JP2003529769A

JP2003529769A - 神経組織の損傷の検出

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Publication number: JP2003529769A
Application number: JP2001572877A
Authority: JP
Inventors: プライス，ジャック
Original assignee: Kings College London
Current assignee: Kings College London
Priority date: 2000-03-30
Filing date: 2001-03-30
Publication date: 2003-10-07
Also published as: EP1269197A2; US20030152962A1; CA2403779A1; GB0007778D0; AU4263901A; WO2001075452A2; WO2001075452A9; WO2001075452A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、神経毒性学および神経病理学の分野での診断に関し、より詳細には、神経組織に対する損傷の領域を可視化することに関する。詳細には、本発明は、神経学的損傷のマーカーとしてＳＣＩＰを使用することに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、神経毒性学および神経病理学の分野での診断に関し、そしてより詳
細には、神経細胞および／または神経組織の損傷の領域を可視化することに関す
る。

【０００２】神経細胞および／または神経組織に対する損傷の検出は、薬物の毒性について
試験する（すなわち、薬物の神経毒性を決定する）場合に、および神経病理学の
存在を決定する場合に、重要である。

【０００３】薬物の毒性試験においては、試験化合物が中枢神経系に対して何らかの有害な
影響を及ぼすかどうかを決定することが必要である。この決定は、いくつかの構
成部分を有する：第１に、化合物が血液−脳関門を通過するか（cross）どうか
という問題であり、通過するのであれば、その化合物が毒性の効果を有するかど
うかという問題であり；第２には、脳または中枢神経系内のどの部位で何らかの
毒性の効果が局在化しているのかを決定しなければならず；第３には、どれくら
いの用量の化合物がその効果を生じるか、およびどれくらいの用量が安全である
かである。

【０００４】培養物中における神経細胞についての研究は、毒性効果および用量効果につい
ての一定の一般化されたデータを与え得るが、従来は、これらの問題は、行動学
的研究（behavioural studies）を使用して（しばしば、Ｉｒｗｉｎプロフィー
ルの形態で）研究されている。動物に注射する化合物の用量を漸次増加し、次い
で、食餌、睡眠、運動などに関係しているパラメーター全体を観察し、そして評
価する。これらのアッセイは、遅く、手段が厳しすぎ、さらに解釈が困難である
という欠点を有する。

【０００５】神経病理学の存在を決定する場合の問題は、その部位での損傷に関する特異的
なマーカーが入手可能ではない場合に、脳の損傷または疾患の領域をどのように
認識するかということである。いくつかの障害（損傷、疾患など）は、非常に特
異的な病理学的な特徴によって特徴付けられる。例えば、アルツハイマー病を特
徴付けるリン酸化されたＴａｕ、神経原線維のもつれ、およびパーキンソン病を
特徴付けるドーパミン作動性神経細胞の枯渇である。しかし、多くの障害に関し
てはこのようなマーカーがなく、その結果として障害を定義することが困難とな
っている。このような障害の一例は、前頭葉痴呆症である。これは、（アルツハ
イマー病についての４０％と比較して）全ての痴呆症のおそらく１０％の原因で
あるが、この病因は、病理学が十分に定義されていないので、１つの障害として
登録されることはほとんどない。別の例は、精神分裂病に関するものであり、こ
こでは、ほとんど疑いのないいくつかの神経病理学が存在する。にもかかわらず
、定義があまりにも不十分であり、有用な基準であると認めることは困難である
。

【０００６】精神分裂病は、それらの病因の大部分が不明である脳の疾患であるが、１つの
現在の仮説は、障害の発端は、生命の初期にあり、おそらく、胎児期の脳の発達
の間にあるというものである。この「神経発達仮説」は、脳の異常が、生命の初
期に存在しつつも、後期青年期または初期成人期までは、それ自体は臨床的には
完全には明らかにならないことを示唆する。この仮説は、疾患の神経病理学およ
び疫学の研究から発展し、そしてより最近の画像研究によって支持されている。
これらの画像研究は、精神分裂症患者の脳室の肥大、ならびに前頭葉および側頭
葉の構造的な異常を実証した。このことは、一般的には、精神分裂症の脳の側頭
葉および前頭葉の異常に関する神経病理学的報告と一致する。病理学的な研究は
また、皮質の発達において微妙な異常が存在し得ることを示す。神経膠腫を伴わ
ない細胞構築の異常に関する知見は、精神分裂症が発育障害であるという証拠と
して受け取られている。それにもかかわらず、病理学的な知見は、それらの変異
性、および精神分裂症患者において観察される前述したマーカーの変化が微妙で
あることによって、主に特徴付けられている。

【０００７】脳の発達期におけるＰＯＵドメインの転写因子の発現の研究によると、ＳＣＩ
Ｐ（抑制されたｃＡＭＰ誘導性ＰＯＵ）と呼ばれ、Ｏｃｔ−６およびＴｓｔ−１
としてもまた公知である、特定の転写因子が、発達期の特定の脳細胞集団におい
て発現されることを見出している。ＳＣＩＰは、胚性幹（ＥＳ）細胞およびマウ
スの内部細胞塊中で発現され、発達に関して重要な役割を有するようである（Su
zuki他、EMBO, 1990;9:3723-3732およびMeijer他、Nucleic Acids Res.,1990;18
:7357-65）が、その最も特徴的な役割は、それが末梢神経系でのＳｃｈｗａｎｎ
細胞の発達において果たされ、ここで、髄鞘形成の開始を適宜調節することであ
る（Bermingham他、Genes Dev., 1996;15:1751-62）。

【０００８】げっ歯類の終脳の発達においては、ＳＣＩＰは、神経細胞が、有糸分裂して、
皮質のプレート（胚性の皮質灰白質）中のそれらの最終的な位置に移動すると発
現する。これは、ＳＣＩＰは、神経細胞が最初にそれらの神経細胞の本質および
軸索突起を確立し始める間に、そして神経細胞がそれらの最終的な皮質層を見出
す間に、発現することを意味する。出生後の脳においては、ＳＣＩＰの発現はほ
とんどなくなるが、層５における神経細胞、大脳皮質の２／３における神経細胞
、および海馬のＣＡ１領域の特定の特異的な亜集団によって発現が維持される（
Frantz他、J. Neurosci., 1994;14:472-485）。神経細胞の発達におけるＳＣＩ
Ｐの役割は知られていないが、その発現のタイミングを考慮すると、これが神経
細胞の亜型の本質を確立することにおいて役割を果たし得ることが示唆される。

【０００９】現在、正常な成体の脳は最少レベルのＳＣＩＰタンパク質を発現することが発
見されているが、脳が損傷を受けている場合には、ＳＣＩＰは損傷部位の神経細
胞によって有意なレベルで発現することが知られている。このことは、障害物質
（damaging agent）の性質にかかわらずあてはまるようである。この現象は、例
えば、限局性皮質形成異常および精神分裂症によって損傷したヒトの脳において
、ならびに物理的な外傷、癲癇による電気活性、または虚血によって損傷したげ
っ歯類の脳において、実証されている。したがって、ＳＣＩＰは、神経組織の損
傷のマーカーとして使用され得る。さらに、ＳＣＩＰの発現は安定であるようで
ある。いったんＳＣＩＰが損傷に応答して発現すると、これは、何ヶ月もの間、
またはなお何年もの間、発現されたままになる。

【００１０】薬物の神経毒性を迅速にそして容易に決定するための方法が、および神経学的
損傷（特に、それについてのマーカーが定義されていない神経学的損傷）の存在
を決定するための方法が、当該分野で必要とされている。

