JP2003514549A - Ｇタンパク質共役受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＨＧ６７核酸及びＨＧ６７ポリペプチドを特徴づける。本明細書中で“ＭＣＨ−Ｒ２”とも称されるＨＧ６７は、ＭＣＨ−Ｒ１と高い配列同一性を有するＧタンパク質共役受容体である。ＨＧ６７のアミノ酸配列を配列番号１に示す。ＨＧ６７のｃＤＮＡ配列を配列番号２に示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） 本明細書で引用されている参考文献は本発明の従来技術とは認められない。

【０００２】 視床下部に存在する神経ペプヂは体重コントロールの仲介において重要な役割
を果たす（Ｆｌｉｅｒら，Ｃｅｌｌ，９２：４３７−４４０（１９９８））。メ
ラニン濃縮ホルモン（ＭＣＨ）は、神経ペプチドＮＥＩ及びＮＧＥをもコードす
る視床下部における大きなプレ−プロホルモン前駆体の一部として合成される環
状１９アミノ酸神経ペプチドである（Ｎａｈｏｎら，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ
ｏｌ，４：６２３−６３７（１９９０））。ＭＣＨは最初サケ下垂体で同定され
、魚ではＭＣＨはメラニン凝集に影響を及ぼし、よって皮膚色素沈着に影響を及
ぼす。マスやウナギでは、ＭＣＨがストレス誘発またはＣＲＦ刺激ＡＣＴＨ放出
に関与することが判明している（Ｋａｗａｕｃｈｉら，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：
３２１−３２３（１９８３））。

【０００３】 ヒトでは、脳において発現する２つのＭＣＨコード遺伝子が同定された（Ｂｒ
ｅｔｏｎら，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，１８：２９７−３１０（１９９３
））。哺乳動物では、ＭＣＨは食物摂取に関係する、外側視床下部や不確帯の核
周囲部細胞体を含め視床下部の神経細胞体に主に局在化していた（Ｋｎｉｇｇｅ
ら，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，１７：１０６３−１０７３（１９９６））。

【０００４】 薬理学的及び遺伝的証拠から、ＭＣＨ作用の主要モードは給食を促進する（食
欲増進）ことであることが示唆される。ＭＣＨ ｍＲＮＡは絶食マウス及びラッ
ト、ｏｂ／ｏｂマウス及び神経ペブチドＹ（ＮＰＹ）に対する遺伝子が標的破壊
されているマウスでは上向き調節されている（Ｑｕら，Ｎａｔｕｒｅ，３８０：
２４３−２４７（１９９６）及びＥｒｉｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３８１：
４１５−４１８（１９９６））。ＭＣＨを中枢に注射（ＩＣＶ）すると食物摂取
が刺激され、ＭＣＨはα−メラノサイト刺激ホルモン（αＭＳＨ）で見られる拒
食効果と拮抗する（Ｑｕら，Ｎａｔｕｒｅ，３８０：２４３−２４７（１９９６
））。ＭＣＨ欠乏マウスはやせて、拒食であり、高い代謝率を有する（Ｓｈｉｍ
ａｄａら，Ｎａｔｕｒｅ，３９６：６７０−６７３（１９９８））。

【０００５】 ＭＣＨ作用は、視床下部−下垂体−軸に対する影響が報告されているように（
Ｎａｈｏｎ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖ．ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，８：２
２１−２６２（１９９４））、食物摂取のモジュレーションに限定されない。Ｍ
ＣＨが視床下部からのＣＲＦのストレス誘発放出及び下垂体からのＡＣＴＨのス
トレス誘発放出をモジュレートし得るように、ＭＣＨはストレスに対する身体応
答に関与し得る。更に、ＭＣＨニューロン系は生殖または母性機能に関与し得る
。

【０００６】 幾つかの文献に、ＭＣＨに結合することが判明している受容体（“ＭＣＨ−Ｒ
１”）が記載されている（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，Ｎａｔｕｒｅ，４００：２６１
−２６５（１９９０）、Ｓａｉｔｏら，Ｎａｔｕｒｅ，４００：２６５−２６９
（１９９９）、Ｂａｃｈｎｅｒら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４５７：５２２
−５２４（１９９９）及びＳｈｉｍｏｍｕｒａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａ
ｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏ
ｎｓ，２６１：６２２−６２６（１９９９））。

【０００７】 （発明の要旨） 本発明はＨＧ６７核酸及びＨＧ６７ポリペフチドを特徴づける。本明細書では
“ＭＣＨ−Ｒ２”とも呼ばれるＨＧ６７は、ＭＣＨ−Ｒ１と高度の配列同一性を
有するＧタンパク質共役受容体である。ＨＧ６７のアミノ酸配列を配列番号１に
示す。ＨＧ６７のｃＤＮＡ配列を配列番号２に示す。

【０００８】 ＨＧ６７ポリペプチドは、配列番号１に存在する少なくとも９個の隣接するア
ミノ酸の領域を含む。前記ポリペプチドは、配列番号１に存在するかもしくは存
在しない追加の領域を含み得る。ＨＧ６７ポリペプチドには、例えば完全長ＨＧ
６７、ＨＧ６７断片、及びＨＧ６７の全部または一部とＨＧ６７に由来しないア
ミノ酸領域を含むキメラポリペフチドが含まれる。

【０００９】 ＨＧ６７核酸は、ＨＧ６７ポリペフチドをコードする領域を含むかまたは配列
番号２に存在する少なくとも１８個の隣接するヌクレオチドまたはその相補体を
含む。前記核酸は、ＨＧ６７をコードする核酸中に存在するか存在しない追加領
域または配列番号２に存在する追加領域またはその相補体を含み得る。ＨＧ６７
核酸には、例えばＨＧ６７の全部または一部をコードする核酸、配列番号２の全
部または一部を含む核酸、及びＨＧ６７の全部または一部をコードするか及び／
または配列番号２の全部または一部を含む組み換え核酸が含まれる。

【００１０】 従って、本発明の第一態様は精製ＨＧ６７ポリペプチドである。このポリペプ
チドは配列番号１の少なくとも９個の隣接するアミノ酸を含む。

【００１１】 「精製ポリペプチド」は、試料または調製物中に存在する全タンパク質の少な
くとも１０％を占める。好ましい実施態様では、精製ポリペプチドは、試料また
は調製物中に存在する全タンパク質の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％
または少なくとも約９５％を占める。「精製ポリペプチド」とは、ポリペプチド
が精製を受けていなくてもよいことを指し、例えば化学合成されたが精製されて
いないポリペプチドも含まれる。

【００１２】 本発明の別の態様は精製ＨＧ６７核酸である。この核酸は、（ａ）配列番号２
の塩基１〜１８０または３９６〜１０２０に存在する少なくとも１８個の隣接す
る塩基またはその相補体の領域、または（ｂ）配列番号１の塩基１〜６０または
１５０〜３４０に存在する少なくとも９個の隣接するアミノ酸をコードする領域
を含む。１つの領域の存在とは、別の領域が存在していないことを示すのではな
い。例えば、異なる実施態様では、核酸は配列番号１をコードする核酸を含むか
または該核酸から構成され得、配列番号２の核酸を含むかまたは該核酸から構成
され得る。

【００１３】 「精製核酸」は、試料または調製物中に存在する全核酸の少なくとも１０％を
占める。好ましい実施態様では、精製核酸は試料または調製物中の全核酸の少な
くとも約５０％、少なくとも約７５％または少なくとも約９５％を占める。「精
製核酸」とは、核酸が精製を受けていなくてもよいことを指し、例えば化学合成
されたが精製されていない核酸が含まれ得る。

【００１４】 本発明の別の態様は発現ベクターである。この発現ベクターは、配列番号１に
示す少なくとも９個の隣接するアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含み、
該ヌクレオチド配列は外因性プロモーターに転写的に結合している。ヌクレオチ
ド配列に関して、「外因性プロモーターに転写的に結合」とは、ヌクレオチド配
列の転写を媒介し得、プロモーターがヌクレオチド配列に元々結合していないよ
うなＲＮＡプロモーターの存在及び配置を指す。

【００１５】 本発明の別の態様は、配列番号１の少なくとも９個の隣接するアミノ酸の領域
をコードする発現ベクターを含む組み換え細胞である。前記発現ベクターは、領
域をコードする核酸に転写的に結合し且つ細胞中に存在するＲＮＡポリメラーゼ
により認識されるプロモーターを含む。

【００１６】 本発明の別の態様は、配列番号１の少なくとも９個の隣接するアミノ酸の領域
をコードする発現ベクターを細胞に導入するステップを含む方法により作成され
る組み換え細胞である。好ましくは、前記発現ベクターは前記領域をコードする
核酸に転写的に結合し且つ細胞中に存在するＲＮＡポリメラーゼにより認識され
るプロモーターを含む。前記発現ベクターは、組み換え核酸を宿主ゲノムに挿入
するために使用され得るか、または核酸の自律ピースとして存在し得る。

【００１７】 本発明の別の態様はＨＧ６７に結合する抗体を含む精製抗体調製物を特徴づけ
る。「精製抗体調製物」は、存在する抗体の少なくとも１０％がＨＧ６７に結合
している調製物である。好ましい実施態様では、ＨＧ６７に結合する抗体は存在
する全抗体の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％または少なくとも約９５
％を占める。「精製抗体調製物」とは、調製物中の抗体が精製されていなくても
よいことを指す。

【００１８】 本発明の別の態様は配列番号１の少なくとも９個の隣接するアミノ酸を含むポ
リペプチドを産生する方法である。この方法は、前記ポリペプチドを発現ベクタ
ーから発現し得る組み換え細胞を増殖させるステップを含む。

【００１９】 本発明の別の態様はＨＧ６７に結合し得る化合物のスクリーニング方法である
。この方法は、（ａ）配列番号１の少なくとも約９個の隣接するアミノ酸を含む
ポリペプチドを組み換え核酸から発現させるステップ、（ｂ）前記ポリペプチド
を１つ以上の試験化合物を含有する試験調製物に供給するステップ、及び（ｃ）
前記ポリペプチドに対する前記試験調製物の結合能力を調べるステップを含む。

【００２０】 試験調製物は被験化合物を１つ以上含有する。別の実施態様では、試験調製物
は１０つ以上、５つ以上または１つの化合物を含有する。

【００２１】 「組み換え核酸」は、元々相互に結合していない１つ以上の領域を含む核酸で
ある。組み換え核酸の例には、元々ＨＧ６７領域に結合していない１つ以上の調
節要素、ウイルス要素または選択マーカーをも含む核酸上に存在するＨＧ６７領
域が含まれる。

【００２２】 本発明の別の態様はＨＧ６７活性のスクリーニング方法である。この方法は、
（ａ）配列番号１の少なくとも９個の隣接する塩基を含むＧタンパク質共役受容
体をコードする組み換え核酸を発現する細胞を１つ以上の試験化合物を含有する
試験調製物と接触させるステップ、及び（ｂ）前記受容体の活性に対する前記試
験調製物の影響を調べるステップを含む。

【００２３】 本発明の別の態様は患者においてＨＧ６７活性をモジュレートするステップを
含む患者において有利な効果を達成する方法である。好ましくは、ＨＧ６７活性
は、受容体の活性または発現を低下させることによりモジュレートされる。ＨＧ
６７活性は、例えばＨＧ６７受容体で活性な有機化合物及びＨＧ６７発現を低下
できる核酸を使用することによりモジュレートされ得る。

【００２４】 本発明の別の態様はＨＧ６７またはその断片に結合し得る化合物のスクリーニ
ング方法である。この方法は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプ
チドまたはその断片を組み換え核酸から発現させるステップ、（ｂ）前記ポリペ
プチドに標識ＭＣＨリガンド及び１つ以上の試験化合物を含有する試験調製物を
供給するステップ、及び（ｃ）前記ポリペプチドに対する標識ＭＣＨリガンドの
結合に対する前記試験調製物の影響を調べるステップを含む。

