JP2003517888A

JP2003517888A - 骨産生製品

Info

Publication number: JP2003517888A
Application number: JP2001546699A
Authority: JP
Inventors: フイリツパール，ピエール; ブラスール，ミシエル
Original assignee: ヘノゲン・ソシエテ・アノニム
Priority date: 1999-12-22
Filing date: 2000-12-20
Publication date: 2003-06-03
Also published as: DE60018607T2; ATE290407T1; AU2130501A; CA2394637A1; EP1239894B1; WO2001045760A1; DE60018607D1; AU774698B2; EP1239894A1

Abstract

(57)【要約】骨産生製品は、少なくとも１種類のリン脂質存在下でトロンビンを産生する組み換え化合物を含む血小板濃厚血漿の凝固マトリックス及び、マトリックスに分散された、骨の形成を誘発するために有効量のカルシウム含有化合物を含んで成る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）骨産生(bone generating)製品は、少なくとも１種のリン脂質の存在下でトロ
ンビンを産生するための組み換え化合物を含む血小板濃厚血漿の凝固マトリック
ス及び、骨の形成を誘発するために有効量の、マトリックス中に分散されたカル
シウム含有化合物を含んで成る。

【０００２】（従来の技術）骨代替物または移植物の調製のために多数の研究が実施されてきた。

【０００３】骨代替物または移植物の調製のために、プリオンを破壊するために、ヒトの骨
を化学薬品により処理することは周知である。そのように処理されたヒトの骨は
その移植後の細胞の成長に適した多孔質のマトリックスとして働く。

【０００４】更に、コラーゲン含有物質から人工マトリックスまたはスポンジを調製し、前
記マトリックスまたはスポンジを骨代替物として使用することも提唱されてきた
。

【０００５】米国特許第５，７３３，５４５号明細書の実施例４は、血漿−軟膜被膜濃縮物
及び粉砕乾燥骨を含む混合物からまたは血漿−軟膜被膜濃縮物及びＣａＣｌ₂か
らの血栓の調製を開示し、前記後者の化合物は混合物の凝固を確保するために使
用される。前記実施例４において、粉砕乾燥骨を含む血漿−軟膜被膜濃縮物の錯
体形成が、恐らくは、固形物の骨からのカルシウムの提供のためであることが述
べられている。前記実施例において、トロンビンの使用が患者の合併症の一因で
あることが明らかに明記されている。

【０００６】しかし、血漿−軟膜被膜濃縮物及び粉砕乾燥骨を混合することにより得られた
骨代替物は骨の産生には適さなかった。

【０００７】今や、骨産生用製品、すなわち、患者に移植されると急速な細胞転移増殖及び
骨の産生を可能にする製品が見いだされた。骨の産生を得るためには、骨産生用
製品を、血小板濃厚血漿、組み換えトロンビン産生用製品、少なくとも１種のリ
ン脂質及び、マトリックスに分散された、骨の形成を誘発するのに有効量のカル
シウム含有化合物、を使用することにより調製しなければならない。リン脂質を
伴うまたはそれの存在下の組み換え組織因子は組み換えトロンビン産生用製品と
して、しかしまた、脱顆粒球血小板のための手段として、そして血小板中に存在
する成長因子を放出するための手段として働く。好ましくは、カルシウム含有化
合物の少なくとも一部分は骨粒子から製造される。例えば、カルシウム含有化合
物の少なくとも３０重量％、好ましくは少なくとも５０重量％は骨粒子、好まし
くは非変性骨粒子から製造される。本発明の骨産生用製品中の骨粒子の存在は、
前記の骨粒子が、組織因子に骨を産生するように誘導するための成長因子と同様
に骨形態発生タンパク質を含むために、骨の産生を改善すると考えられる。患者
に、本発明の骨産生用製品を移植することにより得られた優れた骨産生は、血小
板濃厚血漿中に存在する様々な因子（成長因子、等）及び、１種もしくは複数の
カルシウム含有化合物（好ましくは骨粒子）の存在によると推定される。組み換
え組織因子の存在もまた好ましい。組み換え組織因子は、カルシウム含有化合物
の存在下で骨の形成を誘発し、加速させるのに適した因子の、タンパク質含有マ
トリックスを誘発する。実質的に血小板濃厚血漿、骨粒子及び組み換えトロンビ
ン産生用化合物のみを使用する場合は、本発明の製品中に存在する異なる因子は
、実質的に身体内におけるように（他方に対する１つの因子の比率が身体内にお
ける前記の比率に実質的に等しい）作用し、それにより骨の産生を改善すると推
定される。

【０００８】（発明の簡単な説明）本発明の骨産生製品はトロンビン産生用組み換え化合物を含む血小板濃厚血漿
の凝固マトリックスを含んで成り、前記マトリックスが少なくとも１種のリン脂
質及びマトリックス中に分散された、骨を産生するのに有効量のカルシウム含有
化合物を含んで成る。好ましくは、カルシウム含有化合物は、恐らくは他のカル
シウム含有化合物と混合された骨粒子である。好ましくは、カルシウム含有化合
物の少なくとも３０重量％、好都合には少なくとも５０重量％が骨粒子から成る
。カルシウム含有化合物の例は、ＣａＣｌ₂、リン酸β−トリカルシウム、骨粒
子（変性骨）、骨粒子（非変性骨）、アパタイト、アスピジン、硫酸カルシウム
、炭酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ヒドロキシアパタイト（さんご礁か
らの）、グルコノ乳酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウム、グ
ルトニン酸カルシウム（calcium glutoniate）及びそれらの混合物、である。

【０００９】好都合には、トロンビン産生用組み換え化合物は組み換えトロンボプラスチン
である。好ましくは、本発明の骨産生用製品は２種以上の異なるリン脂質を含ん
で成る。

【００１０】好都合な態様に従うと、トロンビン産生用組み換え化合物は１種の、好ましく
は少なくとも２種の異なるリン脂質と組み合わされる。

【００１１】好ましい態様に従うと、トロンビン産生用組み換え化合物は、ホスファチジル
セリン、その誘導体、少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホスファチジルセリン
、ホスファチジルコリン、その誘導体、及び少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつ
ホスファチジルコリン及びそれらの混合物から成る群から選択された１種のリン
脂質と組み合わされる。好ましくは、トロンビン産生用組み換え化合物は、ホス
ファチジルセリン、その誘導体、少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホスファチ
ジルセリン、ホスファチジルコリン、その誘導体、及び少なくとも１種の脂肪酸
側鎖をもつホスファチジルコリン及びそれらの混合物から成る群から選択された
１種のリン脂質と組み合わされ、脂肪酸側鎖が、少なくとも１種の二重結合及び
、６〜２４炭素原子、最も好ましくは１６〜１８炭素原子をもつ脂肪酸鎖から成
る群から選択される。

【００１２】最も好ましい態様に従うと、トロンビン産生用組み換え化合物は少なくとも２
個のリン脂質の混合物と組み合わされ、その第１のリン脂質は、ホスファチジル
セリン、その誘導体、少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホスファチジルセリン
及びそれらの混合物から成る群から選択され、少なくとも１種の脂肪酸側鎖をも
つホスファチジルセリンの脂肪酸側鎖は、少なくとも１種の二重結合及び６〜２
４炭素原子、好ましくは１６〜１８炭素原子をもつ脂肪酸鎖から成る群から選択
され、他方、第２のリン脂質はホスファチジルコリン、その誘導体、及び少なく
とも１種の脂肪酸側鎖をもつホスファチジルコリン及びそれらの混合物から成る
群から選択され、少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホスファチジルコリンの脂
肪酸側鎖が、少なくとも１種の二重結合及び６〜２４炭素原子をもつ脂肪酸鎖か
ら成る群から選択される。

【００１３】本発明の骨産生用製品において、骨粒子は好ましくは、脳顔面頭蓋骨粒子、腸
骨粒子及びそれらの混合物から成る群から選択された骨粒子である。好ましくは
、骨粒子は非変性骨の粒子である。好都合には、骨粒子は０．５ｍｍと５ｍｍの
間を含んで成り、好ましくは０．５と３ｍｍの間を含んで成り、最も好ましくは
約１ｍｍ（重量平均）を含んで成る平均粒度をもつ。骨粒子は例えば、０．５ｍ
ｍと５ｍｍの間を含んで成り、好ましくは０．５と３ｍｍ、最も好ましくは約１
ｍｍ（重量平均）を含んで成る平均粒度をもつチップまたはフレークの形態をも
つ。可能な態様に従うと、骨粒子は変性骨粒子（例えば、プリオンを除去するた
めに、１種もしくは複数の化学薬品により、放射線、等により処理してある骨を
粉砕することにより調製された骨粒子）並びに非変性骨粒子の混合物から成る。
幾らかの変性骨粒子を使用する場合は、変性骨の前記の粒子は、前記の変性骨粒
子が製品へ幾らかのカルシウムを添加するために使用されるので、０．５ｍｍよ
り小さい粒度をもつことができる。

