JP2003509469A - 経口用組換え乳酸桿菌ワクチン - Google Patents
経口用組換え乳酸桿菌ワクチンInfo
- Publication number
- JP2003509469A JP2003509469A JP2001524624A JP2001524624A JP2003509469A JP 2003509469 A JP2003509469 A JP 2003509469A JP 2001524624 A JP2001524624 A JP 2001524624A JP 2001524624 A JP2001524624 A JP 2001524624A JP 2003509469 A JP2003509469 A JP 2003509469A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lactobacillus
- plantarum
- vaccine
- virus
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 107
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 title claims abstract description 78
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 title claims abstract description 69
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 157
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 157
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 156
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 claims abstract description 118
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 71
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 65
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 claims abstract description 33
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 claims abstract description 33
- 241000894007 species Species 0.000 claims abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 86
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 65
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 53
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 44
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims description 40
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 claims description 31
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 claims description 31
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 28
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 26
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 22
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 22
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 22
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 claims description 21
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 19
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims description 18
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 17
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 15
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 14
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 14
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 13
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 230000002688 persistence Effects 0.000 claims description 10
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 claims description 9
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 claims description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 8
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 7
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 claims description 7
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 6
- 241000212468 Lactobacillus plantarum 80 Species 0.000 claims description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 6
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 claims description 6
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 claims description 5
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 claims description 5
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 claims description 4
- 241000589886 Treponema Species 0.000 claims description 4
- 239000013566 allergen Substances 0.000 claims description 4
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 4
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 claims description 3
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 claims description 3
- 201000007336 Cryptococcosis Diseases 0.000 claims description 3
- 241000221204 Cryptococcus neoformans Species 0.000 claims description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 3
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 claims description 3
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 claims description 3
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 claims description 3
- 241000150452 Orthohantavirus Species 0.000 claims description 3
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 claims description 3
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 3
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 claims description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 3
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims description 3
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 claims description 3
- 244000045947 parasite Species 0.000 claims description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 3
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 3
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 3
- 241000186046 Actinomyces Species 0.000 claims description 2
- 241000712891 Arenavirus Species 0.000 claims description 2
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 claims description 2
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 claims description 2
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 claims description 2
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 claims description 2
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 claims description 2
- 241001445332 Coxiella <snail> Species 0.000 claims description 2
- 241000223935 Cryptosporidium Species 0.000 claims description 2
- 102100027723 Endogenous retrovirus group K member 6 Rec protein Human genes 0.000 claims description 2
- 241000224432 Entamoeba histolytica Species 0.000 claims description 2
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 claims description 2
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 claims description 2
- 241000244009 Filarioidea Species 0.000 claims description 2
- 241000711950 Filoviridae Species 0.000 claims description 2
- 241000224466 Giardia Species 0.000 claims description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 claims description 2
- 241000222722 Leishmania <genus> Species 0.000 claims description 2
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 claims description 2
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 2
- 241000186362 Mycobacterium leprae Species 0.000 claims description 2
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 claims description 2
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 claims description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 claims description 2
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 claims description 2
- 206010037688 Q fever Diseases 0.000 claims description 2
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 claims description 2
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 claims description 2
- 108010079723 Shiga Toxin Proteins 0.000 claims description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims description 2
- 201000005485 Toxoplasmosis Diseases 0.000 claims description 2
- 229940007078 entamoeba histolytica Drugs 0.000 claims description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 claims description 2
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 2
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 claims description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 claims 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 claims 1
- 241000908522 Borreliella Species 0.000 claims 1
- 241001136175 Burkholderia pseudomallei Species 0.000 claims 1
- 241000224467 Giardia intestinalis Species 0.000 claims 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 claims 1
- 208000003926 Myelitis Diseases 0.000 claims 1
- 241000243985 Onchocerca volvulus Species 0.000 claims 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 claims 1
- 229940085435 giardia lamblia Drugs 0.000 claims 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 claims 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims 1
- 108010044241 tetanus toxin fragment C Proteins 0.000 description 57
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 54
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 description 36
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 35
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 20
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 19
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 18
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 description 16
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 description 16
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 15
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 11
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 10
- 229940099472 immunoglobulin a Drugs 0.000 description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 9
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 7
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 6
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 6
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 6
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 5
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 4
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 4
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 4
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000186684 Lactobacillus pentosus Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 2
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186712 Lactobacillus animalis Species 0.000 description 2
- 240000001929 Lactobacillus brevis Species 0.000 description 2
- 241000186840 Lactobacillus fermentum Species 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000003518 caustics Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 2
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 2
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010061629 Dermatophagoides pteronyssinus antigen p 1 Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 241001646719 Escherichia coli O157:H7 Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102100036738 Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-11 Human genes 0.000 description 1
- 241000724675 Hepatitis E virus Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101100283445 Homo sapiens GNA11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000879758 Homo sapiens Sjoegren syndrome nuclear autoantigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- QEZYFJFOYSPYQE-UHFFFAOYSA-N L-prolyl-L-phenylalanyl-L-prolylglycyl-L-prolyl-L-isoleucine Natural products CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C1CCCN1C(=O)CNC(=O)C1N(C(=O)C(CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)C2NCCC2)CCC1 QEZYFJFOYSPYQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000001046 Lactobacillus acidophilus Species 0.000 description 1
- 235000013957 Lactobacillus brevis Nutrition 0.000 description 1
- 241001135786 Lactobacillus cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000186842 Lactobacillus coryniformis Species 0.000 description 1
- 241000218492 Lactobacillus crispatus Species 0.000 description 1
- 241000186673 Lactobacillus delbrueckii Species 0.000 description 1
- 241000186606 Lactobacillus gasseri Species 0.000 description 1
- 241001468157 Lactobacillus johnsonii Species 0.000 description 1
- 241000186871 Lactobacillus murinus Species 0.000 description 1
- 241000186605 Lactobacillus paracasei Species 0.000 description 1
- 241000866650 Lactobacillus paraplantarum Species 0.000 description 1
- 241000186604 Lactobacillus reuteri Species 0.000 description 1
- 241000218588 Lactobacillus rhamnosus Species 0.000 description 1
- 241000186869 Lactobacillus salivarius Species 0.000 description 1
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 1
- 241000589248 Legionella Species 0.000 description 1
- 208000007764 Legionnaires' Disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010065764 Mucosal infection Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 101100219325 Phaseolus vulgaris BA13 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000186429 Propionibacterium Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 230000021839 RNA stabilization Effects 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 241001591005 Siga Species 0.000 description 1
- 102100037330 Sjoegren syndrome nuclear autoantigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 102100038021 Steryl-sulfatase Human genes 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 241000194026 Streptococcus gordonii Species 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000061 acid fraction Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical group C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940096118 ella Drugs 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000688 enterotoxigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- -1 fractions Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000021472 generally recognized as safe Nutrition 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 1
- 230000001571 immunoadjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010820 immunofluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 1
- 231100001039 immunological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 210000001630 jejunum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229940012969 lactobacillus fermentum Drugs 0.000 description 1
- 210000000867 larynx Anatomy 0.000 description 1
- 101150104734 ldh gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 235000021056 liquid food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000006872 mrs medium Substances 0.000 description 1
- 230000016379 mucosal immune response Effects 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000021055 solid food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000020192 tolerance induction in gut-associated lymphoid tissue Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000003211 trypan blue cell staining Methods 0.000 description 1
- OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N ulipristal acetate Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1[C@@H]1C2=C3CCC(=O)C=C3CC[C@H]2[C@H](CC[C@]2(OC(C)=O)C(C)=O)[C@]2(C)C1 OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
- A61K35/741—Probiotics
- A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
- A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/10—Antimycotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
(57)【要約】
ワクチンとして用いるための組換えもしくは改変ラクトバチルスについて述べている。該細菌は異種抗原を細胞内もしくは細菌の表面上のいずれかに発現し、免疫応答を引き出す。該ワクチンは経口投与に適している。好ましい細菌はラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）の種、特にL.プランタルム（L. plantarum） 256である。
Description
【０００１】発明の要約
本発明はワクチン開発の分野のものである。特に本発明は経口ワクチンに関す
る。本発明は、経口投与後に免疫応答を引き出すことのできる抗原の担体として
の組換え非病原性細菌の使用に関する。より特定して述べれば、本発明はラクト
バチルス属の種であるラクトバチルスの使用を包含している。該ラクトバチルス
はラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）に分類されるも
のである。該抗原は該ラクトバチルスの細胞内で、および/もしくはその細胞表
面に露出した形で発現されている。該ワクチンは生菌ワクチンで、生きた微生物
を該抗原の担体として用いているものである。本発明はまた、新規の組換えラク
トバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）およびその作製に用い
るための発現ベクターをも包含している。
る。本発明は、経口投与後に免疫応答を引き出すことのできる抗原の担体として
の組換え非病原性細菌の使用に関する。より特定して述べれば、本発明はラクト
バチルス属の種であるラクトバチルスの使用を包含している。該ラクトバチルス
はラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）に分類されるも
のである。該抗原は該ラクトバチルスの細胞内で、および/もしくはその細胞表
面に露出した形で発現されている。該ワクチンは生菌ワクチンで、生きた微生物
を該抗原の担体として用いているものである。本発明はまた、新規の組換えラク
トバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）およびその作製に用い
るための発現ベクターをも包含している。
【０００２】本発明の背景
当業者は、かねてから現在市販されているサルモネラ・ティフィリウム(Salmo
nella typhimurium)およびマイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis
）などの病原性微生物を弱毒化したものを用いるよりも非病原性の担体をベース
とした経口ワクチンを開発しようとの考え方を持ってきた。そのような弱毒化株
の開発は単調で長期間かかる。そのためには、病原性の排除によって環境もしく
は個体に危険性のない組換え株の開発が必要である。しかしそれらの株は防護的
免疫応答を生じさせるためには免疫原性が維持されていなければならない。また
、遺伝子的に安定な組換え株の開発にも問題がある。もともと病原性である微生
物の使用には、その担体自体に対する免疫応答がブースターワクチンの有効性を
低減させるというという危険性を伴うが、それはそのワクチン接種を受ける個体
が既に担体細菌によってチャレンジを受けていた場合に既に存在している抗体の
存在によって有効性が低減されるのと同様である。最後に、部分的に毒性を有す
る担体株を用いることはその他の担体系を用いるよりも、大きな個体群が危険に
さらされることとなろう。そのような個体群としては幼児、老人、および免疫低
下状態の個体が含まれる。要するに、安全で有効なワクチンが長い間必要とされ
てきた。
nella typhimurium)およびマイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis
）などの病原性微生物を弱毒化したものを用いるよりも非病原性の担体をベース
とした経口ワクチンを開発しようとの考え方を持ってきた。そのような弱毒化株
の開発は単調で長期間かかる。そのためには、病原性の排除によって環境もしく
は個体に危険性のない組換え株の開発が必要である。しかしそれらの株は防護的
免疫応答を生じさせるためには免疫原性が維持されていなければならない。また
、遺伝子的に安定な組換え株の開発にも問題がある。もともと病原性である微生
物の使用には、その担体自体に対する免疫応答がブースターワクチンの有効性を
低減させるというという危険性を伴うが、それはそのワクチン接種を受ける個体
が既に担体細菌によってチャレンジを受けていた場合に既に存在している抗体の
存在によって有効性が低減されるのと同様である。最後に、部分的に毒性を有す
る担体株を用いることはその他の担体系を用いるよりも、大きな個体群が危険に
さらされることとなろう。そのような個体群としては幼児、老人、および免疫低
下状態の個体が含まれる。要するに、安全で有効なワクチンが長い間必要とされ
てきた。
【０００３】
粘膜ワクチン、すなわち粘膜を介する送達経路を用いるワクチンは、全身性の
接種を行うものに対していくつかの利点があるものと考えられる。粘膜ワクチン
はIgAをベースとした免疫応答を防御の第1線として生起させるために用いること
ができる。粘膜感染に対する防護的免疫応答は分泌性IgA分子の産生に強く依存
している。そのような分子は局所的に産生され、粘膜分泌産物へと運ばれる。
接種を行うものに対していくつかの利点があるものと考えられる。粘膜ワクチン
はIgAをベースとした免疫応答を防御の第1線として生起させるために用いること
ができる。粘膜感染に対する防護的免疫応答は分泌性IgA分子の産生に強く依存
している。そのような分子は局所的に産生され、粘膜分泌産物へと運ばれる。
【０００４】
有用と思われる粘膜ワクチンの別のカテゴリーは、ワクチンの非経口適用より
も粘膜適用を介して全身性の免疫応答の誘導を狙うものである。理想的には十分
に有効なものとなるためには粘膜ワクチンでの免疫応答は非経口ワクチンの免疫
応答と同等でなければならない。
も粘膜適用を介して全身性の免疫応答の誘導を狙うものである。理想的には十分
に有効なものとなるためには粘膜ワクチンでの免疫応答は非経口ワクチンの免疫
応答と同等でなければならない。
【０００５】
しかし、抗原の全身適用は粘膜免疫システムの刺激にはうまく働かないか、も
しくは信頼しうるほどは働かない可能性がある。不運にも、特定の抗原の経口投
与が常に十分な免疫応答がもたらされる訳ではなく、いかなる応答をももたらさ
ないこともある。このことは、吸収性が悪いこと、消化管(G.I.)内での抗原の急
速な分解、および宿主側での耐性の誘導によって起こる。そのため、過去におい
ては代替法が提案された。
しくは信頼しうるほどは働かない可能性がある。不運にも、特定の抗原の経口投
与が常に十分な免疫応答がもたらされる訳ではなく、いかなる応答をももたらさ
ないこともある。このことは、吸収性が悪いこと、消化管(G.I.)内での抗原の急
速な分解、および宿主側での耐性の誘導によって起こる。そのため、過去におい
ては代替法が提案された。
【０００６】
試みられたオプションとしてはISCOM(immunostimulating complex)、マイクロ
スフェア、およびリポソームのような防護的担体システムの作成、およびin viv
oでの所望の抗原の局所での産生(すなわち生体内のin situで)のための無害な生
きた微生物の使用が含まれる。
スフェア、およびリポソームのような防護的担体システムの作成、およびin viv
oでの所望の抗原の局所での産生(すなわち生体内のin situで)のための無害な生
きた微生物の使用が含まれる。
【０００７】
抗原の担体として用いる無害な微生物の群を探す際には、乳酸菌の群が検討を
始めるものとして適当なものと考えられた。乳酸菌は食品生産においては大規模
に用いられている。乳酸菌はヒトが摂取するために適した食品グレード(すなわ
ち、通常はGRAS-statusを有するものとして)のグラム陰性微生物の群を形成して
いる。乳酸菌は食品に安全に用いられてきた長期にわたる記録がある。乳酸菌が
好ましいものであることの別の興味深い観点としてはもちろんLPS(これは担体と
して現在用いられているいくつかの病原性微生物には出現する)を持っていない
ことが挙げられる。従って、エンドトキシンショックの危険性に関して問題がな
いので、乳酸菌は粘膜経路を介する適用において明らかに安全である。
始めるものとして適当なものと考えられた。乳酸菌は食品生産においては大規模
に用いられている。乳酸菌はヒトが摂取するために適した食品グレード(すなわ
ち、通常はGRAS-statusを有するものとして)のグラム陰性微生物の群を形成して
いる。乳酸菌は食品に安全に用いられてきた長期にわたる記録がある。乳酸菌が
好ましいものであることの別の興味深い観点としてはもちろんLPS(これは担体と
して現在用いられているいくつかの病原性微生物には出現する)を持っていない
ことが挙げられる。従って、エンドトキシンショックの危険性に関して問題がな
いので、乳酸菌は粘膜経路を介する適用において明らかに安全である。
【０００８】
さらに、乳酸菌は、口、泌尿生殖もしくは消化管などの腔所に住み着くこと、
すなわち定住および/もしくは生育をすることができることによってプロバイオ
ティックス(probiotics)として産生され、そのような場所で乳酸菌は平衡化され
た正常な微生物叢を維持する役割を担っている。しかし、現在までのところ、非
病原性細菌を用いた経口ワクチンで市販されたものはない。
すなわち定住および/もしくは生育をすることができることによってプロバイオ
ティックス(probiotics)として産生され、そのような場所で乳酸菌は平衡化され
た正常な微生物叢を維持する役割を担っている。しかし、現在までのところ、非
病原性細菌を用いた経口ワクチンで市販されたものはない。
【０００９】
粘膜ワクチンの分野では経鼻(および経膣)ワクチンと経口ワクチンとを区別し
なければならない。経口的に投与された抗原が直面する環境は鼻腔の環境よりも
著しく適さないものであることは明らかである。さらに経鼻投与で免疫応答を引
き出すことのできるワクチンは経口投与では成功しなかったことが示されている
。非病原性担体を用いる経鼻ワクチンを経口用に用いることが示唆されてきたが
、特性もしくは効力が予測しがたいために経鼻ワクチンは経口ワクチン開発で問
題に直面した際の助けとはならない。例えば、組換えラクトバチルス・カセイ（
Lactobacillus casei）およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus p
lantarum）株の経鼻ワクチンとして、もしくは経鼻ワクチン中の成分としての使
用については既に報告されており、双方ともこの投与経路に同等に適している。
驚くべきことに、本発明ではラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus pl
antarum）株が経口ワクチンとしてもしくは経口ワクチン中の成分として用いる
ために適したものであることが見出された。これに対して、下記にさらに述べる
とおり、当業界では、経鼻ワクチンとしての使用が示唆されているL・カセイ（L
. casei）などの他のラクトバチルスでは同様な結果は得られていない(Pouwels
ら, J. Biotech. 1996, 44:183-192; Pouwelsら, Int. J. Food Microbiol. 199
8, 41:155-167)。
なければならない。経口的に投与された抗原が直面する環境は鼻腔の環境よりも
著しく適さないものであることは明らかである。さらに経鼻投与で免疫応答を引
き出すことのできるワクチンは経口投与では成功しなかったことが示されている
。非病原性担体を用いる経鼻ワクチンを経口用に用いることが示唆されてきたが
、特性もしくは効力が予測しがたいために経鼻ワクチンは経口ワクチン開発で問
題に直面した際の助けとはならない。例えば、組換えラクトバチルス・カセイ（
Lactobacillus casei）およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus p
lantarum）株の経鼻ワクチンとして、もしくは経鼻ワクチン中の成分としての使
用については既に報告されており、双方ともこの投与経路に同等に適している。
驚くべきことに、本発明ではラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus pl
antarum）株が経口ワクチンとしてもしくは経口ワクチン中の成分として用いる
ために適したものであることが見出された。これに対して、下記にさらに述べる
とおり、当業界では、経鼻ワクチンとしての使用が示唆されているL・カセイ（L
. casei）などの他のラクトバチルスでは同様な結果は得られていない(Pouwels
ら, J. Biotech. 1996, 44:183-192; Pouwelsら, Int. J. Food Microbiol. 199
8, 41:155-167)。
【００１０】
先行技術によって適するものとなる可能性があると示唆されている乳酸菌ベー
スのワクチンには3つのカテゴリーがある。それらのカテゴリーのうちの2つは経
口ワクチンとなりうる可能性があるものと考えられる。第1のものはLactobacill
us lactisをベースとするワクチンで、第2のものはStreptococcus gordoniiをベ
ースとしたワクチンである。この2つのカテゴリーは双方とも種々の有利な点と
不利な点があるが、それらについては詳しく報告されている(Mercercenier A. P
robiotics: A critical review, Horizon Scientific Press, Wymondham, 英国
1999, pp113-127; Pouwelsら, Int. J. Food Microbiol. 1998, 41:155-167)。
スのワクチンには3つのカテゴリーがある。それらのカテゴリーのうちの2つは経
口ワクチンとなりうる可能性があるものと考えられる。第1のものはLactobacill
us lactisをベースとするワクチンで、第2のものはStreptococcus gordoniiをベ
ースとしたワクチンである。この2つのカテゴリーは双方とも種々の有利な点と
不利な点があるが、それらについては詳しく報告されている(Mercercenier A. P
robiotics: A critical review, Horizon Scientific Press, Wymondham, 英国
1999, pp113-127; Pouwelsら, Int. J. Food Microbiol. 1998, 41:155-167)。
【００１１】
第3のカテゴリーはラクトバチルスをベースとしたワクチンで、免疫応答を誘
導することのできる経鼻的に投与される組換えラクトバチルスが含まれる。しか
し、現在までのところ、実際に免疫応答を誘導する経口的に投与しうる組換えラ
クトバチルスはない。そのかわりに、経口投与で有意な免疫応答を作り出すため
に異種抗原をin vivoで発現する組換え非病原性細菌についての不確実な開示は
複数ある。
導することのできる経鼻的に投与される組換えラクトバチルスが含まれる。しか
し、現在までのところ、実際に免疫応答を誘導する経口的に投与しうる組換えラ
クトバチルスはない。そのかわりに、経口投与で有意な免疫応答を作り出すため
に異種抗原をin vivoで発現する組換え非病原性細菌についての不確実な開示は
複数ある。
【００１２】
ある研究では異種抗原を細胞内で発現する組換えラクトバチルスのマウスへの
経口投与に関する不成功に終わった実験が開示されている(Wellsら, Antonie va
n Leeuwenhoek 1996, 70:317-330)。大腸菌(E.coli)のβ-ガラクトシダーゼを細
胞内で発現するラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum） 80
が経口的にマウスに0、1、および2日目に投与された。その後、経口でのブース
ター投与は4週間の間隔を空けて行われた。この実験ではβ-ガラクトシダーゼ(
異種抗原)、これは免疫原性の性質については何も知られていないタンパク質で
あるが、これに対する有意な抗体応答は認められなかった。この結果は、同じ細
菌株、同じ抗原、および同じ発現系を用いて、腹腔内投与によって免疫応答が得
られた結果とは反対のものであった。この失敗について多くの説明がなされたが
、これまでのところそれらのいずれも、経口ワクチン接種で良い結果が得られな
いことを解明することはできていない。
経口投与に関する不成功に終わった実験が開示されている(Wellsら, Antonie va
n Leeuwenhoek 1996, 70:317-330)。大腸菌(E.coli)のβ-ガラクトシダーゼを細
胞内で発現するラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum） 80
が経口的にマウスに0、1、および2日目に投与された。その後、経口でのブース
ター投与は4週間の間隔を空けて行われた。この実験ではβ-ガラクトシダーゼ(
異種抗原)、これは免疫原性の性質については何も知られていないタンパク質で
あるが、これに対する有意な抗体応答は認められなかった。この結果は、同じ細
菌株、同じ抗原、および同じ発現系を用いて、腹腔内投与によって免疫応答が得
られた結果とは反対のものであった。この失敗について多くの説明がなされたが
、これまでのところそれらのいずれも、経口ワクチン接種で良い結果が得られな
いことを解明することはできていない。
【００１３】
他の先行技術は組換えLactobacillus plantarumの使用の可能性に関するもの
である。WO99/11284は乳酸菌を用いて経口ワクチンを作成しうることを示唆して
いる。示唆された実施形態は、可溶性タンパク質が組換え微生物から分泌される
形態のものと考えられる。細胞表面への露出もしくは細胞内での産生については
言及されておらず、非常に多数の乳酸菌が有用であると提案されている。その示
唆された細菌はラクトバチルス・デルブルエキ（Lactobacillus delbruekii）、
ラクトバチルス・カセイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・フェルメ
ンツム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactoba
cillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus para
plantarum）、ラクトバチルス・ペントスス（Lactobacillus pentosus）、ラク
トバチルス・コリニフォルミス（Lactobacillus coryniformis）、ラクトバチル
ス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・リエチマンニ（Lact
obacillus liechmannii）、およびラクトバチルス・ラムノスス（Lactobacillus rhamnosus） 901などの腸内細菌叢から単離されたラクトバチルスの株である。
後者は酸及び胆汁の双方に対して抵抗性を有するので特に好ましいと述べられて
いる。実施例に述べられている乳酸菌はラクトバチルス・プランタルム（Lactob
acillus plantarum）8826である(3 x 10９個/mL, 1日1回で18日間)。
である。WO99/11284は乳酸菌を用いて経口ワクチンを作成しうることを示唆して
いる。示唆された実施形態は、可溶性タンパク質が組換え微生物から分泌される
形態のものと考えられる。細胞表面への露出もしくは細胞内での産生については
言及されておらず、非常に多数の乳酸菌が有用であると提案されている。その示
唆された細菌はラクトバチルス・デルブルエキ（Lactobacillus delbruekii）、
ラクトバチルス・カセイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・フェルメ
ンツム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactoba
cillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus para
plantarum）、ラクトバチルス・ペントスス（Lactobacillus pentosus）、ラク
トバチルス・コリニフォルミス（Lactobacillus coryniformis）、ラクトバチル
ス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・リエチマンニ（Lact
obacillus liechmannii）、およびラクトバチルス・ラムノスス（Lactobacillus rhamnosus） 901などの腸内細菌叢から単離されたラクトバチルスの株である。
後者は酸及び胆汁の双方に対して抵抗性を有するので特に好ましいと述べられて
いる。実施例に述べられている乳酸菌はラクトバチルス・プランタルム（Lactob
acillus plantarum）8826である(3 x 10９個/mL, 1日1回で18日間)。
【００１４】
WO99/11284の乳酸菌はウレアーゼを異種抗原として産生するはずである。それ
以外の抗原については示唆されておらず、in vivoで免疫応答の誘導が成功した
ことが説明されている。その実施例はこのことが単に推測的なものであることを
示したものと想像され、実際の結果は何も提示されていない。抗原(ウレアーゼ)
がその細菌からその周囲へ「遊離」の可溶性タンパク質として分泌されることも
その実施例は示唆している(すなわち、細菌宿主の表面上に露出されている、も
しくは表面とその他の形で関わっている、ということがない)。
以外の抗原については示唆されておらず、in vivoで免疫応答の誘導が成功した
ことが説明されている。その実施例はこのことが単に推測的なものであることを
示したものと想像され、実際の結果は何も提示されていない。抗原(ウレアーゼ)
がその細菌からその周囲へ「遊離」の可溶性タンパク質として分泌されることも
その実施例は示唆している(すなわち、細菌宿主の表面上に露出されている、も
しくは表面とその他の形で関わっている、ということがない)。
【００１５】
事実、その特許に示された方法が免疫応答を示すことにおいて成功するかどう
かには重大な疑いがある。可溶性タンパク質の分泌が免疫応答を誘導するとは考
えられないと指摘する多数の論文が公表されている：従って、その特許の方法が
、経口ワクチンとして有用なものを提供するために適した技法にはなりそうもな
い。このことを実験データが全くないことと併せると、ラクトバチルスを宿主と
して用いる経口ワクチンの可能性の欠如を説明しているものと思われる。せいぜ
いそれは、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter Pylori）関連疾患を治療し
ようとの考えで可溶性タンパク質であるウレアーゼを異種抗原として分泌するラ
クトバチルスの使用の推測的な開示である。例えば、経口/消化器という攻撃的
環境で生存していけるか予測できないことなどの特殊な問題点があるものと予測
されるその他の抗原に関する開示はない。
かには重大な疑いがある。可溶性タンパク質の分泌が免疫応答を誘導するとは考
えられないと指摘する多数の論文が公表されている：従って、その特許の方法が
、経口ワクチンとして有用なものを提供するために適した技法にはなりそうもな
い。このことを実験データが全くないことと併せると、ラクトバチルスを宿主と
して用いる経口ワクチンの可能性の欠如を説明しているものと思われる。せいぜ
いそれは、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter Pylori）関連疾患を治療し
ようとの考えで可溶性タンパク質であるウレアーゼを異種抗原として分泌するラ
クトバチルスの使用の推測的な開示である。例えば、経口/消化器という攻撃的
環境で生存していけるか予測できないことなどの特殊な問題点があるものと予測
されるその他の抗原に関する開示はない。
【００１６】
総説論文(Mercenier, 1999)ではラクトバチルス・プランタルム（Lactobacill
us plantarum）NCIMB 8826(ヒト唾液からの単離菌)中に導入された異種抗原(例
えばTIFC)を発現している多数の構築物について述べている。そこで述べられて
いる組換えラクトバチルス構築物の全てについて、マウスへの経鼻投与は免疫応
答をもたらした。さらにその総説では経口での試験も比較のために行ったことが
示されているが経口実験の結果は示されておらず、抗原が細胞のどこで発現され
たかについても述べられていない。それらの構築物のうちのいずれか、それらの
いくつか、もしくはその全てについて何らかの有意な免疫応答があったのか否か
についても述べられていない。このようにデータがないことと経鼻ワクチンから
経口ワクチンに関するデータの外挿に関する一般的な知識を組み合わせ、以前の
失敗例を考慮すると、経口ワクチンとしてのラクトバチルスの使用は成功しない
ことを示唆しているのではないかと考えられた。確かに、一般的な解釈は成功す
るとの合理的な期待はできないものであった。
us plantarum）NCIMB 8826(ヒト唾液からの単離菌)中に導入された異種抗原(例
えばTIFC)を発現している多数の構築物について述べている。そこで述べられて
いる組換えラクトバチルス構築物の全てについて、マウスへの経鼻投与は免疫応
答をもたらした。さらにその総説では経口での試験も比較のために行ったことが
示されているが経口実験の結果は示されておらず、抗原が細胞のどこで発現され
たかについても述べられていない。それらの構築物のうちのいずれか、それらの
いくつか、もしくはその全てについて何らかの有意な免疫応答があったのか否か
についても述べられていない。このようにデータがないことと経鼻ワクチンから
経口ワクチンに関するデータの外挿に関する一般的な知識を組み合わせ、以前の
失敗例を考慮すると、経口ワクチンとしてのラクトバチルスの使用は成功しない
ことを示唆しているのではないかと考えられた。確かに、一般的な解釈は成功す
るとの合理的な期待はできないものであった。
【００１７】
Mercenierらのグループ(Institut Pasteur, Lille: Grangetteら, Immunology
letters, 69(1): No.1, page 176:45.13)の要約でも状況は類似しており、免疫
がなされたことを支持するデータは示されていない。
がなされたことを支持するデータは示されていない。
【００１８】
この結論はPouwelsら, 1998によって支持されており、彼らはラクトバチルス
・カセイ（Lactobacillus casei）中の発現ベクターが異種の抗原の良好な発現
をどのようになしえたかが報告されているが、経口投与後ではかなり低レベルの
抗体が得られたのみであった。このことはL. caseiの生存性が低いことによるも
のであろうが、このパラメーターはそれ以上は調べられておらず、組換えラクト
バチルス・カセイ（Lactobacillus casei）が防護的免疫応答を示し得なかった
ことには多数のその他の理由がある。例えば、in vivoでの発現量は免疫応答を
実際に引き出すには低すぎるか、もしくはその抗原が免疫応答を誘導することが
可能な様式では提示されなかったのかもしれない。
・カセイ（Lactobacillus casei）中の発現ベクターが異種の抗原の良好な発現
をどのようになしえたかが報告されているが、経口投与後ではかなり低レベルの
抗体が得られたのみであった。このことはL. caseiの生存性が低いことによるも
のであろうが、このパラメーターはそれ以上は調べられておらず、組換えラクト
バチルス・カセイ（Lactobacillus casei）が防護的免疫応答を示し得なかった
ことには多数のその他の理由がある。例えば、in vivoでの発現量は免疫応答を
実際に引き出すには低すぎるか、もしくはその抗原が免疫応答を誘導することが
可能な様式では提示されなかったのかもしれない。
【００１９】
本発明に至った複数の実験において組換えラクトバチルス・カセイ（Lactobac
illus casei）を本発明のL.プランタルム（L. plantarum）との比較として含め
た。これはラクトバチルス・カセイ（Lactobacillus casei）をベースとした発
現系が異種抗原のin vivo担体としての効力を有さないことを確認するものであ
った。この知見は、WO99/11284の開示ではラクトバチルス・カセイ（Lactobacil
lus casei）が有用な宿主の例となりうることが示唆されていたのでその開示に
疑問を呈するものである。
illus casei）を本発明のL.プランタルム（L. plantarum）との比較として含め
た。これはラクトバチルス・カセイ（Lactobacillus casei）をベースとした発
現系が異種抗原のin vivo担体としての効力を有さないことを確認するものであ
った。この知見は、WO99/11284の開示ではラクトバチルス・カセイ（Lactobacil
lus casei）が有用な宿主の例となりうることが示唆されていたのでその開示に
疑問を呈するものである。
【００２０】
この分野で種の間のデータの外挿が常に信頼しうるものとは限らない、という
ことをさらに示すために、以前の実験では組換えL.プランタルム（L. plantarum
）と組換えL・カセイ（L. casei）とを、アジュヴァント活性を引き出すかどう
かについて比較した。L・カセイ（L. casei）はin vivoでのアジュヴァント活性
を引き出す最もよい微生物であることを示した。従ってL・カセイ（L. casei）
がL.プランタルム（L. plantarum）もしくは乳酸菌のその他のいかなる株であっ
ても、それらよりもワクチンの候補として好ましいものと推測するであろう。
ことをさらに示すために、以前の実験では組換えL.プランタルム（L. plantarum
）と組換えL・カセイ（L. casei）とを、アジュヴァント活性を引き出すかどう
かについて比較した。L・カセイ（L. casei）はin vivoでのアジュヴァント活性
を引き出す最もよい微生物であることを示した。従ってL・カセイ（L. casei）
がL.プランタルム（L. plantarum）もしくは乳酸菌のその他のいかなる株であっ
ても、それらよりもワクチンの候補として好ましいものと推測するであろう。
【００２１】本発明の説明