【００２５】 「ＭＣＨリガンド」は、ＭＣＨ結合サイトでＨＧ６７に結合するポリペプチド
を指す。ＭＣＨリガンドには、ヒトＭＣＨ、サケＭＣＨ及びその誘導体が含まれ
る。

【００２６】 本発明の別の態様はＨＧ６７活性をモジュレートし得る化合物のスクリーニン
グ方法である。この方法は、（ａ）（ｉ）ＭＣＨに結合する配列番号１のアミノ
酸またはその断片及び（ｉｉ）Ｇタンパク質に機能的に結合する領域を含み、Ｍ
ＣＨリガンドに結合したときに細胞内シグナルを伝達し得るポリペプチドをコー
ドする組み換え核酸を発現する細胞系をＭＣＨリガンド及び１つ以上の試験化合
物を含有する試験調製物と接触させるステップ、及び（ｂ）前記ポリペプチド活
性に対する前記調製物の影響を調べるステップを含む。

【００２７】 本発明の他の特徴及び作用効果は、複数の実施例を含めた本明細書中の更なる
記載から明らかである。提示されている実施例は本発明を実施するのに有用ない
ろいろな成分及び方法を例示している。これらの実施例は本発明を限定しない。
当業者は、本明細書の記載に基づいて本発明を実施するのに有用な他の及び方法
を同定及び使用することができる。

【００２８】 （図面の簡単な説明） 図１は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＱ７４７２４９の核酸配列（配列番号３）
を示す。 図２Ａ及び２Ｂは、配列番号２と配列番号４の比較を示す。配列番号４は配列
番号３のアンチセンス鎖である。 図３は、一過的にＨＧ６７を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＭＣＨ及び
［Ｐｈｅ^１３，Ｔｙｒ^１９］−ＭＣＨによる［Ｃａ^２＋］_ｉを示す。 図４は、エクオリンアッセイにおけるヒトＭＣＨによるＨＧ６７の活性化を示
す。ＨＥＫ２９３／ｓｅｑ１７／Ｇα１５細胞にＨＧ６７またはベクターのみを
トランスフェクトし、その後トランスフェクトから２日後ＭＣＨについてアッセ
イした。ＲＬＵ：ランダムルミネセンス単位。ＨＧ６７及びＭＣＨ−Ｒ１につい
てのＭＣＨのＥＣ_５０は前記細胞においてそれぞれ２６ｎＭ及び６６ｎＭである
。 図５は、ＨＥＫ−２９３／ａｅｑ／１７細胞におけるＨＧ６７の発現及びＭＣ
Ｈによる活性化を示す。

【００２９】 （発明の詳細な説明） ＨＧ６７は、ＭＣＨ−Ｒ１と３９％のアミノ酸配列同一性を有するＧタンパク
質共役受容体である。ＨＧ６７の内部領域は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＱ７４
７２４９（図１、配列番号３）に記載されている寄託されているゲノム核酸配列
の内部領域と同じである。図２では、配列番号２と配列番号４（配列番号３のア
ンチセンス鎖）を比較している。

【００３０】 本明細書に例示されており、本発明で実施可能な使用には、ＭＣＨ受容体であ
るＨＧ６７領域に依存しない使用が含まれる。例えば、ＨＧ６７核酸はヒトソー
スからクローン化した（実施例１参照）。前記核酸は、ヒトからＨＧ６７転写物
を産生する細胞または前記転写物を産生しない（細菌を含めた）非ヒト細胞を区
別するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。また、ＨＧ
６７に対して特異的な抗体は、ヒトからＨＧ６７を発現する細胞またはＨＧ６７
を発現しない（細菌を含めた）非ヒト細胞を区別するために使用され得る。

【００３１】 ＭＣＨ受容体であるＨＧ６７に基づいて、ＨＧ６７は患者において有利な効果
を達成するための標的を与える。好ましくは、ＨＧ６７活性は、体重減少、体重
増加、ガン（例えば、結腸ガンまたは乳ガン）の治療、痛みの緩和、糖尿病の治
療、ストレス緩和または性機能障害の１つ以上を達成するためにモジュレートさ
れる。

【００３２】 好ましくは、ＨＧ６７活性は、ＭＣＨ受容体で応答を生起させることによりま
たはＭＣＨ受容体アゴニストまたはアンタゴニストにより生起した応答を変更さ
せることによりモジュレートされる。ＭＣＨ−Ｒ受容体活性をモジュレートする
化合物には、アゴニスト、アンタゴスト及びアロステリックモジュレーターが含
まれる。通常、活性に負の影響を与えるＨＧ６７アンタゴスト及びアロステリッ
クモジュレーターは体重減少、ガン（例えば、結腸ガンまたは乳ガン）の治療、
痛みの緩和、ストレス緩和または性機能障害の治療のために使用され、活性に正
の影響を与えるＨＧ６７アゴニスト及びアロステリックモジュレーターは体重増
加のために使用される。

【００３３】 ＨＧ６７活性はＨＧ６７発現をモジュレートすることによっても変更され得る
。ＨＧ６７発現をモジュレートする化合物には、インビボでＨＧ６７を発現し得
るクローン化ＨＧ６７、ＨＧ６７転写物に対して標的されるアンチセンス核酸及
びＨＧ６７転写物に対して標的される酵素核酸が含まれる。

【００３４】 患者は哺乳動物、好ましくはヒトを指す。患者を指すとき、患者は病気または
疾患を有していなくてもよい。用語「患者」には、予防的に治療される被験者及
び病気または疾患に羅漢している被験者が含まれる。

【００３５】 好ましくは、ＨＧ６７活性は患者の体重を減少させるためまたは患者の疾患を
治療するためにモジュレートされる。真性糖尿病は、例えばグルコース負荷の増
加及び／またはインシュリン耐性の低下を達成するようにＨＧ６７活性をモジュ
レートすることにより治療され得る。

【００３６】 過大体重は、高血圧、糖尿病、異常脂肪血症、心血管疾患、胆石、変形性関節
症及び特定のガンを含めた各種疾患に関与する要因である。体重減少は、例えば
前記疾患の可能性を低下させるために前記疾患の治療の一部として使用され得る
。体重減少は、例えば食欲低下、代謝率の増加、脂肪摂取の制限または炭水化物
渇望の低下といった効果の１つ以上を得るためにＨＧ６７活性をモジュレートす
ることにより達成され得る。

【００３７】 別の実施態様では、ＨＧ６７活性は患者の体重を増加させるためにモジュレー
トされる。体重増加は、体重減少を伴う病気または疾患を患っているかまたは治
療を受けている患者にとって特に有用である。体重減少を伴う病気または疾患に
の例には、食欲不振、ＡＩＤＳ、るい痩、悪液質及び虚弱な高齢者が含まれる。
体重低下を伴う治療の例には、化学療法及び放射線療法が含まれる。

【００３８】 ＨＧ６７ポリペプチド ＨＧ６７ポリペプチドは少なくとも９個の隣接するアミノ酸長であるＨＧ６７
領域を含む。ＨＧ６７ポリペプチドは各種用途を有し、例えば機能性受容体に対
する成分を提供し、ＨＧ６７に結合する抗体を作成するための免疫原として使用
され、ＨＧ６７に結合する化合物を同定するための標的として使用され及び／ま
たはＨＧ６７活性に影響を及ぼす化合物の能力を調べるためのアッセイにおいて
使用される。

【００３９】 ＨＧ６７に由来する１つ以上の領域及びＨＧ６７に由来しない１つ以上の領域
を含むキメラポリペプチドでは、ＨＧ６７に由来しない領域が例えば特定目的を
達成するためまたはＨＧ６７またはその断片の代わりに使用され得るポリペプチ
ドを産生するために使用され得る。キメラＨＧ６７ポリペプチドを用いて達成さ
れ得る特定目的には、単離用マーカーの提供、各種受容体領域の機能分析、免疫
応答の強化及びＧタンパク質共役の変更が含まれる。

【００４０】 好ましくは、ＨＧ６７ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含むかまた
は該アミノ酸から構成される。別の実施態様では、ＨＧ６７ポリペプチドは、少
なくとも１８個のアミノ酸長、少なくとも２７個のアミノ酸長、少なくとも５４
個のアミノ酸長、または配列番号１のアミノ酸１〜１０、１１〜２０、２１〜３
０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９
０、９１〜１００、１０１〜１１０、１１１〜１２０、１２１〜１３０、１３１
〜１４０、１４１〜１５０、１５１〜１６０、１６１〜１７０、１７１〜１８０
、１８１〜１９０、１９１〜２００、２０１〜２１０、２１１〜２２０、２２１
〜２３０、２３１〜２４０、２４１〜２５０、２５１〜２６０、２６１〜２７０
、２７１〜２８０、２８１〜２９０、２９１〜３００、３０１〜３１０、３１１
〜３２０、３２１〜３３０及び３３１〜３４０からなる群から選択される領域を
含むかまたは構成される。別の実施態様において、ＨＧ６７ポリペプチドは ＭＮＰＦＨＡＳＣＷＮＴＳＡ（配列番号５）、 ＭＩＧＩＩＣＳＴＧＬＶ（配列番号６）、 ＭＹＱＱＮＫＤＡＲＣＣＮＰＳ（配列番号７）、 ＭＶＬＶＬＶＶＶＦＩＬＳＡＡ（配列番号８）、及び ＭＥＱＰＴＬＡＦＹＶＧＹＹＬＳＩ（配列番号９） からなる群から選択される配列を含むかまたは構成される。

【００４１】 ＨＧポリペプチドは、ＭＣＨに応答し且つ配列番号１と少なくとも約８５％、
好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有する機能性Ｇタンパク質受容体を
も含む。ポリペプチドの配列類似性はＢＬＡＳＴ（援用により本明細書に含まれ
るとするＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：
３３８９−３４０２（１９９７））により調べられ得る。１つの実施態様では、
配列類似性は、ＭＡＴＲＩＸ：ＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＥＲ ＲＥＳＩＤＵＥ Ｇ
ＡＰ ＣＯＳＴ：１１及びＬａｍｂｄａ比：１のパラメータを含むｔＢＬＡＳＴ
ｎサーチプログラムを用いて調べられる。

【００４２】 ポリペプチドは化学的合成を含む方法及び生化学的合成を含む方法のような標
準方法を用いて作成され得る。ポリペプチドの化学合成方法は当業界で公知であ
る（例えば、Ｖｉｎｖｅｎｔ，「ペプチド及びタンパク質薬物デリバリー(Pepti
de and Protein Drug Delivery)」，ニューヨーク州ニューヨークに所在のＤｅ
ｋｋｅｒ（１９９０年）発行を参照されたい）。

【００４３】 ポリヘプチドの生化学的合成方法も当業界で公知である。前記方法ではポリペ
プチド合成のために核酸鋳型を使用する。特定アミノ酸をコードする核酸トリプ
レットの配列を提供する遺伝子コードは当業界で公知である（例えば、Ｌｅｗｉ
ｎ ＧＥＮＥＳ ＩＶ，ｐ．１１９，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ（１９９０年）発行を参照されたい）。タンパク質を産生するために核
酸を細胞に導入し、核酸を発現させる方法の例は文献、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，
「分子生物学の現在のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)
」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ（１９８７−１９９８年）発行及びＳａｍｂｒｏｏｋ
ら，「分子クローニング 実験マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory M
anual)」，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行に記載されている。

【００４４】 （機能性ＨＧ６７） 機能性ＨＧ６７は、リンガンドの結合時にＧ結合共役細胞内信号を伝達する。
ＨＧ６７のアミノ酸配列及び核酸配列を同定すると、ＨＧ６７に関連する機能性
受容体を他のソースから入手するため、ＨＧ６７キメラＧタンパク質共役受容体
を作成するため及び配列番号１の機能誘導体を作成するための手段が提供される
。

