JP2003518244A - 抗体混合物を用いた急速蛋白質同定 - Google Patents

抗体混合物を用いた急速蛋白質同定

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ヒューム，スティーブン・ダレル
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Becton Dickinson and Co
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Abstract

(57)【要約】 電気泳動ゲル（１２）の試料チャンバ（２２）内に蛋白質混合物（１５）を配置し、かつ電気泳動を実施して、分子量に基づいて分離方向（２５）にゲル（１２）内の二次元分離パターン（２６）となるように混合物（１５）を分離することによって、多数の蛋白質を急速に同定するための方法および装置を開示する。分離パターン（２６）を膜（２８）に移行させ、次いで個別の隣接するスロットのセット（６４ａ〜６４ｄ）を有するプレート（５０）を膜（２８）に接触させる。スロット（６４ａ〜６４ｄ）を介して加圧下に各抗体混合物（６６ａ〜６６ｄ）を灌流することによりスロット（６４ａ〜６４ｄ）の各々の内部に異なる抗体混合物（６６ａ〜６６ｄ）を導入する。各スロットを介して灌流された抗体混合物（６６ａ〜６６ｄ）は、異なる蛋白質のバンドが各スロット（６４ａ〜６４ｄ）内の抗体混合物（６６ａ〜６６ｄ）により分割可能である、十分に異なる分子量の数種の異なる蛋白質（２４ａ〜２４ｈ）を認識する。類似の分子量の蛋白質は、別の方法でオーバーラップする蛋白質のバンドが異なるレーンで検出されるよう、異なるスロットを介して灌流される抗体混合物により認識される。各レーンの蛋白質バンドの位置は、そのレーンについて混合物により認識される蛋白質の推定位置と相関付けられる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は電気泳動を用いた蛋白質混合物内の蛋白質を同定するための方法に関
する。
【０００２】 （発明の背景） イムノアッセイ系は蛋白質の分析のために長年用いられている。このような方
法には伝統的なウエスタンブロットが含まれ、これにおいては、試料をＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付し、これにより試料中
に存在する個々の蛋白質をその分子量に従って分割する。ゲル内の蛋白質（抗原
）はその後膜に移行され、抗体含有溶液に曝露される。抗体は特異的蛋白質を認
識し、これにより目的の蛋白質を同定できる。この相互作用を検出するために、
検出可能なマーカーを含有する二次抗体を添加する。典型的には、この操作法は
膜上の特有の蛋白質を検出するために用いられる。
【０００３】 従来技術によれば、蛋白質ブロット法は多数の蛋白質を取り扱うためには十分
適するものではない。伝統的には、同時に数種の異なる蛋白質を分析するために
は、試料の個々のレーンをゲル上で泳動し、蛋白質を膜に移行させ、一連の膜片
に切り分ける（各片が試料を含有する）。個々の膜片の各々を異なる抗体を含有
する溶液と共にインキュベートする。これには各片を個別に取り扱うことが必要
であるが、多大な労力と時間を必要とする作業である。
【０００４】 逐次的プローブを用いた単一のゲル上での複数の蛋白質の検出が報告されてい
る。これらの方法では、試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分割し、膜に移行さ
せ、一次および色素が結合した二次抗体に曝露する。これにより得られる異なる
着色が施された産物のバンドはブロットの単一のレーン上の数種の抗原の同定を
可能とする。方法の１つの変法において（Ｋｒａｊｅｗｓｋｉら、１９９６，
Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３６：２２１−８； Ｌｉｎ ａｎｄ Ｐａ
ｇａｎ， １９８６， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５９：５２２−４；およびＴｈｅ
ｉｓｅｎら、１９８６， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １５２：２１１−４
）、膜を１つの一次抗体に曝露し、これを着色された二次抗体を用いて検出し、
呈色反応を生じさせる。ブロットはその後異なる一次および着色二次抗体で再プ
ローブされ、第１のものとは異なる呈色反応を生じさせる。
【０００５】 この方法の別の変法においては、Ｌｅｅら（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔ
ｈ． １０６：２７−３０， １９８８）は異なる蛋白質の同時プロービングを
報告している。この方法では、異なる種で発生させた一次抗体、例えば一方の抗
体はウサギで作成（すなわちポリクローナル）、他方はマウス（すなわちモノク
ローナル）で作成したものを使用することが必要であり、これらを同時に膜に添
加する。異なる色素を結合された二次抗体（抗ウサギまたは抗マウス）は一次抗
体の一種のみに結合する。このことにより、少なくとも２個の異なる蛋白質を同
時に検出することが可能となる。
【０００６】 単一のブロット上の複数の蛋白質を検出するために二次元（２Ｄ）ゲル電気泳
動を用いることが報告されている。Ｓａｎｃｈｅｚら（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒ
ｅｓｉｓ， １８：６３８−４１， １９９７）は、同定の曖昧さを回避するた
めにｐＩと分子量の双方が十分に異なる９個の個々の蛋白質を検出するためのモ
ノクローナル抗体混合物の使用を開示している。Ｆａｌｅｉｒｏら（ＥＭＢＯ
Ｊ． １６：２２７１−８１， １９９７）は複数のカスパーゼを検出するため
の２Ｄゲル電気泳動の使用を提案している。
【０００７】 Ｌｅｖｉｎへの３件の米国特許（米国特許４，７１３，３４９号、４，８３４
，９４６号および４，９７８，５０７号）は、単一の蛋白質含有膜上の複数の抗
原を検出するために使用できる装置を記載している。装置には上側プレートおよ
び下側プレートが含まれ、その間に蛋白質含有膜が配置されている。上側プレー
トはチャネルの列を含んでおり、その中に抗体含有液体を導入する。
【０００８】 （発明の開示） 本発明は試料中に存在する蛋白質を検出および定量するための改善された方法
を提供する。本発明は数個の蛋白質を同一試料中において同定および／または定
量可能とし、これにより現在のイムノアッセイ系の多くの制限を克服する。特定
の実施例においては、試料中の複数の蛋白質を同時に同定することができる。
【０００９】 本発明はゲル上の分離の方向の少なくとも二次元の分子量勾配パターンに少な
くとも１個の試料から分子量に基づいて蛋白質を電気泳動的に分離することによ
り蛋白質混合物試料中の異なる蛋白質を同定するための方法を提供する。分子量
勾配パターンは分離の方向に伸展する複数の隣接する伸長された特異的結合剤ア
プリケータに同時または逐次的に曝露される。各アプリケータは異なるレーン内
の特異的結合剤の複数の異なるセットを添加し、その際各セットは分離の方向に
沿って異なる蛋白質を相互に識別するために十分異なる分子量の蛋白質を認識す
る。同様の分子量を有する混合物中の蛋白質は、そのほかは部分的または完全に
オーバーラップする蛋白質のバンドが異なるレーンで検出されるように、異なる
レーンにおいて認識される。
【００１０】 蛋白質は分離の方向を横断して伸展する伸長された試料チャンバ内に蛋白質混
合物を導入すること、そして、分子量により分離の方向に蛋白質を分離する電気
泳動を行なうことにより、電気泳動的に分離される。少なくとも３個（例えば少
なくとも１０個）のアプリケータが存在でき、各々は少なくとも２、５、１０ま
たは５０個の異なる特異的結合剤を添加する。１つの実施形態においては、アプ
リケータは実質的に平行である。アプリケータはスロットまたはスロットを有す
る伸長されたチャネルであってよく、それらを通じて特異的結合剤を添加する。
あるいは、各アプリケータは伸長されたスロットの代わりに、複数の僅かに間隙
をおいて設けられたノズルまたは孔部を含んでいる。別の実施形態においては、
伸長されたアプリケータの数に対して添加される異なる特異的結合剤の比率が、
各アプリケータに対して少なくとも１または３個の特異的結合剤（例えば少なく
とも５個以上の特異的結合剤）となる。
【００１１】 特定の実施形態においては、特異的結合剤はモノクローナル抗体のような抗体
である。特異的結合剤はシグナル伝達蛋白質を認識する。別の実施形態において
は、蛋白質混合物試料は細胞溶解物を含む。
