JP2003509016A - ヒト結合接着蛋白質をエンコードするポリヌクレオチド（ｊａｍ−２） - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト結合接着蛋白質をエンコードする単離精製されたポリヌクレオチドに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の属する技術分野 本発明は、分子生物学に関する。より具体的には、本発明は、ヒト結合接着蛋
白質をエンコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドによりエンコー
ドされたポリペプチドおよび前記ポリペプチドを発現する組換えベクターに関す
る。

【０００２】 発明の背景 細胞接着は、多細胞生物の形成および機能維持のために最も重要なものである
。接着蛋白質は、細胞内結合を媒介し、および／または細胞−基層相互作用に関
与する細胞表面分子として分類することができる。それらの細胞内ドメインは、
細胞骨格との機能的結合を提供するが、このことは、効率的な細胞間接着を生じ
させる上で重要と思われる。それらは、特徴的な空間時間的順序で発現される。
免疫グロブリン（以後、「Ｉｇ」）、カドヘリン、インテグリン、セレクチン（
Aplin AE, Howe A, Alahari SK, Juliano RL, (1998) Pharmacol. Rev. 50:197-
263）などの種々のスーパーファミリーが記載されている。免疫グロブリンスー
パーファミリーに属する接着蛋白質は、同型様式および／または異型様式の双方
で作動し得る。共通のビルディングブロックは、Ｉｇドメインであり、この原型
は、５種のＩｇドメインを有する神経細胞接着分子（以後、「ＮＣＡＭ」）であ
る。このファミリーは、白血球−内皮細胞相互作用、神経クレスト細胞移動、神
経突起誘導および腫瘍侵襲などの多様な生物学的機能に関与している。

【０００３】 炎症時に、Ｉｇスーパーファミリーのメンバー同士が相互作用し、血管壁を介
して白血球接着、侵襲および移動に関与することが十分に証明されている（Gonz
alez-Amaro R, Diaz-Gonzalez F, Sanchez-Madrid F, (1998) Drugs 56:977-88
）。セレクチン類は、白血球と活性化内皮との最初の相互作用（繋索／ローリン
グ）に関連するが、インテグリン類およびＩｇスーパーファミリーのＣＡＭ類は
、これらの細胞固着、引き続きそれらの血管外漏出を媒介する。

【０００４】 密着結合（以後、「ＴＪ」）および接着結合（以後、「ＡＪ」）は、並置して
いる内皮細胞と上皮細胞との間で生じる特殊構造である。これらは、動的であり
、かつ制御もされる半透過性細胞間拡散障壁を形成する。血液循環系からの白血
球通過を促進するために、明らかにこれらの構造が崩壊し、または再編成される
必要がある。密着結合は、結合複合体の最頂端構成要素である。近年、２種の膜
貫通蛋白質、すなわちオクルディンおよびクラウディン類が、密着結合を構成す
ることが記載された（Fanning AS, Mitic LL, Anderson JM, (1999) J. Am. Soc
. Nephrol. 10:1337-45）。これらは、推定上４つの膜貫通ドメインを有し、オ
クルディン自身が、接着分子として機能できる。オクルディンは、膜結合グアニ
レートキナーゼの一員であるＺＯ−１と直接相互作用する（Furuse M, Itoh M,
Hirase T, Nagafuchi A, Yonemura S, Tsukita S, Tsukita S, (1994) J. Cell,
Biol. 127:1617-26）。ＺＯ−１は、アクチンフィラメントと会合する能力を介
して結合周辺細胞骨格への結合を提供する（Itoh M, Nagafuchi A, Moroi S, Ts
ukita S, (1997) J. Cell. Biol. 138 (1):181-92）。

【０００５】 接着蛋白質Ｉｇスーパーファミリーの一員である血小板内皮細胞接着分子のＰ
ＥＣＡＭ−１は、内皮細胞間の側膜に局在する（Zocchi MR, Ferrero E, Leone
BE, Rovere P, Bianchi E, Toninelli E, Pardi R, (1996) Eur. J. Immunol. 2
6:759-67）。しかし、それは、ＴＪ構造およびＡＪ構造を伴わない（Ayalon O,
Sabanai H, Lampugnani MG, Dejana E, Geiger B, (1994) J. Cell. Biol. 126
(1):247-58）。白血球の血管外部位へのパラ細胞移動におけるＰＥＣＡＭ−１の
重要な役割が、立証されている（Muller WA, Weigl SA, Deng X, Phillips DM,
(1993) J. Exp. Med. 178:449-60）。１９９８年に、新規マウス結合接着分子（
以後、「ＪＡＭ」）がクローン化され、密着結合のさらなる膜貫通蛋白質成分と
して同定された（Martin-Padura I, Lostaglio S, Schneemann M, Williams L,
Romano M, Fruscella P, Panzeri C, Stoppacciaro A, Ruco L, Villa A, Simmo
ns D, Dejana E, (1998) J. Cell. Biol. 142 (1):117-27）。ＪＡＭは、単独膜
貫通ドメインおよび短い細胞内ドメインの２種のＩｇドメインを有する。したが
って、これは、接着分子のＩｇスーパーファミリーに属し、免疫細胞のパラ細胞
のトランス移動に影響を与えることを示唆する根拠がある。その細胞外ドメイン
が異型相互作用に係るかどうかは明らかではない。それでも、ＪＡＭ機能を阻害
する能力は、関節炎、喘息、リュウマチ様関節炎、ＩＢＤおよびクローン病など
の炎症性疾患の軽減を可能にすると思われる。

【０００６】 密着結合は、血液−脳関門（以後、「ＢＢＢ」）および血液−網膜関門（以後
、「ＢＲＢ」）の維持にとって重要な構造である。場合によっては、内皮ＴＪ類
を選択的に破壊することが望ましいと思われる。例えば、ＢＢＢの破壊により、
治療剤の脳への経血管送達法を提供し得る（Muldoon LL, Pagel MA, Kroll RA,
Roman-Goldstein S, Jones RS, Neuwelt EA, (1999) Am. J. Neuroradiol. 20:2
17-22）。その他の場合において、分極化上皮細胞の密着結合を開放するように
企画された方法により、嚢胞性線維症などの疾患に対して遺伝子送達を改善し得
る場合もある。ここでは、気道上皮細胞の分極化頂端膜がリピド：ｐＤＮＡ複合
体による形質移入を妨げている（Chu Q, Tousignant JD, Fang S, Jiang C, Che
n LH, Cheng SH, Scheule RK, Eastman SJ, (1999) Hum. Gene. Ther. 10:25-36
）。

【０００７】 発明の概要 本発明は、ヒトＪＡＭ２ポリペプチドまたはそのフラグメントをエンコードす
る単離精製されたヒトＪＡＭ２ポリヌクレオチドに関する。さらに本発明は、配
列番号１のヌクレオチド配列を有する単離精製されたポリヌクレオチドに関する
。

【０００８】 本発明はまた、単離精製されたヒトＪＡＭ２ポリペプチドまたはそのフラグメ
ントに関する。さらに本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有する単離精製さ
れたポリペプチドに関する。

