JP2003523210A - タンパク質合成およびタンパク質の発現を増強するためのヌクレオチド配列の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、特に植物、例えば穀物においてタンパク質合成およびタンパク質の発現を増強し得るＣocksfoot mottle virus (ＣｆＭＶ)のリーダー配列(配列番号１) から獲得し得るｃＤＮＡ配列(配列番号２)に実質的に類似したヌクレオチド配列の使用に関する。また、開示されたものは、ヘアピンループ構造を産生し、実質的に類似したヌクレオチド配列を調製する能力をもつ５'ＵＴＲを選択することによって、潜在的エンハンサーエレメントを産生するための方法である。さらに、植物における該発現を増強する方法のみならず、増強された発現に関与するヌクレオチド配列に特徴的な性質である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、Ｃocksfoot mottle virus (ＣｆＭＶ)のリーダー配列(配列番号１)
から得られる配列(配列番号２)に実質的に類似した単離および精製されたヌクレ
オチド配列の使用に関する。この配列はタンパク質合成またはタンパク質の発現
を増強することができるものである。

【０００２】 （背景技術） 植物ウイルスの多くのキャップおよびアンキャップＲＮＡの５'非翻訳領域(５
'ＵＴＲ)は、イン・ビトロおよびイン・ビボにおいてキメラ遺伝子の発現を増強
することが知られている。ほとんどのイン・ビボでの研究は、双子葉特異的ウイ
ルス由来の５'ＵＴＲを用いて双子葉(dicot)植物の細胞で行われてきたが、単子
葉(monocot)細胞で得られたいくつかの結果は、双子葉植物および単子葉植物間
での５'ＵＴＲの適合性に関して異なることを示している。タバコモザイクウイ
スルＲＮＡ(ＴＭＶ)の非翻訳リーダーは、双子葉植物、例えばタバコまたはニン
ジンの系などにおける作用よりもかなり低い程度ではあるが、単子葉植物、例え
ばトウモロコシおよび米のプロトプラストなどにおける翻訳のエンハンサーとし
て作用する。両方の系において、発現を刺激し得る唯一の５'ＵＴＲは、カリフ
ラワーモザイクウイルス(ＣａＭＶ)３５ＳＲＮＡリーダーだけである。植物細胞
中のキメラＲＮＡの翻訳を増強し得るその能力を試験された単子葉特異的ウイル
スの５'ＵＴＲだけがスズメノチャヒキモザイクウイルスＲＮＡ３リーダーであ
り、これはタバコモザイクウイスルのリーダー配列よりも遺伝子発現の強い増強
を付与しなかった(Gallie and Young, 1994)。

【０００３】 本発明の目的は、好ましくは、裸子植物および被子植物の両方、加えて針葉樹
、単子葉植物および双子葉植物、好ましくは工業的に有用な穀物植物、特に穀物
類などの単子葉植物を包含する植物中で、遺伝子およびタンパク質の発現を増強
し得るヌクレオチド配列を提供することである。

【０００４】 同時に、本発明の目的は、遺伝子発現を増強するための方法を提供することで
あり、最終目的はタンパク質生成を改良することである。

【０００５】 本発明の目的は、Ｃocksfoot mottle virusの５'末端リーダー配列(配列番号
１)に実質的に類似したヌクレオチド配列および／またはリーダー配列の５'-末
端で対をなす内部塩基によって安定なヘアピン構造を形成し得る別の実質的に類
似した配列を提供することによって達成される。

【０００６】 (本発明の要約) 本発明の特徴は請求の範囲に定義する。

【０００７】 (図面の簡単な説明) 図１は、本発明の比較実験において使用される５'ＵＴＲの配列を示す。

【０００８】 図２は、本発明で使用されるマーカー遺伝子構築体を示す。

【０００９】 図３は、タバコにおいてタンパク質合成の増強した発現を示す構築体を示す。

【００１０】 図４は、本来のＣｆＭＶεＲＮＡ配列(配列番号１)の３４個の最初の５'末端
ヌクレオチド配列のコンピュータ予測された二次構造を示す。

【００１１】 図５は、本来のキメラ５'ＵＴＲのコンピュータ予測された二次ＲＮＡ構造を
示す。

【００１２】 （本発明の詳細な説明） 定義 本発明で使用される用語は、組換えＤＮＡ技術、さらに農業、 園芸および林
業を含む、伝統的な植物学、植物育種、植物ウイルス学、植物生化学および形質
転換植物の産生の分野で、一般的に用いられている意味を持つ。しかし、幾つか
の用語は、本明細書中では、幾分はずれた意味、または通常の状況よりも広い意
味で用いる。従って、不明瞭な意味の用語に起因する不確かさを避けるために、
本明細書および特許請求の範囲において用いた幾つかの用語は、以下により詳し
く定義する。「植物」なる用語は、植物細胞、植物組織、植物器官さらに全植物
を包含する。該用語は、針葉樹、単子葉植物および／または双子葉植物に加えて
海藻を包含する、裸子植物および被子植物の両方を包含する。

【００１３】 「穀物植物」は、産業的に重要な植物、即ち農業および林業において適用し得
る植物を意味し、それらは特に穀物、例えば、コーン(トウモロコシ)、米、小麦
、カラスムギおよび大麦などを包含する。