【００１２】 開示した実施形態においては、パターンをゲルから移行部材に移行し、異なる
セットの特異的結合剤を移行部材に添加する。方法はまた特異的結合剤の結合位
置を検出すること、および、目的蛋白質を同定する特定の特異的結合剤に各位置
を相関させることを含む。さらに別の実施形態においては、本方法は、目的の蛋
白質を検出した後に、例えば強度または蛍光を測定することにより、目的蛋白質
を定量することを含む。
【００１３】 細胞溶解物試料は電気泳動ゲル内の伸長された試料用のくぼみ内に導入するこ
とができる。電気泳動を試料に対して実施することにより、細胞溶解物を伸長さ
れた試料チャンバから試料チャンバを横断して伸展する分離方向の分子量勾配パ
ターン内に分離する。パターンは移行部材に移行させ、その後、試料チャンバを
実質的に横断して分離の方向に伸展するスロットを有する複数の隣接する伸長さ
れた抗体アプリケータチャネルに同時に曝露する。複数の異なるアプリケータは
異なるセットの特異的結合剤を隣接するレーンの移行部材に添加する。各スロッ
ト内の特異的結合剤は識別可能な分子量の蛋白質を認識し、異なるスロット内の
特異的結合剤は種々の異なる目的の蛋白質を認識するのに十分異なっている。同
程度の分子量であるが、その他の点では部分的または完全にオーバーラップする
単一レーン内の複数の蛋白質は、個別のレーン内で検出される。蛋白質が検出さ
れる位置の各々はその後、各アプリケータについて、結合推定位置と結合検出位
置を比較することにより、目的蛋白質を同定する特定の特異的結合剤に相関させ
る。特定の実施形態において、アプリケータにより少なくとも３つの異なるセッ
トにおいて添加される少なくとも５０個の異なる特異的結合剤（例えば少なくと
も１０セットの３個の結合剤）が存在する。
【００１４】 本発明はまた、試料を電気泳動に付し、これにより複数の異なる蛋白質を分子
量に応じて少なくとも二次元域（すなわち三次元域も使用できる）に分離するこ
とによる、試料中の複数の異なる蛋白質を同時に分析する方法を提供する。複数
の異なる蛋白質は移行部材上に移行されて固定化される。部材は同時または逐次
的に異なるセットの特異的結合剤に曝露される。例えば、数種の個別のスロット
を有するプレートを移行部材に対向して位置させ、その際異なるスロットは異な
るセットの抗体含有混合物を含むようにする。移行部材内に蛋白質が存在する場
合に抗体が蛋白質に結合するのに十分な時間、移行部材の表面に各抗体含有混合
物を曝露する。結合した抗体を検出することにより移行部材中の目的の蛋白質の
所在場所を特定し、蛋白質の位置を既知対照蛋白質の推定結合位置に相関させる
。
【００１５】 特定の実施形態においては、移行部材はニトロセルロースのような蛋白質移行
膜であり、試料は細胞溶解物である。さらに別の実施形態においては、抗体はシ
グナル伝達蛋白質を認識する。さらに別の実施形態においては、各抗体含有混合
物は少なくとも２個（例えば少なくとも３、６または１０個）の異なる抗体を含
んでいる。特定の実施例においては、各膜に適用される異なる抗体の総数は５０
〜２５０の範囲またはそれ以上であることが可能である。別の実施形態において
は、チャネルの数に対する抗体混合物（ただし混合物中の抗体の少なくとも１つ
は異なる蛋白質を認識する）の異なるセットの比率は１：１であり、そして、各
チャネルの抗体の数は２〜１０または１〜２０の範囲である。さらに別の実施形
態において、プレート（または一連のプレート）は少なくとも４、１０、１８、
２０または５０個の異なるチャネルを含む。別の実施形態においては、目的の蛋
白質の分子量は１０ｋＤａ〜３００ｋＤａである。
【００１６】 本発明はまた数個のアプリケータを有するアプリケータプレート、各アプリケ
ータを連絡する液体供給ラインおよび異なる抗体の混合物のセットを含む蛋白質
混合物試料中の異なる蛋白質を同定するためのシステムを提供する。異なる抗体
の混合物は異なる供給ラインと連絡する。異なる抗体の混合物の各々は電気泳動
ゲル上で実質的にオーバーラップしない蛋白質を認識し、かつ、電気泳動ゲル上
でオーバーラップする蛋白質を認識する抗体を含有する。
【００１７】 特定の実施形態においては、本システムは、異なる抗体の混合物を供給ライン
内に導入しアプリケータを通過させるための１個以上のポンプを含む。別の特定
の実施形態において、システムはまた、抗体混合物に曝露されている基体上のバ
ンドを検出するスキャナを有する。基体上のバンドの画像をスキャナにより記録
する。別の実施形態においては、本システムはアプリケータを通じて抗体混合物
を導入できるよう自動化されている。
【００１８】 さらに別の実施形態においては、本システムは、抗体混合物により検出される
蛋白質が蛋白質混合物中に存在する場合に各抗体混合物について検出されるバン
ドの推定位置を含む比較対照画像源を含む。比較対照画像源はコンピュータ読取
可能媒体に保存されている。本発明はまた比較対照画像が保存されるコンピュー
タ読取可能媒体も含む。
【００１９】 本発明はまた、電気泳動により分離域に分離されている蛋白質を同定するため
の装置を提供する。本装置は、数種の異なる伸長されたアプリケータに基体を曝
露するための曝露手段と、異なるアプリケータに異なるセットの抗体混合物を供
給するための供給手段とを含む。第１のアプリケータに供給される抗体混合物の
セットが第１のアプリケータの曝露経路に沿って個別に分割されるために十分異
なる分子量の蛋白質を認識する。特定の実施形態においては、曝露手段は数種の
異なる伸長されたアプリケータに基体を同時に曝露する。別の実施形態において
は、１つのアプリケータに供給される抗体混合物のセットは、別のアプリケータ
に供給される抗体混合物により認識される蛋白質から個別に分割されるために十
分異なる分子量ではない蛋白質を認識する。
【００２０】 本発明の前述および他の特徴および利点は、添付図面を参照しながら記載され
る以下に記載する幾つかの実施形態の詳細な説明により明らかになる。
【００２１】 （発明を実施するための最良の形態） 略記法および定義 以下の定義および方法は本発明をよりよく定義し、当業者に対して本発明の実
施を説明するため示すものである。明細書と請求項を通じて、特段の記載が無い
限り単数としての記載も複数の場合を包含するものとする。すなわち、例えば「
蛋白質」と記載した場合は、複数の蛋白質も包含され、そして「抗体」と記載し
た場合は、１個以上の抗体および当業者の知るその同等物等を包含するものとす
る。
【００２２】 特段の記載が無い限り、本明細書で使用するすべての技術および科学用語は本
発明の属する当該技術分野において一般的に理解されている意味を有するものと
する。
【００２３】 アプリケータ： アプリケータは個別のスロットまたは伸長されたチャネル、
僅かに間隙をおいて一列に配置された一連の孔部、あるいは、基体に抗体混合物
のような特異的結合剤を実質的に連続して添加できるいかなるその他の形状をも
包含する。実質的に連続したアプリケータは目的蛋白質の同定を可能にするもの
である。特異的結合剤はアプリケータを通して添加される。
【００２４】 細胞溶解物： 細胞または組織の分解、崩壊または溶解により形成される混合
物。さらにまた、天然および合成起源の蛋白質のいかなる混合物も包含する。
【００２５】 予測された位置のデータベース： 特異的結合剤の特定のセットにより認識さ
れる蛋白質のゲルまたは移行部材上の予測された位置を示すデータベース。この
データベースは、特異的結合剤の特定のセットにより認識されるどの蛋白質が実
験試料中に発現されるかを調べるために使用する。
【００２６】 検出： 電気泳動的に分離された蛋白質を検出する方法。このような方法は比
色分析、密度測定、増強化学発光法（ＥＣＬ）およびラジオグラフィー等を包含
するが、これらに限定されない。目的の蛋白質により発生したシグナルは、例え
ばフィルムまたはホスホイメージャースクリーン上に記録される。
【００２７】 検出位置： ゲルまたは移行部材上の蛋白質の位置。 ＭＩＮＩＢＬＯＴＴＥＲ装置： 参考により本明細書に組み込まれる米国特許
４，８３４，９４６号に記載された装置。
【００２８】 異なるセットの特異的結合剤： 各々が複数の特異的結合剤、例えば２〜１０
個の個々の特異的結合剤を含有する複数の混合物であり、セットのうち少なくと
も一部（そしてある実施形態においてはすべて）が特有のセットであるもの。特
有のセットとはいかなる他のセット中の抗体と比較しても少なくとも１個の抗体
が異なる（または追加されている）セットを包含するものとする。特定の実施形
態においては、特有のセットは実質的に異なっており、他のセットに存在する抗
体を１つより多く有するセットは存在しない。極めて特別の実施形態においては
、セットの各々は特有のものであり、他のセットの抗体と同じ（または同じ蛋白
