JP2003528621A - タンパク質相互作用のスクリーニングのための細菌ツーハイブリッド系の改良、これに使用する新規菌株、およびその応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 内因性のアデニル酸シクラーゼ活性を欠損している２つの細菌株が提供される。これらの株は、ＢＴＨ１０１およびＤＨＭ１と呼ばれ、ＰＣＴ出願公開第９９／２８７４６号パンフレットに記載されている、酵素の第一の断片に相当する第一のキメラペプチドと、酵素の第二の断片または前記酵素を活性化しうる調節物質に相当する第二のキメラペプチドを含む少なくとも２つのキメラペプチドの細菌マルチハイブリッド系、より好ましくはツーハイブリッド系を含んでなるシグナル増幅系において有用である。このシグナル増幅系は、標的リガンドに結合しうる目的の分子の選択方法において有用であり、目的の分子と標的リガンドとの相互作用は、国際公開第９９／２８７４６号パンフレット号パンフレットに記載されているシグナル増幅系およびそのためのキットを用いて検出される。菌株はまた、国際公開第９９／２８７４６号パンフレット号パンフレットに記載されている、標的リガンドと目的の分子との相互作用を刺激し、または阻害しうる物質のスクリーニング方法、およびそのためのキットにおいて有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】

本発明は、分子を選択するための方法、そのためのキット、分子のスクリーニ
ング方法、そのためのキット、および細菌マルチハイブリッド系を含んでなるシ
グナル増幅系において有用な新菌株の構築に関する。より詳細には、本発明は、
１９９９年６月１０日に発行されたＰＣＴ出願公開第９９／２８７４６号パンフ
レットに記載されたマルチハイブリッド系と呼ばれる技術の改良に関する。この
技術はまた、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95(10), 5752〜5756頁（Kari
moraら）に記載されている。

【０００２】 ２つのタンパク質間の機能的な相互作用の容易なin vivoスクリーニングおよ
び選択を可能とする新規な細菌ツーハイブリッド系が、最近報告されている。こ
の遺伝子工学的システムは、大腸菌（Escherichia coli）のアデニル酸シクラー
ゼ欠損株（ｃｙａ）における人工的なｃＡＭＰシグナル伝達経路の再構築に基く
ものである。それは、２つの相補的な断片からなる百日咳菌（Bordetella pertu
ssis）アデニル酸シクラーゼの触媒ドメインのモジュラー構造における利点を利
用したものである（百日咳菌のアデニル酸シクラーゼ：多彩な作用を発揮する毒
素, Trends in Microbiol. 7, 172-176）。それらが大腸菌の中で別個に発現さ
れた場合、相互作用するポリペプチドが遺伝的にこれらの断片に融合しない限り
、それらは活性のある酵素に変換されない。

【０００３】 細菌ツーハイブリッド系においては、２つのキメラタンパク質間の相互作用に
よって２つのアデニル酸シクラーゼ断片間に機能的な相補性が生じ、酵素活性が
回復する。生じたｃＡＭＰの合成により、いくつかの大腸菌の内在遺伝子の発現
が誘発され、従って、選択可能な表現型が生じる。

【０００４】 デザインによって、この細菌ツーハイブリッド系は、大腸菌ｃｙａ株、すなわ
ち、内因性のアデニル酸シクラーゼを欠いている株中に配置される。ｃｙａ遺伝
子（アデニル酸シクラーゼ構造遺伝子）中に点突然変異、欠失、または挿入を有
する多くの大腸菌ｃｙａ株が報告されている。改良されたホスホマイシンの選択
手順を使用することによって、ＤＨＰ１株が単離された。この株は、ＤＨ１の天
然に生じたｃｙａ誘導体である（F^-, glnV44(AS), recA1, endA1, gyrA96(Nal^r)
, thil, hsdR17, spoT1, rfbD1）。ハイブリッドタンパク質間の機能的相補性は
、試験された他のｃｙａ株に比べ、ＤＨＰ１株において非常に高い効率を示すよ
うであるが、これは、おそらくはキメラタンパク質の安定性が高いためである。

【０００５】 しかしながら、ＤＨＰ１株は、Ｃｙａ⁻表現型からＣｙａ^＋表現型へと非常に
高い頻度（約１０^-6）で自然発生的な復帰突然変異を示すことが見いだされてい
る。このため、非常に多くの形質転換細胞を分析する必要のあるライブラリース
クリーニングのような大規模スクリーニングへの応用においては、ＤＨＰ１の有
用性は、この特徴により制限される。

【０００６】 当技術分野においては、ＰＣＴ出願公開第９９／２８７４６号パンフレットに
記載された方法およびキットに使用することができる細菌株が必要とされている
。新規な菌株はＣｙａ表現型を示し、標準的なハイブリッドタンパク質間で機能
的な相補性を有効に生じさせ、そしてタンパク質−タンパク質相互作用の大規模
分析での使用に適したものでなければならない。

【０００７】

【発明の概要】

本発明は、当技術分野における上記の要求を満たすことを目的とする。より詳
細には、本発明の目的は、ＰＣＴ出願公開第９９／２８７４６号パンフレットに
開示された細菌マルチハイブリッド系、方法、およびキットを使用するための新
たなツールを提供することにある。

【０００８】 より詳細には、本発明はＰＣＴ出願公開第９９／２８７４６号パンフレットに
記載されたキットおよび方法の改良に関するものである。とりわけ、本発明によ
れば、上記の方法とキットにおいて使用するための改良された細菌株が提供され
る。この細菌株は、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３０９を有するＢＴＨ１０
１株およびＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３１０を有するＤＨＭ１株からなる
群より選択される。

【０００９】 一つの実施態様によれば、本発明により、本発明によるＢＴＨ１０１株または
ＤＨＭ１株を使用する、国際公開第９９／２８７４６号パンフレットに記載のシ
グナル増幅系が提供される。

【００１０】 別の実施態様によれば、本発明により、国際公開第９９／２８７４６号パンフ
レットに記載の目的の分子の選択方法が提供される。この方法は、ＢＴＨ１０１
株またはＤＨＭ１株を使用する、国際公開第９９／２８７４６号パンフレットに
記載のシグナル増幅系を利用するものである。

【００１１】 他の実施態様によれば、本発明により、目的の分子を選択するためのキットが
提供される。このキットは、国際公開第９９／２８７４６号パンフレットに記載
のものであり、本発明によるＢＴＨ１０１株またはＤＨＭ１株を利用する。

【００１２】 また、本発明によれば、国際公開第９９／２８７４６号パンフレットに記載の
、目的の分子と標的リガンドとの相互作用を刺激し、または阻害しうる物質をス
クリーニングする方法が提供される。この方法は、本発明によるＢＴＨ１０１株
またはＤＨＭ１株を利用するものである。

【００１３】 さらに、本発明によれば、国際公開第９９／２８７４６号パンフレットに記載
の、目的の分子と標的リガンドとの相互作用を刺激し、または阻害しうる物質を
スクリーニングするためのキットが提供される。このキットは、国際公開第９９
／２８７４６号パンフレットに記載のものであり、本発明によるＢＴＨ１０１株
またはＤＨＭ１株を利用する。

【００１４】 また、本発明によれば、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３０９を有するＢＴ
Ｈ１０１株が提供される。

【００１５】 さらに、本発明によれば、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３１０を有するＤ
ＨＭ１株が提供される。

【００１６】 さらに、本発明によれば、ＤＨＭ１株およびＢＴＨ１０１株を使用する本発明
の方法によって同定された目的の分子が提供される。この目的の分子は、酵素ま
たはそれらの断片と結合された融合標的リガンドと相互作用する分子を発現させ
ることができるポリヌクレオチドに対応しうるものである。

【００１７】 また、本発明によれば、ＢＴＨ１０１株またはＤＨＭ１株を使用する、本発明
による細菌マルチハイブリッド系で形質転換されたベクターの集合体を含んでな
るＤＮＡライブラリーが提供される。各プラスミドは、酵素の第一または第二断
片をコードするポリヌクレオチドに融合された、目的の分子をコードするポリヌ
クレオチドを含有することができる。目的の分子をコードするポリヌクレオチド
は、例えば、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）のゲノムＤＮＡ
の断片とすることができる。

【００１８】 別の実施態様によれば、本発明により、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３６
７を有するピロリ菌（H. pylori）ＤＮＡライブラリー、ＨＧＸＢＨＰ_３が提供
される。

【００１９】 概して、本発明は、ＤＨＭ１およびＢＴＨ１０１として特徴付けられる新たな
菌株、ならびに大腸菌（E. coli）ＸＬ−１／ｐＵＴ１８、ＸＬ−１／ｐＵＴ１
８Ｃ、ＸＬ１−１／ｐＴ２５、およびＸＬ−１／ｐＫＴ２５に含まれるプラスミ
ドに関する。

【００２０】

【発明の具体的説明】

ほとんどの生物学的過程には、特異的なタンパク質−タンパク質相互作用が関
与する。相互作用するタンパク質を同定するため、またはこれらの相互作用を研
究するための一般的な方法論が、数多く開発されている。とりわけ、酵母のツー
ハイブリッド系は、現在のところ、所定の標的タンパク質に結合しうるポリペプ
チドをスクリーニングするための最も強力なin vivoの方法である。それはリポ
ーター遺伝子発現の直接的な活性化によってタンパク質−タンパク質相互作用を
検出するためのハイブリッド遺伝子を利用するものである。

【００２１】 本質的には、２つの仮定のタンパク質パートナーが転写因子のＤＮＡ結合ドメ
インと転写活性化ドメインとに、各々遺伝子的に融合される。目的とする２つの
タンパク質間の生産的な相互作用によって、ＤＮＡ結合ドメインの付近に転写活
性化ドメインがもたらされ、近接した、スクリーニング可能な表現型を与えるリ
ポーター遺伝子（通常は、ｌａｃＺまたは栄養マーカー）の転写が直接的に誘発
される。転写は、転写因子の２つの機能的ドメイン、すなわち、ＤＮＡの特異的
部位を認識して結合するドメインおよび活性化に必要なドメイン、の使用によっ
て活性化され得ることが確かめられている。

【００２２】 ＰＣＴ出願公開第９９／２８７４６号パンフレットには、 （ａ）酵素の第一断片に相当する第一キメラポリペプチド； （ｂ）酵素の第二断片または前記酵素を活性化しうる調節物質に相当する第二
キメラポリペプチド、 を含む、少なくとも２つのキメラポリペプチドの細菌マルチハイブリッド系を含
んでなり、前記第一断片は目的の分子に融合され、前記第二断片または前記調節
物質は標的リガンドに融合されており、前記酵素の活性が目的の前記分子と前記
標的リガンドとのin vivo相互作用により回復して、シグナル増幅が行なわれる
シグナル増幅系、が記載されている。

