JP2003512607A - ムスカリン受容体のアロステリック部位 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
ムスカリン受容体のアロステリック部位を、アセチルコリンなどの一次リガンドの受容体との結合を調節可能である化合物のスクリーニングのためのその使用とともに開示する。本明細書において該部位は式(1)で表される一連のインドロカルバゾールおよび式(2)によって表される一連の関連化合物によって特性決定される。これらの化合物はアロステリック部位に結合して一次リガンドの受容体との結合を調節することができ、ムスカリン受容体サブタイプについて正、負および中立協同性ならびに選択性を示す。
Description
【０００１】発明の分野
本発明はムスカリン受容体、特にムスカリン受容体のアロステリック部位と結
合し、アセチルコリンなどの一次リガンドの受容体との結合を調節できる化合物
に関する。本発明はさらにアロステリック部位と結合する化合物の同定に役立つ
方法および薬物療法におけるその使用に関する。
合し、アセチルコリンなどの一次リガンドの受容体との結合を調節できる化合物
に関する。本発明はさらにアロステリック部位と結合する化合物の同定に役立つ
方法および薬物療法におけるその使用に関する。
【０００２】発明の背景
5種のムスカリン受容体サブタイプはM1〜M5と示され、すべてがアセチルコリ
ン(ACh)の結合によって活性化される。受容体サブタイプは中枢神経系におよび
末梢に広く分布しており、そこでそれらはいくつかの重要な生理学的機能を媒介
する。ゆえに、これらの受容体は種々の症状を治療するための治療標的であり、
可能性ある治療薬にはアゴニストとアンタゴニストの両者がある。多数の症状の
治療において、治療薬は1種または限定された数のサブタイプに対して選択的に
作用することが重要であると考えられている。しかしながら当技術分野には、AC
h結合部位、すなわち、アゴニストおよび競合アンタゴニストの結合部位を構成
すると考えられる配列領域のアミノ酸同定の結果からムスカリン受容体サブタイ
プは構造的に極めて類似しているという問題が残っている。従って、極めて選択
的なムスカリンアンタゴニストを合成することはできず、実質的選択性を有する
直接作用性ムスカリンアゴニストは存在しない(CaulfieldおよびBirdsall, 1998
)。さらなる問題として、外用される合成アゴニストは受容体を慢性的に刺激し
、これが受容体機能の脱感作およびダウンレギュレーションならびに拍動性内因
性AChシグナル伝達機構に関する何らかの情報量の減少をもたらす可能性がある
ということがある。
ン(ACh)の結合によって活性化される。受容体サブタイプは中枢神経系におよび
末梢に広く分布しており、そこでそれらはいくつかの重要な生理学的機能を媒介
する。ゆえに、これらの受容体は種々の症状を治療するための治療標的であり、
可能性ある治療薬にはアゴニストとアンタゴニストの両者がある。多数の症状の
治療において、治療薬は1種または限定された数のサブタイプに対して選択的に
作用することが重要であると考えられている。しかしながら当技術分野には、AC
h結合部位、すなわち、アゴニストおよび競合アンタゴニストの結合部位を構成
すると考えられる配列領域のアミノ酸同定の結果からムスカリン受容体サブタイ
プは構造的に極めて類似しているという問題が残っている。従って、極めて選択
的なムスカリンアンタゴニストを合成することはできず、実質的選択性を有する
直接作用性ムスカリンアゴニストは存在しない(CaulfieldおよびBirdsall, 1998
)。さらなる問題として、外用される合成アゴニストは受容体を慢性的に刺激し
、これが受容体機能の脱感作およびダウンレギュレーションならびに拍動性内因
性AChシグナル伝達機構に関する何らかの情報量の減少をもたらす可能性がある
ということがある。
【０００３】
しかしながら、アゴニストおよび競合アンタゴニストが結合するこれらの受容
体の一次部位の他に、ムスカリン受容体はアロステリック部位も含むことが知ら
れている。アロステリック部位で結合する化合物はリガンドの一次結合部位との
結合を媒介する(GB 2 292 685 AおよびWO96/03377)。従って、アロステリック部
位で結合する化合物はムスカリン受容体サブタイプの選択的調節に関するこれら
の問題のいくつかを克服し得る可能性がある。例として、ブルシンおよびそのN-
置換類似体のいくつかがアロステリック部位で結合する場合には、それらは一次
リガンドアセチルコリン(ACh)またはN-メチルスコポラミン(NMS)、AChの競合ア
ンタゴニストに対するムスカリン受容体の応答を調節するということが知られて
いる。アロステリック部位で結合する化合物によって引き起こされる調節は正、
負または中立であり得る。ある種のムスカリン受容体サブタイプでAChと中立協
同性を有する化合物は受容体と結合するがいずれの濃度でも全く作用しない。こ
れに対し、同一リガンドが別のサブタイプで正または負の協同性を有する場合に
は、そのサブタイプで完全に選択的な作用を及ぼす。協同性に基づくこの形態の
選択性は「絶対サブタイプ選択性」と呼ぶことができる。従って、アロステリッ
ク剤はムスカリン受容体と一次リガンド間の相互作用を調節し得る。
体の一次部位の他に、ムスカリン受容体はアロステリック部位も含むことが知ら
れている。アロステリック部位で結合する化合物はリガンドの一次結合部位との
結合を媒介する(GB 2 292 685 AおよびWO96/03377)。従って、アロステリック部
位で結合する化合物はムスカリン受容体サブタイプの選択的調節に関するこれら
の問題のいくつかを克服し得る可能性がある。例として、ブルシンおよびそのN-
置換類似体のいくつかがアロステリック部位で結合する場合には、それらは一次
リガンドアセチルコリン(ACh)またはN-メチルスコポラミン(NMS)、AChの競合ア
ンタゴニストに対するムスカリン受容体の応答を調節するということが知られて
いる。アロステリック部位で結合する化合物によって引き起こされる調節は正、
負または中立であり得る。ある種のムスカリン受容体サブタイプでAChと中立協
同性を有する化合物は受容体と結合するがいずれの濃度でも全く作用しない。こ
れに対し、同一リガンドが別のサブタイプで正または負の協同性を有する場合に
は、そのサブタイプで完全に選択的な作用を及ぼす。協同性に基づくこの形態の
選択性は「絶対サブタイプ選択性」と呼ぶことができる。従って、アロステリッ
ク剤はムスカリン受容体と一次リガンド間の相互作用を調節し得る。
【０００４】発明の要約
広義には、本発明は、ムスカリン受容体がさらなるアロステリック部位を有す
るという発見に関し、この部位は本明細書において化合物1a、および式1で表さ
れる一連の関連インドロカルバゾール、ならびに化合物2aおよび2b、および式2
で表される一連の関連化合物を用いて特性決定される。これら化合物はアロステ
リック部位と結合して一次リガンドの受容体との結合を調節でき、ムスカリン受
容体サブタイプに対して正、負および中立協同性ならびに選択性を示す。
るという発見に関し、この部位は本明細書において化合物1a、および式1で表さ
れる一連の関連インドロカルバゾール、ならびに化合物2aおよび2b、および式2
で表される一連の関連化合物を用いて特性決定される。これら化合物はアロステ
リック部位と結合して一次リガンドの受容体との結合を調節でき、ムスカリン受
容体サブタイプに対して正、負および中立協同性ならびに選択性を示す。
【０００５】
式1：
【化１】
｛式中、
R1は水素、低級アルキル、アラルキル、イミノアルキルまたはアシル基R19CO
（ここで、R19はアルキルまたはアラルキルである）などのイミノ保護基であり
； R2およびR3は独立に酸素または2個の水素原子であり； R4〜R11は独立に水素または一般的な芳香族置換基、例えば、ハロ、ニトロ、
シアノ、低級アルキル、ハロアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アラルコキシ
から選択され； R12はHまたは低級アルキルであり； XはCH2、 CH(OR16)（ここで、R16は水素、低級アルキルまたはO-保護基である）、 CH(OR16)-CH(OR16)、 CH(OR16)-CH(CH2)n-N(R17)2（ここで、nは0〜5の間の整数であり、かつ、R 17 は以下のもの；アルキル、アラルキルの1種または2種である）であり； R14は水素、OR16、NHR17（ここで、R17はアルキル、ハロアルキル、アラルキ
ルまたはアシル基である）であり； ｍは0〜8の間の整数であり；かつ、 R15は水素、CO2R18、CONHR18またはエステルもしくは置換エステルの同配体(i
sostere)（ここで、R18は水素、アルキルまたは置換アルキル、アラルキルまた
は置換アラルキルである）である｝ で表される化合物。
（ここで、R19はアルキルまたはアラルキルである）などのイミノ保護基であり
； R2およびR3は独立に酸素または2個の水素原子であり； R4〜R11は独立に水素または一般的な芳香族置換基、例えば、ハロ、ニトロ、
シアノ、低級アルキル、ハロアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アラルコキシ
から選択され； R12はHまたは低級アルキルであり； XはCH2、 CH(OR16)（ここで、R16は水素、低級アルキルまたはO-保護基である）、 CH(OR16)-CH(OR16)、 CH(OR16)-CH(CH2)n-N(R17)2（ここで、nは0〜5の間の整数であり、かつ、R 17 は以下のもの；アルキル、アラルキルの1種または2種である）であり； R14は水素、OR16、NHR17（ここで、R17はアルキル、ハロアルキル、アラルキ
ルまたはアシル基である）であり； ｍは0〜8の間の整数であり；かつ、 R15は水素、CO2R18、CONHR18またはエステルもしくは置換エステルの同配体(i
sostere)（ここで、R18は水素、アルキルまたは置換アルキル、アラルキルまた
は置換アラルキルである）である｝ で表される化合物。
【０００６】
式2：
【化２】
｛式中：
XはN(H)またはC(H)であり：
R1、R2は独立に水素、一般的な芳香族置換基、例えば、ハロ、ニトロ、シアノ
、低級アルキル、ハロアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アラルコキシであり
； R3は水素、アルキル、イミノアルキル、またはアラルキルであり； R1およびR2はともに、かつ／またはR2およびR3はともに所望により環置換基を
含んでもよい縮合芳香系または複素環系であり； R4、R5、R6は通常の芳香族置換基であるか； あるいは、R5、R6はともにステロイド環系をはじめとする1〜5個の環を含む、
好ましくは17αおよび17β位のいずれかまたは双方に置換基、例えば、ヒドロキ
シ、アルコキシ、アラルコキシ、アルキル、アルケニル、またはアルキニルを含
む縮合脂環系であり、かつ、R4は合成法に適合する置換基であり； あるいは、R5、R6はともに1〜5個の環を含む縮合脂環系であり、かつ、R4は水
素またはアルキル基であり； あるいはR4、R5、R6は縮合脂環系の一部であり； また、破線は結合の有無のいずれかを示す｝ で表される化合物。
、低級アルキル、ハロアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アラルコキシであり
； R3は水素、アルキル、イミノアルキル、またはアラルキルであり； R1およびR2はともに、かつ／またはR2およびR3はともに所望により環置換基を
含んでもよい縮合芳香系または複素環系であり； R4、R5、R6は通常の芳香族置換基であるか； あるいは、R5、R6はともにステロイド環系をはじめとする1〜5個の環を含む、
好ましくは17αおよび17β位のいずれかまたは双方に置換基、例えば、ヒドロキ
シ、アルコキシ、アラルコキシ、アルキル、アルケニル、またはアルキニルを含
む縮合脂環系であり、かつ、R4は合成法に適合する置換基であり； あるいは、R5、R6はともに1〜5個の環を含む縮合脂環系であり、かつ、R4は水
素またはアルキル基であり； あるいはR4、R5、R6は縮合脂環系の一部であり； また、破線は結合の有無のいずれかを示す｝ で表される化合物。
【０００７】
好ましくは、前記の一般的に定義される置換基はC1〜C10であり、または低級
アルキル置換基の場合には、C1〜C6であり；いずれの場合にも、所望により分枝
および／またはハロゲン置換を含んでもよい。
アルキル置換基の場合には、C1〜C6であり；いずれの場合にも、所望により分枝
および／またはハロゲン置換を含んでもよい。
【０００８】
化合物1a、2aおよび2bの式は本明細書の末尾に示されている。
【０００９】
従って、第1の態様では、本発明は薬物療法に使用するための式１または2で表
される化合物を提供する。
される化合物を提供する。
【００１０】
さらなる態様では、本発明は一次リガンドのムスカリン受容体との結合によっ
て媒介される症状を治療するための医薬の製造のための化合物の使用を提供し、
この化合物は化合物1aおよび／または2aと結合可能であるムスカリン受容体のア
ロステリック部位と結合し、それによって一次リガンドのムスカリン受容体との
結合を調節する。好ましい化合物としては式１または2で表されるものが挙げら
れる。
て媒介される症状を治療するための医薬の製造のための化合物の使用を提供し、
この化合物は化合物1aおよび／または2aと結合可能であるムスカリン受容体のア
ロステリック部位と結合し、それによって一次リガンドのムスカリン受容体との
結合を調節する。好ましい化合物としては式１または2で表されるものが挙げら
れる。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、ムスカリン受容体を化合物1aおよび／または2a
と結合可能であるムスカリン受容体のアロステリック部位と結合することによっ
て一次リガンドのムスカリン受容体との結合を調節する化合物と接触させること
を含んでなる、一次リガンドに対するムスカリン受容体の応答を調節する方法を
提供する。この方法はin vitroで、例えば、スクリーニング法の一部として、ま
たはその他の場合に受容体の応答を活性化もしくは調節するために、あるいは、
in vivoで、例えば、本明細書に記載される症状の1種を患う患者の治療において
実施できる。
と結合可能であるムスカリン受容体のアロステリック部位と結合することによっ
て一次リガンドのムスカリン受容体との結合を調節する化合物と接触させること
を含んでなる、一次リガンドに対するムスカリン受容体の応答を調節する方法を
提供する。この方法はin vitroで、例えば、スクリーニング法の一部として、ま
たはその他の場合に受容体の応答を活性化もしくは調節するために、あるいは、
in vivoで、例えば、本明細書に記載される症状の1種を患う患者の治療において
実施できる。
【００１２】
ムスカリン受容体と結合する一次リガンドは受容体の生物学的活性のアゴニス
トまたはアンタゴニストであり得る。一次リガンドの例としては、アセチルコリ
ン(ACh)またはN-メチルスコポラミン(NMS)が挙げられる。その他の一次リガンド
は当業者には十分に知られている。
トまたはアンタゴニストであり得る。一次リガンドの例としては、アセチルコリ
ン(ACh)またはN-メチルスコポラミン(NMS)が挙げられる。その他の一次リガンド
は当業者には十分に知られている。
【００１３】
このアロステリック部位と結合する化合物、特に、一次リガンドの結合に対し
て正または負の協同作用を有するアロステリック作用性化合物の使用は、ムスカ
リン受容体サブタイプの限定された群、より好ましくは単一のムスカリン受容体
サブタイプのみの天然の機能を選択的に調節するという利点を有し得る。従って
、本発明は、複数の受容体サブタイプと結合する一次リガンドを用いては達成す
るのが困難である、特定のムスカリン受容体サブタイプの機能の選択的活性化と
いう問題を解決するのに役立ち、この選択性に基づく治療的処置の可能性を開く
。これらの症状の例は以下に論じられている。一般にはアロステリック化合物の
ムスカリン受容体との結合が一次リガンドの結合を増強する（すなわち、正の協
同性を示す）ことが好ましいが、一次リガンドの結合を低下させる（すなわち、
拮抗的に作用する、すなわち、負の協同性を示す）化合物も治療可能性を有し得
る。かかる化合物は（競合アンタゴニストと同様に）受容体のアロステリック部
位に結合するときに受容体応答の100%を遮断しないという特性を有する。これら
の化合物はアルツハイマー病、動揺病、鬱病、気管支炎、胃および十二指腸潰瘍
、神経性胃炎、膀胱失調症および貯留、洞性徐脈、パーキンソン病、失禁、喘息
、慢性閉塞性肺疾患、過敏性大腸症候群、過剰な迷走神経の衝動をはじめとする
症状の治療に、予備麻酔として、心臓ペースメーカー調節のため、または睡眠調
節のために使用できる。
て正または負の協同作用を有するアロステリック作用性化合物の使用は、ムスカ
リン受容体サブタイプの限定された群、より好ましくは単一のムスカリン受容体
サブタイプのみの天然の機能を選択的に調節するという利点を有し得る。従って
、本発明は、複数の受容体サブタイプと結合する一次リガンドを用いては達成す
るのが困難である、特定のムスカリン受容体サブタイプの機能の選択的活性化と
いう問題を解決するのに役立ち、この選択性に基づく治療的処置の可能性を開く
。これらの症状の例は以下に論じられている。一般にはアロステリック化合物の
ムスカリン受容体との結合が一次リガンドの結合を増強する（すなわち、正の協
同性を示す）ことが好ましいが、一次リガンドの結合を低下させる（すなわち、
拮抗的に作用する、すなわち、負の協同性を示す）化合物も治療可能性を有し得
る。かかる化合物は（競合アンタゴニストと同様に）受容体のアロステリック部
位に結合するときに受容体応答の100%を遮断しないという特性を有する。これら
の化合物はアルツハイマー病、動揺病、鬱病、気管支炎、胃および十二指腸潰瘍
、神経性胃炎、膀胱失調症および貯留、洞性徐脈、パーキンソン病、失禁、喘息
、慢性閉塞性肺疾患、過敏性大腸症候群、過剰な迷走神経の衝動をはじめとする
症状の治療に、予備麻酔として、心臓ペースメーカー調節のため、または睡眠調
節のために使用できる。
【００１４】
本明細書に定義されるアロステリック部位は先行技術（例えば、英国特許GB 2
292 685 A）に開示されるガラミン、ストリキニーネ、ブルシンおよびN-置換ブ
ルシン類似体と結合する「共通アロステリック部位」とは異なる。逆に、本発明
者は化合物1aおよび式1を有する一連の関連インドロカルバゾールならびに化合
物2aおよび式2を有する一連の関連化合物と結合する新規アロステリック部位を
見出した。
292 685 A）に開示されるガラミン、ストリキニーネ、ブルシンおよびN-置換ブ
ルシン類似体と結合する「共通アロステリック部位」とは異なる。逆に、本発明
者は化合物1aおよび式1を有する一連の関連インドロカルバゾールならびに化合
物2aおよび式2を有する一連の関連化合物と結合する新規アロステリック部位を
見出した。
【００１５】
好ましくは、ムスカリン受容体は先行技術で公知のM1、M2、M3、M4またはM5受
容体から選択される。受容体はヒトまたは適当な動物類似体（ラット、マウスな
ど）であってもよい。いずれかの所定の種由来の1種以上のM1〜M5受容体遺伝子
を安定にまたは一過性に発現するトランスフェクト細胞系統の作製は当技術分野
では十分に公知であり、関連参照文献が、例えば、総説：Hulmeら, 1990およびC
aulfieldおよびBirdsall, 1998に挙げられている。
容体から選択される。受容体はヒトまたは適当な動物類似体（ラット、マウスな
ど）であってもよい。いずれかの所定の種由来の1種以上のM1〜M5受容体遺伝子
を安定にまたは一過性に発現するトランスフェクト細胞系統の作製は当技術分野
では十分に公知であり、関連参照文献が、例えば、総説：Hulmeら, 1990およびC
aulfieldおよびBirdsall, 1998に挙げられている。
【００１６】
一次リガンドのムスカリン受容体との結合を、本明細書に始めて記載されるア
ロステリック部位との相互作用によって調節できる例示的化合物としては化合物
1a、2aおよび2bが挙げられる。
ロステリック部位との相互作用によって調節できる例示的化合物としては化合物
1a、2aおよび2bが挙げられる。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は一次リガンドのムスカリン受容体との結合を、化
合物1aおよび／または化合物2aと結合可能であるムスカリン受容体のアロステリ
ック部位との結合によって調節できる化合物の同定に役立つ方法を提供し、この
方法は： (a)ムスカリン受容体および一次リガンドを1種以上の濃度の候補化合物と接触
させ；さらに、 (b)候補化合物が一次リガンドのムスカリン受容体との結合を、化合物1aおよ
び／または化合物2aと結合可能である受容体のアロステリック部位との結合によ
って調節するかどうかを調べる ことを含んでなる。
合物1aおよび／または化合物2aと結合可能であるムスカリン受容体のアロステリ
ック部位との結合によって調節できる化合物の同定に役立つ方法を提供し、この
方法は： (a)ムスカリン受容体および一次リガンドを1種以上の濃度の候補化合物と接触
させ；さらに、 (b)候補化合物が一次リガンドのムスカリン受容体との結合を、化合物1aおよ
び／または化合物2aと結合可能である受容体のアロステリック部位との結合によ
って調節するかどうかを調べる ことを含んでなる。
【００１８】
本方法は一次リガンドのムスカリン受容体との結合を調節する候補化合物を選
択するさらなる工程を含み得る。
択するさらなる工程を含み得る。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、一次リガンドのムスカリン受容体との結合をア
ロステリック部位との結合により調節できる化合物のスクリーニングにおける、
化合物1aおよび／または2aと結合可能であるムスカリン受容体のアロステリック
部位の使用を提供する。
ロステリック部位との結合により調節できる化合物のスクリーニングにおける、
化合物1aおよび／または2aと結合可能であるムスカリン受容体のアロステリック
部位の使用を提供する。
【００２０】
一次リガンドの結合の調節はいくつかの機構によって達成され得る。アロステ
リック化合物は1種以上のムスカリン受容体サブタイプで正または負の協同性作
用を及ぼすことができ、その他の受容体サブタイプで作用全く及ぼさないこと（
中立協同性）が好ましい。あるいは、またはさらに、アロステリック化合物の結
合はブルシンと結合する共通アロステリック部位などの異なるアロステリック部
位に作用する薬剤の結合に影響を及ぼし得る。
リック化合物は1種以上のムスカリン受容体サブタイプで正または負の協同性作
用を及ぼすことができ、その他の受容体サブタイプで作用全く及ぼさないこと（
中立協同性）が好ましい。あるいは、またはさらに、アロステリック化合物の結
合はブルシンと結合する共通アロステリック部位などの異なるアロステリック部
位に作用する薬剤の結合に影響を及ぼし得る。
【００２１】
好ましくは、候補アロステリク化合物は、一次リガンドの結合に対して正また
は負の協同性作用を有する場合に選択される。従って、好ましい実施形態では、
工程(b)は候補化合物がアロステリック部位と結合するかどうかを調べること、
さらにその結合がその結合部位でいかに一次リガンドの作用を調節するかを調べ
ることを含む。これは平衡および／または動態結合アッセイおよび／または機能
アッセイをはじめとする本明細書に記載されるアッセイを用いて実施できる。
は負の協同性作用を有する場合に選択される。従って、好ましい実施形態では、
工程(b)は候補化合物がアロステリック部位と結合するかどうかを調べること、
さらにその結合がその結合部位でいかに一次リガンドの作用を調節するかを調べ
ることを含む。これは平衡および／または動態結合アッセイおよび／または機能
アッセイをはじめとする本明細書に記載されるアッセイを用いて実施できる。
【００２２】
本発明における使用に好適であるか、または適応し得る一般的なアッセイはLa
zarenoおよびBirdsall (1995), Detection, quantitation and verification of
allosteric interactions of agents with labelled and unlabelled ligands
at G-protein-coupled receptors: Interactions of strychnine and acetylcho
line at muscarinic receptors. Mol. Pharmacol. 48: 362-378; Lazareno ら (
1998), Subtype selective positive cooperative interactions between bruci
ne analogues and acetylcholine at muscarinic receptors: radioligand bind
ing studies. Mol. Pharmol. 53: 573-589; Birdsallら (1999), Subtype selec
tive positive cooperative interactions between brucine analogues and ace
tylcholine at muscarinic receptors: functional studies. Mol. Pharmacol.