質を認識する）抗体を有さない。各混合物は例えば図１１Ａおよび図１１Ｂおよ
び表２に示すように蛋白質の特有の集団を認識できる。
【００２９】 ＥＣＬ： 増強化学発光（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅ
ｎｃｅ）。
【００３０】 電気泳動ゲル： 固体が液体中に分散している固体の外見を有するコロイド系
。固体には例えばＢＩＳ／アクリルアミドまたはアガロースのような物質が包含
されるがこれらに限定されない。アクリルアミドの量または比率はゲル内（勾配
ゲル）またはゲル間（例えばより大型の高分子量の蛋白質の分割に低い比率のゲ
ルを、そしてより小型の低分子量の蛋白質の分割に高い比率のゲルを用いる）で
異なることができる。目的の蛋白質の分割に最も適するゲル系の選択は当業者の
知る通りである。
【００３１】 電気泳動分離： 電場における異なる運動性に基づいて蛋白質のような荷電単
位を分離する分離方法。電場は単位の大きさ、形状、および電荷により異なる。
方法は蛋白質および他の物質の分離のために広範に使用されている。
【００３２】 電気泳動移行： 電気泳動により、ニトロセルロース、ジエチルアミノエチル
−（ＤＥＡＥ−）、セルロース膜またはＰＶＤＦ膜、または、ジアゾベンジルオ
キシメチル−（ＤＢＭ−）またはジアゾフェニルチオエーテル−（ＤＰＴ−）紙
のような移行部材に、分離ゲルから蛋白質を移行させ、分離された蛋白質の生成
パターンを有する膜または紙を得るために用いる方法。
【００３３】 伸長された試料チャンバ： ゲルの「ウェル」としても知られており、蛋白質
混合物試料を投入するゲルの領域である。
【００３４】 分子量勾配パターン： 電場に蛋白質を付した後のゲル内に生成するバンドの
パターン。より小型の低分子量の蛋白質はより大型の高分子量の蛋白質よりも高
速でゲルを通過することによって、その分子量により分離される。
【００３５】 潜在位置または予測位置： 特異的結合剤の各セットにより同定される蛋白質
に相当する、ゲルまたは移行部材上の蛋白質の以前に測定された位置。蛋白質の
この予測位置を未知の実験試料と比較することにより、蛋白質混合物から電気泳
動により分離された蛋白質を同定する。
【００３６】 蛋白質混合物試料： 少なくとも２個の蛋白質を含有する試料。 定量： 試料中の１個以上の蛋白質の相対量を測定する方法。定量は密度分析
により行うことができ、その際、１試料中の蛋白質から発生したシグナルの量を
別の試料中の同じ蛋白質から発生したシグナルの量と比較する。密度分析を実施
するための装置およびソフトウエアの市販品としては、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＧＳ−
５２５分子画像化システム、分子アナリストｖ．２．１附属（Ｂｉｏ−Ｒａｄ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）およびＵＭＡＸ Ａｓ
ｔｒａ １２００Ｓデジタルスキャナ、ＵＮ−Ｓｃａｎ−ＩＴゲルｖ．３．１附
属（Ｓｉｌｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｏｒｅｍ， ＵＴ）が挙げられる。
【００３７】 試料： 本方法により分析するべき標本であり、そのような標本としては、Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ａ．Ｔ
．Ｃ．Ｃ． （Ｍａｎａｓｓｉｓ， ＶＡ）から入手できるもののような組織培
養細胞から発生した細胞溶解物が包含される。潜在的な試料としては、全血、血
漿、血清、尿、脳脊髄液、病理学的標本、穿刺吸入液および生検試料のような生
理学的試料も包含される。さらにまた、天然および合成起源の蛋白質のいかなる
他の混合物も包含する。
【００３８】 シグナル伝達蛋白質： 細胞内へのシグナル分子そのものの導入以外の手段に
よる細胞の外部から内部へシグナルの移行に関わる蛋白質。典型的には、ホルモ
ンまたは生育因子のような細胞外シグナルの相互作用が細胞内における１個以上
のセカンドメッセンジャーの合成をもたらすか、または、他の下流カスケード系
の活性化（例えばリン酸化）をもたらす。シグナル伝達蛋白質の例としては例え
ば図１１Ａおよび図１１Ｂおよび表２に示すものが挙げられるがこれらに限定さ
れない。
【００３９】 特異的結合剤： 実質的に所定の標的にのみ結合する薬剤。例えばシンタキシ
ン４蛋白質の特異的結合剤はシンタキシン４蛋白質にのみ実質的に結合し、他の
蛋白質とは結合しない。本明細書においては、「特異的結合剤」とは抗体または
リガンド結合プローブのような特異的蛋白質にのみ実質的に結合するいかなる物
質または蛋白質も包含するものとする。
【００４０】 「抗体」という用語は、目的の蛋白質に特異的な、すなわち、後に記載する方
法を用いて評価した場合に目的の蛋白質またはその免疫学的に有効な部分（「フ
ラグメント」）にのみ実質的に結合する、モノクローナルおよびポリクローナル
の抗体を包含するものとする。本発明の１つの特徴において使用する目的蛋白質
を認識する抗体はモノクローナル抗体（または免疫学的に有効なその部分）であ
り、ヒト化されたモノクローナル抗体（または免疫学的に有効なその部分）であ
ってもよい。免疫学的には、モノクローナル抗体の有効な部分とは、Ｆａｂ、Ｆ
ａｂ′、Ｆ（ａｂ″）2、ＦａｂｃおよびＦｖ部分等である（総説として、Ｂｅ
ｔｔｅｒ ａｎｄ Ｈｏｒｏｗｉｔｚ， Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．
１９８９， １７８：４７６−９６参照）。
【００４１】 特定の薬剤が目的蛋白質のみに実質的に結合することの測定は、通常の操作法
を用いるか、これを応用することにより容易に行ってよい。１つの適当なｉｎ
ｖｉｔｒｏのアッセイでは、ウエスタンブロッティング法を用いる（Ｈａｒｌｏ
ｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， １９８８のＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌを含む多くの標準的教科書に記載されている）。ウエス
タンブロッティングはモノクローナル抗体のような所定の結合剤が目的蛋白質に
のみ実質的に結合することを調べるために用いてよい。
【００４２】 移行部材： 電気泳動的に分離された蛋白質を分離ゲルから移行させる相手と
なる基体。このような基体には移行膜、例えば蛋白質移行膜が包含される。この
ような膜の例としては、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、またはジエチルアミノエ
チル−（ＤＥＡＥ−）セルロース、またはジアゾベンジルオキシメチル−（ＤＢ
Ｍ−）またはジアゾフェニルチオエーテル−（ＤＰＴ−）紙が包含される。
【００４３】 腫瘍： 新生物 新生物： 細胞の異常生育 癌： 脱分化、生育速度の増大、周囲組織の侵襲を伴った特徴的な退生を示
し、転移することのできる悪性新生物 悪性： 退生侵襲および転移を特徴とする細胞 正常細胞： 非腫瘍、非悪性の細胞。
【００４４】 （詳細説明） 本発明は特定の実施例においては同時検出も含む、試料中の数種の蛋白質を検
出し、定量するための進歩した方法である。この方法はウエスタンブロットの１
様式であり、複数の異なるセットの特異的結合剤、例えばモノクローナル抗体を
、単一の試料を電気泳動で分割した後に、その試料に曝露する。各セットは分子
量が十分に異なる蛋白質を認識するため、異なる蛋白質を相互に識別することが
できる。特異的結合剤の位置を検出し、目的蛋白質を同定する特定の特異的結合
剤と相関させる。一旦蛋白質が同定されると、その位置に存在する蛋白質の量も
定量することができる。
【００４５】 図１Ａおよび図１Ｂは蛋白質分離媒体の特定の例としてのゲル１２を示してお
り、ゲル１２は前方表面１４、連続周囲面１６および後方表面１８を有する。ゲ
ル１２の上端２０は既知態様のインデントまたはノッチを含み、これが試料チャ
ンバ２２となり、これに蛋白質混合物１５を添加して後の電気泳動に付す。図示
した試料チャンバ２２はゲル１２の上端２０の実質的に全体を横断して伸展して
いるが、別の実施形態においてはこれは（例えば）ゲルの上端２０から離れてこ
れと平行である、ゲルの前方表面１４内に配置された台またはスロットであるこ
ともできる。
【００４６】 使用時にはガラスプレート（図示せず）をゲルの前方表面１４および後方表面
１８に対向して配置し、蛋白質混合物１５を試料チャンバ２２に配置し、電流を
ゲル１２に流し、これにより、混合物１５中の蛋白質が分子量に応じて電気泳動
的に分離され、分離方向２５（図１）に伸展する分子量勾配パターン（図２）が