【００１４】本発明の骨産生製品は例えば、５％〜５０容量％の骨粒子、好都合には１０〜
４０％、好ましくは２０〜３０容量％の骨粒子を含んで成る。骨粒子は好ましく
は、本発明の骨産生製品中に存在するカルシウム含有化合物の９０重量％より多
くを形成する。

【００１５】本発明の骨産生製品の好都合な態様に従うと、凝固マトリックスはマトリック
ス形成物剤１マイクロリッター当たり１，５００，０００〜２，０００，０００
個の血小板濃度、及び、好ましくは、マトリックス形成剤１マイクロリッター当
たり０．０５〜０．４μｇの乾燥形態のトロンボプラスチンを含む血小板濃厚血
漿の凝固マトリックスである。血小板濃度は３７℃で血小板の有効性を保証する
ために採用された濃度である。

【００１６】併発症をできるだけ回避し、患者の天然の骨上に産生される骨の移植体をでき
るだけ改善するために、使用される血小板濃厚血漿は患者の血漿からそして／ま
たは患者と組織適合性(hystocompatible)の血漿から（すなわち免疫学的組織適
合性）調製され、他方、骨粒子は患者の骨からそして／または患者と組織適合性
（すなわち免疫学的組織適合性）の１種もしくは複数の骨から調製される。

【００１７】本発明の骨産生用製品は恐らく、成長因子（上科ＢＴＧＦ及び、ＢＭＰ−１の
ようなＢＭＰの科、等）、遺伝子コードＢＭＰ及び／またはＢＴＧＦ、立体因子
、カルシウム含有化合物、薬剤、脂肪酸、抗生物質もしくは抗生物質の混合物（
好ましくはテトラサイクリン群の抗生物質、Vibramaycin^(R)、Doxycycline^(R)、
ミノサイクリン、minocin^(R)(Wyeth-Lederlee）のような抗破骨細胞作用をもつ
１種もしくは複数の化合物、及びマクロライド、ペニシリンに基づいた化合物、
等のようなもう１種の、１種もしくは複数の抗生物質を含む抗破骨細胞作用をも
つ１種もしくは複数の化合物の混合物）、殺バクテリア剤、殺ウイルス剤、フィ
ブリノーゲン、マトリックスの形成を誘発する化合物、バッファー、生理学的ｐ
Ｈ、等において双イオン性バッファー系のような、更なる成分または添加剤、並
びに前記化合物または添加剤の混合物、を含むことができる。

【００１８】好ましい態様の詳細に従うと、骨産生用製品は、０．００１〜１０重量％の１
種もしくは複数の抗生物質（その乾燥形態で計算された）、好都合には０．０１
〜５重量％、好ましくは０．０２〜１％、例えば０．０５〜０．４重量％を含む
。抗生物質は好都合には、抗破骨細胞作用をもつ抗生物質（より具体的にはテト
ラサイクリン群の抗生物質、Vibramaycin^(R)、Doxycycline^(R)、ミノサイクリン
、minocin^(R)(Wyeth-Lederlee））、抗破骨細胞作用をもつ抗生物質の混合物、
及び１種以上の、１種もしくは複数の他の抗生物質（好ましくは、マクロライド
、ペニシリンに基づいた化合物、等及びそれらの混合物）との抗破骨細胞作用を
もつ１種以上の抗生物質の混合物、から成る群から選択される。

【００１９】そのゲル化の前に、骨産生用製品は、好都合には、３７℃で測定された、生理
学的ｐＨ、例えば６．５と８の間、好ましくは、約７〜７．５のｐＨを含んで成
るｐＨに実質的に等しいｐＨをもつ。

【００２０】本発明はまた、トロンビン産生用組み換え化合物を含む血小板濃厚血漿の凝固
マトリックス、及び、前記マトリックス中に分散された骨粒子を含んで成る骨産
生用製品の調製法に関し、そこで、 − 実質的に均質な混合物が、組み換えトロンビン産生用化合物及びリン脂質を
混合物に添加する時に、骨産生を誘発するために有効量の１種類もしくは複数の
カルシウム含有化合物と、血小板濃厚血漿を混合することにより形成され、 − 組み換えトロンビン産生用化合物及び少なくとも１種のリン脂質が、骨粒子
及び血小板濃厚血漿の混合物に添加、混合され、並びに − 組み換えトロンビン産生用化合物、血小板濃厚血漿、リン脂質及び骨粒子の
混合物が、血小板濃厚血漿の凝固及び骨産生用マトリックスの形成を確保するた
めの条件下に維持される。

【００２１】好ましくは凝固は酸素の存在下で、実質的に撹拌せずに実施される。前記凝固
は最も好ましくは、３５℃と４０℃の間を含んで成る温度で、より具体的には、
約３７℃の温度で実施される。

【００２２】本発明の方法において、凝固のために使用されたトロンビン産生用組み換え化
合物は好都合には、組み換えトロンボプラスチンである。

【００２３】好都合には、少なくとも２種の異なるリン脂質を、組み換えトロンビン産生用
化合物、血小板濃厚血漿及び骨粒子の混合物、並びに血小板濃厚血漿及び骨粒子
の混合物、から成る群から選択された混合物に添加し、そこで前記添加が好まし
くは、組み換えトロンビン産生用化合物を添加する時に実施される。

【００２４】本発明の方法において、組み換えトロンビン産生用化合物は好都合には、リン
脂質、好ましくは複数のリン脂質と組み合わされ、そこで１種もしくは複数のリ
ン脂質と組み合わされた前記化合物は好都合には、凍結乾燥ケーク、粉末もしく
は顆粒のような、凍結乾燥製品の形態をもつ。

【００２５】本発明の好ましい方法に従うと、トロンビン産生用組み換え化合物は、ホスフ
ァチジルセリン、その誘導体、少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホスファチジ
ルセリン、ホスファチジルコリン、その誘導体、及び少なくとも１種の脂肪酸側
鎖をもつホスファチジルコリン及びそれらの混合物、からなる群から選択された
少なくとも１種のリン脂質と組み合わされ、そこで脂肪酸側鎖は好都合には、少
なくとも１種の二重結合及び６〜２４炭素原子、好ましくは１６〜１８炭素原子
をもつ脂肪酸鎖から成る群から選択される。

【００２６】本方法の最も好ましい態様に従うと、トロンビン産生用組み換え化合物は少な
くとも２種のリン脂質の混合物と組み合わされ、第１のリン脂質はホスファチジ
ルセリン、その誘導体、少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホスファチジルセリ
ン及びそれらの混合物から成る群から選択され、少なくとも１種の脂肪酸側鎖を
もつホスファチジルセリンの脂肪酸側鎖は、少なくとも１種の二重結合及び６〜
２４炭素原子、好ましくは１６〜１８炭素原子をもつ脂肪酸鎖から成る群から選
択され、他方第２のリン脂質は、ホスファチジルコリン、その誘導体、及び少な
くとも１種の脂肪酸側鎖をもつホスファチジルコリン及びそれらの混合物、から
なる群から選択され、少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホスファチジルコリン
の脂肪酸側鎖は、少なくとも１種の二重結合及び６〜２４炭素原子をもつ脂肪酸
鎖から成る群から選択される。

【００２７】好ましくは、１種もしくは複数のカルシウム含有化合物の少なくとも一部は、
骨粒子、好都合には、脳顔面頭蓋骨粒子、腸骨粒子及びそれらの混合物から成る
群から選択された骨粒子により形成される。骨粒子は好都合には、非変性骨の粒
子である。前記骨粒子は恐らくは、非変性骨粒子及び変性骨粒子の混合物から成
ることができる。骨粒子は好都合には、０．５ｍｍと５ｍｍの間を含んで成る、
好ましくは０．５と３ｍｍの間を含んで成る、最も好ましくは約１ｍｍの平均（
重量）粒度をもつ。

【００２８】本発明の方法において、血小板濃厚血漿に添加された骨粒子の量は例えば、血
小板濃厚血漿及び骨粒子の混合物の約５％〜５０容量％、好都合には１０〜４０
容量％、好ましくは２０％〜３０容量％に相当する。

【００２９】好都合には、本発明の方法に使用された血小板濃厚血漿はマトリックス形成剤
１マイクロリッター当たり１，５００，０００〜２，０００，０００個の血小板
濃度をもつ。

【００３０】好ましくは、血小板濃厚血漿、骨粒子及び組み換えトロンビン産生用化合物の
混合物は骨粒子を含まない混合物１マイクロリッター当たり１，５００，０００
〜２，０００，０００個の血小板濃度をもち、骨粒子を含まない混合物１マイク
ロリッター当たり乾燥形態のトロンボプラスチン０．０５〜０．４μｇを含む。

【００３１】患者のための骨産生用製品の調製に適した本発明の好ましい方法に従うと、血
小板濃厚血漿は、患者の血漿からそして／または、患者と組織適合性の血漿から
調製され、そこで骨粒子は患者の骨からそして／または患者と組織適合性の骨か
ら調製される。