55: 778-786に記載されている。
zarenoおよびBirdsall (1995), Detection, quantitation and verification of
allosteric interactions of agents with labelled and unlabelled ligands
at G-protein-coupled receptors: Interactions of strychnine and acetylcho
line at muscarinic receptors. Mol. Pharmacol. 48: 362-378; Lazareno ら (
1998), Subtype selective positive cooperative interactions between bruci
ne analogues and acetylcholine at muscarinic receptors: radioligand bind
ing studies. Mol. Pharmol. 53: 573-589; Birdsallら (1999), Subtype selec
tive positive cooperative interactions between brucine analogues and ace
tylcholine at muscarinic receptors: functional studies. Mol. Pharmacol.
55: 778-786に記載されている。
【００２３】
使用できる特定のアッセイの例は以下の「材料および方法」節に記載されてい
る。
る。
【００２４】
まず、前記の一般的および特定のアッセイにおいて規定される判断基準を用い
てアロステリッックである候補化合物を選択する。特定の動態的および平衡アッ
セイを用いて新規部位、例えば、化合物2aと結合する部位に結合する化合物をさ
らに選択する。例えば、ブルシン、ガラミン、またはストリキニーネの結合と競
合せず、かつ、2aの新規アロステリック部位との結合と競合するいずれかのアロ
ステリック化合物がさらなる検討または治療薬としての開発のための候補化合物
である。これらの方法は一次リガンドの結合と正、負または中立協同性である化
合物を発見するのに有用である。
てアロステリッックである候補化合物を選択する。特定の動態的および平衡アッ
セイを用いて新規部位、例えば、化合物2aと結合する部位に結合する化合物をさ
らに選択する。例えば、ブルシン、ガラミン、またはストリキニーネの結合と競
合せず、かつ、2aの新規アロステリック部位との結合と競合するいずれかのアロ
ステリック化合物がさらなる検討または治療薬としての開発のための候補化合物
である。これらの方法は一次リガンドの結合と正、負または中立協同性である化
合物を発見するのに有用である。
【００２５】
好ましい実施形態では、スクリーニングは受容体、1種以上の濃度の候補アロ
ステリックリガンド（できれば、対照として候補リガンドの不在下で実施される
アッセイを含む）および1種以上の一次リガンドを別のアロステリックリガンド
の存在または不在下で用いて実施する。好ましくは、本スクリーニング法に使用
する一次リガンドはアセチルコリン(ACh)および／またはN-メチルスコポラミン(
NMS)であるが、その他の好適な一次リガンドも当業者には十分に知られている。
ある実施形態では、本方法は候補化合物のアロステリック部位との結合を1種以
上の濃度のAChの不在または存在下で標識したNMSを用いて測定するアッセイを含
む。あるいは、またはさらに、候補化合物のアロステリック部位との結合はNMS
解離速度定数を測定するアッセイにおいて1種以上の濃度の候補化合物の存在ま
たは不在下で標識したNMSを用いて測定する。もう1つの好ましいアッセイ形式は
、2aによって生じるムスカリン受容体からのNMSの解離速度の加速に対する1種以
上の濃度のアロステリックリガンドの作用に関するアッセイである（以下の第II
部に記載される）。さらなるアッセイは一般的なアッセイにおいてアロステリ
ックであると証明されている試験化合物の、2つのアロステリック部位の一方ま
たは他方に結合すると知られているリガンドの平衡アロステリック作用に対する
作用を定量化することである（第I部、図5に記載される）。
ステリックリガンド（できれば、対照として候補リガンドの不在下で実施される
アッセイを含む）および1種以上の一次リガンドを別のアロステリックリガンド
の存在または不在下で用いて実施する。好ましくは、本スクリーニング法に使用
する一次リガンドはアセチルコリン(ACh)および／またはN-メチルスコポラミン(
NMS)であるが、その他の好適な一次リガンドも当業者には十分に知られている。
ある実施形態では、本方法は候補化合物のアロステリック部位との結合を1種以
上の濃度のAChの不在または存在下で標識したNMSを用いて測定するアッセイを含
む。あるいは、またはさらに、候補化合物のアロステリック部位との結合はNMS
解離速度定数を測定するアッセイにおいて1種以上の濃度の候補化合物の存在ま
たは不在下で標識したNMSを用いて測定する。もう1つの好ましいアッセイ形式は
、2aによって生じるムスカリン受容体からのNMSの解離速度の加速に対する1種以
上の濃度のアロステリックリガンドの作用に関するアッセイである（以下の第II
部に記載される）。さらなるアッセイは一般的なアッセイにおいてアロステリ
ックであると証明されている試験化合物の、2つのアロステリック部位の一方ま
たは他方に結合すると知られているリガンドの平衡アロステリック作用に対する
作用を定量化することである（第I部、図5に記載される）。
【００２６】
これらの方法では、候補化合物は一次リガンドのムスカリン受容体との結合を
増強する（あるいは、正の協同性と呼ばれる）場合に選択され得る。しかしなが
ら、その他の化合物もそれらが一次リガンドのムスカリン受容体との結合を低下
させる（あるいは、負の協同性と呼ばれる）場合に選択され得る。中立の協同性
を有する候補化合物は1種以上のムスカリン受容体サブタイプと結合するがいず
れの濃度でも一次リガンドの平衡結合に影響を全く及ぼさない場合に選択される
。 本明細書に記載される研究に使用されるアロステリック部位は化合物1aおよび
／または2aと結合可能である。先行技術に開示される第1のアロステリック部位
とは対照的に、本明細書に記載される部位はブルシン、ガラミンおよび／または
ストリキニーネと10-４Mまでの濃度ではいずれの実質的な程度でも結合しない。
増強する（あるいは、正の協同性と呼ばれる）場合に選択され得る。しかしなが
ら、その他の化合物もそれらが一次リガンドのムスカリン受容体との結合を低下
させる（あるいは、負の協同性と呼ばれる）場合に選択され得る。中立の協同性
を有する候補化合物は1種以上のムスカリン受容体サブタイプと結合するがいず
れの濃度でも一次リガンドの平衡結合に影響を全く及ぼさない場合に選択される
。 本明細書に記載される研究に使用されるアロステリック部位は化合物1aおよび
／または2aと結合可能である。先行技術に開示される第1のアロステリック部位
とは対照的に、本明細書に記載される部位はブルシン、ガラミンおよび／または
ストリキニーネと10-４Mまでの濃度ではいずれの実質的な程度でも結合しない。
【００２７】
さらなる態様では、本発明は前記の方法によって同定されている候補化合物を
大量に製造し、さらに／または該化合物を医薬組成物として処方するさらなる工
程を含んでなる方法を提供する。
大量に製造し、さらに／または該化合物を医薬組成物として処方するさらなる工
程を含んでなる方法を提供する。
【００２８】
さらなる態様では、本発明は前記の方法によって得られる化合物の一次リガン
ドのムスカリン受容体との結合によって媒介される症状を治療するための医薬の
製造のための使用を提供する。これらの症状の例は以下に論じられている。
ドのムスカリン受容体との結合によって媒介される症状を治療するための医薬の
製造のための使用を提供する。これらの症状の例は以下に論じられている。
【００２９】
以下、添付図面を参照し、限定するものではない例を挙げて本発明を説明する
。
。
【００３０】詳細な説明 アッセイ
前記で示されるように、本発明のスクリーニングアッセイは本明細書に開示さ
れるアロステリック部位に結合し、一次リガンドのムスカリン受容体との結合を
調節できる化合物の同定に有用である。これらのアッセイの厳密な形式は当技術
分野で通常の一般的な知識を用いて当業者によって容易に考案され得る。ある実
施形態では、アッセイは(a)M1ないしM5サブタイプのうちの1種のムスカリン受容
体、(b)1種以上の一次リガンドまたはリガンド類似体、および(c)1種以上の候補
化合物を使用する。所望により、アッセイはさらに(d)調べられる候補化合物と
競合可能である、アロステリック部位で作用すると知られている化合物を使用し
てもよい。アッセイは一般的に受容体、一次リガンドまたはリガンド類似体およ
び1種以上の濃度の候補化合物を、候補化合物がアロステリック部位で結合し得
るか、または結合について競合し得る条件化でin vitroで接触させることを含む
。アッセイの結果は1種以上の候補化合物、競合アロステリック化合物または一
次リガンドもしくはリガンド類似体を標識し、さらにアッセイ系においてどの種
が相互作用するかを調べることによって調べられる。
れるアロステリック部位に結合し、一次リガンドのムスカリン受容体との結合を
調節できる化合物の同定に有用である。これらのアッセイの厳密な形式は当技術
分野で通常の一般的な知識を用いて当業者によって容易に考案され得る。ある実
施形態では、アッセイは(a)M1ないしM5サブタイプのうちの1種のムスカリン受容
体、(b)1種以上の一次リガンドまたはリガンド類似体、および(c)1種以上の候補
化合物を使用する。所望により、アッセイはさらに(d)調べられる候補化合物と
競合可能である、アロステリック部位で作用すると知られている化合物を使用し
てもよい。アッセイは一般的に受容体、一次リガンドまたはリガンド類似体およ
び1種以上の濃度の候補化合物を、候補化合物がアロステリック部位で結合し得
るか、または結合について競合し得る条件化でin vitroで接触させることを含む
。アッセイの結果は1種以上の候補化合物、競合アロステリック化合物または一
次リガンドもしくはリガンド類似体を標識し、さらにアッセイ系においてどの種
が相互作用するかを調べることによって調べられる。
【００３１】
別の実施形態では、特にハイスループットスクリーニングの範囲においては、
スクリーニングアッセイが、候補化合物が一次リガンドの不在下で本明細書に開
示されるアロステリック部位と結合するかどうか調べることを含むことが望まし
い。これらのアッセイに、アロステリック部位と結合する化合物が一次リガンド
もしくはリガンド類似体の受容体との結合を調節するかどうか、またはどのよう
に調節するかについての個別の測定を続けられる。これらのアッセイは(a)ムス
カリン受容体および(b)1種以上の候補化合物、および所望により(c)アロステリ
ックに作用すると知られている1種以上の化合物を、化合物(b)および／または(c
)がアロステリック部位と結合し得るか、または競合し得る条件下で接触させる
ことによって実施できる。候補化合物または競合化合物の受容体との結合は化合
物(b)および／または(c)を標識することによって測定できる。
スクリーニングアッセイが、候補化合物が一次リガンドの不在下で本明細書に開
示されるアロステリック部位と結合するかどうか調べることを含むことが望まし
い。これらのアッセイに、アロステリック部位と結合する化合物が一次リガンド
もしくはリガンド類似体の受容体との結合を調節するかどうか、またはどのよう
に調節するかについての個別の測定を続けられる。これらのアッセイは(a)ムス
カリン受容体および(b)1種以上の候補化合物、および所望により(c)アロステリ
ックに作用すると知られている1種以上の化合物を、化合物(b)および／または(c
)がアロステリック部位と結合し得るか、または競合し得る条件下で接触させる
ことによって実施できる。候補化合物または競合化合物の受容体との結合は化合
物(b)および／または(c)を標識することによって測定できる。
【００３２】
前記のアッセイは対照実験を実施すること、例えば、候補化合物の不在または
存在下でアッセイを実施することを含み得る。
存在下でアッセイを実施することを含み得る。
【００３３】
これらのアッセイでは、ムスカリン受容体は遊離型で、あるいは、例えば受容
体を発現する細胞の表面、もしくは固体支持体に固定化されて存在し得る。好ま
しい形式は細胞表面受容体を用いる。
体を発現する細胞の表面、もしくは固体支持体に固定化されて存在し得る。好ま
しい形式は細胞表面受容体を用いる。
【００３４】
種々の種類の薬剤の標識化は当技術分野では十分に知られている。広義には、
これは薬剤に直接または間接的に検出可能、好ましくは測定可能なシグナルを生
じる標識またはリポーター分子でタグをつけることを含む。リポーター分子の結
合は例えば、共有結合または非共有相互作用によって直接であっても、間接であ
ってもよい。通常使用される標識の例としてはスペクトル的に分離された吸収ま
たは発光特性を有する蛍光色素、蛍光体または色素レーザが挙げられる。好適な
蛍光色素としてはフルオレセイン、ローダミン、ルシフェリン、フィコエリトリ
ンおよびテキサスレッドが挙げられる。好適な色素生産性色素としてはジアミノ
ベンジジンが挙げられる。その他の検出可能標識としては、3H、14C、32P、34S
、126I、または99mTcなどの放射性同位体標識、および検出可能反応生成物を生
じる反応を触媒してシグナルを増幅させられる、アルカリホスファターゼ、β-
ガラクトシダーゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼなどの酵素標識が挙げ
られる。
これは薬剤に直接または間接的に検出可能、好ましくは測定可能なシグナルを生
じる標識またはリポーター分子でタグをつけることを含む。リポーター分子の結
合は例えば、共有結合または非共有相互作用によって直接であっても、間接であ
ってもよい。通常使用される標識の例としてはスペクトル的に分離された吸収ま
たは発光特性を有する蛍光色素、蛍光体または色素レーザが挙げられる。好適な
蛍光色素としてはフルオレセイン、ローダミン、ルシフェリン、フィコエリトリ
ンおよびテキサスレッドが挙げられる。好適な色素生産性色素としてはジアミノ
ベンジジンが挙げられる。その他の検出可能標識としては、3H、14C、32P、34S
、126I、または99mTcなどの放射性同位体標識、および検出可能反応生成物を生
じる反応を触媒してシグナルを増幅させられる、アルカリホスファターゼ、β-
ガラクトシダーゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼなどの酵素標識が挙げ
られる。
【００３５】
その他のリポーターとしては、着色、磁性または常磁性のラテックスビーズな
どの高分子コロイド状粒子または粒状物質、ならびに直接または間接的に検出可
能シグナルを可視観察、電気的に検出あるいはその他の方法で記録されるように
できる生物学的にもしくは化学的に活性な薬剤が挙げられる。これらの分子は発
色するか、もしくは変色を生じる、または電気的特性の変化を引き起こす反応を
触媒する酵素であってもよい。それらはエネルギー状態間の電子遷移が特徴的な
スペクトル吸収または発光をもたらすよう分子的に励起し得る。
どの高分子コロイド状粒子または粒状物質、ならびに直接または間接的に検出可
能シグナルを可視観察、電気的に検出あるいはその他の方法で記録されるように
できる生物学的にもしくは化学的に活性な薬剤が挙げられる。これらの分子は発
色するか、もしくは変色を生じる、または電気的特性の変化を引き起こす反応を
触媒する酵素であってもよい。それらはエネルギー状態間の電子遷移が特徴的な
スペクトル吸収または発光をもたらすよう分子的に励起し得る。
【００３６】
ハイスループットスクリーニングの範囲では、本明細書に記載される方法は、
候補化合物を破棄できる速度を高めるために、個々の化合物ではなく候補化合物
群またはそのプールを用いてアッセイを実施することを含み得る。次いで、アッ
セイにおいて陽性結果を有する個々の化合物群を分離してスクリーニングし、ア
ロステリック部位と相互作用して一次リガンドの結合を調節する群において化合
物を同定できる。他の候補化合物の種々のプールと共にいずれか１つの候補化合
物がアッセイされるのを確保するために適当な手段を取るべきである。このプロ
トコールはあるプールにはあり得るが別のプールにはない、競合アンタゴニスト
またはアゴニストの可能な干渉性マスク効果を最小にする。
候補化合物を破棄できる速度を高めるために、個々の化合物ではなく候補化合物
群またはそのプールを用いてアッセイを実施することを含み得る。次いで、アッ
セイにおいて陽性結果を有する個々の化合物群を分離してスクリーニングし、ア
ロステリック部位と相互作用して一次リガンドの結合を調節する群において化合
物を同定できる。他の候補化合物の種々のプールと共にいずれか１つの候補化合
物がアッセイされるのを確保するために適当な手段を取るべきである。このプロ
トコールはあるプールにはあり得るが別のプールにはない、競合アンタゴニスト
またはアゴニストの可能な干渉性マスク効果を最小にする。
【００３７】
用いる候補化合物は薬剤スクリーニングプログラムに用いられる天然化合物で
あっても合成化学化合物であってもよい。数種の特性決定されたまたは特性決定
されていない成分を含む天然材料の混合物も使用できる。
あっても合成化学化合物であってもよい。数種の特性決定されたまたは特性決定
されていない成分を含む天然材料の混合物も使用できる。
【００３８】
その他の候補化合物は特定の分子形状、大きさ、疎水性、親水性および電荷特
性を有する候補化合物を提供するために、ポリペプチドまたはペプチド断片の三
次構造のモデリングおよび合理的薬剤設計の使用をベースとしてもよい。
性を有する候補化合物を提供するために、ポリペプチドまたはペプチド断片の三
次構造のモデリングおよび合理的薬剤設計の使用をベースとしてもよい。
【００３９】
本発明のアッセイに加えられる候補化合物量は通常、用いる化合物の種類に応
じた試行錯誤によって決定される。
じた試行錯誤によって決定される。
【００４０】
典型的には、約0.01ないし100,000nM濃度の候補化合物、例えば0.1ないし100
μMを使用できる。
μMを使用できる。
【００４１】
さらなる工程では、本発明の方法はより詳細な平衡または動態アッセイによる
、一次リガンドのムスカリン受容体との結合を調節するのに必要な候補化合物量
の定量化を含み得る。
、一次リガンドのムスカリン受容体との結合を調節するのに必要な候補化合物量
の定量化を含み得る。
【００４２】
本発明のスクリーニング法に、アッセイにおいて選択された候補化合物の単離
および／または製造および／または使用、ならびに／または一次リガンドのムス
カリン受容体との結合に対して正、中立もしくは負の協同性作用を有する候補化
合物がリード化合物としてさらに開発するのに好適となる生物学的特性を有する
かどうか調べるためのさらなる試験を続けてもよい。これらは膜、全細胞、全組
織および／またはin vivoにおける機能についてのアッセイにおいてその活性を
調べる試験、ならびにその代謝安定性、バイオアベイラビリティーおよび作用期
間および副作用の存在についての試験を含む。
および／または製造および／または使用、ならびに／または一次リガンドのムス
カリン受容体との結合に対して正、中立もしくは負の協同性作用を有する候補化
合物がリード化合物としてさらに開発するのに好適となる生物学的特性を有する
かどうか調べるためのさらなる試験を続けてもよい。これらは膜、全細胞、全組
織および／またはin vivoにおける機能についてのアッセイにおいてその活性を
調べる試験、ならびにその代謝安定性、バイオアベイラビリティーおよび作用期
間および副作用の存在についての試験を含む。
【００４３】
さらなる態様では、本発明は化合物1aおよび／または化合物2bと結合するムス
カリン受容体のアロステリク部位と結合する特性を共有する化合物の模倣物の設
計またはスクリーニングにおける前記化合物の使用を提供する。
カリン受容体のアロステリク部位と結合する特性を共有する化合物の模倣物の設
計またはスクリーニングにおける前記化合物の使用を提供する。
【００４４】
既知の医薬上有効な化合物の模倣物の設計はリード化合物に基づいて医薬を開
発するための公知のアプローチである。これは有効化合物を合成するのが困難ま
たは費用がかかる場合、または特定の投与法に好適でない場合に望ましいもので
あろう。模倣設計、合成および試験を使用して標的特性について多数の分子をラ
ンダムにスクリーニングするのを避けることができる。
発するための公知のアプローチである。これは有効化合物を合成するのが困難ま
たは費用がかかる場合、または特定の投与法に好適でない場合に望ましいもので
あろう。模倣設計、合成および試験を使用して標的特性について多数の分子をラ
ンダムにスクリーニングするのを避けることができる。
【００４５】
所定の標的特性を有する化合物からの模倣物の設計では通常とられるいくつか
の工程がある。第1に、標的特性を決定するのに決定的かつ／または重要である
化合物の特定の部分を決定する。化合物の有効領域を構成するこれらの部分また
は残基はそのファルマコフォアとして知られている。ひとたび、ファルマコフォ
アが見出されれば、ある範囲の起源、例えば、分光技術、X線解析データおよびN
MRからのデータを用いて、その物理的特性、例えば、立体化学、結合、大きさお
よび／または電荷を一致させるためにその構造がモデルとされる。コンピュータ
ー解析、類似性マッピング（これは原子間の結合よりもファルマコフォアの電荷
および／または容積をモデルとする）およびその他の技術も本モデリングプロセ
スに使用できる。
の工程がある。第1に、標的特性を決定するのに決定的かつ／または重要である
化合物の特定の部分を決定する。化合物の有効領域を構成するこれらの部分また
は残基はそのファルマコフォアとして知られている。ひとたび、ファルマコフォ
アが見出されれば、ある範囲の起源、例えば、分光技術、X線解析データおよびN
MRからのデータを用いて、その物理的特性、例えば、立体化学、結合、大きさお
よび／または電荷を一致させるためにその構造がモデルとされる。コンピュータ
ー解析、類似性マッピング（これは原子間の結合よりもファルマコフォアの電荷
および／または容積をモデルとする）およびその他の技術も本モデリングプロセ
スに使用できる。
【００４６】
本アプローチの変法では、リガンドの三次構造およびその結合パートナーを決
定し、またはモデルとする。これはリガンドおよび／または結合パートナーが結
合の際にコンホメーションを変化させる場合に特に有用であり、模倣物の設計に
おいてモデルにこれを考慮できる。
定し、またはモデルとする。これはリガンドおよび／または結合パートナーが結