【０００９】 本発明はまた、組換えベクターに関する。このベクターはまた、ヒト結合接着
蛋白質をエンコードする配列番号１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ
ドを含有する。該ポリヌクレオチドは、このヌクレオチド配列の発現を制御する
プロモーターおよび終結セグメントに作動可能に結合している。

【００１０】 本発明はまた、組換えベクターを含有する宿主細胞に関する。該宿主細胞は、
細菌細胞、動物細胞または植物細胞であり得る。本発明はまた、ここに記載され
た組換えベクターを含有する形質転換哺乳類に関する。

【００１１】 最後に、本発明は、前にここに記載されたポリペプチドに結合する抗体に関す
る。

【００１２】 図面の簡単な説明 図１Ａは、マウス結合接着蛋白質（以後、「マウスＪＡＭ」と言う）のオープ
ンリーディングフレームと相同性発現配列タグ（以後、「ＥＳＴ」と言う）との
バイオテクノロジーインフォメーション国立センターのホームページを介してww
w.ncbi.nlm.nih.govでアクセスされるデータベースから得られる整列を示す。図
１Ｂは、停止コドンを含むヒト結合接着蛋白質（以後、「ヒトＪＡＭ２」）の３
’末端をエンコードする重複ＥＳＴの整列を示す。同一性はＤＮＡレベルで示す
。図１Ｃは、ヒトＪＡＭ２の完全オープンリーディングフレームを得るのに使用
されるｃＤＮＡ末端の迅速増幅（以後、「ＲＡＣＥ」と言う）の要約である。各
反応から同定された最長クローンを、マウスＪＡＭと整列する。

【００１３】 図２は、ヒトＪＡＭ２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の完全ｃＤ
ＮＡとアミノ酸配列を示す。予想シグナル配列および膜貫通ドメインには下線が
引かれている。Ｎ−結合グリコシル化部位は、細胞外ドメインにおいて免疫グロ
ブリン様折りたたみ内にジスルフィド結合を形成するシステイン残基として強調
して示す。ＰＫＣリン酸化部位は、細胞内ドメインにおいて強調して示す。

【００１４】 図３は、ヒトＪＡＭ２（上段）およびマウスＪＡＭ（下段）のオープンリーデ
ィングフレームの整列を示す。ジスルフィド結合を形成する予想保存システイン
残基は太字で記す。保存ＰＫＣリン酸化部位は、１本下線が引かれている。

【００１５】 図４は、高緊縮下で探索された正常化多組織ノーザンブロットにおけるヒトＪ
ＡＭ２転写体の同定を示す。転写体は、ヒトＪＡＭ２、アクチンまたはＧＡＰＤ
Ｈ［α^３２Ｐ］ｄＣＴＰ標識プローブに対するハイブリダイゼーションにより可
視化された。図４Ａは、ＪＡＭ２（ｉ）およびアクチン（ｉｉ）プローブを示す
。末梢血リンパ球（レーン１）；肺（レーン２）；胎盤（レーン３）；小腸（レ
ーン４）；肝臓（レーン５）；腎臓（レーン６）；脾臓（レーン７）；胸腺（レ
ーン８）；結腸（レーン９）；骨格筋（レーン１０）；心臓（レーン１１）；脳
（レーン１２）。図４Ｂは、ＪＡＭ２（ｉ）およびＧＡＰＤＨ（ｉｉ）プローブ
を示す。右心室（レーン１）；左心室（レーン２）；右心房（レーン３）；左心
房（レーン４）；肺尖（レーン５）；大動脈（レーン６）；成人心臓（レーン７
）；胎児心臓（レーン８）。矢印は、ヒトのＪＡＭ２転写体を示す。

【００１６】 図５は、ＪＡＭ２のウェスタンブロット分析を示す。ＪＡＭ２発現ＣＨＯ細胞
（レーン２）の対照（レーン１）の細胞溶解が、マウスのポリクローナル抗ＪＡ
Ｍ２細胞外ドメイン抗体により探索された。ＨＳＢ細胞溶解は、免疫前（レーン
３）または抗ＪＡＭ２（レーン４）抗体の何れかにより探索された。等量の蛋白
質を全レーンに載せた。

【００１７】 図６は、免疫蛍光によりチャイニーズハムスターの卵巣細胞に発現されたＪＡ
Ｍ２の局在部位決定を示す。完全長ＪＡＭ２（Ａ）を発現する安定な細胞系また
は対照（Ｂ）を、パラホルムアルデヒドで固定し、マウスの１次抗ＪＡＭ２抗体
の１：１００希釈液次いでＧＡＭ−ＦＩＴＣで染色した。細胞着色の単一角度図
を、２６×０．４μｍのｚ軸平面から容積測定的に再構成した。作業倍率は×４
００。デジタルコントラストレベルは、画像捕捉中変化させなかった。スケール
バーは、２０μｍ。

【００１８】 図７は、種々の白血球細胞系におけるＪＡＭ２カウンター受容体についてのス
クリーニングを示す。カルセイン負荷細胞を９６穴プレートに捕捉されたＪＡＭ
２−Ｆｃに添加した。結合は、ＴＢＳ＋Ｃａ／Ｍｇ／Ｍｎ（ｎ＝６）中で実施し
た。ウエルを洗浄し、細胞溶解状態を維持し、蛍光光度計により励起４８５／発
光５３０ｎｍで蛍光を測定した。代表的な実験からのデータ。平均±ＳＥＭ。Ｆ
Ｕ、任意の蛍光単位。

【００１９】 図８は、ＪＡＭ２接着のカチオン依存性を示す。ＨＳＢ細胞結合を、ＴＢＳ＋
Ｃａ／Ｍｇ／Ｍｎ、ＢＢ（ｎ＝１０）；ＴＢＳ（ｎ＝７）；ＴＢＳ＋ＥＤＴＡ（
ｎ＝５）；ＴＢＳ＋Ｃａ（ｎ＝４）；ＴＢＳ＋Ｍｇ（ｎ＝４）；ＴＢＳ＋Ｍｎ（
ｎ＝１０）中で実施した。（ｎ）回の独立した実験からの平均データを、％結合
緩衝液（ＢＢ）±ＳＥＭとして表した。ＦＵ、任意の蛍光単位。ｈｏｃ検定後の
フィッシャーのＰＬＳＤによる対ごとの比較、ＴＢＳとの有意差：^＊ｐ＜０．０
００１、ＴＢＳ＋Ｃａとの有意差：^ｔｐ＜０．０００１、およびＴＢＳ＋Ｍｇと
の有意差：^±ｐ＜０．００１。

【００２０】 図９は、マンガン活性化ＪＡＭ２接着におけるカチオンの効果を示す。ＨＳＢ
細胞結合を、ＴＢＳ＋Ｃａ／Ｍｇ／Ｍｎ（ＢＢ）；ＴＢＳ＋Ｍｎ；ＴＢＳ＋Ｍｎ
／Ｍｇ；ＴＢＳ＋Ｍｎ／Ｃａ中で実施した。７回の独立した実験からの平均デー
タを、％結合緩衝液（ＢＢ）±ＳＥＭとして表した。ＦＵ、任意の蛍光単位。ｈ
ｏｃ検定後のフィッシャーのＰＬＳＫによる対ごとの比較、ＴＢＳとの有意差：

