JP2003512384A - Ｒｓウイルス感染症の治療用薬剤 - Google Patents

Ｒｓウイルス感染症の治療用薬剤

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Abstract

(57)【要約】 RSウイルス(RSV)による感染症の予防または治療に使用するための薬剤の製造における、(i) アネキシンIIまたはL-セレクチンへのRSV G-タンパク質の結合に拮抗する生成物、または(ii) アネキシンIIまたはL-セレクチンの細胞表面レベルの減少をもたらす生成物の使用。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は、RSウイルス感染の予防および治療に関する。
【０００２】発明の背景 RSウイルス(respiratory syncytial virus 以下、RSVと称する)は、乳児期お
よび幼児期の初期において唯一最も重要な呼吸病原体である。特に、先天性心臓
欠陥、気管支肺形成不全を患う子供、未熟乳児、および免疫不全疾患を患う乳児
は、RSV感染の危険性が高く、重大な罹患、多くの場合は死に至る。一次RSV感染
症の約40％が入院を必要とするかもしれない下気道の関与を示す。幼い子供に加
えて、骨髄移植または固体器官移植中に免疫抑制下にある成人および子供も、RS
Vに感染した場合には重篤な肺炎を発現する危険性が高い。RSVはまた、年配者に
おいて重篤な下気道疾患も生じ、特に介護施設で生活する年配者は、毎年大規模
なRSV感染症の流行に曝されている。
【０００３】 最近まで、RSV感染症のための治療は、水分補給、補充酸素、および補助呼吸
などの支持的対策(supportive measure)に限定されていた。1986年以降、最初の
合成非インターフェロン誘導型広域スペクトル抗ウイルスヌクレオシドであるリ
バビリンが、多くの国でRSV感染症の治療のために認可されている。エーロゾル
化リバビリンに曝されたヘルスケアワーカーに対する潜在的な奇形遺伝性、およ
び仲介(intervention)のコスト効果が乏しいために、アメリカ小児科アカデミー
(American Academy of Paediatrics)はリバビリンは危険性の高いグループ(例え
ば、病が重篤かつ罹患および死亡の危険性が高い乳児など)用であり得ると勧告
している。
【０００４】 ヒト化抗体MEDI-493を用いた臨床治験では、入院、病院滞在の期間、および集
中治療室滞在の期間の短縮が達成されたことが示された。この抗体の投与では、
予防的結果しか得られず、確定した感染または症状の治療までは及ばない。この
薬剤は、筋内投与されなければならず、利用可能な投与経路が限定されている。
また、製造および生産の費用が高い。投与が簡単で、コスト効果があり、確定し
た感染および症状を治療するための治療的用途および予防の可能性がある、RSV
感染症に対する有効な治療が必要とされている。
【０００５】発明の概要 本発明者らは、今回、アネキシンIIが上皮細胞上でRSVの受容体として作用す
ること、およびL-セレクチンが白血球上でRSVの受容体として作用することを示
す。本発明者らはまた、国際特許出願公開番号WO97/01355(参照により本明細書
に援用される)に開示される式(II)および(III)の化合物が、RSV感染症の治療に
おいて有用であることも発見した。特に、1,6-ビス-[3-(3-カルボキシメチルフ
ェニル)-4-(2-α-D-マンノピラノシルオキシ)フェニル]ヘキサンが、RSV感染症
の治療において特に有用である。
【０００６】 WO97/01335の式(II)および(III)の化合物は、成人呼吸困難症候群(ARDS)、ク
ローン病、敗血症性ショック、外傷性ショック、多器官(multi-organ)不全、自
己免疫疾患、喘息、炎症性腸疾患、乾癬、慢性関節リウマチ、心臓発作後に生じ
る再灌流障害、発作、器官移植、および癌などの疾患を治療するために開示され
ている。WO97/01335においては、化合物をウイルス感染症の治療に使用すること
は開示されておらず、特に該化合物がRSV感染症の治療に有用になり得ることは
教示されていない。
【０００７】 従って、本発明は、RSウイルス(RSV)による感染症の予防または治療方法で使
用するための、(i) アネキシンIIまたはL-セレクチンへのRSV G-タンパク質の結
合に拮抗する生成物、または(ii) アネキシンIIまたはL-セレクチンの細胞表面
レベルの減少をもたらす生成物を提供する。
【０００８】 本発明はまた、RSV感染症を予防または治療することが可能な生成物を同定す
る方法であって、 (a) 候補物質を、アネキシンIIもしくはその誘導体と、またはL-セレクチンも
しくはその誘導体と接触させ、該候補物質がそれに結合するかどうかを確認する
ステップ、 (b) 候補物質の、アネキシンIIまたはその誘導体およびRSV G-タンパク質また
はその誘導体への供給を、該候補物質の不在下でアネキシンIIまたはその誘導体
がRSV G-タンパク質またはその誘導体に結合するような条件下で実施し、該候補
物質が、アネキシンIIまたはその誘導体とRSV G-タンパク質またはその誘導体と
の結合に拮抗するかどうかを確認するステップ、または (c) 候補物質の、L-セレクチンまたはその誘導体およびRSV G-タンパク質また
はその誘導体への供給を、該候補物質の不在下でL-セレクチンまたはその誘導体
がRSV G-タンパク質またはその誘導体に結合するような条件下で実施し、該候補
物質が、L-セレクチンまたはその誘導体とRSV G-タンパク質またはその誘導体と
の結合に拮抗するかどうかを確認するステップ、 を含み、 ステップ(a)における物質の結合またはステップ(b)もしくは(c)における結合
の拮抗が、該候補物質がRSV感染症を予防または治療することが可能であること
を示すものである方法を提供する。
【０００９】 さらに、本発明は、RSV感染症を予防または治療することが可能な生成物を同
定する方法であって、候補物質が、アネキシンIIもしくはその誘導体の細胞表面
レベルの減少、またはL-セレクチンもしくはその誘導体の細胞表面レベルの減少
をもたらす能力を有するかどうかを試験し、それによって該候補物質がRSV感染
症を予防または治療することが可能であるかどうかを決定するステップを含む方
法を提供する。
【００１０】図面の簡単な説明 図１は、RSV感染性に対する複合糖質の影響を示す。Hep2細胞(200μl/ウェル
；5×105細胞/ml)をマイクロタイタープレートウェルに添加して、プレートを一
晩37℃にてインキュベートした。マンナンの段階希釈液(100μl/ウェル；最終最
高濃度500μg/ml、最終最低濃度0.05μg/ml)、またはフコイダンの段階希釈液(1
00μl/ウェル；最終最高濃度500μg/ml、最終最低濃度0.05μg/ml)を0.4mlのRSV
株(1×107ffu/ml)と混合し、各サンプルを50μl、Hep2細胞単層に添加した。フ
コイダンはHep2細胞のRSV感染性において濃度に依存した阻害を生じたが、マン
ナンは感染性を阻害しなかった。値は、２つの個別の実験の平均値であり、各実
験は３つ１組で行った。
【００１１】 図２ａは、化合物Ａの構造を示す。
【００１２】 図２ｂは、RSV感染性に対する化合物Ａおよび可溶性セレクチンの影響を示す
。L-セレクチン-ZZの段階希釈液(100μl/ウェル；最終最高濃度15μg/ml、最終
最低濃度0.015μg/ml)またはE-セレクチン-ZZの段階希釈液(100μl/ウェル；濃
度範囲0.05〜50μg/ml)または化合物Ａの段階希釈液(100μl/ウェル；濃度範囲0
.08〜800μg/ml)を、0.4mlのRSV株(1×107ffu/ml)と混合し、各サンプルを50μl
、Hep2細胞単層に添加した。L-セレクチン-ZZおよびL-セレクチンインヒビター
はRSV感染性を低減したが、E-セレクチン-ZZは効果がなかった。値は、２つの個
別の実験の平均値であり、各実験は３つ１組で行った。
【００１３】 図３は、L-セレクチン-ZZ(50μl；10μg/ml)を、抗体(50μl；20μg/ml)もし
くはフコイダン(50μl；50μg/ml) および/または2 mM Ca2+-イオンもしくは5 m
M EDTAの存在下または不在下においてRSV Gタンパク質で被覆したウェルに添加
した場合の、L-セレクチンとRSV Gタンパク質との結合を示す。L-セレクチン-ZZ
はCa2+に依存してRSV Gタンパク質に結合し、結合はフコイダンおよび抗-L-セレ
クチン抗体により阻害された。
【００１４】 図４は、L-セレクチン-ZZとそのリガントとの結合に対する酵素的治療の効果
を示す。イムノアフィニティー精製Gタンパク質および因子Ｈを、シアリダーゼ
、マンノシダーゼ、またはヘパリナーゼの段階希釈液と共にインキュベートした
。マイクロタイタープレートウェルを、酵素処理したGタンパク質および未処理G
タンパク質で被覆した。
【００１５】 Ａ．シアリダーゼ(影無し)、マンノシダーゼ(斜線)、またはインキュベーショ
ン緩衝液(影付き)でのGタンパク質の前処理により、L-セレクチンの結合は減少
しなかった。
【００１６】 Ｂ．ヘパリナーゼでのGタンパク質の前処理により、L-セレクチンとGタンパク
質との結合が減少した。L-セレクチンとGタンパク質との結合の減少は、前イン
キュベーション緩衝液に使用したヘパリナーゼの濃度に依存した。所与の濃度に
おいて、ヘパリナーゼＩ(影無し)は、ヘパリナーゼIII(影付き)よりも、Gタンパ
ク質からL-セレクチン結合部位を除去するのに効果的であった。
【００１７】 図５は、Hep2細胞のRSV感染性に対するTQ1の影響を示す。
【００１８】 異なる濃度[100μg/ml(影付き)；50μg/ml(影無し)]の抗L-セレクチン抗体、
抗P-セレクチン抗体、またはイソタイプ対照抗体を、RSV株(1×107ffu/ml)と混
合し、各サンプルを50μl、Hep2細胞単層に添加した。驚くべきことに、TQ1は、
HEP2細胞のRSV感染性を阻害したが、このアッセイでテストした他の抗体は効果
がなかった。値は、２つの個別の実験の平均値であり、各実験は３重に行った。
【００１９】 図６は、組換えアネキシンIIの結合特性を示す。マイクロタイタープレートウ
ェルを、Gタンパク質、プラスミノゲン、またはウシ血清アルブミンで被覆し、
実施例に記載するように非特異的結合部位をTween20でブロックした。150mM NaC
lを含有する10mM Tris/HCl緩衝液(pH7.4)中のアネキシンIIの段階希釈液、5mM C
a2+-イオンまたは5mM EDTAを含有するHRP共役抗HisTag抗体の段階希釈液(1:1000
希釈)をタンパク質被覆ウェルに添加した。(Ａ)アネキシンIIとRSV Gタンパク質
およびプラスミノゲンとの結合は濃度に依存し、(Ｂ)EDTAの存在下では阻害され
た。
【００２０】 図７は、アネキシンIIとプラスミノゲンおよびヘパリンとの結合を示す。マイ
クロタイタープレートウェルを、ヘパリン(100μg/ml；100μl)またはプラスミ
ノゲン(100μg/ml；100μl)またはRSV粒子(100μg/ml；100μl)で被覆した。非
特異的結合部位を、実施例に記載するようにブロックした。150mM NaCl、5mM Ca
Cl2およびHRP共役抗His抗体(1:1000希釈)を含む10mM Tris/HCl緩衝液(pH 7.4)中
のTQ1抗体の段階希釈液(最高濃度100μg/ml；50μl)または対照抗体の段階希釈
液(最高濃度100μg/ml；50μl)またはセレクチンアンタゴニストの段階希釈液(
最高最終濃度500μM)の存在下で、アネキシンII(10μg/ml；50μl)をタンパク質
被覆ウェルに添加した。TQ1は、アネキシンIIがヘパリン(Ａ)およびプラスミノ
ゲン(Ｂ)またはRSV粒子(Ｃ)に結合するのを阻害するが、イソタイプ対照抗体の
存在下では結合の阻害は認められなかった。セレクチンアンタゴニスト(化合物
Ａ)は、アネキシンIIがプラスミノゲンおよびヘパリンに結合するのを阻害した
。
【００２１】 図８は、LAM1-3に認識されるエピトープ(L-セレクチンの残基番号92および156
)と、アネキシンII中の(Ｃ末端内に局在化されている)ヘパリンおよびプラスミ
ノゲン結合部位との配列アライメントを示す。一致する領域および潜在的TQ1エ
ピトープは(*)で示す。
【００２２】 図９は、RSV感染性に対する可溶性アネキシンIIおよび可溶性セレクチンの影
響を示す。
【００２３】 図10は、ウイルス感染細胞からのIL-8放出に対する化合物Ａの影響を示す。
【００２４】配列の簡単な説明 配列番号１は、ヒトL-セレクチンの完全長アミノ酸配列を示す。アミノ酸1〜2
8はシグナルペプチドを形成し、アミノ酸29〜38はシグナルペプチドを形成する
。アミノ酸39〜332は、可溶型L-セレクチンに認められる細胞外ドメインを形成
する。アミノ酸333〜355は膜貫通領域を形成し、アミノ酸356〜372は細胞質領域
を形成する。Ｃ型レクチン炭水化物結合ドメインはアミノ酸55〜155で認められ
る。
【００２５】 配列番号２は、可溶型アネキシンIIの完全長アミノ酸配列を示す。推定ヘパリ
ン/炭水化物結合部位は、アミノ酸240〜339に認められる。
【００２６】 配列番号３は、RSV Gタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００２７】 配列番号４および５は、アネキシンIIのクローニングで使用されるオリゴヌク
レオチドプライマーを示す。
【００２８】発明の詳細な説明 RSV Gタンパク質のアネキシンIIまたはL-セレクチンへの結合に拮抗するか、
またはアネキシンIIまたはL-セレクチンの細胞表面レベルを減少させる任意の適
切な生成物を、本発明に使用できる。
【００２９】 生成物は、アネキシンIIとGタンパク質との結合、またはL-セレクチンとGタン
パク質との結合を阻害または減少し得る。生成物は、アネキシンII、L-セレクチ
ンまたはRSV Gタンパク質に結合可能であり得る。
【００３０】 生成物は、アネキシンIIまたはL-セレクチンへのRSV Gタンパク質の結合を、
特異的または実質的に特異的に拮抗してもしなくてもよく、つまりこれらのタン
パク質とアネキシンIIまたはL-セレクチンのリガンド(典型的には天然型リガン
ド)などの他のタンパク質との結合の拮抗は生じても生じなくてもよい。L-セレ
クチンの適切なリガンドとしては、シアリルルイスＸ(sLex)、硫酸化sLex、GlyC
AM-1、CD34、グリコカリックス、PSGL-1、スルファチド、ホスホスホマンナンエ
ステル(phosphosphomannan ester)、リン脂質、マンノース-6-リン酸、補体因子
Ｈ、フコイダン、またはグリコサミノグリカンが挙げられる。アネキシンIIの適
切なリガンドとしては、リン脂質、グリコサミノグリカン、プラスミノゲン、ヒ
トサイトメガロウイルス、グリコプロテインＢ、テネイシン-C、またはフコイダ
ンが挙げられる。
【００３１】 一実施形態では、生成物は、アネキシンIIおよび/またはL-セレクチンと特異
的に結合する。このような生成物は、いずれかのタンパク質の任意の活性(例え
ば炭水化物結合またはリン脂質結合)を阻害してもしなくてもよい。生成物は、
アネキシンIIまたはL-セレクチンに可逆的または不可逆的に結合してもよい。不
可逆的に結合する生成物は、タンパク質から非常にゆっくりと解離する。なぜな
ら、それらは、共有結合的または非共有結合的に非常に固く結合しているからで
ある。可逆的結合は、不可逆的結合と対照的に、アネキシンII/L-セレクチン生
成物複合体の解離が速いのが特徴である。
【００３２】 生成物は、任意にRSV Gタンパク質を除いて、アネキシンIIまたはL-セレクチ
ンと結合する天然型薬剤に、構造特性または結合特性のいずれかにおいて類似し
