JP2003514033A

JP2003514033A - 癌治療用のホルボキサゾール誘導体

Info

Publication number: JP2003514033A
Application number: JP2001538037A
Authority: JP
Inventors: ウックン、ファティ、エム．; ナルラ、ラーマ、ケー．
Original assignee: パーカーヒューズインスティテュート
Priority date: 1999-11-15
Filing date: 2000-11-15
Publication date: 2003-04-15
Also published as: WO2001036048A9; US20050119322A1; WO2001036048A8; WO2001036048A1; CA2391382A1; EP1231984A1; AU1612301A; US20030125366A1; US6797721B2

Abstract

(57)【要約】癌細胞増殖阻害、アポトーシスの誘導、および転移の阻害を含む癌治療用の合成ホルボキサゾールＡおよびその誘導体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本出願は、２０００年１１月１５日出願の全締約国指定のＰａｒｋｅｒＨｕ
ｇｈｅｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（米国内企業）（米国を除く全締約国についての
出願人）およびＦａｔｉｈＭ．Ｕｃｋｕｎ（米国国民）（米国のみの出願人）
のＰＣＴ国際特許出願として公認されている。

【０００２】（発明の分野）本発明は、癌治療における合成ホルボキサゾールＡの使用および抗癌薬として
有用な新規のホルボキサゾールＡ誘導体に関する。特に、本発明は、ヒト白血病
、乳癌、前立腺癌、および脳腫瘍細胞を含む癌細胞に対して強力な細胞増殖抑制
効果およびアポトーシス効果を有する新規のデヒドロブロモおよび混合メチルケ
タール誘導体を含む。本発明の新規のホルボキサゾール誘導体化合物は、細胞外
基質の移動（腫瘍転移に必要な活動）を阻害する。さらに、本発明は、治療薬と
しての合成ホルボキサキソールＡおよび本発明の新規のホルボキサゾールＡ誘導
体の使用方法に関する。

【０００３】（発明の背景）ホルボキサゾールは、インド洋の海綿動物Ｐｈｏｒｂａｓ類から単離された天
然産物である（Ｓｅａｒｌｅ，ｅｔａｌ．、１９９５、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ．、１１７、８１２６〜８１３１）。これは種々のヒト固形腫瘍細胞株に
対して強力な細胞増殖抑制活性を示している（Ｓｅａｒｌｅ，ｅｔａｌ．、１
９９５、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１８、９４２２〜９４２３）。ホル
ボキサゾールの正確な作用機構は未知であるが、微小管標的細胞分裂抑制薬とし
て作用せず、Ｓ期の細胞周期を抑止するようである（Ｍｏｌｉｎｓｋｉ，Ｔ．Ｆ
．、１９９６、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ、３７、７８７９〜７
８８０）。

【０００４】抗癌薬としてのホルボキサゾールの使用は、その天然供給源からの単離に関連
する問題のために制限されている。多数の海洋海綿由来の天然産物は、海綿動物
に一時的にのみ関連し得る共生微生物による生合成の結果であり、実験用培地で
は不可能である。さらに、海綿動物（ホルボキサゾールの天然供給源）の供給は
限られており、捕獲制限されている。したがって、これらの治療薬の潜在能力を
利用するためにはホルボキサゾールおよび活性な抗癌性ホルボキサゾール誘導体
の合成経路が必要である。

【０００５】ホルボキサゾールおよびホルボキサゾール誘導体の合成経路には、構造−活性
関係およびこれらの化合物に関する細胞の反応範囲の調査が必要である。特に、
合成ホルボキサゾール化合物については、治療活性に関連するホルボキサゾール
化合物の構造を解明および確認する必要がある。ホルボキサゾールは完全に特徴
づけられていないので、この技術を有効に適用するために提唱された化学構造を
確認する必要がある。有用なホルボキサゾールの構造を、その合成による生成お
よび合成化合物の活性の分析によって確認することができる。

【０００６】ホルボキサゾール化合物は複雑で合成が困難である。第１の合成ホルボキサゾ
ール化合物を、Ｆｏｒｓｙｔｈｅｔａｌ．、１９８８、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ
．Ｓｏｃ．、１２０、５５９７に記載のように生成した。以下の実施例に記載の
ように、以下に示す構造（Ｉ）を有する合成ホルボキサゾールＡは細胞傷害薬と
して活性であることが示された。さらに、合成ホルボキサゾールＡの特定の誘導
体にも細胞傷害活性が示された。以下の実施例で細胞傷害性を示さない合成ホル
ボキサゾールＡの特定の誘導体が細胞移動および侵入を阻害することが示された
ので、癌細胞転移を予防する有用な薬剤が得られる。

【０００７】（発明の開示）下記の化学構造（Ｉ）を有する合成ホルボキサゾールＡおよび特定のホルボキ
サゾールＡ誘導体を合成し、ヒト白血病、乳癌、前立腺癌、および脳腫瘍細胞を
含む癌細胞に対するその細胞傷害効果を試験した。合成ホルボキサゾールＡおよ
びホルボキサゾールＡの新規のデヒドロブロモおよび混合メチルケタール誘導体
がナノモル濃度で癌細胞に対して強力な細胞傷害活性を示すことが見出された。

【０００８】一般に、本発明は、癌細胞に対して強力な細胞傷害活性を有する新規の化合物
および組成物に関する。１つの実施形態は、細胞傷害または阻害有効量の合成ホ
ルボキサゾールＡおよびホルボキサゾールＡの新規のデヒドロブロモまたは混合
メチルケタール誘導体を含む組成物に関する。本発明の細胞傷害性化合物には、
以下の式を有するものが含まれる。

【０００９】Ｉ．ホルボキサゾールＡ

【化３】

【００１０】ＩＩ．４５，４６−デヒドロブロモ−ホルボキサゾールＡ

【化４】

【００１１】ＩＩＩ．３３−Ｏ−メチル−ホルボキサゾールＡ

【化５】

【００１２】本発明の別の実施形態は、薬学的組成物として細胞傷害性ホルボキサゾール化
合物を被験体に送達するために処方された組成物を提供する。本発明のさらなる実施形態は、有効量の本発明の化合物または組成物の被験体
への投与または癌細胞との接触による癌細胞増殖の阻害方法またはアポトーシス
の誘導方法を提供する。本発明のさらに別の実施形態は、ホルボキサゾールＡの特定の誘導体および細
胞外基質を介した癌細胞の接着および移動（腫瘍転移に必要な活動）の阻害方法
を提供する。これらの化合物の構造および活性を、以下の実施例に記載する。本発明のさらなる実施形態は、以下の実施例に記載のホルボキサゾールＡ誘導
体の合成方法を提供する。

【００１３】本発明の上記の要旨は、本発明のそれぞれ開示された実施形態またはそれぞれ
の実施を説明することを意図しない。以下のより詳細な図面および詳細な説明に
より、これらの実施形態を例示する。添付の図面と共に以下の本発明の種々の実施形態の詳細な説明を考慮すれば本
発明をより完全に理解することができる。

【００１４】本発明は、細胞増殖を停止させ且つ細胞のアポトーシスを誘導するための薬学
的組成物において有用な細胞傷害性化合物としての上記の構造（Ｉ）を有する合
成ホルボキサゾールＡを含む。以下の実施例で、有用な治療薬としての合成ホル
ボキサゾールＡを確立する。

