JP2003520605A - 84p2a9:前立腺癌において高度に発現される前立腺および精巣特異的タンパク質 - Google Patents
84p2a9:前立腺癌において高度に発現される前立腺および精巣特異的タンパク質Info
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Abstract
Description
8,560の利益を主張し、この内容全体は、本明細書中に参考として援用され
る。
質(84P2A9と称される)に関し、そして84P2A9を発現する種々の癌
、特に前立腺癌の管理において有用な診断および治療の方法および組成物に関す
る。
の主なヒトの死亡原因である。全世界的に、数百万の人々が、毎年癌により死亡
している。米国単独では、癌は毎年50万人をはるかに超える人々の死亡原因で
あり、毎年140万あまりの新たな症例が診断されている。心臓疾患での死亡は
、有意に減少している一方で、癌に起因する死亡は、一般に増加の傾向にある。
来世紀の初期には、癌は死亡の主原因になると予測されている。
。特に、肺、前立腺、乳房、結腸、膵臓、および卵巣の癌腫は、主要な癌の死亡
原因の代表である。これらおよび事実上全ての他の癌腫は、共通する致死的特徴
を共有している。ごくわずかな例外はあるが、癌腫が原因の転移性疾患は、致命
的である。さらに、初期の段階ではその原発性癌を生き延びた癌患者についてす
ら、その生活が劇的に変化したという共通の経験が示されている。多くの癌患者
は、再発または処置の失敗についての可能性を承知しているために駆り立てられ
る、強い不安を経験している。多くの癌患者は、処置後に肉体的衰弱を経験して
いる。さらに、多くの癌患者は、再発を経験している。
メリカおよび北欧では、はるかに、最も一般的な男性の癌であり、そして男性に
おける癌による死亡の2番目の主原因である。米国単独では、肺癌のみに次いで
、40,000人をはるかに超える男性がこの疾患で毎年死亡している。これら
の数字の規模にもかかわらず、転移性の前立腺癌に対する有効な処置は未だ存在
しない。外科的前立腺切除、放射線療法、ホルモン除去(hormone ab
lation)療法、外科的去勢および化学療法は、主要な処置様式であり続け
ている。不運にも、これらの処置は、多くに対して有効でなく、かつしばしば、
所望されない結果を付随する。
腫瘍マーカーが存在しないことは、依然としてこの疾患の診断および管理におけ
る大きな限界を残している。血清の前立腺特異抗原(PSA)アッセイは非常に
有用なツールであるが、その特異性および一般的利用性は、いくつかの重要な点
が欠如していると広く考えられている。
マウスにおける疾患の異なるステージを再現し得る前立腺癌異種移植片の生成に
より改善されてきた。LAPC(Los Angeles Prostate C ancer)異種移植片は、重症複合型免疫不全(SCID)マウスにおける
経過を生き延び、かつアンドロゲン依存性からアンドロゲン非依存性への移行を
模倣する能力を示した前立腺癌異種移植片である(Kleinら、1997、N
at.Med.3:402)。より近年同定された前立腺癌マーカーとしては、
PCTA−1(Suら、1996、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 93:7252)、前立腺特異膜(PSM)抗原(Pintoら、Cli
n Cancer Res 1996 Sep;2(9):1445−51)、
STEAP(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999 De
c 7;96(25):14523−8)および前立腺幹細胞抗原(PSCA)
(Reiterら、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
95:1735)。
は、前立腺癌を診断し、そしてこれを処置する取り組みを促進したが、診断およ
び治療をさらに改善するために、前立腺癌および関連する癌に対するさらなるマ
ーカーおよび治療標的を同定する必要がある。
遺伝子に関する。この遺伝子は、前立腺、精巣、腎臓、脳、骨、皮膚、卵巣、乳
房、膵臓、結腸、リンパ球および肺の癌を含む複数の癌において過剰発現する。
正常な組織における84P2A9遺伝子発現のノーザンブロット発現分析は、成
体の組織における前立腺および精巣に関連した高度な発現パターンを示す。正常
な前立腺および前立腺腫瘍異種移植片における84P2A9発現の分析は、LA
PC−4およびLAPC−9前立腺腫瘍異種移植片において過剰発現を示す(L
APC−9において最も高い発現)。84P2A9のヌクレオチド(配列番号1
)配列およびアミノ酸(配列番号2)配列を、図2に示す。84P2A9アミノ
酸配列の位置は、dbESTデータベース中のESTにいくらかの相同性を示す
。84P2A9の、正常な成体組織におけるこの前立腺および精巣関連の発現プ
ロフィールは、前立腺腫瘍異種移植片において観察される過剰発現と共に、84
P2A9が、少なくともいくつかの癌において異常に過剰発現し、従って、癌(
例えば、前立腺、精巣、腎臓、脳、骨、皮膚、卵巣、乳房、膵臓、結腸、リンパ
球および肺の癌)のための有用な診断および/または治療の標的として作用する
ことを示す(例えば、図4〜8を参照のこと)。
しくは、84P2A9タンパク質および4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15またはそれ以上のアミノ酸のフラグメントをコードする
ポリヌクレオチド、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッドならびに関連
分子、84P2A9の遺伝子もしくはmRNA配列またはその一部分に相補的か
または少なくとも90%の相同性を有する、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチド、ならびに84P2A9の遺伝子、mRNAもしくは84P2A9をコ
ードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする、ポリヌクレオチドまたはオリ
ゴヌクレオチドを含む単離された形態における)のすべてもしくは一部分に対応
するか、または一部分に相補的なポリヌクレオチドを提供する。84P2A9を
コードするcDNAおよび遺伝子を単離するための手段もまた、提供する。84
P2A9遺伝子産物の発現のための、84P2A9ポリヌクレオチドを含む組換
えDNA分子、このような分子で形質転換した細胞または形質導入した細胞、な
らびに宿主ベクター系をまた、提供する。本発明はさらに、84P2A9タンパ
ク質およびそのポリペプチドフラグメントに結合する抗体(ポリクローナル抗体
およびモノクローナル抗体、マウスおよび他の哺乳動物の抗体、キメラ抗体、ヒ
ト化抗体および完全なヒト抗体、ならびに検出可能なマーカーで標識された抗体
を含む)を提供する。
チドおよび84P2A9タンパク質の存在および状態を検出するための方法、な
らびに84P2A9を発現する細胞を同定するための方法を提供する。本発明の
代表的な実施形態は、癌のような増殖を調節できないいくつかの形態を有するか
またはこのような形態を有することが疑われる組織サンプルまたは血液学的サン
プルにおける84P2A9遺伝子産物をモニターするための方法を提供する。
の種々の免疫原性組成物または治療組成物およびストラテジーを提供する。これ
らの組成物およびストラテジーとしては、84P2A9の転写、翻訳、プロセシ
ングまたは機能を阻害することを目的とした治療、ならびに癌ワクチンが挙げら
れる。
び他の科学技術用語または用語法は、本発明が属する分野の当業者によって一般
的に理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合において、一般
的に理解される意味を有する用語は、明確さおよび/または迅速な参照のために
本明細書中で定義され、そしてこのような定義の本明細書中への包含は、当該分
野において一般に理解されるものを制して実質的な相違を表すとは必ずしも解釈
されるべきではない。本明細書中に記載または参照される技術および手順の多く
は、一般に、従来の方法論(例えば、Sambrookら、Molecular
Cloning:A Laboratory Manual 第2版(198
9)Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s、Cold Spring Harbor,N.Y.に記載の広く使用される
分子クローニングの方法論のような)を使用して、当業者によって十分に理解さ
れ、そして一般的に用いられる。適切な場合、市販のキットおよび試薬の使用を
含む手順は、他に注記されない限り、一般に、製造業者によって規定されるプロ
トコルおよび/またはパラメーターに従って実行される。
た前立腺癌」、「進行した疾患」および「局所的に進行した疾患」とは、前立腺
被膜を通して伸長した前立腺癌を意味し、そして米国泌尿器学会(AUA)シス
テムの下でのステージC疾患、Whitmore−Jewettシステムの下で
のステージC1−C2疾患、およびTNM(腫瘍、節、転移)システムの下での
ステージT3−T4およびN+疾患を含むことが意味される。一般に、手術は、
局所的に進行した疾患を有する患者のためには推奨されず、そしてこれらの患者
は、臨床的に局在化している(器官に限定された)前立腺癌を有する患者と比較
して、実質的により好ましくない結果を有する。局所的に進行した疾患は、前立
腺の側縁を超える硬化の触診可能な証拠、または前立腺基部上の不均衡もしくは
硬化によって臨床的に同定される。局所的に進行した前立腺癌は、腫瘍が前立腺
被膜に侵入するかもしくは浸透するか、外科的な境界まで伸長するか、または精
嚢に侵入する場合、現在、徹底的な前立腺切除後に病理学的に診断される。
得るか、または慣用的なハイブリドーマ技術によって産生されるモノクローナル
抗体のような人工物であり得る。抗84P2A9抗体は、モノクローナル抗体お
よびポリクローナル抗体、ならびにこれらの抗体の抗原結合ドメインおよび/ま
たは1以上の相補性決定領域を含むフラグメントを含む。本明細書中で使用され
る場合、抗体フラグメントは、その標的に結合する免疫グロブリン分子の可変領
域(すなわち、抗原結合領域)の少なくとも一部として定義される。1つの実施
形態において、特に、単一の抗84P2A9抗体(アゴニスト、アンタゴニスト
および中和抗体を含む)、およびポリエピトープ(polyepitopic)
特異性を有する抗84P2A9抗体組成物を含む。本明細書中で使用される場合
、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団(すなわち、こ
の集団を含む抗体は、少量で存在する天然に存在する潜在的な変異を除いて、同
一である)から得られた抗体をいう。
かまたは妨げ、そして/または細胞の破壊を引き起こす物質をいう。この用語は
、放射性同位体(例えば、At211、I131、I125、Y90、Re18 6 、Re188、Sm153、Bi212、P32およびLuの放射性同位体)
、化学療法試薬、および毒素(例えば、低分子の毒素、あるいはフラグメントお
よび/またはその改変体を含む細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性
な毒素)を含むことが意図される。
用語「ハイブリダイズ」、「ハイブリダイズする(hybridizing)」
、「ハイブリダイズする(hybridizes)」などは、従来のハイブリダ
イゼーション条件、好ましくは、例えば、50% ホルムアミド/6×SSC/
0.1% SDS/100μg/ml ssDNA中でのハイブリダイゼーショ
ンをいうことが意味される。ここで、ハイブリダイゼーションのための温度は、
37℃より高い温度であり、そして0.1×SSC/0.1% SDS中での洗
浄のための温度は、55℃より高い。
の遺伝子に、対応するかまたは相補的である混入物ポリヌクレオチド、あるいは
84P2A9遺伝子産物もしくはそのフラグメント以外のポリペプチドをコード
する混入物ポリヌクレオチドから実質的に分離される場合、「単離された」と言
われる。当業者は、容易に核酸単離手順を利用して、単離された84P2A9ポ
リヌクレオチドを獲得し得る。
用して、84P2A9タンパク質に通常関連する細胞成分からこの84P2A9
タンパク質を取り出した場合に、タンパク質が「単離された」といわれる。当業
者は、標準的な精製方法を使用して、単離された84P2A9タンパク質を容易
に獲得し得る。
、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよびヒトを含む、哺乳動物として分類される任意の
哺乳動物をいう。本発明の1つの好ましい実施形態において、この哺乳動物は、
マウスである。本発明の別の好ましい実施形態において、この哺乳動物は、ヒト
である。
、局所的なリンパ節、または離れた部位に拡がった前立腺癌を意味し、そしてA
UAシステム下でのステージD疾患、およびTNMシステム下でのステージTx
NxM+を包含することが意味される。局所的に進行した前立腺癌の場合、手術
は一般的には転移性疾患を有する患者には指示されず、そしてホルモン(アンド
ロゲン除去)治療が好ましい治療様式である。転移性前立腺癌を有する患者は、
最終的に、処置の開始から12〜18ヶ月以内にアンドロゲン抵抗性の状態を発
症し、そしてこれらの患者のおよそ半数がアンドロゲン抵抗性状態の発症の後6
ヶ月以内に死亡する。前立腺癌転移についての最も一般的な部位は骨である。前
立腺癌の骨転移は、しばしば特徴的に、溶骨性ではなく骨芽細胞性である(すな
わち、正味の骨の形成を生じる)。骨への転移は、脊椎において最も頻繁に見出
され、大腿骨、骨盤、胸郭、頭蓋、および上腕骨が続く。転移のための他の一般
的な部位としては、リンパ節、肺、肝臓、および脳が挙げられる。転移性の前立
腺癌は、代表的には、切開または腹腔鏡的な骨盤(pclvic)のリンパ節切
除術、全身の放射性核種スキャン、骨格のラジオグラフィー、および/あるいは
骨病変生検によって診断される。
lar Cloning:A Laboratory Manual,New
York:Cold Spring Harbor Press,1989によ
って記載され、同定されるが記載されたものに限定されず、そして洗浄溶液およ
び上記の条件よりも低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件(例
えば、温度、イオン強度、および%SDS)の使用を含む。中程度にストリンジ
ェントな条件の例は、以下である:20%ホルムアミド、5×SSC(150m
M NaCl、15mM クエン酸三ナトリウム)、50mM リン酸ナトリウ
ム(pH7.6)、5×デンハルト溶液、10% 硫酸デキストラン、および2
0mg/mL変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中における37℃での一晩のイ
ンキュベーションであり、次いで約37℃〜50℃で1×SSC中におけるフィ
ルターの洗浄である。当業者は、プローブ長などのような因子を適応させるのに
必要なように温度、イオン強度などを調整する方法を認識する。
フにおけるような「モチーフ」は、特定の機能または改変(例えば、リン酸化さ
れるか、グリコシル化されるか、またはアミド化される)に関連する、タンパク
質の一次配列の一部を形成するアミノ酸の任意のセット(これは連続的であるか
、または一般的に不変または保存された特定の位置に配置され得る)を言う。
塩基または10塩基対の長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味し、リボヌク
レオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれかまたはいずれかの型のヌクレ
オチドの改変形態であり、そして一本鎖および二本鎖の形態のDNAおよび/ま
たはRNAを含むことを意味する。当該分野において、この用語は、しばしば「
オリゴヌクレオチド」と相互に使用される。本明細書中で議論される場合、ポリ
ヌクレオチドは、本明細書中で開示されたヌクレオチド配列を含み得、ここでチ
ミン(T)(例えば、配列番号1に示されるような)はまたウラシル(U)であ
り得る。この説明は、DNAおよびRNAの化学的構造間の違い、特に4つの主
な塩基のうち1つがRNAでは、チミンの代わりにウラシルであるという知見に
関連する。
6、7または8アミノ酸のポリマーを意味する。本明細書を通して、アミノ酸に
ついての標準的な3文字表記または1文字表記が使用される。当該分野において
、この用語は、しばしば「ペプチド」と相互に使用される。
易に決定可能であり、そして一般的には、プローブの長さ、洗浄温度、および塩
濃度に依存する経験による計算である。一般に、長いプローブほど、適切なアニ
ーリングのためにより高い温度を必要とし、一方、短いプローブほど、より低い
温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般に、融解温度より下の環境
において相補鎖が存在する場合の、変性した核酸配列が再アニーリングする能力
に依存する。プローブと、ハイブリダイズ可能な配列との間の所望される相同性
の程度が高いほど、使用され得る相対的な温度が高くなる。結果として、より高
い相対的な温度が、反応条件をよりストリンジェントにする傾向があるが、より
低い温度ではそのようなことがより少ない、ということになる。ハイブリダイゼ
ーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Au
subelら、Current Protocols in Molecula
r Biology、Wiley,Interscience Publish
ers,(1995)を参照のこと。
リンジェンシー条件」は、以下の条件によって同定され得るが、これらに限定さ
れない:(1)洗浄のために低いイオン強度および高い温度を使用する条件(例
えば、0.015M 塩化ナトリウム/0.0015M クエン酸ナトリウム/
0.1% ドデシル硫酸ナトリウム、50℃);(2)ハイブリダイゼーション
の間に変性剤(例えば、ホルムアミド)を使用する条件(例えば、50% (v
/v)ホルムアミドおよび0.1% ウシ血清アルブミン/0.1% Fico
l/0.1% ポリビニルピロリドン/50mM リン酸ナトリウム緩衝液(p
H 6.5)および750mM 塩化ナトリウム、75mM クエン酸ナトリウ
ム、42℃);または(3)50% ホルムアミド、5×SSC(0.75M
NaCl、0.075M クエン酸ナトリウム)、50mM リン酸ナトリウム
(pH 6.8)、0.1% ピロリン酸ナトリウム、5×Denhardt’
s溶液、超音波処理したサケ精子DNA(50μg/ml)、0.1% SDS
、および10% 硫酸デキストラン、42℃、さらに以下の洗浄工程、42℃に
おいて0.2×SSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)および50%ホ
ルムアミド、55℃、続いて、高ストリンジェンシー洗浄(EDTAを含む0.
1×SSCからなる、55℃)を使用する条件。
を含む細胞を有する動物であり、その導入遺伝子は、その動物に、または出生前
(例えば、胚段階)でその動物の祖先に導入される。「導入遺伝子」は、細胞の
ゲノムに組み込まれるDNAであり、トランスジェニック動物は、その細胞から
発生する。
細書中で具体的に記載される84P2A9遺伝子およびタンパク質、ならびに他
の84P2A9にコードされたタンパク質またはペプチドに対応する遺伝子およ
びタンパク質、および前述の構造的に類似の改変体を含むことが意味される。こ
のような他の84P2A9ペプチドおよび改変体は、一般的に、84P2A9コ
ード配列に高度に相同なコード配列を有し、そして好ましくは、少なくとも約5
0%のアミノ酸相同性(BLAST基準を使用して)、そして好ましくは、50
%、60%、70%、80%、90%以上の核酸相同性、そして少なくとも約6
0%のアミノ酸相同性を共有し(BLAST基準を使用して)、より好ましくは
、70%以上の相同性を共有する(BLAST基準を使用して)。
P2A9関連タンパク質、ならびに対立遺伝子、保存的置換改変体およびホモロ
グを含み、これらは、本明細書中で概略される方法または当該分野において容易
に利用可能な方法に従う過度の実験なしに単離/生成および特徴付けされ得る。
異なる84P2A9タンパク質またはそれらのフラグメントの一部を合わせる融
合タンパク質、ならびに84P2A9タンパク質および異種ポリペプチドの融合
タンパク質もまた含まれる。このような84P2A9タンパク質は、まとめて8
4P2A9関連タンパク質、本発明のタンパク質、または84P2A9として言
われる。本明細書中で使用される場合、用語「84P2A9関連ポリペプチド」
は、ポリペプチドフラグメントまたは4、5、6、7、8、9、10、11、1
2、13、14、15以上のアミノ酸の84P2A9タンパク質配列を言う。
D異種移植片を用いる実験は、アンドロゲン依存性(AD)前立腺癌からアンド
ロゲン非依存性(AI)癌への進行に関連する遺伝子の同定をもたらした。簡単
には、LAPC−4 AD異種移植片を有するマウスを、腫瘍の大きさが直径1
cmに達した時に去勢した。腫瘍の大きさが退行し、そして一時的にアンドロゲ
ン依存性タンパク質PSA産生が停止した。去勢後7〜15日で、PSAレベル
は、マウス血中において再び検出可能であった。最終的に、このような腫瘍は、
AI表現型を発現し、そして去勢マウスにおいて再び増殖を開始する。去勢後、
異なる時点で腫瘍を収集し、アンドロゲン非依存性への移行の間に開始および停
止される遺伝子を同定した。
e)ハイブリダイゼーション(SSH)(Diatchenkoら、1996、
PNAS 93:6025)を使用して、種々のアンドロゲン依存性およびアン
ドロゲン非依存性LAPC異種移植片由来のcDNAを比較することによって新
規な遺伝子(例えば、前立腺癌において過剰発現される遺伝子)を同定した。こ
のストラテジーは、組織および癌特異的発現を示す新規な遺伝子の同定をもたら
した。これらの遺伝子の1つ(84P2A9と称される)が、去勢3日後のLA
PC−4 AD腫瘍に由来するcDNAを、インタクトな雄で増殖したLAPC
−4 AD腫瘍に由来するcDNAから差し引いた、差し引き(サブトラクショ
ン)から同定された。約425pbのSSH DNA配列(図1)は、新規であ
り、そしてdbESTデータベースにおける発現配列タグ(EST)にのみ相同
性を示す。
コードする。84P2A9の最初の特徴付けは、それが前立腺癌、精巣癌、腎臓
癌、脳の癌、骨の癌、皮膚癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌、リンパ球の癌お
よび肺癌を含む複数の癌において異常に発現されることを示す。前立腺癌におけ
る84P2A9の発現は、このタンパク質が、腫瘍進行において機能的な役割を
有する証拠を提供する。転写因子としての84P2A9機能が、腫瘍形成に関連
する遺伝子の活性化または腫瘍形成をブロックする遺伝子の抑制に関連する可能
性がある。
質は、多くの分析的アプローチを使用して特徴付されている。例えば、ヌクレオ
チドコードおよびアミノ酸配列の分析を、潜在的に関連する分子、および認識可
能な構造ドメイン、位相的特徴、ならびに84P2A9 mRNAおよびタンパ
ク質構造内の他のエレメントを同定するために行った。84P2A9 mRNA
発現のノザンブロッド分析を、84P2A9メッセージを発現する正常組織およ
び癌性組織の範囲を確立するために行った。
番号1)を、LAPC−4 AD cDNAライブラリー(Lambda ZA
P Express,Stratagene)からクローン化した(図2)。こ
のcDNAは、504アミノ酸(配列番号2)のオープンリーディングフレーム
(ORF)をコードする。配列分析は、6つの潜在的な核局在化シグナルの存在
を明らかにし、そしてPSORTプログラム(http://psort.ni
bb.ac.jp:8800/form.html)を使用して核にあることが
予想された。このタンパク質配列は、ヒト脳タンパク質KIAA1152(配列
番号5)と幾分の相同性(337アミノ酸領域にわたって39.5%の同一性)
を有し、LUCA15腫瘍サプレッサータンパク質(配列番号6)に相同である
ドメインを含む(42アミノ酸領域にわたって64.3%の同一性)(GenB
ank寄託番号P52756)(図3)。
が、前立腺癌、精巣癌、腎臓癌、脳の癌、骨の癌、皮膚癌、卵巣癌、乳癌、膵臓
癌、結腸癌、リンパ球の癌および肺癌を含む特定の癌においても発現される(例
えば、図4〜8を参照のこと)。ヒト前立腺腫瘍の異種移植片は、高レベルの8
4P2A9を発現する重度の転移性前立腺癌を有する患者に元々由来した(図4
)。
リペプチド、反応性細胞傷害性T細胞(CTL)、ヘルパーT細胞(HTL)お
よび抗ポリペプチド抗体が、例えば、癌(特に前立腺癌)における調節されない
細胞増殖に関連する状態の試験に関連する周知の診断的アッセイに使用される、
遺伝子のファミリーに見出される特性と類似である特定の特性を示す(例えば、
実施例3に例として記載されるような、その非常に特異的な組織発現パターンお
よび前立腺癌におけるその過剰発現の両方を参照のこと)。このクラスの最も知
られたメンバーは、PSA(何年もの間前立腺癌の存在を同定およびモニターす
るために医者によって使用されてきた典型的なマーカー)である(例えば、Me
rrillら、J.Urol.163(2):503〜5120(2000);
Polascikら、J.Urol.Aug;162(2):293〜306(
1999)およびFortierら、J.Nat.Cancer Inst.9
1(19):1635〜1640(1999)を参照のこと)。p53およびK
−rasを含む種々の他の診断マーカーもまた、この状況において使用される(
例えば、Tulchinskyら、Int J Mol Med 1999 J
ul;4(1):99〜102およびMinimotoら、Cancer De
tect Prev 2000;24(1):1〜12)。従って、84P2A
9ポリヌクレオチドおよびポリペプチド(ならびにこれらの分子の存在を同定す
る使用される84P2A9ポリヌクレオチドプローブおよび抗84P2A9抗体
を)およびこれらの特性のこの開示は、当業者が、例えば、癌に関連した状態の
検査に関連した種々の診断的アッセイにおいて使用される方法と類似である方法
においてこれらの分子を使用することを可能にする。
抗体を使用する診断方法の代表的な実施形態は、PSAポリヌクレオチド、ポリ
ペプチドおよび抗体を使用する十分に確立された診断アッセイ由来のこれらの方
法と類似する。例えば、PSA過剰発現および前立腺癌の転移をモニターする方
法においてPSA mRNAの存在および/またはレベルを観察するためにPS
Aヌクレオチドを、プローブ(例えば、ノザン分析において(例えば、Shar
iefら、Biochem.Mol.Biol.Int.33(3):567〜
74(1994)を参照のこと))およびプライマー(例えば、PCR分析にお
いて(例えば、Okegawaら、J.Urol.163(4):1189〜1
190(2000)を参照のこと))として使用されるように、本明細書中に記
載された84P2A9ポリヌクレオチドは、84P2A9の過剰発現またはこの
遺伝子を発現する前立腺および他の癌の転移を検出するために同様に使用され得
る。あるいは、PSAポリペプチドを使用してPSAに特異的な抗体を生成し、
次にこの抗体を、PSAタンパク質の過剰発現(例えば、Stephanら、U
rology 55(4):560〜3(2000)を参照のこと)または前立
腺細胞の転移(例えば、Alanenら、Pathol.Res.Pract.