得る。薬剤がポリペプチドである場合、生成物は、天然型薬剤と相同性を有し得
る。生成物は、天然型薬剤と同じ部位においてアネキシンIIまたはL-セレクチン
と結合し得る。このような生成物は、典型的に、薬剤がいずれかのタンパク質に
結合するのと競合するか、拮抗するか、または阻害し得る。生成物は、RSV Gタ
ンパク質が結合するのと同じ部位において、アネキシンIIまたはL-セレクチンと
結合し得る。
【００３３】 生成物は、天然型薬剤が結合する部位と重複する部位において、アネキシンII
またはL-セレクチンと結合しなくてもよい。このような生成物は、薬剤がいずれ
かのタンパク質とも結合するのを阻害し得る。
【００３４】 生成物は、アネキシンIIまたはL-セレクチンの可溶型であってもよい。アネキ
シンIIまたはL-セレクチンの可溶型は、天然のものでも、人工的に生成されたも
のであってもよい。典型的には、このような生成物は、アネキシンIIまたはL-セ
レクチンの断片、またはこのような断片の相同体から構成されるかまたは実質的
に構成される。断片は、ＮまたはＣ末端において追加のアミノ酸を含んで、例え
ば融合タンパク質の形態を取っていてもよい。可溶型は、L-セレクチンまたはア
ネキシンIIの細胞外ドメインの全体または一部のみを含んでいてもよく、細胞外
ドメインの酵素的切断により生成されてもよい。可溶型L-セレクチンは、L-セレ
クチンの他のアミノ酸配列を含まずに、配列番号１(L-セレクチン)アミノ酸39〜
332に示される配列の全体または一部のみにより示される配列を有するタンパク
質を含むことが好ましい。可溶型アネキシンIIは、典型的には、四量体である。
アネキシンIIの可溶型または模倣体は、RSV Gタンパク質のアネキシンIIまたはL
-セレクチンへの結合に拮抗し得る。そして、L-セレクチンの可溶型または模倣
体は、RSV Gタンパク質のアネキシンIIまたはL-セレクチンへの結合に拮抗し得
る。
【００３５】 生成物は、アネキシンIIまたはL-セレクチンの構造を変化させてもよく、変化
させなくてもよい。一実施形態では、生成物は、アネキシンIIまたはL-セレクチ
ンを、RSV Gタンパク質に結合しにくい形態または結合できない形態に変える。
この変化は可逆的でも不可逆的でもよい。典型的には、アネキシンIIまたはL-セ
レクチンは、生成物と結合した場合にのみこのような変化形態をとる。不可逆的
変化は、例えば、タンパク質が生成物により化学的に修飾された場合または分解
(例えばペプチド結合の分解)された場合のどちらかに起こり得る。
【００３６】 一実施形態では、生成物は、アネキシンIIまたはL-セレクチンと結合すること
によってではなく、RSV Gタンパク質と結合することにより、RSV Gタンパク質の
アネキシンIIまたはL-セレクチンへの結合に拮抗する。生成物は、上記生成物が
アネキシンIIまたはL-セレクチンに結合および作用するのと同じように、RSV G
タンパク質に結合および/または作用し得る。従って、生成物のRSV Gタンパク質
への結合は、典型的には特異的であり、可逆的でも不可逆的でもよく、RSV Gタ
ンパク質の構造を変化させてもさせなくてもよい。このような生成物は典型的に
はアネキシンIIまたはL-セレクチンの構造および/または結合特性に類似するた
め、生成物はアネキシンIIまたはL-セレクチンの「模倣体」(例えばいずれかのタ
ンパク質と相同性を有するポリペプチド)として作用し得る。
【００３７】 模倣体は、アネキシンIIもしくはL-セレクチンにその結合特性が類似するよう
に(例えば計算機により)設計されていてもよいし、ならびに/またはアネキシンI
IもしくはL-セレクチンに結合する薬剤と結合する能力に基づいて(例えば物質の
ライブラリーから)選択されていてもよい。模倣体(一実施形態では本明細書に記
載するアネキシンIIまたはL-セレクチンの可溶型である)は、L-セレクチンまた
はアネキシンIIの炭水化物結合(認識)ドメインを含み得る。模倣体は、配列番号
１(L-セレクチン)のアミノ酸55〜155もしくは配列番号２(アネキシンII)のアミ
ノ酸240〜339に示される配列またはそのような配列の相同体を、少なくとも含む
か、それのみを含むか、またはその一部を含み得る。
【００３８】 生成物がペプチド(例えばアネキシンIIまたはL-セレクチンの可溶型)の場合、
少なくとも20のアミノ酸、例えば少なくとも50、100、200、300、500、1000、20
00以上のアミノ酸の長さを典型的に有する。
【００３９】 一実施形態では、生成物は、アネキシンIIまたはL-セレクチンの発現を低下さ
せるか、または細胞内または細胞表面においてアネキシンIIまたはL-セレクチン
のレベルを低下させる。生成物は、アネキシンIIまたはL-セレクチンが細胞の表
面から脱落することを誘発し得る。
【００４０】 生成物は、典型的に、アネキシンIIまたはL-セレクチンの発現を阻害するか、
アネキシンIIまたはL-セレクチンの分解を増すことにより、アネキシンIIまたは
L-セレクチンの細胞内レベルを低下させ得る。従って、このような生成物は、細
胞または細胞内に与えられた場合に、細胞中のアネキシンIIまたはL-セレクチン
の発現および/またはレベルを低下させる。
【００４１】 アネキシンIIまたはL-セレクチンの発現を阻害する生成物は、アネキシンIIま
たはL-セレクチンの発現を促進する１つ以上の細胞成分を阻害するか、アネキシ
ンIIまたはL-セレクチンの発現を阻害する１つ以上の細胞生成を刺激し得る。典
型的には、これらの成分は、アネキシンIIまたはL-セレクチンの発現に特異的ま
たは実質的に特異的である。生成物は、上記生成物がアネキシンIIまたはL-セレ
クチンに結合および作用するのと同じように、成分に結合および/または作用し
得る。従って、生成物の成分への結合は、典型的に、特異的でかつ可逆的でも不
可逆的でもよく、成分の構造を変化させてもさせなくてもよい。成分は、アネキ
シンIIまたはL-セレクチンの発現を直接的または間接的に促進または阻害する。
【００４２】 発現を直接促進する細胞成分としては、アネキシンIIもしくはL-セレクチンの
プロモーター、アネキシンIIもしくはL-セレクチンプロモーターに結合するかも
しくは該プロモーターからの発現に影響を及ぼす転写因子、アネキシンIIもしく
はL-セレクチン遺伝子からmRNAを発現できるRNAポリメラーゼ、アネキシンIIも
しくはL-セレクチンmRNAに結合および/もしくはアネキシンIIもしくはL-セレク
チンmRNAを核から細胞質に輸送する核因子、アネキシンIIもしくはL-セレクチン
mRNAをアネキシンIIまたはL-セレクチンタンパク質に翻訳するのに寄与する翻訳
因子、またはアネキシンIIもしくはL-セレクチンタンパク質をそれらの細胞表面
位置に結合および/もしくは輸送する因子が挙げられる。
【００４３】 発現を間接的に促進する成分としては、アネキシンIIまたはL-セレクチン発現
経路から1ステップ外れた成分、例えば、アネキシンIIまたはL-セレクチンの発
現を直接促進する成分のプロモーター、転写因子、ポリメラーゼ、核因子、翻訳
因子が挙げられる。従って、発現を間接的に促進する成分は、アネキシンIIまた
はL-セレクチンの発現を直接促進する成分から1ステップまたは2ステップ以上外
れていてもよい。
【００４４】 つまり、生成物は、アネキシンIIまたはL-セレクチンmRNAの転写または翻訳を
阻害し得る。生成物は、アネキシンIIまたはL-セレクチン遺伝子からの転写の特
異的なインヒビターであり、他の遺伝子からの転写は阻害しないことが好ましい
。生成物は、(i)コード配列の5’側、および/または(ii)コード配列、および/ま
たは(iii)コード配列の3’側のいずれかにおいて、アネキシンIIまたはL-セレク
チン遺伝子と結合し得る。こうして、生成物は、アネキシンIIまたはL-セレクチ
ンプロモーターと結合して転写開始を阻害し得る。上述したように、生成物は、
アネキシンIIまたはL-セレクチン遺伝子からの転写のために必要なタンパク質に
結合してその作用を阻害し得る。
【００４５】 生成物は、アネキシンIIまたはL-セレクチンmRNAの非翻訳領域または翻訳領域
に結合し得る。これにより、翻訳の開始を防止できる。あるいはまた、インヒビ
ターは、非翻訳領域と会合するタンパク質に結合して、タンパク質が非翻訳領域
と会合するのを防ぐことができる。
【００４６】 ポリヌクレオチドである生成物(以下に記載するアンチセンスポリヌクレオチ
ドなど)は、化学的に修飾されてもよい。これにより、ヌクレアーゼに対する耐
性が増強され、細胞に侵入する能力が増強され得る。例えば、ホスホロチオエー
トオリゴヌクレオチドを使用してもよい。他のデオキシヌクレオチド類似体とし
ては、メチルホスホネート、ホスホロアミデート(phosphoramidate)、ホスホロ
ジチオエート、N3’P5’-ホスホロアミデートおよびオリゴリボヌクレオチドホ
スホロチオエート、それらの2’-O-アルキル類似体、ならびに2’-O-メチルリボ
ヌクレオチドメチルホスホネートが挙げられる。
【００４７】 あるいはまた、混合骨格オリゴヌクレオチド(MBO)を使用してもよい。MBOは、
ホスホチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのセグメント、ならびに改変され
たオリゴデオキシ-またはオリゴリボヌクレオチドの適切に配置されたセグメン
トを含む。MBOは、ホスホロチオエート結合のセグメント、および他の改変型オ
リゴヌクレオチドの他のセグメント(例えば、非イオン性でありかつヌクレアー
ゼに対して非常に耐性なメチルホスホネート、または2’-O-アルキルオリゴリボ
ヌクレオチド)を有する。
【００４８】 上記したように、細胞中でのアネキシンIIまたはL-セレクチンの発現は、アネ
キシンIIまたはL-セレクチンmRNAに結合できる生成物が細胞中に存在することに
より低下され得る。従って、アネキシンIIまたはL-セレクチンmRNAにハイブリダ
イズ可能なポリヌクレオチドは、アネキシンIIまたはL-セレクチン発現の適切な
インヒビターを構成できる。
【００４９】 ポリヌクレオチドは、アネキシンIIまたはL-セレクチンmRNAに対してアンチセ
ンスであり得る。このようなポリヌクレオチドは、アネキシンIIまたはL-セレク
チンmRNAにハイブリダイズ可能であってよく、そうしてアネキシンIIまたはL-セ
レクチンmRNA代謝の１つ以上の要素(転写、mRNAプロセシング、核からのmRNA輸
送、翻訳、またはmRNA分解)を妨害することにより、アネキシンIIまたはL-セレ
クチンの発現を阻害してもよい。アンチセンスポリヌクレオチドはDNAであって
もよいが、典型的にはRNAである。アンチセンスポリヌクレオチドは、一本鎖ま
たは二本鎖ポリヌクレオチドとして得られ得る。アンチセンスポリヌクレオチド
は、典型的には、アネキシンIIまたはL-セレクチンmRNAにハイブリダイズして、
二重らせん(典型的にRNA-RNA二重らせん)を形成し、これはmRNAの翻訳および/ま
たは脱安定化を直接阻害できる。このような二重らせんは、ヌクレアーゼによる
分解を受けやすくてもよい。
【００５０】 アンチセンスポリヌクレオチドは、アネキシンIIまたはL-セレクチンmRNAの全
体または一部にハイブリダイズしてもよい。典型的には、アンチセンスポリヌク
レオチドは、アネキシンIIまたはL-セレクチンmRNAのリボソーム結合領域または
コード領域にハイブリダイズする。ポリヌクレオチドは、アネキシンIIまたはL-
セレクチンmRNAの全体または一部領域に対して相補的であってもよい。例えば、
ポリヌクレオチドは、アネキシンIIまたはL-セレクチンmRNAの全体または一部と
完全な相補体であってもよい。しかし、絶対的な相補性は必要なく、生理学的条
件下において20℃、30℃もしくは40℃を上回る溶融温度を有する二重らせんを形
成するのに十分な相補性を有するポリヌクレオチドが、本発明で使用するのに特
に適している。ポリヌクレオチドは、中度から高度なストリンジェンシー条件下
(例えば0.03M塩化ナトリウムおよび0.003Mクエン酸ナトリウムで摂氏約50〜約60
度)でアネキシンIIまたはL-セレクチンmRNAにハイブリダイズするポリヌクレオ
チドであってもよい。互いに相同なポリヌクレオチドは、通常、このような条件
下では互いとハイブリダイズする。
【００５１】 好適な一実施形態では、アンチセンスポリヌクレオチド配列は、mRNAのコード
配列全体、およびmRNAのコード配列のすぐ5’側にある50ヌクレオチドに相補的
である。しかし、ポリヌクレオチドは、mRNAの5’側または3’側非翻訳領域の全
体または一部にハイブリダイズしてもよい。ポリヌクレオチドは、典型的に、6
〜40ヌクレオチドの長さである。好ましくは、12〜20ヌクレオチドの長さである
。ポリヌクレオチドは、少なくとも40、例えば少なくとも60、または少なくとも
80ヌクレオチドの長さであり、100、200、300、400、500、1000、2000、または3
000ヌクレオチド以上に及ぶ長さであり得る。
【００５２】 一実施形態では、生成物は、アネキシンIIまたはL-セレクチンmRNAに選択的に
結合し、それらを不活化できる。生成物は、例えば、リボザイムである。
【００５３】 本発明は、上記性質のいずれかを有する生成物をin vivoで提供する物質を投
与することにより実施されてもよい。このような物質も「生成物」という用語に含
まれる。一実施形態では、物質は、上皮細胞、白血球または内皮細胞などのRSV
感染を受けやすい細胞においてのみ組織特異的に生成物を提供する。
【００５４】 典型的に、物質は、in vivoで処理されて生成物を提供できる不活化型または
前駆体型の生成物である。従って、物質は、共有結合的または非共有結合的に担
体に会合した生成物を含み得る。典型的には、物質を修飾または分解して生成物
を得てもよい。以下に記載するように、物質は、例えば処理(例えば、転写およ
び/または翻訳)されて上述したような生成物が得られるポリヌクレオチドであり
得る。
【００５５】 本発明は、RSウイルスの処置用薬剤の製造のための式(II)および(III)で表さ
れる化合物の使用を提供する。
【００５６】 式(II)で表される化合物は下記のとおりである：
【化４】 〔式中、 Xは、-CN、-(CH2)nCO2H、-(CH2)nCONHOH、-O(CH2)mCO2H、-O(CH2)mCONHOH、-(
CH2)nCONHNH2、-(CH2)nCOZ、-(CH2)nZ、-CH(CO2H)(CH2)mCO2H、-(CH2)nO(CH2)mC
O2H、-CONH(CH2)mCO2H、-CH(OZ)(CO2H)、-CH(Z)(CO2H)、-(CH2)nSO3H、-(CH2)nP
O3D1D2、-NH(CH2)mCO2H、-CONH(CHR3)CO2H、(1-H-テトラゾリル-5-アルキル-)お
よび-OHからなる群より選択され； 二価構造の場合、Yは、-(CH2)f-、-CO(CH2)fCO-、-(CH2)fO(CH2)f-、-CO(CH2) f O(CH2)fCO-、-(CH2)gS(O)b(CH2)fS(O)b(CH2)g-、-CO(CH2)gS(O)b(CH2)fS(O)b(C
H2)gCO-、-(CH2)fV(CH2)f-、-(CH2)fCOVCO(CH2)f-、-CO(CH2)fCOVCO(CH2)fCO-、
-CO(CH2)fV(CH2)fCO-、-CONH(CH2)fNHCO-、-CO(CH2)fW(CH2)fCO-、-(CH2)fWSW(C
H2)f-、-(CH2)fCONH(CH2)fNHCO(CH2)f-、-(CH2)fCOW(CH2)fWCO(CH2)f-または-CH 2 (CH2)fW(CH2)fCH2-（ここで、Vは-N[(CH2)q]2N-であり、qは独立して２〜４で
あり、Wはアリールまたはヘテロアリールである）であり； 三価構造の場合、Yは、