【００４５】 ＨＧ６７ポリペプチドは、ＨＧ６７に対する配列類似性に基づいて容易に同定
され、入手できる。ＨＧ６７のアミノ酸配列も核酸配列もＨＧ６７ポリペプチド
を同定及び入手するために使用され得る。例えば、配列番号１はＨＧ６７ポリペ
プチドをコードする核酸を同定・クローン化するための縮重核酸プローブまたは
プライマーを作成するために使用され得、配列番号２またはその断片はＨＧ６７
ポリペプチドをコードする核酸を同定・クローン化するために穏和な緊縮条件下
で使用され得る。

【００４６】 クローン化のための縮重プローブ及び穏和な緊縮条件の使用は当業界で公知で
ある。前記方法の例はＡｕｓｕｂｅｌ，「分子生物学の現在のプロトコール(Cur
rent Protocols in Molecular Biology)」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ（１９８７−
１９９８年）発行及びＳａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング 実験マニュア
ル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)」，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行に
記載されている。

【００４７】 特定ソースから入手したＨＧ６７から、受容体活性を有する誘導体を作成する
ことができる。前記誘導体には、アミノ酸置換、付加及び欠失を有するポリペプ
チドが含まれる。本質的に同じ特性を有する誘導体を作成するためのＨ６７に対
する変化は、ＨＧ６７結合ドメインの外側で３次構造を変更しない方法で実施し
なければならない。ポリペプチドがＨＧ６７活性を有する能力はＧタンパク質活
性を測定するような方法を用いて確認され得る。

【００４８】 天然アミノ酸の違いは異なるＲ基に起因する。Ｒ基はアミノ酸の各種特性、例
えば物理的サイズ、電荷及び疎水性に影響を及ぼす。アミノ酸は、中性及び疎水
性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、
フェニルアラニン及びメチオニン）、中性及び極性（グリシン、セリン、スレオ
ニン、チロシン、システイン、アスパラギン及びグルタミン）、塩基性（リシン
、アルギニン及びヒスチジン）及び酸性（アスパラギン酸及びグルタミン酸）の
複数のグループに分割され得る。

【００４９】 通常、異なるアミノ酸を置換するとき、類似の特性を有するアミノ酸を交換す
ることが好ましい。特定基内での異なるアミノ酸の置換、例えばロイシンのバリ
ンでの置換、リシンのアルギニンでの置換、グルタミンのアルギニンでの置換は
、ポリペプチド官能性に変化を与えない良好な候補である。

【００５０】 異なるアミノ酸基の範囲外の交換も可能である。好ましくは、前記交換はポリ
ペプチド中の置換すべきアミノ酸の位置を考慮してなされる。例えば、ポリペプ
チドの内部の非極性アミノ酸の代わりにグルタミンよりもアルギニンの方がより
自由に使用できる。なぜならば、アルギニンは長い脂肪族側鎖を有するからであ
る（Ａｕｓｕｂｅｌ，「分子生物学の現在のプロトコール(Current Protocols i
n Molecular Biology)」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８，追補３
３，Ａｐｐｅｎｄｉｘ １Ｃ参照）。

【００５１】 （ＨＧ６７抗体） ＨＧ６７を認識する抗体は、免疫原として配列番号１を含むポリペプチドまた
はその断片を用いて作成され得る。好ましくは、免疫原として使用されるポリペ
プチドは配列番号１のポリペプチドまたは少なくとも９個のアミノ酸長を有する
配列番号１の断片から構成される。

【００５２】 ＨＧ６７に対する抗体は各種用途を有し、例えばＨＧ６７の存在を同定するた
め及びＨＧ６７ポリペプチドを単離するために使用される。ＨＧ６７の存在の同
定は、例えばＨＧ６７を産生する細胞を同定するために使用され得る。前記同定
によりＨＧ６７の別のソースが提供され、前記同定はＨＧ６７を産生することが
公知の細胞をＨＧ６７を産生しない細胞と区別するために使用され得る。例えば
、ＨＧ６７に対する抗体により、ＨＧ６７を発現するヒト細胞をＨＧ６７を発現
しないヒト細胞またはＨＧ６７を発現しない（細菌を含めた）非ヒト細胞と区別
することができる。

【００５３】 前記抗体の作成・使用する方法は当業界で公知である。その方法の例は、Ａｕ
ｓｕｂｅｌ，「分子生物学の現在のプロトコール(Current Protocols in Molecu
lar Biology)」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８、Ｈａｒｌｏｗら
，「抗体 実験室マニュアル(Antibodies, A Laboratory Manual)」，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８年）発行及び
Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）に記載さ
れている。

【００５４】 （結合アッセイ） ＨＧ６７またはその断片は、受容体に結合する化合物を同定するための結合研
究で使用され得る。前記研究は、競合及び非競合フォーマットを含めた各種フォ
ーマットを用いて実施され得る。更なる競合研究は、ＨＧ６７に結合することが
認められている追加化合物を用いて実施され得る。

【００５５】 リガンド結合に関与する特定ＨＧ６７配列は、受容体及び各種受容体断片に結
合する標識化合物を用いて容易に同定され得る。結合領域を狭くするように被験
断片を選択するために各種方法を使用することができる。前記方法の例には、Ｎ
末端から約１５個のアミノ酸長の隣接する断片の試験及びより長い断片の試験が
含まれる。より長い断片を試験するときには、化合物に結合する断片を細分して
結合領域を更に位置づけることができる。結合研究のために使用される断片は組
み換え核酸方法を用いて作成される。

【００５６】 好ましくは、結合研究は組み換え核酸から発現させたＨＧ６７を用いて実施す
る。より好ましくは、組み換え発現させたＨＧ６７は配列番号１のアミノ酸配列
から構成される。

【００５７】 結合アッセイは、個別の化合物または複数の化合物を含有する調製物を用いて
実施され得る。ＨＧ６７への結合能力を有する複数の化合物を含有する調製物は
、ＨＧ６７に結合する化合物を同定するために試験され得る小グループに分割さ
れ得る。

【００５８】 結合アッセイは異なる環境に存在する組み換え産生させたＨＧ６７を用いて実
施され得る。前記環境の例には、ＨＧ６７組み換え核酸を含む細胞抽出物及び精
製細胞抽出物が含まれ、異なる環境に導入される組み換え手段により産生される
精製ＨＧ６７受容体ポリペプチドの使用も含まれる。

【００５９】 ＨＧ６７に対するリガンドとしてのＭＣＨを同定することは受容体活性の作成
手段を提供し、受容体に結合するため且つ受容体活性を変更するための標的を提
供する。ＭＣＨリガンドはＭＣＨ構造に基づいて容易に設計され得る。ＭＣＨリ
ガンドの例には、ヒトＭＣＨ、サケＭＣＨ及びその誘導体が含まれる。好適な誘
導体は、例えばヒトＭＣＨの１個以上のアミノ酸を欠失または置換し、生じたポ
リペプチドを試験することにより実験的に同定され得る。特定配列を有するポリ
ペプチドの産生方法は当業界で公知である。（Ｐｈｅ^１３Ｔｙｒ^１９）−ＭＣＨ
がＨＧ６７に結合するＭＣＨ誘導体の１例である。

【００６０】 ＭＣＨリガンドに対して各種タイプの標識を使用することができる。前記標識
の例には、放射線標識、ルミネセント分子、ハプテン及び酵素基質が含まれる。
特定標識の結合を妨害する能力は、特定標識で標識したＭＣＨのＭＣＨ結合に対
する競合能力を比較することにより容易に測定され得る。

【００６１】 （機能性アッセイ） １つ以上のＨＧ６７領域を含む機能性Ｇタンパク質が関与するアッセイは、Ｈ
Ｇ６７で活性な化合物の選択、受容体活性に影響を与える化合物の能力の評価及
び異なるＨＧ６７領域の活性のマッピングのような各種目的のために使用され得
る。ＨＧ６７活性は各種方法、例えばＨＧ６７の細胞内コンフォメーションの変
化の検出、Ｇタンパク質活性の測定または細胞内メッセンジャーのレベルの測定
を用いて調べることができる。

【００６２】 組み換え発現させた受容体は、化合物が該受容体または別の受容体で活性であ
るかどうかの測定を容易とするために使用され得る。例えば、ＨＧ６７は通常受
容体を発現しない細胞系、例えばＨＥＫ ２９３、ＣＯＳ ７またはＣＨＯにお
いて発現ベクターにより発現され得、発現ベクターを含まないまたはＨＧ６７を
コードしない発現ベクターを含む同一の細胞系はコントロールとして作用し得る
。

【００６３】 各種Ｇタンパク質活性（例えば、Ｇｉ、Ｇｓ及びＧｑ）の測定方法は当業界で
公知である。Ｇｉ及びＧｓ活性は、色素胞アッセイ、ｃＡＭＰ産生を測定するア
ッセイ、ｃＡＭＰ蓄積の阻害を測定するアッセイ及び^３５Ｓ−ＧＴＰの結合を測
定するアッセイのような方法を用いて測定され得る。ｃＡＭＰは、ラジオイムノ
アッセイのような各種方法を用い、ｃＡＭＰ応答遺伝子リポータータンパク質に
より間接的に測定され得る。

【００６４】 Ｇｑ活性は、細胞内Ｃａ^２＋を測定する方法のような方法を用いて測定され得
る。Ｃａ^２＋を測定するために使用され得る当業界で公知の方法の例には、染料
（例えば、Ｆｕｒａ−２）の使用及びＣａ^２＋−バイオルミネセンス感受性リポ
ータータンパク質（例えば、エクオリン）の使用が含まれる。Ｇタンパク質活性
を測定するためにエクオリンを使用する細胞系の例はＨＥＫ２９３／ａｅｑ１７
である（いずれも援用により本明細書に含まれるとするＢｕｔｔｏｎら，Ｃｅｌ
ｌ Ｃａｌｃｉｕｍ，１４：６６３−６７１（１９９３）及びＦｅｉｇｈｎｅｒ
ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：２１８４−２１８８（１９９９））。

【００６５】 キメラＨＧ６７は、受容体で活性な化合物をアッセイするため及び受容体の異
なる領域に関する情報を得るために使用され得る。キメラＨＧ６７受容体はＮ−
末端細胞外ドメイン、貫膜領域（好ましくは７個の貫膜領域）、細胞外ループ領
域及び細胞内ループ領域からなる貫膜ドメイン、細胞内カルボキシ末端ドメイン
を含み、１つ以上のドメインが配列番号１に存在する少なくとも９個の隣接する
アミノ酸の領域を少なくとも１つ含む。別の実施態様では、キメラＨＧ６７はＨ
Ｇ６７の細胞外ドメインを含み及び／または配列番号１に存在する少なくとも１
８個の隣接するアミノ酸の領域を１つ以上含む。

【００６６】 Ｇタンパク質共役の特異性は細胞内ドメインにより決定される。キメラＨＧ６
７は、所望のＧタンパク質に機能的に結合するように作成され得る。キメラ受容
体を作成し、Ｇタンパク質共役応答を測定する方法は、例えば国際特許第９７／
０５２５２号パンフレット、米国特許第５，９８１，１９５号明細書及び同５，
２６４，５６５号明細書に記載されている。

【００６７】 機能性アッセイは、個々の化合物または複数の化合物を含有する調製物を用い
て実施され得る。１つ以上の化合物がＨＧ６７活性に影響を及ぼす複数の化合物
を含有する調製物は、ＨＧ６７活性に影響を及ぼす化合物を同定するために化合
物の小グループに分割され得る。

【００６８】 機能性アッセイは異なる環境に存在する組み換え産生したＨＧ６７を用いて実
施され得る。前記環境の例には、組み換え核酸から発現させたＨＧ６７及びポリ
ペプチドに対する適当な膜を含む細胞抽出物及び精製細胞抽出物；及びＧタンパ
ク質活性を測定するのに適した別の環境に導入される組み換え手段により産生さ
れる精製ＨＧ６７の使用が含まれる。