【００１４】 本発明における植物ウイルスは、植物のpiconrnavirus様ウイルス、特にsobem
ovirues、さらに特に「Ｃocksfoot mottle virus (ＣｆＭＶ)」であり、これはs
obemovirus群のメンバーである。

【００１５】 「ヌクレオチド配列」なる用語は、二本鎖および一本鎖ＤＮＡおよび／または
ＲＮＡを包含するが、それに限定しない。

【００１６】 「フラグメント」なる用語は、発現の増強に常に寄与するヌクレオチド配列の
最小エレメントを意味する。該「フラグメント」は、単独で有効であり得るが、
しばしば付加的である。従って、同じもしくは異なる配列を持つフラグメントの
「ダイマー」および／または「マルチマー」を形成する１以上の「フラグメント
」をどのよう順番もしくは方向であっても組み併せることが有用である。

【００１７】 「発現を増強する」なる用語は、転写、mＲＮＡ安定化、ＲＮＡ輸送、翻訳お
よびタンパク質安定化を包含する発現を改良もしくは増強することを意味し、最
終目的は、所望のタンパク質の量を改良することである。本発明の好ましい態様
が、植物中でタンパク質合成の増強を提供することであっても、本発明のヌクレ
オチド配列の使用は植物に限定しない。本発明の該ヌクレオチド配列は、各々の
宿主生物体と和合し、形質転換し得る、任意の真核生物または原核生物の形質転
換体および／または発現ベクターまたはＤＮＡ構築体に挿入し得る。

【００１８】 「エンハンサー」または「エンハンサーエレメント」は、上記で定義されたよ
うに、発現を増加もしくは改良する能力を有するヌクレオチド配列の成分または
ヌクレオチド配列のフラグメントを意味する。

【００１９】 「リーダー配列」なる用語は、アミノ酸配列に必ずしも翻訳されないメッセン
ジャーＲＮＡの開始にある配列を意味する。

【００２０】 「形質転換した（される）」なる用語は、遺伝的情報を「付加」または「変化
」することによって、変更することを意味する。

【００２１】 「発現を増強する高い能力を有するヌクレオチド配列を選択および調製する方
法」なる語は、ＲＮＡ植物ウイルス中にある５'末端のリーダー配列の選択を意
味し、その５'末端のリーダー配列は、コンピュタープログラム推定の二次構造
によって決定されるような「安定なステムループ構造を形成し得る」ものである
。「ヘアピン構造またはステムループ」は、一本鎖ヌクレオチオド配列を意味し
、例えば、同じ鎖内で、安定な内部塩基対をなすか水素結合を形成することによ
ってヘアピンループ構造を形成し得る一本鎖ヌクレオチオド配列を意味する。本
発明において、特に、Ｃocksfoot mottle virus のリーダー配列の５'末端で形
成される構造と実質的に類似した構造を意味する。

【００２２】 「実質的に類似」なる用語は、少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好
ましくは８０％、最も好ましくは９０％の相同性を有する配列を意味する。

【００２３】 （本発明の概要） 本発明は、タンパク質合成および／またはタンパク質の発現を増強するための
方法に関する。エンハンサーを、植物におけるタンパク質合成を増強するため、
特に、収穫植物、例えば単子葉植物を代表する穀類などにおけるタンパク質合成
を増強するために開発する。上記のように、エンハンサー配列の使用は植物に限
定しない。該方法は、発現を増強する能力、即ちエンハンサーエレメントを有す
るヌクレオチド配列の使用を基にする。そのようなエレメントは、例えば、植物
ウイルス中のキャップまたはアンキャップＲＮＡの５'ＵＴＲから見出される確
率が高い。該５'ＵＴＲは、それらの５'末端に安定な内部塩基対をなすことによ
ってヘアピンループ構造を形成し得るヌクレオチド配列の存在について、５'Ｕ
ＴＲをチェックすることによって選択する。

【００２４】 そのようなＵＴＲは、その５'末端にヘアピンループを形成し得る選択された
５'ＵＴＲと実質的に類似するヌクレオチド配列を調製するためのモデルとして
使用し得る。該ヌクレオチド配列は、該ベクター中に該ヌクレオチド配列を機能
的に挿入することによって、全ての形質転換および／または発現ベクター、プラ
スミドまたはＤＮＡ構築体、加えて本発明で開示された植物ベクターで使用し得
る。穀物植物、特に穀物は、該ヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列を含
む該植物ベクターを用いて、既知の方法で形質転換させ得る。

【００２５】 本発明は、Ｃocksfoot mottle virus のリーダー配列(配列番号１)を基に実施
された結果を基にしているが、この結果は技術分野に対してより広範に適用し得
る。

【００２６】 上記記載のとおりＣocksfoot mottle virusは、sobemovirues、即ち、植物Ｒ
ＮＡウイルスのメンバーである。Ｃocksfoot mottle sobemoviruesのゲノムＲＮ
Ａは、Maekinen(1995)らによって単離および特性分析された。ＣｆＭＶのゲノム
は４０８２塩基対の長さのプラス鎖ＲＮＡ分子である。