合の際にコンホメーションを変化させる場合に特に有用であり、模倣物の設計に
おいてモデルにこれを考慮できる。
【００４７】
次いで、ファルマコフォアを模倣する化学群がグラフトされ得る鋳型分子を選
択する。鋳型分子およびそれにグラフトされる化学群は、模倣物の合成が容易で
あるように、薬理学的に許容されるように、リード化合物の生物学的活性を保持
する間in vivoで分解しないように便宜に選択できる。次いで、本アプローチに
よって見出された模倣物または模倣物類を、それらが標的特性を有するかどうか
、またはそれらがどの程度までそれを示すかを確かめるためにスクリーニングで
きる。次いで、さらなる試験または最適化、例えば、in vivoまたは臨床試験の
ために1種以上の最終模倣物に到達するためにさらなる最適化または修飾を実施
できる。
択する。鋳型分子およびそれにグラフトされる化学群は、模倣物の合成が容易で
あるように、薬理学的に許容されるように、リード化合物の生物学的活性を保持
する間in vivoで分解しないように便宜に選択できる。次いで、本アプローチに
よって見出された模倣物または模倣物類を、それらが標的特性を有するかどうか
、またはそれらがどの程度までそれを示すかを確かめるためにスクリーニングで
きる。次いで、さらなる試験または最適化、例えば、in vivoまたは臨床試験の
ために1種以上の最終模倣物に到達するためにさらなる最適化または修飾を実施
できる。
【００４８】医薬用途
本明細書において一次リガンドのムスカリン受容体との結合を調節するのに有
用であると同定される化合物は医薬として処方し使用できる。
用であると同定される化合物は医薬として処方し使用できる。
【００４９】
医薬組成物は1種以上の前記化合物の他に、医薬上許容される賦形剤、担体、
バッファー、安定剤または当業者には十分に公知のその他の材料を含んでなり得
る。かかる材料は非毒性であるべきであり、かつ、有効成分の有効性を干渉すべ
きでない。担体またはその他の材料の正確な性質は投与経路、例えば、経口、静
脈内、皮膚もしくは皮下、鼻、筋内、または腹膜内経路によって異なり得る。
バッファー、安定剤または当業者には十分に公知のその他の材料を含んでなり得
る。かかる材料は非毒性であるべきであり、かつ、有効成分の有効性を干渉すべ
きでない。担体またはその他の材料の正確な性質は投与経路、例えば、経口、静
脈内、皮膚もしくは皮下、鼻、筋内、または腹膜内経路によって異なり得る。
【００５０】
経口投与用医薬組成物は錠剤、カプセル剤、散剤または液体の形態であっても
よい。錠剤はゼラチンまたはアジュバントなどの固体担体を含んでもよい。液体
医薬組成物は一般に水、石油、動物もしくは植物油、鉱物油または合成油などの
液体担体を含む。生理食塩水溶液、デキストロースまたはその他の糖類溶液また
はエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールな
どのグリコールも含んでよい。
よい。錠剤はゼラチンまたはアジュバントなどの固体担体を含んでもよい。液体
医薬組成物は一般に水、石油、動物もしくは植物油、鉱物油または合成油などの
液体担体を含む。生理食塩水溶液、デキストロースまたはその他の糖類溶液また
はエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールな
どのグリコールも含んでよい。
【００５１】
医薬製剤は本発明の化合物を賦形剤（例えば、ラクトース、スクロース、グル
コース、マンニトールまたはソルビトールなどの糖誘導体；コーンスターチ、デ
キストリンまたはカルボキシメチルデンプンなどのデンプン誘導体；結晶セルロ
ース、低級ヒドロキシプロピル置換セルロース、カルボキシメチルセルロース、
カルボキシメチルセルロースカルシウム、または内部架橋カルボキシメチルセル
ロースナトリウムなどのセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；およ
びプルランをはじめとする有機賦形剤；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウムも
しくはマグネシウムメタ-アルミン酸珪酸などの珪酸塩；リン酸カルシウムなど
のリン酸塩；炭酸カルシウムなどの炭酸塩；および硫酸カルシウムなどの硫酸塩
をはじめとする無機賦形剤）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カ
ルシウムまたはステアリン酸マグネシウムなどの金属ステアリン酸塩；タルク；
コロイド状シリカ；蜜蝋または鯨蝋などのワックス；ホウ酸；アジピン酸；硫酸
ナトリウムなどの硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；DL-ロ
イシン；脂肪族系酸のナトリウム塩;ラウリル硫酸ナトリウムまたはラウリル硫
酸マグネシウムなどのラウリル硫酸塩；無水珪酸または珪酸水和物などの珪酸塩
；および前記のデンプン誘導体）；結合剤（例えば、ポリビニルピロリドン、マ
クロゴールおよび前記の賦形剤の類似化合物）；崩壊剤（例えば、前記の賦形剤
の類似化合物）；およびクロスカーメロースナトリウム、カルボキシメチルデン
プンナトリウムなどの化学修飾デンプン-セルロースまたは架橋ポリビニルピロ
リドン）；安定剤（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのp-ヒ
ドロキシベンゾエート；クロロブタノール、ベンジルアルコールまたはフェニル
エチルアルコールなどのアルコール；塩化ベンズアルコニウム；フェノールまた
はクレゾールなどのフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；およびソルビ
ン酸）；矯正剤（例えば、従来使用されるものなどの甘味料、酢または香り）；
希釈剤などのような1種以上のアジュバントと混合することによって製造できる
。
コース、マンニトールまたはソルビトールなどの糖誘導体；コーンスターチ、デ
キストリンまたはカルボキシメチルデンプンなどのデンプン誘導体；結晶セルロ
ース、低級ヒドロキシプロピル置換セルロース、カルボキシメチルセルロース、
カルボキシメチルセルロースカルシウム、または内部架橋カルボキシメチルセル
ロースナトリウムなどのセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；およ
びプルランをはじめとする有機賦形剤；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウムも
しくはマグネシウムメタ-アルミン酸珪酸などの珪酸塩；リン酸カルシウムなど
のリン酸塩；炭酸カルシウムなどの炭酸塩；および硫酸カルシウムなどの硫酸塩
をはじめとする無機賦形剤）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カ
ルシウムまたはステアリン酸マグネシウムなどの金属ステアリン酸塩；タルク；
コロイド状シリカ；蜜蝋または鯨蝋などのワックス；ホウ酸；アジピン酸；硫酸
ナトリウムなどの硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；DL-ロ
イシン；脂肪族系酸のナトリウム塩;ラウリル硫酸ナトリウムまたはラウリル硫
酸マグネシウムなどのラウリル硫酸塩；無水珪酸または珪酸水和物などの珪酸塩
；および前記のデンプン誘導体）；結合剤（例えば、ポリビニルピロリドン、マ
クロゴールおよび前記の賦形剤の類似化合物）；崩壊剤（例えば、前記の賦形剤
の類似化合物）；およびクロスカーメロースナトリウム、カルボキシメチルデン
プンナトリウムなどの化学修飾デンプン-セルロースまたは架橋ポリビニルピロ
リドン）；安定剤（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのp-ヒ
ドロキシベンゾエート；クロロブタノール、ベンジルアルコールまたはフェニル
エチルアルコールなどのアルコール；塩化ベンズアルコニウム；フェノールまた
はクレゾールなどのフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；およびソルビ
ン酸）；矯正剤（例えば、従来使用されるものなどの甘味料、酢または香り）；
希釈剤などのような1種以上のアジュバントと混合することによって製造できる
。
【００５２】
静脈注射、皮膚または皮下注射、または苦痛部位での注射には、有効成分は発
熱物質を含まず、好適なpH、等張性および安定性を有する、非経口的に許容され
る水溶液の形態である。当業者ならば、例えば、生食注射、リンガー液、乳酸加
リンガー液などの等張ビヒクルを用いて好適な溶液を上手く製造できる。防腐剤
、安定剤、バッファー、酸化防止剤および／またはその他の添加剤も必要に応じ
て含んでよい。
熱物質を含まず、好適なpH、等張性および安定性を有する、非経口的に許容され
る水溶液の形態である。当業者ならば、例えば、生食注射、リンガー液、乳酸加
リンガー液などの等張ビヒクルを用いて好適な溶液を上手く製造できる。防腐剤
、安定剤、バッファー、酸化防止剤および／またはその他の添加剤も必要に応じ
て含んでよい。
【００５３】
好ましくは、「予防的に有効な量の」または「治療上有効な量の」（予防は治
療と考えられうるが、場合に応じて）本発明の医薬上有用な化合物を個人に与え
るが、これは個人に利益を十分に示すものである。典型的には、これが、例えば
、ムスカリン受容体、好ましくはムスカリン受容体サブタイプの1種での一次リ
ガンドの作用を調節する化合物を用いて患者において治療上有用な作用を引き起
こす。投与される化合物の実際量、および投与の速度および時間的経過は治療さ
れる症状の性質および重篤度によって異なる。治療処方、例えば、用量などの決
定は一般開業医およびその他の医師の責任内にあり、典型的には、治療される疾
患、個々の患者の症状、送達部位、投与法および開業医に公知のその他の因子を
考慮する。前記の技術およびプロトコールの例はRemingtonのPharmaceutical Sc
iences, 16版, Oslo, A.（編), 1980に見出せる。
療と考えられうるが、場合に応じて）本発明の医薬上有用な化合物を個人に与え
るが、これは個人に利益を十分に示すものである。典型的には、これが、例えば
、ムスカリン受容体、好ましくはムスカリン受容体サブタイプの1種での一次リ
ガンドの作用を調節する化合物を用いて患者において治療上有用な作用を引き起
こす。投与される化合物の実際量、および投与の速度および時間的経過は治療さ
れる症状の性質および重篤度によって異なる。治療処方、例えば、用量などの決
定は一般開業医およびその他の医師の責任内にあり、典型的には、治療される疾
患、個々の患者の症状、送達部位、投与法および開業医に公知のその他の因子を
考慮する。前記の技術およびプロトコールの例はRemingtonのPharmaceutical Sc
iences, 16版, Oslo, A.（編), 1980に見出せる。
【００５４】
特に、化合物はムスカリン受容体でのAChの作用によって媒介される症状の治
療において有用であり得る。これらの例としてアルツハイマー病、パーキンソン
病、動揺病、ハンチントン舞踏病、精神分裂病、鬱病、不安、鎮静、痛覚脱失、
卒中、予備麻酔、鎮痙、過敏性大腸症候群、膀胱失調症または貯留、消化性潰瘍
疾患、気管支炎／喘息／慢性閉塞性気道疾患、洞性徐脈、ペースメーカー調節、
緑内障、無弛緩症、症候性びまん性食道痙攣症、胆管ジスキネジア、強皮症、糖
尿病、下部食道機能不全、腸偽閉塞、睡眠調節、瞳孔径の制御または神経性胃炎
が挙げられる。
療において有用であり得る。これらの例としてアルツハイマー病、パーキンソン
病、動揺病、ハンチントン舞踏病、精神分裂病、鬱病、不安、鎮静、痛覚脱失、
卒中、予備麻酔、鎮痙、過敏性大腸症候群、膀胱失調症または貯留、消化性潰瘍
疾患、気管支炎／喘息／慢性閉塞性気道疾患、洞性徐脈、ペースメーカー調節、
緑内障、無弛緩症、症候性びまん性食道痙攣症、胆管ジスキネジア、強皮症、糖
尿病、下部食道機能不全、腸偽閉塞、睡眠調節、瞳孔径の制御または神経性胃炎
が挙げられる。
【００５５】
症状の種類および重篤度によって、組成物を約0.01ないし20mg、より好ましく
は0.02ないし10mgの化合物/患者の体重1kgの初回量を提供するよう投与できる。
前記のように、その他の投与処方および組成物に含まれる化合物の適当量の決定
は当業者によって容易に決定され得る。
は0.02ないし10mgの化合物/患者の体重1kgの初回量を提供するよう投与できる。
前記のように、その他の投与処方および組成物に含まれる化合物の適当量の決定
は当業者によって容易に決定され得る。
【００５６】材料
3H-NMS(81-86Ci/mmol)はAmercham International UKから入手し、35S-GTPyS(1
000-1400Ci/mmol)はNEN, Bostonから入手した。硫酸ブルシン、三ヨウ化ガラミ
ンおよび塩化AChはSigma Chemical Co., Dorset, UKから入手した。スタウロス
ポリンはSigmaおよびAlexis Corporation, Nottingham, UKから入手した。Go 78
74(1i)、Go 6976(1h)およびK-252c(1g)はCalbiochem, N0ttingham, UKから入手
した。K-252a(1b)およびK-252b(1c)はAlexisおよびTCS Biologicals Ltd, Bucki
ngham, UKから入手した。KT5823(1e)およびKT5720(1a)はTCS、 Calbiochemおよ
びAlexisから入手した。KT5926(1d)はTCSおよびCalbiochemから入手した。WIN 5
1708(2b)およびWIN 62577(2c)はRBI(Semat)、St Albans, UKから入手した。2の
類似体は一般的なスキーム：
000-1400Ci/mmol)はNEN, Bostonから入手した。硫酸ブルシン、三ヨウ化ガラミ
ンおよび塩化AChはSigma Chemical Co., Dorset, UKから入手した。スタウロス
ポリンはSigmaおよびAlexis Corporation, Nottingham, UKから入手した。Go 78
74(1i)、Go 6976(1h)およびK-252c(1g)はCalbiochem, N0ttingham, UKから入手
した。K-252a(1b)およびK-252b(1c)はAlexisおよびTCS Biologicals Ltd, Bucki
ngham, UKから入手した。KT5823(1e)およびKT5720(1a)はTCS、 Calbiochemおよ
びAlexisから入手した。KT5926(1d)はTCSおよびCalbiochemから入手した。WIN 5
1708(2b)およびWIN 62577(2c)はRBI(Semat)、St Albans, UKから入手した。2の
類似体は一般的なスキーム：
【化３】
に従う文献法を用いて合成し生成物を必要に応じてさらに化学修飾した。化合物
または関連物の合成のためのさらなる補助は参照文献の節に列挙される、Bajwa
およびSykes(1978-1980)による研究論文に提供されている。
または関連物の合成のためのさらなる補助は参照文献の節に列挙される、Bajwa
およびSykes(1978-1980)による研究論文に提供されている。
【００５７】方法 細胞培養および膜調製
：
ヒトムスカリンM1〜M4受容体をコードするｃDNAを安定に発現するCHO細胞(Buc
kleyら, 1989)を37℃にて5%のCO2下で10%(v/v)の生まれたての子牛の血清、50U/
mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシンおよび2mMのグルタミンを含有
するα-MEM培地(GIBCO)で増殖させた。細胞はコンフルエンスまで増殖させすく
い取って低張培地（20mMのHepes＋10mMのEDTA、pH7.4）に入れて回収した。膜は
0℃にてポリトロンでホモゲナイズし、次いで遠心分離（40,000×g、15分）する
ことによって調製し、20mMのHepes＋0.1mMのEDTA、pH7.4中で1度洗浄し、-70℃
にて同一バッファー中に2〜5mg/mlのタンパク質濃度で保存した。タンパク質濃
度は標準としてウシ血清アルブミンを用いてBioRad試薬で測定した。受容体の収
率はバッチごとに異なったが、M1、M2、M3およびM4サブタイプそれぞれについて
総膜タンパク質の約10、1、2および2pmol/mgであった。
kleyら, 1989)を37℃にて5%のCO2下で10%(v/v)の生まれたての子牛の血清、50U/
mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシンおよび2mMのグルタミンを含有
するα-MEM培地(GIBCO)で増殖させた。細胞はコンフルエンスまで増殖させすく
い取って低張培地（20mMのHepes＋10mMのEDTA、pH7.4）に入れて回収した。膜は
0℃にてポリトロンでホモゲナイズし、次いで遠心分離（40,000×g、15分）する
ことによって調製し、20mMのHepes＋0.1mMのEDTA、pH7.4中で1度洗浄し、-70℃
にて同一バッファー中に2〜5mg/mlのタンパク質濃度で保存した。タンパク質濃
度は標準としてウシ血清アルブミンを用いてBioRad試薬で測定した。受容体の収
率はバッチごとに異なったが、M1、M2、M3およびM4サブタイプそれぞれについて
総膜タンパク質の約10、1、2および2pmol/mgであった。
【００５８】放射リガンド結合アッセイ
：
特に断りのない限り、凍結膜を解凍し、20mMのHepes＋100mMのNaCl＋10mMのMg
Cl2を含有するインキュベーションバッファー（pH7.4）に再懸濁して放射リガン
ドおよび非標識薬剤とともに1mlの容積で30℃にて2時間インキュベートした。膜
はBrandel細胞収穫器(Semat, Herts, UK)を用いて濾過することで、0.1％のポリ
エチレンイミンで予浸したガラスファイバーフィルター(Whatman GF/B)上に回収
し、シンチレーション液(ReadySafe, Beckman)中で一晩抽出してBeckman LS6000
シンチレーションカウンターで放射活性をカウントした。膜タンパク質濃度（5
〜50μg/ml）は添加した放射リガンドの約15％以下が結合するよう調節した。非
特異的結合は10-6MのQNB（ピコモル効力を有するアンタゴニスト）の存在下で測
定したところ、総結合の1〜5％を占めていた。GTPは非標識AChを含むアッセイに
おいて2×10-4Mの濃度で存在した。データ点は通常2組で測定した。CHO細胞膜は
コリンエステラーゼ活性を保持しない(GnageyおよびEllis, 1996; Lazarenoおよ
びBirdsall, 1993)ので、AChはコリンエステラーゼ阻害剤の不在下で使用できる
。化合物はジメチルスルホキシドに溶解したが、2％という最高最終濃度でも結
合に作用を及ぼさなかった。
Cl2を含有するインキュベーションバッファー（pH7.4）に再懸濁して放射リガン
ドおよび非標識薬剤とともに1mlの容積で30℃にて2時間インキュベートした。膜
はBrandel細胞収穫器(Semat, Herts, UK)を用いて濾過することで、0.1％のポリ
エチレンイミンで予浸したガラスファイバーフィルター(Whatman GF/B)上に回収
し、シンチレーション液(ReadySafe, Beckman)中で一晩抽出してBeckman LS6000
シンチレーションカウンターで放射活性をカウントした。膜タンパク質濃度（5
〜50μg/ml）は添加した放射リガンドの約15％以下が結合するよう調節した。非
特異的結合は10-6MのQNB（ピコモル効力を有するアンタゴニスト）の存在下で測
定したところ、総結合の1〜5％を占めていた。GTPは非標識AChを含むアッセイに
おいて2×10-4Mの濃度で存在した。データ点は通常2組で測定した。CHO細胞膜は
コリンエステラーゼ活性を保持しない(GnageyおよびEllis, 1996; Lazarenoおよ
びBirdsall, 1993)ので、AChはコリンエステラーゼ阻害剤の不在下で使用できる
。化合物はジメチルスルホキシドに溶解したが、2％という最高最終濃度でも結
合に作用を及ぼさなかった。
【００５９】実験設計およびデータ解析
：
一般的データ予備処理、ならびに「親和性比」算出および半定量的平衡アッセ
イの慣例のプロットはMinitab(Minitab Ltd, Coventry, UK)を用いて実施した。
その他のアッセイはSigmaPlot(SPSS Inc., Erkrath, Germany)の適合手順を用い
て非線形回帰分析で解析した。この手順は2種以上の独立変数、例えば、2種の薬
剤の濃度を使用できるという点で比較的強力である。
イの慣例のプロットはMinitab(Minitab Ltd, Coventry, UK)を用いて実施した。
その他のアッセイはSigmaPlot(SPSS Inc., Erkrath, Germany)の適合手順を用い
て非線形回帰分析で解析した。この手順は2種以上の独立変数、例えば、2種の薬
剤の濃度を使用できるという点で比較的強力である。
【００６０】受容体に対するアロステリック剤の親和性および 3 H-NMSおよびAChとのその協同
性の大きさの推定のための平衡結合アッセイ ： 設計および解析は詳細に記載されている(LazarenoおよびBirdsall, 1995；Laz
arenoら, 1998)。便宜には、低濃度の3H-NMS(Kdの1〜2倍)の特異的結合をいくつ
かの濃度の試験薬剤の存在下、すべて1種以上の濃度のAChの不在および存在下で
測定した。高濃度の3H-NMS（Kdの5〜10倍）の特異的結合も測定した。非線形回
帰分析を用いてデータを方程式１：
性の大きさの推定のための平衡結合アッセイ ： 設計および解析は詳細に記載されている(LazarenoおよびBirdsall, 1995；Laz
arenoら, 1998)。便宜には、低濃度の3H-NMS(Kdの1〜2倍)の特異的結合をいくつ
かの濃度の試験薬剤の存在下、すべて1種以上の濃度のAChの不在および存在下で
測定した。高濃度の3H-NMS（Kdの5〜10倍）の特異的結合も測定した。非線形回
帰分析を用いてデータを方程式１：
【数１】
｛式中、BLAXは観察された特異的に結合した放射リガンドであり、L、AおよびX
はそれぞれ3H-NMS、AChおよびアロステリック剤の濃度であり、KL、KAおよびKX
は対応するリガンドと受容体の親和性定数であり、αおよびβはそれぞれXと3H-
NMSおよびAChとのアロステリック定数であり、nはAChの結合を記述するロジステ
ィック勾配係数であり、かつ、sはXの結合を記述する「シルド(Schild)勾配」因
子である。アロステリックモデルによればsは1であるべきである。｝に適合させ
た。
