JP2003512834A - アデノ随伴ウイルスの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 アデノ随伴ウイルスを精製するための方法であって、（１）アデノ随伴ウイルスがマトリックスに結合する条件下で不純ウイルス試料をアフィニティマトリックスに適用する工程であって、当該アフィニティマトリックスが、ウイルスへの結合においてヘパラン硫酸と競合することができる吸着体を構成要素とするものである工程；（２）マトリックスから夾雑物を溶出させて、ウイルスを多量に含むマトリックスを産出する工程；（３）ウイルスを多量に含むマトリックスからウイルスを溶出する工程；（４）溶出したウイルスを、完全なウイルスは分解することができないプロテアーゼで処理して、タンパク質性夾雑物を分解する工程；および、（５）分解されたタンパク質性夾雑物から完全なウイルスを分離する工程とを含む方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、アデノ随伴ウィルスの精製方法に関するものである。

【０００２】 （背景技術） アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ウイルスを介した遺伝子治療プロトコール
において有望であることが明らかとされている。ＡＡＶは、２０〜２２ｎｍと小
型であり、自己増殖能欠損型の非病原性パルボウイルスである。ＡＡＶは、４.
７ｋＢの一本鎖ＤＮＡゲノムをもっており、当該ゲノムは、ｃａｐ遺伝子を介し
て構造タンパク質をコードし、また、ｒｅｐ遺伝子を介して非構造タンパク質を
コードしている。このウイルスは、１４６ｂｐの逆方向末端反復配列（ＩＴＲｓ
）を一組有しており、当該配列は、ＡＡＶが複製およびパッケージングされるの
に必要な唯一のシス作用因子である。

【０００３】 伝統的に、組換えＡＡＶは、２種類のプラスミドを混合したもので許容細胞株
を形質転換することによって調製される。これら２種類のプラスミドとは、ＡＡ
Ｖの機能をトランスに補う（すなわち、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝
子のみを含む）第一のプラスミド、およびウイルスのＩＴＲｓの間に目的遺伝子
を含む第二のプラスミドをいう（HermonatとMuzyczka，１９８４年）。組換えＡ
ＡＶは、通常はアデノウイルスである適当なヘルパーウイルスを感染させた形質
転換細胞から調製され、上清および溶解細胞ペレットの両方から精製される。し
かし、全ての細胞は、組換えＡＡＶを調製するために必須の両プラスミドを受容
する可能性が低いということがあるため、この系は効率的ではない。

【０００４】 最近、改良されたＡＡＶ調製法についての報告がなされた（Clarkら、１９９
５年）。この方法について簡単に説明すれば、１種類のプラスミドを用いてＡＡ
Ｖ産生細胞株を調製したものであるが、当該プラスミドは、ｒｅｐおよびｃａｐ
両遺伝子を一緒にもつウイルスＩＴＲｓと選抜マーカーの間に目的とする遺伝子
を有するものを使用する（Clarkら、１９９５年）。そして適当な選抜を行なう
ことにより、すべての細胞が、組換えＡＡＶを調製するのに必要な配列を有する
ようにする。これらの細胞にヘルパーウイルスを感染させ、得られた細胞ペレッ
トおよび細胞上清から組換えＡＡＶを精製するものである。

【０００５】 ＡＡＶ精製プロトコールの不都合な点は、いったんウイルスが調製されると、
そのウイルスを濃縮したり精製したりすることが困難であったことである。従来
、塩化セシウム密度勾配調製遠心法が、最適な方法とされていた。しかしこの方
法には、精製に時間がかかるという短所があるため、比較的限定された量を処理
する場合にしか応用することができない。白血病性芽細胞などの細胞を形質転換
するためには、高い多重感染度（ＭＯＩ）が必要であり、高力価ウイルスの調製
および多数の改変細胞を必要とする実験においては、多量のウイルスを必要とす
る。これは、従来の方法を用いていては困難である。

【０００６】 アフィニティークロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを用
いての組換えＡＡＶ精製が試みられてきた。Clarkらは、ヘパリンを結合させた
ＨＰＬＣを使用して、ＡＡＶ産生細胞の可溶化物からＡＡＶ粒子を精製したこと
を報告している（１９９９年）。Zolotukhinらも、通常のカラムまたはＨＰＬＣ
カラムのいずれかによるヘパリンアフィニティークロマトグラフィーの使用を報
告している（１９９９年）。これらの著者らは、部分精製したウイルスをアフィ
ニティーカラムに適用する前に、粗製可溶化物からの不純な組換えＡＡＶを、イ
オジキサノール密度勾配を用いて前処理しなければならないことを発見している
。

【０００７】 従来技術である精製法に伴う問題点は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
れば高い純度のものが得られるが、完全でない（すなわち、無効な）粒子が存在
するため、得られるＡＡＶは不純なままであることにある。さらに、密度勾配遠
心法の使用は、時間がかかる上にスケールアップを簡単に行なうことができない
ため望ましくない。

【０００８】 本発明の目的は、密度勾配遠心法を使用しない精製技術を提供することによっ
て、これらの短所を克服し、精製したＡＡＶの感染性に対する粒子の比率を低下
させることにある。

【０００９】 （発明の開示） 即ち本発明は、アデノ随伴ウイルスを精製するための方法であって、以下の工
程を含むものを提供するものである。 （１）アデノ随伴ウイルスがマトリックスに結合する条件下で不純ウイルス試料
をアフィニティマトリックスに適用する工程であって、当該アフィニティマトリ
ックスが、ウイルスへの結合においてヘパラン硫酸と競合することができる吸着
体を構成要素とするものである工程； （２）マトリックスから夾雑物を溶出させて、ウイルスを多量に含むマトリック
スを調製する工程； （３）ウイルスを多量に含むマトリックスからウイルスを溶出する工程； （４）溶出したウイルスを、完全なウイルスは分解することができないプロテア
ーゼで処理して、タンパク質性夾雑物を分解する工程；および、 （５）分解されたタンパク質性夾雑物から完全なウイルスを分離する工程。

【００１０】 溶出したウイルスのプロテアーゼ処理後、分解されたタンパク質性夾雑物から
完全なウイルスを分離する工程を行なうことによって、ウイルス調製物の純度が
上がることが明らかとなった。プロテアーゼ処理によって非ウイルス性タンパク
質夾雑物が分解されるとともに、完全でないウイルス粒子（すなわち、導入遺伝
子をパッケージングしないウイルス）をも分解すると考えられる。このことによ
って、より純度の高いウイルス調製物がもたらされる。このプロテアーゼは、完
全なウイルスは分解できないものでなければならない。例えば、プロテアーゼＫ
は、本発明に適したプロテアーゼではない。有用なプロテアーゼとしては、適当
なセリンプロテアーゼを挙げることができ、好ましくは、トリプシンである。