【００２７】 最初の実験として、一組の植物発現ベクターを、ＣｆＭＶリーダー配列 (Ｃｆ
ＭＶε)(配列番号１)に対するｃＤＮＡ(配列番号２)を利用して構築した。ヌク
レオチド配列、即ちｃＤＮＡ配列は、下記の３つの双子葉特異的ウイルス由来の
天然キャップドＲＮＡの５'ＵＴＲから得ることができ、発現増幅の比較研究に
おいて使用した。これらは、アルファルファモザイクウイルス(ＡＭＶ)ＲＮＡ４
(ＡＭＶ５')のリーダー配列(配列番号４)（JoblingおよびGerke, 1987）、タバ
コモザイクウイルスのリーダー配列(配列番号９) (ＴＭＶΩ、Gallie & Young,
1994)およびポテトウイルスＸＲＮＡ-リーダー(ＰＶＸαβ(配列番号７、Huisma
n et al., 1988)のリーダーα配列 (配列番号５)およびβ配列 (配列番号６)を
包含する。

【００２８】 本発明の実験で使用される全ての構築体の翻訳開始コドンは、ＡＭＶにおける
Ｎｃｏ１認識配列-３ＣＡＣＣＡＵＧＧ (配列番号１０)、ＣｆＭＶにおけるＰＶ
Ｘαβ、ＴＭＶΩおよびＴＴＣＣＡＵＧＧ(配列番号１１)の範囲に位置する。Lu
etckeら(1987)によって提案された植物における翻訳開始のための該コンセンサ
ス配列は、−３ＡＡＣＡＡＵＧＧＣ(配列番号１２)であった。リーダー配列のＡ
ＴＧは、該コンセンサス配列とは異なった：全ては、−１および−４位置で(Ａ
ＴＧのＡは＋１である)あり、またＣｆＭＶεリーダー配列 (配列番号２)は-３
の位置である(図２)。

【００２９】 図１は、この研究で使用された５'ＵＴＲ配列を示す。Hagenbuehleら(1978)
の１８ｓリボゾームＲＮＡ(rＲＮＡ)のコンセンサス配列と相補的なヌクレオチ
を、ＣfＭＶε（配列番号１）の配列上にアスタリスクで印をつけた。図２では
、異なる５'ＵＴＲ(ブラックボックス)をコードするｃＤＮＡは、転写開始部位(
矢印)の下流に挿入した。各ウイルス５'ＵＴＲに対するｃＤＮＡの本来の配列を
大文字で示し、ベクター構築体で使用されたＸｈｏ１およびＮｃｏ１部位を含む
ベクター誘導配列を下枠に示した。５'ＵＴＲ内の二次構造の計算された安定性(
kＪ／molのＧ)を右に示した。植物において、翻訳効率に対する−３位の効果は
、動物の翻訳効率ほど有意でないようである(Koziel et al. 1996)。要約すると
、リーダー配列間の開始コドンのコンテキストの差異は、翻訳効率において見か
け上の明らかな違いを生じず、少なくともＣｆＭＶεリーダー配列 (配列番号１
)および(配列番号２)の引立てではないようであり、そして遺伝子発現に対する
効果はリーダー配列それ自身の特性によって説明されるべきであると、結論し得
る。

【００３０】 該エレメントの近位配列の修飾およびウイルス性リーダー配列のベクター誘導
されたヌクレオチド５'および３'の付加(図２)は、それらの機能に影響を示し得
る。しかし、mＲＮＡおよび酵素活性の定常状態を、類似のＡＭＶ５'およびＴＭ
ＶΩ誘導体と融合されたリポーター遺伝子を発現する形質転換植物から定量した
研究(Datla et al., 1993 および Dowson Day et al., 1993)では、ＣａＭＶ３
５Ｓプロモーターのキャップ部位のヘテロな５'ＵＴＲ下流の挿入は転写レベル
に影響するが、それら遺伝子の該発現に対する遺伝子操作されたリーダー配列の
主な影響は翻訳レベルで現れたということを示している。Zeleninaら(1992)によ
ると、イン・ビトロで、下流のベクター誘導された配列およびリポーター遺伝子
の前の異なるスペーサー配列にもかかわらずＰＶＸαβもまたその翻訳を増強す
る特性を保持している。

【００３１】 ウイルス５'ＵＴＲをコードするｃＤＮＡを植物発現ベクター中の推定ＣａＭ
Ｖ３５Ｓキャップ部位(Guilley et al. 1982)のポリリンカー領域の下流に挿入
し、リポーター遺伝子の発現に対する異なるリーダー配列の効果を酵素活性レベ
ルで分析した。これは、調節エレメントを試験するための融通のきく方法である
が、遺伝子操作された遺伝子の発現を制御する転写および翻訳事象を区別しない
。ＡＭＶ５'、ＴＭＶΩおよびＰＶＸαβは、全て翻訳のエンハンサーとして機
能することが示されているので(Gallie, 1996およびその引用文献)、Ｃocksfoot
mottle virusのリーダー配列の発現能力が増強されるかどうかを決めるための
比較試験において特に有用である。