【００３２】本発明の好ましい方法の詳細に従うと、血小板濃厚血漿の凝固は、少なくとも
１種の抗生物質の存在下で実施され、そして／または少なくとも１種の抗生物質
が血小板濃厚血漿の凝固後に、混合物に添加される。抗生物質または抗生物質の
混合物は恐らくは、その粉砕の前に骨粒子及び／または骨に、そして／またはト
ロンビン産生用組み換え化合物にそして／またはリン脂質に添加することができ
る。好ましくは、抗生物質もしくは抗生物質の混合物はトロンビン産生用組み換
え化合物（トロンビンを産生する組み換え化合物）と、好ましくは組み換えトロ
ンボプラスチンと混合される。

【００３３】好ましい態様の詳細に従うと、骨産生用製品に添加されたまたは血小板濃厚血
漿の骨産生用製品の凝固中に使用された、１種もしくは複数の抗生物質の量は、
１種もしくは複数の抗生物質を０．００１〜１０重量％（その乾燥形態で計算さ
れた）、好都合には０．０１％〜５重量％、好ましくは０．０２〜１％、例えば
０．０５％〜０．４重量％、より具体的には０．２〜０．３％を含む。抗生物質
は好都合には、抗破骨細胞作用をもつ抗生物質（より具体的にはテトラサイクリ
ン群の抗生物質、Vibramaycin^(R)、Doxycycline^(R)、ミノサイクリン、minocin⁽ ^R) (Wyeth-Lederlee））、抗破骨細胞作用をもつ抗生物質の混合物、及び１種以
上の１種もしくは複数の他の抗生物質（好ましくは、マクロライド、ペニシリン
に基づいた化合物、等及びそれらの混合物）との抗破骨細胞作用をもつ１種以上
の抗生物質の混合物、から成る群から選択される。

【００３４】最も好ましくは、少なくとも１種の抗生物質は、トロンビンを産生する組み換
え化合物を添加する前に、しかし好都合には、トロンビンを産生する組み換え化
合物を添加する時に、少なくとも血小板濃厚血漿及びカルシウム含有化合物を含
む混合物に添加される。

【００３５】本発明はまた、血小板濃厚血漿及び骨産生を誘発するのに有効量のカルシウム
含有化合物の混合物からの骨産生用製品の調製のために、少なくとも１種のリン
脂質と混合した、トロンビン産生用組み換え化合物の使用に関する。

【００３６】本発明の更なる目的は、トロンビン産生用組み換え化合物、少なくとも１種の
リン脂質及びカルシウム含有化合物を含む混合物であり、カルシウム含有化合物
／トロンビン産生用組み換え化合物からのカルシウムの重量比は０．５より大き
く、好都合には２より大きい。前記は好都合には、乾燥粉末の形態をもつ。カル
シウム含有化合物は好ましくは、カルシウム含有塩、リン酸β−トリカルシウム
、変性骨の粒子及びそれらの混合物から成る群から選択される。

【００３７】本発明のまだ更なる目的は、トロンビン産生用組み換え化合物、少なくとも１
種のリン脂質及び少なくとも１種の抗生物質を含む混合物である。混合物中に存
在する１種もしくは複数の抗生物質（乾燥物質として）／混合物中に存在するト
ロンビン産生用組み換え化合物（乾燥物質として）の重量比は好都合には、１：
１より大きく、好ましくは３：１より大きく、最も好ましくは５：１より大きく
、そしてより具体的には１０：１より大きい。例えば、前記の比率は５：１と５
０：１の間を含んで成り、より具体的には１０：１と２５：１の間を含んで成る
。

【００３８】抗生物質は好都合には、抗破骨細胞作用をもつ抗生物質（より具体的にはテト
ラサイクリン群の抗生物質、Vibramaycine^(R)、Doxycycline^(R)、ミノサイクリ
ン、minocin^(R)(Wyeth-Lederlee））、抗破骨細胞作用をもつ抗生物質の混合物
、及び１種以上の、１種もしくは複数の他の抗生物質（好ましくは、マクロライ
ド、ペニシリンに基づいた化合物、等及びそれらの混合物）との抗破骨細胞作用
をもつ１種以上の抗生物質の混合物、から成る群から選択される。

【００３９】トロンビン産生組み換え化合物は好都合には、組み換えトロンボプラスチンで
ある。

【００４０】本発明は更に、密閉材の調製法に関し、そこでフィブリノーゲン含有溶液が少
なくとも１種のリン脂質の存在下でトロンビン産生用組み換え化合物と接触、好
ましくは混合される。好都合には、トロンビン産生用組み換え化合物は組み換え
トロンボプラスチンである。

【００４１】好都合には、ゲルが、６と８の間、好都合には７と７．５の間に維持されたｐ
Ｈで形成されるように、少なくとも１種類のリン脂質、少なくとも１種類の抗生
物質及び少なくとも有効量の１種類のバッファーの存在下で、トロンビン産生用
組み換え化合物と、フィブリノーゲン含有溶液を接触させることにより，ゲルが
形成される。

【００４２】好ましくは１種類もしくは複数の抗生物質及び１種類もしくは複数のバッファ
ー剤を含むバッファー溶液を調製し、フィブリノーゲン含有溶液と接触させる。
前記バッファー溶液のｐＨは好都合には、６と８の間、最も好ましくは７と７．
５の間を含んで成る。バッファー溶液は恐らくは、しかし好都合には、１種類も
しくは複数のトロンビン産生用組み換え化合物及び／または１種類もしくは複数
のリン脂質を含むことができる。

【００４３】可能なバッファーは例えば、ＴＲＩＳバッファー、リンゲ溶液（solution of
Ringe）、重炭酸ナトリウム及びそれらの混合物である。

【００４４】好ましくは、フィブリノーゲン含有溶液は少なくとも２種の異なるリン脂質の
存在下で、トロンビン産生用組み換え化合物と接触される。

【００４５】最も好ましくは、フィブリノーゲン含有溶液はホスファチジルセリン、その誘
導体、少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホスファチジルセリン、ホスファチジ
ルコリン、その誘導体、及び、少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホスファチジ
ルコリンから成る群から選択された少なくとも１種のリン脂質、好ましくは、前
記の群から選択された少なくとも２個のリン脂質の存在下で、トロンビン産生用
組み換え化合物と接触される。ホスファチジルコリンの脂肪酸側鎖は好都合には
、少なくとも１種の二重結合及び６〜２４炭素原子、好都合には１６〜１８炭素
原子をもつ脂肪酸鎖から成る群から選択される。

【００４６】密封材の形成の前に、混合溶液は好都合には、生理学的ｐＨ、例えば３７℃で
測定された、６．５と８の間を含んで成るｐＨ、好ましくは約７〜７．５、のｐ
Ｈに実質的に等しいｐＨをもつ。

【００４７】好都合には、血小板濃厚血漿はフィブリノーゲン含有溶液として使用される。
血小板濃厚血漿は好都合には、１マイクロリッター当たり、１，５００，０００
〜２，０００，０００個の血小板の濃度をもつ。好ましくは、１マイクロリッタ
ー当たり１，５００，０００〜２，０００，０００個の血小板濃度をもつ血小板
濃厚血漿、１マイクロリッター当たり０．０５〜０．４μｇの乾燥形態のトロン
ボプラスチン及び、１マイクロリッター当たり０．０１〜４μｇ（好都合には０
．１〜０．４μｇ、好ましくは０．２〜０．３μｇ）の１種類もしくは複数の抗
生物質（乾燥物質として）が、ゲル化期間に、６と８の間、好都合には７と７．
５の間にｐＨを調整するために、有効量の１種類もしくは複数のバッファー剤の
存在下で、血小板濃厚血漿と接触させられる。

【００４８】血小板濃厚血漿を使用する時には、できるだけ併発症を回避し、患者の密封材
の移植体をできるだけ改善するために、使用された血小板濃厚血漿を患者の血漿
からそして／または患者と組織適合性の血漿から（すなわち、免疫学的な組織適
合性）調製される。

【００４９】フィブリノーゲン含有溶液、好ましくは血小板濃厚血漿は好都合には、少なく
とも１種類の、好ましくは２種類の異なるリン脂質の存在下で、そして少なくと
も１種類の抗生物質の存在下で、少なくとも１種類のトロンビン産生用組み換え
化合物と接触させられる。

【００５０】好ましくは、フィブリノーゲン含有溶液、好ましくは血小板濃厚血漿は、少な
くとも１種類のトロンビン産生用組み換え化合物及び少なくとも１種類、好まし
くは２種類の異なるリン脂質を含む溶液と接触させられる。