【００２１】

【化１】 ＴＢＳ＋Ｍｎとの有意差：

【００２２】

【化２】 ＴＢＳ＋Ｍｎ／Ｍｇとの有意差：^＃ｐ＜０．０１。

【００２３】 図１０は、ＨＳＢ細胞へのＪＡＭ２Ｉｇドメインの接着を示す。ＪＡＭ２Ｉｇ
ドメイン１およびドメイン１＋２の分泌Ｆｃ融合蛋白質を、感染ＳＦ２１細胞の
培養液からＧＡＭによる捕捉によりＥＬＩＳＡウエルに固定化した。

【００２４】 図１１は、ＨＳＢ細胞への表面ビオチン化蛋白質の沈殿を示す。Ｋ５６２（レ
ーン１）細胞およびＨＳＢ（レーン２、レーン３）細胞の原形質膜を表面ビオチ
ン化し、特異的結合蛋白質を、ＪＡＭ２−Ｆｃ（レーン１、レーン２）またはＪ
ＡＭ１−Ｆｃ（レーン３）の何れかにより沈殿させた。ＪＡＭ１は、マウスＪＡ
Ｍのヒト相同体、ＧｅｎＢａｎｋＡＣＣＮｏ．Ｕ８９９１５である。バンドは、
電気泳動および転移後のアビジン−ＨＲＰおよびＥＣＬにより検視した。等量の
蛋白質を全レーンに載せた。

【００２５】 発明の詳細な説明 Ｉ．本発明 本発明は、ヒトの結合接着蛋白質（ここでは「ヒトＪＡＭ２」と言う」）をエ
ンコードする単離精製されたポリヌクレオチド配列に関する。他の実施態様にお
いて、本発明は、ヒトＪＡＭ２に係るポリペプチドに関する。さらに他の実施態
様において、本発明は、発現の際ヒトＪＡＭ２を産生する組換えベクターに関す
る。本発明はまた、これらの組換えベクターにより形質転換された宿主細胞に関
する。

【００２６】 ＩＩ．配列リスト 本出願はまた、９種の配列を包含する配列リストを含む。該配列リストは、ヌ
クレオチド配列およびアミノ酸配列を含む。ヌクレオチド配列に関して、塩基対
は、以下の塩基コードにより表される。

【００２７】

【表１】

【００２８】 出願に示されたアミノ酸はＬ−体であり、以下のアミノ酸−３文字略語により
表される。

【００２９】

【表２】

【００３０】 ＩＩＩ．ポリヌクレオチド １つの態様において、本発明は、ヒトＪＡＭ２をエンコードする単離生成され
たポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドは、遺伝子配列、ｃＤＮ
Ａまたは合成ＤＮＡなどのＤＮＡ分子であり得る。該ＤＮＡ分子は、２本鎖また
は１本鎖であり得、１本鎖の場合、コーディング鎖であり得る。さらに、該ポリ
ヌクレオチドは、ｍＲＮＡ類などのＲＮＡ分子であり得る。

【００３１】 本発明はまた、これらのコーディング配列に同じかまたは相補的なＲＮＡ配列
と共に、コーディング配列に相補的な非コーディング鎖（アンチセンス）を提供
する。通常の当業者は、対応するＲＮＡ配列にはチミジン（Ｔ）の替わりにウラ
シル（Ｕ）を含むことを容易に理解するであろう。

【００３２】 １つの実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、ヒトＪＡＭ２のコー
ディング配列を含む単離精製されたｃＤＮＡ分子である。代表的なｃＤＮＡ分子
は配列番号１として示される。

【００３３】 当業界によく知られているように、遺伝子コードの縮退のために、配列番号１
またはその部分またはそのフラグメントによりエンコードされたものと同じポリ
ペプチドに対してコードできる多数の他のＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子がある。
本発明はまた、配列番号１に示される配列に少なくとも７０％の相同性、好まし
くは少なくとも８０％の相同性、最も好ましくは少なくとも９０％の相同性を有
する相同性ポリヌクレオチドを考慮している。ここで用いられる用語の「相同性
」とは、相補性の程度を言う。部分的相同性または完全相同性（すなわち、同一
性）もあり得る。部分的相補配列は、同一配列が標的核酸にハイブリダイズする
ことを少なくとも部分的に阻害するものであり、それは機能的用語の「実質的に
相同性」を用いて述べる。標的配列に対して完全相補的配列のハイブリダイゼー
ション阻害は、低緊縮条件下でのハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロ
ットまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を用いて検討
し得る。実質的に相同性の配列またはプローブは、低緊縮条件下で標的配列に対
して完全相補的配列またはプローブの結合（すなわち、ハイブリダイゼーション
）に競合し阻害することになる。このことは、低緊縮条件が非特異的結合を許す
ようなものではなく、すなわち互いに２つの配列結合が特異的（すなわち、選択
的）相互作用であることを必要とする低緊縮条件であるということである。非特
異的結合の不在は、部分的な相補性の程度さえも欠く（例えば、約３０％未満の
同一性）第２の標的配列の使用により試験し得る。非特異的結合の不在下では、
プローブは、第２の非相補的な標的配列にハイブリダイズしないであろう。さら
に、本発明はまた、上記に表したｃＤＮＡ配列の天然由来の対立変種および変異
体を、これらの変種および変異体が発現の際ヒトの結合接着蛋白質をコードする
限り考慮している。本発明はまた、ＪＡＭ２ポリヌクレオチドのスプライス変種
を含む。

【００３４】 本発明のポリヌクレオチドは、当業界によく知られている方法を用いてマーカ
ー補助の選択に使用できる。マーカー補助の選択は、遺伝子の完全配列を必要と
しない。その代わり、部分的配列は、ハイブリダイゼーションプローブとして、
またはＰＣＲまたは他の方法により増幅するオリゴヌクレオチドプライマーの主
成分として使用でき、他の哺乳類における結合接着蛋白質に特異的なヌクレオチ
ドを同定する。

【００３５】 ＩＶ．ポリペプチド 本発明はまた、ヒトＪＡＭ２ポリペプチドを提供する。ヒトＪＡＭ２に関する
アミノ酸配列は、配列番号２に供され、２９８個のアミノ酸残基を含む。

【００３６】 本発明はまた、開示配列に類似の生物活性が示されるような、ここに表される
配列に実質的に重複するアミノ酸配列を考慮している。このような考慮された配
列としては、アミノ酸配列または種類（例えば、保存される置換配列）において
最小の変化であって、この非実質的な変化がポリペプチドの基本的性質および生
物学的活性を変えないことを特徴とする配列が挙げられる。