【００１５】本発明はまた、白血病、前立腺癌、乳癌、および脳腫瘍細胞を含む、癌細胞、
特に多剤耐性癌細胞、例えば、ヒトＢ細胞系急性リンパ芽球性白血病細胞、神経
膠芽種、およびＢＴ−２０ヒト乳癌細胞、に対する細胞傷害薬として強力な活性
を有する新規のホルボキサゾールＡ誘導体を提供する。さらに、本発明の新規の
特定のホルボキサゾールＡ誘導体は、腫瘍細胞接着および移動（腫瘍細胞転移に
必要な活動）の強力なインヒビターである。本発明はあまり制限されないが、以
下の説明および実施例により、本発明の種々の態様がさらに認識される。

【００１６】（定義）本出願で使用された全ての科学用語および技術用語は、特記しない限り当該分
野での一般的に使用されている意味を有する。本出願で使用されるように、以下
の用語および句は以下の意味を有する。本明細書中で使用される、「薬学的に受容可能なキャリア」には、本発明の化
合物と組み合わせた場合、化合物が生物活性（癌細胞のアポトーシス誘導能力な
ど）を維持し、被験体の免疫系と反応性を示さない任意の材料が含まれる。例と
しては、任意の標準的な薬学的キャリア（リン酸緩衝化生理食塩水、水、乳濁液
（油／水乳濁液など）、および種々の型の湿潤剤など）が含まれるが、これらに
限定されない。本発明の組成物の有用なキャリアとしてペグ化およびリポソーム
系もまた含まれる。さらに、特定の抗癌抗原抗体などのキャリア分子およびＥＧ
Ｆなどのリガンドを使用して、化合物を標的細胞に輸送することができる。この
ようなキャリアを含む組成物（複合体分子を含む）は周知の従来方法によって処
方される（例えば、レミントンの薬学、第４３章、第１４版、ＭａｃｋＰｕｂ
ｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡを参照のこと）。本発明の文脈中の「Ｔｒｅａｔｉｎｇ」、「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」、または「
ｔｏｔｒｅａｔ」は、疾患の徴候を示すか罹患している哺乳動物の病態を特徴
づける少なくとも１つの症状を阻害または阻止することを意味する。癌治療の文
脈では、治療には、腫瘍成長の予防、腫瘍サイズの減少、腫瘍細胞死の促進、お
よびアポトーシスの増加が含まれる。治療には、癌細胞接着および組織への移動
の予防も含まれる。「阻害する」は、測定可能な減少または完全な予防を意味する。「多剤耐性癌細胞」は、１つまたは複数の治療薬による治療に耐性を示す１つ
または複数の癌細胞型を意味する。「治療有効量」は、投与により幾らかの治療上の利点が得られる用量であり、
本発明の文脈では、癌細胞成長および／または増殖の阻害、アポトーシスの予防
または阻害、腫瘍質量の減少、癌細胞接着および／または移動の予防、および患
者の寿命の延長が含まれる。「プロドラッグ」は、例えば、細胞への薬物の侵入の促進または患者への化合
物の投与による本発明の化合物の使用を容易にする置換基である。プロドラッグ
部分を、例えばｉｎｖｉｖｏでの酵素切断によって化合物から切断することが
できる。プロドラッグ部分の例には、ｉｎｖｉｖｏで加水分解されて本発明の
化合物を放出することができるリン酸基、ペプチド臨界、および糖が含まれる。

【００１７】（本発明の化合物）Ｆｏｒｓｙｔｈｅｔａｌ．、１９８８、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、
１２０、５５９７に記載の方法に従って調製した合成ホルボキサゾールＡは、以
下の式Ｉの化学構造を有する。本発明の新規の細胞傷害性ホルボキサゾールＡ誘
導体は、以下の式ＩＩおよびＩＩＩの構造を有する。

【００１８】Ｉ．ホルボキサゾールＡ

【化６】

【００１９】ＩＩ．４５，４６−デヒドロブロモ−ホルボキサゾールＡ

【化７】

【００２０】ＩＩＩ．３３−Ｏ−メチル−ホルボキサゾールＡ

【化８】

【００２１】（細胞傷害化合物）以下の実施例に記載のように、合成ホルボキサゾールＡおよびいくつかの個別
の合成アナログを細胞傷害性について試験した。合成ホルボキサゾールＡは例え
ばＭＴＴアッセイにより白血病、乳癌、および脳腫瘍細胞の増殖を阻害した。Ｃ
４５−Ｃ４６末端ブロミドの代わりにアルキンを保有するアナログ４５，４６−
デヒドロブロモ−ホルボキサゾールＡ、Ｃ３３ヘミケタールの代わりに混合メチ
ルケタールを有する３３−Ｏ−メチル−ホルボキサゾールＡもまた、低いナノモ
ルＩＣ₅₀で濃度依存性様式において癌細胞増殖を阻害した。それに対して、他の
６つの合成アナログは細胞傷害活性を示さなかった。この３つの細胞傷害活性化
合物はまた癌細胞の間代性増殖を阻害し、アポトーシスを誘導した。

【００２２】データにより、強力な活性にはマクロライド、中心のオキサゾール、ポリエン
側鎖、ホルボキサゾールＡのアクリレート部分が必要であることが示唆される。
これらの領域の改変により、任意の細胞傷害活性が本質的に消失する。分子モデ
リングにより、２，３−ジヒドロ−ホルボキサゾールＡの高次構造は、親化合物
の高次構造に類似していることが示される。

【００２３】４５，４６−デヒドロブロモ−ホルボキサゾールＡおよび３３−Ｏ−メチル−
ホルボキサゾールＡの高活性により、新規の細胞傷害薬の利用に必要な分離化学
を単純化することができる。Ｃ２９〜Ｃ３１オキサゾール形成の収量およびＳｏ
ｎｏｇｉｓｈｉｒａ型カップリングを介した末端炭素−炭素結合の形成の増加に
より、特に抗癌薬の製造に魅力的なデヒドロブロモアナログが得られる。

【００２４】本発明の有用な化合物を以下の実施例に記載のように細胞傷害性について試験
する。このような試験には、ヒト癌細胞株の余対数的増殖の阻害および癌細胞増
殖の阻害およびアポトーシスの誘導を同定するためのＭＴＴアッセイが含まれる
。これらのアッセイは癌治療分野で周知であり、有用な薬学的癌治療薬の予測に
有効なアッセイとして十分に確立されている。

【００２５】（接着／移動阻害用化合物）以下の実施例は、細胞外基質への癌細胞の接着および腫瘍細胞移動のインヒビ
ターとしての合成ホルボキサゾールＡおよびホルボキサゾールＡの特定の誘導体
の有効性を示すが、この誘導体は細胞傷害性であってもなくてもよい。特に強力
且つ有用な阻害化合物は合成ホルボキサゾールＡおよび以下の非細胞傷害性誘導
体である：２９−ホルボキサゾールＡ、Ｃ−３１−メチル−ホルボキシレート、
および１８−メチル−ホルボキシレート。

【００２６】ホルボキサゾールＡ

【化９】

【００２７】２９−ホルボキサゾールＡ

【化１０】

【００２８】Ｃ−３１−メチル−ホルボキシレート

【化１１】

【００２９】１８−メチル−ホルボキシレート

【化１２】

【００３０】以下の実施例に記載のアッセイによって本発明の有用な阻害化合物を癌細胞の
接着／移動の阻害能力について試験する。このようなアッセイには、非阻害性コ
ントロールと比較した阻害化合物の存在下での細胞外基質タンパク質への細胞の
結合阻害およびＡｌｂｉｎｉｅｔａｌ．、１９８７、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ
．、４７：３２３９に公開された方法によるＭａｔｒｉｇｅｌ(商標)Ｍａｔｒｉ
ｘへの癌細胞侵入の阻害が含まれる。これらのアッセイは癌治療分野で周知であ
り、有用な薬学的癌細胞転移阻害薬の予測に有効なアッセイとして十分に確立さ
れている。

