JP2003504330A - 神経再生を促進するための組成物および方法 - Google Patents

神経再生を促進するための組成物および方法

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Abstract

(57)【要約】 ステロイド受容体複合体の破壊およびMAPキナーゼ/キナーゼ活性の刺激により、神経突起伸展および神経再生が促進される。この破壊は、成熟複合体、または成熟複合体の集合に必要な成熟複合体の前駆体などのステロイド受容体複合体の物理的集合または機能の破壊という形をとり得る。ゲルダナマイシンおよびそのアナログ、バスタジンおよびバスタジンファミリーのメンバー、ラジシコールおよびそのアナログ、ならびにPKBP-52抗体が、複合体を破壊し、神経成長を促進することが示されている。神経栄養化合物を発見するためのアッセイ法及び、これらのアッセイ法により発見される化合物、これらの化合物が組み込まれる薬学的組成物、損傷または疾患により引き起こされるニューロン機能障害を有する被験者を治療する方法が開示される。任意のこれらの化合物を、神経成長が望ましい部位に局所的にまたは神経突起伸展が望ましい生物に全身的に加えられる熱などの、治療有効量の熱と組み合わせて使用することができる。または、これらの化合物を、例えば、解剖学的経路に沿った（特に、離断した神経または部分的に離断した神経を取り囲んで）神経再生が望ましい、該解剖学的経路を規定する管状部材などのテンプレートと共に、使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、神経学的損傷及び疾患の治療に有用な神経栄養化合物及び薬剤に関
する。
【０００２】 発明の背景 外傷による、又は機械的に誘発された末梢神経系における軸索変性の後には、
軸索の再生が起こり、機能が回復することが多い。しかし、軸索伸長の速度（3
〜4mm/日）は遅く、完全に神経学的機能が回復しないこともある。神経学的機能
が修復される場合には、損傷部位と標的組織との距離に応じて、数週間又は数ヶ
月以内に回復が起こる。遠距離にわたる再生の速度を高める療法は、患者にとっ
て極めて有益で、医療費を大いに減少させると思われる。
【０００３】 他の神経学的状態は、慢性的な疾患又は損傷により引き起こされる、末梢神経
系又は中枢神経系におけるニューロンの機能異常より生じる。慢性疾患過程は、
神経系に永久に進行性の傷害を与え、通常（特に中枢神経系においては）永久的
な機能の欠損をもたらす。そのような神経学的機能の欠損は、世界中で、身体能
力低下及び死亡の主要な原因となっている。
【０００４】 免疫抑制剤FK506（USANタクロリムス；プログラフ（Prograf）（登録商標））
は、イムノフィリンFKBP-12と結合することにより免疫抑制を誘導する。この結
合により、カルシニューリンによる転写因子NF/AT（活性化T細胞の核内因子）の
脱リン酸化が抑制され、カルシニューリンの核内への移行が遮断され、T細胞増
殖にとって必要なインターロイキン-2（IL-2）のようなサイトカインの合成及び
分泌の受容体媒介性の増加が抑制される。FK506は、座骨神経の挫傷の後、用量
依存的に、ラットにおける機能回復及び軸索再生の速度を高めることも見出され
ている。
【０００５】 米国特許第5,654,332号（アーミステッド（Armistead）ら）は、FKBP-12と結
合し、NGFの存在下で神経突起伸展を刺激すると言われる免疫抑制性FK506アナロ
グについて論じている。これらのFKBP-12結合化合物の神経栄養活性は、「FKBP-
12に対する親和性及びFKBP-12のロータマーゼ活性を阻害する能力に直接的に関
連している」（同上、第7カラム第47〜50行）と言及された。ロータマーゼ活性
は、ペプチジルイソメラーゼによるシス-トランス異性化の尺度となり、この活
性の阻害は治療剤の免疫抑制及び神経栄養の活性の指標として受け入れられてい
る。米国特許第5,614,547号（ハミルトン（Hamilton）ら）を参照のこと。
【０００６】 FKBP-12に結合するが、カルシニューリン活性は阻害しない（および免疫抑制
剤ではない）2つの合成FK506アナログの全身投与により、有髄線維のサイズが増
加することが報告されている（ゴールド（Gold）ら、Exp.Neurol.147:269-278,1
997；スタイナー（Steiner）ら、Nature Medicine 3:1-8,1997；スタイナー（St
einer）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:2019-2024,1997）。アンドロゲン及び
エストロゲンがハムスターにおいて顔面神経再生を刺激することも報告されてい
る（例えば、タンザー（Tanzer）及びジョーンズ（Jones）、Exp.Neurol.146:25
8-264,1997）。
【０００７】 神経再生を刺激することが以前より示されている化合物の多くは、免疫抑制（
FK506及び免疫抑制活性を保持しているアナログ）又はアンドロゲンもしくはエ
ストロゲンの刺激のような、望ましくない副作用を有している。従って、投与を
受ける被験者に十分に許容される種類の神経成長刺激化合物を提供する必要性が
存在する。
【０００８】 発明の概要 FK506及び他のアナログが神経成長刺激を誘導する機構は以前から誤解されて
おり、それがこの目的のための新薬開発にとって障壁となっていた。
【０００９】 本発明は、神経成長刺激が、従来考えられていたようなFKBP-12との相互作用
によってではなく、成熟ステロイド受容体複合体の破壊により促進されるという
驚くべき発見を利用している。複合体の破壊には、ステロイド受容体複合体、例
えば成熟ステロイド受容体複合体又は成熟複合体の前駆体である比較的未成熟な
型の複合体の、物理的組立ての阻害、分解の促進、又は機能の阻害が含まれうる
。MAPキナーゼ/キナーゼ（MEK）の神経成長刺激への関与、及び神経成長刺激化
合物と組み合わされた場合の神経突起伸展において熱の果たす役割は、本発明の
一部として利用されうる付加的なパラメーターである。
【００１０】 神経突起伸展を促進する生化学的機構の発見を考慮して、神経成長の促進にお
いて活性を有する可能性のある新規化合物を選択するためのアッセイ法が開発さ
れている。そのようなアッセイ法は、アンドロゲン又はエストロゲンのようなス
テロイドリガンド以外の被検化合物がステロイド受容体複合体の組立てを破壊す
るか否かを決定する段階、及びステロイド受容体複合体の組立てを破壊する化合
物を選択する段階を含む。又は、アッセイ法は、試験化合物がMEK活性を刺激す
る能力を決定する段階、及びこれに基づいて化合物を選択する段階を含む。スク
リーニングされうる特定の種類の化合物の例には、ゲルダナマイシン（geldanam
ycin）及びその構造的アナログ、ラパマイシン及びその構造的アナログ、FK506
及びその構造的アナログ、ラジシコール（radicicol）及びそのアナログ、並び
にバスタジン（bastadin）及びそのアナログが含まれる。このアッセイ法により
選択される化合物は、さらなる調査のため、化合物により誘導される実際の神経
突起伸展を測定するための付加的なアッセイ法において試験することができる。
このように、ステロイド受容体複合体の破壊又はMEK刺激のためのアッセイ法に
より、神経栄養化合物が同定されている。
【００１１】 （例えば会合の阻害又は分解の促進により）例えば成熟ステロイド受容体複合
体のような、ステロイド受容体複合体の組立てもしくは機能を破壊する、又はME
K活性を刺激する化合物（アッセイ法により発見された化合物を含む）を被験者
に投与することにより、被験者の神経細胞成長を刺激するための方法が設計され
ている。ここで、化合物は、（アンドロゲン又はエストロゲンのような）ステロ
イド受容体複合体のステロイドホルモン結合部位に対するリガンド以外の化合物
であり、いくつかの特定の態様においてFKBP-12と高親和性で結合しない。治療
的量の熱は、神経成長刺激化合物と組み合わせて投与されうる。特定の態様にお
いて、ステロイド受容体複合体のp23構成要素とhsp-90構成要素との会合を破壊
するため、又はFKBP-52とhsp-90との会合を破壊するための化合物が投与される
。他の態様において、ATPと競合してhsp-90のアミノ末端ATP結合部位、例えばス
テロイド受容体複合体のゲルダナマイシン結合部位に結合する化合物が投与され
る。更に他の態様において、MEK活性を刺激するための化合物が投与される。こ
れらの方法は、ゲルダナマイシン又はその構造的なアナログもしくは模倣物のよ
うなベンゾキノンアンサマイシン、抗FKBP-52抗体、ラジシコール又は構造的ア
ナログもしくはその模倣物、又はバスタジン又はその構造的アナログもしくは模
倣物の投与を含む。本方法は、ステロイド受容体複合体の会合を破壊する化合物
以外の第二の神経栄養因子の投与も含みうる。
【００１２】 方法は、中枢神経系又は末梢神経系いずれかのニューロンに対する疾患又は損
傷により引き起こされるニューロン機能異常に関連した神経学的状態を有する動
物（ヒトのような哺乳動物を含む）の治療において有用である。加熱又は非加熱
の化合物又は組成物は、成熟ステロイド受容体複合体（例えば、hsp-90のゲルダ
ナマイシン結合部位）に結合して成熟ステロイド受容体複合体の会合を破壊又は
MEK活性を刺激し、ニューロンからの神経突起伸展を促進するために、治療に有
効な神経栄養量を動物に投与する。本方法はまた、外科的神経移植又はその他の
神経学的組織の移植のような操作と関連して、移植片又は埋没物の治癒を促進し
、移植片又は埋没物の隣接組織への取り込みを促進するためにも使用されうる。
【００１３】 ステロイド受容体複合体のステロイドホルモン結合部位に対するリガンドでは
ないある種の薬学的化合物は、ステロイド受容体複合体の組立てを破壊できる。
これらの化合物は、ゲルダナマイシン及びその構造的アナログ、ラパマイシン及
びその構造的アナログ、又はFK-506及びその構造的アナログ、ラジシコール又は
その構造的アナログもしくは模倣物、又はバスタジン又はその構造的アナログも
しくは模倣物でありうるが、さらに特定の態様において、化合物は、低いロータ
マーゼ阻害活性を有するか、FK-506又はラパマイシンのアナログ以外であるか、
高親和性でFKBP-12と結合しないか、又は免疫抑制性でない。特定の態様におい
て、化合物は、ステロイド受容体複合体の会合の阻害又は解離の促進のいずれか
により、ステロイド受容体複合体（例えば、成熟ステロイド受容体複合体）の形
成を特異的に破壊する；例えばステロイド受容体複合体のp23構成要素とhsp-90
との会合の破壊、又はFKBP-52とhsp-90との会合の破壊、又はp23、FKBP-52、も
しくはhsp-90と複合体との相互作用の阻害による。いくつかの化合物の態様では
、化合物は、ゲルダナマイシンとステロイド受容体複合体との結合部位でもある
、hsp-90のアミノ末端ATP結合部位に、ATPと競合して結合する。特定の態様にお
いて、化合物は、hsp-90のゲルダナマイシン結合部位に結合するラジシコール又
はラジシコールアナログである。他の態様において、化合物は、抗FKBP-52抗体
、又はステロイド受容体複合体のhsp-90からのFKBP-52の解離を特異的に引き起
こす他の薬剤である。
【００１４】 化合物は、NGF、IGF-1、αFGF、βFGF、PDGF、BDNF、CNTF、GDNF、NT-3、NT4/
5、及びそれらの混合物のような他の神経栄養因子、又はステロイド受容体複合
体のリガンドであるステロイドホルモン（エストロゲン、アンドロゲン、又はデ
キサメタゾンのようなコルチコステロイド）も含むことのできる薬学的組成物に
取り込まれうる。
【００１５】 さらに特定の局面において、化合物は、複合体からのp23又はFKBP-52の解離を
引き起こすこと、又はp23もしくはFKBP-52と複合体との会合を阻害すること、又
はp23、FKBP-52もしくはhsp-90と複合体との相互作用を阻害することにより、ス
テロイド受容体複合体の組立てを破壊するか、又は機能を妨害する、低いFKBP-1
2結合親和性及び低いロータマーゼ活性を有するFK506アナログからなる群より選
択される、複合体のステロイドホルモン結合部位以外のステロイド受容体複合体
のポリペプチドに結合する、神経成長を刺激する量の薬剤、例えば、ベンゾキノ
ンアンサマイシン及びそれらの構造的アナログ、複合体の選択された構成要素と
もう一つのポリペプチド構成要素との相互作用の部位に、複合体の選択されたポ
リペプチド構成要素の配列を含むペプチド、抗体、並びにそれらの組み合わせで
ある。
【００１６】 本発明の化合物は、有意なカルシニューリン阻害又はロータマーゼ阻害を有し
ている必要がない。化合物は、ロータマーゼ阻害に関して、1nMより大きい、例
えば10nM、25nMより大きいIC50を有していてもよく、さらには50〜100nMのIC50
を有していてもよい。
【００１７】 神経細胞成長を刺激する化合物を被験者に投与することにより、被験者におけ
る神経細胞成長を刺激することができ、化合物は、ラジシコール（radicicol）
もしくはそのアナログ；バスタジン（bastadin）もしくはそのアナログ；または
、MAPキナーゼ/キナーゼ活性を刺激する薬剤のうちの一つ又は複数である。特定
の態様において、化合物は、ラジシコールアナログ、又は例えば、バスタジン1
、バスタジン2、バスタジン3、バスタジン4、バスタジン5、バスタジン6、バス
タジン7、バスタジン8、バスタジン9、バスタジン10、バスタジン11、バスタジ
ン12、バスタジン13、バスタジン14、バスタジン15、バスタジン16、バスタジン
17、バスタジン18、バスタジン19、もしくはバスタジン20、特に、バスタジン10
などのバスタジン、またはバスタジンアナログである。
【００１８】 方法はまた、ラジシコールもしくはそのアナログ、またはバスタジンもしくは
そのアナログを、成熟ステロイド受容体複合体の会合を破壊またはMAPキナーゼ/
キナーゼ活性を刺激する化合物以外の神経栄養因子と組み合わせて投与する段階
を含む。神経栄養因子は、例えば、NGF、IGF-1、α-FGF、β-FGF、PDGF、BDNF、
CNTF、GDNF、NT-3、NT4/5、およびその混合物であり得る。
【００１９】 別の局面は、ラジシコールアナログまたは血小板由来増殖因子BB（PDGFBB）も
しくはそのアナログなどの、MAPキナーゼ/キナーゼ活性を刺激する薬剤を検出す
ることによる、神経細胞成長を刺激する薬剤のスクリーニングである。
