JP2003531601A - コルチコトロピン放出因子受容体ＣＲＦ２αのプロモーター配列の活性を変化させる因子の同定法 - Google Patents

コルチコトロピン放出因子受容体ＣＲＦ２αのプロモーター配列の活性を変化させる因子の同定法

Info

Publication number
JP2003531601A
JP2003531601A JP2001580188A JP2001580188A JP2003531601A JP 2003531601 A JP2003531601 A JP 2003531601A JP 2001580188 A JP2001580188 A JP 2001580188A JP 2001580188 A JP2001580188 A JP 2001580188A JP 2003531601 A JP2003531601 A JP 2003531601A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
crf
receptor
promoter
cell line
human
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2001580188A
Other languages
English (en)
Inventor
ネッド エイチ． カリン，
パトリック エイチ． ローズブーム，
チャールズ エフ． ランドリー，
スティーブン エイ． ナンダ，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wisconsin Alumni Research Foundation
Original Assignee
Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wisconsin Alumni Research Foundation filed Critical Wisconsin Alumni Research Foundation
Publication of JP2003531601A publication Critical patent/JP2003531601A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

(57)【要約】 ＣＲＦ2α受容体のプロモーター領域の活性を変化させる因子の同定法を開示する。実施態様の１つでは、本方法は、（ａ）レポーター遺伝子に作動可能に連結された異種ＣＲＦ2α受容体のプロモーター配列をコードする核酸配列を含む細胞株または生物を得る工程、及び（ｂ）前記細胞またはトランスジェニック動物に試験因子を移入し、前記因子が前記細胞株またはトランスジェニック動物に移入されていないコントロール細胞株またはトランスジェニック動物と比較して前記レポーター遺伝子産物の発現を評価する工程からなる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願の相互参照） 本発明は、２０００年５月２日に出願された米国特許仮出願第60／201,129号
の利益を主張する。
【０００２】 （連邦政府により援助を受けた研究または開発に関する記述） 本発明を、以下の機関から授与された合衆国政府援助金を使用して行った。Ｎ
ＩＨ ＭＨ４０８５５。合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】 （発明の背景） 現代社会では、ストレスおよびそれによる疾患が蔓延しており、これが深刻な
窮迫、身体の健康および社会的および職業上の機能の変化を引き起こす。極端な
場合、ストレスは、うつ病、不安障害、心的外傷後ストレス障害、および他の疾
患を含む身体的障害を有する神経病理学的問題を引き起こし得る。最近の研究で
は、身体および脳に対するストレスの潜在的影響が示されている。例えば、慢性
の強いストレスにより、記憶において重要な役割を果たす脳の領域に変化を起こ
し得る。さらに、ストレスは、心血管機能、免疫機能、および胃腸生理学に負の
影響を与え得る。
【０００４】 人口の１０％がうつ病を罹患しており、別に１５％が臨床的に有意な不安症を
罹患していると見られている。このストレス関連問題の高い発生数は、一次診療
医師への来診者の約５０％がストレスおよび／または心理学的関連疾患であると
いう事実を反映している。
【０００５】 現在のストレスおよびそれによる障害の治療は、その後に非常に調査されてお
り、バリウムおよびザナックスなどの伝統的な抗不安薬が含まれる。プロザック
などのより最近のより新しい抗鬱薬を使用して、うつ病、不安、および他のスト
レス関連問題が治療されている。昨年、米国ではプロザックなどの薬物に６０億
ドルが投じられたと見積もられている。しかし、これらの治療は、約３０％の個
体で効果がなく、反応した個体のうちおよそ５０％の個体しか正常に機能回復し
ない。さらに、これらの薬物での治療は、厄介な副作用（５０％が顕著な性的不
能）を起こすことにより多数の個体に受け入れられない。うつ病および不安が再
発性且つ慢性の障害であるので、患者が長期間薬物を快適に服用することが重要
である。コルチコトロピン放出因子ＣＲＦ系の過剰活性がうつ病および不安に関
連し、この系を標的とする治療は非常に有効であり得る。
【０００６】 （発明の概要） 実施態様の１つでは、本発明はＣＲＦ2α受容体のプロモーター領域の活性を
変化させる因子の同定法である。本方法は、（ａ）レポーター遺伝子に作動可能
に連結した異種ＣＲＦ2α受容体のプロモーター配列をコードする核酸配列を含
む細胞株または生物を得る工程、（ｂ）前記細胞またはトランスジェニック動物
に試験因子を移入し、前記因子が前記細胞株または生物に移入されていないコン
トロール細胞株またはトランスジェニック動物と比較して前記レポーター遺伝子
産物の発現を評価する工程からなる。
【０００７】 好ましい実施態様では、ＣＲＦ2α受容体はラット受容体またはヒト受容体で
ある。
【０００８】 別の実施態様では、本発明は、細胞株がレポーター遺伝子に作動可能に連結さ