【００３１】本発明の方法では、癌細胞を約ナノモル濃度の阻害化合物に接触させて癌細胞
接着および非疾患組織への侵入／移動を阻害する。これは、例えば細胞が拡散し
得る除去手術中で重要である。いくつかの癌細胞の攻撃的悪性状態と関連する細
胞外基質（ＥＣＭ）への細胞の接着により、接着部位で新たな腫瘍が成長し得る
。本発明の化合物の投与による接着および移動の阻害により、新規の腫瘍成長を
阻害することができる。

【００３２】（新規のホルボキサゾールＡ誘導体の合成）合成ホルボキサゾールＡおよび誘導体を、下記のように合成することができる
。上記の構造式Ｉを有するホルボキサゾールＡの合成は、Ｆｏｒｓｙｔｈｅｔ
ａｌ．、１９９８、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２０、５５９７〜５５
９８に記載されている。４５，４６−デヒドロブロモ−ホルボキサゾールＡおよ
び３３−Ｏ−メチル−ホルボキサゾールＡの特定の合成を以下に記載する（それ
ぞれ合成スキームＩおよびＩＩを参照のこと）。

【００３３】４５，４６−デヒドロブロモ−ホルボキサゾールＡを、ホルボキサゾールＡの
全合成に使用したものと類似の様式で、ＣｈｉＳｏｎｇＬｅｅ博士の博士論
文（ミネソタ大学、１９９９年５月２１日、「ホルボキサゾールＡのＣ１８〜Ｃ
３０フラグメントの合成および全合成の至適化」）に記載のように調製した。こ
れには、Ｌｅｅ博士の博士論文に記載のＣ１〜Ｃ３０中間体とＦｅｒｙａｎＡ
ｈｍｅｄの博士論文（ミネソタ大学、１９９９年、「ホルボキサゾールＡのＣ３
１〜Ｃ４６フラグメントの合成」）に記載のように調製したＣ３１〜Ｃ４６デヒ
ドロブロモ中間体とのカップリングが含まれていた。０℃のＴＦＡのＣＨ₂Ｃｌ₂ 溶液での処理によるＣ１〜Ｃ３０〜ｔ−Ｂｏｃ基の選択的除去により、Ｃ３１〜
Ｃ４６フラグメントのＣ１〜Ｃ３０ドメインへの結合を進行させた。次いで、隣
接するアミノアルコールを、Ｃ４６カルボン酸にカップリングした。得られたヒ
ドロキシアミドを、所望のオキサゾールを得る前に感受性アミド−アルデヒドを
経る段階的酸化−シクロ脱水処理（Ｗｉｐｆ，Ｐ．；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃ．Ｐ．；
１９９３．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５８：３６０４およびＷｉｐｆ，Ｐ．；Ｌ
ｉｍ，Ｓ．；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９５、１１７：５５８に記載
）に供する。Ｃ１３およびＣ３８のシリルエーテルをＴＢＡＦ／酢酸エチルで切
断し、Ｃ３３−Ｏ−メチルアセタールを６％ＨＣｌ水溶液を使用して加水分解し
て所望の４５，４６−デヒドロブロモ−ホルボキサゾールＡを得る。

【００３４】合成スキームＩ：４５，４６−デヒドロブロモ−ホルボキサゾールＡ

【化１３】

【００３５】一般にＦｏｒｓｙｔｈｅｔａｌ．、１９９８、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．、１２０：５５９７に従って、３３−Ｏ−メチル−ホルボキサゾールＡを調
製した。この化合物を得るために、ホルボキサゾールＡへの合成経路から最終脱
保護（６％ＨＣｌ水溶液を含む３３−Ｏ−メチル−ホルボキサゾールＡ）を省略
した。ビニルブロミド末端を含むＣ３１〜Ｃ４６合成中間体（Ａｈｍｅｄａｎ
ｄＦｏｒｓｙｔｈ、１９９８、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．、３９：
１８３に記載）をＣ１〜Ｃ３０アミノアルコール中間体とカップリングし、生成
物をＦｏｒｓｙｔｈ，ｅｔａｌ．、の論文に記載のように所望の３３−Ｏ−メ
チル−ホルボキサゾールＡに進行させた。具体的には、ビニルブロミド末端を含
むＣ１〜Ｃ３０ドメインとＣ３１〜Ｃ４６ドメインとのカップリング後、得られ
たヒドロキシアミドを段階的シクロ脱水処理工程に供して（Ｗｉｐｆ，Ｐ．；Ｍ
ｉｌｌｅｒ，Ｃ．Ｐ．；１９９３．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５８：３６０４お
よびＷｉｐｆ，Ｐ．；Ｌｉｍ，Ｓ．；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９５
、１１７：５５８に記載）所望のオキサゾールを得た。Ｃ１３およびＣ３８のシ
リルエーテルをＴＢＡＦ／酢酸エチルで切断してＣ３３−Ｏ−メチル−ホルボキ
サゾールを得た。

【００３６】合成スキームＩＩ：Ｃ３３−Ｏ−メチル−ホルボキサゾールＡ

【化１４】

【００３７】接着および移動阻害誘導体２９−ホルボキサミドＡ、Ｃ−３１−メチル−ホル
ボキシレート、および１８−メチル−ホルボキシレートを、Ｆｏｒｓｙｔｈｅ
ｔａｌ．、１９８８、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２０、５５９７〜５
５９８に記載の用に合成する。

【００３８】（プロドラッグ）用語「プロドラッグ」は、２つの分子種がホルボキサゾールＡ誘導体および抱
合体を生物学的に不活性にするが生物活性化の際に薬理学的活性を有する部分で
ある抱合分子を定義すること意味する。プロドラッグには、例えば、例えば酵素
（すなわち、エステラーゼによるエステル結合の切断）によるか酸触媒加水分解
によって切断することができる分子種に共有結合したホルボキサゾールＡ誘導体
が含まれる。本発明で有用なプロドラッグには、例えば、エステルまたはアミド
、Ｎ−マニケ塩基、Ｎ−ヒドロキシメチル誘導体、Ｎ−アシル誘導体またはホル
ボキサゾールＡ誘導体および他の部分との間のオキサゾリジン結合を含むプロド
ラッグが含まれる。

【００３９】（投与方法）本発明の抱合体を、薬学的組成物として処方し、哺乳動物宿主（選択された投
与経路に適応し、小分子およびその抱合体の投与に適切な種々の形態のヒト患者
を含む）に投与することができる。

【００４０】本発明の組成物を、非経口（すなわち、静脈内または腹腔内、注入または注射
）で投与することが好ましい。本発明の１つの実施形態では、腫瘍注射、化合物
の脳（例えば、脳室液）への注射、または静脈内注射による全身送達によって直
接投与することができる。抱合体を含む本発明の化合物は同サイズであり、脳に
迅速にアクセスすると予想される組成物は血液脳関門を通過する。

【００４１】抱合体の溶液または懸濁液を水、等張生理食塩水（ＰＢＳ）中で調製し、任意
選択的に無毒の界面活性剤と混合することができる。グリセロール、液体ポリエ
チレングリコール、ＤＮＡ、植物油、トリアセチン、およびその混合物中に分散
液を調製することができる。通常の保存および使用条件下で、これらの調製物は
、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含み得る。