【００２０】 方法はまた、神経細胞成長が望ましい部位に、例えば正常な解剖学的経路に沿
って、または、離断した、部分的に離断した、もしくはさもなくば損傷した神経
の解剖学的領域に、十分量の熱を加える段階を含む。あるいは、例えば発熱を誘
導することにより、または暖められた環境に身体を置くことにより、被験者の体
温を全身にわたって上げてもよい。本発明はまた、神経成長が望ましい部位に、
例えば、解剖学的経路に沿った神経成長が望ましいような、該解剖学的経路を規
定する管状部材などのテンプレート（template）を供給することを含む。望まし
いならば、治療有効量の神経栄養化合物を、神経成長を促進するテンプレートと
共に提供することができる。テンプレートは、離断したまたは部分的に離断した
神経の両端の間に配置されうる。神経成長を促進するのに有効な治療上十分量の
熱を、テンプレートに加えることができる。または、望ましい解剖学的経路に沿
ったテンプレートに神経栄養化合物を注入することができ、または注入されたテ
ンプレートを加熱することができる。
【００２１】 いくつかの態様において、ラジシコール化合物またはそのアナログは下記式で
あり、かつ、特定の態様においてはラジシコールでない：
【化９】 式中、X、Y、Z、R1、R2、およびR3は実施例14に定義される通りである。
【００２２】 いくつかの態様において、神経栄養化合物は以下のような完全なバスタジンま
たはバスタジンアナログ
【化１０】 であり、式中、各Rは、H、C1-8アルキル、またはスルファトからなる群より別々
に選択され、Wは、H、OH、またはC1-8アルコキシからなる群より選択され、X、Y
、およびZは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、またはC1-8アルコキシからなる
群より別々に選択され、AおよびBは、単結合または二重結合により結合された炭
素原子である。特定の完全なバスタジン構造（天然の大環式バスタジン構造も示
す）を実施例15に示す。
【００２３】 下記式のヘミバスタジン（hemibastadin）およびそのアナログも含まれる：
【化１１】 式中、A、B、R、W、X、およびYは、完全なバスタジンについて上記で規定された
通りである。特定のヘミバスタジン構造を実施例15に示す。
【００２４】 下記式のヘミバスタジノール（hemibastadinol）およびそのアナログもまた含
まれる：
【化１２】 式中、A、B、R、W、X、およびYは、完全なバスタジンについて上記で規定された
通りである。特定のヘミバスタジノール構造を実施例15に示す。
【００２５】 その他の態様において、化合物は以下のようなバスタジンサブユニット：
【化１３】 であり、式中、A、B、R、W、およびXは、完全なバスタジンについて上記で規定
された通りである。バスタジンサブユニットの特定の例を実施例15に示す。
【００２６】 以下の詳細な説明および添付の図面から、前述の、および様々な本発明の特徴
および利点がさらに明らかになると考えられる。
【００２７】 特定の態様の詳細な説明 ステロイド受容体は、特定の構造遺伝子の上流領域との直接的な相互作用によ
り遺伝子発現を制御する分子のスーパーファミリーに属する。受容体が活性状態
及び不活性状態の両方をとることができることが、ホルモンの作用にとって重要
である。この制御は、ステロイド受容体複合体（SRC）を形成する、受容体（ス
テロイドリガンド結合構成要素）、ならびに熱ショックタンパク質（hsp-90）、
p23、及びFKBP-52のようなシャペロンタンパク質の多構成要素複合体との会合に
より達成される。ステロイド受容体がそのリガンドと結合すると、受容体は活性
化され、SRCのシャペロンタンパク質が解離し、受容体のDNA結合ドメインが遺伝
子調節配列との相互作用のため露出する。この様式で制御されているステロイド
受容体ファミリーのメンバーには、（アルドステロンのような）鉱質コルチコイ
ド、（デキサメタゾンのような）糖質コルチコイド、（プロゲステロンのような
）プロゲスチン、（テストステロンのような）アンドロゲン、並びにエストロゲ
ン（エストロゲン、β-エストリオール、及びβ-エストラジオールを含む）が含
まれる。
【００２８】 ステロイド受容体複合体組立てのモデルを図1に示す。ステロイド受容体SRとh
sp-90/p-60/hsp-70折り畳み複合体（フォールドソーム（foldosome））とのATP
依存性の会合により、p23又はモリブデン酸塩の非存在下で不安定な中間（SR/hs
p-90/p-60/hsp-70）複合体が生じる。p23が複合体と会合し、hsp-90がイムノフ
ィリン（例えば、FKBP-52及びCyP40）のようなテトラトリコペプチドリピート（
tetratricopeptide repeat）（TPR）ドメインタンパク質と結合すると、準成熟
準安定SRCが形成される（SR/hsp-90/p23/FKBP-52）。図1において、TPRドメイン
は、FKBP-52が結合している黒塗りの三日月形により示されている。成熟ステロ
イド受容体複合体の組立ては、図1に示されている最終段階であり、シャペロン
タンパク質の複合体hsp-90/p23/FKBP-52がステロイド受容体SRと共に組立てられ
る。
【００２９】 イムノフィリンとは、免疫抑制剤活性の媒介因子であることが知られている高
度に保存されたシャペロンタンパク質のファミリーである。最もよく特徴づけら
れているイムノフィリンはFKBP-12であり、FKBP-12は、Tリンパ球において免疫
抑制剤FK-506と相互作用して、カルシニューリンが活性化T細胞の核内因子（NF/
AT）の脱リン酸化を抑制し、それにより免疫機能にとって必要なサイトカインの
合成及び分泌を遮断する。イムノフィリンはペプチジルイソメラーゼ（PPIase）
活性を有し、この活性の阻害剤は、ペプチジルプロピルのシス-トランス異性化
の阻害を測定するロータマーゼアッセイ法で検出されうる。しかし、FKBP-12に
よる免疫抑制は、ロータマーゼ活性を阻害する能力により媒介されるのではない
。免疫抑制を実際には媒介していないカルシニューリン活性の脱リン酸化を測定
しているにもかかわらず、ロータマーゼ活性はイムノフィリンの免疫抑制活性の
指標として受け入れられている。従来の研究者らは、（FK506がそうであること
が見出されていたため）神経再生を促進すると考えられるFKBP-12結合薬を検索
するため、ロータマーゼアッセイ法を利用していた。
【００３０】 本発明は、神経再生を促進するものが、FKBP-12と結合するのではなく、SRCの
組立ての破壊であるという驚くべき所見を利用する。したがって、ロータマーゼ
又は免疫抑制の活性を測定することにより神経再生を促進するFKBP-12アナログ
を見出そうという従来の努力は見当違いであり、（免疫抑制及び心筋症のような
）望ましくない副作用を有する薬物を見出す可能性が高かった。本発明は、神経
再生を促進する実際の生化学的機構の発見を利用して先行技法におけるアッセイ
法よりも優れた、新規な神経栄養薬を見出すための優れたアッセイ法を提供する
。
【００３１】 そのような新規化合物の一つが、ベンゾキノンアンサマイシン抗生物質である
ゲルダナマイシンであり、これは薬学的に特異的にhsp-90に結合し（Whitesell
ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:8324-8328,1994）、ヘテロ複合体アセンブリ系
のp23構成要素とhsp-90との会合を阻害する（Johnson及びToft,Mol.Endocrinol.
9:670-678,1995）。それにより、ゲルダナマイシン及びラジシコールはステロイ
ド受容体複合体の解離を促進し、複合体のホルモン反応型の再組立てを遮断する
ことにより、ホルモン活性化を抑制し、最終的にホルモン受容体の分解をもたら
す。ゲルダナマイシンは、組立ての中間段階において、プロゲステロン受容体（
PR）複合体（Smithら,Mol.Cell.Biol.15:6804-6812,1995）及び糖質コルチコイ
ド（GR）複合体（Czarら,Biochem.36:7776-7785,1997）の組立てを遮断するため
、ホルモン結合ドメインが適切に折り畳まれず、従ってステロイドと高親和性で
結合することができない（例えば、約10nM未満の濃度で存在するステロイドリガ
ンドに結合できない）。ゲルダナマイシンはまた、エストロゲン及びアンドロゲ
ンのホルモン受容体にも作用することが知られている（Smithら,Mol.Cell.Biol.
15:6804-6812,1995;Nairら,Cell Stress and Chaperones 1:237-250,1996）。9S
から4Sへの変換、又はDNA結合活性の獲得のいずれかにより測定されるGR及びPR
の形質転換は、hsp-90からのステロイド受容体の解離と相関している（例えば、
Meshinchiら,J.Biol.Chem.265:4863-4870,1990;Kostら,Mol.Cell.Biol.9:3829-3
838,1989を参照のこと）。
【００３２】 本発明に従い見出されたもう一種類の神経栄養剤は、SRCのFKBP-52構成要素に
作用するものである。驚くべきことに、神経栄養免疫抑制剤FK506の作用は、hsp
-90のコンフォメーション変化を誘導し、FKBP-52との相互作用を介していること
が見出され、hsp-90からのp23の解離を可能にし、それにより成熟SRCの組立てを
妨害する。本発明はまた、FKBP-52への結合によってSRCを破壊しうるバスタジン
を含む。マック（Mack）らにより、バスタジン5が[3H]リアノジンのリアノジン
受容体への結合を刺激するが、そのような刺激はFK506により中和されることが
示された（Mackら、J.Biol.Chem.、269(37) pp.23236-49、1994）。本出願の図2
におけるモデルは、FK506がどのようにFKBP-52に結合するかを示している。この
結合部位に関してバスタジン5と競合することにより、又はFKBP-52のコンフォメ
ーションにおける変化を誘導することにより、FK506はバスタジン5の作用を阻害
しうる。
【００３３】 図10に示されたように、バスタジン10は神経細胞成長を刺激する。
【００３４】 抗FKBP-52抗体もまた、成熟SRCの組立てを阻害する。FK506とGR関連FKBP-52と
の結合により、デキサメタゾン反応性のGRの核内移行の増加、及びGR媒介性遺伝
子発現の増強が引き起こされる（Sanchez及びNing、METHODS:A Companion to Me
th.Enzymol.9:188-200,1996）。
【００３５】 FKBP-52及びCyP40はhsp-90に直接的に結合し、FKBP-52とCyP40はhsp-90との結
合を相互に競合する。CyP40は、サイクロスポリンA（CsA）が標的とするタンパ
ク質及びそのアナログの一例である。これらのイムノフィリンは、互いに排他的
な様式でhsp-90に結合し、別々にCyP40-hsp-90複合体及びFKBP-52-hsp-90複合体
を形成させる（Ratajczak及びCarrello,J.Biol.Chem.271:2961-2965,1996）。FK
BP-52、CyP40、及びPP5のようなイムノフィリン、並びにp60及びMas70pのような
非イムノフィリンタンパク質は、一つ又は複数のテトラトリコペプチドリピート
（TPR）ドメイン（Ratajczakら,J.Biol.Chem.268:13187-13192,1993）を有し、h
sp-90のTPR結合ドメインと結合する。タンパク質におけるTPRドメイン数の増加
は、hsp-90結合親和性の増加と相関していると考えられる。従って、一つ又は複
数のTPRドメインを有しているペプチドは、hsp-90結合親和性を増加しているこ
とが予想され、成熟ステロイド受容体複合体の組立てに必要なFKBP-52とhsp-90
との会合を妨害すると考えられる。
【００３６】 例えば、FKBP-52及びCyP40両方とhsp-90との結合は、3つのTPRドメインを含む
ヒトCyP40の精製された断片によって、及び4つのTPRドメインを含むラットPP5の
断片により競合的に阻害される（Pratt及びToft,Endocrine Rev.18:306-360,199
7の総説による）。従って、そのような精製された断片、又は一つもしくは複数
のTPRドメイン（特に、2つ、3つ、もしくはそれ以上のTPRドメイン）を含むPP5
、p60、及びMas70のような他のペプチドは、ステロイド受容体複合体の組立て又
は機能の妨害に適しており、本発明の範囲に含まれる。
【００３７】 ラジシコール、ラジシコールアナログ、バスタジン、バスタジンアナログ、ゲ
ルダナマイシン及び、ステロイド受容体複合体のステロイド結合ドメインと直接
結合しないその他の神経栄養剤の効果は、これらの化合物とステロイド受容体複
合体の構成要素との結合により生じ、直接的（hsp-90との結合、もしくはhsp-90
とステロイド受容体との結合の妨害により）、又は間接的（それ自体がhsp-90と
結合するFKBP-52のようなポリペプチド、もしくはp23と結合するポリペプチドと
の結合により）に、又はhsp-90もしくはp23とステロイド受容体複合体との会合
を抑制することにより、ステロイド受容体複合体からのhsp-90の解離が引き起こ
されると考えられる。hsp-90が複合体を形成し、他のhsp-90基質タンパク質のた
めにそのシャペロン機能を実行する能力の妨害もまた、FK506及び/又はゲルダナ
マイシンによる観察されている神経再生刺激の原因であるか、又はそれに寄与し
ていると考えられる。成熟ステロイド受容体複合体の機能を妨害する薬剤（準成
熟複合体又はフォールドソームのような、成熟複合体の前駆体の妨害を含む）も
、本発明の範囲に含まれる。MAPキナーゼ/キナーゼを刺激する化合物もまた、本
発明の範囲に含まれる。
【００３８】 本発明の神経栄養化合物の特定の態様は、カルシニューリン阻害を実質的に含
まず、低いロータマーゼ阻害、例えば、約1nMより大きい、又はさらには5もしく
は10nMより大きいIC50を有しうる。
【００３９】 MAPキナーゼ/キナーゼ（MEK）が神経突起伸展において果たす役割の同定はま
た、神経成長を刺激しうる化合物のスクリーニングのための基準も提供する。ME
K活性を刺激する化合物は、本発明の範囲に含まれる。
【００４０】 略語及び定義 AR： アンドロゲン受容体。
【００４１】 ER： エストロゲン受容体。