【００２３】 このシグナル増幅系は、標的リガンドに結合しうる目的の分子の選択方法にお
いて有用であり、ここで、目的の分子と標的リガンドとの相互作用は、シグナル
増幅を生じさせ、転写活性化を誘発することによって、シグナル増幅系で検出さ
れる。

【００２４】 ＰＣＴ出願公開第９９／２８７４６号パンフレットにはまた、目的の分子を選
択するためのキットが記載されており、このキットは、 （ａ）シグナル増幅系； （ｂ）内因性アデニル酸シクラーゼを欠損した大腸菌株もしくはいずれかの細
菌株または他のいずれかの真核細胞；および （ｃ）相補性の検出を可能とする培地、を含んでいる。この培地は、ラクトー
スもしくはマルトースを唯一の炭素源として補充した最少培地のような指示培地
または選択培地、抗生物質を含む培地、蛍光を可視化するための培地、慣用的な
培地、およびファージ受容体の存在による選別を可能とする培地からなる群より
選択されるものである。

【００２５】 国際公開第９９／２８７４６号パンフレットに記載された、目的の分子を選択
するためのキットはまた、 （ａ）目的の分子が既知の野生型分子に対する変異分子である、シグナル増幅
系、 （ｂ）目的の分子が対照としての既知の野生型分子である、シグナル増幅系、 （ｃ）内因性アデニル酸シクラーゼを欠損した大腸菌株もしくはいずれかの細
菌株または他のいずれかの真核細胞； （ｄ）ラクトースもしくマルトースを唯一の炭素源として補充した最少培地の
ような指示培地または選択培地、抗生物質を含む培地、蛍光を可視化するための
培地、慣用的な培地、および各シグナル増幅系についてファージ受容体の存在に
よる選別を可能とする培地からなる群より選択される培地；および （ｅ）変異分子でのシグナル増幅系が、野生型でのシグナル増幅系に対して、
増強されるかまたは阻害されるかを検出する手段、を含んでなる。

【００２６】 さらに、ＰＣＴ出願公開第９９／２８７４６号パンフレットには、標的リガン
ドと目的の分子との相互作用を刺激または阻害しうる物質をスクリーニングする
方法が記載されている。刺激活性または阻害活性は、増幅を生じさせて、各々転
写活性化を誘発するかまたは転写活性化を消失させることによって、シグナル増
幅系で検出される。シグナル増幅および誘発されたかまたは消失した転写活性化
は、いかなる物質も含まない同一のシグナル増幅系から得られたものと比較され
る。標的リガンドと目的の分子との相互作用を刺激または阻害しうる物質をスク
リーニングする方法は、内因性アデニル酸シクラーゼを欠損している大腸菌株も
しくはいずれかの菌株または他のいずれかの真核細胞中で行うことができる。

【００２７】 さらに、ＰＣＴ出願公開第９９／２８７４６号パンフレットには、標的リガン
ドと目的の分子との相互作用を刺激または阻害しうる物質をスクリーニングする
ためのキットが記載されている。このキットは、 （ａ）標的リガンドと目的の分子との相互作用を刺激または阻害しうる物質を含
むシグナル増幅系； （ｂ）対照としていかなる物質も含まないシグナル増幅系； （ｃ）内因性アデニル酸シクラーゼを欠損した大腸菌株もしくはいずれかの菌株
または他のいずれかの真核細胞； （ｄ）唯一の炭素源としてラクトースもしくはマルトースを補充した最少培地の
ような指示プレートもしくは選択培地、抗生物質を含む培地、蛍光を可視化する
ための培地、慣用的な培地、およびファージ受容体の存在による選別を可能とす
る培地からなる群より選択される、相補性の検出を可能とする培地；および （ｅ）上記の物質を含むシグナル増幅系が、いかなる物質をも含まないシグナル
増幅系に対して、増強されるかまたは阻害されるかを検出する手段、を含む。

【００２８】 ＰＣＴ出願公開第９９／２８７４６号パンフレットに記載された細菌ツーハイ
ブリッド系および他の方法ならびにキットで使用されていた、元の大腸菌ｃｙａ
株、ＤＨＰ１株は、ホスホマイシン耐性株として単離された自然発生のｃｙａ突
然変異体である。ＤＨＰ１株中では、相補性は効率的に働くが、この株は高い頻
度でＣｙａ^＋表現型に復帰突然変異する傾向があり、これが大規模スクリーニン
グでの使用の障害となっていた。

【００２９】 新たなｃｙａ株が構築された。本発明によるこれらの新たな株は、（ｉ）復帰
突然変異せず、（ii）効率的な相補性を示す。２つのこうした株、ＤＨＭ１およ
びＢＴＨ１０１を選択し、以下に記載する。使用した細菌株およびプラスミドを
表１に示す。

【００３０】

【表１】

【００３１】 1. Uzan, M. and Danchin A., 1978. Correlation between the serine sensit
ivity and the derepressibility of the ilv genes in Escherichia coli relA
-mutants. Mol Gen Gent., 165:21-30. 2. Karimova, G., Pidoux, J., Ullmann, A. & Ladant, D., 1988. A bacteria
l two-hybrid system based on reconstituted signal transduction pathway.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:5752-5756. 3. Sancar, A., Rupp, W. D., 1979. Physical map of the recA gene. Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:3144-3148.

【００３２】 本発明による２つの菌株、ＤＨＭ１およびＢＴＨ１０１は、ＰＣＴ出願公開第
９９／２８７４６号パンフレットに記載の方法およびキットにおいて使用できる
。ＰＣＴ出願公開第９９／２８７４６号パンフレットの全開示内容は信頼に足る
ものであり、参照することにより本明細書の開示の一部とされる。本明細書中で
使用する用語は、国際公開第９９／２８７４６号パンフレットで使用されたもの
と同じ定義を有する。

【００３３】 従来の細菌株ＤＨＰ１と、新たな菌株ＤＨＭ１およびＢＴＨ１０１を、以下に
詳細に説明する。

【００３４】 １．ＤＨＰ１ ＰＣＴ出願公開第９９／２８７４６号パンフレットに記載のＤＨＰ1株は、Ｄ
Ｈ１のアデニル酸シクラーゼ欠損（ｃｙａ）誘導体（F^-, glnV44(AS), recA1, e
ndA1, gyrA96(Nal^r), thi1, hsdR17, spoT1, rfbD1）(25)であり、選択用抗生物
質としてホスホマイシンを使用して単離されたものである（Alper, M.D. & Ames
, B. N. (1978） J. Bacteriol. 133, 149-57）。使用した増殖培地は、含有成
分の多い培地であるＬＢまたは１％の炭素源を補充した合成培地Ｍ６３（Miller
, J. H. (1972) Experiments in molecular genetics (Cold Spring Harbor Lab
oratory, Cold Spring harbor, N. Y.)）であった。抗生物質の濃度は、アンピ
シリン１００ｍｇ／ｍｌおよびクロラムフェニコール３０ｍｇ／ｍｌであった。
糖醗酵能のスクリーニングは、１％のマルトースを含むマッコンキー寒天プレー
ト上、または４０ｍｇ／ｍｌのＸ-Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）および０．５ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を含むＬＢプレート上で行った。

【００３５】 ２．ＤＨＭ１：F^-, recA1, endA1, gyrA96(Nal^r), thi1, hsdR17, spoT1, rfbD1
, glnV44(AS), ｃｙａ-８５４ ＤＨＭ１株は、Ｐ１形質導入（Miller, 1972）によって導入されたｃｙａ遺伝
子内の小さな欠失（ｃｙａ‐８５４）を有するＤＨＰ１誘導体である。この目的
のために、Ｐ１virファージの溶解物を、ドナー株であるＦＢ８ ｃｙａ‐８５
４ ilv‐691::Tn10（M. Perrote氏より分譲していただいた）で調製した。この
株は、ｃｙａに近接した連鎖中にあるトランスポゾンＴｎ１０挿入体を有する（
Wanner, 1986）。この連鎖は、大腸菌のrecA遺伝子をコードするpBR322の誘導体
である、プラスミドpRecAを有し、Ｒｅｃ^＋表現型に復帰突然変異する（G. Kari
mova, 未発表の結果）ＤＨＰ１の中に、ｃｙａ‐８５４変異を移動させるために
使用した。得られたＴｃ^Ｒ（テトラサイクリン耐性）形質導入体を、ｃｙａ遺伝
子中で２００塩基対が欠失している、変異対立遺伝子ｃｙａ‐８５４の存在につ
いて試験した（Glaser, P., Roy A, Danchin, A., 1989）。これは、テトラサイ
クリン（２５μｇ／ｍｌ）を含むマッコンキー／マルトース指示プレート上に、
再度細胞を線状に塗布することにより行った。ｃｙａ‐８５４変異を有する形質
導入体は復帰突然変異をしない（Ｃｙａ^＋細胞−赤色表現型−は、多数のコロニ
ーにおいて検出できなかった）のに対し、本来のＤＨＰ１のｃｙａ変異を有する
形質導入体は、多数のコロニー中の赤いＣｙａ^＋細胞の出現によって示されたよ
うに、高い頻度で復帰していたため、ｃｙａ‐８５４変異を有する形質導入体は
、ＤＨＰ１から得られた本来のｃｙａ変異を有する細胞とは容易に区別すること
ができた。２つのマーカー、ilv::Tn10とｃｙａ‐８５４との同時形質導入の頻
度は、約３０％であった。こうした形質導入体の１つが選択され、ＤＨＰ１１と
命名された。

【００３６】 ＤＨＭ１株は、pRecAを有するＤＨＰ１１中に、大腸菌Ｋ１２ ＦＢ８からの
ｉｌｖ野生型対立遺伝子をＰ１形質導入することによって構築された。形質導入
体を、アミノ酸を添加していない最少培地上で選択した。得られた形質導入体を
再度単離した後に、ｃｙａ‐８５７変異の存在とＴｎ１０（Ｔｃ^Ｓ−感受性）の
喪失とを、マッコンキー／マルトースとＴｃ（２５μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ
上にプレーティングすることによって証明した。pRecAプラスミドをキュアリン
グするために、形質導入体ＤＨＭ１（pRecA）をＬブロス中で終夜増殖させ、そ
の後マッコンキー／マルトースプレート上に撒いた。pRecAを喪失したＤＨＭ１
細胞を同定するために、１００個のシングルコロニーを２つのプレート：アンピ
シリン（Ａｍｐ、１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレート上および抗生物質を含
まないマッコンキー／マルトースプレート上に、再度線状に塗布した。プレート
を３７℃で２４時間保持した。いくつかのＡｍｐ−感受性クローンをマッコンキ
ー／マルトースプレートから拾い、再度線状に塗布した後に相補性についての試
験を行い、ＤＨＭ１と命名された１つのクローンを選択した。