【化５】 であり、Tは、-(CH2)f-、-CO(CH2)f-、-(CH2)gS(O)b(CH2)f-および-CO(CH2)gS(O
)b(CH2)f-（ここで、カルボニル基はビフェニル単位に隣接して位置する）から
なる群より選択され； R1およびR2は、独立して、水素、アルキル、ハロゲン、-OZ、-NO2、-(CH2)nCO 2 H、-NH2および-NHZからなる群より選択され； R3は、水素、アルキル、アラルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、
アルキルカルボン酸およびアルキルカルボキサミドからなる群より選択され； fは1〜16であり、gは0〜6であり、nは0〜6であり、mは1〜6であり、pは0〜6で
あり、bは0〜2であり、Zはアルキル、アリールまたはアラルキルであり、D1およ
びD2は独立して水素またはアルキルである。〕 で表される化合物ならびにその薬学的に許容しうる塩、エステル、アミドおよび
プロドラッグ。
【００５７】 好ましくは、使用される化合物は、式(III)：
【化６】 〔式中、Xは、-COOH、-(CH2)nCOOHまたは-O(CH2)nCOOHであり、Yは、-(CH2)n-、
-(CH2)nW(CH2)n-、-(CH2)nWOW(CH2)n-、-(CH2)nS(CH2)nS(CH2)n-、-CO(CH2)nCO-
または-(CH2)nCOW(CH2)nWCO(CH2)n-である（ここで、Wはアリールまたはヘテロ
アリールであり、nは0〜6である)。〕 で表される化合物ならびにその薬学的に許容しうる塩、エステル、アミドおよび
プロドラッグである。
【００５８】 好ましくは、Yは-(CH2)fまたは-CH2(CH2)fW(CH2)fCH2-である。
【００５９】 より好ましくは、Xは3-CH2CO2Hであり、Yは-(CH2)fまたは-CH2(CH2)fW(CH2)fC
H2である。
【００６０】 本発明において使用するために特に好ましい化合物は、 1,7-ビス-[3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(2-α-D-マンノピラノシルオ
キシ)フェニル]ヘプタン、 1,6-ビス-[3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(2-α-D-マンノピラノシルオ
キシ)フェニル]ヘキサン、 1,5-ビス-[3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(2-α-D-マンノピラノシルオ
キシ)フェニル]ペンタン、 1,4-ビス-[3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(2-α-D-マンノピラノシルオ
キシ)フェニル]ブタン、 N,N'-ビス-[4-(3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(α-D-マンノピラノシル
オキシ)フェニル)ブタン-1-イル]-4,4'-トリメチレンジピペリジン、 S,S'-ビス-[3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(2-α-D-マンノピラノシルオ
キシ)-3-フェニルプロパ-1-イル]-1,3-ジチオプロパン、 1,7-ビス-[3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(2-α-D-マンノピラノシルオ
キシ)フェニル]-1,7-ビス-オキソヘプタン、 1,6-ビス-[3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(2-α-D-マンノピラノシルオ
キシ)フェニル]-1,6-ビス-オキソヘキサン、 1,5-ビス-[3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(2-α-D-マンノピラノシルオ
キシ)フェニル]-1,5-ビス-オキソペンタン、 1,4-ビス-[3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(2-α-D-マンノピラノシルオ
キシ)フェニル]-1,4-ビス-オキソブタン、 1,3,5-トリス-[3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(2-α-D-マンノピラノシ
ルオキシ)フェニルメチル]ベンゼン、および 1,3,5-トリス-[4-[3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(α-D-マンノピラノシ
ルオキシ)フェニル]-4-オキソ-2-チオブチル]ベンゼン、 またはその薬学的に許容しうる塩、エステル、アミドおよびプロドラッグである
。
【００６１】 RSV感染症の治療用薬剤の製造に使用するのにより好ましい化合物は、1,6-ビ
ス-[3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(2-α-D-マンノピラノシルオキシ)フェ
ニル]ヘキサンまたはその薬学的に許容しうる塩、エステル、アミドおよびプロ
ドラッグである。
【００６２】 理論に縛られるつもりはないが、式(II)および(III)で表される化合物は細胞
表面上の糖タンパク質受容体に結合して、細胞へのRSVの付着または融合を阻害
するものと推測される。
【００６３】 本明細書において「アルキル」という用語は、１〜12個の炭素原子を有する一
価の直鎖または分枝鎖基を意味するものであり、限定するものではないが、メチ
ル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、イソブチル、
tert-ブチルなどが挙げられる。
【００６４】 「低級アルキル」という用語は、１〜６個の炭素原子を有する任意のアルキル
基を意味する。
【００６５】 「ハロゲン」という用語は、塩素、フッ素、臭素およびヨウ素からなる群より
選択される任意の原子を意味する。
【００６６】 「アルコキシ」という用語は、酸素原子を介して分子に結合されるアルキル基
を意味し、限定するものではないが、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、n-
ブトキシ、sec-ブトキシ、イソブトキシ、tert-ブトキシなどが挙げられる。
【００６７】 「アルキルアミノ」という用語は、構造-NH-(アルキル)、または-N-(アルキル
)2を有する基を意味し、例えば、メチルアミノ、エチルアミノ、イソプロピルア
ミノなどが挙げられる。
【００６８】 「アリール」という用語は、炭素環式芳香族基および複素環式芳香族基を意味
し、限定するものではないが、フェニル、1または2-ナフチル、フルオレニル、(
1,2)-ジヒドロナフチル、インデニル、インダニル、チエニル、ベンゾチエニル
、チエノピリジルなどが挙げられる。
【００６９】 「アラルキル」(アリールアルキルとも呼ばれる)という用語は、アルキル基に
アリール基が結合した基を意味し、限定するものではないが、ベンジル、1およ
び2-ナフチルメチル、ハロベンジル、アルコキシベンジル、ヒドロキシベンジル
、アミノベンジル、ニトロベンジル、グアニジノベンジル、フルオレニルメチル
、フェニルメチル(ベンジル)、1-フェニルエチル、2-フェニルエチル、1-ナフチ
ルエチルなどが挙げられる。
【００７０】 「ヒドロキシアルキル」という用語は、アルキル基に-OHが結合した基を意味
する。
【００７１】 「アミノアルキル」という用語は、アルキル基に構造-NRxRyが結合した基を意
味する。基RxおよびRyは、独立して、例えば水素、アルキルおよびアリールから
選択される。
【００７２】 「アルキルカルボン酸」という用語は、アルキル基にカルボキシル基(-CO2H)
が結合した基を意味する。
【００７３】 「アルキルカルボキサミド」という用語は、アルキル基に式-CONRxRy(式中、
基RxおよびRyはアミノアルキルについて上で定義したとおりである)で表される
基が結合した基を意味する。
【００７４】 本明細書において「薬学的に許容しうる塩、エステル、アミドおよびプロドラ
ッグ」という用語は、適切な医学的判断の範囲内で、不都合な毒性、刺激、アレ
ルギー応答などを生じることなく患者の組織との接触に使用するのに適しており
、合理的な損益比に対応しており、そしてその所期の使用にとって効果的な、本
発明の化合物のカルボン酸塩、アミノ酸付加塩、エステル、アミドおよびプロド
ラッグ、ならびに可能な場合には両性イオン型の本発明の化合物を意味する。「
塩」という用語は、本発明の化合物の、相対的に無毒性の無機および有機酸付加
塩を意味する。これらの塩は、化合物の最終的な単離・精製の際にin situで製
造でき、または精製された遊離形態の化合物を適当な有機または無機酸と別個に
反応させて、それにより得られた塩を単離することで製造できる。代表的な塩と
しては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、シュウ酸
塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩
、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩(tosylate)、クエン酸
塩、マレイン酸塩、フマル酸塩(furmarate)、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル
酸塩、メシル酸塩(mesylate)、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩(lactiob
ionate)、ラウリルスルホン酸塩などが挙げられる。塩には、アルカリ金属およ
びアルカリ土類金属(例えば、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、
マグネシウムなど)に基づくカチオン、ならびに無毒性のアンモニウム、４級ア
ンモニウムおよびアミンカチオン(例えば、限定するものではないが、アンモニ
ウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、
ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなど)も
含まれ得る(例えば、S.M.Bergeら, "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci.,
66:1-19(1977)を参照。これは参照により本明細書に組み入れることとする)。
【００７５】 本発明の化合物の薬学的に許容しうる無毒性エステルとしては、例えば、C1〜
C6のアルキルエステル(アルキル基は直鎖状でも分枝鎖状でもよい)が挙げられる
。許容しうるエステルには、C5〜C7のシクロアルキルエステルならびにアリール
アルキルエステル(例えば限定するものではないがベンジル)も含まれる。C1〜C4 のアルキルエステルが好ましい。アミノ酸エステルも含まれる。本明細書におい
てアミノ酸は、植物および動物タンパク質に通常見出される20種のアミノ酸のう
ちの一つを意味し、それらは有機または生化学の基本書、例えばStryer, "Bioch
emistry", 第3版, 第21頁に挙げられている。本発明の化合物のエステルは、通
常の方法で製造できる。
【００７６】 本発明の化合物の薬学的に許容しうる無毒性アミドとしては、例えば、アンモ
ニア、１級C1〜C6アルキルアミンおよび２級C1〜C6ジアルキルアミン(ここでア
ルキル基は直鎖状でも分枝鎖状でもよい)から誘導されるアミドが挙げられる。
２級アミンの場合、アミンは、1個の窒素原子を含む５〜６員の複素環の形態で
あってもよい。アンモニアから誘導されるアミド、C1〜C3のアルキル１級アミド
およびC1〜C2ジアルキル２級アミドが好ましい。本発明の化合物のアミドは、通
常の方法で製造できる。
【００７７】 「プロドラッグ」という用語は、例えば血液中での加水分解によって、in viv
oで変換されて上記式で表される親化合物を生じる化合物を意味する。徹底的な
解説は、A. C. S. Symposium Seriesの14巻のT.HiguchiおよびV.Stella, "Pro-d
rugs as Novel Delivery Systems", や、Bioreversible Carriers in Drug Desi
gn, Edward B.Roche編, American Pharmaceutical Association and Pergamon P
ress, 1987に記載されており、その双方は参照により本明細書に組み入れること
とする。
【００７８】 したがって、本発明のさらなる態様では、RSV感染症に罹患した哺乳動物(ヒト
を含む)の治療方法であって、式(II)または(III)で表される化合物の有効量を投
与することを含む方法が提供される。
【００７９】 さらなる態様では、RSV感染症の治療のための式(II)または(III)で表される化
合物の使用も提供される。
【００８０】 本明細書において、治療が、予防ならびに確定した感染症または症状の治療に
まで及ぶということは当業者には明らかであろう。
【００８１】 式(II)および(III)で表される化合物は、国際公開WO97/01335号に記載された
医薬製剤または医薬組成物、例えば限定するものではないが非経口投与、吸入、
鼻腔内投与、または経口投与に適した組成物として製剤化しうる。
【００８２】 好ましくは、式(II)および(III)で表される化合物は、経口、吸入、鼻腔内投
与または静脈内投与用に製剤化される。
【００８３】 好ましくは、製剤は、エアロゾルによる投与またはネブライザーを用いること
による投与に適している。
【００８４】 治療に使用するために必要な式(II)および(III)で表される化合物の量は、選
択された特定の化合物のみならず、投与経路、治療される症状の性質ならびに患
者の年齢および状態によって様々である。しかし、一般に、適切な用量は、１日
当たり約0.1〜750mg/kg(体重)の範囲、好ましくは0.5〜50mg/kg/日の範囲である
。所望の用量を、１回用量で投与してもよく、または適当な間隔をおいて投与す
る分割用量(例えば1日当たり２回、３回、４回またはそれ以上の分割用量)で投
与してもよい。
【００８５】 式(II)および(III)で表される化合物は、参照により本明細書に組み入れられ
た国際公開WO97/01335号の記載のとおりに製造される。
【００８６】 アネキシンIIもしくはL-セレクチンへのRSV G-タンパク質の結合に拮抗する生
成物またはアネキシンIIもしくはL-セレクチンの細胞表面レベルの減少をもたら
す生成物を使用して、RSV感染症を治療または予防することができる。上記のと
おり、本発明は、上述した特徴のいずれかを有する可能性のある生成物を同定す
る方法を提供する。したがって、該生成物の同定は、候補物質が、そのような拮
抗特性を有するかどうか、あるいはいずれかのタンパク質の細胞表面レベルに対
してそのような作用を及ぼすかどうかを確認することによって、そして場合によ
っては候補物質が上記のその他の特性のいずれかを有するかどうかをさらに確認
することによって行うことができる。
【００８７】 生成物が結合の拮抗作用をもたらすかどうかを確認する方法は、候補物質がア
ネキシンIIまたはL-セレクチンに結合するかどうか、あるいは候補物質がG-タン
パク質とアネキシンIIまたはセレクチンとの結合を阻害するかどうかを確認する
ことを基礎とすることができる。したがって、本発明は、RSV感染症を予防また
は治療することが可能な生成物を同定する方法であって、 (a) 候補物質を、アネキシンIIまたはL-セレクチンと接触させ、該候補物質が
