JP2003524396A

JP2003524396A - 細胞、細胞集団ならびにそれらを作製する方法およびそれらを使用する方法。

Info

Publication number: JP2003524396A
Application number: JP2000605724A
Authority: JP
Inventors: ユージーンオー．マジャー，; ジェフェリーエル．バーカー，; ドラガンマリック，; ハーベイラビン，; アビイサンドラー，
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1999-03-18
Filing date: 2000-03-17
Publication date: 2003-08-19
Also published as: EP1161523A4; WO2000055306A1; AU3751800A; EP1161523A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、一般的に、前駆細胞および前駆体細胞を含む幹細胞（これは、好ましくは不死化され、そして中枢神経系（ＣＮＳ）から誘導される）；開示される細胞および遺伝的に改変された形態の開示された細胞を宿主に移植することによって、宿主を処置する方法、ならびにこれらを作製する方法に関する。詳細には、本発明の細胞株および方法は、中枢神経系における神経変性（例えば、パーキンソン症候群）によって引き起こされる障害の処置に使用され得る。さらに、本発明は、本発明の不死化された多能性細胞を作製する方法ならびにそれらを同定する方法を提供する。本発明の細胞、細胞株および細胞型は、好ましくは、少なくとも部分的に単離されるか、単離されるか、そして／または精製される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本願は、米国仮特許出願第６０／１２４，８８９（２０００年３月１８日出願
）の権利を主張し、その全ての内容は、本明細書中によって参考として援用され
る。

【０００２】本明細書中に記載される本発明は、米国政府機関によってなされたか、または
米国政府機関との契約下でなされた。米国政府機関の名前および政府契約番号は
、ＮＩＨ−ＣＲＡＤＡ番号９４−００３−ＮＳである。

【０００３】（発明の背景）本発明は一般的に、前駆（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）細胞および前駆体（ｐｒｅ
ｃｕｒｓｏｒ）細胞を含む幹細胞（これらは好ましくは、不死化されそしてヒト
胎児中枢神経系（ＣＮＳ）に由来する）；開示の細胞および一般的に改変された
形態の開示の細胞を宿主に移植することによって、宿主を処理する方法に関する
。より詳細には、本発明は、胎児ＣＮＳ由来細胞（例えば、ヒト胎児ＣＮＳ由来
細胞株）のようなＣＮＳ由来細胞株、およびこれらの不死化されたＣＮＳ由来細
胞を宿主に移植することによって宿主を処置する方法を提供する。治療適用にお
いて有用な不死化されたＣＮＳ由来細胞を単離する方法がまた、開始される。

【０００４】細胞移植治療は、特に神経性疾患の処置に対して魅力的である。固体組織移植
は、いくつかの理由のために神経性疾患に対して特に不適切である。固体組織移
植に必要とされるような脳の開放外科的曝露は、神経系経路に修復不可能な損傷
を引き起こし得、臨床的な神経性欠損を生じる。さらに、神経性機能は、しばし
ば、外科的に確立され得ない複合細胞間結合に依存する。さらに、中枢神経系の
細胞は、無酸素症および栄養素剥奪に対して非常に感受性である。固体組織移植
片の内部における細胞がしばしば生存力の維持に対する十分な灌流を欠くので、
固体組織移植片の迅速な血管新生が重要である。Ｓｔｅｎｅｖｉら、Ｂｒａｉｎ
Ｒｅｓ．，１１４：１−２０（１９７６）。

【０００５】１つの通常の神経性症候群であるパーキンソン症候群は、細胞移植治療におけ
る試みの目的である。Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄら、ＢｒａｉｎＲｅｓ．，１７７：
５５５−５６０（１９７９）；Ｌｉｎｄｖａｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：
５７４−５７７（１９９０）；Ｆｒｅｅｄ，Ｒｅｓｔｏｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅ
ｕｒｏｓｃｉ．，３：１０９−１３４（１９９１）。パーキンソン症候群は、脳
幹神経節の黒質におけるド−パミン産生ニューロンの損失によって起こる。Ｂｕ
ｒｎｓら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１２：１４１８−１４２１（１９８
５）；Ｗｏｌｆｆら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，８６：９０１１−９０１４（
１９８９）。パーキンソン症候群の臨床発現によって特徴付けられる病因が未知
の疾患であるパーキンソン病は、これらのドーパミン産生ニューロンの特発性破
壊によって生じる。パーキンソン症候群は、種々の薬物（例えば、抗精神病薬ま
たは化学薬剤（例えば、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒ
ドロピリジン））によって引き起こされ得る。Ｂｕｒｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０：４５４６−４５５０（１９８３）および
Ｂａｎｋｉｅｗｉｃｚら、ＬｉｆｅＳｃｉ．，３９：７−１６（１９８６）。

【０００６】ドーパミン作用性細胞を冒された動物の線条に移植することによって、実験的
に誘導されたパーキンソン症候群の臨床発現を逆転させる試みがなされた。遺伝
的に改変された線維芽細胞（チロシンヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡを用
いてトランスフェクトされた）が、ドーパミン作用性経路の病巣を有する動物に
首尾良く移植された。動物の運動性機能および行動は、ドーパミン産生線維芽細
胞の移植の後に改善された。Ｗｏｌｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ、８６：９０１１−９０１４（１９８９）；Ｆｉｓｈｅｒら、Ｎｅ
ｕｒｏｎ、６：３７１−３８０（１９９１）。誕生の後に得られた細胞と比較し
て、胎児組織の移植によって移植片の生存が増強され、それゆえ、臨床の改善が
延長され得た。ＧａｇｅおよびＦｉｓｈｅｒ，Ｎｅｕｒｏｎ，６：１−１２（１
９９１）。黒質線状体ドーパミン系に対する化学損傷の後に、新鮮な胎児ドーパ
ミン作用性ニューロンが、サルの尾状核に移植された。移植に続いて、損傷誘導
された行動欠損が改善された。Ｂａｎｋｉｅｗｉｃｚら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒ
ｇ．，７２：２３１−２４４（１９９０）およびＴａｙｌｏｒら、Ｐｒｏｇ．Ｂ
ｒａｉｎＲｅｓ．，８２：５４３−５５９（１９９０）。

【０００７】パーキンソン症候群に冒されているヒトが、ドーパミン作用性ヒト胎児ニュー
ロンの線条体移植によって処置された。Ｌｉｎｄｖａｌｌら、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕ
ｒｏｌ．，４６：６１５−６３１（１９８９）；Ｗｉｄｎｅｒら、ＮｅｗＥｎ
ｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２７：１５５６−１５６３（１９９２）。移植された細
胞は、流産から得た。流産の前に、女性は、いくつかの疾患を生じるウイルスに
対する抗体に対してスクリーニングした。手術の後に、処置された患者は、神経
性機能の改善を示した。しかし、この患者は、免疫抑制治療の維持を必要とした
。

【０００８】近年の研究により、中枢神経系の支持細胞（例えば、神経膠星状細胞および稀
突起神経膠細胞）から放出される栄養因子が、細胞培養におけるニューロンの生
存に重要であることが示された。Ｏ’Ｍａｌｌｅｙら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．
，１１２：４０−４８（１９９１）。神経成長因子を発現するように遺伝的に改
変された移植線維芽細胞が、采脳弓（ｆｉｍｂｒｉａ−ｆｏｒｎｉｘ）に対する
損傷（これは、アルツハイマー病に見られるような前脳基底部（ｂａｓａｌｆ
ｏｒｅｂｒａｉｎ）におけるアセチルコリンニューロンの消滅を引き起こす）の
後に、前脳基底部のコリン作用性ニューロンの生存を増強することが示された。
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：１５７５−１５７７（１９８
８）。

【０００９】神経性障害に関する細胞移植治療における以前の試みにより、奨励される結果
が提供されたが、いくつかの有意な問題が残っている。細胞移植に対する胎児組
織の供給は、非常に制限される。最大の生存性を確実にするために、胎児細胞は
、移植の前に新鮮に回収されなければならない。これは、移植手順と人工妊娠中
絶との調整が必要である。それでも、胎児組織は、米国において広く利用可能で
ある。また、細胞が得られる胎児の妊娠期間は、移植片の生存に影響を与える。
ＧａｇｅおよびＦｉｓｈｅｒ、前述。特定の妊娠期間のみの胎児組織を得ること
は、移植のための胎児組織の利用性に対してさらなる制限を加える。さらに、新
鮮な胎児組織が移植される場合、倫理的な考慮により、ある潜在的な移植レシピ
エントはその手順を行うことを渋るようになる。

【００１０】胎児組織は新鮮な流産児から得られるので、感染汚染に関する有意な危険性が
存在する。胎児組織を供給する流産している女性は種々の感染に対してスクリー
ニングされるが、いくつかの感染（例えば、ＨＩＶ）は、臨床的に検出可能でな
く、従って、スクリーニング工程の間に同定され得ない。従って、広範に実施す
る場合、新鮮な胎児細胞の移植は、多くの感染続発症を引き起こすようである。

【００１１】不死化された細胞株の使用は、多くのこれらの有効性の問題および感染を克服
し得る。不死化する遺伝子を含む不死化されたヒト胎児神経由来の細胞株は、Ｍ
ａｊｏｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：１２５７
−１２６２（１９８５）および米国特許第４，７０７，４４８号に報告されてい
る。

【００１２】近年、中枢神経系由来のヒト胎児由来の細胞の集団をＳＶ４０ウイルスの起点
欠失変異体を用いてトランスフェクトすることによって産生された細胞株（ＳＶ
Ｇ細胞として呼ばれる）が、神経性移植治療の処置において見込みを示したこと
が見出された。米国特許第５，７５３，４９１号；同第５，８６９，４６３号お
よび同第５，６９０，９２７号を参照のこと。ＳＶＧ細胞は、胎児グリア細胞の
永久に確立された株の例として記載された。Ｍａｊｏｙら、ＰｒｏｃＮａｔ
ＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、８２：１２５７−６１（１９８５）を参照のこと（
これは、ヒト中枢神経系の強力に不死化された細胞を産生するための不死化する
遺伝子の使用に関する最初の報告である）。ＳＶＧ細胞のこの集団はまた、グリ
アまたは神経グリアとして特徴付けられた。Ｆｉｔｏｕｓｓｉら、Ｎｅｕｒｏｓ
ｃｉｅｎｃｅ，８５：４０５−１３（１９９８）；Ｍａｊｏｒら、ＰｒｏｃＮ
ａｔＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，８２：１２５７−６１（１９８５）；Ｔｏｒ
ｎａｔｏｒｅら、ＣｅｌｌＴｒａｎｓｐｌａｎｔ，５：１４５−６３（１９９
６）および発行された、特許第４，７０７，４４８号；第５，６９０，９２７号
；第５，７５３，４９１号；第５，８６９，４６３号。ＳＶＧ細胞は、ＥＭＥＭ
（Ｅａｇｌｅ’ｓＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ＋１０
％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）＋２ｍＭｌ−グルタミン）を含む「標準的な培地」
中で、増殖させた。ＳＶＧ細胞株は、標準的な方法によって容易にトランスフェ
クトされ得、そして異種ＤＮＡを発現する。Ｔｏｒｎａｔｏｒｅら、Ｃｅｌｌ
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，５：１４５−６３（１９９６）および米国特許第５，７
５３，４９１号（これらは、神経性障害の処置に有用な生物学的活性分子を含み
得る）。

【００１３】より最近において、造血系のように、ＣＮＳが、より形態学的に規定された細
胞へ成長し得る細胞を含むことが理解される。すなわち、ＣＮＳが前駆細胞また
は幹細胞を含むことが、今やより容易に理解され、この前駆細胞または幹細胞は
、精製されている場合維持そして貯蔵され、複数の使用のために、翻訳の前また
は後のいずれかで複数の細胞型に成長し得る移植可能な産物に成長する可能性を
含み得る。従って、これらの細胞は、多分化能であり、そして複数の細胞型の産
生および維持に対する要求物を減少し得る。さらに、そのような多能性細胞を移
植することは、患者によって必要とされる細胞型の置換および再増殖を可能にし
得、これは、細胞を、失われた組織型または損傷を受けた細胞型を置換するため
に成長させることが可能であり得る場合、外部のエフェクターを必要としない。

【００１４】したがって、当該分野で緊急に必要とされることは、不死化されたヒト胎児Ｃ
ＮＳ由来の幹細胞または多能性細胞、およびこの使用に適した細胞株を治療的に
移植する方法である。理想的には、この方法は、移植の後に、腫瘍形成を引き起
こさず、激しい炎症も誘発しない。望ましくは、この方法は、感染汚染の危険性
および規定された細胞有効性が最小化されるような細胞株から誘導される細胞を
使用し得る。非常に驚くべきことに、本発明は、これらの要求および他の関連す
る要求を満たす。

【００１５】（発明の要旨）本発明は、宿主を処置するための方法を提供し、この方法は、不死化されたヒ
ト神経由来の細胞株（好ましくは胎児細胞株）の多能性細胞を宿主に移植する工
程を包含する。移植のための細胞ならびにそれらの同定および精製の方法がまた
提供される。一般的に、この細胞株およびそれらの細胞株内の細胞型は、ヒト胎
児ＣＮＳ細胞のようなＣＮＳ細胞（例えば、ＳＶＧ細胞株）から由来する。この
細胞は、神経細胞型またはグリア細胞型のいずれかへの特異的なさらなる分化を
伴わずに、宿主の中枢神経系に移植され得る。あるいは、本発明の多能性細胞は
、本発明の処置方法における使用の前にさらに分化され得る。これらの細胞は、
宿主の抗体に対して不浸透性である膜によってカプセル化され得る。

【００１６】本発明のいくつかの実施形態において、多能性細胞は、ペプチドをコードする
核酸配列、アミノ酸配列またはタンパク質を用いてトランスフェクトされ得る。
ペプチド、アミノ酸配列またはタンパク質は、一般的に、チロシンヒドロキシラ
ーゼのような酵素または神経成長因子のような成長因子あるいはそれらの部分で
あり、これらとしては、グルコシル化されたペプチドおよびタンパク質ならびに
グリコシル化されていないペプチドおよびタンパク質が挙げられる。本明細書以
後に通常ペプチド、アミノ酸配列およびタンパク質の用語のいずれか１つによっ
て言及される、ペプチド、アミノ酸配列およびタンパク質はまた、疾患関連抗原
であり得る。この細胞は、処置または予防の目的に対して移植され得る。いくつ
かの例において、この細胞は、移植の後に除去され得る。

【００１７】さらなる実施形態において、本発明は、異種核酸配列を含む不死化された多能
性ヒト胎児ＣＮＳ由来の細胞株およびそれらの細胞株から誘導された特定の細胞
型を提供し、ここで、この細胞株は、異種核酸配列を発現することができる。

【００１８】特に好ましい細胞株および細胞型は、チロシンヒドロキシラーゼ、セロトニン
または芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼをコードする核酸を発現することがで
きる。

【００１９】関連する実施形態において、本発明は、薬学的に受容可能なキャリアと共に本
発明の少なくとも１つの多能性細胞型またはその誘導体を含む、移植可能な組成
物を提供する。

【００２０】従って、本発明は、多能性細胞を含む単離された胎児中枢神経系細胞株を提供
し、この多能性細胞は、制限なく分離する能力および神経細胞またはグリア細胞
に分化する潜在性を有する。本発明のこの細胞株は、好ましくは幹細胞、前駆細
胞または前駆体細胞を含む。胎児中枢神経系由来の細胞株は、ヒト胎児中枢神経
系から誘導される。

【００２１】本発明は、本発明の好ましくは単離および／または精製された細胞の塊（ｃｌ
ｕｓｔｅｒ）を提供し、好ましくは神経球（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）の形態で
ある。

【００２２】１つの実施形態において、本発明は、単離および／または精製された多能性細
胞を提供する。本発明の細胞は、本明細書中にさらに記載されそして定義される
ように、以下のマーカーの任意の組み合わせによって特徴付けられ得る：ＴｎＴ
ｘ−／ＣｈＴｘ−、ＴｎＴｘ＋／ＣｈＴｘ＋、ＴｎＴｘ＋／ＣｈＴｘ−、ＴｎＴ
ｘ＋／ＣｈＴｘ＋、Ａ２Ｂ５−／ＴｎＴｘ−、Ａ２Ｂ５＋／ＴｎＴｘ−、Ａ２Ｂ
５−／ＴｎＴｘ＋、Ａ２Ｂ５−／ＣｈＴｘ−、Ａ２Ｂ５＋／ＣｈＴｘ＋、Ａ２Ｂ
５−／ＣｈＴｘ＋、Ａ２Ｂ５＋／ＣｈＴｘ−、ＴｎＴｘ−／ＣｈＴｘ−／ネスチ
ン＋、および／またはＴｎＴｘ−／ＣｈＴｘ−／ネスチン−。