【００３７】 ＤＨＭ１細胞中のＬａｃ^＋およびＭａｌ^＋復帰突然変異体の頻度を試験するた
めに、ＬＢ中でＤＨＭ１（１０ｍｌ）を終夜培養した培養物を遠心分離によって
回収し、Ｂ６３培地で３回洗浄し、唯一の炭素源としてマルトースまたはラクト
ースを補充したX-galを含む最少培地上にプレーティングした。Ｌａｃ^＋および
Ｍａｌ^＋クローンの頻度は、各々、１０^−７および１０^−９であった。これらの
Ｌａｃ^＋およびＭａｌ^＋復帰突然変異体はＣｙａ^＋復帰突然変異体ではなかった
が、ｌａｃプロモーター中のｃＡＭＰ／ＣＡＰ非依存性突然変異またはｃＡＭＰ
非依存性ＣＡＰ突然変異（ＣＲＰ^＊）から生じることに留意すべきである。

【００３８】 ３．ＢＴＨ１０１：F^-, galE15, galK16, rpsL1(Str^r), hsdR2, mcrA1, mcrB1,
cya-99 ＢＴＨ１０１株は、接合およびＰ１形質導入技術（Miller, 1972）によって構
築されたＭＣ１０６１の誘導体である。ｃｙａ遺伝子内に正確な欠失を導入する
試みを行い、本発明者らは、Ｃｙａ^＋（実際は、Ｌａｃ^＋またはＭａｌ^＋表現型
）に復帰突然変異する頻度が非常に低いため、最も確実にｃｙａ遺伝子内の欠失
を有すると思われる、ＭＣ１０６１、ＢＴＨ９９という自然発生のｃｙａ突然変
異体を単離した。この突然変異体は、以下のようにして得られた。第一に、pSKb
luescript IIベクター（Stratagene社）中−XhoI部位とXbaI部位との間−に、次
のＤＮＡ断片：ｃｙａＡ遺伝子のすぐ上流にある大腸菌染色体ＤＮＡの１．５ｋ
ｂ断片、クロラムフェニコール耐性カセット、ｃｙａＡ遺伝子のすぐ下流にある
大腸菌染色体ＤＮＡの１．５ｋｂ断片、およびカナマイシン耐性カセット（Kari
mova、未発表データ）を挿入して、プラスミド、pSKDKancyaを構築した。プラス
ミドpSKDKancyaをドナー株HfrKL800中に入れて形質転換し、得られた形質転換体
を受容株であるＭＣ１０６１（ストレプトマイシン耐性）と、３７℃で３０分間
交配（mated）した。交配混合物（mating mixture）のアリコートを、Ｋａｎ（
５０μｇ／ｍｌ）およびＳｔｒ（１００μｇ／ｍｌ、供与菌細胞を逆選択するた
め）を補充したマッコンキー・マルトース指示プレート上にプレーティングした
。その後、受容菌Ｋａｎ^ＲおよびＳｔｒ^Ｒ細胞を、ｃｙａ誘導体を選択するため
に、ラムダvirファージのストックと混合し（大腸菌ｃｙａ株はλに耐性である
）、再度マッコンキー・マルトース指示プレート上にプレーティングした。いく
つかのλ^Ｒ、ｃｙａ誘導体を単離した。それらはいずれも、ｃｙａの欠損を有し
ていなかったが、得られたクローンのいくつかは安定なｃｙａ表現型を示した（
すなわち、それらは非常に低い頻度でＬａｃ^＋またはＭａｌ^＋表現型に復帰突然
変異した）。プラスミドを喪失しているクローンを同定するために、次いで、再
単離した組換体をＬＢ−Ｋａｎおよびマッコンキー・マルトース指示プレート上
にプレーティングした。こうしたｃｙａの１つ、Ｋａｎ^Ｓ−感受性クローンであ
るＢＴＨ９９は、標準的な相補性プラスミド（pKT25-zip/pUT18-zip、図１およ
び図２を参照されたい）を用いる細菌ツーハイブリッド系において良好な相補能
を示したため、さらに研究を進めた。ＢＴＨ９９のｃｙａ‐99変異は、現在特徴
づけを行っている。

【００３９】 ＢＴＨ１０１は、２つの連続するＰ１形質導入によって作られたＢＴＨ９９の
誘導体である。第一に、野生型のlacオペロンをＦＢ８から形質導入し、形質導
入体を、１ｍＭのｃＡＭＰの存在下で、ラクトースを補充した最少培地プレート
上で選択した。Ｌａｃ^＋クローン（ＢＴＨ１００）を再度単離し、ｃＡＭＰを含
むかまたは含まないマッコンキー／ラクトース指示プレートを用いて、ｃｙａ‐
９９の存在について試験した。ＢＴＨ１０１株は、（ＦＢ８からの）ｉｌｖ野生
型対立遺伝子のＢＴＨ１００へのＰＩ形質導入によって作製した。得られたクロ
ーンを、アミノ酸を含まない最少培地上で選択した。こうしたクローンの１つで
あるＢＴＨ１０１を、さらなる特徴づけのために維持した。

【００４０】 本発明の実施に有用なプラスミドおよび菌株は、以下のように、フランス国パ
リのCollection Nationale de Cultures de Microorganismesに寄託されている
。

【００４１】プラスミド 寄託日 受託番号 XL-1/pUT18 1998年11月25日 I-2092 XL-1/pUT18C 1998年11月25日 I-2093 XL-1/pT25 1998年11月25日 I-2094 XL-1/pKT25 1998年11月25日 I-2095 DHM1 1999年9月10日 I-2310 BTH101 1999年9月10日 I-2309 ピロリ菌 1999年12月14日 I-2367 ライブラリー HGX BHP₃

【００４２】 プラスミドｐＫＴ２５（３４４５−ｂｐ）は、Ｔ２５断片をコードする低コピ
ーベクターｐＳＵ４０（カナマイシン耐性選択マーカーを発現する）の誘導体で
ある。それは、以下のようにして作製された：１０４４−ｂｐのHindIII−EcoRI
、ｐＴ２５断片をまずHindIIIとEcoRIとで開環した（直鎖状にした）ｐＳＵ４０
中にサブクローニングし、ｐＫＴ２５Ｌを得た。ｐＫＴ２５Ｌから、２３６−ｂ
ｐのNheI−HindIII断片を除いて、ｐＫＴ２５を得た。

【００４３】 プラスミドｐＵＴ１８（３０２３−ｂｐ）は、Ｔ１８断片（ＣｙａＡのアミノ
酸２２５番〜３９９番目）をコードする高コピー数ベクターｐＵＣ１９（アンピ
シリン耐性選択マーカーを発現し、ｐＴ２５またはｐＫＴ２５に適合する）の誘
導体である。第一段階では、本発明者らは、２４−ｂｐの二本鎖オリゴヌクレオ
チド（５’−ＡＴＴＣＡＴＣＧＡＴＡＴＡＡＣＴＡＡＧＴＡＡ−３’[配列番号
１]およびその相補配列）を、ｐＵＣ１９のHindIII−NheI部位の間に挿入して、
プラスミドｐＵＣ１９Ｌを構築した。その後、Ｔ１８のオープンリーディングフ
レームを有する５３４−ｂｐの断片をＰＣＲ（適当なプライマーと標的ＤＮＡと
してｐＴ１８を用いる）により増幅し、EcoRIとClaI（適当な制限部位はＰＣＲ
プライマー中に含まれていた）で消化したｐＵＣ１９Ｌ中にクローニングした。
得られたプラスミドｐＵＴ１８では、Ｔ１８のオープンリーディングフレームが
ｐＵＣ１９のマルチクローニング部位の下流に、読み枠が一致するように融合さ
れていた。このプラスミドを、Ｔ１８のＮ末端に異種ポリペプチドが融合されて
いるキメラタンパク質を作り出すようにデザインした（マップを参照されたい）
。

【００４４】 プラスミドｐＵＴ１８Ｃ（３０１７−ｂｐ）は、Ｔ１８断片をコードするｐＵ
Ｃ１９（アンピシリン耐性選択マーカーを発現し、ｐＴ２５またはｐＫＴ２５に
適合する）の誘導体である。それは、上記のＴ１８のオープンリーディングフレ
ームを有する５３４−ｂｐのＰＣＲ増幅断片をHindIIIとPstI（適当な制限部位
がＰＣＲプライマー中に含まれている）とで開環させたｐＵＣ１９Ｌ中にサブク
ローニングすることによって構築した。得られたプラスミドｐＵＴ１８Ｃでは、
Ｔ１８のオープンリーディングフレームは、ｐＵＣ１９Ｌのマルチクローニング
部位の上流に、読み枠が一致するように融合されていた。このプラスミドを、Ｔ
１８のＣ末端に異種ポリペプチドが融合されているキメラタンパク質を作り出す
ようにデザインした（マップを参照されたい）。

【００４５】 プラスミドpKT25‐zip（３５５６−ｂｐ）は、ＧＣＮ４のロイシンジッパー領
域をコードするＤＮＡ断片（適当なプライマーを用いてＰＣＲ−増幅したもの）
を、上記のように、KpnIによって切断されたｐＫＴ２５中に挿入することによっ
て構築された、ｐＫＴ２５の誘導体である。 プラスミドpUT18‐zip（３１２５−ｂｐ）は、ＧＣＮ４のロイシンジッパー領
域をコードする１１４ｂｐのＤＮＡ断片（適当なプライマーを用いてＰＣＲ−増
幅されたもの）を、上記のように、KpnIとEcoRIとによって開環し、直線化され
たｐＵＴ１８中に挿入することによって構築された、ｐＵＴ１８の誘導体である
。 プラスミドpUT18C‐zip（３１１９−ｂｐ）は、ＧＣＮ４のロイシンジッパー
領域をコードする１１４ｂｐの同ＤＮＡ断片を、上記のように、KpnIとEcoRIと
によって開環し、直線化されたｐＵＴ１８中に挿入することによって構築された
、ｐＵＴ１８Ｃの誘導体である。

【００４６】 以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。実施例１ ＢＴＨ１０１細胞中のＬａｃ^＋およびＭａｌ^＋復帰突然変異体の出現頻度を調
べるために、ＬＢ中で終夜培養したＢＴＨ１０１（１０ｍｌ）を遠心分離して集
め、Ｂ６３培地で３回洗浄し、唯一の炭素源としてマルトースまたはラクトース
を補充したX‐galを含有する最少培地上にプレーティングした。Ｌａｃ^＋および
Ｍａｌ^＋クローンの出現頻度は、各々１０^−８および１０^−９であった。

【００４７】実施例２ 細菌ツーハイブリッド系中における相補性の効率を調べるために、異なる菌株
である、ＤＨＰ１、ＤＨＭ１およびＢＴＨ１０１を、図１および図２に示した多
くのプラスミドの組み合わせで同時形質転換した。各同時形質転換体によって発
現されたβ−ガラクトシダーゼ活性を、上述したような液体培養（Karimovaら、
1998）で測定した。図１および図２のデータは、全体的に独立した実験の２つの
異なるセットに対応するものである。