【００１１】 本発明のアフィニティマトリックスは、ウイルスの表面上で細胞レセプターに
結合する機能を有するリガンドを介して、アデノ随伴ウイルスに結合すると考え
られる。SummerfordとSamulskiは、膜結合性ヘパラン硫酸プロテオグリカン（Ｈ
ＳＰＧ）が、ＡＡＶ２型に対するレセプターであることを報告している（１９９
８年）。したがって、ヘパラン硫酸と競合することができる吸着体は、いずれも
本発明に係るアフィニティマトリックスの吸着体の構成要素となることができる
。ヘパラン硫酸との競合は、適当な競合アッセイ法によって測定することができ
よう。この方法は、一般的に、ヘパラン硫酸に対する推定吸着体を滴定する工程
、および、例えばスキャッチャード（Scatchard）分析法によって、ウイルスに
対する結合について競合するか否かを決定する工程を含む。このタイプのアッセ
イ法では、通常、例えば放射性標識または蛍光タグによってＡＡＶを標識する必
要があろう。一例としては、放射性標識されたＡＡＶを、ハンクスの平衡塩類溶
液（ＨＢＳＳ）など適当なバッファーの中で、適当な比率で標的細胞と９０分間
４℃でインキュベートするものがある。この例では、非結合標識を除去するため
に３回洗浄を行なった後、適当なカウンターを用いて細胞数を数える。結合アッ
セイは、推定吸着体を用いた場合または用いない場合のいずれかにて行ない、一
般的には、さまざまな濃度の吸着体を使用して、放射活性を測定する。推定吸着
体の親和性が高くなるほど、ＡＡＶの標的細胞への結合は弱くなる。

【００１２】 同様のアッセイ法は、感染性に基づくものでもよい。標識されたウイルスを用
いる代わりに、推定吸着体の存在下および不在下での導入遺伝子発現を測定する
。吸着体の結合が起きれば、導入遺伝子の発現は少なくなるはずである。

【００１３】 吸着体は、ヘパラン硫酸そのもの、またはその類似化合物を含むことができ、
好適にはグリコサミノグリカンを含む。ウイルスの感染性を阻害することができ
るグリコサミノグルカンの中で、ヘパリンまたはコンドロイチンＢが好適である
。ヘパリンを含むアフィニティマトリックスは市販されているため、ヘパリンが
特に好適である。このように市販されているアフィニティマトリックスとしては
、ＰＯＬＯＳ ＨＥ／ＰとＰＯＲＯＳ ＨＥ１／Ｍ（BOEHRINGER, MANNHEIM製）、
ヘパリン−アガロースＩ型、II型−ＳまたはIII型−Ｓ（SIGMA製）、およびＡＦ
ＦＩ−ＧＥＬヘパリンゲル（BIO RAD製）などがある。アフィニティマトリック
スは、従来からのカラムや、ＨＰＬＣまたはＦＰＬＣ用カラムのいずれかのカラ
ムの中に適宜充填される。

【００１４】 一般的に、マトリックス材料は、カラムに結合させるウイルスを適用するのに
適した緩衝液媒質など、適当な媒質で平衡させる。このような媒質の一つは、ｐ
Ｈ ７.４のダルベッコの改良ＰＢＳである。タンパク質夾雑物の溶出は、例えば
、さらにカラム用バッファーを用いてマトリックスを洗浄することによって行な
うことができる。必要ならば、適当な濃度の塩類を含むバッファーを適用して、
タンパク質夾雑物を洗い流すことができる。このような塩の濃度は、マトリック
スに結合したウイルスを溶出するほど高いものであってはならない。マトリック
スからのウイルス溶出は、例えば、バッファー中の塩濃度を、ＮａＣｌでは１モ
ル程度まで上昇させることによって行なうことができる。このように、ウイルス
を溶出するのに十分なイオン強度をもつ溶液によって、ウイルスを多量に含むマ
トリックスを洗浄する。

【００１５】 プロテアーゼ処理した後は、完全なウイルスと、タンパク性夾雑物を分解して
生じたペプチド断片との混合液が存在すると考えられる。したがって、分解され
たタンパク質性夾雑物から完全なウイルスを分離するために工程（５）が必要と
なり、様々な方法でこれを行なうことができる。例えば、水と非混和性の有機溶
媒によって、完全なウイルスを抽出することができる。これは、水相に多量に存
在する夾雑物からウイルスを取り出すことによる。この溶媒としては、一般的に
は、非極性溶媒であり、クロロホルム、または１,２−トリクロロトリフルオロ
エタンなどのフッ化炭素であるハロゲン化アルカン溶媒を挙げることができる。
あるいは、工程（１）、（２）および（３）を繰り返すだけで、夾雑物から完全
なウイルスを分離することができる。これは、不純なウイルスを生成するために
最初に用いたマトリックスと同一または異なった第２のアフィニティマトリック
スを用いるか、または、単に、最初のアフィニティマトリックスを再使用して行
なうことができる（但し、アフィニティマトリックスを洗浄することにより、イ
オン強度が高すぎてマトリックスへの効果的な結合が起こらないような環境にア
フィニティマトリックスを置かないようにする場合）。分解されたタンパク質性
夾雑物からウイルスを分離するのに適したその他の方法としては、ゲル排除クロ
マトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーなどがある。

【００１６】 本発明に係る方法は、不純なウイルス試料からＡＡＶを精製するのに適してい
るが、最小限の前処理を必要とすることが分かっている。試料は、通常の細胞溶
解法によって得られたアデノ随伴ウイルス産生細胞可溶化物を含むだけであろう
。好ましくは、アデノ随伴ウイルス産生細胞は、可溶化物にするために、１回以
上の凍結／融解サイクルに付される。部分精製されたウイルスを調製するために
、例えば、密度勾配遠心法を用いた部分精製を行なう必要はない。

【００１７】 （図面の簡単な説明） ここで、図面を参照して本発明を更に詳しく説明するが、これらは単なる例示
に過ぎない。

【００１８】 図１は、ＨＳアフィニティーカラムから溶出した画分のＰＣＲ解析の結果を示
している。

【００１９】 図２は、ＨＳアフィニティーカラムから溶出した画分のポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動の結果を示している。