【００１１】本発明は、神経学的損傷のマーカーとしてＳＣＩＰを使用することを提供する
。

【００１２】本発明は、神経学的損傷を検出する方法を提供する。この方法は、神経細胞お
よび／または神経組織中でのＳＣＩＰ遺伝子の発現についてアッセイすることを
含む。神経細胞および／または神経組織中でのＳＣＩＰの発現レベルの上昇が神
経学的損傷の存在を示す。

【００１３】成体の神経細胞および／または神経組織（特に、脳）が最少レベルのＳＣＩＰ
タンパク質を発現することが見出されているが、神経細胞および／または神経組
織が損傷されている場合には、ＳＣＩＰの発現レベルが障害物質の性質とは無関
係に、損傷部位の神経細胞によって増大することが見いだされている。発現レベ
ルの増大は、ＳＣＩＰをコードするｍＲＮＡまたはＳＣＩＰタンパク質の、標準
的なアッセイ技術（例えば、標識されたポリヌクレオチドを使用するインサイチ
ューハイブリダイゼーション、または標識された抗体分子を使用する免疫組織化
学）により、容易に検出される。ＳＣＩＰの発現のレベルは、ｍＲＮＡまたはＳ
ＣＩＰタンパク質のレベルによって測定される場合には、損傷していない対応す
る神経細胞および／または神経組織中でのレベルと比較して、少なくとも５０％
、より好ましくは少なくとも１００％増大するのが好ましい。したがって、神経
組織中でのＳＣＩＰ遺伝子の発現をアッセイすることによって、神経学的損傷が
存在しているかどうかを決定することが可能である。

【００１４】用語「神経学的損傷」は、脳および中枢神経系を含む神経系の任意の損傷をい
う。好ましくは、この用語は、脳に対するいずれもの損傷を意味する。損傷は、
不慮の事故によって、または物理的な損傷、虚血性障害、発育障害、または急性
の神経毒性障害によって生じた損傷を含む疾患によって、引き起こされ得る。神
経学的損傷の例として、神経細胞の減少を導く神経細胞の細胞傷害性損傷、神経
細胞の突起および髄鞘形成の減少を導く軸索または樹状突起に対する損傷、神経
膠細胞の増殖、瘢痕化、および細胞毒性の応答を導く神経系の炎症が挙げられる
。神経学的損傷のさらなる例として、精神分裂症、または前頭葉痴呆症、および
癲癇のような、精神医学的または神経退行性の障害が挙げられる。神経学的損傷
はまた、例えば、強力な毒性薬剤の注射を含む毒性学の研究において、損傷が意
図的に誘導されている動物内にあり得る。

【００１５】用語「ＳＣＩＰ遺伝子」は、ヒト、マウス、ラットのＳＣＩＰ遺伝子、ＳＣＩ
Ｐ遺伝子と機能的に等価な任意の他のホモログまたはＳＣＩＰ遺伝子の突然変異
体を指す。ヒトのＳＣＩＰ遺伝子の配列は、受入番号ＮＭ００２６９９（Ｇｅ
ｎｅｂａｎｋ）を有しており、Monuki他、Science, 249, 1300-1309, 1990に記
載されている。ラットのＳＣＩＰ遺伝子は、受入番号Ｍ７２７１１（Ｇｅｎｅｂ
ａｎｋ）を有しており、Kuhn他、Mol. Cell. Biol, 11, 4642-4650, 1991に記載
されている。マウスのＳＣＩＰ遺伝子の配列は、受入番号Ｍ８８３０２（Ｇｅｎ
ｅｂａｎｋ）を有しており、Hara他、PNAS USA, 89, 3280-3284, 1992に記載さ
れている。ヒトのＳＣＩＰ遺伝子とげっ歯類のＳＣＩＰ遺伝子との間には大きな
相同性があり、ヒトの配列はマウスおよびラットの配列に対して９８．８％の相
同性がある。

【００１６】用語「天然のＳＣＩＰ遺伝子と機能的に等価なホモログおよび天然のＳＣＩＰ
遺伝子の突然変異体」は、ヒトのＳＣＩＰ遺伝子の配列と少なくとも８０％の配
列相同性を有し、かつ神経学的損傷の部位で発現される任意のヌクレオチド配列
を指す。好ましくは、ＳＣＩＰ遺伝子は、ヒトのＳＣＩＰ遺伝子と少なくとも９
０％の配列相同性を有し、かつ神経学的損傷の部位で発現される。

【００１７】用語「ＳＣＩＰタンパク質」は、本明細書中で使用される場合には、上記で定
義されるようなＳＣＩＰ遺伝子によってコードされる任意のポリペプチドを指し
、かつ炭水化物基の付加のように、翻訳後に修飾されたタンパク質を含む。

【００１８】用語「ＳＣＩＰｍＲＮＡ」は、本明細書中で使用される場合には、上記で定
義されるようなＳＣＩＰ遺伝子によって転写される任意のｍＲＮＡを指し、かつ
切断型のｍＲＮＡ転写物および代替的にスプライシングされたｍＲＮＡ転写物を
含む。

【００１９】ＳＣＩＰ遺伝子の発現は、任意の適切なアッセイ手順を使用することによって
アッセイされ得る。好ましくは、ＳＣＩＰ遺伝子の発現は、ＳＣＩＰ遺伝子によ
ってコードされるＳＣＩＰタンパク質に対して親和性を有している抗体分子を使
用してアッセイされる。あるいは、プローブ（例えば、標識されたポリヌクレオ
チドプローブ）が、ＳＣＩＰをコードするｍＲＮＡの存在を同定するために使用
され得る。ＳＣＩＰをコードするｍＲＮＡを検出するために使用され得る、逆転
写ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）のような多数の他の方法が存在することが、
当業者に明らかであろう。

【００２０】神経組織は、脳および中枢神経系を含む任意の神経組織であり得り、そして神
経細胞は任意の神経組織に由来し得る。好ましくは、神経組織は脳であり、より
好ましくは、神経組織は、脳の大脳皮質である。

【００２１】特に好ましい実施形態では、本発明の方法は、被験体から神経細胞および／ま
たは神経組織のサンプルを得ること、およびＳＣＩＰタンパク質が存在している
かどうかを決定するために、神経細胞および／または神経組織をＳＣＩＰタンパ
ク質に対して親和性を有する抗体分子と接触させることを含む。

【００２２】抗体分子は、ＳＣＩＰタンパク質に特異的に結合可能な任意の抗体分子であり
得る。抗体分子は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。
ＳＣＩＰタンパク質に特異的に結合可能な抗体のフラグメント（例えば、Ｆｖ、
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメント、および単鎖Ｆｖフラグメント）もまた、
使用され得る。抗体分子は、キメラ抗体分子のような組換えの抗体分子であり得
る。このような抗体分子を産生するための方法は、当業者に周知である。

【００２３】抗体分子は標識されることが好ましい。適切な標識としては、西洋ワサビペル
オキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）
、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、フルオレセイン、および放射性同位元素、例えば¹²⁵ Ｉ、³Ｈ、および¹⁴Ｃ、が挙げられる。

【００２４】使用される標識に依存して、標識された抗体分子が固定された量が、当業者に
周知の標準的な方法を使用して決定され得る。例えば、標識がＨＲＰである場合
には、酵素によりルミノールが分解し、それにより化学発光の放出が測定され得
る。一方、放射活性標識が使用される場合には、標識の存在は、放出される放射
線を検出することによって測定される。