【００６９】 ＨＧ６７受容体活性化合物のスクリーニングは、アッセイにおいてＭＣＨリガ
ンドを使用することにより容易となる。スクリーニングアッセイのＭＣＨリガン
ドを使用するとＨＧ６７を与える。前記活性に対する試験化合物の影響は、例え
ばアロステリックモジュレーター及びアンタゴニストを同定するために調べられ
得る。更に、前記アッセイはアゴニストを同定するために使用され得る。

【００７０】 ＨＧ６７核酸 ＨＧ６７核酸は、配列番号１の少なくとも９個の隣接するアミノ酸をコードす
る領域を含み、または配列番号２に存在する少なくとも１８個の隣接する塩基を
含む。ＨＧ６７核酸は各種用途を有し、例えばＨＧ６７核酸の存在を同定するた
めにハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとして使用され、
ＨＧ６７に関連する受容体をコードする核酸を同定するためにハイブリダイゼー
ションプローブまたはＰＣＲプライマーとして使用され及び／またはＨＧ６７ポ
リペプチドの組み換え発現のために使用される。

【００７１】 ＨＧ６７セグメントをコードしないかまたは配列番号２に存在しないＨＧ６７
核酸の領域は特定の目的を達成するために選択されることが好ましい。特定の目
的を達成するために使用され得る追加領域の例には、サンドイッチアッセイの一
部として使用され得る捕捉領域、核酸の存在を示すべくプローブされ得るリポー
ター領域、発現ベクター領域及び他のポリペプチドをコードする領域が含まれる
。

【００７２】 別の実施態様では、ＨＧ６７核酸は配列番号１のポリペプチドをコードする核
酸を含むかまたは構成され、或いは配列番号２の核酸配列を含むかまたは構成さ
れる。別の実施態様では、ＨＧ６７核酸は、配列番号１の塩基１〜６０または１
５０〜３４０に存在する少なくとも９個の隣接するアミノ酸、少なくとも１８個
の隣接するアミノ酸、少なくとも２７個の隣接するアミノ酸または少なくとも５
４個の隣接するアミノ酸をコードする配列を含むかまたは構成され、或いは配列
番号２の塩基１〜１８０または３９０〜１０２０に存在する少なくとも１８個の
隣接するヌクレオチド、少なくとも３６個の隣接するヌクレオチドまたは少なく
とも７２個の隣接するヌクレオチド配列またはその相補体を含むかまたは構成さ
れ、或いは ＡＴＧＡＡＴＣＣＡＴＴＴＣＡＴＧＣＡＴＣＴＴＧＴＴＧＧ（配列番号１０）、 ＡＴＧＡＴＴＧＧＧＡＴＴＡＴＣＴＧＴＴＣＡＡＣＡ（配列番号１１）、 ＡＴＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＴＡＡＧＧＡＴＧＣＣＡＧＡＴ（配列番号１２）
、 ＡＴＧＡＡＧＴＴＧＡＣＡＡＡＧＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧ（配列番号１３）、
及び ＡＴＧＧＧＡＡＡＣＡＣＴＣＴＧＡＡＡＴＣＡＣＡＣＴＴＴ（配列番号１４） からなる群から選択される核酸配列を含むかまたは構成される。

【００７３】 ＨＧ６７核酸は、ＭＣＨに応答し且つ配列番号１と少なくとも約８５％、好ま
しくは少なくとも９５％の配列類似性を有する機能性Ｇタンパク質をコードする
核酸；及び配列番号２と少なくとも約８５％、好ましくは９０％の配列類似性を
有する核酸をも含む。核酸の配列類似性はＦＡＳＴＡ（援用により本明細書に含
まれるとするＰｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，
１８３：６３−９７（１９９０））により決定され得る。１つの実施態様では、
配列類似性は、ＭＡＴＲＩＸ：ＢＬＯＳＵＭ５０、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＩＥＳ
：ｏｐｅｎ＝−１２，ｒｅｓｉｄｕｅ＝−２のパラメータを含むＦＡＳＴＡサー
チプログラムを用いて調べられる。

【００７４】 本明細書に記載のガイドラインは、各種ソースからＨＧ６７関連受容体をコー
ドする核酸配列を得るため、及びＨＧ６７活性を有する受容体を構築するために
使用され得る。各種ソースからのＨＧ６７関連受容体をコードする核酸配列の入
手は、縮重プローブ及びプライマーの組合せを用い、ハイブリダイゼーション条
件を適切に選択することにより容易となる。縮重プローブ及びプライマーの組合
せは遺伝子コードの縮重を考慮して作成される。ハイブリダイゼーション条件の
モジュレートは、類似の配列を有する核酸へハイブリダイズできるようにプロー
ブまたはプライマーの特異性をコントロールするのに有用である。

【００７５】 ハイブリダイゼーション検出及びＰＣＲクローニングに使用される方法は当業
界で公知である。核酸検出方法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニ
ング 実験マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)」，第２版，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（
１９８９年）発行に記載されている。ＰＣＲクローニング方法は、例えばＷｈｉ
ｔｅ，「分子クローニング方法(Methods in Molecular Cloning)」，第６７巻，
Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９７年）発行に記載されている。

【００７６】 ＨＧ６７プローブ及びプライマーは、例えばゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含
む核酸ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。前記ライブラリ
ーは市販されており、Ａｕｓｕｂｅｌ，「分子生物学の現在のプロトコール(Cur
rent Protocols in Molecular Biology)」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ（１９８７−
１９９８年）発行に記載されているような方法を用いて作成され得る。

【００７７】 特定のアミノ酸配列及び遺伝子コードの公知の縮重から始めて、多数の異なる
コーディング核酸配列を得ることができる。遺伝子コードの縮重は、殆どすべて
のアミノ酸がヌクレオチドトリプレット、すなわちコドンの各種組合せによりコ
ードされるために生ずる。特定コドンの特定アミノ酸への翻訳は当業界で公知で
ある（例えば、Ｌｅｗｉｎ，ＧＥＮＥＳ ＩＶ，ｐ．１１９，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９０年）発行）。アミノ酸は、下記する
ようにコドンによりコードされる： Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ，ＧＣＣ，ＧＣＧ，ＧＣＵ、 Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ，ＵＧＵ、 Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ，ＧＡＵ、 Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドンＧＡＡ，ＧＡＧ、 Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ，ＵＵＵ、 Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ，ＧＧＣ，ＧＧＧ，ＧＧＵ、 Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ，ＣＡＵ、 Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ，ＡＵＣ，ＡＵＵ、 Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドンＡＡＡ，ＡＡＧ、 Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ，ＵＵＧ，ＣＵＡ，ＣＵＣ，ＣＵＧ，ＣＵ
Ｕ、 Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ、 Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ，ＡＡＵ、 Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ，ＣＣＣ，ＣＣＧ，ＣＣＵ、 Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ，ＣＡＧ、 Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ，ＡＧＧ，ＣＧＡ，ＣＧＣ，ＣＧＧ，Ｃ
ＧＵ、 Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ，ＡＧＵ，ＵＣＡ，ＵＣＣ，ＵＣＧ，ＵＣＵ
、 Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン：コドンＡＣＡ，ＡＣＣ，ＡＣＧ，ＡＣＵ、 Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ，ＧＵＣ，ＧＵＧ，ＧＵＵ、 Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ、 Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ，ＵＡＵ。

【００７８】 所望の配列を有する核酸は、化学的及び生化学的方法を用いて合成され得る。
化学的方法の例は、Ａｕｓｕｂｅｌ，「分子生物学の現在のプロトコール(Curre
nt Protocols in Molecular Biology)」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ（１９８７−１
９９８年）発行及びＳａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング 実験マニュアル
(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)」，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行に記
載されている。

【００７９】 生化学的合成方法には、核酸鋳型及び適当な酵素（例えば、ＤＮＡ及び／また
はＲＮＡポリメラーゼ）の使用を含む。前記方法の例には、インビトロ増幅方法
（例えば、ＰＣＲ及び転写に基づく増幅）及びインビボ核酸複製が含まれる。好
適な方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ，「分子生物学の現在のプロトコール(Current Pro
tocols in Molecular Biology)」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ（１９８７−１９９８
年）発行、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング 実験マニュアル(Molecul
ar Cloning, A Laboratory Manual)」，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行及びＫａｃ
ｉａｎらま米国特許第５，４８０，７８４号明細書に記載されている。

【００８０】 （ＨＧ６７プローブ） ＨＧ６７プローブは、適切なハイブリダイゼーション条件下でＨＧ６７標的核
酸に特異的にハイブリダイズし得且つ非標的核酸からＨＧ６７核酸を区別し得る
領域を含む。ＨＧ６７プローブは、ＨＧ６７核酸に対して相補性でない核酸をも
含む。

【００８１】 好ましくは、存在する非相補的核酸はリポーター配列または捕捉配列のような
特定目的を有する。しかしながら、追加の核酸がＨＧ６７核酸が標的及び非標的
間の区別を妨げない限り、追加の核酸は特定の目的を持つ必要がない。

【００８２】 ハイダリダイゼーションは相補的ヌクレオチド塩基を介して起こる。ハイブリ
ダイゼーション条件は、２つの分子または領域が安定なハイブリッドを形成する
のに十分に強い相互作用を有するかを決定する。

【００８３】 一緒にハイブリダイズする２つの分子間の相互作用の程度は、産生されるハイ
ブリッドのＴｍにより反映される。Ｔｍが高ければ、相互作用はより強く、ハイ
ブリッドはより安定である。Ｔｍは当業界で公知の各種因子、例えば相補性の程
度、存在する相補的塩基の種類（例えば、Ａ−Ｔハイブリダイゼーション対Ｇ−
Ｃハイブリダイゼーション）、修飾核酸の存在及び溶液成分により影響される（
例えば、Ｓａｍｂｏｏｋら，「分子クローニング 実験マニュアル(Molecular C
loning, A Laboratory Manual)」，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行参照）。

【００８４】 ハイブリッドのＴｍが特定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で使用す
る温度よりも高いときに安定なハイブリッドが形成される。プローブの特異性の
程度は、ハイブリダイゼーション緊縮条件を調節することにより変更され得る。
プローブハイブリダイゼーションの検出は、検出可能標識を用いると容易となる
。検出可能標識の例には、蛍光、酵素及び放射性標識が含まれる。

【００８５】 緊縮条件の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング 実験マニュアル
(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)」，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行に記
載されている。高緊縮条件の例は次の通りである：ＤＮＡ含有フィルターのプレ
ハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液及び１００μｇ／
ｍｌの変性サケ精液ＤＮＡからなる緩衝液中６５℃で２時間〜一晩実施する。フ
ィルターを、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精液ＤＮＡ及び５〜２０×１０^６ｃｐ
ｍの^３２Ｐ標識プローブを含むプレハイブリダイゼーション混合物中６５℃で１
２〜４８時間ハイブリダイズする。フィルターは、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤ
Ｓを含有する溶液中３７℃で１時間洗浄する。この後に、０．１×ＳＳＣ及び０
．１％ＳＤＳ中５０℃で４５分間洗浄し、その後オートラジオグラフィーにかけ
る。高緊縮条件を用いる他の方法には、例えば５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液
、５０％ホルムアミド中４２℃で１２〜４８時間実施するハイブリダイゼーショ
ンステップまたは０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ ＳＤＳ中６５℃で３０〜６０分
間実施する洗浄ステップを含む。

【００８６】 プローブは核酸またはその誘導体、例えば修飾核酸及びペプチド核酸からなる
。修飾核酸には、１つ以上の改変糖基、改変ヌクレオチド内結合及び／または改
変ヌクレオチドプリンまたはピリミジン塩基を有する核酸が含まれる。修飾核酸
は、いずれも援用により本明細書に含まれるとする国際特許第号９８／０２５８
２パンフレット、米国特許第５，８５９，２２１号明細書及び同第５，８５２，
１８８号明細書に記載されている。