発生する。チャンバ２２はゲル１２を十分横切って伸展し、パターン２６に抗体
の異なる混合物を添加する複数の（例えば３個以上の）隣接する伸張されたアプ
リケータスロットを用いてパターンの複数同時分析を可能とするのに十分広い勾
配パターン（図２）を形成する。したがって、チャンバ２２の長さは少なくとも
個々のアプリケータを組み合わせた幅と同じ長さである。
【００４７】 図２は、少なくとも８個の個々の蛋白質２４ａ〜２４ｈを含有する試料に由来
する仮説的分子量勾配パターンを示す。説明を目的として述べれば、少なくとも
８個の異なる蛋白質が相互に識別可能であるが、その理由はこれらがゲル１２で
個別に分割されるために十分な相違を分子量において有しているためである。特
定の実施例においては、識別可能なバンド内の蛋白質の分子量は少なくとも５〜
３０ｋＤａ、例えば１０〜２０ｋＤａ、例えば図９に示す通り１２ｋＤａとなる
。少なくとも８バンドが識別可能に表示されているが、混合物中の一部の蛋白質
の分子量は個々に分割するために十分異ならない場合も有り、ゲル１２上でオー
バーラップする場合もある。バンドは、図面においては明確化のために顕著に分
離した状態で示したが、図２に示すように明確に分離されたバンドである必要は
ない。本発明は後に説明する通りオーバーラップする蛋白質であっても容易に個
別同定可能とするものである。
【００４８】 図３に示す通り、勾配パターン２６は従来の態様で移行部材２８に電気泳動的
に移行させることができ、これにより分離の二次元域が分離方向２５に対して維
持される。次に移行部材２８上の勾配パターン２６を複数の異なるセットの特異
的結合剤に同時に曝露し、後に記載する通り混合物内の特定の蛋白質を同定する
。
【００４９】 各曝露域において異なるセットの蛋白質を検出する概念は図４Ａおよび図４Ｂ
で説明する。図４Ａはアプリケータプレート５０を示しており、これは移行部材
２８上に配置される。アプリケータプレート５０は４個の隣接する伸長されたス
ロット６４ａ、６４ｂ、６４ｃおよび６４ｄの１セットを有し、これらの各々は
幅Ｗ１を有し、各スロットは幅Ｗ２の間隔で配置されている。電気泳動の前に蛋
白質混合物を配置するゲルチャンバ２２の長さは少なくとも４スロット（４Ｗ１
）＋４スロット間距離（３Ｗ２）の全幅と同じ長さである。各スロットの長さも
また、スロットが勾配パターン６２の輪郭８４を取り囲んでこれと一致する２次
元の分離域の内部に抗体を添加できるように、スロットが分離方向６３に伸展す
る勾配パターン６２の距離と実質的に一致するために十分な長さである。しかし
ながら、別の実施形態においては、アプリケータは２次元の分離域の部分的領域
のみに渡っている。
【００５０】 図４Ｂは、４種の異なるセットの抗体混合物を蛋白質分離パターン６２（分離
したバンドとして表示）を有する移行部材２８に添加した仮説的実施例を示し、
ここでは、蛋白質は分離方向６３に分離されている。４種の異なる抗体混合物を
、アプリケータ５０（図４Ａ）の４個の個別のスロット６４ａ、６４ｂ、６４ｃ
、６４ｄから、例えば加圧下に各混合物を注入するか、または、毛管作用により
、相当する入口６５ａ、６５ｂ、６５ｃ、６５ｄおよび出口６７ａ、６７ｂ、６
７ｃ、６７ｄを通して添加する。４個のスロット６４ａ、６４ｂ、６４ｃおよび
６４ｄの痕跡は図４Ｂに示す相当する輪郭６６ａ、６６ｂ、６６ｃおよび６６ｄ
により示され、ここで輪郭の各々の異なる陰影は各スロットより基体に添加され
た異なる抗体混合物の痕跡を示している。
【００５１】 この特定の例においては、１つのスロットから添加された混合物中の抗体の何
れも、異なるスロット中の別の混合物中の抗体の何れかにより認識される蛋白質
と同様のものを認識することはない。抗体混合物を移行部材２８内の蛋白質と十
分な時間相互作用させた後、混合物をスロットから、例えば出口６７ａ、６７ｂ
、６７ｃ、６７ｄから与えられる吸引圧または毛管作用により取り出す。次に蛋
白質を例えばＥＣＬを用いて検出する。蛋白質の検出に際しては、アプリケータ
プレート５０のスロットを通してＥＣＬ溶液を注入することもできるが、膜全体
をＥＣＬ溶液に入れ、その後フィルムまたは蛍光画像化スクリーンに感光して蛋
白質を可視化する。
【００５２】 図５はこの仮説的分析の結果を示すものであり、ここでは９個の蛋白質の混合
物を含有する試料をゲル内の電気泳動により分離し、そしてニトロセルロース膜
のような移行部材２８に移行させ、図４Ａおよび図４Ｂに関して記載した通り分
析した。異なるセットの抗体混合物６６ａ、６６ｂ、６６ｃおよび６６ｄの各々
は各曝露域において少なくとも２種の特異的蛋白質を認識する。図示した例にお
いては、混合物６６ａは蛋白質２４ｂおよび２４ｇを認識し、混合物６６ｂは蛋
白質２４ａおよび２４ｄを認識し、混合物６６ｃは蛋白質２４ｆおよび２４ｈ1
を認識し、そして蛋白質６６ｄは蛋白質２４ｃ、２４ｅおよび２４ｈ2を認識し
ている。混合物６６ｃにより認識された蛋白質２４ｈ1および混合物６６ｄによ
り認識された蛋白質２４ｈ2は同じレーンで検出された場合はオーバーラップし
て識別不可能である場合もある。蛋白質を同定した後、それらは、場合により、
各々が発光し感光性スクリーンまたはＸ線フィルムのような材料に転写させたＥ
ＣＬシグナルの強度を測定することにより定量することができる。
【００５３】 蛋白質シグナルを同定した後、分離域（図４Ｂおよび図５において破線８４で
表示）内部のシグナルの位置を特定の蛋白質に由来するシグナルの推定位置と相
関づけることができる。例えば、蛋白質２４ｈ1に対する検出シグナルが場内部
（例えば痕跡６６ｃ内）の蛋白質Ｘに対する推定位置に相当する場合、蛋白質２
４ｈ1は蛋白質Ｘとして同定される。同様に、図５の他の検出されたシグナルの
位置は分離域８４内部（例えば特定のレーン６６ａ〜６６ｄの痕跡のような曝露
の特定域内部）の他の既知蛋白質のシグナルの推定位置、および、このようにし
て同定された異なる蛋白質と相関させることができる。この方法を用いることに
より、使用する抗体の数および／またはレーン、例えば異なるスロット６４に相
当するレーン６６の数に応じて、（例えば）１０、５０、１００、２００、５０
０または１０００以上もの蛋白質を同時に同定するための高処理量技術が提供さ
れるのである。
【００５４】 図６〜図８は複数の異なるセットの特異的結合剤を複数の移行部材１２８ａ、
１２８ｂに曝露するために使用できる装置１３０の特定の例を示す。図６〜図８
に示す装置１３０はＬｅｖｉｎのＭＩＮＯＢＬＯＴＴＥＲ装置（米国特許４，８
３４，９４６号）であるが、他の装置も本発明の方法で使用することができる。
図６〜図８において、装置１３０はアプリケータプレート１３２およびベースプ
レート１３４を有し、その間に移行部材１２８が配置される。アプリケータプレ
ート１３２はアプリケータスロットの２つのセット１４４ａおよび１４４ｂを含
んでおり、そして各セットには９個の隣接する伸長されたスロットが含まれ、各
スロットは幅Ｗ１を有し、各スロットは幅Ｗ２の間隔で配置されている。電気泳
動の前に蛋白質混合物を入れるゲルチャンバ２２（図１）の長さは少なくとも９
スロット（９Ｗ１）＋９スロット間距離（８Ｗ２）の全幅と同じ長さである。各
スロットのセット１４４ａ、１４４ｂにおける各スロットの長さもまたスロット
が勾配パターン２６の輪郭を取り囲んでこれと一致する２次元域の内部に抗体を
適用できるように、各シリーズのスロットが分離方向２５に伸展する勾配パター
ン２６（図２および図３）の距離と実質的に一致するために十分な長さである。
図６〜図８に示す例に関しては、第１の移行部材１２８ａをスロットのセット１
４４ａ（図８）の下部に配置し、そして第２の移行部材１２８ｂを１４４ｂの下
部に配置し、そして相当するシリーズ１４４ａおよび１４４ｂの相当するスロッ
トの各々の内部に抗体混合物の同一のセットを導入することにより、２種の異な
る移行部材を同時に分析することができる。この特定の実施例は異なる移行部材
に同一のセットの抗体混合物を添加する場合を示しているが、異なるセットの抗
体混合物を各セット１４４ａ、１４４ｂにおいて使用することができ、そして、
同じ蛋白質混合物の電気泳動ゲルに由来する移行部材も使用してよい。
【００５５】 プレート１３２、１３４は微細刻印された先端部および外側に貫通する錨幹を
有する手動回転可能なセット螺子１３６により共に固定されている。図７は螺子
が伸展する際に通過するアプリケータプレート１３２の端部の周囲の数個の螺子
受け孔１３８を示す。螺子孔１３８はベースプレート１３４内の内部に向けて貫
通する孔部１４０に並置されている。複数の異なるセットの特異的結合剤に２個
の異なる移行部材１２８ａ、１２８ｂ（図８）を同時に曝露するために、クッシ
ョンシート１４２ａ、１４２ｂをスロットの各セット１４４ａ、１４４ｂの下部
にベースプレート１３４の上部に設置し、より有効な封止をおこなう。アプリケ