【００４８】実施例３ ベクターの構築 ｐＵＴ１８ＣはＣｏｌＥ１複製起点を含むため、高コピー数のプラスミドであ
る。このため、これはプレイ（prey）ベクターとして使用した。KpnI−PstI部位
中に長いオリゴヌクレオチドを連結することによって、新たなマルチクローニン
グ部位を作製した。上側および下側のオリゴヌクレオチドの配列は、各々以下の
とおりである：ＡＧＧＣＣＧＣＡＧＧＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＡＧＴＧ
ＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＧＧＣＣＡＣＴＧＧＧＧＣＣＣ
ＧＧＴＡＣ[配列番号２]およびＣＧＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＡＧ
ＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＣＴＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＣＣ
ＴＧＣＧＧＣＣＴＴＧＣＡ[配列番号３]。双方のオリゴヌクレオチドをアニール
し、得られた二本鎖オリゴヌクレオチドを、あらかじめ消化しておいたｐＵＴ１
８Ｃベクターに連結した。pKT25NewSFIは、ｐＫＴ２５の誘導体であり、ベイト
（bait）ベクターとして使用した。それは、pUT18CNewSFIの１つに類似したマル
チクローニング部位を含み、上側のＡＧＧＧＣＣＧＣＡＧＧＧＧＣＣＧＣＧＧＣ
ＣＧＣＡＣＴＡＧＴＧＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣ
ＡＣＴＧＧＧＧＣＣＣＧＧＴＡＣ[配列番号４]および下側のＣＧＧＧＣＣＣＣＡ
ＧＴＧＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＣＴＡＧＴＧ
ＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＣＣＴＧＣＧＧＣＣＣＴＴＧＣＡ[配列番号５]というオ
リゴヌクレオチドで構築された。これら２つのベクターのマップは、図３および
４に示されている。

【００４９】 連結産物をエレクトロポレーションした後に、７．４×１０^６個の独立したコ
ロニーを回収した。ＰＣＲスクリーニング実験によれば、ランダムに選択した１
９２個のコロニーのうち８５個（４４％）が挿入物を含んでおり、これらについ
て引き続き配列を決定した。７９個の配列が利用可能であった。４１個（５２％
）の挿入物を含むプラスミドはセンス方向で見いだされた。挿入物の開始位置の
計算からは、クローニングに明らかな偏りは観察されなかった。７９個の挿入物
の大きさの平均は、決定しなかった。

【００５０】実施例４ ライブラリーの構築 ピロリ菌からのゲノム断片をｐＵＴ１８ＣＮＳ中にクローニングするのに使用
した方法は、他の文献に記載されている（国際公開第９９／２８７４６号パンフ
レット）。要約すると、ｐＵＴ１８ＣＮＳをBamHI消化し、ベクターの自己連結
を防ぐためにグアノシンヌクレオチドで末端をフィルインした。霧状にした（ne
bulized）ピロリ菌からのゲノムＤＮＡを、マングマメヌクレアーゼ、Ｔ４ポリ
メラーゼおよびクレノウ酵素の混合物を用いて平滑末端にした。さらに、挿入物
を、アダプターを用いて、直線化したｐＵＴ１８ＣＮＳプラスミド中に連結した
。ＤＨ１０Ｂ（Gibco BRL社）のエレクトロ−コンピテント細胞を連結産物によ
り形質転換し、ＬＢ＋アンピシリン上にプレーティングした。１９２個のコロニ
ーをランダムに選択し、挿入物を有するプラスミドの実数を求め、クローニング
段階の間に起こるべき偏りを検出した。これらのコロニーは、７２０および７２
１オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ実験において、鋳型として使用した。ＰＣ
Ｒ産物はさらに同じオリゴヌクレオチドを用いて配列決定した。配列をＢＬＡＳ
Ｔソフトウェアで処理した。残りのコロニーを集めてプールした。グリセロール
またはＤＭＳＯと一緒に２０ｍｌを、１ｍｌのクリオチューブ（凍結保存用チュ
ーブ）に分注し、−８０℃で保存した。残りのプール分を５０ｍｌのファルコン
チューブに分注し、遠心分離した。上清を除き、チューブを−８０℃で保存した
。ライブラリ−ＤＮＡをキアジェン・マキシ−プレップキット（Quiagen Maxi-P
rep kit）で抽出した。

【００５１】実施例５ ベイト構築 ｐＫＴ２５ＮＳをBamHＩとPstI制限酵素とで消化した。このベクターをウシの
小腸ホスファターゼを用いて、さらに脱リン酸化した。ウレアーゼの補助タンパ
ク質ＵｒｅＨ（HP0067）は、酵母のスクリーニングにおけるピロリ菌のツーハイ
ブリッドの全ゲノムアプローチにおいて既に使用されている（国際公開第９９／
２８７４６号パンフレット）。全長コード配列に相当する挿入物を、pAS2ΔΔ‐
HP0067から、新たに調製したpKT25NewSFI中にBamHI-PstIサブクローニングした
。

【００５２】実施例６ ライブラリースクリーニング ＤＨＭ１をｃｙａ^-宿主株として使用した。エレクトロ−コンピテントＤＨＭ
１細胞を、pKT25NewSFI-HP0067で形質転換し、ＬＢ＋カナマイシン上にプレーテ
ィングした。ついで、pKT25NewSFI-HP0067細胞をエレクトロ−コンピテントとし
、１：１に希釈したピロリ菌のライブラリー（４０ｎｇ）で形質転換した。形質
転換細胞を、１ｍｌのＳＯＣ培地を加えた後に１時間３７℃でインキュベーショ
ンし、さらに、１ｍｌのＭ９培地で洗浄した。１／１０，０００に希釈し、二重
形質転換体を数えるために、細胞をＬＢ＋カナマイシン＋アンピシリン上にプレ
ーティングした。残りの形質転換細胞は、未希釈のものを９枚のＭ６３＋マルト
ース＋X‐Gal＋ＩＰＴＧ＋カナマイシン＋アンピシリンプレート上にプレーティ
ングするか、１／１０希釈のものを９枚の同じプレート上にプレーティングする
か、または１／１００希釈のものを１０枚の同じプレート上にプレーティングし
た。

【００５３】 ４０ｎｇのライブラリーＤＮＡによるDHM1/pKT25NewSFI-HP0067の形質転換の
後に、５×１０^７個の二重形質転換体が得られた。このため、各々１／１０また
は１／１００希釈を行わない場合には、約５×１０^６、５×１０^５および５×１
０^４個の細菌をＭ６３スクリーニングプレート上にプレーティングした。１５日
間増殖させ、０倍希釈で３個、１／１０希釈で１１個、１／１００希釈で４個の
１８個の陽性クローンを選択した。

【００５４】実施例７ プレイの分離および同定 ３０℃で増殖および青染色後、陽性クローンをＭ６３＋マルトース＋X-Gal＋
カナマイシン＋アンピシリンのプレート上に線状に塗布し、バックグラウンドの
陰性コロニーから分離した。ＬＢ＋カナマイシン中で終夜培養し、プラスミド・
ミニ−プレップ（Plasmid mini-preps、Qiagen社製）で、プレイ・プラスミドを
回収した。次いで、７２０および７２１プライマーを用いて、プレイの挿入断片
の配列を決定した。これらの配列上でＢＬＡＳＴホモロジーを行った。 全てのＸＸ陽性クローンの配列を決定した。クローンの同定を表２に示す。

【００５５】

【表２】

【００５６】 挿入物の最初のヌクレオチドの位置に従って選別し、表３の結果を得た。

【００５７】

【表３】

【００５８】 １８個のクローンのうち５個は、別のウレアーゼ補助タンパク質ｕｒｅＦ（HP
0069）と対応しており、これはＰＣＴ 国際公開第９９／２８７４６号パンフレ
ットの対応する酵母のツーハイブリッドスクリーニングでも見出された。これら
５個のクローンから、４つの独立した融合部（挿入断片の開始部位が異なる）が
見出された。これらの挿入体は全て、Ｔ１８と読み枠が一致することが見出され
た。１８個のクローンのうち５個は、ＨＰ１４９３に対応するが、これはピロリ
菌（Helicobacter pylori）の予想されるコード領域で、公表された遺伝子デー
タベースに納められている他の配列のいずれとも公知のホモロジーを有していな
かった。この５個のクローンには、少なくとも３個の独立融合部が見出され、う
ち２個はＴ１８を有する枠の外に見出された。このプレイは、対応する酵母のツ
ーハイブリッドスクリーニング（国際公開第９９／２８７４６号パンフレット）
においては見出されなかった。これは、酵母のツーハイブリッド技術で単離する
ことができないｕｒｅＨの新規なタンパク質パートナーに相当するものであるの
かも知れない。

【００５９】 本発明は国際公開第９９／２８７４６号パンフレットに記載した大腸菌中での
シグナル増幅系を利用しており、目的とするタンパク質は、百日咳菌のアデニル
酸シクラーゼの触媒ドメインにある２つの相補断片と遺伝的に融合されている。
百日咳菌はｃｙａＡ遺伝子によりコードされるカルモジュリン（ＣａＭ）依存性
アデニル酸シクラーゼ毒素を産生する。

【００６０】 触媒ドメインは、この１７０６残基長のタンパク質の最初の４００個のアミノ
酸内に位置している。

【００６１】 触媒ドメインは、タンパク質分解により２つの相補断片、Ｔ２５およびＴ１８
に開裂しうるが、これらはＣａＭ存在下では完全に活性のある三重複合体に会合
していた。ＣａＭ不存在下では、両断片の混合物は検出可能な活性を示さなかっ
たため、再度会合して基礎となるＣａＭ非依存性活性を発揮できなかったことが
示唆された。

【００６２】 活性な酵素の産生に必要であるこれら２つの相補性断片Ｔ２５およびＴ１８は
、ＣａＭ存在下に大腸菌中で別個のものとして発現させると互いを認識できず、
機能を有する酵素を再構築することができない。しかしながら、Ｔ２５およびＴ
１８を、相互作用が可能なペプチドあるいはタンパク質に融合させ、キメラペプ
チドのヘテロ二量体とすると、アデニル酸シクラーゼ断片間に機能的相補性が生
じる。

【００６３】 アデニル酸シクラーゼ欠損大腸菌株（ＣａＭあるいはＣａＭ関連タンパク質を
欠く大腸菌）中で発現させると、相互作用すると推定されるタンパク質に融合さ
せたＴ２５およびＴ１８断片は再度会合してｃＡＭＰ合成を開始する。

【００６４】 標的リガンドと目的の分子との相互作用は、２つのアデニル酸シクラーゼ断片
間にｃＡＭＰ合成に至る機能的相補性を生じさせ、これにより、今度はいくつか
の内在遺伝子の発現が誘発される。このアッセイを用いれば、単純な遺伝的スク
リーニングにより、所定の標的と相互作用するタンパク質を発現している特定の
クローンを選択することができる。