【００３７】 そのペプチドの生物学的機能を実質的に変更することなくポリペプチドの構造
に修飾および変化が成されることは当業界によく知られている。例えば、ある一
定のアミノ酸は、目立った機能喪失なしに供されたポリペプチドにおいて他のア
ミノ酸に置換できる。このような変化を成すにあたり、アミノ酸残基のような置
換は、側鎖置換基、例えばそれらのサイズ、電荷、疎水性、親水性などの相対的
類似性に基づいて実施することができる。

【００３８】 ここに引用により組込まれた米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されてい
るように、以下の疎水性値がアミノ酸残基に与えられた。すなわち、Ａｒｇ（＋
３．０）；Ｌｙｓ（＋３．０）；Ａｓｐ（＋３．０）；Ｇｌｕ（＋３．０）；Ｓ
ｅｒ（＋３．０）；Ａｓｎ（＋０．２）；Ｇｌｎ（＋０．２）；Ｇｌｙ（０）；
Ｐｒｏ（−０．５）；Ｔｈｒ（−０．４）；Ａｌａ（−０．５）；Ｈｉｓ（−０
．５）；Ｃｙｓ（−１．０）；Ｍｅｔ（−１．３）；Ｖａｌ（−１．５）；Ｌｅ
ｕ（−１．８）；Ｉｌｅ（−１．８）；Ｔｙｒ（−２．３）；Ｐｈｅ（−２．５
）；およびＴｒｐ（−３．４）である。アミノ酸残基が同様の疎水性値（例えば
、プラスマイナス２．０値以内）を有する他のものに置換でき、なお生物学的に
等価のポリペプチドを獲得できることが解される。

【００３９】 同様の方法で、疎水性指標における類似性に基づいて置換が成される。各アミ
ノ酸残基は、疎水性特性および電荷特性に基づく疎水性親水性指数が与えられた
。これらの疎水性親水性指数値は、Ｉｌｅ（＋４．５）；Ｖａｌ（＋４．２）；
Ｌｅｕ（＋３．８）；Ｐｈｅ（＋２．８）；Ｃｙｓ（＋２．５）；Ｍｅｔ（＋１
．９）；Ａｌａ（＋１．８）；Ｇｌｙ（−０．４）；Ｔｈｒ（−０．７）；Ｓｅ
ｒ（−０．８）；Ｔｒｐ（−０．９）；Ｔｙｒ（−１．３）；Ｐｒｏ（−１．６
）；Ｈｉｓ（−３．２）；Ｇｌｕ（−３．５）；Ｇｌｎ（−３．５）；Ａｓｐ（
−３．５）；Ａｓｎ（−３．５）；Ｌｙｓ（−３．９）；およびＡｒｇ（−４．
５）である。疎水性親水性指数に基づいた置換を実施するにあたり、プラスマイ
ナス２．０以内の値が好ましい。

【００４０】 本発明のポリペプチドは、当業界に知られた標準法、好ましくはMerrifieldの
方法（J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)）などの固体状態法を用いて化
学的に合成できる。別途に、本発明の蛋白質は、ＤＮＡ組換え技術の方法を用い
て製造できる（Sambrookら、"Molecular Cloning-A Laboratory Manual", 2^nd,
Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989)）。

【００４１】 Ｖ．組換えベクター 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクター、本発明の組
換えベクターにより遺伝子的に工作された宿主細胞、および組換え技術による本
発明のポリペプチドの生産に関する。

【００４２】 本発明のポリペプチドは、当業界によく知られる組換え技術を用いてポリペプ
チドを生産するのに使用できる。例えば、ポリヌクレオチドを、ポリペプチドを
発現するために種々の発現ベクターの任意の１種に含ませることができる。この
ようなベクターとしては、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ
４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラ
スミド、プラスミドおよびファージＤＮＡの組合せから誘導されたベクター、牛
痘、アデノウィルス、鶏痘ウィルスおよび仮性狂犬病などのウィルスＤＮＡが挙
げられる。遺伝的要素を得るために最も一般的なベクターの１つは、よく知られ
たクローニングベクターｐＢＲ３２２（ATCC 受託番号３７０１７として、ヴァ
ージニア州マナサス、American Type Culture Collectionから入手できる）から
のものである。ｐＢＲ３２２の「バックボーン」の部分は、適当なプロモーター
および構造的配列と組合せて発現される。しかし、他のベクターがいずれも、宿
主中で複製でき、生存可能である限り使用し得る。

【００４３】 本発明のポリヌクレオチド配列は、前方または逆方向において前記の組換えベ
クターの１つに挿入され得る。当業界でよく知られる多様な方法が、これを達成
するために用いることができる。一般に、該ポリヌクレオチドは、適当な制限エ
ンドヌクレアーゼ部位に挿入される。

【００４４】 適当な発現ベクターに挿入される場合、本発明の該ポリヌクレオチドは、ｍＲ
ＮＡ合成を方向づけるために、プロモーターなどの適当な発現制御配列に作動可
能に結合される。ここで用いられる用語「作動可能に結合」とは、プロモーター
配列が、第２の配列に相当するＤＮＡ配列転写を開始し、介在するようなプロモ
ーターと第２の配列との間の機能的結合の意味を含む。一般に、作動可能に結合
とは、連結されるべきヌクレオチド配列が隣接していること、および二つのタン
パク質コード領域を結合する場合、隣接して同一のリーディングフレームにある
ことを意味する。異種構造配列が、発現組換え産物の安定化または精製簡便化等
の望ましい性質を付与するＮ末端またはＣ末端同定ペプチドを含む融合タンパク
質をコードし得る。

【００４５】 プロモーター領域を、クロラムフェニコールトランススフェラーゼ（ＣＡＴ）
ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、いずれもの望まし
い遺伝子から選択できる。このようなプロモーターは、３−ホスホグリセレート
キナーゼ（ＰＧＫ）、α−因子、酸ホスファターゼ、または熱ショック蛋白質な
どの解糖系酵素をエンコードするオペロン類から誘導できる。使用できる細菌プ
ロモーターの例としては、限定しないが、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇ
ｐｔ、ラムダＰ_Ｒ、Ｐ_Ｌおよびｔｒｐが挙げられる。真核性プロモーター類とし
ては、前初期ＣＭＶ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レト
ロウィルスからのＬＴＲ類、およびマウスメタロチオネイン−Ｉが挙げられる。
使用できる他のプロモーター類の例としては、バキュロウィルスのポリヘドリン
プロモーターが挙げられる。

【００４６】 典型的に、組換え発現ベクターは、ベクターの維持を保証する複製源を含む。
組換え発現ベクターは、好ましくは形質転換された宿主細胞の選択のための表現
型形質を提供する１種または複数の選択的マーカー遺伝子を含む。使用できる選
択的マーカー遺伝子の例としては、限定しないが、真核細胞培養についてジヒド
ロ葉酸レダクターゼ耐性またはネオマイシン耐性、大腸菌についてテトラサクリ
ン耐性またはアンピシリン耐性、およびS. cerevisiaeについてはＴＲＰ１遺伝
子が挙げられる。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位お
よび転写終結セグメントを含み得る。ベクターはまた、発現増幅のための適当な
配列を含み得る。