アネキシンIIまたはL-セレクチンに結合するかどうかを確認するステップ、 (b) 候補物質の、アネキシンIIおよびRSV G-タンパク質への供給を、該候補物
質の不在下でアネキシンIIがRSV G-タンパク質に結合するような条件下で実施し
、該候補物質が、アネキシンIIとRSV G-タンパク質との結合に拮抗するかどうか
を確認するステップ、または (c) 候補物質の、L-セレクチンおよびRSV G-タンパク質への供給を、該候補物
質の不在下でL-セレクチンがRSV G-タンパク質に結合するような条件下で実施し
、該候補物質が、L-セレクチンとRSV G-タンパク質との結合に拮抗するかどうか
を確認するステップ、 を含み、 ステップ(a)、(b)または(c)におけるアネキシンIIまたはセレクチンは細胞の
表面上に存在しないか、または細胞の表面上で組換え発現されており、ステップ
(a)におけるアネキシンまたはL-セレクチンへの物質の結合またはステップ(b)も
しくは(c)における結合の拮抗が、該候補物質がRSV感染症を予防または治療する
ことが可能であることを示すものである、方法を提供する。
【００８８】 ステップ(a)では、いずれかの適当な結合アッセイフォーマット、例えば後述
のフォーマットのいずれかを使用することができる。
【００８９】 上述のように、上記方法では、アネキシンIIまたはL-セレクチンは細胞表面上
に存在しないか、または細胞の表面上で組換え発現される。したがって、どちら
のタンパク質も、アネキシンIIもしくはL-セレクチンを天然で発現しない細胞上
、または該タンパク質を改変されたレベル(一般には高レベル)で発現するように
操作された細胞の表面上で発現され得る。よって、アネキシンIIまたはL-セレク
チンが発現される細胞は、該タンパク質を発現する組換えベクターを含み得る。
【００９０】 細胞は真核細胞であってよく、例えば哺乳動物細胞、具体的には霊長類(例え
ばヒト)細胞または齧歯類(例えばマウスもしくはラット)細胞であってよい。細
胞は原核細胞であってもよく、例えば細菌細胞であってよい。細胞は上皮細胞ま
たは白血球であってもよい。アネキシンIIまたはL-セレクチンは、例えば本明細
書に挙げた細胞のいずれかの細胞抽出物(例えば部分精製抽出物)の形態であって
もよい。
【００９１】 「アネキシンII」、「L-セレクチン」および「RSV G-タンパク質」という用語
は、これらのタンパク質(例えば本明細書で挙げた種のいずれかのタンパク質)の
天然形態、これらのタンパク質の誘導体を含む。典型的には、そのような誘導体
はこれらのタンパク質の相同体(タンパク質の断片の相同体を含む)である。誘導
体は、上記のような可溶型のアネキシンIIまたはL-セレクチンであってもよい。
誘導体は、天然のアネキシンII、L-セレクチンおよび／またはRSV G-タンパク質
の関連した結合活性の一部または全部を有する。誘導体は、配列番号１(L-セレ
クチン)のアミノ酸55〜155または配列番号２(アネキシンII)のアミノ酸240〜339
の炭水化物結合部位またはこれらの配列の一部もしくは相同配列を含み得る。
【００９２】 本発明の方法で使用するためのL-セレクチン、アネキシンIIおよびRSV G-タン
パク質は、公知の技術により得られる。これらのタンパク質の完全長アミノ酸配
列は、それぞれ本明細書の配列番号１、２および３に示されている。当業者はこ
れらの配列情報を利用することで、常用の方法を用いてアネキシンII、L-セレク
チンまたはRSV G-タンパク質を製造することができる。またこれらの配列情報を
本発明の方法とともに使用することで、RSV感染症の治療生成物であるこれらの
タンパク質の断片または誘導体を得ることもできる。
【００９３】 本発明の方法において、アネキシンII、L-セレクチンおよび／またはRSV G-タ
ンパク質は、一般に適当なバッファー中に存在し、適当なバッファーには、アネ
キシンII、L-セレクチンおよび／またはRSV G-タンパク質の結合条件へと導くpH
において緩衝能をもたらしうる任意の適当な生物学的バッファーがある。アネキ
シンII、L-セレクチンおよび／またはRSV G-タンパク質は、細胞内の状況と類似
の状況(例えば温度など)に存在してもよい。
【００９４】 候補物質が、アネキシンIIまたはL-セレクチンと、RSV G-タンパク質との結合
を阻害可能かどうかを確認する方法は、候補物質にアネキシンII、L-セレクチン
および／またはRSV G-タンパク質を供給し、例えばRSV G-タンパク質に結合する
アネキシンIIもしくはL-セレクチンの量またはアネキシンII、L-セレクチンもし
くはRSV G-タンパク質に結合する候補物質の量を測定することによって結合が生
じているかどうかを確認することを含み得る。結合は、結合によって変化する候
補物質、アネキシンII、L-セレクチンまたはRSV G-タンパク質の特徴、例えば分
光学的変化を測定することによって確認できる。
【００９５】 アッセイフォーマットは「バンドシフト」系であってもよい。これは、候補物
質が、ゲル電気泳動において、アネキシンII、L-セレクチンまたはRSV G-タンパ
ク質を、該候補物質の不在下でのアネキシンII、L-セレクチンまたはRSV G-タン
パク質と比べて前進または遅延させるかどうかを確認することを含む。
【００９６】 この方法は競合結合法であってもよい。これは、候補物質が、アネキシンIIま
たはL-セレクチンへのRSV G-タンパク質の結合を阻害可能であるかどうかを確認
するものである。そのような方法は、 (i) 候補物質を、RSV G-タンパク質および標識化アネキシンIIとともにインキ
ュベートするステップ、 (ii) RSV G-タンパク質に結合した標識化アネキシンIIの量を測定するステッ
プ、および (iii) ステップ(ii)で測定された、結合した標識化アネキシンIIの量を、該候
補物質の不在下でRSV G-タンパク質に結合するアネキシンIIの量と比較するステ
ップ、ここで候補物質の存在下での標識化アネキシンIIの結合が、候補物質の不
在下での結合と比べて減少している場合、候補物質が、RSV G-タンパク質へのア
ネキシンIIの結合を阻害し、RSV感染症の予防または治療に使用するのに適して
いる可能性があることを示すものである、 を含み得る。
【００９７】 RSV G-タンパク質に結合した標識化アネキシンIIの量は、直接または間接的に
測定できる。直接測定は、RSV G-タンパク質画分から結合していない標識化アネ
キシンIIを含むアッセイ混合物を除去し、RSV G-タンパク質画分中の標識の量を
測定することによって実施できる。あるいは、RSV G-タンパク質に結合した標識
化アネキシンIIの量は、RSV G-タンパク質画分の除去後にアッセイ溶液中に残っ
ている標識の量を測定することによって間接的に確認することができ、これはRS
V G-タンパク質に結合した量と反比例する。
【００９８】 別の実施形態では、競合結合アッセイは、標識化アネキシンIIの代わりに標識
化L-セレクチンを使用すること、または標識していないアネキシンIIまたはL-セ
レクチンとともに標識化RSV G-タンパク質を使用することを含み得る。標識して
いない成分に結合した標識化成分の量は、上記の方法によって測定することがで
きる。候補物質の不在下での結合と比較した、候補物質の存在下での標識化成分
の結合の減少は、候補物質が標識していない成分への標識化成分の結合を阻害し
ており、RSV感染症の予防または治療における使用に適している可能性があるこ
とを示すものである。
【００９９】 競合結合アッセイ系では、標識されていないアネキシンII、L-セレクチンまた
はRSV G-タンパク質は、固体担体に固定化されていてもよく、溶液中に存在して
もよい。固定化されたアネキシンII、L-セレクチンまたはRSV G-タンパク質の使
用には、結合反応の完了後、溶液を固体担体から単に除去することによって、結
合したアネキシンII／RSV G-タンパク質またはL-セレクチン／RSV G-タンパク質
複合体を、溶液中に残っている標識化アネキシンII、L-セレクチンまたはRSV G-
タンパク質から分離できるという利点がある。一方、生成物がアッセイ中に固定
化されず、むしろ溶液中に存在する場合、一般的には、標識の量を測定する前に
、結合したアネキシンII／RSV G-タンパク質またはL-セレクチン／RSV G-タンパ
ク質複合体を、複合体を形成していない標識化アネキシンII、L-セレクチンまた
はRSV G-タンパク質から分離するための手段を講じておく必要がある。そのよう
な分離は、例えば、複合体に対する抗体を用いて複合体を沈降させることによっ
て、または非特異的沈降技術を用いることによって行うことができる。
【０１００】 本明細書に記載された方法またはアッセイで使用するのに適した標識としては
、放射性同位体、例えば125I、35S、32P、酵素、抗体、ポリヌクレオチドおよび
ポリペプチド、例えばビオチンが挙げられる。
【０１０１】 さらなる実施形態では、競合結合アッセイは、２種の標識されていない成分を
使用する。その一つは固体担体に固定化され、例えばRSV G-タンパク質が固体担
体に固定化され、アネキシンIIは溶液中に存在しうる。結合反応が完了したら、
結合したアネキシンII／RSV G-タンパク質複合体は、固体担体から溶液を除去す
ることによって、溶液から分離することができる。結合したアネキシンIIの量は
、アネキシンIIに特異的な抗体を使用して測定することができる。
【０１０２】 様々なタイプの上記のアッセイを使用することで、本明細書に挙げたいずれか
の２つの物質間の結合を測定することができる。
【０１０３】 アネキシンIIまたはL-セレクチンへのRSV G-タンパク質の結合に拮抗する生成
物は、上記の方法においてアネキシンIIまたはL-セレクチンと結合しているRSV
G-タンパク質の測定可能な減少をもたらすものである。好ましい生成物は、アネ
キシンまたはL-セレクチンと結合しているRSV G-タンパク質を、生成物濃度１μ
g ml-1、10μg ml-1、100μg ml-1、500μg ml-1、１mg ml-1、10 mg ml-1、ま
たは100 mg ml-1にて、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少
なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも
80％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％減少させるもの
である。阻害率は、被験物質の存在下および不在下でのアッセイの比較における
結合の減少率である。上記の阻害率の程度と阻害剤の濃度の比較を利用して、本
発明の阻害剤を特定することができ、低濃度でより大きな阻害を示すものが好ま
しい。
【０１０４】 本発明は、アネキシンIIまたはL-セレクチンの細胞表面レベルの減少をもたら
す生成物を同定する方法であって、細胞または細胞抽出物に候補物質を供給し、
該候補物質が細胞の表面におけるレベルの減少をもたらすかどうかを確認するこ
とを含む方法も提供する。細胞は、本明細書に記載した細胞のような、アネキシ
ンIIまたはL-セレクチンを発現する細胞であればどれでもよい。
【０１０５】 生成物は、アネキシンIIまたはL-セレクチンの発現を阻害しうる。したがって
、本発明は、アネキシンIIまたはL-セレクチンの発現を阻害する生成物を同定す
る方法であって、アネキシンIIまたはL-セレクチンの発現経路における１種以上
の成分、またはこれらの成分の機能的類似体に候補物質を供給し、 (i) 該候補物質がアネキシンIIまたはL-セレクチンの発現を促進する成分に結
合するかどうかまたは該成分を阻害するかどうか、あるいは (ii) 該候補物質がアネキシンIIまたはL-セレクチンの発現を阻害する成分を
刺激するかどうか、 を確認することを含む方法を提供する。
【０１０６】 「成分」という用語は、天然の成分またはその機能的類似体を含む。
【０１０７】 したがって、生成物は、該成分に候補物質を供給し、候補物質が該成分に結合
するかどうかを確認することによって同定できる。上記のフォーマットのような
任意の適当な結合アッセイフォーマットを使用できる。
【０１０８】 別の実施形態では、生成物は、候補物質の該成分への供給を、該成分を活性に
する条件下で行い、候補物質が該成分の活性を阻害または刺激するかどうかを確
認することによって同定される。
【０１０９】 一般に、本発明の方法で使用される細胞発現経路の成分は、アネキシンIIまた
はL-セレクチンの発現に特異的であるか、実質的に特異的である。典型的には、
本発明の方法においては、下記成分の１種以上が使用される：アネキシンIIもし
くはL-セレクチンプロモーター、アネキシンIIもしくはL-セレクチンプロモータ
ーに結合するかまたは該プロモーターからの発現に影響を及ぼす転写因子、アネ
キシンIIもしくはL-セレクチン遺伝子からmRNAを発現させ得るRNAポリメラーゼ
、アネキシンIIもしくはL-セレクチンmRNAに結合するかおよび／または核から細
胞質にアネキシンIIもしくはL-セレクチンmRNAを輸送する核因子、アネキシンII
もしくはL-セレクチンmRNAのアネキシンIIもしくはL-セレクチンタンパク質への
翻訳に寄与する翻訳因子、またはアネキシンIIもしくはL-セレクチンタンパク質
に結合するかおよび／またはアネキシンIIもしくはL-セレクチンタンパク質を細
胞表面に輸送する因子。
【０１１０】 上記成分のいずれかの機能的類似体を本発明の方法で使用してもよい。類似体
は天然成分の関連活性の一部または全部を有する。典型的には、類似体は天然成
分の断片を含む。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである成分の場合、類似
体は一般に天然成分と相同性を有する。
【０１１１】 当該成分は、細胞から得られ得る。したがって該成分は、細胞、典型的には該
成分が組換え発現されるか天然で発現される組換えまたは天然細胞の内部に存在
し得る。該成分は細胞抽出物の形態で提供されてもよく、あるいは細胞抽出物か
ら精製されていても、部分精製されていてもよい。典型的には、該成分はヒト細
胞中にあるか、ヒト細胞由来のものであり、ヒト細胞は例えばアネキシンIIまた
はL-セレクチンを発現する細胞である。
【０１１２】 細胞は、哺乳動物細胞、例えば霊長類細胞または齧歯類細胞、具体的にはマウ
スまたはラット細胞であってよい。
【０１１３】 アネキシンIIまたはL-セレクチン発現経路の細胞成分は、当業者に公知である
か、または当業者であれば容易に得ることができる。それらは、例えばアネキシ
ンIIもしくはL-セレクチン、またはアネキシンIIもしくはL-セレクチンmRNAに結
合する能力に基づいて、細胞から精製され得る。
【０１１４】 アネキシンIIまたはL-セレクチンの転写を阻害する生成物は、 (i)mRNAの形態で発現される第２のポリヌクレオチド配列に機能的に連結された
アネキシンIIまたはL-セレクチンプロモーター活性を有する第１のポリヌクレオ
チド配列を含む試験構築物を得ること； (ii)候補物質を、該物質の不在下では該第２のポリヌクレオチド配列がmRNAの形
態で発現されるような条件下で該試験構築物と接触させること；および (iii)該物質が構築物からの発現を阻害するか否かを決定すること、 を包含する方法において同定できる。
【０１１５】 また、アネキシンIIまたはL-セレクチンmRNAの転写を阻害する生成物は、 (i)コード配列に機能的に連結されたアネキシンIIまたはL-セレクチンプロモー
ター活性を有するポリヌクレオチド配列を含む試験構築物を得ること； (ii)候補物質を、該物質の不在下では該コード配列にコードされたポリペプチド