192(3):233〜7(1996)を参照のこと)をモニターする方法にお
いてPSAタンパク質の存在および/またはレベルを観察するために使用し得る
ように、本明細書中で記載された84P2A9ポリペプチドは、84P2A9過
剰発現またはこの遺伝子を発現する前立腺細胞および他の癌の細胞の転移の検出
に使用するための抗体を生成するために使用され得る。
異なる領域(例えば、リンパ節)への癌細胞の移動に関係するので、84P2A
9ポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドを発現する細胞の存在について
生物学的サンプルを試験するアッセイが、転移の証拠を提供するために使用され
得る。例えば、84P2A9発現細胞を通常含まない組織(リンパ節)由来の生
物学的サンプルが、LAPC4およびLAPC9(それぞれ、リンパ節および骨
転移から単離された異種移植片)に見られる84P2A9発現のような84P2
A9発現細胞を含むことが見出される場合、この発見は、転移を示す。
えば、通常84P2A9を発現しないかまたは異なるレベルで84P2A9を発
現する生物学的サンプル中の細胞が、84P2A9を発現するかまたは84P2
A9の増加した発現を有することが見出された場合に、癌の証拠を提供するため
に使用され得る(例えば、図4〜10に示される、腎臓、肺および結腸癌の細胞
ならびに患者サンプルなどにおける84P2A9の発現を参照のこと)。このよ
うなアッセイにおいて、当業者は、生物学的サンプルを、第二の組織制限マーカ
ー(84P2A9に加えて)(例えば、PSA、PSCAなど)の存在について
試験することによって転移の補足的な証拠を生成することをさらに望み得る(例
えば、Alanenら、Pathol.Res.Pract.192(3):2
33−237(1996)を参照のこと)。
Aをモニターする方法における使用のために当業者によって使用されるように、
84P2A9ポリヌクレオチドフラグメントおよびポリヌクレチド改変体が、類
似の様式で使用される。特に、PSAをモニターする方法において使用される代
表的なPSAポリヌクレオチドは、PSA cDNA配列のフラグメントからな
るプローブまたはプライマーである。これを例示すると、PSAポリヌクレオチ
ドをPCR増幅するために使用されるプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応にお
いて機能するように全PSA配列未満を含まなくてはならない。このようなPC
R反応の状況において、当業者は、一般に、目的のポリヌクレオチドの異なる部
分を増幅するためにかまたは増幅反応を最適化するためにプライマーとして使用
され得る、種々の異なるポリヌクレオチドフラグメントを作製する(例えば、C
aetono−Anolles,G.Biotechniques 25(3)
:472−476,478−480(1998);Robertsonら,Me
thods Mol.Biol.98:121−154(1998)を参照のこ
と)。このようなフラグメントの使用のさらなる例示が実施例3に提供され、こ
こで、84P2A9ポリヌクレオチドフラグメントが、癌細胞における84P2
A9 mRNAの過剰発現を示すためのプローブとして使用される。さらに、医
療従事者によるそれらの使用を容易にするために、改変体ポリヌクレオチド配列
は、代表的に、PCRおよびノーザン分析における対応するmRNAについての
プライマーおよびプローブとして使用される(例えば、Sawaiら,Feta
l Diagn.Ther.Nov−Dec;11(6):407−13および
Current Protocols In Molecular Biolo
gy,Volume 2,Unit 2,Frederick M.Ausub
ulら,編,1995を参照のこと)。ポリヌクレオチドフラグメントおよび改
変体は、代表的に、それらが、高いストレンジェンシーの条件下で、標的ポリヌ
クレオチド配列(例えば、配列番号1に示される84P2A9ポリヌクレオチド
)に結合し得る共通の性質および特徴を有する限り、この状況において有用であ
る。
モニターする方法における使用のために当業者によって使用されるように、84
P2A9ポリペプチドフラグメントおよびポリペプチド改変体が、類似の様式で
使用され得る。特に、PSAをモニターする方法において使用される代表的なP
SAポリペプチドは、PSAタンパク質に特異的に結合する抗体またはT細胞に
よって認識され得る抗体エピトープを含むPSAタンパク質のフラグメントであ
る。ポリペプチドフラグメントまたはポリペプチド改変体を使用して抗体(例え
ば、抗PSA抗体またはT細胞)を生成するこの実施は、代表的に、当業者によ
って使用されている融合タンパク質のような広範な種々の系と共に当該分野にあ
る(例えば、Current Protocols In Molecular
Biology,Volume 2,Unit 16,Frederick
M.Ausubulら,編,1995を参照のこと)。この状況において、目的
のタンパク質の各エピトープは、抗体またはT細胞が反応性である構造を提供す
るように機能する。代表的に、当業者は、目的のポリペプチドの異なる部分に特
異的な抗体を生成するために使用され得る種々の異なるポリペプチドフラグメン
トを一般に生成する(例えば、米国特許第5,840,501号および米国特許
第5,939,533号を参照のこと)。例えば、本明細書中に記載されるかま
たは当該分野で利用可能な84P2A9生物学的モチーフの1つを含むポリペプ
チドを利用することが、好ましくあり得る。ポリペプチドフラグメントおよび改
変体またはアナログは、代表的に、これらが標的ポリペプチド配列(例えば、配
列番号2に示される84P2A9ポリペプチド)に特異的な抗体またはT細胞を
生成し得るエピトープを含む限り、この状況において有用である。
チド(ならびに、これらの分子の存在を同定するために使用される84P2A9
ポリヌクレオチドプローブおよび抗84P2A9抗体またはT細胞)は、それら
を前立腺の癌を診断する際に有用にする特定の特性を示す。前立腺癌のような、
本明細書中に記載の特定の疾患状態を存在または発症を評価するために、84P
2A9遺伝子産物の存在を測定する診断アッセイは、予防的基準についての患者
の同定またはさらなるモニタリングのために有用であり、このことは、PSAを
用いて首尾良くなされている。さらに、これらの物質は、例えば、前立腺起源の
転移の明確な診断が、PSAのみの試験に基づいてなされ得ない状況における、
PSAに対して類似または相補的特性を有する分子についての当該分野での必要
性を満足する(例えば、Alanenら、Pathol.Res.Pract.
192(3):233−237(1996))。その結果、84P2A9ポリヌ
クレオチドおよびポリペプチド(ならびに、これらの分子の存在を同定するため
に使用される84P2A9ポリヌクレオチドプローブおよび抗84P2A9抗体
)は、前立腺起源の転移を確認するために使用される。
2A9ポリヌクレオチドは、1q32.3におけるオンコジーン関連染色体異常
の同定におけるそれらの使用のような、多くの他の特異的な有用性を有する。さ
らに、診断アッセイにおけるそれらの使用に加えて、本明細書中に開示される8
4P2A6関連タンパク質およびポリヌクレオチドは、未知の起源の組織の法医
学的分析におけるそれらの使用のようなタンパク質の利用性を有する(Take
hama K Forensic Sci Int 1996 Jun 28;
80(1−2):63−9)。
配列のすべてもしくは一部分に対応するか、またはそのすべてもしくは一部分に
相補的な、ポリヌクレオチド(好ましくは、84P2A9タンパク質およびその
フラグメント、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッドならびに関連分子
をコードするポリヌクレオチド、84P2A9遺伝子もしくはmRNA配列また
はその一部分に相補的なポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ならびに
84P2A9遺伝子、mRNAもしくは84P2A9をコードするポリヌクレオ
チド(集合的に、「84P2A9ポリヌクレオチド」)にハイブリダイズするポ
リヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む単離形態における)を提供する
。
列を有する84P2A9ポリヌクレオチドである。84P2A9ポリヌクレオチ
ドは、配列番号1に示されるようなヒト84P2A9のヌクレオチド配列を有す
るポリヌクレオチド(ここで、Tはまた、Uであり得る);84P2A9タンパ
ク質のすべてまたは一部分をコードするポリヌクレオチド;前述のポリヌクレオ
チドに相補的な配列;あるいは前述のうちのいずれかのポリヌクレオチドフラグ
メントを含み得る。別の実施形態は、配列番号1に示されるような、ヌクレオチ
ド残基番号163〜ヌクレオチド残基番号1647の配列を有するか、または残
基番号718〜残基番号1390の配列を有するポリヌクレオチドを含み、ここ
で、Tはまた、Uであり得る。別の実施形態は、その配列が、American
Type Culture Collectionに、登録番号PTA−11
51として寄託されたプラスミドに含まれるcDNAによってコードされる、8
4P2A9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態は
、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号1に示される
ヒト84P2A9cDNAまたはそのポリヌクレオチドフラグメントにハイブリ
ダイズし得るポリヌクレオチドを含む。
A配列(およびこのような配列に相補的な配列)の特定の一部分をコードする8
4P2A9ポリヌクレオチド(例えば、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、またはそれ以上連続するアミノ酸のタンパク質および
そのフラグメントをコードするポリヌクレオチド)を含む。例えば、本明細書中
で開示される本発明の代表的な実施形態は、以下を含む:図2(配列番号2)に
示される84P2A9タンパク質のおよそアミノ酸位置1〜およそアミノ酸位置
10をコードするポリヌクレオチド、図2に示される84P2A9タンパク質の
およそアミノ酸10〜およそアミノ酸20をコードするポリヌクレオチド、図2
に示される84P2A9タンパク質のおよそアミノ酸20〜およそアミノ酸30
をコードするポリヌクレオチド、図2に示される84P2A9タンパク質のおよ
そアミノ酸30〜およそアミノ酸40をコードするポリヌクレオチド、図2に示
される84P2A9タンパク質のおよそアミノ酸40〜およそアミノ酸50をコ
ードするポリヌクレオチド、図2に示される84P2A9タンパク質のおよそア
ミノ酸50〜およそアミノ酸60をコードするポリヌクレオチド、図2に示され
る84P2A9タンパク質のおよそアミノ酸60〜およそアミノ酸70をコード
するポリヌクレオチド、図2に示される84P2A9タンパク質のおよそアミノ
酸70〜およそアミノ酸80をコードするポリヌクレオチド、図2に示される8
4P2A9タンパク質のおよそアミノ酸80〜およそアミノ酸90をコードする
ポリヌクレオチド、および図2に示される84P2A9タンパク質のおよそアミ
ノ酸90〜およそアミノ酸100をコードするポリヌクレオチドなど。このスキ
ームに従って、84P2A9タンパク質のアミノ酸100〜504のアミノ酸配
列の一部分をコードするポリヌクレオチド(少なくとも10個の核酸の)は、本
発明の代表的な実施形態である。
た意図される。例えば、図2に示される84P2A9タンパク質のおよそアミノ
酸1(または20、または30、または40など)〜およそアミノ酸20(また
は30、または40、または50など)をコードするポリヌクレオチドは、当該
分野に周知の種々の技術によって生成され得る。このようなポリヌクレオチドの
例示の実施形態は、図2に示されるような配列を有するヌクレオチド残基番号7
18からヌクレオチド残基番号1390のポリヌクレオチドからなる。
タンパク質配列内に含まれる、1つ以上の生物学的モチーフをコードする84P
2A9ポリヌクレオチドフラグメントを含む。一つの実施形態において、本発明
の代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、本明細書中で開示される1つ以上
の核局在化配列をコードし得る。別の実施形態において、本発明の代表的なポリ
ヌクレオチドフラグメントは、LUCA 15および/またはKIAA1152
および/またはNY−Lu−12肺癌抗原(AF 042857)に対する相同
性を示す、84P2A9の1つ以上の領域(これらは、ジンクフィンガーモチー
フおよびRNA結合モチーフを示す)をコードし得る(例えば、Gereら、C
ancer Res.58(5):1034−1041を参照のこと)。本発明
の別の実施形態において、代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、本明細書
中の84P2A9タンパク質およびポリペプチドを議論する主題において、より
詳細に開示されるような、以下の1つ以上をコードし得る:84P2A9 Nグ
リコシル化部位、cAMPおよびcCMP依存性タンパク質キナーゼリン酸化部
位、カゼインキナーゼIIリン酸化部位またはN−ミリストイル化部位およびア
ミド化部位。本発明のなお別の実施形態において、代表的なポリヌクレオチドフ
ラグメントは、1つ以上の84P2A9選択的スプライシング改変体(例えば、
図4に示されるような前立腺癌において過剰発現される4.5kB転写物を生成
するスプライス改変体)に独特である配列をコードし得る。
、染色体1q32.3に対するヒト84P2A9遺伝子マッピングによって、8
4P2A9タンパク質の異なる領域をコードするポリヌクレオチドを用いて、染
色体1バンドq32(種々の癌と関連して同定される)上の細胞発生異常が特徴
づけされ得る。詳細には、1q32における種々の染色体異常(転座および欠失
を含む)が、多数の異なる癌における頻繁な細胞発生異常として同定された(例
えば、Biecheら、Genes Chromasomes Cancer,
24(3):255〜263(1999);Gorunovaら、Genes
Chromosomes Cancer,26(4):312〜321(199
9);Reidら、Cancer Res.(22):5415〜5423(1
995)を参照のこと)。従って、84P2A9タンパク質の特定の領域をコー
ドするポリヌクレオチドは、新しいツールを提供し、このツールを用いて、以前
に可能であったよりも正確に、染色体1のこの領域における細胞発生異常の特異
的性質(悪性の表現型に寄与し得る)を描写し得る。この文脈では、これらのポ
リヌクレオチドは、よりわずかでかつ共通性が少ない染色体異常を同定するため
に、染色体スクリーニングの感度の増大に関して当該分野における必要性を満足
する(例えば、Evansら、Am.J.Obstet.Gynecol 17
1(4):1055〜1057(1994)を参照のこと)。
るので(図4)、これらのポリヌクレオチドは、癌性組織に対する正常な組織に
おける84P2A9遺伝子産物の状態を評価する方法において使用され得る。代
表的には、84P2A9タンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチド
を使用して、84P2A9遺伝子産物の特定の領域(核局在化シグナルを含むよ
うな領域)において、混乱状態(例えば、欠失、挿入、点変異、または変異(抗
原の消失を生じる)など)の存在を評価し得る。例示的なアッセイとしては、R
T−PCRアッセイ、ならびに一本鎖高次構造多型(SSCP)分析(例えば、
Marrogiら、J.Cutan.Pathol.26(8):369−37
8(1999)を参照のこと)の両方が挙げられ、これらの両方は、タンパク質
の特定の領域をコードするポリヌクレオチドを利用して、タンパク質内のこれら
の領域を試験する。
形態は、ゲノムDNA、cDNA、リボザイムおよびアンチセンス分子、ならび
に天然の供給源または合成由来にせよ、代替の骨格に基づくか、または代替の塩
基を含む核酸分子である。例えば、アンチセンス分子は、RNA、あるいは他の
分子(ペプチド核酸(PNA)または塩基対依存様式でDNAもしくはRNAに
特異的に結合する非核酸分子(例えば、ホスホロチオエート誘導体)を含む)で
あり得る。当業者は、本明細書中で開示される84P2A9のポリヌクレオチド
およびポリヌクレオチド配列を使用して、核酸分子のこれらのクラスを容易に獲
得し得る。
因性オリゴヌクレオチドの投与を必然的に伴う。用語「アンチセンス」は、この
ようなオリゴヌクレオチドが、その細胞内標的(例えば、84P2A9)に相補
的であるという事実をいう。例えば、Jack Cohen,OLIGODEO
XYNUCLEOTIDES,Antisense Inhibitors o
f Gene Expression,CRC Press,1989;および
Synthesis 1:1−5(1988)を参照のこと。本発明の84P2
A9アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Sオリゴヌクレオチド(ホスホロチオ
エート誘導体またはS−オリゴ、Jack Cohen、前出を参照のこと)の
ような誘導体を含み、この誘導体は、癌細胞増殖阻害作用の増大を示す。S−オ
リゴ(ヌクレオシドホスホロチオエート)は、オリゴヌクレオチド(O−オリゴ
)の等電子アナログであり、リン酸基の非架橋酸素原子は、硫酸原子で置換され
ている。本発明のS−オリゴは、3H−1,2−ベンゾジチオール−3−オン−
1,1−ジオキシド(これは、硫酸転移試薬である)での対応するO−オリゴの
処理によって調製され得る。Iyer,R.P.ら、J.Org.Chem.5
5:4693−4698(1990);およびIyer,R.P.ら、J.Am
.Chem.Soc.112:1253−1254(1990)を参照のこと。
本発明のさらなる84P2A9アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当該分野で
公知のモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む(例えば、Partr
idgeら、1996、Antisense & Nucleic Acid
Drug Development 6:169〜175を参照のこと)。
2A9ゲノム配列または対応するmRNAの最初の100N末端コドンまたは最
後の100C末端コドンに相補的であり、そしてこれらのコドンと安定にハイブ
リダイズする、RNAまたはDNAであり得る。完全な相補性(コンプリメンタ
リティー)(complementarity)は必要ではないが、高い程度の
相補性(コンプリメンタリティー)が好ましい。この領域に相補的なオリゴヌク
レオチドの使用は、84P2A9 mRNAへの選択的ハイブリダイゼーション
を可能にし、そしてプロテインキナーゼの他の調節サブユニットを特定するmR
NAへの選択的ハイブリダイゼーションを不可能にする。好ましくは、本発明の
84P2A9アンチセンスオリゴヌクレオチドは、84P2A9 mRNAにハ
イブリダイズする配列を有するアンチセンスDNA分子の15〜30マーのフラ
グメントである。必要に応じて、84P2A9アンチセンスオリゴヌクレオチド
は、84P2A9の、最初の10のN末端コドンおよび最後の10のC末端コド
ンにおける領域に相補的な30マーオリゴヌクレオチドである。あるいは、アン
チセンス分子は、84P2A9発現の阻害において、リボザイムを利用するよう
に改変される。L.A.CoutureおよびD.T.Stinchcomb;
Trends Genet 12:510−515(1996)。
ペアを含み、これは、本発明のポリヌクレオチドまたはその任意の特定の部分の
特異的増幅、および本発明の核酸分子またはその任意の部分に選択的もしくは特
異的にハイブリダイズするプローブの特異的増幅を可能にする。プローブは、検
出可能なマーカー(例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学
発光化合物、金属キレート剤または酵素のような)で標識され得る。このような
プローブおよびプライマーが、サンプルにおける84P2A9ポリヌクレオチド
の存在を検出するために使用され得、そして84P2A9タンパク質を発現する
細胞を検出するための手段として使用され得る。
A配列の、すべてまたは一部分を含むポリペプチドが挙げられる。84P2A9
mRNAを特異的に増幅し得るプライマーペアの例はまた、以下の実施例にお
いて記載される。当業者に理解されるように、非常に多くの異なるプライマーお
よびプローブが、本明細書中に提供される配列に基づいて調製され得、そして8
4P2A9 mRNAを、有効に増幅および/または検出するために使用され得
る。
的としては、84P2A9遺伝子、mRNAまたはそのフラグメントの、増幅お
よび/または検出のための、プローブおよびプライマーとしての使用;前立腺癌
および他の癌の、診断および/または予後予測のための試薬としての使用;84
P2A9ポリペプチドの発現を指向し得るコード配列としての使用;84P2A
9遺伝子の発現および/または84P2A9転写物の翻訳を、調節または阻害す
るための手段としての使用;ならびに治療薬としての使用が挙げられるが、これ
らに限定されない。
産物をコードする他のポリヌクレオチドの単離、ならびに84P2A9の遺伝子
産物のホモログ、選択的にスプライシングされたアイソフォーム、対立遺伝子改
変体、および84P2A9遺伝子産物の変異体形態をコードするポリヌクレオチ
ドの単離を可能にする。84P2A9遺伝子をコードする全長cDNAを単離す
るために利用され得る種々の分子クローニング方法は、周知である(例えば、S
ambrook,J.ら、Molecular Cloning:A Labo
ratory Manual,第2版、Cold Spring Harbor
Press,New York,1989;Current Protoco
ls in Molecular Biology.Ausubelら編、Wi
ley and Sons,1995を参照のこと)。例えば、λファージクロ
ーニング方法論が、市販のクローニング系を使用して慣用的に利用され得る(例
えば、Lambda ZAP Express,Stratagene)。84
P2A9遺伝子cDNAを含むファージクローンは、標識された84P2A9
cDNAまたはそのフラグメントを用いて調べることにより同定され得る。例え
ば、一つの実施形態において、84P2A9 cDNA(図2)またはその一部
分が、合成され、そしてプローブとして使用されて、84P2A9遺伝子に対応
する重複するcDNAおよび84P2A9遺伝子に対応する全長cDNAを回収
し得る。84P2A9遺伝子自体は、84P2A9 DNAプローブまたはプラ
イマーを使用して、ゲノムDNAライブラリー、細菌人工染色体ライブラリー(
BAC)、酵母人工染色体ライブラリー(YAC)などをスクリーニングするこ
とによって単離され得る。
はアナログもしくはホモログを含む組換えDNAまたはRNA分子(これには、
当該分野において周知のファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、YA
C、BAC、ならびに種々のウイルス性および非ウイルス性ベクターが含まれる
が、これらに限定されない)、およびこのような組換えDNAまたはRNA分子
で形質転換またはトランスフェクトされた細胞を提供する。本明細書中で使用さ
れる場合、組換えDNAまたはRNA分子は、インビトロでの分子操作に供され
たDNAまたはRNA分子である。このような分子を生成するための方法は周知
である(例えば、Sambrookら、1989(前出)を参照のこと)。
4P2A9ポリヌクレオチド、またはそのフラグメントもしくはアナログもしく
はホモログを含む組換えDNA分子を含む、宿主−ベクター系を提供する。適切
な真核生物宿主細胞の例としては、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞(例え
ば、哺乳動物細胞または昆虫細胞(例えば、バキュロウイルス感染可能細胞(例
えば、Sf9細胞またはHighFive細胞)))が挙げられる。適切な哺乳
動物細胞の例としては、種々の前立腺癌細胞株(例えば、DU145、TsuP
r1、他のトランスフェクト可能であるかまたは形質導入可能な前立腺細胞株)
、ならびに組換えタンパク質の発現のために慣用的に使用される多くの哺乳動物
細胞(例えば、COS細胞、CHO細胞、293細胞、293T細胞)が挙げら
れる。より詳細には、84P2A9のコード配列を含むポリヌクレオチドまたは
そのフラグメントもしくはアナログもしくはホモログを使用し、当該分野で慣用
的に使用され、そして広く知られたかなり多数の宿主−ベクター系を用いて、8
4P2A9タンパク質またはそれらのフラグメントを生成し得る。
主−ベクター系が利用可能である(例えば、Sambrookら、1989(前
出);Current Protocols in Molecular Bi
ology、1995(前出)を参照のこと)。哺乳動物での発現に好ましいベ
クターとしては、pcDNA 3.1 myc−His−tag(Invitr
ogen)およびレトロウイルスベクターpSRαtkneo(Mullerら
、1991、MCB 11:1785)が挙げられるが、これらに限定されない
。これらの発現ベクターを使用して、84P2A9は、好ましくは、いくつかの
前立腺癌細胞株および非前立腺癌細胞株(例えば、293、293T、rat−
1、NIH 3T3、およびTsuPr1を含む)において発現され得る。本発
明の宿主−ベクター系は、84P2A9タンパク質またはそれらのフラグメント
の産生のために有用である。このような宿主−ベクター系は、84P2A9およ
び84P2A9の変異またはアナログの機能的特性を研究するために使用され得
る。
くはフラグメントは、84P2A9をコードする構築物でトランスフェクトされ
た哺乳動物細胞によって産生され得る。実施例に記載した例示的な実施形態にお
いて、293T細胞は、84P2A9またはそのフラグメントもしくはアナログ
もしくはホモログをコードする発現プラスミドでトランスフェクトされ得、この
84P2A9タンパク質またはその関連タンパク質は、293T細胞において発
現され、そして組換え84P2A9タンパク質は、標準的な精製方法(例えば、
抗84P2A9抗体を使用するアフィニティ精製)を使用して単離され得る。本
明細書中の実施例において同様に記載される別の実施形態では、84P2A9コ
ード配列は、レトロウイルスベクターpSRαMSVtkneo中にサブクロー
ニングされ、そして種々の哺乳動物細胞株(例えば、NIH 3T3、TsuP
r1、293およびrat−1)に感染するために使用されて、84P2A9発
現細胞株を樹立する。当該分野において周知の種々の他の発現系もまた使用され
得る。84P2A9コード配列にインフレームで連結されたリーダーペプチドを
コードする発現構築物は、組換え84P2A9タンパク質の分泌形態の産生のた
めに使用され得る。
トによってコードされるタンパク質は、種々の用途を有する。これには、以下が
挙げられるが、これらに限定されない:抗体の産生、および84P2A9遺伝子
産物に結合する、リガンドおよび他の因子および細胞構成要素を同定するための
方法において。84P2A9タンパク質またはそれらのフラグメントに対して惹
起された抗体は、診断および予後アッセイにおいて、ならびに84P2A9タン
パク質の発現によって特徴付けられるヒト癌(前立腺および精巣の癌を含むが、
これに限定されない)の管理における画像化方法において有用であり得る。この
ような抗体は、細胞内で発現され得、そしてこのような癌を有する患者を処置す
る方法において使用され得る。84P2A9タンパク質の検出のために有用な種
々の免疫学的アッセイが意図され、これには、種々の型のラジオイムノアッセイ
、酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)、酵素結合免疫蛍光アッセイ
(ELIFA)、免疫細胞学的方法などが挙げられるが、これらに限定されない
。このような抗体が、標識され得、そして84P2A9発現細胞を検出し得る免
疫学的画像化試薬として使用され得る(例えば、ラジオシンチグラフィ(rad
ioscintigraphic)画像化方法において)。84P2A9タンパ
ク質はまた、以下にさらに記載されるように、癌ワクチンの生成において特に有
用であり得る。
ラグメントを提供する。84P2A9タンパク質の特定の実施形態は、図2に示
されるようなヒト84P2A9のアミノ酸配列の全てまたは部分を有するポリペ
プチドを含む。あるいは、84P2A9タンパク質の実施形態は、図2に示され
るヒト84P2A9のアミノ酸配列における変異を有する改変体ポリペプチドを
含む。
の構造的同一性および相同性(例えば、90%以上の同一性)を共有する。代表
的に、84P2A9関連タンパク質の対立遺伝子改変体は、本明細書中に記載さ
れる84P2A9配列内に保存的アミノ酸置換を含むか、または84P2A9ホ
モログにおいて対応する位置に由来するアミノ酸の置換を含む。84P2A9対
立遺伝子改変体の1つのクラスは、特定の84P2A9アミノ酸配列の少なくと
も小さな領域と高い程度の相同性を共有するタンパク質であるが、この配列とは
根本的な背反(例えば、非保存的置換、短縮化(truncation)、挿入
、またはフレームシフト)をさらに含むタンパク質である。タンパク質配列の比
較において、用語、類似性、同一性、および相同性は、各々異なる意味を有する
。さらに、オーソロジー(Orthology)およびパラロジー(Paral
ogy)は、1つの生物体における所定のタンパク質ファミリーのメンバーの、
他の生物体の同じファミリーのメンバーに対する関係を記載する、重要な概念で
ある。
更することなく、タンパク質中でなされ得る。このような変化としては、以下が
挙げられる:イソロイシン(I)、バリン(V)、およびロイシン(L)のいず
れか、任意の他のこれらの疎水性アミノ酸についての置換;グルタミン酸(E)
に対するアスパラギン酸(D)、およびその逆の置換;アスパラギン(N)に対
するグルタミン(Q)、およびその逆の置換;ならびに、スレオニン(T)に対
するセリン(S)、およびその逆の置換。他の置換はまた、タンパク質の三次元
構造における特定のアミノ酸の環境およびその役割に依存して、保存的とみなさ
れ得る。例えば、グリシン(G)およびアラニン(A)は、しばしば交換可能で
あり得、アラニン(A)およびバリン(V)も同様であり得る。比較的疎水性で
あるメチオニン(M)はしばしば、ロイシンおよびイソロイシンと交換可能であ
り得、そして時としてバリンと交換可能であり得る。リジン(K)およびアルギ
ニン(R)はしばしば、そのアミノ酸残基の重要な特徴がその電荷であり、そし
てこれら2つのアミノ酸残基の異なるpKが重要でない位置において、交換可能
である。さらに他の変化が、特定の状況において、「保存的」とみなされ得る(
本明細書における表2;頁13〜15「Biochemistry」第2版。L
ubert Stryer編(Stanford University);H
enikoffら.,PNAS 1992第89巻10915〜10919;L
eiら、J Biol.Chem 1995 5月19日;270(20):1
1882〜6を参照のこと)。
られた84P2A9タンパク質の改変体(例えば、アミノ酸の挿入、欠失および
置換を有するポリペプチド)を含む。84P2A9改変体は、当該分野において
公知の方法(例えば、部位特異的変異誘発、アラニンスキャニング(alani
ne scanning)、およびPCR変異誘発)を使用して作製され得る。
部位特異的変異誘発[Carterら、Nuc.Acids Res.13:4
331(1986);Zollerら、Nuc.Acids Res.10:6
487(1987)]、カセット式変異誘発[Wellら、Gene 34:3
15(1985)]、制限選択的変異誘発[Wellsら、Philos.Tr
ans.R.Soc.London SerA 317:415(1986)]
または他の公知技術を、クローン化されたDNAにおいて実施し、84P2A9
改変体DNAを産生し得る。
活性に関与する、連続配列に沿った1以上のアミノ酸を同定するために使用され
得る。とりわけ好ましい走査アミノ酸は、比較的小さい中性アミノ酸である。こ
のようなアミノ酸としては、アラニン、グリシン、セリン、およびシステインが
挙げられる。アラニンが、代表的に、この群の中で好ましい走査アミノ酸である
。なぜなら、アラニンは、β炭素を越えて側鎖を排除し、そして改変体の主鎖コ
ンフォメーションを変更する可能性が低いからである。アラニンもまた、代表的
に好ましい。なぜなら、アラニンは、最も一般的なアミノ酸であるからである。
さらに、埋没位置および露出位置の両方において、頻繁に見出される[Crei
ghton、The Proteins(W.H.Freeman&Co.、N
.Y.);Chothia、J.Mol.Biol.150:1(1976)]
。アラニン置換が適切な量の改変体を生じない場合には、同配体アミノ酸が使用
され得る。
配列番号2のアミノ酸配列を有する84P2A9タンパク質と共通して少なくと
も1つのエピトープを有するという特有の特徴を有する。この結果、84P2A
9改変体に特異的に結合する抗体またはT細胞はまた、配列番号2のアミノ酸配
列を有する84P2A9タンパク質に特異的に結合する。ポリペプチドが、84
P2A9タンパク質に特異的に結合する抗体またはT細胞によって認識され得る
エピトープをもはや含まない場合、このポリペプチドは、配列番号2に示される
タンパク質の改変体ではなくなる。当業者は、タンパク質を認識する抗体が、異
なるサイズのエピトープに結合することを理解する。約4または5アミノ酸(連
続してもしなくても)の数のグループ分けは、最小エピトープにおけるアミノ酸
の代表的な数とみなされる。例えば、Nairら、J.Immunol.200
0 165(12):6949〜6955;Hebbesら.,Mol Imm
unol(1989)26(9):865〜73;Schwartzら.,J.
