JP2003510054A5

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Publication number: JP2003510054A5
Application number: JP2001525396A
Authority: JP
Filing date: 2000-09-22
Publication date: 2007-11-08

Description

【書類名】明細書
【発明の名称】一塩基多形性の平行遺伝子型決定用の三次元マイクロアレイシステム
【特許請求の範囲】
【請求項１】マイクロアレイに含まれるオリゴヌクレオチドプローブの一塩基伸長を検出するための装置であって、上記伸長がポリメラーゼによって、生物学的サンプル中の核酸のヌクレオチド配列に特異的になされ、当該装置が、
（ａ）複数の試験部位のアレイを含む支持基体と、
（ｂ）試験部位で該支持基体と接触している複数の多孔質ポリマーパッドと、
（ｃ）試験部位で該多孔質ポリマーパッドと接触している複数のリンカー部分と、
（ｄ）５’残基と３’残基とを有する複数のオリゴヌクレオチドプローブであって、５’残基でリンカー部分に固定化され、生物学的サンプル中の標的核酸と特異的に結合又は相互作用するオリゴヌクレオチドプローブと、
（ｅ）多孔質ポリマーパッド、リンカー部分及びオリゴヌクレオチドと接触している反応溶液であって、ハイブリダイゼーション緩衝液、ポリメラーゼ、さらに連鎖停止ヌクレオチド種を含む複数のプライマー伸長単位を含み、異なる連鎖停止ヌクレオチド種の各々が他の検出可能な標識と識別できる異なる検出可能な標識と結合している反応溶液と、
（ｆ）標識された連鎖停止ヌクレオチド種を検出するための検出器と
を含んでおり、
上記生物学的サンプルが上記オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズする核酸を含む場合であって、しかも中乃至高度ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で該核酸を試験部位に曝露した場合に、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が少なくとも１つの標識された連鎖停止ヌクレオチドを組み込んで伸長し、
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブの３’残基が標的核酸中の多形性残基と相補的である、装置。
【請求項２】前記標識が蛍光標識である、請求項１記載の装置。
【請求項３】オリゴヌクレオチドプローブの一塩基伸長を検出するためのマイクロアレイを含む装置であって、上記伸長がポリメラーゼによって、生物学的サンプル中の核酸のヌクレオチド配列に特異的になされ、当該装置が、
（ａ）複数の試験部位のアレイを含む支持基体と、
（ｂ）試験部位で該支持基体と接触している複数の多孔質ポリマーパッドと、
（ｃ）試験部位で該多孔質ポリマーパッドと接触している複数のリンカー部分と、
（ｄ）５’残基と３’残基とを有する複数のオリゴヌクレオチドプローブであって、５’残基でリンカー部分に固定化され、生物学的サンプル中の標的核酸と特異的に結合又は相互作用するオリゴヌクレオチドプローブと、
（ｅ）多孔質ポリマーパッド、リンカー部分及びオリゴヌクレオチドと接触している反応溶液であって、ハイブリダイゼーション緩衝液、ポリメラーゼ、さらに連鎖停止ヌクレオチド種を含む複数のプライマー伸長単位を含み、異なる連鎖停止ヌクレオチド種の各々が他の検出可能な標識と識別できる異なる検出可能な標識と結合している反応溶液と、
（ｆ）標識された連鎖停止ヌクレオチド種を検出するための検出器と
を含んでおり、
上記生物学的サンプルが上記オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズする核酸を含む場合であって、しかも中乃至高度ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で該核酸を試験部位に曝露した場合に、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が少なくとも１つの標識された連鎖停止ヌクレオチドを組み込んで伸長し、
上記核酸とハイブリダイズする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブの３’残基が、標的核酸中の多形性残基のすぐ３’側の隣接ヌクレオチドと相補的である、装置。
【請求項４】前記標識が蛍光標識である、請求項３記載の装置。
【請求項５】請求項１記載の装置を用いてマイクロアレイに含まれるオリゴヌクレオチドプローブの一塩基伸長を検出する方法であって、上記伸長がポリメラーゼによって、生物学的サンプル中の核酸のヌクレオチド配列に特異的になされ、当該方法が、