【００８７】 （組み換え発現） ＨＧ６７ポリペプチドは、翻訳システムを用いて適当な宿主または試験管にお
いて組み換え核酸から発現され得る。好ましくは、組み換え発現させたＨＧ６７
ポリペプチドはＨＧ６７に結合し且つ受容体の活性をモジュレートする化合物を
スクリーニングするアッセイにおいて使用される。

【００８８】 好ましくは、発現は発現ベクターを用いて宿主細胞において実施される。発現
ベクターは、ポリペプチドをコードする組み換え核酸と共に適切な転写及びプロ
セッシングのための調節要素を含む。存在し得る調節要素には、組み換え核酸に
元々結合している調節要素及び組み換え核酸に元々結合していない外因性調節要
素が含まれる。外因性プロモーターのような外因性調節要素は特定宿主において
組み換え核酸を発現するために有用であり得る。

【００８９】 「組み換えヌクレオチド配列」は、当該配列に元々結合していない１つ以上の
核酸領域を含む核酸上に存在する配列である。存在し得る領域の例には、配列に
元々結合していない１つ以上の調節要素、ウイルス要素及び選択マーカーが含ま
れる。

【００９０】 一般的に、発現ベクター中に存在する調節要素は転写プロモーター、リボソー
ム結合サイト、ターミネーター及び任意に存在するオペレーターを含む。別の好
ましい要素は真核細胞でのプロセッシングのためのポリアデニル化信号である。
好ましくは、発現ベクターは宿主細胞での自律複製のための複製起源、選択マー
カー、特定数の有用な制限酵素サイト及び高コピー数のためのポテンシャルをも
含む。発現ベクターの例はクローニングベクター、修飾クローニングベクター、
特別に設計されたプラスミド及びウイルスである。

【００９１】 各種宿主において適当レベルのポリペプチド発現を与える発現ベクターは当業
界で公知である。当業界で公知の哺乳動物発現ベクターには、ｐｃＤＮＡ３（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣｌｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ
２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ ３
７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＮＴｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７２２４）、ｐＲＳＶｇ
ｐｔ（ＡＴＣＣ ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１９８）、ｐ
ＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ ３７４
６０）、ｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びラムダ−ＺＤ３５（ＡＴＣＣ
３７５６５）が含まれる。当業界で公知の細菌発現ベクターには、ｐＥＴ１１ａ
（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ラムダｇｔ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡＩ
Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含
まれる。当業界で公知の真菌細胞発現ベクターには、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ）及びピチア発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。当業
界で公知の昆虫細胞発現ベクターには、Ｂｌｕｅ Ｂａｃ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）が含まれる。

【００９２】 組み換え宿主細胞は原核または真核細胞であり得る。組み換え宿主細胞の例に
は、細菌細胞（例えば、大腸菌）、真菌細胞（例えば、酵母）、哺乳動物細胞（
例えば、ヒト、ウシ、ブタ、サル及びげっ歯動物）及び昆虫細胞（例えば、ショ
ウジョウバエ及びカイコ由来細胞系）が含まれる。市販されている哺乳動物細胞
系には、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ．ｓｕｐ．−）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．３）、Ｌ
細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．２）、２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７
３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３（ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、Ｈｅ
Ｌａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、
ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
１７１）が含まれる。

【００９３】 特定宿主での発現を高めるために、宿主のコドン使用を考慮するように配列番
号２に示す配列を修飾することが有用であり得る。異なる生物のコドン使用は当
業界で公知である（Ａｕｓｕｂｅｌ，「分子生物学の現在のプロトコール(Curre
nt Protocols in Molecular Biology)」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１
９９８，追補３３，Ａｐｐｅｎｄｉｘ １Ｃ参照）。

【００９４】 発現ベクターは標準方法を用いて宿主細胞に導入され得る。前記方法の例には
、形質転換、トランスフェクション、リポフェクション、プロトプラスト融合及
びエレクトロポレーションが含まれる。

【００９５】 ポリペプチドをコードする核酸は、発現ベクターを使用せずに、例えば合成ｍ
ＲＮＡまたは天然ｍＲＮＡを用いて細胞において発現され得る。更に、ｍＲＮＡ
は各種の無細胞系（例えば、小麦胚芽抽出物及び網状赤血球抽出物）及び細胞系
（例えば、カエル卵母細胞）において翻訳され得る。ｍＲＮＡの細胞系への導入
は、例えば微量注入により達成され得る。

【００９６】 ＨＧ６７発現のモジュレーション ＨＧ６７発現は、ＨＧ６７活性を増加または低下させる手段としてモジュレー
トされ得る。前記モジュレーションには、ＨＧ６７発現を低下させるためのＨＧ
６７核酸活性の阻害またはＨＧ６７活性を増加させるためのＨＧ６７核酸の供給
が含まれる。

【００９７】 （ＨＧ６７活性の阻害） ＨＧ６７核酸活性は、ＨＧ６７を認識し且つ前記核酸の転写または翻訳能力に
影響を及ぼす核酸を用いて阻害され得る。ＨＧ６７核酸活性の阻害は、例えば標
的実証研究で使用され得る。

【００９８】 Ｈ６７翻訳を阻害する好ましい標的はｍＲＮＡである。Ｈ６７をコードするｍ
ＲＮＡのタンパク質への翻訳能力は、アンチセンス核酸や酵素核酸のような化合
物により影響される。

【００９９】 アンチセンス核酸は標的ｍＲＮＡの領域にハイブリダイズされ得る。アンチセ
ンス核酸の構造に応じて、アンチセンス活性は翻訳開始の妨害、ｍＲＮＡのプロ
ラッシングの防止、ハイブリッドアレスト及びｍＲＮＡのＲＮＡアーゼＨ活性に
よる分解のような各種メカニズムによりもたらされ得る。

【０１００】 酵素核酸は別の核酸分子を認識し、開裂し得る。好ましい酵素核酸はリボザイ
ムである。

【０１０１】 アンチセンス核酸及びリボザイムの一般的構造並びに前記分子のデリバリー方
法は当業界で公知である。修飾または非修飾核酸がアンチセンス分子及びリボザ
イムとして使用され得る。各種タイプの修飾が、ＲＮＡアーゼＨにより開裂され
る能力のような或るアンチセンス活性に影響を与え得、核酸安定性に影響を与え
得る。各種アンチセンス分子及びリボザイム並びに前記分子の使用については、
援用により本明細書に含まれるとする米国特許第５，８４９，９０２号明細書、
同第５，８５９，２２１号明細書及び同第５，８５２，１８８号明細書に記載さ
れている。

【０１０２】 医薬投与に関するガイドラインは、例えば上掲のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版及び上掲のＭｏｄｅ
ｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，第２版に概説されている。核酸は異なる環
境に存在する細胞に試験管内、生体内及び生体外方法を用いて導入され得る。

【０１０３】 （ＨＧ６７発現の増加） ＨＧ６７をコードする核酸は、例えば体重を増加させるため、またはＨ６７発
現に影響を及ぼす化合物をスクリーニングするための試験系（例えば、トランス
ジェニック動物）を作成するために使用され得る。核酸は、異なる環境に存在す
る細胞に導入され、発現され得る。

【０１０４】 医薬投与に関するガイドラインは、例えば上掲のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版及び上掲のＭｏｄｅ
ｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，第２版に概説されている。遺伝子治療にお
いて有用な方法の例は、援用により本明細書に含まれるとする「遺伝子治療及び
分子生物学：基本的メカニズムから臨床応用まで(Gene Therapy & Molecular Bi
ology: From Basic Mechanisms to Clinical Applications)」，Ｂｏｕｌｉｋａ
ｓ編，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８年）発行に記載されて
いる。

【０１０５】 Ｈ６７活性のモジュレート 本明細書の記載をガイドとして用いて、ＨＧ６７をモジュレートし得る化合物
を入手し、患者において有利な効果を達成するために使用することができる。前
記効果は、例えばＨＧ６７で活性な化合物を用いて体重の変化またはストレスの
緩和により得ることができる。

【０１０６】 体重の変化は、体重過小患者の体重を増加させるためにまたは体重過大患者の
体重を減少させるために特に有用である。更に、例えば体重を増加させるために
飼育動物を治療することもできる。体重過小患者には、ボディ・マス指数（ＢＭ
Ｉ）の正常体重範囲の下限よりも約１０％以上、２０％以上または３０％以上少
ない体重を有する患者が含まれる。体重過大患者には、ＢＭＩの正常体重範囲の
上限よりも約１０％以上、２０％以上または３０％以上多い体重を有する患者が
含まれる。正常体重範囲は当業界で公知であり、患者の年令、身長及び身体のタ
イプのような要因が考慮される。

【０１０７】 ＢＭＩは患者自身の身長／体重の比である。ＢＭＩは体重（ｋｇ）を身長（ｍ
）の二乗で割って計算することにより求められる。ＢＭＩの正常範囲は１９〜２
２である。

【０１０８】 好ましくは、Ｈ６７活性は非タンパク質ＨＧ６７アゴニストまたはアンタゴニ
ストを用いて変更される。アゴニスト及びアンタゴニストとしては、１つ以上の
アリールまたはヘテロアリールを含み、約１５０〜９００の分子量を有する有機
化合物が好ましい。

【０１０９】 ＨＧ６７モジュレート化合物はキット中に提供され得る。前記キットは、通常
活性化合物を投与剤型で含む。剤型は、１日以上の期間にわたり定期的に、例え
ば１日１〜６回患者に投与したときに有利な効果が得られ得るように十分量の活
性化合物を含有している。好ましくは、キットは（例えば、肥満または体重過大
を治療するための）体重減少またはストレス緩和のための剤型の使用及び特定期
間服用すべき剤型の量を指示する使用説明書をも含む。

【０１１０】 治療のための投与 医薬投与に関するガイドラインは、いずれも援用により本明細書に含まれると
するＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ，第１８版，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９９０
年）発行及びＭｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，第２版，Ｂａｎｋｅ
ｒ及びＲｈｏｄｅｓ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．（１９９０年）
に概説されている。

【０１１１】 適当な官能基を有するＨＧ６７活性化合物は酸性塩または塩基性塩として製造
され得る。（水または油に溶解または分散し得る生成物の形態の）医薬的に許容
され得る塩には、例えば無機または有機の酸または塩基から形成されるような慣
用の非毒性塩または第４級アンモニウム塩が含まれる。前記塩の例には、酸付加
塩（例えば、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香
酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、亜硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩
、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、
ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリ
セロリン酸塩、半硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩，臭化水素酸塩
、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩
、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウサ
ン塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピク
リン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸
塩、トシル酸塩及びウンデカン酸塩）及び塩基酸塩（例えば、アンモニウム塩、
アルカリ金属塩（例：ナトリウム塩及びカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例
：カルシウム塩及びマグネシウム塩）、有機塩基との塩（例：ジシクロヘキシル
アミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン）及びアミノ酸（例：アルギニン及びリ
シン）との塩）が含まれる。

【０１１２】 ＨＧ活性化合物は、経口、経鼻、注射及び経粘膜を含めた各種ルートにより投
与され得る。懸濁液として経口投与される活性成分は製薬業界で公知の方法に従
って製造され得、増量剤として微晶質セルロース、懸濁剤としてアルギン酸また
はアルギン酸ナトリウム、増粘剤としてメチルセルロース及び矯味／矯臭剤を含
み得る。即時放出性錠剤として、前記組成物は微晶質セルロース、リン酸ジカル
シウム、スターチ、ステアリン酸マグネシウム及びラクトース及び／または他の
賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤及び滑沢剤を含み得る。