【００２０】 図３は、ＨＳアフィニティーカラムから溶出し、トリプシン処理し、溶媒で抽
出した部分標本のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示している。

【００２１】 図４は、ＨＳアフィニティーカラム溶出液を処理したものと未処理のもののウ
エスタンブロット解析結果を示している。

【００２２】 図５は、ＨＳアフィニティーカラム溶出液を処理したものと未処理のものをさ
らにウエスタンブロット解析した結果を示している。

【００２３】 図６は、ＨＳアフィニティーカラム精製したＡＡＶ−ＧＦＰで形質導入された
細胞の蛍光解析の結果を示している。

【００２４】 （発明を実施するための最良の形態） （実施例） 材料および方法 クロニーングとプラスミド調製 常法（Sambrookら、１９８９年）を用いて、蛍光センサーである増強緑色蛍光
タンパク質（ＥＧＦＰ、Clonetech製）を発現プラスミドｐＢＫ−ＣＭＶ（Strat
agene製）中へＰＣＲクロニーングした。およそ２．０Ｋｂｐの非翻訳領域を含
むＧＦＰカセット（ＧＦＰのＤＮＡ断片）を、ＡＡＶ−２由来のｐＤ−１０（Wa
ngら、１９９７年）にクロニーングして、ｐＡＡＶ−ＧＦＰを得た。ｐＡＡＶ−
ヘルパーを得るために両方のＩＴＲｓを除去して、ｐＤ−１０からｒｅｐ／ｃａ
ｐトランスプラスミドを調製した。ＡＡＶ−２が、これらの実験で使用された唯
一の血清型であった。

【００２５】 細胞可溶化物を含むｒＡＡＶの調製 ｒＡＡＶを調製するために、５％ＣＯ₂存在下３７℃で、１０％ウシ胎児血清
を添加したダルベッコの改良イーグル培地［ＤＭＥＭ］（Life Technologies製
）の中で２９３細胞を樹立した。５×１０⁵個の細胞を平板培養して、９０ｍｍ
ペトリ皿の中で５０〜６０％コンフルエントな状態に至らせた。細胞を、無血清
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Life Technologies製）の中で２回洗浄した。形質転換の１
時間前に細胞を野生型Ａｄ５型に感染させ（m.o.i.＝３−５）、製造業者の指示
に従って、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中のリポフェクチン（Life Technologies製）を用
いて、ｐＡＡＶ−ＧＦＰとｐＡＡＶ−ヘルパーの１：３の混合物２５μｇによっ
て細胞を形質転換させた。３７℃で５時間インキュベートした後、ＤＮＡ／リポ
フェクチン／Ｏｐｔｉ−ＭＥＭの混合液を除去し、新しい添加済みＤＭＥＭと入
れ換えた。形質転換効率は測定しなかった。培養液は形質転換してから４日間放
置した後、上清と少量の残留細胞ペレットを回収した。次の処理に移るに先立っ
て、５６℃で１時間インキュベートし、すべての細胞可溶化物から混入Ａｄを除
去した。

【００２６】 上清はそのままにして、細胞ペレットを２ｍｌのダルベッコの改良ＰＢＳ、ｐ
Ｈ７.４（ＰＢＳ）の中に再懸濁した。そして、これらのペレットの凍結および
融解処理を３回繰り返した後、ＭＳＥベンチトップソニケーター（MSE Benchtop
sonicator）を全出力で使用して、３０秒間超音波破砕を行なった。２０００ｇ
で遠心分離して細胞残渣を沈殿させ、ここで得られた上清を最初の上清に加えた
。

【００２７】 残った細胞残渣に対し、この処理を２回まで繰り返した。

【００２８】 ＨＳアフィニティーカラム調製およびｒＡＡＶの濃縮 ＰＯＲＯＳ ＨＥ／Ｐの４．６×５０ｍｍヘパリンアフィニティーカラム（Boe
hringer Mannheim製）をＦＰＬＣ用機器（Pharmacia製）に設置して、２ｍｌ／
分の流速でカラム容量に対して５０倍量の３Ｍ ＮａＣｌによって平衡した。ｒ
ＡＡＶ精製の前に、２８０ｎｍでのバックグランドの吸光度（Ａ₂₈₀）が０．０
１よりも小さくなるように、カラム容量に対して５０倍量のＰＢＳを用いてＨＳ
アフィニティーカラムを洗浄した。ＨＳアフィニティーカラムに適用する前に、
ｒＡＡＶを含有する上清を、流速６ｍｌ／分で０．２０μｍの使い捨て濾紙（Mi
llipore製）を使用して濾過した。ＰＢＳで十分に洗浄した後、ｒＡＡＶを１０
×１ｍｌの一定分量に溶出した。当該溶出は、Ａ₂₈₀の読み取り値が適用前のレ
ベルに戻るまで継続して行ない、最終濃度１ＭのＮａＣｌを含むＰＢＳの０〜１
００％の勾配を用いて、６ｍｌ／分の流速で行なった。各クロマトグラフィー操
作の後、ＨＳアフィニティーカラムは、５０カラム容量の８Ｍ尿素により２ｍｌ
／分の流速で洗浄してから、５０カラム容量の３Ｍ ＮａＣｌにより２ｍｌ／分
の流速で洗浄し、同じバッファーの中で保存した。

【００２９】 バックグランドに対するＡ₂₈₀での増加量による検出を行いながら、タンパク
質を含有する等分量液を３７℃で１時間インキュベートするか、最終濃度０．０
２％のトリプシンとともに３７℃で１時間インキュベートするか、または、前述
と同様にトリプシンとともにインキュベートしてから等量の１,１,２−トリクロ
ロトリフルオロエタン（アークロン）（ＢＤＨ）で２回抽出した。プロテアーゼ
および溶媒で処理した後、いくつかの一定分量液をファルマシア製ＰＤ−１０脱
塩カラムにより用いて脱塩し、次いで製造業者の指示に従い、前述と同様にＨＳ
アフィニティーカラムに最適用した。