（ａ）マイクロアレイ中に含まれるオリゴヌクレオチドプローブを、マイクロアレイ中に含まれるオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする標的核酸を含む生物学的サンプルに、中乃至高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイゼーション緩衝液、ポリメラーゼ、及び複数の標識された連鎖停止ヌクレオチド種を含む反応溶液中で曝露する工程と、
（ｂ）マイクロアレイ中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが生物学的サンプル中の標的核酸とハイブリダイズし、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブが少なくとも１つの標識された連鎖停止ヌクレオチド種と共に一塩基伸長を起こすのに十分な時間及び温度でマイクロアレイをインキュベートする工程、及び
（ｃ）オリゴヌクレオチド中に組み込まれた、標識された連鎖停止ヌクレオチド種を検出する工程
を含んでおり、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブの３’残基が標的核酸中の多形性残基と相補的である、方法。
【請求項６】前記標識が蛍光標識である、請求項５記載の方法。
【請求項７】請求項１記載の装置を用いてマイクロアレイに含まれるオリゴヌクレオチドプローブの一塩基伸長を検出する方法であって、上記伸長がポリメラーゼによって、生物学的サンプル中の核酸のヌクレオチド配列に特異的になされ、当該方法が、
（ａ）マイクロアレイ中に含まれるオリゴヌクレオチドプローブを、マイクロアレイ中に含まれるオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする標的核酸を含む生物学的サンプルに、中乃至高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイゼーション緩衝液、ポリメラーゼ、及び複数の標識された連鎖停止ヌクレオチド種を含む反応溶液中で曝露する工程と、
（ｂ）マイクロアレイ中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが生物学的サンプル中の標的核酸とハイブリダイズし、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブが少なくとも１つの標識された連鎖停止ヌクレオチド種と共に一塩基伸長を起こすのに十分な時間及び温度でマイクロアレイをインキュベートする工程、及び
（ｃ）オリゴヌクレオチド中に組み込まれた、標識された連鎖停止ヌクレオチド種を検出する工程
を含んでおり、上記核酸とハイブリダイズする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブの３’残基が、標的核酸中の多形性残基のすぐ３’側の隣接ヌクレオチドと相補的である、方法。
【請求項８】前記標識が蛍光標識である、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一塩基伸長分析による核酸変異及び遺伝子多形性の検出法に関する。特に、本発明は、ポリマーヒドロゲル系マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）の所定の領域と結合したオリゴヌクレオチドと生物学的サンプル中の核酸との間のハイブリダイゼーション後にオリゴヌクレオチドマイクロアレイにおける特定のオリゴヌクレオチドの一塩基伸長を検出するための装置及び方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
核酸における一塩基変異及び遺伝子多形性の検出は、現代の診断医学及び生物学的研究において重要な手段である。加えて、核酸に基づく分析も、感染性微生物、例えば、バクテリア及びウイルスの同定、正常及び不完全な遺伝子発現のレベルの評価、並びに腫瘍遺伝子などの疾患に関連する変異遺伝子の検出及び同定において重要な役割を果たす。かかる分析の速度、有効性、経済性及び特異性における改善は、医学分野において非常に必要とされている。
【０００３】
理想的には、かかる分析は、感度が高く、特異的で、容易に自動化できるものでなければならない。核酸分析における感度を向上させるための工夫は従来技術において公知である。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（Mulis、米国特許第４６８３１９５号、１９８７年７月２８日発行）では、サンプル中に有用な量（約１μｇ）の特定の核酸を産生する能力を提供する（特定の核酸の当初の量はこれよりも実質的に少ない（約１ｐｇ））。しかしながら、従来技術は核酸ハイブリダイゼーション分析の特異性を向上させるのにあまりうまくいっていなかった。