【００５１】１種類以上の抗生物質を使用する時に、使用される１種類もしくは複数の抗生
物質の量は好都合には、密封材が１種類もしくは複数の抗生物質を０．００１〜
１０重量％、好都合には０．０１％〜５重量％、好ましくは０．０２〜１％、最
も好ましくは０．０５〜０．４％含むようなものである。密封材混合物中に存在
する１種類もしくは複数の抗生物質／密封混合物中に使用されたトロンビン産生
用組み換え化合物の重量比（乾燥物質として計算された）は好都合には、１：１
より大きく、好ましくは３：１より大きく、最も好ましくは５：１より大きく、
そしてより具体的には１０：１より大きい。例えば、前記の比率は５：１と５０
：１の間、より具体的には１０：１と２５：１の間を含んで成る。

【００５２】抗生物質は好都合には、抗破骨細胞作用をもつ抗生物質（より具体的にはテト
ラサイクリン群の抗生物質、Vibramaycin^(R)、Doxycycline^(R)、ミノサイクリン
、minocin^(R)(Wyeth-Lederlee））、抗破骨細胞作用をもつ抗生物質の混合物、
並びに１種以上の１種もしくは複数の他の抗生物質（好ましくは、マクロライド
、ペニシリンに基づいた化合物、等及びそれらの混合物）との抗破骨細胞作用を
もつ１種以上の抗生物質の混合物、から成る群から選択される。

【００５３】本発明は更に、本発明に従う密封材の調製のためのキットに関し、前記キット
は − フィブリノーゲン含有物質、好ましくはフィブリノーゲン含有溶液を含む第
１のバイアル、 − トロンビン産生用組み換え化合物、好ましくは前記組み換え化合物を含む溶
液、を含む第２のバイアル、 − 恐らくは、フィブリノーゲン含有溶液及び／またはトロンビン産生用組み換
え化合物を含む溶液の調製のための、第１のバイアル及び／または第２のバイア
ルに添加されるべき溶液を含む第３のバイアル、を含んで成り、そこで第１のバイアル及び／または第２のバイアル及び／または第３のバイアルが少
なくとも１種のリン脂質、好ましくは少なくとも２種の異なるリン脂質を含み、
そして第１のバイアル及び／または第２のバイアル及び／または第３のバイアル（好
ましくは第２及び／または第３のバイアル）が少なくとも１種類の抗生物質を含
む。

【００５４】好都合には、第１のバイアル及び／または第２のバイアル及び／または第３の
バイアルは少なくとも１種類のバッファー剤を含む。好ましくは、第２のバイア
ルが少なくとも１種類のリン脂質及び少なくとも１種類の抗生物質を含み、他方
、第３のバイアルが１種類もしくは複数のバッファー剤を含む。最も好ましくは
、第１のバイアルが乾燥形態のフィブリノーゲン含有物質を含み、他方、第２の
バイアルが乾燥形態のトロンビン産生用組み換え化合物を含む。

【００５５】本発明の製品及び方法の詳細及び特徴は以下の実施例の説明から明白になるで
あろう。

【００５６】

【実施例の説明】

前記の実施例の調製のために、以下の製品を使用した。

【００５７】ＰＲＰ：骨移植体が移植された患者の血小板濃厚血漿。血漿の血小板濃度は血
漿１マイクロリッター当たり１，８００，０００個の血小板であった。ＰＲＰは
細菌学的抑制のために最大の割合の生命血小板を得るために白血球を除去するた
めの既知の通常の処理を受け、前記ＰＲＰは少なくとも５日間活性であった。そ
の使用の前に、ＰＲＰを３７℃で震盪し、前記の震盪はＰＲＰを含む容器を震盪
することにより実施した。

【００５８】トロンボプラスチン：使用したトロンボプラスチンは会社DADE AG(Duedingen,
Switzerland）により商品名INNOVINとして販売されたトロンボプラスチンであっ
た。トロンボプラスチンは合成リン脂質、すなわちホスファチジルセリン及びホ
スファチジルコリンと組み合わせて凍結された組み換えヒト組織因子であり、前
記リン脂質は少なくとも１種類の脂肪酸側鎖をもち、脂肪酸側鎖は少なくとも１
種の二重結合及び１６〜１８炭素原子をもつ脂肪酸鎖からなる群から選択された
。Innovinはプロトロンビンを含まず、因子FVIIを含まず、そして因子FXを含ま
ない。カルシウムはInnovin中に存在する。Innovinは試験の目的のための既知の
製品である。Innovinはまた、生理学的ｐＨにおいて幾らかのカルシウム、双イ
オン性バッファー系を含む。

【００５９】骨粒子：骨粒子は骨の移植が必要な患者の腸骨または脳顔面頭蓋骨から調製さ
れた。患者の新鮮な骨を１ｍｍの平均直径をもつ骨のフレーク（骨ミール）に粉
砕した。骨粒子をその調製の直後にＰＲＰに添加する。

【００６０】水：使用した水は蒸留、滅菌の、発熱物質を含まない水である。（実施例１）前記実施例において、ＰＲＰの５０ｍｌを滅菌容器内に入れた。骨粒子１０ｍ
ｌ容量（脳顔面頭蓋から採取）をＰＲＰに添加し、混合した。次に容器を酸素含
有雰囲気中で滅菌条件下で３７．５℃に加熱する（例えば、３７．５℃の温度を
もつ、水及び０．９％ＮａＣｌを含む水浴を使用することにより）。

【００６１】 Innovinの１０ｍｇを蒸留、滅菌そして発熱物質を含まない水２ｍｌと混合し
た。水＋Innovinの混合物を３７．５℃の温度に維持したＰＲＰ＋骨粒子混合物
に添加した。

【００６２】撹拌せずに約１０分後、容器内にゲルが形成し、前記ゲルは患者への移植に適
した骨産生用製品である。（実施例２） Innovinの２０ｍｇを蒸留、滅菌そして発熱物質を含まない水の２ｍｌと混合
し、ＰＲＰ＋骨粒子混合物に添加したことを除いて、実施例１を繰り返した。（実施例３〜９）前記実施例において、使用した試薬の量が異なることを除いて実施例１を繰り
返した。実施例３４５６７８９ＰＲＰ（ｍｌ） 50 50 50 50 50 50 50 骨粒子（ｍｌ） 10 10 15 40 30 25 50 脳顔面頭蓋 Innovin（ｍｇ） 20 10 10 10 10 20 10 水（ｍｌ） 2 2 2 2 2 4 4 （実施例１０〜１９）前記実施例においては、使用した試薬の量が異なることを除いて実施例１を繰
り返した。実施例 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 ＰＲＰ（ｍｌ） 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 骨粒子（ｍｌ） 10 20 10 10 10 20 10 （脳顔面頭蓋）骨粒子（ｍｌ） 10 20 40 10 10 20 10 10 20 30 （腸骨） Innovin（ｍｇ) 20 20 10 20 10 10 20 30 10 10 水（ｍｌ） 2 2 4 2 2 2 2 2 4 4 ゲル形態をもつ前記実施例１〜１９の骨産生製品は患者に、例えば、より重症
な上顎顔面アトロフィーを罹患するヒトの患者に容易に移植することができる。
本発明の骨産生製品は骨の隙間に容易に充填することができ、形状を形成するこ
とができる。本発明の骨産生製品をより重症な上顎顔面アトロフィーを罹患する
ボランティアに使用した。洞リフト移植及び上顎顔面骨上の付加移植（on lay g
raft）を実施した。これらの試験は、本発明の骨産生製品が適用された部分に骨
の成長または骨の産生を示した。（実施例２０）ヒトの骨を、プリオンを除去するために変性し、γ−放射した。骨を０．２ｍ
ｍの平均（重量）粒度に粉砕した。乾燥後、骨粒子１０ｇを乾燥INNOVIN１０ｍ
ｇと乾燥混合して、トロンビン産生用組み換え化合物、リン脂質及び高濃度のカ
ルシウム含有化合物の混合物を得た。

【００６３】次に、そのように調製した混合物を本発明の骨産生製品の調製のために使用し
た。

【００６４】 INNOVIN１０ｍｇ＋変性骨粒子１０ｇの混合物をINNOVIN１０ｍｇ単独の代わり
に使用し、そしてパスタを調製するように水量を調整するために、より大量の滅
菌水（５〜１０ｍｌ）を使用したことを除いて、実施例１の方法を繰り返した。

【００６５】（実施例２１）組み換えトロンボプラスチンを添加する前に、ＰＲＰ及び骨粒子混合物１ｍｌ
当たりVibramycin^(R)２００μｇを添加したことを除いて、実施例１を繰り返し
た。（実施例２２）組み換えトロンボプラスチン添加の前に、ＰＲＰ及び骨粒子混合物１ｍｌ当た
りミノサイクリン（Minocin^(R)）１００μｇを添加したことを除いて、実施例１
を繰り返した。（実施例２３）組み換えトロンボプラスチン添加の前に、ＰＲＰ及び骨粒子混合物１ｍｌ当た
りミノサイクリン（Minocin^(R)）５０μｇを添加したことを除いて、実施例１を
繰り返した。（実施例２４）組み換えトロンボプラスチン添加の前に、ＰＲＰ及び骨粒子混合物１ｍｌ当た
りミノサイクリン（Minocin^(R)）２０μｇを添加したことを除いて、実施例１を
繰り返した。（実施例２５） Innovinの１０ｍｇをVibramycin^(R)１００ｍｇと混合した。Vibramycinの存在
はInnovinの安定性及び作用を改善するように見える。