れた異種ＣＲＦ2α受容体体プロモーターをコードする核酸配列を含む構築物で
形質転換されている形質転換細胞株、または、動物がレポーター遺伝子に作動可
能に連結された異種ＣＲＦ2α受容体プロモーターをコードする核酸配列で形質
転換されているトランスジェニック動物の関連物である。
【０００９】 本発明の目的は、レポーター遺伝子に作動可能に連結された異種ＣＲＦ2α受
容体プロモーターをコードする核酸配列でトランスフェクションされた形質転換
細胞株またはトランスジェニック動物を作製することである。
【００１０】 本発明の別の目的は、ＣＲＦ2α受容体プロモーター領域の活性を変化させる
化合物をスクリーニングすること、又は因子を同定することである。
【００１１】 本発明の他の目的、利点、および特徴は、特許請求の範囲、明細書、および図
面を分析および再検討後に明らかとなる。
【００１２】 （発明の説明） Ａ．概説 本発明は、ストレスに対する種々の電気生理学的、免疫、およびエンドクリン
ならびに挙動応答を調整すると考えられるホルモンおよび神経伝達物質であるコ
ルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）に関する。
【００１３】 動物研究により、ＣＲＦ系の拮抗作用によりストレスに関連する窮迫および身
体への影響が遮断されることが示されている。ヒトでの研究により、脳における
ＣＲＦ系がうつ病、不安障害、および他の神経精神医学的問題を抱える患者で過
剰な活性を示すことが示されている。さらに、ヒトおよび動物での研究により、
多数の有効な抗うつ薬治療により脳ＣＲＦ活性が減少することが示されている。
これらの所見に基づいて、医薬産業は、現在、脳のＣＲＦの影響を遮断または減
少させる経口用化合物の探索を急いでいる。既にいくつかの化合物が同定され、
ヒト研究での初期段階である。
【００１４】 ＣＲＦ系は、現在、５つの成分からなることが公知である。ＣＲＦは、ニュー
ロンから放出される神経伝達物質であり、隣接する脳細胞上に存在するＣＲＦ受
容体との相互作用によってその効果を発揮する。ウロコルチンは、このシステム
とも相互作用するＣＲＦに類似の別の神経伝達物質である。一旦刺激されると、
受容体は、ストレスの影響を媒介する細胞内プロセスを活性化する。
【００１５】 ＣＲＦは、ＣＲＦ1およびＣＲＦ2と呼ばれる２つの異なる受容体との相互作用
によってその効果を発揮する。「ＣＲＦ2α」、「ＣＲＦ2β」、および「ＣＲＦ2γ 」と呼ばれるＣＲＦ2受容体の少なくとも３つの異なるスプライス変異体も存
在する。ＣＲＦ1およびＣＲＦ2受容体に加えて、「ＣＲＦ結合タンパク質」と呼
ばれる、その放出後にＣＲＦを不活化するように機能する脳細胞中で見出される
タンパク質も存在する。
【００１６】 ＣＲＦの生物学的性質については多く知られているが、ＣＲＦ1、ＣＲＦ2、お
よび結合タンパク質についてはほとんど理解されていない。ＣＲＦ1受容体はス
トレスの影響の媒介を担い、うつ病および不安において重要でもあり得る。しか
し、他の証拠により、ＣＲＦ2受容体はまたストレスの影響の媒介において重要
な役割を果たすことが示唆される。医薬産業では、ストレスの影響を遮断するア
ンタゴニストの開発にＣＲＦ1を標的にしている。ＣＲＦ2に対する興味もあり得
るが、この受容体に特異的な小分子アンタゴニストは発見されていない。
【００１７】 本発明により、ＣＲＦ2受容体をコードする遺伝子調節の変化を目的とする異
なる治療アプローチが得られ、これは不安、うつ病、および他のストレス関連問
題の治療におけるより有効なストラテジーである潜在性を有する。このアプロー
チは、これらの疾患の主な問題がＣＲＦおよび／またはその受容体の過剰発現で
あるという仮説に基づく。したがって、これらの問題の主な原因を標的とする治
療がより有効であり、他の系に対して非特異的影響を示さないはずである。例え
ば、ＣＲＦまたはその受容体の調節を制御する薬物により、より正確にストレス
が管理される。受容体アンタゴニストが脳および身体全体の全ての受容体に影響
を与え、疾患において最も重要な領域と選択的に相互作用しないので、伝統的な
アプローチは多数の望ましくない効果を引き起こす。
【００１８】 受容体および他のタンパク質を生成する遺伝子の調節に影響を与える薬物の理
解および開発の利点は、これらの薬物が特定の組織中のタンパク質レベルの変化
を指示することができるという点である。例えば、扁桃は脳の奥深くに存在し、
うつ病および不安におけるＣＲＦの効果の媒介の中枢と考えられている。一旦扁
桃中のＣＲＦの選択的発現を調節する因子が同定されると、この領域中のＣＲＦ
のみに影響を与え且つ残りの他の部位（皮質、脳幹、心臓、視床下部）に影響を
与えないように標的化することができる。
【００１９】 本発明の目的のために、本発明者らは、ラットＣＲＦ2受容体遺伝子のプロモ
ーター領域をクローン化および同定した。この遺伝子のプロモーター領域は、Ｃ
ＲＦ2受容体が体内のどの場所に発現し、発症中のどの時間に発症するのかの同
定を担う。この領域はまた、受容体の発現程度を制御する。したがって、本発明
者らは、プロモーター領域が、上記の種々の精神病理学（うつ病、全身性不安、
対人不安、心的外傷後ストレス障害、およびパニック障害を含む）の治療用の薬
物開発の標的であると想定する。細胞中の遺伝子のプロモーター領域および／ま
たはチップベースのスクリーニングアッセイを使用して、プロモーター領域を変
化させてＣＲＦ2受容体の発現に影響を与える因子の同定法を開発することがで
きる。これらの因子は、種々の精神病理学の治療における有意な治療潜在能力を
有し得る。
【００２０】 Ｂ．ヒトＣＲＦ2受容体遺伝子 ヒトＣＲＦ2受容体の全遺伝子を含むクローンを、リサーチ・ジェネティック
ス（Research Genetics）（ハンツビル、アラバマ州）から得た。このＰＡＣク
ローン（ＲＰ５−１１４３Ｈ１９）は、ＣＲＦ2α、ＣＲＦ2β、およびＣＲＦ2
γ受容体の第１のエクソンおよび３つ全てのイソ型に共通の残りの１１エクソン
を含む１２７，４２５ｂｐのインサートを含んでいた（図１を参照のこと）。こ