【０００４】
核酸分析の特異性は、プローブと標的配列間のハイブリダイゼーションの分子相補性の程度により決定される。相補性標的を１又は２の不適当な標的と、厳密に定義された条件下で識別することは理論的には可能であるが、ハイブリダイゼーションの標的／プローブ濃度及びハイブリダイゼーション条件に対する依存性により、ハイブリダイゼーションミスマッチを、とりわけ変異及び遺伝子多形性を高い信頼性で検出するために用いることができる範囲が制限される。
【０００５】
一塩基伸長の検出は、従来技術において変異及び遺伝子多形性検出に用いられてきた。
米国特許第５９２５５２０号は、一塩基伸長を用いた遺伝子多形性の検出法及び少なくとも２種のジデオキシ連鎖停止ヌクレオチド三リン酸（各々、検出可能で識別可能な蛍光標識基で標識されている）を用いたオリゴヌクレオチドプローブ上の捕捉基を開示している。
米国特許第５７１００２８号は、問題の核酸中の特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を、検出可能に標識された連鎖停止ヌクレオチド（各々、蛍光標識基で検出可能・識別可能に標識されている）を用いて決定する方法を開示している。
【０００６】
米国特許第５５４７８３９号は、問題の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を、光除去可能な保護基を含む連鎖停止ヌクレオチドを用いて決定する方法を開示している。
米国特許第５５３４４２４号は、問題の核酸の特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を、伸長プライマーにアニールされ、４種の連鎖停止種のうちの１つで伸長された４のアリコートの各々を用いて決定し、その後４種の鎖伸長ヌクレオチドすべてでさらに伸長して、問題の位置でのヌクレオチドの同一性を、一塩基以上にプライマーが伸長されないことにより確認する方法を開示する。
【０００７】
米国特許第４９８８６１７号は、２つの隣接するヌクレオチドプライマーを標的核酸とアニールし、２つのオリゴヌクレオチドを共有結合するリガーゼのような連結剤を与えて、２つのオリゴヌクレオチドが第一のオリゴヌクレオチドの３’区域及び第二のオリゴヌクレオチドの５’区域で標的核酸と完全に一致する条件下でのみ、第三の結合したオリゴヌクレオチドを生じさせることにより、問題の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決定する方法を開示している。
【０００８】
米国特許第４６５６１２７号は、連鎖停止又はエキソヌクレアーゼ耐性リガーゼを含む他のヌクレオチドでのプライマー伸長を使用し、続いて複数の伸長生成物をエキソヌクレアーゼ処理して、耐性種を検出することによる、問題の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決定する方法を開示している。
【０００９】
（発明が解決しようとする課題）
バイオチップマイクロアレイは、一般に固体支持基体、付着マトリックス、及び付着マトリックスに固定された複数の生体分子プローブを含む。ポリマーヒドロゲルパッド、特にポリアクリルアミドゲルパッドは、様々なバイオチップマイクロアレイにおいて付着マトリックスとして用いられてきた（米国特許第５５５２２７０号、同第５６１６４７８号、同第５７３６２５７号及び同第５７４１７００号参照）。ポリマーヒドロゲルパッドから作られたマイクロアレイは他の種類のマイクロアレイよりも経済的であり、より広範囲の多様な官能基を生体分子固定に使用できるので、そのマイクロアレイが明らかに有利である。さらに、ポリマーヒドロゲルは、三次元構造を提供し、これによりより多くの生体分子プローブを付着させることができ、これにより、固定されたプローブと生物学的サンプルにおける標的分子間の相互作用の可能性が増大する。
この分野において、問題の核酸を含む生物学的サンプルにおける変異及び遺伝子多形性を検出するための核酸分析の一塩基伸長生成物を検出するための、簡単で、経済的で、かつ有効な方法が依然として必要とされている。
【００１０】
（課題を解決するための手段）
本発明は、一塩基伸長分析による核酸変異及び遺伝子多形性の検出法を提供する。特に、本発明は、ポリマーヒドロゲル系マイクロアレイの所定の領域と結合したオリゴヌクレオチドと生物学的サンプルにおける核酸間のハイブリダイゼーション後のオリゴヌクレオチドマイクロアレイにおける特定のオリゴヌクレオチドの一塩基伸長を検出するための装置及び方法を提供する。