【００６５】 本発明によれば、酵素の第一断片に相当する第一キメラポリペプチド、および
酵素の第二断片または前記酵素を活性化しうる調節物質に相当する第二キメラポ
リペプチドを含む、少なくとも２つのキメラポリペプチドの細菌マルチハイブリ
ッド系、より好ましくはツーハイブリッド系、を含んでなり、前記第一断片は目
的の分子に融合され、前記第二断片または前記調節物質は標的リガンドに融合さ
れており、前記酵素の活性が目的の前記分子と前記標的リガンドとのin vivo相
互作用により回復して、シグナル増幅が行なわれるシグナル増幅系であって、前
記シグナル増幅がＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３０９を有するＢＴＨ１０１
株およびＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３１０を有するＤＨＭ１株からなる群
より選択される大腸菌（E. coli）株中で行われる、シグナル増幅系が提供され
る。

【００６６】 本発明の一つの実施態様によれば、酵素はあらゆる起源からのアデニル酸シク
ラーゼおよびグアニル酸シクラーゼからなる群より選択することができる。様々
な起源とは、ボルデテラ（Bordetella）属またはこの型の酵素を産生するあらゆ
る生物をいう。一つの具体例においては、前記酵素は、国際公開第９９／２８７
４６号パンフレットに記載されているような、アデニル酸シクラーゼ酵素の最初
の４００個のアミノ酸残基内に位置している、ボルデテラ属菌のアデニル酸シク
ラーゼ（ＣｙａＡ）の触媒ドメインである。

【００６７】 本発明はまた、第一断片および第二断片にも関するものであり、これらは前記
酵素の活性を回復させることによってin vitroで前記酵素の天然アクチベーター
と機能的に相互作用する、同酵素からの断片のいずれかの組み合わせである。

【００６８】 本発明の一つの実施態様によれば、第一および第二断片は国際公開第９９／２
８７４６号パンフレットに記載されている以下の群から選択される。 （ａ）ＣｙａＡの１番〜２２４番目のアミノ酸に相当する断片Ｔ２５とＣｙａ
Ａの２２５番〜３９９番目のアミノ酸に相当する断片Ｔ１８； （ｂ）ＣｙａＡの１番〜２２４番目のアミノ酸に相当する断片とＣｙａＡの２
２４番〜３８４番目のアミノ酸に相当する断片； （ｃ）ＣｙａＡの１番〜１３７番目のアミノ酸に相当する断片とＣｙａＡの１
３８番〜４００番目のアミノ酸に相当する断片； （ｄ）ＣｙａＡの１番〜３１７番目のアミノ酸に相当する断片とＣｙａＡの３
１８番〜４００番目のアミノ酸に相当する断片；および （ｅ）Ｇタンパク質、フォルスコリン等の分子と会合する真核細胞のアデニル
酸シクラーゼからの２つの断片。

【００６９】 第一および第二断片は、国際公開第９９／２８７４６号パンフレットに記載さ
れているように百日咳菌ＣｙａＡの１番〜２２４番目のアミノ酸に相当する断片
Ｔ２５と、百日咳菌ＣｙａＡの２２５番〜３９９番目のアミノ酸に相当する断片
Ｔ１８とすることができる。一つの実施態様によれば、第一断片はボルデテラの
アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）の触媒ドメインの変異断片である。

【００７０】 調節物質は、この酵素の天然アクチベーターまたはその断片とすることができ
る。天然アクチベーターは、カルモジュリン（ＣａＭ）またはその断片でもよく
、第一断片は野生型酵素に対して変異していてもよい。カルモジュリンの断片は
約７０アミノ酸長で、好ましくは、国際公開第９９／２８７４６号パンフレット
に記載されているような、哺乳類カルモジュリンの７７番〜１４８番残基に相当
するものであってもよい。

【００７１】 本発明はまた、目的の分子と標的リガンドとの相互作用が、本発明によるシグ
ナル増幅系を用い、シグナル増幅を生じさせて転写活性化または転写抑制を誘発
することによって検出される、標的リガンドに結合しうる目的の分子の選択方法
であって、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３０９を有するＢＴＨ１０１株およ
びＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３１０を有するＤＨＭ１株からなる群より選
択される大腸菌（E. coli）株中で行われる、目的の分子の選択方法に関する。

【００７２】 第一の実施態様によれば、本発明によるシグナル増幅系は、酵素の少なくとも
２つの異なる断片の細菌マルチハイブリッド系を含んでなるものであり、前記酵
素の活性が前記目的の分子と前記標的リガンドとの相互作用によって回復する。

【００７３】 第二の実施態様によれば、本発明によるシグナル増幅系は、少なくとも酵素の
第一断片および調節物質の細菌マルチハイブリッド系を含んでなるものであり、
前記酵素の活性が前記目的の分子と前記標的リガンドとの相互作用によって回復
する。

【００７４】 本発明によるシグナル増幅系は、国際公開第９９／２８７４６号パンフレット
に記載の細菌マルチハイブリッド系を含む。

【００７５】 本発明による目的の分子の選択方法では、目的の分子と前記標的リガンドとの
相互作用は、転写活性化を誘発するシグナル増幅によって検出され、シグナリン
グ分子の合成またはリポーター遺伝子の発現を測定することによって定量される
。

【００７６】 シグナル増幅は、シグナリング分子の産生に相当する。シグナリング分子は、
シグナリングカスケード反応をもたらしうるすべての分子である。一つの実施態
様によれば、シグナリング分子はｃＡＭＰの合成に相当し、別の実施態様では、
ｃＧＭＰの合成に相当する。

【００７７】 転写活性化は、リポーター遺伝子の発現をもたらす。このリポーター遺伝子は
、ラクトースやマルトースのような栄養マーカーをコードする遺伝子；アンピシ
リン、クロラムフェニコール、カナマイシンまたはテトラサイクリンのような抗
生物質に対する耐性を付与する遺伝子；毒素をコードする遺伝子；グリーン蛍光
タンパク質（ＧＦＰ）型の蛍光マーカーのような色素マーカー；ファージλ受容
体、ｌａｍＢのようなファージ受容体タンパク質またはその断片をコードする遺
伝子、および選択可能な表現型を与える他のいずれかの遺伝子からなる群より選
択される。

【００７８】 一つの実施態様によれば、ｃＡＭＰは、ＣＡＰと結合すると、異化オペロンの
転写を活性化することができ、細菌が、マルトースやラクトースといった炭水化
物を発酵すること、および細菌表面のマーカーとなるファージλ受容体、Ｌａｍ
Ｂタンパク質を発現することを可能とする。ＢＴＨ１０１またはＤＨＭ１を用い
る細菌マルチハイブリッド系を含むこのシグナル増幅系は、例えば、小ペプチド
（ＧＣＮ４ロイシンジッパー）、細菌タンパク質（チロシルｔＲＮＡシンターゼ
）、または真核タンパク質（酵母Ｐｒｐ１１／Ｐｒｐ２１複合体）との相互作用
を明らかにすることができる。

【００７９】 したがって、いずれかの目的遺伝子がｃＡＭＰ／ＣＡＰ依存性プロモーターと
融合している特定のリポーターカセットをデザインすることができる。このよう
にして、複合体ライブラリーのスクリーニングおよび選択を促進するために、抗
生物質耐性遺伝子を用いるこのような単純な選択系を構築することが可能となる
。

【００８０】 リポーター遺伝子は、ｃＡＭＰ／ＣＡＰ依存性プロモーターの制御下では、天
然には細菌中に存在しない毒素であってもよい。これは、標的リガンドと目的の
分子との所定の相互作用を失わせる化合物あるいは突然変異を探索する場合に、
特に有用となる。この構築物によれば、標的リガンドと目的の分子との会合が起
こると、ｃＡＭＰが産生されて毒素遺伝子の発現スイッチが入り、細胞は死滅す
る。標的リガンドと目的の分子との相互作用を刺激または阻害できる物質および
相互作用を失わせる物質は、毒素遺伝子の発現を遮断し、細胞の増殖を可能にす
ることができるだろう。標的リガンドと目的の分子との相互作用を失わせる物質
の簡易な選別は、ファージλに対する耐性である。ファージ受容体であるＬａｍ
Ｂタンパク質は、ｌａｍＢ遺伝子から形成され、マルトース・レギュロンの一部
となっているため、その発現にはｃＡＭＰが必要である。標的リガンドと目的の
分子との相互作用を失わせる物質は、ｃＡＭＰ合成を阻害し、細菌はファージλ
に耐性となる。その結果、細胞は増殖する。

【００８１】 所定の相互作用を失わせる化合物または突然変異を選択する他のスキームは、
ｃＡＭＰ／ＣＡＰにより抑制されるプロモーターの転写制御下に選択できるマー
カー（例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、テトラサ
イクリンなどに対する耐性を付与する遺伝子）を保有する菌株を構築することに
より、デザインできる。このようなｃＡＭＰ／ＣＡＰ抑制性プロモーターは、プ
ロモーター領域内に合成のＣＡＰ結合部位を導入することにより作製することが
でき、それについてはMoritaらが既に報告している（Morita T、Shigesada K、K
imizuka F、Aiba H. (1988), 'Regulatory effect of a synthetic CRP recogni
tion sequence placed downstream of a promoter' Nucleic Acids Res. 16: 73
15 - 32）。

【００８２】 各々グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）として生物学的に活性な物質を検出す
る方法に関する、国際出願公開第９６／２３８９８号パンフレット（Thastrup O
.ら）および国際出願公開第９７／１１０９４号パンフレット（Thastrup O.ら）
、ならびにＧＦＰの使用と新規な変異型ＧＦＰについて記載している国際出願公
開第９７／０７４６３号パンフレット（Chalfie O.ら）は、参照することにより
本明細書の開示の一部とされる。

【００８３】 本発明における標的リガンドは、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、受容
体、リガンド、抗原、抗体、ＤＮＡ結合タンパク質、糖タンパク質、リポタンパ
ク質、および組換えタンパク質からなる群より選択される。

【００８４】 目的の分子の選択方法によれば、目的の分子は、標的リガンドと相互作用する
ことができ、可能であれば前記標的リガンドに結合できるものである。目的の分
子の選択方法の特定の実施態様によれば、目的の分子が既知の野生型分子に対す
る変異分子であり、前記目的の分子は、標的リガンドと相互作用する能力につい
て試験される。

【００８５】 本発明は、本発明による目的の分子の選択方法によって同定された目的の分子
を含む。本発明はさらに、酵素またはその断片と結合した融合標的リガンドと相
互作用する分子を発現できるポリヌクレオチドに相当する目的の分子を含む。

【００８６】 好適な実施態様によれば、本発明による目的の分子の選択は、ＤＨＭ１株中で
行われる。別の好ましい実施態様によれば、本発明による目的の分子の選択は、
ＢＴＨ１０１株中で行われる。