【００４２】注射および注入に適切な薬学的投薬形態には、滅菌水溶液もしくは分散液また
は滅菌注射用もしくは注入用溶液または分散液の即席の調製に適応した有効成分
を含む滅菌粉末を含み得る。全ての場合、最終的な投薬形態は滅菌流体であり且
つ製造および保存条件下で安定であるべきである。液体キャリアまたは媒介物は
、例えば、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール
、または液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、無毒性グリセリルエステ
ル、およびその適切な混合物を含む溶媒または液体分散液であり得る。例えば、
リポソームの形成、必要な粒子サイズの維持（分散液の場合）、または無毒性界
面活性剤の使用によって適切な流動度を維持することができる。種々の抗菌薬お
よび抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸
、チメロサールなど、によって微生物活性を予防することができる。多くの場合
、等張剤（例えば、糖、緩衝液、塩化ナトリウム）を含むことが望ましい。組成
物中への吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムヒドロ
ゲルおよびゼラチン、の封入によって注射用組成物の吸収を延長させることがで
きる。適切な溶媒中で必要量の抱合体への上記の他の成分の組み込みおよび必要なら
ばその後の濾過滅菌によって滅菌注射用溶液を調製する。滅菌注射用溶液の調製
用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分および予め濾過滅菌した溶
液中に存在するさらなる任意の所望の成分の粉末が得られる真空乾燥および凍結
乾燥技術である。

【００４３】（癌治療）本発明の目的のために、癌治療方法には、癌細胞と本発明の化合物を接触させ
て癌細胞増殖を阻害することと、癌細胞を死滅させることと、および／または患
者の生存期間を延長させることが含まれる。本発明の方法による癌治療には、癌
細胞の接着および移動の防止による転移の阻害も含まれる。本発明の細胞傷害性および接着／移動阻害化合物は、哺乳動物での使用に適切
である。本明細書中で使用される、「哺乳動物」は、乳腺から分泌されるミルク
によって子供を育てる任意のクラスの高等脊椎動物、例えば、ヒト、ウサギ、お
よびサル、を意味する。

【００４４】（アポトーシス）アポトーシス、すなわちプログラム細胞死は、新規のタンパク質合成に必要な
能動的処理工程である。典型的には、この処理工程には、ＡＴＰが必要であり、
新規のＲＮＡおよびタンパク質合成が含まれ、細胞の恒常性に必要な遺伝子テン
プレートの破壊によって細胞のＤＮＡを分解する内因性エンドヌクレアーゼの活
性化が最高になる。アポトーシスは変性、分化、および一般的な細胞代謝回転中
の細胞の消去に認められ、通常、レセプター結合事象によって制御されるようで
ある。これらの理由のために、アポトーシスは「プログラム細胞死」または「細
胞の自殺」と呼ばれている。全ての細胞が自殺するように遺伝的にプログラムさ
れているようであるのに、これは通常抑制されている。通常の環境下では、もは
や生物に必要とされない細胞のみがこの自己破壊プログラムを活性化させる。アポトーシス細胞死は、原形質膜出血、細胞体積の減少、核濃縮、およびヌク
レオソーム間隔でのＤＮＡの内部ヌクレオチド切断性分解によって特徴づけられ
る。原形質膜の完全性の損失は、壊死と呼ばれる細胞死の形態とは異なり比較的
遅いアポトーシス事象であり、低酸素および一定の毒素への暴露によって引き起
こされ、典型的には、膜浸透性の増加および細胞破壊によって早くから特徴付け
られている。

【００４５】（接着／移動）接着は、ラミニン、フィブロネクチン、およびコラーゲンを含む細胞外基質タ
ンパク質への接着による細胞（癌細胞など）の活動を含むことを意味する。接着
アッセイは公知であり、本発明の目的のためには、細胞外基質タンパク質を被覆
したプレートへの腫瘍細胞の接着が含まれる。移動は、細胞外基質を介して移動し組織に侵入する腫瘍細胞の活動を含むこと
を意味する。移動アッセイには、細胞外基質から形成された基質（ＭＡＴＲＩＧ
ＥＬ(商標)基質など）を通過する細胞の移動能力が含まれる。

【００４６】（有用な用量）ｉｎｖｉｖｏでの癌細胞の選択的死滅または癌細胞接／移動の阻害に使用す
る場合、投与量は、所望の効果を得るために有効な量、例えば、癌細胞の減少ま
たは消滅に十分であるか、腫瘍細胞の接着／移動の阻害に十分な量、である。当
業者は、公知の方法を使用した実施例に記載のｉｎｖｉｔｒｏデータからの推
定により適量を決定することができる。一般に、癌細胞アポトーシス、癌細胞増殖の阻害、および生存期間の延長に有
効な新規のホルボキサゾールＡ誘導体の投与量は、ナノモル量の化合物の投与量
、好ましくは１００ナノモル以上である。標的部分への化合物の抱合体によって
必要量を好ましくは５０ナノモル以上の濃度に減少させることができる。細胞接着および移動阻害活性のために、一般に２００ナノモル以下のより高い
投薬量で化合物を投与する。有効投与量は、各患者に特異的な条件によって変化する。一般に、疾患の重症
度、腫瘍の位置（近いか離れているか）、宿主の年齢、代謝、疾患、薬物使用履
歴などの因子が薬物の有効性の予測に寄与する。当業者は、標準的な手順および
患者分析を使用して実施例で得られたデータから予想される適切な用量を計算す
る。一般に、約１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重を送達する用量が有効であると予想され
るが、それ以上または以下でも有用であり得る。さらに、本発明の組成物を、他の抗癌薬と組み合わせて投与することができる
。このような併用療方法では、ホルボキサゾール誘導体の投与量は、単一の薬物
治療よりも少ない。

【００４７】（実施例）以下の実施例を参照して本発明をさらに明白にすることができるが、これらは
好ましい実施形態を例示するもので、決して本発明を制限するものではない。

【００４８】実施例１：ホルボキサゾール誘導体の合成全ての化学薬品をＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ、Ｍｉ
ｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎから購入し、直接合成に使用した。アセト
ニトリル、メタノール、エタノール、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、クロロ
ホルム、および塩化メチレンなどの無水溶媒をＡｌｄｒｉｃｈから窒素下で密封
したボトルで購入し、挿管によって反応容器に移した。全反応を窒素雰囲気下で
行った。