本発明は、問題の核酸を含む生物学的サンプルにおける変異及び遺伝子多形性を検出するための方法及び装置を提供する。本発明の方法及び装置を用いた一塩基伸長の検出は、標識された連鎖停止ヌクレオチド種を配列特異的に組み込むことにより達成される。好ましい実施形態では、一塩基伸長は、オリゴヌクレオチドアレイ、最も好ましくはアドレス可能なアレイとのハイブリダイゼーションを用いて行われ、各オリゴヌクレオチドの配列は公知であり、アレイ中の特定のアドレスと関連する。
【００１１】
本発明の実施において、本発明は、リンカー部分により多孔質ポリマーパッドに固定された、オリゴヌクレオチドプローブのアレイを提供する。好ましくは、アレイにおける各々の同定された試験部位（又は「アドレス」）での各オリゴヌクレオチドの配列は公知であり、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、分析される生物学的サンプル中に含まれる核酸（「標的」又は「標的核酸」と称する）における配列と相補的である。
【００１２】
本発明の一実施形態では、分析される（つまり、ヌクレオチド位置で変異又は遺伝子多形性の存在の有無を決定するための）サンプル核酸におけるヌクレオチドの位置に直接隣接する位置とハイブリダイズするように、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの配列が選択される。本文における「隣接」なる用語は、分析される塩基の１ヌクレオチド塩基上流、すなわち、標的ＤＮＡの鋳型鎖に関しては３’方向における位置を包含することを意図する。アレイにおけるオリゴヌクレオチドプローブのサンプル中の核酸とのハイブリダイゼーションは、前記オリゴヌクレオチドプローブを含む試験部位で、ハイブリダイゼーション緩衝液中で、サンプル中の核酸と前記核酸と相補的であるアレイ中のオリゴヌクレオチドプローブ間にハイブリダイゼーションが起こるような時間及び温度で行われる。一塩基伸長は、ポリメラーゼ、最も好ましくは耐熱性ポリメラーゼを用いて、標識された連鎖停止プライマー伸長単位の存在下で行われる。好ましい実施形態では、各連鎖停止ヌクレオチド種（例えば、ジデオキシ（ｄｄ）ＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ及びｄｄＴＴＰ）は、異なる標識、最も好ましくは放射性標識、電気化学的標識又は蛍光染料と結合される。一塩基伸長は、例えば、慣用の光学検出法を用いて、オリゴヌクレオチド中に組み込まれた標識の同一性を定量することにより検出される。
【００１３】
本発明の方法のもう一つの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブの配列は、標的核酸とハイブリダイズして、オリゴヌクレオチドの３’残基が、変異又は遺伝子多形性を調べられる標的核酸におけるヌクレオチド位置に対応するように選択される。アレイにおいて、標的核酸と配列同一性を有するオリゴヌクレオチドプローブは３’残基でハイブリダイズし、以下に記載するようにポリメラーゼにより媒介される一塩基伸長段階において伸長できる。３’残基に対応する位置で多形性である標的核酸とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションも（ハイブリダイゼーション条件は、かかるハイブリダイゼーションを可能にするように選択されるので）ハイブリダイズすることができるが、ミスマッチでハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドの３’残基で「ミスマッチ」が存在する。この実施形態では、オリゴヌクレオチドの３’残基で適切にハイブリダイズされた標的核酸種とハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドのみが、ミスマッチを認識しないポリメラーゼを用いて伸長される。したがって、本発明の方法において、一塩基伸長は多形性部位に隣接する部位に向けられ、最も好ましくは、単一の、標識された連鎖停止種のみを用いてアドレスすることができる非多形性部位を含む。
本発明の特定の好ましい実施形態は、後記の好ましい実施形態のさらに詳細な説明及び請求の範囲から明らかになるであろう。
【００１４】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は、一塩基伸長分析による、核酸変異及び遺伝子多形性、好ましくは一塩基多形性（ＳＮＰ）の検出法を提供する。特に、本発明はポリマーヒドロゲル系マイクロアレイの所定の領域と結合したオリゴヌクレオチドと生物学的サンプル中の核酸間のハイブリダイゼーション後のオリゴヌクレオチドマイクロアレイにおける特定のオリゴヌクレオチドの一塩基伸長を検出するための装置及び方法を提供する。
【００１５】