【００２３】本発明はさらに、単離および／または精製された、本発明の細胞株由来の細胞
および／または組織由来を提供する。本発明の細胞および／または組織は、生物
学的に活性なペプチドまたはタンパク質（これは、例えば、疾患関連ペプチドも
しくはタンパク質、酵素、栄養因子、および／またはサイトカインであり得る）
をコードする異種核酸配列をさらに含み得る。本発明の細胞および／または組織
の中でコードされる酵素は、例えば、チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＴＰＣＨ１
、ＡＡＤＣまたはＶＭＡＴ２であり得る。コードされる栄養因子は、例えば、Ｇ
ＤＮＦ、ＶＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ｂＦＧＦ

【００２４】

【化２】、ＣＮＴＦ、ＰＤＧＦ、ＢＭＰ、ＬＩＦ、ノイロチュリン（Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ
）、ペルセフィン（Ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）、ノイブラスチン（Ｎｅｕｂｌａｓｔ
ｉｎ）、ＮＴ４／５、ＮＴ３またはミッドカイン（Ｍｉｄｋｉｎｅ）であり得る
。サイトカインは、例えば、ＩＬ−１０またはＩＬ−６であり得る。異種核酸は
、転写プロモーター（これは、例えば、調節可能なプロモーターであり得る）に
作動可能に連結され得る。

【００２５】本発明は、本明細書中に細胞のＮＧ１、ＮＧ２およびＮＧ３集団として規定さ
れる細胞集団を提供する。

【００２６】本発明は、多能性細胞を同定する方法を提供し、この方法は、多能性細胞を含
むと考えられる細胞サンプル中、ＴｎＴｘおよびＣｈＴｘに対する結合パートナ
ーならびにＡ２Ｂ５抗体の存在または非存在を測定する工程を包含する。本発明
の方法は、胎児中枢神経系由来の細胞から誘導される多能性細胞を同定するため
に使用され得る。詳細には、これらの細胞を含むサンプルを、Ａ２Ｂ５抗体結合
細胞結合パートナー、ＴｎＴｘレセプターおよびＣｈＴｘレセプターまたはそれ
らのフラグメントから選択される少なくとも１つの細胞特異的結合パートナーに
特異的に結合する少なくとも１つの因子と、この因子が細胞に結合する条件下で
混合し、続いてこの結合を多能性細胞の存在の指標として検出することによって
、これらの細胞が同定される方法を、本発明は提供する。本発明の方法において
使用される因子としては、Ａ２Ｂ５抗体またはフラグメント、ＣｈＴｘまたはそ
のフラグメントおよびＴｎＴｘまたはそのフラグメントが挙げられる。この文脈
において結合パートナーおよび因子が、抗体、抗体フラグメント、リガンド、リ
ガンドフラグメント、レセプターまたはレセプターフラグメントを含み得ること
を、当業者は理解する。

【００２７】本発明の方法はまた、細胞を、その細胞がヒトネスチン抗体に特異的に結合す
る能力によって同定する工程を包含し得る。

【００２８】さらに、本発明における検出に使用される結合パートナー、因子、リガンドお
よび抗体は、検出可能な標識（これは、例えば、検出系の蛍光成分、化学発光成
分、放射性成分、免疫学的に検出可能な成分および／または酵素学的に活性な成
分であり得る）を含み得るかまたはこれらを含有し得る。

【００２９】本発明に従う細胞を同定する方法は、特定の細胞集団を精製、富化および／ま
たは分離するためにもまた使用され得る蛍光活性化されたセルソーターを用いて
細胞を分析する工程を包含し得る。

【００３０】本発明はまた、細胞の集団に多能性胎児神経系由来の細胞を富化する方法を提
供し、この方法は、集団を血清の存在下で、好ましくはクライシスを介して培養
する工程、続いて血清を含まない培地でその集団を培養する工程を包含する。

【００３１】さらに、本発明は、神経性症候群または神経性疾患を有する哺乳動物を処置す
る方法を提供し、この方法は、本発明の少なくとも１つの細胞または細胞集団を
含む治療有効量の組成物をその哺乳動物に移植する工程を包含する。

【００３２】（詳細な説明）本発明は一般的に、中枢神経系の細胞由来、好ましくは胎児中枢神経系（例え
ば、ヒト胎児中枢神経系）由来の不死化された多能性ヒト細胞株、およびそれら
の細胞株を中枢神経系の障害の処置に使用する方法に関する。詳細には、本発明
の細胞株および方法は、中枢神経系における神経変性（例えば、パーキンソン症
候群）によって引き起こされる障害の処置に使用され得る。

【００３３】さらに、本発明は、本発明の不死化された多能性細胞を作製する方法ならびに
それらを同定する方法を提供する。本発明の細胞、細胞株および細胞型は、好ま
しくは、少なくとも部分的に単離されるか、単離されるか、そして／または精製
される。

【００３４】１つの実施形態において、本発明は、中枢神経系障害に冒される宿主を処理す
るための方法、またはそのような障害の症状を、中枢神経系の細胞由来の不死化
ヒト胎児細胞を移植することによって軽減する方法を提供する。好ましくは、本
発明の細胞は、そのような細胞の中枢神経系への移植に続く、移植片拒絶、強力
な大脳内炎症または腫瘍形成を生成しない。さらに、さらなる分化後、細胞は、
ニューロン移動および軸索伸長を好ましく誘導し、これは、細胞が神経応答を刺
激する栄養因子を産生するように機能していることを示す。

【００３５】ＣＮＳの細胞由来の不死化された多能性ヒト胎児細胞（例えば、本発明によっ
て提供される）の移植は、多くの疾患を処置する方法を提供する。例えば、パー
キンソン病は、これらの細胞またはそれらから誘導されるさらに分化された細胞
を、冒された宿主の脳幹神経節へ移植することによって処理可能である。本発明
の移植細胞由来の分化細胞または本発明の移植由来細胞によって産生されるはず
である栄養因子は、ドパミン作用性のニューロン消滅を阻害し得るか、またはド
パミン作用性のニューロン再生を誘導して存在するニューロンからの軸索増殖の
増加を可能にしさえする。ドーパミン作用性ニューロンの増加した集団により、
パーキンソン症候群に冒された人の臨床的な改善を提供し得る。

【００３６】さらに、本発明の多能性細胞がグリア細胞に成長され得る場合、ミエリン化さ
れた稀突起膠細胞または多機能性星状細胞の再生を提供することが可能であり得
る。

【００３７】さらなる実施形態において、移植された細胞は、神経学的に関連するポリペプ
チドをコードする核酸を用いて、インビボまたはインビトロにおいてトランスフ
ェクトされ得る。用語「神経学的に関連するペプチド」は、通常、中枢神経系組
織内の反応を触媒するペプチドまたはタンパク質をいう。そのようなペプチドは
、天然に存在する神経ペプチド、タンパク質もしくは酵素であり得、または中枢
神経系内で治療的活性を有するペプチドまたはタンパク質フラグメントであり得
る。例としては、神経成長因子、栄養因子およびサイトカイン、ならびに重要な
神経化学物質の生成を触媒することに使用される酵素、またはこれらの中間体が
挙げられる。特に好ましい局面において、この細胞は、例えば、ＴＨ（チロシン
ヒドロキシラーゼ）、ＧＴＰＣＨ１（ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１）、ＡＡＤＣ
（芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ）、ＶＭＡＴ２（小胞性モノアミントラン
スポーター２）、ＧＤＮＦ（グリア由来の神経栄養因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮
増殖因子）、ＢＤＮＦ（脳由来の神経栄養因子）、ＮＧＦ（神経成長因子）ｂＦ
ＧＦ（ＦＧＦＩＩまたは基本の繊維芽細胞増殖因子としてもまた公知）、ＣＮＴ
Ｆ（毛様体神経栄養因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来の増殖因子）、ＢＭＰ（これ
は骨形態形成タンパク質のファミリーとして公知）、ＬＩＦ（白血病阻害因子）
、ノイロチュリン、ペルセフィン、ノイブラスチン、ＮＴ４／５（ニューロトロ
フィン４／５）、ＮＴ３（ニューロトロフィン３）、ミッドカイン、ＩＬ−１０
（インターロイキン１０）またはＩｌ−６をコードする核酸を用いてトランスフ
ェクトされる。

【００３８】チロシンヒドロキシラーゼは、チロシンをＬ−ＤＯＰＡに転換する酵素であり
、これはまた、ドーパミン産生における比率制限工程（ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉ
ｎｇｓｔｅｐ）である。従って、移植された細胞によるチロシンヒドロキシラ
ーゼの発現は、これらの細胞がドーパミンを産生して分泌することを可能にする
。従って、ニューロン再生を促進することに加えて、移植された細胞は、黒質に
おけるドーパミン濃度を増加し得る、そしてドーパミン作用性のニューロン損失
の効果を制限または逆転し得る。発作の処置に適用した場合、このポリペプチド
は、損傷を受けた神経組織の再脈管新生を補助し得るか、または損傷を受けた神
経組織の生存および再生を増強し得る神経栄養因子の供給を補助し得る。

【００３９】本発明の方法はまた、ハンティングトン舞踏病、てんかん、発作、アルツハイ
マー病、外傷性脳損傷、脊髄損傷、てんかん、または多発性硬化症のような他の
神経性障害を処置するために使用され得る。本発明の不死化されたヒト胎児ＣＮ
Ｓ由来の細胞が、ＣＮＳと互換性であると予想される場合、他の障害の処置を効
果的にするために、これらの細胞を、ＣＮＳ中の移植に対して生理学的に活性な
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を用いてトランスフェクトすることは当然可能
である。例えば、ハンティングトン舞踏病および筋萎縮性側索硬化症において、
このペプチドは、グルタミン酸塩のような興奮性神経伝達物質をブロックし得る
。例えば、多発性硬化症の処置に適用された場合、このペプチドは、代表的に、
髄鞘形成の栄養性刺激物質（例えば、稀突起神経膠細胞消滅を阻害し得る血小板
由来の増殖因子または毛様体の神経栄養物質）である。これらの疾患は局所病巣
よりもより一般化されているため、代替の移植方法が望ましくあり得る。例えば
、この細胞は、脳脊髄液に曝露された表面上に移植され得る。発現および分泌に
続いて、このペプチドは、脳脊髄液の自然な循環によって脳の全表面に渡って洗
浄される。移植に適した部位としては、側脳室、腰椎の鞘内領域などが挙げられ
る。アルツハイマー病において、これらの細胞は、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ、２４２：１５７５−１５７８（１９８８）（これは、本明細書中に
参考として援用される）によって記載されるように、前脳基底部の支持ニューロ
ンに対して神経成長因子を産生するようにトランスフェクトされ得る。

【００４０】従って、本発明の細胞株および細胞型は、遺伝子ベクターとして役立ち得る。

【００４１】本発明の方法はまた、神経外部における細胞の移植によって宿主を処置するた
めに使用され得る。本発明のこの実施形態は、特に、宿主の予防処置に対して有
用である。不死化された多能性ヒト胎児神経由来の細胞は、疾患関連抗原（例え
ば、ＨＩＶｇｐ１２０ポリペプチド（これは、例えば、米国特許第５，１６６
，０５０号に記載されるようにＨＩＶの主要な中和ドメインを含む））をコード
するＤＮＡを用いてトランスフェクトされ得る。次いでこの細胞は、トランスフ
ェクトされたＤＮＡによってコードされる抗原を発現し、そして分泌し得る。こ
の抗原は、移植された細胞によって連続的に分泌され得、そして強い免疫応答を
誘導し得る。宿主を完全に免疫するための適切な時間の後、これらの細胞は除去
され得る。

【００４２】本明細書中に使用される場合、「宿主を処理する」とは、疾患プロセスにおけ
る予防介入、待期介入および治癒的介入を含む。従って、用語「処置」は、本明
細書中に使用される場合、代表的に、治療が求められている特定の障害の症状を
減少または除去するための治療的方法をいう。用語「宿主」は、本明細書中に使
用される場合、一般的に、任意の温血動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ
歯類など）をいい、宿主は特定の処置のレシピエントである。代表的に、用語「
宿主」および「患者」は、ヒト被験体をいうために本明細書中において交換可能
に使用される。

【００４３】広範な種々の疾患および症候群が、本発明の方法によって処置され得る。一般
的に、疾患は、以下を含むがこれらに限定されない神経性疾患である：パーキン
ソン症候群（パーキンソン病を含む）、アルツハイマー病、てんかん、ハンティ
ングトン舞踏病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ゴシェ病、テイ−サック
ス病、ニューロパシー、脳腫瘍、発作。本発明の方法はまた、非神経性疾患の処
置に使用され得る。例えば、本発明の方法は、感染疾患（例えば、上記に記載さ
れるようなウイルス、細菌、原生動物亜界など）に対して宿主を免疫するために
使用され得る。本発明の不死化された多能性ヒト胎児神経由来の細胞は、生理学
的に活性なペプチドまたは免疫原性エピトープを含むペプチドをコードするＤＮ
Ａによってトランスフェクトされ得る。本発明の方法は、宿主に、ペプチド産生
細胞を移植するため、そして他の型のペプチド（例えば、成長ホルモン）の連続
したインビボ送達を提供するために使用され得る。

【００４４】上記の処置方法を実行するために、本発明はまた、宿主または患者への移植に
適した細胞株を提供する。

【００４５】一般的に、本発明の方法によって移植される細胞は、不死化された多能性ヒト
胎児ＣＮＳ由来の細胞である。「神経由来の」または「ＣＮＳ由来の」とは、不
死化の前に、細胞をＣＮＳから回収すること、そして／または細胞が神経性細胞
表現型（ニューロンまたはグリア）を有することを意味する。神経性細胞型とし
ては、ニューロン、神経膠星状細胞、稀突起神経膠細胞、脈絡叢上皮細胞などが
挙げられる。

【００４６】ＣＮＳの細胞は、幹細胞からニューロン細胞および神経膠細胞へと発達すると
して、カテゴリー化されてきた。ＭｃＫｅｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７６：６６−
７１（１９９７）。幹細胞から、ニューロン細胞または神経膠細胞のいずれかへ
の経路に沿って、ＣＮＳにおける幹細胞は、神経芽細胞（未熟ニューロン）また
は神経膠芽細胞（未熟神経膠）となり、その後、さらに成熟ニューロン細胞（ニ
ューロン）および神経膠細胞（星状細胞および稀突起神経膠細胞）へと分化する
能力を有する。多能性ＣＮＳ由来の幹細胞は、培養物中で増殖するために、マイ
トジェン因子（例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および／または
上皮増殖因子（ＥＧＦ））を必要とすることが、一般に考えられている。Ｆｌａ
ｘら、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１６：１０３３−９（１９９８）；Ｇａ
ｇｅら、ＡｎｎｕＲｅｖＮｅｕｒｏｓｃｉ、１８：１５９−９２（１９９５
）；Ｋｉｔｃｈｅｎｓら、ＪＮｅｕｒｏｂｉｏｌ、２５：７９７−８０７（１
９９４）；Ｋｕｈｎら、ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ、１７：５８２０−９（１９９７
）；Ｍｏｒｓｈｅａｄら、Ｎｅｕｒｏｎ、１３：１０７１−８２（１９９４）；
Ｐａｌｍｅｒら、ＭｏｌＣｅｌｌＮｅｕｒｏｓｃｉ、８：３８９−４０４（
１９９７）；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ、１２：４５６５−７
４（１９９２）；Ｓａｈら、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１５：５７４−８
０（１９９７）；Ｓｈｉｈａｂｕｄｄｉｎら、ＥｘｐＮｅｕｒｏｌ、１４８：
５７７−８６（１９９７）；Ｗｅｉｓｓら、ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ、１６：７５
９９−６０９（１９９６）；ＺｈｏｕおよびＣｈｉａｎｇ、ＷｏｕｎｄＲｅｐ
ａｉｒＲｅｇｅｎ、６：３３７−４８（１９９８）。実際には、幹細胞は、無
血清培地培養において継代される（Ｆｉｓｈｅｒ、ＮｅｕｒｏｂｉｏｌＤｉｓ
、４：１−２２（１９９７）；Ｆｌａｘら、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１
６：１０３３−９（１９９８）；Ｇａｇｅら、ＡｎｎｕＲｅｖＮｅｕｒｏｓ
ｃｉ、１８：１５９−９２（１９９５）；Ｋｉｔｃｈｅｎｓら、ＪＮｅｕｒｏ
ｂｉｏｌ、２５：７９７−８０７（１９９４）；Ｋｕｈｎら、ＪＮｅｕｒｏｓ
ｃｉ、１７：５８２０−９（１９９７）；Ｍｏｋｒｙら、ＳｂＶｅｄＰｒ
ＬｅｋＦａｋＫａｒｌｏｖｙＵｎｉｖｅｒｚｉｔｙＨｒａｄｃｉＫｒ
ａｌｏｖｅ、３８：１６７−７４（１９９５）；Ｍｏｒｓｈｅａｄら、Ｎｅｕｒ
ｏｎ、１３：１０７１−８２（１９９４）；Ｐａｌｍｅｒら、ＭｏｌＣｅｌｌ
Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、８：３８９−４０４（１９９７）；Ｓａｈら、ＮａｔＢ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１５：５７４−８０（１９９７）；Ｓｈｉｈａｂｕｄｄｉ
ｎら、ＥｘｐＮｅｕｒｏｌ、１４８：５７７−８６（１９９７）；Ｗｅｉｓｓ
ら、ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ、１６：７５９９−６０９（１９９６）；Ｚｈｏｕお
よびＣｈｉａｎｇ、ＷｏｕｎｄＲｅｐａｉｒＲｅｇｅｎ、６：３３７−４８
（１９９８））。なぜなら、血清の添加およびマイトジェン因子の除去は、幹細
胞の、ニューロン細胞型または神経膠細胞型のいずれかへの分化を生じることが
、見出されているからである（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、１９９２；Ｓｔｅｍｐｌｅ、
１９９２；Ａｎｄｅｒｓｏｎ９２；Ｆｌａｘ、１９９８）。