が発現されるような条件下で該試験構築物と接触させること；および (iii)該物質が構築物からの発現を阻害するか否かを決定すること を包含する方法においても同定できる。
【０１１６】 アネキシンIIまたはL-セレクチンプロモーター活性を有するポリヌクレオチド
は、 (i)ヒトもしくは動物アネキシンIIもしくはL-セレクチンプロモーターの配列； (ii)(i)と相同性を有する配列；または (iii)(i)もしくは(ii)の断片である配列、 を含み得る。
【０１１７】 配列(i)は、通常、霊長類またはげっ歯類(典型的にマウスまたはラット)アネ
キシンIIまたはL-セレクチンプロモーターなどの哺乳動物アネキシンIIまたはL-
セレクチンプロモーターである。一般的に、(i)は、アネキシンIIまたはL-セレ
クチン遺伝子の少なくともヌクレオチド-500〜-1、典型的に-300〜-1を含む(数
字は転写開始部位に基づく)。
【０１１８】 典型的に、ポリヌクレオチドは、転写因子またはRNAポリメラーゼと結合する(
i)に存在する配列、あるいはまたこれらの配列の代わりに、同じ転写因子および
RNAポリメラーゼと結合できる配列の相同体を含む。典型的に、このような配列
またはそれらの相同体は、(i)と同じ順番および/または実質的に同じ相対間隔で
ポリヌクレオチドに存在する。
【０１１９】 一般的に、本方法は、試験化合物の不在によって核酸からコード配列の発現が
生じる条件下で実施される。核酸はまた、アネキシンIIまたはL-セレクチン遺伝
子の他の非転写または非翻訳領域を含んでいてもよい。コード配列は、典型的に
、発現のリポーターとして作用できるタンパク質をコードする。アッセイは、該
核酸を含む細胞において実施してもよい。物質を任意の他の公知のプロモーター
と共に試験して、試験物質が遺伝子発現の全般的なインヒビターである可能性を
試験してもよい。
【０１２０】 任意のリポーターポリペプチド、例えばルシフェラーゼ、GUS、またはGFPを使
用してもよい。ルシフェラーゼは、化学発光を検出することによりアッセイされ
る。GUSは、例えば5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-グルクロン酸(glucor
onic acid)(X-gluc)または4-メチルウンベリフェリル-β-グルクロニド(MUG)な
どの適切な物質の加水分解を測定することによりアッセイされる。MUGの加水分
解により、蛍光測定できる生成物が産生される。GFPは、494nmでの励起後、590n
mにおいて蛍光を測定することにより定量される。これらの方法は当業者に周知
である。
【０１２１】 あるいはまた、コード配列はアネキシンIIもしくはL-セレクチンコード配列そ
のもの、または該配列の断片であってもよい。アネキシンIIまたはL-セレクチン
の発現は、例えば、ノーザン/RNAブロッティング、ウェスタン/抗体ブロッティ
ング、RNA in situハイブリダイゼーション、または免疫学的局在決定により測
定され得る。
【０１２２】 本発明の生成物は、実質的に単離された形態で存在し得る。生成物を、該生成
物の意図する目的を妨害せず、かつ実質的に単離されていると見なされる担体ま
たは希釈液と混合してもよいことが理解されるだろう。本発明の生成物はまた、
実質的に精製された形態であってもよく、この場合には通常、ポリペプチドまた
は調製物の乾燥質量の少なくとも90％(例えば、少なくとも95％、98％もしくは9
9％)を含むであろう。
【０１２３】 上記方法において試験され得る適切な候補物質としては、RSV G-タンパク質、
アネキシンIIまたはL-セレクチンに特異的な抗体生成物(例えば、モノクローナ
ルおよびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、およびCDRグラフティ
ングされた抗体)が挙げられる。さらに、コンビナトリアルライブラリー、定義
された化学同一性(chemical identities)、ペプチドおよびペプチド模倣体、オ
リゴヌクレオチド、ならびにディスプレイライブラリー(例えば、ファージディ
スプレイライブラリー)などの天然型生成物ライブラリーも試験され得る。候補
物質は化学化合物であってもよい。候補物質のバッチを、例えば１回の反応につ
き10の物質を用いる最初のスクリーニングに用いて、そして阻害を示す物質のバ
ッチを個別に試験してもよい。
【０１２４】 本発明の生成物は、RSV G-タンパク質、アネキシンII、またはL-セレクチンの
間の結合を阻害できる抗体であってもよい。本明細書に記載する任意の物質に対
する抗体は、以下の方法により生成できる。物質に対する抗体は、宿主動物にお
いて物質全体またはその抗原性エピトープ(以下、「免疫原」)に対して抗体を生じ
させることにより生成され得る。モノクローナルおよびポリクローナル抗体の生
成方法は周知である。免疫原は、RSV G-タンパク質、アネキシンII、またはL-セ
レクチン(本明細書で言及するこれらのタンパク質の誘導体を含む)を含み得る。
【０１２５】 ポリクローナル抗体の生成方法は、適切な宿主動物(例えば実験動物)を免疫原
で免疫化すること、および血清から免疫グロブリンを単離することを包含する。
つまり、動物を免疫原で接種し、その後動物から血液を採取し、IgG画分を精製
する。
【０１２６】 モノクローナル抗体の生成方法は、所望の抗体を生成する細胞を不死化させる
ことを包含する。接種された実験動物から得た脾臓細胞を腫瘍細胞と融合させる
ことにより、ハイブリドーマ細胞を生成してもよい(KohlerおよびMilstein, Nat
ure 256, 495-497, 1975)。
【０１２７】 所望の抗体を生成する不死化細胞は、従来の方法により選択され得る。ハイブ
リドーマを、培養液中で成長させるか、腹腔内に注射して腹水を形成するか、ま
たは同種宿主または易感染性(immunocompromised)宿主の血流に注射してもよい
。ヒト抗体は、ヒトリンパ球のin vitro免疫化、その後のエプスタイン-バーウ
イルスでのリンパ球の形質転換により調製され得る。
【０１２８】 モノクローナルおよびポリクローナル抗体の両方の生成のために実験動物は、
ヤギ、ウサギ、ラット、またはマウスが適している。所望であれば、免疫原は、
例えばアミノ酸残基の１つの側鎖を介して免疫原が適切な担体にカップリングさ
れたコンジュゲートとして投与され得る。担体分子は、典型的に生理学的に許容
される担体である。得られる抗体は、単離してもよいし、所望であれば精製され
てもよい。
【０１２９】 RSV感染の予防または治療に適した抗体は、本発明の方法により同定され得る
。
【０１３０】 本明細書に記載する任意のポリペプチド(例えばアネキシンIIまたはL-セレク
チン)の模倣体(または誘導体)は、典型的に、元のポリペプチドと相同なポリペ
プチドである。あるいはまた、模倣体は、相同でないポリペプチドであるか、非
ポリペプチド物質であり得る。典型的に物質の模倣体は、物質と結合可能な特異
的な抗体と結合する。典型的にアネキシンIIの模倣体はRSV G-タンパク質と結合
する能力を有し、RSV G-タンパク質の模倣体はアネキシンIIと結合する能力を有
する。模倣体は、典型的に、元の物質と実質的に同様の形、大きさ、フレキシビ
リティー、または電子配置を有する。これは、典型的に元の物質の誘導体である
。
【０１３１】 典型的に、別のポリペプチドと相同であるポリペプチドは、該ポリペプチドと
少なくとも70％相同、好ましくは少なくとも80％もしくは90％、より好ましくは
少なくとも95％、97％もしくは99％相同である。このような相同性は、少なくと
も15、好ましくは少なくとも30、例えば少なくとも40、60または100以上の連続
したアミノ酸の領域にわたり存在し得る。ポリペプチド相同性の測定方法は、当
技術分野で周知である。このような相同性は、アミノ酸同一性に基づいて計算さ
れ得る。UWGCGパッケージは、例えばデフォルトの設定で、相同性を計算するの
に使用できるBESTFITプログラムを提供する(Devereuxら (1984) Nucleic Acids
Research 12, p387-395)。
【０１３２】 相同ポリペプチドは、典型的に、置換、挿入または欠失(例えば１〜５、６〜1
0、または10〜20以上の置換、欠失または挿入)により異なる。置換は、「保存的」
であることが好ましい。これらは、以下の表に従って定義される。２列目の同じ
ブロック内にあるアミノ酸、好ましくは３列目の同じ行にあるアミノ酸が互いに
置換され得る：
【０１３３】 アネキシンIIもしくはL-セレクチンとRSV G-タンパク質との結合を阻害するこ
と、アネキシンIIもしくはL-セレクチンの発現もしくは活性を阻害すること、ま
たは細胞内もしくは細胞表面でのアネキシンIIもしくはL-セレクチンのレベルを
低減させることが上記スクリーニング法において見とめられた生成物は、RSV感
染を治療または予防するために使用できる。従って、RSVを患う患者の症状は、
このような生成物を投与することにより改善できる。治療上有効量のこのような
生成物を、それを必要とするヒト患者に与え得る。
【０１３４】 RSV感染を予防または治療するのに使用される生成物の処方は、同定される物
質の性質などの要素に依存するであろう。典型的に、生成物は、製薬上許容しう
る担体または希釈液と使用されるように処方される。例えば、それは局所、非経
口、吸入、鼻腔内、静脈内、筋内、皮下、経皮、または経口投与のために処方さ
れ得る。処方は、エーロゾルまたは噴霧器を使用した投与に適していることが好
ましい。医師は、それぞれの特定の患者に対して必要な投与経路を決定できるで
あろう。製薬上の担体または希釈液は、例えば等張性溶液であり得る。
【０１３５】 生成物の用量は、様々なパラメーターに応じて、特に使用する物質；治療する
患者の年齢、体重および症状；投与経路；ならびに必要な養生法に応じて決定さ
れ得る。しかし、適切な用量は、体重１kg当たり0.1〜100mg(例えば体重１kg当
たり1〜40mg)であり得る。ここでも、医師は、任意の特定の患者に対する必要な
投与経路及び用量を決定できるであろう。
【０１３６】 上述したように、本発明の生成物は、組換え複製可能ベクターの形態であり得
るポリヌクレオチドからin vivoで発現され得る。
【０１３７】 ポリヌクレオチドは、一般的に、ポリヌクレオチドの転写をもたらすことがで
きる制御配列に機能的に連結された生成物をコードする配列を含む。制御配列は
、プロモーターを含み得る。「機能的に連結された」という用語は、記載する成分
が、それらが意図する様式で機能するような関係で並置されていることを指す。
【０１３８】 ベクターは、例えば、典型的に複製起点を含むプラスミドまたはウイルスベク
ターであり得る。ベクターは、RSVに感染し得る本明細書中で言及するような任
意の細胞型などの特定の細胞型にポリヌクレオチドを送達できるものであり得る
。
【０１３９】 ポリヌクレオチドは、裸の(naked)核酸構築物として直接投与され得る。哺乳
動物細胞による裸の核酸構築物の摂取は、いくつかの公知のトランスフェクショ
ン技法(例えばトランスフェクション剤の使用を含む)により増強される。これら
の薬剤の例としては、陽イオン剤(例えばリン酸カルシウムおよびDEAE-デキスト
ラン)、ならびにリポフェクタント(lipofectant)(例えばリポフェクタム(lipofe
ctam)(登録商標)およびトランスフェクタム(transfectam)(登録商標))が挙げら
れる。
【０１４０】 以下の実施例により本発明を説明する。試薬の入手元は以下の通りである。
【０１４１】 使用した抗L-セレクチンモノクローナル抗体は、TQ1(サブタイプIgG1；Coulte
r Immunology, Coulter Corporation, Hialeah, FL 33010)、LAM 1-3およびDreg
56である。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)-コンジュゲートブタ-抗ウサギIg
G(カタログ番号 p217；ロット番号111)はDako-Immunoglobulin, Denmarkから入
手した。マンナンおよびフコイダンは、Sigma, UKから得た。1,6-ビス-[3-(3-カ
ルボキシメチルフェニル)-4-(2-α-D-マンノピラノシルオキシ)フェニル]ヘキサ
ン、二ナトリウム塩の構造を図２ａに示す。マンナンおよびフコイダンは、Sigm
a, UKから得た。抗His抗体(クローンHis-1；カタログ番号H 1029)および対応す
る対照抗体マウスIgG2a(カタログ番号 M9144)は両方ともSigma(Dorset, U.K.)か
ら入手した。抗ヒトアネキシンII抗体(クローン LC148；カタログ番号0590-5066
)は、Cambridge Bioscience(Cambridge, U.K.)から入手し、対応する対照抗体マ
ウスIgG1はCoulter(Buckinghamshire, U.K.カタログ番号6602872)から入手した
。
【０１４２】実施例１ RSV-感染性への複合炭水化物の影響 本発明者らは、下記の２つの異なるタイプの複合炭水化物を、RSV-感染性の可
溶性阻害剤の可能性のあるものとして使用した：硫酸化フコースのポリマーであ
り、著しく負に帯電したフコイダン(fucoidan)、およびマンノースのポリマーで
あり、中性の炭水化物であるマンナン。
【０１４３】 RSVのヒトA2株のストック(stocks)を、Hep2細胞（ECACC第85020207号）の単層
中で増殖させ、ドライアイスおよびメタノール中ですばやく凍結させ、-70℃で
貯蔵した。ウイルスストックを、以下に記載する蛍光フォーカスアッセイ(fluor
escent focus assay)を用いて、感染性についてアッセイし、力価を、1ml当たり
のフォーカス形成単位(ffu/ml)として表した。
【０１４４】 RSVを培地（2%子牛胎児血清、2mMのグルタミンおよび抗生物質を補ったEMEM）
で希釈して、約1x104ffu/mlを与えた。精製レクチンの段階希釈物（100μl）ま
たは炭水化物の段階希釈物（100μl）を、0.4mlのRSV懸濁液に加えた。陽性対照
として、100μlの緩衝液のみを、0.4mlのウイルスのアリコートに添加した。50
μlの各試料を、平底96ウェルプレート中の集密的なHep2細胞の３つの(triplica
te)ウェルに添加した。培地のみを含む３つのウェルを陰性対照としてインキュ
ベートした。プレートを37℃にて90分間インキュベートして、ウイルスを細胞表
面に吸収させ、次いでさらに150μlの培地をあらゆるウェルに添加した。プレー
トを37℃にて24時間インキュベートして、ウイルス複製を完全に一巡させた。
【０１４５】 細胞をPBSで洗浄し、PBS中の75％冷アセトン(v/v)で固定した。Hep2細胞単層
を、0.1％(v/v)Tween20および10％(v/v)FCSを含有するPBS(PBS/T20)中のマウス
抗RSVモノクローナル抗体プール（Novacastra Ltd., Newcastle-upon-tyne, UK
）の1/100希釈物の25μlと共に30分間インキュベーションすることによって、蛍
光フォーカスのために染色した。PBS/T20中で洗浄後、ウェルを、フルオレセイ
ン-結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Dako）の1/20希釈物の25μlと共にインキ
ュベートした。細胞を洗浄し、PBS中の0.1％(w/v)ナフタレンブラックと共に10
分間対比染色した。各ウェル中の蛍光を発する細胞数を数えた。
【０１４６】 図１に示された結果は、フコイダンがRSV感染性の良好な阻害剤であることを
示す。マンナンはRSV感染性への影響を示さなかった。これらの結果は、RSVのHe
p2細胞への結合に関わる宿主細胞レクチンが、L-セレクチンと同様の特性を有す