本発明において使用する場合、「アレイ」なる用語は、整列した空間的配列、特に複数の試験部位での固定された生体分子の列を意味する。
本発明において使用する場合、「アドレス可能なアレイ」なる用語は、各試験部位が正確に定義されたｘ−及びｙ−座標を有し、したがってアレイにおける特定の位置の所定の試験部位を同定することができるアレイを意味する。
本発明において使用する場合、「プローブ」及び「生体分子プローブ」なる用語は、相補性生体分子（本発明において標的分子と称する）、好ましくは核酸を検出するために用いられる生体分子、特にオリゴヌクレオチドを意味する。
【００１６】
本発明において使用する場合、「マイクロアレイ」、「バイオチップ」及び「バイオチップアレイ」なる用語は、固体支持基体上の試験部位で整列した固定された生体分子プローブの整列した空間的配列を意味する。当該分野において用いられるバイオチップは、生物学的結合対の一構成要素を含む生物学的分子のアレイ又はマイクロアレイ、好ましくは整列したアレイ、最も好ましくは整列したアドレス可能なアレイを含む基体を包含する。本発明のマイクロアレイは、好ましくは生物学的サンプル中に存在するか又は存在することが予想される少なくとも１つの配列と相補的であるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドアレイである。
【００１７】
本発明において使用する場合、「試験部位」なる用語は、複数のプローブ分子が固定される基体上の予め定義された領域を意味する。試験部位は、任意の都合のよい形状、例えば、円形、長方形、楕円形又はくさび形を有する。本発明の装置の好ましい実施形態では、試験部位は約１ｃｍ²の面積を有する。さらに好ましい実施形態では、試験部位は１ｍｍ²未満、０．５ｍｍ²未満、約１００００μｍ²未満、又は１００μｍ²未満の面積を有する。
【００１８】
本発明の装置は、感染性、遺伝子疾患の診断のために標的核酸を分析するために特に有用である。標的核酸は、一般に感染性因子又は遺伝子疾患、さらに詳細には一塩基（又は点）変異により引き起こされる疾患に関連する既知ヌクレオチド配列を有する遺伝子の一部である。装置は、標的遺伝子に対して特異的な核酸オリゴヌクレオチドアレイ、及びオリゴヌクレオチドアレイにおける少なくとも１つのプローブのハイブリダイゼーション部位に隣接するか（「３’オフセット法と称する」又はアレイにおける少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブの３’残基を含む（「３’包含法」と称する）標的配列における特定の一塩基の同一性を検出し、決定する手段が組み込まれている。
【００１９】
本発明は、ヒドロゲル系付着マトリックスに固定されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイを提供する。好ましくは、アレイ中の各アドレスでの各オリゴヌクレオチドの配列は既知であり、前記オリゴヌクレオチドアレイにおけ少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、分析されるサンプル中の核酸の配列の一部に対して相補的である。少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列は、変異又は遺伝子多形性に関して調べられるサンプル核酸におけるヌクレオチド位置のすぐ隣の位置まで伸長されるように選択されるのが最も好ましい。別法として、オリゴヌクレオチドは、変異又は遺伝子多形性の部位を包含するように選択されるが、後者の実施形態では、単一オリゴヌクレオチド、最も好ましくは野生型対立遺伝子又は種の配列を有する単一オリゴヌクレオチド、或いはアレイ中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドがサンプル中の核酸と確実にハイブリダイズするように、多形性位置で各々可能なヌクレオチドの１つを有する多数のオリゴヌクレオチドを提供するのが一般的に好ましい。ハイブリダイゼーション及び伸長反応は、反応チャンバー中、ハイブリダイゼーション緩衝液中、サンプル中の核酸とこれに相補的なアレイ中のオリゴヌクレオチド間にハイブリダイゼーション及び一塩基伸長が起こる時間及び温度で行われる。
【００２０】
本発明の一実施形態では、装置は試験部位のアレイを含む支持基体と、試験部位で該支持基体と接触している複数の多孔質ポリマーパッドと、試験部位で多孔質ポリマーパッドと接触している複数のリンカー部分と、リンカー部分に固定された複数のオリゴヌクレオチドプローブ（前記オリゴヌクレオチドプローブは生物学的サンプル中の核酸と特異的に結合又は相互作用する）と、多孔質ポリマーパッドと接触している反応溶液と、リンカー部分と、及びオリゴヌクレオチドプローブ（反応溶液は、ハイブリダイゼーション緩衝液、ポリメラーゼ、連鎖停止ヌクレオチド種をさらに含む複数のプライマー伸長単位を含み、各異なる連鎖停止ヌクレオチド種は識別可能な標識と結合している）と、及び標識された連鎖停止ヌクレオチド種を検出する手段を含む。