Immunol.(1985)135(4):2598〜608を参照のこと。
別の特定のクラスの84P2A9関連タンパク質改変体は、配列番号2のアミノ
酸配列またはそのフラグメントと90%以上の同一性を共有する。別の特定のク
ラスの84P2A9タンパク質改変体またはアナログは、以下に記載されるか、
または当該分野で以前に公知であった、84P2A9の生物学的モチーフの1つ
以上を含む。従って、開始フラグメントに対して機能(例えば、免疫原性)特性
が変化した84P2A9フラグメントのアナログ(核酸またはアミノ酸)は、本
発明によって包含される。当該分野の技術範囲であるかそうなっているモチーフ
が図2の核酸またはアミノ酸配列に適用されることが理解される。
される84P2A9タンパク質の504未満のアミノ酸配列を含むポリペプチド
を含む。例えば、本発明の代表的な実施形態は、以下を含む:図2(配列番号2
)に示される84P2A9タンパク質のうち4、5、6、7、8、9、10、1
1、12、13、14、15またはそれ以上連続するかのいずれかのアミノ酸を
有するペプチド/タンパク質。さらに、本明細書に開示される本発明の例示的な
実施形態としては、84P2A9配列の全体にわたって、図2に示される84P
2A9タンパク質の約アミノ酸1〜約アミノ酸10からなるポリペプチド、図2
に示される84P2A9タンパク質の約アミノ酸10〜約アミノ酸20からなる
ポリペプチド、図2に示される84P2A9タンパク質の約アミノ酸20〜約ア
ミノ酸30からなるポリペプチド、図2に示される84P2A9タンパク質の約
アミノ酸30〜約アミノ酸40からなるポリペプチド、図2に示される84P2
A9タンパク質の約アミノ酸40〜約アミノ酸50からなるポリペプチド、図2
に示される84P2A9タンパク質の約アミノ酸50〜約アミノ酸60からなる
ポリペプチド、図2に示される84P2A9タンパク質の約アミノ酸60〜約ア
ミノ酸70からなるポリペプチド、図2に示される84P2A9タンパク質の約
アミノ酸70〜約アミノ酸80からなるポリペプチド、図2に示される84P2
A9タンパク質の約アミノ酸80〜約アミノ酸90からなるポリペプチド、およ
び図2に示される84P2A9タンパク質の約アミノ酸90〜約アミノ酸100
からなるポリペプチドなどが挙げられる。このスキームに従って、84P2A9
タンパク質のアミノ酸100〜504のアミノ酸配列の部分からなるポリペプチ
ドが、本発明の代表的な実施形態である。84P2A9タンパク質のより大きな
部分からなるポリペプチドもまた意図される。例えば、図2に示される84P2
A9タンパク質の約アミノ酸1(または、20もしくは30もしくは40など)
個〜約アミノ酸20(または、30もしくは40もしくは50など)個からなる
ポリペプチドが、当該分野において周知の種々の技術によって生成され得る。こ
の段落における開始位置および停止位置は、特定の位置およびその位置プラスマ
イナス(±)5残基をいうことが理解されるべきである。
るように、84P2A9関連タンパク質配列内に含まれる1以上の生物学的モチ
ーフのアミノ酸残基を含む、84P2A9関連タンパク質を含む。1実施形態に
おいて、本発明のタンパク質は、1以上の84P2A9核局在配列(例えば、配
列番号2の残基42−45のRKRR、配列番号2の残基47−50のRKRR
、配列番号2の残基101−104のKRRP、配列番号2の残基135−13
9のRRRRRK、および/または配列番号2の残基186−189のKKRK
)を含む。別の実施形態において、本発明のタンパク質は、1以上の84P2A
9 N−グリコシル化部位(例えば、配列番号2の残基131−134のNRT
L、配列番号2の残基212−215のNQTNおよび/または配列番号2の残
基394−397のNCSV)を含む。別の実施形態において、本発明のタンパ
ク質は、LUCA 15および/またはKIAA1152に対して相同性を示す
84P2A9の1以上の領域を含む。別の実施形態において、本発明のタンパク
質は、1以上の84P2A9 cAMPおよびcGMP−依存性タンパク質キナ
ーゼリン酸化部位(例えば、配列番号2の残基48−51のKRRSおよび/ま
たは配列番号2の残基102−105のRRPS)を含む。別の実施形態におい
て、本発明のタンパク質は、1以上の84P2A9タンパク質キナーゼCリン酸
化部位(例えば、配列番号2の残基133−135のTLR、配列番号2の残基
152−154のSNK、配列番号2の残基171−173のSDR、配列番号
2の残基214−216のTNK、配列番号2の残基313−315のSRR、
配列番号2の残基328−330のSSKおよび/または配列番号2の残基39
6−398のSVR)を含む。別の実施形態において、本発明のタンパク質は、
1以上の84P2A9カゼインキナーゼIIリン酸化部位(例えば、配列番号2
の残基10−13のSALE、配列番号2の残基70−73のSSLE、配列番
号2の残基71−74のSLEE、配列番号2の残基91−94のSDSD、配
列番号2の残基214−217のTNKD、配列番号2の残基232−235の
SESD、配列番号2の残基240−243のSSTD、配列番号2の残基24
8−251のTNDE、配列番号2の残基287−290のTELDおよび/ま
たは配列番号2の残基374−377のTEHD)を含む。別の実施形態におい
て、本発明のタンパク質は、1以上のN−ミリストイル化部位(例えば、配列番
号2の残基67−72のGSDSSL、配列番号2の残基245−250のGL
FTND、配列番号2の残基269−274のGGACGI、配列番号2の残基
336−341のGGTPTS、配列番号2の残基337−342のGTPTS
M、配列番号2の残基409−414のGSLCTG、配列番号2の残基459
−464のGSGLGRおよび/または配列番号2の残基481−486のGL
GLGF)を含む。別の実施形態において、本発明のタンパク質は、1以上のア
ミド化部位(例えば、配列番号2の残基45−48のRGRKおよび/または配
列番号2の残基113−116のRGKR)を含む。このようなポリペプチドの
例示的な実施形態は、以下からなる群から選択される2以上の(配列番号2にお
いて、上で同定されるような)アミノ酸配列を含む:KKRK、NQTN、NC
SV、TNK、SRR、SSK、SVR、GLFTND、GGACGI、GGT
PTS、GTPTSMおよびGSLCTG。好ましい実施形態において、このポ
リペプチドは、3または4または5または6またはそれより多くの以下の(配列
番号2において、上で同定されるような)アミノ酸配列を含む:KKRK、NQ
TN、NCSV、TNK、SRR、SSK、SVR、GLFTND、GGACG
I、GGTPTS、GTPTSMおよびGSLCTG。
な、本明細書中に記載されるプロセスによって同定される1以上の免疫活性エピ
トープを含む。HLA分子に対して親和性を有するペプチドおよびアナログ(こ
れらは、免疫原性エピトープとして関連する)を同定するためのプロセスは、当
該分野で周知である。免疫原性を調節するために、このようなエピトープのアナ
ログを産生するための原理がまた、開示される。種々の参考文献は、このような
分子の同定において有用である。例えば、以下を参照のこと:WO 97336
02(Chestnutら);Sette,Immunogenetics 1
999 50(3−4):201−212;Setteら,J.Immunol
.2001 166(2):1389−1397;Alexanderら,Im
munol.Res.18(2):79−92;Sidneyら,Hum.Im
munol.1997 58(l):12−20;Kondoら,Immuno
genetics 1997 45(4):249−258;Sidneyら,
J.Immunol.1996 157(8):3480−90;およびFal
kら,Nature 351:290−6(1991);Huntら,Scie
nce 255:1261−3(1992);Parkerら,J.Immun
ol.149:3580−7(1992);Parkerら,J.Immuno
l.152:163−75(1994));Kastら,1994 152(8
):3904−12;Borras−Cuestaら,Hum.Immunol
.2000 61(3):266−278;Alexanderら,J.Imm
unol.2000 164(3);164(3):1625−1633;Al
exanderら,PMID:7895164,UI:95202582;O’
Sullivanら,J.Immunol.1991 147(8):2663
−2669;Alexanderら,Immunity 1994 1(9):
751−761およびAlexanderら,Immunol.Res.199
8.18(2):79−92。これによって、これらの刊行物の開示は、本明細
書中でその全体が参考として援用される。
合わせを含むポリペプチドを含み、ここで、特定の実施形態は、これらのポリペ
プチドのモチーフまたは介在配列のいずれか内に、挿入、欠失または置換を含ま
ない。さらに、これらのモチーフのいずれかの部位に、多数のN末端アミノ酸残
基および/またはC末端アミノ酸残基のいずれかを含む、実施形態が、(例えば
、このモチーフが配置されるポリペプチド構築物のより大きな部分を含むために
)所望され得る。代表的に、モチーフのいずれかの部位における、N末端アミノ
酸残基および/またはC末端アミノ酸残基の数は、約1〜約100アミノ酸残基
、好ましくは、5〜約50アミノ酸残基である。
9の選択的スプライシング改変体(例えば、前立腺癌で過剰発現される4.5K
Bの転写物によってコードされるスプライシング改変体(図4に示される)に対
して固有であるアミノ酸配列を含む。84P2A9の選択的スプライシング改変
体のモニタリングは、有用である。なぜなら、タンパク質の選択的スプライシン
グにおける変化は、癌の進行を導く一連の事象における1つの工程として示唆さ
れるからである(例えば、Carstensら、Oncogene 15(25
0:3059−3065(1997)を参照のこと)。結果として、84P2A
9の選択的スプライシング改変体のモニタリングは、84P2A9遺伝子産物に
おける摂動に関連する症候群(例えば、癌)を評価するためのさらなる手段を提
供する。
、本明細書中で議論された84P2A9モチーフが増殖調節不全に関連するとい
う観察の観点から、そして84P2A9が癌において過剰発現されるので(図4
)、悪性疾患表現型の特異的特性の解明に有用である。従って、これらの酵素ま
たは分子に関連するモチーフのタンパク質の存在は、明らかである。例えば、カ
ゼインキナーゼII、cAMPおよびcCMP依存性タンパク質キナーゼ、なら
びにタンパク質キナーゼCは、例えば、悪性疾患表現型の発生に関連することが
公知の酵素である(例えば、Chenら、Lab Invest.,78(2)
:165−174(1998);Gaiddonら、Endocrinolog
y 136(10):4331−4338(1995);Hallら、Nucl
eic Acids Research 24(6):1119−1126(1
996);Peterzielら、Oncogene 18(46):6322
−6329(1999)およびO’Brian,Oncol.Rep.5(2)
:305−309(1998)を参照のこと)。さらに、グリコシル化およびミ
リスチル化の両方は、癌および癌進行にも関連するタンパク質修飾である(例え
ば、Dennisら、Biochim.Biophys.Acta 1473(
1):21−34(1999);Rajuら、Exp.Cell Res.23
5(1):145−154(1997)を参照のこと)。アミド化は、癌および
癌進行に関与する別のタンパク質の改変である(例えば、Trestonら,J
.Natl.Cancer Inst.Monogr.(13):169−17
5(1992)を参照のこと)。さらに、核局在配列は、悪性の細胞の能力に影
響を与えると考えられる(例えば、Mirskiら、Cancer Res.5
5(10):2129−2134(1995)を参照のこと)。
前立腺癌において高度に発現されることが示されるので(図4)、これらのペプ
チド/タンパク質は、正常組織 対 癌性組織における84P2A9遺伝子産物
の状態を評価するための方法、および悪性疾患表現型を解明するための方法にお
いて使用され得る。代表的に、84P2A9タンパク質の特定の領域をコードす
るポリペプチドは、84P2A9遺伝子産物の特定の領域(例えば、核局在シグ
ナルを含む領域)における摂動(例えば、欠失、挿入、点変異など)の存在を評
価するために使用され得る。例示的アッセイは、84P2A9ポリペプチド配列
内に含まれる1以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含む84P2A9関連
タンパク質を標的化する抗体またはT細胞を利用して、正常組織 対 癌性組織
における、この領域の特性を評価し得る。あるいは、84P2A9タンパク質内
に含まれる1以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含む84P2A9ポリペ
プチドは、84P2A9のこの領域と相互作用する因子をスクリーニングするた
めに使用され得る。
伝子配列における変更を可能にする。特に、当業者は、特定の宿主種によって特
定のコドンの好ましさを認識し、そして所望の宿主に好ましいように、開示され
た配列を適応させ得る。例えば、好ましいアナログコドン配列は、代表的に、希
少コドン(すなわち、所望の宿主の公知の配列において、約20%未満の使用頻
度を有するコドン)が、高頻度のコドンで置換されている。特定の種についての
コドンの好ましさは、例えば、以下のアドレスの、INTERNET上で利用可
能なコドン使用表を利用することによって算出され得る:http://www
.dna.affrc.go.jp/〜nakamura/codon.htm
l。約20%未満の使用頻度を有する任意のコドンを置換することによって、特
定の宿主種について最適化されたヌクレオチド配列は、本明細書中で「コドン最
適化配列」と呼ばれる。
ある。これらとしては、偽性のポリアデニル化シグナル、エキソン/イントロン
スプライシング部位シグナル、トランスポゾン様反復、をコードする配列の排除
、および/または遺伝子発現に有害である、他のこのような、よく特徴付けられ
た配列の排除が挙げられる。配列のGC含量は、所定の細胞宿主について、その
宿主細胞において発現される公知の遺伝子を参照して算出されるように、平均レ
ベルに調整され得る。可能な場合、この配列は、予測されるヘアピンmRNA二
次構造を回避するように改変され得る。他の有用な改変としては、Kozak,
Mol.Cell.Biol.9:5073−5080(1989)に記載のよ
うに、オープンリーディングフレームの開始における、翻訳開始コンセンサス配
列の付加が挙げられる。当業者は、排他的に5’近位AUGコドンにおいて、真
核生物のリボソーム開始翻訳が希少条件下でのみ排除される一般法則を理解する
(例えば、Kozak PNAS92(7):2662−2666、(1995
)およびKozak NAR 15(20):8125−8148(1987)
を参照のこと)。コドン最適化に加えて、偽性のポリアデニル化配列の排除、エ
キソン/イントロンスプライシングシグナルの排除、トランスポゾン様反復の排
除、および/またはGC含量の最適化によって、所定の宿主種における発現を最
適化されたヌクレオチド配列は、本明細書中で、「発現増強配列」と呼ばれる。
化される。精製された84P2A9タンパク質分子は、84P2A9の抗体また
は他のリガンドへの結合を損なう、他のタンパク質または分子を実質的に含まな
い。単離および精製の性質および程度は、意図される用途に依存する。84P2
A9タンパク質の実施形態として、精製された84P2A9タンパク質、および
機能的な可溶性84P2A9タンパク質が挙げられる。1実施形態において、こ
のような機能的な可溶性84P2A9タンパク質またはそのフラグメントは、抗
体、T細胞または他のリガンドによって結合されるべき能力を保持する。
図2に示される84P2A9のアミノ酸配列の部分に対応する)を含む、84P
2A9タンパク質を提供する。本発明のこのようなタンパク質は、84P2A9
タンパク質の特性(例えば、84P2A9タンパク質に関連するエピトープと特
異的に結合する抗体の産生を誘発する能力;このような抗体によって結合される
べき能力;HTLもしくはCTLの活性化を惹起する能力;および/またはHT
LもしくはCTLによって認識されるべき能力)を示す。
合成技術または化学切断方法を使用して生成され得る。あるいは、組換え方法を
使用して、84P2A9関連タンパク質をコードする核酸分子を生成し得る。1
実施形態において、本明細書中に記載される84P2A9コード核酸分子は、8
4P2A9タンパク質の規定のフラグメントを生成するための手段を提供する。
84P2A9タンパク質フラグメント/配列は、ドメイン特異的抗体(例えば、
84P2A9タンパク質の細胞外エピトープまたは細胞内エピトープを認識する
抗体)の生成および特徴付け、84P2A9またはその特定の構造ドメインに結
合する薬剤または細胞因子の同定、ならびに種々の治療状況(癌ワクチンまたは
このようなワクチンを調製する方法を含むが、これらに限定されない)において
、特に有用である。
ou−Fasman、Garnier−Robson、Kyte−Doolit
tle、Eisenberg、Karplus−SchultzまたはJame
son−Wolf分析の方法を含む、当該分野で周知の種々の分析技術を使用す
るか、または免疫原性に基づいて、予測および/または同定され得る。このよう
な構造を含むフラグメントは、サブユニット特異的抗84P2A9抗体もしくは
T細胞の生成、または84P2A9に結合する細胞因子の同定において、特に有
用である。
CクラスI分子HLA−A2への結合を、予測した。具体的には、84P2A9
タンパク質の完全なアミノ酸配列を、BioinformaticsおよびMo
lecular Analysis Section(BIMAS)Webサイ
ト(http://bimas.dcrt.nih.gov/)において見出さ
れるHLA Peptide Motif Searchアルゴリズムに入力し
た。このHLA Peptide Motif Searchアルゴリズムは、
HLAクラスI分子および特にHLA−A2の溝における特定のペプチド配列の
結合に基づいて、Dr.Ken Parkerによって開発された(例えば、F
alkら、Nature 351:290−6(1991);Huntら,Sc
ience 255:1261−3(1992);Parkerら,J.Imm
unol.149:3580−7(1992);Parkerら,J.Immu
nol.152:163−75(1994))を参照のこと)。このアルゴリズ
ムは、HLA−A2および多数の他のHLAクラスI分子との予測された結合に
関して、完全なタンパク質配列の8量体、9量体、および10量体ペプチドの配
置および順位付け(ranking)を可能にする。多くのHLAクラスI結合
ペプチドは、8量体、9量体、10量体または11量体である。例えば、クラス
I HLA−A2に関して、このエピトープは、好ましくは、2の位置にロイシ
ン(L)またはメチオニン(M)およびC末端にバリン(V)またはロイシン(
L)を含む(例えば、Parkerら、J.Immunol.149:3580
−7(1992)を参照のこと)。ペプチドと結合すると予測された84P2A
9の選択された結果は、以下の表1に示される。DIMASサイトによって予測
されるか、または適用されるべき当該分野で適用可能なHLAクラスIまたはク
ラスIモチーフ(例えば、視覚的もしくはコンピュータに基づいた方法、または
関連分野の当業者によって理解される)によって特定されるか、または当該分野
の一部となった、いずれのエピトープも、本発明の範囲内であることが理解され
るべきである。表1において、各ファミリーメンバーの候補物に順位付けするト
ップ10は、それらの配置、各特定のペプチドのアミノ酸配列、および見積もら
れた結合スコアと共に示される。この結合スコアは、37℃、pH6.5でペプ
チドを含む複合体の分離に関する、見積もられた半減期に対応する。最も高い結
合スコア(すなわち、63.04(84P2A9))を有するペプチドは、細胞
表面上でHLAクラスIに最も長期間最も堅く結合すると予測され、従って、T
細胞認識について最良の免疫原性標的を提示する。ペプチドのHLA対立遺伝子
との実際の結合は、抗原処理欠損細胞株T2上でのHLA発現の安定化によって
評価され得る(例えば、Xueら、Prostate 30:73−8(199
7)およびPeshwaら、Prostate 36:129−38(1998
)を参照のこと)。特定のペプチドの免疫原性は、樹状細胞のような細胞を提示
する抗原の存在下で、CD8+細胞障害性Tリンパ球(CTL)の刺激によって
インビトロで評価され得る。
ベクター(例えば、C末端6XHisおよびMYCタグを有する、84P2A9
をコードするCMV駆動発現ベクター(pcDNA3.1/mycHIS、In
vitrogenまたはTag5、GenHunter Corporatio
n、Nashville TN))を用いてトランスフェクトされた細胞(例え
ば、293T細胞)において、従来発現され得る。Tag5ベクターは、トラン
スフェクトされた細胞中で、分泌された84P2A9タンパク質の産生を容易に
するために使用され得る、IgGK分泌シグナルを提供する。培養培地中で分泌
されたHIS−標的84P2A9は、例えば、標準的な技術を使用するニッケル
カラムを使用して、精製され得る。
範囲内に含まれる。1つの型の共有結合性改変としては、84P2A9の選択さ
れた側鎖あるいはN末端残基またはC末端残基と反応し得る有機誘導体化薬剤と
の、84P2A9ポリペプチドの標的化されたアミノ酸残基の反応が挙げられる
。本発明の範囲内に含まれる84P2A9ポリペプチドの別の型の共有結合性改
変としては、本発明のタンパク質のネイティブなグリコシル化パターンの変更が
挙げられる。「ネイティブなグリコシル化パターンの変更」は、本明細書中の目
的を意図し、ネイティブ配列84P2A9に見い出される1以上の炭水化物部分
の欠失(基礎となるグリコシル化部位の除去、または化学的手段および/または
酵素的手段によるグリコシル化の欠失のいずれかによって)、および/またはネ
イティブ配列84P2A9に存在しない、1以上のグリコシル化部位の付加を意
味する。さらに、この句は、存在する種々の炭水化物部分の性質および割合の変
更を含む、ネイティブタンパク質のグリコシル化の質的変化を含む。84P2A
9の別の型の共有結合性改変としては、米国特許第4,640,835号、同第
4,496,689号、同第4,301,144号、同第4,670,417号
、同第4,791,192号または同第4,179,337号に示されるような