【００３２】 本発明において、リーダー配列(Gehrke et al., 1983; Sleat et al., 1988)
のコンピューターを基にした推定折りたたみを使用すると、この研究で使用され
た別のリーダー配列の推定折りたたみとは対照的に、ＣｆＭＶεリ−ダーは５'
末端で安定な構造を形成するポテンシャルを持っていることがわかった。例えば
、図４は、ＣｆＭＶの５'末端ヌクレオチドの最初の３４個の推定ＲＮＡの二次
構造を示し、図５は、ＣｆＭＶの本来の５'ＵＴＲの推定ＲＮＡ二次構造を示す
。注目すべきは、ベクター誘導された配列５'-ＡＣＣＵＣＧＡＧ-３' (配列番号
１３)と対をなす分子内塩基が、本来のＣｆＭＶε(配列番号１)と比較すると、
リーダー配列の５'末端でヘアピン構を形成するポテンシャルを高めることであ
る。

【００３３】 このステムループ構造は、ルシフェラーゼ(ＬＵＣ)およびβ-ガラクトシダー
ゼ (ＧＵＳ)のmＲＮＡの５'末端に位置する場合、ＣｆＭＶεリーダーに対する
ＲＮＡ二次構造の予測で維持される(データは示していない)。この推定構造は、
ε-リーダーを有するＣｆＭＶＲＮＡおよび別のＲＮＡのキャップ独立性翻訳に
於いて重要であろう。１つの可能性は、この５'構造は翻訳中維持されるが、リ
ボゾームの下流のこの構造に関して内部に入るための適当な環境を提供すること
である。

【００３４】 ５'ＵＴＲによって付与される翻訳増強のいくつかは、配列依存性であると考
えられる。ＴＭＶΩおよびＰＶＸαβリーダー配列のその配列は、１８ＳrＲＮ
Ａの３'末端配列と相補的配列モチーフを含む。１８ＳrＲＮＡの３'末端と有意
な相補性はＣｆＭＶεリーダー配列(図１)においても見出した。これは、ヘアピ
ンループ形成能は新規有効なエンハンサーを開発するための有用な道具となり得
るという事実のさらなる証拠でもある。相同的な構造が別のsobemovirues(Ryabo
v et al., 1996)のＲＮＡの５'末端でも見出されたという事実は、エンハンサー
として有用な別のヌクレオチド配列が、別のsobemovirusesの中から見いだされ
る可能性を示唆する。

【００３５】 Ｃocksfoot mottle virus ＲＮＡ(ＣｆＭＶε) の５'ＵＴＲは、２つの異なる
リポーター遺伝子の非翻訳リーダー中に挿入される場合、これらの遺伝子の発現
を、タバコプロトプラストおよび培養した大麦細胞懸濁液において、２から３倍
増強した。以前に十分に特性分析された双子葉植物ウイルスのＲＮＡからの３つ
の５'ＵＴＲ; ＡＭＶ５'、ＴＭＶΩおよびＰＶＸαβを参照に用いた(図２)。こ
れらのエレメントは、タバコプロトプラストにおいて、３から５倍の増強を示し
た。これは、類似の構築体(Datla et al., 1993, Dowson Day et al., 1993, Ze
lenina et al., 1992)を用いて行われた別の一時的発現実験と一致する(図３)。
しかし、ＣｆＭＶεとは対照的に、これらの５'ＵＴＲの全ては、大麦細胞にお
いて遺伝子発現を増強しなかった。一般的に、ウイルスリーダー配列は、ｕｉｄ
Ａｂに対してよりもｌｕｃの発現に対してより刺激的な効果を持つように見える
。

【００３６】 さらに、ＣｆＭＶεが、タバコプロトプラスト、特に大麦細胞において２つの
リポーター遺伝子の一時的発現を増強することを示す。双子葉植物特異的ウイル
スの５'ＵＴＲは、全て大麦細胞において遺伝子発現を増強することができない
というこの事実は、双子葉植物および単子葉植物におけるリーダー配列の機能に
対する差異に関するさらなる証拠を提供するものである。

【００３７】 本発明において、ＣｆＭＶεが、植物細胞において遺伝子発現を増強する植物
ウイルスの５'ＵＴＲに属することを示す。ＣｆＭＶεの一次および二次構造を
コンピューターで分析すると、翻訳のキャップ非依存性の開始における推定的役
割を持つ配列および構造モチーフを示す。３つの双子葉植物ウイルスから誘導さ
れた５'ＵＴＲと対照的に、該ＣｆＭＶεリーダー配列は、大麦においてもまた
遺伝子発現を増強する。そのため、ＣｆＭＶεのヌクレオチド配列と実質的に類
似するヌクレオチド配列および／または類似のヘアピン構造を形成するものは、
植物のための発現ベクターを構築する場合、選択に関する５'ＵＴＲのためのモ
デルとして使用し得る。そのようなエレメントは、大麦においてだけでなく、穀
物を含む別の形質転換作物植物でも外来遺伝子の効率的な発現を保証する。