【００２１】
本発明の装置の支持基体は、ガラス、珪素、窒化珪素、プラスチック、ゴム、織物、セラミック、プリント回路板、化合物半導体（ＧａＡｓ）、又はその組合せを包含するが、これに限定されない任意の固体物質からつくられるのが有利である。好ましい実施形態では、本発明の装置の支持基体は、珪素又はガラスから構成される。支持基体は、１〜約１０⁸の試験部位を含み、約０．０１μｍ²から約５ｃｍ²間の表面積を有する。好ましい実施形態では、支持基体は、約１００００μｍ²の表面積を有し、約１０⁴の試験部位を含む。好ましい実施形態では、試験部位は、約０．０５μｍ〜０．５ｍｍの間隔で離れるように支持基体上に配列される。さらに好ましい実施形態では、試験部位は均一な間隔で固体支持基体上に規則正しく区切られている。好ましくは、任意の特定の部位のオリゴヌクレオチドプローブは、互いに同一であるが、各試験部位は該試験部位に独特のオリゴヌクレオチドプローブを含む。
【００２２】
本発明の装置の多孔質ポリマーパッドは、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲル、ポリエチレングリコール、セルロースゲル、ゾルゲル、ポリピロール、炭素、カーバイド、酸化物、窒化物、又は当業者に一般的な他の多孔質ポリマー物質を包含するが、これに限定されない物質で構成される。好ましい実施形態では、多孔質ポリマーパッドはポリアクリルアミドゲルを含む。装置の多孔質ポリマーヒドロゲルマトリックスは、本願出願人による同時係属中の米国特許出願番号０９／３４４２１７号、同第０９／３４４６２０号及び同０９／４３８２０９号（各々出典明示により本発明の一部とする）に記載されている方法を用いて製造され、生体分子プローブをこれに固定することができる。
【００２３】
本発明において使用されるプローブは、好ましくは、経験的に決められる長さの上限及び下限を有するオリゴヌクレオチドである。短すぎるプローブは、分析のハイブリダイゼーション条件下で一塩基伸長することができる熱力学的に安定な二本鎖を形成しないことは当該分野においてよく知られているので、オリゴヌクレオチドの長さの下限は、安定なハイブリダイゼーションに必要な長さである。オリゴヌクレオチドの長さの上限は、予め決められた調査標的以外の領域において二本鎖を産生し、標識されたプライマー伸長単位を人工的に組み込むのに必要な長さである。本発明において使用される好ましいオリゴヌクレオチドプローブは、約８〜約５０、より好ましくは約１０〜約４０、さらにより好ましくは約１２から約３０、最も好ましくは約１５〜２５ヌクレオチドの長さを有する。しかしながら、さらに長いプローブ、すなわち、４０ヌクレオチドより長いものも使用することができる。オリゴヌクレオチドは、その５’末端で、多孔質ポリマーパッドに固定され、オリゴヌクレオチドの３’末端は前記のようなポリメラーゼを使用した一塩基伸長に利用可能な状態である。
【００２４】
本発明のある実施形態では、リンカー部分は、共役ポリマー又はコポリマーフィルムを含む。かかる共役ポリマー又はコポリマーフィルムは、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリアニリン、ポリフラン、ポリピリジン、ポリカルバゾール、ポリフェニレン、ポリ（フェニレンビニレン）、ポリフルオレン、又はポリインドール、或いはその誘導体、コポリマー、又はその組合せを包含するが、これに限定されない。もう一つの好ましい実施形態では、リンカー部分は天然のピロールマトリックスを含む。さらに別の実施形態おいて、リンカー部分はチオールリンカーを含む。さらに他の実施形態では、リンカー部分はさらにストレプタビジンを含む（また、プローブ分子はビオチニル化される）。
【００２５】
本発明の方法及び装置を用いた一塩基伸長を行うための好ましいポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性をほとんど又は全く有さないポリメラーゼである。生理学的温度よりも高い温度、例えば、５０℃又は６０℃又は７０℃で耐性であり、生合成的に活性であるポリメラーゼ、或いは少なくとも９０℃〜約９５℃の温度に耐性であるポリメラーゼがさらに好ましい。好ましいポリメラーゼは、Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓから得られるＴａｑポリメラーゼ（Perkin-Elmer Cetus, Foster City, CAから商業的に入手可能）、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ及びＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（U.S. Biochemical, Cleveland, OHから商業的に入手可能）、及びＥｘｏ（−）Ｐｆｕポリメラーゼ（New England Biolabs, Beverley, MAから商業的に入手可能）を包含する。