様式の、種々の非タンパク質様ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール(P
EG)、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン)のうちの1つ
への、84P2A9ポリペプチドの連結が挙げられる。
合された84P2A9を含むキメラ分子を形成する様式で、改変され得る。この
ようなキメラ分子は、化学的または組換え的に合成され得る。キメラ分子は、別
の腫瘍関連抗原またはそのフラグメントに融合された本発明のタンパク質を有し
得るか、または84P2A9配列のフラグメントの融合体(アミノ酸または核酸
)を含み得、図2(配列番号2)のアミノ酸配列または核酸配列のそれぞれに対
して、その長さを通じて直接的に相同性でない分子が、産生され;このようなキ
メラ分子は、複数の84P2A9の同一の配列を含み得る。キメラ分子としては
、ポリヒスチジンエピトープタグを有する84P2A9関連タンパク質の融合体
が挙げられ得、このタグは、固定されたニッケルが選択的に結合し得るエピトー
プを提供する。このエピトープタグは、一般に、84P2A9のアミノ末端また
はカルボキシル末端に配置される。代替的実施形態において、このキメラ分子は
、84P2A9関連タンパク質の、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定
の領域との融合体を含み得る。キメラ分子の二価形態(「免疫付着因子(imm
unoadhesin)」とも呼ばれる)について、このような融合体は、Ig
G分子のFc領域に対するものであり得る。このIg融合体は、好ましくは、I
g分子内の少なくとも1つの可変領域の代わりに、84P2A9ポリペプチドの
可溶性(膜貫通ドメインを欠失または不活性化した)形態での置換を含む。特に
好ましい実施形態において、免疫グロブリン融合体は、IgGI分子のヒンジ領
域、CH2領域およびCH3領域、またはヒンジ領域、CH1領域、CH2領域
およびCH3領域を含む。免疫グロブリン融合体の産生については、米国特許第
5,428,130号(1995年6月27日公布)もまた参照のこと。
する抗体を提供する。好ましい抗体は、84P2A9関連タンパク質に特異的に
結合し、そして非84P2A9タンパク質と結合しない(または、弱く結合する
)。別の実施形態において、抗体は、84P2A9抗体関連タンパク質およびそ
のホモログと結合する。
ならびに画像化方法において特に有用であり得る。同様に、このような抗体は、
84P2A9が他の型の癌でもまた発現または過剰発現される限り、他の癌の処
置、診断および/または予後に有用である。さらに、細胞内で発現された抗体(
例えば、単鎖抗体)は、84P2A9の発現に関与する癌(例えば、進行した前
立腺癌および転位性前立腺癌)を処置する際に治療学的に有用である。
出および定量に有用な種々の免疫学的アッセイを提供する。このようなアッセイ
は、適切には、84P2A9または変異体84P2A9タンパク質を認識および
結合し得る、1以上の84P2A9抗体を含み、そして、以下を含むが、これら
に限定されない当該分野で周知の種々の免疫学的アッセイ形式で行われ得る:種
々の型のラジオイムノアッセイ、酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)、酵
素連結免疫蛍光アッセイ(ELIFA)など。
ッセイ(阻害性または刺激性)および主要組織適合遺伝子複合体(MHC)結合
アッセイを含む。さらに、84P2A9を発現する前立腺癌および他の癌を検出
し得る画像化方法がまた、本発明によって提供され、この方法には、標識化84
P2A9抗体を使用する、ラジオシンチグラフィー画像化方法が挙げられるが、
これらに限定されない。このようなアッセイは、84P2A9を発現する癌(例
えば、前立腺癌)の検出、モニタリングおよび予後において、臨床的に有用であ
る。
質およびポリペプチドの精製、ならびに84P2A9ホモログおよび関連分子の
単離のための方法において使用され得る。例えば、1つの実施形態において、8
4P2A9タンパク質を精製する方法は、84P2A9抗体(これは、固体マト
リックスに結合されている)を、84P2A9を含有する溶解物または他の溶液
と共に、この84P2A9抗体が84P2A9に結合するのを可能にする条件下
でインキュベートする工程;固体マトリックスを洗浄して不純物を除去する工程
;および84P2A9をその結合された抗体から溶出する工程を包含する。本発
明の84P2A9抗体の他の用途としては、84P2A9タンパク質を模倣する
抗イディオタイプ抗体の産生が挙げられる。
単離または免疫結合体化された形態の、84P2A9関連タンパク質、ペプチド
またはフラグメントを使用して、適切な哺乳動物宿主を免疫することによって調
製され得る(Antibodies:A Laboratory Manual
,CSH Press編、HarlowおよびLane(1988);Harl
ow、Antibodies,Cold Spring Harbor Pre
ss,NY(1989))。さらに、84P2A9の融合タンパク質(例えば、
84P2A9 GST融合タンパク質)もまた使用され得る。特定の実施形態に
おいて、図2のオープンリーディングフレームアミノ酸配列の全てまたはほとん
どを含むGST融合タンパク質が産生され、そして適切な抗体を産生するための
免疫原として使用される。別の実施形態において、84P2A9ペプチドが合成
され、そして免疫原として使用される。
ンパク質または84P2A9発現細胞を用いるか、または用いずに)使用して、
そのコードされる免疫原に対する免疫応答を産生し得る(概要については、Do
nnellyら、1997、Ann.Rev.Immunol.15:617−
648を参照のこと)。
るために84P2A9タンパク質の特定の領域を選択し得る。例えば、84P2
A9アミノ酸配列の疎水性および親水性分析を使用して、84P2A9構造の親
水性領域を同定し得る。免疫原性構造を示す84P2A9タンパク質の領域、な
らびに他の領域およびドメインは、以下のような当該分野で公知の種々の他の方
法を使用して容易に同定され得る:例えば、Chou−Fasman、Garn
ier−Robson、Kyte−Doolittle、Eisenberg、
Karplus−SchultzまたはJameson−Wolf分析。従って
、これらのプログラム/方法のいずれかによって同定された領域は、本発明の範
囲内にある。84P2A9抗体の産生のための方法はさらに、本明細書中に提供
される実施例によって例示される。
方法、およびキャリア(例えば、BSA、KLHまたは他のキャリアタンパク質
)とのタンパク質の免疫原性結合体を調製するための方法は、当該分野で周知で
ある。いくつかの状況下で、例えば、カルボジイミド試薬を使用する直接的な結
合体化が使用され;他の例において、連結試薬(例えば、Pierce Che
mical Co.,Rockford,ILによって供給される連結試薬)が
、効果的である。84P2A9免疫原の投与は一般に、当該分野で一般に理解さ
れるように、適切な期間にわたって、適切なアジュバントの使用を用いた注射に
よって行われ得る。免疫スケジュールの間、抗体の力価は、抗体形成の能力(a
dequacy)を決定することによって理解され得る。
生され得る。例えば、所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株が、一
般に公知のように、KohlerおよびMilsteinの標準的なハイブリド
ーマ技術、または産生性(producing)B細胞を不死化する改変を使用
して調製される。所望の抗体を分泌する不死化細胞株は、抗原が84P2A9関
連タンパク質である免疫アッセイによってスクリーニングされる。所望の抗体を
分泌する適切な不死化細胞培養物が同定された場合、これらの細胞を拡大してイ
ンビトロ培養物または腹水のいずれかから抗体が産生され得る。
産生され得る。84P2A9タンパク質の所望の領域に特異的に結合する領域は
また、複数の種の起源のキメラ抗体または相補性決定領域(CDR)移植化(g
rafted)抗体の状況下で産生され得る。ヒト化84P2A9抗体またはヒ
ト84P2A9抗体もまた産生され得、そして治療的状況下での使用のために好
ましい。1以上の非ヒト抗体CDRを、対応するヒト抗体配列と置換することに
よる、マウス抗体および他の非ヒト抗体をヒト化するための方法は、周知である
(例えば、Jonesら、1986、Nature 321:522−525;
Riechmannら、1988、Nature 332:323−327;V
erhoeyenら、1988、Science 239:1534−1536
を参照のこと)。Carterら、1993、Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 89:4285、およびSimsら、1993、J.Immu
nol.151:2296もまた参照のこと。完全なヒトモノクローナル抗体を
産生するための方法としては、ファージディスプレイ法およびトランスジェニッ
ク法が挙げられる(総説については、Vaughanら、1998、Natur
e Biotechnology 16:535−539を参照のこと)。
ナトリアルライブラリー(すなわち、ファージディスプレイ)を使用するクロー
ニング技術を使用して産生され得る(Protein Engineering
of Antibody Molecules for Prophylac
tic and Therapeutic Applications(Man
.Clark,M.(編)、Nottingham Academic、45−
64頁(1993)のGriffithsおよびHoogenboom、Bui
lding an in vitro immune system:huma
n antibodies from phage display libr
aries;BurtonおよびBarbas、Human Antibodi
es from combinatorial libraries(同書)6
5−82頁)。完全なヒト84P2A9モノクローナル抗体はまた、PCT特許
出願WO98/24893(KucherlapatiおよびJakobovi
tsら、1997年12月3日公開)に記載されるように、ヒト免疫グロブリン
遺伝子座を含むように操作されたトランスジェニックマウスを使用して産生され
得る(Jakobovits、1998、Exp.Opin.Invest.D
rugs 7(4):607−614もまた参照のこと)。この方法は、ファー
ジディスプレイ技術に必要とされるインビトロ操作を回避し、そして高親和性の
真正ヒト抗体を効率的に産生する。
4P2A9関連タンパク質、84P2A9ペプチド、84P2A9発現細胞また
はその抽出物を使用する、多数の周知の手段(ウエスタンブロット、免疫沈降、
ELISAおよびFACS分析を含む)によって確証され得る。
標識されるか、または第2の分子に結合体化され得る。適切な検出可能なマーカ
ーとしては、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金
属キレート剤または酵素が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、2以
上の84P2A9エピトープに特異的な二重特異性的抗体が、当該分野で一般に
公知の方法を使用して産生され得る。ホモダイマー性の抗体もまた、当該分野で
公知の架橋技術によって産生され得る(例えば、Wolffら、Cancer
Res.53:2560−2565)。
ク動物または「ノックアウト」動物のいずれかを生成するために使用され得、こ
れらの動物は、次いで、治療的に有用な試薬の開発およびスクリーニングにおい
て有用である。確立された技術に従って、84P2A9をコードするcDNAは
、84P2A9コードするゲノムDNAをクローニングするために使用され得、
そしてそのゲノム配列は、84P2A9をコードするDNAを発現する細胞を含
むトランスジェニック動物を生成するために使用され得る。トランスジェニック
動物(特に、マウスまたはラットのような動物)を生成するための方法は、当該
分野で慣用的となり、そして例えば、米国特許第4,736,866号および米
国特許第4,870,009号に記載される。代表的に、特定の細胞が、組織特
異的エンハンサーと共に84P2A9導入遺伝子の組み込みのために標的化され
る。
を使用して、84P2A9をコードするDNAの発現の増大の効果を試験し得る
。このような動物は、例えば、その過剰発現と関連する病理学的状態からの防御
を付与すると考えられる試薬についての、試験動物として使用され得る。本発明
のこの局面に従って、動物を試薬で処置し、そしてこの導入遺伝子を保有する処
置していない動物と比較した、その病理学的状態の発生率の減少は、その病理学
的状態についての潜在的な治療的介入を示す。
アウト」動物を構築し得、この動物は、84P2A9をコードする内因性遺伝子
とその動物の胚細胞に導入された84P2A9をコードする改変ゲノムDNAと
間の相同組換えの結果として、84P2A9をコードする欠損性または84P2
A9をコードする改変遺伝子を有する。例えば、84P2A9をコードするcD
NAを使用して、確立された技術に従って、84P2A9をコードするゲノムD
NAをクローニングし得る。84P2A9をコードするゲノムDNAの一部は、
欠失され得るか、または別の遺伝子(例えば、組み込みをモニターするために使
用され得る、選択マーカーをコードする遺伝子)で置換され得る。代表的に、数
キロベースの変更されていない隣接DNA(5’末端および3’末端の両方)が
、そのベクターに含まれる(相同組換えベクターの記載については、例えば、T
homasおよびCapecchi、Cell、51:503(1987)を参
照のこと)。このベクターは、胚性幹細胞株に(例えば、エレクトロポレーショ
ンによって)導入され、そして導入されたDNAが内因性のDNAと相同組換え
した細胞が、選択される(例えば、Liら、Cell、69:915(1992
)を参照のこと)。次いで、この選択された細胞を、動物(例えば、マウスまた
はラット)の胚盤胞に注射し、凝集キメラを形成させる(例えば、Bradle
y、Teratocarcinomas and Embryonic Ste
m Cells:A Practical Approach、E.J.Rob
ertson編(IRL,Oxford、1987)、113−152頁を参照
のこと)。次いで、キメラ性の胚を、適切な偽妊娠雌性養母動物に移植し、そし
てその胚は、満期まで育成させて、「ノックアウト」動物を作製し得る。生殖細
胞中に相同組換えされたDNAを有する子孫は、標準的な技術によって同定され
得、そしてその子孫を用いて、全ての細胞が相同組換えDNAを含む動物を育種
し得る。ノックアウト動物は、例えば、84P2A9ポリペプチドの非存在に起
因する、特定の病理学的状態に対して防御する能力および病理学的状態の発生に
ついて、特徴付けられ得る。
関連タンパク質およびその改変体を検出するための方法、そして84P2A9を
発現する細胞を同定するための方法に関する。84P2A9は、前立腺癌のリン
パ節転移および骨転移に由来するLAPC異種移植片において発現されるようで
ある。84P2A9の発現プロフィールは、それを転移された疾患についての潜
在的な診断マーカーにする。この状況において、84P2A9遺伝子産物の状態
は、進行した段階の疾患に対する感受性、進行速度および/または腫瘍の凝集性
を含む、種々の因子を予測するために有用な情報を提供する。以下で詳細に議論
されるように、患者サンプル中の84P2A9遺伝子産物の状態は、以下を含む
当該分野で周知の種々のプロトコルによって分析され得る:免疫組織化学分析、
インサイチュハイブリダイゼーションを含む種々のノザンブロット技術、RT−
PCR分析(例えば、レーザ捕捉微小分析サンプルに対して)、ウエスタンブロ
ット分析および組織アレイ分析。
び他の組織、尿、精液、細胞調製物など)中の84P2A9ポリヌクレオチドの
検出のためのアッセイを提供する。検出可能な84P2A9ポリヌクレオチドと
しては、例えば、84P2A9遺伝子またはそのフラグメント、84P2A9
mRNA、選択的スプライシング改変体84P2A9 mRNA、および84P
2A9ポリヌクレオチドを含む組換えDNAもしくはRNA分子が挙げられる。
84P2A9ポリヌクレオチドを増幅し、そして/または84P2A9ポリヌク
レオチドの存在を検出するための多くの方法は、当該分野において周知であり、
そして本発明のこの局面の実施に用いられ得る。
出するための方法は、少なくとも1つのプライマーを使用して、逆転写によって
サンプルからcDNAを産生する工程;その中の84P2A9 cDNAを増幅
するために、センスおよびアンチセンスのプライマーとして84P2A9ポリヌ
クレオチドを使用して、そのように産生されたcDNAを増幅する工程;ならび
に増幅された84P2A9 cDNAの存在を検出する工程、を包含する。必要
に応じて、増幅された84P2A9 cDNAの配列が、決定され得る。
方法は、サンプルからゲノムDNAを最初に単離する工程;その中の84P2A
9遺伝子を増幅するために、センスおよびアンチセンスのプライマーとして84
P2A9ポリヌクレオチドを使用して単離されたゲノムDNAを増幅する工程;
ならびに増幅された84P2A9遺伝子の存在を検出する工程、を包含する。任
意の多くの適切なセンスプローブおよびアンチセンスプローブの組合せが、84
P2A9について提供されるヌクレオチド配列(図2)から設計され、そしてこ
の目的のために使用され得る。
、および他の組織、尿、細胞調製物など)中の84P2A9関連タンパク質の存
在を検出するためのアッセイを提供する。84P2A9関連タンパク質を検出す
るための方法もまた、周知であり、そして例えば、免疫沈降、免疫組織化学分析
、ウエスタンブロット分析、分子結合アッセイ、ELISA、ELIFAなどが
挙げられる。例えば、1つの実施形態において、生物学的サンプル中の84P2
A9タンパク質の存在を検出する方法は、84P2A9抗体、その84P2A9
反応性フラグメント、または84P2A9抗体の抗原結合領域を含む組換えタン
パク質と、サンプルとを最初に接触させる工程;ならびに次いで、それに対する
サンプル中の84P2A9タンパク質の結合を検出する工程、を包含する。
の実施形態において、84P2A9遺伝子を発現する細胞を同定するためのアッ
セイは、細胞中の84P2A9 mRNAの存在を検出する工程を包含する。細
胞中の特定のmRNAを検出するための方法は、周知であり、そして例えば、相
補DNAプローブを使用するハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、標識さ
れた84P2A9リボプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション
、ノザンブロットおよび関連技術)ならびに種々の核酸増幅アッセイ(例えば、
84P2A9に特異的な相補プライマーを使用するRT−PCR、および例えば
、分岐DNA、SISBA、TMAなどのような他の増幅型検出方法)が挙げら
れる。あるいは、84P2A9遺伝子を発現する細胞を同定するためのアッセイ
は、細胞中の84P2A9タンパク質または細胞によって分泌された84P2A
9タンパク質の存在を検出する工程を包含する。タンパク質を検出するための種
々の方法が、当該分野において周知であり、そして84P2A9関連タンパク質
および84P2A9発現細胞の検出のために用いられる。
かつ評価するためにツールとして有用であり得る。例えば、84P2A9発現は
、前立腺癌で有意に上方制御され、そしてまた、他の癌(前立腺癌、精巣癌、腎
臓癌、脳腫瘍、骨肉腫、皮膚癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌、リンパ性癌お
よび肺癌を含む)において発現される。癌細胞での84P2A9発現または過剰
発現を阻害し得る分子または生物学的薬剤の同定は、治療上の価値がありる。例
えば、このような薬剤は、RT−PCR、核酸ハイブリダイゼーションまたは抗
体結合によって84P2A9発現を定量するスクリーニングを使用して、同定さ
れ得る。
するアッセイは、この個体に由来する生物学的サンプルの増殖または腫瘍形成能
力に関する情報を提供し得る。例えば、84P2A9 mRNAは、正常前立腺
組織に比べて前立腺癌(ならびに、例えば図4〜8に示される他の癌組織)にお
いてかなり多く発現されるので、生物学的サンプル中の84P2A9 mRNA
転写物または84P2A9タンパク質の相対レベルを評価するアッセイは、84
P2A9調節不全と関連する疾患(例えば、癌)を診断するために使用され得、
そして適切な治療選択肢を規定するに有用である予後情報を提供し得る。
癌患者サンプル中で発現するので、84P2A9の発現状態は、形成異常細胞、
前癌性細胞および癌性細胞の存在、段階および位置を含む情報を決定するため、
種々段階に対する疾患の感受性を予測するため、および/または腫瘍攻撃性を判
断するために有用な情報を提供する。さらに、この発現プロフィールは、転移し
た疾患の画像化試薬として有用にする。従って、本発明の重要な局面は、生物学
的サンプル(例えば、癌のような調節不能の細胞増殖によって特徴付けられる病
理に罹患しているか、または罹患していると疑われる個体由来のもの)における
84P2A9の状態を試験するための種々の分子予後方法および診断方法に関す
る。
から前癌状態、次いで癌状態に進行する、複数段階プロセスであることが公知で
ある(例えば、Alersら、Lab Invest.77(5):437〜4
38(1997)およびIsaacsら、Cancer Surv.23:19
〜32(1995)を参照のこと)。この状況において、調節不能な細胞増殖(
例えば、前立腺癌における異常な84P2A9発現)の証拠について生物学的サ
ンプルの試験をすることは、癌のような病理が治療選択肢がより限定される段階
に進行する前の、このような異常な細胞病理の早期検出を可能にし得る。このよ
うな試験において、目的の生物学的サンプル(例えば、調節不能な細胞増殖を有
することを疑われるヒト)における84P2A9の状態は、例えば、対応する正
常サンプル(例えば、病理によって影響されていない個体(またあるいは別の個
体)(例えば、調節不能な細胞増殖を有すると疑われない人)由来のサンプル)
における84P2A9の状態と比較され得る。目的の生物学的サンプル中の84
P2A9の状態における変化(正常サンプルと比較して)は、調節不能な細胞増
殖の証拠を提供する。正常サンプルとして、病理によって影響されていない生物
学的サンプルを使用することに加えて、所定の基準値(例えば、mRNA発現の
、所定の正常レベル(例えば、Greverら、J.Comp.Neurol.