はそれぞれ3H-NMS、AChおよびアロステリック剤の濃度であり、KL、KAおよびKX
は対応するリガンドと受容体の親和性定数であり、αおよびβはそれぞれXと3H-
NMSおよびAChとのアロステリック定数であり、nはAChの結合を記述するロジステ
ィック勾配係数であり、かつ、sはXの結合を記述する「シルド(Schild)勾配」因
子である。アロステリックモデルによればsは1であるべきである。｝に適合させ
た。
【００６１】
ある濃度以上で、いくつかのアロステリック剤、特に3H-NMSと中立または正の
協同性を示すものは結合が平衡に達しないほど3H-NMS結合の動態速度を落とし得
る。ほとんどの場合において、薬剤の存在下で3H-NMS結合が平衡に達するのを可
能するのに十分なインキュベーション時間を用いた。しかしながら、いくつかの
場合には、最高濃度の薬剤は結合平衡に達するのを阻害するのに十分なほどに3H
-NMS動態速度を落とすと予測され、これらの場合にはデータは方程式２：
協同性を示すものは結合が平衡に達しないほど3H-NMS結合の動態速度を落とし得
る。ほとんどの場合において、薬剤の存在下で3H-NMS結合が平衡に達するのを可
能するのに十分なインキュベーション時間を用いた。しかしながら、いくつかの
場合には、最高濃度の薬剤は結合平衡に達するのを阻害するのに十分なほどに3H
-NMS動態速度を落とすと予測され、これらの場合にはデータは方程式２：
【数２】
｛式中、BLAXtは非平衡条件下で観察された特異的結合であり、BLAXは方程式１
で定義される予測平衡結合であり、tはインキュベーション時間であり、koffは3 H-NMSの解離速度定数であり、かつ、BL0は結合した放射リガンドの初期量であり
、この場合には0に設定される。｝によりよく適合した。この方程式は3H-NMSの
アロステリック剤占有受容体からの解離は無視できるものであり、かつ、AChお
よびアロステリック剤双方の結合動態は3H-NMSの解離速度と比較して速いと仮定
している。
で定義される予測平衡結合であり、tはインキュベーション時間であり、koffは3 H-NMSの解離速度定数であり、かつ、BL0は結合した放射リガンドの初期量であり
、この場合には0に設定される。｝によりよく適合した。この方程式は3H-NMSの
アロステリック剤占有受容体からの解離は無視できるものであり、かつ、AChお
よびアロステリック剤双方の結合動態は3H-NMSの解離速度と比較して速いと仮定
している。
【００６２】
単一の濃度のAChのみを使用する場合には、データを「親和性比」プロットで
可視化したが、ここで親和性比とは特定の濃度の試験薬剤の存在下での「一次」
リガンド（3H-NMSまたはACh）の見かけの親和性を試験薬剤の不在下での一次リ
ガンドの見かけの親和性で除したものである。理論的には、親和性比プロットの
EC50またはIC50は遊離受容体での試験薬剤のKdに相当し、漸近レベルは試験薬剤
および一次リガンドの協同性定数に相当する(LazarenoおよびBirdsall, 1995)。
親和性比は以下のように特定の結合データから算出した(LazarenoおよびBirdsal
l, 1999)： 単一濃度の試験薬剤の存在下での3H-NMSの親和性比は方程式：
可視化したが、ここで親和性比とは特定の濃度の試験薬剤の存在下での「一次」
リガンド（3H-NMSまたはACh）の見かけの親和性を試験薬剤の不在下での一次リ
ガンドの見かけの親和性で除したものである。理論的には、親和性比プロットの
EC50またはIC50は遊離受容体での試験薬剤のKdに相当し、漸近レベルは試験薬剤
および一次リガンドの協同性定数に相当する(LazarenoおよびBirdsall, 1995)。
親和性比は以下のように特定の結合データから算出した(LazarenoおよびBirdsal
l, 1999)： 単一濃度の試験薬剤の存在下での3H-NMSの親和性比は方程式：
【数３】
によって与えられる。
【００６３】
単一濃度の試験薬剤の存在下でのAChの親和性比は方程式：
【数４】
｛式中、BLは低[3H-NMS]単独の存在下での結合であり；BL1は高[3H-NMS]の存在
下での結合であり；BLAは低[3H-NMS]およびAChの存在下での結合であり；BLXは
低[3H-NMS]および特定の濃度の試験薬剤の存在下での結合であり；BLAXは低[3H-
NMS]、AChおよび同一濃度の試験薬剤の存在下での結合であり；Lは低3H-NMS濃度
であり：L1は高3H-NMS濃度であり；ならびにqは低および高3H-NMS濃度の比、L/L 1 である｝によって与えられる。
下での結合であり；BLAは低[3H-NMS]およびAChの存在下での結合であり；BLXは
低[3H-NMS]および特定の濃度の試験薬剤の存在下での結合であり；BLAXは低[3H-
NMS]、AChおよび同一濃度の試験薬剤の存在下での結合であり；Lは低3H-NMS濃度
であり：L1は高3H-NMS濃度であり；ならびにqは低および高3H-NMS濃度の比、L/L 1 である｝によって与えられる。
【００６４】
いくつかのACh濃度を含むアッセイを用いて、親和性比プロットを、必要に応
じて方程式１または2へのデータセットの適合からのパラメーター推定値を用い
て算出した(LazarenoおよびBirdsall, 1995)。3H-NMSおよびAChの親和性比、rL
およびrAはそれぞれ方程式：
じて方程式１または2へのデータセットの適合からのパラメーター推定値を用い
て算出した(LazarenoおよびBirdsall, 1995)。3H-NMSおよびAChの親和性比、rL
およびrAはそれぞれ方程式：
【数５】
および
【数６】
｛式中、記号は前記に同じである｝によって与えられる。
【００６５】アロステリック剤の 3 H-NMS占有受容体に対する親和性を推定するオフレート(off -rate)アッセイ
：
高濃度の膜（2〜4mgタンパク質/ml）を高濃度の3H-NMS（5nM）とともに約15分
間インキュベートした。次いで、10μlのアリコートをいくつかの濃度のアロス
テリック剤の存在下で空または1mlの10-6MのQNBのみを含むチューブに分配した
（典型的にはn=4）。非特異的結合は10μlの膜および2μlの3H-NMS+QNBを含有す
る個別に調製したチューブで測定した。しばらくした後、すなわち約2.5解離半
減期（表２参照）後サンプルを濾過した。データは式： koff=ln(B0/Bt)/t {式中、B0は最初に結合した放射リガンドであり、Btはt分の解離後に残存する結
合した放射リガンドである。}を用いて速度定数koffに変換した。これらの値は
最終的に真の3H-NMS解離速度定数（アロステリック剤の不在下でのkoff）の%阻
害として表し、非線形回帰分析を用いてロジスティック関数に適合させた。理論
的には、3H-NMS解離の阻害が受容体の形状のアロステリック変化によって引き起
こされるのか、または結合したアロステリック剤によるその結合ポケットにおけ
る3H-NMSの捕捉によって引き起こされるのかにかかわらず、曲線は1の勾配を有
し、3H-NMS占有受容体でのアロステリック剤の占有曲線に対応するはずである(L
azarenoおよびBirdsall, 1995)。最初に、曲線を制限なしに適合させた。勾配係
数が1と異なるものではなく、かつ、最大阻害（「Emax」）が約100%を超えなか
った場合には、勾配を1に制限してEmaxを適合させた。適合させたEmaxが100%を
超えた場合には（実験によるばらつきまたはエラーを除いては物理的に不可能な
こと）、Emaxを100に制限して勾配を適合させた。検討中の化合物では、Emaxは1
00未満であることが多く、ほとんどのかかる場合には、データは1に制限した勾
配とよく適合した。
間インキュベートした。次いで、10μlのアリコートをいくつかの濃度のアロス
テリック剤の存在下で空または1mlの10-6MのQNBのみを含むチューブに分配した
（典型的にはn=4）。非特異的結合は10μlの膜および2μlの3H-NMS+QNBを含有す
る個別に調製したチューブで測定した。しばらくした後、すなわち約2.5解離半
減期（表２参照）後サンプルを濾過した。データは式： koff=ln(B0/Bt)/t {式中、B0は最初に結合した放射リガンドであり、Btはt分の解離後に残存する結
合した放射リガンドである。}を用いて速度定数koffに変換した。これらの値は
最終的に真の3H-NMS解離速度定数（アロステリック剤の不在下でのkoff）の%阻
害として表し、非線形回帰分析を用いてロジスティック関数に適合させた。理論
的には、3H-NMS解離の阻害が受容体の形状のアロステリック変化によって引き起
こされるのか、または結合したアロステリック剤によるその結合ポケットにおけ
る3H-NMSの捕捉によって引き起こされるのかにかかわらず、曲線は1の勾配を有
し、3H-NMS占有受容体でのアロステリック剤の占有曲線に対応するはずである(L
azarenoおよびBirdsall, 1995)。最初に、曲線を制限なしに適合させた。勾配係
数が1と異なるものではなく、かつ、最大阻害（「Emax」）が約100%を超えなか
った場合には、勾配を1に制限してEmaxを適合させた。適合させたEmaxが100%を
超えた場合には（実験によるばらつきまたはエラーを除いては物理的に不可能な
こと）、Emaxを100に制限して勾配を適合させた。検討中の化合物では、Emaxは1
00未満であることが多く、ほとんどのかかる場合には、データは1に制限した勾
配とよく適合した。
【００６６】GTPγS結合アッセイ
：
M1受容体を発現する膜（5〜20μg/ml）を35S-GTPγS（0.1nM）、GDP（10-7M）
およびリガンドとともに1mlの容積のインキュベーションバッファー中で30〜60
分間30℃にてインキュベートした。結合した標識は濾過により、水で予め濡らし
たガラスファイバーフィルター上に回収した。
およびリガンドとともに1mlの容積のインキュベーションバッファー中で30〜60
分間30℃にてインキュベートした。結合した標識は濾過により、水で予め濡らし
たガラスファイバーフィルター上に回収した。
【００６７】第1部 結果
検討した化合物の構造を明細書末尾に示す。図1は、一定濃度のAChの不在下お
よび存在下でM1受容体における平衡3H-NMS結合に及ぼす化合物1f(スタウロスポ
リン)の影響を示している。3H-NMS結合は、10μMまでのスタウロスポリン濃度に
より増加し、30μMで減少した。3H-NMS結合の増加は、Bmax(データは示されてい
ない)の増加ではなく3H-NMSのKdの減少を反映している。30μMのスタウロスポリ
ンを用いたときの結合の減少は、高濃度のスタウロスポリンによる3H-NMS速度論
の遅れ(以下を参照されたい)およびそれに伴う3H-NMS結合の平衡化の欠如(Lazar
eno and Birdsall, 1995)によって引き起こされる。ACh結合に及ぼすスタウロス
ポリンの影響は、図1を調べても明確にはならないが、3H-NMS速度論に及ぼす高
濃度のスタウロスポリンの影響を考慮に入れてデータの非線形回帰分析を行った
ところ、データにうまく適合し(図1中の線)、AChとスタウロスポリンとの間で4
倍の負の協同性が見いだされた。4つの受容体サブタイプにおける3H-NMS結合お
よびACh結合に及ぼすスタウロスポリンの独立した影響は、結合データを親和性
比に変換するとより容易に視覚化される(Lazareno and Birdsall, 1995; Lazare
no et al, 1998)(図2)。理論上、親和性比プロットのEC50もしくはIC50は、遊離
受容体に対する試験薬剤のKdに相当し、漸近値は一次リガンドとの協同性に相当
する。スタウロスポリン(1f)は、M1およびM2受容体において3H-NMSとの正の協同
性を示し、M4受容体において3H-NMSとの中立の協同性を示し、そしてM3受容体で
は不活性もしくは中立の協同性であった。それは、M1、M2およびM4サブタイプに
おいてAChとの負の協同性を有し、M3受容体ではAChに対して中立もしくは不活性
であった。スタウロスポリンは、非占有受容体に対してμM領域のKd値を有して
いた(図2、表1)。M1受容体を用いてAChによる35S-GTPγS結合の促進を測定する2
つの機能アッセイにおいて、10μMのスタウロスポリンは、基礎活性およびEmax
をそれぞれ17%±7%および25%±4%低減し、さらにAChの効力を2.9±0.9分の1に減
少させた。これは、3H-NMS結合研究から予測された3.6倍の変化と一致する(デー
タは示されていない)。
よび存在下でM1受容体における平衡3H-NMS結合に及ぼす化合物1f(スタウロスポ
リン)の影響を示している。3H-NMS結合は、10μMまでのスタウロスポリン濃度に
より増加し、30μMで減少した。3H-NMS結合の増加は、Bmax(データは示されてい
ない)の増加ではなく3H-NMSのKdの減少を反映している。30μMのスタウロスポリ
ンを用いたときの結合の減少は、高濃度のスタウロスポリンによる3H-NMS速度論
の遅れ(以下を参照されたい)およびそれに伴う3H-NMS結合の平衡化の欠如(Lazar
eno and Birdsall, 1995)によって引き起こされる。ACh結合に及ぼすスタウロス
ポリンの影響は、図1を調べても明確にはならないが、3H-NMS速度論に及ぼす高
濃度のスタウロスポリンの影響を考慮に入れてデータの非線形回帰分析を行った
ところ、データにうまく適合し(図1中の線)、AChとスタウロスポリンとの間で4
倍の負の協同性が見いだされた。4つの受容体サブタイプにおける3H-NMS結合お
よびACh結合に及ぼすスタウロスポリンの独立した影響は、結合データを親和性
比に変換するとより容易に視覚化される(Lazareno and Birdsall, 1995; Lazare
no et al, 1998)(図2)。理論上、親和性比プロットのEC50もしくはIC50は、遊離
受容体に対する試験薬剤のKdに相当し、漸近値は一次リガンドとの協同性に相当
する。スタウロスポリン(1f)は、M1およびM2受容体において3H-NMSとの正の協同
性を示し、M4受容体において3H-NMSとの中立の協同性を示し、そしてM3受容体で
は不活性もしくは中立の協同性であった。それは、M1、M2およびM4サブタイプに
おいてAChとの負の協同性を有し、M3受容体ではAChに対して中立もしくは不活性
であった。スタウロスポリンは、非占有受容体に対してμM領域のKd値を有して
いた(図2、表1)。M1受容体を用いてAChによる35S-GTPγS結合の促進を測定する2
つの機能アッセイにおいて、10μMのスタウロスポリンは、基礎活性およびEmax
をそれぞれ17%±7%および25%±4%低減し、さらにAChの効力を2.9±0.9分の1に減
少させた。これは、3H-NMS結合研究から予測された3.6倍の変化と一致する(デー
タは示されていない)。
【００６８】
スタウロスポリンはまた、3H-NMS解離を抑制（本明細書では阻害と同義語とし
て使用する）した(図3)。曲線はすべて勾配係数1を有していた。スタウロスポリ
ンは、M1受容体において最も強力かつ効果的であり、1μMのIC50を有して3H-NMS
解離を見かけ上完全に抑制した。それは、他の受容体サブタイプでは1/3〜1/4の
強さであり、3H-NMS解離の最大下(submaximal)抑制を惹起し、M3受容体において
最小の効果を呈して67%の抑制率であった。3H-NMS解離の抑制に対するIC50値は
、3H-NMSリガンド結合受容体に対するスタウロスポリンのKd値に理論上対応し、
M1およびM2受容体における値は、アロステリックモデルによる平衡結合研究から
予測される値と一致する(表2)。M4受容体における予測値と観測値との間には2倍
のずれを生じた。これはおそらく、3H-NMSとの負の協同性の小さな度合いを測定
する際の誤差が原因であろう。M3受容体における平衡結合研究では、スタウロス
ポリンは、3H-NMSもしくはAChのいずれの結合に対してもほとんどもしくはまっ
たく影響を及ぼさなかった。同一の濃度範囲にわたりスタウロスポリンによって 3 H-NMS解離が抑制されることはあきらかであるので、スタウロスポリンはM3受容
体において不活性ではなく3H-NMSおよびAChに対して中立の協同性であったこと
が示唆される。
て使用する）した(図3)。曲線はすべて勾配係数1を有していた。スタウロスポリ
ンは、M1受容体において最も強力かつ効果的であり、1μMのIC50を有して3H-NMS
解離を見かけ上完全に抑制した。それは、他の受容体サブタイプでは1/3〜1/4の
強さであり、3H-NMS解離の最大下(submaximal)抑制を惹起し、M3受容体において
最小の効果を呈して67%の抑制率であった。3H-NMS解離の抑制に対するIC50値は
、3H-NMSリガンド結合受容体に対するスタウロスポリンのKd値に理論上対応し、
M1およびM2受容体における値は、アロステリックモデルによる平衡結合研究から
予測される値と一致する(表2)。M4受容体における予測値と観測値との間には2倍
のずれを生じた。これはおそらく、3H-NMSとの負の協同性の小さな度合いを測定
する際の誤差が原因であろう。M3受容体における平衡結合研究では、スタウロス
ポリンは、3H-NMSもしくはAChのいずれの結合に対してもほとんどもしくはまっ
たく影響を及ぼさなかった。同一の濃度範囲にわたりスタウロスポリンによって 3 H-NMS解離が抑制されることはあきらかであるので、スタウロスポリンはM3受容
体において不活性ではなく3H-NMSおよびAChに対して中立の協同性であったこと
が示唆される。
【００６９】
スタウロスポリンの開環類似体であり正荷電が残っているGo 7874(1i)は、M1
、M2およびM4受容体において3H-NMSとの弱い負の協同性およびAChとのより強い
負の協同性を示し、M3受容体において逆のパターンを示した(図2)。データをア
ロステリックモデルにうまく適合させるために、Go 7874(1i)の場合には勾配係
数>1を結合式に導入する必要があった(表1)。Go 7874は、M1、M2およびM4受容体
において3H-NMS解離の見かけ上完全な抑制を、M3受容体において最大下抑制を引
き起こした。M1、M2およびM4受容体における曲線の勾配は、同様に>1であった(
図3、表2)。三元複合体アロステリックモデルからは1以外の勾配係数が予測され
ないので、データに対して完全な機構的説明を与えることはできない。しかしな
がら、3H-NMS占有受容体に対するGo 7874の親和性値を平衡結合研究からのモデ
ルにより予測すると、その値はM1およびM4受容体における観測値ときわめてよく
一致し(表2)、M2およびM3受容体においてわずか3倍のずれを生じるにすぎない。
このずれはおそらく、M2およびM3サブタイプにおける平衡研究で現れる小さな協
同性効果およびM3受容体からの3H-NMS解離に対する小さな抑制効果を測定する際
の誤差が組み合わさって生じたものと思われる。
、M2およびM4受容体において3H-NMSとの弱い負の協同性およびAChとのより強い
負の協同性を示し、M3受容体において逆のパターンを示した(図2)。データをア
ロステリックモデルにうまく適合させるために、Go 7874(1i)の場合には勾配係
数>1を結合式に導入する必要があった(表1)。Go 7874は、M1、M2およびM4受容体
において3H-NMS解離の見かけ上完全な抑制を、M3受容体において最大下抑制を引
き起こした。M1、M2およびM4受容体における曲線の勾配は、同様に>1であった(
図3、表2)。三元複合体アロステリックモデルからは1以外の勾配係数が予測され
ないので、データに対して完全な機構的説明を与えることはできない。しかしな
がら、3H-NMS占有受容体に対するGo 7874の親和性値を平衡結合研究からのモデ
ルにより予測すると、その値はM1およびM4受容体における観測値ときわめてよく
一致し(表2)、M2およびM3受容体においてわずか3倍のずれを生じるにすぎない。
このずれはおそらく、M2およびM3サブタイプにおける平衡研究で現れる小さな協
同性効果およびM3受容体からの3H-NMS解離に対する小さな抑制効果を測定する際
の誤差が組み合わさって生じたものと思われる。
【００７０】
スタウロスポリンの環縮小類似体でありメチルアミノ基がメチルエステルで置
き換えられたKT5823(1e)は、M1およびM2受容体において3H-NMS結合の大きな増加
を引き起こし、これらの受容体においてAChとの中立もしくはやや正の協同性を
示した。KT5823は、M3およびM4受容体において不活性であるかもしくは3H-NMSお
よびAChに対して中立の協同性であった(図2)。M1受容体においてNMSとの正の協
同性が機能研究で確認された。この研究では、1mMのKT5823が、M1受容体におけ
るAChの35S-GTPγS結合促進能力を1.9±0.9倍に増加させ、非標識NMSの親和性を
3.3±1.7倍に増加させた(n=2、データは示されていない)。KT5823は、3H-NMS解
離をM1受容体において完全に、M2受容体において80%、そしてM3およびM4受容体
において30〜40%抑制した(図3)。3H-NMS占有受容体に対するKT5823の親和性をM1 およびM2受容体における平衡研究から推定したところ、その値は直接測定した値
に非常に類似していた。M3およびM4受容体において3H-NMS解離の抑制が観測され
たことから、KT5823はこれらの受容体において不活性ではなく3H-NMSおよびACh
に対して中立の協同性であることが示唆される。
き換えられたKT5823(1e)は、M1およびM2受容体において3H-NMS結合の大きな増加
を引き起こし、これらの受容体においてAChとの中立もしくはやや正の協同性を
示した。KT5823は、M3およびM4受容体において不活性であるかもしくは3H-NMSお
よびAChに対して中立の協同性であった(図2)。M1受容体においてNMSとの正の協
同性が機能研究で確認された。この研究では、1mMのKT5823が、M1受容体におけ
るAChの35S-GTPγS結合促進能力を1.9±0.9倍に増加させ、非標識NMSの親和性を
3.3±1.7倍に増加させた(n=2、データは示されていない)。KT5823は、3H-NMS解
離をM1受容体において完全に、M2受容体において80%、そしてM3およびM4受容体
において30〜40%抑制した(図3)。3H-NMS占有受容体に対するKT5823の親和性をM1 およびM2受容体における平衡研究から推定したところ、その値は直接測定した値
に非常に類似していた。M3およびM4受容体において3H-NMS解離の抑制が観測され
たことから、KT5823はこれらの受容体において不活性ではなく3H-NMSおよびACh
に対して中立の協同性であることが示唆される。
【００７１】
KT5823のヘキシルエステル類似体であるKT5720(1a)は、M1受容体において3H-N
MSおよびAChの両方に対して正の協同性であった(図1、表1)。より詳細なアッセ
イにおいて、ACh親和性がすこし(40%)増加することが確認された（図5）。KT572