【００４２】 GR： 糖質コルチコイド受容体。
【００４３】 PR： プロゲステロン受容体。
【００４４】 SRC： ステロイド受容体複合体。これらに限定されないが、プロゲステロン受容体、
糖質コルチコイド受容体、エストロゲン受容体、アンドロゲン受容体、及び鉱質
コルチコイド受容体を含む、任意のステロイド受容体に関連した多重タンパク質
複合体。
【００４５】 TPR： テトラトリコペプチドリピートは、FKBP-52のドメインIIIである。TPRは、34
アミノ酸からなる縮重コンセンサス配列であることが、シコルスキ（Sikorski）
ら（Cell 60:307-317,1990）により最初に同定された。
【００４６】 模倣物： 医薬品と類似の効果を有する（ペプチドのような）生物学的化合物、例えば、
hsp-90のゲルダナマイシン結合部位に結合することにより、ベンゾキノンアンサ
マイシンと類似の効果を有するペプチド。
【００４７】 ステロイド受容体複合体のステロイドホルモン結合部位に対するリガンド： 受容体サブタイプに対する既に認識されたリガンド。例えば、GRに対するデキ
サメタゾン、ERに対するエストロゲン、ARに対するテストステロン、PRに対する
プロゲステロン。
【００４８】 イムノフィリン： シス-トランス異性化を生じるPPIase活性を有するシャペロンタンパク質の高
度に保存されたファミリー。イムノフィリンは、低分子量イムノフィリン（40kD
未満）と高分子量イムノフィリン（40〜65kD）とに分類される。高分子量イムノ
フィリン（例えば、FKBP-52）は、FKBP-12とは対照的に、hsp-90との結合を媒介
するテトラトリコペプチドリピート（TPR）を3つ又はそれ以上含む。イムノフィ
リンは、サイクロスポリンA（シクロフィリン）又はFK506及びラパマイシン（FK
結合タンパク質、FKBP）のいずれかに結合する能力に基づき、さらに2つの種類
に分類されうる。イムノフィリンのFKBPファミリーのメンバーには、FKBP-12、F
KBP-13、FKBP-25、FKBP-52（FKBP-59とも呼ばれる）及びFKBP-65が含まれる。PP
5も、シルバーステイン（Silverstein）ら（J.Biol.Chem.272:16224-16230,1997
）により報告されたように、FK506に弱く結合するため、このファミリーのメン
バーであると見なされる。
【００４９】 NGPA： 神経成長促進剤。「神経成長促進剤」又はNGPAは、特定の作用機構に限定され
ることなく、hsp-90及びFKBP-52（これらに限定されない）を含む構成要素のよ
うな、ステロイド受容体複合体のポリペプチド構成要素に結合し、神経再生を促
進する物質として定義される。特定の態様において、NGPAは、FKBP-12に結合せ
ず（又は低親和性で、もしくは1μMより大きいKdで結合し）、低いロータマーゼ
阻害活性（2500nMより大きい見かけKi）を有し、カルシニューリンに低親和性で
結合し（結合に30μMより大きい濃度を必要とし）、又は薬剤が投与された被験
者において総血液リンパ球数の減少が実質的に存在しないことにより測定される
非免疫抑制性を有する。NGPAには、これらに限定されないが、以下の化合物が含
まれる：非FKBP-12結合性（「非結合性」）又は低親和性FKBP-12結合性のFK506
アナログ；ゲルダナマイシン、ゲルダナマイシンの天然に存在するアナログ（こ
れらに限定されないが、ハービマイシンA及びマクベシン（DeBoerら,J.Antibiot
.(Tokyo)23:442-447,1970;Omuraら,J.Antibiot.(Tokyo)32:255-261,1979;Onoら,
Gann.73:938-944,1992）を含む）、並びにゲルダンピシン（geldampicin）、ツ
ニカマイシン、及びジヒドロゲルダナマイシンのようなそれらの構造的なアナロ
グ及び誘導体、さらに実施例12に列挙された化合物を含むベンゾキノンアンサマ
イシン；SRCの構成要素を妨害するか、又は競合的に結合する、（TPRドメインの
ような）複合体の構成要素間の相互作用部位に、ステロイド受容体複合体の特定
のポリペプチド構成要素のアミノ酸配列を含むペプチド；並びにステロイド受容
体複合体のポリペプチド間の相互作用を妨害する、ステロイド受容体複合体のポ
リペプチド構成要素に特異的に結合する抗体、例えば抗hsp-90、抗FKBP-52など
。神経栄養剤には、（SRCの会合の阻害もしくは解離の促進のいずれかにより）
成熟SRCの会合を物理的に破壊するか、又はSRCの（p23、FKBP-52、もしくはhsp-
90のような）構成要素の相互作用を阻害する化合物が含まれる。神経栄養剤には
更に、MAPキナーゼ/キナーゼ活性を刺激する化合物が含まれる。哺乳動物の体温
を生理学的に許容される温度まで増大させるために、神経成長を刺激する化合物
の投与と組み合わせて、生理学的に許容される期間適用される熱は、更にもう一
つの神経栄養剤である。
【００５０】 神経栄養性： 神経成長の促進。
【００５１】 形質転換： 9S非DNA結合型ステロイド受容体複合体から4S DNA結合型への変換。「活性化
」という用語は、ステロイドリガンド非結合型からステロイドリガンド結合型へ
のステロイド受容体の変換をさす。
【００５２】 ロータマーゼ活性： ロータマーゼ（PPIase）活性は、例えば国際公開公報第92/04370号のようにし
て決定され、Kiとして表されうる。モデル基質、N-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe
-4-ニトロアナリド（nitroanalide）におけるアラニン-プロリンペプチド結合の
シス-トランス異性化を、基質のトランス型から4-ニトロアナリドを放出させる
キモトリプシンを用いたカップルアッセイ法において分光学的にモニターするこ
とができる。異なる濃度の阻害剤の添加による、反応の程度に対する阻害効果が
決定され、阻害剤濃度の関数としての一次速度定数の変化の解析により見かけKi の推定値が得られる。本発明のアッセイ法において、ロータマーゼ活性は、化合
物の神経栄養活性とは関連がなく、決定される必要がないことが見出された。
【００５３】 （FKBP-12結合化合物又はFK506アナログのような）「公知の」又は「認識され
た」化合物とは、特許又は文献において従来報告されているもの、又は報告され
ていないが先行技術として認可されるものである。
【００５４】 アナログとは、神経突起伸展刺激などの親化合物の生物活性を保持する、構造
的な類似化合物である。
【００５５】 実施例1 神経成長促進剤を同定するためのアッセイ法 神経再生を刺激する候補化合物の一次スクリーニングとして用いられうる、hs
p-90、FKBP-52、及びステロイド受容体複合体の他のポリペプチド構成要素に結
合する化合物を解析するための周知の方法が多数存在する。化合物は、続いて、
神経再生刺激における活性についてインビトロ又はインビボで試験されうる。
【００５６】 実施例は、被検化合物とステロイド受容体複合体の構成要素であるポリペプチ
ドとの結合に関するアッセイ法を含む。hsp-90との結合を検出するためのアッセ
イ法は、例えば、ホワイトセル（Whitesell）ら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:8
324-8328,1994）により記載されている。20μg/mLのTNESV緩衝液（50mM Tris-HC
l,pH7.4/1％ Nonidet P-40/2mM EDTA/100mM NaCl/1mM オルトバナジン酸塩/1mM
フェニルメチルスルホニルフルオリド/1mL当たり20μgのロイペプチン/1ml当た
り20μgのアプロチニン）に溶解した市販品のhsp-90（StressGen Biotechnologi
es,Victoria,BC）及び被検化合物を、一般的な固体支持体に固定化されたゲルダ
ナマイシン、例えばゲルダナマイシンがカップリングしたアガロースビーズ（Wh
itesellら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:8324-8328,1994）と共に、4℃で45分間
インキュベートする。次に、TNESV緩衝液でビーズを洗浄し、還元ローディング
緩衝液中で加熱することにより結合したhsp-90を溶出させる。それを、SDS/PAGE
及び銀染色（Bio-Rad）により解析することができる。又は、hsp-90が標識され
ている場合には、非結合標識ではなく結合標識に関してアッセイ法を行うことが
できる。ゲルダナマイシンと競合してhsp-90に結合する被検化合物は、可溶化hs
p-90とビーズとの結合を阻害する。
【００５７】 他のステロイド受容体複合体ポリペプチド構成要素に結合する化合物を同定す
るため、類似のアッセイ法を行うことができる。FKBP-52との結合は、組換えFKB
P-52（Peattieら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10974-10978,1992）を用いてアッ
セイされうる。p23との結合は、組換えヒトp23（Johnsonら,Mol.Cell.Biol.14:1
956-1963,1994）及び固定化hsp-90を用いてアッセイされうる。精製されたhsp70
及び組換えp60（Dittmarら,J.Biol.Chem.271:12833-12839,1996）も、そのよう
な結合アッセイ法において利用可能である。
【００５８】 一般的なイムノアッセイ法、及びステロイド受容体複合体構成要素に特異的な
抗体、例えば、FKBP-52（Taiら,Biochem.25:5269-5275,1986）、hsp-90（Sanche
zら,J.Biol.Chem.260:12398-12401,1985;Catelliら,EMBO J.4:3131-3135,1985;S
chuhら,J.Biol.Chem.260:14292-14296,1985）、hsp70（hsp-90も認識する血清）
（Erhartら,Oncogene 3:595-603,1988）、及びp23（Johnsonら,Mol.Cell.Biol.1
4:1956-1963,1994）に対する抗体を用いて、イムノアッセイ法を行うこともでき
る。
【００５９】 受容体複合体からのhsp-90の解離を含む、受容体形質転換に関する通常行われ
ている定量解析は、ホスフォセルロース（Kalimiら,J.Biol.Chem.250:1080-1086
,1975;Atger及びMilgrom,Biochem.15:4298-4304,1976）、ATP-セファロース（To
ftら,J.Steroid Biochem.7:1053-1059,1976;Miller及びToft,Biochem.17:173-17
7,1978）、及びカルボキシメトール-セファデックス（Milgromら,Biochem.12:51
98-5205,1973;Parchman及びLitwack,Arch.Biochem.Biophys.183:374-382,1977）
のようなポリアニオンに結合する状態へ受容体複合体を変換する。
【００６０】 神経細胞成長（神経突起伸展）に関するインビトロアッセイ法は、実施例2及
びゴールド（Gold）ら（Exp.Neurol.147:269-278,1997）によって提供されてい
る。ラット座骨神経に対する挫傷の後の神経再生及び機能回復に対する被検化合
物の全身投与の効果を検査する、神経再生に関するインビボアッセイ法は、例え
ば、ゴールド（Gold）ら（Restor.Neurol.Neurosci,6:287-296,1994）、ゴール
ド（Gold）ら（J.Neurosci.15:7505-7516,1995）、ワング（Wang）ら（J.Pharma
col.Exp.Therapeutics 282:1084-1093,1997）、ゴールド（Gold）ら（Exp.Neuro
l.147:269-278,1997）、及びゴールド（Gold）ら（Soc.Neurosci.Abst.23:1131,
1997）において論じられている。麻酔を受けたラットの座骨神経を露出させ、股
関節部のレベルで鉗子を用いて神経に挫傷を与える。座骨神経挫傷の後、例えば
皮下注射又は経口投与により被検化合物をラットに投与する。機能回復を、動物
が脚を立て爪先を動かすことができるようになるまでの神経挫傷からの日数、及
び動物が後肢及び爪先で歩行することができるようになるまでの日数を決定する
ことにより調べる。
【００６１】 神経再生は、挫傷部位からの既知の距離（0.5cm）の座骨神経から組織を採取
し、光学顕微鏡により有髄線維の数を計数することによっても調べられる。軸索
のサイズを電子顕微鏡により計測する。適当なソフトウェアを有するコンピュー
タに接続されたデジタル化タブレットを用いて軸索鞘を追跡することにより、有
髄線維及び無髄線維両方の軸索域を決定する。これらのデータから累積ヒストグ
ラムを構築し、被検化合物投与の軸索域に対する効果を調べるため、平均値及び
標準誤差を計算する。
【００６２】 実施例2 FK506及びゲルダナマイシンは共通の機構により神経再生を促進する 本実施例は、FK506及びゲルダナマイシンが共通の機構により神経再生を促進
することを例示する。SH-SY5Yヒト神経芽腫細胞を、10％ウシ胎児血清（SIGMA）
、50IU/mLペニシリン、及び50mg/mLストレプトマイシン（GIBCO）が添加されたD
MEM培地（GIBCO）中で、37℃、7％CO２で維持した。細胞を、1×10６個/ウェル
で6穴プレートに播き、0.4mMアフィジコリン（SIGMA）で処理した。5日目、細胞
を洗浄し、DMEM培地に溶解したFK506（1及び10nM）（Calbiochem-Novabiochem I
nt'l.,La Jolla,CA）及び/もしくはゲルダナマイシン（0.1、1、及び10nM）（Ca
lbiochem-Novabiochem,La Jolla,CA）の存在下又は非存在下で、（突起伸展を誘
導するため）10ng/mLの神経成長因子（NGF）（Boehringer Mannheim,Indianapol
is,IN）で処理した。培地を96時間後に交換し、さらに72時間（総時間168時間）
後に、化合物（NGFとFK506及び/又はゲルダナマイシンとの混合物）を含む新鮮
培地と交換した。軸索長の上位50％を統計解析用に選択した。全ての実験を2連
ウェルで行い、再現性のため少なくとも2回反復した。
【００６３】 細胞の神経突起長の解析のため、72時間目及び168時間目に、1ウェル当たり20