ることを示す。
【０１４７】 Hep2細胞上のRSV受容体がL-セレクチンと同様であることをさらに確立するた
めに、可溶性L-セレクチン、可溶性E-セレクチンまたは低分子量のパン-セレク
チンアンタゴニスト（図2a）を相互作用の可能性のある阻害剤として用いて、上
記したRSV感染性実験を繰り返した。図2bに示されたデータは、試験した最高濃
度（15μg/ml）で、可溶性L-セレクチンが73％だけRSV感染性を阻害し、それに
対して、E-セレクチンはより高い濃度（50μg/ml）でさえ、効果がなかったこと
を示す。RSV感染を妨げることが先に示された（図１）フコイダンはL-セレクチ
ンの有効な阻害剤であるが、E-セレクチンには効果がないことに注目すべきであ
る。さらには、低分子量のセレクチンアンタゴニストである化合物Aは、多分RSV
と宿主細胞との相互作用を妨げることによって、有効な抗ウイルス活性（IC50約
8μg/ml；9μM）を有していた。
【０１４８】実施例２ L-セレクチンのRSV G-タンパク質への結合 L-セレクチンがRSV G-タンパク質と直接相互作用できることを確立するために
、精製したG-タンパク質をマイクロタイタープレート上に固定化するアッセイを
設計した。膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを欠くが、タンパク質AのZ
Z-ドメインを有するC-末端キメラを含む組換えヒトセレクチン（セレクチン-ZZ'
と称される）を、Malhotraらによって記載された方法(1997)により発現し、IgG-
アフィニティクロマトグラフィーによって精製した。ZZドメインはヒトIgGに固
く結合する。
【０１４９】 マイクロタイタープレートのウェル（Maxisorb、NUNC、Denmark）を、50mM-重
炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.6）中のイムノアフィニティ精製したG-タンパク質
（5μg/ml；100μl）または抗体（100μg/ml；100μl）を用いて、周囲温度で16
時間コーティングした（Malhotraら、1997）。非特異的結合部位を、10mMのTris
/HCl緩衝液（pH7.4）中のTween20（1％v/v）を用いて、周囲温度で２時間ブロッ
クした。L-セレクチン-ZZを、競合物質の存在下または不在下で、コーティング
したウェルの、2mMのCaCl2または2mMのEDTA、0.1％(v/v)のTween20およびHRP-結
合したIgG（1/500希釈物）を含む10mMのTris/HCl緩衝液（pH7.4）中に添加した
。プレートを周囲温度で２時間インキュベートした。徹底的に洗浄後、結合した
セレクチン-ZZ-IgG複合体の量を、HRP基質であるO-フェニレンジアミンジヒドロ
クロリド（Fast enzyme system; Sigma, cat.no. P-9187）を添加することによ
って決定した。５分後に3MのHClにて反応を止め、A490を測定した。
【０１５０】 図３は、L-セレクチンがRSV G-タンパク質と直接結合することを示す。L-セレ
クチン-ZZのG-タンパク質への結合はCa2+依存性であり、フコイダンおよび抗L-
セレクチン抗体TQ1によって阻害される。これらの特性は、G-タンパク質が、L-
セレクチン内の炭水化物認識ドメイン(CRD)に結合していることを示唆する。
【０１５１】 直接結合または阻害実験に基づいて、L-セレクチンが、Ca2+-イオンの存在下
で、フコシル化されシアリル化されたオリゴ糖の硫酸化形態、例えば硫酸化シア
リル-ルイスx（sLex,NeuAcα2-3、Galβ1-4（α1-3Fuc）GlcNAc）に結合するこ
とができることが示された。L-セレクチンはまた、硫酸化多糖、例えばヘパラン
硫酸およびデキストラン硫酸ならびに、スルファチド、カルジオリピンおよびリ
ポ多糖(LPS)に結合することが報告されている（RosenおよびBertozzi(1996)；Ma
lhotraおよびBird(1997)）。L-セレクチンのRSV G-タンパク質への結合に必要と
される多糖についてさらに情報を得るために、本発明者らは、精製G-タンパク質
のシアリダーゼまたはヘパリナーゼまたはマンノシダーゼでの前処理の、上記し
た方法を用いて固定化したリガンドへのL-セレクチンの結合に対する効果につい
て研究した。図４に示されているように、G-タンパク質のヘパリナーゼ（図4B）
での前処理（シアリダーゼまたはマンノシダーゼ（図4A）での前処理ではなく）
は、L-セレクチンのG-タンパク質のヘ結合を減らした。ヘパリナーゼによるL-セ
レクチンのG-タンパク質への結合の減少は、予備インキュベーション緩衝液で使
用した酵素の濃度に依存性であった。
【０１５２】 因子Hをシアリダーゼ消化の対照として使用した。というのは、因子Hのシアリ
ダーゼ処理はL-セレクチンへのその結合を減少させることが先に示されたからで
ある（Malhotraら；1999）。ここで示された結果は、L-セレクチンと G-タンパ
ク質との間の主な相互作用は、G-タンパク質によって発現されるヘパリン様の構
造によって仲介されることを示す。
【０１５３】実施例３ 抗L-セレクチン抗体のHep2細胞のRSV感染性への影響 L-セレクチンは、白血球の細胞表面上に構成的に発現されるが、上皮細胞また
は例えばHep2細胞のような細胞系統上に発現されるとは考えられない。本発明者
らの結果は、Hep2細胞上の受容体は、L-セレクチンとは別個のレクチンであるが
、同様の炭水化物結合特性を有することを示す。公知の抗L-セレクチン抗体のい
ずれがRSV感染性への効果を有するかどうかを試験するために、幾つかの抗体を
、RSVin vitro感染性アッセイにおいて試験した。図５は、TQ1が、阻害活性を有
する唯一の抗L-セレクチン抗体であり、それに対して他の抗L-セレクチン抗体LA
M1-3およびDreg56（結果は示されていない）、抗P-セレクチン抗体または対照抗
体は、RSV感染性の有意な阻害を示さなかったことを示す。さらには、Hep2細胞
のTQ1抗体での免疫染色は、Hep2細胞におけるTQ1エピトープの発現を示した。TQ
1エピトープの発現は、RSV感染したHep2細胞において増加された。
【０１５４】実施例４ Hep2細胞からのRSV結合分子の精製 フコイダンおよびL-セレクチン特異的抗体TQ1の両方がRSV感染性を阻害するこ
とが示されたので、本発明者らはこれらの試薬を用いて、Hep2細胞からRSV結合
種の可能性のあるものを分離し、かつ特性決定した。
【０１５５】 マイクロタイタープレートのウェルを、100mMの重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐH
9.6）中のフコイダン（500μg/ml；200μl／ウェル）、TQ1、ウシ血清アルブミ
ン、または対照抗体（イソタイプ対照）でコーティングした。非特異的結合部位
を、5mMのCaCl2および1%のTween20を含む10mMのTris/HCl（pH7.4）を用いてブロ
ックした。Hep2細胞（1x107細胞）を、5mMのCaCl2、1%NP40およびプロテアーゼ
阻害剤カクテル（Sigma）を含む10mMのTris-HCl（pH7.4）の10mlの溶解緩衝液に
、４℃にて４時間、懸濁させた。細胞溶解物を遠心分離し、上清を、ウェル当た
り200μlにてフコイダンでコーティングしたマイクロタイタープレートのウェル
に入れた。2mMのCaCl2を含む10mMのTris/HCl緩衝液（pH7.4）で徹底的に洗浄し
た後、フコイダンに結合した物質を、10mMのEDTAを含む10mMのTris/HCl緩衝液（
pH7.4）で溶出した。EDTA-溶出液を濃縮し、最終体積1ml まで、5mMのCaCl2を含
む10mMのTris/HClに対して透析した。
【０１５６】 得られた溶液の２分の１を50μlまでさらに濃縮し、SDS-PAGE（8-16%ゲル）に
加えた。分子量50kDaおよび100kDaの２つの主なバンドが見られた。フコイダン
結合画分中に存在するが、対照画分には存在しないタンパク質バンドを切り出し
、マススペクトル法およびナノ-スプレー（以下参照）によってさらに分析した
。残留する濃縮タンパク質を、2mMのCaCl2を含む10mMのTris/HCl緩衝液（pH7.4
）に対して透析し、抗アンネキシンII抗体（100μg/ml；100μl）または抗L-セ
レクチン抗体でコーティングしたウェル、TQ1（100μg/ml；100μl）またはイソ
タイプ対照抗体（100μg/ml；200μl）と共に１晩再インキュベートした。抗体
結合物質を、SDS-PAGE試料緩衝液で溶出した。溶出したタンパク質をSDS-PAGEに
より分析し、以下のようにしてさらに特性決定した。
【０１５７】 興味あるタンパク質バンドを、Wilmら（1996）により公開された方法に従って
、Coomassie染色ゲルから切り出し、還元し、アルキル化し、そしてトリプシン
で消化した。ゲル片を切り出し、アセトニトリル中での脱水により収縮させた。
アセトニトリルを除去し、ゲル片を減圧遠心分離で乾燥した。乾燥ゲル片を、50
mMの重炭酸アンモニウム（pH8.5）、5mMのCaCl2および12.5μg/mlトリプシンか
らなる消化緩衝液（Boehringer Mannheim, 配列決定等級）（10μl）中に再膨潤
させた。37℃にて１晩消化を進めた。トリプシンでの消化の後、得られた幾つか
のペプチドを、100mMの重炭酸アンモニウム（2x50μl）およびアセトニトリル（
2x50μl）、次いで50%メタノール中の5%ギ酸（2x50μl）を用いて抽出した。各
工程は、効率的な抽出を促進させるために10分間渦巻混合を含んでいた。次に、
試料を遠心分離した後、液体を除いてラベルを貼った管に入れた。次に、各試料
から得られた抽出物をまとめて、遠心エバポレーターを用いて乾燥した。
【０１５８】 タンパク質消化物から得られた乾燥抽出物を、5%メタノールを含む5%ギ酸（10
μl）に再溶解させた。アリコート（0.4μl）を、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮
酸およびニトロセルロースで予備コーティングしたステンレス鋼の標的にスポッ
トした。標的を風乾した後、1%水性トリフルオロ酢酸(TFA)（2μl）で洗浄した
。過剰の洗浄溶液を吹き飛ばし、標的を圧縮空気を用いて乾燥した。337nm窒素
レーザーを装備したTofSpec SE装置（Micromass, Manchester, UK）を用いて、M
ALDIマススペクトルを得た。マトリックス-関連イオンシグナル（質量／電荷(m/
z)1060.10）およびトリプシン自己消化ペプチド（m/z 2163.057）を用いて、マ
ススペクトルを較正した。１同位体質量を各ペプチドに割当て、これらを「ペプ
チド質量地図」（Jensenら、1997）としてひとまとめに使用して、インハウス(i
n-house)非重複タンパク質配列データベースを検索した。このデータベースは目
下、200,000より多いエントリーを含み、PeptideSearch（商標）ソフトウェア（
Mannら、1993）を用いて検索された。タンパク質の起源の種において、その等電
点に、制限が置かれず、０〜300kDaのタンパク質質量範囲が可能であった。
【０１５９】 試料の残余を、少量のPOROS R2樹脂（PerSeptive Biosystems）を含む、引き
伸ばした(pulled-out)ガラスキャピラリーを用いて脱塩した。次に、ペプチドを
、50%メタノール中の1%ギ酸（2μl）を用いて、ナノスプレー針へ直接溶出した
。nanoES源（WilmおよびMann、1996）を装備したPE-Sciex API III Ionspray（
商標）マススペクトロメーター（PE-Sciex、Thornhill、ON、カナダ）を用いて
、幾つかのペプチドについてタンデムMS/MSマススペクトルを得た。MS/MS方式に
おいては、第１四重極を用いて前駆体イオンを選択し、この前駆体イオンは次に
、アルゴン気体分子での衝突により断片化が誘発される衝突セルへと進められる
。衝突のエネルギーは典型的には、前駆体イオンの質量および電荷に依存して、
30-60eVである。主鎖結合の開裂により形成されるイオンは、電荷がN-末端断片
に保持されるならa、b、cと呼ばれ、電荷がC-末端断片に存在するならx、y、zと
呼ばれる（Mannら、1993による命名）。高質量生成物イオン（２重または３重に
帯電した前駆体イオンについてm/z値より上の第３の四重極を走査することによ
って観察される）はしばしば、一連のy''イオンの一部である（BonnerおよびShu
shan、1995）。y''イオンのパターンから、部分的アミノ酸配列を決定すること
ができる。これは、配列を括弧に入れる質量と共に、ペプチド・シーケンス・タ
グ(Peptide Sequence Tag)（MannおよびWilm、1995）を形成し、これはペプチド
、故にタンパク質の同一性を確認するために使用された。
【０１６０】 50kDaのタンパク質からの16ペプチドおよび100kDaのタンパク質からの10ペプ
チドのDE-MALDIスペクトルデータは、それぞれアネキシンIIおよびヌクレオリン
との100％一致を示した。この分析およびナノスプレー技術を用いたペプチドの
さらなる配列決定から、明らかな50kDaのMrを有するタンパク質はヒトアネキシ
ンIIであり、100kDaのタンパク質はヌクレオリンであることを確認した。
【０１６１】実施例５ Hep2細胞上でのアネキシンIIおよびTQ1エピトープの発現 Hep2細胞でのアネキシンIIの発現を、抗アネキシンII抗体を用いて確立し、細
胞表面発現を、発現パターンの共焦分析によって確立した。RSV感染したHep2細
胞および対照のHep2細胞のスライドをリン酸緩衝生理食塩水ですすぎ、4%パラホ
ルムアルデヒド中で15分間インキュベートすることにより固定した。スライドを
リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、必要とされるまで４℃で貯蔵した。
【０１６２】 RSV-感染したHep2細胞および対照のHep2細胞のスライドを、アネキシンIIに対
する特異的抗体、L-セレクチン対する特異的抗体(TQ1)または対照抗体と共に、
リン酸緩衝生理食塩水中でインキュベートすることによって、免疫細胞化学反応
を行った。徹底的に洗浄後、スライドをFITCまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ
(HRP)-結合２次抗体で処理した。HRP-結合スライドを、酵素について特異的な基
質を用いて展開し、対比染色し、光学顕微鏡下で調べた。蛍光標識した細胞を、
ヨウ化プロピジウムを含むVectashieldを用いて封入し(mountanted)、蛍光顕微
鏡を用いて調べた。
【０１６３】 RSV感染細胞は、非感染細胞より高いアネキシンIIの発現を示した。この発現
パターンは、抗L-セレクチン抗体TQ1を用いて観察されたものと同様である。イ
ソタイプ対照抗体または他の抗L-セレクチン抗体は、Hep2細胞の染色を示さず、
このことはTQ1がHep2細胞上のエピトープを認識していることを示すものであり
、L-セレクチンに存在するものとは別個である。共焦点顕微鏡は、感染細胞にお
けるアネキシンIIの発現が細胞表面と主に関連することを示した。
【０１６４】実施例６ アネキシンIIのクローニング、発現および結合特性 アネキシンIIのRSV G-タンパク質への結合特性をさらに確立するために、本発
明者らは、Hajjarら（1996)に記載された方法によってアネキシンIIのクローニ
ングおよび発現を開始した。簡単に述べると、全長cDNAアネキシンIIを構成する
イメージクローン(Image clone)をHinxton Hall(Cambridge, U.K.)から入手し、