本発明の第1の態様は異種抗原を発現する(in vivoで発現していることが適し
ているが)組換え乳酸菌を含んでいるワクチン(例えば経口の)である。該抗原は
細胞内でおよび/もしくは乳酸菌の表面で(露出されて)発現するものとすること
ができる。従ってこのものは該異種抗原に対する免疫原性を引き出すための特異
的免疫原性を引き出す構成成分となりうるか、または免疫応答を引き出すことが
できる。該組換え乳酸菌とは好ましくはL. plantarumなどのラクトバチルスであ
って、任意で経口的な送達のための製剤中に用いるために適した製薬上許容され
る担体が少なくとも1つ共存させうる。
ているが)組換え乳酸菌を含んでいるワクチン(例えば経口の)である。該抗原は
細胞内でおよび/もしくは乳酸菌の表面で(露出されて)発現するものとすること
ができる。従ってこのものは該異種抗原に対する免疫原性を引き出すための特異
的免疫原性を引き出す構成成分となりうるか、または免疫応答を引き出すことが
できる。該組換え乳酸菌とは好ましくはL. plantarumなどのラクトバチルスであ
って、任意で経口的な送達のための製剤中に用いるために適した製薬上許容され
る担体が少なくとも1つ共存させうる。
【００２２】
本説明では下記の用語と語句は特に断らない限りは下記の意味を有する。
【００２３】
「細菌宿主」とは、所望の抗原を発現する(例えば組換え技法を介して)ために
用いられる細菌もしくは細菌株を意味する。この細菌宿主はヒトもしくは動物(
哺乳動物)にワクチンの中に含ませて、もしくはワクチンの一部として、該抗原
に対する免疫応答を引き出す目的で投与される。この用語は該抗原を発現するよ
うに形質転換された天然の株、該抗原を発現している組換え株(これは別に「組
換え宿主株」とも呼ぶ)、もしくはその両者を示すために用いられる。
用いられる細菌もしくは細菌株を意味する。この細菌宿主はヒトもしくは動物(
哺乳動物)にワクチンの中に含ませて、もしくはワクチンの一部として、該抗原
に対する免疫応答を引き出す目的で投与される。この用語は該抗原を発現するよ
うに形質転換された天然の株、該抗原を発現している組換え株(これは別に「組
換え宿主株」とも呼ぶ)、もしくはその両者を示すために用いられる。
【００２４】
ワクチンの「粘膜送達(経路)」とは、皮膚を貫通させたり刺したりする(例え
ば、静脈内、筋肉内、皮下、もしくは腹腔内投与にともなって起こる)ことを必
要としない、ヒトもしくは動物の体への投与経路のいかなるものをも意味する。
通常はこのことはワクチンが生体の腔所のうちの1つを介して生体に投与される
ことを意味し、それによってワクチンは粘膜と接触することとなる。従って、粘
膜投与は特に経鼻、経口および/もしくは経膣投与を意味する。
ば、静脈内、筋肉内、皮下、もしくは腹腔内投与にともなって起こる)ことを必
要としない、ヒトもしくは動物の体への投与経路のいかなるものをも意味する。
通常はこのことはワクチンが生体の腔所のうちの1つを介して生体に投与される
ことを意味し、それによってワクチンは粘膜と接触することとなる。従って、粘
膜投与は特に経鼻、経口および/もしくは経膣投与を意味する。
【００２５】
「粘膜ワクチン」とは、粘膜送達に適した、適合させた、意図した、および/
またはそのために製剤化されたいかなるワクチンをも意味する。
またはそのために製剤化されたいかなるワクチンをも意味する。
【００２６】
「経口送達(経路)」(ワクチンの)とは、消化管もしくはその部分で、それによ
ってワクチンが提示されうる、ヒトもしくは動物の体内への送達経路のいかなる
ものをも意味する。通常は経口送達経路には口中への、もしくは口を介しての消
化管への投与が含まれる。「経口投与」もまた消化管もしくはその部分への直接
的な投与が含まれ、そのようなものとしては胃の中への、例えばチューブもしく
はカテーテルを用いての投与が含まれる。
ってワクチンが提示されうる、ヒトもしくは動物の体内への送達経路のいかなる
ものをも意味する。通常は経口送達経路には口中への、もしくは口を介しての消
化管への投与が含まれる。「経口投与」もまた消化管もしくはその部分への直接
的な投与が含まれ、そのようなものとしては胃の中への、例えばチューブもしく
はカテーテルを用いての投与が含まれる。
【００２７】
「経口ワクチン」とは、上記で定義した経口送達のために適した、適合させた
、意図した、および/またはそのために製剤化されたいかなるワクチンをも意味
する。
、意図した、および/またはそのために製剤化されたいかなるワクチンをも意味
する。
【００２８】
応答(例えば抗体応答もしくは免疫応答)はそれがヒトもしくは動物に検出可能
な変化もしくは応答をもたらす場合、特に抗体、サイトカイン、リンホカイン、
その他などの検出可能な免疫学的変化もしくは応答をもたらす場合には、「有意
」であると見なされる。ある応答が「有意」であるかどうかを決定するための試
験は当業界では既知であり、そのようなものとしては、限定はされないが、ELIS
A法、ELISPOT法およびin vitroリンパ球刺激アッセイを用いる生物学的サンプル
中の抗体レベルの滴定が含まれる。そのような技法は通常は、ヒトもしくは動物
から得られた生物学的液体または細胞サンプルなどの生物学的サンプルについて
行われる。
な変化もしくは応答をもたらす場合、特に抗体、サイトカイン、リンホカイン、
その他などの検出可能な免疫学的変化もしくは応答をもたらす場合には、「有意
」であると見なされる。ある応答が「有意」であるかどうかを決定するための試
験は当業界では既知であり、そのようなものとしては、限定はされないが、ELIS
A法、ELISPOT法およびin vitroリンパ球刺激アッセイを用いる生物学的サンプル
中の抗体レベルの滴定が含まれる。そのような技法は通常は、ヒトもしくは動物
から得られた生物学的液体または細胞サンプルなどの生物学的サンプルについて
行われる。
【００２９】
「有意」な応答とは、必ずしもそうでなくともよいが、下記に定義する「防護
的」応答ともなりうるものである。ある応答(例えばある病原体もしくは抗原に
対する免疫学的応答)はそれが病原体に対しての、および/または抗原に関連する
病原体に対しての応答を示すヒトもしくは動物を防護することができるとき、「
防護的」であると見なされる。
的」応答ともなりうるものである。ある応答(例えばある病原体もしくは抗原に
対する免疫学的応答)はそれが病原体に対しての、および/または抗原に関連する
病原体に対しての応答を示すヒトもしくは動物を防護することができるとき、「
防護的」であると見なされる。
【００３０】
抗原は、それが細菌宿主の表面(例えば細菌の細胞壁もしくはエンベロープ)の
上に存在している、その一部を形成している、付着している、および/もしくは
伴っている、または検出(例えばFACSもしくは免疫蛍光顕微鏡などの適切な免疫
学的検出技法を用いて)が可能である場合に、細菌宿主上に「露出」されている
ものと(また、抗原の「(表面)露出」ともいう)見なされる。
上に存在している、その一部を形成している、付着している、および/もしくは
伴っている、または検出(例えばFACSもしくは免疫蛍光顕微鏡などの適切な免疫
学的検出技法を用いて)が可能である場合に、細菌宿主上に「露出」されている
ものと(また、抗原の「(表面)露出」ともいう)見なされる。
【００３１】
好ましくは、「露出」されているとは、細菌が、免疫応答をメディエートする
ことのできるヒトもしくは動物の細胞(例えば下記の消化管の細胞など)に十分な
時間、十分な量、提示された場合に、該抗原に対して「十分な」免疫応答を細菌
が引き出すことができることを意味する。
ことのできるヒトもしくは動物の細胞(例えば下記の消化管の細胞など)に十分な
時間、十分な量、提示された場合に、該抗原に対して「十分な」免疫応答を細菌
が引き出すことができることを意味する。
【００３２】細菌株
ラクトバチルス・プランタルムの株は既知のパラメーターを用いて容易に決定
することができる(例えば、Bergeys Manual of determinative bacteriologyお
よびVescoveら, Ann. Microbiol. Enzymol. 43, 261-284(1993))。従って、当業
者であれば、ある乳酸菌がラクトバチルス・プランタルムであるかどうかを容易
に決めることができる。様々な研究所に多数のラクトバチルス・プランタルムの
株が寄託されており、容易に利用することができる。
することができる(例えば、Bergeys Manual of determinative bacteriologyお
よびVescoveら, Ann. Microbiol. Enzymol. 43, 261-284(1993))。従って、当業
者であれば、ある乳酸菌がラクトバチルス・プランタルムであるかどうかを容易
に決めることができる。様々な研究所に多数のラクトバチルス・プランタルムの
株が寄託されており、容易に利用することができる。
【００３３】
細菌宿主として選択された天然の菌株は好ましくはGRAS(generally regarded
as safe:一般的に安全と見なされる)とされるものであるべきで、より好ましく
は食品グレードのものである。
as safe:一般的に安全と見なされる)とされるものであるべきで、より好ましく
は食品グレードのものである。
【００３４】
また、用いる細菌宿主はある抗原をコードしている適切な構築物を用いて形質
転換すると所望の抗原を細胞内でおよび/もしくは表面上に露出して発現するこ
とのできるものでなければならない。
転換すると所望の抗原を細胞内でおよび/もしくは表面上に露出して発現するこ
とのできるものでなければならない。
【００３５】
好ましくは該抗原の発現レベル、例えばSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動
もしくはFACSによって測定される細胞内の、および/もしくは細胞表面上に露出
されている抗原の発現レベルは、細胞の総タンパク質の少なくとも1〜5%、ある
いはまた同一条件下で同一の発現ベクターを用いてL.プランタルム（L.プランタ
ルム（L.plantarum))256株によって提供される発現レベルの80%以上、好ましく
は100%以上であるべきである。
もしくはFACSによって測定される細胞内の、および/もしくは細胞表面上に露出
されている抗原の発現レベルは、細胞の総タンパク質の少なくとも1〜5%、ある
いはまた同一条件下で同一の発現ベクターを用いてL.プランタルム（L.プランタ
ルム（L.plantarum))256株によって提供される発現レベルの80%以上、好ましく
は100%以上であるべきである。
【００３６】
また、細菌宿主は、口、咽頭、喉頭、腸、小腸、大腸、回腸、および/もしく
は結腸、またはそれらの組み合わせなどの消化管の少なくとも一部分に定住およ
び/もしくはコロニー形成できることが好ましい。細菌宿主は種としてそれが腸
内、に定住することが好ましく、小腸もしくは盲腸内であることがより好ましい
。
は結腸、またはそれらの組み合わせなどの消化管の少なくとも一部分に定住およ
び/もしくはコロニー形成できることが好ましい。細菌宿主は種としてそれが腸
内、に定住することが好ましく、小腸もしくは盲腸内であることがより好ましい
。
【００３７】
該(組換え)ラクトバチルス・プランタルム株は、免疫されることとなる個体の
体内で少なくとも5日間、好ましくは少なくとも9日間、および15もしくは20日以
上が適切であるが、そのような期間の持続性を(経口投与で、糞便中のその株の
存在で測定するとき)示すことが好ましい。投与方法が下記のとおり1回以上の追
加免疫の使用を含む場合には、より長い持続性は必要ではない。
体内で少なくとも5日間、好ましくは少なくとも9日間、および15もしくは20日以
上が適切であるが、そのような期間の持続性を(経口投与で、糞便中のその株の
存在で測定するとき)示すことが好ましい。投与方法が下記のとおり1回以上の追
加免疫の使用を含む場合には、より長い持続性は必要ではない。
【００３８】
好ましい実施形態においては、等価の条件下でL.プランタルム（L.プランタル
ム（L.plantarum)) 80の持続性より長い持続性および、好ましくはL.プランタル
ム（L.プランタルム（L.plantarum)) NCIMB 8826より長い持続性が示される。こ
のことは、選択肢はあるが好ましくは同じ年令で等価の治療条件下でのマウスの
消化管で客観的に評価することができる。
ム（L.plantarum)) 80の持続性より長い持続性および、好ましくはL.プランタル
ム（L.プランタルム（L.plantarum)) NCIMB 8826より長い持続性が示される。こ
のことは、選択肢はあるが好ましくは同じ年令で等価の治療条件下でのマウスの
消化管で客観的に評価することができる。
【００３９】
該L.プランタルム（L.plantarum)株は、LMG 9211(上述のMercinierによって報
告されているNCIMB 8826)、DSM 4229 L. casei 393、および/もしくはL.プラン
タルム（L.plantarum) 80ではないことが好ましい。細菌宿主は下記のL.プラン
タルム（L.plantarum)株のうちの1つであることが好ましい：256、LMG 1284、LM
G 6907、LMG 8155、LMG 9205、LMG 9206、LMG 9208、LMG 9209、LMG 9210、LMG
9212、LMG 11405、LMG 11460、LMG 8095、LMG 8027、LMG 12167、LMG 13556、LM
G 17552、LMG 18021、LMG 18023、LMG 18024、LMG 18027、LMG 18095；386、299
、105、または275(Molinら, 1993, J. Appl. Bacteriol. 74:314を参照せよ)、2
99v(WO 96/29083を参照せよ)；So5、36Ｅ、95、120、もしくは44(Johannsonら,
1995, Int. J. Syst. Bacteriol. Vol 45(4):670-675を参照せよ)、79、107、98
、53、97、101、または125(Johanssonら, 1995, Int. J. Food. Micro. 25:159
を参照せよ)、CH、ATCC 8041、ATCC 10012、ATCC 10776、WCFS、DF66 IIIa、DF6
6spez.-IVa、および/もしくはJapanese Collection of Micro-organismsから寄
託番号8341、8342、8343、8344、8345、8346、8347、および/もしくは8348で入
手可能なL.プランタルム（L.plantarum)株。
告されているNCIMB 8826)、DSM 4229 L. casei 393、および/もしくはL.プラン
タルム（L.plantarum) 80ではないことが好ましい。細菌宿主は下記のL.プラン
タルム（L.plantarum)株のうちの1つであることが好ましい：256、LMG 1284、LM
G 6907、LMG 8155、LMG 9205、LMG 9206、LMG 9208、LMG 9209、LMG 9210、LMG
9212、LMG 11405、LMG 11460、LMG 8095、LMG 8027、LMG 12167、LMG 13556、LM
G 17552、LMG 18021、LMG 18023、LMG 18024、LMG 18027、LMG 18095；386、299
、105、または275(Molinら, 1993, J. Appl. Bacteriol. 74:314を参照せよ)、2
99v(WO 96/29083を参照せよ)；So5、36Ｅ、95、120、もしくは44(Johannsonら,
1995, Int. J. Syst. Bacteriol. Vol 45(4):670-675を参照せよ)、79、107、98
、53、97、101、または125(Johanssonら, 1995, Int. J. Food. Micro. 25:159
を参照せよ)、CH、ATCC 8041、ATCC 10012、ATCC 10776、WCFS、DF66 IIIa、DF6
6spez.-IVa、および/もしくはJapanese Collection of Micro-organismsから寄
託番号8341、8342、8343、8344、8345、8346、8347、および/もしくは8348で入
手可能なL.プランタルム（L.plantarum)株。
【００４０】
好ましくは、用いるラクトバチルス菌は、それが投与されることとなる、例え
ばワクチン接種されることとなる個体(ヒトもしくは動物)にとって外来のもので
ある。本発明の細菌は改変されたものもしくは組換え体であり、野生型もしくは
天然の細菌、つまり非組換えもしくは未改変のラクトバチルス菌も外来のものと
して適している。このように、外来性のものであるということは、その個体(も
しくはヒト)が以前に遭遇したことのないラクトバチルス菌株であるということ
を意図している。言いかえれば、非ヒト、例えばヒトの体内に認められない、も
しくは存在しないラクトバチルス菌株を使用することが好ましい。その株はヒト
もしくは動物の体内に認められないもの、例えば腸(消化管)中に存在しない株が
好ましい。そのような株はより強いもしくは範囲の広い免疫応答を引き起こすこ
ととなろう。従って、これまで何人かの先行技術者らはヒト由来のL.プランタル
ム（L.plantarum)株(例えば、ヒト唾液からの単離菌であるNCIMB 8826)を用いた
が、本発明者らは直観に反するアプローチを取り、ヒトの体内には存在しない株
を探した。
ばワクチン接種されることとなる個体(ヒトもしくは動物)にとって外来のもので
ある。本発明の細菌は改変されたものもしくは組換え体であり、野生型もしくは
天然の細菌、つまり非組換えもしくは未改変のラクトバチルス菌も外来のものと
して適している。このように、外来性のものであるということは、その個体(も
しくはヒト)が以前に遭遇したことのないラクトバチルス菌株であるということ
を意図している。言いかえれば、非ヒト、例えばヒトの体内に認められない、も
しくは存在しないラクトバチルス菌株を使用することが好ましい。その株はヒト
もしくは動物の体内に認められないもの、例えば腸(消化管)中に存在しない株が
好ましい。そのような株はより強いもしくは範囲の広い免疫応答を引き起こすこ
ととなろう。従って、これまで何人かの先行技術者らはヒト由来のL.プランタル
ム（L.plantarum)株(例えば、ヒト唾液からの単離菌であるNCIMB 8826)を用いた
が、本発明者らは直観に反するアプローチを取り、ヒトの体内には存在しない株
を探した。
【００４１】
例えば、先行技術者らは、NCIMB 8826として寄託されたL.プランタルム（L.pl
antarum)株を用いた。この株はヒトの体内に見出され、例えば消化管内には既に
存在している。このことは、ヒトにとって外来のものである(もしくは体内に存
在しない)ラクトバチルス菌株のように良好な免疫応答がこれによって引き起こ
されるもしくは引き出せるとは考えられないことを意味する。
antarum)株を用いた。この株はヒトの体内に見出され、例えば消化管内には既に
存在している。このことは、ヒトにとって外来のものである(もしくは体内に存
在しない)ラクトバチルス菌株のように良好な免疫応答がこれによって引き起こ
されるもしくは引き出せるとは考えられないことを意味する。
【００４２】
従って、本発明は、好ましくは個体の粘膜に見出されない(非粘膜性)もしくは
消化管に見出されない、例えば(ワクチン接種されることとなるヒトもしくは動
物種に対して)内在性でないラクトバチルス菌株を用いる。実際、最も好ましい
株(例えばL.プランタルム（L.plantarum) 256)は貯蔵された牧草中に見出された
。このような株はヒトに対して明らかに外来のもので、そのため、より大きな免
疫応答が提供される。それでも該株は腸の粘膜に付着しうることが好ましい。
消化管に見出されない、例えば(ワクチン接種されることとなるヒトもしくは動
物種に対して)内在性でないラクトバチルス菌株を用いる。実際、最も好ましい
株(例えばL.プランタルム（L.plantarum) 256)は貯蔵された牧草中に見出された
。このような株はヒトに対して明らかに外来のもので、そのため、より大きな免
疫応答が提供される。それでも該株は腸の粘膜に付着しうることが好ましい。
【００４３】
また株は非食料品、例えば、(ヒトの)食品中には見出されないものを起源とす
ることもできる。このことによっていくつかのL.caseiの株、例えば393などを排
除することができる。393株はチーズ中に見出され、そのため乳製品もしくは発
酵産物中に見出される株を排除することが好ましい。このことは、該個体はその
株と接触(例えば、摂取)したことがなく(もしくは接触したことがないかもしれ
ず)、そのため、食品中に見出されない株を用いることは免疫応答をより引き起
こさせるものと考えられる。このことはある種のラクトバチルス菌で認められた
長い持続時間を説明しうる。それらの細菌の体内からの除去はそれらが免疫系に
は認識されないのでより緩徐に行われうる。従って株は動物起源、例えば動物の
食糧(例えば、貯蔵牧草)からのものとすることが適当である。一般的により適し
た株は食糧(例えば酪農製品)よりは共生(腸内)のものである。
ることもできる。このことによっていくつかのL.caseiの株、例えば393などを排
除することができる。393株はチーズ中に見出され、そのため乳製品もしくは発
酵産物中に見出される株を排除することが好ましい。このことは、該個体はその
株と接触(例えば、摂取)したことがなく(もしくは接触したことがないかもしれ
ず)、そのため、食品中に見出されない株を用いることは免疫応答をより引き起
こさせるものと考えられる。このことはある種のラクトバチルス菌で認められた
長い持続時間を説明しうる。それらの細菌の体内からの除去はそれらが免疫系に
は認識されないのでより緩徐に行われうる。従って株は動物起源、例えば動物の
食糧(例えば、貯蔵牧草)からのものとすることが適当である。一般的により適し
た株は食糧(例えば酪農製品)よりは共生(腸内)のものである。
【００４４】
好ましくは該ラクトバチルス菌株は生存可能で(もしくは生存している)天然の
ままのものである。それらの株は少なくとも7日間、個体中で(粘膜で)生存し続
けることができるものが適している。このことは当業界で既知の方法(例えば、
糞便中のその生物体の存在を調べること)を用いて容易に調べることができる。
ままのものである。それらの株は少なくとも7日間、個体中で(粘膜で)生存し続
けることができるものが適している。このことは当業界で既知の方法(例えば、
糞便中のその生物体の存在を調べること)を用いて容易に調べることができる。
【００４５】
このように本発明はさらに非ヒトおよび/もしくは非ヒト用食品のラクトバチ
ルス菌、例えばL.プランタルム（L.plantarum)などに関し、それは異種抗原を発
現(細胞内でおよび/もしくは細胞表面上で)するように改変されたものである。
この細菌は好ましくは、その細菌が投与されることとなる個体中に免疫応答を引
き起こすことのできるものである。このように、天然のもしくは非改変L.プラン
タルム（L.plantarum)は好ましくはその個体に対して外来性のもの、例えばそれ
が投与されることとなるヒトもしくは動物に対して内在性でないものである。好
ましくは選択されたL.プランタルム（L.plantarum)株はヒトもしくは動物種の消
化管もしくは粘膜に存在しないものである。
ルス菌、例えばL.プランタルム（L.plantarum)などに関し、それは異種抗原を発
現(細胞内でおよび/もしくは細胞表面上で)するように改変されたものである。
この細菌は好ましくは、その細菌が投与されることとなる個体中に免疫応答を引
き起こすことのできるものである。このように、天然のもしくは非改変L.プラン
タルム（L.plantarum)は好ましくはその個体に対して外来性のもの、例えばそれ
が投与されることとなるヒトもしくは動物に対して内在性でないものである。好
ましくは選択されたL.プランタルム（L.plantarum)株はヒトもしくは動物種の消
化管もしくは粘膜に存在しないものである。
【００４６】
本発明はまた、異種抗原を細胞内および/もしくは細胞表面上で発現するよう
に改変されたL.プランタルム（L.plantarum)にも関し、その細菌は個体に免疫応
答を引き出し、それはその個体の消化管内で少なくとも7日間は生き続けること
のできるものである。
に改変されたL.プランタルム（L.plantarum)にも関し、その細菌は個体に免疫応
答を引き出し、それはその個体の消化管内で少なくとも7日間は生き続けること
のできるものである。
【００４７】
当業者であれば、その他の適する株を下記の性質もしくは因子の1つ以上を基
に選択することができる： − 該抗原をコードする構築物の、選択された細菌宿主中での安定性：選択され
た細菌宿主中での抗原の発現レベル：選択された細菌宿主中での抗原の発現の調
節：選択された細菌宿主中での抗原の発現部位；および/もしくは産生された抗
原の安定性。
に選択することができる： − 該抗原をコードする構築物の、選択された細菌宿主中での安定性：選択され
た細菌宿主中での抗原の発現レベル：選択された細菌宿主中での抗原の発現の調
節：選択された細菌宿主中での抗原の発現部位；および/もしくは産生された抗
原の安定性。
【００４８】
− 用いる株の生化学的特性、例えばその糖発酵プロフィール(API)、細胞壁組
成、LTAの構造、ペプチドグリカンの構造、16S RNAの配列、酸抵抗性、胆汁酸抵
抗性、凝集の特性、アジュヴァント活性、免疫調節特性、in vitro 接着性、マ
ンノース特異的接着、タンパク質性の接着因子の存在、mapA様接着因子および/
もしくは繰り返しアミノ酸配列を有する大きなタンパク質性接着因子の存在、な
らびに/または、 − 細菌宿主と、その宿主が投与されることとなる(すなわち本発明のワクチン
の一部として)個体の細胞との相互作用、例えば、これらに限定はされないが、
持続性、生存性、in vivo での抗原の発現および/もしくは組織特異的な持続性
が含まれる。
成、LTAの構造、ペプチドグリカンの構造、16S RNAの配列、酸抵抗性、胆汁酸抵
抗性、凝集の特性、アジュヴァント活性、免疫調節特性、in vitro 接着性、マ
ンノース特異的接着、タンパク質性の接着因子の存在、mapA様接着因子および/
もしくは繰り返しアミノ酸配列を有する大きなタンパク質性接着因子の存在、な
らびに/または、 − 細菌宿主と、その宿主が投与されることとなる(すなわち本発明のワクチン
の一部として)個体の細胞との相互作用、例えば、これらに限定はされないが、
持続性、生存性、in vivo での抗原の発現および/もしくは組織特異的な持続性
が含まれる。
【００４９】
これらの性質特性のうちの少なくともいくつか、好ましくは大部分、より好ま
しくは実質的に全てにおいて、例えば当業界でそれ自体が既知であるこれらの性
質を調べるための試験/アッセイをもとに調べたときに、用いる株は実質的に(少
なくとも)上述の株と等価であるか、より好ましくはL.プランタルム（L.plantar
um)256と等価であるべきである。適切な宿主を選択した後、その宿主を本明細書
記載の遺伝子構築物を用いて形質転換し、その後、その宿主の経口ワクチンとし
ての適切性を試験し、すなわち後記の実施例中で述べている試験とプロトコール
を用いて試験することができる。本明細書の説明に基づいて、および任意で確認
のために本明細書記載の試験を行えば、当業者であれば本発明のワクチンとして
、もしくはワクチン中に用いるために適切なL.プランタルム（L.plantarum)の他
の株を同定することができるであろうということは想像できる。
しくは実質的に全てにおいて、例えば当業界でそれ自体が既知であるこれらの性
質を調べるための試験/アッセイをもとに調べたときに、用いる株は実質的に(少
なくとも)上述の株と等価であるか、より好ましくはL.プランタルム（L.plantar
um)256と等価であるべきである。適切な宿主を選択した後、その宿主を本明細書
記載の遺伝子構築物を用いて形質転換し、その後、その宿主の経口ワクチンとし
ての適切性を試験し、すなわち後記の実施例中で述べている試験とプロトコール
を用いて試験することができる。本明細書の説明に基づいて、および任意で確認
のために本明細書記載の試験を行えば、当業者であれば本発明のワクチンとして
、もしくはワクチン中に用いるために適切なL.プランタルム（L.plantarum)の他
の株を同定することができるであろうということは想像できる。
【００５０】
好ましくは、L.プランタルム（L.plantarum)は第1グループ(もしくはクラスタ
ー)のものであり(そのような株としては101、97、53、256、ATCC 14917、36Ｅ、
95、98、299、299v、107、105、79、275、386、So5、およびATCC 8014が含まれ
る)、サブグループ(もしくはサブクラスター)1bが適している(そのような株とし
ては256、ATCC 14917、36Ｅ、95、および98が含まれる)。特に好ましいのはL.プ
ランタルム（L.plantarum)の256株である。
ー)のものであり(そのような株としては101、97、53、256、ATCC 14917、36Ｅ、
95、98、299、299v、107、105、79、275、386、So5、およびATCC 8014が含まれ
る)、サブグループ(もしくはサブクラスター)1bが適している(そのような株とし
ては256、ATCC 14917、36Ｅ、95、および98が含まれる)。特に好ましいのはL.プ
ランタルム（L.plantarum)の256株である。
【００５１】
上述の株の1種以上の組み合わせも用いることができる。
【００５２】組換えの態様
本発明の好ましい態様は、組換えラクトバチルス・プランタルム（Lactobacil
lus plantarum）が異種抗原を細胞内に、及び／又は消化管内に存在する条件下
で異種抗原が細胞表面上に露出されるように発現させることが可能である発現ベ
クターを含むワクチンである。
lus plantarum）が異種抗原を細胞内に、及び／又は消化管内に存在する条件下
で異種抗原が細胞表面上に露出されるように発現させることが可能である発現ベ
クターを含むワクチンである。
【００５３】
異種抗原が病原性微生物に対する免疫原性の誘発に特異的であるワクチンの形
態の組換えラクトバチルス・プランタルムのあらゆる実施形態が本発明の範囲に
包含される。その宿主は、粘膜コロニー形成病原体又は粘膜、特には口腔経路を
介して体内に侵入する病原体に特異的な異種抗原を発現し得る。この異種抗原は
消化管コロニー形成病原体に特異的なものであってもよい。破傷風（Clostridiu
m tetanus）に特異的な異種抗原、例えば、TTFCが特に適切な候補である。
態の組換えラクトバチルス・プランタルムのあらゆる実施形態が本発明の範囲に
包含される。その宿主は、粘膜コロニー形成病原体又は粘膜、特には口腔経路を
介して体内に侵入する病原体に特異的な異種抗原を発現し得る。この異種抗原は
消化管コロニー形成病原体に特異的なものであってもよい。破傷風（Clostridiu
m tetanus）に特異的な異種抗原、例えば、TTFCが特に適切な候補である。
【００５４】
組換え細菌宿主（例えば、ラクトバチルス・プランタルム）は、異種抗原を細
胞内に、及び／又は異種抗原が保護免疫原性を誘発するのに十分な程度に細胞表
面上に露出されるように発現させることが可能な発現ベクターを含む。
胞内に、及び／又は異種抗原が保護免疫原性を誘発するのに十分な程度に細胞表
面上に露出されるように発現させることが可能な発現ベクターを含む。
【００５５】
好ましくは、これらのワクチンは一回投与が十分なものであるように処方され