視野を無作為に撮影した。適当なソフトウェア（Bioquant IV,R&M Biometrics,N
ashville,TN）を有するIBM XTコンピュータに接続されたヒューストンインスト
ルメントHI-PAD（Houston Instrument HI-PAD）デジタル化タブレットを用いて
写真上で神経突起長を測定し、細胞体の長さの2倍よりも長い突起のみを測定し
た。同一の処理を受けたウェルからのデータは差がなかったことからそれらを合
わせた。これらのデータから平均値及びヒストグラムを構築した。分布の形状を
仮定しないマン-ホイトニー（Mann-Whitney）U検定を用いてヒストグラムを比較
した。
【００６４】 未処理の細胞及び処理を受けた細胞の神経突起の平均長を表1に示す。
【００６５】
【表１】 NGF存在下でのゲルダナマイシン処理168時間後の神経突起における上
位50％の平均長
【００６６】 ゲルダナマイシン及びFK506は、各々、濃度依存的に神経突起伸展を刺激する
。ゲルダナマイシン及びFK506の類似の神経栄養効果、極めて低い濃度（例えば
、0.1nM；データは示していない）での相加的な効果、及び高濃度での阻害効果
（高濃度の単独の各化合物など）から、2つの化合物が、共通の機構により神経
細胞に作用して神経突起を促進することを証明された。以下の実施例に例示され
るように、その機構は、両化合物とステロイド受容体複合体の構成要素との相互
作用を含むことがここで見出された。FKBP-12は、ゲルダナマイシン又はFK506の
いずれかによる神経突起伸展の刺激において役割を果たさないようである。
【００６７】 SH-SY5Yヒト神経芽腫細胞以外の細胞系が、神経成長アッセイ法において用い
られうる。適当な他の細胞系の例には、PC-12（ラットクロム親和細胞腫）、LA-
N-5細胞（SH-SY5Yよりも分化の程度が低いヒト神経芽腫細胞）、及びNeuro-2a細
胞及びNS20Y細胞（マウス神経芽腫）が含まれる。
【００６８】 実施例3 FKBP-12ノックアウトマウスはFKBP-12が神経栄養活性に関与していないことを証
明する FK506が神経伸長を増加させる能力にとってFKBP-12が必要であるか否かを試験
するため、FKBP-12ノックアウトマウス（Shou.ら,Nature 391:489,1998）を用い
た。そのようなマウスは、通常、胚期14.5日目（E14.5）から出生の間に重篤な
心筋症により死亡し、これはFKBP-12とカルシウム放出チャンネルとの既知の関
係と一致している。これらのマウスの脳には、著しい病理は認められていない。
E18.5ホモ接合性FKBP-12ノックアウトマウス及び野生型マウスから、一次ニュー
ロン海馬培養物を調製した。FKBP-12ノックアウトマウス及び野生型マウスにお
ける、FK506によるニューロンの再生促進反応には、違いが見出されなかった。
海馬ニューロンの平均軸索長は、薬物無添加の細胞培養物において（それぞれ20
3±9.5及び219±8.0；平均値±S.E.M.）[二元配置ANOVA及び最小有意差のシェフ
ェ試験；p=0.68、df=230]又はFK506処理培養物において（それぞれ264±18.2及
び276±11.1）[二元配置ANOVA及び最小有意差のシェフェ試験；p=0.94、df=112]
、FKBP-12ノックアウトマウスと野生型マウスとで有意に異ならなかった。
【００６９】 FK506は、FKBP-12ノックアウトマウス[二元配置ANOVA及び最小有意差のシェフ
ェ試験；p＜0.006、df=144]及び野生型マウス[二元配置ANOVA及び最小有意差の
シェフェ試験；p＜0.002、df=198]由来の細胞において、同様に、未処理の値よ
りも大きな有意な増加、即ちそれぞれ30％及び26％の増加を誘発した。このよう
に、FKBP-12ノックアウトマウス由来のニューロン細胞は、FK506の神経突起伸展
促進特性に対する反応性を保持している。従って、FKBP-12は、FK506が神経突起
伸展をインビトロで促進するために必要ではない。
【００７０】 実施例4 FKBP-52はFK506の神経栄養活性を遮断する ヒト神経突起伸展をインビトロで検査し、いずれのニューロイムノフィリンが
効果を媒介するのかを探究するため、神経芽腫SH-SY5Y細胞を用いた。SH-SY5Y細
胞は、外因性の神経成長因子（NGF）の非存在下では突起を伸長させず、10ng/ml
NGFにおいて神経栄養活性が最適となる。初期研究により、FK506が濃度依存的
にSH-SY5Y細胞の神経突起伸展を増加させることが示された。神経突起長の累積
ヒストグラムより、10pM〜10nMのFK506が有意に[マン-ホイトニーU検定（α=0.0
5）]神経突起伸展を増加させることが示された。しかし、100nMでは効果が低く
、1000nM又はそれ以上の濃度では神経突起伸展が阻害された。
【００７１】 FKBP-52の関与は、FKBP-12と相互作用しないマウスモノクローナル抗体FKBP-5
2Ab（StressGen Biotechnologies Corp.,British Columbia,Canada）を用いて証
明された。抗体を細胞内に導入するため、抗体の存在下で10分間サポニン（30μ
g/μl）を処理してSH-SY5Y細胞を透過性化した。予備実験で、サポニン処理によ
りNGF単独に対する細胞の反応性は変化しないことが示された。FKBP-52抗体は、
50nMと100nMの間で濃度依存的に、FK506（1及び10nM）がSH-SY5Y細胞の神経突起
伸展を促進する能力を有意に[マン-ホイトニーU検定（α=0.05）]遮断した。神
経突起長の累積ヒストグラムより、100nMのFKBP-52抗体はこれらの濃度における
FK506の作用を完全に遮断することが示された。驚くべきことに、抗体は、FK506
の作用のみならずNGFの作用も遮断した。このことから、おそらくMAPキナーゼ経
路（ERK2）が関わるシグナル伝達経路の収束が示唆される。関与している基本機
構に関わらず、FK506の神経突起伸展促進特性は、イムノフィリンFKBP-52との相
互作用に完全に依存している。
【００７２】 実施例5 FKBP-52抗体は神経突起伸展を促進する FKBP-52抗体（FKBP-52Ab）自体は、神経突起伸展に対してアゴニスト特性を有
する。図5の神経突起長の累積ヒストグラムより、FKBP-52Abが、有意に[マン-ホ
イトニーU検定（α=0.05）]、濃度依存的に、神経突起長の分布をより長い突起
を示す右方向にシフトさせたことが示されている。実際、FKBP-52Abは、FK506（
10nM）で観察される最大の神経突起よりも長い神経突起を単位時間当たりに誘導
し、現在までのところ見出された最も速く成長するいくつかの神経突起を生成さ
せた（最大長880m）。これらの所見は、神経突起伸展を増加させる能力を維持し
つつ、FKBP-52とFKBP-12とを区別することができる（即ち、両イムノフィリンに
実質的に結合しない）化合物を開発できる可能性があることを証明している。こ
の所見より、新規な種類のニューロイムノフィリンリガンド、すなわちFKBP-12
結合親和性が低いか、もしくは存在せず、SRCの構成要素に特異的に結合し、FKB
P-52（又は、p23もしくはhsp-90のようなSRCの他の構成要素）と選択的に相互作
用することにより神経再生を増加させる、ニューロイムノフィリン化合物の開発
が可能となる。
【００７３】 合成糖質コルチコイド、デキサメタゾン及びβ-エストラジオールはいずれも
、濃度依存的に、SH-SY5Y細胞における神経突起伸展を有意に増加させた。β-エ
ストラジオール（50nM）は、神経突起伸展においてデキサメタゾン（50nM）より
も有意に[マン-ホイトニーU検定（α=0.05）]より顕著な陽性効果を生じ、SH-SY
5Y細胞におけるエストロゲン受容体複合体の関与がより顕著であることが示唆さ
れた。このことは、β-エストラジオールとFK506との組み合わせがさらに有意な
[マン-ホイトニーU検定（α=0.05）]神経突起伸展の増加を生じないことを示す
データによっても裏付けられ、これらの化合物が同一のステロイド受容体サブタ
イプに作用することが示された。対照的に、デキサメタゾンとFK506との組み合
わせは、FKBP-52抗体調節下の場合より速くはないにしても、少なくとも同等の
速さで成長する神経突起（最大長960μm）を生じ、デキサメタゾンとFK506が異
なるステロイド受容体サブタイプに作用することが示唆された。以上を考え合わ
せると、FK506及びβ-エストラジオールにより誘発される最大神経突起伸展が相
加的でないという所見から、FK506によるヒトSH-SY5Y神経突起伸展促進において
、エストロゲン受容体複合体が糖質コルチコイド受容体複合体よりも大きな役割
を果たしていることが示唆される。
【００７４】 実施例6 ゲルダナマイシンはステロイド受容体複合体の破壊により神経突起伸展を促進す
る 成熟ステロイド複合体（FKBP-52及びp23を含む）の再会合を遮断し、それによ
りステロイド反応要素の核内移行及び活性化を抑制する、ベンゾキノン抗生物質
であるゲルダナマイシンで、SH-SY5Y細胞を処理した。単独のゲルダナマイシン
（0.1〜10nM）は、濃度依存的な様式で有意に[マン-ホイトニーU検定（α=0.05
）]神経突起伸展を増加させた。このように、ステロイド受容体複合体の破壊は
、神経突起伸展を増加させるのに充分である。ゲルダナマイシン及びステロイド
ホルモンはステロイド受容体リガンド構成要素の核への移行に逆の効果を有して
いるため、これらの結果は、これらの化合物の神経突起伸展に対する促進効果が
、ステロイド受容体リガンド結合構成要素の核内移行及びステロイド反応要素の
活性化以外の機構により媒介されていることを証明している。そこで、この情報
を用いて、神経再生において使用できる新規な種類のhsp-90結合化合物を開発す
るため、ゲルダナマイシンの構造を活用することが可能である。
【００７５】 ステロイド受容体複合体の破壊を決定するためのアッセイ法は、実施例10に記
載されている。
【００７６】 実施例7 他の化合物と組み合わせたゲルダナマイシンの神経栄養効果 他の神経栄養物質とゲルダナマイシンとの相互作用を探究するため、SH-SY5Y
細胞を1nM（示されていない）又は10nMのゲルダナマイシン及び様々な他の化合
物で共処理した。一方で、ゲルダナマイシン（10nM）は、有意に[マン-ホイトニ
ーU検定（α=0.05）]、FK506、デキサメタゾン又はβ-エストラジオールによる
神経突起伸展促進を阻害した。0.1nMのゲルダナマイシンは、これらの化合物全
ての神経突起伸展促進の阻害効果が低かった。他方、ゲルダナマイシン（10nM）
は、有意に[マン-ホイトニーU検定（α=0.05）]、FKBP-52抗体の神経突起伸展促
進効果を増強した。FKBP-52抗体とゲルダナマイシンとの組み合わせ効果は、hsp
-90におけるそれらの結合部位が異なっていることと一致している。ゲルダナマ
イシンはhsp-90のN末端部分に結合し、FKBP-52はC末端部分に結合する（Scheige
lら,J.Bio.Chem.272:8007,1997）。この所見は、ステロイドレベルにおける相互
作用が試験された化合物全てについて複合的であることを示しているが、抗体が
多少異なって作用することを明らかにしている。
【００７７】 これらの所見は、ゲルダナマイシンがhsp-90の（解離ではなく）コンフォメー
ション変化を生じさせ、それによるアデノシントリホスファターゼ活性を介して
p23が複合体から解離する活性化（アデノシンジホスフェート）状態がもたらさ
れる、図2に示されたモデルにより説明されうる。対照的に、FKBP-52がFK506と
結合している場合にはFK506は複合体からFKBP-52を解離させないため、このコン
フォメーション変化は遮断され、これによりp23の放出が抑制される。ステロイ
ドホルモンの存在下では、hsp-90のコンフォメーション変化を抑制するための類
似の相互作用が生じうる。このモデルは、FKBP-52抗体が、おそらくリン酸化の
程度を変化させ、それによりhsp-90との結合を減少させることにより、複合体か
らFKBP-52を解離させ、p23の放出をもたらすhsp-90のコンフォメーション変化が
起こることを示している。したがって、hsp-90からのFKBP-52の解離が、ゲルダ
ナマイシンにより誘導され、p23を放出させるコンフォメーション変化を妨げな
いため、ゲルダナマイシンとFKBP-52抗体との組み合わせは（阻害的ではなく）
相加的である。
【００７８】 さらに、hsp-90からの解離後のFKBP-52と微小管（Czarら,Mol.Endocrinol 8:1
731,1994）及びおそらくアクチンのようなミクロフィラメント（Taiら,Biochem.
32:8842,1993）との会合は、FKBP-52抗体を用いた場合に、FK506を用いた場合よ
りも顕著に神経突起伸展を促進すると思われる。微小管は、神経突起伸展及び軸
索伸長に関与しており、従って（SRCからの解離後の）FKBP-52とこれらの要素と
の会合は神経突起伸展を促進する特に効果的な機構である。
【００７９】 実施例8 ステロイド受容体複合体の安定化は神経突起伸展を阻害する 本実施例は、図2に示されたモデルにより予測されるように、ステロイド受容
体複合体の解離の抑制により神経突起伸展が阻害されることを示す。SH-SY5Y細
胞を、20mMの濃度で無傷の細胞における複合体の解離を抑制する遷移金属オキシ
アニオン（oxyanion）である、モリブデン酸ナトリウムで処理した。驚くべきこ
とに、モリブデン酸塩（20mM）自体は、神経突起伸展に対して穏和ではあるが有
意な[マン-ホイトニーU検定（α=0.05）]アゴニスト効果を示した。予測通り、
モリブデン酸塩（20mM）は、FK506により誘発される神経突起伸展促進を減少さ
せ、モリブデン酸塩の存在下でFK506により生成される神経突起長の分布はモリ
ブデン酸塩単独の場合と有意な差はなかった[マン-ホイトニーU検定（α=0.05）
]。さらに、モリブデン酸塩（20mM）は、有意に[マン-ホイトニーU検定（α=0.0
5）]、FKBP-52抗体の神経突起伸展促進効果を阻害した。
【００８０】 デキサメタゾンの存在下でのモリブデン酸塩（20mM）の神経突起伸展促進効果
は、モリブデン酸塩単独の場合と比較して有意に[マン-ホイトニーU検定（α=0.
05）]減少した。さらに、モリブデン酸塩（20mM）はβ-エストラジオール及びゲ
ルダナマイシンの神経突起伸展促進効果を完全に[マン-ホイトニーU検定（α=0.
