ましくは発色性基質と反応させて、例えば分光光度計で、蛍光光
度計でまたは目視によって検出できる化学部分を生成するようにする。抗体を検
出し得るように標識するために利用できる酵素としては、限定されるものでない
が、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ-5-ステロイドイ
ソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α-グリセロリン酸、デヒドロ
ゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、アル
カリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラク
トシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-6-リン
酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙
げられる。検出は、酵素に対する発色性基質を利用する比色法によって実施でき
る。検出はまた、同様に調製した標準物と比較して、基質の酵素反応の程度を視
覚的に比較することによって実施することもできる。

【０１０３】 検出はまた、様々な他のイムノアッセイの任意のものを利用して実施してもよ
い。例えば、ある特定の実施形態においては、抗体または抗体フラグメントを放
射標識することによって、ラジオイムノアッセイ（RIA）を利用してNGPCRを検出
することが可能である（例えば、本明細書に参照により組み入れられるWeintrau
b, B.,「ラジオイムノアッセイの原理(Principles of Radioimmunoassays)」, S
eventh Training Course on Radioligand Assay Techniques , The Endocrine S
ociety, March, 1986、を参照）。放射性同位体は、ガンマカウンタまたはシン
チレーションカウンタを使用することによって、あるいはオートラジオグラフィ
によって、検出できる。

【０１０４】 抗体を蛍光化合物を用いて標識することも可能である。蛍光標識した抗体を適
切な波長の光に曝すと、その存在は蛍光によって検出できる。通常使用する蛍光
標識化合物には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリ
トリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルデヒドおよびフルオレ
サミンがある。

【０１０５】 ある特定の実施形態においては、抗体はまた、¹⁵²Euまたは他のランタニド族
などの蛍光放射金属を用いて検出しうるように標識してもよい。これらの金属は
、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）またはエチレンジアミン四酢酸（EDTA）
などの金属キレート基を用いて抗体に結合することができる。

【０１０６】 ある特定の実施形態においては、抗体は、化学発光化合物とカップリングする
ことによって検出しうるように標識してもよい。化学発光タグ付き抗体の存在は
、次に、化学反応の過程で生じる発光の存在を検出することによって決定する。
特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、感熱性ア
クリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステ
ルである。

【０１０７】 ある特定の実施形態においては、生物発光化合物を使用して本発明の抗体を標
識してもよい。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増加する生
体系に見られる化学発光の一形式である。生物発光タンパク質の存在は、発光の
存在を検出することによって確認する。ある特定の実施形態による標識用の生物
発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンである。

【０１０８】NGPCR発現または活性をモジュレートする化合物に対するスクリーニングアッセ
イ 以下のアッセイは、NGPCR（限定されるものでないが、NGPCRのECDまたはCDを
含む）と相互作用する（例えば、結合する）化合物、NGPCR（限定されるもので
ないが、NGPCRのTMまたはCDを含む）と相互作用する細胞内タンパク質と相互作
用する（例えば、結合する）化合物、NGPCRとNGPCR介在シグナル伝達に関わる膜
貫通タンパク質もしくは細胞内タンパク質との相互作用を妨害する化合物、およ
びNGPCR遺伝子の活性をモジュレートする（すなわち、NGPCR遺伝子発現のレベル
をモジュレートする）かまたはNGPCRのレベルをモジュレートする化合物、を同
定するために設計した。ある特定の実施形態においては、NGPCR遺伝子調節配列
（例えば、プロモーター配列）と結合してNGPCR遺伝子発現をモジュレートでき
る化合物を同定するアッセイを利用することができる。例えば、本明細書に参照
によりその全文が組み入れられるPlatt, K.A., 1994, J. Biol. Chem. 269:2855
8-28562を参照すること。

【０１０９】 本発明のある特定の実施形態によってスクリーニングできる化合物としては、
限定されるものでないが、NGPCRのECDと結合して、天然のリガンドによって誘発
される活性を模擬する（すなわち、アゴニスト）かまたは天然のリガンドによっ
て誘発される活性を阻害する（すなわち、アンタゴニスト）、ペプチド、抗体と
そのフラグメント、および他の有機化合物（例えば、ペプチドミメチックス）；
ならびにNGPCRのECD（またはその部分）を模擬して天然のリガンドと結合して「
中和する」ペプチド、抗体とそのフラグメント、および他の有機化合物が挙げら
れる。

【０１１０】 そのような化合物としては、限定されるものでないが、例えば可溶性ペプチド
などのペプチド（限定されるものでないが、無作為ペプチドライブラリー（例え
ば、Lam, K.S.ら, 1991, Nature 354:82-84；Houghten, R.ら, 1991, Nature 35
4:84-86を参照）およびD型および/またはL型アミノ酸からなるコンビナトリアル
化学で作製された分子ライブラリーのメンバーを含む）、リンペプチド（限定さ
れるものでないが、無作為または部分的に変性した定方向（directed）リンペプ
チドライブラリーのメンバーを含む；例えば、Songyang, Z.ら, 1993, Cell 72:
767-778を参照）、抗体（限定されるものでないが、ポリクローナル、モノクロ
ーナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラまたは一本鎖抗体、およびFAb、F(a
b')₂およびFAb発現ライブラリーフラグメント、ならびにそれらのエピトープ結
合フラグメントを含む）、ならびに小有機または無機分子が挙げられる。