ータプレート１３２上のアプリケータスロット１１４ａ、１４４ｂのセットが各
移行部材１２８ａ、１２８ｂについて分離方向２５に伸展するように、移行部材
１２８ａ、１２８ｂをクッションシート１４２ａ、１４２ｂの上部に重ねる。ア
プリケータプレート１３２は図８に示す通りプレートを相互に圧着させるように
螺子１３６を閉めることによりベースプレート１３４に固定される。この圧着に
よりスロットのセット１４４ａ、１４４ｂの間の空隙はすべて閉鎖され、個別の
アプリケータスロット相互を効果的に封止する。
【００５６】 各スロットが特有のセットの抗体を分離パターンに添加できるように、異なる
セットの特異的結合剤（例えば異なる抗体の液体混合物）を各々の異なるアプリ
ケータスロットを通して導入する。液体混合物は、入口および出口１４７、１４
８を通して、個々のスロットの各々に導入され、これを通過し、これから退出す
る。予め選択された抗体混合物が加圧下に各スロットを通って注入され、各スロ
ットにより取り囲まれる領域（曝露域）に相当するレーンに沿って抗体混合物に
移行部材が曝露されるように、セット１４４、１４５の各スロットにつき個別の
入口および出口が存在する。異なる抗体の混合物をセットの各スロットを通して
注入し、プレート１３２、１３４およびクッションシート１４２ａ、１４２ｂの
圧力によりスロットを相互に封止するため、異なるセットの蛋白質が各曝露域内
で（存在する場合は）検出される。蛋白質のバンドが分離方向にオーバーラップ
する場合は、それらは異なるレーンにおいて同定されるため、相互に識別するこ
とができる。この例においては、各レーン内で検出される蛋白質の位置は予め決
定することができ、そして検出された蛋白質の位置は蛋白質を同定するそのレー
ンの既知の位置に相関させられる。
【００５７】 本発明の特定の局面に関する詳細を以下の実施例において記載する。 実施例１ 複数の蛋白質の同時検出 本実施例は１７５個の異なる蛋白質を同時に同定し定量する実験を記載する。
本実験はシグナル伝達蛋白質を認識するモノクローナル抗体を用いるが、他の種
類の抗体、例えばポリクローナル抗体や特定の蛋白質を認識する他の薬剤または
他の種類の蛋白質も使用できる。
【００５８】 組織培養細胞からの溶解物の調製 細胞を組織培養用の皿またはフラスコにおいて全面培養となるまで生育させた
。培地を除去し細胞をＰＢＳ（２０ｍｌｓ／１５ｃｍプレートまたはフラスコ）
で洗浄した後、約２〜３ｍｌの沸騰細胞溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐ
Ｈ７．４， １．０ｍＭ ｏ−バナジウム酸ナトリウム、１．０％ＳＤＳ）を添
加した。溶液をプレート内で攪拌し、細胞蛋白質の急速な変性を確実に行った。
得られた細胞溶解物を５０ｍＬ容のポリプロピレン製の円錐型試験管に入れ、短
時間マイクロウエーブ処理した（５〜１０秒）。その後溶解物を１０〜３０秒間
超音波処理し、細胞溶解試料中に存在するＤＮＡを剪断した。あるいは、２６ゲ
ージの針に溶解物を反復通過させるか、または約１５〜３０秒間ポリトロンでホ
モゲナイズすることもできる。得られた試料から少量（例えば１００μＬ）を希
釈して１．０ｍＬとすることによりＳＤＳ濃度を０．１％まで下げ、蛋白質の総
含有量をＰｉｅｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）のＢＣＡ試薬を用いて測定し
た。試料の残余はその後の使用のために−８０℃で保存した。
【００５９】 組織からの溶解物の調製 新たに入手した組織または凍結した組織を以下の通り調製することができる。
組織（０．２ｇ）を煮沸細胞溶解緩衝液（上記）３．５ｍｌと共にインキュベー
トし、１５〜２０秒間最高速度でポリトロンを用いてホモゲナイズした。等量の
２Ｘ電気泳動試料緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８， ４％ ＳＤＳ
， １０％ グリセロール、０．００６％ブロモフェノールブルー、２％β−メ
ルカプトエタノール）を添加して試料を十分混合した。試料はその後の使用のた
めに−８０℃で凍結保存できる。
【００６０】 これらの方法を用いて溶解物を調製することにより、組織の起源に関わらず細
胞蛋白質の良好な標本化が可能になる。例えば血液中の蛋白質は過剰に標本化さ
れ、誤った蛋白質含有量となる場合がある。
【００６１】 試料の分析 Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ． ＃ＴＩＢ１５２， Ｍａｎａｓｓａｓ
， ＶＡ）を全面培養となるまで生育させ、その後、１２時間１００ｎｇ／ｍＬ
のホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａカタ
ログ番号Ｐ８１３９， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）で処理するか、未処理とし
た。細胞溶解物は前述の通り作成した。
【００６２】 個々の試料（０．２５ｍｇ蛋白質）を１６×１６ｃｍの７．５％〜１３％勾配
のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（図１と同様）の幅を実質的に横断して伸展
する単一の大型レーンとして泳動した。試料を電気泳動して分子量により蛋白質
を分離し、それらを電気泳動的にＰＶＤＦ膜に移行させた後、膜を相互に連絡し
ていない２５個の隣接する個別のスロットを有するＭＩＮＩＢＬＯＴＴＥＲ２５
装置（米国特許４，８３４，９４６号参照）に設置し、アプリケータおよびベー
スプレートを前述の図８に関する記載の通り膜に対向して固定した。異なる抗体
を含有する混合物をアプリケータプレートの異なるチャネルの各々の内部に注入
し、その際チャネルの間で相互の混入汚染が起こらないようにした。この特定の
実施例においては、異なる特異的結合剤のセットの各々には３〜８個の異なるモ
ノクローナル抗体（大部分は７個の異なる抗体を含む）を各々至適濃度で含有さ
せた。各曝露域（レーン）の蛋白質がそれぞれの大きさに基づいて容易に同定さ
れるように、異なる抗体の各々のセットは抗体により検出される蛋白質の異なる
大きさに基づいて発生したものである。チャネルの１つにおいては、抗体の標準
セットを各ゲルについて使用することにより分子量マーカーとする。この特定の
実施例においては、抗体の標準セットは図９Ａおよび図９Ｂのレーン２５におい
て泳動させた。
【００６３】 抗体含有溶液は２５℃で、６０分間チャネル内でインキュベートした。抗体含
有溶液をチャネルから取り出し、その後チャネルを緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
ｐＨ７．５， １００ ｍＭ ＮａＣｌ， ０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で
洗浄し、未結合の抗体を除去した。その後、プレートを取り外した後に膜を２５
℃で６０分間二次抗体の抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（セイヨウワサビパーオキシダ
ーゼ）と共にインキュベートし、次に緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ， ０．１
％ Ｔｗｅｅｎ−２０， ５％脱脂乳）で洗浄し、未結合の二次抗体を除去した
。蛋白質を可視化するために、膜を増強化学ルミネセンス用試薬（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢｉｏｔｅｃｈまたはＰｉｅｒｃｅまたは他の製造
元からの同様の試薬）と共にインキュベートし、その後膜を蛍光画像化スクリー
ンに曝露した。あるいは、膜をフィルムに曝露することもできる。次に得られた
シグナル（スクリーン上またはフィルム上）をデジタルコンピュータにデジタル
画像として取り込む。
【００６４】 対照データベースは蛋白質分離域内部の特定の位置において、各アプリケータ
スロットからの抗体により同定される蛋白質の各々に相当するシグナルのイメー
ジを含んでいる。各レーンの対照画像と実験ゲル由来の相当するレーンの画像と
で位置を比較することにより、異なる特異的結合剤のセット中に存在する抗体に
より認識された２５チャネルの各々中の各蛋白質が同定された。蛋白質同定後、
その位置の移行部材内に存在するその量を、分離域で同定された特定の蛋白質の
量に画像の輝度を相関させる例えばＢｉｏｒａｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａ
ｌｙｓｔ ｖ．２．１またはＳｉｌｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＵＮ−Ｓｃａｎ