【００２５】ＳＣＩＰタンパク質に対して親和性を有している第１の抗体分子、および第１
の抗体分子に対して親和性を有している第２の標識された抗体分子を提供するこ
とも可能である。抗体分子をこのように組合せて使用することは、当業者に周知
である。

【００２６】神経細胞および／または神経組織のサンプルを被験体から得て、そしてＳＣＩ
Ｐ遺伝子によって転写される任意のｍＲＮＡを認識するプローブと接触させる本
発明の方法もまた、行われ得る。

【００２７】好ましくは、プローブは標識される。適切な標識として、抗体分子に関して上
記に言及した標識のうちいずれか１つが挙げられる。好ましくは、プローブをジ
ゴキシゲニンで標識し、そしてアルカリホスファターゼに結合した抗ジゴキシゲ
ニン抗体を使用して検出する。このような抗体は、Boehringer Mannheimから入
手可能である。好ましくは、プローブは、ＲＮＡプローブまたはＤＮＡプローブ
のような核酸プローブである。

【００２８】プローブは好ましくは、ＳＣＩＰ遺伝子によって転写される任意のｍＲＮＡの
少なくとも一部の配列に対応する配列を有している核酸プローブである。プロー
ブは、任意の大きさであり得るが、好ましくは、プローブは、約１０〜５００、
より好ましくは、約２０〜３００、そして最も好ましくは、約３０〜２００ヌク
レオチド長である。

【００２９】プローブの配列が、ＳＣＩＰ遺伝子によって転写される任意のｍＲＮＡの任意
の部分であって、ＳＣＩＰ遺伝子について特有である部分に対応することが好ま
しい。したがって、プローブは、ＰＯＵホメオドメインまたはＰＯＵドメインに
対応している配列は有さないことが好ましい。ＰＯＵホメオドメインおよびＰＯ
Ｕドメインは、十分に定義されており、当業者に公知である。例えば、マウスの
ＳＣＩＰ遺伝子のＰＯＵホメオドメインは、マウスのＳＣＩＰタンパク質のアミ
ノ酸３３５から３９６をコードし、そして、マウスのＳＣＩＰ遺伝子のＰＯＵド
メインは、マウスのＳＣＩＰタンパク質のアミノ酸２４０から３１９をコードす
る。ヒトおよびラットのＳＣＩＰ遺伝子のＰＯＵホメオドメインおよびＰＯＵド
メインは、マウスのＳＣＩＰ遺伝子中とほぼ同じ位置に存在する。

【００３０】好ましくは、プローブは、ＳＣＩＰタンパク質のＮ末端領域をコードする部分
であって、ＳＣＩＰ遺伝子によって転写される任意のｍＲＮＡの部分に対応する
核酸プローブである。

【００３１】好ましくは、プローブは、Ｔ３およびＴ７ポリメラーゼを使用して以下の配列
を転写することによって産生されるＲＮＡプローブである。５’ｇｇａｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｃｇｇｇａｃｃｃｇｇｃｃｔｇｃａｃｃａｃｇ
ｃａｃｔｇｃａｃｇａｇｇａｃｇｇｃｃａｃｇａｇｇｃａｃａｇｃｔｇｇａｇｃ
ｃｇｔｃｇｃｃａｃｃａｃｃｇｃａｃｃｔｇｇｇｃｇｃａｃａｃｇｇａｃａｃｇ
ｃａｃｇｇａｃａｔｇｃａｃａｃｇｃｇｇｇｃｇｇｃｃｔｇｃａｃｇｃｇｇｃｇ
ｇｃｇｇｃｇｇｃｇｃａｃｃｔｇｃａｃｃｇｇｇ３’

【００３２】本発明は、ＳＣＩＰタンパク質またはＳＣＩＰ遺伝子から転写されたｍＲＮＡ
のいずれかを認識する試薬を使用することによって、神経細胞および／または神
経組織の損傷の領域を同定する手段を提供する。

【００３３】考慮中の神経細胞および／または神経組織が、神経学的損傷を有していると推
定される被験体から採取され得る。神経細胞および／または神経組織は、検死に
よって採取され得るか、または生検として被験体が生存している間に採取され得
る。被験体はヒトであり得るか、またはマウスもしくはラットのようなヒト以外
の動物であり得る。

【００３４】神経組織は、従来の免疫組織化学のために、当該分野で行われている公知の標
準的な手順を使用して調製され得る。例えば、神経組織が脳である場合には、脳
は標準的な固定液（例えば、ホルマリン）中で固定され、次いでパラフィン中に
包埋され、そしてミクロトーム上で切断される。あるいは、脳は凍結させられ、
次いで低温維持装置（クリオスタット）上で切断される。このようにして調製さ
れた脳の切片は、次いで、例えば、免疫組織化学的に染色することによって、ま
たはインサイチューハイブリダイゼーションによって、ＳＣＩＰ遺伝子の発現に
ついて分析され得る。

【００３５】本発明はまた、ＳＣＩＰの発現を検出するためにキットを提供する。このキッ
トは、ＳＣＩＰタンパク質に対して親和性を有している第１の抗体分子、第１の
抗体分子に対して親和性を有している第２の標識された抗体分子、第２の抗体の
標識と組合せた場合に着色反応を発生する展開剤、適切な緩衝稀釈剤、ならびに
細胞および／または組織を染色し、抗体分子を使用して標識された物質を含有し
ているＳＣＩＰとの対比をするための対比染色を含む。

【００３６】本発明はまた、インサイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）によってＳ
ＣＩＰの発現を検出するためのさらなるキットを提供する。ここでは、キットは
、ＳＣＩＰ遺伝子によって転写される任意のｍＲＮＡに対して相補的な配列をコ
ードしており、かつ標識されている核酸プローブ、予備インキュベーションおよ
びインキュベーションステップのための緩衝溶液、標識された核酸プローブに対
して親和性を有している標識された抗体分子、標識された抗体分子との接触の際
に着色反応を発生する展開剤、適切な緩衝希釈剤、ならびに、細胞および／また
は組織を染色し、標識された核酸プローブおよび抗体分子を使用して標識された
物質を含有しているＳＣＩＰとの対比をするための対比染色を含む。

【００３７】本発明のキットは、ネガティブおよび／またはポジティブな結果を得るための
適切な成分を含むことがさらに好ましい。ポジティブな結果を得るための成分と
は、対象の組織中で発現された遺伝子を検出するために使用される。これは、構
成的に発現される遺伝子（例えば、ＧＡＰＤＨ）または組織特異的遺伝子であり
得る。これは、神経系においては、神経線維、ｔａｕ、またはグリア線維の酸性
タンパク質であり得る。ネガティブな結果は、好ましくは、ＳＣＩＰ遺伝子自体
の配列を有しているヌクレオチドプローブを使用することによって得られる。こ
れは、当業者に公知の標準的なアプローチである。