【０１１１】 本発明のある特定の実施形態によってスクリーニングできる他の化合物として
は、限定されるものでないが、血液脳関門を通過し、適当な細胞（例えば、小脳
、視床下部など）に進入し、そしてNGPCR遺伝子またはNGPCRシグナル伝達経路に
関わる何らかの他の遺伝子に（例えば、遺伝子発現に関わる調節領域または転写
因子との相互作用によって）影響を与えることができる小有機分子；あるいはNG
PCRの活性に（例えば、CDの酵素活性を阻害または増強することによって）影響
を与えるそのような化合物、またはNGPCRシグナル伝達経路に関わる何らかの他
の細胞内因子の活性に影響を与えるそのような化合物が挙げられる。

【０１１２】 コンピューターモデル化および検索技術は、NGPCR発現または活性をモジュレ
ートできる化合物の同定、または既に同定した化合物の改良を可能にする。その
ような化合物または組成物が同定されれば、活性部位または領域が同定される。
そのような活性部位は典型的にはリガンド結合部位である。活性部位は、当業界
で公知の方法を用いて、例えば、ペプチドのアミノ酸配列から、核酸のヌクレオ
チド配列から、または関連化合物または組成物とその天然リガンドとの複合体の
研究から、同定することができる。後者の場合、化学的またはX線結晶学的方法
を利用して、その因子上のどこに複合体化したリガンドが存在するかを見出すこ
とによって活性部位を見付けることができる。

【０１１３】 次に、活性部位の3次元幾何構造を決定する。これは、X線結晶学を含む、完全
な分子構造を決定できる既知の方法によって行うことができる。他方、固相また
は液相NMRを用いて、ある特定の分子内距離を決定してもよい。任意の他の実験
的構造決定法を用いて部分的または完全な幾何構造を得てもよい。幾何構造は天
然または人工の複合体化リガンドを用いて測定してもよく、これらは決定される
活性部位構造の精度を向上することができる。

【０１１４】 もし不完全なまたは精度の不十分な構造が決定された場合、コンピューターに
基づく数値モデル化の方法を利用してその構造を完成したりまたはその精度を改
善することができる。いずれの認知されたモデル化方法を利用してもよく、タン
パク質または核酸などの特定の生物高分子に特異的なパラメーター化モデル、分
子運動の計算に基づく分子動力学モデル、熱集合に基づく統計力学モデル、また
は複合モデルが挙げられる。ほとんどのタイプのモデルについては、構成原子お
よびグループ間の力を表す標準分子力場が必要であり、物理化学で知られる力場
から選択することができる。不完全または精度の低い実験的構造は、これらのモ
デル化方法により計算した完全かつ精度のより高い構造に対する制約条件となる
。

【０１１５】 最後に、実験的に、モデル化によって、またはそれらの組合せによって、活性
部位の構造を決定すれば、モジュレーティング(modulating)化合物候補は、化合
物とその分子構造の情報をともに含むデータベースを検索することにより同定す
ることができる。そのような検索は、決定した活性部位構造に適合する構造であ
って、活性部位を規定する官能基と相互作用する構造を有する化合物を探索する
。そのような検索は手作業で実施してもよいが、好ましくはコンピューターを利
用する。この検索から見出されるこれらの化合物は潜在的なNGPCRモジュレーテ
ィング化合物である。

【０１１６】 あるいは、これらの方法を利用して、既知のモジュレーティング化合物または
リガンドから、改良されたモジュレーティング化合物を同定することができる。
既知化合物の組成物を改変して、上記の実験的およびコンピューターモデル化方
法を新しい組成物に適用し、その改変の構造的効果を決定することができる。次
に、改変した構造を化合物の活性部位構造と比較して、適合または相互作用が改
善するかどうかを判定する。この方法で、側鎖基を変えるなどによる粗成の体系
的な変化を迅速に評価して、特異性もしくは活性の改善された改変モジュレーテ
ィング化合物またはリガンドを得ることができる。

【０１１７】 NGPCRの活性部位ならびに関係する伝達および転写因子の同定に基づくモジュ
レーティング化合物を同定するために有用な、さらなる実験的またはコンピュー
ターモデル化法は、当業者には明らかであろう。

【０１１８】 分子モデル化システムの例は、CHARMmおよびQUANTAプログラム（Polygen Corp
oration, Waltham, MA）である。CHARMmはエネルギー最小化および分子動力学関
数を実行する。QUANTAは分子構造の構築、グラフモデル化および解析を実行する
。QUANTAは、分子の相互挙動のインタラクティブな構築、改変、視覚化、および
解析を可能にする。

【０１１９】 複数の論文により、特定のタンパク質と相互作用する薬物のコンピューターモ
デル化が概説されており、例えば、Rotivinenら, 1988, Acta Pharmaceutical F
ennica 97:159-166；Ripka, New Scientist 54-57 （June 16, 1988）；McKinal
yおよびRossmann, 1989, Annu. Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29:111-122；Perry
およびDavies, 「QSAR：薬物設計における定量的な構造-活性相関（QSAR: Quant
itative Structure-Activity Relationships in Drug Design）」 pp. 189-193
（Alan R. Liss, Inc. 1989）；LewisおよびDean, 1989 Proc. R. Soc. Lond. 2
36:125-140および141-162；ならびに核酸成分に対するモデル受容体に関しては
、Askewら, 1989, J. Am. Chem. Soc. 111:1082-1090が挙げられる。化学物質の
スクリーニングおよびグラフ描画用の他のコンピュータープログラムは、BioDes
ign, Inc. （Pasadena, CA.）、Allelix, Inc. （Mississauga, Ontario, Canad
a）、およびHypercube, Inc. （Cambridge, Ontario）などの会社から市販され
ている。これらは主に特定のタンパク質に特異的な薬物に適用するために設計さ
れているが、DNAまたはRNAの領域が同定されればそれらの領域に特異的な薬物の
設計のためにそれらを適合させることができる。