−ＩＴ ｖ．３のようなソフトウエアを用いて定量することができる。この実施
例においては、Ｓｉｌｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのソフトウエアを用いて図９Ａ
および図９Ｂに示すすべての蛋白質バンドを定量した。図９Ａおよび図９Ｂのレ
ーン１９についてどのように定量をおこなったかを示す例を図１０Ａおよび図１
０Ｂに示す（以下に詳述する）。
【００６５】 すなわち、この方法は多数の蛋白質を同時に同定できるのみならず、元の混合
物中の蛋白質の相対量を測定することもできるのである。
【００６６】 抗体の混合物の２５個の異なるセットに曝露された実際の移行部材のデジタル
画像である図９Ａおよび図９Ｂに示す通り、数百の蛋白質を同時に可視化できる
。各「レーン」（アプリケータプレート内の単一のスロットから添加された異な
る特異的結合剤の１セットについて曝露域となっている）を、そのスロット内の
抗体が認識する蛋白質の既知の位置と比較する。
【００６７】 例えば図１０Ａに示すとおり、図９Ａ（＋ＰＭＡ）および図９Ｂ（−ＰＭＡ）
において（*）を付されたレーン１９を対照画像と比較する。対照画像は抗体混
合物中の抗体により認識される蛋白質の予測された位置を含んでいる。図１０Ａ
は、どのように対照画像を用いて図９Ａおよび図９Ｂのレーン１９の蛋白質を同
定するかを示している。図１０Ｂは、図１０Ａで観察された各レーンの蛋白質バ
ンドの各々の相対強度の測定により蛋白質相互の相対的定量をどのように行なう
かを示している。表１は、各試料中の蛋白質の各々の相対密度を示している。
【００６８】
【表１】
【００６９】 本分析により異なる試料中の同じ蛋白質の比較分析が可能となる。例えばＰＭ
Ａの存在下、蛋白質の発現パターンがＪｕｒｋａｔ細胞で変化する。ＤＳＩＦ、
ｒＳｅｃ８、ＰＤＩおよびＨＡＸ蛋白質の濃度は低下するが、アネキシンＶＩお
よびＢａｄ蛋白質の濃度はＰＭＡの存在により強力に調節されているとは考えら
れない。これと同様の分析法を用いて図９Ａおよび図９Ｂに示した残りの２４レ
ーンに示す蛋白質を同定、分析および定量した。
【００７０】 したがって、このイムノアッセイ法は数百の蛋白質の発現の相違を同時に分析
可能とする。慎重に選択されたセットの異なる特異的結合剤を用いて数百の十分
特性化された蛋白質をこのようにの平行分析することは、多大な時間の節約とな
る。
【００７１】 実施例２ 診断方法の検討 上記した方法を用いて、多数の蛋白質の存在と濃度を２個以上の試料の間で定
量的に比較することができる。この蛋白質の同時並行分析は、シグナル伝達蛋白
質のような細胞蛋白質の相違に（例えば腫瘍の進行中の）遺伝子発現の変化を関
連付けることができる。例えば、この方法を用いて正常細胞と同じ細胞型の腫瘍
細胞中の多数の蛋白質の発現濃度を比較することができる。
【００７２】 この方法においては、細胞または組織の溶解物を目的試料から調製する。この
ような溶解物は種々の試料、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．（Ｍａｎａｓｓｉｓ， ＶＡ）
から入手できるもののような組織培養細胞と、全血、血漿、血清、尿または脳脊
髄液のような生理学的試料と、生検試料や微細穿刺吸入液のような病理学的標本
とから得ることができる。同時に、正常組織の試料も入手する。あるいは、正常
組織が得られない場合は、抗体混合物の各々に曝露されている正常組織（すなわ
ち非腫瘍の肝、腎、皮膚等）の画像を含むデータベースを比較対照として使用す
る。患者から得られた試料（すなわち肝腫瘍生検試料）中で観察された発現濃度
を正常組織のデータベース（すなわち正常肝試料）中の同じ蛋白質について観察
される発現濃度と比較することにより、疾患状態が存在するかどうかを調べるこ
とができる。
【００７３】 １個より多い受容器２２がゲル内に設置されている場合は例えば１個のゲル上
での同時隣接分析も可能であるが、正常組織の溶解物を異なるゲル上で個々に電
気泳動に付す。実施例１に記載した方法により、異なるセットの特異的結合剤を
用いて蛋白質を分割し、プロービングする。結合剤は蛋白質を認識し、複数の目
的の蛋白質の発現濃度を正常試料と腫瘍試料との間で比較する。この方法は正常
細胞および新生物細胞における蛋白質の発現の差を測定するための安価で効率的
な手法である。さらにまた、蛋白質発現の比較は、正常細胞から前新生物異型性
へ、ｉｎ ｓｉｔｕの癌腫へ、そして、侵襲性の転移患部への進行に従って細胞
内で行なうことができる。
【００７４】 新生物の発症の各段階における相対的蛋白質発現の比較は、新生物の変化の生
化学的機序に関する重要な手がかりとなる。蛋白質発現のこのようなパターンが
測定された後、これらのパターンを用いて、例えば腫瘍の生化学的側面を調べる
ことにより、腫瘍を診断または評価し、これを悪性化の進行の特定の段階に割り
付けることができる。このような情報は診断目的のため、あるいは、腫瘍（また
は他の生物学的材料）の入手元である対象に対して適切な治療法の選択のために
用いることができる。
【００７５】 本方法の他の使用例には、正常過程における複数の蛋白質の発現の比較、およ
び、異なる系統の細胞（例えば幹細胞と成人分化細胞、胎児と成人の細胞、およ
びアポトーシスと増殖性の細胞）の複数の蛋白質の発現の比較が包含される。
【００７６】 実施例３ 特異的結合剤の異なるセット この実施例は本発明において使用することのできる異なる特異的結合剤のセッ
トを説明するものである。特異的結合剤の他のセットは、これらのセットを発生
させるために使用したものと同じ原理を用いて発生させることができる。各セッ
トにより認識される蛋白質は電気泳動的に相互に識別できるほど十分その分子量
において異なっている。本実施例においては、特異的結合剤はシグナル伝達蛋白
質を認識するモノクローナル抗体である。しかしながら、他の蛋白質（天然また
は合成）を認識するポリクローナル抗体のような他の抗体もまた使用できる。さ
らに、固体表面上の蛋白質に特異的に結合するいかなるリガンド剤も使用できる
。
【００７７】 操作の簡便化のために、すべての入手可能なマウスモノクローナル抗体をその
抗体に対して最適なシグナルを発生させた細胞溶解物に応じて分割した。例えば
、ヒト表皮様細胞系統ＨｅＬａにおいて標的蛋白質を認識することが予め分かっ
ている抗体のすべてをグループ化した。この情報から、各標的蛋白質が少なくと
も５〜２０ｋＤａ、例えば１０〜２０ｋＤａ離れてアクリルアミドゲル中で移行
するように抗体混合物を構築した。次に、図１１Ａに示す通り、これらの抗体混
合物を、個々および完全な混合物の双方として、ＨｅＬａ細胞溶解物から得たウ
エスタンブロット（実施例１参照）に添加した。図１１Ｂに示す通りＪｕｒｋａ
ｔ細胞内で大きいシグナルを生成した物を用いて同様の抗体混合物を発生させた
。この方法を用いて多数の抗体混合物を発生させた。
【００７８】 すなわち、上記した実施例から明らかな通り、特有の特異性を有する異なる抗
体を混合して、例えば２個の異なる抗体からゲルの分離性にのみ制限される最大
数までを含有する抗体混合物を形成することができる。抗体の混合は図１１に示
す通りその特異性に影響しない。抗体混合物は一般的に２個〜１０個の異なる抗
体を含有し、その標的はその見かけの分子量（ｋＤａ）において少なくとも２０
ｋＤａ異なる（図１１Ａ参照、ＰＫＡｃ ｖｓ． ｈＩＬＰ）か、または、少な
くとも５〜１０ｋＤａ異なる（図１１Ｂ参照、Ｒａｂ ８ ｖｓ． Ｒａｃｋ−
１）。すなわち、所定の混合物中の抗体の数はそのマーカーの分子量の「理想的
な」相違により選択することができる。例えば１０〜２５０ｋＤａの範囲の分子
量を有する蛋白質を分離する勾配ゲルにおいては、分子量差２０ｋＤａを選択し
た場合、１２個の異なる抗体を単一の混合物中に用いる。しかしながら、一部の
蛋白質は複数のイソフォーム（ダブレットまたはトリプレット）を有しており、
また、発現の内因的相違（一部の豊富な蛋白質はゲル上で広いバンドを形成する
）および異なる大きさの蛋白質分解産物のため、抗体の数は例えば所定の混合物
中で約１０個までに制限される場合もある。混合物を発生させる過程は長時間を
要する単調な作業であり、発生したすべてのシグナルが明確に同定できるように
なるまで、個々の抗体および混合物を異なる細胞溶解物中で試験することが必要
である。
【００７９】
【表２】
【００８０】 本発明の原理を適用してよい多くの可能な実施形態に鑑みて、説明した実施形
態は本発明の特定の例であるのみであり、本発明の範囲を限定すると解釈しては
ならない。例えば移行部材に同時にスロットを適用する代わりに、スロットを逐
次的に適用することもできる。出入口を経由するスロットへの供給源からの抗体
