JP2003510292A - 粘膜DTPaワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
において援用される。
度に有効な不活化された細胞全体のワクチンは、1940年代から利用可能であ
ったが、毒性の細胞成分の存在に起因して、その安全性についての問題により、
その接種が制限されている(1)。従って、規定されたB.pertussis
抗原を少数含む無細胞百日咳ワクチン(Pa)が生産されてきており、そしてヒ
トにおける使用について承認されている(2)。
リア、破傷風、百日咳)の形態で小児に筋肉内投与されている。しかし、筋肉内
のワクチン接種は、理想的な投与経路とはいえない。粘膜ワクチン(経口、鼻内
など)は、2つの理由で好ましい(3)。第一に、粘膜ワクチンは、大規模での
投与がより容易であり、特殊な装置の必要が回避され、そして針に関連する問題
も回避される。第二に、粘膜ワクチンは、分泌性IgAによって媒介される粘膜
免疫を刺激する。ほとんどの病原体は、粘膜を通じて身体に侵入することから、
粘膜免疫が所望される。
、6、7、8、9)が、報告された保護のレベルは、従来のワクチンと比較され
なかったか、または非経口的に与えられたミョウバンアジュバント化された抗原
で観察されたものには及ばなかった。
(Pa)、および(b)コレラ毒素(CT)またはE.coli熱不安定性毒素
(LT)のいずれかの無毒化形態、を含む粘膜DTPaワクチンを提供する。
は、粘膜アジュバントとして作用する(10)。CTおよびLTは相同であり、
そして代表的には互換性である。
のであり得る。適切な例としては、アミノ酸63にリジン残基を有するLT(「
LT−K63」参考文献11)、およびアミノ酸72にアルギニン残基を有する
LT(「LT−R72」、参考文献12)が挙げられ、これらの両方は、抗原特
異的血清IgG、sIgA、ならびにDTPaに対する局所的および全身性のT
細胞応答を増強することが見出されている。LT−K63が好ましい。なぜなら
、LT−K63は、B.pertussis感染の信頼ある動物モデルにおいて
、ミョウバンで処方された、経口送達されるDTPaワクチンで生成されるレベ
ルと等価の、高いレベルの保護を生じることが見出されているからである。他の
適切な変異体としては、残基63においてチロシンを有するLT(「Y63」、
参考文献13)、および参考文献14において開示されている種々の変異体(す
なわち、D53、K97、K104およびS106)、ならびにその組合せ(例
えば、D53およびK63の両方の変異を有するLT)が挙げられる。
形態において、本発明の粘膜ワクチンは、好ましくは、粘膜投与に適合されてお
り、例えば、鼻噴霧、鼻滴剤、ゲルまたは粉末による(例えば、15)。
凝集素(FHA)を含む。その無細胞百日咳抗原はさらに、ペルタクチン(pe
rtactin)、および必要に応じて、凝集原2および凝集原3を含み得る(
16,17)。
好ましくは無毒化されている。無毒化は、化学的手段および/または遺伝的手段
によるものであり得る。好ましい無毒化変異体は、9K/129G二重変異体(
2)であり、これは本明細書において「rPT」と呼ぶ。
しくはCRM197変異体(10)である。破傷風抗原(T)は、好ましくは破
傷風トキソイド(18)である。
P抗原もまた、含有され得る(例えば、参考文献19(これは、HBV抗原を含
む)および参考文献20)。
、本発明に従うワクチンを患者に投与する工程を包含する。この免疫応答は、好
ましくは、百日咳、ジフテリアおよび破傷風に対して保護性である。この患者は
、好ましくは小児である。
て、追加免疫応答を惹起し得る。この初回刺激ワクチン接種は、粘膜または非経
口の経路によってであり得た。
チン接種するため、またはB.pertussisに対して既に惹起された初回
刺激免疫応答を追加免役するための鼻内医薬の製造における、コレラ毒素(CT
)またはE.coli熱不安定性毒素(LT)の無毒化された変異体の使用を提
供する。
抗原(Pa)、および(b)コレラ毒素(CT)またはE.coli熱不安定性