【００４７】 原核宿主および真核宿主の使用に係る適当なクローニングベクターおよび発現
ベクターは、ここに引用して組込まれるSambrookら、Molecular Cloning: A Lab
oratory Manual、第２版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、（1989
）に記載されている。多数の好適なベクター類およびプロモーター類は、商品と
して入手でき、本発明に使用できる。使用できるベクター類の例としては、限定
しないが、細菌：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Quiagen）、ｐＢＳ、
ｐＤ１０、ファージスクリプト、ｐｓｉＸ１７４、ｐブルースクリプトＳＫ、ｐ
ＳＫＳ、ｐＮＨ８Ａ、ｐｋｒＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Stratage
ne）；ｐｔｒｃ９９ａ、ＰＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、
ｐＲＩＴ５（Pharmacia）；ｐＧＥＭ（Promega）。真核生物：ｐＷＬＮＥＯ、ｐ
ＳＶ２ＣＡＴ、ｐ）Ｇ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Stratagene）、ｐＳＶＫ３、ｐ
ＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Pharmacia）が挙げられる。

【００４８】 他の態様において、本発明は、前記の組換えベクターを含む宿主細胞に関する
。前記のポリヌクレオチドを含むベクター（クローニングベクターまたは発現ベ
クターなど）が、適当な宿主を形質転換、形質導入または形質移入して宿主が蛋
白質を発現させるために使用できる。本発明に使用できる適当な宿主としては、
限定しないが、E. coli、Streptomyces、Bacillus subtilis、Salmonella typhi
muriumと共に、シュードモナス族、ストレプトマイセス族およびスタフィロコッ
カス族の種々の種のような原核生物細胞、酵母のような低級真核生物細胞ならび
にドロソフィラＳ２およびスポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞が含まれる。組換え
構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡ
Ｅ−デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションによ
り達成できる（ここに引用して組込まれるDavis, L., Dibner, M., Battey, L.,
Basic Methods in Molecular Biology, (1986) を参照）。

【００４９】 哺乳動物細胞培養系のような種々の高等真核細胞もまた、組換え蛋白質を発現
するのに使用できる。哺乳動物発現系の例としては、Gluzman, Cell, 23:175 (1
981) により記載されるサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合ベクタ
ーを発現できる他の細胞系、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよび
ＢＨＫ細胞系が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製源、好適なプロモー
ターおよびエンハンサー、および任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニ
ル化部位、スプライス供与部位および受容部位、転写終結配列、および５’側部
非転写配列を含む。ＳＶ４０スプライスおよびポリアデニル化部位から誘導され
たＤＮＡ配列が、必要な非転写遺伝子要素を提供するのに使用できる。

【００５０】 工作された宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択、または本
発明のヒト結合接着蛋白質をエンコードする遺伝子増幅のために適当なものとし
て修飾された従来の栄養培地中で培養できる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発
現用に選択された宿主細胞と共に以前に用いられたものであり、当業界によく知
られる方法を用いて実験的に決定できる。

【００５１】 高等真核細胞による本発明のポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド
の転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加できる。エン
ハンサーは、１０から約３００の塩基対の長さであるＤＮＡのシス作用要素であ
り、それらは転写を増加するプロモーターに作用する。本発明に使用できる好適
なエンハンサーの例としては、複製源の塩基対１００から２７０の後期部位上の
ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウィルス早期プロモーターエンハンサー、
複製源の後期部位上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウィルスエンハン
サーが挙げられる。

【００５２】 好適な宿主株の形質転換および該宿主株の適当な細胞密度への増殖後、選択さ
れたプロモーターは、適当な手段（温度変化または化学誘導など）により誘導さ
れ、細胞をさらなる期間培養する。細胞は、一般に遠心分離により収穫し、物理
化学手段により破砕し、生じた粗製抽出物は、さらなる精製のために保存される
。蛋白質の発現に用いられた微生物細胞は、凍結融解サイクル、音波処理、機械
的破砕、または溶菌剤の使用など任意の好適な方法により破砕できる。

【００５３】 本発明のポリペプチドは、組換え細胞培養液、細胞マスからまたは他に当業界
に知られる蛋白質化学の方法に従って、回収精製できる。例えば、硫酸アンモニ
ウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、およびクロマトグラフィーの種々の形態、
例えばアニオン／カチオン交換、ホスホセルロース、疎水性相互作用、免疫アフ
ィニティーなどのアフィニティークロマトグラフィー、レクチンおよびヒドロキ
シアパタイトクロマトグラフィーである。他の方法としては、透析、限外ろ過、
ゲルろ過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび等電点電気泳動を挙げることができる。必要
ならば蛋白質の再生段階を成熟蛋白質の形状を完成するのに使用できる。最終的
に、正常システムまたは逆システムにおける高性能液体クロマトグラフィー（以
後、「ＨＰＬＣ」）を最終精製段階に使用できる。

【００５４】 無細胞翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡ類を用いて
このようなポリペプチドを生産するのに使用できる。

【００５５】 ｃＤＮＡ配列は、分子のどの部分が機能に関与しているかを決定するために、
関連位置において変異したｗｔＪＡＭ２またはＪＡＭ２の何れかを発現する安定
な細胞系を調製するのに使用できる。安定なまたは一時的な細胞系が、５’末端
または３’末端の何れかにタグ、例えばＨＡエピトープを有するＪＡＭ２により
作製でき、ＪＡＭ２の機能／修飾／細胞相互作用のモニタリングを可能にする。
さらに、組換えＪＡＭ２を発現する細胞系は、ＪＡＭ２機能の小分子阻害剤に関
してスクリーンするのに使用できる。

【００５６】 ＪＡＭ２の細胞外配列は、組換え蛋白質をマウス／ヒトＩｇＧのＦｃ領域に融
合させるのに使用し得る。このタンパク質は以下のように使用できる。

【００５７】 ａ）ＪＡＭ２リガンドに関するスクリーンのために、ＪＡＭ２−Ｆｃ融合をＥ
ＬＩＳＡプレートに捕捉し得る。培養細胞（例えば単球）をカルシエン（calcie
n）染料でラベルし、固定化ＪＡＭ２−Ｆｃと共にインキュベートし、洗浄し、
蛍光を測定し得る。他に、ＪＡＭ２−Ｆｃを固体支持体に結合させてから、種々
の細胞／組織由来の可溶化蛋白質を精製するカラム作製に使用することができる
。その後ペプチド配列決定によりこのリガンドを同定し得るであろう。その他の
方法としては、ＪＡＭ２−Ｆｃを細胞ライゼートに結合させ、ＤＳＳとの架橋が
実施され得よう。

【００５８】 ｂ）ＪＡＭ２リガンドの同定の際、ＪＡＭ２−ＦｃはＪＡＭ２異型相互作用の
小分子阻害剤に関するスクリーンに使用し得る。

【００５９】 ｃ）異型または同型相互作用のＪＡＭ２機能を中和する道具として。ＪＡＭ２
−Ｆｃは、ＪＡＭ２機能を撹乱させるために、種々の動物モデルにおいてインビ
ボで投与し得る。他にコンセプト立証研究がインビトロで実施し得る。