1996 Dec 9、376(2):306〜14および米国特許第5,83
7,501号を参照のこと)もまた使用して、正常サンプルにおける84P2A
9と対比して疑わしいサンプルにおける84P2A9を比較し得る。
され、そして遺伝子およびその産物の状況または状態をいう。代表的に、当業者
は、遺伝子およびその産物の状況または状態を評価するための多くのパラメータ
ーを使用する。これらには、発現される遺伝子産物の位置(84P2A9発現細
胞の位置を含む)、ならびに発現される遺伝子産物(例えば、84P2A9 m
RNAポリヌクレオチドおよびポリペプチド)のレベルおよび生物学的活性が挙
げられるがこれらに限定されない。84P2A9の状態における変化は、当該分
野で周知の、多種多様の方法論(代表的に本明細書中に記載されるもの)によっ
て評価され得る。代表的に、84P2A9の状態における変化は、84P2A9
および/または84P2A9発現細胞の位置、ならびに/あるいは84P2A9
mRNA発現における上昇および/またはタンパク質発現における上昇を含む
。
たは現象を同定する目的で、生物学的サンプルにおける84P2A9の状態が、
当業者によって利用される多くの方法(ゲノムサザン分析(例えば、84P2A
9遺伝子における摂動(perturbation)を検査するため)、84P
2A9 mRNAのノーザン分析および/またはPCR分析(例えば、84P2
A9 mRNAのポリヌクレオチド配列または発現レベルの変化を検査するため
)、およびウエスタン分析および/または免疫組織化学分析(例えば、ポリペプ
チド配列、サンプル中のポリペプチド位置の変化、84P2A9タンパク質の発
現レベルの変化および/または84P2A9タンパク質とポリペプチド結合パー
トナーとの関連を検査するため)が挙げられるがこれらに限定されない)によっ
て評価される。検出可能な84P2A9ポリヌクレオチドには、例えば、84P
2A9遺伝子またはそのフラグメント、84P2A9 mRNA、選択的スプラ
イス変異体84P2A9 mRNA、および84P2A9ポリヌクレオチドを含
む組換えDNA分子またはRNA分子が挙げられる。
は転移した疾患についての診断マーカーにする。特に、84P2A9の発現状態
は、特定の疾患の状態、進行および/または腫瘍攻撃性に対する感受性を推定す
るために有用な情報を提供する。本発明は、84P2A9状態を決定し、そして
84P2A9を発現する癌(例えば、前立腺癌、膀胱癌、精巣癌、卵巣癌、乳癌
、膵臓癌、結腸癌および肺癌)を診断するための方法およびアッセイを提供する
。患者サンプルにおける84P2A9状態は、当該分野で周知の多数の手段(免
疫組織化学的分析、インサイチュハイブリダイゼーション、レーザ捕捉マイクロ
精査(micro−dessected)サンプルに対するRT−PCR分析、
臨床サンプルおよび細胞株のウエスタンブロット分析、ならびに組織アレイ分析
が挙げられるがこれらに限定されない)によって分析され得る。84P2A9遺
伝子および遺伝子産物の状態を評価するための代表的なプロトコルは、例えば、
Ausubulら編、1995、Current Protocols In
Molecular Biology,Units 2[Northern B
lotting],4[Southern Blotting],15[Imm
unoblotting]および18[PCR Analysis]に見出され
得る。
当該分野における多くの周知の手順によって検査され得る。例えば、身体の特定
の部位から採取した生物学的サンプルにおける84P2A9の状態は、84P2
A9発現細胞(例えば、84P2A9のmRNAまたはタンパク質を発現する細
胞)の存在または非存在を、サンプルを評価することによって検査され得る。こ
の検査は、例えば、84P2A9発現細胞が、通常はこのような細胞を含まない
生物学的サンプル(例えば、リンパ節)において見出された場合、調節不能な細
胞増殖の証拠を提供し得る。生物学的サンプルにおける84P2A9の状態のこ
のような変化は、しばしば調節不能な細胞増殖に関係する。詳細には、調節不能
な細胞増殖の1つの指標が、起源の器官(例えば、精巣または前立腺)から身体
の異なる領域(例えば、リンパ節)への癌細胞の転移である。この状況において
、調節不能な細胞増殖の証拠は、重要である。なぜなら、例えば潜在的なリンパ
節の転移が、前立腺癌の患者のかなりの割合において検出され得、そしてこのよ
うな転移は、疾患進行の既知の予測物と関連があるからである(例えば、Mur
phyら、Prostate 42(4):315〜317(2000);Su
ら、Semin.Surg.Oncol.18(1):17〜28(2000)
およびFreemanら、J Urol Aug,154(2Pt 1):47
4〜8を参照のこと)。
、過形成または癌)を有すると疑われる個体に由来する試験組織サンプル中の細
胞によって発現される84P2A9遺伝子産物の状態を決定して、次いでそのよ
うに決定された状態を、対応する正常サンプル中の84P2A9遺伝子産物の状
態に対して比較することによって84P2A9遺伝子産物をモニターする方法で
あって、正常サンプルと比較して試験サンプルにおける異常な84P2A9遺伝
子産物の存在は、この個体の細胞において細胞増殖の調節不全の存在を指標を提
供する、方法を提供する。
を提供する。このアッセイは、対応する正常細胞または組織における発現レベル
と比べて、試験細胞サンプルまたは組織サンプルにおける84P2A9 mRN
Aまたはタンパク質の発現における有意な増加を検出する工程を包含する。84
P2A9の存在は例えば、前立腺組織、精巣組織、腎臓組織、脳組織、骨組織、
皮膚組織、卵巣組織、乳組織、膵臓組織、結腸組織、リンパ組織および肺組織を
含むがこれに限定されない中で評価され得る(例えば、図4〜8を参照のこと)
。これらの任意の組織における84P2A9の有意な発現の存在は、癌の発生、
存在および/または重篤度を示すために有用である。なぜなら対応する正常組織
は84P2A9 mRNAを発現しないか、またはより低いレベルで発現するか
らである。
ク質レベルで決定される。例えば、このような方法またはアッセイは、試験組織
サンプル中の細胞によって発現される84P2A9タンパク質のレベルを決定す
る工程、およびそのように決定されたレベルを、対応する正常サンプルにおいて
発現される84P2A9のレベルに対して比較する工程を包含する。1つの実施
形態において、84P2A9タンパク質の存在は、例えば、免疫組織化学方法を
使用して評価される。84P2A9タンパク質発現を検出し得る84P2A9抗
体または結合パートナーが、この目的のために、当該分野で周知の種々のアッセ
イ形式において使用される。
urbation)(例えば、挿入、欠失、置換など)を同定するために、生物
学的サンプル中の84P2A9ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の状態を評価し
得る。このような実施形態は、有用である。なぜなら、ヌクレオチドおよびアミ
ノ酸配列における摂動は、増殖調節不全の表現型と関連する多くのタンパク質で
観察されるからである(例えば、Marrogiら、1999、J.Cutan
.Pathol.26(8):369〜378を参照のこと)。例えば、84P
2A9の配列における変異は、腫瘍の存在または促進の指標であり得る。従って
、このようなアッセイは、84P2A9における変異が機能の潜在的損失または
腫瘍増殖の増加を閉める、診断的および予測的価値を有する。
々のアッセイが、当該分野において周知である。例えば、84P2A9遺伝子産
物の核酸配列またはアミノ酸配列のサイズおよび構造は、本明細書中で議論され
るノーザン、サザン、ウエスタン、PCRおよびDNA配列決定プロトコルによ
って観察され得る。さらに、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列における摂動
を観察するための他の方法(例えば、一本鎖高次構造多型分析)が、当該分野で
周知である(例えば、米国特許第5,382,510号および同第5,952,
170号を参照のこと)。
チル化状態を試験し得る。遺伝子の5’調節領域におけるCpG島の異常な脱メ
チル化および/または過メチル化は、不死化細胞および形質転換細胞において頻
繁に起こり、そして種々の遺伝子の変化した発現を生じ得る。例えば、pi−ク
ラスグルタチオンS−トランスフェラーゼ(正常前立腺において発現するが前立
腺癌腫の90%より多くで発現しないタンパク質)のプロモーターの過メチル化
は、この遺伝子の転写を永続的に止めるようであり、そしてこれは前立腺癌腫に
おけるもっとも頻繁に検出されるゲノム変異である(De Marzoら、Am
.J.Pathol.155(6):1985〜1992(1999))。さら
に、この変化は、高悪性度の前立腺上皮内新生物(PIN)の症例の少なくとも
70%において存在する(Brooksら、Cancer Epidemiol
.Biomarkers Prev.、1998、7:531〜536)。別の
実施形態において、LAGE−I腫瘍特異的遺伝子の発現(これは正常前立腺に
おいて発現しないが、前立腺癌の20〜25%において発現する)は、デオキシ
−アザシチジンによってリンパ芽球様細胞において誘導され、これは腫瘍の発現
が脱メチル化に起因することを示唆する(Letheら、Int.J.Canc
er 76(6):903〜908(1998)。この状況において、遺伝子の
メチル化状態を試験するための種々のアッセイは、当該分野で周知である。例え
ば、サザンハイブリダイゼーションアプローチにおいて、CpG島の全体的なメ
チル化状態を評価する目的で、メチル化CpG部位を含む配列を切断できないメ
チル化感受性制限酵素を利用し得る。さらに、MSP(メチル化特異的PCR)
は、所定の遺伝子のCpG島に存在する全てのCpG部位のメチル化状態を容易
に概略描写し得る。この手順は、亜硫酸水素ナトリウム(これは全ての非メチル
化シトシンをウラシルに変更する)によるDNAの最初の修飾、それに続くメチ
ル化DNA対非メチル化DNAに特異的なプライマーを使用した増幅を包含する
。メチル化法を包含するプロトコールはまた、例えばCurrent Prot
ocols In Molecular Biology、Unit 12、F
rederick M.Ausubulら編、1995において見出され得る。
る領域)にマッピングされる遺伝子座、)の状態を評価するさらなる方法を提供
する。遺伝子増幅は、サンプルにおいて、例えば、本明細書中に提供される配列
に基づいて、適切な標識プローブを使用して、従来のサザンブロッティング、ま
たはmRNAの転写を定量するノーザンブロッティング(Thomas、198
0、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:5201〜520
5)、ドットブロッティング(DNA分析)、またはインサイチュハイブリダイ
ゼーションによって直接的に測定される。あるいは、特定の二重鎖(DNA二重
鎖、RNA二重鎖、およびDNA−RNAハイブリッド二重鎖またはDNA−タ
ンパク質二重鎖を含む)を認識する抗体が用いられる。次いで、この抗体が、標
識され、そして二重鎖が表面に結合され、その結果、この表面上での二重鎖の形
成により、二重鎖に結合した抗体の存在が検出され得るアッセイが、行われ得る
。
を検出するために例えば、ノーザン分析、ドットブロット分析またはRT−PC
R分析を使用して、癌細胞(前立腺癌、精巣癌、腎臓癌、脳癌、骨癌、皮膚癌、
卵巣癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌、リンパ癌および肺癌を含むがこれに限定されな
い)の存在について従来通りにアッセイされ得る(図4〜8を参照のこと)。R
T−PCRにより増幅可能な84P2A9 mRNAの存在は、癌の存在の指標
を提供する。末梢血中の腫瘍細胞についてのRT−PCR検出アッセイは、多数
のヒト固形腫瘍の診断および管理における使用について現在評価されている。前
立腺癌の分野において、これらは、PSAおよびPSMを発現する細胞の検出の
ためのRT−PCRアッセイを含む(Verkaikら、1997、Urol.
Res.25:373〜384;Ghosseinら,1995,J.Clin
.Oncol.13:1195〜2000;Hestonら,1995,Cli
n.Chem.41:1687〜1688)。RT−PCRアッセイは、当該分
野で周知である。
つの実施形態において、癌に対する感受性を推定するための方法は、組織サンプ
ル中の84P2A9 mRNAまたは84P2A9タンパク質を検出する工程で
あって、その存在が、癌に対する感受性を示し、ここで存在する84P2A9
mRNA発現の程度が感受性の程度に相関する、工程を包含する。特定の実施形
態において、前立腺組織または他の組織中の84P2A9の存在が、試験され、
ここでこのサンプル中の84P2A9の存在は、前立腺癌の感受性(または前立
腺腫瘍の発生もしくは存在)の指標を提供する。密接に関連する実施形態におい
て、これらの分子の構造における摂動(例えば、挿入、欠失、置換など)を同定
するために、生物学的サンプルにおける84P2A9のヌクレオチド配列および
アミノ酸配列の完全性を評価し得、ここでサンプル中の84P2A9遺伝子産物
における1以上の摂動の存在が、癌の感受性(または腫瘍の発生もしくは存在)
の指標を提供する。
つの実施形態において、腫瘍の攻撃性を測定するための方法は、腫瘍サンプル中
の細胞によって発現される84P2A9 mRNAまたは84P2A9タンパク
質のレベルを決定する工程、そのように決定されたレベルを、同じ個体から採取
された対応する正常組織または正常組織参照サンプル中に発現される84P2A
9 mRNAまたは84P2A9タンパク質のレベルに対して比較する工程であ
って、ここで正常サンプルに対する腫瘍サンプルにおける84P2A9 mRN
Aまたは84P2A9タンパク質発現の程度が、攻撃性の程度を示す、工程を包
含する。特定の実施形態において、腫瘍の攻撃性は、84P2A9が腫瘍細胞中
に発現される程度を決定することによって評価され、ここでより高い発現レベル
は、より攻撃性の腫瘍を示す。密接に関連する実施形態において、これらの分子
の構造における摂動(例えば、挿入、欠失、置換など)を同定するために、生物
学的サンプルにおける84P2A9ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の完全
性を評価し得、ここで1以上の摂動の存在は、より攻撃性の腫瘍を示す。
ための方法に関する。1つの実施形態において、個体における悪性疾患の進行を
経時的に観察するための方法は、腫瘍サンプル中の細胞によって発現される84
P2A9 mRNAまたは84P2A9タンパク質のレベルを決定する工程、そ
のように決定されたレベルを、同じ個体から異なる時間に採取された等価な組織
サンプル中に発現される84P2A9 mRNAまたは84P2A9タンパク質
のレベルに対して比較する工程であって、ここで腫瘍サンプルにおける経時的な
84P2A9 mRNAまたは84P2A9タンパク質発現の程度が、癌の進行
に関する情報を提供する、工程を包含する。特定の実施形態において、癌の進行
は、腫瘍細胞における84P2A9発現が経時的に変化する程度を決定すること
によって評価され、ここでより高い発現レベルは、癌の進行を示す。また、これ
らの分子の構造における摂動(例えば、挿入、欠失、置換など)を同定するため
に、生物学的サンプル中の84P2A9ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の
完全性を評価し得、ここで1以上の摂動の存在は、癌の進行を示す。
診断プロトコルのいずれか1つと組み合わされ得る。例えば、本明細書中に開示
される本発明の別の実施形態は、組織サンプルの状態を診断し、かつ予後を判定
する手段として、84P2A9遺伝子および84P2A9遺伝子産物の発現(ま
たは84P2A9遺伝子および84P2A9遺伝子産物における摂動)と、悪性
疾患に関連する因子との間の一致を観察するための方法に関する。この状況にお
いて、悪性疾患に関連する種々多様なの因子(例えば、悪性疾患と関連する遺伝
子の発現(例えば、前立腺癌などについてのPSA、PSCAおよびPSMの発
現))および肉眼的細胞学的観察(例えば、Bockingら、1984、An
al Quant Cytol.6(2):74〜88;Eptsein、19
95、Hum Pathol.26(2):223〜9;Thorsonら、1
998、Mod Pathol.11(6):543〜51;Baisdenら
、1999、Am.J.Surg.Pathol.23(8):918〜24を
参照のこと)が、利用され得る。84P2A9遺伝子および84P2A9遺伝子
産物の発現(または84P2A9遺伝子および84P2A9遺伝子産物における
摂動)と、悪性疾患に関連するさらなる因子との間の一致を観察するための方法
が有用である。なぜなら、例えば、疾患と一致する一組の特定の因子の存在は、
組織サンプルの状態を診断し、かつ予後を判定するために重要な情報を提供する
からである。
物の発現(または84P2A9遺伝子および84P2A9遺伝子産物における摂
動)と、悪性疾患に関連する因子との間の一致を観察するための方法は、組織サ
ンプルにおいて、84P2A9のmRNAまたはタンパク質の過剰発現を検出す
る工程、組織サンプルにおいてPSAのmRNAまたはタンパク質の過剰発現を
検出する工程、ならびに84P2A9のmRNAまたはタンパク質の過剰発現と
PSAのmRNAまたはタンパク質の過剰発現との一致を観察する工程を包含す
る。特定の実施形態において、前立腺組織における84P2A9 mRNAおよ
びPSA mRNAの発現が、試験される。好ましい実施形態において、サンプ
ルにおける84P2A9 mRNA過剰発現とPSA mRNA過剰発現との一
致は、前立腺癌、前立腺癌感受性、または前立腺腫瘍の発生もしくは状態の指標
を提供する。
方法が、本明細書中に記載され、そして標準的な核酸およびタンパク質の検出技
術および定量技術の使用が、当該分野において周知である。84P2A9 mR
NAの検出および定量のための標準的な方法としては、標識された84P2A9
リボプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション、84P2A9ポ
リヌクレオチドプローブを使用するノーザンブロットおよび関連する技術、84
P2A9に特異的なプライマーを使用するRT−PCR分析、ならびに他の増幅
型検出方法(例えば、分岐DNA、SISBA、TMAなど)が挙げられる。特
定の実施形態において、半定量的RT−PCRが、以下の実施例に記載されるよ
うに、84P2A9 mRNA発現を検出および定量するために使用され得る。
84P2A9を増幅し得る任意の数のプライマー(本明細書中に詳細に記載され
る種々のプライマーセットを含むがこれらに限定されない)が、この目的のため
に使用され得る。タンパク質の検出および定量のための標準的な方法が、この目
的のために使用される。特定の実施形態において、野生型84P2A9タンパク
質と特異的に反応するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が、生検組
織の免疫組織化学的アッセイにおいて使用され得る。
分野で受け入れられた種々のプロトコルのいずれか1つを通じて、84P2A9
と相互作用するタンパク質、小分子および他の因子、ならびに84P2A9によ
って活性化される経路を同定し得る。例えば、種々のいわゆる相互作用捕捉系(
「ツーハイブリッドアッセイ」ともいわれる)のうちの1つを利用し得る。この
ような系において、相互作用する分子は、レポーター遺伝子の発現を指向する転
写因子を再構成し、次いで、そのレポーター遺伝子の発現をアッセイする。代表
的な系は、真核生物転写アクチベーターの再構成を通じて、インビボでタンパク
質−タンパク質相互作用を同定し、そしてこれは例えば、米国特許第5,955
,280号、同第5,925,523号、同第5,846,722号および同第
6,004,746号に開示されている。
2A9タンパク質配列と相互作用する分子を同定し得る。このような方法におい
て、選択されたレセプター分子(例えば、84P2A9)に結合するペプチドが
、アミノ酸の無作為収集物または制御された収集物をコードするライブラリーを
スクリーニングすることによって同定される。このライブラリーによってコード
されるペプチドは、バクテリオファージコートタンパク質の融合タンパク質とし
て発現され、次いで、バクテリオファージ粒子が、目的のレセプターに対してス
クリーニングされる。
プチドが、予期されるリガンド分子またはレセプター分子の構造に関するいかな
る予備情報を必要することなく同定され得る。84P2A9タンパク質配列と相
互作用する分子を同定するために使用され得る代表的なペプチドライブラリーお
よびスクリーニング方法が、例えば、米国特許第5,723,286号および同
第5,773,731号に開示されている。
るタンパク質−タンパク質相互作用を同定するために使用される。このような相
互作用は、他の研究者によって示されるような免疫沈降技術(Hamilton
BJら、Biochem.Biophys.Res.Commun.1999
,261:646〜51)を使用して試験され得る。代表的には、84P2A9
タンパク質は、抗84P2A9抗体を使用して、84P2A9を発現している前
立腺癌細胞株から免疫沈降され得る。あるいは、Hisタグに対する抗体が、(
上記のベクターを使用して)84P2A9を発現するように操作された細胞株に
おいて使用され得る。免疫沈降した複合体は、ウエスタンブロッティング、タン
パク質の35S−メチオニン標識、タンパク質微量配列決定、銀染色および2次
元ゲル電気泳動のような手順によってタンパク質の会合に対して試験され得る。
9と相互作用する低分子が同定され得る。例えば、リン酸化および脱リン酸化、
第2メッセンジャーのシグナル伝達ならびに腫瘍形成を媒介する84P2A9の
能力と干渉する分子を含む、タンパク質の機能と干渉する低分子が同定され得る
。代表的な方法には、例えば、米国特許第5,928,868号に議論されてお
り、そして少なくとも1つのリガンドが低分子であるハイブリッドリガンドを形
成するための方法が挙げられる。例示的な実施形態において、このハイブリッド
リガンドは、細胞中に導入され、次いでこの細胞は、第1および第2の発現ベク
ターを含む。各発現ベクターは、転写モジュールについてのコード配列に連結さ
れた標的タンパク質をコードするハイブリッドタンパク質を発現するためのDN
Aを含む。細胞は、レポーター遺伝子をさらに含み、その発現は、第1および第
2のハイブリッドタンパク質の互いに対する近接性に依存し、ハイブリッドリガ
ンドが、両方のハイブリッドタンパク質上の標的部位に結合する場合のみに、こ
の事象が生じる。レポーター遺伝子を発現するこれらの細胞が選択され、そして
未知の低分子または未知のハイブリッドタンパク質が、同定される。
ミノ酸配列と相互作用する分子についてスクリーニングする方法からなる。この
方法は、分子集団と84P2A9アミノ酸配列とを接触させる工程、相互作用を
促進する条件下で、分子集団と84P2A9アミノ酸配列とを相互作用させる工
程、84P2A9アミノ酸配列と相互作用する分子の存在を決定する工程、次い
で84P2A9アミノ酸配列と相互作用する分子から84P2A9アミノ酸配列
と相互作用しない分子を分離する工程を包含する。特定の実施形態において、こ
の方法はさらに、84P2A9アミノ酸配列と相互作用する分子を精製する工程
を包含する。好ましい実施形態において、84P2A9アミノ酸配列は、ペプチ
ドのライブラリーと接触される。
および他の癌)において発現される84P2A9の同定は、このような癌の処置
に対する多くの治療アプローチを展開する。本明細書中で議論されるように、転
写因子としての84P2A9の機能は、腫瘍促進遺伝子を活性化すること、また
は腫瘍形成をブロックする遺伝子を抑制することに関与する可能性がある。
原を連想させ、これらは、黒色腫および他の癌にてアップレギュレートされる、
精巣関連遺伝子である(Van de EyndeおよびBoon、Int J
Clin Lab Res.27:81〜86、1997)。癌におけるそれ
らの組織特異的発現および高発現レベルに起因して、MAGE抗原は、癌ワクチ
ンについての標的として現在調査されている(Durrant、Antican
cer Drugs 8:727〜733、1997;Reynoldsら、I
nt J Cancer 72:972〜976、1997)。84P2A9の
発現パターンは、84P2A9が同様に、前立腺癌に対する癌ワクチンアプロー
チのための理想的な標的であるという証拠を提供する。その構造的特徴は、84
P2A9が転写因子であり得ることを示し、そして84P2A9が、低分子標的
であることの証拠を提供する。
チが、前立腺癌、精巣癌、および84P2A9を発現する他の癌に罹患する患者
に有用であることが予期される。これらの治療アプローチは、一般的に、2つの
種類に分類される。1つの種類は、その結合パートナーまたは他のタンパク質と
の、84P2A9タンパク質の結合または会合を阻害するための、種々の方法を
包含する。別の種類は、84P2A9遺伝子の転写または84P2A9 mRN
Aの翻訳を阻害するための、種々の方法を包含する。
ための魅力的な標的であることを示す。細胞外および細胞内分子の両方を標的化
するための多数の典型的な抗体ストラテジー(例えば、補体およびADCC媒介
死滅ならびに本明細書中で議論される内部抗体の使用)が当該分野で公知である
。84P2A9は対応する正常細胞によってではなく、種々の系統の癌細胞によ
って発現されるので、84P2A9免疫反応性組成物の全身投与は、非標的器官
および非標的組織に対して、その免疫治療分子の結合により引き起こされる、毒
性効果、非特異的効果および/または非標的効果なしで、優れた感受性を示すこ
とが予期される。84P2A9のドメインと特異的に反応性である抗体は、毒素
または治療薬剤との結合体、あるいは細胞の増殖または機能を阻害し得る裸の抗
体のいずれかとして、84P2A9を発現する癌を全身的に処置するために有用
であり得る。
し、そして結合パートナーとの相互作用のような機能を調節または阻害し、結果
として、腫瘍細胞の増殖阻害および/または破壊を媒介しそして/または腫瘍細
胞の増殖を阻害する。このような抗体が治療効果を発揮する機構は、補体媒介性
細胞溶解、抗体依存性細胞の細胞傷害、84P2A9の生理学的機能を調節する
こと、リガンド結合またはシグナル伝達経路を阻害すること、腫瘍細胞分化を調
節すること、腫瘍脈管形成因子プロフィールを変化させること、および/または
アポトーシスを誘導することを包含し得る。
のような免疫抗原分子を特異的に標的化および結合し得ることを理解する。さら
に、当業者は、抗体を細胞傷害性薬剤に結合体化することが日常的であることを
理解する。この状況において、細胞毒性薬剤および/または治療剤が、その細胞
(例えば、84P2A9)によって発現される分子に特異的な抗体にそれらを結
合体化することによって直接細胞に送達される場合、細胞傷害性薬剤は、これら
の細胞に対して、その既知の生物学的効果(例えば、細胞傷害性)を発揮するこ
とを予期することが妥当であることを、当業者は理解する。
れた抗体を使用するための方法が、当該分野で公知である。癌の状況においては
、代表的な方法は、細胞表面上への結合または局在化に利用可能な発現されたマ
ーカー(例えば、84P2A9)に結合する標的化薬剤(例えば、抗84P2A
9抗体)に連結した、選択された細胞傷害性および/または治療剤を含む結合体
の生物学的に有効な量を、腫瘍を有する動物に投与する工程を包含する。代表的
な実施形態は、細胞傷害性および/または治療剤を84P2A9を発現する細胞
に送達する方法からなり、この方法は、84P2A9エピトープに免疫特異的に
結合する抗体に細胞傷害薬剤を結合体化する工程および抗体−薬剤結合体に細胞
を曝露する工程を包含する。別の特定の例示的な実施形態は、転移した癌に罹患
することが疑われる個体を処置する方法からなり、この方法は、細胞傷害性薬剤
および/または治療剤に結合体化した抗体の治療的有効量を含む薬学的組成物を
上記患者に非経口的に投与する工程を包含する。
れない、他の型の癌の処置にて首尾良く使用されている種々のアプローチから得
られた教示に従い得る:結腸癌(Arlenら、1998、Crit.Rev.
Immunol.18:133〜138)、多発性骨髄腫(Ozakiら、19
97、Blood 90:3179〜3186;Tsunenariら、199
7、Blood 90:2437〜2444)、胃癌(Kasprzykら、1
992、Cancer Res.52:2771〜2776)、B細胞リンパ腫
(Funakoshiら、1996、J.Immunother.Emphas
is Tumor Immunol.19:93〜101)、白血病(Zhon
gら、1996、Leuk.Res.20:581〜589)、結腸直腸癌(M
ounら、1994、Cancer Res.54:6160〜6166;Ve
ldersら、1995、Cancer Res.55:4398〜4403)
、および乳癌(Shepardら、1991、J.Clin.Immunol.