【００４９】（４５，４６−デヒドロブロモ−ホルボキサゾールＡ）４５，４６−デヒドロブロモ−ホルボキサゾールＡ誘導体を、合成スキームＩ
に記載のように調製した。詳細には、ＣｈｉＳｏｎｇＬｅｅ博士の博士論文
（ミネソタ大学、１９９９年５月２１日、「ホルボキサゾールＡのＣ１８〜Ｃ３
０フラグメントの合成および全合成の至適化」）に記載のように調製したＣ１〜
Ｃ３０ドメインへのＦｅｒｙａｎＡｈｍｅｄの博士論文（ミネソタ大学、１９
９９年、「ホルボキサゾールＡのＣ３１〜Ｃ４６フラグメントの合成」）に記載
のように調製したＣ３１〜Ｃ４６の結合を、０℃でのＴＦＡのＣＨ₂Ｃｌ₂溶液で
の処理によるＣ１〜Ｃ３０ドメインからのｔ−Ｂｏｃ基の選択的除去によって進
行させた。得られた隣接アミノアルコールを、Ｋｎｏｒｒ，ｅｔａｌ．、１９
８９、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．３０：１９２７およびＫｏｎｉｇ，
ｅｔａｌ．、１９７０、Ｂｅｒ．Ｄｔｓｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｇｅｓ．、１０３：
２０３４に記載のようにＨＢＴＵ／ＨＯＢＴを使用してＣ３１〜Ｃ４６カルボン
酸に結合した。次いで、得られたヒドロキシアミドを、所望のオキサゾールを得
る前に感受性アミド−アルデヒドを経る段階的酸化−シクロ脱水処理（Ｗｉｐｆ
，Ｐ．；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃ．Ｐ．；１９９３．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５８：
３６０４およびＷｉｐｆ，Ｐ．；Ｌｉｍ，Ｓ．；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．
、１９９５、１１７：５５８に記載）に供する。Ｃ１３およびＣ３８のシリルエ
ーテルをＴＢＡＦ／酢酸エチルで切断した。得られたジオール（０．４ｍｇ、０．４μｍｏｌ）のＴＨＦ（０．５ｍＬ）撹
拌溶液に、６％ＨＣｌ水溶液（０．１ｍＬ）を添加した。混合物を３０時間撹拌
し、飽和ＮａＨＣＯ₃水溶液（０．５ｍＬ）で洗浄した。水相を酢酸エチル（５
×１ｍＬ）で抽出し、合わせた抽出物をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濾過し、濃縮した
。残渣の分離用薄層クロマトグラフィー（酢酸エチル）によって白色フィルムと
して所望の生成物（０．２ｍｇ、０．２μｍｏｌ、５１％）を得た。Ｒ_f０．４
５（酢酸エチル−メタノール、１５：１ｖ／ｖ）：ＨＮＭＰ（ＣＤＣｌ₃、５
００ＭＨｚ、部分解析）δ７．５８（ｓ，１Ｈ）、７．４３（ｓ，１Ｈ）、６．
３０（ｄ，Ｊ＝１８．５Ｈｚ）、６．２５（ｓ，１Ｈ）、５．９２（ｍ，２Ｈ）
、３．３７（ｓ，３Ｈ）、３．３０（ｓ，３Ｈ）。ホルボキサゾールＡの特徴を
示すデータと比較すると、混合メチルアセタールの加水分解を示す生成物の¹Ｈ
ＮＭＲスペクトルにおいて３．４０〜３．３０ｐｐｍの間に２つのシグナルの
みが認められる。図１Ａは、４５，４６−デヒドロブロモ−ホルボキサゾールＡ
の¹ＨＮＭＲスペクトルである。

【００５０】（３３−Ｏ−メチルホルボキサゾールＡ）３３−Ｏ−メチルホルボキサゾールＡ誘導体を合成スキームＩに記載のように
調製した。具体的には、ビニルブロミド末端を含むＣ３１〜Ｃ４６合成中間体（
ＡｈｍｅｄａｎｄＦｏｒｓｙｔｈ、１９９８、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬ
ｅｔｔ．、３９：１８３に記載）をＣ１〜Ｃ３０アミノアルコール中間体とカッ
プリングし、生成物をＦｏｒｓｙｔｈ，ｅｔａｌ．、の論文に記載のように所
望の３３−Ｏ−メチル−ホルボキサゾールＡに進行させた。具体的には、ビニル
ブロミド末端を含むＣ１〜Ｃ３０ドメインとＣ３１〜Ｃ４６ドメインとのカップ
リング後、得られたヒドロキシアミドを段階的シクロ脱水処理工程に供して（Ｗ
ｉｐｆ，Ｐ．；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃ．Ｐ．；１９９３．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、
５８：３６０４およびＷｉｐｆ，Ｐ．；Ｌｉｍ，Ｓ．；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．、１９９５、１１７：５５８に記載）所望のオキサゾールを得た。所望のオキサゾール中間体（０．８ｍｇ、０．６μｍｏｌ）の酢酸エチル（１
ｍＬ）撹拌溶液に、ＴＢＡＦ（０．２ｍＬの１．０ＭＴＨＦ溶液、０．２ｍｍｏ
ｌ）を添加した。混合物を２日間撹拌し、飽和ＮＨ₄Ｃｌ溶液（０．５ｍＬ）で
洗浄した。水相を酢酸エチル（５×１ｍＬ）で抽出し、合わせた抽出物をＮａ₂
ＳＯ₄で乾燥し、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（酢
酸エチル）に供して、白色フィルムとして所望の生成物（０．５ｍｇ、０．４μ
ｍｏｌ、８０％）を得た：Ｒ_f０．４６（酢酸エチル−メタノール、１５：１ｖ
／ｖ）：¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃、５００ＭＨｚ、部分解析）δ７．５８（ｓ，
１Ｈ）、７．４３（ｓ，１Ｈ）、５．９２（ｍ，２Ｈ）、３．３４（ｓ，３Ｈ）
、３．３１（ｓ，３Ｈ）、３．２７（ｓ，３Ｈ）。ホルボキサゾールＡの特徴を
示すデータと比較すると、生成物の¹ＨＮＭＲスペクトルにはシグナル７．６
５、７．４０、１．０９、０．８９、０．０７、および０．０３が存在せず、こ
れはＴＢＤＰＳおよびＴＢＳ基の喪失を示す。図１Ｂは、３３−Ｏ−メチル−ホ
ルボキサゾールＡの¹ＨＮＭＲスペクトルである。

【００５１】実施例２：合成ホルボキサゾールＡおよび誘導体の細胞傷害性。合成ホルボキサゾールＡおよびいくつかの種々のホルボキサゾールＡ誘導体化
合物のヒト白血病、乳癌、および脳腫瘍細胞に対する細胞傷害性を評価した。化
合物に対する特定の置換基の相対的重要性も研究した。コントロールとしてのゲ
ニステインと共に上記実施例１に記載のように調製したホルボキサゾールＡ誘導
体化合物を試験した。

【００５２】（細胞傷害性アッセイ）ＭＴＴ（３−[４，５−ジメチルチアゾール−２−イル]−２，５−ジフェニル
テトラゾリウムブロミド）アッセイ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ
Ｃｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して、ヒト腫瘍細胞に
対する合成ホルボキサゾールＡおよび種々の化合物の細胞傷害性アッセイを行っ
た。簡単に述べれば、薬物暴露前に指数関数的に増殖している脳腫瘍細胞を２．
５×１０⁴細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、３７℃で３６時
間インキュベートした。処理日に培養培地をウェルから慎重に吸引し、０．１〜
２５０μＭの濃度範囲で種々のホルボキサゾールＡ誘導体ならびにチロシンキナ
ーゼ阻害イソフラボンゲニステイン（ＧＥＮ）を含む新鮮な培地と交換した。３
連のウェルを各処理に使用した。ヒト神経膠芽腫細胞Ｕ３７３（脳腫瘍）、ヒトＢ細胞系急性リンパ芽球性白血
病細胞ＮＡＬＭ−６、およびヒト乳癌細胞ＢＴ−２０を、アメリカンタイプカル
チャーコレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から獲得し、１０％ウシ胎児
血清および抗生物質を補充したダルベッコ改変イーグル培地中で連続細胞株とし
て維持した。細胞を種々の化合物と共に加湿５％ＣＯ₂中、３７℃で２４〜３６時間インキ
ュベートした。各ウェルに、１０μｌのＭＴＴ（最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）を
添加し、プレートを３７℃で４時間インキュベートして代謝活性細胞との反応に
よりＭＴＴにホルマザン結晶を形成させた。ホルマザン結晶を０．０１ＭＨＣ
ｌ中に１０％ＳＤＳを含む溶液中に３７℃で一晩溶解させた。マイクロプレート
リーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）における５４０ｎｍおよび６９０ｎｍの基準
波長での各ウェルの吸光度を測定した。ＯＤ₅₄₀値を各ウェル中の生存細胞に変
換するために、各細胞株について作成したＯＤ₅₄₀値を標準ＯＤ₅₄₀−細胞数曲線
上の値と比較した。生存率を以下の式を使用して計算した。