のクローンは、ＣＲＦ2αのエクソン１の約４２，０００ｂｐ上流および最後の
エクソンの約３９，０００ｂｐ下流を含む。
【００２１】 Ｃ．ラットＣＲＦ2受容体遺伝子 ラットＣＲＦ2受容体遺伝子を、ストラタジーン（Stratagene）（ラホーヤ、
カリフォルニア州）から得たλＦＩＸ（登録商標）ＩＩ中で構築したスピローグ
−ドーリー・ラット・ゲノム・ライブラリーからクローン化した。ライブラリー
を、雄ラット（１６月齢）から得た腎臓ＤＮＡの部分的Ｓａｕ３ＡＩ消化物から
調製した。ライブラリーを、ｃＤＮＡの塩基１〜２６１に相当する（ゲンバンク
番号Ｕ１６２５３）ラットＣＲＦ2αｃＤＮＡの32Ｐ標識フラグメントで探索し
た（ティー．ダブリュー．ローベンベルグら（T.W.Lovenberg, et al.）、プロ
シーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オ
ブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proc. Natl. Acad. Sci. U SA ）、１９９５年、第９２巻、ｐ．８３６−８４０：ＰＮＡＳ５７）。得られた
１つのポジティブクローンをプラーク精製し、インサートをＮｏｔＩ消化によっ
て切り出し、ｐＧＥＭ−５Ｚｆ（＋）ベクター（プロメガ（Promega）、マディ
ソン、ウィスコンシン州）にサブクローン化した。無作為に分散させたプライマ
ー結合部位を使用するＧＰＳ−１ゲノム・プライミング・システム（ニュー・イ
ングランド・ビオラボズ（New England Biolabs）、ベヴァリー、マサチューセ
ッツ州）を使用して全インサートを配列決定した。
【００２２】 インサートは、１４，８９４ｂｐ長であると同定され、イントロン／エクソン
連結を、インサート配列のラットＣＲＦ2α（ゲンバンク番号Ｕ１６２５３）、
マウスＣＲＦ2β（ゲンバンク番号Ｕ２１７２９）、およびヒトＣＲＦ2γ（ゲン
バンク番号ＡＦ０１９３８１）ｃＤＮＡ配列との比較によって同定した。これに
より、クローンはＣＲＦ2αの第１のエクソンおよびＣＲＦ2βの第２のエクソン
（１ａ）を含むことが明らかとなった（図１）。クローンはまた、各イソ型に共
通のエクソン２を含んでいた。さらに、クローンは、ＣＲＦ2γの第１のエクソ
ンに対応する領域を含んでいた。しかし、これはエクソンとして機能するために
必要なコンセンサススプライス部位配列およびＡＴＧ翻訳開始部位を欠く。
【００２３】 Ｄ．ラットおよびヒトＣＲＦ2遺伝子配列の比較 本発明者らは、ラットＣＲＦ2ゲノムクローンに対応するヒトＣＲＦ2遺伝子領
域を同定した（図１を参照のこと）。ＣＲＦ2αのプロモーター領域は、ＣＲＦ2 α の第１のエクソンの上流に存在するが、第１のＣＲＦ2γエクソンの下流に存
在しない約４０００ｂｐの配列内に存在するはずである。本発明者らは、ゲネテ
ィックス・コンピュータ・グループ（ＧＣＧ）ウィスコンシン・パッケージ・バ
ージョン１０．０のＢｅｓｔＦｉｔプログラムを使用して、第１のＣＲＦ2αエ
クソンの最初の２０００ｂｐすぐ上流を含むこのフラグメントのサブ領域中のラ
ットおよびヒトのＣＲＦ2遺伝子配列を比較した。このギャップ作製ペナルティ
ーを４０に設定し、ギャップ伸長ペナルティーを２に設定した。分析により２つ
の配列は７０．４％同一であることが明らかとなった（図２を参照のこと）。マ
ウスおよびサル配列は共にそれぞれラットおよびヒトと比較して７０．４％を超
えて同一なようである。
【００２４】 転写因子結合部位は、転写因子が遺伝子調節に効果を発揮するように結合する
プロモーター領域に存在する短いＤＮＡ配列である。これらの部位は、他の系の
遺伝子に固有の発現特性を付与することが見出されており、ＣＲＦ2受容体遺伝
子の時間的および空間的調節に重要なようである。これらの部位はまた、遺伝子
の適切な発生発現および細胞特異的発現に最も重要なＣＲＦ2受容体プロモータ
ー領域である基本的プロモーターの強調に使用される。
【００２５】 潜在的な転写因子結合部位を同定するために、ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ ｖ
２．２（ケイ．ケイ．クヴァントら（K.K.Quandt, et al.）、ヌクレイック・ア
シッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、１９９５年、第２３巻、第２３号、
ｐ．４８７８−４８８４）、Ｔｒａｎｓｆａｃ ４．０脊椎動物行列を使用した
公的ドメインソフトウェア（ティー．ハインメイヤーら（T.Heinemeyer, et al. ）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、１９９９年、
第２７巻、第１号、ｐ．３１８−３２２）を使用してラットおよびヒト配列の両
方のＣＲＦ2αエクソン開始部位のすぐ２０００ｂｐの配列について分析した。
閾値を、コア類似性については１．０に、行列類似性については０．９に設定し
た。これにより、ヒトおよびラットＣＲＦ2αプロモーター領域中にそれぞれ１
５２および１４６個の潜在的転写因子結合部位が同定された。
【００２６】 任意の所与のプロモーター配列内に、多数の潜在的な転写因子結合部位が存在
する。これらのうち最終的に機能的関連性を有するものはほとんどない。２つの
異なる種由来の同一のプロモーター間の比較により、保存されているので遺伝子
の適切な機能に重要であるだろうエレメントを同定することができる。ヒトとラ
ットとの比較の結果により、２つの配列内の位置および方向について保存されて
いる５１個の推定結合部位が明らかとなった。これらの転写因子結合部位を、表
１に列挙する。表中の位置は、転写開始部位のすぐ上流の２０００ｂｐ内の配列
の位置を示す。これらの部位がラットおよびヒトの間で保存されているので、こ
れらの部位は重要な調節エレメントを構成し得ると考えられる。
【００２７】 Ｅ．ＣＲＦ2α受容体プロモーター構築物の調製 ＣＲＦ2α受容体の正確な時間的および空間的発現を付与するヒトおよびラッ