毒素(LT)のいずれかの無毒化形態、を含む免疫原性組成物を提供する。
における参考文献は、それらの対立遺伝子変異体および機能的変異体を包含する
と理解される。それらはまた、野生型タンパク質に対して有意な配列同一性を有
するタンパク質を包含する。同一性の程度は、好ましくは、例えば、MPSRC
Hプログラム(Oxford Molecular)において実行されるSmi
th−Waterman相同性検索アルゴリズムを用いるか、gap open
penalty=12およびgap extension penalty=
1のパラメータでのアフィンギャップ検索を用いて算出すると、50%を超える
(例えば、65%、80%、90%、またはそれを超える)。これらのタンパク
質の免疫原性フラグメントもまた使用され得、同様にそのタンパク質を組み込む
より長いタンパク質、変異体またはフラグメント(例えば、融合タンパク質)も
使用され得る。しかし、全ての場合において、そのタンパク質(野生型、改変体
、変異体、フラグメントまたは融合物)は、実質的に、野生型免疫原性を保持す
る。
の精製、化学的合成など)により、および種々の形態(例えば、ネイティブ、融
合物など)で調製され得る。これらのタンパク質は、好ましくは、実質的に純粋
または単離された(すなわち、そのタンパク質が天然において通常付随する他の
細菌タンパク質または宿主細胞タンパク質を実質的に含まない)形態で調製され
る。
)。核酸は、そのワクチンのタンパク質成分をコードし、そして個々のタンパク
質成分を置換し得るか、またはそれらを補い得る。例として、そのワクチンは、
破傷風毒素をコードするDNAを含み得る。
が、治療性(すなわち、感染後の疾患を処置する)でもあり得る。
に受容可能なキャリア」を含む。このキャリアは、その組成物を受ける個体に対
して有毒な抗体の産生をそれ自体が誘発しない任意のキャリアを包含する。適切
なキャリアは、代表的に、大きく、ゆっくり代謝される高分子(例えば、タンパ
ク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合性アミノ酸、アミノ酸コポリマ
ー、脂質凝集物(例えば、油小滴またはリポソーム)、および不活化ウイルス粒
子)である。そのようなキャリアは、当業者に周知である。そのワクチンはまた
、希釈剤(例えば、水、生理食塩水、グリセロールなど)を含み得る。さらに、
補助物質(例えば、湿潤剤、乳化剤、pH緩衝化物質など)が存在し得る。
よび必要に応じて他の任意の上記の成分を含む。「免疫学的に有効な量」とは、
単回用量においてまたは一連の部分としてのいずれかとして、個体に対してその
量を投与することが、処置または予防について有効であることを意味する。この
量は、処置される個体の健康状態および身体状態、年齢、処置される個体の分類
学的群(例えば、非ヒト霊長類、霊長類など)、その個体の免疫系が抗体を合成
する能力、所望される保護の程度、ワクチンの処方、処置医の医療的状況の評価
、および他の関連する因子に依存して変動する。その量は、慣用的な試験を通じ
て決定され得る比較的広汎な範囲に入ると予測される。投薬処置は、単回用量ス
ケジュールまたは多数回用量スケジュールであり得る。そのワクチンは、他の免
疫調節因子と組み合わせて投与され得る。
arlan UK由来)であり、そしてIrish Department o
f Healthの規制に従って収容した。
部頸部リンパ節および後部縦壁(胸部)リンパ節を取り出し、そして免疫応答を
評価した。個々のマウスからの脾臓細胞または未刺激もしくは免役したマウスか
らのプールされたリンパ節細胞(2×106細胞/ml)を、熱殺傷した(80
℃で30分間)B.pertussis細菌(106細胞または107細胞/ml
)、熱不活化rPT(1−5μg/ml)またはFHA(1−5μg/ml)を
有する、8%FCSを補充したRPMI中で37℃で三連にて培養した。ホルボ
ール(phorbal)ミリステートアセテート(PMA)+抗マウスCD3を
陽性コントロールとして用い;培地のみを陰性コントロールとして用いた。DT