11:117〜127)。いくつかの治療アプローチは、毒素への裸の抗体の結
合(例えば、抗CD20抗体への131Iの結合(例えば、RituxanTM 、IDEC Pharmaceuticals Corp.)を含むが、一方他
のアプローチは、抗体と他の治療薬剤との(例えば、HerceptinTM(
トラスツズマブ(trastuzumab)とパクリタキセル(Genente
ch,Inc.)との)同時投与を含む。前立腺癌の処置のために、例えば、8
4P2A9抗体が、照射、化学療法またはホルモン除去と組み合わせて、投与さ
れ得る。
療は、進行性または転移性の癌にて特に適切であり得る。本発明の抗体療法を用
いる処置は、1回以上の化学療法を受けたことのある患者に示され得、一方、化
学療法レジメンまたは照射レジメンと本発明の抗体療法を組み合わせることが、
化学療法処置を受けていない患者に好ましい。さらに、抗体療法は、特に、化学
療法薬剤の毒性を許容しない患者にとって、非常に良好に併用する化学療法の減
少した投薬量の使用を可能にし得る。
たは84P2A9発現の存在および程度を確実に示し得る他の技術を使用して、
何人かの癌患者が84P2A9発現の存在およびレベルについて評価されること
は、望ましい。腫瘍生検または外科的検体の免疫組織化学分析が、この目的につ
いて好ましい。腫瘍組織の免疫組織化学的分析のための方法が、当該分野で周知
である。
体としては、その腫瘍に対する強力な免疫応答を開始し得る抗体、または直接細
胞傷害性である抗体が挙げられる。これに関して、抗84P2A9モノクローナ
ル抗体(mAb)は、補体媒介性細胞傷害または抗体依存性細胞傷害(ADCC
)のいずれかの機構によって、腫瘍細胞溶解を惹起し得、これらの機構の両方が
、エフェクター細胞Fcレセプター部位または補体タンパク質との相互作用のた
めに、その免疫グロブリン分子のインタクトなFc部分を必要とする。さらに、
腫瘍増殖に対する直接の生物学的効果を発揮する抗84P2A9 mAbが、本
発明の実施にて有用である。このような直接的な細胞傷害性のmAbが作用し得
る可能な機構としては、細胞増殖の阻害、細胞分化の調節、腫瘍脈管形成因子プ
ロフィールの調節、およびアポトーシスの誘導が、挙げられる。特定の抗84P
2A9 mAbが抗腫瘍効果を発揮する機構は、当該分野で一般的に知られてい
るように、ADCC、ASMCC、補体媒介性細胞溶解、その他のような細胞死
を決定するように設計された多くのインビトロアッセイを使用して、評価される
。
メラmAbの使用が、何人かの患者で、中程度の免疫応答から強力な免疫応答を
誘導し得る。いくつかの場合において、これは、循環からの抗体のクリアランス
および減少した効力をもたらす。最も重症な場合において、このような免疫応答
は、潜在的に腎不全を引き起こし得る、免疫複合体の大規模な形成をもたらし得
る。従って、本発明の治療法の実施にて使用される好ましいモノクローナル抗体
は、高い親和性で標的84P2A9抗原に特異的に結合するが、患者において低
い抗原性を示すかまたは全く抗原性を示さない、完全にヒトであるかまたはヒト
化されているかのいずれかである抗体である。
Abの組み合わせまたはカクテルの投与を意図する。このようなmAbカクテル
は、それらが、異なるエピトープを標的とするmAbを含むか、異なるエフェク
ター機構を利用するか、または免疫エフェクター機能性に依存するmAbと直接
細胞傷害性mAbを組み合わせるのと同じ程度に、特定の利点を有し得る。組み
合わせたこのようなmAbは、相乗的治療効果を示し得る。さらに、抗84P2
A9 mAbの投与は、種々の化学療法薬剤、アンドロゲン遮断薬、および免疫
モジュレーター(例えば、IL−2、GM−CSF)を含むがこれらに限定され
ない、他の治療薬剤と組み合され得る。抗84P2A9 mAbは、それらの「
裸」の形態または非結合体化形態で投与されるか、またはそれらに結合体化した
治療薬剤を有し得る。
介して投与される。投与の潜在的に有効な経路としては、静脈内経路、腹腔内経
路、筋肉内経路、腫瘍内経路、皮内経路などが挙げられるが、これらに限定され
ない。処置は一般的に、受容可能な投与経路(例えば、静脈注射(IV))を介
する、代表的には約0.1〜約10mg/kg体重の範囲の用量での、抗84P
2A9抗体調製物の反復投与を包含する。10〜500mg mAb/週の範囲
の用量が、効果的であり得かつ十分に許容され得る。
づいて、抗84P2A9 mAb調製物の初回負荷用量約4mg/kg患者体重
のIVに引き続く、毎週の用量約2mg/kgのIVが、受容可能な投薬レジメ
ンを示し得る。好ましくは、この初回負荷量が、90分以上の注入として投与さ
れる。周期的維持用量は、30分以上の注入として投与されるが、ただし、その
初回量が十分に許容される場合に限る。しかし、当業者が理解するように、種々
の因子が、特定の場合における理想的な用量レジメンに影響する。このような因
子としては、例えば、使用されるAbまたはmAbの結合親和性および半減期、
患者における84P2A9発現の程度、循環する放出された(shed)84P
2A9抗原の程度、所望される安定状態の抗体濃度レベル、処置の頻度、および
本発明の処置方法と組み合わせて使用される化学療法薬剤の影響ならびに特定の
患者の健康状態が、挙げられ得る。
するために、所定のサンプル中の84P2A9のレベル(例えば、循環する84
P2A9および/または84P2A9発現細胞のレベル)について評価されるべ
きである。このような評価はまた、治療を通じモニターする目的のために使用さ
れ、そして他のパラメーター(例えば、前立腺癌治療における血清PSAレベル
)を評価することと組み合わせて、治療の成功を判断するために有用である。
2A9の結合または他のタンパク質との84P2A9の結合を阻害するための、
種々の方法および組成物、ならびに84P2A9機能を阻害するための方法を包
含する。
ドする組換えベクターが、84P2A9を発現する細胞中へと遺伝子移入技術を
介して導入され得、その遺伝子移入技術において、そのコードされる単鎖抗84
P2A9抗体が細胞内発現され、84P2A9タンパク質に結合し、そしてそれ
により84P2A9タンパク質の機能を阻害する。このような細胞内単鎖抗体を
操作するための方法は周知である。このような細胞内抗体(「内部抗体(int
rabody)」としても公知)は、その細胞内の特定の区画に特異的に標的化
され得、その処置の阻害活性が焦点となる制御を提供する。この技術は、当該分
野で首尾良く適用されている(概説として、RichardsonおよびMar
asco、1995、TIBTECH、第13巻を参照のこと)。内部抗体は、
別の豊富な細胞表面レセプターの発現を事実上除去することが示されている。例
えば、Richardsonら、1995、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 92:3137〜3141;Beerliら、1994、J.B
iol.Chem.289:23931〜23936;Deshaneら、19
94、Gene Ther.1:332〜337を参照のこと。
鎖の可変ドメインを含み、そして単一のポリペプチドとして発現される。必要に
応じて、単鎖抗体は、その軽鎖定常領域に結合された単鎖可変領域フラグメント
として発現される。周知の細胞内輸送シグナルが、発現される内部抗体を所望の
細胞内区画に対して正確に標的化するために、このような単鎖抗体をコードする
組換えポリヌクレオチドベクター中に操作され得る。例えば、小胞体(ER)に
標的化された内部抗体は、リーダーペプチドを組み込むように、そして必要に応
じてC末端ER保持シグナル(例えば、KDELアミノ酸モチーフ)を組み込む
ように、操作され得る。核において活性を発揮することが意図される内部抗体は
、核局在化シグナルを含むように操作され得る。脂質部分が、原形質膜の細胞質
ゾル側に内部抗体をつなぐために、その内部抗体に結合される。内部抗体はまた
、細胞質ゾルにおいて機能を発揮するように標的化される。例えば、細胞質内部
抗体を使用して、細胞質ゾル内に因子を隔離し得、それによりそれらの因子がそ
の天然での細胞での終着点に輸送されることを防ぎ得る。
、それにより核内でその活性を阻害する。核標的化シグナルは、所望の標的化を
達成するために、84P2A9のような内部抗体に操作される。このような84
P2A9内部抗体は、特定の84P2A9ドメインを特異的に結合するように設
計される。別の実施形態において、84P2A9タンパク質に特異的に結合する
細胞質ゾル内部抗体を使用して、84P2A9が核へのアクセスを得ることを妨
げ、それにより、核内での任意の生物学的活性を発揮することを妨げる(例えば
、84P2A9が他の因子と転写複合体を形成するのを妨げる)。
内部抗体の転写は、適切な腫瘍特異的プロモーターおよび/またはエンハンサー
の調節制御下に配置される。内部抗体発現を前立腺に特異的に標的化するために
、例えば、PSAプロモーターおよび/またはプロモーター/エンハンサーが、
利用され得る(例えば、米国特許第5,919,652号を参照のこと)。
その結合パートナーに接近/結合することまたは他のタンパク質と結合すること
を妨げる、組換え分子が、84P2A9機能を阻害するために使用される。この
ような組換え分子は、例えば、84P2A9特異的抗体分子の反応性部分を含み
得る。特定の実施形態において、84P2A9結合パートナーの84P2A9結
合ドメインが、ヒトIgG(例えば、ヒトIgG1)のFc部分に連結された2
つの84P2A9リガンド結合ドメインを含む、二量体融合タンパク質へと操作
される。このようなIgG部分は、例えば、GH2ドメインおよびGH3ドメイ
ンならびにヒンジ領域を含み得るが、GH1ドメインは含み得ない。このような
二量体融合タンパク質は、可溶性形態で、84P2A9の発現と関係する癌(前
立腺癌および精巣癌を含むがこれらに限定されない)に罹患する患者に投与され
得、ここでこの二量体融合タンパク質は84P2A9に特異的に結合し、それに
より84P2A9の結合パートナーとの相互作用をブロックする。このような二
量体融合タンパク質は、公知の抗体連結技術を使用してさらに組み合わされて、
多量体タンパク質に合わされる。
を阻害するための、種々の方法および組成物を提供する。同様に、本発明はまた
、84P2A9 mRNAからタンパク質への翻訳を阻害するための、方法およ
び組成物も提供する。
4P2A9遺伝子を84P2A9アンチセンスポリヌクレオチドと接触させる工
程を包含する。別のアプローチにおいて、84P2A9 mRNAの翻訳を阻害
する方法は、84P2A9 mRNAをアンチセンスポリヌクレオチドと接触さ
せる工程を包含する。別のアプローチにおいて、84P2A9特異的リボザイム
が、84P2A9メッセージを切断するために使用され、それにより翻訳を阻害
する。このようなアンチセンスに基づく方法およびリボザイムに基づく方法はま
た、84P2A9遺伝子の調節領域(例えば、84P2A9プロモーターエレメ
ントおよび/またはエンハンサーエレメント)に関し得る。同様に、84P2A
9遺伝子転写因子を阻害し得るタンパク質が、84P2A9 mRNA転写を阻
害するために使用され得る。上述の方法において有用な種々のポリヌクレオチド
および組成物が、上記されている。転写および翻訳を阻害するためのアンチセン
ス分子およびリボザイム分子の使用は、当該分野で周知である。
る他の因子もまた、84P2A9を発現する癌の処置に有用であり得る。同様に
、84P2A9のプロセシングと干渉し得る因子は、84P2A9を発現する癌
の処置に有用である。このような因子を利用する癌の処置方法もまた、本発明の
範囲内にある。
に、治療用ポリヌクレオチド分子(すなわち、アンチセンス、リボザイム、内部
抗体をコードするポリヌクレオチドおよび他の84P2A9阻害分子)を送達す
るために使用され得る。多数の遺伝子治療アプローチが、当該分野で公知である
。84P2A9アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、84P2A9転写
と干渉し得る因子などをコードする組換えベクターは、このような遺伝子治療ア
プローチを使用して標的腫瘍細胞に送達され得る。
ジメンのいずれか1つと組み合わされ得る。これらの治療アプローチは、全ての
患者、特に、化学療法剤の毒性に十分に耐性ではない患者についての利点である
、化学療法の投薬量の減少、および/またはより低頻度の投与の使用を可能にし
得る。
ような組成物の組合せの抗腫瘍活性は、種々のインビトロおよびインビボアッセ
イ系を使用して評価され得る。治療の可能性を評価するためのインビトロアッセ
イとしては、細胞増殖アッセイ、軟寒天アッセイおよび腫瘍促進活性を示す他の
アッセイ、治療用組成物が結合パートナーへの84P2A9の結合を阻害する程
度を決定し得る結合アッセイなどが挙げられる。
て評価され得る。例えば、異種間前立腺癌モデル(ここで、ヒト前立腺癌の外植
片または継代された異種移植組織が、免疫無防備動物(例えば、ヌードマウスま
たはSCIDマウス)に導入される)は、前立腺癌に関して適切であり、そして
記載されている(Kleinら、1997,Nature Medicine
3:402〜408)。例えば、PCT特許出願WO98/16628,Saw
yersら(1998年4月23日公開)は、原発性腫瘍の発生、微小転移、お
よび後期段階の疾患の骨芽細胞性転移の形成特性を再現し得るヒト前立腺癌の種
々の異種移植モデルを記載する。効力は、腫瘍形成、腫瘍後退または転移などの
阻害を測定するアッセイを使用して推定され得る。以下の実施例もまた参照のこ
と。
いて有用である。1つの実施形態において、治療用組成物で処置された腫瘍保有
マウス由来の異種移植片は、アポトーシス病巣の存在について試験され得、そし
て未処置のコントロール異種移殖片保有マウスと比較され得る。アポトーシス病
巣が処置マウスの腫瘍に見出される程度は、この組成物の治療効力の指標を提供
する。
なキャリアを含む薬学的組成物に処方され得る。適切なキャリアとしては、治療
用組成物と組み合わされる場合に、治療用組成物の抗腫瘍機能を保持し、かつ患
者の免疫系と一般に非反応性である、任意の物質が挙げられる。例としては、任
意の多数の標準的な薬学的キャリア(例えば、滅菌リン酸緩衝化生理食塩水溶液
、静菌水など)が挙げられるがこれらに限定されない(一般には、Reming
ton’s Pharmaceutical Sciences(第16版),
A.Osal.編、1980を参照のこと)。
任意の経路を通じて投与され得る。潜在的に効果的な投与経路としては、静脈内
、非経口、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内、器官内、眼内などが挙げられるがこ
れらに限定されない。静脈内注射に好ましい処方物は、保存静菌水、滅菌非保存
水の治療用組成物溶液を含み、そして/または注射用0.9%滅菌塩化ナトリウ
ム(USP)を含むポリビニルクロリドまたはポリエチレンバッグに希釈される
。治療用タンパク質調製物は、凍結乾燥され得、そして滅菌粉末として、好まし
くは減圧下で貯蔵され得、次いで注射する前に、例えば、ベンジルアルコール保
存剤を含む静菌水中に、または滅菌水中に再溶解され得る。
法および標的の癌とともに変化し、そして一般に、当該分野で理解される多数の
他の因子に依存する。
行した前立腺癌および転移した前立腺癌で高度に発現されることが示される。こ
の発現パターンは、癌−精巣(Cancer−Testis)(CT)抗原また
はMAGE抗原(黒色腫および他の癌において上方制御される、精巣特異的遺伝
子である)を連想させる(Van den EyndeおよびBoon,Int
J Clin Lab Res.27:81〜86,1997)。84P2A
9の組織特異的発現および癌での高い発現レベルに起因して、MAGE抗原は、
現在癌ワクチンの標的として検討されている(Durrant,Antican
cer Drugs 8:727〜733,1997;Reynoldsら、I
nt J Cancer 72:972〜976,1997)。
癌ワクチン、およびDNAベースのワクチンを提供する。84P2A9の発現を
考慮すると、癌ワクチンは、非標的組織に対して非特異的効果を生じることなく
、84P2A9を発現している癌の特異的な予防および/または処置に効果的で
ある。抗癌療法での使用について、液性免疫および細胞媒介性免疫を生成するワ
クチンにおける腫瘍抗原の使用は、当該分野で周知であり、そしてヒトPSMA
およびげっ歯類PAP免疫原を使用して、前立腺癌に使用されている(Hodg
eら、1995,Int.J.Cancer 63:231〜237;Fong
ら、1997、J.Immunol.159:3113〜3117)。
は84P2A9をコードする核酸分子、および84P2A9免疫原(これは、代
表的に多数の体液性またはT細胞エピトープ免疫反応性エピトープを含む)を発
現し、かつ適切に提示し得る組換えベクターを用いることによって容易に実施さ
れ得る。この文脈において、当業者は、免疫反応性エピトープの送達のための広
範な種々の異なるワクチンシステムが公知であることを理解する(例えば、He
rylnら、Ann Med 1999 Feb;31(1)66〜78;Ma
ruyamaら、Cancer Immunol Immunother 20
00 Jun;49(3):123〜32)。要するに、このような技術は、哺
乳動物において免疫応答(例えば、体液および/または細胞媒介性応答)を生じ
る方法から構成され、哺乳動物の免疫系を免疫反応性エピトープ(例えば、配列
番号2に示される84P2A9タンパク質のエピトープ)に曝露する工程を包含
する。これにより、哺乳動物は、そのエピトープに特異的な免疫応答を生じる(
例えば、そのエピトープを特異的に認識する抗体を生成する)。好ましい方法に
おいて、84P2A9免疫原は、生物学的モチーフを含む。非常に好ましい実施
形態では、84P2A9免疫原は、当該分野で周知の適切な分析技術の1つを用
いて同定された1つ以上のアミノ酸配列(例えば、表1に示される配列)を含む
。
周知である(例えば、ハイブリドーマの生成における第一工程として)。哺乳動
物において免疫応答を生成する方法は、哺乳動物の免疫系をタンパク質上の外因
性免疫原性エピトープ(例えば、配列番号2の84P2A9タンパク質)に曝露
し、それによって免疫応答を生じる工程を包含する。代表的な実施形態は、宿主
を十分な量の84P2A9またはB細胞もしくは細胞傷害性T細胞が惹起したエ
ピトープまたはそのアナログと接触させて;そしてその後少なくとも一定の間隔
でこの宿主をさらなる84P2A9またはB細胞もしくは細胞傷害性T細胞が惹
起したエピトープまたはそのアナログと接触させることによって、宿主における
84P2A9に対する免疫応答を生成する方法からなる。特定の実施形態は、8
4P2A9タンパク質またはマルチエピトープペプチドに対する免疫応答を生じ
る方法からなる。この方法は、ワクチン調製物中の84P2A9免疫原(例えば
、84P2A9タンパク質またはそのペプチドフラグメント、84P2A9融合
タンパク質など)をヒトまたは動物に投与する工程を包含する。代表的には、こ
のようなワクチン調製物は、さらに適切なアジュバントを含む。(例えば、米国
特許第6,146,635号を参照のこと)。これらの方法における代表的改変
は、84P2A9免疫原に対して、個体中で免疫応答を生成する方法からなる。
この方法は、インビボで個体の体の筋肉または皮膚に対して、以下からなる群よ
り選択されるような遺伝子ワクチン促進因子(facilitator)を投与
する工程を包含する:陰イオン性脂質;サポニン;レクチン;エストロゲン化合
物;ヒドロキシル化低級アルキル;ジメチルスルホキシド;および尿素;ならび
にDNA分子(感染性因子から解離し、そして84P2A9免疫原をコードする
DNA配列を含む。このDNA配列は、このDNAの発現を制御する調節配列に
作動可能に連結されており;ここでこのDNA分子は、細胞に取り込まれ、この
DNA配列は、細胞中で発現され、そして免疫応答がこの免疫原に対して生成さ
れる)。(例えば、米国特許第5,962,428号を参照のこと)。
送達系が、84P2A9をコードする核酸分子を送達するために用いられ得る。
本発明のこの局面の実施において使用され得る種々のウイルス遺伝子送達系は、
以下を包含するが、これらに限定されない:ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス
、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイ
ルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、およびシンドビスウイルス(Re
stifo、1996、Curr.Opin.Immunol.8:658−6
63)。非ウイルス送達系もまた使用され、84P2A9タンパク質またはその
フラグメントをコードする裸のDNAを用いて、抗腫瘍応答を誘導するために患
者に導入され得る(例えば筋内または皮内に)。1つの実施形態において、全長
ヒト84P2A9 cDNAを用いる。別の実施形態では、特定の細胞傷害性T
リンパ球(CTL)エピトープをコードする84P2A9核酸分子が用いられ得
る。CTLエピトープは、特定化されたHLA対立遺伝子に最適に結合し得る、
84P2A9タンパク質内のペプチドを同定するための特定のアルゴリズム(例
えば、Epimer、Brown University)を用いて決定され得
る。
の免疫系に84P2A9抗原を呈示するための樹状細胞の使用を包含する。樹状
細胞は、MHCクラスIおよびII分子、B7共同刺激因子(co−stimu
lator)、およびIL−12を発現し、そして従って、高度に分化された(
specialized)抗原提示細胞である。前立腺癌では、前立腺特異的膜
抗原(PSMA)のペプチドでパルスされた自己樹状細胞が、第I相臨床試験に
おいて、前立腺癌患者の免疫系を刺激するために使用されつつある(Tjoaら
、1996、Prostate 28:65−69;Murphyら、1996
、Prostate 29:371−380)。従って、樹状細胞は、MHCク
ラスIおよびII分子の場合において、T細胞に対して84P2A9ペプチドを
提示するために使用され得る。1つの実施形態では、自己樹状細胞は、MHCク
ラスIおよび/またはクラスII分子に結合し得る84P2A9ペプチドでパル
スされる。別の実施形態では、樹状細胞は、完全84P2A9タンパク質でパル
スされる。なお別の実施形態は、当該分野で公知の種々の実行ベクター(例えば
、アデノウイルス(Arthurら、1997、Cancer Gene Th
er.4:17−25)、レトロウイルス(Hendersonら、1996、
Cancer Res.56:3763−3770)、レンチウイルス、アデノ
随伴ウイルス、DNAトランスフェクション(Ribasら、1997、Can
cer Res.57:2865−2869)、および腫瘍由来RNAトランス
フェクション(Ashleyら、1997、J.Exp.Med.186:11
77−1182))を用いて樹状細胞における84P2A9遺伝子の過剰発現を
操作することを包含する。84P2A9を発現する細胞は、免疫調節因子(例え
ば、GM−CSF)を発現するように操作され得、そして免疫剤として使用され
得る。
9タンパク質を発現する細胞に対する免疫応答を惹起するためのワクチンとして
使用され得る。詳細には、抗イディオタイプ抗体の生成は、当該分野で周知であ
り、そして84P2A9タンパク質上のエピトープを模倣する抗イディオタイプ
抗84P2A9抗体を生成するように容易に適合され得る(例えば、Wagne
rら、1997、Hybridoma 16:33−40;Foonら、199
5、J Clin Invest 96:334−342;Herlynら、1
996、Cancer Immunol Immunother 43:65−
76を参照のこと)。このような抗イディオタイプ抗体は、癌ワクチンストラテ
ジーにおいて使用され得る。
な体液性免疫応答および細胞性免疫応答を生成するために使用され得る。84P
2A9関連タンパク質/免疫原をコードするDNAおよび適切な調節配列を含む
構築物は、個体の筋肉または皮膚に直接的に注射され得、それにより、筋肉また
は皮膚の細胞が、この構築物を取り込み、そしてコードされた84P2A9タン
パク質/免疫原を発現する。あるいは、ワクチンは84P2A9関連タンパク質
を含む。84P2A9タンパク質免疫原の発現は、骨癌、結腸癌、膵臓癌、精巣
癌、子宮頸癌および卵巣癌に対する予防的または治療的な体液性免疫および細胞
性免疫の生成を生じる。当該分野で公知の種々の予防的および治療的遺伝子免疫
技術が使用され得る(概説については、インターネットアドレスwww.gen
web.comで公開されている情報および参考文献を参照のこと)。
よって、キットもまた提供される。このようなキットは、1つ以上のコンテナ(
容器)(例えば、バイアル、チューブなど)を厳重に閉じ込めて受容するように
区画化されるキャリアを備え得る。コンテナ手段のそれぞれは、本方法において
、使用されるべき別々の要素の1つを含む。例えば、コンテナは、検出可能に標
識された、または検出可能に標識され得るプローブを含み得る。このようなプロ
ーブは、それぞれ84P2A9関連タンパク質または84P2A9遺伝子または
メッセージに特異的な抗体またはポリヌクレオチドであり得る。キットが、標的
核酸配列を検出するために核酸ハイブリダイゼーションを利用する場合、キット
はまた、標的核酸配列の増幅用のヌクレオチドを含むコンテナ、および/または
レポーター分子(例えば、酵素標識、蛍光標識、または放射性同位体標識)に結
合されるレポーター手段(例えば、ビオチン結合タンパク質(例えば、アビジン
またはストレプトアビジン)を含むコンテナを有し得る。
販および使用者の観点で所望の物質(緩衝液、希釈剤、フィルター、ニードル、
シリンジ、およびパッケージ挿入物を含む)を含む1つ以上の他のコンテナを含
む。表示は、組成物が、特定の治療または非治療適用について使用されることを
示し、そしてまたインビボまたはインビトロのいずれかの使用(例えば、上記の
使用)についての説明を示し得るために、コンテナ上に存在し得る。
ャーコレクション(ATCC;10801 University Blvd.