【０１２０】 以上、結合を改変できる化合物の設計と作製について記載したが、天然産物ま
たは合成化学物質を含む既知化合物およびタンパク質を含む生物活性物質のライ
ブラリーを、インヒビターまたはアクチベーターである化合物について、スクリ
ーニングすることもできる。

【０１２１】 また、細胞に基づくシステムを利用して、生細胞においてNGPCRと結合する化
合物を同定し、さらにその結合に関連する活性の改変を評価することもできる。
ある特定の実施形態によれば、細胞に基づくシステムで利用し得るNGPCRのアゴ
ニストおよびアンタゴニストに対するアッセイは、限定されるものでないが、本
明細書に参照によりその全文が任意の目的で組み入れられる米国特許第6,004,80
8号およびPCT出願US99/17425に記載のアッセイが挙げられる。

【０１２２】 そのようなアッセイに特に関係する1つのツールは、なかんずく、本明細書に
参照により組み入れられる米国特許第5,625,048号に記載の緑色蛍光タンパク質
である。その細胞アッセイに利用しうる細胞としては、限定されるものでないが
、白血球、または白血球から誘導された細胞系、リンパ球、胚幹細胞を含む幹細
胞などが挙げられる。さらに、目的の機能性NGPCRを発現し、かつ、化学的変化
もしくは表現型変化によって測定される試験用もしくは天然リガンドによる活性
化に、または他の宿主細胞遺伝子の誘導に応答するよう遺伝子操作した発現宿主
細胞（例えば、B95細胞、COS細胞、CHO細胞、OMK細胞、繊維芽細胞、Sf9細胞）
を、本アッセイの最後に利用することができる。

【０１２３】 本明細書に記載のアッセイにより同定した化合物は、例えば、NGPCR遺伝子産
物のある特定の生物学的機能を詳細に検討するのに有用である。そのような化合
物を患者に治療上有効な用量にて投与し、様々な生理学的障害または精神障害の
いずれかを治療することができる。治療上有効な用量は、何らかの生物学的兆候
もしくは顕性症候の改善、阻止、予防、または変化をもたらすために十分な化合
物の量を意味する。

【０１２４】 そのような化合物の毒性および治療効果は、細胞培養または実験動物における
標準的な薬学的方法により、例えば、LD50（集団の50%に対する致死用量）およ
びED50（集団の50%に治療効果のある用量）を決定するための方法により、確認
することができる。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数であって、LD50/E
D50の比率として表される。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用
を示す化合物を使用してもよいが、通常は、非罹患細胞に対する損傷の可能性を
最小限にして副作用を軽減するために、そのような化合物を罹患組織部位へ標的
化する送達システムを設計するよう注意が払われる。

【０１２５】 細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータは、ヒトに使用する用量範囲
を決定するのに利用することができる。そのような化合物の用量は、好ましくは
、ED50を含みかつ僅かしかまたは全く毒性の無い循環濃度の範囲内にある。用量
はこの範囲内で、使用する投与形態および利用する投与経路に依存して様々であ
ってよい。本発明の方法で使用するいずれの化合物についても、治療上有効な用
量は最初に細胞培養アッセイから評価することができる。動物モデルでは、細胞
培養で決定したIC50（すなわち、症候の最高阻害値の半値を達成する試験化合物
の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように用量を決定すればよい。その
情報を利用して、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に決定できる。血漿中の
レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィによって測定してもよい。

【０１２６】 本発明において利用する医薬組成物は、通常の方法で、1以上の生理学的に許
容される担体または賦形剤を用いて製剤化することができる。従って、化合物な
らびにその生理学的に許容される塩および溶媒和物を、吸入もしくは吹送（口ま
たは鼻を通して）による投与、あるいは経口、バッカル、非経口、頭蓋内、くも
膜下腔内、または直腸投与用に製剤化することができる。

【０１２７】 経口投与用には、医薬組成物は、例えば、結合剤（例えば、プレゲル化トウモ
ロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロ
ース）；増量剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カル
シウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）
；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム
）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの製薬上許容される
賦形剤とともに通常の方法で製造した形態、例えば錠剤またはカプセル剤の形態
をとることができる。錠剤は、当業界で周知の方法によって被覆してもよい。経
口投与用の液体調製物は、例えば、液剤、シロップ剤もしくは懸濁剤の形態をと
ってもよいし、または使用前に水もしくは他の適当なビヒクルを用いて構成する
乾燥製品として提供してもよい。そのような液体調製物は、懸濁化剤（例えば、
ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または食用硬化油脂）；乳化剤（例え
ば、レシチンまたはアカシア）；非水ビヒクル（例えば、アーモンド油、油状エ
ステル、エチルアルコールまたは植物精油）；および保存剤（例えば、メチルも
しくはプロピル-p-ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）などの製薬上許容さ
れる添加剤とともに通常の方法によって製造してもよい。前記調製物はまた、バ
ッファー塩、香料、着色剤および甘味剤を適宜含有してもよい。

【０１２８】 経口投与用の調製物を適切に製剤化して活性化合物の放出が制御されるように
してもよい。

【０１２９】 バッカル投与用には、組成物を通常の方法で錠剤またはトローチ剤の形態に製
剤化してもよい。

【０１３０】 吸入による投与用には、本発明によって使用する化合物を加圧パックもしくは
噴霧器から、適当な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフ
ルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガ
スを利用した、エーロゾルスプレーによる吹付けの形態で送達するのが好都合で
ある。加圧エーロゾルの場合、用量単位は、定量を送達するバルブを備えること
によって決定することができる。吸入器または吹送器に使用する、例えばゼラチ
ンのカプセルおよびカートリッジは、化合物と、ラクトースまたはデンプンなど
の適当な粉末基剤との粉末混合物を含有するように製剤化してもよい。