【００３８】 本発明において、単子葉植物および双子葉植物の根本的な差異が、翻訳機構が
mＲＮＡの特異的な５'ＵＴＲを利用し得る程度に、存在し得ることを示す。植物
ウイルスの進化は５'ＵＴＲの特異的特徴を導き、それが特別なウイルスの宿主
範囲内の植物における翻訳組織の効率的捕獲を可能にする。ＣｆＭＶεの場合、
リーダー配列のその推定単子葉植物特異的特徴の同定は、５'ＵＴＲの機能をよ
り詳細に理解するためにもまた穀物の遺伝子操作にとっても重要であり得る。

【００３９】 本発明は、方法論および結果が詳細に記載されている下記の章でさらに説明す
る。これらの方法、さらに得られた結果は、保護すべき範囲を制限するものと解
されるべきではない。上記説明を基に、当業者は、農業および林業に対する別の
十分に機能する好ましい有利な適用を開発することを容易になし得る。

【００４０】 材料および方法 プラスミド ホタルルシフェラーゼ(luc)および細菌β−ガラクトシダーゼ(uidＡ)をコード
する遺伝子を、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターおよび植物発現ベクター(プラスミ
ド) pＲＴ１０１(Toepfer et al., 1993)中にあるターミネーターの間のポリリ
ンカー領域中に導入した。得られる植物発現ベクターは、リポーター遺伝子(図
１)を翻訳(ＡＴＧはＮco１認識部位中に含まれる)のための開始コドンの前にあ
る２５塩基対を含む翻訳されないポリリンカー誘導リーダー配列をコードする。
これら３５Ｓ-lucおよび３５Ｓ-uidＡベクターは、一時的発現研究において参照
として使用した。ウイルス５'ＵＴＲのためのcＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応
(ＰＣＲ)、増幅(ＣfＭＶε)、オリゴヌクレオチドのアニーリング(ＡＭＶ５'お
よびＴＭＶΩ)またはプラスミド(ｐＴＺ-５ＸからのＰＶＸαβ、J. Atabekovの
ご好意による寄贈、(Zelenina, et al, 1999)）からのサブクローニングによっ
て得た。それらを、３５Ｓ-lucおよび３５Ｓ-uidＡ ベクター(図２)の非翻訳リ
ーダーのＸｈｏ１およびＮｃｏ１部位の間をサブクローニングし、ほとんどのポ
リリンカーを置換する。プロモーターおよびリポーター遺伝子の間の相対比は、
ＡＬＦ ＤＮＡシークエンサー(Pharmacia LKB)を用いて、配列決定した。

【００４１】 大規模なプラスミド単離は、ＢirnboimおよびＤoly (1979)のアルカリ分解方
法に従って行った。プラスミド調製物をＱiagen^Rカラムを用いてさらに精製し、
ＴＥ緩衝液(１０ｍＭ Ｔrisおよび１mＭ ＥＤＴＡ、pＨ８)に溶出した。精製試
料中のＤＮＡ濃度を分光光度計器で測定し、ＴＥ緩衝液で１mg/mlに希釈した。
一時的発現実験の際の変動を制御するために、一つのマーカーを有する各々のプ
ラスミドを、１:１の濃度比で、第二のマーカーを発現するプラスミドと混合し
た。内部標準物は、タバコのプロトプラストの電気穿孔についてｐＡＮＵ５およ
びｐＡＮＵ６(参照リーダーを有する３５Ｓ-uidＡおよび３５Ｓ-luc構築体、図
１)であり、大麦細胞の衝撃についてｐＡＨＣ１８(ユビキチンluc融合物、Chris
tensen および Quail, 1996)およびpＨＴＴ５１５(ユビキチンuidＡ融合物、pＡ
ＨＣ２５からの融合物、Christensen および Quail, 1996)である。

【００４２】 組織培養した大麦細胞についての粒子衝撃(パーティクルボンバルドメント) プラスミドＤＮＡをタングステン粒子上に沈殿させ、BiolisticR PDS-1000/He
装置を用いて大麦の懸濁培養細胞に移行させた(Hordeum vulgare L. cv. Pokko)
。非胚Ｐ１細胞(VTT-G-93001)の粒子衝撃および培養を、基本的に Ritala et al
. (1993)に記載のように行った。各構築体に対して５回の繰返しを有する少なく
とも２つの独立した実験を行った。

【００４３】 タバコプロトプラストの単離および電気穿孔 プロトプラストを、温室で成育させたタバコ(Nicotiana tabacum)の表面の滅
菌した葉から単離した。プロトプラストの単離、電気穿孔および培養を基本的に
SuntioおよびTeeri (1994)に記載のように行った。ただし、電気穿孔を分光光度
計用キュベット（１ml）中で、電極として離れた一組のプラチナプレート９mmを
用いること、そして５５０Ｖ(BioRad Gene PulserR)を流す２５ uＦコンデンサ
ーからのパルスを与えることにした。２倍のＤＮＡ試料(2.5Hx106 プロトプラス
トあたり10Fμg)を有する２つの独立した電気穿孔実験を、各々一組の構築体を
比較するために行った。