05）]阻害した。モリブデン酸塩とβ-エストラジオールとの相互作用の程度がモ
リブデン酸塩とデキサメタゾンとの相互作用の程度よりも大きいのは、ヒトSH-S
Y5Y神経突起伸展におけるエストロゲン受容体複合体の関与がより大きいことと
一致している。モリブデン酸塩は、比較的低い（2mM）濃度では、類似の、しか
し比較的顕著でない効果を生じた（示していない）。
【００８１】 単独のモリブデン酸塩が、どのようにして伸展を増加させるのかは明らかでな
いが、データ（モリブデン酸塩がFKBP-52抗体を含む全ての薬剤の活性を阻害す
ることを示している）は、受容体複合体の解離が神経突起発達経路の活性化にと
って重要な段階であることを示している。モリブデン酸塩によるこの解離の抑制
は、ゲルダナマイシン、及び複合体の会合を破壊することにより作用する他の神
経栄養剤の神経栄養活性を阻害する。従って、アッセイにモリブデン酸塩を添加
することによって引き起こされる神経栄養活性の阻害は、神経栄養剤が構造的又
は機能的にSRCを破壊しているか否かを決定するための試験を構成しうる。
【００８２】 実施例9 ロータマーゼ阻害活性の決定 本発明のいくつかの態様は、ペプチジルプロピルイソメラーゼ（ロータマーゼ
）活性の阻害が低いか、または存在しない。この活性の阻害は、米国特許第5,61
4,547号に記載されているような、当技術分野において既知の方法により評価さ
れうる。阻害は、モデル基質N-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリド
内のアラニン-プロリンペプチド結合のシス-トランス異性化に関する見かけKiと
して表され、これは、基質のトランス型からパラ-ニトロアニリドを放出するキ
モトリプシンカップルアッセイ法において分光学的にモニターされる。異なる濃
度の阻害剤の添加により引き起こされるこの反応の阻害を決定し、阻害剤濃度の
関数の一次速度定数の変化としてデータが解析され、見かけKi値が得られる。
【００８３】 950mlの氷冷アッセイ緩衝液（25mM HEPES、pH7.8、100nM NaCl）、10mlのFKBP
（10mM Tris-HCl pH7.5,100mM NaCl,1mMジチオスレイトール中2.5mM）、25mlの
キモトリプシン（1mM HCl中50mg/ml）、及び10mlの様々な濃度の被検化合物を含
むジメチルスルフォキシドを、プラスティックキュベットに添加する。5mlの基
質（2.35mM LiClを含むトリフルオロエタノール中に5mg/mlのスクシニル-Ala-Ph
e-Pro-Phe-パラ-ニトロアニリドを含む）を添加することにより反応を開始させ
る。
【００８４】 分光光度計を用いて390nmにおける吸光度を経時的に90秒間モニターし、経時
吸光度データファイルから速度定数を決定する。2500又はそれ以上、例えば5000
より大きい、もしくはさらに10,000より大きい見かけKiを有する阻害剤を、「低
い」ロータマーゼ阻害を有していると見なす。
【００８５】 実施例10 薬剤がSRCに結合し機能を破壊するか否かを決定するためのアッセイ法 SRCの構成要素との結合を検出するためのアッセイ法が実施例1に示されている
。SRCの破壊の検出は、付加的なアッセイ法により検査されうる。
【００８６】 p23の放出によるSRCの破壊は、ホワイトセル（Whitesell）及びクック（Cook
）（1996）に開示された技法により調べることができ、ベンゾキノンアンサマイ
シンとhsp-90との結合によって、デキサメタゾン結合活性の急速な非競合的な消
失に関連する糖質コルチコイド受容体免疫沈降物からのp23タンパク質が完全な
消失すること、及び糖質コルチコイド受容体タンパク質の細胞レベルにおける遅
い（2〜8時間）顕著な減少をもたらすことを示している。この方法を用いたとこ
ろ、hsp-90と糖質コルチコイド受容体との共沈降、及び糖質コルチコイド受容体
沈降物からの検出可能なp23の完全な消失は、薬物処理により破壊されなかった
。
【００８７】 ホワイトセル（Whitesell）及びクック（Cook）は、TNESV緩衝液（50mM Tris-
HCl,pH7.4％/1％ Nonidet P-40/2mM EDTA/100mM NaCl/1mMオルトバナジン酸/1mM
フェニルメチルスルフォニルフルオリド/2μg/mlロイペプチン/20μg/mlアプロ
チニン）で細胞を溶解し、溶解物（1回の沈降当たり0.75mgの全タンパク質）を
ゲルダナマイシンがカップリングしたビーズと共にインキュベートすることによ
りアフィニティ沈降を行った。還元ローディング緩衝液中での加熱により結合タ
ンパク質を溶出させ、SDS-PAGE及びその後のクーマシーブルー染色により解析す
る。細胞溶解物からの免疫沈降を、特異的なモノクローナル抗体BuGR-2及びプロ
テインGセファロースビーズ（Pharmacia）を用いて実行する。GRとヘテロタンパ
ク質複合体構成要素との共沈降を含む実験のため、細胞を、10mMモリブデン酸ナ
トリウムを含む界面活性剤を含まない低張緩衝液中に溶解する。SDS-PAGE及びタ
ンパク質のニトロセルロースへの電気泳動転写の後、全細胞溶解物、ゲルダナマ
イシンアフィニティ沈降物、及び糖質コルチコイド受容体免疫沈降物におけるタ
ンパク質のイムノブロット検出を行った。齧歯動物由来GRの検出にはBuGR-2ハイ
ブリドーマ上清（1：40）を用い、ヒトGRにはペプチド由来ウサギポリクローナ
ル抗体（1：250；PAI-512、Affinity Bioreagents；Golden,CO）を用いる。hsp-
90及びhsp-70は、それぞれAC88抗体及びN27F3-4抗体（1：5000；StressGen;Vict
oria,BC,Canada）により検出される。p23のブロットには抗体JJ3（1：1000）を
含む腹水が用いられる。ユビキチン化タンパク質を完全に変性させ、その検出が
増強されるようブロットを20分間オートクレーブ処理した後、ユビキチン化タン
パク質を検出するため、ポリクローナルウサギ抗ユビキチン抗血清（1：500；Si
gma Chemical Co.）が用いられる。検出は、適当なペルオキシダーゼ結合二次抗
体（1:20,000）及び化学発光基質（Kierkegaard and Perry Laboratories,Gaith
ersburg,MD）を用いて行われる。
【００８８】 デキサメタゾン結合活性の欠失は、HeLa細胞（2×10５/ウェル、24穴プレート
）を、37℃、完全培地中で、様々な時間、様々な濃度のゲルダナマイシンで処理
する、結合アッセイ法を用いて決定されうる。処理期の最後に、培地を吸引し、
単層を1％BSA及び0.1％アジ化ナトリウムを含む氷冷PBS（結合緩衝液）で2回洗
浄する。次に、単層を、5mM非放射性デキサメタゾンを含む、又は含まない結合
緩衝液中に1.0μCi/ウェル（48nM）の[３H]デキサメタゾン（Amersham、82Ci/mm
ol）と共に、氷上で60分間インキュベートする。この結合期の後、ウェルを冷却
結合緩衝液で4回洗浄し、次に0.5mlエタノールで30分間抽出する。エタノール溶
液をシンチレーションバイアルに移し、蒸発乾燥させた後、標準的な液体シンチ
レーション計数を行う。特異的な結合を、過剰の非放射性デキサメタゾンの非存
在下で結合した1分間当たりのカウントから、その存在下で結合した1分間当たり
のカウントを減じたものとして計算する。デキサメタゾンをエストロゲン及び他
のステロイドに置き換えることにより、これらのステロイドの受容体を用いて類
似の測定を行い、リガンド結合の破壊を検出することができる。
【００８９】 受容体免疫沈降物からの検出可能なp23の消失（p23バンドの消滅）は、SRCの
破壊に関連したp23の消失を示している可能性がある。
【００９０】 実施例11 抗体の調製 本発明は、SRCの構成要素に対する抗体の調製も考案している。SRCの構成要素
は、免疫沈降のような、当技術分野において既知の技法により精製されうる。モ
ノクローナル抗体又はポリクローナル抗体は、SRC構成要素タンパク質、ペプチ
ド断片、又はこれらのタンパク質の変異型のいずれかに対して作製されうる。最
適には、タンパク質に対して作製された抗体は、タンパク質を特異的に検出する
と考えられる。即ち、タンパク質に対して作製された抗体は、そのタンパク質を
認識し結合し、ヒト細胞において見出される他のタンパク質を実質的に認識又は
結合しないと考えられる。抗体がタンパク質を特異的に検出することについては
、多数の標準的なイムノアッセイ法のうちのいずれか、例えばウェスタンブロッ
ティング法（Sambrookら,1989）により決定される。
【００９１】 特定の抗体調製物がタンパク質を特異的に検出することをウェスタンブロッテ
ィングにより決定するため、ヒト細胞（例えば、リンパ球）から全細胞タンパク
質を抽出し、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動す
る。次に、ウェスタンブロッティングによりタンパク質をメンブレン（例えば、
ニトロセルロース）に転写し、抗体調製物をメンブレンと共にインキュベートす
る。非特異的に結合した抗体を除去するためメンブレンを洗浄した後、特異的に
結合した抗体の存在をアルカリホスファターゼのような酵素に結合した抗マウス
抗体を用いることにより検出する。基質5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフ
ェート/ニトロブルーテトラゾリウムの適用により、免疫学的に局在化したアル
カリホスファターゼによる濃青色化合物が生成される。
【００９２】 タンパク質を特異的に検出する抗体は、この技法により、（その分子量により
決定されるゲル上の特定の位置に位置すると考えられる）タンパク質バンドに結
合することが示されると考えられる。抗体と他のタンパク質との非特異的な結合
は、ウェスタンブロット上で弱いシグナルとして起こり、検出されうる。この結
合の非特異的な性質は、特異的タンパク質結合から生じた強い主要なシグナルと
比較して、ウェスタンブロット上に得られた弱いシグナルとして当業者には認識
される。
【００９３】 SRCのタンパク質構成要素に特異的に結合する抗体は、本明細書において「特
異的結合剤」と呼ばれる種類の分子に属する。SRCタンパク質に特異的に結合す
ることができる特異的結合剤には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（
ヒト化モノクローナル抗体を含む）、並びにFab断片、F(ab')2断片及びFv断片の
ようなモノクローナル抗体の断片、さらにSRCのタンパク質構成要素に特異的に
結合することができる任意の他の薬剤が含まれうる。
【００９４】 記載のようにして同定され単離されたSRCタンパク質構成要素のエピトープに
対するモノクローナル抗体は、コーラー（Kohler）及びミルスタイン（Milstein
）（1975）の古典的な方法又はそれらの変法に従いマウスのハイブリドーマから
調製されうる。簡単に述べると、数週間にわたり数マイクログラムの選択された
タンパク質を繰り返しマウスに接種する。次に、マウスを屠殺し、抗体産生脾細
胞を単離する。ポリエチレングリコール法を用いて脾細胞をマウス骨髄腫細胞と
融合させ、アミノプテリンを含む選択培地（HAT培地）での系の増殖により過剰
の未融合細胞を破壊する。融合に成功した細胞を希釈し、希釈液の一部をマイク
ロタイタープレートのウェル内に置き、培養を継続する。エングバル（Engvall
）（1980）により最初に記載されたようなELISA、及びそれらの変法のようなイ
ムノアッセイ操作により、ウェルの上清液中の抗体を検出することにより抗体産
生クローンを同定する。選択された陽性クローンを増殖させ、それらのモノクロ
ーナル抗体産物を用いるために回収する。モノクローナル抗体作製のための詳細
な操作は、ハーロー（Harlow）及びレーン（Lane）(1988)に記載されている。さ
らに、（治療適用のための）ヒト化型モノクローナル抗体、及びモノクローナル
抗体の断片を作製するためのプロトコルは、当技術分野において既知である。
【００９５】 単一のタンパク質の異種エピトープに対する抗体を含むポリクローナル抗血清
は、発現タンパク質で適当な動物を免疫することにより調製することができ、こ
の発現タンパク質は、修飾されていなくても、又は免疫原性を増強させるため修
飾されていてもよい。効果的なポリクローナル抗体産生は、抗原及び宿主種の両
方に関連した多くの因子によって影響を受ける。例えば、小分子は、他よりも免
疫原性が低い傾向があり、担体及びアジュバントの使用を必要とするかもしれな
い。また、宿主動物は、接種部位及び用量に反応して変化し、不適切又は過剰の
抗原量は低力価の抗血清をもたらす。複数の皮内部位に投与された少量（ngレベ
ル）の抗原が最も信頼できる。ウサギのための効果的な免疫プロトコルは、バイ
ツカイティス（Vaitukaitis）ら（1971）に見出される。
【００９６】 一定の間隔で追加注射を与え、例えば既知の濃度の抗原に対する寒天内二重免
疫拡散により半定量的に決定される抗体力価が減少し始めたとき、抗血清は回収
されうる。例えば、オクタロニー（Ouchterlony）ら（1973）を参照のこと。抗
体のプラトー濃度は、通常、血清（約12μMで）0.1から0.2mg/mlまでの範囲であ
る。抗血清の抗原に対する親和性は、例えばフィッシャー（Fisher）(1980)によ