0は、M3受容体においてほとんどもしくはまったく影響を及ぼさず、M4受容体に
おいて3H-NMSとの中立の協同性およびAChとの負の協同性を示した。M2受容体に
おけるKT5720の作用は不明である。初期のバッチは3H-NMSおよびAChに対してや
や抑制効果を示したが(図2)、その後のバッチは3H-NMSに対してやや正の効果を
示した(データは示されていない)。他のサブタイプでは、バッチ依存効果はみら
れなかった。KT5720は、M1、M3およびM4受容体において3H-NMS解離の不完全な抑
制を引き起こしたが、M2受容体においてほとんどもしくはまったく影響を及ぼさ
なかった(図3)。最大の効果は、M1受容体を用いたときに観測され、このサブタ
イプ単独では、低濃度のKT5720によって少ないが矛盾のない3H-NMS解離の増加が
起こった。11回の単一時間点アッセイのうちの10回のアッセイにおいて、この現
象が観測され、その際、3H-NMSの解離速度定数(koff)は、10〜300nMの最も効果
的な濃度のKT5720の存在下で11±1%増加し(n=10)、2回の全時間的経過研究にお
いて、koffは、0.1μMのKT5720の存在下で16.3±0.5%増加した(データは示され
ていない)。3H-NMS占有受容体に対するKT5720の親和性をM1およびM4受容体にお
ける平衡研究から推定したところ、その値は直接測定した値に類似していた(表2
)。
MSおよびAChの両方に対して正の協同性であった(図1、表1)。より詳細なアッセ
イにおいて、ACh親和性がすこし(40%)増加することが確認された（図5）。KT572
0は、M3受容体においてほとんどもしくはまったく影響を及ぼさず、M4受容体に
おいて3H-NMSとの中立の協同性およびAChとの負の協同性を示した。M2受容体に
おけるKT5720の作用は不明である。初期のバッチは3H-NMSおよびAChに対してや
や抑制効果を示したが(図2)、その後のバッチは3H-NMSに対してやや正の効果を
示した(データは示されていない)。他のサブタイプでは、バッチ依存効果はみら
れなかった。KT5720は、M1、M3およびM4受容体において3H-NMS解離の不完全な抑
制を引き起こしたが、M2受容体においてほとんどもしくはまったく影響を及ぼさ
なかった(図3)。最大の効果は、M1受容体を用いたときに観測され、このサブタ
イプ単独では、低濃度のKT5720によって少ないが矛盾のない3H-NMS解離の増加が
起こった。11回の単一時間点アッセイのうちの10回のアッセイにおいて、この現
象が観測され、その際、3H-NMSの解離速度定数(koff)は、10〜300nMの最も効果
的な濃度のKT5720の存在下で11±1%増加し(n=10)、2回の全時間的経過研究にお
いて、koffは、0.1μMのKT5720の存在下で16.3±0.5%増加した(データは示され
ていない)。3H-NMS占有受容体に対するKT5720の親和性をM1およびM4受容体にお
ける平衡研究から推定したところ、その値は直接測定した値に類似していた(表2
)。
【００７２】
KT5823のメトキシ基がヒドロキシル基で置き換えられたK-252a(1b)は、M1受容
体において3H-NMSとの正の協同性およびAChとの中立もしくはやや負の協同性を
示した(図2、表1)。他のサブタイプを用いた平衡結合研究では、ほとんどもしく
はまったく効果が観測されなかった。K-252aは、M1受容体において3H-NMS解離を
見かけ上100%抑制した。データをうまく適合させるために、勾配係数>1にする必
要があった。他のサブタイプにおいて、ほんのわずかではあるか矛盾のない3H-N
MS解離速度に及ぼす効果が観測された(図3、表2)。
体において3H-NMSとの正の協同性およびAChとの中立もしくはやや負の協同性を
示した(図2、表1)。他のサブタイプを用いた平衡結合研究では、ほとんどもしく
はまったく効果が観測されなかった。K-252aは、M1受容体において3H-NMS解離を
見かけ上100%抑制した。データをうまく適合させるために、勾配係数>1にする必
要があった。他のサブタイプにおいて、ほんのわずかではあるか矛盾のない3H-N
MS解離速度に及ぼす効果が観測された(図3、表2)。
【００７３】
K252b(1c)、K252c(1g)、KT-5926(1d)およびGo 6976(1h)は、10μMの濃度まで
、3H-NMSおよびAChの平衡結合ならびに3H-NMSの解離に対してほとんどもしくは
まったく影響を及ぼさず、さらなる研究は行わなかった。
、3H-NMSおよびAChの平衡結合ならびに3H-NMSの解離に対してほとんどもしくは
まったく影響を及ぼさず、さらなる研究は行わなかった。
【００７４】
我々は、他の既知のアロステリック薬剤が作用する受容体上の同一部位におい
て相互作用を介して先に記載のアロステリック効果が起こるかを調べようと試み
た。図5aは、M1受容体における平衡3H-NMS結合に及ぼすKT5720(1a)とガラミンと
の相互作用の影響を示している。ガラミンは、予想されたとおり3H-NMS結合に対
して抑制効果を有し、KT5720は、予想されたとおり3H-NMSとの正の協同性を示し
た。ガラミンおよびKT5720を同一部位に作用させた場合、ガラミンは、KT5720の
存在下で効力が低下するはずであり、非線形回帰分析から、2つの薬剤間の強い
負の協同性が示唆された。実際には、分析の結果、中立の協同性であることがあ
きらかにされた。すなわち、平衡結合研究において、ガラミンおよびKT5720は、
離れていて見かけ上相互作用のない部位を介して、M1受容体においてアロステリ
ックに相互作用する。しかしながら、M1受容体においてスタウロスポリンおよび
ガラミンを用いて類似の実験を行ったところ、これらの化合物間には負の協同作
用もしくは拮抗作用が存在していた。
て相互作用を介して先に記載のアロステリック効果が起こるかを調べようと試み
た。図5aは、M1受容体における平衡3H-NMS結合に及ぼすKT5720(1a)とガラミンと
の相互作用の影響を示している。ガラミンは、予想されたとおり3H-NMS結合に対
して抑制効果を有し、KT5720は、予想されたとおり3H-NMSとの正の協同性を示し
た。ガラミンおよびKT5720を同一部位に作用させた場合、ガラミンは、KT5720の
存在下で効力が低下するはずであり、非線形回帰分析から、2つの薬剤間の強い
負の協同性が示唆された。実際には、分析の結果、中立の協同性であることがあ
きらかにされた。すなわち、平衡結合研究において、ガラミンおよびKT5720は、
離れていて見かけ上相互作用のない部位を介して、M1受容体においてアロステリ
ックに相互作用する。しかしながら、M1受容体においてスタウロスポリンおよび
ガラミンを用いて類似の実験を行ったところ、これらの化合物間には負の協同作
用もしくは拮抗作用が存在していた。
【００７５】
KT5720が作用して3H-NMS解離に影響を及ぼすM1受容体上の部位を調べるために
、それぞれ2もしくは3つの濃度のガラミン、ブルシンおよびスタウロスポリンの
存在下で、KT5720の濃度依存的効果を測定した。2つの独立したアッセイで非常
に類似した結果が得られた。データをまとめて図6に示す。各条件におけるデー
タは、2つの形態、すなわち、いずれの試験試薬も存在させずに測定される全体
的対照(すなわち、「真の」)koffに対する抑制パーセントとして、およびそれぞ
れの曲線に対して試験薬剤の存在下およびKT5720の不在下で測定されるそれ自体
の対照koffに対する分率として、示されている。この後者の「分率効果」尺度は
、有用な性質を有している。KT5720と試験薬剤との相互作用が競合的である場合
、試験薬剤の存在下で、EC50は増加し、漸近的「分率効果」も変化するであろう
。相互作用が非競合的および非相互的である場合(すなわち、中立の協同性)、し
かも最大濃度の試験薬剤が3H-NMS解離を完全に抑制する場合、試験薬剤の存在下
で、EC50および漸近レベルは両方とも不変である。
、それぞれ2もしくは3つの濃度のガラミン、ブルシンおよびスタウロスポリンの
存在下で、KT5720の濃度依存的効果を測定した。2つの独立したアッセイで非常
に類似した結果が得られた。データをまとめて図6に示す。各条件におけるデー
タは、2つの形態、すなわち、いずれの試験試薬も存在させずに測定される全体
的対照(すなわち、「真の」)koffに対する抑制パーセントとして、およびそれぞ
れの曲線に対して試験薬剤の存在下およびKT5720の不在下で測定されるそれ自体
の対照koffに対する分率として、示されている。この後者の「分率効果」尺度は
、有用な性質を有している。KT5720と試験薬剤との相互作用が競合的である場合
、試験薬剤の存在下で、EC50は増加し、漸近的「分率効果」も変化するであろう
。相互作用が非競合的および非相互的である場合(すなわち、中立の協同性)、し
かも最大濃度の試験薬剤が3H-NMS解離を完全に抑制する場合、試験薬剤の存在下
で、EC50および漸近レベルは両方とも不変である。
【００７６】
図6の上部パネル中の線(スタウロスポリンが存在する場合は除く)は、データ
に対して双曲的当てはめを行ったものである。低濃度のKT5720が3H-NMS解離を増
大させる効果はすべての曲線に現れた。データをそれ自身の対照に対する分率効
果として表現した場合、種々の濃度のガラミンもしくはブルシンの存在下におけ
るKT5720の曲線はオーバーラップする。すなわち、それらは同一のEC50および漸
近レベルを有する。ガラミンの存在下において、効力が濃度に依存してすこし増
大したが、これはおそらく実験誤差であろう。なぜなら、正の協同作用が存在す
るのであれば、「それ自身の対照に対する分率」プロットの漸近レベルが低下す
るはずだからである。したがって、これらのデータは、M1受容体からの3H-NMS解
離を抑制するようにガラミンおよびブルシンが作用する部位とは異なる部位にKT
5720が作用することを示唆する。
に対して双曲的当てはめを行ったものである。低濃度のKT5720が3H-NMS解離を増
大させる効果はすべての曲線に現れた。データをそれ自身の対照に対する分率効
果として表現した場合、種々の濃度のガラミンもしくはブルシンの存在下におけ
るKT5720の曲線はオーバーラップする。すなわち、それらは同一のEC50および漸
近レベルを有する。ガラミンの存在下において、効力が濃度に依存してすこし増
大したが、これはおそらく実験誤差であろう。なぜなら、正の協同作用が存在す
るのであれば、「それ自身の対照に対する分率」プロットの漸近レベルが低下す
るはずだからである。したがって、これらのデータは、M1受容体からの3H-NMS解
離を抑制するようにガラミンおよびブルシンが作用する部位とは異なる部位にKT
5720が作用することを示唆する。
【００７７】
スタウロスポリンでは、全く異なるパターンの結果が観測された。低濃度のKT
5720の促進効果はより明瞭にあらわれ、曲線は、ガラミンもしくはブルシンが存
在する場合よりも高い濃度のKT5720に収束する傾向がある。EC50値を正確に測定
することはできなかったが、「分率効果」プロットを調べると、スタウロスポリ
ンがKT5720の効力を低下させたことが示唆される。これらの結果から、スタウロ
スポリンおよびKT5720は、3H-NMS解離の抑制を仲介する部位に関して競合すると
考えられる。スタウロスポリンはガラミンもしくはブルシンとは異なる部位に作
用する可能性があることが強く示唆される。
5720の促進効果はより明瞭にあらわれ、曲線は、ガラミンもしくはブルシンが存
在する場合よりも高い濃度のKT5720に収束する傾向がある。EC50値を正確に測定
することはできなかったが、「分率効果」プロットを調べると、スタウロスポリ
ンがKT5720の効力を低下させたことが示唆される。これらの結果から、スタウロ
スポリンおよびKT5720は、3H-NMS解離の抑制を仲介する部位に関して競合すると
考えられる。スタウロスポリンはガラミンもしくはブルシンとは異なる部位に作
用する可能性があることが強く示唆される。
【００７８】考察
我々が調べた9種のインドロカルバゾールのうちの5種は、ムスカリン様受容体
においてアロステリックに作用する。これらのうち、4種は、類似の構造を有し
、それらのアロステリック効果に関していくつかの類似点が存在するが、5つ目
のGo 7874(1i)は、テトラヒドロフラン/ピラン環系が欠失しており、そのことが
、いくらか異なる効果を生じる原因であると思われる。
においてアロステリックに作用する。これらのうち、4種は、類似の構造を有し
、それらのアロステリック効果に関していくつかの類似点が存在するが、5つ目
のGo 7874(1i)は、テトラヒドロフラン/ピラン環系が欠失しており、そのことが
、いくらか異なる効果を生じる原因であると思われる。
【００７９】
平衡結合研究において、4種の活性スタウロスポリン様化合物(スタウロスポリ
ン(1f)、KT5823(1e)、KT5720(1a)、およびK-252a(1b))は、3H-NMSとの正もしく
は中立の協同性を示したのみであるのに対して、AChでは、正、中立および負の
協同性が観測された。4種の化合物は、M1受容体において3H-NMSとの最大の親和
性および最大の正の効果を示したが、それらはM3受容体において不活性(もしく
は3H-NMSおよびAChに対して中立の協同性)であった。これらの化合物は、1の勾
配係数で結合した。ただし、M1受容体におけるKT5823は除く。この例外の原因は
、部分的には、この化合物で観測される3H-NMSとの強い(7〜10倍)正の協同性か
ら生じるアーティファクトであると思われる。スタウロスポリン以外の正に帯電
したリガンドであるGo 7874(1i)もまた、M1受容体に対して選択性を示したが、
他の4種の化合物とは対照的に、3H-NMSとの負の協同性およびAChとの中立および
負の両方の協同性を示し、1より大きい勾配係数で結合した。
ン(1f)、KT5823(1e)、KT5720(1a)、およびK-252a(1b))は、3H-NMSとの正もしく
は中立の協同性を示したのみであるのに対して、AChでは、正、中立および負の
協同性が観測された。4種の化合物は、M1受容体において3H-NMSとの最大の親和
性および最大の正の効果を示したが、それらはM3受容体において不活性(もしく
は3H-NMSおよびAChに対して中立の協同性)であった。これらの化合物は、1の勾
配係数で結合した。ただし、M1受容体におけるKT5823は除く。この例外の原因は
、部分的には、この化合物で観測される3H-NMSとの強い(7〜10倍)正の協同性か
ら生じるアーティファクトであると思われる。スタウロスポリン以外の正に帯電
したリガンドであるGo 7874(1i)もまた、M1受容体に対して選択性を示したが、
他の4種の化合物とは対照的に、3H-NMSとの負の協同性およびAChとの中立および
負の両方の協同性を示し、1より大きい勾配係数で結合した。
【００８０】
4種のスタウロスポリン様化合物はまた、3H-NMS占有M1受容体に対しても選択
性を示したが、このことは、親和性よりも3H-NMS解離の抑制の大きさにおいて、
より明瞭に現れた。先の場合と同様に、これらの化合物は、勾配1で3H-NMS占有
受容体に結合した。ただし、M1受容体におけるK-252aは除く。Go 7874は、1より
もかなり大きい勾配係数を有してM1、M2およびM4受容体からの3H-NMS解離を完全
に抑制した。
性を示したが、このことは、親和性よりも3H-NMS解離の抑制の大きさにおいて、
より明瞭に現れた。先の場合と同様に、これらの化合物は、勾配1で3H-NMS占有
受容体に結合した。ただし、M1受容体におけるK-252aは除く。Go 7874は、1より
もかなり大きい勾配係数を有してM1、M2およびM4受容体からの3H-NMS解離を完全
に抑制した。
【００８１】
平衡結合アッセイにおける化合物の活性と3H-NMS解離の最大の抑制度との間に
関連性が存在するように思われる。すなわち、特定のサブタイプにおいて50%未
満の3H-NMS解離抑制を示す化合物は、平衡研究において不活性であり、一方、50
%を超えて3H-NMS解離を遅らせる化合物は、平衡研究において活性であるという
アドホックな関係が現在のデータから得られる。この規則は、20件中17件で有効
であり、例外は、M3受容体におけるスタウロスポリン、M3受容体におけるGo 787
4およびM4受容体におけるKT5720である。平衡状態のアロステリック活性と3H-NM
S解離の抑制度との間の正の関係は、アロステリック薬剤の結合が受容体上の一
次リガンド認識部位を妨害する度合いを反映している可能性がある。試験薬剤が 3 H-NMS解離を抑制するが平衡状態で不活性である場合は、平衡状態での試験薬剤
の結合の欠如を反映しているのではなく、協同作用の欠如、すなわち、中立の協
同性を実際に反映している可能性がある。
関連性が存在するように思われる。すなわち、特定のサブタイプにおいて50%未
満の3H-NMS解離抑制を示す化合物は、平衡研究において不活性であり、一方、50
%を超えて3H-NMS解離を遅らせる化合物は、平衡研究において活性であるという
アドホックな関係が現在のデータから得られる。この規則は、20件中17件で有効
であり、例外は、M3受容体におけるスタウロスポリン、M3受容体におけるGo 787
4およびM4受容体におけるKT5720である。平衡状態のアロステリック活性と3H-NM
S解離の抑制度との間の正の関係は、アロステリック薬剤の結合が受容体上の一
次リガンド認識部位を妨害する度合いを反映している可能性がある。試験薬剤が 3 H-NMS解離を抑制するが平衡状態で不活性である場合は、平衡状態での試験薬剤
の結合の欠如を反映しているのではなく、協同作用の欠如、すなわち、中立の協
同性を実際に反映している可能性がある。
【００８２】
アロステリックモデルによれば、3H-NMS占有受容体に対する試験薬剤の親和性
は、2つの独立した方法、すなわち、3H-NMS解離に及ぼす影響を直接測定するこ
とから、および平衡状態で測定される遊離受容体に対する親和性と3H-NMSとの協
同性との積から、推定することが可能である。本研究では、比較しうる十分な精
度でこれらの尺度が決定された例が11件存在する。尺度間には良好な一致がみら
れた。3件の比較では約3倍の差異、1件では約2倍の差異、そして残りの7件では6
0%以下の差異であった。5例では平衡推定値が直接測定値よりも大きく、7例では
小さかったので、自明な偏りは存在しなかった。Go 7874(1i)およびK-252a(1b)
で観測された鋭い勾配はモデルにより予測されないが、これらの結果は、アロス
テリックモデルによりデータを解釈することができることを示唆している。
は、2つの独立した方法、すなわち、3H-NMS解離に及ぼす影響を直接測定するこ
とから、および平衡状態で測定される遊離受容体に対する親和性と3H-NMSとの協
同性との積から、推定することが可能である。本研究では、比較しうる十分な精
度でこれらの尺度が決定された例が11件存在する。尺度間には良好な一致がみら
れた。3件の比較では約3倍の差異、1件では約2倍の差異、そして残りの7件では6
0%以下の差異であった。5例では平衡推定値が直接測定値よりも大きく、7例では
小さかったので、自明な偏りは存在しなかった。Go 7874(1i)およびK-252a(1b)
で観測された鋭い勾配はモデルにより予測されないが、これらの結果は、アロス
テリックモデルによりデータを解釈することができることを示唆している。
【００８３】
この単純なモデルでは、マイクロモル以下の濃度において解離が初期に約15%
促進され、続いて、より高濃度において解離の最大下抑制が起こるM1受容体にお
ける3H-NMS解離に及ぼすKT5720の影響を説明することはできない。スタウロスポ
リンの存在下では、促進効果はより顕著になり、一方、3H-NMS解離を遅らせるKT
5720の能力は減少するようにみえた。このことから、KT5720は2つの異なる部位
で効果を発揮し、そのうちの一方だけがスタウロスポリンによっても占有されう
ると考えられる。これとは対照的に、ガラミンもしくはブルシンが存在してもKT
5720の能力もその分率漸近効果も影響を受けなかった。このことから、スタウロ
スポリンとは異なり、ガラミンおよびブルシンは、KT5720が3H-NMS解離を調節す
る部位とは異なる部位に作用し、KT5720の結合とガラミンもしくはブルシンの結
合との間には相互作用は存在しない（すなわち中立の協同性）と考えられる。
促進され、続いて、より高濃度において解離の最大下抑制が起こるM1受容体にお
ける3H-NMS解離に及ぼすKT5720の影響を説明することはできない。スタウロスポ
リンの存在下では、促進効果はより顕著になり、一方、3H-NMS解離を遅らせるKT
5720の能力は減少するようにみえた。このことから、KT5720は2つの異なる部位
で効果を発揮し、そのうちの一方だけがスタウロスポリンによっても占有されう
ると考えられる。これとは対照的に、ガラミンもしくはブルシンが存在してもKT
5720の能力もその分率漸近効果も影響を受けなかった。このことから、スタウロ
スポリンとは異なり、ガラミンおよびブルシンは、KT5720が3H-NMS解離を調節す
る部位とは異なる部位に作用し、KT5720の結合とガラミンもしくはブルシンの結
合との間には相互作用は存在しない（すなわち中立の協同性）と考えられる。
【００８４】
類似の結論をM1受容体における平衡結合研究から導くことができる。平衡結合
研究では、KT5720はガラミンとの相互作用を示さなかった。これとは対照的に、
スタウロスポリンおよびガラミンを用いたM1受容体における類似の平衡結合研究
では、負の協同作用もしくは競合的作用が実証された。スタウロスポリン(負)お
よびKT5720(中立)によって示されるガラミンとの異なる相互作用は、ガラミンと
同様にスタウロスポリンが正に帯電した分子でありKT5720が中性であるという事
実に関連づけられる。
研究では、KT5720はガラミンとの相互作用を示さなかった。これとは対照的に、
スタウロスポリンおよびガラミンを用いたM1受容体における類似の平衡結合研究
では、負の協同作用もしくは競合的作用が実証された。スタウロスポリン(負)お
よびKT5720(中立)によって示されるガラミンとの異なる相互作用は、ガラミンと
同様にスタウロスポリンが正に帯電した分子でありKT5720が中性であるという事
実に関連づけられる。
【００８５】
これらの結果は、KT5720およびおそらく他のインドロカルバゾールが、ガラミ
ンおよびほとんどの他のアロステリック薬剤が結合する「共通のアロステリック
部位」とは異なるムスカリン様受容体上のアロステリック部位に結合することを
示唆する。既に報告されているアロステリック薬剤は、作用上重要であると考え
られる正に帯電した窒素を有している。スタウロスポリンおよびGo 7874もまた
、正に帯電しているが、他の活性なインドロカルバゾールは中性である。このこ
とから、この新しいアロステリック部位においては正に帯電した窒素は必要ない