【００５３】生存率％＝｛生存細胞数［ｔｅｓｔ］｝／｛生存細胞数［コントロール］×１０
０

【００５４】ＩＣ５０値を、非線形回帰分析によって計算した。

【００５５】以下の表１に示すように、合成ホルボキサゾールＡは、９つの多剤耐性ヒト癌
細胞株のパネルに対して強力な細胞傷害性を示した。合成ホルボキサゾールＡの
抗癌活性を、共焦点レーザー顕微鏡で確認した。ＴＵＮＥＬアッセイによってア
ポトーシスを確認した。

【００５６】

【表１】

【００５７】以下の表２（表２ａ，ｂ）は、合成し、抗癌活性について試験した１０個のホ
ルボキサゾールＡ化合物の番号および構造を示す。細胞傷害性を表３に示したが
、データを、試験した１０個の合成ホルボキサゾールＡについてのＩＣ₅₀［ＭＴ
Ｔ］として示す。表３に示されるように、ホルボキサゾールＡ誘導体４５，４６
−デヒドロブロモ−ホルボキサゾールＡおよび３３−Ｏ−メチル−ホルボキサゾ
ールＡは強力な細胞傷害薬であるが、残りの誘導体は細胞傷害活性を欠いていた
。感受性の順序は、Ｎａｌｍ−６＞ＢＴ−２０＞Ｕ３７３であった。以下に示す
ように、３つの活性な化合物はまた、３つ全ての癌細胞株のクローン原性増殖を
抑止した。

【００５８】

【表２ａ】

【表２ｂ】

【００５９】

【表３】

【００６０】（アポトーシスのｉｎｓｉｔｕ検出）合成ホルボキサゾールＡおよび合成アナログを、アポトーシス活性についても
アッセイした。ＡｐｏｐＴａｇｉｎｓｉｔｕ検出キット（Ｏｎｃｏｒ、Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を製造者の指示に従って使用したｉｎｓｉｔｕ
ニック末端標識方法によってアポトーシスアッセイを行った。免疫蛍光を使用し
て、本発明の新規のホルボキサゾールＡ誘導体で処理したヒト乳癌細胞株ＢＴ−
２０（アメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）
の形態学的特徴を試験した。急速に増殖している培養フラスコ由来の細胞をトリプシン処理し、６ウェル培
養プレート上の滅菌２２ｍｍ²カバースリップに播種した。カバースリップ上の
細胞を、処理前に２４時間再びインキュベートした。ＤＭＳＯ中で最終濃度１０
０μＭに調製した原液由来のホルボキサゾールＡ誘導体を細胞に添加した。最終
ＤＭＳＯ濃度を試験サンプルおよびコントロールにおいて０．１％に維持した。
処理前に細胞を３７℃で２４時間再びインキュベートした。２４時間後、カバー
スリップを−２０℃のメタノール中に１５分間固定後、リン酸緩衝化生理食塩水
＋０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＰＢＳ−Ｔｘ）中で１５分間インキュベー
トした。次いで、カバースリップを、１：１０００の希釈度でαチューブリンに
対するモノクローナル抗体と共に３７℃の湿室で４０分間インキュベートした。
カバースリップをＰＢＳ−Ｔｘ中で１５分間洗浄後、ＦＩＴＣに抱合したヤギ抗
マウスＩｇＧ抗体（ＡｍｅｒｓｈａｍＣｏｒｐ．、ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉ
ｇｈｔｓ、ＩＬ）と共にインキュベートした。カバースリップをＰＢＳ−Ｔｘで
再度リンスし、５μＭのＴＯＴＯ−３（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、Ｅ
ｕｇｅｎｅ、ＯＲ）と２０分間インキュベートして核ＤＮＡを標識した。カバー
スリップを即座にＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ、Ｂｕｒｌ
ｉｎｇａｍｅ）中のスライド上に反転させて光漂白を防止し、マニキュア液でシ
ールして、４℃で保存した。多開口数の対物レンズを具備したＮｉｋｏｎＥｃｌｉｐｓｅＥ８００直立
顕微鏡に取り付けたＢｉｏ−ＲａｄＭＲＣ−１０２４共焦点レーザー顕微鏡を
使用してスライドを試験した。Ｌａｓｅｒｓｈａｒｐ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒ
ｃｕｌｅｓ、ＣＡ）およびＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄ
ｏｂｅＳｙｓｔｅｍｓ、ＭｏｕｔａｉｎＶｉｅｗ、ＣＡ）を使用してデジタ
ルデータを処理し、ＦｕｊｉＰｉｃｔｏｇｒａｐｈｙ熱転写プリンター（Ｆｕ
ｊｉ、Ｅｌｍｓｆｏｒｄ、ＮＹ）で印刷した。データは、合成ホルボキサゾール
Ａおよび以下の２つの合成アナログのアポトーシス活性を示していた：４５，４
６−デヒドロブロモ−ホルボキサゾールＡおよび３３−Ｏ−メチル−ホルボキサ
ゾールＡ。試験した他の合成アナログはアポトーシス誘導能力を示さなかった。さらに、ミトコンドリアアッセイにより、図２に記載の脱分極ミトコンドリア
の増加が認められる。細胞を２．５ｎＭ、５ｎＭ、または１０ｎＭのホルボキサ
ゾールＡ、３３−Ｏ−メチル−ホルボキサゾールＡ、または４５，４６−デヒド
ロブロモ−ホルボキサゾールＡと７２時間インキュベートし、ＤｉＩＣ１（５）
で染色してミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）を評価し、ＨｅＮｅレーザーを具備
した細胞分別機で分析した。３つ全ての化合物は、用量依存様式で脱分極ミトコ
ンドリアが漸増した。

【００６１】（クローン原性アッセイ）合成ホルボキサゾールＡおよび合成誘導体の増殖阻害活性を、クローン原性ア
ッセイで試験した。癌細胞を１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭ用量の合成ホ
ルボキサゾールＡまたはホルボキサゾールＡの誘導体で処理した。処理細胞には
、Ｕ３７３ヒト神経膠芽腫細胞、ＮＡＬＭ−６、ヒトＢ細胞系急性リンパ芽球性
白血病細胞、およびＢＴ−２０ヒト乳癌細胞を含んでいた。癌細胞を、０．９％
メチルセルロース、３０％ウシ胎児血清、および５０μＭの２−メルカプトエタ
ノールを補充したα−ＭＥＭからなるクローン原性培地に再懸濁した。細胞を、
１００，０００細胞／ｍＬ／皿で２連でペトリ皿にプレートし、加湿５％ＣＯ₂
インキュベーター中で７日間培養した。癌細胞コロニーを高光学分割倒立顕微鏡
を使用してグリッド上で計数した。結果を、以下の式を使用した特定濃度の試験
物質でのクローン原性細胞の阻害％として示した。

【００６２】阻害％＝（１−平均コロニー数（試験）／平均コロニー数（コントロール）×１
００

【００６３】これらのヒト癌細胞ＢＴ−２０のクローン原性増殖に対するホルボキサゾール
Ａの効果を表４に示し、これは合成ホルボキサゾールＡおよび以下の２つの合成
アナログ：４５，４６−デヒドロブロモ−ホルボキサゾールＡおよび３３−Ｏ−
メチル−ホルボキサゾールＡの有効な増殖阻害活性を示す。