り記載されているような、競合結合曲線を作製することにより決定される。
【００９７】 SRCタンパク質に対する抗体を作製するための第三の手段は、SRCのタンパク質
構成要素の推定アミノ酸配列に基づき、市販のペプチド合成機で合成された合成
ペプチドを使用することである。
【００９８】 実施例12 ゲルダナマイシンのアナログ及び誘導体 「ゲルダナマイシン誘導体」という用語は、神経突起伸展を刺激する能力にお
いてゲルダナマイシンと構造的に類似している化合物をさす。ゲルダナマイシン
は、平面ベンゾキノンが埋め込まれた、閉環したアンサ環からなる。
【化１４】
【００９９】 アンサ環は、その骨格に平面アミド及び3個の炭素-炭素二重結合（それらのう
ちの2個は1,3-ジエンで配置している）が含まれており、その16個の骨格原子の
うちの9個が1個のカルボニル基、1個のカルバメート基（-OC(O)NH２）、1個の水
酸基、2個のメトキシ基、及び4個のメチル基のような非水素置換体を保有してい
るため、立体障害を受けている。ゲルダナマイシンの結晶構造は公開されており
、ベンゾキノンアンサマイシンの構造/活性相関はステビンス（Stebbins）ら（C
ell 89:239-250,1997）、シュナー（Schnur）ら（J.Med.Chem.38:3813-3820,199
5）、及びシュナー（Schnur）ら（J.Med.Chem.38:3806-3812,1995）に記載され
ている。ゲルダナマイシン誘導体は、ゲルダナマイシンのカルバメート基及びア
ンサ環を有していてもよく（Schurら,J.Med.Chem.38:3806-3812,1995）、ならび
に/又は官能基にC23メトキシ基及びC22メチル基のような修飾を有していてもよ
い（Stebbinsら,Cell 89:239-250,1997）。ゲルダナマイシン誘導体は、米国特
許第5,3877,584号、第4,261,989号、及び第3,987,035号、並びに日本特許出願第
88041885号、第56100766号、及び第89002593号などにも論じられている。
【０１００】 ゲルダナマイシンの構造的アナログであるいくつかのベンゾキノンアンサマイ
シンの構造を表2に公開する。
【０１０１】
【表２】 ゲルダナマイシンのいくつかの構造的アナログ
【０１０２】 ゲルダナマイシンのさらなるベンゾキノンアンサマイシンアナログを表3及び4
に示す。表3は、ゲルダナマイシン誘導体のいくつかの合成スキームを例示して
おり、表4は、シュナー（Schnur）ら（J.Med.Chem.38:3813-3820,1995）に、よ
り完全に記載されている、誘導体のための置換を公開している。
【０１０３】
【表３】 アンサ環修飾によるゲルダナマイシン誘導体の合成スキーム スキーム1 スキーム2
【０１０４】
【表４】 表3に示された化合物のための置換
【０１０５】
【表５】 アミノゲルダナマイシン誘導体のいくつかの合成スキーム（スキーム
1）及びキノン修飾を有するゲルダナマイシン（スキーム2） スキーム1 スキーム2 ゲルダナマイシンのキノン修飾
【０１０６】 表5の誘導体のためのいくつかの置換パターンを表6に示す。
【０１０７】
【表６】 表5に示された化合物のためのいくつかの置換
【０１０８】 アナログはまた、以下の目的のために、周知の方法により、適当な官能基を付
加することによって修飾されうる：特定の細胞画分（例えば、血液、リンパ系、
中枢神経系など）へのアナログの浸透の増加を含めた選択された生物学的特性を
増強するため、経口利用可能性を増加させるため、可溶性を増加させて注射によ
る投与を可能にするため、代謝を変化させるため、及び排出の速度を変化させる
ため。
【０１０９】 いくつかの特定の態様において、アナログは約750原子量単位（a.m.u.）未満
の分子量を有する（親化合物としての量であり、そのような化合物の塩は、より
高い分子量を有していてもよい）。
【０１１０】 実施例13 FK506及びラパマイシンのアナログ 「FK506アナログ」という語は、神経突起伸展を刺激する能力においてFK506に
構造的に類似している化合物をさす。V-10,367のようないくつかのFK506アナロ
グは、FKBP12結合ドメインを保持しているが、カルシニューリンと相互作用する
エフェクタードメインの構造成分を欠いている。FK506アナログは、低い又は高
い親和性でFKBP12に結合しうる。例えば、V-10,367は、高親和性（Kｄ＜1nM）で
FKBP12に結合する（Armisteadら,Acta.Crystallogr.51:522-528,1995）。
【０１１１】 FK506と構造的に関連しており、かつFKBP12を阻害し、それにより免疫抑制を
引き起こすFK506の能力を有する化合物を設計するため、多大な努力がなされて
いる。例えば、ビーラー（Bierer）ら（Science 250;556-559,1990）、バンデュ
イン（Van Duyne）ら（Science 252:839-842,1991）、バンデュイン（Van Duyne
）ら（J.Mol.Biol.229:105-124,1993）、ハウスケ（Hauske）ら（J.Med.Chem.35
:4284-4296,1992）、ホルト（Holt）ら（J.Am.Chem.Soc.115:9925-9938、 1993）
、ホルト（Holt）ら（Bioorg.Med.Chem.Lett.3:1977-1980,1993）、ティーグ（T
eague）及びストックス（Stocks）（Bioorg.Med.Chem.Lett.3:1947-1950,1993）
、ワング（Wang）ら（Bioorg.Med.Chem.Lett.4:1161-1166,1994）、ヤマシタ（Y
amashita）ら（Bioorg.Med.Chem.Lett.4:325-328,1994）、ストックス（Stocks
）（Bioorg.Med.Chem.Lett.4:1457-1460,1994）、ゴウレット（Goulet）ら（Per
spect.Drug Disc.Design 2:145-162,1994）、ウィルソン（Wilson）ら（Acta Cr
yst.D51:511-521,1995）、アーミステッド（Armistead）ら（Acta Cryst.D51:52
2-528,1995）、米国特許第5,192,773号、第5,330,993号、第5,516,797号、第5,6
12,350号、第5,614,547号、第5,622,970号、第5,654,332号、並びに公開された
国際特許出願第92/00278号、第92/04370号、第92/19593号、第92/21313号、第94
/07858号、及び第96/40633号を参照のこと。これらの参照は、FK506、及びカル
シニューリンを阻害するエフェクタードメイン（括弧内に示されている）を欠い
ているV-10,367のようなその既知のアナログのうちのいくつかの構造を公開して
いる。「公知の」又は「認識された」化合物とは、先行技法として認可される特
許又は文献において従来報告されている（FK506アナログのような）化合物であ
る。
【化１５】
【化１６】
【０１１２】 FK506アナログは、FKBP-12に対する広範囲の結合親和性を有している。本明細
書において提示されたFK506の神経栄養活性の機構より、神経細胞成長の刺激に
おけるFK506及びFK506アナログの有効性はFKBP-12結合能とは関連がないことが
示唆された。それよりむしろ、神経細胞成長の刺激におけるそれらの有効性は、
そのような化合物が、例えばステロイド受容体複合体におけるFKBP-52とhsp-90
との相互作用を妨害することにより、又は複合体からのp23の解離を促進するこ
とにより、物理的又は機能的にステロイド受容体複合体を破壊する能力に関連し
ている。
【０１１３】 「非結合性FK506アナログ」とは、FKBP-12と実質的に結合しないFK506アナロ
グと定義される。低いFKBP-12結合親和性を有するFK506アナログとは、10μMよ
り大きい、好ましくは30μMより大きい、より好ましくは100μMより大きい、周
知のアッセイ法を用いて測定される見かけKｄでFKBP-12と結合するアナログをさ
す。見かけKｄは、例えば、ハーディング（Harding）ら（Nature 341:758-760,1
989）（レポーティングリガンドとして32-[1-１４C]-ベンゾイルFK506を使用）
、シエキエルカ（Siekierka）ら（Nature 341:755-757,1989）（レポーティング
リガンドとして[３H]ジヒドロ-FK506を使用）、及び米国特許第5,654,332号の記
載のようにして実行される、競合LH-20結合アッセイ法により決定されうる。
【０１１４】 代替的に、又はさらに、アナログは約0.01から約100mg/kg体重/日の用量レベ
ルで患者に投与された場合、FKBP-12ロータマーゼ活性を実質的に阻害しないも
のであってもよい。FKBP-12ロータマーゼ活性の阻害のアッセイ法は実施例9に記
載されている。
【０１１５】 非結合性FK506アナログは、例えば米国特許第5,516,797号、国際公開公報第92
/21313号、第92/19593号、及び第92/04370号に論じられているような、周知のア
ッセイ法により証明されうるように、非免疫抑制性である。
【０１１６】 「ラパマイシンアナログ」には、ラパマイシンに構造的に類似している化合物
、例えばオケイン（Ocain）ら（Biochem.Biophys.Res.Commun.192-1340-1346,19
93）に示されているようなWAY-124,466が含まれる。このアナログは、トリエン
領域が修飾されている以外はラパマイシンと同一であり、該参照に示されている
方法により決定される、12.5nMのPPIase活性に対するKiを有する。このアナログ
はまた、非免疫抑制性であることが、マウス胸腺細胞の増殖を阻害する能力がな
いことにより該参照において決定された。他のラパマイシンアナログには、他の
大環状トリエン、31位及び42位がエステル化されたモノアシル化誘導体及びジア
シル化誘導体（米国特許第4,313,885号）、並びにラパマイシンの水溶性プロド
ラッグ（米国特許第4,650,803号）、1位、3位、もしくは5位の二重結合のうちの
1個、2個、もしくは3個が対応するアルカンに還元されている水素化誘導体、又
は薬学的に許容されるそれらの塩（米国特許第5,023,262号）、（42位の基のよ
うな）水酸基が対応するケトンに酸化されている酸化誘導体（例えば、米国特許
第5,023,263号に記載されている42-オキソラパマイシン又は薬学的に許容される
塩）、7,29-ビスデスメチルラパマイシン（米国特許第5,093,338号）、並びに逆
アルドール反応による塩基分解によりC-31炭素とC-32炭素との間が切断されたラ
パマイシン（米国特許第5,138,051号）が含まれる。
【０１１７】 実施例14 ラジシコールおよびそのアナログ 「ラジシコールアナログ」とは、ラジシコールと構造的に類似した化合物、例
えば、米国特許第5,731,343号、米国特許第5,650,430号、米国特許第4,228,079
号、国際公開公報第96/33989号および国際公開公報第98/18780号に示される化合
物を指し、これら全てが参照として本明細書中に組み入れられる。このような化
合物の特定の例は、以下の構造式：
【化１７】 において示され、式中、R1、R2、およびR3は、H、C1-C8アルキルまたはCOR5から
なる群より別々に選択され、R5は、水素、置換アルキル、アルコキシ、アルケニ
ル、置換アルケニル、アルケニルオキシ、アルキニル、置換アルキニル、6個〜1
4個の環原子を有するアリール、6個〜14個の環原子を有するアリールオキシ、5
個または6個の環原子を有する複素環式基、アリール基に融合された5個または6
個の環原子を有する複素環式基、シクロアルキル、シクロアルケニル、およびア
リール基に融合されたシクロアルキルからなる群より選択される。COR5の特定の
例を表7に示す。表7に示す任意の基を、R1、R2、およびR3として使用することが
できる。Xはハロゲンである。Yは、OおよびN-O-R4からなる群より選択され、式
中、R4は、水素およびC1-8アルキルからなる群より選択される。Zはハロゲンで
ある。または、ZはR3と結合して、エポキシド環を形成することができる。
【０１１８】
【表７】
【０１１９】実施例15 バスタジンおよびそのアナログ 「バスタジン」とは、現在知られているか、または将来発見される任意のバス
タジンを指す。バスタジンファミリー由来の化合物とは、ハロゲン化チロシンな
どのバスタジンサブユニットを指し、ブロモチロシンおよびシュウ酸アミドの3-
ブロモチラミンアミド（3-bromotyramine amide）を含む。バスタジンはまた、
ブロモチロシン2量体を意味するヘミバスタジンを含む。ヘミバスタジンは、ヘ
ミバスタジン1、ヘミバスタジン2、およびヘミバスタジン3、ならびにヘミバス
タジノール1、ヘミバスタジノール2、およびヘミバスタジノール3を含む。
【０１２０】 神経突起伸展を改善するための本発明の方法は、（他の神経栄養化合物を探す
アッセイ法における使用を含む）本発明の任意の局面において、任意のバスタジ
ンもしくはバスタジンファミリーの任意のメンバーまたはそのアナログを使用す
ることを含む。
【０１２１】 バスタジンおよびバスタジンファミリーのその他のメンバーの特定の例には、
参照として本明細書中に組み入れられている、ペティット（Pettit）ら、J.Nat.
