JP2003520811A - ヌクレオシドの位置的修飾によるオリゴヌクレオチドＣｐＧ誘導性免疫刺激の調節 - Google Patents

ヌクレオシドの位置的修飾によるオリゴヌクレオチドＣｐＧ誘導性免疫刺激の調節

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドにより惹起された免疫応答を調節するための方法を提供する。本発明の方法は、アンチセンス用途においては免疫刺激効果の減少を、ならびに、免疫治療用途においては免疫刺激効果の増大を、両方とも可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】関連出願への参照 本出願は、2001年1月26日に提出された、出願番号第６０／１７８,５６２号の
米国仮出願に対する優先権を主張しており、この結果、その全内容は参照により
組み込まれる。
【０００２】発明の背景 発明の属する技術分野 本発明は、アンチセンス法における、および、免疫刺激剤としての、オリゴヌ
クレオチドの治療的な使用に関する。
【０００３】関連技術の概要 オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの診断的プローブ法から遺伝子発現のアンチセ
ンス的な阻害に至る、多様な技術に使用されており、近代的な分子生物学におい
て必要不可欠な道具となった。オリゴヌクレオチドのこの広範な使用は、オリゴ
ヌクレオチド合成のための迅速、安価かつ効率的な方法に対する要求を増大させ
るに至った。
【０００４】 アンチセンス用途および診断用途のためのオリゴヌクレオチドの合成は、現在
、定法にしたがって達成することができる。例えば、Methods in Molecular Bio
logy, Vol 20: Protocols for Oligonucleotides and Analogs pp. 165-189 (S.
Agrawal, Ed., Humana Press, 1993); Oligonucleotides and Analogues: A Pr
actical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., 1991); および Uhlmann an
d Peyman, supra. Agrawal and Iyer, Curr. Op. in Biotech. 6: 12 (1995);
および Antisense Research and Applications (Crooke and Lebleu, Eds., CRC
Press, Boca Raton, 1993)を参照。初期の合成アプローチは、ホスホジエステ
ルおよびホスホトリエステル化学を含む。Khorana et al., J. Molec. Biol. 72 : 209 (1972)は、オリゴヌクレオチド合成のためのホスホジエステル化学を開示
している。Reese, Tetrahedron Lett. 34: 3143-3179 (1978)は、オリゴヌクレ
オチドおよびポリヌクレオチドの合成のためのホスホトリエステル化学を開示し
ている。これらの初期のアプローチは、合成のためのより効率的なホスホルアミ
ダイトおよびＨ−ホスホネートアプローチに、大きく道を譲った。Beaucage and
Caruthers, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981)は、ポリヌクレオチドの
合成におけるデオキシヌクレオシドホスホルアミダイトの使用を開示している。
Agrawal and Zamecnik、米国特許第５,１４９,７９８号（１９９２）は、Ｈ−ホ
スホネートアプローチによる最適化されたオリゴヌクレオチドの合成を開示して
いる。
【０００５】 これら両方の近代的アプローチは、多様な修飾されたヌクレオチド間結合を有
するオリゴヌクレオチドを合成するために使用された。Agrawal and Goodchild,
Tetrahedron Lett. 28: 3539-3542 (1987)は、ホスホルアミダイト化学を使用
したオリゴヌクレオチドメチルホスホネートの合成を教示している。Connolly e
t al., Biochemistry 23: 3443 (1984)は、ホスホルアミダイト化学を使用した
オリゴヌクレオチドホスホロチオエートの合成を開示している。Jager et al.,
Biochemistry 27: 7237 (1988)は、ホスホルアミダイト化学を使用したオリゴヌ
クレオチドホスホルアミデートの合成を開示している。Agrawal et al., Proc.
Antl. Acad. Sci. USA 85: 7079-7083 (1988)は、Ｈ−ホスホネート化学を使用
したオリゴヌクレオチドホスホルアミデートおよびホスホロチオエートの合成を
開示している。
【０００６】 より最近になって、いくつかの研究者が、疾患の治療的処置に対するアンチセ
ンスアプローチの有効性を証明した。Crooke, Antisense Nucleic Acid Drug De
v. 8: vii-viiiは、ヒトサイトメガロウイルス誘導性網膜炎の処置のためのホス
ホロチオエートオリゴヌクレオチドが販売承認を得たことを開示している。残念
ながら、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの使用は、当初予想していたよ
り複雑になった。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドにより惹起されたある
種の効果は、予想したアンチセンスメカニズムでは説明できなかった。例えば、
McIntyre et al., Antisense Res. Dev. 3: 309-322 (1993)は、「センス」ホス
ホロチオエートオリゴヌクレオチドが特異的な免疫刺激を起こすことを教示して
いる。この副作用および他の副作用により、ホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドの姿は複雑になった。
【０００７】 一方、ホスホジエステルおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが免疫
刺激を誘導できるという観察は、この副作用を治療の道具として発展させること
への関心を創出した。これらの努力は、ジヌクレオチドＣｐＧを含むホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチドに集中した。Kuramoto et al., Jpn. J. Cancer Re
s. 83: 1128-1131 (1992)は、ＣｐＧジヌクレオチドを含むパリンドロームを含
有するホスホジエステルオリゴヌクレオチドが、インターフェロンアルファおよ
びガンマの合成を誘導し、そして、ナチュラルキラー活性を増強できることを教
示している。Krieg et al., Nature 371: 546-549 (1995)は、ホスホロチオエー
トＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが免疫刺激性であることを開示している。Lian
g et al., J. Clin. Invest. 98: 1119-1129 (1996)は、このようなオリゴヌク
レオチドが、ヒトＢ細胞を活性化することを開示している。Moldoveanu et al.,
Vaccine 16: 1216-124 (1998)は、ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレ
オチドが、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を増強することを教示して
いる。McCluskie and Davis, The Journal of Immunology 161: 4463-4466 (199
8)は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが強力なアジュバントとして作用し、Ｂ型
肝炎表面抗原に対する免疫応答を増強することを教示している。
【０００８】 これらの報告は、ＣｇＧ含有オリゴヌクレオチドによって惹起される免疫応答
を調節できることに対する要求があることを明らかにしている。理想的には、こ
のような調節は、アンチセンス用途において免疫刺激効果を減少させ、ならびに
、免疫療法用途において免疫刺激効果を増大させることを含むべきである。
【０００９】発明の簡単な概要 本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドにより惹起される免疫応答を調節す
る方法を提供する。本発明の方法は、アンチセンス用途においては免疫刺激効果
の減少を、ならびに、免疫療法用途においては免疫刺激効果の増強を、両方とも
可能にする。したがって、本発明はさらに、このようなオリゴヌクレオチドを作
製および使用するための用途および方法のいずれにとっても最適なレベルの免疫
刺激効果を有するオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１０】 当該発明者は、驚くべきことに、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの位置的修飾
（positional modification）が、その免疫刺激能力に劇的な影響を与えること
を発見した。特に、オリゴヌクレオチドの３’アルキル化またはアルコキシル化
、あるいは、ＣｐＧジヌクレオチドの５’または３’側の特定の位置への、荷電
していないヌクレオシド間結合（uncharged internucleoside linkage）の導入
が、再現性があり、かつ予想できる形で、その免疫刺激効果を増強するかまたは
低減する。
【００１１】 第１の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効
果を低減する方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド
中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５’および／または３’側の近傍の位置に、３’
置換ヌクレオシドを導入することを含む。好ましい態様において、この方法は、
３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよ
いもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−５’結合を創出することを含
む。
【００１２】 第２の側面において、本発明は、低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有
オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチド
の５’および／または３’側の近傍の位置に、３’置換ヌクレオシドを含むもの
を提供する。好ましい態様において、本発明のこの側面のＣｐＧ含有オリゴヌク
レオチドは、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであって
もなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間の２’−５’結合を含む
。
【００１３】 第３の側面において、本発明は、哺乳類での遺伝子発現においてアンチセンス
特異的な低減を得る方法を提供し、該方法は、哺乳類に低減された免疫刺激効果
を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを投与することを含み、ここで、該オリ
ゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５’および／または３’側の近傍の
位置に、３’置換ヌクレオシドを含む。好ましい態様において、本発明のこの側
面に使用されるＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、３’置換ヌクレオシドの２’
位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの
５’位との間に２’−５’結合を含む。
【００１４】 第４の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効
果を低減する方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド
中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、荷電していないヌクレオ
シド間結合を導入することを含む。 第５の側面において、本発明は、低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有
オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチド
の５’側の近傍の位置に、荷電していないヌクレオシド間結合を含むものを提供
する。
【００１５】 第６の側面において、本発明は、哺乳類においてアンチセンス特異的な遺伝子
発現の低減を得る方法を提供し、該方法は、哺乳類に低減された免疫刺激効果を
有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを投与することを含み、ここで、該オリゴ
ヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、荷電していな
いヌクレオシド間結合を含む。 第７の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効
果を低減する方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド
中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、２’−５’ヌクレオシド
間結合を導入することを含む。
【００１６】 第８の側面において、本発明は、低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有
オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチド
の５’側の近傍の位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を含むものを提供する
。 第９の側面において、本発明は、哺乳類においてアンチセンス特異的な遺伝子
発現の低減を得る方法を提供し、該方法は、哺乳類に低減された免疫刺激効果を
有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを投与することを含み、ここで、該オリゴ
ヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、２’−５’ヌ