と考えられる。観測された親和性および協同性は、類似体の化学構造のわずかな
変化に感応する。たとえば、K-252aのエステル基のアルキル鎖の長さを増大させ
るかまたはそのヒドロキシ基をメチル化すると親和性は3〜15倍に増加し、一方
、K-252aのエステル上のメチル基を除去するかもしくはインドロカルバゾール環
をアルコキシ置換すると、見かけ上不活性な化合物を生じる。
ンおよびほとんどの他のアロステリック薬剤が結合する「共通のアロステリック
部位」とは異なるムスカリン様受容体上のアロステリック部位に結合することを
示唆する。既に報告されているアロステリック薬剤は、作用上重要であると考え
られる正に帯電した窒素を有している。スタウロスポリンおよびGo 7874もまた
、正に帯電しているが、他の活性なインドロカルバゾールは中性である。このこ
とから、この新しいアロステリック部位においては正に帯電した窒素は必要ない
と考えられる。観測された親和性および協同性は、類似体の化学構造のわずかな
変化に感応する。たとえば、K-252aのエステル基のアルキル鎖の長さを増大させ
るかまたはそのヒドロキシ基をメチル化すると親和性は3〜15倍に増加し、一方
、K-252aのエステル上のメチル基を除去するかもしくはインドロカルバゾール環
をアルコキシ置換すると、見かけ上不活性な化合物を生じる。
【００８６】
ここで研究した薬剤は、種々のプロテインキナーゼの強力な阻害剤であること
が知られており、ほとんどの場合、これらの薬剤は、ムスカリン様受容体よりも
これらの標的に対してずっと大きな親和性を示すが、特筆すべきことに、KT5720
は、その好ましい標的であるプロテインキナーゼA(PKA)に対して、M1受容体に対
する能力の約6倍高い能力を有するにすぎない(PKAではlog親和性が7.2であるの
に対して、M1受容体では6.4である)。
が知られており、ほとんどの場合、これらの薬剤は、ムスカリン様受容体よりも
これらの標的に対してずっと大きな親和性を示すが、特筆すべきことに、KT5720
は、その好ましい標的であるプロテインキナーゼA(PKA)に対して、M1受容体に対
する能力の約6倍高い能力を有するにすぎない(PKAではlog親和性が7.2であるの
に対して、M1受容体では6.4である)。
【００８７】
我々の目的の1つは、M1受容体においてAChの親和性を増大させるが他のサブタ
イプにおいてACh結合および機能に影響を及ぼさない薬剤の開発であった。KT572
0のアロステリック特性を検出することは、この目標に向けてのステップであり
うる。KT5720は、M1受容体における最も強力な化合物であり、遊離受容体に対す
るlog親和性は6.4であった。また、KT5720は、すこし(40%)ではあるが矛盾のな
いAChとの正の協同性を示した。このほか、KT5720は、他のサブタイプにおいてA
Ch親和性にほとんどもしくはまったく影響を及ぼさず、したがって、近似的にM1 受容体に対して「絶対的サブタイプ選択性」を呈しそうである。すなわち、1つ
の受容体サブタイプにおいてAChとの正もしくは負の協同性を示し、他のサブタ
イプにおいて中立の協同性を示す。結果として、いかなる濃度の薬剤を投与した
場合でも、1つの受容体サブタイプのみが機能的に影響を受ける(Lazareno and B
irdsall, 1995)。
イプにおいてACh結合および機能に影響を及ぼさない薬剤の開発であった。KT572
0のアロステリック特性を検出することは、この目標に向けてのステップであり
うる。KT5720は、M1受容体における最も強力な化合物であり、遊離受容体に対す
るlog親和性は6.4であった。また、KT5720は、すこし(40%)ではあるが矛盾のな
いAChとの正の協同性を示した。このほか、KT5720は、他のサブタイプにおいてA
Ch親和性にほとんどもしくはまったく影響を及ぼさず、したがって、近似的にM1 受容体に対して「絶対的サブタイプ選択性」を呈しそうである。すなわち、1つ
の受容体サブタイプにおいてAChとの正もしくは負の協同性を示し、他のサブタ
イプにおいて中立の協同性を示す。結果として、いかなる濃度の薬剤を投与した
場合でも、1つの受容体サブタイプのみが機能的に影響を受ける(Lazareno and B
irdsall, 1995)。
【００８８】
本節の結果は、ムスカリン様受容体におけるスタウロスポリンといくつかの他
のインドロカルバゾール類似体との極めて強力なアロステリック相互作用を示し
ており、その相互作用は、少なくともKT5720の場合には、「共通のアロステリッ
ク部位」とは異なる部位で起こる。活性なインドロカルバゾールは、3H-NMS解離
に対してさまざまな最大効果を引き起こし、3H-NMS解離に対する最大効果の大き
さは、平衡研究で検出される活性の良好な予測子であることから、2つの作用に
対して共通の機構が示唆される。一般的には、平衡アッセイおよび解離アッセイ
から得られる結果は、観測される作用の根底をなす機構としての三元アロステリ
ック複合体モデルと互いに一致した。
のインドロカルバゾール類似体との極めて強力なアロステリック相互作用を示し
ており、その相互作用は、少なくともKT5720の場合には、「共通のアロステリッ
ク部位」とは異なる部位で起こる。活性なインドロカルバゾールは、3H-NMS解離
に対してさまざまな最大効果を引き起こし、3H-NMS解離に対する最大効果の大き
さは、平衡研究で検出される活性の良好な予測子であることから、2つの作用に
対して共通の機構が示唆される。一般的には、平衡アッセイおよび解離アッセイ
から得られる結果は、観測される作用の根底をなす機構としての三元アロステリ
ック複合体モデルと互いに一致した。
【００８９】第2部 結果
我々はまた、明細書末尾に示された一般式2で表される第2のファミリーの化合
物の相互作用についても調べた。図7は、これらの構造に対するオフレートアッ
セイから得られたデータを示し、表3にはパラメーター推定値がまとめられてい
る。図8および9は、平衡アッセイから得られた親和性比プロットを示し、表4に
はパラメーター推定値がまとめられている。
物の相互作用についても調べた。図7は、これらの構造に対するオフレートアッ
セイから得られたデータを示し、表3にはパラメーター推定値がまとめられてい
る。図8および9は、平衡アッセイから得られた親和性比プロットを示し、表4に
はパラメーター推定値がまとめられている。
【００９０】
2b(WIN 51708)は、M2およびM4受容体において約10倍のM4選択性で3H-NMS解離
を強力に抑制した。また、M1受容体において最大下抑制を引き起こし、M3受容体
では影響はみられなかった。5-6二重結合を有する2c(WIN 62577)は、3H-NMS占有
M4受容体に対する親和性を約1/10に低減し、M2受容体においてより小さな最大効
果を生じた。これらの効果は、平衡アッセイにも現れた。平衡アッセイでは、2b
は、M2受容体において3H-NMSとの正の協同性をすこし示し、M4受容体においてよ
り大きな正の効果を示したのに対して、たかだか1/5の能力である2cは、3H-NMS
との負の協同性をわずかに示した。AChに対して、2bは、M1およびM3受容体にお
いて負の協同性をすこし示し、M2およびM4受容体においてより大きな負の効果を
示し、一方、2cは、M2およびM4受容体において同様に負であり、M1受容体におい
てほとんど中立であり、そしてM3受容体においてAChとの正の相互作用をすこし(
1.5倍)示した。この後者の効果は、より詳細なアッセイにおいて確認された(た
とえば図10)。特筆すべきこととして、M3受容体において2bおよび2cは両方とも
効力があり3H-NMSとの負の協同性をすこし示したので、オフレートアッセイでは
M3受容体においていくらかの活性を呈するはずであったが、活性は観測されなか
った。
を強力に抑制した。また、M1受容体において最大下抑制を引き起こし、M3受容体
では影響はみられなかった。5-6二重結合を有する2c(WIN 62577)は、3H-NMS占有
M4受容体に対する親和性を約1/10に低減し、M2受容体においてより小さな最大効
果を生じた。これらの効果は、平衡アッセイにも現れた。平衡アッセイでは、2b
は、M2受容体において3H-NMSとの正の協同性をすこし示し、M4受容体においてよ
り大きな正の効果を示したのに対して、たかだか1/5の能力である2cは、3H-NMS
との負の協同性をわずかに示した。AChに対して、2bは、M1およびM3受容体にお
いて負の協同性をすこし示し、M2およびM4受容体においてより大きな負の効果を
示し、一方、2cは、M2およびM4受容体において同様に負であり、M1受容体におい
てほとんど中立であり、そしてM3受容体においてAChとの正の相互作用をすこし(
1.5倍)示した。この後者の効果は、より詳細なアッセイにおいて確認された(た
とえば図10)。特筆すべきこととして、M3受容体において2bおよび2cは両方とも
効力があり3H-NMSとの負の協同性をすこし示したので、オフレートアッセイでは
M3受容体においていくらかの活性を呈するはずであったが、活性は観測されなか
った。
【００９１】
2cから橋頭窒素を除去すると2aが得られ、M1およびM2受容体において親和性が
10倍に増加し、M3受容体では30倍に増加するが、M４受容体では親和性はほとん
どもしくはまったく変化しなかった。M１受容体において、これはlog親和性が6.
5であり、これらの化合物中で最も強力であった。受容体サブタイプのいずれに
おいても、3H-NMSおよびAChの両方に対して2〜5倍の負の協同性を示した。オフ
レートアッセイにおいて、2aは、3H-NMS解離を促進するという特有の効果を示し
た。また、M3受容体において3H-NMSオフレートが2〜3倍に増加し、他のサブタイ
プにおいてより少ない効果を示し、有効性の順序はM3>M1>M4>M2であった。この
効果は、完全解離アッセイにおいて確認された(図11)。
10倍に増加し、M3受容体では30倍に増加するが、M４受容体では親和性はほとん
どもしくはまったく変化しなかった。M１受容体において、これはlog親和性が6.
5であり、これらの化合物中で最も強力であった。受容体サブタイプのいずれに
おいても、3H-NMSおよびAChの両方に対して2〜5倍の負の協同性を示した。オフ
レートアッセイにおいて、2aは、3H-NMS解離を促進するという特有の効果を示し
た。また、M3受容体において3H-NMSオフレートが2〜3倍に増加し、他のサブタイ
プにおいてより少ない効果を示し、有効性の順序はM3>M1>M4>M2であった。この
効果は、完全解離アッセイにおいて確認された(図11)。
【００９２】
2aのエチニル基およびヒドロキシ基をケト基で置き換えた2fおよび2iにおいて
は、オフレートアッセイ(図7)および平衡アッセイ(データは示されていない)に
おける活性が完全に消失する。
は、オフレートアッセイ(図7)および平衡アッセイ(データは示されていない)に
おける活性が完全に消失する。
【００９３】
2bおよび2cからエチニル置換基を除去して、17-ヒドロキシ類似体2dおよび2e
を得た。これらの化合物は、オフレートアッセイにおいて、それらの対応する類
似体よりもわずかに大きい効力を有し、M1受容体においてより大きな抑制効果を
示したが、依然として3H-NMS占有M3受容体ではほとんどもしくはまったく影響を
受けなかった。平衡研究において(図8)、2dは、すべてのサブタイプにおいて3H-
NMSとの正の協同性を示し、M4受容体におけるそのlog親和性は7であり、これは
本研究で最も強力な相互作用であった。2eは、3H-NMSに対してやや負、中立およ
び正の効果を示した。化合物は両方ともAChとの負の協同性を示したが、2eは、M 3 受容体においてAChとの正の協同性をすこし(30%)示した。
を得た。これらの化合物は、オフレートアッセイにおいて、それらの対応する類
似体よりもわずかに大きい効力を有し、M1受容体においてより大きな抑制効果を
示したが、依然として3H-NMS占有M3受容体ではほとんどもしくはまったく影響を
受けなかった。平衡研究において(図8)、2dは、すべてのサブタイプにおいて3H-
NMSとの正の協同性を示し、M4受容体におけるそのlog親和性は7であり、これは
本研究で最も強力な相互作用であった。2eは、3H-NMSに対してやや負、中立およ
び正の効果を示した。化合物は両方ともAChとの負の協同性を示したが、2eは、M 3 受容体においてAChとの正の協同性をすこし(30%)示した。
【００９４】
2gおよび2jは、2bのステロイド部分の2つの環が欠失した2bの類似体である。2
gはトランス異性体として報告され、2jはシス異性体として報告されている。2b
自体はトランス配置を有しているので、2gがオフレートアッセイ(図7)および平
衡アッセイ(データは示されていない)において実質的に不活性であり、一方、2j
が、オフレートアッセイ(2bの約1/10〜1/100の強さであるが)においてならびに3 H-NMSおよびAChに対して大きな負の作用および2bのわずか1/2〜1/5の強さを与え
た平衡アッセイにおいて強い活性を示したことは、非常に驚くべきことである。
gはトランス異性体として報告され、2jはシス異性体として報告されている。2b
自体はトランス配置を有しているので、2gがオフレートアッセイ(図7)および平
衡アッセイ(データは示されていない)において実質的に不活性であり、一方、2j
が、オフレートアッセイ(2bの約1/10〜1/100の強さであるが)においてならびに3 H-NMSおよびAChに対して大きな負の作用および2bのわずか1/2〜1/5の強さを与え
た平衡アッセイにおいて強い活性を示したことは、非常に驚くべきことである。
【００９５】
2lは、2jの末端切断型であり、もはやキラルではない。これもまた活性であり
、オフレートアッセイでは2jに類似した効力(およびM3受容体に対してより大き
な効果)を示したが、平衡アッセイでは、特にM2およびM4受容体において効力は
より小さく(図9)、これらのサブタイプにおいて3H-NMSとの正の協同性を惹起し
た。
、オフレートアッセイでは2jに類似した効力(およびM3受容体に対してより大き
な効果)を示したが、平衡アッセイでは、特にM2およびM4受容体において効力は
より小さく(図9)、これらのサブタイプにおいて3H-NMSとの正の協同性を惹起し
た。
【００９６】
2hは、2cのピリミドイミダゾール類似体であり、縮合ベンゼン環が欠失してい
る。この変化により、遊離受容体および3H-NMS占有受容体の両方に対して親和性
が1/2〜1/20に低減し、3H-NMSおよびAChとの負の協同性が増大した。
る。この変化により、遊離受容体および3H-NMS占有受容体の両方に対して親和性
が1/2〜1/20に低減し、3H-NMSおよびAChとの負の協同性が増大した。
【００９７】
2kは、ピリミジン環の異なる位置に結合されたイミダゾール環を有する2hの類
似体である。これは、3H-NMS占有受容体において2hの30〜200倍の親和性を有す
るか、もしくはM3サブタイプにおける小さな効果を正確に解釈すればM3受容体に
おいて1000倍より高い親和性を有するものであった。これはまた、遊離受容体に
対して2hの10〜50倍の親和性を有し、すべてのサブタイプにおいて1mM未満のKd
値を示した。これは、M1受容体において3H-NMSに対して強い正の協同性を示し(
図9)、M2およびM4受容体において3H-NMSに対して正であり、M3受容体においてや
や負であった。これはAChとの負の協同性が2〜4倍であった。
似体である。これは、3H-NMS占有受容体において2hの30〜200倍の親和性を有す
るか、もしくはM3サブタイプにおける小さな効果を正確に解釈すればM3受容体に
おいて1000倍より高い親和性を有するものであった。これはまた、遊離受容体に
対して2hの10〜50倍の親和性を有し、すべてのサブタイプにおいて1mM未満のKd
値を示した。これは、M1受容体において3H-NMSに対して強い正の協同性を示し(
図9)、M2およびM4受容体において3H-NMSに対して正であり、M3受容体においてや
や負であった。これはAChとの負の協同性が2〜4倍であった。
【００９８】
2kの類似体であるがステロイド骨格の16、17位にピリミドイミダゾール置換基
を有する2tは、不活性であった。このことから、この領域の置換は活性にとって
重要であることが裏付けられる。
を有する2tは、不活性であった。このことから、この領域の置換は活性にとって
重要であることが裏付けられる。
【００９９】
ムスカリン様受容体の一次部位もしくはアロステリック部位に結合するほとん
どの化合物は、塩基性窒素を有しているが、電荷が中和されたアンタゴニストも
報告されている。窒素を含有していない2種のステロイド構造(2mおよび2n)は、2
c、2h、2aおよび2kのステロイド部分に相当する。驚くべきことに、それらは、
オフレートアッセイおよび平衡アッセイのいずれにおいても活性を示し、2mは、
オフレートアッセイにおいて2hよりも効力が強いと思われる(図7)。17-ケト類似
体である2sおよび2-置換類似体である2o〜2rは、不活性であるようにみえた。
どの化合物は、塩基性窒素を有しているが、電荷が中和されたアンタゴニストも
報告されている。窒素を含有していない2種のステロイド構造(2mおよび2n)は、2
c、2h、2aおよび2kのステロイド部分に相当する。驚くべきことに、それらは、
オフレートアッセイおよび平衡アッセイのいずれにおいても活性を示し、2mは、
オフレートアッセイにおいて2hよりも効力が強いと思われる(図7)。17-ケト類似
体である2sおよび2-置換類似体である2o〜2rは、不活性であるようにみえた。
【０１００】
勾配係数に関して、化合物のほとんどは、平衡アッセイもしくは速度論的アッ
セイにおいて結合勾配1を有していた。しかしながら、比較的弱い化合物2l、2j
および2hは、より急な勾配を有しており、より複雑な相互作用が示唆された。
セイにおいて結合勾配1を有していた。しかしながら、比較的弱い化合物2l、2j
および2hは、より急な勾配を有しており、より複雑な相互作用が示唆された。
【０１０１】
3H-NMS解離を増加させる2aの効果は、他のアロステリック薬剤のときと同じ3H
-NMS占有受容体上の部位に2aが結合するかをアッセイする機会を与える。M3受容
体からの3H-NMSの解離速度定数(koff)は、単一時間点だけで、ある濃度範囲の2a
の存在下だけで、かつ1つ以上の濃度の他の薬剤の存在下で測定した。データは
、方法のところで説明したように、対照koffに対する%で表現し、式1であてはめ
を行った。結果を図12および表6に示す。ストリキニーネおよびガラミンは、2a
のEmaxを低下させた。このことから、それらは、2aにより占有される部位とは異
なる部位に作用すると考えられる。しかしながら、それらは、2aのEC50には影響
を及ぼさなかった。このことから、協同的相互作用が存在しなかった、すなわち
、それらは中立の協同性を示したと考えられる。これとは対照的に、1a(KT 5720
)、1f(スタウロスポリン)および2b(WIN 51708)は、2aのEmaxを変化させるように
はみえなかったが、その効力を低減させた。そして強力な負の相互作用を除外す
ることはできないが、競合的相互作用を仮定して、データのあてはめは良好に行
われた。これらの結果から、M1およびM3受容体上に2つのアロステリック部位が
存在することが立証される。特筆すべきこととして、2b(WIN 51708)は、3H-NMS
のkoffを変化させることはないが、あきらかに3H-NMS占有M3受容体に結合する。
-NMS占有受容体上の部位に2aが結合するかをアッセイする機会を与える。M3受容
体からの3H-NMSの解離速度定数(koff)は、単一時間点だけで、ある濃度範囲の2a
の存在下だけで、かつ1つ以上の濃度の他の薬剤の存在下で測定した。データは
、方法のところで説明したように、対照koffに対する%で表現し、式1であてはめ
を行った。結果を図12および表6に示す。ストリキニーネおよびガラミンは、2a
のEmaxを低下させた。このことから、それらは、2aにより占有される部位とは異
なる部位に作用すると考えられる。しかしながら、それらは、2aのEC50には影響
を及ぼさなかった。このことから、協同的相互作用が存在しなかった、すなわち
、それらは中立の協同性を示したと考えられる。これとは対照的に、1a(KT 5720
)、1f(スタウロスポリン)および2b(WIN 51708)は、2aのEmaxを変化させるように
はみえなかったが、その効力を低減させた。そして強力な負の相互作用を除外す
ることはできないが、競合的相互作用を仮定して、データのあてはめは良好に行
われた。これらの結果から、M1およびM3受容体上に2つのアロステリック部位が
存在することが立証される。特筆すべきこととして、2b(WIN 51708)は、3H-NMS
のkoffを変化させることはないが、あきらかに3H-NMS占有M3受容体に結合する。
【０１０２】考察
本明細書には、アロステリックにムスカリン様受容体と相互作用する新しい一
連の化合物が記載されている。最初のリード物質は、2種の市販の化合物2b(WIN
51708)および2c(WIN 62577)より提供した。これらの化合物は、ラットNK1受容体
における強力なアンタゴニストであるが、2bにより例証されるように、これらの
化合物の親和性は、ヒトNK1受容体では1/400に低減する。実際には、我々の結果
によると、2bは、ヒトニューロキニン受容体と比較してヒトムスカリン様受容体
に対してたかだか60倍の効力である。
連の化合物が記載されている。最初のリード物質は、2種の市販の化合物2b(WIN
51708)および2c(WIN 62577)より提供した。これらの化合物は、ラットNK1受容体
における強力なアンタゴニストであるが、2bにより例証されるように、これらの
化合物の親和性は、ヒトNK1受容体では1/400に低減する。実際には、我々の結果
によると、2bは、ヒトニューロキニン受容体と比較してヒトムスカリン様受容体
に対してたかだか60倍の効力である。
【０１０３】
これらの2種の化合物および本明細書に記載の類似体は、NMSおよび特にAChに
対して正、中立および弱い負の協同性を呈する。この後者の特性は、次の点で重
要である。すなわち、他のサブタイプにおいてAChに対して中立の協同性を有す
る(したがって、いずれの濃度においても不活性である)特異的ムスカリン様受容
体サブタイプにおけるアロステリックエンハンサーが、このシリーズで合成され
うることが示唆される。この形態の選択性は、親和性ではなく協同性に基づいて
、「絶対的サブタイプ選択性」と呼ばれ(Lazareno et al, 1998; Birdsall et a
l, 1999)、すべての我々の結合および機能データの解析を裏づける三元複合体ア
ロステリックモデル(Lazareno and Birdsall, 1995)の直接的な結果として得ら
れる。
対して正、中立および弱い負の協同性を呈する。この後者の特性は、次の点で重
要である。すなわち、他のサブタイプにおいてAChに対して中立の協同性を有す