【００４４】 一時的発現の分析 ＬＵＣおよびＧＵＳ酵素活性を、遺伝子導入の３４-３８時間後の試料から測
定した。可溶性タンパク質を、プロトプラストペレットから抽出し、冷細胞分解
緩衝液Ｎo.２(Bio-Orbit, Turku, Finland)中で、プラスチック乳棒で単時間粉
砕することによって、氷上で１.５ mlのマイクロセントリフューゲーションチュ
ーブ中に大麦細胞を集めた。細胞の破砕残骸物を、２回の遠心分離(20000g、5分
)により、分解物から除去した。透明な上清中のタンパク質濃度を、Bio-Radタン
パク質アッセイキット(Catalog 500-0006)を用いて測定した。ＧＵＳ活性を、Je
fferson (1987)による蛍光分析アッセイにより測定した。ＬＵＣアッセイについ
ては、分解物のアリコート(１０μl)を、１００μl反応用緩衝液(Luciferase As
say System, Promega)に添加し、反応中の相対的蛍光（luminiscense）を照度計
（luminometer）(Bio-Orbit, model 1253)を用いて測定した。ＧＵＳおよびＬＵ
Ｃに対する比活性を、mgタンパク質あたりで測定した。酵素活性に対する標準化
値（Normalized values）を、特定試料中の内部標準の値でＧＵＳまたはＬＵＣ
活性を割ることによって決定した。各一組のプラスミドを含む実験からのデータ
を、参照リーダー(１００％)を有する３５Ｓ-lucおよび３５Ｓ-uidＡ構築体に対
する平均活性の割合として計算し、有意差をt-検定および分散分析(anova)によ
って試験した。

【００４５】 リーダー配列のコンピューター分析 使用した全リーダー配列の二次構造は、ＲＮＡ-ＤＲＡＷプログラム(http://b
roccoli-mfn.ki.se/rnadraw/rnadraw.html)を用いて予測した。二次構造の安定
性に関する細胞エネルギー計算は、イン・ビボでの発現実験を行った場合と同じ
温度で行った。

【００４６】 結果 ウイルスＴＭＶΩのＲＮＡの５'ＵＴＲおよびＣocksfoot mottle virus RNA
リーダー(ＣｆＭＶε)をコードするcＤＮＡを、植物発現ベクター中の非翻訳リ
ーダー配列のlucリポーター遺伝子に挿入した(図２)。該発現増強を測定するた
めにＬＵＣ発現レベルを翻訳実験によって測定した。

【００４７】 表１に示したようなイン・ビトロ翻訳実験では、ＬＵＣをＣｆＭＶε−リーダ
ーと融合した場合にルシフェラーゼ(ＬＵＣ)mＲＮＡ 翻訳の増強が有意でないこ
とを示した(図３)。その同じ構築体を用いて、タバコプロトプラストにおけるタ
ンパク質合成の相対的な増強を測定するために転写物を産生した（表１）。３つ
の双子葉植物特異的ウイルス(ＡＭＶ５'、ＴＭＶΩおよびＰＶＸαβ)のＲＮＡ
の５'ＵＴＲおよびＣocksfoot mottle virus ＲＮＡリーダー(ＣｆＭＶε)をコ
ードするcＤＮＡを、植物発現ベクター中の、uidＡの非翻訳リーダー配列および
lucリポーター遺伝子に挿入した(図２)。ＧＵＳおよびＬＵＣ発現レベルに対す
る異なる５'ＵＴＲの効果を測定するために、該構築体を、電気穿孔によってタ
バコプロトプラストに、また粒子衝撃によって懸濁培養した大麦細胞に遺伝子導
入した。

【００４８】 ウイルスリーダー配列を有する構築体からの一時的発現を、２５塩基対リーダ
ーを有する対照のuidＡおよびluc構築体と比較し(図２)、そして、ウイルス複製
５'ＵＴＲによって付与された増強を評価した。タバコプロトプラストにおいて
、全ての５'ＵＴＲはリポーター遺伝子の発現を増強した。ＡＭＶ５'およびＣｆ
ＭＶεは２から３倍、ＴＭＶΩおよびＰＶＸαβは４から５倍(表２)であった。
しかし、大麦細胞においては、唯一ＣｆＭＶεだけが、uidＡおよびluc発現に対
する刺激的な効果を持つことがわかった。この単子葉植物特異的ウイルスで誘導
された５'ＵＴＲによって与えられた遺伝子発現の相対的なレベルは、ＰＶＸα
βに対するレベルよりも３倍高く、唯一双子葉植物ウイルスで誘導された５'Ｕ
ＴＲが、参照リーダーとしてリポーター遺伝子に匹敵する発現レベルであった(
表２)。