クレオシド間結合を含む。
【００１７】 第１０の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激
効果を増大させる方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオ
チド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧ
ジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに
対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番
目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド
、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレ
オチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３
’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌク
レオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧ
ジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに
対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番
目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、３
’置換ヌクレオシドを導入することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌ
クレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。好ましい態様におい
て、この方法は、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであ
ってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−５’結合を
創出することを含む。
【００１８】 第１１の側面において、本発明は、増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有
オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチド
に対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４
番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシ
ド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌク
レオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して
３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌ
クレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、Ｃｐ
Ｇジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチド
に対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４
番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシ
ド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれら
の組合せからなる群から選択される位置に、３’置換ヌクレオシドを含むものを
提供する。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドではない。好ましい態様において、本発明のこの側面のＣｐＧ含
有オリゴヌクレオチドは、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオ
シドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−５
’結合を含む。
【００１９】 第１２の側面において、本発明は、哺乳類に免疫応答を誘導する方法を提供し
、該方法は、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、Ｃｐ
Ｇジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチド
に対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６
番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシ
ド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌク
レオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して
３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌ
クレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、Ｃｐ
Ｇジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチド
に対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４
番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に３
’置換ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを、哺乳類に投与することを含む
。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレ
オチドではない。好ましい態様において、本発明のこの側面に使用されるＣｐＧ
含有オリゴヌクレオチドは、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレ
オシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−
５’結合を含む。
【００２０】 第１３の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激
効果を増大させる方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオ
チド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧ
ジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに
対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番
目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド
、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレ
オチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３
’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌク
レオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧ
ジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに
対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番
目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、荷
電されていないヌクレオシド間結合を導入することを含む。ある好ましい態様で
は、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００２１】 第１４の側面において、本発明は、増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有
オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチド
に対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４
番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシ
ド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌク
レオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して
３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌ
クレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、Ｃｐ
Ｇジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチド
に対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４
番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシ
ド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれら
の組合せからなる群から選択される位置に、荷電されていないヌクレオシド間結
合を含むものを提供する。
【００２２】 第１５の側面において、本発明は、哺乳類に免疫応答を誘導する方法を提供し
、該方法は、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、Ｃｐ
Ｇジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチド
に対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６
番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシ
ド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌク
レオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して
３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌ
クレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、Ｃｐ
Ｇジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチド
に対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４
番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に荷
電されていないヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを、哺乳類に投与
することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセン
スオリゴヌクレオチドではない。
【００２３】 第１６の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激
効果を増大させる方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオ
チド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧ
ジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに
対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番
目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド
、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレ
オチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３
’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌク
レオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧ
ジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに
対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番
目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、２
’−５’ヌクレオシド間結合を導入することを含む。ある好ましい態様では、該
オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００２４】 第１７の側面において、本発明は、増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有
オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチド
に対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４
番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシ
ド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌク
レオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して
３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌ
クレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、Ｃｐ
Ｇジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチド
に対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４
番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシ
ド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれら
の組合せからなる群から選択される位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を含
むものを提供する。
【００２５】 第１８の側面において、本発明は、哺乳類に免疫応答を誘導する方法を提供し
、該方法は、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、Ｃｐ
Ｇジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチド
に対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６
番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシ
ド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌク
レオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して
３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌ
クレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、Ｃｐ
Ｇジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチド
に対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４
番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に２
’−５’ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを、哺乳類に投与するこ
とを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドではない。
【００２６】好ましい態様の詳細な説明 本発明は、アンチセンス法における、および、免疫刺激剤としての、オリゴヌ
クレオチドの治療的な使用に関する。本明細書中に引用した特許および出版物は
、当該分野における知識レベルを反映しており、参照によりその全体をこの明細
書に組込む。本明細書中に引用した任意の参照の任意の教示と本明細書との間に
対立がある場合、本発明の目的のためには、後者が優先されるべきである。
【００２７】 本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドにより惹起される免疫応答を調節す
る方法を提供する。本発明の方法は、アンチセンス用途においては免疫刺激効果
の減少を、ならびに、免疫療法用途においては免疫刺激効果の増強を、両方とも
可能にする。したがって、本発明はさらに、このようなオリゴヌクレオチドを作
製および使用するための用途および方法のいずれにとっても最適なレベルの免疫
刺激効果を有するオリゴヌクレオチドを提供する。
【００２８】 当該発明者は、驚くべきことに、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの位置的修飾
が、その免疫刺激能力に劇的な影響を与えることを発見した。特に、オリゴヌク
レオチドの３’アルキル化またはアルコキシル化、あるいは、ＣｐＧジヌクレオ
チドの特定の５’または３’位への、荷電していないヌクレオシド間結合の導入
が、再現性があり、かつ予想できる形で、その免疫刺激効果を増強するかまたは
低減する。
【００２９】 本発明の最初の９つの側面に使用する場合、「相補的」という用語は、ゲノム
領域、遺伝子またはそのＲＮＡ転写物に、生理学的な条件下でハイブリダイズす
る能力を有することを意味する。このようなハイブリダイゼーションは、通常、
相補鎖間の、好ましくはワトソン−クリック型またはフーグスティン型塩基対を
形成する、塩基特異的水素結合の結果であるが、他の様式の水素結合、ならびに
、塩基スタッキングもまた、ハイブリダイゼーションをもたらすことができる。
実際的な問題として、このようなハイブリダイゼーションは、特異的な遺伝子発
現の阻害の観察から推測することができる。
【００３０】 本発明の最初の９つの側面に使用する場合、「アンチセンス活性」という用語
は、オリゴヌクレオチドが、細胞または動物内に導入されたときに、それが相補
的である遺伝子の発現の減少を惹起するものを意味する。
【００３１】 第１の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効
果を低減する方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド
中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５’および／または３’側の近傍の位置に、３’
置換ヌクレオシドを導入することを含む。好ましい態様において、この方法は、
３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよ
いもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−５’結合を創出することを含
む。
【００３２】 本発明のこの側面の方法は、ＣｐＧジヌクレオチドの組込み直後のサイクルに
おける合成過程に、適切な３’置換モノマーシントンを単に使用することにより
、よく知られた任意の合成技術を用いて、都合よく行うことができる。好ましい
モノマーは、ホスホルアミダイト、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスホネート
を含む。したがって、本発明の目的において、「オリゴヌクレオチド中の、Ｃｐ
Ｇジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、３’置換ヌクレオシドを導入するこ
と」とは、単に、３’置換ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを、このよ
うな位置に合成することを意味する。３’置換ヌクレオシドを含むオリゴヌクレ
オチドの合成は、最近、Kumar and Takaku, Bioorganic & Medicinal Chemistry
Letters 9: 2515-2520 (1999)に記載された。
【００３３】 第２の側面において、本発明は、低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有
オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチド
の５’および／または３’側の近傍の位置に、３’置換ヌクレオシドを含むもの
を提供する。好ましい態様において、本発明のこの側面のＣｐＧ含有オリゴヌク
レオチドは、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであって
もなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間の２’−５’結合を含む
。
【００３４】 好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドは、約１２〜約５０のヌクレオチ
ド、最も好ましくは、約１２〜約３５のヌクレオチドを有するだろう。本発明の
この側面の好ましいオリゴヌクレオチドは、遺伝子または遺伝子転写物に相補的
である。より好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドはアンチセンス活性を
有する。いくつかの好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレ
オチド中に存在する各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの３’置換ヌクレオ
シドを有する。いくつかの好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、１個のみ
の３’置換ヌクレオシドを有する。
【００３５】 第３の側面において、本発明は、哺乳類での遺伝子発現においてアンチセンス
特異的な低減を得る方法を提供し、該方法は、哺乳類に低減された免疫刺激効果
を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを投与することを含み、ここで、該オリ
ゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５’および／または３’側の近傍の
位置に、３’置換ヌクレオシドを含む。好ましい態様において、本発明のこの側
面に使用されるＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、３’置換ヌクレオシドの２’
位と、３’置換ヌクレオシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの
５’位との間に２’−５’結合を含む。
【００３６】 本発明のこの側面の方法では、好ましくは、オリゴヌクレオチドの投与は非経
口投与、経口投与、舌下投与、経皮投与、局所投与、鼻内投与または直腸内投与
であるべきである。治療組成物の投与は、公知の手順を使用し、疾患の症状また
は代用の指標を減少させるために効果的な用量および期間で行うことができる。
全身的に投与する場合、治療組成物は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの血液
レベルが約０．０１マイクロモーラー〜約１０マイクロモーラーに達する十分な
用量で投与される。局所的な投与においては、これより大幅に低い濃度が有効か
も知れず、そして、大幅に高い濃度が耐容されるかもしれない。好ましくは、オ
リゴヌクレオチドの総用量は、患者１日当たりオリゴヌクレオチド約0.1ｍｇか
ら、１日体重１ｋｇ当たりオリゴヌクレオチド約２００ｍｇまでの範囲だろう。
【００３７】 単一の処置エピソードとして、１つの個体に、治療的に有効な量の１種または
２種以上の本発明の治療組成物を、同時にまたは順次投与することが望ましいか
もしれない。好ましい態様においては、問題の組成物を投与した後、補体の活性
化、有糸分裂誘起（mitogenesis）およびトロビン血餅形成の抑制（inhibition
of thrombin clot formation）からなる群から選択される生物学的効果について
１種または２種以上の測定が行なわれる。 本発明のこの側面の方法は、疾患または遺伝子発現の動物モデルに有用であり
、そしてさらに、ヒトまたは動物の疾患の治療的処置に有用である。
【００３８】 第４の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効
果を低減する方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド
中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、荷電していないヌクレオ
シド間結合を導入することを含む。
【００３９】 本発明の第４、第５および第６の側面に関しては、好ましい荷電していないヌ
クレオシド間結合は、ホスホルアミデート結合、カルバメート結合、ペプチド結
合、アルキルホスホネート結合、特にメチルホスホネート結合を含むがこれに限
定されず、そしてさらに、リン酸塩の架橋していない酸素原子が、ハロゲン（好
ましくはＣｌ、ＢｒまたはＦ）、１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を有する
下級アルキル基、２〜６個の炭素原子を有するアリールまたはアリル基、および
、アミノ基から選択される化学的部分に共有結合しているか、または、それによ
り置換されている結合を含み、ここで、このようなアルキル、アリールまたはア
リル基は、無置換であってもよく、または、例えばハロゲノ基、水酸基、トリフ
ルオロメチル基、シアノ基、ニトロ基、アシル基、アシルオキシ基、アルコキシ
基、カルボキシル基、カルボアルコキシ（carbalkoxyl）基、またはアミノ基に
よって置換されていてもよい。
【００４０】 本発明のこの側面の方法は、ＣｐＧジヌクレオチドの組込み直後のサイクルに
おける合成過程に、適切なＰ置換モノマーシントンを単に使用することにより、
よく知られた任意の合成技術を用いて、都合よく行うことができる。好ましいモ
ノマーは、ホスファイト、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスファイトを含む。
したがって、本発明の目的において、「オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌク
レオチドの５’側の近傍の位置に、荷電していないヌクレオシド間結合を導入す
ること」とは、単に、荷電していないヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレ
オチドを、このような位置に合成すること、即ち、ＣｐＧのＣの５’位が荷電さ
れていない結合を形成することを意味する。荷電されていないヌクレオシド間結
合を含むオリゴヌクレオチドの合成は、当該分野によく知られている。
【００４１】 第５の側面において、本発明は、低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有
オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチド
の５’側の近傍の位置に、荷電されていないヌクレオシド間結合を含むものを提
供する。好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドは、約１２〜約５０のヌク
レオチド、最も好ましくは、約１２〜約３５のヌクレオチドを有するだろう。本
発明のこの側面の好ましいオリゴヌクレオチドは、遺伝子または遺伝子転写物に
相補的である。より好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドはアンチセンス
活性を有する。いくつかの好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、該オリゴ
ヌクレオチド中に存在する各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの荷電されて