る(したがって、いずれの濃度においても不活性である)特異的ムスカリン様受容
体サブタイプにおけるアロステリックエンハンサーが、このシリーズで合成され
うることが示唆される。この形態の選択性は、親和性ではなく協同性に基づいて
、「絶対的サブタイプ選択性」と呼ばれ(Lazareno et al, 1998; Birdsall et a
l, 1999)、すべての我々の結合および機能データの解析を裏づける三元複合体ア
ロステリックモデル(Lazareno and Birdsall, 1995)の直接的な結果として得ら
れる。
【０１０４】
三元複合体アロステリックモデルは、3H-NMS占有受容体に対する化合物の親和
性が、2つの方法により、すなわち、平衡アッセイから得られる遊離受容体に対
する親和性と3H-NMSに対する協同性との積として、およびオフレートアッセイか
ら得られるIC50(またはEC50)の逆数として、推定しうることを示唆する。表5は
、各タイプの尺度に対して少なくとも2つの観測値が存在する化合物のpKocc(平
衡研究から得られる)値とpKoff(オフレート研究から得られる)値との比較を示し
ている。32件の比較のうち、23件では、2つの尺度間のずれは、log単位で0.3(2
倍)未満であり、この値は、実験誤差により容易に説明される。ほとんどの他の
場合には、データ中の観測誤差もしくは化合物の効果からの予測誤差により、ず
れを説明することができる。M1受容体における2bと2cとのずれは、オフレートア
ッセイにおける効果が小さいことにより説明可能である。2dは、オフレートアッ
セイではM3受容体における効果が小さく、そしてパラメーターをうまく規定でき
るようにM4受容体においてはより低い濃度を用いなければならない。2jは、M2お
よびM4受容体において強い負の協同性を有しており、これについては、ここで使
用した実験デザインを用いて正確に測定することはできない。また、2kは、M3受
容体を用いるオフレートアッセイでは効果が非常に小さい。そのほか、2dおよび
2kのいずれについてもM2受容体におけるずれは3倍であり、これについての明確
な説明は存在しない。32件の観測値のうち、2つの異常値は、そのようなデータ
の予測しうる変動の範囲内に存在しうる。また、全体的に、データはこの比較的
厳しい試験に合格する。したがって、平衡結合および3H-NMS解離のいずれにおけ
る効果に対しても適用しうる根底をなす機構としての三元複合体アロステリック
モデルに対してデータが矛盾することはない。
性が、2つの方法により、すなわち、平衡アッセイから得られる遊離受容体に対
する親和性と3H-NMSに対する協同性との積として、およびオフレートアッセイか
ら得られるIC50(またはEC50)の逆数として、推定しうることを示唆する。表5は
、各タイプの尺度に対して少なくとも2つの観測値が存在する化合物のpKocc(平
衡研究から得られる)値とpKoff(オフレート研究から得られる)値との比較を示し
ている。32件の比較のうち、23件では、2つの尺度間のずれは、log単位で0.3(2
倍)未満であり、この値は、実験誤差により容易に説明される。ほとんどの他の
場合には、データ中の観測誤差もしくは化合物の効果からの予測誤差により、ず
れを説明することができる。M1受容体における2bと2cとのずれは、オフレートア
ッセイにおける効果が小さいことにより説明可能である。2dは、オフレートアッ
セイではM3受容体における効果が小さく、そしてパラメーターをうまく規定でき
るようにM4受容体においてはより低い濃度を用いなければならない。2jは、M2お
よびM4受容体において強い負の協同性を有しており、これについては、ここで使
用した実験デザインを用いて正確に測定することはできない。また、2kは、M3受
容体を用いるオフレートアッセイでは効果が非常に小さい。そのほか、2dおよび
2kのいずれについてもM2受容体におけるずれは3倍であり、これについての明確
な説明は存在しない。32件の観測値のうち、2つの異常値は、そのようなデータ
の予測しうる変動の範囲内に存在しうる。また、全体的に、データはこの比較的
厳しい試験に合格する。したがって、平衡結合および3H-NMS解離のいずれにおけ
る効果に対しても適用しうる根底をなす機構としての三元複合体アロステリック
モデルに対してデータが矛盾することはない。
【０１０５】
検討した2b、2cおよび類似体は、ごく簡単に言えば、平面状芳香族複素環系と
、脂環式環系、特にステロイド構造との縮合体であるとみなすことができる。最
も驚くべきこととして、ステロイド部分単独、たとえば、2n、(ただし、他の類
似体の中には該当しないものもある)および複素環系(2l)はいずれも、独立して
、3H-NMSとアロステリックに相互作用することが可能であり、互いに同等な親和
性を有している。この結果は、これらの化合物が同一のファルマコホアの異なる
が連続しているサブドメインと相互作用し得ることを示唆している。
、脂環式環系、特にステロイド構造との縮合体であるとみなすことができる。最
も驚くべきこととして、ステロイド部分単独、たとえば、2n、(ただし、他の類
似体の中には該当しないものもある)および複素環系(2l)はいずれも、独立して
、3H-NMSとアロステリックに相互作用することが可能であり、互いに同等な親和
性を有している。この結果は、これらの化合物が同一のファルマコホアの異なる
が連続しているサブドメインと相互作用し得ることを示唆している。
【０１０６】
アロステリック部位への結合は、ステロイド環を一定にした場合、複素環の性
質に感応する(2h、2aおよび2kを2cと比較されたい)。同様に、ステロイド環上の
17-置換基の性質も、縮合系において重要であると思われる。17-ケト官能基を有
する類似体は不活性であるのに対して、17βヒドロキシル基を有する化合物はす
べて活性である。17-αエチニル基が存在すると、それより微妙な効果を生じ(お
もにM4受容体に関して)、こうした効果は、5-6結合が飽和状態であるときの効果
と互いに関連づけられるように思われる。
質に感応する(2h、2aおよび2kを2cと比較されたい)。同様に、ステロイド環上の
17-置換基の性質も、縮合系において重要であると思われる。17-ケト官能基を有
する類似体は不活性であるのに対して、17βヒドロキシル基を有する化合物はす
べて活性である。17-αエチニル基が存在すると、それより微妙な効果を生じ(お
もにM4受容体に関して)、こうした効果は、5-6結合が飽和状態であるときの効果
と互いに関連づけられるように思われる。
【０１０７】
他の驚くべき結果としては、2jが活性であるのに対して、2gが見かけ上不活性
であることが挙げられる。これらの化合物は両方とも、ラセミ体であり、それら
はそれぞれシスおよびトランス配置でステロイドのAB環を有する2bの末端切断型
類似体である。活性は、シス異性体とではなくトランス異性体と関連づけられる
ことが期待された。
であることが挙げられる。これらの化合物は両方とも、ラセミ体であり、それら
はそれぞれシスおよびトランス配置でステロイドのAB環を有する2bの末端切断型
類似体である。活性は、シス異性体とではなくトランス異性体と関連づけられる
ことが期待された。
【０１０８】
本研究で検討した化合物の多くは、ほとんどのムスカリン様アロステリック薬
剤とは対照的に、高濃度において3H-NMSの会合および解離を完全には抑制しない
。多くの場合、それらは、単に、速度論に関連して2倍以下の速度低下効果を生
じるにすぎず、実際、いくつかの場合には、特にM3受容体においては、非常に小
さな効果を生じるにすぎない(図7)。
剤とは対照的に、高濃度において3H-NMSの会合および解離を完全には抑制しない
。多くの場合、それらは、単に、速度論に関連して2倍以下の速度低下効果を生
じるにすぎず、実際、いくつかの場合には、特にM3受容体においては、非常に小
さな効果を生じるにすぎない(図7)。
【０１０９】
特筆すべき知見として、2aは、3H-NMSの解離速度を増大させる。この場合、M3
受容体において最大の効果が観測され、M2受容体において最小の効果が観測され
る。注目すべき点として、2aを用いた平衡研究およびオフレート研究から得られ
るデータは、アロステリックモデルと全体として一致している。すなわち、3H-N
MS占有受容体に対する親和性の推定値に関して、2つのタイプのアッセイから得
られる値にずれは存在しない。勾配係数は1であるかもしくは近似的に1であった
。こうした一致はみられるが、ただし、2aによる3H-NMS解離の促進は、本研究に
おいておよびムスカリン様受容体におけるアロステリック薬剤に関するすべての
他の発表済み研究において他のあらゆる化合物で観測される抑制効果とは逆の結
果である。
る。注目すべき点として、2aを用いた平衡研究およびオフレート研究から得られ
るデータは、アロステリックモデルと全体として一致している。すなわち、3H-N
MS占有受容体に対する親和性の推定値に関して、2つのタイプのアッセイから得
られる値にずれは存在しない。勾配係数は1であるかもしくは近似的に1であった
。こうした一致はみられるが、ただし、2aによる3H-NMS解離の促進は、本研究に
おいておよびムスカリン様受容体におけるアロステリック薬剤に関するすべての
他の発表済み研究において他のあらゆる化合物で観測される抑制効果とは逆の結
果である。
【０１１０】
2aのこの特有の効果のおかげで、他のアロステリック薬剤が、2aのときと同じ
部位に作用することにより3H-NMS解離を抑制するかを評価することができた。1a
(KT5720)、1f(スタウロスポリン)および2bは、3H-NMSリガンド結合受容体におい
て2aのときと同じ部位に結合するが、ガラミンおよびストリキニーネは、異なる
部位に結合して2aの結合に影響を及ぼさない、すなわち、ガラミンおよびストリ
キニーネは、2aに対して中立の協同性を示すことを我々は見いだした。
部位に作用することにより3H-NMS解離を抑制するかを評価することができた。1a
(KT5720)、1f(スタウロスポリン)および2bは、3H-NMSリガンド結合受容体におい
て2aのときと同じ部位に結合するが、ガラミンおよびストリキニーネは、異なる
部位に結合して2aの結合に影響を及ぼさない、すなわち、ガラミンおよびストリ
キニーネは、2aに対して中立の協同性を示すことを我々は見いだした。
【０１１１】
結論として、次のような一般的な要点を挙げることができる。(1)アロステリ
ックク薬剤は、3H-NMSの解離速度を促進したり、抑制したり、もしくはそれに影
響を及ぼさない可能性がある。(2)少なくとも2つのオーバーラップしないアロス
テリック部位、すなわち、「共通」部位および「WIN」部位が存在する。(3)アロス
テリック部位はいずれも、AChに対する正の協同作用を支援することができる。(
4)2aを用いることにより、他のアロステリック薬剤が「WIN」部位に結合するかを
調べる試験が行える。
ックク薬剤は、3H-NMSの解離速度を促進したり、抑制したり、もしくはそれに影
響を及ぼさない可能性がある。(2)少なくとも2つのオーバーラップしないアロス
テリック部位、すなわち、「共通」部位および「WIN」部位が存在する。(3)アロス
テリック部位はいずれも、AChに対する正の協同作用を支援することができる。(
4)2aを用いることにより、他のアロステリック薬剤が「WIN」部位に結合するかを
調べる試験が行える。
【０１１２】引用文献
本明細書に記載の引用文献はいずれも、参照により明示的に本明細書に組み入
れるものとする。
れるものとする。
【０１１３】
Caulfield and Birdsall, International Union of Pharmacology XVII: ムスカ
リン様受容体の分類. Pharmacol. Rev., 50: 279-290, 1998. Hulme et al, Ann. Rev. Pharmacol., 30: 633-73, 1990. Lazareno and Birdsall, Br. J. Pharmacol., 109: 1110-1119, 1993. Lazareno and Birdsall, Mol. Pharmacol., 48: 362-378, 1995. Lazareno et al, Mol. Pharmacol., 53: 573-589, 1998. Lazareno and Birdsall, ‘放射性リガンド研究における競合的およびアロステ
リック相互作用の測定’ In: G protein-coupled receptors. Haga and Berstei
n, eds, CRC press, Boca Raton, 1-48, 1999. Birdsall et al, Mol.Pharmacol. 55: 778-786, 1999. Buckley et al, Mol. Pharmacol., 35: 469-476, 1989. Gnagey and Ellis, Biochem. harmacol., 52: 1767-1775, 1996. Bajwa and Sykes, J. C. S. Perkin I, 1618-1620, 1978. Bajwa and Sykes, J. C. S. Perkin I, 1816-1820, 1979. Bajwa and Sykes, J. C. S. Perkin I, 3085-3094, 1979. Bajwa and Sykes, J. C. S. Perkin I, 481-486, 1980. Bajwa and Sykes, J. C. S. Perkin I, 1019-1030, 1980. Bajwa and Sykes, J. C. S. Perkin I, 1859-1861, 1980.
リン様受容体の分類. Pharmacol. Rev., 50: 279-290, 1998. Hulme et al, Ann. Rev. Pharmacol., 30: 633-73, 1990. Lazareno and Birdsall, Br. J. Pharmacol., 109: 1110-1119, 1993. Lazareno and Birdsall, Mol. Pharmacol., 48: 362-378, 1995. Lazareno et al, Mol. Pharmacol., 53: 573-589, 1998. Lazareno and Birdsall, ‘放射性リガンド研究における競合的およびアロステ
リック相互作用の測定’ In: G protein-coupled receptors. Haga and Berstei
n, eds, CRC press, Boca Raton, 1-48, 1999. Birdsall et al, Mol.Pharmacol. 55: 778-786, 1999. Buckley et al, Mol. Pharmacol., 35: 469-476, 1989. Gnagey and Ellis, Biochem. harmacol., 52: 1767-1775, 1996. Bajwa and Sykes, J. C. S. Perkin I, 1618-1620, 1978. Bajwa and Sykes, J. C. S. Perkin I, 1816-1820, 1979. Bajwa and Sykes, J. C. S. Perkin I, 3085-3094, 1979. Bajwa and Sykes, J. C. S. Perkin I, 481-486, 1980. Bajwa and Sykes, J. C. S. Perkin I, 1019-1030, 1980. Bajwa and Sykes, J. C. S. Perkin I, 1859-1861, 1980.
【化４】
表1
ムスカリン様受容体における3H-NMSおよびAchに対するインドロカルバゾール
の平衡結合パラメーター。図2および5に示されているようなアッセイを、適宜、
式1もしくは2にあてはめた(方法のところを参照されたい)。*n=2の場合を除いて
、少なくとも3つのアッセイの結果である。空欄は、少なくとも2セットのパラメ
ーター推定値を得ることができなかったことを示している。#すべてではないが
いくつかの値は、3H-NMS占有受容体に対する親和性を、オフレートアッセイから
得られた表2に記載の平均値に固定して解析することにより得られたものである
。表中、nameは名称、slopeは勾配、cooperativityは協同性、meanは平均、sem
は標準誤差、staurosporineはスタウロスポリンである。
の平衡結合パラメーター。図2および5に示されているようなアッセイを、適宜、
式1もしくは2にあてはめた(方法のところを参照されたい)。*n=2の場合を除いて
、少なくとも3つのアッセイの結果である。空欄は、少なくとも2セットのパラメ
ーター推定値を得ることができなかったことを示している。#すべてではないが
いくつかの値は、3H-NMS占有受容体に対する親和性を、オフレートアッセイから
得られた表2に記載の平均値に固定して解析することにより得られたものである
。表中、nameは名称、slopeは勾配、cooperativityは協同性、meanは平均、sem
は標準誤差、staurosporineはスタウロスポリンである。
【０１１４】
【表１】
表2
インドロカルバゾールによるムスカリン様受容体からの3H-NMS解離の抑制%。
図4に示されているような曲線を、方法のところに記載されている算定式にあて
はめた。「estd pK」は、遊離受容体に対する親和性と、表1にまとめられている
平衡結合アッセイから導かれる3H-NMSに対する協同性との積である。「diff」は
、観測されたpK(-log IC50)と「estd pK」との差である。空欄は、少なくとも2
セットのパラメーター推定値を得ることができなかったことを示している。本研
究で観測された3H-NMS解離速度定数(分-1)は、(平均±標準誤差(n)): M1 0.058
±0.002 (26); M2 0.34±0.01 (12); M3 0.054±0.002 (10); M4 0.057±0.002
(10)である。表中、nameは名称、slopeは勾配、meanは平均、semは標準誤差、 staurosporineはスタウロスポリンである。
図4に示されているような曲線を、方法のところに記載されている算定式にあて
はめた。「estd pK」は、遊離受容体に対する親和性と、表1にまとめられている
平衡結合アッセイから導かれる3H-NMSに対する協同性との積である。「diff」は
、観測されたpK(-log IC50)と「estd pK」との差である。空欄は、少なくとも2
セットのパラメーター推定値を得ることができなかったことを示している。本研
究で観測された3H-NMS解離速度定数(分-1)は、(平均±標準誤差(n)): M1 0.058
±0.002 (26); M2 0.34±0.01 (12); M3 0.054±0.002 (10); M4 0.057±0.002
(10)である。表中、nameは名称、slopeは勾配、meanは平均、semは標準誤差、 staurosporineはスタウロスポリンである。
【０１１５】
【表２】
表3
オフレートアッセイから得られたパラメーター推定値。Emaxは、3H-NMS解離の
最大抑制%を示している。空欄は、少なくとも2つの信頼しうる推定値が得られな
かったことを示している。2f、2gおよび2iに対する推定値は得ることができなか
った。*n=2、#n=1以外は、n>=3である。表中、Nameは名称、slopeは勾配、mean
は平均、semは標準誤差である。
最大抑制%を示している。空欄は、少なくとも2つの信頼しうる推定値が得られな
かったことを示している。2f、2gおよび2iに対する推定値は得ることができなか
った。*n=2、#n=1以外は、n>=3である。表中、Nameは名称、slopeは勾配、mean
は平均、semは標準誤差である。
【０１１６】
【表３】
表4
平衡アッセイから得られたパラメーター推定値。pKは、遊離受容体に対する薬
剤のlog親和性の推定値である。「alloN」および「alloA」は、それぞれ、3H-NM
SおよびAchに対する協同性の推定値である。2f、2gおよび2iに対する推定値は得
ることができなかった。*n=2、#n=1以外は、n>=3である。表中、Nameは名称、sl
opeは勾配、meanは平均、semは標準誤差である。
剤のlog親和性の推定値である。「alloN」および「alloA」は、それぞれ、3H-NM
SおよびAchに対する協同性の推定値である。2f、2gおよび2iに対する推定値は得
ることができなかった。*n=2、#n=1以外は、n>=3である。表中、Nameは名称、sl
opeは勾配、meanは平均、semは標準誤差である。
【０１１７】
【表４】
表5
平衡(pKocc)アッセイおよびオフレート(pKoff)アッセイから得られた3H-NMS占
有受容体における親和性推定値の比較。「diff」は、pKoccとpKoffとの差である
。n>=2である。表中、Nameは名称、semは標準誤差である。
有受容体における親和性推定値の比較。「diff」は、pKoccとpKoffとの差である
。n>=2である。表中、Nameは名称、semは標準誤差である。
【０１１８】
【表５】
表6
3H-NMS占有M3受容体に対するlog親和性値および3H-NMS解離速度の最大抑制%の
推定値。これらの値は、アロステリックモデルで解析される2aを用いた競合アッ
セイから導かれたものである(補遺2中の式1)。協同性の値は、0(競合的もしくは
強い負の協同的相互作用)または1(中立の協同性、非相互作用性)に固定した。試
験薬剤に対する勾配の値は、スタウロスポリンの場合(勾配=1.31±0.16, n=3)を
除いて、1に固定した。
推定値。これらの値は、アロステリックモデルで解析される2aを用いた競合アッ
セイから導かれたものである(補遺2中の式1)。協同性の値は、0(競合的もしくは
強い負の協同的相互作用)または1(中立の協同性、非相互作用性)に固定した。試
験薬剤に対する勾配の値は、スタウロスポリンの場合(勾配=1.31±0.16, n=3)を
除いて、1に固定した。
【０１１９】
【表６】
以下、添付図面を参照し、実施例を挙げて本発明を説明するが、これらの実施
例に限定するものではない。
例に限定するものではない。
【図１】
2.2mMのAChの不在および存在下、0.2mMのGTPはすべて存在下でのM1受容体での 3
H-NMS(210pM)の結合に対するスタウロスポリン(1f)の作用。点は個々の観察で
ある。線は方程式2への適合を示し（方法を参照）、5.95±0.06のlog親和性、1.
01±0.05の勾配係数、1.51±0.06の3H-NMSとの協同性、および0.27±0.03のACh
との協同性を生じた。これらのデータの親和性比プロットは図２に示されている
。
ある。線は方程式2への適合を示し（方法を参照）、5.95±0.06のlog親和性、1.