【０１３１】 化合物は、注射、例えばボーラス注射または連続輸液による非経口投与用に製
剤化することができる。注射用製剤は、例えば、アンプルまたは複数用量容器中
に入れた保存剤を添加した単位剤形で提供してもよい。本発明の組成物は、油性
または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳化液などの形態をとってもよく、
懸濁化剤、安定剤および/または分散剤などの製剤助剤を含有してもよい。ある
いは、活性成分は、適当なビヒクル、例えば発熱物質を含まない無菌水を用いて
使用前に構成する粉末形態であってもよい。

【０１３２】 化合物はまた、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの通常の座薬
基剤を含有する座薬もしくは保持浣腸などの直腸用組成物として製剤化してもよ
い。

【０１３３】 上記の諸製剤に加えて、本発明の化合物はデポ調製物として製剤化することが
できる。このような長期間作用する製剤は、移植（例えば皮下にまたは筋内に）
によってまたは筋内注射によって投与することができる。従って、前記化合物は
、例えば、適当なポリマーまたは疎水性材料（例えば許容しうる油中の乳剤とし
て）またはイオン交換樹脂とともに、または、例えば低溶解性塩のような低溶解
性誘導体として、製剤化してもよい。

【０１３４】 本発明の組成物は、所望であれば、活性成分を含有する1以上の単位剤形を含
有するパックまたはディスペンサー装置として提供してもよい。そのようなパッ
クは、例えばブリスターパックなどの金属もしくはプラスチック箔を含んでなる
ものでもよい。パックまたはディスペンサー装置には投与の指示書を付随させて
もよい。

【０１３５】NGPCRと結合する化合物に対するin vitroスクリーニングアッセイ NGPCR（限定されるものでないが、NGPCRのECDまたはCDを含む）と相互作用し
得る（例えば、結合し得る）化合物を同定するin vitroシステムを設計すること
ができる。同定した化合物は、例えば、野生型および/または突然変異NGPCR遺伝
子産物の活性をモジュレートするのに利用でき、NGPCRのある特定の生物学的機
能を詳細に詰めるのに利用でき、正常なNGPCR相互作用を破壊する化合物を同定
するスクリーニングするのに利用でき、またはそれ自身そのような相互作用を破
壊することができる。

【０１３６】 NGPCRと結合する化合物を同定するのに利用するアッセイの原理は、NGPCRと試
験化合物との反応混合物を、２成分が相互作用し結合する条件下で十分な時間を
かけて調製し、複合体を形成させ、そしてこれを取除き、および/または反応混
合物中に検出することからなる。使用するNGPCR種は、スクリーニングアッセイ
の目的に依って変わり得る。例えば、ある特定の実施形態においては、自然リガ
ンドのアゴニストを探す場合、全長NGPCR、もしくは、例えばTMおよび/またはCD
が分子から欠失した可溶性末端切断NGPCR、ECDに対応するペプチド、またはアッ
セイ系での利便性を与えるタンパク質またはポリペプチド（例えば、標識付け、
得られる複合体の単離など）と融合した1つ以上のNGPCR ECDを含有する融合タン
パク質を利用することができる。細胞質ドメインと相互作用する化合物を探して
同定する場合は、NGPCR CDに対応するペプチドおよびNGPCR CDを含有する融合タ
ンパク質を利用することができる。

【０１３７】 スクリーニングアッセイは、様々な方法で実施しうる。例えば、そのようなア
ッセイを実施する一方法は、NGPCRタンパク質、ポリペプチド、ペプチドもしく
は融合タンパク質、または試験物質を固相上に固定し、反応終了時に固相上に固
定されたNGPCR／試験化合物複合体を検出することを含む。そのような方法のあ
る特定の実施形態においては、NGPCR反応物を固相上に固定し、固定しない試験
化合物は直接的または間接的に標識することができる。

【０１３８】 実施にあたって、ある特定の実施形態においては、マイクロタイタープレート
を固相として利用するのが好都合である。固定される成分は、非共有結合または
共有結合によって固定することができる。非共有結合は、固体表面をタンパク質
の溶液を用いて単にコートし、かつ乾燥して実施することができる。ある特定の
実施形態においては、固定されるべきタンパク質に特異的な固定した抗体、例え
ばモノクローナル抗体を利用して、該タンパク質を固体表面へ固定してもよい。
表面は予め調製して保存してもよい。

【０１３９】 アッセイを実施するために、固定された成分を含有するコートした表面に、非
固定成分を加える。ある特定の実施形態においては、反応が完了した後、形成さ
れたいずれの複合体も固定されたまま固体表面上に残る条件のもとで、未反応成
分を（例えば洗浄によって）除去する。様々な実施形態において、固体表面上に
固定された複合体の検出は、複数の方法によって実施することができる。予め非
固定成分を前標識している場合、表面上に固定された標識の検出は複合体が形成
されたことを示す。予め非固定成分を前標識していない場合、ある特定の実施形
態においては、間接標識を利用して表面上に固定された複合体を検出することが
できる。例えば、前に非固定であった成分に対して特異的な標識抗体を使用する
（抗体は、順に、標識した抗Ig抗体を用いて直接標識するかまたは間接標識する
ことができる）。

【０１４０】 ある特定の実施形態においては、反応を液相で実施し、反応産物を未反応成分
から分離して複合体を検出する。例えば、NGPCRタンパク質、ポリペプチド、ペ
プチドもしくは融合タンパク質、または試験化合物に特異的な固定した抗体を使
用して溶液中に形成されたいずれの複合体も固定し、そして可能な複合体の他の
成分に特異的な標識した抗体を使用して固定した複合体を検出する。