Manassas、VA 20110−2209 USA)に、2000年1月
6日に寄託され、そしてATCC受託番号PTA−1151が確定されている。
び例示する。これらはいずれも、本発明の範囲の制限を意図するものではない。
ら入手し、記載のように生成した(Kleinら、1997、Nature M
ed.3:402−408)。アンドロゲン依存性LAPC−4異種移植片およ
びアンドロゲン非依存性LAPC−4異種移植片(それぞれLAPC−4 AD
およびAI)ならびにLAPC−9 ADおよびAI異種移植片を雄性SCID
マウスにおいて増殖させ、そしてレシピエント雄に小組織塊として継代させた。
LAPC−4 AIおよびLAPC−9 AI異種移植片は、LAPC−4 A
D腫瘍またはLACD−9腫瘍からそれぞれ誘導した。AD腫瘍を有する雄性マ
ウスを去勢し、そして2〜3ヶ月間飼育した。腫瘍が再増殖した後、この腫瘍を
採集し、そして去勢雄SCIDマウスにおいてまたは雌性SCIDマウスにおい
て継代させた。RNAおよびタンパク質の分析のためのヒト組織をUCLA(L
os Angeles,CA)のヒト組織リソースセンター(Human Ti
ssue Resource Center)(HTRC)およびQualTe
k,Inc.(Santa Barbara,CA)から得た。良性の前立腺過
形成組織サンプルは患者由来であった。
児血清を有するDMEM中で維持した。
いてTrizol試薬(Life Technologies、Gibco B
RL)においてホモジナイズし、総RNAを単離した。ポリA RNAを、Qi
agenのOligotex mRNA MiniキットおよびMidiキット
を用いて総RNAから精製した。総RNAおよびmRNAを、分光光度計分析(
O.D. 260/280nm)によって定量し、そしてゲル電気泳動によって
分析した。
Cは太文字表記) アダプター1: 5’CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCG
CCCGGGCAG3’(配列番号8) 3’GGCCCGTCCTAG5’(配列番号9)(ここで、CTAGは太文
字表記) アダプター2: 5’GTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGC
GGCCGAG3’(配列番号10) 3’CGGCTCCTAG5’(ここで、CTAGは太文字表記)(配列番号
11) PCRプライマー1: 5’CTAATACGACTCACTATAGGGC3’(配列番号12) ネスト化プライマー(NP)1: 5’TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGA3’(配列番号13)(
ここで3’末端のGAは太文字表記) ネスト化プライマー(NP)2: 5’AGCGTGGTCGCGGCCGAGGA3’(配列番号14)(ここ
で、3’末端のGAは太文字表記)。
癌で示差的に発現され得る遺伝子に対応するcDNAを同定した。SSH反応は
2つのLAPC−4 AD異種移植片からのcDNAを利用した。詳細には、8
4P2A9 SSH配列を差引き(subtraction)から同定した。こ
こで、LAPC−4 AD腫瘍(去勢後3日)由来のcDNAを、インタクトな
雄で増殖したLAPC−4 AD腫瘍由来のcDNAから差引き(サブトラクト
)した。インタクトな雄において増殖したLAPC−4 AD異種移植片腫瘍を
を「テスター」cDNAの供給源として使用し、一方、LAPC−4 AD腫瘍
(去勢後3日)由来のcDNAを、「ドライバー」cDNAの供給源として使用
した。
LONTECHのPCR−Select cDNA Subtraction
Kit、およびプライマーとして1ngのオリゴヌクレオチドDPNCDNを使
用して、上記のように、関連の異種移植片組織から単離された2μgのポリ(A
)+RNAから合成した。第一鎖および第二鎖合成を、キットの使用者マニュア
ルプロトコル(CLONTECH Protocol No.PT1117−1
、Catalog No.K1804−1)に記載のように実施した。得られた
cDNAをDpnIIで37℃で3時間消化した。消化したcDNAをフェノー
ル/クロロホルム(1:1)で抽出し、そしてエタノール沈殿した。
I消化cDNA(上述を参照のこと)と、ヒト良性前立腺肥大(BPH)、ヒト
細胞株HeLa、293、A431、Colo205、およびマウス肝臓由来の
消化cDNAの混合物とを組み合わせることにより生成した。
こと)からの1μlのDpnII消化cDNA(400ng)を希釈することに
より生成した。次いで、希釈したcDNA(2μl、160ng)を、総容量1
0μlで16℃で一晩、400uのT4 DNAリガーゼ(CLONTECH)
を用いて、別の連結反応中で、2μlのアダプター1およびアダプター2(10
μM)に連結した。連結を、1μlの0.2M EDTAで、そして72℃で5
分間加熱して終結させた。
DNAを、1.5μl(20ng)のアダプター1連結のおよびアダプター2連
結のテスターcDNAを含む2つの各チューブに添加することにより実施した。
4μlの最終容量で、サンプルに鉱油を重層し、MJ Research サー
マルサイクラー中で、98℃で1.5分間変性し、次いで、68℃で8時間ハイ
ブリダイズさせた。次いで、2つのハイブリダイゼーションを、さらなる1μl
の新鮮な変性ドライバーcDNAと一緒に混合し、そして68℃で一晩ハイブリ
ダイズさせた。次いで、第二のハイブリダイゼーションを、200μlの20m
M Hepes、pH8.3、50mM NaCl、0.2mM EDTA中で
希釈し、70℃で7分間加熱し、そして−20℃で貯蔵した。
び配列決定) SSH反応から生じる遺伝子フラグメントを増幅するために、2つのPCR増
幅を行った。第一のPCR反応において、1μlの希釈最終ハイブリダイゼーシ
ョン混合物を、最終容量25μlの1μlのPCRプライマー1(10μM)、
0.5μl dNTP混合物(10μM)、2.5μlの10×反応緩衝液(C
LONTECH)、および0.5μlの50×Advantage cDNA
polymerase Mix(CLONTECH)に添加した。PCR1を、
以下の条件を用いて実施した:75℃で5分、94℃で25秒、次いで27サイ
クルの以下:94℃で10秒、66℃で30秒、72℃で1.5分。5つの別の
第一のPCR反応を各実験について行った。産物をプールし、そして水で1:1
0に希釈した。第二のPCR反応については、プールし、そして希釈した第一の
PCR反応物からの1μlを、プライマーNP1およびNP2(10μM)をP
CRプライマー1の代わりに使用したことを除き、PCR1について用いたもの
と同じ反応混合物に添加した。PCR2を、10〜12サイクルの以下:94℃
で10秒、68℃で30秒、72℃で1.5分を用いて実施した。PCR産物を
、2%アガロースゲル電気泳動を用いて分析した。
を用いてpCR2.1に挿入した。形質転換E.coliを青/白選択およびア
ンピシリン選択に供した。白色コロニーを釣り上げ、96ウェルプレート中に並
べ、そして液体培養中で一晩増殖させた。挿入物を同定するために、PCR増幅
をPCR1の条件ならびにプライマーとしてNP1およびNP2を用いて1ml
の細菌培養物において実施した。PCR産物を2%アガロースゲル電気泳動を用
いて分析した。
プラスミドDNAを調製し、配列決定し、そしてGenBank、dBest、
およびNCI−CGAPデータベースの核酸相同性検索に供した。
mplificationシステムを用いるオリゴ(dT)12〜18プライミ
ングによって1μgのmRNAから生成した。製造者プロトコルを使用し、そし
てこれは、42℃で50分間の逆転写酵素とのインキュベーション、続いて37
℃で20分間のRNAse H処理を包含した。反応を完了した後、この容積を
、標準化の前に水で200μlに増大させた。16の異なる正常ヒト組織由来の
第一鎖cDNAを、Clontechから入手した。
cgcgctcgtcgtcgacaa3’(配列番号15)および5’agc
cacacgcagctcattgtagaagg3’(配列番号16)を用い
てβアクチンを増幅することにより実施した。第一鎖cDNA(5μl)を、0
.4μMプライマー、0.2μM各dNTP、1×PCR緩衝液(Clonte
ch、10mM Tris−HCL、1.5mM MgCl2、50mM KC
l、pH8.3)、および1×Klentaq DNAポリメラーゼ(Clon
tech)を含む総容量50μlで増幅した。18サイクル、20サイクルおよ
び22サイクルで、5μlのPCR反応物を取り出し、そしてアガロース電気泳
動のために使用した。PCRを、以下の条件下で、MJ Researchサー
マルサイクラーを用いて実施した:初期変性は94℃で15秒間であり、続いて
18サイクル、20サイクル、および22サイクルの以下:94℃で15、65
℃で2分、72℃で5秒、である。72℃での最終伸長を2分間行った。アガロ
ースゲル電気泳動後、複数の組織からの283bpのβアクチンバンドのバンド
強度を可視検査によって比較した。22サイクルのPCR後に全ての組織におい
て等しいβアクチンバンド強度を生じるように、第一鎖cDNAの希釈因数を算
定した。22サイクルのPCR後に全ての組織において等しいバンド強度を達成
するには、3ラウンドの標準化が必要であった。
一鎖cDNAを、以下のプライマー対を用いる25、30、および35サイクル
の増幅を用いるPCRによって分析し得る。これらプライマーは、(MIT;詳
細については、www.genome.wi.mit.eduを参照のこと)の
補助により設計し得る。
することにより達成し得る。
メントクローン(SSHクローン)の単離に至った。全ての候補クローンを配列
決定し、そして、対応する遺伝子の正体に関する情報を提供し、そして示差的な
発現について特定の遺伝子を分析するための決定を導くのを補助するために、主
な公的な遺伝子およびESTデータベース中の全配列に対する相同性分析に供し
た。一般に、検索したデータベースのいずれかにおいていかなる公知の配列とも
相同性を有さず、従って新規な遺伝子を表すと考えられる遺伝子フラグメント、
ならびに以前に配列決定された発現配列タグ(EST)に対して相同性を示す遺
伝子フラグメントを、RT−PCRおよび/またはノーザン分析によってディフ
ァレンシャル(示差的)発現分析に供した。
に有意な相同性を示すが、既知の遺伝子のいずれに対しても相同性は示さなかっ
た、そして84P2A9と名づけられた。
ける高度な前立腺および精巣の関連発現パターンを示した(図4)。
)を、LAPC−4 AD cDNAライブラリー(Lambda ZAP E
xpress,Stratagane)からクローニングした(図2)。このc
DNAは、504アミノ酸のオープンリーディングフレーム(ORF)をコード
する。配列分析によって、6つの可能性のある核局在化シグナルの存在が示され
、そしてPSORTプログラム(http://psort.nibb.ac.
jp:8800/form.html)を用いて核であることが予測される。タ
ンパク質配列は、ヒト脳タンパク質KIAA1152(337アミノ酸領域にわ
たって39.5%同一性)と相同であり、そしてLUCA15腫瘍サプレッサー
タンパク質と相同であるドメインを示す(42アミノ酸領域にわたって64.3
%同一性)(GenBank登録番号#P52756)(図3)。84P2A9
cDNAは、プラスミドp84P2A9−1として、アメリカンタイプカルチ
ャーコレクション(ATCC;Manassas,VA)に2000年1月5日
に寄託され、そして登録番号PTA−1151を割り当てられた。
が、この配列は、精巣由来のいくつかのESTと重複する。
れた84P2A9 SSHフラグメント(実施例1)を用いる、全部で16の異
なる正常ヒト組織を含む、2つの多重組織ブロット(Clontech;Pal
o Alto、California)のノーザンブロッティングによって分析
した。RNAサンプルを、βアクチンプローブを用いて定量的に標準化した。こ
の結果は、正常精巣および前立腺における、2.4kbおよび4.5kbの転写
物の発現を実証した(図4)。
ィングを、LAPC異種移植片由来のRNAにおいて実施した。結果は、全ての
異種移植片において高いレベルの84P2A9発現を示し、LAPC−9 AD
、LAPC−9 AIにおいて最高レベルが検出された(図4および5)。これ
らの結果は、84P2A9が、前立腺癌において上方制御されることの証拠を提
供する。
U2−OS)、肺(CALU−1、NCI−H82,NCI−H146)、およ
び腎臓(769−P、A498、CAKI−1、SW839)の癌細胞株におい
て検出された(図5)。中度の発現レベルが、いくつかの膵臓(PANC−1、
BxPC−3、HAPC、CAPAN−1)、結腸(SK−CO−1、CACO
−2、LOVO、COLO−205)、骨(SK−ES−1、RD−ES)、乳
房(MCF−7、MDA−MB−435s)および精巣癌(NCCIT)の細胞
株で検出された(図5)。
方における84P2A9の発現を示す(図6)。これらの結果は、84P2A9
が、前立腺癌および可能性としては他の癌で上方制御される、非常に精巣特異的
な遺伝子であることを示唆する。MAGE抗原と同様に、このように84P2A
9は、癌−精巣抗原としてみなされ得る(Van den EyndeおよびB
oon,Int J Clin Lab Res.27:81〜86,1997
)。
び数個の癌細胞株を代表する)を含むマルチ組織RNAドットブロットを用いて
さらに分析され得る。
以上の注射によって、哺乳動物中で惹起できる。代表的には、免疫剤および/ま
たはアジュバントは、複数の物質または腹膜注射によって哺乳動物に注射される
。代表的に、ペプチドは、84P2A9のコード領域から設計され得る。代替的
に(あるいは)、免疫剤は、84P2A9タンパク質の全てもしくは一部、また
はそれらの融合タンパク質を含み得る。例えば、84P2A9アミノ酸配列は、
当該分野で周知の種々の公知の融合タンパク質パートナーのいずれか1つ(例え
ば、マルトース結合タンパク質、LacZ、チオレドキシンまたは免疫グロブリ
ン定常領域)に融合され得る(例えば、Current Protocols
In Molecular Biology,第2巻、16ユニット、Fred
erick M.Ausubulら、編.,1995;Linsley,P.S
.,Brady,W.,Urnes,M.,Grosmaire,L,Daml
e,N.,およびLedbetter,L.(1991)J.Exp.Med.
174.561−566)。他のこのような組換え細菌タンパク質としては、グ
ルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、および84P2A9のHIS
タグ化融合タンパク質(適切なアフィニティーマトリックスを用いて誘導細菌か
ら精製され得る)が挙げられる。
して免疫剤を結合体化することは有用であり得る。このような免疫原性タンパク
質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサ
イログロブリン、およびダイズトリプシンインヒビターが挙げられるがこれらに
限定されない。使用され得るアジュバントの例としては、フロイント完全アジュ
バントおよびMPL−TDMアジュバント(モノホスホリル LipidA、合
成トレハロースジコリノマイコレート)が挙げられる。
に混合した約200μgの融合タンパク質またはKLH−ペプチドを用いて皮下
に免疫した。次いで、約200μgの免疫原を含有する不完全フロイントアジュ
バントを2週間毎に皮下注射した。各免疫の後約7−10日に採血して、ELI
SAによる抗血清の力価モニタリングに用いる。
て、ウェスタンブロット分析および免疫沈降分析によって、抗血清の特異性を試
験する。84P2A9を発現するために、細胞を遺伝子操作するために、全長8
4P2A9 cDNAを発現ベクター(カルボキシ末端で6Hisタグを提供す
る)中にクローニングし得る(pCDNA 3.1 myc−his,InVi
trogen)。293T細胞への構築物のトランスフェクション後、細胞溶解
物を、免疫沈降し、そして抗−Hisまたはv5抗エピトープ抗体(Invit
rogen)および抗84P2A9血清を用いてウエスタンブロットし得る(図
11を参照のこと)。Hisタグ化タンパク質およびペプチドで免疫したウサギ
由来の血清、ならびに枯渇したGSTおよびMBPタンパク質血清を、Affi
gelマトリックス(BioRad)に共有結合したそれぞれの免疫原からなる
アフィニティーカラムを通過させることによって、精製する。
pGEX−6P−1中にクローニングすることによって、グルタチオンS−トラ
ンスフェラーゼ(GST)遺伝子に、融合した(Amersham Pharm
acia Biotech,NJ)。全ての構築物を作製してN末端で融合した
GSTおよびC末端の6つのヒスチジンエピトープとともに組換え84P2A9
タンパク質配列を精製した。ヒスチジンコドンをORFの3’末端でクローニン
グプライマーに付加することによって、6つのヒスチジンエピトープタグを生成
した。PreScissionTM認識部位によって、84P2A9からGST
タグの切断を可能にする。アンピシリン耐性遺伝子およびpBR322起点によ
ってE.coli中でのプラスミドの選択および維持が可能になる。この構築物
において、84P2A9のアミノ酸1〜151を含有するフラグメントを、pG
EX−6P−1にクローニングした。さらなる構築物を84P2A9タンパク質
のpGEX−6P−1にまたがる領域(例えば、アミノ酸1〜504およびアミ
ノ酸151〜504)中に作製し得る。
A9 cDNAを、例えば、C末端に6Hisタグを提供する発現ベクター(p
CDNA3.1 myc−his、InVitrogen)中にクローン化し得
る。これらの構築物は、293T細胞中にトランスフェクトされ得る。トランス
フェクトされた293T細胞溶解液は、ウェスタンブロットにおいて上記実施例
4に記載された抗−84P2A9ポリクローナル血清でプローブされ得る。
neo中にサブクローン化し得、そして以下のように84P2A9発現細胞株0
確立するために用い得る。84P2A9コード配列(翻訳開始ATG〜停止コド
ンまで)は、84P2A9 cDNAからds cDNAテンプレートを用いて
PCRにより増幅される。PCR産物を、ベクター上のEcoR1(平滑末端化
)およびXba1制限部位を介してpSRαMSVtkneo中にサブクローン
化し、そしてDH5αコンピテント細胞中に形質転換する。コロニーを釣り上げ
、cDNA上の特有の内部制限部位をもつクローンをスクリーニングする。陽性
のクローンは、このcDNA挿入片の配列決定により確認する。その後、レトロ
ウイルスを、例えば、NIH3T3、TsuPr1、293またはrat−1細
胞を用いる、種々の細胞株の感染および生成のために用い得る。
A9の産生) 哺乳動物細胞において84P2A9を発現するため、1512bp(504ア
ミノ酸)の84P2A9 ORFを、完全な翻訳開始Kozakコンセンサス配
列をとともに、pcDNA3.1/V5−His−TOPO(Invitrog
en,Carlsbad,CA)中にクローニングした。タンパク質発現は、サ
イトメガロウイルス(CMV)プロモーターから駆動される。組換えタンパク質
は、V5エピトープおよび6つのヒスチジン(C末端に融合された)を有する。
pcDNA3.1/V5−His−TOPOベクターはまた、ウシ成長ホルモン
(BGH)ポリアデニル化シグナルおよび転写終止配列(mRNAの安定性を強
化する)を含み、そしてエピソーム複製のためのSV40起点およラージT抗原
を発現する細胞株中の単一ベクターレスキューを伴う。ネオマイシン耐性遺伝子
が、このタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシ
リン耐性遺伝子およびColE1起点が、E.coli中でのプラスミドの選択
および維持を可能にする。
bp(517アミノ酸)ORFをpSRa構築物中にクローニングする。pSR
a構築物の293T−10A1パッケージング株へのトランスフェクション、ま
たは293細胞中のpSRaおよびヘルパープラスミド(φ )の同時トランス
フェクションによって、それぞれ、アンホトロピックおよびエクトトロピックな
レトロウイルスを生成する。このレトロウイルスを用いて、種々の哺乳動物細胞
株を感染し得、これによってクローニングした遺伝子84P2A9の宿主細胞株
への組み込みを生じる。タンパク質発現は、長末端反復配列(LTR)から駆動
される。ネオマイシン耐性遺伝子が、このタンパク質を発現する哺乳動物細胞の
選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびColE1起点が、E.
coliにおけるプラスミドの選択および維持を可能にする。さらなるpSRa
構築物を作製して、N末端およびC末端の両方のGFPおよび全長84P2A9
タンパク質のmyc/6HIS融合タンパク質を生成する。
めに、84P2A9 cDNAを、N末端にHis−タグを提供する、バキュロ
ウイルス転移ベクターpBlueBac4.5(Invitrogen)中にク
ローニングする。詳細には、pBlueBac−84P2A9を、ヘルパープラ
スミドpBac−N−Blue(Invitrogen)とともに、SF9(S
podoptera frugiperda)昆虫細胞中に同時トランスフェク
トし、組換えバキュロウイルスを生成する(詳細についてはInvitroge
nの指示マニュアルを参照のこと)。次いで、バキュロウイルスを細胞上清から
収集し、そしてプラークアッセイにより精製する。
ighFive昆虫細胞(InVitrogen)の感染により生成する。組換
え84P2A9タンパク質は、抗−84P2A9抗体を用いて検出され得る。8
4P2A9タンパク質は、精製され、そして種々の細胞を基礎にしたアッセイに
おいて、または84P2A9に特異的なポリクローナルおよびモノクローナル抗
体を生成するための免疫原として用いられ得る。
,Nat.Genetics 7:22)(Research Genetic
s,Huntsville AI)を用いて、84P2A9の染色体局在化を決
定した。以下のPCRプライマーを用いて、94P2A9を局在化した: 84P2A9.1 gacttcactgatgcgatggtaggt(配列
番号17) 84P2A9.2 gtcaatactttccgatgctttgct(配列
番号18) 93照射ハイブリッドパネルDNAについて得られたマッピングベクターは以下
であった: 000010001100101100100000110001001001
000010001010011000100000001001001001
010000000100000010000。このベクターおよびマッピング
プログラムは、http://www.genome.wi.mit.edu/
cgi−bin/contig/rhmapper.plで、染色体1q32.
3上の84P2A9に位置する(D1S1602−D1S217)。
化するか否かを決定するために、ルシフェラーゼ(luc)を基礎にした転写レ
ポーターアッセイを、84P2A9を発現する細胞中で実施する。これらの転写
レポーターは、良く特徴付けられたシグナル伝達経路の下流にある、既知の転写
因子のためのコンセンサス結合部位を含む。これらのレポーターおよびそれらの
関連転写因子、シグナル伝達経路、および活性化刺激物の例を、以下に列挙する
。 1.NFκB−luc、NFκB/Rel;Ik−キナーゼ/SAPK;成長/
アポトーシス/ストレス 2.SRE−luc、SRF/TCF/ELK1;MAPK/SAPK;成長/
分化 3.AP−1−luc、FOS/JUN;MAPK/SAPK/PKC;成長/
アポトーシス/ストレス 4.ARE−luc、アンドロゲンレセプター;ステロイド類/MAPK;成長
/分化/アポトーシス 5.p53−luc、p53;SAPK;成長/分化/アポトーシス 6.CRE−luc、CREB/ATF2;PKA/p38;成長/アポトーシ
ス/ストレス 84P2A9媒介効果は、mRNA発現を示す細胞中でアッセイされ得る。ル
シフェラーゼレポータープラスミドは、脂質媒介トランスフェクション(TFX
−50、Promega)により導入され得る。相対的転写活性であるルシフェ
ラーゼ活性の指標は、細胞抽出物のルシフェリン基質とのインキュベーションに
より測定され、そして反応の化学発光がルミノメーター中でモニターされる。
、完全フロイントアジュバント中に混合された、約10〜50μgのタンパク質
免疫原を用いて腹腔内に免疫する。タンパク質免疫原としては、細菌およびバキ
ュロウイルスが産生した組換え84P2A9タンパク質および哺乳動物が発現し
たヒトIgG FC融合タンパク質が挙げられる。次いでマウスに、フロイント
の不完全アジュバント中に混合された10〜50μgの抗原で2〜4週間毎に、
引き続いて免疫を行う。あるいは、Ribiアジュバントを最初の免疫に用いる
。さらに、DNAベースの免疫プロトコールを用いる。このプロトコールでは、
84P2A9 cDNA単独もしくはIgG FC融合をコードするpCDNA
3.1のような哺乳動物発現ベクターを用いて、プラスミドDNAの直接注射に
よってマウスを免疫する。このプロトコールを単独で、そしてタンパク質免疫原
と組み合わせて用いる。免疫後7〜10回採血をして、免疫応答の力価および特
異性をモニタリングする。一旦、適切な反応性および特異性(ELISA、ウエ
スタンブロットおよび免疫沈降分析によって決定)を得ると、次いで、当該分野
で周知の確立された手順で融合およびハイブリドーマ生成を行う(Harlow
およびLane,1988)。
ゼ(GST)融合タンパク質(84P2A9タンパク質を包含する)を合成して
、免疫原として用いる。BalbCマウスを、最初に、完全フロイントアジュバ
ント中に混合された、10〜50μgのGST−84P2A9融合タンパク質を
用いて腹腔内に免疫する。引き続いて、フロイントの不完全アジュバント中に混
合された10〜50μgのGST−84P2A9タンパク質で2週間毎に、全部
で3回マウスに免疫を行う。全長84P2A9タンパク質に対する、免疫マウス
由来血清の反応性を、293T細胞から発現されたHISタグ化84P2A9タ
ンパク質の部分的精製調製物を用いて、ELISAによってモニタリングする(
実施例5)。最強の反応性を示すマウスを、3週間休息させ、そしてPBS中の
融合タンパク質の最後の注射をし、次いで4日後に屠殺する。次いで屠殺マウス
の脾臓を回収し、そして標準的な手順を用いてSPO/2ミエローマ細胞に融合
する(HarlowおよびLane、1988)。HAT選択の後、増殖ウェル
からの上清を、ELISAおよびウエスタンブロットによりスクリーニングし、
84P2A9特異的抗体産生クローンを同定する。
し得る。親和性測定は、エピトープ結合に対する抗体の強さを定量し、そしてど
の84P2A9モノクローナル抗体が診断または治療使用に好適であるかを規定
するのを補助するために用いられ得る。BIAcoreシステム(Uppsal
a、Sweden)は、結合親和性を決定するための好適な方法である。BIA
coreシステムは、生体分子相互作用をリアルタイムでモニターするために、
表面プラスモン共鳴を用いる(SPR、Welford K.1991、Opt
.Quant.Elect.23:1;MortonおよびMyszka、19
98、Methods in Enzymology 295:268)。BI
Acore分析は、会合速度定数、解離速度定数、平衡解離定数、および親和性
定数を首尾良く生成する。
的役割を有するという証拠を提供する。84P2A9は、腫瘍形成または腫瘍形
成をブロックする遺伝子を抑制するのに関与する活性化合物遺伝子に関与する転
写因子として機能する可能性がある。84P2A9機能は、インビトロアプロー
チを用いて哺乳動物細胞中で評価され得る。哺乳動物発現については、84P2
A9は、pcDNA 3.1 myc−His−タグ(実施例5)およびレトロ
ウイルスベクターpSRαtkneo(Mullerら、1991、MCB 1
1:1785)を含む多くの適切なベクター中にクローン化され得る。このよう
な発現ベクターを用い、84P2A9は、NIH3T3、rat−1、TsuP
r1および293Tを含むいくつかの細胞株で発現され得る。84P2A9の発
現は、抗−84P2A9抗体を用いてモニターされ得る(実施例4および9を参
照のこと)。
ビボアッセイで試験され得、これには、組織培養中の細胞増殖,アポトーシスシ
グナルの活性化、SCIDマウスにおける腫瘍形成、および膜侵襲培養系を用い
るインビトロ侵襲(MICS)(Welchら、Int.J.Cancer 4
3:449−457)が含まれる。84P2A9細胞表現型を、84P2A9の
発現を欠く細胞の表現型と比較する。84P2A9の転写効果は、遺伝子アレイ
(Clontech)および転写レポーターアッセイ(Stratagene)
を用いて遺伝子発現上の84P2A9の効果を評価することによって試験され得
る。
ャンバ(Becton Dickinson)を通る細胞の通過を測定すること
により、侵襲および遊走性質の改変についてアッセイされ得る。対辺への膜を通
じる細胞の通過は、カルセイン−Am(Molecular Probes)を
負荷したインジケーター細胞を用いる蛍光アッセイ(Becton Dicki
nson Technical Bulletin #428)を用いてモニタ
ーされる。分析された細胞株は、親および84P2A9過剰発現PC3、NIH
3T3ならびにLNCaP細胞を含む。84P2A9発現細胞が化学誘引物質の
性質を有するか否かを決定するために、インジケーター細胞を、コントロール培
地に比較して84P2A9馴化培地の勾配に向かう多孔性膜を通じる通過につい
てモニターする。このアッセイをまた使用して、候補の癌治療組成物による84
P2A9で誘導される効果の特異的中和を定性および定量し得る。
よび移動)と連結された抗アンチセンスRNA技術を用いて評価され得る。アン
チセンスRNAオリゴヌクレオチドを、84P2A9発現細胞中に導入し得、そ
れによって84P2A9の発現を防ぐ。コントロールおよびアンチセンス含有細
胞を、増殖、侵襲、移動、アポトーシスおよび転写能力について分析し得る。8
4P2A9発現の損失の局所および全身効果が評価され得る。
ス中の遺伝子過剰発現によりインビボで評価され得る。例えば、SCIDマウス
に、各脇腹上に、tkNeo空ベクターまたは84P2A9を含む、PC3、T
SUPR1、またはDU145細胞のいずれかの1×106を皮下注射し得る。
少なくとも以下の2つのストラテジーが用いられ得る:(1)ポリオーマウイル
ス、鶏痘ウイルス(1989年7月5日に公開されたUK2,211,504)
、(アデノウイルス2のような)アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、ト
リザルコーマウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイ
ルスおよびシミアンウイルス40(SV40)のようなウイルスのゲノムから、
または例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター(このよ
うなプロモーターが宿主細胞系と適合するという条件で)の異種哺乳動物プロモ
ーターから得られた構成的プロモーターのようなプロモーターの調節下の、構成
的84P2A9発現、ならびに(2)(このようなプロモーターが宿主細胞系と
適合するという条件で)ecdysone、tetなどのような、誘導性ベクタ
ー系の制御下の調節発現。次いで、腫瘍容積を、触知可能な腫瘍の出現時にモニ
ターし、そして、経時的に、84P2A9発現細胞が、より速い速度で成長する
か否か、および84P2A9発現細胞により生成される腫瘍が、改変された病原
性の特徴(例えば、増大した転移、血管形成、化学的治療薬物に対して減少した
応答性)を示すか否かを決定する。さらに、マウスに、1×105の同じ細胞を
同所的に移植し得、84P2A9が、前立腺における局所成長に対する影響、ま
たは特に肺、リンパ節、および骨髄に特異的に転移する細胞の能力に対する影響
を有するか否かを決定する。
センス分子およびリボザイムのような)候補治療組成物の84P2A9阻害効果
を決定するために有用である。
の細胞位置は、細胞生物学で広く用いられる細胞下分画技法を用いて評価され得
る(Storrie Bら、Methods Enzymol.1990;18
2:203−25)。前立腺細胞株または精巣細胞株は、核、細胞質ゾルおよび
膜画分に分離され得る。異なる画分中の84P2A9発現は、ウェスタンブロッ
ティング技法を用いて試験され得る。
HISタグ84P2A9をコードする発現ベクター(PCDNA 3.1 MY
C/HIS、Invitrogen)でトランスフェクトし得る。このトランス
フェクト細胞を回収し、そして先に記載のように(Pemberton、P.A
.ら、1997、J of Histochemistry and Cyto
chemistry、45:1697−1706)、差示的細胞下分画プロトコ
ルに供し得る。このプロトコルは、細胞を、核、重膜(リソソーム、ペルオキシ
ソーム、およびミトコンドリア)、軽膜(原形質膜および小胞体)、および可溶
性タンパク質について濃縮された画分に分割する。
らの刊行物の開示は、それらの全体が本明細書に参考として援用されている。
、これらは、本発明の個々の局面の単なる例示として意図され、そして機能的に
等価である任意のものは、本発明の範囲内にある。本明細書に記載のこれらに加
えて、本発明のモデルおよび方法に対する種々の改変は、先行する記述および教
示から当業者に明らかとなり、そして本発明の範囲内に同様に入ることが意図さ
れる。このような改変またはその他の実施の形態は、本発明の真の範囲および思
想から逸脱することなく実施され得る。
HLA−A2に対する推定結合)
に対する推定結合のさらなる分析を提供する。
ブロック置換マトリックス)から改作した。値が高いほど、置換は関連する天然
のタンパク質中に見出される可能性が高い。
ハイブリダイゼーション(suppression subtractive
hybridization)(SSH)DNA配列(配列番号3)を示す。こ
の配列は、種々のアンドロゲン依存性LAPC異種移植片およびアンドロゲン非
依存性LAPC異種移植片由来のcDNAの比較において同定された。
(配列番号2)を示す。下記の実施例2を参照のこと。開始ATG(AAC A
TG G)(配列番号4)の周辺の配列は、Kozak配列(Aは−3位、そし
てGは+1位)を示す。Kozak配列の開始メチオニンを太字で示し、核局在
シグナルを四角で囲んだ。
列番号5)およびLUCA15(配列番号6)のアミノ酸配列とのアラインメン
トを示す。図3Aは、84P2A9タンパク質配列(下線)が、ヒト脳タンパク
質KIAA1152に対するいくらかの相同性を有することを示す(337アミ
ノ酸領域にわたり39.5%同一性、スコア:407.0;ギャップ頻度:5.