【００４７】ＣＮＳ由来幹細胞は、ニューロン、星状細胞または稀突起神経膠細胞へと分化
し得、そして脳を占有するに十分に自己再生し得る細胞として、定義される。Ｍ
ｃＫａｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７６：６６−７１（１９９７）。前駆細胞は、幹
細胞より制限された、潜在的な細胞多様性を有するが、依然としてニューロンま
たは神経膠を形成し得る。前駆体細胞は、さらにより制限された表現型（例えば
、神経芽細胞であり、これは、ニューロンになり得るのみである）を有する。し
かし、当業者は、多能性細胞型からの分化した細胞型への細胞の発達が、多数の
組織学的マーカーの出現および消失により規定され得ることを理解し、これらの
うちのいくつかは、本明細書中に記載される。用語幹細胞、前駆細胞および前駆
体細胞は、本明細書中において使用されるが、これらの用語は、本明細書中に記
載される多能性の不死化細胞の特徴付けを限定するべきではなく、そして分化を
完了するための経路に沿った最終工程を記載することを意味しない。すなわち、
例えば、前駆細胞が、環境条件（例えば、培養培地）に依存して、幹細胞の特徴
を示す能力を有し得ることは、可能である。これらは、潜在的な細胞表現型のさ
らなる制限に導く、各分化工程の特殊化の相対尺度に対する、相対的な記載であ
る。

【００４８】従って、多能性細胞とは、本明細書中において参照される場合に、複数の表現
型を発現する可能性を有する細胞であり、そして幹細胞、前駆細胞、および前駆
体細胞を含む。

【００４９】ＣＮＳにおける幹細胞の同定は、中間フィラメントタンパク質であるネスチン
（ｎｅｓｔｉｎ）に対する抗体を使用して、慣用的に実施されてきた。Ｌｅｎｄ
ａｈｌら、Ｃｅｌｌ、６０：５８５−９５（１９９０）；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、
ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ、１２：４５６５−７４（１９９２）。ネスチンは、ＣＮ
Ｓ幹／前駆細胞の増殖の際に発現される。ＦｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎおよびＭｃＫ
ａｙ、ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ、８：１１４４−５１（１９８８）；Ｒｅｙｎｏｌ
ｄｓら、ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ、１２：４５６５−７４（１９９２）；Ｓｔｅｍ
ｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ｃｅｌｌ、７１：９７３−８５（１９９２）；
Ｖｅｓｃｏｖｉら、Ｎｅｕｒｏｎ、１１：９５１−６６（１９９３）。神経性前
駆細胞を同定するために使用されてきた別のマーカーは、中間フィラメントタン
パク質である、ビメンチンである。Ｆｌａｘら、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
、１６：１０３３−９（１９９８）；ＫｉｌｐａｔｒｉｃｋおよびＢａｒｔｌｅ
ｔｔ、Ｎｅｕｒｏｎ．１０：２５５−２６５（１９９３）。

【００５０】ＣＮＳ由来の幹細胞を使用して分化した造血細胞を形成し得るという最近の実
証により実証されるように、幹細胞の大きな成形性が存在するという、発達中の
認識が存在する。Ｂｊｏｒｎｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８３：５３４−７（
１９９９）。同様に、間質骨髄幹細胞を使用して、脳の細胞（ニューロンおよび
星状細胞を含む）を作製し得た。Ａｚｉｚｉら、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄ
ＳｃｉＵＳＡ、９５：３９０８−１３（１９９８）；Ｐｅｒｅｉｒａら
、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、９５：１１４２−７（
１９９８）；Ｐｒｏｃｋｏｐ、ＪＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍＳｕｐｐｌ、３
１：２８４−５（１９９８）；Ｐｒｏｃｋｏｐ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７６：７１
−４（１９９７）；Ｓａｎｃｈｅｚ−ＲａｍｏｓＪ．、ＭｏｖｅｍｅｎｔＤ
ｉｓｏｒｄｅｒｓ、１３：１２２（ｐ２．１４９）（１９９８）。従って、ニュ
ーロンおよび神経膠よりも、ＣＮＳ由来の幹細胞（本明細書中に開示されるよう
な）から、より広い多様性の細胞型を作製することが、可能であり得る。実際に
、ネスチン発現もまた、筋芽細胞（これは、筋前駆体細胞であり、ネスチンを発
現する細胞の成形性を強調する）において見出されている。Ｋａｃｈｉｎｓｋｙ
ら、ＤｅｖＢｉｏｌ、１６５：２１６−２８（１９９４）。

【００５１】本発明が多能性の不死化細胞を提供するので、造血細胞置換に関するかまたは
これを必要とする疾患を処置すること（例えば、化学療法または放射線療法の一
部）もまた、可能であり得ることが、理解される。現在提供される多能性不死化
細胞が、骨髄細胞を再生し、そしてインビボで分化するか、またはインビボもし
くはインビトロで分化して、造血細胞を産生することが、可能であり得る。

【００５２】一旦、幹細胞または多能性細胞を移植治療（本明細書中に記載されるように）
のために使用する可能性が適用されると、制限されたこれらの細胞の供給が存在
し、そしてこれらの天然供給源からの同定、単離、および発現が困難であるとい
う、実際上の困難が残る。幹細胞に導入される不死化遺伝子の報告が存在するが
、現在まで、ＣＮＳ由来の真に不死の幹細胞または多能性細胞の報告は、存在し
ない。不死化細胞株は、現在、クライシス後（老化後）親集団から得られ得る細
胞の、無制限の供給源として認識される。細胞株の不死化は、通常、不死化遺伝
子を通常含む細胞に、老化の期間を経過させることを必要とする。ヒトＣＮＳ幹
／前駆細胞は、以前にｖ−ｍｙｃタンパク質をコードする不死化遺伝子を含むよ
うトランスフェクトされた（Ｆｌａｘら、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１６
：１０３３−９（１９９８）；Ｓａｈら、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１５
：５７４−８０（１９９７））が、これらのトランスフェクトされたＣＮＳ前駆
細胞が、培養物中で無制限に（すなわち、７５％より大、好ましくは８５％より
大、より好ましくは１００％より大）増殖され得ること、またはこれらがクライ
シスを経て不死化されたことは、示されていない。

【００５３】不死の多能性胎児細胞株の調製は、一般に、以下の手順に従って実施され得る
。胎児細胞を、人工妊娠中絶に続いて収集し得る。中絶に続いて胎児を供与する
婦人は、代表的に、種々の感染症（ヒト免疫欠損ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、
Ｃ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、ならびにヘルペスウイルス１型およ
び２型を含む）に関して血清学的にスクリーニングされる。

【００５４】胎児脳を、同定および収集する。細胞を、以下のように調製し得る：脳組織を
１９ゲージのニードルを通して吸引し、そしてイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ
、Ｇｉｂｃｏ、ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）で２回洗浄する。細胞を、ポリ−
Ｄ−リジンで処理（０．１ｍｇ／ｍｌで５分間）した培養皿上にプレート化する
。細胞を、２０％ウシ胎仔血清、７５ｇ／ｍｌストレプトマイシン、７５単位／
ｍｌペニシリン、１％ブドウ糖および２ｇ／ｍｌファンギゾンを補充したＥＭＥ
Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）で増殖させる。不死化の前に、細胞を３７℃で５％ＣＯ₂の
加湿環境内でインキュベートする。細胞を調製するための他の方法もまた使用さ
れ得ることを、当業者は理解する。例えば、これらの細胞の集団を得るための組
織供給源は、非胎児であり得る（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｊ．、Ｐａｌｍｅｒ，Ｔ
．Ｄ．、Ｇａｇｅ，Ｆ．Ｈ．「Ｒｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄａｎｄｎｅｕｒ
ｏｔｒｏｐｈｉｎｓｃｏｌｌａｂｏｒａｔｅｔｏｒｅｇｕｌａｔｅｎｅ
ｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎａｄｕｌｔ−ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒａｌｓ
ｔｅｍｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｓ」Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ３８：６５−
８１、１９９９）。

【００５５】本発明の方法により移植されるべき細胞は、種々の技術により不死化され得る
。代表的に、細胞は、不死化遺伝子の導入、および引き続く、細胞のクライシス
の経過により、不死化される。この細胞集団を、本明細書中において、細胞のＮ
Ｇ１集団と呼ぶ。不死化遺伝子を含むがクライシスを経過していない、最初の細
胞培養物は、多能性の幹細胞および／または前駆細胞、ニューロン細胞ならびに
神経芽細胞を含有し、そして産生することが、予測される。本明細書中に記載の
方法を用いて、不死化の前に、またはもしかすると不死化遺伝子の導入の前にさ
え、これらの前駆細胞または多能性細胞を、この最初の細胞培養物から精製する
ことが可能である。しかし、好ましい方法、および本明細書中に例示される方法
は、不死化遺伝子を導入する工程、クライシスを通して、不死化遺伝子を含む、
ＣＮＳ由来の胎児細胞の集団を培養し、これによって多能性の、不死のＣＮＳ由
来の幹細胞または前駆細胞の高度に富化された集団を得る工程を包含する。

【００５６】不死化遺伝子の導入の前に、ＣＮＳ由来の胎児細胞は、規則的に栄養補充しな
がら数ヶ月間生存するが、細胞増殖をほとんど示さない。ＣＮＳ由来の胎児細胞
は、好ましくは、複製不能なＳＶ４０欠失変異体（例えば、Ｍａｊｏｒ（米国特
許第４，７０７，４４８号）に記載されるような）でトランスフェクトされる。
しかし、短縮型ＳＶ４０を、不死化遺伝子として使用し得る。Ｔｒｕｃｋｅｎｍ
ｉｌｌｅｒら、ＣｅｌｌＴｉｓｓｕｅＲｅｓ、２９１：１７５−８９（１９
９８）。

【００５７】本発明の細胞を作製する、現在例示される方法は、ＳＶ４０遺伝子の導入を包
含するが、これらの細胞は、代替的に、当該分野において周知の他の技術により
、不死化され得る。例えば、エプスタイン−バーウイルスによる不死化が、米国
特許第４，４６４，４６５号（本明細書中に参考として援用される）に記載され
るように、使用され得る。複製のＯｒｉＰおよびＯｒｉＬｙｔ起源を欠くエプス
タイン−バーウイルス変異体は、特に有用である。不死化の別の有用な方法は、
Ｂａｒｔｌｅｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：
３２５５−３２５９（１９８８）（本明細書中に参考として援用される）により
記載されるように、ｃ−ｍｙｃのような、増殖制御のための細胞遺伝子の過剰発
現である。

【００５８】一般に、本発明によるさらなる不死化手順に適した細胞は、足場依存性であり
、軟質寒天においては増殖せず、そして病巣形成を示さない。これらの細胞はま
た、培養物中の正常ヒト細胞と等しい生殖時間を有し、そして増殖を接触阻止さ
れる。

【００５９】１つの実施形態において、本発明は、不死の多能性ＣＮＳ由来の胎児細胞の集
団を提供し、これらは本明細書中で一般に、ＮＧ１集団と呼ばれる。米国特許第
４，７０７，４４８号（本明細書中に参考として援用される）に記載される、Ａ
ｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａ
ｓｓａｓ、ＶＡ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．ＣＲＬ８６２１）に寄託されたＳＶＧ細胞
株は、本発明のＮＧ１細胞集団を作製するための出発物質として、特に有用であ
る。本明細書中以下で、「ＳＶＧ細胞」または「ＳＶＧ細胞株」によって、細胞
株Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．ＣＲＬ８６２１由来の細胞または細胞株を意味する。誘導
体によって、細胞株Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．ＣＲＬ８６２１のサブクローン、複製物
、または遺伝的に変更された変異体を意味する。

【００６０】異種のクライシス前のヒト細胞株を、特許４，７０７，４４８およびＭａｊｏ
ｒら、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、８２：１２５７−
６１（１９８５）に提供される方法により、複製不可能なＧｌｕｚｍａｎ、Ｃｅ
ｌｌ、２３：１７５−８２（１９８１）（ＳＶ４０ウイルスの起源欠損変異体（
ｏｒｉｇｉｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ−ｍｕｔａｎｔ）（ｏｒｉ^-））を使用して
樹立し、ヒト胎児多能性細胞においてＳＶ４０不死化遺伝子を発現させた。これ
らの細胞（これらをＳＶＧと指定した）は、ヒト大グリア細胞を含む、迅速に増
殖する培養物を提供し、これは、濃縮物中での感染またはトランスフェクション
に続いて、そして初代ヒト胎児神経芽細胞と同じ速度で、感染性ＪＣウイルスを
繁殖させ得る。

【００６１】本発明の好ましい実施形態において、ＳＶＧ細胞は、標準培地中で増殖され、
そして不死化されるためにクライシス期を経過する。異種親ＳＶＧ細胞の小さな
画分のみが、ＳＶ４０不死化のために代表的であるクライシスを生存した。Ｂｒ
ｙａｎおよびＲｅｄｄｅｌ、ＣｒｉｔＲｅｖＯｎｃｏｇ、５：３３１−５７
（１９９４）。クライシスから生じるＳＶＧ細胞は、これらが増殖不死化される
点で、親ＳＶＧとは異り、従って、本明細書中においてＮＧ１と呼ばれる、別の
細胞集団であると考えられる。クライシスの発生は、ＳＶＧ細胞のおおよそ３３
〜３８継代において開始することが見出された。クライシスの間、非常に少量の
細胞増殖が存在し、そして細胞は、非常に大きく顆粒性に見える。ＳＶＧ細胞が
クライシスにあった場合に、細胞を顕微鏡で観察すると観察可能な細胞死が存在
した。細胞がクライシスにあり、そして周２回栄養補充され、そして１．５×１
０６／Ｔ７５フラスコ以上の細胞密度に維持する場合に、細胞の稀なコロニーが
、時々、クライシスから生じ、そして増殖し始める。クライシス後ＳＶ４０不死
化ヒトＣＮＳ由来細胞株の発生および細胞株自体（ならびにそこに含まれる細胞
型）は、独自であり、そして本明細書中に記載されるように、治療剤のため、お
よび治療剤の開発のために、潜在的に有用である。

【００６２】この実施形態によれば、ＳＶＧ細胞は、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ；Ｂ
ｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒＣａｔ＃１２−１２５Ｆ）＋１０％ＦＢＳ（ＢｉｏＷ
ｈｉｔｔａｋｅｒＣａｔ＃１４−５０１Ｆ）＋２ｍＭ１−グルタミン（Ｑｕ
ａｌｉｔｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を含む
「標準培地」において増殖された。これらの細胞の継代を、培地の除去により達
成し、そしてハンクスバランス塩溶液（ＨＢＳＳ：ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、
Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で２回洗浄し、０．２５％トリプシン−ＥＤ
ＴＡ溶液（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）とともに３分間インキュベートして、細
胞を解離した。懸濁した細胞を新鮮な標準培地に添加し、そして室温で５分間、
１００×ｇで遠心分離した。次いで、細胞ペレットを新鮮な標準倍地中で培養し
、そして新たな７５ｃｍ２フラスコ内でプレート化した。