【００８７】 本発明はまた、目的の分子を選択するためのキットであって、 （ａ）本発明によるシグナル増幅系； （ｂ）Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３０９を有するＢＴＨ１０１株とＣ．
Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３１０を有するＤＨＭ１株とからなる群より選択さ
れる、内因性アデニル酸シクラーゼ欠損細菌株；および （ｃ）唯一の炭素源としてラクトースもしくはマルトースを補充した最少培地
のような指示培地または選択培地、抗生物質を含む培地、蛍光、発光を可視化す
るための培地、Ｘ−ＧＡＬ培地のような慣用的な培地、およびファージ受容体の
存在による選別を可能とする培地からなる群より選択される、相補性の検出を可
能とする培地、 を含んでなる、キットに関する。

【００８８】 他の実施態様によれば、本発明は、目的の分子を選択するためのキットであっ
て、 （ａ）目的の分子が既知の野生型分子に対する変異分子である、本発明による
シグナル増幅系； （ｂ）目的の分子が対照としての既知の野生型分子である、本発明によるシグ
ナル増幅系； （ｃ）Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３０９を有するＢＴＨ１０１株とＣ．
Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３１０を有するＤＨＭ１株とからなる群より選択さ
れる、内因性アデニル酸シクラーゼ欠損細菌株； （ｄ）唯一の炭素源としてラクトースもしくはマルトースを補充した最少培地
のような指示培地または選択培地、抗生物質を含む培地、蛍光、発光を可視化す
るための培地、Ｘ−ＧＡＬ培地のような慣用的な培地、および各シグナル増幅系
についてファージ受容体の存在による選別を可能とする培地からなる群より選択
される、相補性の検出を可能とする培地；および （ｅ）変異分子でのシグナル増幅系が、野生型でのシグナル増幅系に対して、
増強されるかまたは阻害されるかを検出する手段、 を含んでなる、キットに関する。

【００８９】 本発明はまた、刺激活性または阻害活性が、それぞれ、本発明によるシグナル
増幅系を用いて、増幅を生じさせて、転写活性化を誘発するかまたは消失させる
ことによって検出され、前記シグナル増幅および誘発されたかまたは消失した転
写活性が、いずれの物質も含まない同一のシグナル増幅系から得られるものと比
較される、標的リガンドと目的の分子との相互作用を刺激または阻害しうる物質
のスクリーニング方法であって、スクリーニングが、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号
Ｉ−２３０９を有するＢＴＨ１０１株およびＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３
１０を有するＤＨＭ１株からなる群より選択される大腸菌（E. coli）株中で行
われる、前記スクリーニング方法に関する。

【００９０】 好適な実施態様によれば、本発明による、標的リガンドと目的の分子との相互
作用を刺激または阻害しうる物質のスクリーニング方法は、前記シグナル増幅系
が、酵素の少なくとも２つの異なる断片の細菌マルチハイブリッド系を含んでな
るものであり、前記酵素の活性が前記目的の分子と前記標的リガンドとの相互作
用によって回復することによって特徴付けられる。他の好適な実施態様によれば
、本発明による、標的リガンドと目的の分子との相互作用を刺激または阻害しう
る物質のスクリーニング方法は、前記シグナル増幅系が、少なくとも酵素の第一
断片および調節物質の細菌マルチハイブリッド系を含んでなるものであり、前記
酵素の活性が前記目的の分子と前記標的リガンドとの相互作用によって回復する
ことによって特徴付けられる。

【００９１】 本発明による、標的リガンドと目的の分子との相互作用を刺激しうる物質のス
クリーニング方法においては、シグナル増幅はシグナリング分子の生成に相当す
る。

【００９２】 本発明による、標的リガンドと目的の分子との相互作用を阻害しうる物質のス
クリーニング方法では、シグナリング分子の生成に相当するシグナル増幅はブロ
ックされるかまたは部分的に失われる。

【００９３】 本発明による、標的リガンドと目的の分子との相互作用を刺激しうる物質のス
クリーニング方法では、転写活性化がリポーター遺伝子の発現をもたらす。

【００９４】 本発明による、標的リガンドと目的の分子との相互作用を阻害しうる物質のス
クリーニング方法では、リポーター遺伝子の発現をもたらす前記転写活性化がブ
ロックされるかまたは部分的に失われる。

【００９５】 本発明による、標的リガンドと目的の分子との相互作用を刺激または阻害しう
る質のスクリーニング方法では、前記標的リガンドは、受容体、リガンド、抗原
、抗体、ＤＮＡ結合タンパク質、糖タンパク質、およびリポタンパク質からなる
群より選択され、前記物質は、刺激または阻害親和性を有する、タンパク質、糖
タンパク質、リポタンパク質、リガンド、および他のいずれかの薬物からなる群
より選択されるものである。

【００９６】 本発明による、標的リガンドと目的の分子との相互作用を刺激または阻害しう
る物質のスクリーニング方法においては、シグナリング分子は、ｃＡＭＰの合成
またはｃＧＭＰの合成に相当する。

【００９７】 本発明によるスクリーニング方法においては、リポーター遺伝子は、ラクトー
ス、マルトースのような栄養マーカーをコードする遺伝子；アンピシリン、カナ
マイシンまたはテトラサイクリンのような抗生物質に対する耐性を付与する遺伝
子；毒素をコードする遺伝子；グリーン蛍光タンパク（ＧＦＰ）型の蛍光マーカ
ーのような色素マーカー；ファージλ受容体、ｌａｍＢのようなファージ受容体
タンパク質またはその断片をコードする遺伝子；および選択可能な表現型を与え
る他のいずれかの遺伝子からなる群より選択されるものである。

【００９８】 好適な実施態様によれば、本発明によるスクリーニング方法では、目的の分子
は既知の野生型分子に対する変異分子であり、前記目的の分子は、前記標的リガ
ンドと相互作用する能力について試験される。

【００９９】 好適な実施態様によれば、物質のスクリーニングはＤＨＭ１株中で行われる。
別の好ましい実施態様によれば、物質のスクリーニングはＢＴＨ１０１株中で行
われる。

【０１００】 本発明はまた、標的リガンドと目的の分子との相互作用を刺激または阻害しう
る物質をスクリーニングするためのキットであって、 （ａ）標的リガンドと目的の分子との相互作用を刺激または阻害しうる物質を
含む、本発明によるシグナル増幅系； （ｂ）対照としていかなる物質も含まない、本発明によるシグナル増幅系； （ｃ）Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３０９を有するＢＴＨ１０１株および
Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３１０を有するＤＨＭ１株からなる群より選択
される、内因性アデニル酸シクラーゼ欠損細菌株； （ｄ）唯一の炭素源としてラクトースもしくはマルトースを補充した最少培地
のような指示プレートまたは選択培地、抗生物質を含む培地、蛍光を可視化する
ための培地、慣用的な培地、およびファージ受容体の存在による選別を可能とす
る培地からなる群より選択される、相補性の検出を可能とする培地；および （ｅ）前記物質を含むシグナル増幅系が、いかなる物質をも含まないシグナル
増幅系に対して、増強されるかまたは阻害されるかを検出する手段、 を含んでなる、キットに関する。

【０１０１】 百日咳菌アデニル酸シクラーゼ活性の機能分析は、内因性アデニル酸シクラー
ゼ欠損大腸菌株中で容易にモニターすることができる。大腸菌中において、転写
活性化因子であるＣＡＰ（異化代謝産物アクチベータータンパク質）に結合する
ｃＡＭＰは、ラクトースまたはマルトースなどの炭水化物の異化代謝に関与する
遺伝子を含む、種々の遺伝子の発現を多面発現作用的に調節する［Ullmann A. &
Danchin A. (1983) Advances in Cyclic Nucleotide Research (Raven Press,
New York) Vol. 15, pp.1-53］。したがって、ｃＡＭＰを欠く大腸菌株は、ラク
トースまたはマルトースを発酵できない。ＣｙａＡの全触媒ドメイン（アミノ酸
１番〜３９９番目）をｌａｃＺ（プラスミドpDIA5240）の転写制御および翻訳制
御下に大腸菌ｃｙａ中で発現させると、そのカルモジュリン非依存性の残存活性
が、アデニル酸シクラーゼ欠損株を相補するのに十分であり、ラクトースまたは
マルトースの発酵能が回復する（Ladant D., Glaser, P. & Ullmann A. (1992)
J. Biol. Chem. 267, 2244-2250）。これは標識プレート上（すなわち、LB-X-Ga
lまたはマルトース添加マッコンキー培地）または選択培地上（唯一の炭素源と
してラクトースまたはマルトースを補充した最少培地）でスコアにすることがで
きる。

【０１０２】 さらに本発明は、本発明の方法によって同定される目的の分子に関する。

【０１０３】 本発明はまた、本発明の方法によって同定される、目的の分子と標的リガンド
との相互作用を刺激または阻害しうる物質に関する。

【０１０４】 本発明はまた、前記細菌マルチハイブリッド系が、 （ａ）酵素の第一断片に相当する第一キメラポリペプチド； （ｂ）酵素の第二断片または前記酵素を活性化しうる調節物質に相当する第二
キメラポリペプチド；および （ｃ）標的リガンドと目的の分子との相互作用を刺激または阻害しうる物質、
を含み、前記第一断片は目的の分子に融合され、前記第二断片または前記調節物
質は標的リガンドに融合されており、前記酵素の活性が目的の前記分子と前記標
的リガンドとの相互作用によって回復して、シグナル増幅が行なわれる、本発明
によるシグナル増幅系であって、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３０９を有す
るＢＴＨ１０１株およびＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３１０を有するＤＨＭ
１株からなる群より選択される内因性アデニル酸シクラーゼ欠損細菌株をさらに
含む、シグナル増幅系に関する。

【０１０５】 また本発明は、細菌マルチハイブリッド系で形質転換されたベクターの集合体
であって、各ベクターが酵素の第一または第二断片をコードするポリヌクレオチ
ドに融合した、目的の分子をコードするポリヌクレオチドを含有するものである
前記ベクターの集合体を含有する、ＤＮＡライブラリーに関し；前記ポリヌクレ
オチドは、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、およびミトコンドリアＤＮＡから
なる群より選択されるものである。好適な実施態様によれば、本発明によるＤＮ
Ａライブラリーは、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３６７を有するピロリ菌（
H. pylori）ＤＮＡライブラリーである。

【０１０６】 本発明はさらに、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ． 受託番号Ｉ−２３０９を有するＢＴＨ１
０１株およびＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ． 受託番号Ｉ−２３１０を有するＤＨＭ１株に関
する。

【０１０７】 概して、本発明は、ＰＣＴ出願公開第９９／２８７４６号パンフレットに記載
されたＤＨＰ１株の限界を克服する新たな大腸菌Ｃｙａの２株の構築および選択
に関する。新規な株であるＤＨＭ１およびＢＴＨ１０１は、安定なＣｙａ^-表現
型を示す。ＤＨＭ１はｃｙａ遺伝子内に約２００ｂｐの内部欠失を有する。一方
、ＢＴＨ１０１はｃｙａ遺伝子内に特徴づけされていない突然変異を持ち、この
変異は、本株からＣｙａ+復帰突然変異体が分離されないことから、欠失の可能
性が高い。