【００６６】 Innovin−Vibramycin^(R)混合物をゲルの調製のために実施例１におけるように
使用した。（実施例２６） Innovinの１０ｍｇを水５ｍｌと混合した。その後、Vibramycin１００ｍｇをI
nnovinの前記の水性混合物に添加した。次に、混合物を凍結乾燥して、Innovin
及びVibramycinを含む粉末またはケークを得た。

【００６７】次に、凍結乾燥製品を実施例２５におけるように使用した。

【００６８】 Innovinの調製方法におけるように、組み換えトロンボプラスチン及びリン脂
質の水性混合物を凍結乾燥し、前記抗生物質（例えばVibramycin）を、その凍結
乾燥の前に水性混合物に添加することができる（例えば、Innovinの調製法で実
施したように、Ｃａ⁺⁺、バッファー及び安定剤の混合物への添加の前及び／また
は後に）。（実施例２７〜２９） Minocin^(R)（Wyeth-Lederlee）をVibramycin^(R)の代わりに使用したことを除
いて、実施例２４〜２６を繰り返した。（実施例３０〜５９） American diagnostica Inc.の組み換え組織因子４５００Ｌ／ＢをInnovinの代
わりに使用したことを除いて、実施例１〜２９を繰り返した。American diagnos
tica Inc.の組み換え組織因子４５００Ｌ／Ｂ２も使用することができる。（実施例６０）密封材を、ＰＲＰ５０ｍｌをInnovin１０ｍｇ、Minocin^(R)１００ｍｇ及び生
理学的に許容できるバッファー（ＰＲＰとのその混合の前の水溶液に対して約７
．２のｐＨをもつために十分な量の、例えば重炭酸ナトリウムの溶液）を含む水
溶液２ｍｌと混合することにより調製した。密封ゲルをそのようにして得た。（実施例６１）ＰＲＰ５０ｍｌを第１のシリンジの室内に入れ、他方Innovin１０ｍｇ、Minoc
in^(R)１００ｍｇ及び生理学的に許容できるバッファー（重炭酸ナトリウム）を
含む水溶液２ｍｌを第２のシリンジの室内に入れた。傷に混合物を適用する前に
、Innovin、Minocin及びバッファーとＰＲＰを混合するために２本のシリンジを
ミキサーに、そしてミキサーにＰＲＰ１ｍｌ当たりInnovin溶液０．０４ｍｌを
連続的に配達するための手段に接続した。（実施例６２） Innovin１０ｍｇ及びVibramycin^(R)２００ｍｇ及びバッファー剤（溶液のｐＨ
は約７．２である）を含む水溶液１０ｍｌを使用し、手段がＰＲＰ１ｍｌ当たり
Innovin−Vibramycin溶液０．２ｍｌをミキサーに連続的に配達することを除い
て、実施例６１を繰り返した。（実施例６３）密封材の調製用キットで、前記キットは − ＰＲＰを含む第１のバイアル − 乾燥形態のInnovin及びVibramycinを含む第２のバイアル、 − Innovin−Vibramycinを含む溶液を再構成するための滅菌水及びバッファー
（３種のバイアルを一緒に混合する時に、好ましくは第２及び第３のバイアルを
最初に混合し、その混合物を第１のバイアルの内容物と混合物する時に、７．２
のｐＨを確保するのに十分な量）を含む第３のバイアル、を含んで成る。

【００６９】好都合には、キットは更に、再構成されたInnovin−Vibramycin溶液とＰＲＰ
を混合するための手段及び、例えば噴霧により傷の上に混合物を適用するための
手段を含んで成る。（実施例６４）特に前記実施例で調製された、本発明の密封組成物及びパスタ（骨産生製品）
を人工骨、１種類以上の滅菌処理を受けた骨、をコートするために使用した。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１４年１月１７日（２００２．１．１７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項２】抗破骨細胞作用をもつ１種もしくは複数の抗生物質及び１種
もしくは複数のバッファー剤及び恐らくは、トロンビン産生用組み換え化合物及
び恐らくはリン脂質、を含むバッファー溶液が調製され、前記バッファー溶液が
６と８の間、好ましくは７と７．５の間から成るｐＨをもち、そしてフィブリノ
ーゲン含有溶液が前記バッファー溶液と接触させられる、請求項１の方法。

【請求項３】トロンビン産生用組み換え化合物が組み換えトロンボプラス
チンである、請求項１及び２のいずれかの方法。

【請求項４】フィブリノーゲン含有溶液が少なくとも２種の異なるリン脂
質の存在下でトロンビン産生用組み換え化合物と接触される、請求項１〜３のい
ずれかの方法。

【請求項５】血小板濃厚血漿が、少なくとも１種類のリン脂質の存在下で
トロンビンを産生するための組み換え化合物、バッファー剤及び抗破骨細胞作用をもつ少なくとも１種の抗生物質並びに、ゲルの形成期間に、接触されたフィブリノーゲン溶液のｐＨが６と８の間、好都合には７と７．５の間に維持されるように有効量のバッファーと接触される、請求項１〜４のいずれかの方法。

【請求項６】血小板濃厚血漿が１マイクロリッター当たり、１，５００，
０００〜２，０００，０００個の血小板濃度をもつ、請求項５の方法。

【請求項７】血小板濃厚血漿が１マイクロリッター当たり１，５００，０
００〜２，０００，０００個の血小板濃度をもち、他方、ゲル化期間に、ｐＨを
６と８の間、好都合には７と７．５の間に調整するための有効量の１種もしくは
複数のバッファー剤の存在下で、１マイクロリッター当たり乾燥形態の０．０５
〜０．４μｇのトロンボプラスチン及び１マイクロリッター当たり０．０５〜４
μｇの１種もしくは複数の抗生物質が、血小板濃厚血漿と接触される、請求項５または６の方法。

【請求項８】 − フィブリノーゲン含有物質、好ましくはフィブリノーゲ
ン含有溶液を含む第１のバイアル、 − トロンビン産生用組み換え化合物、好ましくは前記組み換え化合物を含む溶
液を含む第２のバイアル、 − 恐らくは、フィブリノーゲン含有溶液及び／またはトロンビン産生用組み換
え化合物を含む溶液の調製のための、第１のバイアル及び／または第２のバイア
ルに添加されるべき溶液を含む第３のバイアル、を含んで成り、そこで、第１のバイアル及び／または第２のバイアル及び／または第３のバイアルが少
なくとも１種類のリン脂質、好ましくは少なくとも２種の異なるリン脂質を含み
、そして第１のバイアル及び／または第２のバイアル及び／または第３のバイアル、好
ましくは第２または第３のバイアルが、抗破骨細胞作用をもつ少なくとも１種の抗生物質を含みそして、第１のバイアル及び／または第２のバイアル及び／または第３のバイアルが、ゲルの形成期間に、接触されたフィブリノーゲン溶液のｐＨが６と８の間、好都合には７と７．５の間に維持されるように有効量の少なくとも１種のバッファー剤を含んで成る、請求項１〜７のいずれかに記載の密封材の調製のためのキット
。

【請求項９】第２のバイアルが少なくとも１種のリン脂質、少なくとも１
種のバッファー剤及び少なくとも１種の抗生物質を含む、請求項８のキット。

【請求項１０】第１のバイアルが乾燥形態のフィブリノーゲン含有物質を
含み、他方、第２のバイアルが乾燥形態の、トロンビン産生用組み換え化合物を
含む、請求項９のキット。

【請求項１１】少なくとも１種のリン脂質の存在下でトロンビンを産生す
るための組み換え化合物を含む血小板濃厚血漿の凝固マトリックス、骨の形成を
誘発するための前記マトリックス中に分散された有効量のカルシウム含有化合物及び抗破骨細胞作用をもつ少なくとも１種の抗生物質を含んで成る、骨産生製品
。

【請求項１２】カルシウム含有化合物が骨粒子、カルシウム含有添加剤と
の骨粒子の混合物から成る群から選択される、請求項１１の骨産生製品。

【請求項１３】トロンビン産生用組み換え化合物が組み換えトロンボプラ
スチンである請求項１１の骨産生製品。

【請求項１４】少なくとも２種の異なるリン脂質を更に含んで成る、請求
項１１の骨産生製品。

【請求項１５】カルシウム含有化合物が骨粒子、カルシウム含有添加剤と
の骨粒子の混合物、から成る群から選択され、そして骨粒子が、脳顔面頭蓋骨粒
子、腸骨粒子及びそれらの混合物から成る群から選択された骨粒子である、請求
項１１の骨産生製品。

【請求項１６】カルシウム含有化合物が、骨粒子、骨粒子のカルシウム含
有添加剤との混合物から成る群から選択され、そして骨粒子が非変性骨粒子であ
る、請求項１１の骨産生製品。