【００６０】 ＪＡＭ２が同型様式で結合することが判れば、細胞外ドメイン由来の組換え蛋
白質がこのような相互作用の分析に使用し得る。蛋白質は、Ｆｃタグを所有しな
いであろう。同型様式の相互作用を生み出すのはどれなのかを決定するために、
単独の免疫グロブリン様ドメイン類が作製され得る。このような組換え蛋白質は
、本来の、または組換えＪＡＭ２を発現する細胞内のパラ細胞透過性を減少させ
る能力を評価するために使用し得る。別々のドメイン同士、または双方のＩｇ様
ドメインを有する組換え体との相互作用は種々の方法で評価し得る。例としては
、ＤＳＳとの架橋、分析的超遠心分離、またはサイズ分離カラムがある。

【００６１】 ＪＡＭ２配列は、細胞系におけるＪＡＭ２機能阻害に関するアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド類の同定に使用し得る。さらに縮退オリゴヌクレオチド類は、ポ
リメラーゼ連鎖反応により、このファミリーのさらなるメンバーの同定を補助す
るためにｃＤＮＡライブラリーとＪＡＭ２配列との低緊縮ハイブリダイゼーショ
ンが実施し得る。

【００６２】 ＪＡＭ２の細胞内ドメインは、酵母の２−ハイブリッド系において、新規な相
互作用の相手を「釣り上げる」ために使用し得る。さらに。ＪＡＭ２配列は、相
同組換えにより内在性遺伝子を不活化するため、およびそれによってＪＡＭ２を
欠失した細胞、組織、動物を作り出すために使用し得る。このような細胞、組織
、動物は、その後、通常ＪＡＭ２に依存する特異的インビボ過程を明らかにする
ために使用し得る。

【００６３】 ＪＡＭ２は多くの組織においては低レベルで発現しており、病的状態時にアッ
プレギュレートされ得る。この発現パターンは、ＪＡＭ２が内皮に局在化してい
ることを示唆する。しかし、他の細胞種もまたＪＡＭ２を発現する可能性も確か
にある。ＪＡＭ２が上皮細胞の密着結合に局在しているならば、それは転移時に
ある役割を演ずることが提案されている。ＪＡＭ２の欠失または発現低下により
、腫瘍細胞間の接着低下させるのみならず、内皮を経て血管内へとそれらが移動
することをも促進し得る。脳内でのＪＡＭ２発現は、血液脳関門における役割を
示し得る。大動脈および心臓におけるＪＡＭ２の発現はアテローム発生および再
灌流損傷などの炎症性または透過性変化を示す状態時に、ある役割を演じ得るこ
とを示す。さらに、ＪＡＭ２が単球の挿入円板に局在し、したがって、シンシチ
ウムの維持に、ある役割を演じている可能性がある。

【００６４】 ＶＩ．抗体 本発明のポリペプチド類、そのフラグメントまたは前記ペプチド類を発現する
細胞は抗体を産生する免疫原として使用し得る。これらの抗体は、例えば多クロ
ーン性または単クローン性抗体であり得る。本発明は、Ｆａｂフラグメントまた
はＦａｂ発現ライブラリーの産生物と同様にキメラ抗体、単一鎖抗体およびヒト
化抗体をも含む。

【００６５】 本発明のポリペプチドに対して、生成された抗体はポリペプチドを動物、好ま
しくは非ヒトに投与することにより得ることができる。本発明のポリペプチドフ
ラグメントのみをエンコードする配列でも本来の全ポリペプチドに結合する交代
を生成するために使用することができる。その後このような抗体は、そのポリペ
プチドを発現する組織からこのポリペプチドを単離するために使用し得る。

【００６６】 単クローン性抗体の作製には、連続的細胞系培養により産生された抗体を提供
する任意の方法を使用し得る。例としては、ハイブリドーマ法（ここに参照して
組込まれるKohlerおよびMilstein, 1975, Nature, 256:495-497に記載）、トリ
オーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（ここに参照して組込まれるKozborら、
1983, Immunology Today 4:72に記載）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法がヒト
単クローン性抗体の産生のために挙げられる（ここに参照して組込まれるColeら
、1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss社、pp-
77-96に記載）。

【００６７】 ここに参照して組込まれる米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている
ような単一鎖抗体の産生に関する方法が、本発明の免疫原性ポリペプチドに対す
る単一鎖抗体の産生のために採用できる。

【００６８】 本発明の抗体は下記の目的に使用し得る。

【００６９】 ａ）正常および病的状態下での組織内ＪＡＭ２のプローブ細胞局在部位／発現
の探査。

【００７０】 ｂ）細胞および／または発作組織からのＪＡＭ２蛋白質を免疫沈降し、それが
例えばグリコシル化、リン酸化などにより変化するかどうかを測定する。

【００７１】 ｃ）ＪＡＭ２機能測定の補助のため。例えば、ＪＡＭ２が炎症細胞と相互作用
するか、またはそれらのパラ細胞移動に影響を与えることが判れば、インビトロ
およびインビボ双方でこの機能を阻害するために中和抗体が開発されるであろう
。

【００７２】 例示のために本発明の実施例を示す。

【００７３】 実施例１：ヒトＪＡＭ２のクローニングおよび発現 電子工学的クローニング法と従来のクローニング法とを組合せて使用し、配列
番号１で示されるポリヌクレオチド鎖をクローン化した。使用された電子工学的
方法は、バイオテクノロジーインフォメーション国立センター（ＮＣＢＩ）のホ
ームページを介してwww.ncbi.nlm.nih.govでアクセスされる発現配列タグ（ＥＳ
Ｔ）データベースの利用を含んでいる。電子工学的クローニングのための鋳型と
して、ここに参照して組込まれるMartin-Padura I, Lostaglio S, Schneemann M
, Williams L, Romano M, Fruscella P, Panzeri C, Stoppacciaro A, Ruco L,
Villa A, Simmons D, Dejana E, J. Cell. Biol. (1998) 142 (1):117-27発行の
新規マウス結合接着蛋白質のｃＤＮＡ配列（ＪＡＭ）を使用した。マウスＪＡＭ
ｃＤＮＡ配列は、またＧｅｎＢａｎｋ（アクセス番号Ｕ８９９１５）においても
入手し得る。Basic Local Alignment Search Tool（ＢＬＡＳＴ２．０）を、マ
ウスＪＡＭとの相同性を示すＥＳＴ類の同定に使用した。