【００２６】
本発明のさらに他の実施形態では、装置はさらに複数のウェルを含み、各ウェルは多孔質ポリマーパッドを包含し、複数のオリゴヌクレオチドプローブは、該多孔質ポリマーパッドと接触しているリンカー部分に固定される。「ウェル」なる用語は、本発明においては、慣用的な意味において、多孔質ポリマーパッドが所定の体積において含まれている支持基体の部分を説明するために使用され、前記ウェルは該支持基体の表面から突出しているか、又はその中に埋め込まれている。好ましくは、任意の特定のウェルにおけるオリゴヌクレオチドプローブは、互いに同じであり、各ウェルはそのウェル独自のオリゴヌクレオチドプローブを含む。
【００２７】
本発明により提供されるＳＮＰ検出のための本発明の方法は、一般に：（１）特定位置におよぶ一本鎖核酸を得るための問題の標的核酸を含むサンプルを（典型的にはサンプルを変性することにより）調製する；（２）一本鎖標的核酸を、調査されるヌクレオチド塩基のすぐとなりの標的核酸におけるヌクレオチド配列の一部とハイブリダイズする既知配列を有するオリゴヌクレオチドプローブと接触させる（これにより、調査されるヌクレオチド配列が、二本鎖におけるプライマーの３’−末端とアニールされたヌクレオチド塩基のすぐ５’側の標的における第一の対になっていない塩基となるようにプライマーと標的の間に二本鎖を形成する；このオリゴヌクレオチドは好ましくはアドレス可能なアレイにおける特定のアドレスを占める特異的オリゴヌクレオチドである）；（３）二本鎖を、緩衝溶液、ポリメラーゼ、及び少なくとも１つのプライマー伸長単位を含む試薬と接触させる（ここに、プライマー伸長単位は、伸長部分、最も好ましくは連鎖停止ヌクレオチド、任意のリンカー、及び検出可能な標識を含む。ポリメラーゼにより触媒されるプライマー伸長反応の結果、プライマーの３’−末端でプライマー伸長単位の伸長部分が組み込まれ、一塩基によりプライマーが伸長される）；（４）組み込まれなかったプライマー伸長単位を除去する；（５）独自の標識又はタグにより伸長された二本鎖中の組み込まれたプライマー伸長単位の同一性を確認することを含む。好ましい標識又はタグは、例えば、放射性標識、電気化学的標識及び蛍光染料を包含する。
【００２８】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、複数の標的核酸の多形性種のうちの１つに対してのみ相補性であるように構築される。これらの実施形態では、３’残基を包含するオリゴヌクレオチド全体に対して相補性である標的核酸は、オリゴヌクレオチドの一塩基伸長及びその中への標識されたプライマー伸長単位の組み込みを支持し、一方、オリゴヌクレオチドの３’残基と相補性でない標的核酸はオリゴヌクレオチドの一塩基伸長を支持せず、標識されたプライマー伸長単位は組み込まれない。これらの実施形態では、組み込まれたプライマー伸長単位は、好ましくは多形性部位のすぐ隣の部位に対して相補性であり、該部位は、好ましくは非多形性である。
【００２９】
プライマー伸長単位における伸長部分は、好ましくは、連鎖停止部分であり、最も好ましくは、ジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）、例えば、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、及びｄｄＴＴＰである；しかしながら、当業者に一般的な他のターミネーター、例えば、アシクロヌクレオチド類似体又はアラビノシド三リン酸も本発明の範囲に含まれる。これらのｄｄＮＴＰは、一般的なデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）と、糖成分の３’位でヒドロキシル基がない点で異なる。これにより、組み込まれたｄｄＮＴＰの鎖伸長が防止され、したがって鎖が停止する。本発明は、電気化学的、光学的又は放射性検出器を用いて検出することができる、例えば、電気化学的標識、蛍光染料又は放射性標識で標識されたプライマー伸長単位を提供する。しかしながら、ｄｄＮＴＰのヌクレオチド鎖中への取り込みを妨害しない任意の標識を使用することができる。
【００３０】
所望により、調査されるサンプル中の標的ＤＮＡを、当業者に一般的なインビトロ増幅反応、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術により増幅することができる。本発明の方法において使用される生物学的サンプル中の標的ＤＮＡの精製により、ポリメラーゼにより、より迅速で、より正確な鋳型による合成ができる。