【００３８】上記に示されるように、抗体分子を使用してＳＣＩＰの発現を検出するための
キットは、以下を含む：・ＳＣＩＰタンパク質に対して親和性を有している第１の抗体分子。・第１の抗体分子に対して親和性を有している第２の抗体分子。通常は、第２
の抗体分子は、その中で第１の抗体分子が惹起された種の免疫グロブリンに対し
て特異的に反応する第２の種の中で惹起された抗体である。第２の抗体分子は、
好ましくは、間接的な免疫組織化学のために便利であるように、蛍光標識または
酵素標識のいずれかに結合させる。蛍光標識の例は、ＦＩＴＣまたはＲＩＴＣで
ある：酵素標識の例は、ＨＲＰまたはアルカリホスファターゼである。・展開剤。これらは、第２の抗体分子の標識との接触の際に、着色反応が発生
するように使用される。例は、ペルオキシダーゼ連結結合体についてのジアミノ
−ベンジジンおよび過酸化水素である。展開剤は、適切な緩衝希釈剤とともに提
供される。・第１および第２の抗体分子の両方についての希釈剤は、代表的には、タンパ
ク質（例えば、ウシ血清アルブミン）の供給源、および界面活性剤（例えば、Ｔ
ｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）を加えた緩衝生理食塩溶液を含む。・細胞および／または組織を染色し、そしてＳＣＩＰを染色した物質との対比
をするための対比染色は、当業者に周知である。

【００３９】上記に示されるように、ＩＳＨによってＳＣＩＰの発現を検出するためのキッ
トは、以下を包含する：・ＳＣＩＰ遺伝子によって転写される任意のｍＲＮＡと同一である核酸プロー
ブ、およびＳＣＩＰ遺伝子によって転写される任意のｍＲＮＡと相補的である配
列をコードする核酸プローブ。これらのプローブは、代表的には、続く検出のた
めにハプテン（例えば、ジゴキシゲニン）のような標識を有している。・この手順における種々のプレインキュベーションおよびインキュベーション
ステップにおいて使用する多数の緩衝溶液。・標識された核酸に対して親和性を有している標識された抗体分子（例えば、標
識（例えば、アルカリホスファターゼ）に結合した抗ジゴキシゲニン抗体）。こ
の抗体分子についての希釈剤もまた好ましくは含まれる。・展開剤。着色反応を発生する酵素試薬が、一般的に使用される。検出は、この
着色反応に基づく。例は、ペルオキシダーゼ連結結合体についてはＮＢＴ（４−
ニトロブルー塩化テトラゾリウム）ジアミノベンジジンと過酸化水素、およびＢ
ＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート）ジアミノベン
ジジンと過酸化水素、である。これらは、適切な緩衝希釈剤とともに提供される
。・細胞および／または組織を染色し、そしてＳＣＩＰを染色した物質との対比を
するための、対比染色。

【００４０】本発明は、ＳＣＩＰを発現する任意の神経細胞および／または神経組織を、標
準的な顕微鏡検査法によって可視化することを可能にする。次いで、発現のパタ
ーンを、対照の動物（例えば、４０週齢を超える成体のラットもしくはマウス）
またはヒトと比較することにより、ＳＣＩＰが損傷している領域のどの組織領域
で特異的に発現しているかを同定することを可能にする。このＳＣＩＰの発現の
同定によって、実施者は、被験体が神経学的損傷を有するかどうかを容易に決定
することができる。実施者はまた、神経系のどの領域に悪影響が及ぼされている
かを正確に特定することも可能である。これによって、被験体が羅患している疾
患または供されている実験操作と、神経細胞および／または神経組織に対する損
傷との関係について結論を導くことが可能になる。

【００４１】神経毒性学においては、本発明は、神経毒性試薬を同定する迅速かつ正確な手
段を提供する。これは、新規の薬物の評価に対して、または他の化合物の毒性学
的スクリーニング（例えば、潜在的な毒性環境因子または細菌毒素の評価）にお
いて有用である。

【００４２】神経病理学においては、本発明は、神経病理学の特異的なマーカーが利用でき
ない疾患に関係している神経病理学の性質および部位を同定する、迅速かつ正確
な手段を提供する。本発明は、生存している被験体または検死の被験体の診断と
して使用することができ、あるいは種々の神経学的傷害の病理研究のために使用
することができる。

【００４３】本発明を、図面を参照して以下の実施例において本明細書中で説明する。

【００４４】実施例材料および方法組織の調製ヒトの組織外科用のサンプルを、MRC Brain Bank, Institute of Psychiatry, King’s C
ollege Londonから、または緊急に外科標本から集めた。実施例１で使用したサ
ンプルの人口統計学的な特徴を、表１および２に記載する。年齢、性別、または
検死体の死後時間については、グループ間で有意な差異はなかった（表３）。排
除の基準は、頭部の損傷、アルコール依存症、またはアルツハイマー病のような
任意の中枢神経系に関係している障害があることとした。組織を、ＤＳＭ−ＩＩ
Ｉ−Ｒの基準に従って精神分裂症の臨床的な診断を受けた患者から得た。死亡の
前月における神経弛緩剤への暴露の平均を、精神分裂症の被験体について概算し
、クロルプロマジン当量（ＣＰＺＥ）で表した。

【００４５】別の組織標本もまた、限局性皮質形成異常またはアルツハイマー病のいずれか
の病理学的な診断を受けた患者から得た。

【００４６】組織調製物は、標準的な組織病理学的標本とした。この標本を２４〜４８時間
の間、１０％のホルマリン中で固定し、標本の大きさに応じて４〜２０個の切片
に切断し、次いでパラフィンブロック中に包埋し、７μｍに切断した。

【００４７】げっ歯類の組織組織標本を、海馬領域に片側脳損傷を受けた４０週齢を超えるＢａｌｂＣマウ
スから、および全身虚血を誘導したＷｉｓｔａｒラットから採取した。組織標本
を、４％のパラホルムアルデヒド中で４℃で一晩、固定し、パラフィンワックス
中に包埋し、７μｍに切断した。

【００４８】神経毒性の傷害成体のラットまたはマウスに、神経毒性作用を生じさせることが既知の化合物
、例えば、フェニトイン（７５ｍｇ／ｋｇ）または３−ニトロプロピオン酸（１
２０ｍｇ／ｋｇ）、を腹腔内に注射した。この注射の翌日、上記動物を、認可さ
れた標準技法を使用して屠殺し、それらの脳を取り出し、免疫細胞化学のために
処理した。この調製は、当業者にとって標準的な手順である。これは、４％のパ
ラホルムアルデヒドでの組織の固定、３０％のスクロース溶液中での一晩の液浸
による組織の凍結保護、次いで液体窒素中での組織の凍結を含む。次いで組織を
、低温維持装置（クリオスタット）上で１０μＭの厚さで切断する。次いで、組
織切片を標準的な手順を使用して免疫細胞化学用に処理する。

【００４９】抗体の調製組織切片を、タンパク質、ＳＣＩＰと特異的に反応する抗体を使用して染色す
る。抗体は、Meijer他、Nucleic. Acids Res., 18, 7357-7365 (1990); Meijer
他、Nucleic. Acids Res., 20, 2241-2247 (1992)の方法に従って調製し得る。
典型的には、このような抗体は、ＳＣＩＰをコードする発現プラスミドが導入さ
れている大腸菌中で、タンパク質を過剰発現させ、そのタンパク質を精製して得
た調製物に対して惹起させ得る。これは、ｐＥＴ１１Ａ発現ベクター（Novagen
）のＢａｍＨＩ部位中におけるイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（
ＩＰＴＧ）誘導性Ｔ７プロモータの後に位置するｐＮ１ＳＣＩＰから、ＢａｍＨ
Ｉ−ＢｇｌＩＩフラグメントをクローニングすることによって達成し得る。Meij
er他、Nucleic Acids Res., 18, 7357-7365 (1990);Meijerら、Nucl. Acid Res.
, 20, 2241-2247 (1992)を参照のこと。次いで、この遺伝構築物を大腸菌のＢＬ
２１株にトランスフェクトし得る。一晩培養物を、１：１０に稀釈し、室温でＯ
Ｄ₆₀₀＝０．８まで培養する。ＩＰＴＧを０．４ｍＭの最終濃度まで添加するこ
とによって、過剰発現を誘導し、培養物を４時間インキュベートする。