【００７４】 電子工学的クローニング 疑問の蛋白質配列を全リーディングフレームで動的に翻訳されたヌクレオチド
配列データベースと比較するｔｂｌａｓｔｎプログラムを用いて、完全マウスＪ
ＡＭペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｕ８９９１５）をヒトＥＳＴ配
列との相同性に関して探索した。完全マウスＪＡＭ蛋白質配列は３００個のアミ
ノ酸長である。開始コドンは塩基対（以後、「ｂｐ」）７１で始まり、停止コド
ンは９７１で始まる（図１Ａを参照）。ＥＳＴに合うものの中から、さらなる分
析のために１つが選択された。使用した基準はマウスＪＡＭに対する正当な相同
性と免疫グロブリン様の折りたたみに特異的なシステイン残基の保持であった。
ＡＡ４０６３８９がマウスＪＡＭと１６１個のアミノ酸が重複し、アミノ酸レベ
ルで４２％の同一性を示し、実際のｃＤＮＡの組立てのために選ばれた（図１Ａ
を参照）。組立てのすべての間、翻訳を全リーディングフレームでモニターし、
実際の蛋白質の推定される開始および終結コドンを同定した。可能な場合は、配
列決定の誤りを確認するために多重複ＥＳＴ類の検査を実施した。ＡＡ４０６３
８９の最終３’１３０ｂｐをｂｌａｓｔｎプログラムを用いたヒトｄｂＥＳＴに
よりブラスト化した。ＡＡ９１２６７４は２５７ｂｐに亘って重複し、９９．６
％の同一性を示した（図１Ｂを参照）。ＡＡ４０６３８９の５’末端配列に関し
データベースをさらに探索したが、追加のＥＳＴ類は見つからなかった。

【００７５】 従来のクローニング このｃＤＮＡに関しさらに５’配列を得るために、ＲＡＣＥを実施した。主要
目的は、直線配列においてほぼマウスＪＡＭのものと一致した推定のリボソーム
開始部位（ＡＴＧ）を同定することであった。

【００７６】 ３種の異なるＲＡＣＥ反応を、ヒト胎盤ｍＲＮＡ（Clontech）にＭａｒａｔｈ
ｏｎｃＤＮＡ増幅キット（Clontech、カリフォルニア州パルアルト）を用いて連
続的に実施した。最初に、ＡＡ４０６３８９に対するオリゴヌクレオチド、５’
−ＣＣＣＣＧＣＡＴＣＡＣＴＴＣＴＴＧＴＣＡＣＡＴＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＧ−
３’（配列番号３）により実施した。このプライマーとマウスＪＡＭとの整列に
より、このプライマーは翻訳開始部位の約３１８ｂｐ下流に位置することを示し
た。４２℃にてＡＭＶ逆転写酵素（Clontech）でｍＲＮＡを逆転写した。以下の
プロトコルに従ってＲＡＣＥを実行した。

【００７７】

【表３】

【００７８】 生成物を、大腸菌ベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Invitrogen、カリフォルニ
ア州カールスバッド）および塩基配列決定のために選ばれた１１種のクローン（
ABI sequencer、テキサス州セクライト）に連結した。最長クローンは、ＡＴＧ
の５’に４５ｂｐ伸長し、マウスＪＡＭにほぼ整列させられた（図１Ｃを参照）
。しかし、この推定上の翻訳開始コドン上流の停止コドンは同定できなかった。

【００７９】 停止コドンの同定を試みるために、フレーム内にておよびこのＡＴＧ上流にお
いて、２つの追加ＲＡＣＥ反応を実施した。最初にＲＡＣＥ反応１と同じ伸長用
プライマーを用いた。しかし、ｍＲＮＡは５８℃でサーモスクリプト（BRL Life
Technologies、米国ニューヨーク）により逆転写した。生成物をｐＣＲ−Ｂｌ
ｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Invitrogen）に連結した。塩基配列決定された６種のク
ローンの中で、最長のもののみが２２対の追加塩基対を所有していた（図１Ｃ）
。ＲＡＣＥ反応３では、オリゴヌクレオチド５’−ＣＴＧＣＴＣＧＡＧＧＡＧＧ
ＴＣＧＡＧＧＧＴＣＣＣ−３’（配列番号４）をＲＡＣＥ反応２から得られた配
列内で設計した。ｍＲＮＡを、５８℃でサーモスクリプトにより転写した。３種
のクローンを塩基配列決定すると、最長のものは、ＲＡＣＥ反応２において同定
されたものに対して１６７対の追加塩基対を所有していた（図１Ｃを参照）。

【００８０】 ＲＡＣＥ反応は、全部で推定上の翻訳開始コドンのさらに２３４ｂｐ５’を産
生した。停止コドンは、ＡＴＧとフレーム内にあるこの配列内には同定されなか
った。しかし、発明者らは、幾つかの理由でそれをオープンリーディングフレー
ムの真の開始であると考えている。第一に、ヒトＪＡＭ２リーディングフレーム
と公表されたマウスＪＡＭリーディングフレーム（図３を参照）との整列は、こ
のＡＴＧがマウスＪＡＭのものとほぼ一致することを示している。第２に、この
部位の周りのヌクレオチド（ＧＧＡＡＧＡＴＧＧ）は、−３位にＡおよび＋４位
にＧを有し、したがって開始コンセンサス配列と一致する。第３に、ＪＡＭ２の
最初の２８個のアミノ酸はシグナルペプチドであると考えられる。

【００８１】 完全長ＪＡＭ２の構築 完全長ヒトＪＡＭ２を構築するために、２つの別個のＰＣＲ反応生成物を、内
在ＥｃｏＮＩ制限部位を介して共に連結した。オープンリーディングフレームの
５’切片の合成のために、開始コドンを取り囲むセンスプライマー、５’−ＧＣ
ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＡＴＧＧＣＧＡＧＧＡＧＧ−３’（配列番号５）およ
び細胞外ドメインの末端を狙ったアンチセンスプライマー、５’−ＧＣＴＡＴＴ
ＡＴＧＣＣＧＧＴＡＣＣＧＴＴＧＡＧＡＴＣＡＴＣＴＡＣ−３’（配列番号６）
を設計した（次の操作のためにプライマーに組入れられた制限部位に下線を引い
てある）。生成物を、以下のプログラムを用いてヒト胎盤ｍＲＮＡ（Clontech）
から増幅した。すなわち、９５℃で２分、１サイクル；９５℃で２０秒、５８℃
で２０秒、７２℃で３０秒、３５サイクル；７２℃で３分、１サイクルである。
凡そ７２０ｂｐ生成物をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯに連結した。

【００８２】 オ−プンリーディングフレームセンスプライマーの３’切片の合成のために、
リーディングフレームの２４８ｂｐに位置する５’−ＴＡＡＡＡＡＴＣＧＡＧＣ
ＴＧＡＧＡＴＧＡＴＡＧ−３’（配列番号７）を、停止コドン（太字）を組入れ
たアンチセンスプライマーである

【００８３】

【化３】 （配列番号８）と結合した。以下のプログラムを用いて生成物をヒト胎児腎臓細
胞（ＨＥＫ−２９３、American Type Culture Collection、ヴァージニア州マナ
サス、ＡＴＣＣアクセス番号ＣＲＬ−１５７３）から誘導したｍＲＮＡから増幅
した。すなわち、９５℃で７分、１サイクル；９５℃で２０秒、５６℃で２０秒
、７２℃で３０秒、２８サイクル；７２℃で５分、１サイクルである。凡そ６４
９ｂｐ生成物をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯに連結した。２つの独立したＰＣＲ反応を
実施し、各々のクローンを各塩基の立証のために塩基配列決定した。