混合物の注入は、他の注入方法に置き換えることができ、そして分離域内部のバ
ンドの比較対照位置も曝露域内部の比較対照位置の検出に置き換えることができ
る。すなわち、本発明の範囲は添付する請求項により定義される。したがってこ
れらの請求項の範囲と精神に属するすべてが本発明として請求されるものである
。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は伸長された試料チャンバを含む分離ゲルである。２つの図
、すなわち、（Ａ）ゲルが水平位置の上面図、および（Ｂ）ゲルが垂直位置の前
面図を示す。このゲルは電流が適用された場合に蛋白質をその分子量に基づいて
分離する。
【図２】 図２は図１Ａと類似の図であり、９個の蛋白質を含有する試料か
らゲル内で発生させた分子量勾配パターンの模式図を示す。
【図３】 図３は移行部材に電気泳動的に移行させた後の分子量勾配パター
ンの模式図である。
【図４】 図４Ａは被覆プレート内に４個の伸張されたアプリケータを有す
る装置の側面図であり、図４Ｂは図４Ａに示した装置を用いて移行部材に添加し
た抗体混合物の異なるセットの模式図である。
【図５】 図５は９個の蛋白質を同時に同定するために抗体混合物で同時に
プロービングされた移行部材の模式図である。
【図６】 図６は分離された蛋白質を高速同定するための組立装置の上面図
である。
【図７】 図７は図６に示した装置の側面図であり、被覆プレートおよび底
部プレートは相互に分離しており、被覆プレート内の伸長されたアプリケータを
示している。
【図８】 図８は図６の矢印８−８の方向に見た拡大破断断面立面図である
。
【図９】 図９は本発明の蛋白質同定法に付された２個の移行部材のデジタ
ル画像であり、ＰＭＡの存在下（Ａ）および非存在下（Ｂ）でインキュベートし
たＪｕｒｋａｔ細胞内で多くの細胞を同時に同定した実験の結果を示している。
【図１０】 図１０は対照移行部材および対照群と比較した図９のレーン（ * 図９Ａおよび図９Ｂのレーン）を含む移行部材の部分の（Ａ）移行部材および
（Ｂ）そのグラフ表示のデジタル画像である。
【図１１】 図１１は（Ａ）Ｈｅｌａ細胞および（Ｂ）Ｊｕｒｋａｔ細胞の
細胞溶解物において試験した２個の抗体の混合物を示す移行部材のデジタル画像
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/483 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３１５Ｋ ３１５Ｆ ３０１Ｃ ３１５Ｚ ３０１Ａ (72)発明者 カンポス−ゴンザレス，ロベルト アメリカ合衆国、40515 ケンタッキー州、 レキシントン、ウッドグレン・コート、 973 (72)発明者 ヒューム，スティーブン・ダレル アメリカ合衆国、40444 ケンタッキー州、 ランカスター、デイビス・アベニュ、321 Ｆターム(参考） 2G045 DA36 FB03 FB05 4B029 AA07 BB17 FA15 4D054 FA06 FB15 FB20 【要約の続き】 るスロットを介して灌流される抗体混合物により認識さ れる。各レーンの蛋白質バンドの位置は、そのレーンに ついて混合物により認識される蛋白質の推定位置と相関 付けられる。

Claims (51)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも１個の試料混合物からゲル上の分離の方向のパタ
    ーンに蛋白質を分離することと、 分離の方向に伸展する複数の隣接する特異的結合剤アプリケータにパターンを
    曝露することであって、少なくとも一部のアプリケータが特異的結合剤の異なる
    セットを添加し、各セットが、分離の方向に沿って異なる蛋白質を相互に判別す
    るために十分異なる蛋白質を認識することとを含む、 蛋白質混合物試料中の異なる蛋白質を同定する方法。
  2. 【請求項２】 分離の方向を横断して伸展する伸長された試料チャンバ内に
    蛋白質混合物を導入し、かつ、電気泳動を実施して分子量により分離の方向に蛋
    白質を分離することにより、異なる蛋白質を電気泳動的に分子量勾配パターンに
    分離する、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 アプリケータが少なくとも３個の伸長されたアプリケータを
    備え、その各々が少なくとも２個の異なる特異的結合剤を添加する、請求項２に
    記載の方法。
  4. 【請求項４】 アプリケータが少なくとも３個の伸長されたアプリケータを
    備え、その各々が少なくとも６個の異なる特異的結合剤を添加する、請求項２に
    記載の方法。
  5. 【請求項５】 アプリケータが合計１０個の異なる特異的結合剤を添加する
    、請求項３に記載の方法。
  6. 【請求項６】 アプリケータが合計５０個の異なる特異的結合剤を同時に添
    加する、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 アプリケータの数に対して添加される異なる特異的結合剤の
    比率は、各アプリケータに対する少なくとも１個の異なる特異的結合剤である、
    請求項３に記載の方法。
  8. 【請求項８】 アプリケータの数に対して添加される異なる特異的結合剤の
    比率が、各アプリケータに対する少なくとも３個の異なる特異的結合剤である、
    請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 アプリケータが少なくとも１０個のアプリケータを含む、請
    求項３に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 アプリケータが実質的に相互に平行に伸展する、請求項１
    に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 アプリケータがアプリケータプレート内にスロットを含む
    、請求項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 アプリケータが、特異的結合剤が添加される際に通過する
    スロットと連絡する伸長されたチャネルをさらに含む、請求項１１に記載の方法
    。
  13. 【請求項１３】 特異的結合剤が抗体である、請求項１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 抗体がモノクローナル抗体である、請求項１３に記載の方
    法。
  15. 【請求項１５】 蛋白質試料混合物が細胞溶解物を含む、請求項１に記載の
    方法。
  16. 【請求項１６】 特異的結合剤がシグナル伝達蛋白質を認識する、請求項１
    に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 特異的結合剤にパターンを曝露した後に、特異的結合剤の
    結合位置を検出し、かつ、目的の蛋白質を同定する特定の特異的結合剤に各位置
    を相関させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 目的の蛋白質を検出した後に、目的の蛋白質を定量するこ
    とをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 パターンをゲルから移行部材に移行させ、かつ、異なるセ
    ットの特異的結合剤を移行部材に添加する、請求項１に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 電気泳動ゲル内の伸長された試料チャンバ内に蛋白質混合
    物を導入することと、 蛋白質混合物に対して電気泳動を実施して、蛋白質混合物を、伸長された試料
    チャンバから、試料チャンバを横切って伸展する分離の方向の分子量勾配パター
    ンに分離することと、 分離の方向に伸展し、かつ実質的に試料チャンバを横断するスロットを有する
    複数の隣接する伸長された抗体アプリケータチャネルに同時にパターンを曝露す
    ることであって、各スロットが異なるセットの特異的結合剤を添加し、各セット
    内の特異的結合剤が識別可能な分子量の蛋白質を認識し、類似の分子量を有する
    蛋白質が異なるスロットにより適用された特異的結合剤により検出されることと
    、 各チャネルに沿って１つ以上の特異的結合剤の結合位置を検出し、かつ、目的
    の蛋白質を同定する特定の特異的結合剤に各位置を相関させることとを含む、 蛋白質混合物中の異なる蛋白質を同時に同定する方法。