【００６３】フラスコがコンフルエントであった場合には、クライシス前ＳＶＧ細胞を、３
〜４日ごとに継代培養したが、クライシスの間、これらの細胞は、遅い増殖およ
び細胞死に起因して、８〜１０日ごとに継代培養する必要があったのみである。
クライシスにおいては、ＳＶＧ細胞は頻繁に継代培養される必要がなかったが、
７５ｃｍ２フラスコあたり１．５×１０６で播種し続けた。ＳＶＧ細胞は、約２
ヶ月間、クライシスに維持され得、その後、１以上の細胞のコロニーが生じ、そ
してフラスコ内で増殖し始めた。これらのコロニー（各継代でともに混合した）
は、フラスコ内で他の細胞より早く成長し、そしてクライシス後の細胞株を構築
した。有用なクライシス後細胞型は、おおよそ３８継代後に得られ得るが、有用
なクライシス後多能性細胞もまた、例えば、３８〜５０継代後、例えば、４４、
４５、４７または４９継代後に得られ得る。ＮＧ１クライシス後細胞株を、ＳＶ
Ｇ細胞を指定したフラスコに播種し、そしてこれがクライシスを経過してクライ
シスから生じる際に、これを別個の細胞株として処理することにより、生成した
。ＮＧ１細胞株は、クローンではないと考えられる。なぜならこれは、フラスコ
内のクライシスから生じる全てのコロニーのプールを表すからである。

【００６４】本発明のさらなる実施形態は、不死化遺伝子を含む胎児ＣＮＳ由来細胞（例え
ば、ＳＶＧ細胞集団に含まれるもの）が種々の細胞マーカーを発現するという、
予期しない発見に基づく。ニューロンまたは神経膠細胞のための表現型マーカー
の相対的な発現、ならびに本発明のＮＧ１集団内ならびに最初のクライシス前の
（例えば、ＳＶＧ）集団内の多能性ＣＮＳ由来細胞の分化が、培地組成の変化に
より、意図的に調節され得ることが、ここで見出された。従って、本発明は、Ｃ
ＮＳ由来胎児細胞の混合集団を異なる細胞型に関して富化する方法を提供する。
具体的には、培養条件から血清を除去することが、ニューロン系列に分化するこ
とが予測される細胞として同定される細胞をより多く有する細胞の集団を富化す
ることが、予期せず見出された。この効果は、クライシス後、ＮＧ１細胞集団に
ついては実証されたが、これはクライシス前の最初の細胞（例えば、ＳＶＧ集団
）についても等しく適用可能であることもまた、予測される。ＳＶＧ集団から産
生された富化された細胞集団は、本明細書中でＮＧ２集団と呼ばれ、そしてクラ
イシス後のＮＧ１集団から産生された富化された集団は、本明細書中でＮＧ３集
団と呼ばれる。これらの集団に含まれる細胞型の代表的な同定は、以下に記載さ
れるが、当業者は、これらの集団の例示は限定ではないことを理解する。

【００６５】親のクライシス前（およびクライシス後）ＳＶＧ細胞の分化に対する薬剤の可
能な効果は、最初に、１２−ミリステート（ｍｙｒｓｔａｔｅ）１３アセテート
（ＰＭＡ）の標準培地への添加の際に、軸索様プロセスの伸長により観察された
。この能力は、ホルスコリン（これは、ｃＡＭＰを上昇させる）の添加が、神経
芽線維原酸性タンパク質（ＧＦＡＰ；分化した神経膠マーカー）および神経フィ
ラメント（ＮＦ；分化したニューロンマーカー）のギャップジャンクション連結
および発現を増加させ得るという最近の報告によりさらに確かめられた。Ｄｏｗ
ｌｉｎｇ−ＷａｒｒｉｎｅｒおよびＴｒｏｓｋｏ、ＦＡＳＥＢＪ．Ａｂｓｔｒ
．、４３８２（１９９８）ならびにＤｏｗｌｉｎｇ−ＷａｒｒｉｎｅｒおよびＴ
ｒｏｓｋｏ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ９５：８５９−８６８（２０００）。
分化を制御するこの能力および区別可能な細胞表現型は、新たな細胞集団を作製
する可能性および／または細胞集団内で細胞型の割合を変更する可能性を示唆し
た。集団内で細胞の型を変更する能力、ならびに特に、より多数の多能性細胞お
よびニューロン前駆体細胞を血清内で継代した胎児ＣＮＳ由来細胞の集団から富
化する能力は、特に予測不可能である。外因性マイトジェンの非存在下および血
清の存在下で、ニューロンおよび星状細胞は、すでに分化されたと予測されたこ
とが、一般に考えられる。Ｐａｌｍｅｒら、ＭｏｌＣｅｌｌＮｅｕｒｏｓｃ
ｉ、８：３８９−４０４（１９９７）；Ｓａｈら、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ、１５：５７４−８０（１９９７）。

【００６６】別の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載の多能性胎児ＣＮＳ由来
細胞、および特定の細胞型の、同定および精製の方法を提供する。

【００６７】ＣＮＳの発達を研究する場合に遭遇する主要な困難の１つは、独自に特異的な
細胞マーカーがないことに部分的に起因して、特定の細胞系列を、増殖および分
化の異なる段階において容易には同定し得ないことであった。現在、ＣＮＳ細胞
において特定の細胞表面エピトープ、細胞質エピトープまたは核エピトープを検
出するために使用され得る市販のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体
の数が、急速に増加している。しかし、これらのエピトープの多くは、そのいく
つかの発達段階において、ニューロン細胞型と神経膠細胞型との間で共有される
。従って、調査中の特定の細胞集団のより正確な同定を得るために、蛍光プロー
ブを使用する、二重および三重の免疫標識手順を使用することの必要性が、増加
している。蛍光を検出するために、二重または三重の発光フィルタセットを備え
るフローサイトメーターは、特定のＣＮＳ集団のこの複雑さおよび多様性を非常
に迅速かつ正確な様式で評価するために、理想的には適する。本発明の好ましい
方法は、フローサイトメーターの使用を包含するが、パニングおよび磁気ビーズ
を含む、細胞を同定および選別する他の方法が、使用され得る。

【００６８】本発明において、３つの細胞マーカーが、本発明の特定の細胞型を特徴付ける
ために使用された。これらの細胞マーカーは、破傷風毒素フラグメントＣ（Ｔｎ
Ｔｘ）、コレラ毒素（ＣｈＴｘ）およびＡ２Ｂ５と指定されるモノクローナル抗
体を含む。破傷風毒素フラグメントＣ（ＴｎＴｘ）レセプターは、破傷風毒素レ
セプターを発現する、熱的に有糸分裂後発達するニューロン（ｔｈｅｒｍａｌｌ
ｙｐｏｓｔ−ｍｉｔｏｔｉｃｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｎｅｕｒｏｎ）（Ｋｏ
ｕｌａｋｏｆｆら、ＤｅｖＢｉｏｌ、１００：３５０−７（１９８３））のマ
ーカーである。Ａ２Ｂ５と指定される多数の抗体が存在する。これらの抗体は、
特定の細胞集団の細胞表面上のシアル酸残基の混合物を認識する。Ａ２Ｂ５抗体
が結合するシアル酸残基の異種性に起因して、Ａ２Ｂ５陽性（Ａ２Ｂ５＋）細胞
に対する指定は、Ａ２Ｂ５抗体と結合する細胞を示した。

【００６９】Ａ２Ｂ５抗体は、ニューロン前駆細胞マーカーおよび神経膠前駆細胞マーカー
として、使用される。Ａｂｎｅｙら、ＤｅｖＢｉｏｌ、１００：１６６−７１
（１９８３）；Ｆｒｅｄｍａｎら、ＡｒｃｈＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ
、２３３：６６１−６（１９８４）；ＲａｏおよびＭａｙｅｒ−Ｐｒｏｓｃｈｅ
ｌ、ＤｅｖＢｉｏｌ、１８８：４８−６３（１９９７）。コレラ毒素（Ｃｈｏ
ｌｅｒａｔｏｘｉｎ−ＦＩＴＣ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）は、
分化していないニューロン（ＳｈｉｎｄｌｅｒおよびＲｏｔｈ、ＢｒｉｎＲｅ
ｓＤｅｖＢｒａｉｎＲｅｓ、９２：１９９−２１０（１９９６））または
前駆細胞を標識するために使用される。

【００７０】神経幹／前駆細胞は、中間フィラメントタンパク質であるネスチンの発現によ
り、同定された。Ｌｅｎｄａｈｌら、Ｃｅｌｌ、６０：５８５−９５（１９９０
）。ＣＮＳ由来の幹細胞の同定は、中間フィラメントタンパク質であるネスチン
に対する抗体を使用して、慣用的に実施されてきた。Ｌｅｎｄａｈｌら、Ｃｅｌ
ｌ、６０：５８５−９５（１９９０）；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、ＪＮｅｕｒｏｓ
ｃｉ、１２：４５６５−７４（１９９２）。ネスチンはまた、増殖中の神経幹／
前駆細胞において発現されることが、見出された。Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎおよ
びＭｃＫａｙ、ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ、８：１１４４−５１（１９８８）；Ｒｅ
ｙｎｏｌｄｓら、ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ、１２：４５６５−７４（１９９２）；
ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ｃｅｌｌ、７１：９７３−８５（１９
９２）；Ｖｅｓｃｏｖｉら、Ｎｅｕｒｏｎ、１１：９５１−６６（１９９３）。

【００７１】本実験において使用されるネスチンに対する抗体は、ネスチン−３３１Ｂと指
定されるウサギポリクローナル免疫グロブリンであり、ヒトネスチンを同定する
（Ｍｅｓｓａｍら、ＥｘｐＮｅｕｒｏｌ．、１６１：５８５−５９６（２００
０））。ヒトネスチンに対する抗体は、ニューロンまたは神経膠になる可能性を
有するＣＮＳ幹／前駆細胞のマーカーであると特徴付けられた（Ｍｅｓｓａｍら
、ＥｘｐＮｅｕｒｏｌ１６１：５８５−５９６、２０００）。

【００７２】ネスチンに対する抗体は、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＢｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ（ラットネスチンに対す
る抗体）から入手可能であるか、またはヒトネスチンを認識する抗体は、Ｒ．Ｍ
ｃＫａｙ（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）から要請し得る。ヒトネスチン遺
伝子配列は、クローニングされた（Ｄａｈｌｓｔｒａｎｄら、ＪＣｅｌｌＳ
ｃｉ、１０３：５８９−９７（１９９２））。そして公共に利用可能なデータベ
ースにより入手可能であり、その結果、ヒトネスチンに対する抗体は、当該分野
において公知の手段により作製し得る。例えば、公知のネスチン配列を用いて、
エピトープマッピングプログラムアルゴリズムを使用して高度に抗原性のペプチ
ドフラグメントを得ることは、簡単である。従って、６から５０を超えるまでの
アミノ酸長のペプチドが、市販者（ＰｅｐｔｉｄｅｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＫＹ）により合成され得、そしてＫＬＨまたは別
のキャリア分子に結合体化されて、このペプチドの免疫原性を増強する。適切な
量（＞１ｍｇ／接種）が、ウサギに皮下的に投与され得、そして３ブースター量
の接種が、代表的に４、８、１２〜１６週目に提供され得る。ポリクローナル抗
体またはモノクローナル抗体の効率的な産生に関して以前に記載された方法が、
本願において使用され得る。ＪｅｎｎｅｓおよびＳｔｕｍｐｆ、Ｎｅｕｒｏｅｎ
ｄｏｃｒｉｎｅＰｅｐｔｉｄｅＭｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ、４２：６６５（１
９８９）；ＹｏｕｎｇｂｌｏｏｄおよびＫｉｚｅｒ、Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｅＰｅｐｔｉｄｅＭｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ、３８：６０５（１９８９）。

【００７３】本発明の細胞型の分化系統のさらなる表示は、ＪＣウイルスの、任意の所定の
細胞型に感染する能力によって提供される。より具体的には、ＪＣウイルスが、
ニューロン細胞とは対照的に、グリア細胞に優先的に感染することを当業者は理
解する。ＪＣウイルスは、星状細胞とは対照的に、稀突起膠細胞により優先的に
感染する。Ｍａｊｏｒら、ＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌＲｅｖ，５：４９−
７３（１９９２）。

【００７４】神経先祖細胞を同定するために使用され、かつ本発明の細胞型のさらなる特徴
付けに使用され得る別のマーカーは、中間細糸タンパク質、ビメンチンである。
Ｆｌａｘら、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１６：１０３３−９（１９９８：
Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｎｅｕｒｏｎ，１０：２５５−２６
５（１９９３））。ＮＧ１細胞の多能性と一致して、これらの細胞はまた、ビメ
ンチンを発現する。Ｔｏｒｎａｔｏｒｅら、ＣｅｌｌＴｒａｎｓｐｌａｎｔ，
５：１４５−６３（１９９６）。

【００７５】本発明の方法の、多能性細胞型のために細胞の集団を富化させる能力、ならび
に例示的な細胞集団のキャラクタリゼーションを、図１〜３から要約したデータ
と共に表１に示す。

【００７６】

【表１】ＮＧ１またはＮＧ３の細胞集団から生じ得る上記のマーカーのその発現に関し
て、本発明の１４の特定の細胞型（括弧内に型番号を示す）は以下のように規定
される。

【００７７】ＴｎＴｘ−／ＣｈＴｘ−（１）ＴｎＴｘ−／ＣｈＴｘ＋（２）ＴｎＴｘ＋／ＣｈＴｘ−（３）ＴｎＴｘ＋／ＣｈＴｘ＋（４）Ａ２Ｂ５−／ＴｎＴｘ−（５）Ａ２Ｂ５＋／ＴｎＴｘ＋（６）Ａ２Ｂ５＋／ＴｎＴｘ−（７）Ａ２Ｂ５−／ＴｎＴｘ＋（８）Ａ２Ｂ５−／ＣｈＴｘ−（９）Ａ２Ｂ５＋／ＣｈＴｘ＋（１０）Ａ２Ｂ５−／ＣｈＴｘ＋（１１）Ａ２Ｂ５＋／ＣｈＴｘ−（１２）上記の１型細胞は、さらにネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）＋（型１３）およびネス
チン−（型１４）細胞に誘導され得、これらはまたＴｎＴｘ−／ＣｈＴｘ−であ
る。

【００７８】これらのうち、型（１、５および９）は、最も未成熟であると予想される。な
ぜなら、これらは表現型マーカーに対して陰性だからである。Ｎｅｕｒｏｂａｓ
ａｌ培地＋Ｎ２補充におけるＴｎＴｘ−／ＣｈＴｘ−型１細胞は、総集団におい
て約１％のＡ２Ｂ５＋細胞を有する（図３）。これらの１型細胞がゲートから出
る場合、残りの細胞の９５％はネスチン＋である。このネスチン＋／ＴｎＴｘ−
／ＣｈＴｘ−細胞表現型は、おそらく、グリアまたはニューロンの経路のいずれ
かに入らない幹／先祖細胞を表す。これらの細胞は、幹／先祖細胞と一致した特
性を有し、これは、ニューロン型またはグリア細胞の異なる型（すなわち、星状
細胞または稀突起膠細胞）に分化する可能性を有し得る。

【００７９】本発明の他の細胞型は、マーカーの組合わせを用いて同定される。以下は、表
現型の意義についての説明であり、これは細胞の最終のニューロンまたはグリア
表現型を限定するようには意図されない。

【００８０】ＣｈＴｘ＋／ＴｎＴｘ−（細胞型２またはおそらく１１）細胞表現型は、一般
にプレニューロンマーカーとみなされる。一方、ＣｈＴｘ＋／ＴｎＴｘ＋（４型
細胞）は、細胞を縮瞳後ニューロンと同定する。これらの４型細胞は、主にニュ
ーロンの経路に沿って進み、特にニューロン増殖を増強する因子の存在下で指示
される場合がそうである。