【０１４１】 ある特定の実施形態においては、細胞によるアッセイを利用してNGPCRと相互
作用する化合物を同定することができる。この目的には、NGPCRを発現する細胞
系、またはNGPCRを発現するように（例えば、NGPCR DNAの形質転換または形質導
入によって）遺伝子操作された細胞系（例えばCOS細胞、CHO細胞、繊維芽細胞な
ど）を利用することができる。試験化合物と、例えば、宿主細胞により発現され
たNGPCRのECDとの相互作用は、天然リガンドとの比較または競合によって決定す
ることができる。

【０１４２】5.5.2.NGPCRと相互作用する細胞内タンパク質のアッセイ タンパク質-タンパク質の相互作用を検出するいずれかの適当な方法を、NGPCR
と相互作用する膜貫通タンパク質または細胞内タンパク質を同定するために使用
することができる。使用できる方法には、細胞溶解物または細胞溶解物から得た
タンパク質とNGPCRとの勾配もしくはクロマトグラフィカラムを通しての共免疫
沈降、架橋および共精製があって、NGPCRと相互作用する溶解物中のタンパク質
を同定することができる。これらのアッセイに対して、使用しうるNGPCR成分は
、全長NGPCR、膜固定領域を欠く可溶性誘導体（例えば、TMが欠失してCDと融合
したECDを含有する末端切断分子となった末端切断NGPCR）、CDに対応するペプチ
ド、またはNGPCRのCDを含有する融合タンパク質である。そのような細胞内タン
パク質は、一度単離されると同定することができ、順に、標準技術を一緒に用い
て、それが相互作用するタンパク質を同定することができる。例えば、NGPCRと
相互作用する細胞内タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部分は、Edman分
解技術を用いるような、当業者が周知する技術を利用して確かめることができる
（例えば、Creighton, 1983,「タンパク質：構造と分子的原理（Proteins : Str
uctures and Molecular Principles）」, W. H. Freeman & Co., N.Y., pp.34-4
9を参照）。得られたアミノ酸配列をガイドとして使って、そのような細胞内タ
ンパク質をコードする遺伝子配列をスクリーニングするために利用できるオリゴ
ヌクレオチド混合物を作製することができる。スクリーニングは、例えば、標準
のハイブリダイゼーションまたはPCR技術によって実施できる。オリゴヌクレオ
チド混合物の作製およびスクリーニングの技術は周知である（例えば、Ausubel,
前掲、および「PCRプロトコル：方法と応用への手引き（PCR Protocols : A Gui
de to Methods and Applications）」, 1990, Innis, M.ら編, Academic Press, Inc., New Yorkを参照）。

【０１４３】 さらに、NGPCRと相互作用する膜貫通タンパク質または細胞内タンパク質をコ
ードする遺伝子の同時同定を行う方法を利用することができる。これらの方法は
、例えば、周知のλgt11ライブラリーの抗体プロービング技術と類似した方法で
、標識したNGPCRタンパク質、またはNGPCRポリペプチド、ペプチドまたは融合タ
ンパク質、例えばマーカー（例えば、酵素、蛍光、発光タンパク質または染料）
またはIg-Fcドメインと融合したNGPCRポリペプチドまたはNGPCRドメインを使用
して、発現ライブラリーをプロービングする。

【０１４４】 in vivoタンパク質相互作用を検出する1つの方法は、ツー・ハイブリッド・シ
ステム（two-hybrid system）であって、限定する方法としてでなく、説明する
ことのみを目的として詳細に記載する。このシステムの説明の1つが記載されて
いて（Chienら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582）、Clontec
h （Palo Alto, CA）から市販されている。

【０１４５】 簡単に説明すると、そのようなシステムを利用するには、2つのハイブリッド
タンパク質をコードするプラスミドを構築する。1つのプラスミドは、NGPCR、NG
PCRポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質をコードするNGPCRヌクレオ
チド配列と融合した転写アクチベータータンパク質のDNA結合ドメインをコード
するヌクレオチドを有し、もう１つのプラスミドは、cDNAライブラリーの部分と
してこのプラスミドに組換えられた未知タンパク質をコードするcDNAと融合した
転写アクチベータータンパク質の活性化ドメインをコードするヌクレオチドを有
する。DNA結合ドメイン融合プラスミドとcDNAライブラリーを、その調節領域が
転写アクチベーターの結合部位を含有するレポーター遺伝子（例えば、HBSまた
はlacZ）を含有する酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevi
siae）株中に形質転換する。いずれのハイブリッドタンパク質も単独では受容体
遺伝子の転写を活性化できず、DNA結合ドメインハイブリッドは活性機能を提供
しないから活性化できず、また活性化ドメインハイブリッドはアクチベーター結
合部位に局在化できないので活性化できない。2つのハイブリッドタンパク質が
相互作用すると、機能アクチベータータンパク質が再構成され、その結果、レポ
ーター遺伝子の発現がもたらされ、それがレポーター遺伝子産物に対するアッセ
イによって検出される。