【００４９】 リーダー配列の一次および二次構造分析 イン・ビボ実験に用いた該リーダーの二次構造の推定（図１）は、それらのホ
ールディングのポテンシャルにける顕著な差異をもたらした。該参照リーダー、
ＡＭＶＲＮＡ４-リーダーおよびＴＭＶΩは、安定な分子内塩基対形成に関して
低いポテンシャルを示した。ＰＶＸαβ-リーダーの構造に対する有意に高い△
Ｇ値は、β配列内の塩基対によって形成される推定ヘアピン構造によるものであ
る。なお、５'隣接のα配列は非構造的である(Smirnyagina et al. 1991)。別の
リーダーとは対照的に、ＣｆＭＶεは、５'末端で安定な構造を形成する高いポ
テンシャルを持つ(図２Ａ)。このステムループ構造は、リーダーの３４個の最初
のヌクレオチドによって形成され、この自由エネルギーは−５０.３ kJ/molであ
り、一方、完全リーダーの自由エネルギーは、２３℃で−７１.２ kJ/molである
(図４および５)。この研究で使用されるキメラ構築体において、ベクター誘導
された配列とＣｆＭＶ配列の間の塩基対は、３つの塩基対分だけ５'ステム構造
の長さを増加させ、完全リーダーの自由エネルギーを-９９.１ kJ/molに上げる
。５'-末端構造は一部分ＣｆＭＶε中のヌクレオチド２５−３９の領域と部分的
にオーバーラップし、それは数種の有機体から誘導された１８ＳリボゾームＲＮ
Ａ３'末端のコンセンサス配列(Hagenbuehle et al., 1978, Wu et al., 1987)と
相補的である。この領域の１３個のヌクレオチド内の１０個は、このコンセンサ
ス配列のほとんどの３'近位ヌクレオチドと塩基対を形成し得る(４Ｇ-Ｃ、５Ａ-
Ｕおよび１Ｇ-Ｕ対、図１)。１８ＳrＲＮＡと類似の相補性は、他のsobemovirus
、即ちSouthern bean mosaic mosaic(ＳＢＭＶ)ＲＮＡの５'ＵＴＲにもまた存在
する。ＳＢＭＶにおいて、その相補性は１５個のヌクレオチドの内の１０個であ
る(Wu et al., 1987)。この研究において、該発現の研究はタバコおよび大麦の
系で行った。タバコ１８ＳrＲＮＡ(accession number X59789)およびＣｆＭＶε
の相補性は１５個のヌクレオチドの内１１個であり、一方、大麦においては(Aza
d and Deacon, 1980)１２個のヌクレオチドの内７個である。

【００５０】 表１ タバコプロトプラストにおいてウイルス性ＵＴＲによって付与されたタンパク
質合成の相対的増強。ＬＵＣ値は２５塩基対の参照リーダーを有する構築体に対
する相対的な平均値として示した。

【表１】

【００５１】 cＤＮＡ構築体を有するタバコプロトプラストおよび大麦細胞におけるウイル
ス５'ＵＴＲによって付与されるタンパク質発現の相対的増強。ＬＵＣおよびＧ
ＵＳ値は、２５塩基の参照リーダーを有する構築体に対する相対的な平均値とし
て示した。

【００５２】 表２：

【表２】

【００５３】 参考文献 Azad, A.A. & Deacon, N.J. (1980) Nucleic Acids Res. 8, 4365-4376. Birnboim, H.C. & Doly, J. (1979) Nucl Acids Res 7: 1513-1523. Christensen, A.H. & Quail, P.H. (1996) Transgenic Res 5: 213-218. Datla, R.S.S., et al. (1993) Plant Sci 94: 139-149. Dowson Day, M., et al. (1993) Plant Mol Biol 23: 97-109.Hagenbuechle, O.w, D.W. et al. (1978) Cell 13, 551-563. Gallie, D.R., et al. (1987) Nucl Acids Res 15: 8693-8711. Gallie, D.R., et al. (1989) Plant Cell 1: 301-311. Gallie, D.R. & Walbot, V. (1992) Nucl Acids Res 20: 4631-4638. Gallie, D.R. & Young, T.E. (1994)Plant Physiol 106: 929-939. Gallie, D.R. (1996)Plant Mol Biol 32: 145-158. Gehrke, L., et al. (1983) Biochemistry 22: 5157-5164. Ghosh, A., et al. (1979) Nucl Acids Research 7: 2137-2146. Guilley, H., et al. (1982) Cell 30: 763-773. Huisman, M.J., et al. (1988) J Gen Virol 69: 1789-1798. Jefferson, R.A. (1987) Plant Mol Biol Rep 5: 387-405. Jobling, S.A. & Gehrke, L. (1987) Nature 325: 622-625. Kozak, M. (1989) J Cell Biol 108: 229-241. Koziel, M.G., et al. (1996)Plant Mol Biol 32: 393-405. Leathers, V., et al. (1993) Mol Cell Biol 13: 5331-5347. Luetcke, H.A., et al. (1987) EMBO J 6: 43-48. Mandeles, S. (1968) J Biol Chem 243: 3671-3674. McElroy, D. & Brettel, R.I.S. (1994) Tibtech 12: 62-68. Makinen, K., et al. (1995) J Gen Virol 76: 2817-2825. Ow, D.W., et al. (1986) Science 234: 856-859. Pooggin, M.M. & Skrjabin, K.G. (1992) Mol Gen Genet 234: 329-331. Ritala, A., et al. (1993)Plant Cell Rep 12: 435-440. Ryabov, E.V., et al. (1996) Mol Plant Path 86: 391-397. Shine, J. & Dalgarno, L. (1974) Proc Nat Acad Sci 71: 1342-1346. Sleat, D.E., et al. (1988) Eur J Biochem 175: 75-86. Smirnyagina, E.V., et al. (1991) Biochimie 73: 587-598. Sleat, D.E., et al. (1992) In: Genetic Engineering with Plant viruses (Wilson, T.M.A. and Davies, J.W., eds.). Boca Raton, FL: CRC Press, pp . 55-113. Suntio, T.M. & Teeri, T.H. (1994) Plant Mol Biol Rep 12: 43-57. Truve, E., et al.(1997) Arch Phytopath Pflanz 30: 473-485. Toepfer, R., et al. (1993) Method Enzymol 217: 66-78. Wu, S., et al. (1987) Virology 161, 73-80. Zelenina, D.A., et al. (1992) FEBS lett 296 (3): 267-270.