る。しかしながら、例えばG.I.管における細菌宿主の持続性を考慮して、特定の
期間にわたって複数回適用される実施形態も想定される。本発明によるワクチン
製剤では追加免疫ワクチン接種の提供も想定されている。
る。しかしながら、例えばG.I.管における細菌宿主の持続性を考慮して、特定の
期間にわたって複数回適用される実施形態も想定される。本発明によるワクチン
製剤では追加免疫ワクチン接種の提供も想定されている。
【００５６】
好ましい投与方法は、第1〜第4日のいずれかでの1回以上の「初期」投薬もし
くは投与、それに続く第14〜第21日のいずれかでの1回以上の追加免疫投与、及
び、任意に、第28〜第25日のいずれかでの1回以上のさらなる追加免疫投与を含
む。一般には、この期間内での1回の初期投与とそれに続く1回の追加免疫投与で
十分である。
くは投与、それに続く第14〜第21日のいずれかでの1回以上の追加免疫投与、及
び、任意に、第28〜第25日のいずれかでの1回以上のさらなる追加免疫投与を含
む。一般には、この期間内での1回の初期投与とそれに続く1回の追加免疫投与で
十分である。
【００５７】
驚いたことに、幾つかの場合、例えば細菌宿主を6〜12日の持続期間で用いる
とき、有意な免疫応答が実質的には第1追加免疫投与の後にのみ得られたことが
見出されている。これは、第1追加免疫の時期に−すなわち、第14〜第21日に−
細菌宿主（すなわち、初期投与からの）が個体の糞中にもはや検出できなかった
という事実にもかからずであった。後述の例は、等しく初回刺激したマウスは、
初回刺激の後2、3又は4週のいずれかに経口ワクチンを再投与したときに全て追
加免疫されたことを示す。したがって、一態様において、本発明はそのような投
与及び追加免疫方法に適する方法及び製剤に関する。
とき、有意な免疫応答が実質的には第1追加免疫投与の後にのみ得られたことが
見出されている。これは、第1追加免疫の時期に−すなわち、第14〜第21日に−
細菌宿主（すなわち、初期投与からの）が個体の糞中にもはや検出できなかった
という事実にもかからずであった。後述の例は、等しく初回刺激したマウスは、
初回刺激の後2、3又は4週のいずれかに経口ワクチンを再投与したときに全て追
加免疫されたことを示す。したがって、一態様において、本発明はそのような投
与及び追加免疫方法に適する方法及び製剤に関する。
【００５８】
また、本発明は、異種抗原を細胞内に、及び／又はラクトバチルス・プランタ
ルム80β−ガラクトシダーゼの発現について開示されたベクター又はガラクトシ
ダーゼを発現するラクトバチルス・プランタルム80のいずれをも超える程度まで
細胞表面上に露出させるように発現させることが可能な（発現ベクターを適切に
含有する）組換えラクトバチルス・プランタルムを含むワクチンにも関する。
ルム80β−ガラクトシダーゼの発現について開示されたベクター又はガラクトシ
ダーゼを発現するラクトバチルス・プランタルム80のいずれをも超える程度まで
細胞表面上に露出させるように発現させることが可能な（発現ベクターを適切に
含有する）組換えラクトバチルス・プランタルムを含むワクチンにも関する。
【００５９】
ワクチン接種しようとする細胞又は宿主の生存可能性に障害を与えることなし
に可能な限り高程度の発現が想定されている。発現をより高めることで、免疫化
の目的に必要とされ得る投薬の頻度及び用量はより小さくなる。もちろん、投薬
方法は抗原の量だけに依存するのではなく、抗原の型及びワクチン中の他の免疫
原性刺激因子の有無にも依存する。
に可能な限り高程度の発現が想定されている。発現をより高めることで、免疫化
の目的に必要とされ得る投薬の頻度及び用量はより小さくなる。もちろん、投薬
方法は抗原の量だけに依存するのではなく、抗原の型及びワクチン中の他の免疫
原性刺激因子の有無にも依存する。
【００６０】
高程度の発現は、ワクチン中の組換えラクトバチルス・プランタルムに存在す
る発現ベクターの相同発現及び／又はそれに対する分泌シグナルを用いることに
よって達成することができる。実施例における構築物に存在するような適切に発
現を調節するシグナルが有用である。その他の発現シグナルも明らかである。発
現ベクターは、それが組み込まれるラクトバチルス株に依存して発現を最適化す
ることができる。
る発現ベクターの相同発現及び／又はそれに対する分泌シグナルを用いることに
よって達成することができる。実施例における構築物に存在するような適切に発
現を調節するシグナルが有用である。その他の発現シグナルも明らかである。発
現ベクターは、それが組み込まれるラクトバチルス株に依存して発現を最適化す
ることができる。
【００６１】
驚いたことに、ラクトバチルス・カセイ（Lactobacillus casei）において合
理的なレベルの（しかしながら、その組換えラクトバチルス・カセイを経口ワク
チンとして意図するには十分な程度にではない）発現をもたらす発現ベクターが
、ラクトバチルス・プランタルムに対し、経口投与で免疫原性をもたらすのに十
分な発現をもたらすことが見出された。したがって、ラクトバチルス・カセイに
おいて発現可能な発現ベクターを含むラクトバチルス・プランタルムが包含され
る。これは、第1にはラクトバチルス・カセイにおけるワクチン用途に十分な発
現の欠如のために、及び第2には様々な乳酸菌の間での発現レベルの予測不能性
のために、予測できるものではなかった。
理的なレベルの（しかしながら、その組換えラクトバチルス・カセイを経口ワク
チンとして意図するには十分な程度にではない）発現をもたらす発現ベクターが
、ラクトバチルス・プランタルムに対し、経口投与で免疫原性をもたらすのに十
分な発現をもたらすことが見出された。したがって、ラクトバチルス・カセイに
おいて発現可能な発現ベクターを含むラクトバチルス・プランタルムが包含され
る。これは、第1にはラクトバチルス・カセイにおけるワクチン用途に十分な発
現の欠如のために、及び第2には様々な乳酸菌の間での発現レベルの予測不能性
のために、予測できるものではなかった。
【００６２】
好ましいラクトバチルス・プランタルムはラクトバチルス・プランタルム256
であり、これは、この株が同じ条件下でラクトバチルス・カセイよりも良好な結
果をもたらすためである。
であり、これは、この株が同じ条件下でラクトバチルス・カセイよりも良好な結
果をもたらすためである。
【００６３】抗原
抗原は免疫応答を誘発又は刺激することができ、したがって、それに対して免
疫応答、より具体的には上に定義される「顕著な」免疫応答及び／又は「保護」
免疫応答が動物（好ましくは、ヒトのような哺乳動物）において誘発され得るあ
らゆる抗原であり得る。抗原は、通常、ワクチンを投与しようとするヒト又は動
物の病原体、疾患状態及び／又は障害に関連する。好ましくは、抗原は、例えば
リンパ球上又はそれらから放出される抗体内に存在する、1種類以上の（例えば
、特異的）受容体と相互作用することが可能である。このように、抗原は免疫原
であり得る。抗原は一般に免疫応答を誘発し得るものであるため、通常、酵素（
例えば、ウレアーゼ、β−ガラクトシダーゼ）、例えば、個体体内に既に存在す
るタンパク質は排除される。したがって、抗原は好ましくはその個体にとって外
来性である。
疫応答、より具体的には上に定義される「顕著な」免疫応答及び／又は「保護」
免疫応答が動物（好ましくは、ヒトのような哺乳動物）において誘発され得るあ
らゆる抗原であり得る。抗原は、通常、ワクチンを投与しようとするヒト又は動
物の病原体、疾患状態及び／又は障害に関連する。好ましくは、抗原は、例えば
リンパ球上又はそれらから放出される抗体内に存在する、1種類以上の（例えば
、特異的）受容体と相互作用することが可能である。このように、抗原は免疫原
であり得る。抗原は一般に免疫応答を誘発し得るものであるため、通常、酵素（
例えば、ウレアーゼ、β−ガラクトシダーゼ）、例えば、個体体内に既に存在す
るタンパク質は排除される。したがって、抗原は好ましくはその個体にとって外
来性である。
【００６４】
微生物宿主において発現可能であるあらゆる抗原、抗原成分又はそれ自体公知
のエピトープを用いることができる。通常、これはペプチド、タンパク質、又は
それらの抗原性の部分もしくは断片、例えば、エピトープである。そのようなも
のとして、それは未変性抗原性ペプチドもしくはタンパク質（又は、それらの部
分、断片もしくはエピトープ）又は、例えば合成により、もしくは組換えDNA技
術を用いて得られる、それらの抗原性類似体もしくは突然変異体のいずれかであ
り得る。
のエピトープを用いることができる。通常、これはペプチド、タンパク質、又は
それらの抗原性の部分もしくは断片、例えば、エピトープである。そのようなも
のとして、それは未変性抗原性ペプチドもしくはタンパク質（又は、それらの部
分、断片もしくはエピトープ）又は、例えば合成により、もしくは組換えDNA技
術を用いて得られる、それらの抗原性類似体もしくは突然変異体のいずれかであ
り得る。
【００６５】
様々な抗原に対する有意の免疫応答、好ましくは、保護免疫応答を誘発する（
illicit）のに用いることができる組換え細菌及び／又は細菌株を、それらに基
づくワクチンの他に、提供することができる。適切な抗原には以下のものが含ま
れる： −アレルゲン； −HIVウイルスに由来するもの（例えば、そのgp160エンベロープタンパク質）
、（リーシュマニア属（Leishmania）寄生虫の）表面糖タンパク質、シガ（Shig
a）様毒素、赤痢菌（Shigella）リポ多糖抗原、大腸菌（Escherichia coli）海
馬采抗原、（腸内毒素原性大腸菌株の）CFA抗原、炭疽毒素、百日咳毒素、破傷
風毒素を含むウイルス及び／又は細菌抗原； −ヘルペスウイルス、風疹ウイルス、インフルエンザウイルス、ムンプスウイ
ルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、RSウイルス、カンピロバ
クター（Campylobacter）種、クラミジア類、クリプトスポリジウム属の種、サ
イトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アクチノミセス（Actinomyces）
種、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）、アレナウイルス、アルボウイル
ス、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、カンジダ（Candida）属の種、コ
レラ菌（Vibrio cholera）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcu
s neoformans）、大腸菌O157:H7、O26:H11、O111:H8及びO104:H21のEHEC株、大
腸菌のETEC株、腸管組織侵入性（EIEC）を有することが示される大腸菌株、大腸
菌のEPEC株、大腸菌のEAggEC株、大腸菌のDAEC株、フィロウイルス、パルボウイ
ルス、フィラリオ上科（Filarioidea）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aure
us）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）属の種、ヘリコバクター・ピ
ロリ（Helicobacter pylori）、カリチウイルス、ジアルディア・ランブリア（G
iacardia lamblia）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、ハンタウイルス、A、B
、C、D、E型肝炎ウイルス、レジオネラ株、らい菌（Mycobacterium leprae）、
リステリア菌（Listeria monocytogenes）、クロストリジウム・ペルフリンゲン
ス属の種、ライム病ボレリア（Borrelia burgdorferi）、偽鼻疽菌（Pseudomona
s pseudomallei）、EBウイルス、回旋糸状菌、疱瘡ウイルス、百日咳菌（Bordet
ella pertussis）、ペスト菌（Yersinia pestis）、Q熱コクシエラ（Coxiella b
urnetti）、狂犬病ウイルス、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidium）、結核
菌（Mycobacterium tuberculosis）、チフス菌（Salmonella typhi）、マラリア
、カリニ肺炎の原因となる（真核生物寄生虫）もしくは、トキソプラズマ症の原
因となる病原体に由来する抗原。
illicit）のに用いることができる組換え細菌及び／又は細菌株を、それらに基
づくワクチンの他に、提供することができる。適切な抗原には以下のものが含ま
れる： −アレルゲン； −HIVウイルスに由来するもの（例えば、そのgp160エンベロープタンパク質）
、（リーシュマニア属（Leishmania）寄生虫の）表面糖タンパク質、シガ（Shig
a）様毒素、赤痢菌（Shigella）リポ多糖抗原、大腸菌（Escherichia coli）海
馬采抗原、（腸内毒素原性大腸菌株の）CFA抗原、炭疽毒素、百日咳毒素、破傷
風毒素を含むウイルス及び／又は細菌抗原； −ヘルペスウイルス、風疹ウイルス、インフルエンザウイルス、ムンプスウイ
ルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、RSウイルス、カンピロバ
クター（Campylobacter）種、クラミジア類、クリプトスポリジウム属の種、サ
イトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アクチノミセス（Actinomyces）
種、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）、アレナウイルス、アルボウイル
ス、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、カンジダ（Candida）属の種、コ
レラ菌（Vibrio cholera）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcu
s neoformans）、大腸菌O157:H7、O26:H11、O111:H8及びO104:H21のEHEC株、大
腸菌のETEC株、腸管組織侵入性（EIEC）を有することが示される大腸菌株、大腸
菌のEPEC株、大腸菌のEAggEC株、大腸菌のDAEC株、フィロウイルス、パルボウイ
ルス、フィラリオ上科（Filarioidea）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aure
us）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）属の種、ヘリコバクター・ピ
ロリ（Helicobacter pylori）、カリチウイルス、ジアルディア・ランブリア（G
iacardia lamblia）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、ハンタウイルス、A、B
、C、D、E型肝炎ウイルス、レジオネラ株、らい菌（Mycobacterium leprae）、
リステリア菌（Listeria monocytogenes）、クロストリジウム・ペルフリンゲン
ス属の種、ライム病ボレリア（Borrelia burgdorferi）、偽鼻疽菌（Pseudomona
s pseudomallei）、EBウイルス、回旋糸状菌、疱瘡ウイルス、百日咳菌（Bordet
ella pertussis）、ペスト菌（Yersinia pestis）、Q熱コクシエラ（Coxiella b
urnetti）、狂犬病ウイルス、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidium）、結核
菌（Mycobacterium tuberculosis）、チフス菌（Salmonella typhi）、マラリア
、カリニ肺炎の原因となる（真核生物寄生虫）もしくは、トキソプラズマ症の原
因となる病原体に由来する抗原。
【００６６】
好ましくは、アレルゲン（allerben）はヒトアレルゲンであるか、又は組成物
を投与しようとする個体の型もしくは種においてアレルギー反応を引き起こすア
レルゲンである。これはハウス又は昆虫アレルゲン、例えば、ダストマイト（du
st mite）に由来するもの、例えば、Der p 1であり得る。
を投与しようとする個体の型もしくは種においてアレルギー反応を引き起こすア
レルゲンである。これはハウス又は昆虫アレルゲン、例えば、ダストマイト（du
st mite）に由来するもの、例えば、Der p 1であり得る。
【００６７】
未変性抗原及び抗原性成分（それらの抗原性部分、断片又はエピトープを含む
）以外に、−合成又は組換えDNA技術によって得られる−それらの抗原性突然変
異体又は類似体を用いることができる。また、本発明のワクチンにおいて、2種
類以上のそのような抗原の組合せが存在していたり発現していたりしていてもよ
い。これらの抗原は単一の（型もしくは株の）細菌宿主が発現しても、数種類の
異なる（型もしくは株の）細菌宿主が発現してもよい。
）以外に、−合成又は組換えDNA技術によって得られる−それらの抗原性突然変
異体又は類似体を用いることができる。また、本発明のワクチンにおいて、2種
類以上のそのような抗原の組合せが存在していたり発現していたりしていてもよ
い。これらの抗原は単一の（型もしくは株の）細菌宿主が発現しても、数種類の
異なる（型もしくは株の）細菌宿主が発現してもよい。
【００６８】
上述のうち、ロタウイルス、RSウイルス、結核菌、ヒト免疫不全ウイルス、大
腸菌、コレラ菌、連鎖球菌及びクラミジアに対する、及び／又はそれらに特異的
な抗原が本発明のワクチンにおいて抗原として用いるのに特に好ましい。
腸菌、コレラ菌、連鎖球菌及びクラミジアに対する、及び／又はそれらに特異的
な抗原が本発明のワクチンにおいて抗原として用いるのに特に好ましい。
【００６９】
抗原は、好ましくは、発現時に、−未変性株と比較して低下する可能性はある
が、少なくともある程度は−投与により依然として組換え細菌宿主を消化管内に
定住させ、及び／又は（その一部に）コロニーを形成させ、そこに存続させるよ
うなものである。これは、その抗原及び／又はそれに関連する病原体に対する有
意の免疫応答をもたらすのに十分な期間であればよい。
が、少なくともある程度は−投与により依然として組換え細菌宿主を消化管内に
定住させ、及び／又は（その一部に）コロニーを形成させ、そこに存続させるよ
うなものである。これは、その抗原及び／又はそれに関連する病原体に対する有
意の免疫応答をもたらすのに十分な期間であればよい。
【００７０】
抗原は、細菌株において、その抗原を組換え細菌宿主内でその宿主をワクチン
における使用に適するものにするような方法で発現するそれ自体公知のあらゆる
発現系を用いて発現させることができる。これは、少なくとも抗原が細胞内に、
及び／又は細菌宿主の表面上に露出されるように、適切なレベル、例えば、全細
胞タンパク質の少なくとも1〜5％（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び
標準タンパク質染色による測定で）発現するべきであることを意味する。
における使用に適するものにするような方法で発現するそれ自体公知のあらゆる
発現系を用いて発現させることができる。これは、少なくとも抗原が細胞内に、
及び／又は細菌宿主の表面上に露出されるように、適切なレベル、例えば、全細
胞タンパク質の少なくとも1〜5％（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び
標準タンパク質染色による測定で）発現するべきであることを意味する。
【００７１】発現系
通常、発現系は、所望の抗原（すなわち、成分）をコードする少なくとも1つ
のヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を含有し、好ましくは、このヌクレオチ
ド配列は細菌宿主におけるその配列の発現を指令することが可能なプロモーター
に機能可能に連結する。適切には、発現させようとする抗原はその細菌宿主の優
先コドン使用に適合する核酸配列によってコードすることができる。この構築物
は、選択された細菌宿主において作動可能な、エンハンサー、転写開始配列、シ
グナル配列、レポーター遺伝子、転写終結配列等を含む（全ての）他の適切なエ
レメントをさらに含むことができる。
のヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を含有し、好ましくは、このヌクレオチ
ド配列は細菌宿主におけるその配列の発現を指令することが可能なプロモーター
に機能可能に連結する。適切には、発現させようとする抗原はその細菌宿主の優
先コドン使用に適合する核酸配列によってコードすることができる。この構築物
は、選択された細菌宿主において作動可能な、エンハンサー、転写開始配列、シ
グナル配列、レポーター遺伝子、転写終結配列等を含む（全ての）他の適切なエ
レメントをさらに含むことができる。
【００７２】
この構築物は、好ましくは、細菌宿主の形質転換に適する形態及び／又は細菌
宿主において安定に維持され得る形態、例えば、ベクター又はプラスミドである
。より好ましくは、食品グレードの構築物を用いる。
宿主において安定に維持され得る形態、例えば、ベクター又はプラスミドである
。より好ましくは、食品グレードの構築物を用いる。
【００７３】
本発明による特に好ましい構築物は、抗原をコードするヌクレオチド配列が組
み込まれている、PCT／NL95／00135（WO−A−96／32487）に記載されるマルチコ
ピー発現ベクターを含む。このような構築物は、乳酸菌、特にはラクトバチルス
において高レベルの発現で所望のタンパク質又はポリペプチドを発現させるのに
特に適しており、細菌細胞の表面に発現した産生物を向かわせるのにも有利に用
いることができる。これらの構築物（例えば、PCT／NL95／00135の）は、抗原を
コードする核酸配列に、リボゾーム認識及びRNA安定化に必要な少なくとも最少
配列を含む5’非翻訳核酸配列が先行することを特徴とする。これに翻訳開始コ
ドンが続き、この翻訳開始コドンには乳酸菌の遺伝子の翻訳された核酸配列の5
’末端部分の少なくとも5コドンの断片又はその断片の構造的もしくは機能的等
価物が（直後に）続いていてもよい。また、この断片もプロモーターによって制
御される。ここに開示されるものとは異なる実施形態を含むPCT／NL95／00135の
内容、及び本明細書において言及される全ての他の文書は、参照することにより
本明細書に組み込まれる。
み込まれている、PCT／NL95／00135（WO−A−96／32487）に記載されるマルチコ
ピー発現ベクターを含む。このような構築物は、乳酸菌、特にはラクトバチルス
において高レベルの発現で所望のタンパク質又はポリペプチドを発現させるのに
特に適しており、細菌細胞の表面に発現した産生物を向かわせるのにも有利に用
いることができる。これらの構築物（例えば、PCT／NL95／00135の）は、抗原を
コードする核酸配列に、リボゾーム認識及びRNA安定化に必要な少なくとも最少
配列を含む5’非翻訳核酸配列が先行することを特徴とする。これに翻訳開始コ
ドンが続き、この翻訳開始コドンには乳酸菌の遺伝子の翻訳された核酸配列の5
’末端部分の少なくとも5コドンの断片又はその断片の構造的もしくは機能的等
価物が（直後に）続いていてもよい。また、この断片もプロモーターによって制
御される。ここに開示されるものとは異なる実施形態を含むPCT／NL95／00135の
内容、及び本明細書において言及される全ての他の文書は、参照することにより
本明細書に組み込まれる。
【００７４】
好ましくは、用いられる構築物は、少なくとも同じ細菌宿主において同じ条件
下でPCT／NL95／00135のベクターによってもたらされるレベルに匹敵する−例え
ば、細胞内での、及び／又は表面に露出される−発現のレベルを提供する。
下でPCT／NL95／00135のベクターによってもたらされるレベルに匹敵する−例え
ば、細胞内での、及び／又は表面に露出される−発現のレベルを提供する。
【００７５】
本発明のワクチンは好ましくは経口ワクチンであり、換言すると、これらは経
口投与に適合する。このような経口ワクチン組成物は、通常胃内の酸を中和する
ためにアルカリが必要であり、かつ細菌（少なくともそれらの大部分）を活動状
態で胃を介して腸まで通過させるため、通常アルカリ性である。投与された細菌
の大部分が胃を生き抜いて腸まで通過することが好ましい。免疫応答の増加は細
菌が死んでいるのではなく生きているときに、換言すると、生存可能であるとき
に達成することができる。これは、それらがin vivoで異種抗原を発現し続ける
ことができるためである。全ての医薬組成物がアルカリ性であるわけではなく、
したがって、アルカリ性ではないもの（例えば、経鼻製剤）は経口投与には適さ
ない。
口投与に適合する。このような経口ワクチン組成物は、通常胃内の酸を中和する
ためにアルカリが必要であり、かつ細菌（少なくともそれらの大部分）を活動状
態で胃を介して腸まで通過させるため、通常アルカリ性である。投与された細菌
の大部分が胃を生き抜いて腸まで通過することが好ましい。免疫応答の増加は細
菌が死んでいるのではなく生きているときに、換言すると、生存可能であるとき
に達成することができる。これは、それらがin vivoで異種抗原を発現し続ける
ことができるためである。全ての医薬組成物がアルカリ性であるわけではなく、
したがって、アルカリ性ではないもの（例えば、経鼻製剤）は経口投与には適さ
ない。
【００７６】
抗原をコードする配列は、あらゆる天然源から得ることができ、及び／又は公
知DNA合成技術を用いて合成によって調製することができる。次に、抗原をコー
ドする配列を（例えば）適切な発現ベクターに組み込んで本発明の遺伝子構築物
を得ることができ、次いでそれを目的とする細菌宿主株（例えば、PCT／NL95／0
0135に記載されるようなもの）の形質転換に用いることができる。
知DNA合成技術を用いて合成によって調製することができる。次に、抗原をコー
ドする配列を（例えば）適切な発現ベクターに組み込んで本発明の遺伝子構築物
を得ることができ、次いでそれを目的とする細菌宿主株（例えば、PCT／NL95／0
0135に記載されるようなもの）の形質転換に用いることができる。
【００７７】
このようにして得られた組換え細菌宿主を次に培養することができ、それによ
り、任意にさらなる精製及び／又は処理工程、例えば、粉末を形成する凍結乾燥
の後に、回収した細胞をワクチンの処方に用いることができる。
り、任意にさらなる精製及び／又は処理工程、例えば、粉末を形成する凍結乾燥
の後に、回収した細胞をワクチンの処方に用いることができる。
【００７８】
抗原をコードする配列を含む遺伝子構築物の作成に必要とされる技術、及び細
菌宿主の形質転換、培養及び回収のための技術は当該技術分野において公知であ
る。例えば、それらはPCT／NL95／00135の他に、Sambrook et al, "Molecular C
loning: A Laboratory Manual" (2nd ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor La
boratory (1989) 及び F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molec
ular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)
を含む教科書に記載される。
菌宿主の形質転換、培養及び回収のための技術は当該技術分野において公知であ
る。例えば、それらはPCT／NL95／00135の他に、Sambrook et al, "Molecular C
loning: A Laboratory Manual" (2nd ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor La
boratory (1989) 及び F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molec
ular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)
を含む教科書に記載される。
【００７９】
細菌宿主を含むワクチンは、例えば、ワクチンを処方するための、及び／又は
動物もしくはヒトへの経口投与用の生菌製剤を処方するための公知の方法で処方
することができる。例えば消化管障害を治療するための、プロバイオティクス投
与用の製剤を参照することができる。
動物もしくはヒトへの経口投与用の生菌製剤を処方するための公知の方法で処方
することができる。例えば消化管障害を治療するための、プロバイオティクス投
与用の製剤を参照することができる。
【００８０】
本発明によるワクチンは経口投与に適する形態にあることが可能であり、これ
は固体、半固体又は液体形態であり得、これには、限定されるものではないが、
細菌の溶液及び／又は懸濁液が含まれ、通常はこれが好ましい。
は固体、半固体又は液体形態であり得、これには、限定されるものではないが、
細菌の溶液及び／又は懸濁液が含まれ、通常はこれが好ましい。
【００８１】
ワクチン製剤は粉末、例えば、使用前に、例えば適切な液体を用いて、再構成
することができる凍結乾燥粉末の形態であってもよい。投与前に固体、半固体又
は液体食品と混合されている（される）固体もしくは液体製剤の形態であっても
よい。また、発酵製品の形態であってもよい。
することができる凍結乾燥粉末の形態であってもよい。投与前に固体、半固体又
は液体食品と混合されている（される）固体もしくは液体製剤の形態であっても
よい。また、発酵製品の形態であってもよい。
【００８２】
細菌に加えて、ワクチンは1種類以上の薬学的に許容し得る担体又は賦形剤、
例えば、水を含むことができる。また、ワクチンは経口投与に適する1種類以上
のアジュバントを含んでいてもよく、これには免疫アジュバントが含まれる。こ
れらは細菌宿主に適合するものであり、かつ適切には、その所望の免疫原性を（
大幅に）妨害しないものである。一実施形態によると、これらのアジュバントは
乳酸菌、例えば、細菌宿主株それ自体、上述の他のL．プランタルム株のうちの1
つ、別のラクトバチルス種、又はヒトもしくは動物への経口投与に適するラクト
コッカス（Lactococcus）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）もしくは
プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）種であってもよい。
例えば、水を含むことができる。また、ワクチンは経口投与に適する1種類以上
のアジュバントを含んでいてもよく、これには免疫アジュバントが含まれる。こ
れらは細菌宿主に適合するものであり、かつ適切には、その所望の免疫原性を（
大幅に）妨害しないものである。一実施形態によると、これらのアジュバントは
乳酸菌、例えば、細菌宿主株それ自体、上述の他のL．プランタルム株のうちの1
つ、別のラクトバチルス種、又はヒトもしくは動物への経口投与に適するラクト
コッカス（Lactococcus）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）もしくは
プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）種であってもよい。
【００８３】
また、ワクチンは1種類以上のさらなる治療用物質及び／又は細菌によるG.I.