トＣＲＦ2α受容体遺伝子内の最小プロモーター・フラグメントを、ホタル・ル
シフェラーゼ（ｐＧＬ３−ベーシック、プロメガ、マディソン、ウィスコンシン
州）またはレポーターとしての増強緑色蛍光タンパク質（クロンテック、パロア
ルト、カリフォルニア州）のいずれかを含む発現ベクターにサブクローン化する
。
【００２８】 ｉ．ヒトＣＲＦ2α受容体プロモーター ＣＲＦ2α遺伝子のプロモーター領域に対応するフラグメントを得るために、
最初に中間ベクターｐＲＬ−ヌル（プロメガ、マディソン、ウィスコンシン州）
にサブクローン化し、その後細胞のトランスフェクションに使用するレポーター
構築物にサブクローン化する必要があった。ＣＲＦ2α受容体のプロモーター領
域に対応するヒトＣＲＦ2α遺伝子の４０４０ｂｐフラグメント（図１を参照の
こと）を、制限酵素ＮａｒＩおよびＮｄｅＩで切り出した。フラグメントを、同
一の２つの酵素で消化したベクターｐＲＬ−ヌルにサブクローン化した。このイ
ンサートを、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩを使用してｐＲＬ−ヌル構築物から取り
出し、同一の２つの酵素で消化したｐＥＧＦＰ−１ベクターにサブクローン化し
た。本発明者らは、このフラグメントをルシフェラーゼ・レポーターｐＧＬ−３
ベーシック（プロメガ）にサブクローン化した。インサートを、ＥｃｏｌｃＲＩ
およびＳａｌＩを使用してｐＲＬＲＶＩから取り出し、ＳｍａＩおよびＸｈｏＩ
で消化したｐＧＬ３−ベーシックに挿入した。
【００２９】 本発明者らは、本発明者らの配列比較において最初の２０００ｂｐに注目し、
ラットとヒトの配列間で７０．４％の同一性を見出した。本発明者らは配列の４
０４０ｂｐを含むフラグメントを試験したにもかかわらず、５’末端から欠失し
たより小さなフラグメントが基本プロモーターとして機能することを知っている
。推定転写開始点（ＴＳＰ）の３６ｂｐ下流で終結する共通の逆方向（３’）プ
ライマーを使用して、本発明者らは、いくつかの正方向（５’）プライマーを使
用したＰＣＲによってＣＲＦ2αプロモーター領域のより小さなフラグメントを
連続的に作製した。作製された構築物は、ＴＳＰに関する−３８９８、−３４０
６、−２８８３、−２３４６、−１３７５、−８４０、および−３４６から＋３
６ｂｐまで（それぞれ、−３８９８、−３４０６、−２８８３、−２３４６、−
１３７５、−８４０、および−３４６構築物という）であった。本発明者らの目
的は、いくつかの例では５００ｂｐよりも短いことが示されている基本プロモー
ターを定義することである。
【００３０】 ｉｉ．ラットＣＲＦ2α受容体プロモーター ラットＣＲＦ2α受容体のプロモーター領域に対応する４６９３ｂｐフラグメ
ント（図１を参照のこと）を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｒＢＩでの消化によっ
て得た。これを、ｐＥＧＦ−１ベクターのＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｍａＩ部位に
サブクローン化した。このフラグメントを、ルシフェラーゼ・レポーターｐＧＬ
−３ベーシック（プロメガ）にもサブクローン化した。ラットＣＲＦ2αプロモ
ーターのより小さなフラグメントを作製するために、ヒトＣＲＦ2αプロモータ
ー用に記載のものと同一のストラテジーを使用する。
【００３１】
【表１】
【００３２】 Ｆ．トランスフェクション細胞株の産生 実施態様の１つは、本発明は、トランスフェクション細胞株である。このよう
な細胞株の１つの好ましい作製法を以下に記載する。ホタル・ルシフェラーゼ遺
伝子の上流に位置付けたヒトまたはラット・プロモーター・フラグメントを含む
上記の構築物を使用して、固定細胞株をトランスフェクションする。リポフェク
タミン２０００（ライフ・テクノロジー、ロックヴィル、メリーランド州）を使
用して、構築物をＣＨＯ−Ｋ１およびＡ７Ｒ５細胞株にトランスフェクションす
る。中枢神経系の初代培養物およびさらなる固定細胞株もまた、これらのトラン
スフェクションに適切である。トランスフェクション効率を制御するために、細
胞を、ｐＲＬ−ＴＫベクター（プロメガ、マディソン、ウィスコンシン州）にも
同時トランスフェクションする。ｐＲＬ−ＴＫベクターは、単純ヘルペス・ウイ
ルス・チミジン・キナーゼ・プロモーター（低レベル〜中程度のレベルの発現が
得られるプロモーター）のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子下流を含む。タ
ンパク質抽出を標準化するために、ＢＣＡアッセイ（ピアス、ロックフォード、
イリノイ州）を使用して総タンパク質について細胞溶解物をアッセイする。標準
化した量の細胞抽出物由来のレポーター遺伝子発現レベルを、照度計（イー・ジ
ー・アンド・ジー・ウォーラック、ゲーサーズバーグ、メリーランド州）および
二重ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ・システム（プロメガ、マディソン
、ウィスコンシン州）を使用したルシフェラーゼ活性の測定によって定量する。
ホタル・ルシフェラーゼ活性は、ＣＲＦ2α受容体プロモーター活性を反映し、
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性を使用して実験データを標準化する。
【００３３】 Ｇ．ＣＲＦ2α受容体プロモーターフラグメントの基礎発現の特徴づけ 上記の方法を使用して、レポーター遺伝子発現についてＣＨＯ−Ｋ１培養物の
一過性トランスフェクションをアッセイした（図３を参照のこと）。これらの実
験では、４つの基本コントロールを利用した。「空」と名づけた培養物はいかな
る構築物もトランスフェクションしなかった。空培養物を、ＣＨＯ−Ｋ１培養物
のバックグラウンド発光を示すのに使用した。ｐＧＬ−３ベーシックと名づけた
培養物に、実験プロモーターを含まないｐＧＬ−３ホタル・ルシフェラーゼ・レ