Paを用いた実験において、PRN、TTまたはCRM197(1−5μg/m
l)に対する応答もまた試験した。上清を72時間後に取り出し、そしてIFN
−γ(Th1応答の指標である)ならびにIL−4およびIL−5(両方ともT
h2応答の指標である)の濃度を、参考文献22に記載されるような免疫アッセ
イによって決定した。T細胞増殖を、これもまた参考文献22において記載され
るように、3Hチミジン取り込みにより培養の4日後に評価した。結果を、4−
5匹のマウスからの個々の脾臓細胞またはプールしたリンパ節細胞に対して、三
連にて行ったアッセイにおいて、抗原の最適濃度について、1分当たりの平均計
数または平均サイトカイン濃度として表現する。
IgGのレベルをELISAにより決定した。精製した抗原(FHA、PT、T
TおよびDT;1.0μg/ml)を用いてELISAプレートをコーティング
した。このプレートを乳汁タンパク質でブロッキングし、次いで連続希釈した血
清サンプルを加え、結合した抗体を抗マウスIgG(Fc特異的)アルカリホス
ファターゼ結合体によって検出した。肺中の抗原特異的なIgAをELISAに
より検出した。肺を、0.1mM PMSFプロテアーゼインヒビターを含む、
8%FCSを補充したRPMI中でホモジナイズした。ELISAプレートを、
IgGアッセイについては抗原でコーティングし、そして連続希釈した肺ホモジ
ネートを加えた。結合した抗体をヒツジ抗マウスIgA、続いてロバ抗ヒツジI
gGアルカリホスファターゼ結合体を用いて検出した。結果を、未刺激マウスか
らの血清または肺ホモジネートについてのバックグラウンドコントロール値より
2標準偏差上のカットオフに対して、光学密度対血清もしくは肺のホモジネート
希釈の曲線の直線部分の回帰によって算出した、末端点力価として表現する。
3において記載されるように調製した抗原を伴う、FHA(2.5μg/用量)
+rPT(5.0μg/用量)であった。
ント化したが、他方第二のワクチン(図2)をLT−R72(1μg/用量)で
アジュバント化した。コントロールワクチンは、FHA+rPTのみからなる。
このアジュバントを、参考文献24および25に記載されるように調製した。
ワクチン用量でか、または軽いハロセン麻酔後に、50μlに再懸濁し、そして
ミクロピペットで外鼻孔に適用されるワクチン用量を用いて、0週目および4週
目にマウスを免役した。殺傷したB.pertussis、熱不活化PTおよび
FHAに対するT細胞応答を、6週目に、脾臓ならびに胸部リンパ節および頸部
リンパ節において測定した(図1および2)。
ンについて検出された。対照的に、コントロールで鼻内免役されたマウスからの
脾臓および局所的なリンパ節は、有意なB.pertussis特異的T細胞応
答を生成しなかった。ポリクローナル刺激(PMA+抗CD3)に対する陽性応
答により、これらのT細胞がインビトロで応答し得たことが確認された。
全身性の抗体産生を増強したことを示す。コントロールでの免疫は、弱く、かつ
不一致の抗PTおよび抗FHAの血清IgGおよび肺IgA応答を生成した。対
照的に、LT−R72またはLT−K63での同じ抗原の処方物は、一致して、
PTおよびFHAに対して特異的な強力な血清IgGおよび肺IgAを生じ、そ
してまた、特にワクチンを麻酔状態で投与した場合、有意にIgA応答を増強し
た。
。それらは、鼻内送達されるPaの保護効力を増強し得、それゆえ無細胞ワクチ
ンのために有効な鼻内アジュバントである。
いるというサイトカインプロファイルが実施例1において得られた。K63アジ
ュバント(これは、何らの毒性酵素活性を有しない)は、IL−4、IL−5お
よびIFN−γの産生を増強した。これは、混合Th1−Th2(すなわちTh
0)プロファイルの特徴である。対照的に、1.0μgのR72アジュバント(
これは、部分的に毒性の酵素活性を保持する)は、Th2細胞を選択的に増強す
るようであった。
マウスを、1μgまたは10μgのLTK63またはLTR72をアジュバント
として処方されたPaで免役し、そして得られた免疫応答を評価した(図4)。