いないヌクレオシド間結合を有する。いくつかの好ましい態様では、オリゴヌク
レオチドは、１個のみの荷電されていないヌクレオシド間結合を有する。
【００４２】 第６の側面において、本発明は、哺乳類においてアンチセンス特異的な遺伝子
発現の低減を得る方法を提供し、該方法は、哺乳類に低減された免疫刺激効果を
有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを投与することを含み、ここで、該オリゴ
ヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、荷電していな
いヌクレオシド間結合を含む。
【００４３】 本発明のこの側面の方法では、好ましくは、オリゴヌクレオチドの投与は非経
口投与、経口投与、舌下投与、経皮投与、局所投与、鼻内投与または直腸内投与
であるべきである。治療組成物の投与は、公知の手順を使用し、疾患の症状また
は代用の指標を減少させるために効果的な用量および期間で行うことができる。
全身的に投与する場合、治療組成物は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの血液
レベルが約０．０１マイクロモーラー〜約１０マイクロモーラーに達する十分な
用量で投与される。局所的な投与においては、これより大幅に低い濃度が有効か
も知れず、そして、大幅に高い濃度が耐容されるかもしれない。好ましくは、オ
リゴヌクレオチドの総用量は、患者１日当たりオリゴヌクレオチド約0.1ｍｇか
ら、１日体重１ｋｇ当たりオリゴヌクレオチド約２００ｍｇまでの範囲だろう。
【００４４】 単一の処置エピソードとして、１つの個体に、治療的に有効な量の１種または
２種以上の本発明の治療組成物を、同時にまたは順次投与することが望ましいか
もしれない。好ましい態様においては、問題の組成物を投与した後、補体の活性
化、有糸分裂誘起およびトロビン血餅形成の抑制からなる群から選択される生物
学的効果について１種または２種以上の測定が行なわれる。 本発明のこの側面の方法は、疾患または遺伝子発現の動物モデルに有用であり
、そしてさらに、ヒトまたは動物の疾患の治療的処置に有用である。
【００４５】 第７の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効
果を低減する方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオチド
中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、２’−５’ヌクレオシド
間結合を導入することを含む。
【００４６】 本発明のこの側面の方法は、ＣｐＧジヌクレオチドの組込み直後のサイクルに
おける合成過程に、適切な３’保護モノマーシントンを単に使用することにより
、よく知られた任意の合成技術を用いて、都合よく行うことができる。好ましい
モノマーは、ホスホルアミダイト、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスホネート
を含む。したがって、本発明の目的において、「オリゴヌクレオチド中の、Ｃｐ
Ｇジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を導
入すること」とは、単に、荷電していないヌクレオシド間結合を有するオリゴヌ
クレオチドを、このような位置に合成すること、即ち、ＣｐＧのＣの５’位が２
’−５’結合を形成することを意味する。２’−５’ヌクレオシド間結合を含む
オリゴヌクレオチドの合成は、当該分野によく知られている。
【００４７】 第８の側面において、本発明は、低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有
オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチド
の５’側の近傍の位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を含むものを提供する
。好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドは、約１２〜約５０のヌクレオチ
ド、最も好ましくは、約１２〜約３５のヌクレオチドを有するだろう。本発明の
この側面の好ましいオリゴヌクレオチドは、遺伝子または遺伝子転写物に相補的
である。より好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドはアンチセンス活性を
有する。いくつかの好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレ
オチド中に存在する各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの２’−５’ヌクレ
オシド間結合を有する。いくつかの好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、
１個のみの２’−５’ヌクレオシド間結合を有する。
【００４８】 第９の側面において、本発明は、哺乳類においてアンチセンス特異的な遺伝子
発現の低減を得る方法を提供し、該方法は、哺乳類に低減された免疫刺激効果を
有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを投与することを含み、ここで、該オリゴ
ヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に、２’−５’ヌ
クレオシド間結合を含む。
【００４９】 本発明のこの側面の方法では、好ましくは、オリゴヌクレオチドの投与は非経
口投与、経口投与、舌下投与、経皮投与、局所投与、鼻内投与または直腸内投与
であるべきである。治療組成物の投与は、公知の手順を使用し、疾患の症状また
は代用の指標を減少させるために効果的な用量および期間で行うことができる。
全身的に投与する場合、治療組成物は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの血液
レベルが約０．０１マイクロモーラー〜約１０マイクロモーラーに達する十分な
用量で投与される。局所的な投与においては、これより大幅に低い濃度が有効か
も知れず、そして、大幅に高い濃度が耐容されるかもしれない。好ましくは、オ
リゴヌクレオチドの総用量は、患者１日当たりオリゴヌクレオチド約0.1ｍｇか
ら、１日体重１ｋｇ当たりオリゴヌクレオチド約２００ｍｇまでの範囲だろう。
【００５０】 単一の処置エピソードとして、１つの個体に、治療的に有効な量の１種または
２種以上の本発明の治療組成物を、同時にまたは順次投与することが望ましいか
もしれない。好ましい態様においては、問題の組成物を投与した後、補体の活性
化、有糸分裂誘起およびトロビン血餅形成の抑制からなる群から選択される生物
学的効果について１種または２種以上の測定が行なわれる。 本発明のこの側面の方法は、疾患または遺伝子発現の動物モデルに有用であり
、そしてさらに、ヒトまたは動物の疾患の治療的処置に有用である。
【００５１】 第１０の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激
効果を増大させる方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオ
チド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧ
ジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに
対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番
目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド
、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレ
オチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３
’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌク
レオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧ
ジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに
対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番
目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、３
’置換ヌクレオシドを導入することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌ
クレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。好ましい態様におい
て、この方法は、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオシドであ
ってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−５’結合を
創出することを含む。
【００５２】 本発明の第１０の側面に関しては、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、
遺伝子または遺伝子転写物と正確に相補的であり、そして、それが正確に相補的
な遺伝子または遺伝子転写物の発現を減少させることができるオリゴヌクレオチ
ドである。
【００５３】 本発明のこの側面の方法は、ＣｐＧジヌクレオチドの組込み直後のサイクルに
おける合成過程に、適切な３’置換モノマーシントンを単に使用することにより
、よく知られた任意の合成技術を用いて、都合よく行うことができる。好ましい
モノマーは、ホスホルアミダイト、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスホネート
を含む。したがって、本発明の目的において、「オリゴヌクレオチド中の、Ｃｐ
Ｇジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチド
に対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５
番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシ
ド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌク
レオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して
３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌ
クレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、Ｃｐ
Ｇジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチド
に対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６
番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシ
ド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、３’置換ヌクレオ
シドを導入すること」とは、単に、３’置換ヌクレオシドを有するオリゴヌクレ
オチドを、このような位置に合成することを意味する。
【００５４】 第１１の側面において、本発明は、増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有
オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチド
に対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４
番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシ
ド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌク
レオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して
３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌ
クレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、Ｃｐ
Ｇジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチド
に対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４
番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシ
ド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれら
の組合せからなる群から選択される位置に、３’置換ヌクレオシドを含むものを
提供する。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドではない。好ましい態様において、本発明のこの側面のＣｐＧ含
有オリゴヌクレオチドは、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレオ
シドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−５
’結合を含む。
【００５５】 本発明の第１４の側面の好ましいオリゴヌクレオチドは、長さが約６〜約５０
ヌクレオチドであり、安定性、生物学的利用性、または、その他の臨床的に関係
する特徴を改善するために、修飾されたヌクレオチド間結合または修飾された糖
をさらに含んでもよい。
【００５６】 第１２の側面において、本発明は、哺乳類に免疫応答を誘導する方法を提供し
、該方法は、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、Ｃｐ
Ｇジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチド
に対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６
番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシ
ド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌク
レオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して