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、本発明の比較実験において使用される５'ＵＴＲの配列
を示す。

【図２】 図２は、本発明で使用されるマーカー遺伝子構築体を示す。

【図３】 図３は、タバコにおいてタンパク質合成の増強した発現を示す構
築体を示す。

【図４】 図４は、本来のＣｆＭＶεＲＮＡ配列(配列番号１)の３４個の最
初の５'末端ヌクレオチド配列のコンピュータ予測された二次構造を示す。

【図５】 図５は、本来のキメラ５'ＵＴＲのコンピュータ予測された二次
ＲＮＡ構造を示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 マルト・サールマ フィンランド、エフイーエン−00570ヘル シンキ、クロサーレン・プイストティエ38 番、アー４ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA14 CB03 4B024 AA08 BA79 CA04 CA11 DA01 EA01 EA04 FA06 GA14 GA17 GA21 HA03 4B064 AG01 CA11 CA19 CC24 DA11

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エンハンサーとしてのヌクレオチド配列の使用であって、該
   ヌクレオチド配列がヌクレオチド配列（配列番号２)および／またはそのフラグ
   メントおよび／またはマルチマーと実質的に類似しており、該ヌクレオチド配列
   がＣocksfoot mottle virus (ＣｆＭＶ)のリーダー配列(配列番号１)から得られ
   、かつタンパク質合成を増強し、タンパク質の発現を増強し得ることを特徴とす
   る、ヌクレオチド配列の使用。
2. 【請求項２】 該タンパク質合成および該タンパク質の発現が単子葉または
   双子葉植物において増強されることを特徴とする、請求項１記載のヌクレオチド
   配列の使用。
3. 【請求項３】 該発現が増強された植物が、穀物類であることを特徴とする
   、請求項１記載のヌクレオチド配列の使用。
4. 【請求項４】 該発現が増強された植物が、コーン(トウモロコシ)、米、小
   麦、カラスムギおよび大麦からなる群から選択されることを特徴とする、請求項
   １記載のヌクレオチド配列の使用。
5. 【請求項５】 該発現が増強された植物が、大麦であることを特徴とする、
   請求項１記載のヌクレオチド配列の使用。
6. 【請求項６】 発現を増強する改良された能力を有するヌクレオチド配列を
   産生するための方法であって、下記工程、 (a) キャップまたはアンキャップＲＮＡの５'ＵＴＲを選択すること、 (b) ５'-末端における内部塩基対による推定ヘアピン構造を形成し得る能力につ
   いて該５'ＵＴＲのＲＮＡを試験すること、 (c) ５'末端で安定なヘアピン構造を形成するための高いポテンシャルを有する
   キャップまたはアンキャップＲＮＡの５'ＵＴＲと実質的に類似するヌクレオチ
   ド配列を調製すること、 を特徴とする方法。
7. 【請求項７】 該ヌクレオチド配列が、植物ウイルス、好ましくはsobemovi
   rusから得られることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 安定なヘアピン構造を形成する高いポテンシャルを有するＲ
   ＮＡの選択された５'ＵＴＲと実質的に類似するヌクレオチド配列が、ヌクレオ
   チド配列(配列番号１)または(配列番号２)および／またはそのフラグメント、マ
   ルチマー、複合体であることを特徴とする、請求項６記載の方法。
9. 【請求項９】 エンハンサーエレメントであって、キャップおよび／または
   アンキャップＲＮＡの５'ＵＴＲから選択すること、および二次構造の推定コン
   ピュータープログラムによって試験されるような、５'-隣接配列における内部塩
   基対形成のための能力を持つヘアピンループ形成配列の存在について５'ＵＴＲ
   を試験することによって得られるヌクレオチド配列と実質的に同じヌクレオチド
   配列を含むことを特徴とする、エンハンサーエレメント。
10. 【請求項１０】 タンパク質産生を改良するための方法であって、下記工程
    、 (a) キャップまたはアンキャップＲＮＡの５'ＵＴＲを選択すること、 (b) ５'-末端中にある内部塩基対形成によって推定ヘアピン構造を形成する能力
    について、該５'ＵＴＲのＲＮＡを試験すること、 (c) ５-末端で安定なヘアピン構造を形成するための高いポテンシャルを有する
    キャップまたはアンキャップＲＮＡ植物ウイルスの５'ＵＴＲに実質的に類似す
    るヌクレオチド配列を調製すること、 (d) 工程(c)から得られる該ヌクレオチド配列を含有するベクター構築体を調製
    すること、そして (e) 工程(d)から得られるベクターを用いて宿主体を形質転換すること、 を特徴とする、方法。