管の（一部の）コロニー形成及び／又はG.I.管内での細菌の成長を促進及び／又
は強化し得る1種類以上の物質を含むことができる。この製剤は、例えばチュー
ブ又はカテーテルを介する、胃又は腸への（直接）投与に適する形態であっても
よい。好ましくは、経口投与により、細菌宿主は消化管、又は少なくともそれら
の一部、例えば、口、腸、小腸（例えば、十二指腸、空腸もしくは回腸）、大腸
（もしくはそれらの一部、例えば、盲腸）もしくは結腸、好ましくは小腸もしく
は盲腸のいずれかの内に住み着き、その上コロニーを形成することができる。
管の（一部の）コロニー形成及び／又はG.I.管内での細菌の成長を促進及び／又
は強化し得る1種類以上の物質を含むことができる。この製剤は、例えばチュー
ブ又はカテーテルを介する、胃又は腸への（直接）投与に適する形態であっても
よい。好ましくは、経口投与により、細菌宿主は消化管、又は少なくともそれら
の一部、例えば、口、腸、小腸（例えば、十二指腸、空腸もしくは回腸）、大腸
（もしくはそれらの一部、例えば、盲腸）もしくは結腸、好ましくは小腸もしく
は盲腸のいずれかの内に住み着き、その上コロニーを形成することができる。
【００８４】免疫原性
このように、細菌宿主が発現する抗原は粘膜層、G.I.管の裏層及び／又は壁（
以下、集合的に「G.I.管壁」と呼ぶ）、より具体的にはこの壁内の細胞と接触す
ることができる。これは、そのようにして提示される抗原、例えば、抗原提示細
胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞及び／又はBリンパ球）に対する免疫応
答を介在することができる。このG.I.管壁内の細胞による免疫学的応答は、それ
自体で既に上に定義される有意の免疫応答を構成することができ、及び／又はワ
クチンを投与したヒトもしくは動物の体内でさらなる免疫的学的反応／応答を誘
発することができ、これもまた有意の応答であり得、及び／又は本明細書に定義
される保護応答であり得る。しかしながら、本発明は、組換え細菌宿主が免疫応
答を誘発するいずれかの特定の機構に限定されるものではない。例えば、細菌宿
主が発現する抗原によって誘発される免疫応答は、（フリーの）可溶性タンパク
質のような抗原によって誘発される応答と比較してより強力かつ増強された免疫
応答をもたらし得る。
以下、集合的に「G.I.管壁」と呼ぶ）、より具体的にはこの壁内の細胞と接触す
ることができる。これは、そのようにして提示される抗原、例えば、抗原提示細
胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞及び／又はBリンパ球）に対する免疫応
答を介在することができる。このG.I.管壁内の細胞による免疫学的応答は、それ
自体で既に上に定義される有意の免疫応答を構成することができ、及び／又はワ
クチンを投与したヒトもしくは動物の体内でさらなる免疫的学的反応／応答を誘
発することができ、これもまた有意の応答であり得、及び／又は本明細書に定義
される保護応答であり得る。しかしながら、本発明は、組換え細菌宿主が免疫応
答を誘発するいずれかの特定の機構に限定されるものではない。例えば、細菌宿
主が発現する抗原によって誘発される免疫応答は、（フリーの）可溶性タンパク
質のような抗原によって誘発される応答と比較してより強力かつ増強された免疫
応答をもたらし得る。
【００８５】
本発明において、抗原がG.I.管壁及び／又はその内部の特定の細胞−例えば、
免疫応答を介在し、及び／又はそれに関与する細胞−に提示され、及び／又は送
達される様式は、フリーの可溶性タンパク質としての抗原の投与、発現及び／又
は使用と比較したとき、改善又は増強されている可能性がある。例えば、細菌宿
主はG.I.管壁に付着することができ、かつin situで（より）長期間存続可能で
あるため、抗原がG.I.管壁に局部的に（より）多量に、（より）高レベルもしく
は濃度で、より安定もしくは耐久性のある方法で、及び／又は（より）長期間提
示されうる。これらのいずれも（増強された）免疫応答をもたらし得る。
免疫応答を介在し、及び／又はそれに関与する細胞−に提示され、及び／又は送
達される様式は、フリーの可溶性タンパク質としての抗原の投与、発現及び／又
は使用と比較したとき、改善又は増強されている可能性がある。例えば、細菌宿
主はG.I.管壁に付着することができ、かつin situで（より）長期間存続可能で
あるため、抗原がG.I.管壁に局部的に（より）多量に、（より）高レベルもしく
は濃度で、より安定もしくは耐久性のある方法で、及び／又は（より）長期間提
示されうる。これらのいずれも（増強された）免疫応答をもたらし得る。
【００８６】
細菌宿主−又はそれらのあらゆる部分もしくは断片及び／又はそれが産生する
あらゆるさらなる成分−はG.I.管壁及び／又はその内部の特定の細胞、例えば、
免疫応答を介在し、及び／又はそれに関与する細胞と相互作用することができる
。これは、その細菌宿主に関連する抗原に対する免疫応答を、例えばフリーの可
溶性タンパク質としての抗原の投与、発現及び／又は使用と比較して、可能にし
、促進し、又は増強し得る。
あらゆるさらなる成分−はG.I.管壁及び／又はその内部の特定の細胞、例えば、
免疫応答を介在し、及び／又はそれに関与する細胞と相互作用することができる
。これは、その細菌宿主に関連する抗原に対する免疫応答を、例えばフリーの可
溶性タンパク質としての抗原の投与、発現及び／又は使用と比較して、可能にし
、促進し、又は増強し得る。
【００８７】
抗原は、好ましくは、細菌宿主によってその抗原が細胞表面上に露出されるよ
うに発現されるが、−免疫応答を誘発するために−例えば、細菌細胞壁を透過性
にし、及び／又は細胞もしくは細菌細胞壁を破壊する機構により、細菌宿主の細
胞内容物がin situで（すなわち、G.I.管壁で局所的に）放出され、及び／又は
細菌細胞から遊離することを排除するものではない。したがって、（G.I.管壁で
in situで）免疫原性応答は、無傷の細菌宿主ではなく、それらの部分、断片、
画分又は化合物、例えば、そのようなものとしての抗原及び／又は抗原を含む細
胞断片もしくは細胞画分によって（まさに）生じ／誘発され得る。したがって、
ワクチンは無傷の生存可能な菌及び／又は生菌を含むことが好ましくはあるが、
組換え細菌宿主の、又はそれから誘導される、断片、画分、溶解物等を（例えば
、それらをも）含むワクチンが排除されるものではない。
うに発現されるが、−免疫応答を誘発するために−例えば、細菌細胞壁を透過性
にし、及び／又は細胞もしくは細菌細胞壁を破壊する機構により、細菌宿主の細
胞内容物がin situで（すなわち、G.I.管壁で局所的に）放出され、及び／又は
細菌細胞から遊離することを排除するものではない。したがって、（G.I.管壁で
in situで）免疫原性応答は、無傷の細菌宿主ではなく、それらの部分、断片、
画分又は化合物、例えば、そのようなものとしての抗原及び／又は抗原を含む細
胞断片もしくは細胞画分によって（まさに）生じ／誘発され得る。したがって、
ワクチンは無傷の生存可能な菌及び／又は生菌を含むことが好ましくはあるが、
組換え細菌宿主の、又はそれから誘導される、断片、画分、溶解物等を（例えば
、それらをも）含むワクチンが排除されるものではない。
【００８８】用量
投与される細菌の量は重要ではないが、適切には、細菌がG.I.管内（の望まし
い部分）に住み着き、及び／又はコロニー形成し、及び／又は十分な免疫応答を
生じるのに十分なものである。適切な量は、用量当たり少なくとも108cfu、好ま
しくは108−1010cfuである。これは、所望により、十分な量の細菌を腸内まで通
過させる。108cfu未満の用量の経口投与では望ましい免疫原性が（少なくとも信
頼できる様式では）常にもたらされるとは限らない可能性があり、一方、5×101 0 cfuを超える量は、経口投与するのに扱いにくい場合、あまり好ましくない。上
述の細菌の量（投与量）は、例えば、ヒト又は動物の体重１kg当たり106〜108cf
uに相当し得る。ワクチン（又は他の製剤）中の細菌の濃度は、少なくとも5×10 9 ／ml、例えば、少なくとも1010／mlであり得る。この製剤は最大2、3又は4日間
のみ投与することができる。細菌は、最初もしくは最後の投与の後少なくとも5
日、7日又は9日、その個体において依然として検出可能であり得る。
い部分）に住み着き、及び／又はコロニー形成し、及び／又は十分な免疫応答を
生じるのに十分なものである。適切な量は、用量当たり少なくとも108cfu、好ま
しくは108−1010cfuである。これは、所望により、十分な量の細菌を腸内まで通
過させる。108cfu未満の用量の経口投与では望ましい免疫原性が（少なくとも信
頼できる様式では）常にもたらされるとは限らない可能性があり、一方、5×101 0 cfuを超える量は、経口投与するのに扱いにくい場合、あまり好ましくない。上
述の細菌の量（投与量）は、例えば、ヒト又は動物の体重１kg当たり106〜108cf
uに相当し得る。ワクチン（又は他の製剤）中の細菌の濃度は、少なくとも5×10 9 ／ml、例えば、少なくとも1010／mlであり得る。この製剤は最大2、3又は4日間
のみ投与することができる。細菌は、最初もしくは最後の投与の後少なくとも5
日、7日又は9日、その個体において依然として検出可能であり得る。
【００８９】ワクチン
好ましくは、ワクチン接種しようとする個体はヒトまたは動物である。ヒトは
乳児、免疫無防備状態の人、高齢者または正常健康乳児、小児もしくは成人であ
り得る。
乳児、免疫無防備状態の人、高齢者または正常健康乳児、小児もしくは成人であ
り得る。
【００９０】
細菌宿主を用いることの利点の1つは、それらが腸にコロニーを形成するのに
十分な量で腸内に生存／通過することが可能であるということである。それにも
かかわらず、細菌をコーティングした製剤もしくはカプセル封入した製剤中に含
めて、またはそれらの製剤として、例えば遅延放出組成物または腸溶コート組成
物の形態で、投与することができる。適切なカプセル封入化合物には、限定され
るものではないが、キトサン、マルトデキストリン、脂質ならびにオリゴ糖およ
び多糖が含まれる。カプセル封入はワクチンの保存性も改善し得る。ワクチンは
アジュバントを含まなくてもよいが、好ましくは、1種類以上のアジュバントを
含む。
十分な量で腸内に生存／通過することが可能であるということである。それにも
かかわらず、細菌をコーティングした製剤もしくはカプセル封入した製剤中に含
めて、またはそれらの製剤として、例えば遅延放出組成物または腸溶コート組成
物の形態で、投与することができる。適切なカプセル封入化合物には、限定され
るものではないが、キトサン、マルトデキストリン、脂質ならびにオリゴ糖およ
び多糖が含まれる。カプセル封入はワクチンの保存性も改善し得る。ワクチンは
アジュバントを含まなくてもよいが、好ましくは、1種類以上のアジュバントを
含む。
【００９１】
本発明を主としてL.プランタルム株を参照して説明したが、おそらくは、例え
ば本発明のワクチンにおいて、細菌宿主としての使用に適することが同様に立証
され得る他のラクトバチルス属種の株が存在し得る。これらとしては、L．ペン
トスス（L. pentosus）、L．レウトリ（L. reuteri）、L．アニマリス（L. anim
alis）（＝L．ムリヌス（L. murinus））、L．フェルメンツム（L. fermentum）
、L．アシドフィルス（L. acidophilus）、L．クリスパツス（L. crispatus）、
L．ガッセリ（L. gasseri）、L．ジョンソニイ（L. johnsonii）、L．サリバリ
ウス（L. salivarius）、L．ブレビス（L. brevis）、L．ラムノシス（L. rhamn
osis）および／またはL．パラカセイ（L. paracasei）に由来する株が含まれ得
る。
ば本発明のワクチンにおいて、細菌宿主としての使用に適することが同様に立証
され得る他のラクトバチルス属種の株が存在し得る。これらとしては、L．ペン
トスス（L. pentosus）、L．レウトリ（L. reuteri）、L．アニマリス（L. anim
alis）（＝L．ムリヌス（L. murinus））、L．フェルメンツム（L. fermentum）
、L．アシドフィルス（L. acidophilus）、L．クリスパツス（L. crispatus）、
L．ガッセリ（L. gasseri）、L．ジョンソニイ（L. johnsonii）、L．サリバリ
ウス（L. salivarius）、L．ブレビス（L. brevis）、L．ラムノシス（L. rhamn
osis）および／またはL．パラカセイ（L. paracasei）に由来する株が含まれ得
る。
【００９２】
本発明において有用な株は、好ましくは、GRAS状態を有し、より好ましくは食
品品質である。また、これらは、上記PCT／NL95／00135の発現ベクター、または
この好ましい発現ベクターに匹敵する（例えば、細胞内で、および／または細菌
宿主の表面上に露出される）発現のレベルをもたらす他のベクターと組合せて、
最も好ましく用いられる。
品品質である。また、これらは、上記PCT／NL95／00135の発現ベクター、または
この好ましい発現ベクターに匹敵する（例えば、細胞内で、および／または細菌
宿主の表面上に露出される）発現のレベルをもたらす他のベクターと組合せて、
最も好ましく用いられる。
【００９３】
さらに、ラクトバチルス属に属する株の使用が好ましくはあるが、適切な株が
おそらくはビフィドバクテリアおよびプロピオバクテリア、例えば、ビフィドバ
クテリウム属および／またはプロピオバクテリウム属由来のものからも選択でき
ることが考えられる。適切な株は、L.プランタルムと同じ方法で当業者が選択す
ることができ、および／またはラクトバチルスを選択することができる。
おそらくはビフィドバクテリアおよびプロピオバクテリア、例えば、ビフィドバ
クテリウム属および／またはプロピオバクテリウム属由来のものからも選択でき
ることが考えられる。適切な株は、L.プランタルムと同じ方法で当業者が選択す
ることができ、および／またはラクトバチルスを選択することができる。
【００９４】
例えば、選択された株が本発明に係る細菌宿主として適切であるかどうかを決
定／確認するのに適する試験では、その宿主をTTFC担持ベクターpLP401（TTFC抗
原の表面固定化／表面露出発現用）および／またはTTFC担持ベクターpLP503（TT
FC抗原の細胞内発現用）で形質転換した後、そのようにして得られた組換え宿主
を、動物、好ましくは哺乳動物（例えば、BALB／cおよび／またはC57bl／6マウ
スのようなマウス）に、好ましくは実施例において言及されるような単回投与初
回免疫および追加免疫スケジュールに従って、経口投与し、次いでELISAにより
破傷風トキソイドを用いて各個体の血清中のIgGの終点力価を測定する。そのよ
うなアッセイにおいて、選択された組換え宿主は、好ましくは、同じベクターで
形質転換して同じ条件下で投与したとき、L.プランタルムNICMB 8826および／ま
たはL.プランタルム80よりも高い（すなわち、少なくとも1％高い）力価；より
好ましくは少なくとも10％高く、さらにより好ましくは少なくとも20％高い力価
をもたらす。
定／確認するのに適する試験では、その宿主をTTFC担持ベクターpLP401（TTFC抗
原の表面固定化／表面露出発現用）および／またはTTFC担持ベクターpLP503（TT
FC抗原の細胞内発現用）で形質転換した後、そのようにして得られた組換え宿主
を、動物、好ましくは哺乳動物（例えば、BALB／cおよび／またはC57bl／6マウ
スのようなマウス）に、好ましくは実施例において言及されるような単回投与初
回免疫および追加免疫スケジュールに従って、経口投与し、次いでELISAにより
破傷風トキソイドを用いて各個体の血清中のIgGの終点力価を測定する。そのよ
うなアッセイにおいて、選択された組換え宿主は、好ましくは、同じベクターで
形質転換して同じ条件下で投与したとき、L.プランタルムNICMB 8826および／ま
たはL.プランタルム80よりも高い（すなわち、少なくとも1％高い）力価；より
好ましくは少なくとも10％高く、さらにより好ましくは少なくとも20％高い力価
をもたらす。
【００９５】
好ましくは、選択された組換え宿主は、同じベクターで形質転換されて同じ条
件下で投与されたL.プランタルム256によってもたらされる力価の少なくとも70
％、より好ましくは少なくとも90％である力価をもたらし、さらにより好ましく
は、同じベクターで形質転換されて同じ条件下で投与されたL.プランタルム256
によってもたらされる力価と少なくとも等しい力価をもたらす。
件下で投与されたL.プランタルム256によってもたらされる力価の少なくとも70
％、より好ましくは少なくとも90％である力価をもたらし、さらにより好ましく
は、同じベクターで形質転換されて同じ条件下で投与されたL.プランタルム256
によってもたらされる力価と少なくとも等しい力価をもたらす。
【００９６】
本発明は、さらに、従来記載されている細菌を本発明のワクチンにおいて用い
ることに関する。本発明は、さらに、異種抗原の細胞内発現または細胞表面上で
の露出に適する発現ベクターに関する。この発現は、細菌、例えば、従来記載さ
れているラクトバチルス・プランタルムにおけるものである。
ることに関する。本発明は、さらに、異種抗原の細胞内発現または細胞表面上で
の露出に適する発現ベクターに関する。この発現は、細菌、例えば、従来記載さ
れているラクトバチルス・プランタルムにおけるものである。
【００９７】
本発明は、さらに、異種抗原を（例えば、細胞内に、および／または細胞表面
上に）発現するように改変されているラクトバチルス（例えば、L.プランタルム
）細菌の、非改変L.プランタルムが異物となる個体に対するワクチンの製造への
使用に関する。非改変L.プランタルムは好ましくはヒト（またはヒトの食品）に
は見出されず、または、例えば、哺乳動物のG.I.管もしくは粘膜中に存在しない
。本明細書に記載される細菌はワクチンの製造に用いることができる。このワク
チンは経口投与に適合し得る。好ましくは、この細菌は投与することで何らかの
免疫応答を誘発する。本発明のワクチンは、特には、破傷風の予防に用いること
ができる。
上に）発現するように改変されているラクトバチルス（例えば、L.プランタルム
）細菌の、非改変L.プランタルムが異物となる個体に対するワクチンの製造への
使用に関する。非改変L.プランタルムは好ましくはヒト（またはヒトの食品）に
は見出されず、または、例えば、哺乳動物のG.I.管もしくは粘膜中に存在しない
。本明細書に記載される細菌はワクチンの製造に用いることができる。このワク
チンは経口投与に適合し得る。好ましくは、この細菌は投与することで何らかの
免疫応答を誘発する。本発明のワクチンは、特には、破傷風の予防に用いること
ができる。
【００９８】
法律が許容する場合、本発明は個体、例えば、ヒトまたは動物（例えば、哺乳
動物）への細菌またはワクチンの投与にも関し、ここで、その個体（または、適
切な場合、被験体）は細菌またはワクチンを必要とするものである。この個体は
、上述のように、特定の疾患の治療を必要とするものであっても予防を必要とす
るものであってよい。
動物）への細菌またはワクチンの投与にも関し、ここで、その個体（または、適
切な場合、被験体）は細菌またはワクチンを必要とするものである。この個体は
、上述のように、特定の疾患の治療を必要とするものであっても予防を必要とす
るものであってよい。
【００９９】
本発明の一太陽である好ましい特徴および特性は、必要に応じて変更を加えて
他の態様に同様に適用することができる。
他の態様に同様に適用することができる。
【０１００】
本発明を、図面を参照する以下の実施例によって説明するが、これらは単に説
明のために提供されるものであり、本発明は以下の実施例に限定されるものと解
釈されるべきではない。
明のために提供されるものであり、本発明は以下の実施例に限定されるものと解
釈されるべきではない。
【０１０１】実施例 一般的な問題
小児科および免疫無防備状態の集団における、安全な非侵襲性ベクター、例え
ば、共生ラクトバチルスによる粘膜関連リンパ系組織への抗原の送達は、ワクチ
ン投与の選択肢の普及を決定的に向上させる。破傷風毒素の50kDaフラグメントC
（TTFC）が細胞内タンパク質もしくは表面露出タンパク質として発現するような
、ラクトバチルスにおける異種遺伝子発現のために構築されたワクチンを用いる
マウスの経口および経鼻免疫化が記載されている。そのデータは、ラクトバチル
ス・プランタルム株がラクトバチルス・カセイよりも有効であることを示す。組
換え生ラクトバチルスでのマウスの免疫化は、ワクチン株の経鼻もしくは経口送
達の後に、有意なレベルの循環TTFC特異的IgGを誘導した。加えて、経鼻送達後
の排出領域リンパ節における抗原特異的抗体分泌細胞および抗原特異的T細胞活
性化の他に、気管支肺胞洗浄液中にsIgAが誘導されることから、小児用ワクチン
の安全な粘膜送達についての使用可能性が実証される。
ば、共生ラクトバチルスによる粘膜関連リンパ系組織への抗原の送達は、ワクチ
ン投与の選択肢の普及を決定的に向上させる。破傷風毒素の50kDaフラグメントC
（TTFC）が細胞内タンパク質もしくは表面露出タンパク質として発現するような
、ラクトバチルスにおける異種遺伝子発現のために構築されたワクチンを用いる
マウスの経口および経鼻免疫化が記載されている。そのデータは、ラクトバチル
ス・プランタルム株がラクトバチルス・カセイよりも有効であることを示す。組
換え生ラクトバチルスでのマウスの免疫化は、ワクチン株の経鼻もしくは経口送
達の後に、有意なレベルの循環TTFC特異的IgGを誘導した。加えて、経鼻送達後
の排出領域リンパ節における抗原特異的抗体分泌細胞および抗原特異的T細胞活
性化の他に、気管支肺胞洗浄液中にsIgAが誘導されることから、小児用ワクチン
の安全な粘膜送達についての使用可能性が実証される。
【０１０２】
粘膜免疫化の標的部位で生存可能である微生物生ワクチン−ベクターは、粘膜
および全身部位での免疫応答を同時に促進する効率的な送達システムの代表であ
る。現在までの観察は、粘膜免疫応答の誘導について非複製性抗原を上回る弱毒
化病原性ウイルスおよび細菌の優位性を強調している。したがって、ペプチドま
たは精製組換えタンパク質に基づく経口サブユニットワクチン・アプローチは、
本発明の重要な必要条件の1つ、G.I.管それ自体における防護的免疫の誘導にお
いて不十分である可能性がある。経口ワクチン投与は、単回用量免疫の潜在力を
維持し、したがってワクチン投与プログラムにおけるコンプライアンス率の改善
に貢献しながら、安全かつ安価なままである。現在、破傷風に対するワクチン投
与は破傷風毒素（TT）製剤を必要とし、全ての針送達用ワクチンに伴う狭い適用
範囲および混入の問題がそのまま存在する。破傷風毒素フラグメントC（TTFC）
は破傷風ハロトキシンの50kDa非毒性パパイン開裂生成物であり、代替的防護的
免疫原であり、かつ現在開発中の幾つかの生菌−ベクター系で利用されている。
適切な生微生物ベクターによる粘膜表面へのワクチンサブユニットの送達は、非
経口ワクチンが遭遇する障害に対する合理的な応答である。しかしながら、安全
可能性および環境面への考慮、特に開発途上国におけるワクチン受容者の免疫状
態は、大部分の粘膜送達ベクター候補、例えば、大腸菌、サルモネラ菌およびワ
クシニアウイルスの使用を依然として否定する。したがって、非病原性の食品品
質または共生菌ベクターが、それらのワクチンとしての可能性のため、注目を集
め始めている。
および全身部位での免疫応答を同時に促進する効率的な送達システムの代表であ
る。現在までの観察は、粘膜免疫応答の誘導について非複製性抗原を上回る弱毒
化病原性ウイルスおよび細菌の優位性を強調している。したがって、ペプチドま
たは精製組換えタンパク質に基づく経口サブユニットワクチン・アプローチは、
本発明の重要な必要条件の1つ、G.I.管それ自体における防護的免疫の誘導にお
いて不十分である可能性がある。経口ワクチン投与は、単回用量免疫の潜在力を
維持し、したがってワクチン投与プログラムにおけるコンプライアンス率の改善
に貢献しながら、安全かつ安価なままである。現在、破傷風に対するワクチン投
与は破傷風毒素（TT）製剤を必要とし、全ての針送達用ワクチンに伴う狭い適用
範囲および混入の問題がそのまま存在する。破傷風毒素フラグメントC（TTFC）
は破傷風ハロトキシンの50kDa非毒性パパイン開裂生成物であり、代替的防護的
免疫原であり、かつ現在開発中の幾つかの生菌−ベクター系で利用されている。
適切な生微生物ベクターによる粘膜表面へのワクチンサブユニットの送達は、非
経口ワクチンが遭遇する障害に対する合理的な応答である。しかしながら、安全
可能性および環境面への考慮、特に開発途上国におけるワクチン受容者の免疫状
態は、大部分の粘膜送達ベクター候補、例えば、大腸菌、サルモネラ菌およびワ
クシニアウイルスの使用を依然として否定する。したがって、非病原性の食品品
質または共生菌ベクターが、それらのワクチンとしての可能性のため、注目を集
め始めている。
【０１０３】
共生菌は宿主との洗練された非侵襲性生態系を維持しており、免疫系によって
サーベイされるものの、必ずしもそれらの生態学的ニッチからの免疫クリアラン
スを受けやすいとは限らない。気管〜消化管の様々な領域におけるラクトバチル
スの優位性は経口生ワクチンとしてのそれらの特別の潜在能力を示す。それらの
「一般的に安全と認められる（generally recognised as safe）」（GRAS）状態
は食品業界における妥当性から明らかであり、それらの免疫応答を増強する能力
は同時投与された経口用DxRRVアカゲザル−ヒト再編成（reassortent）ロタウイ
ルスワクチンおよびTNP結合抗原で示されており、これは、おそらくは、グラム
陽性ペプチドグリカンおよびリポテイコ酸分画の、マクロファージ活性化特性お
よびIFN-γ誘導特性によるものである。ラクトバチルスが関与する粘膜での免疫
ホメオスタシスは、T細胞サブセットによる物理的排除、IgA分泌および能動的な
調節の組合せである。（可溶性食物性抗原とは対照的な）微粒子形態のTTFCをワ
クチン投与することによる経口送達後の抗原特異的末梢寛容（経口寛容）を回避
し、腸内細菌の免疫調節に通常寄与する機構による加工処理および提示を許容す
る可能性を調べた。このデータは、ラクトバチルス・プランタルム256がラクト
バチルス・カセイ393と比較してより有効であり、細胞内抗原として発現するTTF
Cの送達が、幾つかの状況においては、（試験した条件および使用した検出技術
の下で）細胞表面発現よりも僅かに有用であったことを示す。
サーベイされるものの、必ずしもそれらの生態学的ニッチからの免疫クリアラン
スを受けやすいとは限らない。気管〜消化管の様々な領域におけるラクトバチル
スの優位性は経口生ワクチンとしてのそれらの特別の潜在能力を示す。それらの
「一般的に安全と認められる（generally recognised as safe）」（GRAS）状態
は食品業界における妥当性から明らかであり、それらの免疫応答を増強する能力
は同時投与された経口用DxRRVアカゲザル−ヒト再編成（reassortent）ロタウイ
ルスワクチンおよびTNP結合抗原で示されており、これは、おそらくは、グラム
陽性ペプチドグリカンおよびリポテイコ酸分画の、マクロファージ活性化特性お
よびIFN-γ誘導特性によるものである。ラクトバチルスが関与する粘膜での免疫
ホメオスタシスは、T細胞サブセットによる物理的排除、IgA分泌および能動的な
調節の組合せである。（可溶性食物性抗原とは対照的な）微粒子形態のTTFCをワ
クチン投与することによる経口送達後の抗原特異的末梢寛容（経口寛容）を回避
し、腸内細菌の免疫調節に通常寄与する機構による加工処理および提示を許容す
る可能性を調べた。このデータは、ラクトバチルス・プランタルム256がラクト
バチルス・カセイ393と比較してより有効であり、細胞内抗原として発現するTTF
Cの送達が、幾つかの状況においては、（試験した条件および使用した検出技術
の下で）細胞表面発現よりも僅かに有用であったことを示す。
【０１０４】組換えDNA技術
大腸菌DH5αを従来記載されているpLP401シャトルベクターまたはpLP503シャ
トルベクター（Maassenら, Vaccine 17:2117, 1999）を操作するための宿主株と
して用いた。TTFCをコードする1329bp DNA（A. Mercenier、Lille、フランス）
を、そのXhoIおよびNcoI制限部位を有する3’末端で、PCR技術を用いて伸長し、
pLP401およびpLP503シャトルベクターへのクローン化を容易にした。
トルベクター（Maassenら, Vaccine 17:2117, 1999）を操作するための宿主株と
して用いた。TTFCをコードする1329bp DNA（A. Mercenier、Lille、フランス）
を、そのXhoIおよびNcoI制限部位を有する3’末端で、PCR技術を用いて伸長し、
pLP401およびpLP503シャトルベクターへのクローン化を容易にした。
【０１０５】
エレクトロポレーションによってプラスミドをラクトバチルスに導入する前に
、シャトルベクター中に存在するTldhターミネーター配列をNotI消化によって除
去し、下記表1に示されるpLP401またはpLP503プラスミドを得た。
、シャトルベクター中に存在するTldhターミネーター配列をNotI消化によって除
去し、下記表1に示されるpLP401またはpLP503プラスミドを得た。
【０１０６】
【表１】
略語一覧：p-ldh＝L．カセイのldh遺伝子のプロモーター配列、pα-amy＝L．ア