Pfuポリメラーゼおよび26マーのオリゴヌクレオチド順方向および逆方向プライ
マーを用いたPCRによって増幅した。プライマーは、アネキシンII配列における
塩基52-66および1052-1066にそれぞれ対応する、 5'-GGTCGGGATCCGTCTACTACTGTTCACGA-3'および 5'-AAAAACTCGAGGTCATCTCCACCACA-3' であった。5' Bam HIおよび3' Xho I制限部位を構築物に導入し、哺乳動物の開
始(ATG)および終止(TGA)コドンを除去した。Qiagenキット（California, USA）
を用いて、改変したインサートをアガロースゲル片から精製し、pET21b(+)プラ
スミドに連結した。このプラスミドは、His-Tagを含む（Novagen、Wisconsin、U
SA）。pETベクターおよびインサートの制限消化および配列決定は、アネキシンI
I配列が、正しく挿入され、配列の誤りを有していないことを示した。プラスミ
ドを使用して、BLR DE3大腸菌(Escherichia coli)を形質転換した。細菌を、50
μg/mlのカルベニシリンを含む100mlのLuria-Bertani培地中で0.6 OD600まで増
殖させた。1mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドを培地に添加し、
細胞を37℃で３時間インキュベートすることによって、タンパク質発現を誘発さ
せた。細胞懸濁液を7500rpm（SA-600ローター）で遠心分離した。ペレットを、1
00mMのNaCl、2mMのPMSFおよび2mMのベンズアミジンを含む、氷冷した20mMのTris
-HClpH8.0緩衝液（超音波処理用緩衝液）に再懸濁させた。細胞懸濁液を４回の
バーストで30秒間超音波処理した。上清を、室温にてDNase（5μg/ml）およびRN
ase（10μg/ml）で15分間処理した後、４℃にて15分間12,000gで遠心分離した。
上清を、超音波処理用緩衝液で予備平衡させたTalonコバルトに基づくアフィニ
ティ樹脂（Clontech, Hampshire, U.K.）1mlと共に、ロッキングベッドミキサー
で20℃にて30分間インキュベートした。樹脂を1mlのカラムに入れ、溶出物がA28 0 ＜0.01に達するまで、超音波処理用緩衝液、次いで10mMのイミダゾールを含む
超音波処理用緩衝液で逐次洗浄した。組換えタンパク質を、100mMのイミダゾー
ルを含む超音波処理用緩衝液中に溶出させた。溶出タンパク質を、PBSに対して
１晩透析し、精製タンパク質をSDS-PAGEにて8〜16%Tris-グリシン(Novex)で分析
した。別の組の実験においては、精製タンパク質をSDS-PAGEで分離し、ニトロセ
ルロースフィルター上にブロットした。次に、ブロットを、アネキシンII、His-
tagおよび関連する対照に対する抗体で処理した。
【０１６５】 構築物の発現は、IPTG-誘導プロモーターの制御下にあり、IPTG-誘導細菌（ア
ネキシンII構築物を用いて形質転換した）の可溶化により、予想される分子量（
約40kDa）のバンドが生じた。非誘導細菌においては、対応するバンドは見られ
なかった。アネキシンIIまたはHis-tagに対する抗体を用いたウェスタンブロッ
トによって、誘導細菌のみに正しい分子量のバンドが同定された（データは示さ
れていない）。アネキシンIIをTalonコバルトアフィニティカラムで精製した。
【０１６６】 組換えアネキシンIIが機能的に活性であることを証明するために、本発明者ら
は、公知のリガンドプラスミノーゲンへのアネキシンIIの結合を特徴づけた。マ
イクロタイタープレートのウェル（Maxisorb、NUNC、デンマーク）をG-タンパク
質、プラスミノーゲンまたはウシ血清アルブミンでコーティングし、非特異的結
合部位を、実施例２で記載したようにして、Tween20でブロックした。アネキシ
ンII-Hisの段階希釈物を、コーティングしたウェルの、150mMのCaCl2、5mMのCa2 + イオンまたは5mMのEDTA含有HRP-抗His抗体（1:1000希釈物）を含む10mMのTris/
HCl緩衝液(pH7.4)中に添加した。プレートを周囲温度で２時間インキュベートし
た。徹底的に洗浄した後、結合したアネキシンII-HisTag-HRP複合体の量を、HRP
基質O-フェニレンジアミンジヒドロクロリド（Fast enzyme system; Sigma, cat
.no.P-9187）を添加することによって決定した。５分後に3MのHClで反応を止め
、A490を測定した。
【０１６７】 図６は、アネキシンIIがプラスミノーゲンに結合し、結合がCa2+イオンに依存
性であったことを示す。これらの結果は、組換えアネキシンIIが機能的に活性で
あることを示す。図６はまた、アネキシンIIが、濃度およびCa2+イオン依存性の
様式で、RSV G-タンパク質に結合することを示す。Hep2細胞はTQ1エピトープお
よびアネキシンII抗体エピトープのためのエピトープの両方を発現すること、お
よび、TQ1抗体はHep2細胞のRSV感染性を阻害することが先に示された。したがっ
て、アネキシンIIがRSVの受容体として働くために、TQ1がアネキシンIIと交差反
応し、アネキシンIIのそのリガンドへの結合を阻害することを示すことが必要で
ある。組換えアネキシンIIをSDS-PAGEで分離し、ニトロセルロースフィルター上
にブロットした。ブロットを抗アネキシンII抗体、TQ1またはイソタイプ対照抗
体で処理した。結合した一次抗体を、HRP-結合抗マウスIgGで検出した。抗アネ
キシンII抗体およびTQ1はアネキシンII上でエピトープを認識し、それに対して
、イソタイプ対照抗体はアネキシンIIと反応しなかった。
【０１６８】 図７に示した結果は、TQ1が、アネキシンIIのヘパリン（図7a）、プラスミノ
ーゲン（図7b）およびRSV G-タンパク質（図7c）への結合を阻害することを確立
した。最後に、図7dは、セレクチンアンタゴニストである化合物Aが、アネキシ
ンIIのプラスミノーゲンおよびヘパリンへの結合を阻害することを示す。
【０１６９】実施例７ 可溶性アネキシンIIおよびセレクチンのRSV感染性への影響 L-セレクチン-ZZの段階希釈物（100μl/ウェル；最終最大濃度15μg/ml、最終
最小濃度0.015μg/ml）またはE-セレクチン-ZZの段階希釈物（100μl/ウェル；
最終最大濃度50μg/ml、最終最小濃度0.05μg/ml）または化合物Aの段階希釈物
（100μl/ウェル；最終最大濃度800μg/ml、最終最小濃度0.08μg/ml）またはア
ネキシンII-Histagの段階希釈物（100μl/ウェル；最終最大濃度70μg/ml、最終
最小濃度7μg/ml）を、0.4mlのRSVストック（1x107ffu/ml）と混合し、50μlの
各試料をHep2c細胞単層に添加した。ウイルス感染性を、蛍光フォーカスアッセ
イによって決定した。L-セレクチン-ZZ、アネキシンII-Histagおよび、L-セレク
チン-炭水化物相互作用の阻害剤はRSV感染性を減らし、それに対して、E-セレク
チン-ZZは結合に何ら影響を及ぼさなかった。値は２つの実験の平均であり、各
実験は三つ一組で行われた。
【０１７０】実施例８ 化合物Aのin vitro評価：結合アッセイ Hep2c細胞ECACC No.85020207（200μl／ウェル；5x105細胞/ml）を、マイクロ
タイタープレートのウェルに添加し、プレートを37℃で１晩インキュベートした
。化合物Aの段階希釈物（1,6-ビス[3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(2-α-D
-マンノピラノシルオキシ)フェニル]ヘキサン、２ナトリウム塩；100μl/ウェル
；最終最大濃度800μg/ml、最終最小濃度0.08μg/ml）を、0.4mlのRSVストック
（1x107ffu/ml）と混合し、50μlの各試料をHep2c細胞単層に添加し、ウイルス
感染性を以下に記載したようにして決定した。ウイルスストックを、以下に記載
したようにして、蛍光フォーカスアッセイを用いて感染性についてアッセイし、
力価を1ml当たりのフォーカス形成単位(ffu/ml)として表した。
【０１７１】蛍光フォーカスアッセイ RSV A2を培地（2%の牛胎児血清、2mMのグルタミンおよび抗生物質を補ったイ
ーグル最小必須培地(Eagles Minimal Essential Medium、EMEM)）で希釈して、
約1x104ffu/mlとした。化合物Aの段階希釈物（100μl）を0.4mlのRSV懸濁液に添
加した。陽性の対照として、100μlの緩衝液だけを0.4mlのウイルスのアリコー
トに添加した。50μlの各試料を、平底の96ウェルプレート中の集密的なHep2c細
胞の三つのウェルに添加した。培地のみを含む３つのウェルを陰性の対照として
インキュベートした。
【０１７２】 プレートを37℃で90分間インキュベートして、ウイルスを細胞表面に吸収させ
、次いでさらに150μlの培地をあらゆるウェルに添加した。プレートを37℃で24
時間インキュベートして、ウイルス複製を完全に一巡させた。細胞をPBSで洗浄
し、PBS中の75%冷アセトン(v/v)で固定した。Hep2c細胞単層を、0.1%(v/v)Tween
20および10%(v/v)FCSを含むPBS(PBS/T20) （牛胎児血清／リン酸緩衝生理食塩水
／Tween20）中のマウス抗RSVモノクローナル抗体プールの1/100希釈物の25μlと
共に30分間インキュベートすることによって、蛍光フォーカスのために染色した
。PBS/T20で洗浄後、ウェルを、フルオレセイン結合ヤギ抗マウス免疫グロブリ
ンの1/20希釈物の25μlと共にインキュベートした。細胞を洗浄し、PBS中の0.1%
(w/v)ナフタレンブラックで10分間対比染色した。各ウェル中の蛍光を発する細
胞の数を数えた。
【０１７３】 値は、三つ一組の実験結果の平均である。
【０１７４】 SDは標準偏差を表す。
【０１７５】実施例９ ウイルス感染したA549細胞からのサイトカインIL-8放出における影響 A549細胞（上皮細胞系）を、培養皿に約5x105（DMEM+FCS中）で接種し、24ウ
ェルプレート（1ml細胞懸濁液／ウェル）中で集密になるまで（約３日間）増殖
させた。実験開始の24時間前に、培地を、血清を含まない培地（DMEM+0.1%BSA）
と取り替えた。RSVの懸濁液（M.O.I値0.1を与える）を化合物A（30μM〜300μM
）またはビヒクル(vihicle)と同時に添加した。細胞を37℃で１時間インキュベ
ートした後、PBSで２回洗浄した。最後に、PBSを、適当な濃度の化合物Aまたは
ビヒクルを含むDMEM+BSAで置換した。感染後種々の時間間隔で（0.48〜72時間）
、培地をウェルから除去し、遠心分離（400xg、４分、室温）して、A549細胞を
ペレット化した。IL8のためのアッセイ（R&D Elisa kit）を行なうまで、上清を
−20℃で凍結させた。
【０１７６】 結果を図10に示し、各ウェルに存在するバイオマス（全生存細胞）に対して表
す。付着したA549細胞のバイオマスを決定するために、メチレンブルー（ウェル
当たり500μl）を細胞に添加し、室温で40分間インキュベートした。細胞をPBS
で２回洗浄することによって、過剰のメチレンブルーを除去した。乾燥後、細胞
を可溶化し、放出されたメチレンブルーを、分光光度計（OD620nm）を用いて測
定した。メチレンブルーは、生存細胞を染色する色素である。したがって、ウェ
ル当たりの色素の量は、バイオマスまたは生存細胞についての概算値を与える。
図10は、A549細胞からのIL-8のRSV-仲介放出が時間依存性であり、化合物Aによ
って強く阻害されたことを示す。
【０１７７】実施例10 化合物Aのin vivo評価 48匹のメスBalb/cマウス（平均体重20g）を８匹ずつの６群に分けた。感染の
４時間前に、マウス群に以下の処置を施した。
【０１７８】
【０１７９】 すべての鼻腔内接種は、軽いエーテル麻酔下で行なった。時間０で、すべての
動物に、1x105ffuのRSVを感染させた（ストックKV(11/4/97）をPBSで1/5希釈し
、50μlを鼻腔内に与えた）。感染後+4時間に、治療投与を繰り返した。治療投
与量を、さらに３日間、毎日２回繰り返した（動物当たり全部で8投与）。感染
後４日で動物を殺した。肺を除いて培地に入れ、計量した後、ホモジナイズした
。肺ホモジネートを遠心分離し、上清を、先に記載した蛍光アッセイを用いてウ
イルスについてアッセイした。
【０１８０】
【０１８１】 表に示された結果は、ウイルス収量（肺組織1g当たりのffu）のlog10として計
算し、次いで、ウイルス対照（PBS処置群）のウイルス力価に対する化合物Aの存
在下でのウイルス力価のパーセントとして表した。 ＊＊ 処置群は、対照より非常に有意に小さい。 ＊ 処置群は、対照より有意に小さい。
【０１８２】 これらの結果は、RSV感染したマウスへの化合物Aの鼻腔内投与が、４日後に、
96％までウイルス力価を減らすことを証明する。この化合物は、100mg/kgで、腹
腔内投与したリバビリンより効力が大きい。
【０１８３】考察 L-セレクチンおよびG-タンパク質の間の相互作用は、シアリダーゼ依存性では
なく、RSVとL-セレクチンとの間のこの相互作用に関連する炭水化物が、シアリ
ル-ルイスx（sLex,NeuAcα2-3、Galβ1-4(α1-3Fuc)GlcNAc）とは構造的に異な
ることを示す。他方では、L-セレクチンのG-タンパク質への結合は、G-タンパク
質をヘパリナーゼIおよびIIで前処理することによって阻害された。したがって
、本発明者らは、ヘパリン状の構造が、RSVと宿主細胞上のその受容体との相互
作用において重要な役割を演じるものと結論付けている。L-セレクチンは、白血
球の細胞表面に構成的に発現された。したがって、L-セレクチンは白血球上にお
けるRSVについての受容体として働くことができ、そのような相互作用は、炎症
誘発性作用を示し得ると推測できる。
【０１８４】 例えば、L-セレクチンは、白血球活性化に関連する信号を送る分子として確立
されている。抗L-セレクチン抗体またはL-セレクチンリガンド（例えばスルファ
チド、フコイダン、GlyCAM1）による細胞表面L-セレクチンの架橋は、TNF-αお
よびインターロイキン-8 mRNAの発現およびβ2インテグリンの活性化を増加させ
る。かくして、RSVの白血球L-セレクチンへの結合は、白血球から炎症誘発性(pr
o-inflammatory)サイトカインの活性化および放出を誘発することができる。こ
の場合、L-セレクチン阻害剤は、RSVと白血球L-セレクチンとの相互作用を妨げ
、抗炎症効果を誘発することができる。
【０１８５】 上記の実験においては、固相固定化フコイダンを、アフィニティマトリックス
として使用して、Hep2細胞からRSV結合種として可能性のあるものを分離した。
分子量50kDaおよび100kDaの２つのタンパク質がフコイダンに結合することがわ
かった。これらのタンパク質は、アネキシンIIおよびヌクレオリンとして同定さ
れた。本発明者らは、Hep2細胞がアネキシンIIを発現すること、およびアネキシ
ンIIの発現はRSV感染後に増加されることを示した。可溶性アネキシンIIはまた
、Hep2細胞のRSV感染を阻害することが示され、これは可溶性アネキシンIIがHep
2細胞上のRSV結合部位と競合し得ることを示すものである。さらには、本発明者
らは、組換えアネキシンIIが、同様の部位または密接に関連する部位によって、
RSV G-タンパク質、ヘパリンおよびプラスミノーゲンに結合することを示した。
抗L-セレクチン抗体TQ1は驚くべきことに、Hep2細胞のRSV感染を妨げることが示