【００３０】 ポリメラーゼ連鎖反応解析 全ての反応は、下記プライマーペアについて、記載した通りに行なった。ＣＭ
Ｖプライマーは、５' ＡＴＴ ＡＣＧ ＧＧＧ ＴＣＡ ＴＴＡ ＧＴＴ ＣＡ ３'、
および５' ＡＡＴ ＧＧＧ ＧＣＧ ＧＡＧ ＴＴＧ ＴＴＡ ＣＧ ３'であった。反
応は、６０℃でのアニーリングを２８サイクル行ない、その結果４９７ｂｐの断
片が得られた。

【００３１】 全てのＰＣＲ反応前に、各試料をＤＮａｓｅで処理して、ウイルス試料から混
入ＤＮＡをすべて除去した。試料を、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１０
ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含むバッファーの中で、１０ＵのＤＮａｓ
ｅ １（Promega製）とともに３７℃で３０分間インキュベートした。ＤＮａｓｅ
を９５℃で５分間加熱して不活性化した。そして、この試料をこのまま、上記の
ＰＣＲ反応に用いた。

【００３２】 ウイルスの滴定 ２つの別々のアッセイ法を用いて行なった。 ａ）ウイルスのＣＭＶプロモーター領域に対するＰＣＲによって調製した４９７
ｂｐの前述したプローブを用いて、（Andersonら、１９９７年）（Chioriniら、
１９９５年）に記載された通りにウイルスのドットブロットによる定量化を行な
った。ドットブロットの前に、すべての試料を１０ＵのＤＮａｓｅ １（Promega
製）と３７℃で２時間インキュベートして、キャプシド形成されなかったＤＮＡ
（unencapsidated DNA）をすべて分解した。力価は、未知のウイルス画分の濃度
測定シグナル強度と、希釈した既知の標準プラスミドから得られた濃度測定シグ
ナル強度と比較することによって決定した。 ｂ）ウイルスの複製中心アッセイ法は、基本的に既述されたところにしたがって
行なったが（Einerhandら、１９９５年）、用いたアデノウイルスは、５型Ａｄ
（m.o.i.＝１５〜２０）と野生型ＡＡＶ（m.o.i.＝５）であった。

【００３３】 タンパク質アッセイ法とブロット法 全タンパク質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙを用いて測
定した。ポリアクリルアミドゲルおよびウエスタンブロットは、４〜１２％のビ
ス−トリスゲル（Novex Technologies製）を使用した以外は、既述されていると
おりに行なった（Andersonら、１９９７年）。全タンパク質のゲルを、クーマシ
ーブリリアントブルーＲ−２５０を用いて染色し、クーマシー脱染溶液（Bio-Ra
d製）で脱染した。ウエスタンブロットは、既に公表されているプロトコールに
従って（Andersonら、１９９７年）、抗ＡＡＶ Ｃａｐ抗体（Progen Clone B1製
）（Wistubaら、１９９５年）を用いて探索した。ブロットは、５０ｍＭトリス
、ｐＨ６.７、２％ＳＤＳ、および０．７５％β−メルカプトエタノールを含む
溶液を用いて、５０℃で３０分間かけて剥離した。次いで、抗アクチン抗体（Si
gma Chemicals）を用いて再探索する前に、ＰＢＳＴバッファー（０.０５％ Twe
en 20）（Ｖ／Ｖ）と５％ドライミルク（ｗ／ｖ）含有ＰＢＳ）の中でブロット
をすすいだ。

【００３４】 ウイルス感染およびフローサイトメトリー 標的細胞に感染を行なう前に、ｒＡＡＶのすべての一定分量液を、ファルマシ
アＰＤ−１０脱塩カラムを用いて脱塩した。前述した様々な改変法によって調製
したｒＡＡＶの一定分量液を、ＭＯＩが１０になるように細胞に加えた。ｒＡＡ
Ｖとインキュベートする前に、接着標的細胞を、トリプシンまたは表記のような
非酵素的細胞解離用溶液によって、培養フラスコから分離した。分離した後、細
胞は、上記のようにｒＡＡＶとインキュベートする前に、ＨＢＳＳ中で洗浄した
。ｒＡＡＶをＤＭＥＭで希釈して、細胞と一緒に３７℃で１時間インキュベート
し、その後、培地を除去して、新しいＤＭＥＭと入れ換えた。感染させてから４
８時間後に、蛍光活性化細胞スキャナー機器（ＦＡＣＳ）（FACScan-Becton Dic
kinson製）を用いて、ＧＦＰの発現を測定した。簡単に説明すると、細胞を回収
し、ハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で２回洗浄してから、フローサイト
メトリー解析を行なう前に、ＦＡＣＳＦｌｏｗ（Becton Dickinson製）に再懸濁
した。散乱光によって測定したところ、各試料から１０，０００個の生存細胞が
解析された。ネガティブコントロール用の試料は、模擬感染させた。

【００３５】 結果 溶出された一定分量液のＰＣＲ解析 ＨＳアフィニティーカラムのｒＡＡＶ精製能力を測定するために、ＡＡＶ−Ｇ
ＦＰの一定分量液を、材料および方法の項に記載したようにして調製した。

【００３６】 装填、洗浄、そしてＨＳアフィニティーカラムから溶出した後、Ａ₂₈₀におい
てバックグランドよりも高い値を示した各画分の一定分量液をＰＣＲによって解
析し、ウイルスの存在を調べた。これらの画分は、０〜０.７Ｍ ＮａＣｌという
溶出条件に対応するものである。

【００３７】 ＣＭＶプライマーを用いた図１を参照すると、バックグランドを上回るＡ₂₈₀
ピークをもつ画分が、ｒＡＡＶの存在を示す４９７ｂｐの特異的バンドを含んで
いることを明らかにすることができた。ＨＳアフィニティーカラムから溶出した
２５μｌの一定分量液をＤＮａｓｅ １とともにインキュベートしてから、材料
および方法の項に記載したようにしてＰＣＲを行なった。レーンの番号は左から
右になっている。 １）分子量マーカー、２）０〜０.１Ｍ ＮａＣｌ、３）０.１〜０.２Ｍ ＮａＣ
ｌ、４）０.２〜０.３Ｍ ＮａＣｌ、５）０.３〜０.４Ｍ ＮａＣｌ、６）０.４
〜０.５Ｍ ＮａＣｌ、７）０.５〜０.６Ｍ ＮａＣｌ、８）０.６〜０.７Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、９）開始時培養液、１０）組織培養培地、１１）ポジティブコントロール
、１２）ネガティブコントロール、および１３）分子量マーカー。分子量は、１
５００、１２００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４０
０、３００、２００、および１００ｂｐである。