【００３１】
一塩基伸長は、ポリメラーゼの生化学的活性に適当な緩衝溶液中、少なくとも１つのプライマー伸長単位の存在下で行われる。プライマー伸長単位の好ましい実施形態の一般式は：
ｄｄＮＴＰ−Ｌ−^*
（式中、ｄｄＮＴＰは、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰを包含するジデオキシリボヌクレオチド三リン酸を表し、Ｌは任意のリンカー部分を表し、^*は適当な標識又はタグを表す）である。好ましい実施形態では、各連鎖停止ヌクレオチド種（例えば、ジデオキシ（ｄｄ）ＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ及びｄｄＴＴＰ）は異なる標識で標識される。
【００３２】
本発明の連鎖停止ヌクレオチドを含む標識は、所望により、好ましくは約１０〜約２０オングストロームの長さを有するリンカー（Ｌ）により、伸長ヌクレオチドと結合されていてもよい。リンカーは、有機部分、例えば、炭化水素鎖（ＣＨ₂）_mであるか、又はエーテル、エステル、カルボキシアミド、又はチオエーテル部分を含むことができるか、或いはその組合せである。リンカーは無機部分、例えばシロキサン（Ｏ−Ｓｉ−Ｏ）であってもよい。リンカーの長さは、結合したオリゴヌクレオチドプローブと標的核酸間の核酸ハイブリダイゼーション、又はポリメラーゼにより媒介される鎖伸長のいずれかを標識が妨害しないように選択される。
【００３３】
一塩基伸長反応を実施するために本発明の装置を使用する際に、少なくとも１つの標識された連鎖停止ヌクレオチド、ポリメラーゼと適合性で、分析条件下で標的核酸及びオリゴヌクレオチドプローブ間のハイブリダイゼーションを可能にする塩濃度を有するハイブリダイゼーション緩衝液、及びＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ又はＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅを含むように反応混合物が調製される。一本鎖標的核酸、例えば、９０℃より高い温度でのインキュベーションにより変性されたものを、脱イオン水中、ハイブリダイゼーションに適当な濃度まで希釈し、反応混合物に添加する。結果として得られるハイブリダイゼーション混合物を、本発明の装置のポリマーヒドロゲルパッドと接触させる（該パッドはそれに結合した配列が既知の複数のプローブを有する）。少なくとも１つのプローブは、分析において採用されるハイブリダイゼーション条件下で調査されるヌクレオチド塩基を含む標的のヌクレオチド配列の一部とハイブリダイズできるヌクレオチド配列を有する。
【００３４】
一実施形態では、プローブと標的間に二本鎖が形成され、調査されるヌクレオチド塩基は、二本鎖におけるプライマーの３’−末端とアニールされるヌクレオチド塩基のすぐ５’側の標的核酸における第一の対になっていない塩基である。アニールされたプローブの３’末端の一塩基伸長は、標識された連鎖停止ヌクレオチドをプローブ中に組み込むことにより達成される。プローブ配列及び標識された連鎖停止ヌクレオチドは、ヌクレオチドの取り込みが、標的において調査されるヌクレオチドの同一性（すなわち、変異体、野生型又は多形性）の情報を与えるように選択される。
【００３５】
別法として、プローブは、調査される塩基に対応し、これとハイブリダイズする３’末端残基を含む。これらの実施形態では、３’末端残基で「ミスマッチ」を有するオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズするが、ポリメラーゼにより伸長されない。標識を調査することによりプライマー伸長単位の取り込みが検出されることは、オリゴヌクレオチドプローブの配列が、アレイ中の各位置で既知であるならば、調査されるヌクレオチド塩基が同一であることを示唆する。
【００３６】
一塩基伸長反応を実施した後、試験部位を高厳重度（すなわち、低塩溶液中、例えば、０．１×ＳＳＣ、０．０１５ＭＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、所望により界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムを含む）で、約１０〜６５℃の温度で、標的核酸が除去される時間及び温度で洗浄する。洗浄条件は、プローブの長さ及びプローブの複雑さなどのファクターによって変わる。一塩基伸長の検出を、その後、電気化学的、蛍光又は放射性標識を検出するための慣例的検出手段を用いて行う。
【００３７】
前記開示は本発明のある特定の実施形態に重点をおき、これと同等の修正又は代案は請求の範囲において記載される本発明の精神及び範囲に含まれると理解される。