【０１４６】 ツーハイブリッドシステムまたは関連の手法を利用して、活性化ドメインライ
ブラリーを「ベイト（bait）」遺伝子産物と相互作用するタンパク質についてス
クリーニングすることができる。例として、限定されるものでないが、NGPCRを
ベイト遺伝子産物として使用してもよい。全ゲノムまたはcDNA配列を活性化ドメ
インをコードするDNAと融合させる。このライブラリーと、DNA結合ドメインと融
合したベイトNGPCR遺伝子産物のハイブリッドをコードするプラスミドとを酵母
レポーター株中に同時形質転換し、得られる形質転換体をレポーター遺伝子を発
現するものについてスクリーニングする。例えば、限定されるものでないが、NG
PCRのオープンリーディングフレーム（またはNGPCRのドメイン）などのベイトNG
PCR遺伝子配列を、翻訳によってGAL4タンパク質のDNA結合ドメインをコードする
DNAと融合するようにベクター中にクローニングすることができる。これらのコ
ロニーを精製して、レポーター遺伝子発現の原因となるライブラリープラスミド
を単離する。次いでDNA配列決定を利用して、そのライブラリープラスミドによ
ってコードされたタンパク質を同定する。

【０１４７】 ベイトNGPCR遺伝子産物と相互作用するタンパク質を検出するための細胞系のc
DNAライブラリーは、当業者が日常実施する方法を用いて作ることができる。本
明細書に記載のシステムのある特定の実施形態によると、例えば、cDNA断片をベ
クター中に挿入して、翻訳によってGAL4の転写活性化ドメインと融合させてもよ
い。このライブラリーを、ベイトNGPCR遺伝子-GAL4融合プラスミドと共に、GAL4
活性化配列を含有するプロモーターによって駆動されるlacZ遺伝子を含有する酵
母株中に同時形質転換してもよい。GAL4転写活性化ドメインと融合し、かつベイ
トNGPCR遺伝子産物と相互作用するcDNAがコードするタンパク質は、活性GAL4タ
ンパク質を再構成して、それによってHIS3遺伝子の発現を駆動しうる。HIS3を発
現するコロニーは、ヒスチジンを欠く半固体寒天の培地を含有するペトリ皿上で
増殖させることによって検出できる。次いでこれらの株からcDNAを精製し、これ
を使い、当業界で日常実施される技術を利用して、ベイトNGPCR遺伝子相互作用
タンパク質を産生しかつ単離することができる。

【０１４８】NGPCR／細胞内またはNGPCR／膜貫通巨大分子相互作用を妨害する化合物のアッセ イ NGPCRと相互作用する巨大分子は、本明細書においては、「結合パートナー」
を意味する。これらの結合パートナーはおそらく、NGPCRシグナル伝達経路に関
わる。従って、そのような結合パートナーの相互作用を妨害または破壊し、かつ
NGPCRの活性を調節してNGPCR活性に関連する障害を制御するのに利用しうる化合
物を同定することが所望される。例えば、その発現パターンが与えられれば、記
載したNGPCRは、肥満、炎症、免疫障害、糖尿病、心疾患および冠動脈疾患、代
謝障害、ならびに癌の治療に有用な化合物を同定する方法に特に有用であると考
えられる。

【０１４９】 ある特定の実施形態においては、NGPCRとその１種以上の結合パートナーとの
相互作用を妨害する化合物を同定するために利用するアッセイ系は、本明細書に
記載したNGPCRタンパク質、ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質を
含有する反応混合物と結合パートナーとを、両者が相互作用して結合する条件下
で十分な時間調製して複合体を形成させることを含む。化合物の阻害活性を試験
するためには、反応混合物を試験化合物の存在下および非存在下で調製する。試
験化合物は最初に反応混合物中に含まれていても、またNGPCR部分とその結合パ
ートナーを加えた後に加えられてもよい。対照の反応混合物は試験化合物なしに
、またはプラセボと共にインキュベートする。次いでNGPCR部分と結合パートナ
ーとの間の複合体の形成を検出する。複合体が対照の反応で形成されるが試験化
合物を含有する反応混合物で形成されないのは、その化合物がNGPCRと相互作用
結合パートナーとの相互作用を妨害することを示す。さらに、試験化合物および
正常NGPCRタンパク質を含有する反応混合物内の複合体形成を、試験化合物およ
び突然変異体NGPCRを含有する反応混合物内の複合体形成と比較することもでき
る。この比較は、突然変異体のまたは突然変異させたNGPCRの相互作用を特異的
に破壊するが正常NGPCRのそれを破壊しない化合物を同定することを所望する場
合に重要である。

【０１５０】 ある特定の実施形態においては、NGPCRとその結合パートナーとの相互作用を
妨害する化合物に対するアッセイを、不均一または均一フォーマットで実施する
ことができる。不均一アッセイは、NGPCR部分産物またはその結合パートナーを
固相上に固定し、反応終了時に固相上に固定された複合体を検出することを含む
。均一アッセイにおいては、全反応を液相中で実施する。いずれの手法でも、反
応物の添加順序を変えて試験する化合物について様々な情報を得ることができる
。例えば、競合の相互作用を妨害する試験化合物は、試験物質の存在下で反応を
実施することによって、すなわち、試験物質をNGPCR部分と相互作用結合パート
ナーの前に、または同時に、反応混合物に加えることによって同定することがで
きる。あるいは、予め形成された複合体を破壊する試験化合物、例えばより高い
結合定数を有し、複合体の成分の1つと置き換わる化合物は、複合体が形成され
た後に試験化合物を反応混合物に加えることによって試験することができる。あ
る特定の実施形態による様々なフォーマットを以下に簡単に説明する。

【０１５１】 不均一アッセイ系においては、NGPCR部分または相互作用結合パートナーを固
相表面上に固定するのに対して、非固定種は直接的にまたは間接的に標識する。
実施には、マイクロタイタープレートを使用するのが好都合である。固定種は非
共有結合または共有結合によって固定することができる。非共有結合は、単に固
体表面をNGPCR遺伝子産物または結合パートナーの溶液を用いてコートし、乾燥
することによって実施できる。あるいは、固定される種に特異的な固定した抗体
を用いて固相表面にその種を固定してもよい。表面は前もって調製して保存して
もよい。