【００３８】 最初の画分に存在していたのと同様、ＰＣＲの結果によれば、０.２〜０.７Ｍ
ＮａＣｌの間で採取した画分に、ｒＡＡＶが存在することが証明された。

【００３９】 ＨＳアフィニティーカラム溶出分画の純度測定 ＡＡＶを含む画分の精製度を測定するために、各画分の一定分量について、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行なった。結果を図２に示す。ＨＳアフィニテ
ィーカラムから溶出した２５μｌの一定分量液を、還元条件下、４〜１２％ビス
−トリスゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ゲルはクーマシーブ
リリアントブルーで染色し、脱染溶液（Bio-Rad製）で脱染した。

【００４０】 レーンの番号は左から右になっている。 １）０〜０.１Ｍ ＮａＣｌ、２）０.１〜０.２Ｍ ＮａＣｌ、３）０.２〜０.３
Ｍ ＮａＣｌ、４）０.３〜０.４Ｍ ＮａＣｌ、５）０.４〜０.５Ｍ ＮａＣｌ、
６）０.５〜０.６Ｍ ＮａＣｌ、７）０.６〜０.７Ｍ ＮａＣｌ、８）開始時培養
液、および９）組織培養培地。分子量はｋＤａで示してある。

【００４１】 図２のレーン１と２は、最高０.２ＭのＮａＣｌを用いると、ＨＳアフィニテ
ィーカラムから検出可能なタンパク質が溶出されなかったことを示している。Ｐ
ＣＲを用いても、これらの画分からはｒＡＡＶの存在を検出することができなか
った。

【００４２】 ０.２〜０.７Ｍ ＮａＣｌに対応する画分では、ＰＣＲによってｒＡＡＶの存
在が検出され、これらの画分にほとんどのタンパク質が含まれていた（レーン３
〜７）。主要なタンパク質ピークは、約０.３５Ｍ ＮａＣｌのところで溶出した
（データは示されていない）。

【００４３】 溶出後各試料中に存在するタンパク質の総量は、開始時の試料中に存在した総
量よりも少ない。このことは、ＨＳアフィニティーカラムが、タンパク質濃度に
関して、試料中のｒＡＡＶの純度を高めることができることを示している。これ
を表１に示す。しかしながら、純粋なＡＡＶの一定分量液には、ＶＰ１、ＶＰ２
およびＶＰ３に相当する９０、７２、および６０ｋＤａの３種類のタンパク質の
みが１：１：１０の比率で回収されるはずである（Ruffingら、１９９２年）。
これは、明らかに、ＨＳアフィニティーカラムの見かけの特異性にも拘わらず、
これら画分のそれぞれにさまざまな分子量のタンパク質夾雑物が存在しているこ
とを示している。

【００４４】 ＨＳアフィニティーカラム溶出物の純度の向上 物理的変化および化学薬品に対してＡＡＶが高度に安定しているため（Bachma
nnら、１９７９年）、本発明者らは、ｒＡＡＶの完全性を保持しつつ、上記画分
中に見られる余分な夾雑物を分解できるのではないかと判断した。

【００４５】 図２で使用した各試料の一定分量液を、材料および方法の項に記載したように
して、トリプシンで分解しそしてアークロン（Arklone）により抽出し、ポリア
クリルアミドゲルで再泳動を行ない、全タンパク質についてクーマシーブリリア
ントブルーで染色した。これらの結果を図３に示す。ＨＳアフィニティーカラム
から溶出した２５μｌの一定分量液を、トリプシンおよびアークロンで処理した
後、還元条件下で、４〜１２％ビス−トリスゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
って分離した。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色し、脱染溶液（Bio-
Rad製）で脱染した。

【００４６】 レーン番号は左から右に、 １）０〜０.１Ｍ ＮａＣｌ、２）０.１〜０.２Ｍ ＮａＣｌ、３）０.２〜０.３
Ｍ ＮａＣｌ、４）０.３〜０.４Ｍ ＮａＣｌ、５）０.４〜０.５Ｍ ＮａＣｌ、
６）０.５〜０.６Ｍ ＮａＣｌ、７）０.６〜０.７Ｍ ＮａＣｌ、８）開始時培養
液、および９）組織培養培地。分子量はｋＤａで示してある。

【００４７】 これらの処理の結果、ほとんどのタンパク質分子種の相当量が除去できた。実
際、トリプシンおよびアークロンで処理した後、レーン３では、２種類のタンパ
ク質だけしか見えないようになる。レーン３における主要な分子種は約７０ｋＤ
ａであり、微量の分子種は約６０ｋＤａの分子量である。ＡＡＶは、９０、７２
、および６０ｋＤａの３種類のキャプシドタンパク質を持っているため、これら
はＡＡＶのキャプシドタンパク質と思われる（Ruffingら、１９９２年）。

【００４８】 複数のレーンに見られる約３０ｋＤａのバンドは、図２のブロットには見られ
なかった。トリプシンの分子量が約２８ｋＤａであることから、これらのバンド
は、トリプシンか、トリプシンの多量体であろう。

【００４９】 ＡＡＶのキャプシドタンパク質とは思われないこれらの分子種は低分子量であ
るため、アークロンによる処理ではこれらを除去することできなかった。そのた
め、これらの画分を再びＨＳアフィニティーカラムに通して、試料の純度を高め
た。

【００５０】 プロテアーゼ分解と溶媒抽出後の試料分析、および２回目のＨＳアフィニティ ーカラム溶出 トリプシン分解とアークロン抽出後も残留している高分子量タンパク質分子種
が、ｒＡＡＶのキャプシドタンパク質であるか否かを測定するために、ＡＡＶの
３種類のキャプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３（Ruffingら、１
９９２年）を認識する抗−ＡＡＶ ｃａｐ抗体（クローンＢ１（Wistubaら、１９
９５年））を用いてウエスタンブロットを行なった。その結果を図４に示す。全
ての試料は、ドットブロット解析によって測定したＤＮＡ濃度について等量にな
るようにロードした。

【００５１】 下記に示す試料を、還元条件下、４〜１２％ビス−トリスゲルを用いて、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより分離した。ポリペプチドをニトロセルロースに移動させ、Ｖ
−Ｐ１、ＶＰ−２およびＶ−Ｐ３を認識する抗ｃａｐ抗体を用いて探索した。