【００５０】大規模な精製のために、５００ｍｌのＩＰＴＧで誘導した細菌培養物をペレッ
ト状にし、リン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ）で１回洗浄し、１０ｍｌの６Ｍの
尿素／ＰＢＳ中に再懸濁し、音波破砕する。細胞溶解物を、１２０００ｒｅｖ．
／分で４℃にて５分間の遠心分離によって透明にする。

【００５１】イミダゾールを、０．８ｍＭの最終濃度になるまで細胞溶解物に添加し、３０
０μｌのＮｉ−ＮＴＡビーズ（Qiagen）とともに４℃で一晩インキュベートする
。翌日、Ｎｉ−ＮＴＡを６Ｍの尿素と８０ｍＭのイミダゾールを含む１０ｍｌの
ＰＢＳで１５分間、２回洗浄し、さらに６Ｍの尿素と８ｍＭのイミダゾールを含
むＰＢＳで３回洗浄する。ＳＣＩＰタンパク質を、６Ｍの尿素と０．８ｍＭのイ
ミダゾールを含む５００μｌのＰＢＳ中で基質から溶離させる。この精製手順に
よって、高レベルの純度（＞９５％）かつ無傷のＳＣＩＰタンパク質（クマシー
染色したポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって判断し
た場合）を調製することができる。Zwart他、Mech. Dev., 54, 185-194 (1996)
を参照のこと。

【００５２】抗ＳＣＩＰ抗血清の生成ＳＣＩＰタンパク質を過剰発現させ、さらに精製した後、フロイントアジュバ
ント中に再懸濁した０．５〜１．０ｍｇのＳＣＩＰタンパク質を３回連続して注
射すること（それぞれの注射の間に４週間の間隔をあける）によって、ウサギ（
White New Zealand）の中で抗体を惹起させ得る。Zwart他、Mech. Dev., 54, 18
5-194 (1996)を参照のこと。

【００５３】ＳＣＩＰ抗体を、次いで、ニトロセルロース上に固定したＳＣＩＰタンパク質
に結合することによって親和性（アフィニティー）精製する。１％のＢＳＡと３
％の粉ミルクと０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中で４℃にて２時間
のプレインキュベートした後、ニトロセルロースを、室温で３時間ＢＬ２１細胞
溶解物を用いて予めクリアにした抗血清とともに一晩インキュベートする。ＰＢ
Ｓでの十分な洗浄の後、ＳＣＩＰ抗体を、３ＭのＫＳＣＮと０．１ＭのＮａＰＯ₄ と５００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含む水溶液によってニトロセルロースから溶離
する。ＫＳＣＮを除去するために、抗体溶液を、０．１ＭのＮａＰＯ₄（ｐＨ
７．５）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラム上を通過させる。Zwar
tら（前出）を参照のこと。

【００５４】この方法によって惹起させたＳＣＩＰポリクローナル抗血清は、高度に特異的
である。なぜなら、これは、Ｏｃｔ−１／３／４、Ｂｒｎ−１／３／４のような
他のＰＯＵタンパク質と交差反応しないからである。これに加えて、ヒトおよび
ヒト配列を有するげっ歯類の間では、単離されたＳＣＩＰｃＤＮＡの相同性が
大きい（Tobler他、Nucleic Acids Res., 21, 1043 (1993)）。マウスの配列（Z
immerman他、Nucleic. Acids Res., 19, 956(1991)）およびラットの配列（He他
、Nature, 340, 6228(1989); Monuki他、Science, 249, 1300-1303 (1990)）に
対しては、９８．８％の相同性である。この抗体は、免疫組織化学的な用途にお
いて、げっ歯類およびヒトのＳＣＩＰタンパク質を検出するために使用されうる
。

【００５５】免疫組織化学切断した脳の検体を、組織切片中における免疫反応性ＳＣＩＰの存在および位
置を明らかにするために、免疫組織化学的に染色した。これは、標準的な免疫組
織化学的手順を使用して行った。

【００５６】ワックスで包埋した切片のワックスを除去し、メタノール中で再水和した。凍
結させた切片を−２０℃で維持し、使用の直前に室温にした。その後、両方のタ
イプの材料についての手順は同じであった。非内因性のペルオキシダーゼの活性
を遮断するために、切片を３％のＨ₂Ｏ₂を含むメタノール溶液とともに２０分間
インキュベートする。最初に蒸留水で、次いでＴｒｉｓ緩衝生理食塩溶液（ＴＢ
Ｓ）で十分に洗浄後、切片を、ＴＢＳで１：１０に稀釈した正常なブタ血清（Da
ko）で、室温にて３０分間遮断した後、ＴＢＳ中の１次抗ＳＣＩＰ（１：２５０
）抗体中で、４℃にて一晩インキュベートする。

【００５７】明視野顕微鏡検査法のために、切片をDakoで１：２００に希釈したビオチン化
Ｓｗｉｎｅ抗ウサギ２次抗体とともに４５分間インキュベートし、次いで、アビ
ジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（Vector Laboratories）とともに４
５分間インキュベートし、続いて５分間、ＰＢＳキット（Vector Laboratories
）中のジアミノベンジジン（ＤＡＢ）／０．０３％の過酸化水素と反応させる。
次いで、サンプルを、エタノール系中で脱水し、続いて、キシレンで３回すすぎ
、次に媒体に固定したＤＰＸに固定し、カバースライドをかける。

【００５８】蛍光顕微鏡検査法のために、免疫標識した切片を室温で１時間、１：２００の
ウサギ結合蛍光マーカー（Vector）とともにインキュベートする。切片を、抗劣
化媒体(Vectashield)中に包埋し、保存のためにカバースライドをかける。

【００５９】染色手順の後、ＳＣＩＰの発現を、光学顕微鏡検査法および／または蛍光顕微
鏡検査法によって検出し得る。ＳＣＩＰを発現していた組織切片中の細胞は、抗
体染色手順によって標識される。正常で損傷を受けていない成体の脳の材料にお
いては、標識された細胞はまれである。これは、損傷によりＳＣＩＰの発現が誘
導され、ＳＣＩＰの免疫反応性は損傷の徴候を示し、ＳＣＩＰの免疫反応性を有
する部位が損傷の部位を示すことを示す。