01±0.05の勾配係数、1.51±0.06の3H-NMSとの協同性、および0.27±0.03のACh
との協同性を生じた。これらのデータの親和性比プロットは図２に示されている
。
【図２】
M1〜M4受容体での5種のインドロカルバゾール（1a、1b、1e、1fおよび1i）の
親和性比プロット。点は方法に記載されるように、AChの不在および存在下での3 H-NMS結合に関する2組の観察から導いた。パラメーター推定値pK（遊離受容体に
対する試験薬剤のlog親和性）、αNMS（3H-NMSとの協同性）、およびβACh（ACh
との協同性）は必要に応じて方程式1または2を用いて非線形回帰分析から導いた
（方法を参照）。いくつかの同様のアッセイに由来するパラメーター推定値が表
１に要約されている。
親和性比プロット。点は方法に記載されるように、AChの不在および存在下での3 H-NMS結合に関する2組の観察から導いた。パラメーター推定値pK（遊離受容体に
対する試験薬剤のlog親和性）、αNMS（3H-NMSとの協同性）、およびβACh（ACh
との協同性）は必要に応じて方程式1または2を用いて非線形回帰分析から導いた
（方法を参照）。いくつかの同様のアッセイに由来するパラメーター推定値が表
１に要約されている。
【図３】
対照koffのパーセント阻害として表される、M1〜M4受容体での3H-NMSの解離速
度定数(koff)に対する1a、1b、1e、1fおよび1iの作用。点は2組の観察の平均お
よび範囲/2である。線は方法に記載されるようにロジスティック関数への適合を
示す。いくつかの同様のアッセイに由来するパラメーター推定値が表２に要約さ
れている。
度定数(koff)に対する1a、1b、1e、1fおよび1iの作用。点は2組の観察の平均お
よび範囲/2である。線は方法に記載されるようにロジスティック関数への適合を
示す。いくつかの同様のアッセイに由来するパラメーター推定値が表２に要約さ
れている。
【図４】
3mlの容積での、AChによるM1受容体での3H-NMS(50pM)結合の阻害に対する種々
の濃度のKT5720(1a)の作用。点は2組の観察の平均および範囲/2である。線はKT5
720結合についての勾配係数を1に設定した方程式1への適合を示す。パラメータ
ー推定値はKT5720のlog親和性6.6±0.1、3H-NMSとの協同性1.9±0.1、AChとの協
同性1.6±0.2であった。挿入図はこれらのパラメーターから導いた親和性比プロ
ットを示す（方法を参照）。曲線の独立したロジスティック適合から得た増加す
る濃度のKT5720の存在下でのAChの-log IC50値は、5.28、5.33、5.40および5.42
であった。
の濃度のKT5720(1a)の作用。点は2組の観察の平均および範囲/2である。線はKT5
720結合についての勾配係数を1に設定した方程式1への適合を示す。パラメータ
ー推定値はKT5720のlog親和性6.6±0.1、3H-NMSとの協同性1.9±0.1、AChとの協
同性1.6±0.2であった。挿入図はこれらのパラメーターから導いた親和性比プロ
ットを示す（方法を参照）。曲線の独立したロジスティック適合から得た増加す
る濃度のKT5720の存在下でのAChの-log IC50値は、5.28、5.33、5.40および5.42
であった。
【図５】
種々の濃度の(A)KT5720(1a)および(B)スタウロスポリン(1f)の存在下でのM1受
容体での3H-NMS結合のガラミンによる阻害。点は個々の観察である。線はデータ
の方程式3への適合を示し、これではガラミンのKT5720およびスタウロスポリン
との協同性推定値はそれぞれ１および0と有意には異ならず、それらの値に設定
した。ガラミン、KT5720およびスタウロスポリンの勾配係数は1と異ならず、そ
の値に設定した。同様に制限された3種のかかるアッセイから、KT5720は6.22±0
.17のlog親和性および2.39±0.08の3H-NMSとの協同性を有していた。同様に制限
された3種のかかるアッセイから、スタウロスポリンは5.75±0.11のlog親和性お
よび1.62±0.13の3H-NMSとの協同性を有していた。これら6種のアッセイからガ
ラミンは5.05±0.05のlog親和性および0.11±0.01の3H-NMSとの協同性を有して
いた。挿入図は個々の曲線の非線形回帰分析から得られたガラミンの-log IC50
に対する試験薬剤の作用を示す。
容体での3H-NMS結合のガラミンによる阻害。点は個々の観察である。線はデータ
の方程式3への適合を示し、これではガラミンのKT5720およびスタウロスポリン
との協同性推定値はそれぞれ１および0と有意には異ならず、それらの値に設定
した。ガラミン、KT5720およびスタウロスポリンの勾配係数は1と異ならず、そ
の値に設定した。同様に制限された3種のかかるアッセイから、KT5720は6.22±0
.17のlog親和性および2.39±0.08の3H-NMSとの協同性を有していた。同様に制限
された3種のかかるアッセイから、スタウロスポリンは5.75±0.11のlog親和性お
よび1.62±0.13の3H-NMSとの協同性を有していた。これら6種のアッセイからガ
ラミンは5.05±0.05のlog親和性および0.11±0.01の3H-NMSとの協同性を有して
いた。挿入図は個々の曲線の非線形回帰分析から得られたガラミンの-log IC50
に対する試験薬剤の作用を示す。
【図６】
方法に記載のように単一の時点で測定される、単独および他のアロステリック
剤の存在下でのM1受容体からの3H-NMS解離に対するKT5720(1a)の作用。点は2種
のアッセイにおける4組の観察の平均および標準誤差を示す（ただし10-4Mガラミ
ン、および3.10-5Mおよび3.10-4Mブルシンについては除き、これらは2組の観察
の平均および範囲/2を示す）。最上パネルにおける線は個々の曲線の双曲線関数
への適合を示す（ただし、スタウロスポリンの存在下におけるものを除く）。KT
5720のlog EC50の推定値はそれらの適合から導かれている。最上パネルは3H-NMS
の対照koffの%阻害としてデータを示す。下部パネルはKT5720および特定の濃度
の試験薬剤（ガラミン、ブルシンまたはスタウロスポリン）の存在下でのEf、3H
-NMS koff値をその濃度の試験薬剤単独の存在下でのkoff値の割合として示す。
剤の存在下でのM1受容体からの3H-NMS解離に対するKT5720(1a)の作用。点は2種
のアッセイにおける4組の観察の平均および標準誤差を示す（ただし10-4Mガラミ
ン、および3.10-5Mおよび3.10-4Mブルシンについては除き、これらは2組の観察
の平均および範囲/2を示す）。最上パネルにおける線は個々の曲線の双曲線関数
への適合を示す（ただし、スタウロスポリンの存在下におけるものを除く）。KT
5720のlog EC50の推定値はそれらの適合から導かれている。最上パネルは3H-NMS
の対照koffの%阻害としてデータを示す。下部パネルはKT5720および特定の濃度
の試験薬剤（ガラミン、ブルシンまたはスタウロスポリン）の存在下でのEf、3H
-NMS koff値をその濃度の試験薬剤単独の存在下でのkoff値の割合として示す。
【図７】
3H-NMS占有受容体に対する明細書末尾に示される化合物の濃度依存的作用。3H
-NMSのM1〜M4受容体からの解離速度定数のパーセント阻害を単一の時点で測定し
た。凡例はこれらの曲線の非線形回帰分析を用いて得られたIC50（またはEC50）
値を示す。
-NMSのM1〜M4受容体からの解離速度定数のパーセント阻害を単一の時点で測定し
た。凡例はこれらの曲線の非線形回帰分析を用いて得られたIC50（またはEC50）
値を示す。
【図８】
3H-NMSおよびAChの平衡結合に対する有効化合物の濃度依存的作用。作用は「
親和性比」、すなわち、特定の濃度の試験薬剤の存在下での「一次」リガンド（ 3 H-NMSまたはACh）の見かけの親和性を試験薬剤の不在下でのその見かけの親和
性で除したものとして表されている。親和性比は「方法」に記載されるように算
出した。その他の一次リガンドの結合を改変する試験薬剤の濃度でのある一次リ
ガンドとの親和性比>1は正の協同性を示し、親和性比<1は負の協同性を示し、か
つ、親和性比1は中立の協同性を示す。いずれかの一次リガンドの親和性比での
試験薬剤のIC50、またはEC50は遊離受容体についての試験薬剤のKdにほぼ相当す
る。3H-NMSと中立または正の協同性を示し、3H-NMS解離を強力に阻害する高濃度
の化合物は動態作用、すなわち、3H-NMS結合の平衡を欠くことによって3H-NMS結
合を阻害し得る。
親和性比」、すなわち、特定の濃度の試験薬剤の存在下での「一次」リガンド（ 3 H-NMSまたはACh）の見かけの親和性を試験薬剤の不在下でのその見かけの親和
性で除したものとして表されている。親和性比は「方法」に記載されるように算
出した。その他の一次リガンドの結合を改変する試験薬剤の濃度でのある一次リ
ガンドとの親和性比>1は正の協同性を示し、親和性比<1は負の協同性を示し、か
つ、親和性比1は中立の協同性を示す。いずれかの一次リガンドの親和性比での
試験薬剤のIC50、またはEC50は遊離受容体についての試験薬剤のKdにほぼ相当す
る。3H-NMSと中立または正の協同性を示し、3H-NMS解離を強力に阻害する高濃度
の化合物は動態作用、すなわち、3H-NMS結合の平衡を欠くことによって3H-NMS結
合を阻害し得る。
【図９】
3H-NMSおよびAChの平衡結合に対する有効化合物の濃度依存的作用。作用は「
親和性比」、すなわち、特定の濃度の試験薬剤の存在下での「一次」リガンド（ 3 H-NMSまたはACh）の見かけの親和性を試験薬剤の不在下でのその見かけの親和
性で除したものとして表されている。親和性比は「方法」に記載されるように算
出した。その他の一次リガンドの結合を改変する試験薬剤の濃度でのある一次リ
ガンドとの親和性比>1は正の協同性を示し、親和性比<1は負の協同性を示し、か
つ、親和性比1は中立の協同性を示す。いずれかの一次リガンドの親和性比での
試験薬剤のIC50、またはEC50は遊離受容体についての試験薬剤のKdにほぼ相当す
る。3H-NMSと中立または正の協同性を示し、3H-NMS解離を強力に阻害する高濃度
の化合物は動態作用、すなわち、3H-NMS結合の平衡を欠くことによって3H-NMS結
合を阻害し得る。
親和性比」、すなわち、特定の濃度の試験薬剤の存在下での「一次」リガンド（ 3 H-NMSまたはACh）の見かけの親和性を試験薬剤の不在下でのその見かけの親和
性で除したものとして表されている。親和性比は「方法」に記載されるように算
出した。その他の一次リガンドの結合を改変する試験薬剤の濃度でのある一次リ
ガンドとの親和性比>1は正の協同性を示し、親和性比<1は負の協同性を示し、か
つ、親和性比1は中立の協同性を示す。いずれかの一次リガンドの親和性比での
試験薬剤のIC50、またはEC50は遊離受容体についての試験薬剤のKdにほぼ相当す
る。3H-NMSと中立または正の協同性を示し、3H-NMS解離を強力に阻害する高濃度
の化合物は動態作用、すなわち、3H-NMS結合の平衡を欠くことによって3H-NMS結
合を阻害し得る。
【図１０】
単独および3種の濃度の2c(WIN 62577)の存在下（GTP0.2mMは存在していた）で
のAChによるM３受容体との3H-NMS結合の阻害。データは方程式1と適合し（方法
を参照）、5.31という2cのlog親和性、0.47という3H-NMSとの協同性および1.41
というAChとの協同性を得た。挿入図は適合のパラメーターから算出したAChおよ
び3H-NMSの親和性比（1/用量比）を示す。
のAChによるM３受容体との3H-NMS結合の阻害。データは方程式1と適合し（方法
を参照）、5.31という2cのlog親和性、0.47という3H-NMSとの協同性および1.41
というAChとの協同性を得た。挿入図は適合のパラメーターから算出したAChおよ
び3H-NMSの親和性比（1/用量比）を示す。
【図１１】
単独および3種の濃度の2aの存在下での3H-NMSの経時的解離。各受容体サブタ
イプについてのパラメーター推定値および標準誤差は全データセットの方程式２
および3の変形への非線形回帰適合から導いたが、これでは、koffおよびkoffxが 3 H-NMSのそれぞれ遊離および2aが結合した受容体からの解離速度定数であり、pk occ は3H-NMS占有受容体についての2aのlog Kdである。挿入図は時間に対する直
線化トランスフォーメーションln(B/Bo)を示し、ここでBは一定の時間後に残存
する特異的結合であり、Boは特異的結合の最初のレベルである。
イプについてのパラメーター推定値および標準誤差は全データセットの方程式２
および3の変形への非線形回帰適合から導いたが、これでは、koffおよびkoffxが 3 H-NMSのそれぞれ遊離および2aが結合した受容体からの解離速度定数であり、pk occ は3H-NMS占有受容体についての2aのlog Kdである。挿入図は時間に対する直
線化トランスフォーメーションln(B/Bo)を示し、ここでBは一定の時間後に残存
する特異的結合であり、Boは特異的結合の最初のレベルである。
【図１２】
単一の時点で測定した、単独および1種または3種の濃度の試験薬剤の存在下で
の、3H-NMS解離に対する2aの濃度-作用曲線。データは解離速度定数に変換し（
方法を参照）、対照解離速度定数の%として表した。曲線は非線形回帰分析から
の方程式1への適合を示す。ストリキニーネおよびガラミンについては、3H-NMS
の二重にまたは三重に結合した受容体からの解離は0と異ならず、2aとの協同的
相互作用は1と異ならなかった（すなわち、中立の協同性）のでこれらの値を固
定した。1a(KT5720)、1f（スタウロスポリン）および2b(WIN 51708)については
、2aとの協同的相互作用は0と異ならなかった（すなわち、競合）ので、この値
を固定した。「用量-比プロット」と示されるパネルは2aの比EC50（＋薬剤）／E
C50（単独）のlog対log[薬剤]を示す。各アッセイは少なくとも1回反復し、同様
の結果を得た。
の、3H-NMS解離に対する2aの濃度-作用曲線。データは解離速度定数に変換し（
方法を参照）、対照解離速度定数の%として表した。曲線は非線形回帰分析から
の方程式1への適合を示す。ストリキニーネおよびガラミンについては、3H-NMS
の二重にまたは三重に結合した受容体からの解離は0と異ならず、2aとの協同的
相互作用は1と異ならなかった（すなわち、中立の協同性）のでこれらの値を固
定した。1a(KT5720)、1f（スタウロスポリン）および2b(WIN 51708)については
、2aとの協同的相互作用は0と異ならなかった（すなわち、競合）ので、この値
を固定した。「用量-比プロット」と示されるパネルは2aの比EC50（＋薬剤）／E
C50（単独）のlog対log[薬剤]を示す。各アッセイは少なくとも1回反復し、同様
の結果を得た。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｋ 31/58 Ａ６１Ｋ 31/58 ４Ｃ０８６
45/00 45/00 ４Ｃ０９１
Ａ６１Ｐ 1/04 Ａ６１Ｐ 1/04
1/06 1/06
1/16 1/16
3/10 3/10
9/00 9/00
11/00 11/00
11/06 11/06
13/10 13/10
17/00 17/00
25/10 25/10
25/14 25/14
25/16 25/16
25/18 25/18
25/20 25/20
25/22 25/22
25/24 25/24
25/28 25/28
27/02 27/02
27/06 27/06
43/00 １１１ 43/00 １１１
Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
33/566 33/566
// Ｃ０７Ｄ 471/04 １０３ Ｃ０７Ｄ 471/04 １０３Ｚ
487/04 １４４ 487/04 １４４
498/22 498/22
Ｃ０７Ｊ 7/00 Ｃ０７Ｊ 7/00
71/00 71/00
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ
Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ
，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，
ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ
Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ
，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，
ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ
Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ
，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，
ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
Ｆターム(参考） 2G045 BB01 BB10 BB14 BB20 CB01
DA36 FA18 FB08
4C050 AA02 AA03 AA04 AA07 AA08
BB02 CC07 EE03 FF01 GG01
HH01
4C065 AA04 BB04 CC09 DD02 EE02
4C072 AA02 AA06 AA07 BB04 BB08
CC03 CC11 EE09 FF03 GG01
UU01
4C084 AA16 MA16 MA35 MA37 MA43
MA52 MA56 MA59 MA63 MA66
NA14 ZA022 ZA082 ZA122
ZA142 ZA162 ZA182 ZA292
ZA332 ZA362 ZA662 ZA682
ZA752 ZA892 ZC352 ZC422
4C086 AA01 AA02 CB05 CB22 MA01
MA16 MA35 MA37 MA43 MA52
MA56 MA59 MA63 MA66 NA14
ZA02 ZA08 ZA12 ZA14 ZA16
ZA18 ZA29 ZA33 ZA36 ZA66
ZA68 ZA75 ZA89 ZC35 ZC42
4C091 AA01 AA02 BB05 CC01 DD02
DD05 DD13 EE07 FF01 GG01
HH01 JJ03 KK01 LL01 MM03
NN01 NN04 PA02 PA03 PA05
PA09 PB02 QQ01 QQ02 QQ09
QQ15
Claims (31)
- 【請求項１】 化合物1aおよび／または2aと結合可能なムスカリン受容体の
アロステリック部位に結合することによって、一次リガンドのムスカリン受容体
との結合を調節可能である化合物の同定に役立つ方法であって、 (a)ムスカリン受容体および一次リガンドを1種以上の濃度の候補化合物と接触
させ；さらに (b)候補化合物が、化合物1aおよび／または化合物2aと結合可能な受容体のア
ロステリック部位に結合することによって、一次リガンドのムスカリン受容体と
の結合を調節するかどうかを調べる ことを含んでなる方法。 - 【請求項２】 ブルシン、ガラミンまたはストリキニーネがアロステリック
部位と実質的に結合しない、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 ムスカリン受容体がヒトM1、M2、M3、M4、またはM5ムスカリ
ン受容体である、請求項１または請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 候補化合物が、一次リガンドのムスカリン受容体との結合を
増強する場合に選択される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】 候補化合物が、一次リガンドのムスカリン受容体との結合を
低下させる場合に選択される、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】 種々のムスカリン受容体サブタイプで反復される、請求項１
ないし５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 候補化合物が、アロステリック部位と結合し、かつ、一次リ
ガンドの１種以上のムスカリン受容体サブタイプとの結合に全く作用を及ぼさな
いが、一次リガンドのその他のムスカリン受容体サブタイプまたはサブタイプ類
での結合を増強または低下させる場合に選択される、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 候補化合物が、一次リガンドのムスカリン受容体からの解離
速度を変化させるか、または一次リガンドのムスカリン受容体からの解離速度に
作用するアロステリックリガンドの能力を変化させる場合に選択される、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項９】 アロステリックリガンドがムスカリン受容体の共通アロステ
リック部位と結合可能である、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 候補化合物のアロステリック部位との結合を、一次リガン
ド結合部位において競合し、一方が標識されている２種の一次リガンドを使用す
るアッセイで測定する、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１１】 標識された一次リガンドがNMSであり、かつ、他の一次リ
ガンドがAChである、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１２】 １種以上の濃度のさらなるアロステリックリガンドの存在
または不在下で、ムスカリン受容体、候補化合物および一次リガンドを使用する
、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１３】 候補化合物のアロステリック部位との結合を、１種以上の
濃度の候補化合物の存在および不在下で、一次リガンド解離速度定数を測定する
アッセイにおいて標識された一次リガンドを用いて調べる、請求項１ないし１１
のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１４】 一次リガンドがNMSである、請求項１３に記載の方法。
- 【請求項１５】 一般的なアッセイでアロステリックであると証明されてい
る試験化合物の、２つのアロステリック部位の一方または他方と結合すると知ら
れているリガンドの平衡アロステリック作用に対する作用を定量化することをさ
らに含んでなる、請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１６】 一次リガンドがアセチルコリン(ACh)またはN-メチルスコ
ポラミン(NMS)、または別の適当な競合ムスカリンアゴニストもしくはアンタゴ
ニストである、請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１７】 請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の方法により候
補化合物を同定し、その化合物を医薬組成物として処方するさらなる工程を含ん
でなる方法。 - 【請求項１８】 請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の方法によって
得られる化合物の、一次リガンドのムスカリン受容体との結合によって媒介され
る症状を治療するための医薬の製造のための使用。 - 【請求項１９】 ムスカリン受容体の一次リガンドに対する応答を調節する
方法であって、ムスカリン受容体を化合物1aおよび／または2aと結合可能なムス
カリン受容体のアロステリック部位と結合することによって一次リガンドのムス
カリン受容体との結合を調節する化合物と接触させることを含んでなる方法。 - 【請求項２０】 化合物1aおよび／または2aと結合可能なムスカリン受容体
のアロステリック部位と結合し、それによって一次リガンドのムスカリン受容体
との結合を調節する化合物の、一次リガンドのムスカリン受容体との結合によっ
て媒介される症状を治療するための医薬の製造のための使用。 - 【請求項２１】 化合物が一般式1または2で表される、請求項２０に記載の
使用。 - 【請求項２２】 一次リガンドがアセチルコリン(ACh)またはN-メチルスコ
ポラミン(NMS)である、請求項２０または請求項２１に記載の使用。 - 【請求項２３】 症状がアルツハイマー病、パーキンソン病、動揺病、ハン
チントン舞踏病、精神分裂病、鬱病、不安、鎮静、鎮痛、脳卒中、予備麻酔、鎮
痙、過敏性大腸症候群、膀胱失調症または貯留、消化性潰瘍疾患、気管支炎／喘
息／慢性閉塞性気道疾患、洞性徐脈、心臓ペースメーカー調節、緑内障、無弛緩
症、症候性びまん性食道痙攣症、胆管ジスキネジア、強皮症、糖尿病、下部食道
機能不全、腸偽閉塞、睡眠調節、瞳孔径の制御または神経性胃炎である、請求項
２０ないし２２のいずれか1項に記載の使用。 - 【請求項２４】 化合物のアロステリック部位との結合が一次リガンドのム
スカリン受容体との結合を増強する、請求項２０ないし２３のいずれか1項に記
載の使用。 - 【請求項２５】 化合物のアロステリック部位との結合が一次リガンドのム
スカリン受容体との結合を低下させる、請求項２０ないし２３のいずれか1項に
記載の使用。 - 【請求項２６】 化合物のアロステリック部位との結合が一次リガンドの1
種以上のムスカリン受容体サブタイプとの結合に対して全く作用を及ぼさない（
中立協同性）が、その他のサブタイプまたはサブタイプ類でアロステリック作用
を及ぼす(正または負の協同性)、請求項２０ないし２３のいずれか1項に記載の
使用。 - 【請求項２７】 アロステリック部位がブルシン、ガラミンまたはストリキ
ニーネと結合しない、請求項２０ないし２６のいずれか1項に記載の使用。 - 【請求項２８】 ムスカリン受容体がヒトM1、M2、M3、M4、またはM5ムスカ
リン受容体である、請求項２０ないし２７のいずれか1項に記載の使用。 - 【請求項２９】 アロステリック部位と結合することによって一次リガンド
のムスカリン受容体との結合を調節可能である化合物のスクリーニングにおける
、化合物1aおよび／または2aと結合可能なムスカリン受容体のアロステリック部
位の使用。 - 【請求項３０】 薬物療法に使用するための一般式1または2で表される化合
物。 - 【請求項３１】 一次リガンドのムスカリンアセチルコリン受容体との結合
を調節するアロステリック剤である、請求項３０に記載の化合物。
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