３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌ
クレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、Ｃｐ
Ｇジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチド
に対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４
番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に３
’置換ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを、哺乳類に投与することを含む
。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレ
オチドではない。好ましい態様において、本発明のこの側面に使用されるＣｐＧ
含有オリゴヌクレオチドは、３’置換ヌクレオシドの２’位と、３’置換ヌクレ
オシドであってもなくてもよいもう１つのヌクレオシドの５’位との間に２’−
５’結合を含む。
【００５７】 本発明のこの側面の方法では、好ましくは、オリゴヌクレオチドの投与は非経
口投与、経口投与、舌下投与、経皮投与、局所投与、鼻内投与または直腸内投与
であるべきである。治療組成物の投与は、公知の手順を使用し、疾患の症状また
は代用の指標を減少させるために効果的な用量および期間で行うことができる。
全身的に投与する場合、治療組成物は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの血液
レベルが約０．０１マイクロモーラー〜約１０マイクロモーラーに達する十分な
用量で投与される。局所的な投与においては、これより大幅に低い濃度が有効か
も知れず、そして、大幅に高い濃度が耐容されるかもしれない。好ましくは、オ
リゴヌクレオチドの総用量は、患者１日当たりオリゴヌクレオチド約0.1ｍｇか
ら、１日体重１ｋｇ当たりオリゴヌクレオチド約２００ｍｇまでの範囲だろう。
単一の処置エピソードとして、１つの個体に、治療的に有効な量の１種または２
種以上の本発明の治療組成物を、同時にまたは順次投与することが望ましいかも
しれない。好ましい態様においては、問題の組成物を投与した後、補体の活性化
、有糸分裂誘起およびトロビン血餅形成の抑制からなる群から選択される生物学
的効果について１種または２種以上の測定が行なわれる。
【００５８】 ある好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、免疫応答の特異
性または大きさを増大させるために、ワクチンおよび／またはアジュバントとの
組合せにおいて投与される。オリゴヌクレオチドまたはワクチンか、あるいはそ
の両方は、随意的に、キーホールリンペットヘモシアニン、コレラ毒素Ｂサブユ
ニットなどの免疫原性タンパク質、または、任意のその他の免疫原生担体タンパ
ク質と結合されていてもよい。フロイント完全アジュバントを含むがこれに限定
されない、任意の多くのアジュバントを使用してもよい。この側面に関して、「
との組合わせにおいて」とは、同一患者における同一疾患の処置の間において、
を意味し、同時投与ならびに数日までの時間的に間隔をあけた順序を含む任意の
順序で、オリゴヌクレオチドおよび/またはワクチンおよび／またはアジュバン
トを投与することを含む。
【００５９】 このような組合せ処置はまた、オリゴヌクレオチド、およびワクチン／または
ワクチン単独、およびアジュバント／またはアジュバント単独の１回より多い投
与を含んでもよい。オリゴヌクレオチドおよび／またはワクチンおよび／または
アジュバントの投与は、同一のまたは異なる経路によってなされてもよい。 本発明のこの側面の方法は、免疫系のモデル研究に有用であり、そしてさらに
、ヒトまたは動物の疾患の治療的処置に有用である。
【００６０】 第１３の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激
効果を増大させる方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオ
チド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧ
ジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに
対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番
目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド
、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレ
オチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３
’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌク
レオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧ
ジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに
対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番
目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、荷
電されていないヌクレオシド間結合を導入することを含む。ある好ましい態様で
は、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００６１】 本発明の第１３、第１４および第１５の側面に関しては、好ましい荷電してい
ないヌクレオシド間結合は、ホスホルアミデート結合、カルバメート結合、ペプ
チド結合、アルキルホスホネート結合、特にメチルホスホネート結合を含むがこ
れに限定されず、そしてさらに、リン酸塩の架橋していない酸素原子が、ハロゲ
ン（好ましくはＣｌ、ＢｒまたはＦ）、１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を
有する下級アルキル基、２〜６個の炭素原子を有するアリールまたはアリル基、
および、アミノ基から選択される化学的部分に共有結合しているか、または、そ
れにより置換されている結合を含み、ここで、このようなアルキル、アリールま
たはアリル基は、無置換であってもよく、または、例えばハロゲノ基、水酸基、
トリフルオロメチル基、シアノ基、ニトロ基、アシル基、アシルオキシ基、アル
コキシ基、カルボキシル基、カルボアルコキシ基、またはアミノ基によって置換
されていてもよい。
【００６２】 本発明のこの側面の方法は、ＣｐＧジヌクレオチドの組込み直後のサイクルに
おける合成過程に、適切なＰ置換モノマーシントンを単に使用することにより、
よく知られた任意の合成技術を用いて、都合よく行うことができる。好ましいモ
ノマーは、ホスファイト、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスファイトを含む。
したがって、本発明の目的において、「オリゴヌクレオチド中の位置に、荷電し
ていないヌクレオシド間結合を導入すること」とは、単に、荷電していないヌク
レオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを、このような位置に合成すること
、即ち、ＣｐＧのＣから数えて、荷電していないヌクレオシド間結合が、そのヌ
クレオシドの３’結合であることを意味する。荷電されていないヌクレオシド間
結合を含むオリゴヌクレオチドの合成は、当該分野によく知られている。
【００６３】 第１４の側面において、本発明は、増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有
オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチド
に対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４
番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシ
ド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌク
レオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して
３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌ
クレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、Ｃｐ
Ｇジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチド
に対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４
番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシ
ド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれら
の組合せからなる群から選択される位置に、荷電されていないヌクレオシド間結
合を含むものを提供する。
【００６４】 本発明のこの側面の好ましいオリゴヌクレオチドは、遺伝子または遺伝子転写
物に相補的である。より好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドはアンチセ
ンス活性を有する。いくつかの好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、該オ
リゴヌクレオチド中に存在する各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの荷電さ
れていないヌクレオシド間結合を有する。いくつかの好ましい態様では、オリゴ
ヌクレオチドは、１個のみの荷電されていないヌクレオシド間結合を有する。 本発明の第１４の側面の好ましいオリゴヌクレオチドは、長さが約６〜約５０
ヌクレオチドであり、安定性、生物学的利用性、または、その他の臨床的に関係
する特徴を改善するために、修飾されたヌクレオチド間結合または修飾された糖
をさらに含んでもよい。
【００６５】 第１５の側面において、本発明は、哺乳類に免疫応答を誘導する方法を提供し
、該方法は、哺乳類に、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオ
シド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌ
クレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対し
て５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つの
ヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、Ｃ
ｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチ
ドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側
４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオ
シド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌ
クレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対し
て３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択され
る位置に、荷電されていないヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを投
与することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドではない。
【００６６】 本発明のこの側面の方法では、好ましくは、オリゴヌクレオチドの投与は非経
口投与、経口投与、舌下投与、経皮投与、局所投与、鼻内投与または直腸内投与
であるべきである。治療組成物の投与は、公知の手順を使用し、疾患の症状また
は代用の指標を減少させるために効果的な用量および期間で行うことができる。
全身的に投与する場合、治療組成物は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの血液
レベルが約０．０１マイクロモーラー〜約１０マイクロモーラーに達する十分な
用量で投与される。局所的な投与においては、これより大幅に低い濃度が有効か
も知れず、そして、大幅に高い濃度が耐容されるかもしれない。好ましくは、オ
リゴヌクレオチドの総用量は、患者１日当たりオリゴヌクレオチド約0.1ｍｇか
ら、１日体重１ｋｇ当たりオリゴヌクレオチド約２００ｍｇまでの範囲だろう。
単一の処置エピソードとして、１つの個体に、治療的に有効な量の１種または２
種以上の本発明の治療組成物を、同時にまたは順次投与することが望ましいかも
しれない。好ましい態様においては、問題の組成物を投与した後、補体の活性化
、有糸分裂誘起およびトロビン血餅形成の抑制からなる群から選択される生物学
的効果について１種または２種以上の測定が行なわれる。
【００６７】 ある好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、免疫応答の特異
性または大きさを増大させるために、ワクチンおよび／またはアジュバントとの
組合せにおいて投与される。オリゴヌクレオチドまたはワクチンか、あるいはそ
の両方は、随意的に、キーホールリンペットヘモシアニン、コレラ毒素Ｂサブユ
ニットなどの免疫原性タンパク質、または、任意のその他の免疫原生担体タンパ
ク質と結合されていてもよい。フロイント完全アジュバントを含むがこれに限定
されない、任意の多くのアジュバントを使用してもよい。この側面に関して、「
との組合わせにおいて」とは、同一患者における同一疾患の処置の間において、
を意味し、同時投与ならびに数日までの時間的に間隔をあけた順序を含む任意の
順序で、オリゴヌクレオチドおよび/またはワクチンおよび／またはアジュバン
トを投与することを含む。このような組合せ処置はまた、オリゴヌクレオチド、
およびワクチン／またはワクチン単独、およびアジュバント／またはアジュバン
ト単独の１回より多い投与を含んでもよい。オリゴヌクレオチドおよび／または
ワクチンおよび／またはアジュバントの投与は、同一のまたは異なる経路によっ
てなされてもよい。