【０１１３】 鼻エアゾールまたは吸入により投与するとき、前記組成物は製薬業界で公知の
方法に従って製造され得、ベンジルアルコールまたは他の好適な保存剤、バイオ
アビリティーを高めるための吸収促進剤、フルオロカーボン及び／または他の可
溶化剤または分散剤を使用して生理食塩溶液として製造され得る。

【０１１４】 前記化合物は、製薬業界で公知の剤型を用いて静注（ボーラス及び注入）、腹
腔、皮下、場合により閉塞を有する局所、または筋肉内形態で投与され得る。注
射により投与する場合、注射溶液または懸濁液は、好適な非毒性で非経口的に許
容され得る希釈剤または溶媒（例えば、マンニトール、１，３−ブタンジオール
、水、リンゲル液または等張性塩化ナトリウム溶液）または好適な分散／湿潤及
び懸濁剤（例えば、合成モノ−またはジグリセリドを含めた無菌無刺激性固定油
及びオレイン酸を含めた脂肪酸）を用いて製造され得る。

【０１１５】 座薬の形態で直腸投与する場合、前記組成物は、常温で固体であるが薬物を放
出するために直腸腔で液化及び／または溶解する適当な非刺激性賦形剤、例えば
カカオ脂、合成グリセリドエステルまたはポリエチレングリコールと薬物を混合
して製造され得る。

【０１１６】 本発明の治療のための好適に投与レジメは、患者の年令、体重、性別及び医学
的状態；治療する状態の重篤度；投与ルート；患者の腎機能及び肝機能；及び使
用する特定化合物を含めた当業界で公知の要因を考慮して選択される。医薬投与
及び医薬組成物に対するガイドラインは、例えば上掲のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版及び上掲のＭｏ
ｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，第２版に記載されている。

【０１１７】 毒性なしに効果を与える範囲内の薬物の濃度を得る際の最適精度には、標的サ
イトへの薬物アベイラビリティーの薬物動態に基づくレジメが必要である。これ
には、薬物の分布、平衡及び消失の考慮が含まれる。成人患者の１日用量は０．
０１〜１，０００ｍｇの範囲であると予想される。

【０１１８】 （実施例） 以下、本発明のさまざまな特徴及び作用効果を更に説明するために実施例を提
示する。これらの実施例は本発明を実施するのに有用な方法も例示する。これら
の実施例は本発明を限定するものではない。

【０１１９】 実施例１：ＨＧ６７のクローニング ＨＧ６７の完全長コーディング配列を、ＭｃＤｏｎａｌｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４７：２６６−２７０（１９９
８）に記載されている方法及び手順を用いてクローン化した。クローニングのた
めに胎児脳、精巣、胎盤及び前立腺のプールされているｃＤＮＡライブラリーを
使用した。ＰＣＲ反応及び配列決定反応のために以下のプライマーを使用した。

【０１２０】

【化１】 ＰＣＲ反応は、並べたｃＤＮＡライブラリーのスーパープールをスクリーニン
グするために配列番号１５プライマー及び配列番号１６プライマーを用いて実施
した。ポジティブなプールを同定した。

【０１２１】 ＰＣＲに基づくｒａｃｅ反応は、ベクター及び遺伝子特異的プライマーとして
配列番号１５＋配列番号２１（ベクタープライマー）または配列番号２０（ベク
タープライマー）及び配列番号１６＋配列番号２１または配列番号２０を用いて
実施した。これらの反応（一次反応）からのＰＣＲ産物を、一次反応内に入れ子
されたプライマーを用いて二次ＰＣＲ反応を実施するための鋳型として使用した
。すなわち、配列番号１５含有の一次反応のために配列番号１７（配列番号１５
の内部）＋配列番号２２（ベクタープライマー）または配列番号１９（ベクター
プライマー）、並びに配列番号１６含有の一次反応のために配列番号１８（配列
番号１６の内部）＋配列番号２２または配列番号１９。

【０１２２】 増幅産物を精製し、Ｍ１３前進及び復帰プライマー、配列番号１７プライマー
及び配列番号１８プライマーを用いて配列決定した。配列を分析し、アセンブリ
すると、３４０アミノ酸のポリペプチドをコードする１０２３ヌクレオチドのオ
ープンリーディングフレーム及び停止コドンが同定された。胎児脳ライブラリー
からＰＣＲにより完全長クローンを得た。

【０１２３】

【化２】

【０１２４】 実施例２：ＨＧ６７の一過性発現 ヒトＨＧ６７の全コーディング配列をｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢプラスミドベ
クター（カリフォルニア州カールスベルグに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢ
ａｍＨＩ−ＮｏｔＩサイトにクローン化した。生じた構築物をＥｆｆｅｃｔｅｎ
ｅ（ドイツのヒルデンに所在のＱｉａｇｅｎ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎ
ｅ ＰＬＵＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を製造業者の指示に従って用
いてＨＥＫ−２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ＳＶ４０ Ｔ−抗原（ＨＥ
Ｋ−２９３Ｔ）を構成的に発現するヒト胚腎細胞を、１０％ ウシ胎児血清、１
００単位／ｍｌのペニシリンＧ及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補
充したＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地（メリーランド州ロックビルに所在のＬｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）において湿潤雰囲気下３７℃／５％ ＣＯ_２で維持し
た。

【０１２５】 細胞内カルシウムイオン濃度（［Ｃａ^２＋］_ｉ）をＣａ^２＋感受性蛍光染料ｆ
ｕｒａ−２を用いて蛍光定量的に測定した。ＨＧ６７ ｃＤＮＡを有するｐＥＦ
１／Ｖ５−ＨｉｓＢプラスミドベクターを一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ
２９３Ｔ細胞を、トランスフェクトしてから４８時間後２ｍＭ ＥＤＴＡ含有リ
ン酸緩衝生理食塩水を用いて収集し、アッセイ緩衝液（ハンクス液，１０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ，０．１％ ＢＳＡ，ｐＨ７．４）を用いて１回洗浄した。細胞を２
μＭ ｆｕｒａ−２−アセトキシメチルエステル（熊本に所在の同人）含有緩衝
液を用いて１．０×１０^７細胞／ｍｌの細胞密度で懸濁し、ゆっくり振盪しなが
ら３７℃で６０分間インキュベートした。ｆｕｒａ−２充填細胞を緩衝液を用い
て２回洗浄し、緩衝液を用いて１．０×１０^６細胞／ｍｌに再懸濁した。生じた
懸濁液０．５ｍｌを測定の間ガラスセル中３７℃で絶えず撹拌した。細胞懸濁液
にＭＣＨ（大阪のペプチド研究所）または［Ｐｈｅ^１３，Ｌｅｕ^１９］−ＭＣＨ
（フランスのストラスブールに所在のＮｅｏｓｙｓｔｅｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液５μｌを添加し、５００ｎｍ
の放射波長、３４０ｎｍと３８０ｎｍの励起波長での蛍光強度をＣＡＦ−１１０
細胞内イオンアナライザー（東京に所在のＪＡＳＣＯ）によりモニターした。

【０１２６】 図３に示すように、ＭＣＨ及び［Ｐｈｅ^１３，Ｌｅｕ^１９］−ＭＣＨはＨＧ６
７を一過的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞において細胞内カルシウムレベルを用
量に無関係に高い効力（ＭＣＨ及び［Ｐｈｅ^１３，Ｌｅｕ^１９］−ＭＣＨのＥＣ _５０ はそれぞれ２０ｐＭ及び７８ｐＭと計算された）で増加させたが、非トラン
スフェクト細胞では検出できるほどの［Ｃａ^２＋］_ｉ増加を誘導しなかった（デ
ータ示さず）。これらの結果から、ＨＧ６７はＭＣＨ受容体であることが確認さ
れ、ＭＣＨ−Ｒ２と呼称され得る。

【０１２７】 実施例３：ＭＣＨ結合実験 ポリ−Ｌ−Ｌｙｓをコートした２４ウェル培養プレートにＨＥＫ２９３Ｔ細胞
を１×１０^５細胞／ウェルで接種し、一晩培養した。付着細胞にｐＥＦ１／Ｖ５
−ＨｉｓＢ／ＭＣＨ−２Ｒプラスミド（実施例２参照）をトランスフェクトした
。トランスフェクトしてから４８時間後、トランスフェクトされた単層細胞を１
０％ ウシ胎児血清、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び０．１％ バシトラシンを含む
Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地で濯いだ。その後、細胞を［^１２５Ｉ］−ＭＣＨ（１
００ｐＭ，マサチューセッツ州ボストンに所在のＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を含む同一培地（２２０μｌ／ウェル）において３７
℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、細胞を氷冷培地を用いて
３回洗浄し、２Ｍ ＮａＯＨ（５００μｌ／ウェル）を用いて溶解した。ライゼ
ートを試験管に移し、細胞結合放射能をＣＯＢＬＡ Ｑｕａｎｔｕｍ γ−カウ
ンター（コネチカット州メリデンに所在のＰａｃｋｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
）を用いて測定した。非特定的結合は１μＭ 冷ＭＣＨの存在下で定義された。

【０１２８】 ［^１２５Ｉ］−ＭＣＨは良好な窓でＨＧ６７を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に
結合したのに対し、ｍｏｃｋトランスフェクトした細胞では非特異的結合は観察
されなかった（表１）。

【０１２９】

【表１】

【０１３０】 実施例４：ＨＥＫ／２９３／ａｅｑ１７／Ｇα１５におけるＭＣＨによるＨＧ ６７の活性化 ｐＣＲ３．１（米国カリフォルニア州カールズバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ）にクローン化したＨＧ６７の完全コーディング配列をｐＩＲＥＳピュロ
マイシン（米国カリフォルニア州パロアルトに所在のＣｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ
．）にサブクローン化した。クローンをＤＮＡ配列決定により確認した。

【０１３１】 活性を測定するためにＨＥＫ２９３／ａｅｑ１７細胞系を用いた（Ｂｕｔｔｏ
ｎ及びＢｒｏｗｎｓｔｅｉｎ，Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ，１４：６６３−６７
１（１９９３））。マウスプロミスカスＧタンパク質Ｇα１５の完全コーディン
グ配列をベクターｐＩＲＥＳ／ゼオシン（米国カリフォルニア州パロアルトに所
在のＣｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）にクローン化した。生じたプラスミドにＬｉ
ｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（米国メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇに所在
のＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を用いてＨＥＫ２９３／ａｅｑ１７細胞をトランスフェ
クトし、ゼオシンを用いて選択した。それぞれの安定コロニーを単離し、各種受
容体のカップリングについて試験した。乱交雑カップリングを示すクローンをＨ
ＥＫ２９３／ａｅｑ１７／Ｇα１５と命名し、その後のアッセイで使用した。

【０１３２】 ＨＥＫ２９３／ａｅｑ１７／Ｇα１５をダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ，米国
メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇに所在のＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）＋１０
％ ウシ胎児血清（熱不活化）、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、５００μｇ／
ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ、２００μｇ／ｍｌのゼオシン、１００μｇ／ｍｌの
ストレプトマイシン、１００単位／ｍｌのペニシリンにおいて増殖させた。ＨＧ
６７及びＭＣＨ−Ｒ１のプラスミドＤＮＡを、ＧＩＢＣＯ−ＢＥＬが示唆する条
件に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−２０００（米国メリーランド州Ｇａｉ
ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を用いてＨＥＫ２９３／ａｅｑ１７／Ｇα１５にトランス
フェクトした。トランスフェクトしてから２日後、細胞をＤＭＥＭ＋０．１％
ウシ胎児血清で１回洗浄し、次いで８μＭ セレンテラジンｃｐ（米国オレゴン
州ユージーンに所在のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）及び３０μＭ グル
タチオンを含有するＤＭＥＭにおいて３７℃／５％ ＣＯ_２で１時間保持した。
その後、細胞をＶｅｒｓｅｎｅ（米国メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ
に所在のＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）で１回洗浄し、酵素−無細胞解離緩衝液（米国メ
リーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇに所在のＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を用いて
脱離し、ＥＣＢ（ＨａｍのＦ１２栄養素混合物（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）＋０．３
ｍＭ ＣａＣｌ_２，２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ３），０．１％ ウシ胎児血清
）で希釈した。細胞懸濁液を５００×ｇで５分間遠心した。上清を除去し、ペレ
ットをＥＣＢ（１０ｍｌ）に再懸濁した。細胞密度を血球計でカウントすること
により測定し、ＥＣＢで５００，０００細胞／ｍｌに調節した。