ポーター構築物およびｐ−ＲＬ−ＴＫベクターをトランスフェクションした。こ
れらの培養物は、非常に低いレベルの発現を示し、ネガティブ・コントロールと
見なすことができる。ｐＧＬ−３コントロールと名づけた培養物に、ＳＶ４０ウ
イルス・プロモーターのホタル・ルシフェラーゼ・レポーター下流を含む構築物
およびｐＲＬ−ＴＫベクターをトランスフェクションした。これらの培養物は、
非常に高レベルの発現を示すはずであり、ポジティブ・コントロールと見なすこ
とができる。最後に、無関係ＤＮＡと名づけた培養物に、ホタル・レポーター遺
伝子のＤＮＡ配列上流の１９１６ｂｐＤＮＡを含む構築物およびｐＲＬ−ＴＫベ
クターでトランスフェクションした。この構築物の１９１６ｂｐは、無作為ＤＮ
Ａ配列であり、最後の２１ｂｐのほとんどの３’が本発明者らの推定プロモータ
ー構築物と同一であった。これらの培養物は、本発明者らの構築物の特異性を示
すと見なした。
【００３４】 本発明者らの結果は、−３４０６構築物は、ＣＲＦ2αプロモーター構築物の
最も高い発現レベルを有することを示す（図３を参照のこと）。発現レベルは、
一般に、プロモーターの長さが短くなるにつれて減少し、−３４６構築物で最小
となる。一元配置ＡＮＯＶＡにより、構築物間の有意差は、（Ｆ（１０，８３）
＝８６４、Ｐ＜０．００１）であることが明らかとなった。値のボンフェロニ／
ダン調整を使用した多重比較分析により、−３４０６構築物はｐＧＬ３−ベーシ
ックおよびｐＧＬ３コントロール構築物と有意に異なり（共にＰ＜．００１）、
−３４６構築物はまたｐＧＬ３−ベーシックおよびｐＧＬ３コントロール構築物
と有意に異なる（共にＰ＜．００１）ことが示される。平均試験により、本発明
者らの最も低レベルの発現（−３４６構築物）は、ハウスキーピング発現レベル
（ｐＧＬ−３ベーシック）より１４１％高いようであり（平均−３４６＝０．２
２２±．００８、平均ｐＧＬ３ベーシック＝．０９２±．００４）、これらはウ
イルスプロモーター（ｐＧＬ−３コントロール）によって惹起された強力発現の
８％である（平均−３４６＝０．２２２±．００８、平均ｐＧＬコントロール＝
２．８７８±．０４１）ことが示される。本発明者らの最も高い発現レベル（−
３４０６構築物）は、ハウスキーピング発現レベル（ｐＧＬ−３ベーシック）よ
り１２４２％高いようであり（平均−３４０６＝１．２２９±．０４２、平均ｐ
ＧＬ３ベーシック＝．０９２±．０．００４）、これらはＳＶ４０プロモーター
（ｐＧＬ−３コントロール）由来の強力発現の４３％である（平均−３４０６＝
１．２２９±０．４２、平均ｐＧＬコントロール＝２．８７８±．０４１）。さ
らに、無関係のヒト染色体ＤＮＡ配列は、バックグラウンドを超える発現を駆動
することができなかった。全てのＣＲＦ2αプロモーター構築物が有効に機能す
るので、これらを使用して所与の候補薬物の効果を担うプロモーター配列を単離
することができる。所与の候補薬物を含むか含まない構築物の発現と処理してい
るかしていない他の構築物の発現との比較により、所与の候補薬物の効果に関連
する正確なプロモーター領域を同定することができる。したがって、ＣＲＦ2α
プロモーター構築物はＣＲＦ2α特異的転写をモニターするように機能する適切
なツールのようである。
【００３５】 Ｈ．トランスジェニックマウスの産生 別の実施態様では、本発明は、コルチコトロピン放出ホルモン受容体ＣＲＦ2
αの異種プロモーター配列を含むトランスジェニック・マウスである。１つの好
ましい実施態様では、トランスジェニック・マウスを以下のようにして作製する
。本発明者らの細胞培養モデルで一旦潜在的な治療薬が同定されると、トランス
ジェニック動物におけるＣＲＦ2受容体プロモーター活性を変化させる能力を試
験する。増強緑色蛍光タンパク質の上流に存在する基本ＣＲＦ2α受容体プロモ
ーターからなるレポーター構築物を使用して、トランスジェニック・マウスを作
製する。増強緑色蛍光構築物の作製手順は既に記載されており、βガラクトシダ
ーゼ構築物の作製手順は、ホタル・ルシフェラーゼ構築物の作製に使用した手順
と同一であった。これらの動物により、ＣＲＦ2α受容体プロモーターの適切な
空間的および時間的発現を確認することができる。
【００３６】 レポーター構築物は、上記の構築物と同一であり、好ましくはＥＧＦＰまたは
βガラクトシダーゼのコード領域と融合した４０４０ｂｐのヒトＣＲＦ2α受容
体プロモーターまたは４６９３ｂｐのラットＣＲＦ2α受容体プロモーターから
なる。標準的な技術を使用して、トランスジェニック動物を作製する。好ましい
技術は、受精卵の雄性前核への１００コピーのプロモーター−レポーター構築物
の微量注入法を含む。注入された卵を、偽妊娠雌に移植し、これらの移植片由来
の子孫を、ＣＲＦ2α受容体プロモーター−レポーター構築物（「導入遺伝子」
と呼ぶ）の存在について試験した。導入遺伝子を含む動物を、少量の尾組織から
のＤＮＡの抽出およびこのＤＮＡの哺乳動物では通常見出されないＥＧＦＰまた
はβガラクトシダーゼ遺伝子セグメントでの探索によって同定する。ＣＲＦ2α
受容体プロモーター−レポーター導入遺伝子を含む動物を、トランスジェニック
株が確立されるように正常な動物と交配する。好ましくは、ゲノム内の３つの異
なる部位中に導入遺伝子を含む３つのトランスジェニック株を作製する。この方
法では、認められた発現パターンが本発明者らのプロモーター・セグメント由来
のＥＧＰＦまたはβガラクトシダーゼ発現の結果であり、部位挿入効果によるも
のではないことが証明される。
【００３７】 ＣＲＦ2α受容体プロモーター−レポーター導入遺伝子の適切な機能および発
現を確認するために、以下を行うことが好ましい。脳組織切片を後期胚発生の初
めおよび成体（出産６０日目）まで５日間隔でトランスジェニック動物から採取
する。次いで、切片を、それぞれ４８８ｎｍの光または４２０ｎｍの光下で観察
して、ＥＧＦＰまたはβガラクトシダーゼを発現する脳細胞を同定する。レポー
ターの発現パターンを、正常なＣＲＦ2α受容体の発現パターンと比較する。Ｃ
ＲＦ2α受容体プロモーター導入遺伝子発現は、時間的（すなわち、ＣＲＦ2α受