【００６０】インサイチューハイブリダイゼーションＳＣＩＰの発現を、免疫組織化学ではなくインサイチューハイブリダイゼーシ
ョン（ＩＳＨ）を使用して検出し得る。この場合には、タンパク質自体よりもむ
しろ、ＳＣＩＰタンパク質をコードするｍＲＮＡの存在が検出される。ＩＳＨは
、当業者に良く知られている標準技法である（Wilkinson, D. G., In Situ Hybr
idisation: A Practical Approach,第１版、87-106, 1992）。損傷した脳の材料
に由来する切片のワックスを、それぞれ１０分間で３回、Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒ
中で除去し、続いてメタノール中でそれぞれ５分間で２回洗浄する。次いで、切
片をそれぞれ５分間、ＰＢＴで調製した段階的な系列のメタノール溶液（１００
％、７５％、５０％、および２５％）によって再水和し、ＰＢＴを用いてそれぞ
れ５分間で２回洗浄する。再水和後、切片を、ＰＢＴ中の１０μｇ／ｍｌのプロ
テイナーゼＫ（Boehringer Mannheim）で３７℃で１０分間処理し、ＰＢＳ中の
４％のパラホルムアルデヒド中で２０分間、再度固定し、０．１Ｍのトリエタノ
ールアミンアセテートでアセチル化する。次いで、スライドを２５％、５０％、
７５％、および１００％のメタノール系中でそれぞれ５分間脱水する。ＲＮＡプ
ローブの非特異的な結合をブロックするために、切片を、５×ＳＳＣ（０．３Ｍ
のＮａＣｌ、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）、５０％の脱イオ
ン化ホルムアミド（ＢＤＨ）、１ｍｇ／ｍｌの酵母のｔＲＮＡ（Boehringer Man
nheim）、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０μｇ／ｍｌのヘパリン、０．１％のｔｒｉｔ
ｏｎＸ−１００、０．５％のＣＨＡＰＳ（Sigma）、および２％の遮断剤（Boehr
inger Mannheim）を含有している緩衝液でプレハイブリダイズさせる。切片を、
５６℃で２時間の間、プレハイブリダイズさせる。プレハイブリダイゼーション
緩衝液にｃＲＮＡプローブ（最終濃度５×１０⁶ｃｐｍ／ｍｌ）を添加すること
によって、ハイブリダイゼーション緩衝液を調製する。切片をハイブリダイゼー
ション緩衝液でカバーし、密閉した湿潤装置中で６０℃で一晩インキュベートす
る。ハイブリダイズした後、スライドを、６０℃で３０分間、２×ＳＳＣ／５０
％のホルムアミドで２回洗浄し、ＲＮアーゼ（２０μｇ／ｍｌ）で６０℃でさら
に３０分間処理する。２×ＳＳＣおよび０．２×ＳＳＣ中で１５分間、それぞれ
３７℃で十分に洗浄後、ハイブリダイズさせた切片を５％のヤギ血清（Sigma）
中で１時間遮断し、１：３５００に稀釈したアルカリホスファターゼ結合ヒツジ
抗ＤＩＧ（Boehringer Mannheim）中で４℃で一晩インキュベートする。翌日、
切片を、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＭｇＣｌ₂
、１００ｍＭのＮａＣｌ、および０．１％のｔｒｉｔｏｎＸ−１００から調製し
たＮＴＭＴ緩衝液で洗浄し、着色試薬ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Boehringer Mannheim
）中で、十分なシグナルが生じるまでインキュベートする。次いで、シグナルを
、４％のパラホルムアルデヒド中にスライドを浸すことによって固定する。次い
で、切片を、クレシルバイオレット（Nissl）を用いて対比染色し、２５％、５
０％、７５％、および１００％のメタノールの系中でそれぞれ５分間脱水し、続
いてＨｉｓｔｏｃｌｅａｒを用いて清浄し、固定媒体ＤＰＸ（ＢＤＨ）を用いて
カバースライドをかける。

【００６１】ＳＣＩＰ遺伝子によって転写される任意のｍＲＮＡについてのＲＮＡプローブ
は、すでに一般的なドメイン中に存在する（Suzuki他、EMBO, 11, 3723-3732 (1
990): Zwart他、Mech. Dev., 54, 185-194 (1996)）。ＲＮＡプローブは、好ま
しくは、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Stratagene）中にサブクローニングされ、制限
エンドヌクレアーゼＳｍａＩを用いて直鎖状にされた、マウスのＳＣＩＰｃＤ
ＮＡフラグメントの１６０ｂｐ（５’ｇｇａｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｃｇｇｇａｃ
ｃｃｇｇｃｃｔｇｃａｃｃａｃｇｃａｃｔｇｃａｃｇａｇｇａｃｇｇｃｃａｃｇ
ａｇｇｃａｃａｇｃｔｇｇａｇｃｃｇｔｃｇｃｃａｃｃａｃｃｇｃａｃｃｔｇｇ
ｇｃｇｃａｃａｃｇｇａｃａｃｇｃａｃｇｇａｃａｔｇｃａｃａｃｇｃｇｇｇｃ
ｇｇｃｃｔｇｃａｃｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｃａｃｃｔｇｃａｃｃｇｇ
ｇ３’）である。ＲＮＡプローブは、次いで、Ｔ３およびＴ７ポリメラーゼを使
用して、製造業者の説明書（Promega）に従って転写し得る。発現パターンを、
ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−ＵＴＰで標識したセンスおよびアンチセンスＲＮＡ
プローブ、ならびにアルカリホスファターゼに結合させた抗ＤＩＧ抗体（Boehri
nger Mannheim）を使用して可視化する。

【００６２】免疫組織化学的な検出と同様に、ＳＣＩＰの発現を、この方法によって検出す
ることができる。これにより、ＳＣＩＰの発現は、神経学的損傷の部位で増加す
るように調節されており、それゆえ、ＳＣＩＰの発現がこれらの損傷部位のマー
カーであることが明らかになる。

【００６３】実施例１アルツハイマー病を有する患者に由来する脳組織の分析上記の方法に基づいて、側頭葉のブロックが外側膝状体の位置で採取され、こ
れには海馬傍回および海馬が含まれていた。前頭葉のブロックを、脳梁幹の前方
末端で鋭い腹側湾曲の位置で採取した。サンプルが採取された被験体を、表２に
示す。免疫組織化学のために使用した全てのブロックを、１０％のホルマリン中
に固定し、続いて、パラフィンワックス中に包埋する前に、冠状面を切り取った
。

【００６４】７μｍの厚みの切片を、ＳＣＩＰタンパク質の存在および位置を明らかにする
ために、標準的な免疫組織化学的手順を使用して染色した。簡潔には、切片から
ワックスを除去し、メタノール中で再水和させ、１％のＨ₂Ｏ₂で３０分間、予備
処理した。次いで、切片を、０．００１％のクエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ６
．０）の溶液中で８分間、８００Ｗでマイクロ波処理した。Ｔｒｉｓ緩衝生理食
塩溶液（ＴＢＳ）で十分に洗浄後、切片を、ＴＢＳで１：１０に稀釈した正常な
ブタ血清（Dako）で３０分間ブロックし、次いで、ＴＢＳで希釈した（１：２５
０）１次ウサギポリクローナル抗ＳＣＩＰ抗体中で４℃で一晩インキュベートし
た。本研究において使用したＳＣＩＰポリクローナル抗血清は、ＳＣＩＰのＮ末
端領域に対して惹起させて得たものである。この領域は、Ｏｃｔ−１／３／４お
よびＢｒｎ−１／３／４のような他のＰＯＵタンパク質と最も相同性の低い領域
である。前述のように、３ステップのアビジン−ビオチン−西洋ワサビペルオキ
シダーゼ複合システムを使用し(Dako, Ltd）、抗体を、色素原であるジアミノベ
ンジジン（Ｖｅｃｔｏｒ）を使用して可視化した。陰性対照は、同時に処理した
同一材料の切片から構成され、一次抗体をＴＢＳによって置き換えて処理した組
織切片から構成された。