【０１３３】 ヒトＭＣＨをＥＣＢで５倍連続希釈により２×濃縮物に希釈し、アッセイプレ
ートに０．１ｍｌ／ウェルで３回分割した。細胞懸濁液を０．１ｍｌ／ウェルで
注入し、ルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ；フィンランド
国ヘルシンキに所在のＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ）を用いて測定し、全部で４
００の測定値を集積した。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ バージョン
３．０（米国カリフォルニア州サンジェゴに所在のＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔ
ｗａｒｅ Ｉｎｃ．）のソフトウェアを用いて分析した。図４に示すように、Ｈ
Ｇ６７及びＭＣＨ−Ｒ１をトランスフェクトした細胞はいずれもヒトＭＣＨに対
して粗雑な用量依存的応答を示した。ＨＧ６７及びＭＣＨ−Ｒ１に関してＭＣＨ
のアッセイでのＥＣ_５０はそれぞれ２６ｎＭ及び６６ｎＭであった。

【０１３４】 実施例５：ＨＥＫ／２９３／ａｅｑ１７におけるＭＣＨによるＨＧ６７の活性 化 エクオリン発現する安定なリポーター細胞系２９３−ＡＥＱ１７を用いるＨＧ
６７発現をＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ ＲＴルミノメーター（メリーランド州Ｇａｉ
ｔｈｅｒｓｂｕｒｇに所在のＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を用いて測定し
た。２９３−ＡＥＱ１７細胞（Ｔ７５フラスコにおいてトランスフェクトの１８
時間前に平板培養した８×１０^５細胞）にヒトＨＧ６７／ｐＩＲＥＳプロプラス
ミドＤＮＡ（２２μｇ）：リポフェクタミン（２６４μｇ）をトランスフェクト
した。

【０１３５】 約４０時間発現後、細胞中のアポエクオリンにＥＣＢ緩衝液（１４０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ，２ｍＭ ＫＣｌ，２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ＝７．４），
５ｍＭ グルコース，１ｍＭ ＭｇＣｌ_２，１ｍＭ ＣａＣｌ_２，０．１ｍｇ／
ｍｌ ウシ血清アルブミン）において還元条件（３００ｍＭ 還元グルタチオン
）下でセレンテラジン（１０μＭ）を４時間充填した。細胞を収集し、ＥＣＢ培
地で１回洗浄し、５００，０００細胞／ｍｌに再懸濁させた。次いで、細胞懸濁
液１００ｍｌ（５×１０^４細胞に相当）を試験プレートに注入し、集積した光放
射を０．５秒単位で３０秒間記録した。次いで、ライゼート緩衝液（０．１％
最終トリトンＸ−１００濃度）２０μｌを注入し、集積した光放射を０．５秒単
位で１０秒間記録した。各ウェルの“分別応答”を、初期攻撃に対する集積応答
対トリトンＸ−１００溶菌応答を含めた全部の集積ルミネセンスの比を取ること
により計算した。結果を図５に示す。

【０１３６】 実施例６：膜結合アッセイ 膜結合アッセイを、プラスミドベクターｐＣＩｎｅｏにおいてＭＣＨ−Ｒ２を
用いて一過的にトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞に対して、またはプラスミ
ドベクターｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢにおいて安定的にＭＣＨ−Ｒ２を発現する
ＣＨＯ細胞系に対して実施した。一過的発現のために、ＣＯＳ−７細胞を１０％
熱不活化ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲ
Ｌ）において培養した。

【０１３７】 ７×１０^６個のＣＯＳ−７細胞の懸濁液にｐＣＩｎｅｏ／ＭＣＨ−Ｒ２プラス
ミドをエレクトロポレーション（Ｓｔｒａｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４（１３）：４３８４−８（１９８７））によりトラ
ンスフェクトし、６０〜７２時間後細胞を収集した。ＭａｃＮｅｉｌら，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，１９８：３２８−３３４（
１９９４）に記載されているように、一過性のトランスフェクタント及び安定な
トランスフェクタントから低張性溶菌により膜調製物を作成し、液体窒素下で凍
結し、−８０℃で保存した。

【０１３８】 シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を展開して、ＭＣＨ−Ｒ１及びＭＣ
Ｈ−Ｒ２含有膜に対する［^１２５Ｉ］Ｐｈｅ^１３Ｔｙｒ^１９−ＭＣＨ（〜２００
０Ｃｉ／ミリモル；マサチューセッツ州ボストンに所在のＭＥＭ Ｌｉｆｅ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ）の特異的結合を測定した。ＳＰＡは、９６ウェルのＯｐｔｉＰ
ｌａｔｅｓ（コネチカット州メリデンに所在のＰａｃｋａｒｄ）において小麦胚
芽凝集素−ポリビニルトルエンビーズ（イリノイ州アーリントンハイツに所在の
Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．）を用いて実施した。各ウェルは０．２５ｍｇの
ＳＰＡビーズ、１〜１０μｇの膜タンパク質及び２００μｌの結合緩衝液を含ん
でいた。結合緩衝液は５０ｍＭ トリス（ｐＨ７．４）、８ｍＭ ＭｇＣｌ_２、
１２％ グリセロール、０．１％ ＢＳＡ（ミズーリー州セントルイスに所在の
Ｓｉｇｍａ）、及びプロテアーゼ阻害剤［４μｇ／ｍｌのロイペプチン（ミズー
リ州セントルイスに所在のＳｉｇｍａ）、４０μｇ／ｍｌのバシトラシン（ミズ
ーリ州セントルイスに所在のＳｉｇｍａ）、５μｇ／ｍｌのアプロチニン（イン
ディアナ州インディアナポリスに所在のＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．）及び１００μＭのＡＥＢＳＦ（インディアナ州インディアナポリ
スに所在のＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．）］を含んでい
た。

【０１３９】 アッセイは膜調製物に関して最適化した。ＣＨＯ／ＭＣＨ−Ｒ１膜の場合には
１ウェルあたり１μｇの膜が＞６×特異的結合窓を生じ、ＣＯＳまたはＣＨＯ
ＭＣＨ−Ｒ２膜の場合には８μｇの膜が約３×の窓を生じた。特異的結合は、５
００ｎＭ 非標識ＭＣＨの存在下で実施した全結合と非特異的結合の間の差とし
て定義される。

【０１４０】 ビーズを膜で２０分間コートし、９６ウェルに分配した後、ウェルにＤＭＳＯ
中の異なる濃度の試験化合物（最終ＤＭＳＯ濃度＝１〜２％）及び２５ｎＣｉの
［^１２５Ｉ］Ｐｈｅ^１３Ｔｙｒ^１９−ＭＣＨを順次添加した。室温で３時間平衡
後、プレートをＴｏｐＣｏｕｎｔ（コネチカット州メリデンに所在のＰａｃｋａ
ｒｄ）で測定した。ＩＣ_５０をＰｒｉｓｍ ３．０（カリフォルニア州サンジェ
ゴに所在のＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｗａｒｅ）を用いて計算した。

【０１４１】 ヒトＭＣＨ、（Ｐｈｅ^１３Ｔｙｒ^１９）−ＭＣＨ及びサケＭＣＨは、低〜サブ
ナノモルの半マキシマム阻害（ＩＣ_５０）濃度でヨウ素化（Ｐｈｅ^１３Ｔｙｒ^{１ ９} ）−ＭＣＨ放射リガンドを置換した（表２）。

【０１４２】

【表２】

【０１４３】 実施例７：追加実験 更にＭＣＨ−Ｒ２活性を特徴付け、ＭＣＨ−Ｒ２の位置を調べるために追加の
実験を実施した。サケＭＣＨは、実施例５に記載されているように実施したエク
オリンアッセイで測定して、ヒトＭＣＨよりも効果は低いがＭＣＨ−Ｒ２を活性
化する。

【０１４４】 ＭＣＨ−Ｒ２はＧａｑを活性化するようである。ＭＣＨは非常に強力にＭＣＨ
−Ｒ２を介するＩＰ代謝回転を刺激した。ＭＣＨ−Ｒ２は２．８ｎＭのＥＣ_５０ を示したのに対し、ＭＣＨ−Ｒ１は約９０ｎＭのＥＣ_５０を示した。ＭＣＨ−Ｒ
２を介する細胞内カルシウム可動性は各種濃度の百日咳毒素（ＰＴＸ）により影
響されないが、ＭＣＨ−Ｒ１シグナル化は用量依存的に約５０％まで低下した。
ＭＣＨ−Ｒ１シグナル化の非完全ＰＩＸ−阻害の結果は、ＭＣＨ−１Ｒシグナル
化の完全ＰＲＸ阻害を見つけたＬｅｍｂｏら（Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，
１（５）：２６７−７１（１９９９））とは対照的であり、組み換え受容体の異
なる発現レベルに起因するのであろう。最近の報告は、ＣＲＩ−Ｇ１及びＲＩＮ
ｍ５Ｆのようなインシュリン産生細胞におけるＰＴＸ非感受性ＭＣＨ応答を示す
（Ｔｅｄａｙｙｏｎら，２７５（２）：７０９−７１２（２０００））。

【０１４５】 ノーザンブロット分析及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ＭＣＨ
−Ｒ２は脳において特異的に発現することを示す。脳では、高レベルのＭＣＨ−
Ｒ２が大脳皮質、海馬及び視床下部で検出された。他の発現領域には尾状核、被
殻及び視床が含まれる。

【０１４６】 他の実施態様は請求の範囲内である。幾つかの実施態様を示し、説明してきた
が、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく各種変更をなし得る。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＱ７４７２４９の核酸配列（配列番号３）を示す。

【図２Ａ】 配列番号２と配列番号４（配列番号３のアンチセンス鎖）の比較を示す。

【図２Ｂ】 配列番号２と配列番号４（配列番号３のアンチセンス鎖）の比較を示す。

【図３】 一過的にＨＧ６７を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＭＣＨ及び［Ｐｈｅ ^１３ ，Ｔｙｒ^１９］−ＭＣＨによる［Ｃａ^２＋］_ｉを示す。

【図４】 エクオリンアッセイにおけるヒトＭＣＨによるＨＧ６７の活性化を示す。

【図５】 ＨＥＫ−２９３／ａｅｑ／１７細胞におけるＨＧ６７の発現及びＭＣＨによる
活性化を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 9/00 ４Ｃ０８４ 9/00 9/12 ４Ｈ０４５ 9/12 19/02 19/02 35/00 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 16/28 16/28 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ (31)優先権主張番号 ６０／１９８，０２９ (32)優先日 平成12年４月18日(2000．4．18) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＣＡ，Ｊ Ｐ，ＵＳ (72)発明者 リウ，チンユン アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リ ンカーン・アベニユー・126 (72)発明者 マクドナルド，テレンス・ピー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リ ンカーン・アベニユー・126 (72)発明者 ハワード，アンドリユー・デイー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リ ンカーン・アベニユー・126 (72)発明者 岩浅 央 東京都中央区日本橋本町２丁目２番３号 (72)発明者 佐野 秀樹 東京都中央区日本橋本町２丁目２番３号 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB10 BB20 BB50 BB51 CB01 DA13 DA36 FA29 FB02 FB03 FB08 FB12 GC15 4B024 AA01 AA11 BA44 BA80 CA04 GA11 HA12 4B063 QA18 QQ20 QR59 QR80 QS24 QS28 4B064 AG20 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA16 MA17 MA23 MA31 MA52 MA55 MA56 MA59 MA60 MA66 NA14 ZA362 ZA422 ZA702 ZA752 ZA962 ZC332 ZC352 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA50 DA76 EA20 EA50 FA71 FA74