Prod.,59（10）:927-34,1996;フランクリン（Franklin）ら,J.Nat.Prod.,59（12
）:1121-7,1996;ペティット（Pettit）ら,J.Nat.Prod.,58（5）:680-8,1995;マ
ック（Mack）ら,J.Biol.Chem.,269（37）:23236-49,1994;グラビタ（Gulavita）
ら,J.Nat.Prod.,56（9）:1613-7,1993;カルネイ（Carney）およびシューアー（S
cheuer）,J.Nat.Prod.,56（1）153-7,1993;ならびにミアオ（Miao）およびアン
ダーセン（Andersen）,J.Nat.Prod.,53（6）,1990に示されるものが含まれる。
【０１２２】 バスタジンおよびそのアナログの特定の例には、いくつかの特定のバスタジン
およびバスタジンアナログの同一性および置換パターンが以下の表8に示されて
いる、下記式のバスタジンが含まれる。
【化１８】
【０１２３】
【表８】 いくつかのバスタジンおよびバスタジンアナログの置換パターン
【０１２４】 その他のバスタジンの特定の例には、いくつかの特定のバスタジンおよびバス
タジンアナログの同一性および置換パターンが以下の表9に示されている、以下
の構造の化合物が含まれる。
【化１９】
【０１２５】
【表９】 いくつかのバスタジンおよびバスタジンアナログの置換パターン
【０１２６】 バスタジン化合物の例には、以下の構造を有するバスタジン13および34-スル
ファトバスタジン13が含まれ、式中、それぞれ、R＝H、かつR＝SO3Naである。
【化２０】
【０１２７】 開環構造をもつバスタジンの特定の例が存在し、これらには以下の構造を有す
るバスタジン1およびバスタジン2が含まれ、式中、それぞれ、X＝H、かつX＝Br
である。
【化２１】
【０１２８】 バスタジン3および10-スルファトバスタジン3もまた開環構造を有する。これ
らは以下の構造式を有し、式中、バスタジンについてはR＝Hであり、かつ10-ス
ルファトバスタジン3についてはR＝SO3Naである。
【化２２】
【０１２９】 バスタジンファミリー内の化合物の別の例は、以下の構造を有するシュウ酸ア
ミドの3-ブロモチラミンアミドであり、式中、Rは、例えば、HまたはCOCH3であ
り得る。
【化２３】
【０１３０】 バスタジンにはまた、ヘミバスタジンも含まれ、そのいくつかが以下の構造で
説明されうる。同一性および置換パターンを表10で定義する。
【化２４】
【０１３１】
【表１０】 ヘミバスタジンおよびそのアナログの置換パターン
【０１３２】 バスタジンにはまた、ヘミバスタジノールも含まれ、そのいくつかが以下の構
造を有する。いくつかの例の同一性および置換パターンが、以下の表11に提供さ
れる。
【化２５】
【０１３３】
【表１１】 ヘミバスタジノールおよびそのアナログの置換パターン
【０１３４】実施例16 ラジシコールの神経突起伸展に及ぼす影響 実施例2に記載されたインビトロアッセイ法を用いて、神経突起伸展に及ぼす
ラジシコールの影響を調べた。海馬細胞を、0.1ng/mL及び10ng/mLの濃度のラジ
シコールで処理した。ラジシコール処理細胞の神経突起伸展を、非処理細胞及び
10ng/mLのNGFで処理した細胞の成長と比較した。結果を図3に示す。ヒストグラ
ムの右へのシフトは神経突起伸展の刺激が増大したことを示し、NGFのみよりも
、（両方の濃度における）ラジシコールのみが、成長刺激により効果的であるこ
とが分かる。
【０１３５】実施例17 熱が神経突起伸展に及ぼす影響 実施例2に記載のインビトロアッセイ法を用いて、熱のみ、または様々な化合
物との組み合わせが、神経突起伸展に及ぼす影響を調べた。図4は、熱処理のみ
またはNGF処理のみより、熱処理とNGF処理との組み合わせが、被験海馬細胞の神
経突起伸展刺激により効果的でことを示している。図5は、Hsp-90抗体と組み合
わせて投与した場合よりNGFと組み合わせて投与した場合に、熱処理がより効果
的であることを示している。図5はまた、熱処理とNGFおよびHsp-90抗体による処
理との組み合わせが、熱処理とNGF処理の組み合わせほど効果的でないことを示
している。Hsp-90抗体が神経突起伸展の増大を阻害できることにより、熱ショッ
クのメディエーターとしてのHsp-90の関与が示される。
【０１３６】実施例18 MAPキナーゼ/キナーゼの役割 実施例2に記載のインビトロアッセイ法を用いて、MAPキナーゼ/キナーゼの役
割を調べた。NGF、FK506、およびラジシコールと組み合わせたMAPキナーゼ/キナ
ーゼ阻害剤PD 098059を用いて海馬細胞を処理し、これらの各化合物の作用にMAP
キナーゼ経路の下流が関与しているかどうかを決定した。図6では、選択性MAPキ
ナーゼ/キナーゼ（MEK）阻害剤は、濃度依存的にNGFおよびFK-506による神経突
起伸展を阻害することが示された。図7は、PD 098059がまた濃度依存的にラジシ
コールの作用も阻害し、最高濃度がほぼ完全に活性を阻害することを示している
。
【０１３７】実施例19 バスタジンが神経突起伸展に及ぼす影響 実施例2に記載のインビトロアッセイ法を用いて、海馬細胞をバスタジン10ア
ナログで処理した影響を、海馬細胞をラジシコールで処理した影響と比較した。
図9Aは、非処理海馬細胞の72時間後の光学顕微鏡写真である。別の光学顕微鏡写
真である図9Bは、ラジシコールが神経突起伸展に及ぼす影響を示し、図9Cは、バ
スタジン10アナログ（Davis B-10，バスタジン）が神経突起伸展に及ぼす影響を
示す。非処理細胞、ラジシコール処理細胞、およびバスタジン10アナログ処理細
胞の神経突起伸展の長さの定量測定値を図10に示す。総合すると、図9および図1
0は、バスタジンが神経突起伸展を刺激できることを示している。
【０１３８】実施例20 使用法 本発明の神経栄養化合物は、対照と比較して神経成長又は神経再生を刺激する
ために十分な有効量で投与される。神経細胞成長又は神経再生にとって適当な局
所濃度は、インビトロアッセイ法、例えば実施例1に記載のアッセイ法を用いて
容易に調べることができる。又は、神経細胞成長又は再生は、インビボアッセイ
法により、又は被験者における神経細胞成長及び再生の直接的もしくは間接的な
徴候（例えば、過去に離断された正中神経の神経支配域における手の運動及び/
もしくは感覚機能の回復）により、決定できる。好ましくは、神経細胞成長又は
再生速度の増加は、対照と比較して少なくとも10％、好ましくは少なくとも30％
、最も好ましくは50％又はそれ以上である。皮下輸送の場合、FK506アナログの
好ましい用量レベルは、1日当たり約0.1から約400mg/kgの間である。経口投与の
場合、用量レベルの例は、約0.01から約40mg/kg/日の間である。又は、用量はイ
ンビトロで神経栄養性であることが示された組織濃度に達するために十分なもの
でありうる。
【０１３９】 本発明に係る薬学的組成物は、神経再生及び機能回復を促進し、神経突起伸展
を刺激し、それにより、様々な神経病理学的状態を治療するため、そのような治
療を必要とする哺乳動物被験者（例えば、ヒト患者）に定期的に投与することが
できる。神経病理学的状態とは、以下の疾患を含む：物理的損傷（例えば、脊髄
の損傷及び外傷、座骨神経又は顔面神経の病変又は損傷、切断後の肢移植）、疾
患（例えば、糖尿病性ニューロパシー）、癌化学療法（例えば、アクリルアミド
、タキソール、ビンカアルカロイド、及びドキソルビシンにより誘導されるニュ
ーロパシー）、発作及び虚血に関連した脳損傷、並びに神経学的疾患（これらに
限定されないが、様々な末梢ニューロパシー疾患及び神経変性に関連した神経学
的疾患（これらに限定されないが、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋
無力症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、進行性筋萎縮、進行性延髄遺
伝性筋萎縮、ヘルニア性、破裂性、もしくは脱出性の脊髄椎間板症候群、頸椎症
、神経叢障害、胸郭出口破壊症候群、鉛、アクリルアミド、ガンマ-ジケトン（
グルースニファーニューロパシー）、二硫化炭素、ダプソン、ダニ、ポルフィリ
ン症、ギヤンバレー症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、及びハンティ
ングトン舞踏病により引き起こされる末梢ニューロパシーを含む）を含む）によ
り引き起こされる、末梢神経及び中枢神経系に対する傷害。
【０１４０】 さらに、本発明に係る薬学的組成物は、発作（例えば、Sharkey及びButcher,N
ature 371:336-339,1994,Vagitaら,Life Sciences 59:1643-1650,1996;Tokimeら
,Neurosci.Lett.206:81-84,1996;Drakeら,Acta.Physiol.Scand.158:155-159,199
6;及びKurodaら,Neurosci.Res.Comm.19:83-90,1996を参照のこと）、エイズ痴呆
（例えば、Dawson及びDawson,Adv.Neuroimmunol.4:167-173,1994;及びSekigawa
ら,J.Clin.Immunol.15:312-317,1995を参照のこと）、育毛（Yamamotoら,J.Inve
stig.Dermatol.102:160-164,1994;Jiangら, J.Investig.Dermatol.104:523-525,
1995）、及び結合組織疾患（例えば、Steinmannら,J.Biol.Chem.266:1299-1303,
1991を参照のこと）の治療を含み、ならびに男性避妊薬（例えば、Hisatomiら,T
oxicology 109:75-83,1996を参照のこと）としての広範囲の他の治療的又は予防
的な特性を示す。
【０１４１】 末梢神経の離断又は脊髄損傷は、神経成長を刺激する量の薬剤を哺乳動物に投
与すること、及び末梢神経又は脊髄に同種異系移植片（Osawaら,J.Neurocytol.1
9:833-849,1990;Buttemeyerら,Ann.Plastic Surgery 35:396-401,1995）又は人
工神経移植片（Madison及びArchibald,Exp.Neurol.128:266-275,1994;Wellsら,E
xp.Neurol.146:395-402,1997）のような神経移植片を移植することにより治療さ
れうる。末梢神経又は脊髄の離断された末端の間の空間は、好ましくは、コラー
ゲン、メチルセルロースなどのような非細胞性間隙充填材料、又はスワン細胞（
Xuら,J.Neurocytol.26:1-16,1997）、嗅細胞、及び鞘細胞（Liら,Science 277:2
000-2002,1997）のような神経細胞成長を促進する細胞懸濁液で充填される。神
経成長促進剤は、そのような細胞性もしくは非細胞性の間隙充填材料と共に含ま
れてもよいし、又は神経移植操作の前、間、もしくは後に全身投与されてもよい
。
【０１４２】実施例21 薬学的製剤 本発明に係る薬学的製剤は、ある量（例えば、単位用量）の神経栄養剤を、担
体、希釈剤、及び/又は補助剤を含む一つ又は複数の非毒性の薬学的に許容され
る賦形剤と、場合により生物学的活性を有する他の成分と共に含む処方を包含す
る。レミントンの製剤学（Remington's Pharmaceutical Sciences）（Mack Publ
ishing Co.,Easton,PA（第19版））に開示されている技法のような標準的な薬学
的処方技法が用いられる。
【０１４３】 本発明に係る薬学的製剤は、一つ又は複数の本発明の神経栄養剤を含み、例え
ばFK506又はFKBP-12結合性FK506アナログ、NGF、IGF-1、α-FGF、β-FGF、PDGF
、BDNF、CNTF、GDNF、NT-3、及びNT4/5のような生物学的活性を有する一つ又は
複数の他の成分も含んでいてもよい。本発明のSRC破壊剤を第二の神経栄養剤と
組み合わせる場合、2つの薬剤は、理想的には異なるSRC構成要素に作用すること
によりSRCを構造的又は機能的に破壊するものとなるよう選択される。例えば、
第一薬剤は（p23の解離を促進する）ゲルダナマイシンであってよく、第二薬剤
は（FKBP-52とhsp-90との会合を妨害する）FKBP52-Abであってよい。特定の態様
において、組成物は、NGF、又はSRC破壊複合体と組み合わせられて神経成長を刺
激するか、もしくはSRC破壊剤との組み合わせ投与により増強される神経栄養作
用を有する、他の薬剤を含む。
【０１４４】 組み合わせられた生物学的活性を有する薬剤の用量は、インビボで神経再生を
行うことが示された濃度と類似した、作用部位における組織濃度を達成するため
に十分な用量である。薬学的処方は、例えば、被験者が約0.01から100μg/kg体
重/日の間の用量を受容するような量のNGFを含みうる。NGF（又は他の補助剤）
は、別々に、同時に、連続的に、又は互いに約5時間未満以内に投与されうる。
【０１４５】 組成物は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、ロゼンジ、または経口、局所、もし
くは非経口用の溶液もしくは懸濁液のような液体又はゲルの調製物（例えば、眼
もしくは耳用滴剤、咽頭もしくは鼻用スプレーなど）、経皮貼付剤、並びに当技
術分野において既知の他の形態でありうる。
【０１４６】 そのような薬学的組成物は、特定の状態の治療にとって適当な任意の方式で、
例えば経口により、非経口により、直腸に、鼻腔内に、頬に、膣内に、局所に、
眼に、吸入スプレーにより、又は埋め込み型レザバーを介して、全身又は局所に
投与される。本明細書において用いられるように「非経口的に」という用語は、
例えば注射又は点滴による、皮下投与、静脈投与、筋肉内投与、胸骨内投与、滑
液内投与、包膜内投与、肝臓内投与、病巣内投与、及び頭蓋内投与を含むが、こ
れらに限定されない。中枢神経系の治療には、薬学的組成物は、好ましくは、末
梢に投与された場合血液脳関門を容易に透過するものであるか、又は脳室内に投
与される。
【０１４７】 薬学的に許容される担体には、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミ
ニウム、レシチン、（ヒト血清アルブミンのような）血清タンパク質、（リン酸
塩のような）緩衝剤、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性
脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、硫酸プロタミンのような塩もしくは電解質
、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コ
ロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースを
基本とした物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリ
ウム、ポリアクリレート、ロウ、ポリエチレン-ポリオキシプロピレン-ブロック
重合体、ポリエチレングリコール、及び羊毛脂が含まれるが、これらに限定され
ない。
【０１４８】 経口投与用の錠剤及びカプセルは、単位用量提示に適した形態であってよく、
通常の薬学的に許容される賦形剤を含みうる。これらの例には、シロップ、アラ
ビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントゴム、及びポリビニルピロリ
ドン；ラクトース、糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトール、又
はグリシンのような充填剤；ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレン
グリコール、又はシリカのような打錠用滑沢剤；ジャガイモデンプンのような崩
壊剤；並びにラウリル硫酸ナトリウムのような分散剤又は湿潤剤が含まれる。経
口用液体調製物は、例えば水性もしくは油性の懸濁液、溶液、乳液、シロップ、
もしくはエリキシルの形態であってもよく、又は使用前に水もしくは他の適当な
媒体で再生するための乾燥生成物として提示されてもよい。
【０１４９】 薬学的組成物は、無菌の水性又は油性の媒体に含まれて非経口投与されてもよ
い。組成物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒に、例えば1,3-ブ
タンジオール溶液として溶解又は懸濁されうる。一般的に用いられる媒体及び溶
媒には、水、生理食塩水、ハンクス液、リンゲル溶液、及び合成のモノグリセリ
ドもしくはジグリセリドを含む無菌固定油などが含まれる。局所適用の場合、薬
物は、適当な水性又は非水性の媒体中の溶液、懸濁液、クリーム、ローション、
又は軟膏へと製造される。例えば、メタバイスファイトナトリウム又はエデン酸
ニナトリウムのような緩衝液、酢酸フェニル水銀もしくは硝酸フェニル水銀、塩
化ベンザルコニウム、又はクロルヘキシジンを含む殺菌剤及び殺真菌剤のような
保存剤、ヒプロメロース（hypromellose）のような濃化剤などの添加剤が含まれ
ていてもよい。
【０１５０】 含まれる用量単位は、例えば、治療を受ける状態、処方の性質、状態の性質、
請求の範囲に記載された薬学的組成物の態様、投与の方式、並びに患者の状態及
び体重により変化する。用量レベルは、典型的には、インビトロで神経栄養性で
あることが示された濃度と少なくとも同一の、作用部位における組織濃度を達成
するために十分なものである。例えば、1日当たり約0.1から約400mg/kgの用量の
活性成分が、前記の状態の治療において有用でありうる。
【０１５１】 化合物は、好ましくは、これらに限定されないが、酢酸塩、アジピン酸塩、ア
ルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩
、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウ硫酸塩、シクロペンタンプ
ロピオン酸塩、二グルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル
酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘ
キサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、2-ヒドロキシエタンスル
ホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン
酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモエート（pamoate）、ペクチン酸塩、過
硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸
塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシラート、及びウンデカン酸塩
を含む、無機又は有機の酸及び塩基に由来する塩の形態で用いられうる。塩基性
塩には、アンモニウム塩、（ナトリウム塩及びカリウム塩のような）アルカリ金
属塩、（カルシウム塩及びマグネシウム塩のような）アルカリ土類金属塩、（ジ
シクロヘキシルアミン塩のような）有機塩基を有する塩、N-メチル-D-グルカミ
ン、及び（アルギニン、リジンなどのような）アミノ酸を有する塩が含まれるが
、これらに限定されない。塩基性窒素含有基は、例えば（メチル、エチル、プロ
ピル、及びブチルの塩化物、臭化物、及びヨウ化物のような）C1-8ハロゲン化ア
ルキル、（硫酸ジメチル、硫酸ジエチル、硫酸ジブチル、硫酸ジアミルのような
）硫酸ジアルキル、（デシル、ラウリル、ミリスチル、及びステアリルの塩化物
、臭化物、及びヨウ化物のような）長鎖ハロゲン化物、（臭化ベンジル及び臭化
フェネチルのような）アラルキルハロゲン化物などの薬剤により第四級化されう
る。それにより水溶性又は油溶性又は分散可能な生成物が生成する。
【０１５２】 薬学的組成物は、目的とする使用のための指示、例えば米国の食品医薬品局の
ような薬学的規制機関により要求される指示が添付されたキットに含まれうる。
【０１５３】 要約 前述の実施例は、ニューロイムノフィリンリガンド（FK506）及びステロイド
ホルモンの神経栄養特性が、ステロイド受容体複合体の物理的又は機能的な破壊
により媒介されることを例示するものである。破壊の標的として作用しうる複合
体の構成要素のいくつかには、いずれもゲルダナマイシンにより破壊されうる成
熟ステロイド受容体複合体中に共に存在する、FKBP-52、hsp-90、及びp23が含ま
れる。FKBP-52は微小管及びダイニンと会合し、そのTPRモチーフを介してキネシ
ンとも会合しうるため、細胞骨格要素の移動（軸索輸送）において、そしてその
結果軸索伸長においても直接的な役割を果たしているかもしれない。
【０１５４】 本発明者らの発明の原理が適用されうる多くの潜在的な態様を考慮して、例示
された態様は、本発明の単なる例であることが認識されるべきであり、本発明の
範囲を制限するものと見なされるべきではない。そうではなく、本発明の範囲は
、以下の特許請求の範囲及びそれらの等価物により定義される。従って、本発明
者らは、本発明者らの発明として、その等価物を含む、これらの特許請求の範囲
及び精神に含まれる全てのものを請求する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ステロイド受容体複合体の受容体-hsp-90ヘテロ複合体集合を示
す模式図である。
【図２】 成熟ステロイド受容体複合体および、神経成長を促進する本発明
のいくつかの薬剤の結合部位を示す模式図である。
【図３】 非処理海馬細胞および示された濃度のNGFまたはラジシコールの
どちらかで処理した海馬細胞の、72時間後の神経突起伸展の長さを示す累積ヒス
トグラムである。
【図４】 非処理海馬細胞および、熱、NGF、または熱とNGFの組み合わせに
より処理した海馬細胞の、72時間後の神経突起伸展の長さを示す累積ヒストグラ
ムである。
【図５】 非処理海馬細胞、ならびに、NGF、熱とNGFの組み合わせ、熱とHs
p-90抗体（Ab）の組み合わせ、および熱とNGFとHsp-90抗体の組み合わせにより
処理した海馬細胞の、72時間後の神経突起伸展の長さを示す累積ヒストグラムで
ある。
【図６】 非処理海馬細胞、ならびに、NGF、FK506、NGFとMAPキナーゼ/キ
ナーゼ阻害剤PD 098059（二種類の濃度）の組み合わせ、およびFK506とPD 09805
9（二種類の濃度）の組み合わせにより処理した海馬細胞の、72時間後の神経突
起の平均長を示すヒストグラムである。
【図７】 非処理海馬細胞ならびにNGF、およびラジシコール（二種類の濃
度）とPD 098059（二種類の濃度）の様々な組み合わせにより処理した海馬細胞
の、72時間後の神経突起の平均長を示すヒストグラムである。
【図８】 NGF、ラジシコール、およびラジシコールとMAPキナーゼ/キナー
ゼ阻害剤PD 098059との二種類の組み合わせにより処理した海馬細胞の、72時間
後の神経突起伸展の長さを示す累積ヒストグラムである。
【図９Ａ及び図９Ｂ及び図９Ｃ】 非処理細胞、ラジシコールで処理した細
胞、及びバスタジン10アナログで処理した細胞に関する、72時間後海馬細胞を示
す光学顕微鏡写真である。
【図１０】 非処理、およびラジシコールまたはバスタジン10アナログのい
ずれかで処理した、72時間後の海馬細胞の神経突起伸展の長さの累積ヒストグラ
ムである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 FB03 4C084 AA02 AA19 DB55 DB59 MA02 MA52 MA55 NA05 NA10 ZA011 ZB211 ZC781 4C086 AA01 AA02 BA01 BC33 BC76 MA03 MA52 MA55 NA05 NA10 ZA01 ZB21 ZC78 4C206 AA01 AA02 GA28 KA01 MA03 MA72 MA75 NA05 NA10 ZA01 ZB21 ZC78 【要約の続き】 取り囲んで）神経再生が望ましい、該解剖学的経路を規 定する管状部材などのテンプレートと共に、使用するこ とができる。

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 被験者における神経細胞成長を刺激する方法であり、以下の
    段階を含む方法： ラジシコール（radicicol）およびそのアナログ； バスタジン（bastadin）およびそのアナログ； MAPキナーゼ/キナーゼ活性を刺激する薬剤；ならびに その混合物 からなる群より選択される、神経細胞成長を刺激する有効量の薬剤を被験者に投
    与する段階。
  2. 【請求項２】 薬剤がラジシコールアナログである、請求項1記載の方法。
  3. 【請求項３】 薬剤が、バスタジン1、バスタジン2、バスタジン3、バスタ
    ジン4、バスタジン5、バスタジン6、バスタジン7、バスタジン8、バスタジン9、
    バスタジン10、バスタジン11、バスタジン12、バスタジン13、バスタジン14、バ
    スタジン15、バスタジン16、バスタジン17、バスタジン18、バスタジン19、また
    はバスタジン20である、請求項1記載の方法。
  4. 【請求項４】 薬剤がバスタジン10である、請求項3記載の方法。
  5. 【請求項５】 薬剤がバスタジンのアナログである、請求項3記載の方法。
  6. 【請求項６】 化合物を投与する段階が、ラジシコールもしくはそのアナロ
    グ、またはバスタジンもしくはそのアナログを投与する段階を含み、かつ、化合
    物が、ステロイド受容体複合体の会合を阻害するか、ステロイド受容体複合体の
    解離を促進するか、もしくはステロイド受容体複合体の機能を妨げるか、または
    、MAPキナーゼ/キナーゼ活性を刺激する、請求項1記載の方法。
  7. 【請求項７】 投与する段階が、成熟ステロイド受容体複合体の会合を破壊
    またはMAPキナーゼ/キナーゼ活性を刺激する化合物以外の神経栄養因子を投与す
    る段階を含む、請求項1記載の方法。
  8. 【請求項８】 成熟ステロイド受容体の会合を破壊またはMAPキナーゼ/キナ
    ーゼ活性を刺激する化合物以外の神経栄養因子を投与する段階が、NGF、IGF-1、
    α-FGF、β-FGF、PDGF、BDNF、CNTF、GDNF、NT-3、NT4/5、およびその混合物か
    らなる群より選択される神経栄養因子を投与する段階を含む、請求項7記載の方
    法。
  9. 【請求項９】 MAPキナーゼ/キナーゼ活性を刺激する薬剤を検出する段階を
    含む、神経細胞成長を刺激する薬剤をスクリーニングする方法。
  10. 【請求項１０】 ラジシコールおよび血小板由来増殖因子BB（PDGFBB）また
    はそのアナログからなる群より選択される化合物をスクリーニングする段階を含
    む、請求項9記載の方法。
  11. 【請求項１１】 神経細胞成長が望ましい部位に、十分量の熱を加える段階
    をさらに含む、請求項1記載の方法。
  12. 【請求項１２】 神経細胞成長が望ましい部位にテンプレート（template）
    を提供する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
  13. 【請求項１３】 テンプレートが解剖学的経路を規定する管状部材であり、
    かつ該解剖学的経路に沿った神経成長が望ましい、請求項12記載の方法。
  14. 【請求項１４】 治療有効量の請求項1記載の化合物を、神経成長を促進す
    るテンプレートと共に提供する段階をさらに含む、請求項12記載の方法。
  15. 【請求項１５】 テンプレートが、離断した（transected）神経または部分
    的に離断した神経の両端の間に配置される、請求項12記載の方法。
  16. 【請求項１６】 テンプレートに、神経成長を促進するのに有効な、治療上
    十分量の熱を加える段階をさらに含む、請求項12記載の方法。
  17. 【請求項１７】 二つのテンプレート間に請求項1記載の化合物が注入され
    ている、所望の解剖学的経路に沿って神経成長を促進するためのテンプレート。
  18. 【請求項１８】 薬剤が下記式の化合物である、請求項1記載の方法： 【化１】 式中、R1、R2、およびR3は、H、C1-C8アルキル、またはCOR5からなる群より別々
    に選択され、R5は、水素、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、置換アルケ
    ニル、アルケニルオキシ、アルキニル、置換アルキニル、6個〜14個の環原子を
    有するアリール、6個〜14個の環原子を有するアリールオキシ、5個または6個の
    環原子を有する複素環式基、アリール基に融合された5個または6個の環原子を有
    する複素環式基、シクロアルキル、シクロアルケニル、およびアリール基に融合
    されたシクロアルキルからなる群より選択される。
  19. 【請求項１９】 化合物がラジシコール以外の化合物である、請求項18記載
    の方法。
  20. 【請求項２０】 薬剤が、ラジシコール、ラジシコールアナログ、バスタジ
    ン、バスタジンアナログ、またはその組み合わせである、請求項1記載の方法。
  21. 【請求項２１】 薬剤が、ラジシコールアナログ、バスタジン、バスタジン
    アナログ、またはその組み合わせである、請求項20記載の方法。
  22. 【請求項２２】 薬剤が、下記構造を有するバスタジンまたはそのアナログ
    である、請求項1記載の方法： 【化２】 式中、各Rは、H、C1-8アルキル、またはスルファトからなる群より別々に選択さ
    れ、Wは、H、OH、またはC1-8アルコキシからなる群より選択され、X、Y、および
    Zは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、またはC1-8アルコキシからなる群より別
    々に選択され、かつ、AおよびBは、単結合または二重結合により結合された炭素
    原子である。
  23. 【請求項２３】 薬剤が、下記構造を有するバスタジンまたはそのアナログ
    である、請求項1記載の方法： 【化３】 式中、各Rは、H、C1-8アルキル、またはスルファトからなる群より別々に選択さ
    れ、Wは、H、OH、またはC1-8アルコキシからなる群より選択され、X、Y、および
    Zは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、またはC1-8アルコキシからなる群より別
    々に選択され、かつ、AおよびBは、単結合または二重結合により結合された炭素
    原子である。
  24. 【請求項２４】 薬剤が、下記構造を有するバスタジンまたはそのアナログ
    である、請求項1記載の方法： 【化４】 式中、各Rは、H、C1-8アルキル、またはスルファトからなる群より別々に選択さ
    れ、Wは、H、OH、またはC1-8アルコキシからなる群より選択され、X、Y、および
    Zは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、またはC1-8アルコキシからなる群より別
    々に選択され、かつ、AおよびBは、単結合または二重結合により結合された炭素
    原子である。
  25. 【請求項２５】 薬剤が、下記構造を有するバスタジンまたはそのアナログ
    である、請求項1記載の方法： 【化５】 式中、各Rは、H、C1-8アルキル、またはスルファトからなる群より別々に選択さ
    れ、Wは、H、OH、またはC1-8アルコキシからなる群より選択され、XおよびYは、
    水素、ハロゲン、ヒドロキシル、またはC1-8アルコキシからなる群より別々に選
    択され、かつ、AおよびBは、単結合または二重結合により結合された炭素原子で
    ある。
  26. 【請求項２６】 薬剤が、下記構造を有するバスタジンまたはそのアナログ
    である、請求項1記載の方法： 【化６】 式中、各Rは、H、C1-8アルキル、またはスルファトからなる群より別々に選択さ
    れ、Wは、H、OH、またはC1-8アルコキシからなる群より選択され、XおよびYは、
    水素、ハロゲン、ヒドロキシル、またはC1-8アルコキシからなる群より別々に選
    択され、かつ、AおよびBは、単結合または二重結合により結合された炭素原子で
    ある。
  27. 【請求項２７】 薬剤が、下記構造を有するバスタジンまたはそのアナログ
    である、請求項1記載の方法： 【化７】 式中、各Rは、H、C1-8アルキル、またはスルファトからなる群より別々に選択さ
    れ、Wは、H、OH、またはC1-8アルコキシからなる群より選択され、XおよびYは、
    水素、ハロゲン、ヒドロキシル、またはC1-8アルコキシからなる群より別々に選
    択され、かつ、AおよびBは、単結合または二重結合により結合された炭素原子で
    ある。
  28. 【請求項２８】 薬剤が、下記構造を有するバスタジンまたはそのアナログ
    である、請求項1記載の方法： 【化８】 式中、各Rは、H、C1-8アルキル、またはスルファトからなる群より別々に選択さ
    れ、Wは、H、OH、またはC1-8アルコキシからなる群より選択され、Xは、水素、
    ハロゲン、ヒドロキシル、またはC1-8アルコキシからなる群より選択され、かつ
    、AおよびBは、単結合または二重結合により結合された炭素原子である。
  29. 【請求項２９】 哺乳動物被験者における神経細胞成長を刺激する方法であ
    って、以下の段階を含む方法： 薬剤が、ラジシコールおよびそのアナログ、バスタジンおよびそのアナログ、
    ゲルダナマイシンおよびそのアナログ、ベンゾキノンアンサマイシンおよびその
    構造的アナログ、選択された成分ともう一つのポリペプチド成分と複合体との相
    互作用部位における複合体の選択されたポリペプチド成分の配列を含むペプチド
    、ステロイド受容体複合体の一つ又は複数の成分に対する抗体、成熟ステロイド
    受容体複合体の会合を破壊する薬剤以外の神経栄養因子、ならびにその混合物か
    らなる群より選択される、ステロイド受容体複合体の集合を破壊またはMAPキナ
    ーゼ/キナーゼ活性を刺激する有効量の薬剤を、被験者に投与する段階；ならび
    に 治療有効量の熱を加える段階。
  30. 【請求項３０】 哺乳動物被験者における神経細胞成長を刺激する方法であ
    って、以下の段階を含む方法： 解剖学的経路に沿った神経成長が望ましい、該解剖学的経路を規定するテンプ
    レートを提供する段階； 薬剤が、ラジシコールおよびそのアナログ、バスタジンおよびそのアナログ、
    ゲルダナマイシンおよびそのアナログ、ベンゾキノンアンサマイシンおよびその
    構造アナログ、選択された成分ともう一つのポリペプチド成分と複合体との相互
    作用部位における複合体の選択されたポリペプチド成分の配列を含むペプチド、
    ステロイド受容体複合体の一つ又は複数の成分に対する抗体、成熟ステロイド受
    容体複合体の会合を破壊する薬剤以外の神経栄養因子、ならびにその混合物から
    なる群より選択される、ステロイド受容体複合体の集合を破壊またはMAPキナー
    ゼ/キナーゼ活性を刺激する有効量の薬剤を、テンプレートに注入する段階；な
    らびに 治療有効量の熱を加える段階。
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