コントロールPaでの鼻内免疫は、弱いT細胞応答を生成したが、他方、1μg
LTK63の添加は、FHAまたは殺傷したB.pertussisに対して応
答した脾臓細胞およびリンパ節により、増殖ならびにIFN−γおよびIL−5
の産生を増強した。その用量を10μgのLTK63へと増やすと、増殖および
IFN−γの産生の穏和なさらなる増強が生じた。1.0μgのLTR72は、
選択的にTh2応答を増強し、抗原誘導されたIL−4およびIL−5の産生の
レベルは、Pa単独で観察されたものに比較して増強していた。野生型LT(1
.0μg)もまた、選択的にIL−4およびIL−5の産生を増強したが、その
効果は、LTR72で観察された効果ほどは劇的ではなかった。さらに、1.0
μgのLTR72を受けたマウスは、LTK63または野生型LTを用いて免疫
されたマウスよりも、有意に高い抗FHAならびに抗PTIgGおよびIgAの
抗体力価を有した(データは示さず)。LTR72の用量を1.0μgから10
μgに増やすと、IFN−γレベルの増強ならびにIL−4およびIL−5のレ
ベルの減少が生じた。
イトカインプロファイルに影響を与えるようである。低用量のLTR72に存在
する微量のADPリボシル化活性は、Th2のサイトカインプロファイルを調節
するに十分であり、そして抗体応答について強力なアジュバントとして作用する
。逆に、AB複合体の結合効果によって媒介される、LTK63のアジュバント
効果は、Th1サブタイプに向けてさらに押される。さらに、より高い用量のL
TR72では、AB結合活性は、酵素活性を凌駕し得、Th1の増強およびTh
2細胞の誘導を生じる。
チャレンジモデルにおいて免役されたマウスの保護と相関付けした。従って、こ
のモデルを用いて、LTアジュバントを用いて処方された、鼻内送達されるPa
を評価して、ヒト効力を予測した。
液体媒体中で37℃での攪拌条件のもとで増殖させた。48時間の培養物からの
細菌を、1%カゼインを含む生理食塩水中に約2×1010細胞/mlの濃度で再
懸濁した。チャレンジ接種を、ネブライザ手段により15分の期間にわたってマ
ウスに投与し、続いてさらに15分間にわたってチャンバ中で安静にさせた。4
匹のマウスの群を、0日目、3日目、7日目、10日目および14日目に屠殺し
、そして肺中の生存するB.pertussisの数を、評価した。肺を無菌的
に感染したマウスから取りだし、そして氷上で1mlの、1%カゼインを含む無
菌の生理食塩水中にホモジナイズした。個々の肺からの希釈していないかまたは
系列希釈したホモジネートの100μlのアリコートを、Bordet−Gen
ou寒天プレート上で三連でスポットし、そして5日のインキュベーション後に
コロニー数を評価した(図5)。
りも有意に高い、保護レベルを提供した。LT−K63アジュバントは、LT−
R72よりわずかによい保護を生成した。25μl(麻酔なし)中でのLT−R
72でのPaの鼻送達は、50μl中の同じワクチン(麻酔有り)よりもわずか
によい保護を与えた。これらの2つの相違はいずれも有意ではなかった。
a(ミョウバンにおいて25μg FHA+25μg化学的に無毒化されたPT
(16,22))で以前に観察されたレベルを超える。相関曲線の外挿により、
より良好な強度指標を示し、これは、ヒトにおける優れた臨床効力を示唆する。
の形態で小児に筋肉内に投与される。従って、鼻内ワクチン接種の効力を評価す
るために、DTPaワクチンを、筋肉投与のためにミョウバンでアジュバント化
し(300μg/用量、300μl容量)、直接比較のために、LT−K63ア
ジュバント化した鼻内ワクチンを用いた(10μgアジュバント/用量、40μ
l容量)。このワクチンのPa成分は、5μgrPT、2.5μg FHAおよ
び2.5μgペルタクチンを含み;T成分は、10μg破傷風トキソイドであり
;D成分は10μgのCRM197であった。
および体液性免疫応答を増強した(図6および図7)。鼻内ワクチンを用いた血
清IgGのレベルは、筋肉内ワクチンを用いて観察されたレベルと等価であった
が、粘膜免疫は、局所的IgA応答を有利に増強した。