容体が最初に発現した時に発現を開始する）および空間的（すなわち、導入遺伝
子の発現はＣＲＦ2α受容体を正常に発現する中隔および視床下部腹内側部内の
細胞に限定される）に内因性ＣＲＦ2α受容体遺伝子の発現と重複するはずであ
る。
【００３８】 Ｉ．形質転換細胞株およびトランスジェニック動物の使用 レポーター構築物と融合したＣＲＦ2α受容体プロモーター領域でトランスフ
ェクションした細胞が潜在的治療薬であるかを試験する。薬理学的関連量の候補
小分子を培地中のトランスフェクション細胞にアプライし、これらの分子のレポ
ーター遺伝子発現レベルに対する影響を、上記方法によって評価する。これらの
実験を少なくとも１０回複製し、発現において統計的有意差が得られる任意の小
分子を陽性結果と見なす。特定の候補薬物での治療後のレポーターの発現レベル
は、薬物がＣＲＦ2α受容体活性である程度の同定が可能である。
【００３９】 ＣＲＦ2αプロモーター−レポーター活性の発現を増加させる候補薬物を、さ
らにインビボで試験することができる。トランスジェニック動物を候補薬物で治
療して、ＣＲＦ2αプロモーター−レポーター導入遺伝子レベルが細胞株中で見
出されたレベルと同一の様式および程度で上昇するかどうかを同定する。逆の薬
物効果を、これらの動物を使用して同定することもできる。
【００４０】 薬物がインビボで同様の挙動を示し、且つ有意な毒性の兆候がない場合、抗う
つまたは抗不安活性を示すと予想される薬物を種々の動物モデルで試験すること
ができる。候補がこれらの試験で活性である場合、うつ病などの精神病に対する
治療薬として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ラットおよびヒトＣＲＦ2ゲノムクローンを示す図である。
【図２】 図２は、ラットおよびヒトＣＲＦ2α受容体遺伝子のプロモーター領域の比較
を示す図である。
【図３】 図３は、ＣＲＦ2αプロモーターフラグメントの基本発現を示す棒グラフであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ローズブーム， パトリック エイチ． アメリカ合衆国 53711 ウイスコンシン マデイソン メドウッド ドライブ 5801 (72)発明者 ランドリー， チャールズ エフ． アメリカ合衆国 53711 ウイスコンシン フィッチバーグ スパークル ストーン クレセント 5538 (72)発明者 ナンダ， スティーブン エイ． アメリカ合衆国 53719 ウイスコンシン マデイソン フラッグシップ ドライブ 7206 アパートメント ３ Ｆターム(参考） 2G045 AA29 AA40 BB20 CB01 CB17 DA12 DA13 DA14 DA36 4B024 AA11 AA20 BA08 BA80 CA01 CA02 DA02 EA04 FA02 GA11 GA13 HA11 HA20 4B063 QA01 QA05 QA13 QQ21 QQ22 QQ41 QQ42 QQ43 QQ53 QQ61 QQ79 QQ89 QR08 QR32 QR35 QR40 QR42 QR55 QR58 QR62 QR72 QR77 QR80 QS25 QS31 QS32 QS34 QS36 QX01 QX02 4B065 AA90X AA90Y AA91X AA91Y AA93Y AB01 AC14 BA01 BA02 BA05 CA24 CA28 CA46

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）レポーター遺伝子に作動可能に連結した異種ＣＲＦ2
    α受容体のプロモーター配列をコードする核酸配列を含む細胞株または生物を得
    る工程、及び （ｂ）前記細胞または生物に試験因子を移入し、前記因子が前記細胞株または
    生物に移入されていないコントロール細胞株または生物と比較して前記レポータ
    ー遺伝子産物の発現を評価する工程 からなることを特徴とする、ＣＲＦ2α受容体のプロモーター領域の活性を変化
    させる因子の同定法。
  2. 【請求項２】 前記ＣＲＦ2α受容体がラット受容体であることを特徴とす
    る、請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 前記ＣＲＦ2α受容体がヒト受容体であることを特徴とする
    、請求項１の方法。
  4. 【請求項４】 前記ＣＲＦ2α受容体プロモーター領域が、前記ラットＣＲ
    Ｆ2α受容体の転写開始部位上流の４６９３ｂｐを含むことを特徴とする、請求
    項２の方法。
  5. 【請求項５】 前記プロモーター領域が、前記ラットＣＲＦ2α受容体−４
    ６９３ｂｐ上流プロモーターの欠失フラグメントを含み、前記フラグメントが前
    記−４６９３ｂｐ上流プロモーターと比較して少なくとも５０％の転写駆動能力
    を保持していることを特徴とする、請求項２の方法。
  6. 【請求項６】 前記ＣＲＦ2α受容体プロモーター領域が、前記ヒトＣＲＦ2 α 受容体の転写開始部位上流の４０３１ｂｐを含むことを特徴とする、請求項２
    の方法。
  7. 【請求項７】 前記ＣＲＦ2α受容体プロモーター領域が、前記ヒトＣＲＦ2 α 受容体の転写開始部位上流の少なくとも３８９８ｂｐを含むことを特徴とする
    、請求項２の方法。
  8. 【請求項８】 前記ＣＲＦ2α受容体プロモーター領域が、前記ヒトＣＲＦ2 α 受容体の転写開始部位上流の少なくとも３４０６ｂｐを含むことを特徴とする
    、請求項２の方法。
  9. 【請求項９】 前記ＣＲＦ2α受容体プロモーター領域が、前記ヒトＣＲＦ2 α 受容体の転写開始部位上流の少なくとも１３７５ｂｐを含むことを特徴とする
    、請求項２の方法。
  10. 【請求項１０】 前記ＣＲＦ2α受容体プロモーター領域が、前記ヒトＣＲ
    Ｆ2α受容体の転写開始部位上流の少なくとも８４０ｂｐを含むことを特徴とす
    る、請求項２の方法。
  11. 【請求項１１】 前記ＣＲＦ2α受容体プロモーター領域が、前記ヒトＣＲ