された。目下の研究は、TQ1がアネックスIIと交差反応することを証明する。
【０１８６】 本発明者らはまた、TQ1が、L-セレクチンおよびアネキシンIIの両方のRSV G-
タンパク質への結合を阻害することを示し、このことは、TQ1エピトープがRSV結
合部位内に含まれることを示すものである。L-セレクチンにおけるTQ1エピトー
プは、LAM1-3抗体によって認識されるのと同じ領域内、すなわちL-セレクチンの
残基92〜156間にある。他方では、アネキシンIIにおけるヘパリン-およびプラス
ミノーゲン-結合部位は、C-末端領域内に局在化される。アネキシンIIのプラス
ミノーゲン結合領域およびL-セレクチンのTQ1エピトープについての配列のアラ
イメントが図７に示されている。これらの配列内に高度の相同性を有する特定の
領域があり、これらの領域の１つがTQ1エピトープであり得ることに注目するこ
とは興味がある。特異的欠失変異体を用いた将来の研究は、これらの分子の両方
におけるTQ1についてのエピトープを確立しなければならない。RSVが、共通の部
位によってL-セレクチンおよびアネキシンIIへ結合することのさらなる証拠は、
公知のL-セレクチンアンタゴニストがRSV感染性を阻害するだけでなくアネキシ
ンIIのそのリガンド、プラスミノーゲンおよびヘパリンへの結合を阻害するとい
う観察から得られる。
【０１８７】参考文献
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、RSV感染性に対する複合糖質の影響を示す図である。
【図２】 図２ａは、化合物Ａの構造を示す図である。 図２ｂは、RSV感染性に対する化合物Ａおよび可溶性セレクチンの影響を示す
図である。
【図３】 図３は、L-セレクチン-ZZ(50μl；10μg/ml)を、抗体(50μl；20μg/ml)もし
くはフコイダン(50μl；50μg/ml) および/または2 mM Ca2+-イオンもしくは5 m
M EDTAの存在下または不在下においてRSV Gタンパク質で被覆したウェルに添加
した場合の、L-セレクチンとRSV Gタンパク質との結合を示す図である。
【図４】 図４は、L-セレクチン-ZZとそのリガントとの結合に対する酵素的治療の効果
を示す図である。
【図５】 図５は、Hep2細胞のRSV感染性に対するTQ1の影響を示す図である。
【図６】 図６は、組換えアネキシンIIの結合特性を示す図である。
【図７】 図７は、アネキシンIIとプラスミノゲンおよびヘパリンとの結合を示す図であ
る。
【図８】 図８は、LAM1-3に認識されるエピトープ(L-セレクチンの残基番号92および156
)と、アネキシンII中の(Ｃ末端内に局在化されている)ヘパリンおよびプラスミ
ノゲン結合部位との配列アライメントを示す図である。
【図９】 図９は、RSV感染性に対する可溶性アネキシンIIおよび可溶性セレクチンの影
響を示す図である。
【図１０】 図10は、ウイルス感染細胞からのIL-8放出に対する化合物Ａの影響を示す図で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ０７Ｈ 15/203 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 マルホトラ，ラジニーシュ イギリス国 エスジー１ ２エヌワイ ハ ートフォードシャー，スティーヴンエイ ジ，グネルズ ウッド ロード，グラクソ ウェルカム ピーエルシー （番地な し) (72)発明者 バード，マイケル イギリス国 エスジー１ ２エヌワイ ハ ートフォードシャー，スティーヴンエイ ジ，グネルズ ウッド ロード，グラクソ ウェルカム ピーエルシー （番地な し) Ｆターム(参考） 4B063 QA18 QQ79 QR77 4C057 BB02 DD01 JJ24 4C084 AA02 AA17 BA01 BA22 CA53 DC50 MA13 MA17 MA52 MA59 MA63 MA66 ZB332 4C086 AA01 EA08 MA01 MA04 NA14 ZB33

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 RSウイルス(RSV)による感染症の予防または治療に使用する
    ための薬剤の製造における、(i) アネキシンIIまたはL-セレクチンへのRSV G-タ
    ンパク質の結合に拮抗する生成物、または(ii) アネキシンIIまたはL-セレクチ
    ンの細胞表面レベルの減少をもたらす生成物の使用。
  2. 【請求項２】 生成物が可溶型アネキシンIIまたは可溶型L-セレクチンであ
    る、請求項１に記載の使用。
  3. 【請求項３】 可溶型のアネキシンIIまたは可溶型L-セレクチンが少なくと
    も細胞外ドメインを含む、請求項２に記載の使用。
  4. 【請求項４】 生成物が、式(II)： 【化１】 〔式中、 Xは、-CN、-(CH2)nCO2H、-(CH2)nCONHOH、-O(CH2)mCO2H、-O(CH2)mCONHOH、-(
    CH2)nCONHNH2、-(CH2)nCOZ、-(CH2)nZ、-CH(CO2H)(CH2)mCO2H、-(CH2)nO(CH2)mC
    O2H、-CONH(CH2)mCO2H、-CH(OZ)(CO2H)、-CH(Z)(CO2H)、-(CH2)nSO3H、-(CH2)nP
    O3D1D2、-NH(CH2)mCO2H、-CONH(CHR3)CO2H、(1-H-テトラゾリル-5-アルキル-)お
    よび-OHからなる群より選択され； 二価構造の場合、Yは、-(CH2)f-、-CO(CH2)fCO-、-(CH2)fO(CH2)f-、-CO(CH2) f O(CH2)fCO-、-(CH2)gS(O)b(CH2)fS(O)b(CH2)g-、-CO(CH2)gS(O)b(CH2)fS(O)b(C
    H2)gCO-、-(CH2)fV(CH2)f-、-(CH2)fCOVCO(CH2)f-、-CO(CH2)fCOVCO(CH2)fCO-、
    -CO(CH2)fV(CH2)fCO-、-CONH(CH2)fNHCO-、-CO(CH2)fW(CH2)fCO-、-(CH2)fWSW(C
    H2)f-、-(CH2)fCONH(CH2)fNHCO(CH2)f-、-(CH2)fCOW(CH2)fWCO(CH2)f-または-CH 2 (CH2)fW(CH2)fCH2-（ここで、Vは-N[(CH2)q]2N-であり、qは独立して２〜４で
    あり、Wはアリールまたはヘテロアリールである）であり； 三価構造の場合、Yは、 【化２】 であり、Tは、-(CH2)f-、-CO(CH2)f-、-(CH2)gS(O)b(CH2)f-および-CO(CH2)gS(O
    )b(CH2)f-（ここで、カルボニル基はビフェニル単位に隣接して位置する）から
    なる群より選択され； R1およびR2は、独立して、水素、アルキル、ハロゲン、-OZ、-NO2、-(CH2)nCO 2 H、-NH2および-NHZからなる群より選択され； R3は、水素、アルキル、アラルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、
    アルキルカルボン酸およびアルキルカルボキサミドからなる群より選択され； fは1〜16であり、gは0〜6であり、nは0〜6であり、mは1〜6であり、pは0〜6で
    あり、bは0〜2であり、Zはアルキル、アリールまたはアラルキルであり、D1およ
    びD2は独立して水素またはアルキルである。〕 で表される化合物またはその薬学的に許容しうる塩、エステル、アミドもしくは
    プロドラッグである、請求項１に記載の使用。
  5. 【請求項５】 式(II)で表される化合物が、式(III)： 【化３】 〔式中、Xは、-COOH、-(CH2)nCOOHまたは-O(CH2)nCOOHであり、Yは、-(CH2)n-、
    -(CH2)nW(CH2)n-、-(CH2)nWOW(CH2)n-、-(CH2)nS(CH2)nS(CH2)n-、-CO(CH2)nCO-
    または-(CH2)nCOW(CH2)nWCO(CH2)n-である（ここで、Wはアリールまたはヘテロ
    アリールであり、nは0〜6である)。〕 で表される化合物である、請求項４に記載の使用。
  6. 【請求項６】 Yが-(CH2)fまたは-CH2(CH2)fW(CH2)fCH2-である、請求項５
    に記載の使用。
  7. 【請求項７】 Xが3-CH2CO2Hであり、Yが-(CH2)fまたは-CH2(CH2)fW(CH2)fC
    H2である、請求項５または６に記載の使用。
  8. 【請求項８】 生成物が、 1,7-ビス-[3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(2-α-D-マンノピラノシルオ
    キシ)フェニル]ヘプタン、 1,6-ビス-[3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(2-α-D-マンノピラノシルオ
    キシ)フェニル]ヘキサン、 1,5-ビス-[3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(2-α-D-マンノピラノシルオ
    キシ)フェニル]ペンタン、 1,4-ビス-[3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(2-α-D-マンノピラノシルオ
    キシ)フェニル]ブタン、 N,N'-ビス-[4-(3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(α-D-マンノピラノシル
    オキシ)フェニル)ブタン-1-イル]-4,4'-トリメチレンジピペリジン、 S,S'-ビス-[3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(2-α-D-マンノピラノシルオ
    キシ)-3-フェニルプロパ-1-イル]-1,3-ジチオプロパン、 1,7-ビス-[3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(2-α-D-マンノピラノシルオ
    キシ)フェニル]-1,7-ビス-オキソヘプタン、 1,6-ビス-[3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(2-α-D-マンノピラノシルオ
    キシ)フェニル]-1,6-ビス-オキソヘキサン、 1,5-ビス-[3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(2-α-D-マンノピラノシルオ
    キシ)フェニル]-1,5-ビス-オキソペンタン、 1,4-ビス-[3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(2-α-D-マンノピラノシルオ
    キシ)フェニル]-1,4-ビス-オキソブタン、 1,3,5-トリス-[3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(2-α-D-マンノピラノシ
    ルオキシ)フェニルメチル]ベンゼン、および 1,3,5-トリス-[4-[3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(α-D-マンノピラノシ
    ルオキシ)フェニル]-4-オキソ-2-チオブチル]ベンゼン、 ならびにその薬学的に許容しうる塩、エステル、アミドおよびプロドラッグから
    なる群より選択される、請求項１に記載の使用。
  9. 【請求項９】 生成物が、1,6-ビス-[3-(3-カルボキシメチルフェニル)-4-(
    2-α-D-マンノピラノシルオキシ)フェニル]ヘキサンまたはその薬学的に許容し
    うる塩、エステル、アミドもしくはプロドラッグである、請求項１に記載の使用
    。
  10. 【請求項１０】 RSV感染症を予防または治療することが可能な生成物を同
    定する方法であって、 (a) 候補物質を、アネキシンIIもしくはその誘導体と、またはL-セレクチンも
    しくはその誘導体と接触させ、該候補物質がそれに結合するかどうかを確認する
    ステップ、 (b) 候補物質の、アネキシンIIまたはその誘導体およびRSV G-タンパク質また
    はその誘導体への供給を、該候補物質の不在下でアネキシンIIまたはその誘導体
    がRSV G-タンパク質またはその誘導体に結合するような条件下で実施し、該候補
    物質が、アネキシンIIまたはその誘導体とRSV G-タンパク質またはその誘導体と
    の結合に拮抗するかどうかを確認するステップ、または (c) 候補物質の、L-セレクチンまたはその誘導体およびRSV G-タンパク質また
    はその誘導体への供給を、該候補物質の不在下でL-セレクチンまたはその誘導体
    がRSV G-タンパク質またはその誘導体に結合するような条件下で実施し、該候補
    物質が、L-セレクチンまたはその誘導体とRSV G-タンパク質またはその誘導体と
    の結合に拮抗するかどうかを確認するステップ、 を含み、 ステップ(a)における物質の結合またはステップ(b)もしくは(c)における結合
    の拮抗が、該候補物質がRSV感染症を予防または治療することが可能であること
    を示すものである、方法。
  11. 【請求項１１】 ステップ(a)、(b)または(c)が無細胞系で実施される、請
    求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 細胞表面上で組換え発現されたアネキシンIIもしくはその
    誘導体またはL-セレクチンもしくはその誘導体が供給される、請求項１０に記載
    の方法。
  13. 【請求項１３】 結合が競合結合系を用いて測定される、請求項１０〜１２
    のいずれか１項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 RSV感染症を予防または治療することが可能な生成物を同
    定する方法であって、候補物質が、アネキシンIIもしくはその誘導体の細胞表面
    レベルの減少、またはL-セレクチンもしくはその誘導体の細胞表面レベルの減少
    をもたらす能力を有するかどうかを試験し、それによって該候補物質がRSV感染
    症を予防または治療することが可能であるかどうかを決定するステップを含む、
    方法。
  15. 【請求項１５】 RSV感染症を予防または治療することが可能な生成物であ
    ると同定された物質を合成するステップをさらに含む、請求項１０〜１４のいず
    れか１項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法により同定
    された、または請求項１５に記載の方法により合成された物質。
  17. 【請求項１７】 RSVによる感染症の予防または治療用薬剤の製造における
    、請求項１６に記載の物質の使用。
  18. 【請求項１８】 被験体におけるRSV感染症を予防または治療する方法であ
    って、該被験体に、請求項１〜９のいずれか１項に記載の生成物または請求項１
    ６に記載の物質を投与することを含む、方法。
  19. 【請求項１９】 被験体におけるRSV感染症を予防または治療する方法であ
    って、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法を実施し、それによって同
    定された物質を該被験体に投与することを含む、方法。
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