ミロボルス（L. amylovorus）のα−アミラーゼ遺伝子のプロモーター配列、Ery r ＝エリスロマイシン耐性遺伝子、Ampr＝アンピシリン耐性遺伝子、ssAmy＝L．
カセイのα−アミラーゼ遺伝子の分泌シグナル（36aa）をコードする配列、Anch
or＝L．カセイのアンカーペプチド（117aa）コード配列、TTFC＝破傷風毒素のフ
ラグメントCをコードする1329bp DNA。
ミロボルス（L. amylovorus）のα−アミラーゼ遺伝子のプロモーター配列、Ery r ＝エリスロマイシン耐性遺伝子、Ampr＝アンピシリン耐性遺伝子、ssAmy＝L．
カセイのα−アミラーゼ遺伝子の分泌シグナル（36aa）をコードする配列、Anch
or＝L．カセイのアンカーペプチド（117aa）コード配列、TTFC＝破傷風毒素のフ
ラグメントCをコードする1329bp DNA。
【０１０７】
これらのベクターを再ライゲーションすることで、TTFCタンパク質コーディン
グ配列が、pLP401およびpLP503にそれぞれ存在する調節性アミラーゼ遺伝子（α
−アミラーゼ）の下流に存在する翻訳開始領域または構成性乳酸脱水素酵素（Ld
h）遺伝子プロモーター配列と、コドンの読み枠が合うように並置させた。コン
ピテントラクトバチルスのエレクトロポレーションに続いて、エリスロマイシン
（5μg／ml）寒天プレート上で形質転換体を選択した。一般的な分子クローン化
技術およびラクトバチルスの形質転換を、公知の技術を用いて行った（Maassen
ら、前出）。
グ配列が、pLP401およびpLP503にそれぞれ存在する調節性アミラーゼ遺伝子（α
−アミラーゼ）の下流に存在する翻訳開始領域または構成性乳酸脱水素酵素（Ld
h）遺伝子プロモーター配列と、コドンの読み枠が合うように並置させた。コン
ピテントラクトバチルスのエレクトロポレーションに続いて、エリスロマイシン
（5μg／ml）寒天プレート上で形質転換体を選択した。一般的な分子クローン化
技術およびラクトバチルスの形質転換を、公知の技術を用いて行った（Maassen
ら、前出）。
【０１０８】ラクトバチルス株の選択
形質転換の宿主株として適切なラクトバチルス種を、109個の細胞の広範なパ
ネルのリファンピシン耐性野生型ラクトバチルスを1回胃内投与することでマウ
スに接種した後に得られた糞サンプルを定量培養することによって同定した。12
日間までG.I.管内に生存したL.プランタルム256（P. Conway、シドニー、オース
トラリアまたはAdlerberthら, Appl & Env. Microbiology, Vol.62(7): 2244-22
51, 1996）および72時間以内に検出不能となったL．カセイ（ATCC393）をプロト
タイプ宿主株として選択した。
ネルのリファンピシン耐性野生型ラクトバチルスを1回胃内投与することでマウ
スに接種した後に得られた糞サンプルを定量培養することによって同定した。12
日間までG.I.管内に生存したL.プランタルム256（P. Conway、シドニー、オース
トラリアまたはAdlerberthら, Appl & Env. Microbiology, Vol.62(7): 2244-22
51, 1996）および72時間以内に検出不能となったL．カセイ（ATCC393）をプロト
タイプ宿主株として選択した。
【０１０９】ゲル電気泳動およびウェスタンブロット法
上記表1に詳述されるプラスミドを含む組換えL．カセイおよびL.プランタルム
を、グリセロール・ストックから、5μg／mlエリスロマイシンを含有するMRS培
地の1：50希釈液による半嫌気性一晩（o／n）培養によって通常どおりに調製し
た。
を、グリセロール・ストックから、5μg／mlエリスロマイシンを含有するMRS培
地の1：50希釈液による半嫌気性一晩（o／n）培養によって通常どおりに調製し
た。
【０１１０】
構成性ldhプロモーターを含むプラスミドによる形質転換体は、2％（w／v）グ
ルコースを含有する抗生物質選択性LCM培地において37℃で最適に培養した。調
節可能なα−amyプロモーターを含むプラスミドによる形質転換体は、細胞のo／
n培養物をマンニトール（2％w／v）含有LCM培地で1：50に希釈して培養した。こ
れらの細菌から、細胞をW870 BransonTM超音波処理器を用いて30秒オン／30秒オ
フのサイクルで4回超音波処理し、細胞質または細胞膜結合タンパク質の両者を
放出させることによって全細胞抽出物を得た。
ルコースを含有する抗生物質選択性LCM培地において37℃で最適に培養した。調
節可能なα−amyプロモーターを含むプラスミドによる形質転換体は、細胞のo／
n培養物をマンニトール（2％w／v）含有LCM培地で1：50に希釈して培養した。こ
れらの細菌から、細胞をW870 BransonTM超音波処理器を用いて30秒オン／30秒オ
フのサイクルで4回超音波処理し、細胞質または細胞膜結合タンパク質の両者を
放出させることによって全細胞抽出物を得た。
【０１１１】
30μgの全細胞抽出物または画分中のタンパク質をSDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（PAGE）、（10％アクリルアミド、400mMトリス［pH8.9］）によって
、25mMトリス、192mMグリシンバッファ（pH8.3）中、200Vで45分間かけて分離し
た。タンパク質を、BioradTM電気泳動ユニットを用いてニトロセルロースに電気
泳動で移した。最適に希釈したウサギTTFC特異的抗血清およびヤギ抗ウサギIgG
特異的ホスファターゼ結合体（Nordic、Tilburg、オランダ）を用いて免疫ブロ
ットを行った。
ル電気泳動（PAGE）、（10％アクリルアミド、400mMトリス［pH8.9］）によって
、25mMトリス、192mMグリシンバッファ（pH8.3）中、200Vで45分間かけて分離し
た。タンパク質を、BioradTM電気泳動ユニットを用いてニトロセルロースに電気
泳動で移した。最適に希釈したウサギTTFC特異的抗血清およびヤギ抗ウサギIgG
特異的ホスファターゼ結合体（Nordic、Tilburg、オランダ）を用いて免疫ブロ
ットを行った。
【０１１２】TTFCの細胞表面発現のフローサイトメトリー分析
所定の時点で、FACScanによる分析用に細菌を調製した。細胞を2回洗浄し、PB
S／1％ウシ血清アルブミン（BSA）に再懸濁した。50μlの最適に希釈したウサギ
TTFC特異的抗血清をこれらの細胞に1時間添加した。細胞を再度2回洗浄し、1：1
000の希釈でフルオレセインイソチオシアネート結合（FITC）抗ウサギと30分イ
ンキュベートすることによって結合した抗体を検出した。次に、細胞を2回洗浄
した後、Becton-Dickinsonフローサイトメトリーで光散乱および蛍光を分析した
。ゲートは前方および側方散乱のサイトグラムによって決定される適切な結果サ
イズ程度に設定した。対照は、野生型L．カセイまたはL.プランタルム256を染色
し、非免疫ウサギ血清を用いるかまたはウサギTTFC特異的抗血清を除外して組換
え体を染色することによって調製した。全ての手順は氷上で1％BSAを用いて行っ
た。各々のサンプルについて、10,000〜20,000ゲート化イベントのデータを集め
た。細菌細胞懸濁液から得られる蛍光を蛍光ヒストグラムで表し、平均チャンネ
ル強度を算出した。
S／1％ウシ血清アルブミン（BSA）に再懸濁した。50μlの最適に希釈したウサギ
TTFC特異的抗血清をこれらの細胞に1時間添加した。細胞を再度2回洗浄し、1：1
000の希釈でフルオレセインイソチオシアネート結合（FITC）抗ウサギと30分イ
ンキュベートすることによって結合した抗体を検出した。次に、細胞を2回洗浄
した後、Becton-Dickinsonフローサイトメトリーで光散乱および蛍光を分析した
。ゲートは前方および側方散乱のサイトグラムによって決定される適切な結果サ
イズ程度に設定した。対照は、野生型L．カセイまたはL.プランタルム256を染色
し、非免疫ウサギ血清を用いるかまたはウサギTTFC特異的抗血清を除外して組換
え体を染色することによって調製した。全ての手順は氷上で1％BSAを用いて行っ
た。各々のサンプルについて、10,000〜20,000ゲート化イベントのデータを集め
た。細菌細胞懸濁液から得られる蛍光を蛍光ヒストグラムで表し、平均チャンネ
ル強度を算出した。
【０１１３】免疫化
6〜8週齢のBALB／cまたはC57BL／6マウスを、TTFCを発現する組換えL．カセイ
またはL.プランタルムの調製物で胃内（o）または鼻腔内（i.n.）で免疫した。o
／n培養物から得られた細菌を、1％グルコースを含有するMRSまたはLCM培地で1
：50に希釈し、OD695nmが0.6−0.8（対数期中期）に到達するまで37℃で6時間増
殖させた。4℃で遠心することにより細胞をペレット化し、PBSで1回洗浄して無
菌PBS中に適切な濃度の細菌を調製した。
またはL.プランタルムの調製物で胃内（o）または鼻腔内（i.n.）で免疫した。o
／n培養物から得られた細菌を、1％グルコースを含有するMRSまたはLCM培地で1
：50に希釈し、OD695nmが0.6−0.8（対数期中期）に到達するまで37℃で6時間増
殖させた。4℃で遠心することにより細胞をペレット化し、PBSで1回洗浄して無
菌PBS中に適切な濃度の細菌を調製した。
【０１１４】
経口免疫化については、2〜5×109細胞を容量250μlの0.2M NaHCO3に含めて、
連続三日間、胃内に投与した。鼻腔内免疫化については、2〜5×109細胞を容量2
0μlのPBSに含めて非麻酔マウスの鼻腔に投与した。対照マウスには同一用量の
野生型ラクトバチルスを投与した。全ての種菌サンプルについてプレートカウン
トを行い、マウスに投与されたCFU量を確認した。
連続三日間、胃内に投与した。鼻腔内免疫化については、2〜5×109細胞を容量2
0μlのPBSに含めて非麻酔マウスの鼻腔に投与した。対照マウスには同一用量の
野生型ラクトバチルスを投与した。全ての種菌サンプルについてプレートカウン
トを行い、マウスに投与されたCFU量を確認した。
【０１１５】サンプル回収およびELISA
免疫前マウスから得た、および続いて免疫後21日に開始して7日間隔で尾の静
脈から得た血液サンプルから、血清を調製した。
脈から得た血液サンプルから、血清を調製した。
【０１１６】
気管支肺胞洗浄液を得るため、指定された時点でマウスを屠殺し、肺にカニュ
ーレを挿入して0.7mlのPBS／0.1％BSAで繰り返し膨張させた後、集めた洗浄液を
1000gで遠心して上清を−80℃で保存した。
ーレを挿入して0.7mlのPBS／0.1％BSAで繰り返し膨張させた後、集めた洗浄液を
1000gで遠心して上清を−80℃で保存した。
【０１１７】
抗原特異的免疫グロブリンG（IgG）濃度を、TT（RIVM、Bilthoven、オランダ
）の0.16μg／ml溶液50μlでo／nコートしたマイクロタイタープレートを用いて
評価した。個々の血清サンプルを連続log2希釈によって力価測定し、二回アッセ
イした。50μlの最適に希釈したヤギ抗マウスIgG−ホスファターゼ結合体（Nord
ic、Tilburg、オランダ）を添加することにより結合した抗体を検出した。PNPP
（0.1M DEA／MgCl2中に1mg／ml）色原体基質を添加した後、反応の開始後30〜90
分に得られるプレートA450nm値を測定することにより、抗体濃度を定量した。免
疫前マウスから得られる血清の1：10希釈物の平均吸光度（OD 0.2）から決定さ
れるカットオフを用いて終点力価を算出した。気管支肺胞洗浄液中の抗原特異的
免疫グロブリンA（IgA）濃度については、最適に希釈されたヤギ抗マウスIgAホ
スファターゼ結合体（Nordic）を用いて同じ手順を行った。
）の0.16μg／ml溶液50μlでo／nコートしたマイクロタイタープレートを用いて
評価した。個々の血清サンプルを連続log2希釈によって力価測定し、二回アッセ
イした。50μlの最適に希釈したヤギ抗マウスIgG−ホスファターゼ結合体（Nord
ic、Tilburg、オランダ）を添加することにより結合した抗体を検出した。PNPP
（0.1M DEA／MgCl2中に1mg／ml）色原体基質を添加した後、反応の開始後30〜90
分に得られるプレートA450nm値を測定することにより、抗体濃度を定量した。免
疫前マウスから得られる血清の1：10希釈物の平均吸光度（OD 0.2）から決定さ
れるカットオフを用いて終点力価を算出した。気管支肺胞洗浄液中の抗原特異的
免疫グロブリンA（IgA）濃度については、最適に希釈されたヤギ抗マウスIgAホ
スファターゼ結合体（Nordic）を用いて同じ手順を行った。
【０１１８】抗原特異的Tリンパ球増殖アッセイおよびELISPOT
最終免疫化の12および21日後、マウスの脾臓および頸部リンパ節（CLN）を無
菌的に取り出した。細胞濾過器（70μMナイロン；B&D）を通過させることによっ
て単一細胞懸濁液を調製し、1500rmpで10分間遠心した。Trypanブルー色素排除
によって生存可能な非分画細胞数を決定した。
菌的に取り出した。細胞濾過器（70μMナイロン；B&D）を通過させることによっ
て単一細胞懸濁液を調製し、1500rmpで10分間遠心した。Trypanブルー色素排除
によって生存可能な非分画細胞数を決定した。
【０１１９】
抗原特異的Tリンパ球の増殖を試験するため、細胞を再懸濁させ、最終容量200
μlの培養培地（RPMI−1640；10％熱不活化ウシ胎児血清、2mM L−グルタミン、
20U／mlペニシリンおよび20μg／mlストレプトマイシン（全てGibco、Pairsley
、UK）、ならびに50μM 2−メルカプトエタノール｛Sigma、MO｝を補充）中に3
×105細胞／脾臓または5×105細胞／LNの濃度で、無菌平底96ウェル培養プレー
ト（Nunc、デンマーク）にプレーティングした。対照ウェルには培地のみを入れ
、所定の用量範囲の３つ分の培養物に抗原を添加した。全ての細胞は加湿5％CO2 雰囲気中に37℃で4日間維持した。これらの細胞を、最後の16〜18時間に培養ウ
ェルあたり容量30μl中、0.6μCi［3H］チミジン（3H−TdR、5Ci／mMol、TRA 12
0、Amersham、UK）でパルス標識した後、回収した。ILACON細胞ハーベスターを
用いて細胞を集め、ガラス繊維フィルター・ディスク（Whatman）上にのせた。
ガス・シンチレーション分光測定（β−プレート・カウンター、Canberra Packa
rd、Meriden、CT）によってチミジンの取り込みを評価し、3つ分の培養物から結
果を平均c.p.m（±SD）として算出して刺激指数（SI）として表した。
μlの培養培地（RPMI−1640；10％熱不活化ウシ胎児血清、2mM L−グルタミン、
20U／mlペニシリンおよび20μg／mlストレプトマイシン（全てGibco、Pairsley
、UK）、ならびに50μM 2−メルカプトエタノール｛Sigma、MO｝を補充）中に3
×105細胞／脾臓または5×105細胞／LNの濃度で、無菌平底96ウェル培養プレー
ト（Nunc、デンマーク）にプレーティングした。対照ウェルには培地のみを入れ
、所定の用量範囲の３つ分の培養物に抗原を添加した。全ての細胞は加湿5％CO2 雰囲気中に37℃で4日間維持した。これらの細胞を、最後の16〜18時間に培養ウ
ェルあたり容量30μl中、0.6μCi［3H］チミジン（3H−TdR、5Ci／mMol、TRA 12
0、Amersham、UK）でパルス標識した後、回収した。ILACON細胞ハーベスターを
用いて細胞を集め、ガラス繊維フィルター・ディスク（Whatman）上にのせた。
ガス・シンチレーション分光測定（β−プレート・カウンター、Canberra Packa
rd、Meriden、CT）によってチミジンの取り込みを評価し、3つ分の培養物から結
果を平均c.p.m（±SD）として算出して刺激指数（SI）として表した。
【０１２０】
脾臓およびCLN内のTT特異的抗体分泌細胞（ASC）数の定量をCzerkinskyら, J.
Immunol. Methods 65: 109 (1983)に従って行った。マイクロタイタープレート
（Maxisorpプレート、Nunc、デンマーク）をTT（RIVM、Bilthoven、オランダ）
の0.16μg／ml溶液50μlまたは対照としてのPBS 50μlでo／nコートした。徹底
的に洗浄し、PBS／0.1％BSAでプレートをブロックした後、細胞を1×106および2
×105細胞／脾臓または5×105および1×105細胞／LNの濃度で最終容量50μlの培
養培地に添加し、加湿5％CO2雰囲気中、37℃で4時間インキュベートした。これ
らのプレートをすすぎ、10mM EDTAを含む氷冷PBSと共に20分間インキュベートし
て細胞を除去し、PBS／0.05％Tween-20およびPBS／0.5％BSAで再度洗浄した。最
適に希釈したウサギ抗マウスIgホスファターゼ結合体（DAKO、デンマーク）50μ
lをo／n、4℃で添加することによって結合した抗体を検出した。プレートを徹底
的に洗浄し、1％低融点アガロースを含有するAMPバッファ中の1mg／ml BCIPと共
にインキュベートした。これらのプレートを光源上に伏せて、肉眼で青色ドット
を評点した。
Immunol. Methods 65: 109 (1983)に従って行った。マイクロタイタープレート
（Maxisorpプレート、Nunc、デンマーク）をTT（RIVM、Bilthoven、オランダ）
の0.16μg／ml溶液50μlまたは対照としてのPBS 50μlでo／nコートした。徹底
的に洗浄し、PBS／0.1％BSAでプレートをブロックした後、細胞を1×106および2
×105細胞／脾臓または5×105および1×105細胞／LNの濃度で最終容量50μlの培
養培地に添加し、加湿5％CO2雰囲気中、37℃で4時間インキュベートした。これ
らのプレートをすすぎ、10mM EDTAを含む氷冷PBSと共に20分間インキュベートし
て細胞を除去し、PBS／0.05％Tween-20およびPBS／0.5％BSAで再度洗浄した。最
適に希釈したウサギ抗マウスIgホスファターゼ結合体（DAKO、デンマーク）50μ
lをo／n、4℃で添加することによって結合した抗体を検出した。プレートを徹底
的に洗浄し、1％低融点アガロースを含有するAMPバッファ中の1mg／ml BCIPと共
にインキュベートした。これらのプレートを光源上に伏せて、肉眼で青色ドット
を評点した。
【０１２１】ラクトバチルスにおける組換えTTFCの発現
対数期中期にある細胞を回収した後、超音波処理して細菌を破壊することによ
り、L.プランタルムおよびL. カセイ形質転換体による細胞質または細胞壁結合T
TFCの発現が示された。SDS-PAGEおよびTTFC特異的ウサギ抗血清を用いて行った
免疫ブロットによりタンパク質を分離した。
り、L.プランタルムおよびL. カセイ形質転換体による細胞質または細胞壁結合T
TFCの発現が示された。SDS-PAGEおよびTTFC特異的ウサギ抗血清を用いて行った
免疫ブロットによりタンパク質を分離した。
【０１２２】
具体的には、pLP401-TTFC形質転換体（表面結合性発現）をLCM(+2%マンニトー
ル)中で、pLP503-TTFC形質転換体（細胞内発現）をMRS(Difco)中で、37℃でOD 0
.6まで増殖させて（どちらの培地にも5μg/mlのエリスロマイシンを補充する）
、ペレットにして超音波処理により破壊した。30μgの全タンパク質を10% SDS/
ポリアクリルアミドゲルで分析し、分離されたタンパク質を電気泳動によりニト
ロセルロースに移した。TTFCをウサギ抗TTFC(1:500)およびホスファターゼ/PNPP
色原体の組み合わせにより可視化した。線は分子量マーカーの移動度を示す。
ル)中で、pLP503-TTFC形質転換体（細胞内発現）をMRS(Difco)中で、37℃でOD 0
.6まで増殖させて（どちらの培地にも5μg/mlのエリスロマイシンを補充する）
、ペレットにして超音波処理により破壊した。30μgの全タンパク質を10% SDS/
ポリアクリルアミドゲルで分析し、分離されたタンパク質を電気泳動によりニト
ロセルロースに移した。TTFCをウサギ抗TTFC(1:500)およびホスファターゼ/PNPP
色原体の組み合わせにより可視化した。線は分子量マーカーの移動度を示す。
【０１２３】
表面結合産物としてTTFCを発現する組換えL.プランタルム pLP401-TTFCおよび
L. カセイ pLP401-TTFCについて免疫蛍光分析をおこなった。ラクトバチルスを
前方および側方散乱に基づいてゲート化し、1:500に希釈したウサギTTFC特異的
抗血清（Calbiochem, Ca)で染色した。結合した抗体を最適に希釈したFITC結合
抗ウサギIgG(Jackson, PA)により検出した。OD 0.6の時点で回収された細胞の蛍
光レベルをFACScan(Becton Dickinson)により分析し、非組換えラクトバチルス
により得られた蛍光レベルとの関係により示されるヒストグラムの形で示した。
それぞれの実験において10,000細胞を分析した。
L. カセイ pLP401-TTFCについて免疫蛍光分析をおこなった。ラクトバチルスを
前方および側方散乱に基づいてゲート化し、1:500に希釈したウサギTTFC特異的
抗血清（Calbiochem, Ca)で染色した。結合した抗体を最適に希釈したFITC結合
抗ウサギIgG(Jackson, PA)により検出した。OD 0.6の時点で回収された細胞の蛍
光レベルをFACScan(Becton Dickinson)により分析し、非組換えラクトバチルス
により得られた蛍光レベルとの関係により示されるヒストグラムの形で示した。
それぞれの実験において10,000細胞を分析した。
【０１２４】
タンパク質発現の写真およびMackintoshで生成したFACスキャンから、pLP503-
TTFCを含むラクトバチルスは細胞内50kDa TTFCポリペプチドのみを発現すること
が示された。ベクターpLP401-TTFCを含むL.プランタルムは、25kDaのアンカー配
列に融合した50kDa TTFCに相当する表面結合性75kDaポリペプチドを、L. カセイ
pLP401-TTFCよりも高いレベルで発現する。アンカー配列への融合によるL.プラ
ンタルムおよびL. カセイの細胞壁へのTTFCの露出は、FACスキャンにより確認さ
れた。
TTFCを含むラクトバチルスは細胞内50kDa TTFCポリペプチドのみを発現すること
が示された。ベクターpLP401-TTFCを含むL.プランタルムは、25kDaのアンカー配
列に融合した50kDa TTFCに相当する表面結合性75kDaポリペプチドを、L. カセイ
pLP401-TTFCよりも高いレベルで発現する。アンカー配列への融合によるL.プラ
ンタルムおよびL. カセイの細胞壁へのTTFCの露出は、FACスキャンにより確認さ
れた。
【０１２５】組換えラクトバチルスの鼻腔内免疫化後のTTFC特異的抗体応答
マウスから、免疫前および第７日から始めて７日ごとに血清を採集した。個々
のまたは集められた血清におけるTTFC特異的血清IgGを、PBS中の0.16μg/mlの破
傷風毒素により4℃でo/nコートしたマイクロタイタープレートを用いたELISAに
より測定した。結合した抗体は、抗マウスAPコンジュゲートおよびPNPP基質を加
えることにより検出した。90分後にそれぞれのウェルのOD405nm値を測定した。
終点力価を、1:10に希釈した免疫前血清の平均OD+2SD(約0.2)として計算された
カットオフ値を用いて決定した。表２に下記の３つのプロトコールの結果を示す
。
のまたは集められた血清におけるTTFC特異的血清IgGを、PBS中の0.16μg/mlの破
傷風毒素により4℃でo/nコートしたマイクロタイタープレートを用いたELISAに
より測定した。結合した抗体は、抗マウスAPコンジュゲートおよびPNPP基質を加
えることにより検出した。90分後にそれぞれのウェルのOD405nm値を測定した。
終点力価を、1:10に希釈した免疫前血清の平均OD+2SD(約0.2)として計算された
カットオフ値を用いて決定した。表２に下記の３つのプロトコールの結果を示す
。
【０１２６】
A. 3匹のBALB/cマウスを、3用量の5×109のL.プランタルム pLP503-TTFCま
たは3用量の5×109の L. カセイ pLP503-TTFCの20μl PBS溶液により第1〜3日に
鼻腔内免疫化した。第28〜30日に同様の追加免疫を投与した。
たは3用量の5×109の L. カセイ pLP503-TTFCの20μl PBS溶液により第1〜3日に
鼻腔内免疫化した。第28〜30日に同様の追加免疫を投与した。
【０１２７】
B. 16匹のC57BL/6マウスを、３用量の5×109のL.プランタルム pLP503-TTFC
の20μl PBS溶液により鼻腔内で、または200μl NaHCO3溶液により経口で第1〜3
日に免疫化した。第28〜30日に同様の追加免疫を投与した。
の20μl PBS溶液により鼻腔内で、または200μl NaHCO3溶液により経口で第1〜3
日に免疫化した。第28〜30日に同様の追加免疫を投与した。
【０１２８】
C. ３匹のC57BL/6マウスを、第１日および第28日に5×109のL.プランタルム
pLP503-TTFCの20μl PBS溶液により鼻腔内で免疫化した。または、第1〜3日に3
用量のL.プランタルム pLP401-TTFCを20μl PBS溶液により鼻腔内で免疫化した
後、第28〜30日に5×109のL.プランタルム pLP503-TTFC、または第28〜30日およ
び第49〜51日にL.プランタルム pLP401-TTFCのいずれかの20μl PBS溶液により
鼻腔内で追加免疫をおこなった。
pLP503-TTFCの20μl PBS溶液により鼻腔内で免疫化した。または、第1〜3日に3
用量のL.プランタルム pLP401-TTFCを20μl PBS溶液により鼻腔内で免疫化した
後、第28〜30日に5×109のL.プランタルム pLP503-TTFC、または第28〜30日およ
び第49〜51日にL.プランタルム pLP401-TTFCのいずれかの20μl PBS溶液により
鼻腔内で追加免疫をおこなった。
【０１２９】
細胞内TTFCを発現する L.プランタルムまたはL. カセイの３回の鼻腔内投与を
第1〜3日に受けたBALB/cおよびC57BL/6マウスは、第28〜30日の追加免疫として
の鼻腔内投与の後にTTFCに対する二次応答に対して強く感作した。組換えL.プラ
ンタルムによる免疫化後のBALB/cマウスにおけるTTFC特異的応答の力価は、組換
えL. カセイよりも高く（表2A）、第28日という速さでIgGを検出することができ
、第49日にはそれぞれの力価がそれぞれ103.5および102.9に上昇した。
第1〜3日に受けたBALB/cおよびC57BL/6マウスは、第28〜30日の追加免疫として
の鼻腔内投与の後にTTFCに対する二次応答に対して強く感作した。組換えL.プラ
ンタルムによる免疫化後のBALB/cマウスにおけるTTFC特異的応答の力価は、組換
えL. カセイよりも高く（表2A）、第28日という速さでIgGを検出することができ
、第49日にはそれぞれの力価がそれぞれ103.5および102.9に上昇した。
【０１３０】
【表２】
C57BL/6マウスは、BALB/cマウスよりも高い平均終点力価を（有意ではないが
）を示したので（表2B）、細胞内でTTFCを発現するL.プランタルム形質転換体に
よる単回投与初回免疫および追加免疫スケジュールを用いる鼻腔内免疫化による
さらなる分析にこのマウスを選択した（表2C）。
）を示したので（表2B）、細胞内でTTFCを発現するL.プランタルム形質転換体に
よる単回投与初回免疫および追加免疫スケジュールを用いる鼻腔内免疫化による
さらなる分析にこのマウスを選択した（表2C）。
【０１３１】
BALB/cマウスにより得られた表2Aの結果と比較すると、血清IgGのより高い平
均タイター(104.2)が、第49日までにC57BL/6に誘導された。しかしながら、３回
または１回投与量感作および追加免疫のいずれの免疫化スケジュールを用いたか
に関わらず、C57BL/6マウスは、大きくは異ならない血清IgG終点タイターの追加
免疫を示した。
均タイター(104.2)が、第49日までにC57BL/6に誘導された。しかしながら、３回
または１回投与量感作および追加免疫のいずれの免疫化スケジュールを用いたか
に関わらず、C57BL/6マウスは、大きくは異ならない血清IgG終点タイターの追加
免疫を示した。
【０１３２】
対照的に、細胞表面にTTFCを発現するL. プランタルムによって鼻腔内免疫化
されたC57BL/6マウスにおいてTTFC特異的血清IgGを誘導するために、マウスを第
1〜3日に感作した後、抗原特異的応答が測定可能になる前に少なくとも２回（第
28〜30日および第49〜51日）追加免疫をおこなう必要がある（表2C）。しかしな
がら、興味深いことに、L. プランタルム pLP401-TTFCにより上記のように感作
されたマウスは、それに代えてL. プランタルム pLP503-TTFC形質転換体を用い
て第28〜30日に追加免疫をおこなうと、確かにTTFC特異的血清IgG（未経験のマ
ウスから得られた応答よりも速い反応速度を有する）を誘導した（表2C）。この
観察は、非常に興味深いことに、免疫応答の成熟または測定可能性は多くの理由
で起こることを妨げられているが、pLP401-TTFCを形質転換されたL. プランタル
ムの投与後にマウスの抗原特異的感作が実際に起こっていることを意味する。し
かしながら、対照的に、細胞表面にTTFCを発現するL. カセイは、BALB/cまたはC