    Ｆ2α受容体の転写開始部位上流の少なくとも３４６ｂｐを含むことを特徴とす
    る、請求項２の方法。
  12. 【請求項１２】 前記ＣＲＦ2α受容体プロモーター領域が、前記ヒトＣＲ
    Ｆ2α受容体の転写開始部位上流の少なくとも２３４６ｂｐを含むことを特徴と
    する、請求項２の方法。
  13. 【請求項１３】 前記ＣＲＦ2α受容体プロモーター領域が、前記ヒトＣＲ
    Ｆ2α受容体の転写開始部位上流の少なくとも２８８３ｂｐを含むことを特徴と
    する、請求項２の方法。
  14. 【請求項１４】 細胞株が、レポーター遺伝子に作動可能に連結された異種
    ＣＲＦ2α受容体プロモーターをコードする核酸配列を含む構築物で形質転換さ
    れていることを特徴とする、形質転換細胞株。
  15. 【請求項１５】 前記細胞株が、ラットＣＲＦ2α受容体プロモーターを含
    む構築物で形質転換されていることを特徴とする、請求項１４の形質転換細胞株
    。
  16. 【請求項１６】 前記細胞株が、ヒトＣＲＦ2α受容体プロモーターを含む
    構築物で形質転換されていることを特徴とする、請求項１４の形質転換細胞株。
  17. 【請求項１７】 前記ＣＲＦ2α受容体プロモーターが、前記ヒトＣＲＦ2α 受容体の転写開始部位上流の少なくとも３４０６ｂｐを含むことを特徴とする、
    請求項１６の細胞株。
  18. 【請求項１８】 前記ＣＲＦ2α受容体プロモーターが、前記ヒトＣＲＦ2α 受容体の転写開始部位上流の少なくとも３４６ｂｐを含むことを特徴とする、請
    求項１６の細胞株。
  19. 【請求項１９】 動物が、レポーター遺伝子に作動可能に連結された異種Ｃ
    ＲＦ2α受容体プロモーターをコードする核酸配列でトランスフェクションされ
    ていることを特徴とする、トランスジェニック動物。
  20. 【請求項２０】 （ａ）細胞株または生物がレポーター遺伝子に作動可能に
    連結された異種ＣＲＦ2α受容体のプロモーター配列のフラグメントをコードす
    る核酸配列を含む構築物を含み、複数種の細胞株または生物が様々なフラグメン
    トを含む構築物を含む、複数種の細胞株または生物を得る工程、 （ｂ）前記細胞またはトランスジェニック動物に試験因子を移入し、前記因子
    が前記細胞株またはトランスジェニック動物に移入されていないコントロール細
    胞株またはトランスジェニック動物と比較して前記レポーター遺伝子産物の発現
    を評価する工程、 （ｃ）前記複数種の構築物由来のレポーター遺伝子の発現を比較する工程、及
    び （ｄ）前記試験因子と相互作用するフラグメントを含む構築物を同定する工程
    からなることを特徴とする、ＣＲＦ2α受容体プロモーターのどの領域が試験因
    子と相互作用するかを決定する方法。
JP2001580188A 2000-05-02 2001-04-30 コルチコトロピン放出因子受容体ＣＲＦ２αのプロモーター配列の活性を変化させる因子の同定法 Pending JP2003531601A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US20112900P 2000-05-02 2000-05-02
US60/201,129 2000-05-02
PCT/US2001/013920 WO2001083563A2 (en) 2000-05-02 2001-04-30 Method of identifying agents that alter the activity of the promoter sequence for crf receptor 2-alpha

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003531601A true JP2003531601A (ja) 2003-10-28

Family

ID=22744599

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001580188A Pending JP2003531601A (ja) 2000-05-02 2001-04-30 コルチコトロピン放出因子受容体ＣＲＦ２αのプロモーター配列の活性を変化させる因子の同定法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20020032912A1 (ja)
EP (1) EP1279038B1 (ja)
JP (1) JP2003531601A (ja)
AT (1) ATE283480T1 (ja)
AU (1) AU2001295192A1 (ja)
CA (1) CA2407834A1 (ja)
DE (1) DE60107413D1 (ja)
WO (1) WO2001083563A2 (ja)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5965790A (en) * 1997-03-06 1999-10-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. SR-BI regulatory sequences and therapeutic methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
AU2001295192A1 (en) 2001-11-12
EP1279038B1 (en) 2004-11-24
DE60107413D1 (de) 2004-12-30
US20020032912A1 (en) 2002-03-14
EP1279038A2 (en) 2003-01-29
WO2001083563A3 (en) 2002-07-04
CA2407834A1 (en) 2001-11-08
ATE283480T1 (de) 2004-12-15