【００５２】 レーン番号は左から右に、 １）開始時培養液、２）ＨＳアフィニティーカラム後の画分をまとめたもの、３
）ＨＳアフィニティーカラムおよびトリプシンでインキュベーションした後の画
分をまとめたもの、４）ＨＳアフィニティーカラム、トリプシンインキュベーシ
ョン、およびアークロン抽出後の画分をまとめたもの、５）２回目のＨＳアフィ
ニティーカラム流下後の画分をまとめたもの、６）ＣｓＣｌ遠心分離によって調
製したＡＡＶ。分子量はｋＤａで示してある。

【００５３】 図４のレーン１は、３種類のキャプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶ
Ｐ３が、予想された１：１：１０の比率で開始時の材料に存在していることを示
している。これらのタンパク質は、レーン２のＨＳアフィニティーカラムからの
溶出液中にも依然存在している。この試料をトリプシン処理したものであるレー
ン３は、ＡＡＶのキャプシドタンパク質が依然試料中に残っていることを示して
いる。この観察結果は、アークロン処理後（レーン４）、および２回目のＨＳア
フィニティーカラム溶出後のレーン５でも同様であった。レーン６の試料は、Ｃ
ｓＣｌ遠心分離によって精製されたｒＡＡＶである。

【００５４】 ＨＳアフィニティーカラムとそれに続く処理が、細胞残渣を除去したことを証
明するために、図４に示したブロットを剥離し、図５に示すように、抗アクチン
抗体を用いて探索した。過剰に曝露した後でも、アクチンは、開始時材料である
レーン１でしか検出されず、精製後試料であるレーン２〜５のいずれでも検出さ
れなかった。予想通り、ＣｓＣｌ精製した試料であるレーン６には、アクチンは
存在しなかった。

【００５５】 ｒＡＡＶを調製するためのＨＳアフィニティーカラムの効率 精製のさまざまな段階で一定分量液を採取して、ドットブロット解析によって
測定しながら、全タンパク質およびｒＡＡＶゲノムの存在を測定した。１回目に
試料をＨＳアフィニティーカラムに通すと、存在するタンパク質は処理開始時量
の９８.７％が減少した一方で、ｒＡＡＶゲノムの数は３.３％が減少したに過ぎ
なかった。トリプシン処理の効果、トリプシンそのものの存在と、ＡＡＶゲノム
の僅かな減少が原因となって、タンパク質濃度が上昇した。アークロン処理の効
果は、さらに、処理開始時タンパク質量の７９％が減少することであるが、ｒＡ
ＡＶゲノム量の９.７％の減少を伴っていた。２回目にＨＳアフィニティーカラ
ムに通すことの効果は、存在するタンパク質量の６１.９％が減少し、ｒＡＡＶ
ゲノムの数は、処理開始時の数と較べると、３４．７％まで減少したことである
。これらのデータを、表１および表２に示す。

【００５６】 トリプシン処理およびアークロン抽出したウイルスの様々な一定分量液を、複
製中心アッセイ法を用いて測定した。これらのデータを、図３に示す。

【００５７】 精製されたｒＡＡＶベクターの機能解析 最後に、ＨＳアフィニティーカラム精製、トリプシンによる分解およびアーク
ロン抽出によって精製されたｒＡＡＶを用いて、本発明者らは、２９３細胞に感
染させて、前述したＦＡＣＳを用いてＧＦＰの存在を観察した。結果を図６に示
す。細胞は、模擬感染させるか、ＨＳアフィニティーカラム精製、トリプシン消
化およびアークロン抽出を行なったＡＡＶを１０：１のＭＯＩで感染させた。細
胞は、感染後４８時間経過したところで解析した。結果は、ｌｏｇ₁₀間隔で示し
た蛍光強度によるヒストグラムで表した。

【００５８】 実線のヒストグラムは、模擬感染した２９３細胞を示し、灰色の２つめのヒス
トグラムは、細胞のトリプシン処理は発現を消失させる効果があることを示し、
３つめのひし形を施したヒストグラムは、細胞を非酵素的に処理することによっ
てＡＡＶ−ＧＦＰを発現させることができることを示し、最後の白抜きのヒスト
グラムは、細胞を前処理することなくＡＡＶ−ＧＦＰを添加したときの効果を示
している。実線のヒストグラムは、模擬感染した細胞を示し、後ろの白抜きのヒ
ストグラムは、ＡＡＶ−ＧＦＰを添加したときの効果を示しているが、ここでは
、４８時間後に１５.４％の細胞が陽性になった。これは、精製処理の後もウイ
ルスが完全な状態で調製され、細胞によって取り込まれ得るたことを示している
。ウイルス添加の直前にトリプシンによって前処理された２９３細胞がＧＦＰの
発現を示さなかったことから、ウイルスの取り込みは、レセプターを介して行な
われていることが実証された（図６、灰色で斜線を施した２番目のヒストグラム
）。細胞をトリプシン処理すると、ウイルスの取り込みを阻止できることが以前
に示されていた（Mizukamiら、１９９６年）。非酵素的細胞解離液を用いて細胞
を前処理すると、未処理の細胞に較べてウイルスの発現が僅かに減少することが
明らかになったが、ＧＦＰ陽性を示す細胞は、依然多数（１４.１％）あった（
図６、灰色で、ひし形を施した３番目のヒストグラム）。

【００５９】 考察 最近の刊行物のいくつかで、パッケージングを行なう細胞株により産生される
ｒＡＡＶ量を増加させる改良法が報告されている（Vincentら、１９９７年；Li
ら、１９９７年；InoueとRussell、１９９８年）。しかし、ｒＡＡＶストックの
大部分はＣｓＣｌ勾配遠心を用いて調製されるため、ｒＡＡＶの精製に関する刊
行物は殆どなかった。

【００６０】 高度に精製されたベクターのストックは、in vivo実験にとっては重要である
が、さらに別の利益となる可能性がある。精製度が低いｒＡＡＶは、偽形質導入
（pseudotransduction）と名付けられた現象の原因となる（Alexanderら、１９
９７年）が、この現象は、ｒＡＡＶベクターのストック中に存在する生物活性ペ
プチドが、ウイルス粒子とは無関係な形で標的細胞の中に転移したときに起こる
。この偽形質導入については、β−ガラクトシダーゼやアルカリホスファターゼ
などのレポーター遺伝子を使用するときには、特に留意すべきである。