【０１５２】 ある特定の実施形態によってアッセイを実施するには、固定した種のパートナ
ーを、試験化合物を用いて、または用いないでコートした表面に曝す。反応が完
了した後、未反応成分を（例えば、洗浄によって）除去すると、形成したいずれ
かの複合体は固体表面上に固定されて残る。固体表面上に固定した複合体の検出
は複数の方法で実施することができる。非固定種を予め標識する場合、ある特定
の実施形態においては、表面に固定した標識の検出は複合体が形成されたことを
示す。非固定種を予め標識しない場合、ある特定の実施形態においては、間接標
識を利用して表面に固定された複合体を検出できる。例えば、最初に非固定の種
に対して特異的な標識抗体（抗体は、順に、直接標識するかまたは抗Ig抗体を用
いて間接標識することができる）を用いる。反応成分の添加順序によって、複合
体形成を阻害するか、または予め形成した複合体を破壊する試験化合物を検出す
ることができる。

【０１５３】 ある特定の実施形態においては、反応を試験化合物の存在または非存在下で液
相にて実施し、反応産物を未反応成分から分離し、そして複合体を検出すること
ができる。例えば、結合成分の1つに対して特異的な固定した抗体を用いて液中
で形成したいずれかの複合体を固定し、そして他のパートナーに特異的な標識し
た抗体を用いて固定した複合体を検出する。再び、液相への反応物の添加順序に
よって、複合体を阻害するか、または予め形成した複合体を破壊する試験化合物
を同定することができる。

【０１５４】 本発明のある特定の実施形態においては、NGPCR部分と相互作用結合パートナ
ーとの予め形成した複合体を調製する均一アッセイを実施することができ、この
アッセイではNGPCRまたはその結合パートナーは標識されているが、複合体が形
成された場合、標識により作られたシグナルは消失する（例えば、この手法をイ
ムノアッセイに使用するRubensteinによる米国特許第4,109,496号を参照）を利
用することができる。予め形成した複合体からの種の1つと競合して置き換わる
試験物質を加えると、バックグラウンド上にシグナルが発生する。この方法で、
NGPCR／細胞内結合パートナー相互作用を破壊する試験物質を同定することがで
きる。

【０１５５】 ある特定の実施形態においては、固定用のNGPCR融合物を調製することができ
る。例えば、pGEX-5X-1などの融合ベクターを用いて、例えばCDに対応するNGPCR
またはペプチド断片をグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）遺伝子と融合
して、得られる融合タンパク質にその結合活性を維持させることができる。相互
作用結合パートナーを精製して利用し、当業界で日常実施され、かつ本明細書に
記載の方法を用いて、モノクローナル抗体を産生することができる。この抗体を
、例えば当業界で日常実施される方法によって、放射性同位体125Iを用いて標識
することができる。不均一アッセイにおいては、例えば、GST-NGPCR融合タンパ
ク質をグルタチオン-アガロースビーズに固定することができる。次いで相互作
用結合パートナーを、試験化合物の存在または非存在下で、相互作用および結合
が起こるように加えることができる。反応が終わると、未結合物質を洗浄除去し
、標識したモノクローナル抗体を系に加えて複合成分と結合させることができる
。NGPCR遺伝子産物と相互作用結合パートナーとの間の相互作用は、グルタチオ
ン-アガロースビーズと結合して残る放射能の量を測定することによって検出す
ることができる。試験化合物による相互作用の阻害が果たされると、測定放射能
の減少が起こる。

【０１５６】 ある特定の実施形態においては、GST-NGPCR融合タンパク質と相互作用結合パ
ートナーを、固体グルタチオン-アガロースビーズの非存在下で液相中で一緒に
混合してもよい。試験化合物を、種が相互作用する間にまたは後に加えてもよい
。次いでこの混合物にグルタチオン-アガロースビーズを加えて、未結合物質を
洗浄除去する。再び、NGPCR／結合パートナー相互作用の阻害の程度を、標識抗
体を加えてビーズに結合した放射能を測定することによって検出することができ
る。

【０１５７】 本発明のある特定の実施形態においては、これらの前記技術は、NGPCRの結合
ドメインおよび／または相互作用もしくは結合パートナー（結合パートナーがタ
ンパク質である場合）に対応するペプチド断片を片方または両方の全長タンパク
質の代わりに使用して実施することができる。当業界で日常実施される複数の方
法を利用して結合部位を同定し、かつ単離することができる。これらの方法は、
限定されるものでないが、タンパク質の1つをコードする遺伝子の突然変異誘発
と同時免疫沈降アッセイにおける結合破壊に対するスクリーニングが挙げられる
。次に、複合体の第2の種をコードする遺伝子の代償性突然変異を選択すること
ができる。それぞれのタンパク質をコードする遺伝子の配列分析は、相互作用結
合に関わるタンパク質の領域に対応する突然変異を明らかにするであろう。ある
いは、1つのタンパク質を上記の方法を利用して固体表面に固定して、トリプシ
ンなどのタンパク質分解酵素を用いて処理しておいた、標識したその結合パート
ナーと相互作用させて結合させることができる。洗浄の後、相対的に短い、結合
ドメインを含んでなる標識したペプチドが固体材料と結合して残るので、それを
単離して、アミノ酸配列決定によって同定することができる。また、一旦、細胞
内結合パートナーをコードする遺伝子が得られれば、短い遺伝子セグメントを遺
伝子操作してそのタンパク質のペプチド断片を発現させ、それを次いで結合活性
について試験し、かつ精製または合成することもできる。