【０１０８】 ＢＴＨ１０１中における標準的なハイブリッドタンパク質間の機能的相補性は
、ＤＨＰ１中におけるそれと同程度の効率であると思われた。また、ＤＨＭ１中
における同じ標準的なハイブリッドタンパク質間の機能的相補性は、ＤＨＰ１中
よりは効率が劣るものの、試験した全ての大腸菌ｃｙａ^-株の中でより一層大き
い。

【０１０９】 これら２つの菌株をピロリ菌の断片または完全オープンリーディングフレーム
の全ゲノムライブラリースクリーニングを行うための受容細胞として使用し、規
定した‘ベイト’タンパク質と相互作用しうるポリペプチドを探索した。これら
の結果は、これらの新菌株を使用すれば、細菌ツーハイブリッドスクリーニング
がタンパク質−タンパク質相互作用の大規模分析に適応できることを示している
。

【０１１０】 明細書の教示から明らかなように、本発明は上述した１または数例の詳細な実
施態様の範囲内に限定されない；本発明はまた、本発明の主題または範囲から逸
脱することなしに、当業者によって実施されるすべての選択肢を包含している。

【０１１１】参考文献 下記の刊行物を引用した。各刊行物の開示全体は信用に足るものであり、本明
細書中に参考文献として包含されている。 1. Galser, P., Roy, A., A. Danchin, 1989, J. Bacteriol., 171:5176-5178.
Molecular charactersization of two ｃｙａ mutations, ｃｙａ-８５４ and
ｃｙａR1. 2. Karimova, G., J. Pidoux, A. Ullmann and D. Ladant, 1998, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 95:5725-5756. A bacterial two-hybrid system based on
a reconstituted signal transduction pathway. 3. Miller, J. H., 1972, Experiments in Molecular Genetics. 4. Wanner, B.L., 1986, J. Mol. Biol., 191:39-58. Novel regulatory mutan
ts of the phosphate regulon in Escherichia coli K-12. 5. Sancar, A., Rupp, W.D., 1979. Physical map of recA gene. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 76:3144-3148.

【図面の簡単な説明】

【図１】 異なる大腸菌ｃｙａ株におけるｚｉｐ−ｚｉｐ相互作用の結果を示す図である
。β−ガラクトシダーゼ活性が３つの異なる株、ＤＨＭ１、ＢＨＴ１０１および
ＤＨＰ１で見られた。

【図２】 異なる菌株における相互作用の結果を示す図である。β−ガラクトシダーゼ活
性は、菌株ＤＨＭ１およびＢＴＨ１０１で見られた。

【図３】 プラスミドpUT18CNewSfiのマップである。

【図４】 プラスミドpKT25NewSfiのマップである。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 ハイブリジェニックス・ソシエテ・アノニ ム ＨＹＢＲＩＧＥＮＩＣＳ Ｓ．Ａ． フランス国、75012パリ、アブニュー・ド メスニル、180 (72)発明者 グゼル、カリモバ フランス国パリ、リュ、デュパン、11 (72)発明者 ダニエル、ラダン フランス国カシャン、リュ、ド、ランス、 ３ (72)発明者 アニェ、ユルマン フランス国パリ、リュ、ポール、デュピュ イ、３ (72)発明者 リュック、セリッグ フランス国シャラントン、ル、ポン、リ ュ、ド、パリ、160ビス (72)発明者 ピエール、ルグラン フランス国パリ、リュ、ミゾン、５ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA03 CA04 CA07 CA11 DA06 EA04 FA10 GA11 HA11 4B063 QA01 QA05 QQ06 QQ13 QQ43 QQ79 QR33 QR66 QR68 QR69 QR75 QR80 QS24 QS36 QX01 4B065 AA01X AA01Y AA26X AB01 AC10 AC20 BA02 BA25 BB16 CA46