57BL/6のいずれの株においても、L. プランタルム形質転換体それ自体を第1、28
および56日に１回投与量で投与した場合に見られるような感作効果を示さなかっ
た。
されたC57BL/6マウスにおいてTTFC特異的血清IgGを誘導するために、マウスを第
1〜3日に感作した後、抗原特異的応答が測定可能になる前に少なくとも２回（第
28〜30日および第49〜51日）追加免疫をおこなう必要がある（表2C）。しかしな
がら、興味深いことに、L. プランタルム pLP401-TTFCにより上記のように感作
されたマウスは、それに代えてL. プランタルム pLP503-TTFC形質転換体を用い
て第28〜30日に追加免疫をおこなうと、確かにTTFC特異的血清IgG（未経験のマ
ウスから得られた応答よりも速い反応速度を有する）を誘導した（表2C）。この
観察は、非常に興味深いことに、免疫応答の成熟または測定可能性は多くの理由
で起こることを妨げられているが、pLP401-TTFCを形質転換されたL. プランタル
ムの投与後にマウスの抗原特異的感作が実際に起こっていることを意味する。し
かしながら、対照的に、細胞表面にTTFCを発現するL. カセイは、BALB/cまたはC
57BL/6のいずれの株においても、L. プランタルム形質転換体それ自体を第1、28
および56日に１回投与量で投与した場合に見られるような感作効果を示さなかっ
た。
【０１３３】
L. プランタルム-pLP503-TTFCによるマウスの鼻腔内免疫化後の気管支肺胞洗
浄液を用いて、破傷風毒素特異的IgA抗体の誘導を研究した。C57BL/6マウスを、
第1〜3日に鼻腔内（AおよびB）または経口（CまたはD）のいずれかで、5×106 L
. プランタルム pLP503-TTFCにより免疫化した後、第28〜30日に同一の追加免疫
をおこなった。最後の追加免疫の12日後（AおよびC）および21日後（BおよびD）
に、群あたり４匹の動物を殺して、0.7mlのPBS/0.1%BSAをカニューレを通して肺
に流すことにより気管支肺胞洗浄液を得た。これらのサンプル中のTT特異的IgA
を、PBS中の0.16μg/mlの破傷風毒素により4℃でo/nコートしたマイクロタイタ
ープレートを用いたELISAにより測定した。結合した抗体は、抗マウスAPコンジ
ュゲートおよびPNPP基質を加えることにより検出した。それぞれのウェルのOD40 5nm 値を、４℃のo/nの後に測定した。
浄液を用いて、破傷風毒素特異的IgA抗体の誘導を研究した。C57BL/6マウスを、
第1〜3日に鼻腔内（AおよびB）または経口（CまたはD）のいずれかで、5×106 L
. プランタルム pLP503-TTFCにより免疫化した後、第28〜30日に同一の追加免疫
をおこなった。最後の追加免疫の12日後（AおよびC）および21日後（BおよびD）
に、群あたり４匹の動物を殺して、0.7mlのPBS/0.1%BSAをカニューレを通して肺
に流すことにより気管支肺胞洗浄液を得た。これらのサンプル中のTT特異的IgA
を、PBS中の0.16μg/mlの破傷風毒素により4℃でo/nコートしたマイクロタイタ
ープレートを用いたELISAにより測定した。結合した抗体は、抗マウスAPコンジ
ュゲートおよびPNPP基質を加えることにより検出した。それぞれのウェルのOD40 5nm 値を、４℃のo/nの後に測定した。
【０１３４】
表3Aおよび3Bに示すように、第1〜3日にTTFCを発現するL. プランタルムを３
用量投与されているC57BL/6マウスは、第28~30日に追加免疫を鼻腔内投与された
後、12日目および21日目に測定された気管支肺胞洗浄液中において、TT特異的Ig
A応答に対して粘膜を感作された。野生型のL. プランタルム 256により鼻腔内免
疫化されたマウスから得た気管支肺胞洗浄液は、それぞれ12日目または21日目の
いずれにも、マイクロタイタープレート上にコートしたTTに対する反応性を示さ
なかった。
用量投与されているC57BL/6マウスは、第28~30日に追加免疫を鼻腔内投与された
後、12日目および21日目に測定された気管支肺胞洗浄液中において、TT特異的Ig
A応答に対して粘膜を感作された。野生型のL. プランタルム 256により鼻腔内免
疫化されたマウスから得た気管支肺胞洗浄液は、それぞれ12日目または21日目の
いずれにも、マイクロタイタープレート上にコートしたTTに対する反応性を示さ
なかった。
【０１３５】
【表３】
組換えラクトバチルスによる経口免疫化後のTTFC特異的抗体応答
鼻腔内免疫化と経口免疫化の比較研究において、C57BL/6マウスに、第1〜3日
に、細胞内TTFCを発現するL. プランタルムを３用量投与した後、第28〜30日に
追加免疫投与をおこなった。経口免疫化の後、試験した16匹のマウスのうち９匹
にTTFC特異的血清IgG応答が誘導された（表2B）。鼻腔内免疫化の後、16匹のマ
ウス全てが、追加免疫後７日以内に、104.3の平均タイターを有する高いTTFC特
異的終点タイターで応答し、３週間高いレベルを維持した。経口投与に応答した
マウスの平均終点タイターは７日後で101.6であり、追加免疫の14日後に最大値
の102.4に達した。鼻腔内群とは対照的に、経口免疫化されたマウスでは、それ
ぞれ12日後または21日後のいずれにおいても、気管支肺胞洗浄液中でTT特異的Ig
A応答が測定されなかった（表3CおよびD）。
に、細胞内TTFCを発現するL. プランタルムを３用量投与した後、第28〜30日に
追加免疫投与をおこなった。経口免疫化の後、試験した16匹のマウスのうち９匹
にTTFC特異的血清IgG応答が誘導された（表2B）。鼻腔内免疫化の後、16匹のマ
ウス全てが、追加免疫後７日以内に、104.3の平均タイターを有する高いTTFC特
異的終点タイターで応答し、３週間高いレベルを維持した。経口投与に応答した
マウスの平均終点タイターは７日後で101.6であり、追加免疫の14日後に最大値
の102.4に達した。鼻腔内群とは対照的に、経口免疫化されたマウスでは、それ
ぞれ12日後または21日後のいずれにおいても、気管支肺胞洗浄液中でTT特異的Ig
A応答が測定されなかった（表3CおよびD）。
【０１３６】
付加的な研究において、第１、2および３日にマウスに経口感作し、２、３ま
たは４週間後のいずれかに追加免疫をおこなった。追加免疫の時期に関わらず、
TTFC特異的IgG応答は追加接種後７日以内に観察された。
たは４週間後のいずれかに追加免疫をおこなった。追加免疫の時期に関わらず、
TTFC特異的IgG応答は追加接種後７日以内に観察された。
【０１３７】
対照的に、L. カセイ形質転換体（細胞内または表面結合のいずれかのTTFCを
発現する）または細胞表面にTTFCを発現するL. プランタルムにより経口免疫化
されたBALB/cまたはC57BL/6マウスは、試験した全ての等しい時点で検出可能なT
TFC特異的血清IgG応答を誘導しなかった。野生型のラクトバチルスまたは不適切
なベクターを与えたマウスは全ての時点でTTFC特異的血清IgG応答を示さなかっ
た（データは示していない）。
発現する）または細胞表面にTTFCを発現するL. プランタルムにより経口免疫化
されたBALB/cまたはC57BL/6マウスは、試験した全ての等しい時点で検出可能なT
TFC特異的血清IgG応答を誘導しなかった。野生型のラクトバチルスまたは不適切
なベクターを与えたマウスは全ての時点でTTFC特異的血清IgG応答を示さなかっ
た（データは示していない）。
【０１３８】TT特異的抗体分泌細胞、および脾臓およびCLNにおけるT細胞応答
C57BL/6マウスを、第1〜3日に、 5×109 L. プランタルム pLP503-TTFC形質転
換体または対照として野生型のL. プランタルム 256のいずれかにより経口また
は鼻腔内のいずれかで免疫化した。この後、第28〜30日に同一の追加免疫をおこ
なった。最後の追加免疫の12日後または21日後にマウスを殺して脾臓およびCLN
細胞懸濁液を調製した。
換体または対照として野生型のL. プランタルム 256のいずれかにより経口また
は鼻腔内のいずれかで免疫化した。この後、第28〜30日に同一の追加免疫をおこ
なった。最後の追加免疫の12日後または21日後にマウスを殺して脾臓およびCLN
細胞懸濁液を調製した。
【０１３９】
【表４】
注：＊群あたり16匹のC57BL/6マウスを、第1〜3日に5×109 L. プランタルム
（L. プランタルム 256またはL. プランタルム pLP503-TTFC形質転換体のいずれ
か）により鼻腔内(i.n.)または経口免疫化した後、第28〜30日に同一の追加免疫
をおこなった。最後の追加免疫の12日後または21日後に、群あたり８匹の動物を
殺して脾臓および頚リンパ節（CLN；２匹ずつ集める）の細胞懸濁液を調製した
。TT特異的Ig生産細胞の数をELISPOTにより決定した。
（L. プランタルム 256またはL. プランタルム pLP503-TTFC形質転換体のいずれ
か）により鼻腔内(i.n.)または経口免疫化した後、第28〜30日に同一の追加免疫
をおこなった。最後の追加免疫の12日後または21日後に、群あたり８匹の動物を
殺して脾臓および頚リンパ節（CLN；２匹ずつ集める）の細胞懸濁液を調製した
。TT特異的Ig生産細胞の数をELISPOTにより決定した。
【０１４０】
＃このデータは、106細胞あたりの抗体分泌細胞(ASC)として表され、３倍のウ
ェル内で測定された８個の脾臓サンプルまたは４個のCLNサンプルの平均（範囲
）を表す。
ェル内で測定された８個の脾臓サンプルまたは４個のCLNサンプルの平均（範囲
）を表す。
【０１４１】
表４には、ELISPOTにより測定された、脾臓またはCLNに存在するTT特異的抗体
分泌細胞(ASC)の数を示す。L. プランタルム形質転換体による鼻腔内免疫化の後
、最後の追加免疫の12日後に多数のTT特異的ASCが鼻腔内免疫化したマウスの脾
臓およびCLNに見いだされ、これらの数は第21日までに減少した。これらのデー
タは、マウスの抗原特異的感作がCLNレベルで局所的に、および脾臓において全
身的に起こったことを示唆している。経口免疫化された群においては、試験した
８個の脾臓細胞懸濁液のうち２つがTT特異的ASCを含んでいたのに対して、CLNに
おいてはASCは見いだされなかった。
分泌細胞(ASC)の数を示す。L. プランタルム形質転換体による鼻腔内免疫化の後
、最後の追加免疫の12日後に多数のTT特異的ASCが鼻腔内免疫化したマウスの脾
臓およびCLNに見いだされ、これらの数は第21日までに減少した。これらのデー
タは、マウスの抗原特異的感作がCLNレベルで局所的に、および脾臓において全
身的に起こったことを示唆している。経口免疫化された群においては、試験した
８個の脾臓細胞懸濁液のうち２つがTT特異的ASCを含んでいたのに対して、CLNに
おいてはASCは見いだされなかった。
【０１４２】
マウスの鼻腔内免疫化による抗原特異的T-細胞の誘導について、L. プランタ
ルム-pLP503-TTFCを用いて研究した。C57BL/6マウスを、第1〜3日に5×109 L.
プランタルム（L. プランタルム 256またはL. プランタルム pLP503-TTFC形質転
換体のいずれか）により鼻腔内(i.n.)または経口免疫化した後、第28〜30日に同
一の追加免疫をおこなった。最後の追加免疫の12日後(AおよびC)または21日後(B
およびD)に、群あたり８匹の動物を殺して脾臓(AおよびB)およびCLN（２匹ずつ
集める）(CおよびD)の細胞懸濁液を調製した。ウェルあたり3×105の脾臓細胞ま
たは5×105のCLN細胞を、TTFC、TT、TTペプチドP30または培地のみを加えてin v
itroで72時間インキュベーションした後に、[3H]チミジンの取り込みについて細
胞を試験した。[3H]チミジンを最後の18時間に培養液に加えた。結果を、細胞の
３回の試験培養物の平均cpmを、緩衝液のみを与えた培養物の平均cpmで割って計
算したSIとして表す。緩衝液のみを与えた培養物のバックグラウンド値は、A220
〜760cpm、B150〜240cpm、C1000〜4000cpmおよびD150〜560cpmの範囲で変化した
。
ルム-pLP503-TTFCを用いて研究した。C57BL/6マウスを、第1〜3日に5×109 L.
プランタルム（L. プランタルム 256またはL. プランタルム pLP503-TTFC形質転
換体のいずれか）により鼻腔内(i.n.)または経口免疫化した後、第28〜30日に同
一の追加免疫をおこなった。最後の追加免疫の12日後(AおよびC)または21日後(B
およびD)に、群あたり８匹の動物を殺して脾臓(AおよびB)およびCLN（２匹ずつ
集める）(CおよびD)の細胞懸濁液を調製した。ウェルあたり3×105の脾臓細胞ま
たは5×105のCLN細胞を、TTFC、TT、TTペプチドP30または培地のみを加えてin v
itroで72時間インキュベーションした後に、[3H]チミジンの取り込みについて細
胞を試験した。[3H]チミジンを最後の18時間に培養液に加えた。結果を、細胞の
３回の試験培養物の平均cpmを、緩衝液のみを与えた培養物の平均cpmで割って計
算したSIとして表す。緩衝液のみを与えた培養物のバックグラウンド値は、A220
〜760cpm、B150〜240cpm、C1000〜4000cpmおよびD150〜560cpmの範囲で変化した
。
【０１４３】
図１に脾臓またはCLNの抗原特異的T-細胞の応答を示す。L. プランタルム pLP
503-TTFC形質転換体により鼻腔内免疫化されたマウスにおいて、TTFC、TTまたは
TTペプチドP30のいずれかによる再刺激後に増殖が測定可能となり、これは、鼻
腔内免疫化はまず局所的リンパ節の活性化により特異的免疫を誘導したことを示
唆している。脾臓およびCLNの抗原特異的T細胞の応答はまたBALB/cマウスにおい
ても獲得された。野生型のL. プランタルムにより経口または同一の経路で免疫
化されたマウスから得られた細胞中には抗原特異的増殖は観察されなかった（図
１）。
503-TTFC形質転換体により鼻腔内免疫化されたマウスにおいて、TTFC、TTまたは
TTペプチドP30のいずれかによる再刺激後に増殖が測定可能となり、これは、鼻
腔内免疫化はまず局所的リンパ節の活性化により特異的免疫を誘導したことを示
唆している。脾臓およびCLNの抗原特異的T細胞の応答はまたBALB/cマウスにおい
ても獲得された。野生型のL. プランタルムにより経口または同一の経路で免疫
化されたマウスから得られた細胞中には抗原特異的増殖は観察されなかった（図
１）。
【０１４４】
pLP401-/503-プラスミドは、ラクトバチルスにおいて以前には得られなかった
レベルおよび効率での、TTFCの指向性（表面または細胞内）の発現および調節可
能な発現を可能にした。さらに、細胞内にTTFCを発現するL. プランタルム pLP5
03-TTFCは、第1〜3日に感作し、第28〜30日に追加免疫をおこなう鼻腔内送達後
に非常に強い免疫原性を示した。免疫原性は、高いTT特異的IgG血清タイターに
より全身レベルで、また、BAL液にTT特異的IgAを示して粘膜レベルで示された。
TT特異的ASCおよび抗原特異的T-細胞の増殖は脾臓において全身レベルで、また
頚リンパ節において局所的に示された。L. プランタルム-pLP503-TTFCの経口送
達の後に、TT特異的血清IgGの中程度のタイターが測定された。L. カセイおよび
L. プランタルム株が、鼻道に見出されるM-様細胞により効率的に試験され、血
清中に十分なレベルの免疫グロブリンを誘導した。両方のTTFC発現のレベル、非
分解性TTFCの持続可能レベル、G.I.管における持続性における組換え株間の変化
は、組換えワクチンの可能性に極めて重要な影響を与え、しばしば観察されるL. プランタルムとL. カセイ株の間の驚くべき相違の原因となり得る。
レベルおよび効率での、TTFCの指向性（表面または細胞内）の発現および調節可
能な発現を可能にした。さらに、細胞内にTTFCを発現するL. プランタルム pLP5
03-TTFCは、第1〜3日に感作し、第28〜30日に追加免疫をおこなう鼻腔内送達後
に非常に強い免疫原性を示した。免疫原性は、高いTT特異的IgG血清タイターに
より全身レベルで、また、BAL液にTT特異的IgAを示して粘膜レベルで示された。
TT特異的ASCおよび抗原特異的T-細胞の増殖は脾臓において全身レベルで、また
頚リンパ節において局所的に示された。L. プランタルム-pLP503-TTFCの経口送
達の後に、TT特異的血清IgGの中程度のタイターが測定された。L. カセイおよび
L. プランタルム株が、鼻道に見出されるM-様細胞により効率的に試験され、血
清中に十分なレベルの免疫グロブリンを誘導した。両方のTTFC発現のレベル、非
分解性TTFCの持続可能レベル、G.I.管における持続性における組換え株間の変化
は、組換えワクチンの可能性に極めて重要な影響を与え、しばしば観察されるL. プランタルムとL. カセイ株の間の驚くべき相違の原因となり得る。
【０１４５】考察
表面に曝されたTTFCを比較的低レベルに発現するL. プランタルム pLP401-TTF
C組換え株は、鼻腔内投与の後、免疫原性を示したが、抗原特異的応答が測定可
能となる前に、マウスの感作（第1〜3日）およびそれに続く２回の追加免疫（第
28〜30日、および第49〜51日）の両方が必要であった。TTFCの表面への発現はB
細胞の表面に存在するIgによる直接の結合を可能にし、免疫原性を増大させる可
能性を与えるが、この表面の抗原発現は、粘膜免疫化の後にワクチンベクターが
遭遇する低いpH、胆汁酸またはタンパク質分解性の環境により特に影響を受けや
すい。しかしながら、興味深いことに、L. プランタルム pLP401-TTFCにより上
記のように感作されたラットは、第28~30日の早い時期にそれに代えてL. plntar
um pLP503-TTFC形質転換体を用いて追加免疫をおこなうと、TTFC特異的血清IgG
（未経験のマウスから得られる応答よりもより速い反応速度を有する）を確かに
誘導する。この観察は、免疫応答の増強、成熟または測定可能性は多くの理由に
より起こることを妨げられているが、マウスの抗原特異的感作は、pLP401-TTFC
を形質転換されたL. プランタルムの投与後に実際に起こっていることを意味す
る。これは、高いレベルの「安定な」表面発現は、抗原の分解を最小化し、且つ
、免疫誘導部位に十分な抗原が利用可能に残っていることを確実にするために、
蓄積された細胞内抗原レベルほど決定的ではないことを示唆している。
C組換え株は、鼻腔内投与の後、免疫原性を示したが、抗原特異的応答が測定可
能となる前に、マウスの感作（第1〜3日）およびそれに続く２回の追加免疫（第
28〜30日、および第49〜51日）の両方が必要であった。TTFCの表面への発現はB
細胞の表面に存在するIgによる直接の結合を可能にし、免疫原性を増大させる可
能性を与えるが、この表面の抗原発現は、粘膜免疫化の後にワクチンベクターが
遭遇する低いpH、胆汁酸またはタンパク質分解性の環境により特に影響を受けや
すい。しかしながら、興味深いことに、L. プランタルム pLP401-TTFCにより上
記のように感作されたラットは、第28~30日の早い時期にそれに代えてL. plntar
um pLP503-TTFC形質転換体を用いて追加免疫をおこなうと、TTFC特異的血清IgG
（未経験のマウスから得られる応答よりもより速い反応速度を有する）を確かに
誘導する。この観察は、免疫応答の増強、成熟または測定可能性は多くの理由に
より起こることを妨げられているが、マウスの抗原特異的感作は、pLP401-TTFC
を形質転換されたL. プランタルムの投与後に実際に起こっていることを意味す
る。これは、高いレベルの「安定な」表面発現は、抗原の分解を最小化し、且つ
、免疫誘導部位に十分な抗原が利用可能に残っていることを確実にするために、
蓄積された細胞内抗原レベルほど決定的ではないことを示唆している。
【０１４６】
本研究は、鼻腔内免疫化後の免疫原性に対する観察の範囲を広げて、5×109の
TTFCを細胞内に発現するL. プランタルムによるC57BL/6マウスに対する経口免疫
化がTTFC特異的血清IgG応答を誘導することを最初に示したことにより、ラクト
バチルスに基づいたワクチンに対する重要な保証を与える。対照的に、BALB/cま
たはC57BL/6マウスは、L. カセイ形質転換体（細胞内または表面結合のいずれか
のTTFCを発現する）により経口免疫化された。
TTFCを細胞内に発現するL. プランタルムによるC57BL/6マウスに対する経口免疫
化がTTFC特異的血清IgG応答を誘導することを最初に示したことにより、ラクト
バチルスに基づいたワクチンに対する重要な保証を与える。対照的に、BALB/cま
たはC57BL/6マウスは、L. カセイ形質転換体（細胞内または表面結合のいずれか
のTTFCを発現する）により経口免疫化された。
【０１４７】
L. カセイおよびL. プランタルムは、それらのG.I.管内での時速時間が異なる
ことから研究用に選択された。持続性の違いは免疫原性に見いだされた差違を説
明できる。
ことから研究用に選択された。持続性の違いは免疫原性に見いだされた差違を説
明できる。
【０１４８】
L. プランタルムの（細胞表面への発現の）結果を説明するいくつかの要素が
あると考えられる。第１に、抗原は細胞表面には細胞内よりも少ない量で発現さ
れるので（ほぼ1オーダーの違い）、用量効果があり得る。さらに、内腔にはタ
ンパク質を分解する酵素が存在しているので、細胞表面タンパク質はタンパク質
分解をより受けやすい。さらに、タンパク質は細胞表面上で細胞内の同等のタン
パク質と少し異なる立体配座を有していた可能性があり、さらに、細胞表面上の
このような抗原は、細胞表面において、例えば接着に関して活性を変える可能性
がある。
あると考えられる。第１に、抗原は細胞表面には細胞内よりも少ない量で発現さ
れるので（ほぼ1オーダーの違い）、用量効果があり得る。さらに、内腔にはタ
ンパク質を分解する酵素が存在しているので、細胞表面タンパク質はタンパク質
分解をより受けやすい。さらに、タンパク質は細胞表面上で細胞内の同等のタン
パク質と少し異なる立体配座を有していた可能性があり、さらに、細胞表面上の
このような抗原は、細胞表面において、例えば接着に関して活性を変える可能性
がある。
【０１４９】
記載された抗原送達媒体は、宿主-ベクターの組み合わせを明確にし、細胞生
存度への影響、細胞の数、粘膜への接着および組換えラクトバチルスの免疫原性
に基づく免疫系を誘発するメカニズムを評価する必要を強調する。このように、
経口経路による組換えラクトバチルスの送達後のTTFCの免疫原性を最初に立証し
たことは、たとえば、最近の記録である年に400.000人に及ぶ破傷風による死と
戦うための、ラクトバチルスに基づく安全な経口新生児用ワクチンを保証するも
のである。
存度への影響、細胞の数、粘膜への接着および組換えラクトバチルスの免疫原性
に基づく免疫系を誘発するメカニズムを評価する必要を強調する。このように、
経口経路による組換えラクトバチルスの送達後のTTFCの免疫原性を最初に立証し
たことは、たとえば、最近の記録である年に400.000人に及ぶ破傷風による死と
戦うための、ラクトバチルスに基づく安全な経口新生児用ワクチンを保証するも
のである。
【図１】
図１Ａ及びＢは、脾臓細胞の刺激指数を示す図である。
図１Ｃ及びＤは、CLN細胞の刺激指数を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 31/12
33/02 33/02
37/08 37/08
Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21
15/09 Ｃ１２Ｒ 1:25
//(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Ｃ１２Ｒ 1:25）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ
Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ
，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，
ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ
Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ
，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，
ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ
Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ
，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，
ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 リーア，ロバート，ジャン
オランダ国 エヌエル−3904 ピーエヌ
フィーネンダール コンパス ７
(72)発明者 ポーウェルス，ペーター
オランダ国 エヌエル−2289 エイジェイ
リースウィーク デルフトウェグ 14
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA31 BA32 BA38 CA02
DA05 EA04 FA15 GA11 HA15
4B065 AA23Y AA30X AB01 AC14
BA02 CA45
4C084 AA02 AA03 AA13 AA17 BA44
CA53 MA17 MA22 MA23 MA27
MA34 MA35 MA36 MA37 MA41
MA44 MA52 NA04 NA12 NA14
ZB132 ZB322 ZB332 ZB352
ZB382
4C085 AA03 BA02 BA08 BA09 BA12
BA13 BA16 BA17 BA18 BA19
BA20 BA21 BA24 BA45 BA49
BA53 BA55 BA57 BA58 BA63
BA64 BA69 BA74 BA75 BA78
BA80 BA83 BA85 BA88 BA89
BA92 BB03 CC07 DD62 EE01
FF24 GG08
4C087 AA01 AA02 BC56 CA09 CA12
MA17 MA22 MA23 MA27 MA34
MA35 MA37 MA44 MA52 NA04
NA12 NA14 ZB13 ZB32 ZB33
ZB35 ZB38
Claims (30)
- 【請求項１】 異種抗原を細胞内でおよび/もしくは細菌表面で発現するこ
とのできる組換え乳酸菌を含んでいる経口ワクチンであって、該細菌がラクトバ
チルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）であり、該異種抗原に対す
る免疫応答および/もしくは免疫原性を引き出すことのできる、前記ワクチン。 - 【請求項２】 組換えラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plan
tarum）が発現ベクターを含んでおり、該発現ベクターは異種抗原の細胞内での
および/もしくは細胞表面上への露出という形での発現を、任意で消化管内に存
在する条件下で、起こさせることのできる、請求項１記載のワクチン。 - 【請求項３】 該異種抗原が病原性微生物に対する免疫原性を誘導すること
ができ、任意で粘膜に定住している病原体もしくは経口経路などの粘膜を介して
体内に侵入する病原体に対して特異的な異種抗原を用いる、請求項１または２記
載のワクチン。 - 【請求項４】 該異種抗原が消化管中に住み着いている病原性微生物に対す
る免疫原性を誘導する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のワクチン。 - 【請求項５】 該病原性微生物がヘルペスウイルス(herpes virus)、風疹ウ
イルス(rubella virus)、インフルエンザウイルス(influenza virus)、ムンプス
ウイルス(mumps virus)、麻疹ウイルス(measles virus)、ポリオウイルス(polio
myelitis virus)、ロタウイルス(rota virus)、RSウイルス(respiratory syncyt
ial virus)、カンピロバクター(Campylobacter)種、クラミジア(Chlamydia)類、
クリプトスポリジウム(Cryptosporidium)属の種、サイトメガロウイルス(cytome
galovirus)、ヒト免疫不全ウイルス(human immunodeficiency virus)、アクチノ
ミセス(Actinomyces)種、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)、アレナウイル
ス(arenavirus)、アルボウイルス(arbovirus)、ボツリヌス菌(Clostridium botu
linum)、カンジダ(Candida)属の種、コレラ菌(Vibrio cholera)、クリプトコッ
カス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、大腸菌(E.coli)O157:H7,
O26:H11, O111:H8, およびO104:H21のEHEC株、大腸菌のETEC株、腸管組織侵入性
(EIEC)を有することが示されている大腸菌株、大腸菌のEPEC株、大腸菌のEAggEC