【００６５】ウェスタンブロットタンパク質抽出物を、３例の精神分裂症および３例の対照の症例の、側頭葉お
よび前頭葉から調製した。それぞれの抽出物をＰＢＳで２回洗浄し、１％のＮｏ
ｎｉｄｅｔＰ−４０溶解緩衝液（０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０
）、３ＭのＮａＣｌ、０．５ＭのＥＤＴＡ、およびプロテアーゼ阻害剤として２
μｇ／ｍｌのペプスタチン、２μｇ／ｍｌのロイペプチン、１μｇ／ｍｌのペプ
ロトニンを含む）の添加および撹拌することによって溶解させた。可溶化させた
サンプルを、次いで、１３，０００ｒｐｍで４℃にて１０分間遠心分離した。そ
れぞれの抽出物についてのタンパク質濃度を、ＤＣタンパク質アッセイ（BioRad
）を実施することによって概算した。タンパク質の定量化後、サンプルを、標準
的なドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）サンプル緩衝液（０．２５ＭのＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．２％のブロモフェノールブルー、４０％のグリ
セロール、２０％の２−メルカプトエタノール、および８％のＳＤＳを含む）中
に可溶化させ、変性させ、１０％のＴｒｉｓ−ポリアクリルアミドゲル（BioRad
）上に充填し、３５分間、定常の２００ボルトで泳動した。次いで、分離したタ
ンパク質を、半乾燥ブロッティング装置（BioRad）を使用して０．２μｍのニト
ロセルロースペーパー（Sigma）に移し、３０分間、１０ボルトで泳動した。ブ
ロットを、１０％のカゼイン溶液（Sigma）で３０分間ブロックし、次いでこれ
らを、アビジンＣ／ビオチンキットを用いて、製造業者の説明書（Sigma）に従
って処理した。次に、膜を、ＴＢＳ−Ｔ（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、０．５ＭのＮａＣｌ、および０．３％のＴｗｅｅｎ２０を含む）で
洗浄し、ＴＢＳ−Ｔで希釈した（１：３５００）１次ポリクローナル抗体抗ＳＣ
ＩＰとともに３０分間インキュベートした。ブロットを、ＴＢＳ−Ｔで洗浄し、
２次ビオチニル化ヤギ抗ウサギ抗体（Vector）とともに３０分間インキュベート
した。最後に、ＶｅｃｔａｓｔａｉｎＡＢＣ複合システムを使用し（Vector）
、ブロットを色素原であるジアミノベンジジン（Vector）で、ビーズが明確に見
られ得るまで処理した。陰性対照は、一次抗体をＴＢＳ−Ｔで置き換えて同時に
処理した同一の切片のブロットで構成した。

【００６６】画像の分析全ての切片を、画像分析ソフトウェア（ＩｍａｇｅＰｒｏ−ｐｌｕｓ）およ
び動力化した載物台を備えるＬｅｉｃａ光学顕微鏡を使用して分析した。このシ
ステムにより、高倍率で個々に視覚化された別々の顕微鏡視野を互いに結びつけ
ることが可能になり、海馬の構成を包含する大きな細片の単一の複合画像を形成
することが可能になった。海馬の構成の境界を低倍率で引き、そしてそれぞれの
亜領域を、以前に記載された標準的な基準を使用して描いた（Lorento de No, J
. Psychiatry Neurol., 1934; 46: 113-177; Amaral DG, Insausti R:Hippocamp
al formation. In Paxinos G.（Ed.）, The Human Nervous System. Academic P
ress 1990; 711-756）。５つの領域のそれぞれについて神経細胞をランダムに選
択するために、海馬の複合画像を捕捉し、クロスグリッドをその上部に設置した
。

【００６７】ＳＣＩＰを染色した神経細胞の光学密度を、精神分裂症および対照の症例の両
方について、ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３、ＣＡ４、および歯状回（ＤＧ）の領域で
、２５６点グレースケールを使用して定量化した。精神分裂症の症例については
、その核の断面が可視化されている神経細胞の細胞質染色を分析した。対照の症
例については、海馬の細胞構築を同定し、神経細胞について同様に細胞質の分析
を行うことを可能にするため、十分にバックグラウンドを染色した。光学密度の
読み取り値を、クロスグリッドと交わる神経細胞についてのみ概算した。次いで
、それぞれの領域の視野を横切る平均の光学密度の値を計算した。

【００６８】データを、ＭａｎｎＷｈｉｔｎｅｙＵｒａｎｋｓｕｍ試験（ＳＰＳＳ
１０．０）を使用して分析した。多数の比較について調整するために、Ｂｏｎ
ｆｅｒｒｏｎｉ補正項を適用し、０．０１のｐ値を有意であるとみなした。

【００６９】結果免疫組織化学的染色ＳＣＩＰは、全ての精神分裂症の海馬の被験体において広範囲で発現されたが
、一方、対照の症例においてはバックグラウンドを上回る染色はわずかであった
かまたは全く存在しなかった。ＳＣＩＰの染色は、主に細胞質ゾルで観察され、
これは、海馬のピラミッド状の細胞層、および歯状回の顆粒細胞層中に見られた
（図１）。精神分裂症のサンプルの側頭葉においては、ＳＣＩＰの染色は、ＣＡ
１における染色よりも、ＣＡ２、ＣＡ３、ＣＡ４、および歯状の顆粒細胞層にお
ける染色のほうが、より顕著であった。同様の結論を、適合する対照の切片につ
いては導くことはできなかった。なぜなら、ＳＣＩＰの免疫反応性が全く存在し
なかったかまたはごくわずかに存在するだけであったからである。

【００７０】精神分裂症および対照のサンプル中でのＳＣＩＰの染色の強度を評価するため
に、光学密度のパターンを、ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３、ＣＡ４、および歯状回中
ごとに定量化した。図２は、対照および精神分裂症のサンプルについての海馬の
サブ領域あたりの平均光学密度の概算を示す。ＭａｎｎＷｈｉｔｎｅｙＵ
ｒａｎｋ試験によると、試験した５つ全ての海馬の領域において、対照のグルー
プと比較して精神分裂症のグループの光学密度の測定値はかなりの低下を示し、
ｐ値は精神分裂症と対照との間で全ての海馬の領域において０．００１未満であ
った。これは、ＳＣＩＰの染色の強度が、対照よりも精神分裂症の被験体におい
て有意に高かったことを示す。

【００７１】神経弛緩剤の投与、被験体の年齢、および／または検死の遅れが、ＳＣＩＰの
発現に影響を与え得る可能性を調べるために、上記の因子と、５つの領域のそれ
ぞれについて得た平均の光学密度の値との相関関係を、Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ
ｒａｎｋ補正相関試験を使用して分析した。精神分裂症のグループにおいては、
ＳＣＩＰの染色と平均の神経弛緩剤に対する暴露（ＣＰＺＥ）との間に有意な相
関関係はなかった（全ての領域においてｐ＞０．１）。また、ＳＣＩＰの染色と
年齢または検死の遅延との間にも、全ての領域において有意な関係は見出されな
かった（全ての症例においてｐ＞０．１）。

【００７２】ウェスタン分析ＳＣＩＰのタンパク質レベルを、３例の精神分裂症および３例の適合する対照
の前頭葉および側頭葉に由来する抽出物中で試験した。イムノブロットによって
、ＳＣＩＰ抗体が、ＳＣＩＰタンパク質と予想される約４５ＫＤａの単一のタン
パク質を認識することを確認した。精神分裂症の検体の前頭葉および側頭葉にお
いては高いレベルでＳＣＩＰが存在したが、一方、適合する対照の同じ領域中で
は、全くＳＣＩＰの発現がなかったかまたはごくわずかなＳＣＩＰの発現があっ
た（図３）。