【００６８】 第１６の側面において、本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激
効果を増大させる方法を提供する。本発明のこの側面の方法は、オリゴヌクレオ
チド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧ
ジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに
対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番
目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド
、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレ
オチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３
’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌク
レオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に、２’−５’
ヌクレオシド間結合を導入することを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌ
クレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【００６９】 本発明のこの側面の方法は、ＣｐＧジヌクレオチドの組込み直後のサイクルに
おける合成過程に、適切な３’保護モノマーシントンを単に使用することにより
、よく知られた任意の合成技術を用いて、都合よく行うことができる。好ましい
モノマーは、ホスホルアミダイト、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスホネート
を含む。したがって、本発明の目的において、「オリゴヌクレオチド中の位置に
、２’−５’ヌクレオシド間結合を導入すること」とは、単に、２’−５’ヌク
レオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを、このような位置に合成すること
、即ち、ＣｐＧのＣから数えて、荷電していないヌクレオシド間結合が、そのヌ
クレオシドの３’結合であることを意味する。２’−５’ヌクレオシド間結合を
含むオリゴヌクレオチドの合成は、当該分野によく知られている。
【００７０】 第１７の側面において、本発明は、増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有
オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチド
に対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４
番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシ
ド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌク
レオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して
３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌ
クレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、Ｃｐ
Ｇジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチド
に対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４
番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシ
ド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれら
の組合せからなる群から選択される位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を含
むものを提供する。
【００７１】 本発明の第１７の側面の好ましいオリゴヌクレオチドは、長さが約６〜約５０
ヌクレオチドであり、安定性、生物学的利用性、または、その他の臨床的に関係
する特徴を改善するために、修飾されたヌクレオチド間結合または修飾された糖
をさらに含んでもよい。
【００７２】 第１８の側面において、本発明は、哺乳類に免疫応答を誘導する方法を提供し
、該方法は、哺乳類に、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオ
シド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌ
クレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対し
て５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つの
ヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、Ｃ
ｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチ
ドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側
４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオ
シド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌ
クレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対し
て３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからなる群から選択され
る位置に、２’−５’ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを投与する
ことを含む。ある好ましい態様では、該オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオ
リゴヌクレオチドではない。
【００７３】 本発明のこの側面の方法では、好ましくは、オリゴヌクレオチドの投与は非経
口投与、経口投与、舌下投与、経皮投与、局所投与、鼻内投与または直腸内投与
であるべきである。治療組成物の投与は、公知の手順を使用し、疾患の症状また
は代用の指標を減少させるために効果的な用量および期間で行うことができる。
全身的に投与する場合、治療組成物は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの血液
レベルが約０．０１マイクロモーラー〜約１０マイクロモーラーに達する十分な
用量で投与される。局所的な投与においては、これより大幅に低い濃度が有効か
も知れず、そして、大幅に高い濃度が耐容されるかもしれない。好ましくは、オ
リゴヌクレオチドの総用量は、患者１日当たりオリゴヌクレオチド約0.1ｍｇか
ら、１日体重１ｋｇ当たりオリゴヌクレオチド約２００ｍｇまでの範囲だろう。
単一の処置エピソードとして、１つの個体に、治療的に有効な量の１種または２
種以上の本発明の治療組成物を、同時にまたは順次投与することが望ましいかも
しれない。好ましい態様においては、問題の組成物を投与した後、補体の活性化
、有糸分裂誘起およびトロビン血餅形成の抑制からなる群から選択される生物学
的効果について１種または２種以上の測定が行なわれる。
【００７４】 ある好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、免疫応答の特異
性または大きさを増大させるために、ワクチンおよび／またはアジュバントとの
組合せにおいて投与される。オリゴヌクレオチドまたはワクチンか、あるいはそ
の両方は、随意的に、キーホールリンペットヘモシアニン、コレラ毒素Ｂサブユ
ニットなどの免疫原性タンパク質、または、任意のその他の免疫原生担体タンパ
ク質と結合されていてもよい。フロイント完全アジュバントを含むがこれに限定
されない、任意の多くのアジュバントを使用してもよい。この側面に関して、「
との組合わせにおいて」とは、同一患者における同一疾患の処置の間において、
を意味し、同時投与ならびに数日までの時間的に間隔をあけた順序を含む任意の
順序で、オリゴヌクレオチドおよび/またはワクチンおよび／またはアジュバン
トを投与することを含む。このような組合せ処置はまた、オリゴヌクレオチド、
およびワクチン／またはワクチン単独、およびアジュバント／またはアジュバン
ト単独の１回より多い投与を含んでもよい。オリゴヌクレオチドおよび／または
ワクチンおよび／またはアジュバントの投与は、同一のまたは異なる経路によっ
てなされてもよい。
【００７５】 本発明の全ての側面に関して、「オリゴヌクレオチド」という用語は、２個ま
たは３個以上のデオキシリボヌクレオチドのポリマー、または、２’−ハロ−ヌ
クレオシド、２’または３’置換、２’または３’−Ｏ−置換リボヌクレオシド
、デアザヌクレオシドまたはそれらの任意の組合せを含む、任意の修飾されたヌ
クレオシドを含む。このようなモノマーは、公知の任意の多様なヌクレオシド間
結合により互いに結合されていてもよい。ある好ましい態様においては、これら
のヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチ
オエートまたはホスホルアミデート結合、任意の前記のものの２’−５’結合、
または、それらの組合せでもよい。オリゴヌクレオチドという用語はまた、化学
的に修飾された塩基または糖を有し、および／または、親油基、挿入剤、ジアミ
ンおよびアダマンタンを含むがこれらに限定されない追加の置換基を有するこの
ようなポリマーを包含する。
【００７６】 オリゴヌクレオチドという用語はまた、ＰＮＡ、ＬＮＡおよび、五炭糖でない
（例えば六炭糖の）主鎖または主鎖部分を含むオリゴヌクレオチドを包含する。
本発明に関して、「３’−Ｏ−置換」という用語は、五炭糖部分の３’位の、ハ
ロゲン（好ましくはＣｌ、ＢｒまたはＦ）、または、１〜６個の飽和または不飽
和炭素原子を含む−Ｏ−下級アルキル基、または、２〜６個の炭素原子を有する
−Ｏ−アリールまたはアリル基（ここで、このようなアルキル、アリールまたは
アリル基は、無置換であってもよく、または例えば、ハロゲノ基、水酸基、トリ
フルオロメチル基、シアノ基、ニトロ基、アシル基、アシルオキシ基、アルコキ
シ基、カルボキシル基、カルボアルコキシル基またはアミノ基によって置換され
ていてもよい）による置換を意味し、あるいは、このような３’置換は、水酸基
（リボヌクレオシドを生成するための）、アミノ基またはハロゲノ基であっても
よい。
【００７７】 本発明の全ての側面に関して、「ＣｐＧ」または「ＣｐＧジヌクレオチド」と
いう用語は、ジヌクレオチド５’−シチジン−グアニジン−３’を意味し、ここ
でｐはヌクレオチド間結合であり、そして、ジヌクレオチドの糖主鎖は、リボー
ス、デオキシリボース、または３’置換リボース、またはそれらの組合せであっ
てもよい。本発明の最初の３つの側面の好ましい態様において、ｐはホスホジエ
ステル、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホトリエステル、立
体特異性（ＲｐまたはＳｐ）ホスホロチオエートまたはアルキルホスホネート、
および、上記のものの任意の２’−５’共有結合から選択される。ホスホジエス
テルでない、ホスホロチオエートでない態様は、免疫刺激効果をさらに低減する
だろう。本発明の最後の３つの側面の好ましい態様において、ｐはホスホジエス
テル、ホスホロチオエートおよびホスホルジチオエートから選択される。
【００７８】 以下の例は本発明のある好ましい態様をさらに説明することを意図しており、
本発明の範囲を限定することは意図していない。
【００７９】 例１部位特異的３’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドの調製 オリゴヌクレオチドを、自動化ＤＮＡ合成装置（Expedite 8909, PE Biosyste
ms, MA）で固相（１μモルスケール）ホスホルアミダイト化学を用いて合成した
。３’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドホスホロチオエートのセグメントを、３’
−Ｏ−メチル−２’−シアノエチルリボヌクレオシドホスホルアミダイト（Chem
Genes, MA）を用いて、オリゴヌクレオチド内に組込んだ。オリゴヌクレオチド
を、３Ｈ−１,２−ベンゾジチオール−３−オン１,１−ジオキシドを用いて硫化
した。オリゴヌクレオチドを予備逆相ＨＰＬＣで精製し、ＣＧＥ（PE Nelson Tu
rbochrom softwareを介してデータを処理）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
（Bruker Profelx III質量分析計）で特徴化した。
【００８０】 例２in vitroでの免疫刺激効果の調節：３’置換 本研究においてオリゴヌクレオチドの免疫刺激活性を評価するために、我々は
、例１に記載のとおりに、マウス脾臓細胞増殖アッセイを用いた。表１に示した
オリゴをこれらの研究に使用した。
【表１】
【００８１】 我々は、単一のＣｐＧジヌクレオチドを含むＰＳ−オリゴヌクレオチド（オリ
ゴ１）、および、修飾されたヌクレオシドにより、１または２個のデオキシヌク
レオシドの置換を特定部位で行なったオリゴ２〜５を使用した。 オリゴ２〜５における３’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドによる置換は、同時
に２’−５’ヌクレオシド間結合の組込みをもたらした。介在するヌクレオシド
なしのＣｐＧの５’置換（オリゴ２）は、免疫刺激活性を減少させた。驚くべき
ことに、介在するヌクレオシドなしのＣｐＧの３’置換（オリゴ５）もまた、免
疫刺激活性を減少させた。加えて、ＣｐＧの３’における３’−Ｏ−メチルリボ
ヌクレオシド置換を伴うオリゴ３および４は、免疫刺激活性を増大させた（指数
はそれぞれ４．６±０．４３および５．７±０．８７）。
【００８２】 例３in vivoでの免疫刺激効果の調節：メチルホスホネート置換 in vitroの結果のin vivoモデルでの適用性を試験するために、選択したオリ
ゴヌクレオチドをマウスに投与し、免疫刺激活性のレベルの指標として脾腫の度
合いを測定した。５ｍｇ／ｋｇの単一用量をＢａｌｂ／ｃマウス（雌、４〜６週
齢、Harlan Spraque Dawley Inc）に腹腔内投与した。マウスを投与の７２時間
後に屠殺し、脾臓を採取し重量を測定した。陽性対照であるオリゴ１は、ＰＢＳ
のみを受けた陰性対照マウスに比べ、脾臓重量の７４％の増加をもたらした。