【００８１】Ａ２Ｂ５陽性細胞は、ニューロンまたはグリア細胞のいずれかであり得る。Ｃ
ｈＴｘ＋および／またはＴｎＴｘ＋（細胞型２〜４）は、細胞をおそらくニュー
ロンであるように同定する。Ａ２Ｂ５＋／ＣｈＴｘ−またはＡ２Ｂ５＋／ＴｎＴ
ｘ−細胞（細胞型７または１２）は、ニューロンになるように指示されない限り
、おそらくグリア系統である。Ａ２Ｂ５＋／ＣｈＴｘ＋細胞（細胞型１０）は、
グリアまたはニューロン経路のいずれかに分化し得る。Ａ２Ｂ５−／ＴｎＴｘ＋
（細胞型８）は、細胞をおそらくニューロンであるように同定する。

【００８２】ＥＭＥＭ１０％上に保持されるＮＧ１細胞は、表現型的にニューロンまたはグ
リアである細胞を維持するが、ニューロン環境（すなわち、Ｎｅｕｒｏｂａｓａ
ｌ＋Ｎ２補充）に置かれる場合、優先的にニューロンに発達する。ネスチン＋で
あるＴｎＴｘ−／ＣｈＴｘ−１型細胞もまた存在した。この集団は、Ｎｅｕｒｏ
ｂａｓａｌ＋Ｎ２補充条件において増大された。これらの培養物における表現型
の変化は、代謝性条件または培地における因子によって指示される場合、培養物
中のＮＧ１細胞が、特定の合図によって、より成熟したグリアまたはニューロン
経路のいずれかに分化し得る前駆体特性を有する細胞の異質な集団として維持さ
れることを示す。

【００８３】本発明は、本明細書中に記載の集団の細胞が単一表現型ではなく、そして集団
の環境または培養物の意図的な変化（「指示」）によって複数の表現型が生じ得
るという発見に部分的に基づく。

【００８４】本発明の方法は、本発明の細胞の好ましい表現型を規定するために、少なくと
も３つのマーカー（好ましくは組合わせで）を有するこれらの集団の細胞の表現
型の分析を含む（図２）。

【００８５】上記の特定の細胞型の提供を超えて、本発明は、これらの細胞型の１つ以上を
含む組成物（好ましくは、薬学的に受容可能な賦形剤中に）を提供する。

【００８６】これらのマーカーはまた、細胞集団の富化の方法の実証において有用であり、
これは本発明のさらなる実施形態である。具体的には、実施例においてさらに詳
述されるように、細胞のＮＧ１集団は、培養条件の関数として表２に示されるよ
うに特徴付けられる。

【００８７】これらの結果は、本発明の方法によって、すでに存在するものの富化ならびに
／または多数の多能性かつ未成熟な神経細胞型の形成を実証する。

【００８８】本発明の細胞（細胞集団または富化細胞型のいずれか）は、この細胞を細胞培
養培地（例えば、イーグル最小必須培地）またはリン酸緩衝生理食塩水のような
生理学的に適合性のキャリア中に懸濁させることによって、移植のために調製さ
れ得る。細胞密度は、一般に約１０⁴〜１０⁷細胞／ｍｌであり得る。この細胞懸
濁液は、移植の前に穏やかに振盪される。移植される細胞懸濁液の容量は、移植
の部位、処置の目的、および溶液における細胞の密度に大きく依存する。代表的
に、患者または宿主に移植される細胞の量は、「治療的有効量」である。本明細
書中で使用される場合、治療的有効量とは、処置が求められる特定の疾患の有効
な処置に必要とされる、移植される細胞の数をいう。例えば、振せん麻痺のため
の処置の場合、治療的有効量の細胞の移植は、代表的にその疾患（例えば、硬直
、運動不能症および歩行障害）に関連する症状の量および／または重症度におけ
る減少を生じる。振せん麻痺の処置において、各注射において投与される細胞の
量は、この有効量に到達するのに十分な量である。各宿主において、いくつかの
注射が使用され得る。当業者は、適切な細胞投与量の決定方法を理解する。

【００８９】上記のように、細胞型の移植または本発明の細胞集団を直接富化することは可
能であり得るか、あるいは移植のさらに前の細胞型または集団のさらなる分化は
好ましくあり得る。

【００９０】本発明の代替の好ましい実施形態において、移植に有用な細胞は、神経性関連
ペプチドをコードする異種核酸配列と共にトランスフェクトされ得、そしてこの
異種核酸配列を発現し得る。本明細書中で核酸の記載のために使用される場合、
用語「異種」とは、一般に、この配列と共にトランスフェクトされる細胞株内に
は概して天然には存在しない配列をいう。従って、異種配列は、この細胞株にと
って専ら外来性のセグメントを含み得るか、あるいは、非自然な様式で細胞株内
に取り込まれる未変性のセグメント（例えば、非自然なプロモーター／エンハン
サー配列に連結して、代表的にはこのセグメントには関連しない未変性のプロモ
ーターに連結して、あるいはこの細胞株が普通は１つのコピーを提供するかまた
はコピーを提供しない場合に、複数のコピーにおいて提供される）を含み得る。

【００９１】一般に、核酸配列は、転写性プロモーターおよび転写性ターミネーターに作動
可能に連結される。別のＤＮＡセグメントと機能的関係に配置される場合、ＤＮ
Ａセグメントは作動可能に連結される。例えば、プロモーターまたはエンハンサ
ーが配列の転写を刺激する場合、プロモーターまたはエンハンサーはコード配列
に作動可能に連結され；シグナル配列についてのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌
において関与する前タンパク質として発現される場合、ポリペプチドをコードす
るＤＮＡに作動可能に連結される。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は
近接しており、そしてシグナル配列の場合、近接およびリーディングフェイズの
両方である。しかし、エンハンサーは、これが転写を制御するコード配列に近接
しなくてもよい。連結は、好都合な制限部位で、あるいはその代わりに挿入され
るアダプターまたはリンカーでのライゲーションによって達成される。ＤＮＡ配
列はまた、転写エンハンサーにも連結され得る。移植された細胞におけるこのＤ
ＮＡの発現は、構成的または誘導性であり得る。これらの特徴を有する種々の発
現ベクターは、細胞のトランスフェクションのためのＤＮＡ（例えば、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，１９８
８に記載される、プラスミドベクターｐＴＫ２、ｐＨｙｇおよびｐＲＳＶｎｅｏ
、シミアンウイルス４０ベクター、ウシパピローマウイルスベクターまたはエプ
スタイン−バーウイルスベクター）を保有し得る。これらのベクターはまた、ベ
クターｐｃＤＮＡ３．１およびＥＦ−１を含み得、これらは市販（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）されているか、または以前に本明細書中に
参考として援用される。このベクターは、標準的方法、例えばエレクトロポレー
ション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ポリブレントランスフェ
クション、カチオン性脂質によって、細胞内に導入され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎ
ｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，１９８８に記載
される、Ｆｅｌｇｎｅｒ＆Ｇａｄｅｋ，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ
ＵＳＡ，８４：７４１３（１９８７）など。

【００９２】さらに、本発明は、化合物の外来性の添加によって調節され得るプロモーター
系の使用を意図する。これらの調節可能なプロモーター系は、コードされたペプ
チド／タンパク質の用量のいくつかの制御を可能とする。現在では４つの別々の
主要な技術が存在し、そしてインビトロおよびインビボの標的遺伝子の発現を調
節するために開発されてきた。これらは、（１）テトラサイクリンベースの遺伝
子スイッチ、（２）ＲＵ４８６ベースの遺伝子スイッチ、（３）エクジソンベー
スの遺伝子スイッチおよび（４）ＦＫ１０１２（ラパマイシン）ベースの遺伝子
スイッチを含む。

【００９３】核酸によってコードされるペプチドは、ハンティングトン舞踏病の処置におけ
る移動インヒビターのように、一般には直接治療的化合物であり得る。あるいは
、核酸によってコードされるこのペプチドは、宿主の外来性組織によるペプチド
の欠乏性の産生を補充または置換するために選択され得、この欠乏は特定の障害
の症状の原因である。この場合、細胞または細胞集団は、ペプチドの人工的供給
源として作用する。あるいは、このペプチドは、治療的、または神経学的に関連
する化合物の産生を触媒する酵素であり得る。かさねて、このような化合物は宿
主系に対して外来性であり得るか、または合成経路がその他の障害性である外来
性化合物であり得る。後者の場合、宿主のＣＮＳ内でのペプチドの産生は、この
化合物の生成のための追加の経路を提供する。例えば、好ましい実施形態におい
て、不死化ヒト胎児神経誘導細胞株は、チロシンヒドロキシラーゼ酵素をコード
する核酸と共にトランスフェクトされる。チロシンヒドロキシラーゼは、チロシ
ンからのＬ−ｄｏｐａの合成を触媒する。ドパミンは、振せん麻痺の処置におい
て効果的であることが実証されてきた。

【００９４】この核酸はまた、神経成長因子、抑制性成長因子、またはサイトカインのよう
な、脳腫瘍の処置において有用な栄養因子をコードし得る。その神経再生の増強
およびＬ−ｄｏｐａを産生および分泌する能力に起因して、本発明の細胞および
細胞集団は、宿主のＣＮＳにおいてドパミン作用性細胞の損失に関連する中枢神
経系障害（例えば、振せん麻痺）の処置において特に有用である。

【００９５】代表的に、本発明の細胞または細胞集団は、脳の実質組織内の、脳脊髄液を含
む空間（例えば、クモ膜下空間または心室、あるいは神経外的（ｅｘｔｒａｎｅ
ｕｒａｌｌｙ））に移植され得る。本明細書中で使用される場合、用語「神経外
的」は、中枢神経系または末梢神経系組織外の宿主の領域（例えば、腹腔神経節
または坐骨神経）を示すように意図される。「神経外（ｅｘｔｒａｎｅｕｒａｌ
）」領域は、末梢神経を含み得る。「中枢神経系」は、硬膜内のすべての構造を
含むように意味される。

【００９６】本発明の細胞または細胞集団が脳に移植される場合、ＬｅｋｓｅｌｌおよびＪ
ｅｒｎｂｅｒｇ、ＡｃｔａＮｅｕｒｏｃｈｉｒ．、５２：１−７（１９８０）
ならびにＬｅｋｓｅｌｌら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．６６：６２６−６２９（
１９８７）（この両方は、本明細書中に参考として援用される）に記載されるよ
うな、定位的な方法が一般に使用される。標的領域の局在化は、Ｌｅｋｓｅｌｌ
ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｈｙｃｈｉａｔｒｙ、４８：１
４−１８（１９８５）（本明細書中に参考として援用される）に記載されるよう
な、移植前ＭＲＩを一般に含む。標的の座標は移植前ＭＲＩから決定される。

【００９７】移植の前に、Ｂｒｕｎｄｉｎら、ＢｒａｉｎＲｅｓ．、３３１：２５１−２
５９（１９８５）（本明細書中に参考として援用される）によって記載されるよ
うな、種々の細胞が評価され得る。手短に言えば、細胞懸濁液のサンプルアリコ
ートが、０．９％生理食塩水中の、各成分の所定の比のアクリジンオレンジおよ
びエチジウムブロミドの混合物；Ｓｉｇｍａ、と共にスライドガラス上で混合さ
れる。この懸濁液は、血球計測器に移され、そして生存可能および生存不可能な
細胞が、計算チャンバグリッドを可視化するための白色光トランス照射と組合わ
せて、３９０ｎｍの落射証明下で蛍光顕微鏡を使用して、視覚的に計測される。
アクリジンオレンジ標識は、核を緑色で示し、一方エチジウムブロミドは死滅細
胞に入り、オレンジ−赤色の蛍光を生じる。細胞懸濁液は、一般に約５０％、好
ましくは７５％、より好ましくは８５％、あるいは９５％より多くの生存可能細
胞を含むべきである。

【００９８】注射は、一般に、２３〜２７ゲージ針を有する殺菌した１０ｍｌのＨａｍｉｌ
ｔｏｎシリンジで行われる。細胞を充填したシリンジは、定位フレームの頭部に
直接装着される。注射針は、頭蓋の小さなバーホールを通して所定の座標よりも
低下され、４０〜５０ｍｌの懸濁液を約１〜２ｍｌ／分の速度で沈着させ、そし
て針のゆっくりとした退縮前に、さらに２〜５分拡散させた。頻繁に、同じ針の
侵入に沿って１〜３ｍｍ離れて、少なくとも２つの別々の沈着がなされ、そして
標的面積にわたって散乱した５つまでの沈着が、同じ手術において容易になされ
得る。この注射は、手動または注入ポンプによって行われ得る。針の退縮の後の
手術の完了時に、宿主はこのフレームから除去され、そして創傷は縫合される。
予防的抗生物質または免疫抑制治療が、必要に応じて施行される。

【００９９】より全身的な神経性障害の処置のために、細胞は治療的化合物を発現するため
にトランスフェクトされ得、そして心室または腰膜に移植される。治療的化合物
が細胞によって分泌される場合、脳脊髄液の神経性循環は、中枢神経系全体にわ
たって治療的化合物を洗浄し、全身的処置の手段を提供する。心室への移植は、
開放性手順（例えば、Ｍａｄｒａｚｏら、ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３
１６：８３１−８３４（１９８７）またはＰｅｎｎら、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒ
ｙ、２２：９９９−１００４（１９８８）（これらの両方は、本明細書中に参考
として援用される））によって達成され得る。細胞の腰膜への移植は、Ｘ線撮影
の造影剤または抗腫瘍医薬の、腰への穿刺を介した滴下注入と同様の標準的手順
によって最も好都合に達成される。

【０１００】いくつかの場合、本発明に従う細胞を神経外的に移植することが望ましくあり
得る。この細胞は、針または内視鏡を介して、あるいは開放的手順によって、経
皮的に移植され得る。当業者は、特定の適用のために細胞を移植する最も適切な
方法を容易に理解する。この細胞または細胞集団は、移植の前に、膜によってカプセル化され得る。この
カプセル化は、宿主の免疫系に対する障壁を提供し、そして移植反応および炎症
を阻害する。細胞カプセル化のいくつかの方法が使用され得る。いくつかの場合
、細胞は別々にカプセル化される。別の場合、多くの細胞は同じ膜内にカプセル
化される。移植後に細胞が除去される場合、単一膜内に多くの細胞をカプセル化
する比較的大きなサイズの構造が、移植された細胞の回収のための好都合な手段
を提供する。細胞カプセル化のいくつかの方法は当該分野で周知であり、例えば
欧州特許公開番号第３０１，７７７号または米国特許第４，３５３，８８８号、
同第４，７４４，９３３号、同第４，７４９，６２０号、同第４，８１４，２７
４号、同第５，０８４，３５０号、同第５，０８９，２７２号に記載され、これ
らの各々は本明細書中に参考として援用される。

【０１０１】細胞カプセル化の１つの方法は以下の通りである。細胞はアルギン酸ナトリウ
ム（ポリアニオン性の海藻抽出物）と混合され、そして二価カチオン（例えば、
塩化カルシウム）の溶液に押し出され、これがアルギニン酸ナトリウムと複合体
化してゲルを形成し、この細胞を含むゲル状のビーズまたは液滴の形成を生じる
。このゲルビーズは、高分子量（ＭＷ６０〜５００×１０³）濃度（０．０３
〜０．１％ｗ／ｖ）のポリアミノ酸（例えば、ポリ−Ｌ−リジン）と共に短期間
（３〜２０分）インキュベートされて膜を形成する。形成されたカプセルの内部
は、クエン酸ナトリウムでの処理によって化石化（ｒｅｌｉｑｕｉｆｙ）される
。細胞の周りの単一膜は、高度に透過性である（ＭＷカットオフ２００〜４
００×１０³）。細胞を含む単一膜カプセルは、生理食塩水溶液中で１〜３時間
インキュベートされ、アルギニン酸ナトリウムを包括し、カプセル外に拡散させ
、そして平衡状態までカプセルを膨張させる。得られたアルギニン不足カプセル
は、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）またはキトサン（脱アセチル化キチン；ＭＷ２４０
×１０³）のような低分子量アミノ酸（ＭＷ１０〜３０×１０³）と反応して、
相互作用した、透過性の低い膜（ＭＷカットオフ４０〜８０×１０³）を生
成する。次いで、二重膜カプセル化細胞は、上記のようにＥ−ＭＥＭ中で２〜３
週間培養される。