【０１５８】 例えば、限定されるものでないが、GST-NGPCR融合タンパク質を作ってグルタ
チオンアガロースビーズと結合させることにより、NGPCR遺伝子産物を上記のよ
うに固体材料に固定するができる。相互作用結合パートナーを、35Sなどの放射
性同位体を用いて標識し、かつトリプシンなどのタンパク分解酵素を用いて切断
することができる。次に切断産物を固定したGST-NGPCR融合タンパク質に加えて
、結合させることができる。未結合ペプチドを洗浄した後、細胞内結合パートナ
ー結合ドメインを表す標識した結合物質を溶出し精製して、アミノ酸配列につい
て、周知の方法によって分析することができる。このように同定したペプチドは
、合成によって生産するか、または組換えDNA技術を用いて適当な利用しうるタ
ンパク質と融合することができる。

【０１５９】 本発明は、本発明のある特定の実施形態の個々の態様を説明することを意図し
ている、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるべきでなく
、そして機能的に同等である方法および成分は本発明の範囲内にある。実際、本
明細書に示し、かつ記載した改変に加えて、本発明の様々な改変が、当業者には
、以上の説明と添付の図面から明白であろう。そのような改変は請求の範囲内に
入ると意図している。出版物、特許および特許出願を含む全ての参照した文献は
参照により本明細書に任意の目的に対して組み入れられる。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ， ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ Ｎ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ネポムニチー，ボリス アメリカ合衆国 77909 テキサス州，ヒ ューストン，サイプレス ステーション ドライブ 905 ナンバー1515 (72)発明者 ワン，ショアミン アメリカ合衆国 60062 イリノイ州，ノ ースブルック，コメリカル アベニュー 4088 (72)発明者 ウォーク，ディー．，ウェイド アメリカ合衆国 77389 テキサス州，ス プリング，ダーンヒル ドライブ 7507 (72)発明者 ゲルハルト，ブレンダ アメリカ合衆国 77373 テキサス州，ス プリング，クノールブルック レーン 2123 (72)発明者 ターナー，シー．，アレクサンダー，ジュ ニア アメリカ合衆国 77381 テキサス州，ザ ウッドランズ，ウィンター ホィート プレイス 67 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA63 CA02 DA02 DA03 GA11 4B065 AA90X AA91X AA93X AA93Y 4H045 AA10 AA20 BA10 CA40 DA50 EA20 EA50 FA74

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 a）配列番号１に示したヌクレオチド配列； b）配列番号３に示したヌクレオチド配列； c）配列番号５に示したヌクレオチド配列；および d）配列番号６に示したヌクレオチド配列： から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子
2. 【請求項２】 配列番号１に示したヌクレオチド配列を含んでなる請求項１
   に記載の単離された核酸分子。
3. 【請求項３】 a）配列番号１に示したヌクレオチド配列； b）配列番号３に示したヌクレオチド配列； c）配列番号５に示したヌクレオチド配列；および d）配列番号６に示したヌクレオチド配列： から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも22個の連続した塩基を含んでなる
   単離された核酸分子。
4. 【請求項４】 a）配列番号１に示したヌクレオチド配列； b）配列番号３に示したヌクレオチド配列； c）配列番号５に示したヌクレオチド配列；および d）配列番号６に示したヌクレオチド配列： から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列
   を含んでなる単離された核酸分子。
5. 【請求項５】 配列番号２に示したアミノ酸をコードするヌクレオチド配列
   を含んでなる単離された核酸分子。
6. 【請求項６】 配列番号４に示したアミノ酸をコードするヌクレオチド配列
   を含んでなる単離された核酸分子。
7. 【請求項７】 配列番号７に示したアミノ酸をコードするヌクレオチド配列
   を含んでなる単離された核酸分子。
8. 【請求項８】 a）配列番号２に示したアミノ酸配列； b）配列番号４に示したアミノ酸配列；および c）配列番号７に示したアミノ酸配列； から選択されるアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド。
9. 【請求項９】 配列番号２に示したアミノ酸を含んでなる請求項８に記載の
   単離されたポリペプチド。
10. 【請求項１０】 a）配列番号２に示したアミノ酸配列； b）配列番号４に示したアミノ酸配列；および c）配列番号７に示したアミノ酸配列； から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含んで
    なる単離されたポリペプチド。
11. 【請求項１１】 a）少なくとも1つの保存的アミノ酸置換をもつ配列番号２
    に示したアミノ酸配列； b）少なくとも1つの保存的アミノ酸置換をもつ配列番号４に示したアミノ酸配
    列；および c）少なくとも1つの保存的アミノ酸置換をもつ配列番号７に示したアミノ酸配
    列； から選択されるアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド。
12. 【請求項１２】 少なくとも1つの保存的アミノ酸置換をもつ配列番号２に
    示したアミノ酸配列を含んでなる、請求項１１に記載の単離されたポリペプチド
    。
13. 【請求項１３】 請求項１、２、３、４、５、または６に記載のいずれかの
    単離された核酸分子を含有する組換え宿主細胞。
14. 【請求項１４】 宿主細胞が真核生物である、請求項１３に記載の組換え宿
    主細胞。
15. 【請求項１５】 宿主細胞がCHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3
    、およびWI38細胞系から選択される、請求項１４に記載の組換え宿主細胞。
16. 【請求項１６】 （a）ポリペプチドをin vitroで分子と接触させること；
    および（b）前記ポリペプチドと前記分子との結合を検出することを含んでなる
    、請求項８、１０、または１１の1つに記載のポリペプチドと結合する分子を同
    定する方法。