【請求項１７】骨粒子が０．５ｍｍと５ｍｍの間を含んで成る平均粒度を
もつ、請求項１１の骨産生製品。

【請求項１８】カルシウム含有化合物が骨粒子、カルシウム含有添加剤と
の骨粒子の混合物から成る群から選択された、請求項１１の骨産生製品であって
、前記品が１５％〜５０容量％の骨粒子を含んで成る製品。

【請求項１９】凝固マトリックスがマトリックス形成剤１マイクロリッタ
ー当たり１，５００，０００〜２，０００，０００個の血小板濃度をもつ、血小
板濃厚血漿の凝固マトリックスである、請求項１１の骨産生製品。

【請求項２０】凝固マトリックスが１マイクロリッター当たり１，５００
，０００〜２，０００，０００個の血小板濃度のマトリックス形成剤及び、マト
リックス形成剤１マイクロリッター当たり０．０５〜０．４μｇの乾燥形態のト
ロンボプラスチンを含む、血小板濃厚血漿の凝固マトリックスである、請求項１１の骨産生製品。

【請求項２１】血小板濃厚血漿が患者の血漿から調製され、骨粒子が患者
の骨から調製される、患者のための請求項１１の骨産生製品。

【請求項２２】凝固マトリックスが生物適合性フィルムと結合されている
、請求項１１の骨産生製品。

【請求項２３】成長因子、成長因子をコードする遺伝子、カルシウム含有
化合物、薬剤、脂肪酸、抗生物質、殺バクテリア剤、殺ウイルス剤、フィブリノ
ーゲン、マトリックス形成を誘導する化合物及びそれらの混合物から成る群のう
ちから選択された少なくとも１種の添加剤を更に含む、請求項１１の骨産生製品
。

【請求項２４】トロンビン産生用組み換え化合物を含む血小板濃厚血漿の
凝固マトリックス及び、前記マトリックス中に分散された骨粒子を含んで成る、
骨産生製品の調製法であって、そこで、 − 実質的に均質な混合物が、組み換えトロンビン産生用化合物及びリン脂質を
添加すると、骨産生を誘発するために有効量のカルシウム含有化合物と、血小板
濃厚血漿を混合することにより調製され、 − 組み換えトロンビン産生用化合物及びリン脂質が、血小板濃厚血漿から調製
された混合物に添加、混合され、並びに − 組み換えトロンビン産生用化合物、リン脂質、血小板濃厚血漿及びカルシウ
ム含有化合物、の混合物が血小板濃厚血漿の凝固及びマトリックスの形成を確保
するための条件下に維持される、方法。

【請求項２５】カルシウム含有化合物が骨粒子、骨粒子のカルシウム含有
添加剤との混合物から成る群から選択される、請求項２４の方法。

【請求項２６】凝固が酸素の存在下で、実質的に撹拌せずに実施される、
請求項２４の方法。

【請求項２７】凝固のために使用されたトロンビン産生用組み換え化合物
が組み換えトロンボプラスチンである、請求項２４の方法。

【請求項２８】カルシウム含有化合物が骨粒子、骨粒子のカルシウム含有
添加剤との混合物から成る群から選択され、そして少なくとも１種のリン脂質が
組み換えトロンビン産生用化合物、血小板濃厚血漿及び骨粒子の混合物、並びに
血小板濃厚血漿及び骨粒子の混合物、から成る群から選択された混合物に添加さ
れる、請求項２４の方法。

【請求項２９】トロンビン産生用組み換え化合物がリン脂質と組み合わさ
れている、請求項２４の方法。

【請求項３０】トロンビン産生用組み換え化合物が、ホスファチジルセリ
ン、その誘導体、少なくとも１個の脂肪酸側鎖をもつホスファチジルセリン、ホ
スファチジルコリン、その誘導体、及び少なくとも１個の脂肪酸側鎖をもつホス
ファチジルコリン及びそれらの混合物、から成る群から選択された少なくとも１
種のリン脂質と組み合わされる、請求項２４の方法。

【請求項３１】トロンビン産生用組み換え化合物が、ホスファチジルセリ
ン、その誘導体、少なくとも１個の脂肪酸側鎖をもつホスファチジルセリン、ホ
スファチジルコリン、その誘導体、及び少なくとも１個の脂肪酸側鎖をもつホス
ファチジルコリン及びそれらの混合物、から成る群から選択された少なくとも１
種のリン脂質と組み合わされ、前記脂肪酸側鎖が少なくとも１個の二重結合及び
６〜２４炭素原子をもつ脂肪酸鎖から成る群から選択される、請求項２４の方法
。

【請求項３２】トロンビン産生用組み換え化合物が、ホスファチジルセリ
ン、その誘導体、少なくとも１個の脂肪酸側鎖をもつホスファチジルセリン、ホ
スファチジルコリン、その誘導体、及び少なくとも１個の脂肪酸側鎖をもつホス
ファチジルコリン及びそれらの混合物、から成る群から選択された少なくとも１
種のリン脂質と組み合わされ、前記脂肪酸側鎖が少なくとも１個の二重結合及び
１６〜１８炭素原子をもつ脂肪酸鎖から成る群から選択される、請求項２４の方
法。

【請求項３３】トロンビン産生用組み換え化合物が、少なくとも２種のリ
ン脂質の混合物と組み合わされ、そこで、第１のリン脂質が、ホスファチジルセ
リン、その誘導体、少なくとも１個の脂肪酸側鎖をもつホスファチジルセリン及
びそれらの混合物から成る群から選択され、少なくとも１個の脂肪酸側鎖をもつ
ホスファチジルセリンの脂肪酸側鎖が、少なくとも１個の二重結合及び６〜２４
炭素原子をもつ脂肪酸鎖から成る群から選択され、他方、第２のリン脂質が、ホ
スファチジルコリン、その誘導体、及び少なくとも１個の脂肪酸側鎖をもつホス
ファチジルコリン及びそれらの混合物、からなる群から選択され、少なくとも１
個の脂肪酸側鎖をもつホスファチジルコリンの脂肪酸側鎖が、少なくとも１個の
二重結合及び６〜２４炭素原子をもつ脂肪酸鎖から成る群から選択される、請求
項２４の方法。

【請求項３４】カルシウム含有化合物が骨粒子、カルシウム含有添加剤と
の骨粒子の混合物、から成る群から選択され、そして骨粒子が、脳顔面頭蓋の骨
粒子、腸骨の粒子及びそれらの混合物から成る群から選択された骨粒子である、
請求項２４の方法。

【請求項３５】カルシウム含有化合物が、骨粒子、骨粒子のカルシウム含
有添加剤との混合物から成る群から選択され、そして骨粒子が非変性骨の粒子で
ある、請求項２４の方法。

【請求項３６】カルシウム含有化合物が、骨粒子、骨粒子のカルシウム含
有添加剤との混合物から成る群から選択され、そして骨粒子が０．５ｍｍと５ｍ
ｍの間を含んで成る平均粒度をもつ、請求項２４の方法。

【請求項３７】カルシウム含有化合物が骨粒子、カルシウム含有添加剤と
の骨粒子の混合物から成る群から選択され、血小板濃厚血漿に添加された骨粒子
の量が、血小板濃厚血漿及び骨粒子の混合物の約１５％〜５０容量％に相当する
、請求項２４の方法。

【請求項３８】血小板濃厚血漿が、マトリックス形成剤１マイクロリッタ
ー当たり１，５００，０００〜２，０００，０００個の血小板濃度をもつ、請求
項２４の方法。

【請求項３９】血小板濃厚血漿、骨粒子及び組み換えトロンビン産生用化
合物の混合物が、骨粒子を含まない混合物１マイクロリッター当たり１，５００
，０００〜２，０００，０００個の血小板濃度をもち、骨粒子を含まない混合物
１マイクロリッター当たり０．０５〜０．４μｇの乾燥形態のトロンボプラスチ
ンを含む、請求項２４の方法。

【請求項４０】血小板濃厚血漿が患者の血漿、患者と組織適合性の血漿及
びそれらの混合物から成る群から選択された血漿から調製され、本質的に、カル
シウム含有化合物が患者の骨、患者と組織適合性の骨及びそれらの混合物から成
る群から選択された少なくとも１種の骨から調製された骨粒子から成る、患者の
ための骨産生製品の調製のための、請求項２４の方法。

【請求項４２】血小板濃厚血漿及び、骨産生を誘発するために有効量のカ
ルシウム含有化合物からの骨産生製品の調製のための、少なくとも１種のリン脂
質及び抗破骨細胞作用をもつ少なくとも１種の抗生物質と混合して、トロンビン
産生用組み換え化合物の使用。

【請求項４３】トロンビン産生用組み換え化合物、少なくとも１種のリン
脂質及び、抗破骨細胞作用をもつ少なくとも１種の抗生物質を含み、抗生物質／
トロンビン産生用組み換え化合物の重量比が１より大きい混合物。