【００７３】結果は、広範囲のＳＣＩＰの免疫反応性が、精神分裂症の検体の前頭葉および
側頭葉において存在し、一方、適合する対照中では、ＳＣＩＰの発現が限られて
いることを実証する。この発見は、ＳＣＩＰが、精神分裂症における神経病理学
的なマーカーとして、さらには任意の神経学的損傷のマーカーとして有用である
ことを示す。

【００７４】神経毒性についての化合物の試験化合物の神経毒性は、細胞、組織、または動物を試験化合物と接触させ、ＳＣ
ＩＰの発現について上記の方法によって試験するという、本発明に従って試験し
得る。ＳＣＩＰの発現のレベルの上昇は神経毒性を示し、したがって、神経毒性
に至らない化合物が選択される。細胞、組織、または動物と化合物との接触方法
は、当業者に既知である。

【００７５】本明細書中で言及される全ての参考文献は、本明細書中に参照により援用され
る。

【００７６】

【表１】

【００７７】

【表２】

【００７８】

【表３】

【図面の簡単な説明】

【図１】海馬のＣＡ４領域におけるＳＣＩＰ染色を示す。目盛：５０μｍ。

【図２】精神分裂症および対照のグループについての、ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３、ＣＡ
４、および歯状回（ＤＧ）の領域における、ＳＣＩＰを染色した神経細胞の平均
光学密度を示す。

【図３】ウェスタンブロット分析を示す。３例の精神分裂症の前頭葉および側頭葉に由
来する脳抽出物を、ＳＣＩＰに対するポリクローナル抗血清を使用して、適合し
た対照の同様の脳の領域と比較した。ＳＣＩＰは、４５ＫＤａの産物として認識
された。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１４年３月８日（２００２．３．８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項２０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項２２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項２４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項２５

【補正方法】変更

【補正の内容】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/577 33/58 Ａ 33/58 ＺＣ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者プライス，ジャックイギリスロンドンエスイー５８エーエフデンマークヒル１ウィンザーウォークインスティチュートオブサイカイアトリーデパートメントオブニューロサイエンスアンドサイコロジカルメディシンアンドニューロパソロジーアンドクリニカルニューロファーマコロジーＦターム(参考） 2G045 AA29 BB10 BB20 BB22 BB24 BB29 BB50 BB51 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 4B024 AA11 CA09 HA14 4B063 QA05 QA19 QQ08 QQ43 QQ53 QR56 QR77 QS34 QX01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】神経細胞および／または神経組織中のＳＣＩＰ遺伝子の発現
についてアッセイすることを含む、神経の損傷を検出する方法。
【請求項２】ＳＣＩＰタンパク質の存在についてアッセイすることを含
む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】ＳＣＩＰタンパク質の存在を検出するために免疫組織化学的
アッセイを使用する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】被験体から神経細胞および／または神経組織のサンプルを得る
こと、ならびに、ＳＣＩＰタンパク質が存在するかどうかを決定するために、該
神経細胞および／または神経組織を、ＳＣＩＰタンパク質に対して親和性を有し
ている抗体分子と接触させることを含む、請求項２または請求項３に記載の方法
。
【請求項５】前記抗体分子は、モノクローナル抗体である、請求項４に記
載の方法。
【請求項６】前記抗体分子は、標識されている、請求項４または請求項５
に記載の方法。
【請求項７】前記抗体分子は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、または放射
性同位元素で標識されている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】前記抗体分子は、ＳＣＩＰタンパク質に対して親和性を有す
る抗体分子に対して親和性を有しており、かつ標識されている抗体分子によって
検出される、請求項４または請求項５に記載の方法。
【請求項９】ＳＣＩＰｍＲＮＡの存在をアッセイすることを含む、請求
項１に記載の方法。
【請求項１０】ＳＣＩＰｍＲＮＡの存在を検出するためにインサイチュ
ーハイブリダイゼーションアッセイを使用する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】被験体からの神経細胞および／または神経組織のサンプル
を得ること、および前記神経組織をＳＣＩＰｍＲＮＡを特異的に認識するプロ
ーブと接触させることを含む、請求項９または請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】前記プローブは、標識されている、請求項１１に記載の方
法。
【請求項１３】前記プローブは、ジゴキシゲニンで標識されている、請求
項１２に記載の方法。
【請求項１４】前記プローブは、核酸プローブである、請求項１１〜１３
のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】前記核酸プローブは、ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプロー
ブである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】前記プローブは、約１０〜５００ヌクレオチド長である、
請求項１４または１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】前記プローブは、前記ＳＣＩＰｍＲＮＡの少なくとも一
部の配列に対応する配列を有する、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方
法。
【請求項１８】前記プローブの前記配列は、前記ＳＣＩＰｍＲＮＡに固
有の一部であって、前記ＳＣＩＰｍＲＮＡの任意の一部に対応する、請求項１
７に記載の方法。
【請求項１９】前記プローブの前記配列は、前記ＳＣＩＰｍＲＮＡの一
部であって、前記ＳＣＩＰタンパク質のＮ末端領域をコードする部分に対応する
、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】ＳＣＩＰタンパク質に対して親和性を有する第１の抗体分
子、該第１の抗体分子に対して親和性を有する第２の標識された抗体分子、前記
第２の抗体分子の標識との組み合わせにより着色反応を発生する展開剤、適切な
緩衝稀釈剤、ならびに神経細胞および／または神経組織を染色し、前記第１の抗
体分子および第２の抗体分子を使用して標識された物質を含んでいるＳＣＩＰと
の対比をするための対比染色を含む、神経細胞および／または神経組織において
ＳＣＩＰを検出するためのキット。
【請求項２１】ネガティブおよび／またはポジティブな結果を得るために
、１つまたは複数の成分をさらに含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】インサイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）によっ
て、神経細胞および／または神経組織におけるＳＣＩＰの発現を検出するための
キットであって、該キットは、ＳＣＩＰｍＲＮＡに対して相補的な配列をコー
ドしており、かつ標識されている核酸プローブ、プレインキュベーションステッ
プおよびインキュベーションステップのための緩衝溶液、前記標識されている核
酸プローブに対して親和性を有しており、かつ標識されている抗体分子、該標識
されている抗体分子との接触により着色反応を発生する展開剤、適切な緩衝希釈
剤、ならびに、神経細胞および／または神経組織を染色し、前記標識されている
核酸プローブおよび抗体分子を使用して標識された物質を含んでいるＳＣＩＰと
の対比をするための対比染色を含むキット。
【請求項２３】ネガティブおよび／またはポジティブな結果を得るため
に、１つまたは複数の成分をさらに含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法を使用して、
または請求項２０〜２３のいずれか一項に記載のキットを使用して、被験体の細
胞中におけるＳＣＩＰの発現レベルの増大についてアッセイすることを含む、被
験体の精神分裂症を検出するための方法。
【請求項２５】神経細胞および／または神経組織を試験化合物と接触させ
ること、ならびに神経細胞および／または神経組織中でのＳＣＩＰの発現につい
てアッセイすることを含む、試験化合物の神経毒性をアッセイするための方法。
【請求項２６】前記神経細胞および／または神経組織は、インビトロで前
記試験化合物と接触させられる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】前記神経細胞および／または神経組織は、インビボで前記
試験化合物と接触させられる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】前記試験化合物は、動物に投与される、請求項２７に記載
の方法。
【請求項２９】前記神経細胞および／または神経組織中でのＳＣＩＰの発
現レベルの増大は、前記試験化合物の神経毒性を示す、請求項２５〜２８のいず
れか一項に記載の方法。