Claims (48)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１の少なくとも９個の隣接するアミノ酸を含むこと
   を特徴とする精製ポリペプチド。
2. 【請求項２】 ポリペプチドが配列番号１の少なくとも２７個の隣接するア
   ミノ酸を含むことを特徴とする請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】 ポリペプチドが ＭＮＰＦＨＡＳＣＷＮＴＳＡ（配列番号５）、 ＭＩＧＩＩＣＳＴＧＬＶ（配列番号６）、 ＭＹＱＱＮＫＤＡＲＣＣＮＰＳ（配列番号７）、 ＭＶＬＶＬＶＶＶＦＩＬＳＡＡ（配列番号８）、及び ＭＥＱＰＴＬＡＦＹＶＧＹＹＬＳＩ（配列番号９） からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求の範囲第１
   項に記載のポリペプチド。
4. 【請求項４】 ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含むことを特徴
   とする請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。
5. 【請求項５】 ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列から構成されるこ
   とを特徴とする請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。
6. 【請求項６】 （ａ）配列番号２の塩基１〜１８０または３９６〜１０２０
   に存在する少なくとも１８個の隣接する塩基またはその相補体の領域、または（
   ｂ）配列番号１の塩基１〜６０または１５０〜３４０に存在する少なくとも９個
   の隣接するアミノ酸をコードする領域を含むことを特徴とする精製核酸。
7. 【請求項７】 核酸が配列番号２の配列を含むことを特徴とする請求の範囲
   第６項に記載の精製核酸。
8. 【請求項８】 核酸が配列番号１の配列をコードする領域を含むことを特徴
   とする請求の範囲第６項に記載の精製核酸。
9. 【請求項９】 核酸が ＡＴＧＡＡＴＣＣＡＴＴＴＣＡＴＧＣＡＴＣＴＴＧＴＴＧＧ（配列番号１０）、
   ＡＴＧＡＴＴＧＧＧＡＴＴＡＴＣＴＧＴＴＣＡＡＣＡ（配列番号１１）、 ＡＴＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＴＡＡＧＧＡＴＧＣＣＡＧＡＴ（配列番号１２）
   、 ＡＴＧＡＡＧＴＴＧＡＣＡＡＡＧＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧ（配列番号１３）、
   及び ＡＴＧＧＧＡＡＡＣＡＣＴＣＴＧＡＡＡＴＣＡＣＡＣＴＴＴ（配列番号１４） からなる群から選択される配列またはその相補体を含むことを特徴とする請求の
   範囲第６項に記載の精製核酸。
10. 【請求項１０】 配列番号１に示す少なくとも９個の隣接するアミノ酸をコ
    ードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターであって、前記ヌクレオチド配列
    が外因性プロモーターに転写的に結合していることを特徴とする前記発現ベクタ
    ー。
11. 【請求項１１】 ヌクレンチド配列が配列番号１の少なくとも２７個の隣接
    するアミノ酸をコードすることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の発現ベ
    クター。
12. 【請求項１２】 ヌクレオチド配列が ＭＮＰＦＨＡＳＣＷＮＴＳＡ（配列番号５）、 ＭＩＧＩＩＣＳＴＧＬＶ（配列番号６）、 ＭＹＱＱＮＫＤＡＲＣＣＮＰＳ（配列番号７）、 ＭＶＬＶＬＶＶＶＦＩＬＳＡＡ（配列番号８）、及び ＭＥＱＰＴＬＡＦＹＶＧＹＹＬＳＩ（配列番号９） からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードすることを
    特徴とする請求の範囲第１０項に記載の発現ベクター。
13. 【請求項１３】 ヌクレオチド配列が配列番号１のアミノ酸配列を含むポリ
    ペプチドをコードすることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の発現ベクタ
    ー。
14. 【請求項１４】 ヌクレオチド配列が配列番号１のアミノ酸配列から構成さ
    れるポリペプチドをコードすることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の発
    現ベクター。
15. 【請求項１５】 ヌクレオチドが配列番号２に示す少なくとも２７個の隣接
    する塩基を含むことを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の発現ベクター。
16. 【請求項１６】 ヌクレオチド配列が ＡＴＧＡＡＴＣＣＡＴＴＴＣＡＴＧＣＡＴＣＴＴＧＴＴＧＧ（配列番号１０）、
    ＡＴＧＡＴＴＧＧＧＡＴＴＡＴＣＴＧＴＴＣＡＡＣＡ（配列番号１１）、 ＡＴＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＴＡＡＧＧＡＴＧＣＣＡＧＡＴ（配列番号１２）
    、 ＡＴＧＡＡＧＴＴＧＡＣＡＡＡＧＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧ（配列番号１３）、
    及び ＡＴＧＧＧＡＡＡＣＡＣＴＣＴＧＡＡＡＴＣＡＣＡＣＴＴＴ（配列番号１４） からなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲第１５項に記載の発現ベ
    クター。
17. 【請求項１７】 ヌクレオチドが配列番号２の配列を含むことを特徴とする
    請求の範囲第１０項に記載の発現ベクター。
18. 【請求項１８】 ヌクレオチドが配列番号２の配列から構成されることを特
    徴とする請求の範囲第１０項に記載の発現ベクター。
19. 【請求項１９】 請求の範囲第１０項に記載の発現ベクターを含む組み換え
    細胞であって、前記細胞が前記プロモーターにより認識されるＲＮＡポリメラー
    ゼを含むことを特徴とする前記組み換え細胞。
20. 【請求項２０】 請求の範囲第１０項に記載の発現ベクターを細胞に導入す
    るステップを含む方法により作成されることを特徴とする組み換え細胞。
21. 【請求項２１】 ＨＧ６７に結合する抗体を含むことを特徴とする精製抗体
    調製物。
22. 【請求項２２】 請求の範囲第１９項に記載の組み換え細胞を、ポリペプチ
    ドを発現ベクターから発現させる条件下で増殖させるステップを含むことを特徴
    とするＨＧ６７ポリペプチドの製造方法。
23. 【請求項２３】 ＨＧ６７に結合し得る化合物のスクリーニング方法であっ
    て、 （ａ）配列番号１の少なくとも９個の隣接するアミノ酸を含むポリペプチドを組
    み換え核酸から発現させるステップ、 （ｂ）前記ポリペプチドに対して１つ以上の試験化合物を含有する試験調製物を
    供給するステップ、及び （ｃ）前記ポリペプチドに結合する前記調製物の能力を調べるステップ を含むことを特徴とする前記方法。
24. 【請求項２４】 ステップ（ｂ）及び（ｃ）をインビトロで実施することを
    特徴とする請求の範囲第２３項に記載の方法。
25. 【請求項２５】 ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を全細胞を用いて実施
    することを特徴とする請求の範囲第２３項に記載の方法。
26. 【請求項２６】 ポリペプチドを発現ベクターから発現させることを特徴と
    する請求の範囲第２３項に記載の方法。
27. 【請求項２７】 ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列から構成される
    ことを特徴とする請求の範囲第２３項に記載の方法。
28. 【請求項２８】 ＨＧ６７活性のスクリーニング方法であって、 （ａ）配列番号１の少なくとも９個の隣接する塩基を含むＧタンパク質共役受容
    体をコードする組み換え核酸を発現する細胞を１つ以上の試験化合物を含有する
    試験調製物と接触させるステップ、及び （ｂ）前記受容体の活性に対する前記調製物の影響を調べるステップ を含むことを特徴とする前記方法。
29. 【請求項２９】 Ｇタンパク質共役受容体が配列番号１のアミノ酸配列から
    構成されることを特徴とする請求の範囲第２８項に記載の方法。
30. 【請求項３０】 組み換え核酸がｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢ／ｈＭＣＨ−２
    Ｒであり、ステップ（ｂ）で細胞内カルシウムイオン濃度の変化を測定すること
    を特徴とする請求の範囲第２９項に記載の方法。
31. 【請求項３１】 患者において有利な効果を達成するための方法であって、
    前記患者でのＨＧ６７の活性または発現をモジュレートするステップを含むこと
    を特徴とする前記方法。
32. 【請求項３２】 治療を要する患者の体重減少またはストレス低下のために
    実施することを特徴とする請求の範囲第３１項に記載の方法。
33. 【請求項３３】 ＨＧ６７の活性を低下させることを特徴とする請求の範囲
    第３２項に記載の方法。
34. 【請求項３４】 患者が肥満であることを特徴とする請求の範囲第３３項に
    記載の方法。
35. 【請求項３５】 更に、配列番号１のポリペプチドを組み換え発現させ、化
    合物の配列番号１のポリペプチドの活性をモジュレートする能力を測定すること
    によりＨＧ６７活性をモジュレートできる化合物をスクリーニングし、前記化合
    物を患者を処理するために使用することを特徴とする請求の範囲第３２項に記載
    の方法。
36. 【請求項３６】 ＭＣＨ受容体またはその断片に結合できる化合物のスクリ
    ーニング方法であって、 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片を組み換え
    核酸から発現させるステップ、 （ｂ）前記ポリペプチドに対して前記ポリペプチドに結合する標識ＭＣＨリガン
    ド及び１つ以上の試験化合物を含有する試験調製物に供給するステップ、及び （ｃ）前記標識ＭＣＨリガンドのポリペプチドへの結合に対する前記試験調製物
    の影響を調べるステップ を含むことを特徴とする前記方法。
37. 【請求項３７】 ステップ（ｂ）及び（ｃ）をインビトロで実施することを
    特徴とする請求の範囲第３６項に記載の方法。
38. 【請求項３８】 ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を全細胞を用いて実施
    することを特徴とする請求の範囲第３６項に記載の方法。
39. 【請求項３９】 ポリペプチドを発現ベクターから発現させることを特徴と
    する請求の範囲第３６項に記載の方法。
40. 【請求項４０】 ＭＣＨリガンドがヒトＭＣＨであることを特徴とする請求
    の範囲第３９項に記載の方法。
41. 【請求項４１】 ポリペプチドが配列番号１に示すアミノ酸配列または配列
    番号１の断片から構成されることを特徴とする請求の範囲第４０項に記載の方法
    。
42. 【請求項４２】 ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列から構成される
    ことを特徴とする請求の範囲第４０項に記載の方法。
43. 【請求項４３】 試験調製物が１つの化合物を含有することを特徴とする請
    求の範囲第４０項に記載の方法。
44. 【請求項４４】 ＭＣＨ受容体活性をモジュレートできる化合物のスクリー
    ニング方法であって、 （ａ）（ｉ）ＭＣＨに結合する配列番号１のアミノ酸配列またはその断片及び（
    ｉｉ）Ｇタンパク質に機能的に結合する領域を含み、ＭＣＨリガンドに結合する
    と細胞内信号を伝達できるポリペプチドをコードする組み換え核酸を発現する細
    胞系をＭＣＨリガンド及び１つ以上の試験化合物を含有する試験調製物と接触さ
    せるステップ、及び （ｂ）ＭＣＨ受容体活性の指標として前記ポリペフチド活性に対する前記試験調
    製物の影響を調べるステップ を含むことを特徴とする前記方法。
45. 【請求項４５】 ポリペプチドが配列番号２の細胞外ドメイン及び貫膜ドメ
    インを含むキメラ受容体であることを特徴とする請求の範囲第４４項に記載の方
    法。
46. 【請求項４６】 ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列から構成される
    ことを特徴とする請求の範囲第４４項に記載の方法。
47. 【請求項４７】 細胞組み換え核酸が発現ベクター上に存在することを特徴
    とする請求の範囲第４６項に記載の方法。
48. 【請求項４８】 ＭＣＨリガンドがヒトＭＣＨであることを特徴とする請求
    の範囲第４７項に記載の方法。