WO2001083563A2 (en) 2001-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Serafini et al. Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system
Yoshihara et al. OCAM: a new member of the neural cell adhesion molecule family related to zone-to-zone projection of olfactory and vomeronasal axons
Welle et al. Muscle growth after postdevelopmental myostatin gene knockout
DE60314236T2 (de) Verfahren zur diagnose und therapie von schizophrenie
Zerucha et al. A highly conserved enhancer in the Dlx5/Dlx6Intergenic region is the site of cross-regulatory interactions betweenDlx genes in the embryonic forebrain
Morkin Regulation of myosin heavy chain genes in the heart.
Kobayashi et al. HRG4 (UNC119) mutation found in cone–rod dystrophy causes retinal degeneration in a transgenic model
Rawson et al. Expression of mRNAs encoding for two different olfactory receptors in a subset of olfactory receptor neurons
Lazartigues et al. Brain-selective overexpression of angiotensin (AT1) receptors causes enhanced cardiovascular sensitivity in transgenic mice
AU691469B2 (en) DNA encoding taurine and gaba transporters and uses thereof
JPH09509314A (ja) 神経ペプチドｙ／ペプチドｙｙ（ｙ２）受容体をコードした核酸、及び該核酸の使用
CA2428754A1 (en) Corticotropin releasing factor receptor 2 deficient mice and uses thereof
AU780829B2 (en) Corticotropin releasing factor receptor 2 deficient mice and uses thereof
DE69722035T2 (de) Neue testmethode, um den differenzierungszustand von bauchspeicheldrüsenzellen eines säugetieres festzustellen.
Szczygieł et al. Gene therapy vector encoding neuropeptide Y and its receptor Y2 for future treatment of epilepsy: preclinical data in rats
Bullock et al. Lysosomal storage disease associated with a CNP sequence variant in Dalmatian dogs
JP2002503460A (ja) 創傷治癒のための組成物および方法
JP2003513645A (ja) メラノコルチン−３レセプター欠失細胞、非ヒトトランスジェニック動物及び体重を調節する化合物の選択方法
AU729532B2 (en) Melatonin 1a receptor gene regulatory regions and uses thereof
JP2003531601A (ja) コルチコトロピン放出因子受容体ＣＲＦ２αのプロモーター配列の活性を変化させる因子の同定法
US5559021A (en) DNA encoding a novel mammalian transporter homologous to neurotransmitter transporters and uses thereof
Kim et al. The promoter of brain-specific angiogenesis inhibitor 1-associated protein 4 drives developmentally targeted transgene expression mainly in adult cerebral cortex and hippocampus
AU730141B2 (en) Transgenic animals with disrupted npy y1 receptor genes
Roosa et al. Structure, biological activity of the upstream regulatory sequence, and conserved domains of a middle molecular mass neurofilament gene of Xenopus laevis
US7531356B2 (en) Promoter sequences for corticotropin releasing-factor receptor CRF2α and method of identifying agents that alter the activity of the promoter sequences