【請求項４４】抗破骨細胞作用をもつ抗生物質／トロンビン産生用組み換
え化合物の重量比が５より大きい、請求項４３の混合物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】密封材の調製法であって、そこで、フィブリノーゲン含有溶
液が、少なくとも１種のリン脂質の存在下でトロンビンを産生するための組み換
え化合物、少なくとも１種のバッファー及び少なくとも１種の抗生物質と接触さ
れる方法。
【請求項２】フィブリノーゲン含有溶液を、少なくとも１種のリン脂質の
存在下でトロンビンを産生するための組み換え化合物、少なくとも１種の抗生物
質及び、ゲルの形成中、接触されたフィブリノーゲン溶液のｐＨが６と８の間、
好都合には７と７．５の間に維持されるように、有効量の少なくとも１種のバッ
ファーと接触させることにより、ゲルが形成される、請求項１の方法。
【請求項３】１種もしくは複数の抗生物質及び１種もしくは複数のバッフ
ァー剤及び恐らくは、トロンビン産生用組み換え化合物及び恐らくは、リン脂質
を含むバッファー溶液が調製され、前記バッファー溶液が６と８の間、好ましく
は７と７．５の間から成るｐＨをもち、そしてフィブリノーゲン含有溶液が前記
バッファー溶液と接触される、請求項２の方法。
【請求項４】トロンビン産生用組み換え化合物が組み換えトロンボプラス
チンである、請求項１〜３のいずれかの方法。
【請求項５】フィブリノーゲン含有溶液が、少なくとも２種の異なるリン
脂質の存在下でトロンビン産生用組み換え化合物と接触される、請求項１〜４の
いずれかの方法。
【請求項６】フィブリノーゲン含有溶液が、ホスファチジルセリン、その
誘導体、少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホスファチジルセリン、ホスファチ
ジルコリン、その誘導体、及び少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホスファチジ
ルコリン、からなる群から選択された少なくとも１種のリン脂質、好ましくは前
記の群から選択された少なくとも２種のリン脂質の存在下で、トロンビン産生用
組み換え化合物と接触される、請求項１〜５のいずれかの方法。
【請求項７】ホスファチジルコリンの脂肪酸側鎖が、少なくとも１種の二
重結合及び６〜２４炭素原子、好ましくは１６〜１８炭素原子をもつ脂肪酸鎖か
ら成る群から選択される、請求項６の方法。
【請求項８】血小板濃厚血漿が、少なくとも１種類のリン脂質及びバッフ
ァー剤の存在下でトロンビン産生用組み換え化合物と接触される、請求項１〜７
のいずれかの方法。
【請求項９】血小板濃厚血漿が１マイクロリッター当たり、１，５００，
０００〜２，０００，０００個の血小板濃度をもつ、請求項８の方法。
【請求項１０】血小板濃厚血漿が１マイクロリッター当たり１，５００，
０００〜２，０００，０００個の血小板濃度をもち、他方、ゲル化期間に、ｐＨ
を６と８の間、好都合には７と７．５の間に調整するために有効量の１種もしく
は複数のバッファー剤の存在下で、１マイクロリッター当たり０．０５〜０．４
μｇの乾燥形態のトロンボプラスチン及び１マイクロリッター当たり０．０５〜
４μｇの１種もしくは複数の抗生物質が、血小板濃厚血漿と接触される、請求項
８または９の方法。
【請求項１１】請求項１〜１０のいずれかに記載の密封材の調製用キット
であって、 − フィブリノーゲン含有物質、好ましくはフィブリノーゲン含有溶液を含む第
１のバイアル、 − トロンビン産生用組み換え化合物、好ましくは前記組み換え化合物を含む溶
液を含む第２のバイアル、 − 恐らくは、フィブリノーゲン含有溶液及び／またはトロンビン産生用組み換
え化合物を含む溶液の調製のための、第１のバイアル及び／または第２のバイア
ルに添加されるべき溶液を含む第３のバイアル、を含んで成り、そこで、第１のバイアル及び／または第２のバイアル及び／または第３のバイアルが少
なくとも１種類のリン脂質、好ましくは少なくとも２種の異なるリン脂質を含み
、そして第１のバイアル及び／または第２のバイアル及び／または第３のバイアル、好
ましくは第２または第３のバイアルが少なくとも１種類の抗生物質を含む、キット。
【請求項１２】第１のバイアル及び／または第２のバイアル及び／または
第３のバイアルが少なくとも１種類のバッファー剤を含む、請求項１１のキット
。
【請求項１３】第２のバイアルが少なくとも１種のリン脂質、少なくとも
１種のバッファー剤及び少なくとも１種の抗生物質を含む、請求項１２のキット
。
【請求項１４】第１のバイアルが乾燥形態のフィブリノーゲン含有物質を
含み、他方、第２のバイアルが乾燥形態の、トロンビン産生用組み換え化合物を
含む、請求項１１のキット。
【請求項１５】少なくとも１種のリン脂質の存在下でトロンビン産生用組
み換え化合物を含む血小板濃厚血漿の凝固マトリックス並びに骨の形成を誘発す
るために前記マトリックス中に分散された有効量のカルシウム含有化合物を含ん
で成る、骨産生製品。
【請求項１６】カルシウム含有化合物が、骨粒子、カルシウム含有添加剤
との骨粒子の混合物から成る群から選択される、請求項１５の骨産生製品。
【請求項１７】トロンビン産生用組み換え化合物が組み換えトロンボプラ
スチンである請求項１５の骨産生製品。
【請求項１８】少なくとも２種の異なるリン脂質を更に含んで成る、請求
項１５の骨産生製品。
【請求項１９】トロンビン産生用組み換え化合物がリン脂質と組み合わさ
れている、請求項１５の骨産生製品。
【請求項２０】トロンビン産生用組み換え化合物が、ホスファチジルセリ
ン、その誘導体、少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホスファチジルセリン、ホ
スファチジルコリン、その誘導体、及び少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホス
ファチジルコリン及びそれらの混合物、からなる群から選択された少なくとも１
種のリン脂質と組み合わせれている、請求項１５の骨産生製品。
【請求項２１】トロンビン産生用組み換え化合物が、ホスファチジルセリ
ン、その誘導体、少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホスファチジルセリン、ホ
スファチジルコリン、その誘導体、及び少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホス
ファチジルコリン及びそれらの混合物、からなる群から選択された少なくとも１
種のリン脂質と組み合わされ、前記脂肪酸側鎖が少なくとも１種の二重結合及び
６〜２４炭素原子をもつ脂肪酸鎖から成る群から選択される、請求項１５の骨産
生製品。
【請求項２２】トロンビン産生用組み換え化合物が、ホスファチジルセリ
ン、その誘導体、少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホスファチジルセリン、ホ
スファチジルコリン、その誘導体、及び少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホス
ファチジルコリン及びそれらの混合物、からなる群から選択された少なくとも１
種のリン脂質と組み合わされ、前記脂肪酸側鎖が少なくとも１種の二重結合及び
１６〜１８炭素原子をもつ脂肪酸鎖から成る群から選択される、請求項１５の骨
産生製品。
【請求項２３】トロンビン産生用組み換え化合物が、少なくとも２種のリ
ン脂質の混合物と組み合わされ、そこで、第１のリン脂質が、ホスファチジルセ
リン、その誘導体、少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホスファチジルセリン及
びそれらの混合物から成る群から選択され、少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつ
ホスファチジルセリンの脂肪酸側鎖が、少なくとも１種の二重結合及び６〜２４
炭素原子をもつ脂肪酸鎖から成る群から選択され、他方、第２のリン脂質が、ホ
スファチジルコリン、その誘導体、及び少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホス
ファチジルコリン及びそれらの混合物、からなる群から選択され、少なくとも１
種の脂肪酸側鎖をもつホスファチジルコリンの脂肪酸側鎖が、少なくとも１種の
二重結合及び６〜２４炭素原子をもつ脂肪酸鎖から成る群から選択される、請求
項１５の骨産生製品。
【請求項２４】カルシウム含有化合物が、骨粒子、カルシウム含有添加剤
との骨粒子の混合物、から成る群から選択され、そして骨粒子が、脳顔面頭蓋骨
粒子、腸骨粒子及びそれらの混合物から成る群から選択された骨粒子である、請
求項１５の骨産生製品。
【請求項２５】カルシウム含有化合物が、骨粒子、骨粒子のカルシウム含
有添加剤との混合物から成る群から選択され、そして骨粒子が非変性骨の粒子で
ある、請求項１５の骨産生製品。
【請求項２６】骨粒子が０．５ｍｍと５ｍｍの間を含んで成る平均粒度を
もつ、請求項１５の骨産生製品。
【請求項２７】カルシウム含有化合物が骨粒子、カルシウム含有添加剤と