  21. 【請求項２１】 特異的結合剤が抗体を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 特異的結合剤の異なるセットを各々が添加する複数のアプ
    リケータチャネルに同時にパターンを曝露することが、各スロットから少なくと
    も３個の異なる特異的結合剤、およびすべてのアプリケータから合計少なくとも
    ５０個の異なる特異的結合剤を添加することを含む、請求項２０に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 各位置を相関させることが、検出された位置を各アプリケ
    ータの潜在的位置のデータベースと比較することを含み、各潜在的位置が目的の
    蛋白質と関連する、請求項２０に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 電気泳動ゲル内の伸長された試料用のくぼみ内に細胞溶解
    物試料を導入することと、 試料に電気泳動を実施して、細胞溶解物を、伸長された試料チャンバから、試
    料チャンバを横切って伸展する分離の方向の分子量勾配パターンに分離すること
    と、 パターンを移行部材に移行させることと、 分離の方向に伸展し、かつ実質的に試料チャンバを横断するスロットを有する
    複数の隣接する伸長された抗体アプリケータチャネルに、同時に移行部材上のパ
    ターンを曝露することであって、複数のアプリケータが異なるセットの特異的結
    合剤を添加し、各スロット内の特異的結合剤が識別可能な分子量の蛋白質を認識
    し、異なるスロット内の特異的結合剤が、異なる目的の蛋白質を認識するために
    実質的に異なっていることと、 各チャネルに沿って１つ以上の特異的結合剤の結合位置を検出し、かつ、各ア
    プリケータの検出された結合位置と推定結合位置とを比較することによって、目
    的の蛋白質を同定する特定の特異的結合剤に各位置を相関させることであって、 少なくとも５０個の異なる特異的結合剤がアプリケータにより添加されること
    とを含む、 細胞溶解物試料中の異なる蛋白質を同時に同定する方法。
  25. 【請求項２５】 試料を電気泳動に付すことにより複数の異なる蛋白質を分
    子量に応じて分離することと、 複数の異なる蛋白質を移行部材に移行および固定することと、 プレートの一方に数個の個別のスロットを含む装置の上側プレートと下側プレ
    ートの間に移行部材を配置することであって、異なるスロットが異なるセットの
    抗体含有混合物を添加することと、 移行部材内に目的の蛋白質が存在する場合、その蛋白質に抗体が結合するため
    に十分な時間、移行部材の表面に各抗体含有混合物を曝露することと、 移行部材内の目的の蛋白質に結合した抗体含有混合物内の抗体を検出すること
    と、 検出された抗体を目的の蛋白質の結合推定位置に相関させることとを含む、 試料中の複数の異なる蛋白質を同時に分析する方法。
  26. 【請求項２６】 移行部材が蛋白質移行膜である、請求項２５に記載の方法
    。
  27. 【請求項２７】 試料が細胞溶解物である、請求項２５に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 少なくとも２つの異なるセットの抗体含有混合物が、その
    ２つの異なるセットの抗体含有混合物が単一のスロットを通じて単一の曝露域に
    添加される場合には分離域内で識別されない蛋白質を識別する、請求項２５に記
    載の方法。
  29. 【請求項２９】 各抗体含有混合物が少なくとも２個の異なる抗体を含有す
    る、請求項２５に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 各抗体含有混合物が少なくとも１０個の異なる抗体を含有
    する、請求項２５に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 移行部材当たりに適用される異なる抗体の総数が５０〜２
    ５０個である、請求項２５に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 抗体の混合物が添加される際に通過するスロットの数に対
    する抗体の混合物の異なるセットの比率が１：１である、請求項２５に記載の方
    法。
  33. 【請求項３３】 各スロットから添加される異なる抗体の数は２〜１０の範
    囲にある、請求項２５に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 各スロットから添加される異なる抗体の数が１〜２０の範
    囲にある、請求項２５に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 スロットを含むプレートが少なくとも２０個の異なるスロ
    ットを含む、請求項２５に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 スロットを含むプレートが少なくとも５０個のチャネルを
    含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 目的の蛋白質の分子量が１０ｋＤａ〜３００ｋＤａの範囲
    にある、請求項２５に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 複数のアプリケータを有するアプリケータプレートと、 各アプリケータと連絡している液体供給ラインと、 異なる抗体の混合物のセットであって、異なる抗体の混合物が異なる供給ライ
    ンと連絡しており、異なる抗体の混合物の各々が電気泳動ゲル上で実質的にオー
    バーラップしない蛋白質を認識する抗体を含有し、異なる抗体の混合物が電気泳
    動ゲル上でオーバーラップする蛋白質を認識する抗体を含有する、異なる抗体の
    混合物のセットとを含む、 蛋白質混合物試料中の異なる蛋白質を同定するためのシステム。
  39. 【請求項３９】 異なる抗体の混合物を供給ライン内に導入しアプリケータ
    を通過させるための１個以上のポンプをさらに含む、請求項３８に記載のシステ
    ム。
  40. 【請求項４０】 抗体混合物に曝露された基体上のバンドを検出するスキャ
    ナをさらに含む、請求項３８に記載のシステム。
  41. 【請求項４１】 抗体混合物により検出される蛋白質が蛋白質混合物中に存
    在する場合に各抗体混合物について検出されるバンドの推定位置を含む比較対照
    画像源をさらに含む、請求項４０に記載のシステム。
  42. 【請求項４２】 比較対照画像源がコンピュータ読取可能媒体内に保存され
    ている、請求項４１に記載のシステム。
  43. 【請求項４３】 アプリケータを介して抗体混合物を導入するよう自動化さ
    れている、請求項３８に記載のシステム。
  44. 【請求項４４】 複数の異なる伸長されたアプリケータに基体を曝露するた
    めの曝露手段と、 異なるアプリケータに異なるセットの抗体混合物を供給するための供給手段で
    あって、第１のアプリケータに供給されるセットが第１のアプリケータの曝露経
    路に沿って個別に分割されるために十分に異なる分子量の蛋白質を認識する、供
    給手段とを含む、 電気泳動による分離域に分離された蛋白質を同定するための装置。
  45. 【請求項４５】 曝露手段が複数の異なる伸長されたアプリケータに基体を
    同時に曝露する、請求項４４に記載の装置。
  46. 【請求項４６】 第２のアプリケータに供給される抗体混合物のセットが、
    第１のアプリケータに供給される抗体混合物により認識される蛋白質から個別に
    分割されるのに実質的に異なる分子量のものではない蛋白質を認識する、請求項
    ４４に記載の装置。
  47. 【請求項４７】 請求項４０に記載のスキャナによって記録される基体上の
    バンドの画像。
  48. 【請求項４８】 コンピュータ読取可能媒体内に保存されている比較対照画
    像を有する、請求項４２に記載のコンピュータ読取可能媒体。
  49. 【請求項４９】 蛋白質が電気泳動により分離される、請求項１に記載の方
    法。
  50. 【請求項５０】 異なる蛋白質が、分子量により分離され、かつ異なる蛋白
    質を相互に識別するために十分異なる分子量のものである、請求項１に記載の方
    法。
  51. 【請求項５１】 蛋白質が、蛋白質を相互に識別するために十分異なる分子
    量のものである、請求項３８に記載のシステム。
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