【０１０２】アルギニン酸ナトリウムビーズが特に参照される間、任意の非毒性水溶性物質
は、配置される培地における条件の変化が用いられ得ることによって、ゲル化さ
れて形状維持塊を形成し得ることが、当業者によって理解される。このようなゲ
ル化物質は、一般に、逆に荷電したポリマーに曝露される場合に表面層が架橋し
て透過性膜を形成し得るために、容易にイオン化されてアニオン性またはカチオ
ン性基を形成するいくつかの化学的部分を含む。大部分の多糖体ガム（天然およ
び合成の両方）は、アミノ基のような正荷電反応性基を含むポリマーによって架
橋され得る。アルギニン酸ナトリウムガムと反応し得るこの架橋生体適合性ポリ
マーは、ポリリジンおよび他のポリアミノ酸を含む。形成された膜の透過性の程
度は、所望の分子量を有するポリアミノ酸の慎重な選択によって制御され得る。
ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）は、好ましいポリマー性材料であるが、他はキトサ
ンおよびポリアクリレートを含む。分子量は、代表的に約１０⁴〜約１０⁶で変化
する。

【０１０３】本発明を、以下の実施例によりさらに説明する。これらの例は、本発明の局面
を説明するのみであり、本発明の制限として意図されるものではない。

【０１０４】（実施例１）（異種胎児ＣＮＳ由来親細胞の産生）ＳＶＧ細胞は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）より入手され得る（受託番号ＡＴＣＣＣ
ＲＬ８６２１）。ＳＶＧ細胞は、当該分野において公知の手段により培養され
た。米国特許第４，７０７，４４８号、およびＭａｊｏｒら、ＰｒｏｃＮａｔ
ｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８２：１２５７−６１（１９８５）を参照のこ
と。

【０１０５】不死化されたＳＶＧ細胞を、本発明を例示するための出発材料として使用した
が、無制限に分裂する能力を有する細胞である不死化細胞は、ｒａｓ，ＳＶ４０
Ｔ−抗原、ｖ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃのような癌遺伝子を発現するように細胞を遺
伝子改変することによる不死化および自発的に不死化された細胞、を含む多くの
手段により作製され得る。さらに、テロメラーゼを発現するように細胞を遺伝子
改変することによっても、細胞は不死化され得る（Ｚｈｕ，Ｗａｎｇら（１９９
９）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９６（７）：３７２３−
８）。不死化細胞としては、少なくとも部分的にはそのテロメラーゼの高発現に
よって無制限の分裂能を有する幹細胞が挙げられる。不死化細胞は、変異が原因
と考えられる自発的なプロセスに由来し得る。それゆえ、本発明の出発材料は例
示のために本明細書中において示されたＳＶＧ細胞に限定されない。

【０１０６】（実施例２）（クライシス後の不死化ＮＧ１細胞の産生）ＳＶ４０誘導によるヒト細胞の不死化は、二段階のプロセスであった。第一段
階は、培地における寿命の延長であり、ここで細胞は、正常な細胞が老化を受け
る時点を越えて、制限された数の倍加を受けていた。寿命の延長後、細胞は、細
胞死によって細胞分裂が平衡化された状態である「クライシス（ｃｒｉｓｉｓ）
」に入った。第二段階は、不死化細胞のコロニーの稀な出現を含み、これは、無
期限に継代培養された。Ｂｒｙａｎ＆Ｒｅｄｄｅｌ，ＣｒｉｔＲｅｖＯｎｃ
ｏｇ，５：３３１−５７（１９９４）。ＳＶＧ細胞をおよそ３３〜３８回継代ま
で培養した後、それらの細胞はクライシスに入り、その細胞の典型的なものはＳ
Ｖ４０を発現する。ここでは、細胞増殖はほとんどなく、そして細胞は非常に大
きく、顆粒状に見えた。ＳＶＧ細胞がクライシスにある場合、顕微鏡で細胞死が
観察可能であった。クライシスにある細胞に対して１週間に２回給餌し、細胞密
度をＴ７５フラスコ当たり１．５×１０⁶以上に維持した場合、細胞の部分集団
は、時にクライシスから抜け出し、増殖を始める。このＳＶＧのクライシス後亜
系統の細胞は増殖不死化細胞であり、従って、このように発生した細胞を、異な
る細胞集団（ＮＧ１）とみなす。

【０１０７】ＳＶＧ細胞を、イーグル最少必須培地（ＥＭＥＭ：ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ
Ｃａｔ＃１２−１２５Ｆ）＋１０％ＦＢＳ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒＣａ
ｔ＃１４−５０１Ｆ）＋２ｍＭ１−グルタミン（ＱｕａｌｉｔｙＢｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌＣａｔ＃１１８−０８４−０６０）からなる標準培地において増殖
させた。細胞の継代は、培地を除去し、そしてハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ
：ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒＣａｔ＃１０−５４３Ｆ）で２回洗浄し、３分間
０．２５％トリプシン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒＣａｔ＃１７−１６１Ｅ
）と共にインキュベーションして、細胞を解離させることによって行った。この
懸濁細胞を新しい標準培地に添加し、室温で１００×ｇで５分間遠心分離した。
次いで、細胞ペレットは新しい標準培地に移され、新しい７５ｃｍ²の組織培養
フラスコ中内に配置された。

【０１０８】クライシス前ＳＶＧ細胞は３〜４日毎に、フラスコがコンフルエントになった
場合に継代したが、クライシスの間は増殖の遅延や細胞死が理由で、８〜１０日
毎に継代することのみ必要とされた。クライシスの間、ＳＶＧ細胞は頻繁に継代
培養される必要はなかったが、７５ｃｍ²フラスコあたり１．５×１０⁶で播種さ
れ続けた。ＳＶＧ細胞は、１個以上の細胞のコロニーが出現し、フラスコ中で増
殖し始めるまでの約２ヶ月間、クライシスのまま維持された。これらのコロニー
は各継代と共に混合されたが、フラスコ中で他の細胞を増殖させ、クライシス後
細胞株を構成する。ＮＧ１型のクライシス後細胞株は、指定されたフラスコ中に
ＳＶＧ細胞を播種し、そしてそれはクライシスを経て出現したので別個の細胞株
もしくは集団として処理することにより産生した。ＮＧ１型の細胞株は、フラス
コにおいてクライシスから抜け出したすべてのコロニーのプールを表すので、ク
ローンであるとは見なされない。

【０１０９】（実施例３）（フローサイトメトリー分析のためのＳＶＧ細胞の調製）ＳＶＧ細胞を、標準培地中で５０回の継代を通じて増殖させ、次いで、０．２
５％トリプシンを用いてＥＤＴＡ緩衝液中でトリプシン処理した。これらのＮＧ
１型の細胞を組織培養グレードのプラスチックフラスコ中に、約１×１０⁴細胞
／ｃｍ²で配置した。これらの細胞を、１６時間もしくは一晩インキュベートし
、次いで、標準培地もしくは血清を含まないＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ；Ｇｉ
ｂｃｏ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）＋Ｎ２補充物（Ｇｉｂｃｏ）のいず
れかにおいて再給餌した。Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（ＮＢ）の組成は、Ｌｉｆ
ｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（１−８００−８４７−４２２６；Ｃａｔ．Ｎｏ
．２１１０３）より入手可能であり、そして以前にＢｒｅｗｅｒら（ＪＮｅｕ
ｒｏｓｃｉＲｅｓ，３５：５６７−５７６（１９９３））によって、以下を含
むことが記載されている：（括弧内のすべての量は、他に示されない限り、μＭ
とする）無機塩類（ＣａＣｌ₂（無水，１８００），Ｆｅ（ＮＯ₂）₃．９Ｈ₂Ｏ（
０．２），ＫＣｌ（５３６０），ＭｇＣｌ₂（無水，８１２），ＮａＣｌ（５１
３００），ＮａＨＣＯ₃（２６０００）およびＮａＨ₂ＰＯ₄．Ｈ₂Ｏ（９００））
；他の成分（Ｄ−グルコース（２５０００），フェノールレッド（２３），ＨＥ
ＰＥＳ（１００００）およびピルビン酸ナトリウム（２３０）），アミノ酸（Ｌ
−アラニン（２０），Ｌ−アルギニン．ＨＣｌ（４００），Ｌ−アスパラギン．
Ｈ２（５），Ｌ−システイン（１０），Ｌ−グルタミン（５００），グリシン（
４００），Ｌ−ヒスチジン．ＨＣｌ．Ｈ₂Ｏ（２００），Ｌ−イソロイシン（８
００），Ｌ−ロイシン（８００），Ｌ−リシン．ＨＣｌ（５），Ｌ−メチオニン
（２００），Ｌ−フェニルアラニン（４００），Ｌ−プロリン（６７），Ｌ−セ
リン（４００），Ｌ−スレオニン（８００），Ｌ−トリプトファン（８０），Ｌ
−チロシン（４００），Ｌ−バリン（８００）），ビタミン類（Ｄ−Ｃａパン
トテン酸（８），塩化コリン（２８），葉酸（８），ｉ−イノシトール（４０）
，ナイアシンアミド（３０），塩化ピリドキサール（２０），リボフラビン（１
），塩化チアミン（１０）およびビタミンＢ１２（０．２））。また、１００×
Ｎ２補充物は以下を含む；インスリン５００μｇ／ｍｌ，ヒトトランスフェリン
１０，００μｇ／ｍｌ，プロゲステロン０．６３μｇ／ｍｌ，プトレシン０．１
６μｇ／ｍｌ，亜セレン酸塩０．５２μｇ／ｍｌ。

【０１１０】４８〜７２時間後、トリプシン処理によって細胞を収集し、０．１％ＢＳＡ（
ウシ血清アルブミン）を含むＰＢＳ中に１０⁶細胞／ｍｌで再懸濁した。そして
、Ｍａｒｉｃらにより以前に記載されたプロトコール（Ｎｅｕｒｏｍｅｔｈｏｄ
ｓ、３３：３８７−３１８（１９９９））に従ってＦＡＣＳ分析のために処理を
行った。フローサイトメトリー用の適用のために単一細胞懸濁物を達成するため
、より良い結果が得られるようパパインの代わりにトリプシンを使用した。

【０１１１】単離後、細胞を適切な試薬と反応させ、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）に
より分析を行った。各単一細胞について５つまでの異なるパラメーター（細胞の
サイズおよび複雑性、ならびに免疫細胞化学、膜電位、ならびにカルシウム蛍光
シグナルを含む）を１秒あたり数千細胞の速度で同時に測定した。いくつかの実
験においては、これらの異なる細胞パラメーターのいずれか１つもしくは組み合
わせに基づき、次いで、異なる細胞集団の正確な分類を行った。

【０１１２】

【表２】ＦＡＣＳ分析（図１および図２）のために使用される一次標識は、以下の混合
物を含んだ：１）マウスモノクローナルクラスＩｇＧ抗ＴｎＴｘフラグメントＣ
抗体（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，
ＩＮ）と組み合わせたＴｎＴｘフラグメントＣ（Ｓｉｇｍａ，ＳｔＬｏｕｉｓ
，ＭＯ），２）マウスモノクローナルクラスＩｇＭ抗体Ａ２Ｂ５（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ），３）ＦＩＴ
Ｃ複合コレラ毒素（Ｓｉｇｍａ，ＳｔＬｏｕｉｓ，ＭＯ）および／もしくは４
）ウサギポリクローナル抗ネスチンウサギ抗体（ＭｅｓｓａｍＣＡ，Ｈｏｕ
Ｊ，ＭａｊｏｒＥＯ：ＥｘｐＮｅｕｒｏｌ１６１：５８５−５９６，２０
００「ヒト特異的抗ネスチン抗体により特徴付けられる発生中のヒトＣＮＳにお
ける神経およびグリア細胞におけるネスチンの共発現」）。これらの一次標識は
、本発明の細胞表現型を特徴付けるために用いられた。

【０１１３】フローサイトメトリーのために使用される二次標識は、以下を含んだ：１）ヤ
ギ抗マウスＩｇＧ１−ＰＥ−ＣＹ５（ＣＡＬＴＡＧＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ），２）ヤギ抗マウスＩｇＭ−ＰＥ（Ｊａｃｋｓ
ｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈＬａｂｓ，ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ，ＰＡ
）および３）ヤギ抗ウサギＩｇ−ＰＥ（ＣＡＬＴＡＧＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）。免疫蛍光特性はＦＡＣＳ（レーザー励起
４８８ｎｍ、ならびにＦＩＴＣ，ＰＥ，およびＰＥ−ＣＹ５の検出には、それぞ
れ５２５±３０，５７５±２５，および６７０±２０ｎｍの蛍光フィルター設定
を用いた）によりランダムにサンプリングされた２００，０００個の細胞より得
た。

【０１１４】全ての測定はＦＡＣＳＴＡＲおよびフローサイトメーター（ＢｅｃｔｏｎＤ
ｉｃｋｉｎｓｏｎＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）を用いて行った。細胞
を５００ｍＷで操作したアルゴンイオンレーザー（ＳｐｅｃｔｒａＰｈｙｓｉ
ｃｓ，Ｍｏｄｅｌ２０１６，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）を用いて励
起し、そして波長を４８８ｎｍにした。細胞サイズに関連する特性である前方角
光散乱（ＦＡＬＳ）および各エレメントの異なる蛍光発光を、１，０００〜２，
０００事象／秒の速度でランダムに記録した。このデータ収集速度では５〜１０
秒間に約１０，０００個の細胞のプロファイリングを可能にする。ＦＡＬＳデー
タは、波長４８８±１０ｎｍのバンドパスおよび中性密度フィルターの組み合わ
せを用いて線形様式で収集され、一方、蛍光発光を対数的に増幅し、そして適当
な波長で漏らした。多重標識実験では、蛍光発光を呈色クロスオーバーについて
、電気的な補償を用いて補正した。ＦＡＬＳ特性および蛍光強度は、それぞれ１
０２４のチャンネルまで解像された。データを、ＦＡＣＳｔａｔｉｏｎのＭａｃ
ｉｎｔｏｓｈに基づいたコンピュータープラットフォームにおいて操作するＣｅ
ｌｌＱｕｅｓｔＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉ
ｎｓｏｎ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）を用いて解析した。

【０１１５】特定の好ましい試薬および手順においては、標準生理培地（ＮＰＭ）の使用が
含まれ、この培地を、０．１％ＢＳＡ、１４５ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣ
ｌ、１．８ｍＭＣａＣｌ₂、０．８ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＨｅｐｅｓ、
１０ｍＭグルコース（１８．０２ｇ／１００ｍｌ１０ｍｌ）で調製し、こ
れはｐＨ７．３でありかつ２９０−３００ｍＯｓｍの浸透圧モル濃度であり
、フィルター滅菌したものであった。破傷風毒素フラグメントＣ（Ｓｉｇｍａ）
および抗ＴｎＴｘ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）の溶液を、それ
らを１：１の割合で一緒に混合して調製し（例えば、１ｍｇ抗ＴｎＴｘあたり
１ｍｇのＴｎＴｘを添加）、４℃で３０分反応させた。細胞を、終密度１００
０万個細胞／ｍｌになるようにＢＳＡを含むＮＰＭ溶液（ＮＰＭ／ＢＳＡ）中に
再懸濁した。１００万個の細胞あたり１ｇのＴｎＴｘ／抗ＴｎＴｘ混合物を使用
し、４℃、１時間インキュベートした．細胞を２００×ｇ、４℃で１０分間遠心
後、培地上清を除き、残った細胞を１０ｍｌのＮＰＭ／ＢＳＡ中に再懸濁した。
この洗浄操作をさらに２度繰り返し、その後終密度１０００万個細胞／ｍｌとな
るようにＮＰＭ／ＢＳＡ中に再懸濁した。１００万個の細胞あたり１ｇのＰＥ／
ＣＹ５−結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ１（ＣａｌｔａｇＬａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）、および１ｇのＦＩＴＣ−ＣｈＴｘ複合体を加え、４℃で１時間インキュ
ベートした。次いで、ＮＰＭ／ＢＳＡ中で遠心、洗浄操作を３度繰り返し、続い
て、ＮＰＭ／ＢＳＡ中で細胞の終密度が１０００万個細胞／ｍｌになるように再
懸濁した。