【００６１】 従来からのＣｓＣｌ精製法の主な制約となるのは、精製過程の長さと、各操作
において、少量のｒＡＡＶしか精製できないことである。二重ＣｓＣｌ染色法を
用いたｒＡＡＶ精製法は、４８時間もかかる。一回の操作で精製できるベクター
の容量が限定されている結果、ほとんどのｒＡＡＶ調製用プロトコールでは、形
質転換３日後に産生細胞を回収することとなるが、その時点では、ｒＡＡＶのほ
とんどが依然細胞に結合している。最近の論文によれば、形質転換後４日目の方
がより高い力価のｒＡＡＶを得られることが明らかにされた（ChiricoとTrempe
、１９９９年）。しかしこの時点では、ウイルスは溶解した細胞から遊離して細
胞上清に移って行くため、実質的なウイルス力価は細胞と関連していないもので
あった。このことは、ＣｓＣｌ勾配を用いてｒＡＡＶを精製するときに不利にな
る点である。

【００６２】 最近のデータでは、負に荷電したセルロース親和性媒質であるセルファイン硫
酸を使用することによって、ＣｓＣｌに見られる問題点の多くは克服できること
が示された（Tamayoseら、１９９６年）。他のタンパク質および残渣は洗い流さ
れる一方で、ウイルスはマトリックスに結合するので、濃縮され精製されたウイ
ルス画分を溶出することが可能になる。この技術は、ＣｓＣｌ勾配よりもより迅
速により大量の試料を処理することができるが、ｒＡＡＶを含む溶出液には別の
タンパク質が混入している。その他の文献によれば、Tamayoseらは、彼らの最初
の報告において、セルファイン硫酸のみを使用したアフィニティークロマトグラ
フィーだけでは、ｒＡＡＶを高度に精製することはできないと記載している（Ta
mayoseら、１９９６年）。しかしながら、アフィニティーカラム精製の原理は確
立された。

【００６３】 ＨＳＰＧによるＡＡＶの細胞侵入が発見されたことによって（SummerfordとSa
mulski、１９９８年）、ｒＡＡＶを精製するために特定のＨＳアフィニティーカ
ラムを使用することが可能になった。ＣｓＣｌに基づく精製法とは異なり、カラ
ム精製技術を使用するときには、産生細胞が完全に破壊されることは好都合であ
る。この完全な細胞溶解によって、産生されたｒＡＡＶのすべての回収が確実に
なる。

【００６４】 しかし残念なことに、ＨＳアフィニティーカラムから得られる純度が最初は低
いため、高品質のウイルスを調製するためにＨＳアフィニティーカラムクロマト
グラフィーのみが使用されることはない。そこで本発明者らは、ｒＡＡＶと共精
製され得るポリペプチドや他の夾雑物を除去するために、トリプシン分解した後
、有機溶媒による抽出を行ない得るかを調べた。ｒＡＡＶのキャプシドは、完全
に形成されてしまった場合にはトリプシン耐性であるが、個々のｃａｐポリペプ
チドはトリプシン感受性である（Anderson−未発表の観察結果）。有機溶媒の１
,１,２−トリクロロトリフルオロエタン（アークロン）が、従来、Ａｄの精製に
用いられていた（PreciousとRussell、１９８５年）。これらの付加的工程をＨＳ
アフィニティーカラムプロトコールに導入することによって、本発明者らは、ウ
イルスストックの完全性を保持したままで、ウイルス調製物からほとんどのタン
パク質夾雑物を取り除くことができた。

【００６５】 ｒＡＡＶは、相当数の空の粒子を含んでいることが知られているため（Laughl
inら、１９７９年）、トリプシン工程を加えることによって、これらの粒子を除
去し、最終調製物に存在するタンパク質の量を減少させることになるかもしれな
い。複製中心アッセイ法によって測定した感染性粒子と、ドットブロット法で測
定したゲノムとの割合は、常に５０よりも低く、ＡＡＶのアフィニティー精製に
関する文献中でこれまでに報告されている割合よりも優れている。

【００６６】 この精製技術は、すべてのｒＡＡＶ調製物に応用可能であり、精製速度が速く
大量処理が可能であるなど、ＣｓＣｌ勾配法に対するＨＳアフィニティーカラム
精製技術の有利性を保持しつつ、最終産物が不純であるという、ＨＳアフィニテ
ィーカラムの主要な欠点を克服した。本発明者らは、ＨＳアフィニティーカラム
クロマトグラフィーは、これらの改変法とともに、大量のｒＡＡＶベクターを精
製および濃縮する際に、ＣｓＣｌ勾配法に取って代わるようになると確信してい
る。

【００６７】 （参考文献） Alexander, I.E., Russell D.W. and Miller, A.D. （１９９７年） 夾雑物をアデノ随伴ウイルスのストック中へ導入すると、形質転換と類似の現象
が生じ、人為的な産物が生成し得る。 「Human Gene Therapy」，第８(１６）号，第１１９１〜１９２０頁。

【００６８】 Anderson, R.J., Macdonald, I. D., Corbett, T. J., Hacking, G., Lowdell
, M.W. and Prentice, H.G.（１９９７年） ＩＬ１２融合タンパク質（Flexi-12）の構築と生物学的同定：アデノ随伴ウイル
スを使用した急性骨髄性白血病芽へのデリバリー 「Human Gene Therapy」，第８(９)号，第１１２５〜１１３５頁。

【００６９】 Bachmann, P.A., Hoggan, M.D., Kurstak, E., Melnick, J.L., Pereira, H.G
., Tattersall, P and Vago, C.（１９７９年） Parvoviridae: second report.「Intervirology」，第１１号，第２４８〜２５
４号。

【００７０】 Chiorini, J.A., Wendtner, C.M., Urcelay, E., Safer, B., Hallek, M. and
Kotin, R.M.（１９９５年） 高力価の組み換えアデノ随伴ウイルスベクターを用いたＴ細胞共刺激分子である
Ｂ７−２の白血病細胞への効率的なデリバリー 「Human Gene Therapy」，第６号，第１５３１〜１５４１頁。

【００７１】 Chirico, J. and Trempe, J.P.（１９９９年） プラスミドのトランスフェクションを使用した、アデノ随伴ウイルス遺伝子治療
用ベクターのパッケージングの最適化 「Journal of Virological Methods」，第７６(１-２)号，第３１〜４１頁。