の骨粒子の混合物から成る群から選択された、請求項１５の骨産生製品であって
、１５％〜５０容量％の骨粒子を含んで成る製品。
【請求項２８】凝固マトリックスがマトリックス形成剤１マイクロリッタ
ー当たり１，５００，０００〜２，０００，０００個の血小板濃度をもつ、血小
板濃厚血漿の凝固マトリックスである、請求項１５の骨産生製品。
【請求項２９】凝固マトリックスが、マトリックス形成剤１マイクロリッ
ター当たり１，５００，０００〜２，０００，０００個の血小板濃度及び、マト
リックス形成剤１マイクロリッター当たり０．０５〜０．４μｇの乾燥形態のト
ロンボプラスチンを含む、血小板濃厚血漿の凝固マトリックスである、請求項１
５の骨産生製品。
【請求項３０】血小板濃厚血漿が患者の血漿から調製され、骨粒子が患者
の骨から調製される、患者のための請求項１５の骨産生用製品。
【請求項３１】凝固マトリックスが生物適合性フィルムと結合されている
、請求項１５の骨産生用製品。
【請求項３２】成長因子、成長因子をコードする遺伝子、カルシウム含有
化合物、薬剤、脂肪酸、抗生物質、殺バクテリア剤、殺ウイルス剤、フィブリノ
ーゲン、マトリックスの形成を誘導する化合物及びそれらの混合物から成る群の
うちから選択された少なくとも１種の添加剤を更に含む、請求項１５の骨産生製
品。
【請求項３３】抗生物質として、抗破骨細胞作用をもつ少なくとも１種の
抗生物質を含む、請求項３２の骨産生製品。
【請求項３４】トロンビン産生用組み換え化合物を含む血小板濃厚血漿の
凝固マトリックス及び、前記マトリックス中に分散された骨粒子を含んで成る、
骨産生用製品の調製法であって、そこで、 − 実質的に均質な混合物が、組み換えトロンビン産生用化合物及びリン脂質を
添加する時に、骨産生を誘発するために有効量のカルシウム含有化合物と血小板
濃厚血漿を混合することにより調製され、 − 組み換えトロンビン産生用化合物及びリン脂質が、血小板濃厚血漿から調製
された混合物に添加、混合され、並びに − 組み換えトロンビン産生用化合物、リン脂質、血小板濃厚血漿及びカルシウ
ム含有化合物の混合物が血小板濃厚血漿の凝固及びマトリックスの形成を確保す
るための条件下に維持される、方法。
【請求項３５】カルシウム含有化合物が骨粒子、骨粒子のカルシウム含有
添加剤との混合物から成る群から選択される、請求項３４の方法。
【請求項３６】凝固が酸素の存在下で、実質的に撹拌せずに実施される、
請求項３４の方法。
【請求項３７】凝固のために使用されたトロンビン産生用組み換え化合物
が組み換えトロンボプラスチンである、請求項３４の方法。
【請求項３８】カルシウム含有化合物が骨粒子、骨粒子のカルシウム含有
添加剤との混合物から成る群から選択され、そして少なくとも１種のリン脂質が
組み換えトロンビン産生用化合物、血小板濃厚血漿及び骨粒子の混合物、並びに
血小板濃厚血漿及び骨粒子の混合物、から成る群から選択された混合物に添加さ
れる、請求項３４の方法。
【請求項３９】トロンビン産生用組み換え化合物がリン脂質と組み合わさ
れている、請求項３４の方法。
【請求項４０】トロンビン産生用組み換え化合物が、ホスファチジルセリ
ン、その誘導体、少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホスファチジルセリン、ホ
スファチジルコリン、その誘導体、及び少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホス
ファチジルコリン及びそれらの混合物、から成る群から選択された少なくとも１
種のリン脂質と組み合わされる、請求項３４の方法。
【請求項４１】トロンビン産生用組み換え化合物が、ホスファチジルセリ
ン、その誘導体、少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホスファチジルセリン、ホ
スファチジルコリン、その誘導体、及び少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホス
ファチジルコリン及びそれらの混合物、から成る群から選択された少なくとも１
種のリン脂質と組み合わされ、前記脂肪酸側鎖が少なくとも１種の二重結合及び
６〜２４炭素原子をもつ脂肪酸鎖から成る群から選択される、請求項３４の方法
。
【請求項４２】トロンビン産生用組み換え化合物が、ホスファチジルセリ
ン、その誘導体、少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホスファチジルセリン、ホ
スファチジルコリン、その誘導体、及び少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホス
ファチジルコリン及びそれらの混合物、から成る群から選択された少なくとも１
種のリン脂質と組み合わされ、前記脂肪酸側鎖が少なくとも１種の二重結合及び
１６〜１８炭素原子をもつ脂肪酸鎖から成る群から選択される、請求項３４の方
法。
【請求項４３】トロンビン産生用組み換え化合物が、少なくとも２種のリ
ン脂質の混合物と組み合わされ、そこで、第１のリン脂質が、ホスファチジルセ
リン、その誘導体、少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホスファチジルセリン及
びそれらの混合物から成る群から選択され、少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつ
ホスファチジルセリンの脂肪酸側鎖が、少なくとも１種の二重結合及び６〜２４
炭素原子をもつ脂肪酸鎖から成る群から選択され、他方、第２のリン脂質が、ホ
スファチジルコリン、その誘導体、及び少なくとも１種の脂肪酸側鎖をもつホス
ファチジルコリン及びそれらの混合物、からなる群から選択され、少なくとも１
種の脂肪酸側鎖をもつホスファチジルコリンの脂肪酸側鎖が、少なくとも１種の
二重結合及び６〜２４炭素原子をもつ脂肪酸鎖から成る群から選択される、請求
項３４の方法。
【請求項４４】カルシウム含有化合物が骨粒子、カルシウム含有添加剤と
の骨粒子の混合物、から成る群から選択され、そして骨粒子が、脳顔面頭蓋骨粒
子、腸骨粒子及びそれらの混合物から成る群から選択された骨粒子である、請求
項３４の方法。
【請求項４５】カルシウム含有化合物が、骨粒子、骨粒子のカルシウム含
有添加剤との混合物から成る群から選択され、そして骨粒子が非変性骨の粒子で
ある、請求項３４の方法。
【請求項４６】カルシウム含有化合物が、骨粒子、骨粒子のカルシウム含
有添加剤との混合物、から成る群から選択され、そして骨粒子が０．５ｍｍと５
ｍｍの間を含んで成る平均粒度をもつ、請求項３４の方法。
【請求項４７】カルシウム含有化合物が骨粒子、カルシウム含有添加剤と
の骨粒子の混合物、から成る群から選択され、血小板濃厚血漿に添加された骨粒
子の量が、血小板濃厚血漿及び骨粒子の混合物の約１５％〜５０容量％に相当す
る、請求項３４の方法。
【請求項４８】血小板濃厚血漿が、マトリックス形成剤１マイクロリッタ
ー当たり１，５００，０００〜２，０００，０００個の血小板濃度をもつ、請求
項３４の方法。
【請求項４９】血小板濃厚血漿、骨粒子及び組み換えトロンビン産生用化
合物の混合物が、骨粒子を含まない混合物１マイクロリッター当たり１，５００
，０００〜２，０００，０００個の血小板濃度をもち、骨粒子を含まない混合物
１マイクロリッター当たり０．０５〜０．４μｇの乾燥形態のトロンボプラスチ
ンを含む、請求項３４の方法。
【請求項５０】血小板濃厚血漿が患者の血漿、患者と組織適合性の血漿及
びそれらの混合物から成る群から選択された血漿から調製され、カルシウム含有
化合物が本質的に、患者の骨、患者と組織適合性の骨及びそれらの混合物から成
る群から選択された少なくとも１種の骨から調製された骨粒子から成る、患者の
ための骨産生用製品の調製のための、請求項３４の方法。
【請求項５１】血小板濃厚血漿及び、骨産生を誘発するために有効量のカ
ルシウム含有化合物の混合物からの骨産生用製品の調製のための、少なくとも１
種のリン脂質と混合た、トロンビンを産生するための組み換え化合物の使用。
【請求項５２】トロンビン産生用組み換え化合物、少なくとも１種のリン
脂質及びカルシウム含有化合物を含む混合物で、カルシウム含有化合物／トロン
ビン産生用組み換え化合物からのカルシウムの重量比が０．５より大きい混合物
。
【請求項５３】カルシウム含有化合物／トロンビン産生用組み換え化合物
からのカルシウムの重量比が２を越える、請求項５２の混合物。
【請求項５４】前記混合物が乾燥粉末の形態をもつ、請求項５２の混合物
。
【請求項５５】カルシウム含有化合物が塩、変性骨粒子及びそれらの混合
物から成る群から選択される、請求項５２の混合物。
【請求項５６】トロンビン産生用組み換え化合物、少なくとも１種のリン
脂質及び少なくとも１種の抗生物質を含み、抗生物質／トロンビン産生用組み換
え化合物の重量比が１より大きい混合物。
【請求項５７】抗生物質が抗破骨細胞作用をもつ抗生物質である、請求項
５６の混合物。
【請求項５８】抗生物質／トロンビン産生用組み換え化合物の重量比が５
より大きい、請求項５６の混合物。