【０１１６】細胞を、前述のように抗Ａ２Ｂ５抗体および抗ＴｎＴｘ抗体によって二重に免
疫標識され、ＦＡＣＳ電子ゲートによって決定された蛍光サインに基づき４種の
集団（ＴｎＴｘ⁺／Ａ２Ｂ５^-、ＴｎＴｘ⁺／Ａ２Ｂ５⁺、ＴｎＴｘ^-／Ａ２Ｂ５⁺、
およびＴｎＴｘ^-／Ａ２Ｂ５^-）に分類した。これら４種の集団を、荷電した生理
食塩水液滴を用いて分別し、荷電プレートによって直接的に適切な各試験管へと
偏向した。次いで、分別した細胞を生理食塩水で２度洗浄し、分別の純度を調べ
るために再分析したが、全ての場合において９６％より大きい純度であった。分
別後、細胞の生存力に変化はなく、トリパンブルーまたはＰＩ陽性（死もしく瀕
死の）細胞はどの分別された亜集団についても５％以下であった．（実施例４）（培地条件における血清除去の効果）２４〜７２時間の培養期間における培地組成の変化は、再現性のある相対的な
細胞表現型の変化を生じた。不均一なＮＧ１細胞集団を標準培地中に維持した場
合、相対的に高い割合のＡ２Ｂ５⁺、ＣｎＴｘ⁺、およびＴｎＴｘ^-細胞が得られ
た。また、ＮＧ１細胞の培地を、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋Ｎ２補充物に変えたと
ころ、Ａ２Ｂ５⁺細胞は２６％から５％まで減少した。これは培地の変化によっ
て有意な細胞の減少が見られないことに一致するものであった。細胞がＮｅｕｒ
ｏｂａｓａｌ＋Ｎ２補充物中にある場合に、ＣｈＴｘ＋、ＴｎＴｘ＋細胞の割合
が増加することにより同定される、より多くの神経細胞表現型へのシフトが存在
した。培地が標準培地からＮｅｕｒｏｂａｓａｌ＋Ｎ２補充物に変わると、この
ＣｈＴｘ＋、ＴｎＴｘ＋細胞の割合は、ＮＧ１細胞の２％から１８％に変化した
（表３）。培地がＮｅｕｒｏｂａｓａｌ＋Ｎ２補充物に変わった場合に、培地誘
導によって代謝変化が起こり表現型がグリア細胞から神経細胞に変化し、これに
一致する形でＪＣウイルス感受性が完全に消失した．

【０１１７】

【表３】（実施例５）（不均一集団より同定される幹細胞／前駆細胞の存在の実証）最も未分化な状態にある多分化能を有する細胞は、グリア細胞もしくは神経細
胞系統特異的などのようなマーカーも発現することはない細胞であることが予測
される。これらのネガティブな細胞（ＣｈＴｘ−、ＴｎＴｘ−、Ａ２Ｂ５−）を
、考えられる「幹／前駆体」状態について試験した。多分化能を有する幹／前駆
細胞は中間径フィラメントタンパクであるネスチンの発現によって同定され得る
。Ｌｅｎｄａｈｌら、Ｃｅｌｌ、６０：５８５−９５（１９９０）を参照のこと
。ＴｎＴｘ−／ＣｈＴｘ−細胞のおよそ９５％がネスチン陽性と分類された（表
２および図３参照）。標準培地に比べてＮｅｕｒｏｂａｓａｌ＋Ｎ２補充物を用
いた場合、多分化能を有する細胞集団の存在と一致して、ＪＣウイルス感受性の
劇的な消失がみられた（表２）。これは、存在するＮＧ１細胞系統中に、幹／前
駆体細胞集団が存在していることを実証するものである。

【０１１８】本発明に従うＴｎＴｘ、ＣｈＴｘ、Ａ２Ｂ５のマーカーとしての使用が好まし
いが、本発明に従う細胞集団は、これらのマーカーのみによって特徴付けされる
ことには限定されるものではない。特に、他の細胞表現型のマーカーや結合パー
トナー（例えば、細胞表面レセプター、神経伝達物質輸送体、イオンチャンネル
および／またはイオン交換ポンプの有無）は、本発明の細胞および／または細胞
集団の発生段階をさらに特徴付け得る。このようなさらなるマーカー当業者に公
知であり、そして例えば、以下において記載されている：Ｓｉｅｇｅｌ１９９
４；Ｐａｌｍｅｒ、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９７；Ｓａｈ、Ｒａｙら１９９
７；Ｓｎｙｄｅｒ、Ｙｏｏｎら、１９９７；Ｇａｇｅ１９９８；Ｇａｇｅ、Ｋ
ｅｍｐｅｒｍａｎｎら、１９９８；Ｌｉｎｇ、Ｐｏｒｔｅｒら、１９９８；Ｗａ
ｇｎｅｒ、Ａｋｅｒｕｄら、１９９９；およびＧａｇｅ２０００。詳細には、
例えば、ニューロンは、Ｎ型カルシウムチャンネルの発現により同定され得る。
稀突起神経膠細胞は、細胞表面におけるガラクトセレブロシドＣ（ＧａｌＣ）の
存在により同定され得る。ニューロンの亜集団に対するなおより特異的なマーカ
ーとしては、知覚／痛みの経路に関わる細胞を得るためのμオピオイドレセプタ
ーのようなレセプターに対する抗体の使用が含まれ得る。ＦＡＣＳは同時に３種
類より多くの標識で実行し得、これは、発光スペクトルにおいて分解され得る多
くの標識に基づいて、細胞の選別を可能にする。

【０１１９】（実施例６）（表現型のマーカー発現に対するフォルスコリンの効果の欠如）アデニル酸シクラーゼ活性化因子であるフォルスコリンのＮＧ１細胞表現型に
対する効果について調べた。その結果、２４時間フォルスコリン（５μＭ）処理
の時間では、ＥＭＥＭ＋１０％ＦＢＳまたはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ＋Ｎ２補充物
中のいずれにおいてにもかかわらず、ＣｈＴｘ、ＴｎＴｘ、またはＡ２Ｂ５の得
られるＮＧ３細胞表現型の発現に対する効果は見られなかった（図１）。

【０１２０】（実施例７）（個別の細胞タイプの特徴付けおよび単離）ＮＧ１細胞を用いるＡ２Ｂ５および／またはＴｎＴｘおよび／またはＣｈＴｘ
および／またはネスチンの二重または三重の免疫標識反応の結果は、発現の定性
的、定量的な相異を示し、そしてこれらの表面エピトープの同時発現は、図１〜
２に示される。フローサイトメトリーにより観察された以下の個別の細胞タイプ
のリストを以下に示す：ＴｎＴｘ−／ＣｈＴｘ−（１）ＴｎＴｘ−／ＣｈＴｘ＋（２）ＴｎＴｘ＋ＣｈＴｘ−（３）ＴｎＴｘ＋／ＣｈＴｘ＋（４）Ａ２Ｂ５−／ＴｎＴｘ−（５）Ａ２Ｂ５＋／ＴｎＴｘ＋（６）Ａ２Ｂ５＋／ＴｎＴｘ−（７）Ａ２Ｂ５−／ＴｎＴｘ＋（８）Ａ２Ｂ５−／ＣｈＴｘ−（９）Ａ２Ｂ５＋／ＣｈＴｘ＋（１０）Ａ２Ｂ５−／ＣｈＴｘ＋（１１）Ａ２Ｂ５＋／ＣｈＴｘ−（１２）上記１型の細胞はさらにネスチン＋（１３型）細胞およびネスチン−（１４型
）細胞に分けられ、これらもまたＴｎＴｘ−／ＣｈＴｘ−である。

【０１２１】上記のように同定された細胞は個別の細胞集団を表し、これは選別され得、そ
してさらなる使用のためにおそらく培養され得る。これらの細胞の２つ以上の細
胞集団の最適な混合物の利用もあり得る。標準的なＣＮＳの細胞培養法は確立さ
れている。ＢａｎｋｅｒおよびＧｏｓｌｉｎ、ＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、（１９９１）；Ｂｒｅｗｅｒら、
ＪＮｅｕｒｏｓｃｉＲｅｓ、３５：５６７−５７６（１９９３）；Ｆｒｅｓ
ｈｎｅｙＣｕｌｔｕｒｅｏｆＡｎｉｍａＣｅｌｌｓ、ＷｉｌｅｙＬｉ
ｓｓ、ＮＹ、ＮＹ第３版１９９４、そして、本明細書中で引用される他の
参考文献中にもまた示されている。商業的に入手可能である多くの培地処方物が
存在し（Ｇｉｂｃｏ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、それらをＣＮＳの細
胞の培養に用いた。培地処方物はまた、塩基性もしくは酸性の線維芽細胞成長因
子、グリア細胞株由来の神経栄養性因子、白血病抑制因子、市販のインターロイ
キン（Ｇｉｂｃｏ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ；Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ
，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含
み、好ましくは、

【０１２２】

【化３】インスリン、インスリン様成長因子、毛様神経栄養性因子、脳由来神経栄養性因
子、ニューロトロフィン４、ニューロトロフィン３、骨形成タンパク、神経成長
因子、上皮細胞生育因子、血小板由来成長因子、ソニックヘッジホッグタンパク
およびＣＮＳ中の細胞が生存、増殖するための補助となることが知られている市
販の任意の他のタンパク質を含む、成長因子およびサイトカインを含むように補
充され得る。

【０１２３】（実施例８）（フローサイトメトリーを用いた個別の細胞集団の分別）ＣＮＳの特定の細胞集団に関するインビトロでの研究は、細胞の型を明確に同
定し、迅速に単離する能力に限界があるため困難である．これまでの研究者達は
ニューロン、星状細胞、稀突起神経膠細胞、および他の細胞型の単離のために共
通して選択的培地条件を用いた。しかし、これらの手法は通常、数日から数週間
の培養を要し、この時間の間に細胞の性質が変化し得、もはやインビボにおいて
発現される性質を反映しない。現在存在する特定の細胞集団の濃縮に用いる様々
なポジティブまたはネガティブな選択法は表面エピトープに基づくものである（
すなわちパニングおよび補体溶解）。しかし、多くの抗原性エピトープが、それ
ぞれ異なるタイプの細胞に、それらが発達する間共有されているという事実によ
って、これらの手法は複雑となってしまう。それゆえマーカーの組み合わせが特
定の細胞集団の同定および単離に必要となる。分別用に設定されたフローサイト
メトリーを用いると、複数の表現型または機能的な細胞マーカーの有無だけでな
くこれらのマーカーの相対強度にさえ基づいても、非常に純度の高い特異的な細
胞集団を単離することができる。

【０１２４】細胞の分別は、表面エピトープの発現または欠失に基づく。細胞を、抗Ａ２Ｂ
５および／またはコレラ毒素および／またはＴｎＴｘおよび／またはネスチン抗
体を前述のように二重または三重に免疫標識し、そしてＦＡＣＳ電子ゲートによ
って決定されたそれらの蛍光サインに基づいて１４の集団に分類した。引用され
ている情報に基づき、上に示した１４の細胞型およびその混合物を、荷電された
生理食塩水滴によって分別され得、これは、荷電プレートによって直接適当な試
験管に偏向させられ得る（Ｍａｒｉｃら、Ｎｅｕｒｏｍｅｔｈｏｄｓ、３３：２
８７−３１８（１９９９）を参照のこと）。

【０１２５】（実施例９）（標準培地もしくはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ＋Ｎ２補充物中で培養されたＳＶＧ
細胞のＪＣウイルス感染）ＪＣウイルスはヒト中枢神経系におけるグリア表現型細胞に対して向性を有す
る。ＪＣＶは培地中またはヒト脳においてインサイチュでのいずれかで神経細胞
表現型の細胞中では増殖しない。Ａｔｗｏｏｄら、ＪＮｅｕｒｏｖｉｒｏｌ、
１：４０−９（１９９５）；Ｍａｊｏｒら、ＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌＲ
ｅｖ、５：４９−７３（１９９２）。

【０１２６】５０回継代したＮＧ１細胞を半コンフルエントな単層からトリプシン処理した
後、複数の７５ｃｍフラスコに１フラスコあたり１×１０⁶個になるように、ま
たは３５ｍｍウェル中のガラス製カバーグラス上にプレーティングした。細胞を
、１０％ＦＢＳを含むＥ−ＭＥＭ培地中で一晩接着させた。次いで、フラスコま
たはカバーグラスの半数にはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ＋Ｎ２補充物を再び供給し、
残りの半数には新たに調製した標準培地を再び供給した。なお、全ての培地には
抗生物質として２５μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを加えた。

【０１２７】４８時間後、細胞を、細胞あたり０．１〜１．０感染粒子／細胞の感染多重度
となるよう９０分間ＪＣＶｉｒｕｓｍａｄ−４株調製物で処理し、次いで、
ＥＭＥＭまたはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ＋Ｎ２補充物のいずれかを再び供給した。

【０１２８】培養液を、３７℃で７日間インキュベートし、その後細胞および上清を回収し
、そしてウイルスの増殖を測定するための赤血球凝集アッセイ（ＨＡ）のために
処理した。ＨＡアッセイを、２倍に段階希釈したヒトＯ型赤血球を用い、すでに
公開されているプロトコールに従って行った［Ｎｅｅｌら、ＰｒｏｃＮａｔ
ｌＡｃａｄＳｃｉ９３：２６９０−２６９５（１９９６）。

【０１２９】カバーグラスをＰＢＳで洗浄し、アセトン／メタノール混合溶液を用いて固定
化し、そしてＪＣウイルス抗原の免疫細胞化学分析に用いた。固定化された細胞
を、ＪＣＶキャプシド抗原に対してウサギポリクローナル抗血清を用いて３７℃
、２時間処理し、洗浄し、そしてマウスフルオレセイン結合体化抗ウサギＩｇＧ
で処理した。この細胞を、ＵＶ光検査に適したフィルターおよびキセノンアーク
ランプを装備しているＺｅｉｓｓ製ＩＣＭ４０５倒立顕微鏡を用いて検査した
。

【０１３０】１０％ＦＢＳを含むＥＭＥＭ中で培養を行ったフラスコのみが、７日間感染
後に１ｍｌあたり１：２５６のポジティブＨＡタイターを示し、また、抗ＪＣＶ
キャプシド抗体を用いてキャプシド抗原の発現によって決定されるように、３５
−４０％の細胞が感染していることがまた、示された。ＪＣＶキャプシドポジテ
ィブ細胞のこの割合は同じように処理されたＮＧ１細胞を用いたより初期の実験
データと一致する．ＨｏｕおよびＭａｊｏｒ、ＪＮｅｕｒｏｖｉｒｏｌ、４：
４５１−４５６（１９９８）。Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋Ｎ２補充物中で培養され
た細胞は、ＨＡ力価だけでなく抗ＪＣＶ抗体を用いた免疫蛍光もみられなかった
。従って、ＳＶＧ細胞は、代謝的には、より神経細胞表現型にシフトし（ＴｎＴ
ｘ＋の増加およびＡ２Ｂ５の減少）、これらはもはやＪＣウイルスの増殖を維持
できななった。

【０１３１】（実施例１０）（ＮＧ１およびＮＧ３細胞は異なるレベルの栄養因子を分泌する）ＳＶＧ由来細胞は神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）
、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、トランスフォーミング増殖因子１（Ｔ
ＧＦβ１）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）
および線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２；ａａｂａｓｉｃＦＧＦとしても
また知られる）を含む多くの栄養因子を分泌することができる。表４は、培地が
Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋Ｎ２補充物である場合に、ＥＭＥＭ＋１０％ＦＢＳと比
較して、ＳＶＧ細胞分泌の栄養因子分泌量が変化することを示している。特に、
ＥＭＥＭ＋１０％ＦＢＳと比較して、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋Ｎ２補充物におい
てはＢＤＮＦの分泌が減少する。ＦＢＳを含まないＥＭＥＭにおけるＢＤＮＦの
分泌は、ＥＭＥＭ／ＦＢＳにおける分泌とほぼ同じであった（３４．１）。従っ
て、ＥＭＥＭ＋１０％ＦＢＳにおける高レベルのＢＤＮＦは、血清中のＢＤＮＦ
の存在によるものではない。この栄養因子分泌データは、ＥＭＥＭ＋１０％ＦＢ
Ｓ細胞培養培地と比較して、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋Ｎ２培地に基づくＳＶＧ由
来細胞の表現型のさらなる違いを提供する。

【０１３２】

【表４】ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）はＮＧ１細胞（ＥＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ
）またはＮＧ３細胞（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋Ｎ２）を用いて馴化された培地か
ら得る。細胞を、ウェルあたり０．９ｍｌの培地が入っている６ウェルプレート
（ウェルの直径３５ｍｍ）中で培養した。サイトカイン濃度はｐｇ／１０⁵細胞
×４８時間である．「０」は、このアッセイの検出限界以下の光学密度であるこ
とを表す。Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）のＶＥＧ
ＦおよびＰＤＧＦ用ＥＬＩＳＡキット、ならびにＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏ
ｎ，ＷＩ）のＢＤＮＦおよびＮＧＦ用ＥＬＩＳＡキットを用いて、製造業者によ
る使用説明書に従ってアッセイを行った。これらの製造業者は、ＮＴ−３用、Ｔ
ＧＦ１β用、およびＦＧＦ−２用のＥＬＩＳＡキットも販売している。