【００７２】 Clark, K.R., Liu, X., McGrath, J.P.& Johnson, P.R.（１９９９年） 高度に精製された組み換えアデノ随伴ウイルスベクターは、生物学的に活性であ
り、ディフェクタブルヘルパーと野生型ウイルスの影響を受けない。 「Hum. Gene Therapy」，第１０号，第１０３１〜１０３９頁。

【００７３】 Einerhand, M.P.W., Antoniou, M., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Berns,
K.I., Grosveld, F. and Valerio, D.（１９９５年） 組み換えアデノ随伴ウイルス介在遺伝子の転移に続く、赤血球細胞における制御
された高レベルヒトβグロブリン遺伝子発現 「Gene Therapy」，第２号，第３３６〜３４３頁。

【００７４】 Inoue, N. and Russell, D.W.（１９９８年） アデノ随伴ウイルスベクターの調製のための、誘導可能な遺伝子の増幅に基づく
パッケージング細胞 「Journal of Virology」，第７２号，第７０２４〜７０３１頁。

【００７５】 Li, J., Samulski, R.J. and Xiao, X.（１９９７年） アデノ随伴ウイルスベクターの調製における、高度に制御されたｒｅｐ遺伝子発
現の役割 「Journal of Virology」，第７１号，第５２３６〜５２４３頁。

【００７６】 Mizukami, H., Young, N.S. and Brown, K.E.（１９９６年） アデノ随伴ウイルス２型は、１５０キロダルトンの細胞表面グロブリンに結合す
る。 「Virology」，第２１７号，第１２４〜１３０頁。

【００７７】 Precious, B. and Russell, W.C.（１９８５年） アデノウイルスの成育と精製と力価 In: Mahy, B.W.J.,(Ed.) 「Virology, A Practical Approach.」 Oxford: IRL P
ress, 第１９３〜２０６頁。

【００７８】 Ruffing, M., Zentgraf, H. and Kleinschmidt, J.A.（１９９２年） 昆虫細胞におけるアデノ随伴ウイルスの組み換え構造タンパク質によるウイルス
様粒子の集合 「Journal or Virology」，第６６号，第６９２２〜６０３０頁。

【００７９】 Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T.（１９８９年） 「Molecular Cloning A Laboratory Manual Second Edition」, Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press。

【００８０】 Summerford, C. and Samulski, R.J.（１９９８年） 膜結合性ヘパラン硫酸プロテオグリカンは、アデノ随伴ウイルス２型のウイルス
粒子のレセプターである。 「Journal of Virology」，第７２号，第１４３８〜１４４５頁。

【００８１】 Tamayose, K., Hirai, Y. and Shimada, T.（１９９６年） パッケージ細胞株と硫酸化セルソースカラムクロマトグラフィーを使用する、高
力価の組み換えアデノ随伴ウイルスベクターの大容量調整に関する新しい戦略。
「Human Gene Therapy」，第７号，第５０７〜５１３頁。

【００８２】 Vincent, K.A., Piraino, S.T. and Wadsworth, S.C.（１９９７年） 組み換えアデノ随伴ウイルスパッケージの分析とｒｅｐおよびｃａｐ産物の必要
性。 「Journal of Virology」，第７１号，第１８９７〜１９０５頁。

【００８３】 Wang, X.S., Qing, K., Ponnazhagan, S. and Srivastava, A.（１９９７年）
in vivoにおけるアデノ随伴ウイルス２型ＤＮＡの複製：ウイルスの変換された
末端繰り返しにおけるＤ配列の変異分析。 「Journal of Virology」，第７１号，第３０７７〜３０８２頁。

【００８４】 Wistuba, A., Weger, S., Kern, A. and Kleinschmidt, J.A.（１９９５年）
アデノ随伴ウイルス２型集合体の中間体：ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質を含む
可溶化物の同定。 「Journal of Virology」，第６９号，第５３１１〜５３１９頁。

【００８５】 Zolotukhin, S., Bryne, B.J., Mason, E., Zolotukhin, M., Potter, M., Ch
esnut, K and Summerford, S.（１９９９年） 新規な方法を用いた組み換えアデノ随伴ウイルス精製は、感染の力価と収率を改
良する。 「Gene Therapy」，第６号，第９７３〜９８５頁。

【００８６】

【表１】

【００８７】

【表２】

【００８８】

【表３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B065 AA95X BD09 BD14 BD45 CA14

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アデノ随伴ウイルスを精製する方法であって、 （１）アデノ随伴ウイルスがマトリックスに結合する条件下で不純ウイルス試料
   をアフィニティマトリックスに適用する工程であって、当該アフィニティマトリ
   ックスが、ウイルスへの結合においてヘパラン硫酸と競合することができる吸着
   体を構成要素とするものである工程； （２）マトリックスから夾雑物を溶出させて、ウイルスを多量に含むマトリック
   スを調製する工程； （３）ウイルスを多量に含むマトリックスからウイルスを溶出する工程； （４）溶出したウイルスを、完全なウイルスは分解することができないプロテア
   ーゼで処理して、タンパク質性夾雑物を分解する工程；および、 （５）分解されたタンパク質性夾雑物から完全なウイルスを分離する工程とを含
   む方法。
2. 【請求項２】上記アデノ随伴ウイルスが、血清型２のアデノ随伴ウイルスで
   ある請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】上記吸着体が、ヘパラン硫酸またはその類似化合物を含む請求
   項１または２に記載の方法。
4. 【請求項４】上記吸着体が、グリコサミノグリカンを含む請求項３に記載の
   方法。
5. 【請求項５】上記グリコサミノグリカンが、ヘパリンを含む請求項４に記載
   の方法。
6. 【請求項６】上記工程（３）が、ウイルスを溶出するのに十分なイオン強度
   を有する溶液により、該ウイルスを多量に含むマトリックスを洗浄する工程を含
   む請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. 【請求項７】上記プロテアーゼが、トリプシンを含む請求項１〜６のいずれ
   かに記載の方法。
8. 【請求項８】上記工程（５）が、水と非混和性の有機溶媒によって完全なウ
   イルスを抽出する工程を含む請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. 【請求項９】上記水と非混和性の有機溶媒が、ハロゲン化アルカン溶媒であ
   る請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】上記工程（５）が、工程（１）〜（３）を繰り返すことを含
    む請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
11. 【請求項１１】上記不純ウイルス試料が、アデノ随伴ウイルス産生細胞可溶
    化物を含む請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
12. 【請求項１２】上記アデノ随伴ウイルス産生細胞を、少なくとも１回の凍結
    ／融解サイクルに付する請求項１１に記載の方法。