9%)。図3Bは、84P2A9タンパク質配列(下線)が、LUCA15癌抑
制遺伝子タンパク質の一部に対して相同なドメインを含むことを示す(42アミ
ノ酸領域にわたり64.3%同一性、スコア:138.0;ギャップ頻度:0.
0%)。
フラグメントを使用)およびLAPC異種移植片における、84P2A9の限定
された発現のノーザンブロット分析を示す。複数の組織の2つのノーザンブロッ
ト(Clontech)(図4Aおよび4B)ならびに異種移植片ノーザンブロ
ット(図4C)は、84P2A9 SSHフラグメントで検査した。図4Aのレ
ーン1〜8は、それぞれ心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓由
来のmRNAからなる。図4Bのレーン1〜8は、それぞれ脾臓、胸腺、前立腺
、精巣、卵巣、小腸、結腸および白血球由来の総RNAからなる。図4Cのレー
ン1〜5は、それぞれ前立腺、LAPC−4 AD、LAPC−4 AI、LA
PC−9 AD、LAPC−9 AI由来のmRNAからなる。キロベース(k
b)でのサイズ標準を、脇に示す。各レーンは、正常組織について2μgのmR
NAを、そして異種移植片組織について10μgの総RNAを含む。この結果は
、84P2A9の精巣および前立腺ならびにLAPC異種移植片における発現を
示す。
ロット分析を示す。レーン1〜56は、それぞれLAPC−4 AD、LAPC
−4 AI、LAPC−9 AD、LAPC−9 AI、LNCaP、PC−3
、DU145、TsuPr1、LAPC−4 CL、HT1197、SCaBE
R、UM−UC−3、TCCSUP、J82、5637、239T、RD−ES
、PANC−1、BxPC−3、HAPC、Capan−1、SK−CO−1、
CaCo−2、LoVo、T84、Colo−205、KCL 22、PFSK
−1、T98G、SK−ES−1、HOS、U2−OS、RD−ES、CALU
−1、A427、NCI−H82、NCI−H146、769−P、A498、
CAKI−1、SW839、BT20、CAMA−1、DU4475、MCF−
7、MDA−MB−435s、NTERRA−2、NCCIT、TERA−1、
TERA−2、A431、HeLa、OV−1063、PA−1、SW626お
よびCAOV−3における発現を示す。高レベルの84P2A9発現は、脳(P
FSK−1、T98G)、骨(HOS、U2−OS)、肺(CALU−1、NC
I−H82、NCI−H146)、および腎臓(769−P、A498、CAK
I−1、SW839)癌細胞株において検出された。中程度の発現レベルは、膵
臓(PANC−1、BxPC−3、HPAC、CAPAN−1)、結腸(SK−
CO−1、CACO−2、LOVO、COLO−205)、骨(SK−ES−1
、RD−ES)、乳房(MCF−7、MDA−MB−435s)および精巣癌(
NCCIT)細胞株のいくつかにおいて検出された。
分析を示す。前立腺癌患者サンプルは、前立腺組織の正常な部分および腫瘍部分
の両方における84P2A9の発現を示す。レーン1〜7は、それぞれ正常前立
腺、患者1の正常隣接組織、患者1のグリーソン9腫瘍、患者2の正常隣接組織
、患者2のグリーソン7腫瘍、患者3のグリーソン7腫瘍を示す。これらの結果
は、84P2A9が、前立腺癌において、そして潜在的には他の癌においてアッ
プレギュレートされる、まさに精巣特異的遺伝子であるという証拠を提供する。
従って、MAGE抗原と同様に、84P2A9は癌の精巣の抗原として適当であ
り得る(Van den EyndeおよびBoon、Int J Clin
Lab Res.27:81−86、1997)。
から単離されたRNAを示す。レーン1〜15は、それぞれ769−P−クリア
な細胞型;A498−クリアな細胞型;SW839−クリアな細胞型;正常腎臓
;患者1、N;患者1、腫瘍:患者2、N;患者2、腫瘍、クリアな細胞型、分
類III;患者3、N;患者3、腫瘍、クリアな細胞型、分類II/IV;患者
4、N;患者4、腫瘍、クリアな細胞型、分類II/IV;患者5、N;患者5
、腫瘍、クリアな細胞型、分類II;および患者6、腫瘍、胸部への転移、を示
す(N=正常な隣接組織およびCL=細胞株)。ノーザン分析を、各サンプルに
ついて10μgの総RNAを使用して実施した。84P2A9の発現は、試験し
た6つの腫瘍サンプル全て、ならびに3つの腎臓細胞株769−P、A498お
よびSW839において観察された。
織(N)から単離されたRNAを示す。レーン1〜11は、Colo205;L
oVo;T84;Caco−2;患者1、N;患者1、腫瘍分類2、T3N1M
x(リンパ節転移について陽性);患者2、N;患者2、腫瘍、分類1、T2N
0Mx;患者3、N;患者3、腫瘍、分類1、T2N1Mx(リンパ節転移につ
いて陽性);および患者4、腫瘍、分類2、T3 N1 MX(リンパ節転移に
ついて陽性)をそれぞれ示す(N=正常な隣接組織およびCL=細胞株)。ノー
ザン分析を、各サンプルについて総RNAの10μgを使用して実施した。84
P2A9の発現は、試験された4つの腫瘍サンプル全てにおいて、ならびに4つ
の結腸癌細胞株Colo205、LoVo、T84およびCaco−2において
観察された。
ぞれに対応する正常組織(N)のパネルにおけるRNAドットブロットで示す。
癌細胞株は、左から右に、HeLa(子宮頸癌)、Daudi(バーキットリン
パ腫)、K562(CML)、HL−60(PML)、G361(黒色腫)、A
549(肺癌)、MOLT−4(リンパ芽球性白血病)、SW480(結腸直腸
癌)およびRaji(バーキットリンパ腫)である。84P2A9発現は、腎臓
癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、胃癌、結腸癌、子宮頸癌および直腸癌において観察
された。84P2A9はまた、癌細胞株、特にMOLT−4リンパ芽球性白血病
細胞株およびA549肺癌腫細胞株のパネルにおいて高度に発現することが見出
された。発現は、(疾患組織から単離した)正常な隣接組織において検出された
が、健康なドナーから単離した正常な組織においては検出されなかった。この発
現は、これらの組織が完全には正常でないこと、そして84P2A9が腫瘍の初
期段階において発現され得ることを示し得る。
9の発現は、試験された膀胱癌患者の4つの検体において、ならびに3つの膀胱
細胞株(CL)、UM−UC−3(レーン1)、J82(レーン2)およびSC
ABER(レーン3)において観察された。RNAは、6人の膀胱癌患者(P)
から得られた正常な膀胱(Nb)、膀胱腫瘍(T)およびその隣接組織(N)か
ら単離された。P1由来の腫瘍は、遷移性癌腫、分類4;P2は、浸襲性扁平上
皮癌腫;P3は、遷移性癌腫、分類3;P4は、非浸襲性乳頭状癌腫、分類1/
3;P5は、乳頭状癌腫、分類3/3;およびP6は、遷移性癌腫、分類3/2
である。ノーザンブロット分析を、各サンプルについて10μgの総RNAを使
用して実施した。
3T細胞を、pCDNA3.1 V5−HISエピトープタグ化84P2A9プ
ラスミドまたは空のコントロールベクターのいずれかで、一過的にトランスフェ
クトし、そして2日後に回収した。細胞を、SDS−PAGEサンプル緩衝液中
で溶解し、そしてその溶解産物を10〜20%のSDS−PAGEゲル上で分離
し、次いでニトロセルロースに移した。このブロットを、Tris緩衝化生理食
塩水(TBS)+2%無脂肪乳中でブロッキングし、次いでマウス抗V5モノク
ローナル抗体(Invitrogen)のTBS+0.15%Tween−20
+1%乳での1:3,000希釈で探査した。このブロットを洗浄し、次いで抗
マウスIgG−HRP結合体化二次抗体の1:4,000希釈と共にインキュベ
ートした。洗浄後、抗V5エピトープ免疫反応性バンドを、増強された化学発光
によって発光させ、そしてオートラジオグラフィーフィルムに曝露することによ
って可視化した。矢印によって示されるのは、トランスフェクトした細胞におけ
るエピトープタグ化84P2A9タンパク質の発現に対応する、約87Kdの特
異的抗V5免疫反応性バンドである。
Claims (48)
- 【請求項1】 84P2A9関連タンパク質をコードするポリヌクレオチド
であって、ここで、該ポリヌクレオチドは、以下: (a)配列番号1に示される配列を有するポリヌクレオチドであって、ここで
、Tは、Uでもあり得る、ポリヌクレオチド; (b)ヌクレオチド残基番号165からヌクレオチド残基番号1676の、配
列番号1に示される配列を有するポリヌクレオチドであって、ここで、Tは、U
でもあり得る、ポリヌクレオチド; (c)84P2A9関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、
その配列が、アメリカンタイプカルチャーコレクションに登録番号PTA−11
51として寄託されたp129.1−US−P1と命名されたプラスミドに含ま
れるcDNAによってコードされる、ポリヌクレオチド; (d)84P2A9関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、
該84P2A9関連タンパク質が、その全長にわたって配列番号2に示されるア
ミノ酸配列に対して少なくとも90%同一である、ポリヌクレオチド;および (e)(a)〜(d)のうちのいずれか1つのポリヌクレオチドに完全に相補
的である、ポリヌクレオチド からなる群より選択される、ポリヌクレオチド。 - 【請求項2】 配列番号1に示されるポリペプチド配列をコードする、請求
項1に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項3】 請求項1に記載のポリヌクレオチドのフラグメントであって
、以下: (a)ヌクレオチド残基番号720からヌクレオチド残基番号1392の、配
列番号1に示される配列を有する、ポリヌクレオチド; (b)少なくとも10ヌクレオチド塩基長の(a)のポリヌクレオチドのフラ
グメントである、ポリヌクレオチド;または (c)(a)または(b)のポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条
件下で選択的にハイブリダイズする、ポリヌクレオチド を含む、フラグメント。 - 【請求項4】 84P2A9関連タンパク質をコードするポリヌクレオチド
であって、ここで、そのポリペプチドが、KKRK、NQTN、NCSV、TN
K,SRR、SSK、SVR、GLFTND、GGACGI、GGTPTS、G
TPTSMおよびGSLCTGからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、
ポリヌクレオチド。 - 【請求項5】 84P2A9関連タンパク質をコードするポリヌクレオチド
であって、ここで、そのポリペプチドが、HLAクラスI A1、A2、A3、
A24、B7、B27、B58、B62スーパーモチーフ、HLAクラスII
O’Sullivan DRスーパーモチーフまたはAlexander汎DR
結合エピトープスーパーモチーフあるいはHLA DR3モチーフを含む、ポリ
ヌクレオチド。 - 【請求項6】 検出可能なマーカーで標識されている、請求項1〜4のいず
れか1項に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項7】 請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含
む、組換え発現ベクター。 - 【請求項8】 請求項7に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
- 【請求項9】 84P2A9関連タンパク質を産生するためのプロセスであ
って、該ポリペプチドの産生に十分な条件下で、請求項8に記載の宿主細胞を培
養する工程を包含する、プロセス。 - 【請求項10】 産生された前記84P2A9関連タンパク質を回収する工
程をさらに包含する、請求項9に記載のプロセス。 - 【請求項11】 請求項10に記載のプロセスによって産生された、84P
2A9関連タンパク質。 - 【請求項12】 単離された84P2A9関連タンパク質。
- 【請求項13】 配列番号2に示されるアミノ酸配列を有する、請求項12
に記載の84P2A9関連タンパク質。 - 【請求項14】 単離された84P2A9関連タンパク質であって、以下: (a)配列番号1に示される配列を有するポリヌクレオチドであって、ここで
、Tは、Uでもあり得る、ポリヌクレオチド; (b)ヌクレオチド残基番号165からヌクレオチド残基番号1676の、配
列番号1に示される配列を有するポリヌクレオチドであって、ここで、Tは、U
でもあり得る、ポリヌクレオチド; (c)84P2A9関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、
その配列が、アメリカンタイプカルチャーコレクションに登録番号PTA−11
51として寄託されたp129.1−US−P1と命名されたプラスミドに含ま
れるcDNAによってコードされる、ポリヌクレオチド; (d)配列番号2に示されるアミノ酸配列を有する84P2A9関連タンパク
質をコードする、ポリヌクレオチド;および (e)(a)〜(d)のうちのいずれか1つのポリヌクレオチドに完全に相補
的である、ポリヌクレオチド からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列
に正確なアミノ酸配列を有する、タンパク質。 - 【請求項15】 請求項14に記載の単離された84P2A9関連タンパク
質であって、以下: (a)ヌクレオチド残基番号720からヌクレオチド残基番号1392の、配
列番号1に示される配列を有する、ポリヌクレオチド; (b)少なくとも10ヌクレオチド塩基長の(a)のポリヌクレオチドのフラ
グメントである、ポリヌクレオチド;または (c)(a)または(b)のポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条
件下で選択的にハイブリダイズする、ポリヌクレオチド からなる群より選択される、タンパク質。 - 【請求項16】 84P2A9関連タンパク質に免疫特異的に結合する、抗
体またはそのフラグメント。 - 【請求項17】 モノクローナルである、請求項16に記載の抗体またはそ
のフラグメント。 - 【請求項18】 請求項17に記載のモノクローナル抗体の抗原結合領域を
含む、組換えタンパク質。 - 【請求項19】 検出可能なマーカーで標識されている、請求項17に記載
の抗体またはそのフラグメント。 - 【請求項20】 検出可能なマーカーで標識されている、請求項18に記載
の組換えタンパク質。 - 【請求項21】 Fab、F(ab’)2、FvまたはSfvフラグメント
である、請求項16に記載の抗体フラグメント。 - 【請求項22】 ヒト抗体である、請求項16に記載の抗体。
- 【請求項23】 マウス抗原結合領域残基およびヒト定常領域残基を含む、
請求項20に記載の組換えタンパク質。 - 【請求項24】 請求項20に記載のモノクローナル抗体を産生する、非ヒ
トトランスジェニック動物。 - 【請求項25】 請求項22に記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ。
- 【請求項26】 請求項17に記載のモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖
の可変ドメインを含む、単鎖モノクローナル抗体。 - 【請求項27】 84P2A9関連タンパク質に免疫特異的に結合する単鎖
モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。 - 【請求項28】 生物学的サンプル中の84P2A9関連タンパク質または
ポリヌクレオチドの存在を検出するためのアッセイであって、それぞれ、84P
2A9関連タンパク質またはポリヌクレオチドに特異的に結合する、それぞれ、
抗体またはポリヌクレオチドを、該サンプルに接触させる工程、およびそれらに
対する該サンプル中の、それぞれ、84P2A9関連タンパク質またはポリヌク
レオチドの結合を検出する工程を包含する、アッセイ。 - 【請求項29】 84P2A9関連タンパク質またはポリヌクレオチドの存
在を検出するためのアッセイであって、サンプルを得る工程、84P2A9関連
タンパク質またはポリヌクレオチドの存在下で該サンプルを評価する工程を包含
し、それによって、該評価手段が、それぞれ、84P2A9関連タンパク質また
はポリヌクレオチドの存在または量を示す結果を生じる、アッセイ。 - 【請求項30】 生物学的サンプル中の84P2A9ポリヌクレオチドの存
在を検出するための請求項29に記載のアッセイであって、以下: (a)配列番号2に示されるアミノ酸配列を有する84P2A9関連タンパク
質をコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチ
ドプローブを、該サンプルに接触させる工程;および (b)該サンプル中での84P2A9ポリヌクレオチドとの該プローブのハイ
ブリダイゼーションによって形成されたハイブリダイゼーション複合体の存在を
検出する工程 を包含し、該ハイブリダイゼーション複合体の存在は、該サンプル中の84P2
A9ポリヌクレオチドの存在を示す、アッセイ。 - 【請求項31】 生物学的サンプル中の84P2A9 mRNAの存在を検
出するためのアッセイであって、以下: (a)少なくとも1つのプライマーを使用する逆転写によって、該サンプルか
らcDNAを生成する工程; (b)そのように生成されたcDNAを、84P2A9ポリヌクレオチドをセ
ンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして使用して増幅し、その中の
84P2A9 cDNAを増幅する工程; (c)該増幅された84P2A9 cDNAの存在を検出する工程 を包含し、ここで、センスプローブおよびアンチセンスプローブとして使用した
該84P2A9ポリヌクレオチドは、アメリカンタイプカルチャーコレクション
に登録番号PTA−1151として寄託されたプラスミドに含まれる84P2A
9 cDNAを増幅し得る、アッセイ。 - 【請求項32】 84P2A9遺伝子産物をモニターするための請求項31
に記載の方法であって、以下: 個体由来の試験組織サンプル中の細胞によって発現される84P2A9遺伝子
産物の状態を決定する工程; そのように決定された状態を、対応する正常サンプル中の84P2A9遺伝子
産物の状態と比較する工程;および 該正常サンプルと比較した該試験サンプル中の異常な84P2A9遺伝子産物
の存在を同定する工程 を包含する、方法。 - 【請求項33】 請求項32に記載の方法であって、前記84P2A9遺伝
子産物は、前記試験組織サンプル中の84P2A9遺伝子産物のポリヌクレオチ
ド配列を、対応する正常サンプル中の84P2A9遺伝子産物のポリヌクレオチ
ド配列と比較することによってモニターされる、方法。 - 【請求項34】 請求項32に記載の方法であって、前記84P2A9遺伝
子産物は、前記試験組織サンプル中の84P2A9遺伝子産物のレベルを、対応
する正常サンプル中の84P2A9遺伝子産物のレベルと比較することによって
モニターされる、方法。 - 【請求項35】 個体における癌の存在を診断するためのキットであって、
以下: (a)該個体から得た試験サンプル中で発現された84P2A9 mRNAま
たはタンパク質のレベルを決定するための手段;および (b)そのように決定された該レベルを、比較可能な既知の正常組織サンプル
中で発現される84P2A9 mRNAまたはタンパク質のレベルと比較するた
めの指示書 を含み、これによって、該正常組織サンプルと比較した該試験サンプル中での上
昇された84P2A9 mRNAまたはタンパク質の発現が、癌の存在の指標を
提供する、キット。 - 【請求項36】 請求項35に記載のキットであって、前記癌は、白血病、
ならびに前立腺、精巣、腎臓、脳、骨、皮膚、卵巣、乳房、膵臓、結腸および肺
の癌からなる群より選択され、そして前記試験組織サンプルおよび正常組織サン
プルが、血清、血液または尿、ならびに前立腺、精巣、腎臓、脳、骨、皮膚、卵
巣、乳房、膵臓、結腸および肺の組織からなる群より選択される、キット。 - 【請求項37】 84P2A9を発現する癌を有する患者を処置するための
組成物の調製のための、84P2A9関連タンパク質またはその免疫学的部分、
84P2A9関連タンパク質に免疫特異的に結合する単鎖モノクローナル抗体を
コードするポリヌクレオチドを含むベクター、84P2A9コード配列を有する
ポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスポリヌクレオチド、または84P2A
9コード配列を有するポリヌクレオチドを切断し得るリボザイムの使用。 - 【請求項38】 請求項37に記載の使用であって、前記癌が、白血病、な
らびに前立腺、精巣、腎臓、脳、骨、皮膚、卵巣、乳房、膵臓、結腸、リンパ球
および肺の癌からなる群より選択される、使用。 - 【請求項39】 薬学的組成物であって、該組成物は、84P2A9関連タ
ンパク質、84P2A9関連タンパク質に特異的に結合する抗体またはそのフラ
グメント、84P2A9関連タンパク質に免疫特異的に結合する単鎖モノクロー
ナル抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、84P2A9関連タン
パク質コード配列を含むポリヌクレオチド、84P2A9コード配列を有するポ
リヌクレオチドに相補的なアンチセンスポリヌクレオチドまたは84P2A9コ
ード配列を有するポリヌクレオチドを切断し得るリボザイム、および必要に応じ
て、生理学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。 - 【請求項40】 84P2A9を発現する癌を有する患者を処置するための
薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、84P2A9関連タンパク質に免疫
特異的に結合する単鎖モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを含む
ベクターを含み、その結果、該ベクターが、該単鎖モノクローナル抗体コード配
列を該癌細胞に送達し、そして該コードされる単鎖抗体が、その中で細胞内発現
される、薬学的組成物。 - 【請求項41】 84P2A9を発現する癌の処置のためのワクチン組成物
であって、84P2A9関連タンパク質の免疫学的部分および生理学的に受容可
能なキャリアを含む、ワクチン組成物。 - 【請求項42】 患者における84P2A9を発現する癌の発生(発達)を
阻害するための、請求項41に記載のワクチン組成物。 - 【請求項43】 哺乳動物において免疫応答を生じるためのキットであって
、請求項41に記載の84P2A9関連タンパク質の免疫学的部分、および該哺
乳動物の免疫系に該84P2A9関連タンパク質の免疫学的部分を曝露するため
の手段を含み、その結果、免疫応答が、84P2A9に対して生成される、キッ
ト。 - 【請求項44】 84P2A9を発現する細胞に対して細胞傷害剤を送達す
る方法であって、該細胞傷害剤を、84P2A9エピトープに特異的に結合する
請求項16に記載の抗体またはそのフラグメントに結合体化する工程、および該
抗体−薬剤結合体に該細胞を曝露する工程を包含する、方法。 - 【請求項45】 84P2A9タンパク質に対する免疫応答を誘導するため
のキットであって、該キットは、以下: 84P2A9関連タンパク質エピトープ; 該エピトープと、免疫系T細胞またはB細胞とを接触させるための手段であっ
て、それによって、該免疫系T細胞またはB細胞が誘導される、手段 を含む、キット。 - 【請求項46】 請求項45に記載のキットであって、前記免疫系細胞が、
B細胞であり、それによって、該誘導されたB細胞が、84P2A9関連タンパ
ク質に特異的に結合する抗体を生成する、キット。 - 【請求項47】 請求項45に記載のキットであって、前記免疫系細胞が、
T細胞であって、該T細胞が、細胞傷害性T細胞(CTL)であり、それによっ
て、活性化されたCTLが、前記84P2A9タンパク質を発現する自己細胞を
殺傷する、キット。 - 【請求項48】 請求項45に記載のキットであって、前記免疫系細胞が、
T細胞であって、該T細胞が、ヘルパーT細胞(HTL)であり、それによって
、活性化された該HTLが、CTLの細胞傷害活性またはB細胞の抗体産生活性
を促進するサイトカインを分泌する、キット。
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