【０１３３】（実施例１１）（ＮＧ１細胞およびＮＧ３細胞は形態学的に区別し得る）ＮＧ１細胞（ＥＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）の特性は平らな上皮様（ｅｐｉｔｈｅ
ｌｏｉｄ）形態をとることである（図４Ａ）。しかし、ＮＧ３細胞（Ｎｅｕｒｏ
ｂａｓａｌ＋Ｎ２＝ＮＢ＋Ｎ２）は、神経球（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）様の塊
を形成する（図３Ｂ）。正常ヒト神経前駆細胞（ＮＨＮＰ）（Ｃｌｏｎｅｔｉｃ
ｓ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）は多分化能を有する細胞であり、神経細胞また
はグリア細胞に分化し得る。これらのＮＨＮＰ細胞（図３Ｃ）は、細胞の塊とし
てはＮＧ３細胞と形態学的に同一のように思われる。このようにＮＧ３細胞の形
態学的特徴は、以前に観察されたようにヒト多分化幹／前駆細胞と一致し、これ
が神経球と名付けられた（ＲｅｙｎｏｌｄｓおよびＷｅｉｓｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ
、２５５：１７０７−１７１０（１９９２））。ＮＧ３細胞がこれらの神経球様
の塊形成するためにＥＧＦまたはＦＧＦ−２といった分裂因子を必要しないこと
、およびＮＧ３細胞が増殖性の状態を維持することは驚きであった。これらの神
経球様の塊はＮＢ＋Ｎ２中で３０日より長い培養期間の後に形成された。

【０１３４】

【表５】本明細書中で言及されたすべての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも
各刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個々に参考として本明細書中に援
用されることが示されるのと同程度に、本明細書中に参考として援用される。前
述の発明は、理解の明確さの目的のために図示または実施例としていくぶん詳細
に記載されたが、特定の変化および改変が添付の特許請求の範囲内で実施され得
ることが明らかである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１：胎仔ウシ血清を含む培地または血清を含まない培地において培養された
ＳＶＧＰ５０細胞の免疫同定を示し、ここで、比較は、コントロールとフォル
スコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）処理との間で提供される。この例において、分
析は、生細胞に対してゲートをかけた。生ＮＧ１細胞および生ＮＧ３細胞の三重
標識の特徴付けを示す。標識されたＮＧ１細胞の蛍光発光の結果を、パネルＡ〜
Ｆに示し（パネルＡ〜Ｃはコントロールであり、パネルＤ〜Ｆはフォルスコリン
処理である）、そして標識されたＮＧ３細胞は、パネルＧ〜Ｌに示す（パネルＧ
〜Ｉはコントロールであり、パネルＪ〜Ｌはフォルスコリン処理である）。パネ
ルＡ、Ｄ、ＧおよびＪは、Ａ２Ｂ５−フィコエリトリン（ＰＥ）標識対ＴｎＴｘ
−Ｔｃ標識の結果を示し、そしてパネルＢ、Ｅ、ＨおよびＫは、ＣｈＴｘ−ＦＩ
ＴＣ標識対ＴｎＴｘ−ＴＣ標識の結果を示し、そしてパネルＣ、Ｆ、ＩおよびＬ
は、ＣｈＴｘ−ＦＩＴＣ標識対Ａ２Ｂ２−ＰＥ標識の結果を示す。各パネルは４
つの区分または象限に分けられ、ここで各区分は、ＵＬ（上の左）、ＵＲ（上の
右）、ＬＬ（下の左）およびＬＲ（下の右）と名づけられ、各区分に対する陽性
細胞の数は、パネルの右に示す。上の左（ＵＬ）は、Ｘ軸標識に対して陰性かつ
Ｙ軸標識に対して陰性である細胞を示す。上の右（ＵＲ）は、Ｘ軸標識およびＹ
軸標識の両方に対して陽性である細胞を示す。下の左（ＬＬ）は、Ｘ軸標識およ
びＹ軸標識の両方に対して陰性である細胞を示す。下の右（ＬＲ）は、Ｘ軸標識
に対して陽性かつＹ軸標識に対して陰性である細胞を示す。図１は、Ｎｅｕｒｏ
ｂａｌｓａｌ＋Ｎ２培地（ＮＧ３細胞）と比較した、細胞表面マーカーの発現に
対する血清培養培地（ＮＧ１細胞）の効果を示す。ＮＧ３細胞は、ＮＧ１細胞と
比較して、ＴｎＴｘ＋細胞における増加（Ａ対ＧにおけるＵＬ）およびＡ２Ｂ５
＋細胞における減少（Ａ対ＧにおけるＬＲ）を有する。特に、ＮＧ１細胞または
ＮＧ３細胞においてフォルスコリンに起因した大きな変化はなかった。詳細には
、ＴｎＴｘ＋細胞において増加は存在せず（Ｂ対ＥおよびＨ対ＫにおけるＵＲ）
、このことは、フォルスコリンに起因する神経系統細胞における増加が存在しな
かったことを示す。

【図２】図２：抗ＣｈＴｘ−ＦＩＴＣ、抗ＴｎＴｘ−ＰＥ／Ｃｙ５および抗ネスチンＰ
Ｅを用いた、血清を含まない培地で培養されたＳＶＧＰ５０細胞の免疫同定。
ＮＧ３細胞の３重標識の特徴付けは、ＣｈＴｘ、ＴｎＴｘおよびネスチンに対す
る標識を用いて実施した。パネルＡ〜Ｃは、各マーカー（ＴｎＴｘ、ＣｈＴｘま
たはネスチン）に対する個別の蛍光シグナルの相対強度を示す。従って、優性に
ＣｈＴｘ＋細胞（Ａ）、まれにネスチン＋細胞（Ｂ）、そして通常のＮＧ３細胞
の集団中に観察されるＴｎＴｘ−細胞（Ｃ）が大部分で存在した。パネルＤ〜Ｆ
は、示されるマーカーを用いて標識された生細胞の結果を示し（すなわち、パネ
ルＤは、ＴｎＴｘ−ＴＣ（フラグメントＣ）標識対ネスチン−ＰＥ標識を示し；
パネルＥは、ＴｎＴｘ−ＴｃおよびＣｈＴｘ−ＦＩＴＣ標識を示し；そしてパネ
ルＦは、ネスチン−ＰＥおよびＣｈＴｘ−ＦＩＴＣ標識を示す）、ここで、各象
限における細胞のパーセントは、図１に関して上記されるように、各パネルの左
に提供される。パネルＧ〜Ｋの試験により、ネスチン＋細胞が富化されそしてパ
ネルＧの右の部分に単離されたことが示された。ＣｈＴｘ−／ＴｎＴｘ−である
ＮＧ３細胞は、９７．６％ネスチン＋であると見出された。最も高い強度のネス
チン＋細胞は、ＣｈＴｘ−／ＴｎＴｘ−であるＮＧ３細胞の中に優先的に見出さ
れた。

【図３】図３：例えば実施例１１にさらに記載されるように、（Ａ）１０％ＦＢＳ中の
ＳＶＧＥＭＥＭ、（Ｂ）ＳＶＧＮＢ＋Ｎ２、および（ｃ）ＮＨＮＰＮＢ
＋Ｎ２のスキャンされた写真。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人ザガバメントオブザユナイテッドステイツオブアメリカアズリプレゼンテッドバイザセクレタリーオブザデパートメントオブヘルスアンドヒューマンサービシズアメリカ合衆国・メリーランド州 20852・ロックビル・エグゼクティブブールバード 6011・スィート 325・シー／オーナショナルインスティテュートオフヘルス (72)発明者マジャー，ユージーンオー．アメリカ合衆国バージニア 22101，マクリーン，ハンプトンヒルサークル 1452 (72)発明者バーカー，ジェフェリーエル．アメリカ合衆国メリーランド 20814，ベゼスダ，ブラッドリーブールバード 5811 (72)発明者マリック，ドラガンアメリカ合衆国メリーランド 20878，ゲイザースバーグ，クインスオーチャードブールバード 750 (72)発明者ラビン，ハーベイアメリカ合衆国メリーランド 20852，ロックビル，ラルストンロード 11021 (72)発明者サンドラー，アビイアメリカ合衆国メリーランド 20904，シルバースプリング，モーツァルトドライブ 2901 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB13 CB01 DA36 FB01 FB02 FB03 FB07 FB12 4B063 QA18 QQ08 QR48 QS02 QS33 QS36 4B065 AA93X AB01 AC20 BA06 BB19 BB21 BB25 BB34 CA44 4C087 AA01 AA02 BB45 BB63 CA04 MA67 NA14 ZA02 ZA15

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】不死の多能性細胞を含む単離された中枢神経系細胞株であっ
て、該多能性細胞が、神経細胞またはグリア細胞へ分化する能力を有する、細胞
株。
【請求項２】請求項１に記載の細胞株であって、ここで、前記中枢神経系
由来の細胞株が、ヒト中枢神経系に由来する、細胞株。
【請求項３】請求項１に記載の単離された多能性細胞。
【請求項４】請求項３に記載の細胞であって、該細胞が、以下：ＴｎＴｘ
−／ＣｈＴｘ−、ＴｎＴｘ＋／ＣｈＴｘ＋、ＴｎＴｘ＋／ＣｈＴｘ−、ＴｎＴｘ
＋／ＣｈＴｘ＋、Ａ２Ｂ５−／ＴｎＴｘ−、Ａ２Ｂ５＋／ＴｎＴｘ−、Ａ２Ｂ５
−／ＴｎＴｘ＋、Ａ２Ｂ５−／ＣｈＴｘ−、Ａ２Ｂ５＋／ＣｈＴｘ＋、Ａ２Ｂ５
−／ＣｈＴｘ＋、Ａ２Ｂ５＋／ＣｈＴｘ−、ＴｎＴｘ−／ＣｈＴｘ−／ネスチン
＋、およびＴｎＴｘ−／ＣｈＴｘ−／ネスチン−からなるからなる群より選択さ
れるマーカーの組み合わせによって特徴付けられる、細胞。
【請求項５】請求項１に記載の細胞株から誘導される、単離された細胞ま
たは組織。
【請求項６】生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質をコードする異
種核酸配列をさらに含む、請求項３に記載の細胞。
【請求項７】請求項６に記載の細胞であって、ここで、前記生物学的に活
性なペプチドまたはタンパク質が、疾患関連ペプチドまたはタンパク質である、
細胞。
【請求項８】請求項６に記載の細胞であって、ここで、前記生物学的に活
性なペプチドまたはタンパク質が、酵素、栄養因子、サイトカインまたは疾患関
連抗原である、細胞。
【請求項９】請求項８に記載の細胞であって、ここで、前記酵素が、チロ
シンヒドロキシラーゼ、ＧＴＰＣＨ１、ＡＡＤＣおよびＶＭＡＴ２からなる群よ
り選択され；前記栄養因子が、ＧＤＮＦ、ＶＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ｂＦＧ
Ｆ【化１】、ＣＮＴＦ、ＰＤＧＦ、ＢＭＰ、ＬＩＦ、ノイロチュリン、ペルセフィン、ノイ
ブラスチン、ＮＴ４／５、ＮＴ３、ミッドカインからなる群より選択され；前記
サイトカインがＩＬ−１０およびＩＬ−６からなる群より選択される、細胞。
【請求項１０】請求項８に記載の細胞であって、ここで、前記核酸が、転
写プロモーターに作動可能に連結される、細胞。
【請求項１１】請求項８に記載の細胞であって、ここで、前記核酸が、調
節可能なプロモーター系に作動可能に連結される、細胞。
【請求項１２】請求項３に記載の細胞を含む、単離されたかまたは精製さ
れた細胞集団。
【請求項１３】請求項１２に記載の細胞集団であって、ここで、該細胞集
団が、細胞のＮＧ１、ＮＧ２、およびＮＧ３集団からなる群より選択される、細
胞集団。
【請求項１４】多能性細胞を同定する方法であって、該方法は、細胞サン
プル中の、ＴｎＴｘに対する細胞由来の結合パートナー、ＣｈＴｘに対する細胞
由来の結合パートナー、および必要に応じて、Ａ２Ｂ５抗体に対する細胞由来の
結合パートナーの存在または非存在について測定する工程を包含し、該細胞サン
プルは、多能性細胞を含むと考えられている、方法。
【請求項１５】請求項１４に記載の方法であって、ここで、前記多能性細
胞が、胎児中枢神経系由来の細胞である、方法。
【請求項１６】請求項１３に記載の方法であって、ここで、該方法が、少
なくとも１つの因子が前記細胞に結合する条件下で、前記サンプルを、該少なく
とも１つの因子と混合する工程であって、該因子は、ＴｎＴｘに対する細胞由来
の結合パートナー、ＣｈＴｘに対する細胞由来の結合パートナーおよびＡ２Ｂ５
抗体に対する細胞由来の結合パートナーの少なくとも１つに特異的に結合する、
工程、ならびに該結合を検出する工程であって、ここで、該結合が、前記多能性
細胞の存在を示す工程、を包含する、方法。
【請求項１７】請求項１６に記載の方法であって、ここで、Ａ２Ｂ５結合
パートナーを結合する前記因子が、Ａ２Ｂ５抗体またはそのフラグメントであり
；ＣｈＴｘの結合パートナーを結合する該因子が、ＣｈＴｘ結合パートナー抗体
もしくはそのフラグメントまたはＣｈＴｘもしくはそのフラグメントであり；そ
して、ＴｎＴｘの結合パートナーを結合する該因子が、ＴｎＴｘ結合パートナー
抗体もしくはそのフラグメントまたはＴｎＴｘもしくはそのフラグメントである
、方法。
【請求項１８】請求項１４に記載の方法であって、該方法が、前記サンプ
ルをヒトネスチンに特異的に結合する因子と混合する工程、および該サンプル中
で前記リガンドがネスチンに結合するか否かを検出する工程をさらに包含する、
方法。
【請求項１９】請求項１４に記載の方法であって、ここで、前記リガンド
が、検出可能な標識を含み、そして、必要に応じて、前記混合する工程が、該リ
ガンドに結合するさらなる検出可能な成分の添加をさらに含む、方法。
【請求項２０】請求項１９に記載の方法であって、ここで、前記検出可能
な標識が蛍光である、方法。
【請求項２１】請求項２０に記載の方法であって、ここで、前記検出が、
前記細胞を蛍光活性化されたセルソーターを用いて分析する工程をさらに包含す
る、方法。
【請求項２２】請求項１４に従って同定された細胞を分離する工程を包含
する、多能性細胞を精製する方法。
【請求項２３】細胞の集団を多能性の胎児神経系由来細胞を用いて富化す
る方法であって、該方法が、該集団を血清の存在下で培養し、続いて該集団を血
清を含まない培地中で培養する工程を包含する、方法。
【請求項２４】請求項２３に記載の方法であって、ここで、前記集団が、
クライシスを介して血清を含む培地中に継代される、方法。
【請求項２５】多能性の胎児神経系由来細胞を用いて該多能性細胞を含む
細胞集団を富化する方法であって、該方法が、クライシスを介して血清を含む培
地中に該集団を継代する工程であって、ここで、クライシスから出現する該集団
が、該多能性細胞を用いて富化される工程、を包含する、方法。
【請求項２６】請求項２３に記載の方法によって産生される、細胞集団。
【請求項２７】請求項２４に記載の方法によって産生される、細胞集団。
【請求項２８】請求項２５に記載の方法によって産生される、細胞集団。
【請求項２９】前記集団がＳＶＧ細胞株から誘導される、請求項２３に記
載の方法。
【請求項３０】前記集団がＳＶＧ細胞株から誘導される、請求項２４に記
載の方法。
【請求項３１】前記集団がＳＶＧ細胞株から誘導される、請求項２５に記
載の方法。
【請求項３２】神経性症候群または神経性疾患を有する哺乳動物を処置す
る方法であって、該方法が、請求項４に記載の少なくとも１つの細胞を含む治療
的有効量の組成物を該哺乳動物に移植する工程を包含する、方法。
【請求項３３】請求項３に記載の細胞を含む、単離された細胞の塊。
【請求項３４】神経球の形態である、請求項３３に記載の塊。