【００８３】 メチルホスホネートヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドを図３に示
す。オリゴヌクレオチドを、ＣｐＧジヌクレオチドから５’側に３または４ヌク
レオチド、またはＣｐＧジヌクレオチドから３’側に２または３ヌクレオチドに
メチルホスホネート結合を有するように調製した。図３に示すとおり、全てのこ
れらのオリゴヌクレオチドは、マウス脾臓細胞増殖アッセイおよび脾臓肥大アッ
セイの両方で、オリゴ１よりもより免疫刺激的であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 オリゴヌクレオチドなし（Ｃ）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、または種々の無置換
または２’もしくは３’置換オリゴヌクレオチドの存在下におけるマウス脾臓細
胞の増殖アッセイの結果を示した図である。
【図２】 オリゴヌクレオチドを投与されていないか、または、種々の無置換または２’
もしくは３’置換オリゴヌクレオチドを投与したマウスにおける脾臓肥大を示し
た図である。
【図３】 マウス脾臓細胞の増殖アッセイの結果、および、オリゴヌクレオチドを投与し
ていないか（Ｃ）、または、種々の無置換またはメチルホスホネート置換オリゴ
ヌクレオチドを投与したマウスにおける脾臓肥大を示した図である。下線を付し
たヌクレオシドは、３’位にメチルホスホネート結合を有する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA05 GA11 HA19 4C057 MM01 4C084 AA13 NA14 ZB09 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 NA14 NA20 ZB09

Claims (60)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を低減する方
    法であって、該オリゴヌクレオチド中のＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の
    位置に、３’置換ヌクレオシドを導入することを含む、前記方法。
  2. 【請求項２】 遺伝子または遺伝子転写物に相補的なオリゴヌクレオチドを
    作製するために使用される、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 オリゴヌクレオチドがアンチセンス活性を有する、請求項２
    に記載の方法。
  4. 【請求項４】 オリゴヌクレオチド中に存在する各ＣｐＧジヌクレオチドに
    つき１個のみの３’置換ヌクレオシドがオリゴヌクレオチド中に導入されている
    、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 オリゴヌクレオチド中に１個のみの３’置換ヌクレオシドが
    導入されている、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオ
    チドであって、該オリゴヌクレオチドがＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の
    位置に、３’置換ヌクレオシドを含む、前記オリゴヌクレオチド。
  7. 【請求項７】 オリゴヌクレオチドが約１２〜約５０ヌクレオチドの長さで
    ある、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
  8. 【請求項８】 オリゴヌクレオチドが約１７〜約３５ヌクレオチドの長さで
    ある、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
  9. 【請求項９】 オリゴヌクレオチドが遺伝子または遺伝子転写物と相補的で
    ある、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
  10. 【請求項１０】 オリゴヌクレオチドがアンチセンス活性を有する、請求項
    ９に記載のオリゴヌクレオチド。
  11. 【請求項１１】 オリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドに存在する
    各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの３’置換ヌクレオシドを有する、請求
    項６に記載のオリゴヌクレオチド。
  12. 【請求項１２】 オリゴヌクレオチドが１個のみの３’置換ヌクレオシドを
    有する、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
  13. 【請求項１３】 哺乳類においてアンチセンス特異的な遺伝子発現の低減を
    得る方法であって、該方法が、低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリ
    ゴヌクレオチドを哺乳類に投与することを含み、ここで、該オリゴヌクレオチド
    が、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に３’置換ヌクレオシドを含む
    、前記方法。
  14. 【請求項１４】 オリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドに存在する
    各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの３’置換ヌクレオシドを有する、請求
    項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
  15. 【請求項１５】 オリゴヌクレオチドが１個のみの３’置換ヌクレオシドを
    有する、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
  16. 【請求項１６】 ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を増大させ
    る方法であって、該方法が、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに
    対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番
    目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド
    、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレ
    オチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３
    ’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌク
    レオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧ
    ジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに
    対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番
    目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド
    、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの
    組合せからなる群から選択される位置に３’置換ヌクレオシドを導入することを
    含む、前記方法。
  17. 【請求項１７】 オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドで
    はない、請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオ
    チドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側
    ３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオ
    シド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌ
    クレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対し
    て３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目の
    ヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、Ｃ
    ｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチ
    ドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側
    ５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオ
    シド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌ
    クレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからな
    る群から選択される位置に３’置換ヌクレオシドを含む、前記オリゴヌクレオチ
    ド。
  19. 【請求項１９】 オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドで
    はない、請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 オリゴヌクレオチドが約６〜約５０ヌクレオチドの長さで
    ある、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド。
  21. 【請求項２１】 オリゴヌクレオチドが、安定性を改善するために修飾され
    たヌクレオチド間結合または修飾された糖をさらに含む、請求項１８に記載のオ
    リゴヌクレオチド。
  22. 【請求項２２】 哺乳類に免疫応答を誘導する方法であって、該方法が、Ｃ
    ｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチ
    ドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側
    ５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオ
    シド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌ
    クレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対し
    て３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目の
    ヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、Ｃ
    ｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチ
    ドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側
    ６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオ
    シド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に３’置換ヌクレオ
    シドを含むオリゴヌクレオチドを、哺乳類に投与することを含む、前記方法。
  23. 【請求項２３】 オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドで
    はない、請求項２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を増大させ
    る方法であって、該方法が、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに
    対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番
    目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド
    、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレ
    オチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３
    ’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌク
    レオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧ
    ジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに
    対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番
    目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド
    、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの
    組合せからなる群から選択される位置に荷電されていないヌクレオシド間結合を
    導入することを含む、前記方法。
  25. 【請求項２５】 荷電されていないヌクレオシド間結合がアルキルホスホネ
    ートである、請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 アルキルホスホネートがメチルホスホネートである、請求
    項２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドで
    はない、請求項２４に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオ
    チドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側
    ３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオ
    シド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌ
    クレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対し
    て３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目の
    ヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、Ｃ
    ｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチ
    ドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側
    ５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオ
    シド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌ
    クレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからな
    る群から選択される位置に荷電されていないヌクレオシド間結合を含む、前記オ
    リゴヌクレオチド。
  29. 【請求項２９】 荷電されていないヌクレオシド間結合がアルキルホスホネ
    ートである、請求項２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 アルキルホスホネートがメチルホスホネートである、請求
    項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドで
    はない、請求項２８に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 オリゴヌクレオチドが約６〜約５０ヌクレオチドの長さで
    ある、請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。
  33. 【請求項３３】 オリゴヌクレオチドが、安定性を改善するために、修飾さ
    れたヌクレオチド間結合または修飾された糖をさらに含む、請求項２８に記載の
    オリゴヌクレオチド。
  34. 【請求項３４】 哺乳類に免疫応答を誘導する方法であって、該方法が、Ｃ
    ｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチ
    ドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側
    ５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオ
    シド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌ
    クレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対し
    て３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目の
    ヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、Ｃ
    ｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチ
    ドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側
    ６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオ
    シド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に荷電されていない
    ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを、哺乳類に投与することを含む
    、前記方法。
  35. 【請求項３５】 荷電されていないヌクレオシド間結合がアルキルホスホネ
    ートである、請求項３４に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 アルキルホスホネートがメチルホスホネートである、請求
    項３５に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドで
    はない、請求項３４に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を低減する
    方法であって、該方法が、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドの５
    ’側の近傍の位置に２’−５’ヌクレオシド間結合を導入することを含む、前記
    方法。
  39. 【請求項３９】 遺伝子または遺伝子転写物に相補的なオリゴヌクレオチド
    を作製するために使用される、請求項３８に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 オリゴヌクレオチドがアンチセンス活性を有する、請求項
    ３９に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 オリゴヌクレオチドに存在する各ＣｐＧジヌクレオチドに
    つき１個のみの３’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチド中に導入されてい
    る、請求項３８に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 オリゴヌクレオチド中に１個のみの２’−５’ヌクレオシ
    ド間結合が導入されている、請求項３８に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレ
    オチドであって、該オリゴヌクレオチドがＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍
    の位置に２’−５’ヌクレオシド間結合を含む、前記オリゴヌクレオチド。
  44. 【請求項４４】 オリゴヌクレオチドが約１２〜約５０ヌクレオチドの長さ
    である、請求項４３に記載のオリゴヌクレオチド。
  45. 【請求項４５】 オリゴヌクレオチドが約１７〜約３５ヌクレオチドの長さ
    である、請求項４４に記載のオリゴヌクレオチド。
  46. 【請求項４６】 オリゴヌクレオチドが遺伝子または遺伝子転写物と相補的
    である、請求項４３に記載のオリゴヌクレオチド。
  47. 【請求項４７】 オリゴヌクレオチドがアンチセンス活性を有する、請求項
    ４６に記載のオリゴヌクレオチド。
  48. 【請求項４８】 オリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドに存在する
    各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの２’−５’ヌクレオシド間結合を有す
    る、請求項４３に記載のオリゴヌクレオチド。
  49. 【請求項４９】 オリゴヌクレオチドが１個のみの３’置換ヌクレオシドを
    有する、請求項４３に記載のオリゴヌクレオチド。
  50. 【請求項５０】 哺乳類においてアンチセンス特異的な遺伝子発現の低減を
    得る方法であって、該方法が、低減された免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリ
    ゴヌクレオチドを哺乳類に投与することを含み、ここで、該オリゴヌクレオチド
    が、ＣｐＧジヌクレオチドの５’側の近傍の位置に２’−５’ヌクレオシド間結
    合を含む、前記方法。
  51. 【請求項５１】 オリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドに存在する
    各ＣｐＧジヌクレオチドにつき１個のみの２’−５’ヌクレオシド間結合を有す
    る、請求項５０に記載のオリゴヌクレオチド。
  52. 【請求項５２】 オリゴヌクレオチドが１個のみの２’−５’ヌクレオシド
    間結合を有する、請求項５０に記載のオリゴヌクレオチド。
  53. 【請求項５３】 ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの免疫刺激効果を増大させ
    る方法であって、該方法が、オリゴヌクレオチド中の、ＣｐＧジヌクレオチドに
    対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番
    目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド
    、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレ
    オチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３
    ’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌク
    レオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧ
    ジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに
    対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番
    目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド
    、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの
    組合せからなる群から選択される位置に２’−５’ヌクレオシド間結合を導入す
    ることを含む、前記方法。
  54. 【請求項５４】 ２’−５’ヌクレオシド間結合がアルキルホスホネートで
    ある、請求項５３に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 増大した免疫刺激効果を有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオ
    チドであって、該オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側
    ３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側４番目のヌクレオ
    シド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌ
    クレオチドに対して５’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対し
    て３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側３番目の
    ヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、Ｃ
    ｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチ
    ドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側
    ５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオ
    シド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌ
    クレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、およびそれらの組合せからな
    る群から選択される位置に２’−５’ヌクレオシド間結合を含む、前記オリゴヌ
    クレオチド。
  56. 【請求項５６】 オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドで
    はない、請求項５５に記載の方法。
  57. 【請求項５７】 オリゴヌクレオチドが約６〜約５０ヌクレオチドの長さで
    ある、請求項５５に記載のオリゴヌクレオチド。
  58. 【請求項５８】 オリゴヌクレオチドが、安定性を改善するために、修飾さ
    れたヌクレオチド間結合または修飾された糖をさらに含む、請求項５５に記載の
    オリゴヌクレオチド。
  59. 【請求項５９】 哺乳類に免疫応答を誘導する方法であって、該方法が、Ｃ
    ｐＧジヌクレオチドに対して５’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチ
    ドに対して５’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側
    ５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して５’側６番目のヌクレオ
    シド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側の２つのヌクレオシド、ＣｐＧジヌ
    クレオチドに対して３’側３番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対し
    て３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目の
    ヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオシド、Ｃ
    ｐＧジヌクレオチドに対して３’側５番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチ
    ドに対して３’側４番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側
    ６番目のヌクレオシド、ＣｐＧジヌクレオチドに対して３’側４番目のヌクレオ
    シド、およびそれらの組合せからなる群から選択される位置に２’−５’ヌクレ
    オシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを、哺乳類に投与することを含む、前記
    方法。
  60. 【請求項６０】 オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドで
    はない、請求項５９に記載の方法。
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