標準的な」ミョウバンアジュバント化されたワクチンの効力に一致したが、消失
反応速度論は、わずかに異なっていた(図8)。これは、ミョウバン上に吸着さ
れ、そして非経口的に投与される同じ抗原で観察される保護レベルに等価な、B
.pertussis感染に対する保護レベルを生成し得る粘膜送達される組合
せDTPa処方物の初めての開示である。
。
またはPBS(コントロール)のいずれかで筋肉内免疫した。さらなる群の22
匹のマウスを、0週目および4週目で、LT−K63アジュバント化されたワク
チンで、鼻内免疫した。2つのさらなる群の22匹のマウスを、0週目で筋肉内
でのミョウバン処方物で免疫し、そして4週目で鼻内処方物(LT−K63アジ
ュバントとともにまたはそれなしで)免疫した。
免疫応答について測定した。残りのマウスを、感染モデルに供した。各群から1
匹のマウスを、0日目に、および各群から4匹のマウスを、3日目、7日目、1
0日目および14日目に屠殺し、そしてそれらのCFU計数を、それらの肺から
測定した。
いて全ての群で弱かった。しかし、その細胞は、陽性コントロール(PMA+C
D3)に対して応答して増殖した。インビトロでの破傷風トキソイドに対する増
殖応答は、LT−K63をアジュバントとして用いたとき(筋肉内初回刺激の後
)鼻内追加免役されたマウスにおいて有意により強力であった。ジフテリア成分
に対する最も強力なインビトロ増殖は、鼻内で2回免役されたマウスにおいて見
られた。
L−5およびIFN−γ産生の両方を示した。このことは、インビボでTh1お
よびTh2の両方の集団の初回刺激を示す。IL−4産生は、両方のときにおい
て同じ方法で免役した群において限定されていた。鼻内LT−K63処方物での
初回刺激および追加免疫は、筋肉内で初回刺激された群よりもより強いTh2応
答(より高いIL−4およびIL−5)を与えるようである。
−5に限定されており、いずれの群についてもIFN−γはほとんどまたは全く
検出されなかった。従って、DTPaでの鼻内追加免疫は、インビボでTh2細
胞の初回刺激を生じる。最も強いTh2応答は、LT−K63アジュバントで2
回鼻内免役されたマウスから生成された。対照的に、2回の筋肉内注射は、脾臓
内で検出可能なIL−4応答もIL−5応答も与えず、IFN−γもそうではな
かった。
IL−4、IL−5の産生、および低レベルのIFN−γの産生を示した。この
ことは、混合Th1/Th2応答を示す。しかし、IL−4およびIL−5のレ
ベルは、アジュバント化されていない鼻内追加免疫または筋肉内追加免疫と比較
して、LT−K63アジュバントで鼻内追加免役した群において、有意により高
かった。
価において有意な相違を示さなかった。抗PTおよび抗FHAの力価は、鼻内で
追加免疫した群におけるよりも、筋肉内でDTPaで初回刺激および追加免役し
た群においてわずかにより高かった(LT−K63アジュバントありまたはなし
)。抗FHA IgGは、検出されなかったが、これは、上記に提示された結果
とは一致しなかった。IgAレベル(図13)は、LT−K63アジュバントを
用いた筋肉内初回刺激および鼻内追加免疫が鼻内初回刺激および追加免疫に対す
るほとんどの抗原について類似の力価を生成したことを示したが、抗PTレベル
は有意により低かった。LT−K63アジュバントなしでの鼻内追加免疫は、特
にDHAおよびPTNについてより低いIgAレベルを生成した。
−K63を用いた筋肉内での初回刺激および鼻内追加免疫が最も高いレベルを生
じたことを実証した。
疫において観察されたことを示した。消失曲線の反応速度論(図15)は変動す
るが、B.pertussisは、両方の場合において有効に消失し、チャレン
ジ後14日でCFU計数は1(log10)未満であった。今日のほとんどの成人
は、筋肉内百日咳ワクチンを受けている。これは、この例において筋肉内初回刺
激により表される。このデータは、LT−K63アジュバントでの鼻内追加免疫
がワクチン接種の有効方法であることを示す。
効なアジュバントであることも示す。この抗原に対する鼻内増強は、キトサンを
用いて報告されているが、これは、穏和なIgAおよびT細胞の応答について3