Claims (49)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）酵素の第一断片に相当する第一キメラポリペプチド； （ｂ）酵素の第二断片または前記酵素を活性化しうる調節物質に相当する第二
   キメラポリペプチド、 を含む、少なくとも２つのキメラポリペプチドの細菌マルチハイブリッド系を含
   んでなり、前記第一断片は目的の分子に融合され、前記第二断片または前記調節
   物質は標的リガンドに融合されており、前記酵素の活性が目的の前記分子と前記
   標的リガンドとのin vivo相互作用により回復して、シグナル増幅が行なわれる
   シグナル増幅系であって、 前記シグナル増幅がＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３０９を有するＢＴＨ１
   ０１株およびＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３１０を有するＤＨＭ１株からな
   る群より選択される大腸菌（E. coli）株中で行われる、シグナル増幅系。
2. 【請求項２】 前記酵素が、あらゆる起源からのアデニル酸シクラーゼおよびグアニル酸シク
   ラーゼからなる群より選択される酵素である、請求項１に記載のシグナル増幅系
   。
3. 【請求項３】 前記酵素が、アデニル酸シクラーゼ酵素の最初の４００アミノ酸残基内に位置
   する、ボルデテラ属（Bordetella）のアデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）の触媒
   ドメインである、請求項２に記載のシグナル増幅系。
4. 【請求項４】 前記第一および第二断片が、前記酵素の活性を回復させることによってin vit
   roで前記酵素の天然アクチベーターと機能的に相互作用する、同酵素からの断片
   のいずれかの組み合わせである、請求項３に記載のシグナル増幅系。
5. 【請求項５】 前記第一および第二断片が、 （ａ）ＣｙａＡの１番〜２２４番目のアミノ酸に相当する断片Ｔ２５とＣｙａ
   Ａの２２５番〜３９９番目のアミノ酸に相当する断片Ｔ１８； （ｂ）ＣｙａＡの１番〜２２４番目のアミノ酸に相当する断片とＣｙａＡの２
   ２４番〜３８４番目のアミノ酸に相当する断片； （ｃ）ＣｙａＡの１番〜１３７番目のアミノ酸に相当する断片とＣｙａＡの１
   ３８番〜４００番目のアミノ酸に相当する断片； （ｄ）ＣｙａＡの１番〜３１７番目のアミノ酸に相当する断片とＣｙａＡの３
   １８番〜４００番目のアミノ酸に相当する断片；および （ｅ）Ｇタンパク質、フォルスコリン等の分子と会合する真核細胞のアデニル
   酸シクラーゼからの２つの断片、 からなる群より選択されるものである、請求項４に記載のシグナル増幅系。
6. 【請求項６】 前記第一および第二断片が、百日咳菌ＣｙａＡの１番〜２２４番目のアミノ酸
   に相当する断片Ｔ２５と、百日咳菌ＣｙａＡの２２５番〜３９９番目のアミノ酸
   に相当する断片Ｔ１８である、請求項４または５に記載のシグナル増幅系。
7. 【請求項７】 前記調節物質が、前記酵素の天然アクチベーターまたはその断片である、請求
   項１〜３のいずれか一項に記載のシグナル増幅系。
8. 【請求項８】 前記天然アクチベーターがカルモジュリン（ＣａＭ）またはその断片であり、
   前記第一断片が野生型酵素に対して変異しているものである、請求項７に記載の
   シグナル増幅系。
9. 【請求項９】 前記第一断片が、ボルデテラ属のアデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）の触媒ド
   メインの変異断片である、請求項８に記載のシグナル増幅系。
10. 【請求項１０】 細菌マルチハイブリッド系で形質転換されたベクターの集合体であって、各ベ
    クターが酵素の第一または第二断片をコードするポリヌクレオチドに融合した、
    目的の分子をコードするポリヌクレオチドを含有するものである前記ベクターの
    集合体を含有する、ＤＮＡライブラリー。
11. 【請求項１１】 前記ポリヌクレオチドが、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、およびミトコン
    ドリアＤＮＡからなる群より選択されるものである、請求項１０に記載のＤＮＡ
    ライブラリー。
12. 【請求項１２】 ピロリ菌（H. pylori）のＤＮＡライブラリーが、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号
    Ｉ−２３６７を有するものである、請求項１０または１１に記載のＤＮＡライブ
    ラリー。
13. 【請求項１３】 目的の分子と標的リガンドとの相互作用が、請求項１〜９のいずれか一項に記
    載のシグナル増幅系を用い、シグナル増幅を生じさせて転写活性化または転写抑
    制を誘発することによって検出される、標的リガンドに結合しうる目的の分子の
    選択方法であって、 Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３０９を有するＢＴＨ１０１株およびＣ．Ｎ
    ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３１０を有するＤＨＭ１株からなる群より選択される
    大腸菌（E. coli）株中で行われる、目的の分子の選択方法。
14. 【請求項１４】 前記シグナル増幅がシグナリング分子の生成に相当する、請求項１３に記載の
    目的の分子の選択方法。
15. 【請求項１５】 前記転写活性化がリポーター遺伝子の発現をもたらす、請求項１３に記載の目
    的の分子の選択方法。
16. 【請求項１６】 前記シグナル増幅系が、酵素の少なくとも２つの異なる断片の細菌マルチハイ
    ブリッド系を含んでなるものであり、前記酵素の活性が前記目的の分子と前記標
    的リガンドとの相互作用によって回復する、請求項１３〜１５のいずれか一項に
    記載の目的の分子の選択方法。
17. 【請求項１７】 前記シグナル増幅系が、少なくとも酵素の第一断片および調節物質の細菌マル
    チハイブリッド系を含んでなるものであり、前記酵素の活性が前記目的の分子と
    前記標的リガンドとの相互作用によって回復する、請求項１３〜１５のいずれか
    一項に記載の目的の分子の選択方法。
18. 【請求項１８】 前記標的リガンドが、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、受容体、リガン
    ド、抗原、抗体、ＤＮＡ結合タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質および
    組換えタンパク質からなる群より選択されるものである、請求項１３〜１７のい
    ずれか一項に記載の目的の分子の選択方法。
19. 【請求項１９】 前記目的の分子が、前記標的リガンドと相互作用することができ、可能であれ
    ば前記標的リガンドに結合できるものである、請求項１３〜１８のいずれか一項
    に記載の目的の分子の選択方法。
20. 【請求項２０】 前記目的の分子と前記標的リガンドとの相互作用が、転写活性化を誘発するシ
    グナル増幅によって検出され、シグナリング分子の合成またはリポーター遺伝子
    の発現を測定することによって定量される、請求項１３〜１９のいずれか一項に
    記載の目的の分子の選択方法。
21. 【請求項２１】 前記シグナリング分子がｃＡＭＰの合成に相当するものである、請求項１３〜
    ２０のいずれか一項に記載の目的の分子の選択方法。
22. 【請求項２２】 前記シグナリング分子がｃＧＭＰの合成に相当するものである、請求項１６に
    記載の目的の分子の選択方法。
23. 【請求項２３】 前記リポーター遺伝子が、ラクトース、マルトースのような栄養マーカーをコ
    ードする遺伝子；アンピシリン、カナマイシンまたはテトラサイクリンのような
    抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子；毒素をコードする遺伝子；グリーン蛍
    光タンパク（ＧＦＰ）型の蛍光マーカーのような色素マーカー；ファージλ受容
    体、ｌａｍＢのようなファージ受容体タンパク質またはその断片をコードする遺
    伝子；および選択可能な表現型を与える他のいずれかの遺伝子からなる群より選
    択されるものである、請求項１５に記載の目的の分子の選択方法。
24. 【請求項２４】 前記目的の分子が既知の野生型分子に対する変異分子であり、前記目的の分子
    が、前記標的リガンドと相互作用する能力について試験される、請求項１３〜２
    ３のいずれか一項に記載の目的の分子の選択方法。
25. 【請求項２５】 前記選択がＤＨＭ１株中で行われる、請求項１３〜２５のいずれか一項に記載
    の目的の分子の選択方法。
26. 【請求項２６】 前記選択がＢＴＨ１０１株中で行われる、請求項１３〜２５のいずれか一項に
    記載の目的の分子の選択方法。
27. 【請求項２７】 目的の分子を選択するためのキットであって、 （ａ）請求項１〜９のいずれか一項に記載のシグナル増幅系； （ｂ）Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３０９を有するＢＴＨ１０１株とＣ．
    Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３１０を有するＤＨＭ１株とからなる群より選択さ
    れる、内因性アデニル酸シクラーゼ欠損細菌株；および （ｃ）唯一の炭素源としてラクトースもしくはマルトースを補充した最少培地
    のような指示培地または選択培地、抗生物質を含む培地、蛍光、発光を可視化す
    るための培地、Ｘ−ＧＡＬ培地のような慣用的な培地、およびファージ受容体の
    存在による選別を可能とする培地からなる群より選択される、相補性の検出を可
    能とする培地、 を含んでなる、キット。
28. 【請求項２８】 目的の分子を選択するためのキットであって、 （ａ）目的の分子が既知の野生型分子に対する変異分子である、請求項１〜９
    のいずれか一項に記載のシグナル増幅系； （ｂ）目的の分子が対照としての既知の野生型分子である、請求項１〜９のい
    ずれか一項に記載のシグナル増幅系； （ｃ）Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３０９を有するＢＴＨ１０１株とＣ．
    Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３１０を有するＤＨＭ１株とからなる群より選択さ
    れる、内因性アデニル酸シクラーゼ欠損細菌株； （ｄ）唯一の炭素源としてラクトースもしくはマルトースを補充した最少培地
    のような指示培地または選択培地、抗生物質を含む培地、蛍光、発光を可視化す
    るための培地、Ｘ−ＧＡＬ培地のような慣用的な培地、および各シグナル増幅系
    についてファージ受容体の存在による選別を可能とする培地からなる群より選択
    される、相補性の検出を可能とする培地；および （ｅ）変異分子でのシグナル増幅系が、野生型でのシグナル増幅系に対して、
    増強されるかまたは阻害されるかを検出する手段、 を含んでなる、キット。
29. 【請求項２９】 刺激活性または阻害活性が、それぞれ、請求項１〜９のいずれか一項に記載の
    シグナル増幅系を用いて、増幅を生じさせて、転写活性化を誘発するかまたは消
    失させることによって検出され、前記シグナル増幅および誘発されたかまたは消
    失した転写活性が、いずれの物質も含まない同一のシグナル増幅系から得られる
    ものと比較される、標的リガンドと目的の分子との相互作用を刺激または阻害し
    うる物質のスクリーニング方法であって、 スクリーニングが、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３０９を有するＢＴＨ１
    ０１株およびＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３１０を有するＤＨＭ１株からな
    る群より選択される大腸菌（E. coli）株中で行われる、スクリーニング方法。
30. 【請求項３０】 前記シグナル増幅系が、酵素の少なくとも２つの異なる断片の細菌マルチハイ
    ブリッド系を含んでなるものであり、前記酵素の活性が前記目的の分子と前記標
    的リガンドとの相互作用によって回復する、請求項２９に記載の、標的リガンド
    と目的の分子との相互作用を刺激または阻害しうる物質のスクリーニング方法。
31. 【請求項３１】 前記シグナル増幅系が、少なくとも酵素の第一断片および調節物質の細菌マル
    チハイブリッド系を含んでなるものであり、前記酵素の活性が前記目的の分子と
    前記標的リガンドとの相互作用によって回復する、請求項２９に記載の、標的リ
    ガンドと目的の分子との相互作用を刺激または阻害しうる物質のスクリーニング
    方法。
32. 【請求項３２】 前記シグナル増幅がシグナリング分子の生成に相当する、請求項２９〜３１の
    いずれか一項に記載の、標的リガンドと目的の分子との相互作用を刺激または阻
    害しうる物質のスクリーニング方法。
33. 【請求項３３】 前記シグナリング分子の生成に相当する前記シグナル増幅がブロックされるか
    または部分的に失われる、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の、標的リガ
    ンドと目的の分子との相互作用を刺激または阻害しうる物質のスクリーニング方
    法。
34. 【請求項３４】 前記転写活性化がリポーター遺伝子の発現をもたらす、請求項２９〜３２のい
    ずれか一項に記載の、標的リガンドと目的の分子との相互作用を刺激または阻害
    しうる物質のスクリーニング方法。
35. 【請求項３５】 リポーター遺伝子の発現をもたらす前記転写活性化がブロックされるかまたは
    部分的に失われる、請求項２９〜３１および請求項３３のいずれか一項に記載の
    、標的リガンドと目的の分子との相互作用を刺激または阻害しうる物質のスクリ
    ーニング方法。
36. 【請求項３６】 前記標的リガンドが、受容体、リガンド、抗原、抗体、ＤＮＡ結合タンパク質
    、糖タンパク質およびリポタンパク質からなる群より選択されるものである、請
    求項２９〜３５のいずれか一項に記載の、標的リガンドと目的の分子との相互作
    用を刺激または阻害しうる物質のスクリーニング方法。
37. 【請求項３７】 前記物質が、刺激または阻害親和性を有する、タンパク質、糖タンパク質、リ
    ポタンパク質、リガンド、および他のいずれかの薬物からなる群より選択される
    ものである、請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の、標的リガンドと目的の
    分子との相互作用を刺激または阻害しうる物質のスクリーニング方法。
38. 【請求項３８】 前記シグナリング分子がｃＡＭＰの合成に相当するものである、請求項３２ま
    たは３３に記載の、標的リガンドと目的の分子との相互作用を刺激または阻害し
    うる物質のスクリーニング方法。
39. 【請求項３９】 前記シグナリング分子がｃＧＭＰの合成に相当するものである、請求項３２ま
    たは３３に記載の、標的リガンドと目的の分子との相互作用を刺激または阻害し
    うる物質のスクリーニング方法。
40. 【請求項４０】 前記リポーター遺伝子が、ラクトース、マルトースのような栄養マーカーをコ
    ードする遺伝子；アンピシリン、カナマイシンまたはテトラサイクリンのような
    抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子；毒素をコードする遺伝子；グリーン蛍
    光タンパク（ＧＦＰ）型の蛍光マーカーのような色素マーカー；ファージλ受容
    体、ｌａｍＢのようなファージ受容体タンパク質またはその断片をコードする遺
    伝子；および選択可能な表現型を与える他のいずれかの遺伝子からなる群より選
    択されるものである、請求項３４または３５に記載の、標的リガンドと目的の分
    子との相互作用を刺激または阻害しうる物質のスクリーニング方法。
41. 【請求項４１】 前記目的の分子が既知の野生型分子に対する変異分子であり、前記目的の分子
    が、前記標的リガンドと相互作用する能力について試験される、請求項２９〜４
    ０のいずれか一項に記載の、標的リガンドと目的の分子との相互作用を刺激また
    は阻害しうる物質のスクリーニング方法。
42. 【請求項４２】 前記スクリーニングがＤＨＭ１株中で行われる、請求項２９〜４０のいずれか
    一項に記載の、標的リガンドと目的の分子との相互作用を刺激または阻害しうる
    物質のスクリーニング方法。
43. 【請求項４３】 前記スクリーニングがＢＴＨ１０１株中で行われる、請求項２９〜４１のいず
    れか一項に記載の、標的リガンドと目的の分子との相互作用を刺激または阻害し
    うる物質のスクリーニング方法。
44. 【請求項４４】 標的リガンドと目的の分子との相互作用を刺激または阻害しうる物質をスクリ
    ーニングするためのキットであって、 （ａ）標的リガンドと目的の分子との相互作用を刺激または阻害しうる物質を
    含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のシグナル増幅系； （ｂ）対照としていかなる物質も含まない、請求項１〜９のいずれか一項に記
    載のシグナル増幅系； （ｃ）Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３０９を有するＢＴＨ１０１株および
    Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３１０を有するＤＨＭ１株からなる群より選択
    される、内因性アデニル酸シクラーゼ欠損細菌株； （ｄ）唯一の炭素源としてラクトースもしくはマルトースを補充した最少培地
    のような指示プレートまたは選択培地、抗生物質を含む培地、蛍光を可視化する
    ための培地、慣用的な培地、およびファージ受容体の存在による選別を可能とす
    る培地からなる群より選択される、相補性の検出を可能とする培地；および （ｅ）前記物質を含むシグナル増幅系が、いかなる物質をも含まないシグナル
    増幅系に対して、増強されるかまたは阻害されるかを検出する手段、 を含んでなる、キット。
45. 【請求項４５】 請求項１３〜２５のいずれか一項に記載の方法によって同定される、目的の分
    子。
46. 【請求項４６】 請求項２９〜４３のいずれか一項に記載の方法によって同定される、標的リガ
    ンドと目的の分子との相互作用を刺激または阻害しうる物質。
47. 【請求項４７】 前記細菌マルチハイブリッド系が、 （ａ）酵素の第一断片に相当する第一キメラポリペプチド； （ｂ）酵素の第二断片または前記酵素を活性化しうる調節物質に相当する第二
    キメラポリペプチド；および （ｃ）標的リガンドと目的の分子との相互作用を刺激または阻害しうる物質、
    を含み、前記第一断片は目的の分子に融合され、前記第二断片または前記調節物
    質は標的リガンドに融合されており、前記酵素の活性が目的の前記分子と前記標
    的リガンドとの相互作用によって回復して、シグナル増幅が行なわれる、請求項
    １〜９のいずれか一項に記載のシグナル増幅系であって、 Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３０９を有するＢＴＨ１０１株およびＣ．Ｎ
    ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３１０を有するＤＨＭ１株からなる群より選択される
    内因性アデニル酸シクラーゼ欠損細菌株をさらに含む、シグナル増幅系。
48. 【請求項４８】 Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３０９を有するＢＴＨ１０１株。
49. 【請求項４９】 Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．受託番号Ｉ−２３１０を有するＤＨＭ１株。