【００６４】

【表４】

【００６５】実施例３：ホルボキサゾール誘導体は癌細胞接着を阻害する。組織侵入の多段階工程中、腫瘍細胞は最初に細胞表面インテグリンレセプター
を介して細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質に接着し、周囲組織に侵入するための
移動能力を得る。ラミニン、フィブロネクチン、およびＩＶ型コラーゲンなどの
ＥＣＭタンパク質は、腫瘍細胞結合および移動において重要な役割を果たすと考
えられる。ラミニン、フィブロネクチン、およびコラーゲンは、ｉｎｓｉｔｕ
での腫瘍細胞の接着および侵入を促進する血管基底膜およびグリア境界線に見出
されている（Ｃａｒｂｏｎｅｔｔｏ，Ｓ．、１９８４、ＴｒｅｎｄｓＮｅｕｒ
ｏｓｃｉ．、７：３８２〜３８７；Ｒｕｔｋａ，Ｊ．Ｔ．、Ａｐｏｄａｃａ，Ｇ
．、Ｓｔｅｍ，Ｒ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．、６９：１５５〜１７０；Ｖｅ
ｎｓｔｒｏｍ，Ｋ．Ａ．、およびＲｅｉｃｈａｒｄ，Ｌ．Ｆ．、１９９３、ＦＡ
ＳＥＢＪ．、７：９９６〜１００３）。合成ホルボキサゾールＡおよびその合成アナログの存在下でのヒト神経膠芽腫
細胞株Ｕ３７３および２つの乳癌細胞株ＢＴ−２０およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１
を使用して、インテグリン媒介神経膠芽腫および乳癌細胞接着に対するＥＣＭタ
ンパク質の効果を試験した。ヒト脳腫瘍細胞株Ｕ−３７３ＭＧおよび乳癌細胞株ＢＴ−２０およびＭＤＡ−
ＭＢ−２３１をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋ
ｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から獲得し、１０％ウシ胎児血清および抗生物質を補充した
ＤＭＥＭを使用した液体培地中に維持した。化学誘引物質ｉｎｖｉｔｒｏ侵入
アッセイの供給源として線維芽細胞馴化培地を使用した。文献に記載のように馴
化培地を調製した（Ａｌｂｉｎｉｅｔａｌ．、１９８７、ＣａｎｃｅｒＲ
ｅｓ．、４７：３２３９〜３２４５）。馴化培地の調製のために、ＮＩＨ／３Ｔ３胚線維芽細胞（ＡＴＣＣアクセッシ
ョン番号ＣＲＬ−１６５８）を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ倍中で８０％
の密集度に増殖させ、０．５μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む無血清培地
中で２４時間培養した。培養上清を回収し、１０００×ｇで１５分間遠心分離し
て細胞破片を除去し、馴化培地として使用した。ｉｎｖｉｔｒｏ接着アッセイを行って、（ａ）種々の乳癌細胞株および神経
膠芽腫細胞株のベースライン接着特性を研究し、（ｂ）乳癌細胞および神経膠芽
腫細胞の接着特性に対するホルボキサゾールＡ誘導体の効果を評価した。接着ア
ッセイ用プレートを細胞外基質タンパク質ラミニン、フィブロネクチン、および
ＩＶ型コラーゲン（それぞれ刺し封濃度１μｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液）を４℃で一
晩予備コーティングし、乾燥した。実験当日、ウェルを再水和し、１０％ウシ血
清アルブミンのＰＢＳ溶液中で室温で１時間ブロッキングし、下記のように接着
アッセイで使用した。乳癌および神経膠芽腫細胞に対するホルボキサゾールＡおよび特定の誘導体の
効果を研究した。ＤＭＥＭ中で指数関数的に増殖する細胞を、０．１μＭ〜１μ
Ｍの濃度範囲のホルボキサゾールおよびコントロールとしてゲニステインと加湿
５％ＣＯ₂中で２４時間インキュベートした。処理後、細胞をＤＭＥＭ中に再懸
濁した０．０５％トリプシン（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でフラス
コから剥がし、３７℃で２時間インキュベートしてトリプシン処理ストレスから
細胞を回収し、ＥＣＭタンパク質で予備コーティングしたプレートへの接着能力
を試験した。接着アッセイでは、細胞を遠心分離し、無血清ＤＭＥＭで２回洗浄し、計数し
、無血清ＤＭＥＭ中で最終濃度２．５×１０⁵細胞／ｍｌに再懸濁した。２．５
×１０⁴細胞を含む１００μｌの細胞懸濁液各ウェルに添加し、細胞を加湿５％
ＣＯ₂中、３７℃で１時間接着させた。接着画分をＭＴＴ（３−[４，５−ジメチ
ルチアゾール−２−イル]−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッ
セイを使用して定量した。簡単に述べれば、ウェルの洗浄後、１０μｌのＭＴＴ
（最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＣ
ｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を各ウェルに添加し、プレートを
３７℃で４時間インキュベートして、ＭＴＴから代謝活性細胞との反応によるホ
ルマザン結晶を形成させた。ホルマザン結晶を、０．０１ＭＨＣｌ中に１０％Ｓ
ＤＳを含む溶液中に３７℃で一晩溶解した。各ウェルの吸光度を５４０ｎｍおよ
び６９０ｎｍの基準波長でのマイクロプレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ
）で測定した。ＯＤ₅₄₀値を各ウェル中の生存細胞に変換するために、各細胞株について作成
したＯＤ₅₄₀値を標準ＯＤ₅₄₀−細胞数曲線上の値と比較した。ホルボキサゾール
Ａ誘導体で処理した細胞の接着画分を、ＤＭＳＯ処理したコントロール細胞の接
着画分と比較し、以下の式を用いて接着阻害％を決定した。

【００６６】接着阻害％＝１００×｛１−薬物処理細胞の接着画分｝／｛コントロール細胞の
接着画分｝

【００６７】３つの独立した実験で各処理条件を評価した。非線形回帰分析によってＩＣ₅₀ 値を計算した。合成ホルボキサゾールＡおよび新規のホルボキサゾール誘導体は
、用量依存様式でのラミニン、フィブロネクチン、およびコラーゲン被覆プレー
トへのＵ３７３、ＢＴ−２０、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の接着を阻害し
た。驚いたことに、細胞接着を阻害するほとんどの活性アナログは細胞傷害性で
はなかった。活性化合物は、合成ホルボキサゾールＡ、２９−ホルボキサミドＡ
、３１−メチル−ホルボキシレート、および１８−メチル−ホルボキシレートで
あった（図３を参照のこと）。