株、大腸菌のDAEC株、フィロウイルス(filoviridae)、パルボウイルス(parvovir
us)、フィラリオ上科（Filarioidea）、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus
)、ウエルシュ菌(Clostridium perfringens)属の種、ヘリコバクター・ピロリ(H
elicobacter pylori)、カリシウイルス(Calicivirus)、ジアルジア・ランブリア
(Giardia lamblia)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、ハンタウイルス(hantaviru
s)、A, B, C, D, E型肝炎ウイルス(hepatitis virus)、レジオネラ(Legionellae
)の株、らい菌(Mycobacterium leprae)、リステリア菌(Listeria monocytogenes
)、ライム病ボレリア(Borrelia burgdorferi)、偽鼻疽菌(Pseudomonas pseudoma
llei)、EBウイルス(Epstein Barr virus)、回旋糸状虫(Onchocerca volvulus)、
疱瘡ウイルス(Poxvirus)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ペスト菌(Yersini
a pestis)、Q熱コクシエラ(Coxiella burnetti)、狂犬病ウイルス(rabies virus
)、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidium)、結核菌(Mycobacterium tuberculo
sis)、チフス菌(Salmonella typhi)、マラリア、カリニ肺炎の原因となる(真核
生物の寄生体)、もしくはトキソプラズマ症の原因となる病原体、またはそれら
の任意の組み合わせである、上記の請求項のいずれかに記載のワクチン。 - 【請求項６】 ロタウイルス(rotavirus)、RSウイルス(respiratory syncyt
ial virus)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、ヒト免疫不全ウイルス(hum
an immunodeficiency virus)、大腸菌(E.coli)、コレラ菌(Vibrio cholera)、連
鎖状球菌(streptococci)、および/もしくはクラミジア(chlamydia)に対する防護
的応答を引き出す、上記の請求項いずれかに記載のワクチン。 - 【請求項７】 該異種抗原がウイルス性および/または細菌性の抗原であっ
て、任意でHIVウイルスの(gp160)エンベロープタンパク質、リーシュマニア（Le
ishmania）寄生体の表面の糖タンパク質、シガ（Shiga）様毒素、赤痢菌属（Shi
gella）のリポ多糖抗原、大腸菌線毛（fimbrial）抗原、腸管毒産生性の大腸菌
株のCFA抗原、炭疸菌毒素、百日咳（pertussis）毒素、破傷風毒素である、上記
の請求項いずれかに記載のワクチン。 - 【請求項８】 該異種抗原がヒトアレルゲンであるか、もしくは該異種抗原
が破傷風に特異的なものである、請求項1から4のいずれかに記載のワクチン。 - 【請求項９】 防護的免疫原性を誘導することができる、請求項１〜８のい
ずれか１項に記載のワクチン。 - 【請求項１０】 単回投与用ワクチンとして製剤化された、請求項１〜９の
いずれか１項に記載のワクチン。 - 【請求項１１】 組換えラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus pl
antarum）が異種抗原を細胞内および/もしくは細胞表面で、ラクトバチルス・プ
ランタルム（Lactobacillus plantarum）80がβ-ガラクトシダーゼを発現してい
る程度を越える程度に発現する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のワクチ
ン。 - 【請求項１２】 組換えラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus pl
antarum）が、任意でラクトバチルスのための、好ましくはラクトバチルス・プ
ランタルム（Lactobacillus plantarum）のための発現ベクター中に、相同な発
現および/または分泌シグナルを含んでいる、請求項１〜１１のいずれか１項に
記載のワクチン。 - 【請求項１３】 組換えラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus pl
antarum）株が、5日間を越える、好ましくは9日間を越える、より適するものと
しては15もしくはさらに20日間の持続性(ワクチン接種された個体中で)を示す、
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のワクチン。 - 【請求項１４】 組換えラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus pl
antarum）が、L.プランタルム（L. plantarum） 80より長い、好ましくはL.プラ
ンタルム（L. plantarum） NCIMB 8826より長い持続性を、等価の条件下で示す
、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のワクチン。 - 【請求項１５】 幼児、免疫力の低下している者、老人、もしくは正常な健
康な幼児、児童、もしくは成人などのヒトに対しての投与のために製剤化される
、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のワクチン。 - 【請求項１６】 組換えラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus pl
antarum）が組み換えラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum
）256である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のワクチン。 - 【請求項１７】 ワクチンが少なくとも1種のアジュバントもしくは製薬上
許容される担体を含んでいる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のワクチン
。 - 【請求項１８】 請求項１〜１７のワクチンに関する請求項のいずれか１項
で定義されている、組換えラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plan
tarum）であって任意でラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantar
um）256の組換え株である、組換えラクトバチルス・プランタルム（Lactobacill
us plantarum）。 - 【請求項１９】 非ヒト起源の請求項１８記載の細菌。
- 【請求項２０】 異種抗原を発現し個体の体内に免疫応答を引き出すように
改変された、非ヒト、および/もしくは非ヒト食糧のラクトバチルス菌。 - 【請求項２１】 請求項２０記載の細菌であって： (a) 天然のもしくは未改変のL.プランタルム（L. plantarum）が該個体にと
って外来のものであるか、もしくはヒトの消化管もしくは粘膜に存在しないもの
であり； (b) 該抗原が細胞内および/もしくは細胞表面上で発現されており； ならびに/または (c) 該抗原が免疫原である、 細菌。 - 【請求項２２】 異種抗原を細胞内でおよび/または細胞表面上で発現して
個体に免疫応答を引き出し、その免疫応答がその個体の消化管中で少なくとも7
日間持続するように改変されたラクトバチルス菌。 - 【請求項２３】 L.プランタルム（L. plantarum）であるか、またはワクチ
ン中に用いるためのものである、請求項18〜26のいずれか1項に記載のラクトバ
チルス生物体。 - 【請求項２４】 異種抗原の細胞内発現もしくは露出(細胞表面上での)に適
した発現ベクターであって、消化管内に存在する条件下で異種抗原のラクトバチ
ルス・プランタルム（Lactobacillus plantaru）中での発現を提供することので
きる発現ベクター。 - 【請求項２５】 ヒトもしくは動物の体の予防もしくは治療方法に使用する
ための、請求項19から24のいずれか１項に記載の細菌。 - 【請求項２６】 異種抗原を細胞内でおよび/もしくは細胞表面上で発現す
るように改変されたラクトバチルス菌の個体用のワクチンの製造のための使用で
あって、該未改変のL.プランタルム（L. plantarum）が前記個体にとって外来の
ものである製造のための使用。 - 【請求項２７】 未改変のラクトバチルス菌がL.プランタルム（L. plantar
um）であり、ヒトの体内(該株が内在性のものである)では見出されないかまたは
、哺乳動物の消化管もしくは粘膜には存在しないものである請求項２６記載の使
用。 - 【請求項２８】 ワクチンの製造における、請求項１９から２４のいずれか
１項に記載の細菌の使用。 - 【請求項２９】 該ワクチンが経口投与に適合させたものでありおよび/も
しくは投与すると免疫応答を引き出すものである、請求項２８記載の使用。 - 【請求項３０】 破傷風の治療もしくは予防のための請求項２６から２９の
いずれか１項に記載の使用。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP99203056A EP1084709A1 (en) | 1999-09-17 | 1999-09-17 | Oral recombinant lactobacilli vaccines |
| EP99203056.9 | 1999-09-17 | ||
| PCT/GB2000/003575 WO2001021200A1 (en) | 1999-09-17 | 2000-09-18 | Oral recombinant lactobacilli vaccines |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003509469A true JP2003509469A (ja) | 2003-03-11 |
Family
ID=8240652
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001524624A Pending JP2003509469A (ja) | 1999-09-17 | 2000-09-18 | 経口用組換え乳酸桿菌ワクチン |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP1084709A1 (ja) |
| JP (1) | JP2003509469A (ja) |
| CN (1) | CN1387442A (ja) |
| AP (1) | AP2002002445A0 (ja) |
| AU (1) | AU7433700A (ja) |
| CA (1) | CA2383433A1 (ja) |
| IL (1) | IL148713A0 (ja) |
| OA (1) | OA12023A (ja) |
| WO (1) | WO2001021200A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA200201969B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010143885A (ja) * | 2008-12-22 | 2010-07-01 | Asahi Breweries Ltd | 乳酸菌およびそれらを用いた飲食物又は化粧品 |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7220418B1 (en) * | 1999-07-05 | 2007-05-22 | Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie | Delivery of trefoil peptides |
| US7060687B2 (en) | 2001-02-07 | 2006-06-13 | Genmont Biotechnology Co. | Live vaccines for allergy treatment |
| JP4059648B2 (ja) * | 2001-08-28 | 2008-03-12 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 経口用サイトカイン誘導剤 |
| GB0124580D0 (en) * | 2001-10-12 | 2001-12-05 | Univ Reading | New composition |
| EP1319410A1 (en) * | 2001-12-11 | 2003-06-18 | Société des Produits Nestlé S.A. | Use of micro-organisms for a directed delivery of substances to specific parts of the gut |
| US20040043003A1 (en) * | 2002-01-31 | 2004-03-04 | Wei Chen | Clinical grade vectors based on natural microflora for use in delivering therapeutic compositions |
| AU2003249855B2 (en) * | 2002-06-18 | 2008-07-24 | Institut Pasteur De Lille (Ipl) | Cell wall mutants for delivery of biologically active compounds |
| AU2004241895B2 (en) * | 2003-05-22 | 2008-05-01 | Synbiotics Ab | A probiotic composition comprising at least two lactic acid bacterial strains which are able to colonise the gastrointestinal tracts in combination with having intestinal survival property, intestinal binding property, an infection protection property and a fiber fermenting property |
| ATE503838T1 (de) * | 2003-10-28 | 2011-04-15 | Friesland Brands Bv | Ortspezifische verabreichung von aktiven substanzen im darm |
| US8821893B2 (en) * | 2004-07-02 | 2014-09-02 | Bio Peptides, Corp. | Oral vaccine for Borrelia |
| EP1723965A1 (en) * | 2005-05-18 | 2006-11-22 | Stallergenes Sa | Compositions for antigen-specific induction of immuno-tolerance via oral immunization |
| JPWO2006126682A1 (ja) * | 2005-05-27 | 2008-12-25 | 財団法人化学及血清療法研究所 | アルツハイマー病の予防・治療用ワクチン |
| RU2440123C2 (ru) * | 2005-10-06 | 2012-01-20 | Проби Аб | Применение lactobacillus для лечения вирусных инфекций |
| WO2007106073A2 (en) * | 2006-03-02 | 2007-09-20 | University Of Massachusetts | Modified pathogens for use as vaccines |
| EP3173096A1 (en) | 2011-04-06 | 2017-05-31 | Biovaxim Limited | Pharmaceutical compositions for preventing and/or treating an hiv disease in humans |
| CN107899009B (zh) * | 2011-04-06 | 2021-09-17 | 拜欧瓦克西姆有限公司 | 用于预防和/或治疗人中的hiv疾病的药物组合物 |
| CN102580118B (zh) * | 2012-02-24 | 2014-03-12 | 重庆大学 | 志贺样毒素Stx1B口服疫苗的制备方法及其产品 |
| US9452205B2 (en) | 2012-09-24 | 2016-09-27 | Montana State University | Recombinant Lactococcus lactis expressing Escherichia coli colonization factor antigen I (CFA/I) fimbriae and their methods of use |
| KR102143856B1 (ko) * | 2013-06-11 | 2020-08-12 | 하우스 웰니스 푸드 코퍼레이션 | 대식세포에 물질을 송달하는 담체 |
| SG11202009631WA (en) * | 2018-03-31 | 2020-10-29 | Pebble Labs Usa Inc | Systems, methods and composition of using rnase iii mutants to produce srna to control host pathogen infection |
| AU2021380725A1 (en) * | 2020-11-10 | 2023-07-06 | Elanco Us Inc. | Immunogenic probiotic compositions and methods of use including in vaccination |
| GB202019767D0 (en) | 2020-12-15 | 2021-01-27 | Chain Biotechnology Ltd | Compostitions and methods |
| CN113308396B (zh) * | 2021-05-18 | 2023-03-21 | 上海市公共卫生临床中心 | 一种植物乳杆菌及在制备新冠疫苗免疫增强剂中的应用 |
| CN113304254A (zh) * | 2021-06-07 | 2021-08-27 | 吉林大学 | 一种微小隐孢子虫Cp15重组侵入型乳酸菌活载体疫苗 |
| CN114561313B (zh) * | 2021-08-26 | 2022-09-13 | 佛山市孛特碧欧微生物科技有限公司 | 格氏乳杆菌及其应用 |
| GB202209115D0 (en) | 2022-06-21 | 2022-08-10 | Chain Biotechnology Ltd | Compositions and methods |
| DE102022119024A1 (de) * | 2022-07-28 | 2024-02-08 | INM - Leibniz-Institut für Neue Materialien gemeinnützige Gesellschaft mit beschränkter Haftung | Neuartige genetische Werkzeuge |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL8700890A (nl) * | 1987-04-15 | 1988-11-01 | Tno | Transformatie van lactobacillus, daarbij bruikbare recombinante plasmiden, getransformeerde lactobacillus species en gebruik daarvan. |
| GB9718616D0 (en) * | 1997-09-02 | 1997-11-05 | Queen Mary & Westfield College | Oral vaccine |
-
1999
- 1999-09-17 EP EP99203056A patent/EP1084709A1/en not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-09-18 CN CN00815334A patent/CN1387442A/zh active Pending
- 2000-09-18 WO PCT/GB2000/003575 patent/WO2001021200A1/en not_active Application Discontinuation
- 2000-09-18 CA CA002383433A patent/CA2383433A1/en not_active Abandoned
- 2000-09-18 IL IL14871300A patent/IL148713A0/xx unknown
- 2000-09-18 AP APAP/P/2002/002445A patent/AP2002002445A0/en unknown
- 2000-09-18 EP EP00962689A patent/EP1212083A1/en not_active Withdrawn
- 2000-09-18 OA OA1200200076A patent/OA12023A/en unknown
- 2000-09-18 JP JP2001524624A patent/JP2003509469A/ja active Pending
- 2000-09-18 AU AU74337/00A patent/AU7433700A/en not_active Abandoned
-
2002
- 2002-03-08 ZA ZA200201969A patent/ZA200201969B/en unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010143885A (ja) * | 2008-12-22 | 2010-07-01 | Asahi Breweries Ltd | 乳酸菌およびそれらを用いた飲食物又は化粧品 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU7433700A (en) | 2001-04-24 |
| EP1212083A1 (en) | 2002-06-12 |
| IL148713A0 (en) | 2002-09-12 |
| CA2383433A1 (en) | 2001-03-29 |
| EP1084709A1 (en) | 2001-03-21 |
| CN1387442A (zh) | 2002-12-25 |
| EP1084709A9 (en) | 2001-05-16 |
| ZA200201969B (en) | 2003-08-27 |
| WO2001021200A1 (en) | 2001-03-29 |
| AP2002002445A0 (en) | 2002-03-31 |
| OA12023A (en) | 2006-04-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2003509469A (ja) | 経口用組換え乳酸桿菌ワクチン | |
| Mercenier et al. | Lactic acid bacteria as live vaccines | |
| Shaw et al. | Engineering the microflora to vaccinate the mucosa: serum immunoglobulin G responses and activated draining cervical lymph nodes following mucosal application of tetanus toxin fragment C‐expressing lactobacilli | |
| Seegers | Lactobacilli as live vaccine delivery vectors: progress and prospects | |
| EP1537214B1 (en) | Regulated bacterial lysis for gene vaccine vector delivery and antigen release | |
| CN108779482B (zh) | 工程化肠道共生细菌在其外膜囊泡(omv)中表达异源蛋白质以递送至胃肠道 | |
| Wen et al. | Immunization with recombinant Lactobacillus casei strains producing K99, K88 fimbrial protein protects mice against enterotoxigenic Escherichia coli | |
| Alimolaei et al. | Oral immunization of mice against Clostridium perfringens epsilon toxin with a Lactobacillus casei vector vaccine expressing epsilon toxoid | |
| WO2003063785A2 (en) | Methods and composition for delivering nucleic acids and/or proteins to the intestinal mucosa | |
| US20090324638A1 (en) | Live bacterial vaccine | |
| Zhang et al. | Enhanced protection against nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae elicited by oral multiantigen DNA vaccines delivered in attenuated Salmonella typhimurium | |
| CN117202927A (zh) | 组合物和方法 | |
| Havenith et al. | Gut-associated lactobacilli for oral immunisation | |
| US20050232947A1 (en) | Bacterial spores | |
| US20060257415A1 (en) | Adjuvants | |
| US20040009937A1 (en) | Methods and composition for delivering nucleic acids and/or proteins to the respiratory system | |
| Medaglini et al. | Recombinant Gram-positive bacteria as vehicles of vaccine antigens | |
| US20050075298A1 (en) | Methods and composition for delivering nucleic acids and/or proteins to the intestinal mucosa | |
| Mohamadzadeh | Induction of protective immunity against microbial challenge by targeting antigens expressed by probiotic bacteria to mucosal dendritic cells | |
| WO2003074681A1 (en) | Recombinant spores | |
| Boersma et al. | Probiotic bacteria as live oral vaccines Lactobacillus as the versatile delivery vehicle | |
| WO2003063786A2 (en) | Methods and composition for delivering nucleic acids and/or proteins to the respiratory system | |
| JP2009078995A (ja) | 歯周病用免疫ワクチン | |
| WO1999011284A1 (en) | Oral vaccine | |
| Seegers et al. | Development of lactobacilli for mucosal immunization |