回の免疫を必要とした。対照的に、LT−K63は、2回のみの鼻内免疫後のI
gG、IgA、IL−4およびIL−5の強力な応答を誘導し得た。類似のレベ
ルの抗DT中和抗体もまた、キトサンを用いたのと同様に生成された。
内にとどめつつ改変がなされ得ると理解される。
)
内でのT細胞応答を示す。このアッセイにおいて使用されるそのT細胞刺激は、
PT(充填された)、FHA(診断シェード)、またはB.pertussis
細菌(水平線)であった。Paワクチン(FHA+rPT)は、LT−K63ア
ジュバントのあるなしで、軽いハロセン麻酔のあるなしで送達された。PBSは
コントロールであった。
LT−R72アジュバントについて類似のデータを示す。PMA/CD3(陰な
し)を、陽性コントロールとして使用した。
バントを用いた結果を示し、そして3Bは、LT−R72アジュバントを用いた
結果を示す。黒棒は、抗PT応答を示し、白棒は、抗FHA応答を示す。
を示す。
消失の反応速度論を示す。5Aは、LT−K63を用いた結果を示し、そして5
Bは、LT−R72を用いた結果を示す。結果は、1回の実験群当たり、1時点
当たり4匹のマウスからの個々の肺についての平均の生B.pertussis
である。
i)LT−K63アジュバントおよび鼻内投与(黒棒)を比較する、DTPaワ
クチンにおける5個の抗原に対する、IgAおよびIgG応答を示す。
した、D(下)、T(中)、およびPa(上)のDTPaワクチン成分に対する
、T細胞増殖(3H−CPMで測定した)を示す。
(上)および肺ホモジネートIgA(下)の力価(log10)を示す。
る場合、Pa単独に対する統計学的有意(ステューデントのt検定)は、*(p
<0.05)または**(p<0.01)のいずれかによって表す。
Claims (13)
- 【請求項1】 粘膜DTPaワクチンであって、以下: (a)ジフテリア抗原、破傷風抗原および無細胞百日咳抗原;ならびに (b)コレラ毒素またはE.coli熱不安定性毒素のいずれかの無毒化形態
、 を含む、DTPaワクチン。 - 【請求項2】 前記化合物(b)は、LT−K63またはLT−R72であ
る、請求項1に記載のDTPaワクチン。 - 【請求項3】 鼻内投与に適合された、請求項1または請求項2に記載のD
TPaワクチン。 - 【請求項4】 前記無細胞百日咳抗原は、無毒化百日咳完全毒素および糸状
赤血球凝着素、ならびに必要に応じてペルタクチンを含む、請求項1〜3のいず
れか1項に記載のDTPaワクチン。 - 【請求項5】 前記無毒化百日咳完全毒素は、9K/129G二重変異体で
ある、請求項4に記載のDTPaワクチン。 - 【請求項6】 前記ジフテリア抗原は、CRM197変異体であり、そして
前記破傷風抗原は、破傷風トキソイドである、請求項1〜5のいずれか1項に記
載のDTPaワクチン。 - 【請求項7】 非DTPa抗原をさらに含む、請求項1〜6のいずれか1項
に記載のDTPaワクチン。 - 【請求項8】 患者において免疫応答を惹起する方法であって、請求項1 〜7のいずれか1項に記載のワクチンを患者に投与する工程を包含する、方法。
- 【請求項9】 前記患者は小児である、請求項8に記載の方法。
- 【請求項10】 前記ワクチンは、追加免疫として与えられる、請求項8に
記載の方法。 - 【請求項11】 以下: (a)ジフテリア抗原、破傷風抗原および無細胞百日咳抗原;ならびに (b)ワクチンとしての使用のための、コレラ毒素またはE.coli熱不安
定性毒素のいずれかの無毒化形態、 を含む、組成物。 - 【請求項12】 百日咳、ジフテリアおよび破傷風に対して、患者をワクチ
ン接種するための鼻内医薬を製造するにおける、コレラ毒素またはE.coli
熱不安定性毒素の無毒化変異体の使用。 - 【請求項13】 百日咳、ジフテリアおよび破傷風に対する患者の追加免疫
ワクチン接種のための鼻内医薬の製造における、コレラ毒素またはE.coli
熱不安定性毒素の無毒化変異体の使用。
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