【００６８】実施例４：癌細胞侵入の阻害ヒト脳腫瘍細胞株Ｕ−３７３および乳癌細胞株ＢＴ−２０およびＭＤＡ−ＭＢ
−２３１細胞のｉｎｖｉｔｒｏ侵入を、８．０μｍ孔ポリカーボネートフィル
ターインサート（Ａｌｂｉｎｉ，ｅｔａｌ．、１９８７、ＣａｎｃｅｒＲｅ
ｓ．、４７：３２３９〜３２４５）を有するＭａｔｒｉｇｅｌ(商標)被覆Ｃｏｓ
ｔａｒ２４ウェルトランスウェル細胞培養チャンバー（「Ｂｏｙｄｅｎチャンバ
ー」）を使用した以前に公開されている方法を使用してアッセイした。チャンバ
ーフィルターを、５０μｇ／ｍｌのＭａｔｒｉｇｅｌ(商標)基質で被覆し、層流
フード下、室温で一晩インキュベートし、４℃で保存した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ(
商標)基質は、いくつかの細胞外基質（ＥＣＭ）成分（コラーゲン、ラミニン、
およびプロテオグリカンを含む）から作製されている。癌細胞を、５００、２５
０、１２５、６２．５、および３１．２ｎＭの合成ホルボキサゾール化合物で７
２時間インキュベートした。実験当日に、被覆インサートを０．１％ウシ血清アルブミンを含む０．５ｍｌ
の無血清ＤＭＥＭで１〜２時間再水和した。処理細胞をトリプシン処理し、ＢＳ
Ａを含む無血清ＤＭＥＭで２回洗浄し、計数し、１×１０⁵細胞／ｍｌに再懸濁
した。無血清ＤＭＥＭ中に５×１０⁴細胞を含む０．５ｍｌの細胞懸濁液を、Ｍ
ａｔｒｉｇｅｌ(商標)被覆および再水和フィルターインサートに添加した。化学
誘引物質として７５０μｌのＮＩＨ線維芽細胞馴化培地を２４ウェルプレートに
入れ、インサートをウェルに入れ、３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、フィルターインサートを取り出し、培地をデキャント
し、移動していないフィルターの表上の細胞を先に綿をつけたアプリケーターで
掻き出した。フィルターの裏面に移動した侵入細胞を固定し、Ｈｅｍａ−３溶液
で染色し、顕微鏡下で計数した。フィルターあたり５〜１０個の無作為な視野を
計数して侵入画分の平均（±ＳＥ）値を決定した。ホルボキサゾールＡ誘導体で
処理した細胞の侵入画分を、ＤＭＳＯ処理コントロール細胞の侵入画分と比較し
、以下の式を使用して侵入阻害％を決定した。

【００６９】接着阻害％＝１００×｛１−薬物処理細胞の接着画分｝／｛コントロール細胞の
接着画分｝

【００７０】３つの独立した実験で各処理条件を評価した。ＧｒａｐｈａｄＰｒｉｓｉｎ
ソフトウェアバージョン２．０（ＧｒａｐｈｐａｄＳｏｆｔｗａｒｅＩｎｃ
．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用した非線形回帰分析によってＩＣ₅₀値を
計算した。Ｕ３７３神経膠芽腫ならびにＢＴ−２０およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞
は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ(商標)被覆Ｂｏｙｄｅｎチャンバーに非常に侵入した。本
発明の合成ホルボキサゾール化合物による阻害を、以下の表５に示す。

【００７１】

【表５】

【００７２】実施例５：ホルボキサゾールＡ誘導体は、スフェロイドからの癌細胞移動を阻
害する。直径２００〜４００μｍのＵ３７３神経膠芽腫スフェロイドを、種々の濃度の
合成ホルボキサゾールＡ、３３−Ｏ−メチル−ホルボキサゾールＡ、および４５
，４６−デヒドロブロモ−ホルボキサゾールＡの０．１％ＤＭＳＯ溶液で処理し
た。細胞をインヒビターインヒビターの非存在下でのコントロールＤＭＳＯと２
時間インキュベートし、フィブロネクチン被覆カバースリップに移した。次いで
、ＷＨＩ−Ｐ１５４を含むＤＭＥＭ中、３７℃で４８時間スフェロイドをインキ
ュベートした。３３−Ｏ−メチル−ホルボキサゾールＡまたは４５，４６−デヒドロブロモ−
ホルボキサゾールＡでの神経膠芽腫スフェロイドの処理により、未処理コントロ
ールと比較して用量依存様式でスフェロイドからの細胞移動を有意に阻害した。本発明は、上記の特定の実施例に制限されるとみなすべきではなく、むしろ添
付の特許請求の範囲に公正に記載の本発明の全ての態様を対象とすると理解すべ
きである。本発明を適用することができる種々の修正形態、等価の処理工程、お
よび多数の構造が当業者に容易に明白であり、これらは本明細書の再検討により
導き出される。さらに、直径２００〜４００μｍの多細胞Ｕ３７３神経膠芽腫スフェロイドを
、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、および３１．３５ｎＭ
のホルボキサゾールＡ、２９−ホルボキサミドＡ、１８−メチル−ホルボキシレ
ート、および３１−メチル−ホルボキシレートの０．１％ＤＭＳＯ溶液または０
．１％ＤＭＳＯのみと２時間インキュベートし、フィブロネクチン被覆カバース
リップに移した。次いで、スフェロイドを各化合物を含むＭＥＭ中でインキュベ
ートし、３７℃で４８時間培養した。インキュベーション終了時に、スフェロイ
ドを固定し、Ｈｅｍａ−３溶液で染色した。スフェロイドからの細胞の移動距離
を顕微鏡およびマイクロメーターを使用して測定した。多数の刊行物を本明細書中で引用した。このような刊行物はそれぞれ完全に記
載されているようにすべての目的のために参考として援用される。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】４５，４６−デヒドロブロモ−ホルボキサゾールＡの¹ＨＮ
ＭＲスペクトルを示す図である。

【図１Ｂ】３３−Ｏ−メチル−ホルボキサゾールＡの¹ＨＮＭＲスペク
トルを示す図である。

【図２】白血病ＮＡＬＭ−６細胞のミトコンドリア膜貫通能力に対する合
成ホルボキサゾールＡおよびホルボキサゾールＡ誘導体の効果を示すグラフであ
る。

【図３】細胞外基質タンパクに対する合成ホルボキサゾールＡおよびホル
ボキサゾールＡ誘導体の効果を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｄ 498/22 Ｃ０７Ｄ 498/22 // Ｃ０７Ｄ 309/10 309/10 413/14 413/14 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4C062 AA19 4C063 AA03 BB03 CC78 DD52 EE01 4C072 AA03 BB04 CC01 CC13 DD07 EE09 FF15 GG07 HH05 HH08 4C086 AA01 AA02 BA07 BC69 CB22 GA02 MA01 MA02 MA04 NA14 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】有効治療量の下記式の化合物および薬学的に受容可能なキャ
リアを含む組成物。【化１】
【請求項２】有効治療量の下記式の化合物および薬学的に受容可能なキャ
リアを含む組成物。【化２】
【請求項３】前記化合物をプロドラッグとして処方する、請求項１または
請求項２に記載の組成物。
【請求項４】癌細胞と有効アポトーシス誘導量の請求項１または請求項２
に記載の化合物とを接触させる工程を包含する、癌細胞のアポトーシスの誘導方
法。
【請求項５】癌細胞と阻害有効用量の請求項１または請求項２に記載の化
合物とを接触させる工程を包含する、癌細胞分裂の阻害方法。
【請求項６】治療有効用量の請求項１または請求項２に記載の化合物を患
者に投与する工程を包含する、癌の治療方法。
【請求項７】治療有効用量の１つまたは複数の２９−ホルボキサミドＡ、
３１−メチル−ホルボキシレート、および１８−メチル−ホルボキシレートなら
びに薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物。
【請求項８】癌細胞と請求項７に記載の組成物とを接触させる工程を包含
する、癌細胞の接着または移動の予防方法。
【請求項９】治療有効用量の式（Ｉ）を有する合成ホルボキサゾールＡお
よび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物。
【請求項１０】癌細胞に有効用量の合成ホルボキサゾールＡを投与する工
程を包含する、癌細胞のアポトーシスの誘導方法。
【請求項１１】治療有効量の合成ホルボキサゾールＡ、２９−ホルボキサ
ミドＡ、３１−メチル−ホルボキシレート、および１８−メチル−ホルボキシレ
ートからなる群から選択される化合物を患者に投与する工程を包含する、癌の治
療方法。