【００８４】 配列の特徴 ヒトＪＡＭ２ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、図２および配列番号１およ
び２にそれぞれ示す。図２に示されるように、２９８個のアミノ酸の完全コーデ
ィング領域は、推定のシグナル配列、２種の免疫グロブリン様ドメイン、単独の
膜貫通ドメイン（下線）および短い細胞内ドメインの特徴をなす。シグナルペプ
チド、すなわちＶＶＡ−ＬＧ（１本下線）またはＡＹＧ−ＦＳ（点下線）につい
て２つの可能な開裂部位がある。指定されたＡＴＧは、Kozakコンセンサス内に
あり、ヒトＪＡＭ１のＡＴＧと整列できる事実に基づいて、真の翻訳開始シグナ
ルである。免疫グロブリン様ドメイン内にジスルフィド結合を形成すると予測さ
れた４個のシステイン残基に注目する。第１および第２のシステインは、第１の
免疫グロブリン様折りたたみ内に位置し、第３および第４のシステインは、第２
の免疫グロブリン様折りたたみ内に位置する。アミノ酸番号９８、番号１８７、
番号２３６で可能なＮ結合グリコシル化部位（ＮｘＳ／Ｔ）およびアミノ酸番号
２７９で可能なＰＫＣリン酸化部位（Ｓ／ＴｘＲ／Ｋ）に注目する。したがって
、ＪＡＭ２機能は、ＰＫＣにより修飾されよう。さらに、ＪＡＭ２（ＳＦＩＩ）
のＣ最末端のアミノ酸は、ＰＤＺドメイン（Songyang Z, Fanning AS, Fu C, Xu
J, Marfatia SM, Chishti AH, Crompton A, Chan AC, Anderson, JM, Cantley,
LC (1997) Science 275:73-77）と相互作用するであろうと予測されるコンセン
サスに一致する。ＰＤＺドメインを含む蛋白質は、主として原形質膜に局在し、
細胞間接触の特定部位に補充される。ごく最近、ヒトＪＡＭ（ＪＡＭ１）の細胞
内ドメインがＰＤＺドメインを介して、密着結合同伴蛋白質ＺＯ−１およびＡＦ
−６に結合することが報告された（Bazzoni G, Martinez-Estrada OM, Orsenigo
F, Cordenonsi M, Citi S, Dejana E, (2000) J. Biol. Chem. 275:20520-2052
6; Ebnet K, Schulz CU, Meyer Zu, Brickwedde MK, Pendl GG, Vestweber D. (
2000) J. Biol Chem Jun 15; [刊行前に電子出版された]）。したがって、ＪＡ
Ｍ２が同様に結合活性を発揮する可能性が高い。

【００８５】 配列の整列 ヒト結合接着配列とマウスＪＡＭとの整列により、アミノ酸レベルにおいて４
３％類似性および３５％同一性を有することがわかる（図３を参照）。保存され
たシステインの位置が、双方の配列において注目される。

【００８６】 発現パターン ＪＡＭ２の組織発現を、細胞外ドメインから誘導された［α^３２Ｐ］ｄＣＴＰ
標識プローブを用いて正常化ヒト多組織ノーザンブロット（Clontech）にて検討
した。この結果は、ＪＡＭ２が約４．５ｋｂおよび１．５ｋｂの２つの転写体と
して発現されることを示す（図４を参照）。このブロットは、高緊縮にてプロー
ブされた。したがってこれら２つの種は、選択的スプライシングによる生成物で
あろう。図４は、ヒトＪＡＭ２が心臓内に多量に発現することを示す。発現はま
た、はるかに低レベルで胎盤中に生じ、脳および骨格筋で明らかである。図４Ｂ
は，心臓におけるＪＡＭ２転写体のより詳細な検討を示す。クレアーチャンバー
特異的発現は明らかでなかった。ＧＡＰＤＨに関連して、胎児心臓にいくらか低
い発現がある。しかし、大動脈、心房および心室において大きな差は見られなか
った。

【００８７】

【表４】

【００８８】 如何なる理論にも縛られることは望まないが、ＪＡＭ２とマウスＪＡＭとの相
同性により、発明者らは、ＪＡＭ２がこれら組織の内皮細胞に局在すると予測す
る。これは、ヒトの大動脈内皮細胞および心臓微小血管内皮細胞から誘導された
ｍＲＮＡのＰＣＲ分析により確認される（上記表１を参照）。興味深いことに、
ヒト臍帯静脈内皮細胞（以後、「ＨＵＶＥＣ」と言う）からの生成物が、わずか
に検出できた。したがって、ＪＡＭ２発現は、ある血管床に制限されると思われ
る。マウスＪＡＭは内皮細胞に加えて、上皮細胞にも発現する。ポリメラーゼ連
鎖反応を用いて、ヒト胎児腎臓細胞系（ＨＥＫ−２９３）における発現は、検出
できるが、結腸上皮細胞系、ＣａＣｏ２においてはごく低レベルのみである。

【００８９】 ＥＳＴデータベースは、ヒトＪＡＭ２配列を部分的にエンコードする多くのＥ
ＳＴ類を含む。表１は、配列が誘導された組織を文書化している。それは、各組
織における発現レベルについての情報を提供しているのではない。発現パターン
は、内皮細胞および上皮細胞の双方に特異的な蛋白質であるマウスＪＡＭと一致
している。

【００９０】 実施例２：ＪＡＭ２の機能特性 Ａ．方法 １．昆虫細胞における細胞外ドメインの発現 オリゴヌクレオチドが、完全長クローンからヒトＪＡＭ２の細胞外ドメインを
増幅するために設計された。センス５’−ＧＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＡＴＧ
ＧＣＧＡＧＧＡＧＧ−３’（配列番号５）およびアンチセンス５’−ＧＣＴＡＴ
ＴＡＴＧＣＣＧＧＴＡＣＣＧＴＴＧＡＧＡＴＣＡＴＣ−３’（配列番号６）オリ
ゴヌクレオチドが、生成物をマウスＩｇＧ−２ａの定常領域を所有する（Cunnin
gham SA, Tran TM, Arrate MP, Brock TA, (1999) J. Biol. Chem. 274:18421-7
）ｐＦａｓＢａｃ１（Life Technologies, GIBCO BRL、ニュ−ヨーク州グランド
アイランド）ベクターにサブクローニングのために、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ
制限部位（下線）に組込まれた。このベクターは、ポリヘドリンプロモーターか
ら蛋白質発現を誘導する。組換え蛋白質は、Ｓｆ２１昆虫細胞からｍＩｇＧ２ａ
への融合として分泌される。

【００９１】 ２．哺乳類細胞における完全長クローンの発現 ＪＡＭ２の完全長クローンが、検出目的のためにＨＡタグを組込むためにＰＣ
Ｒ変異誘発によりそのＣ末端において修飾された。センス５’−ＧＣＣＧＣＧＧ ＡＴＣＣ ＡＡＧＡＴＧＧＣＧＡＧＧＡＧＧ−３’（配列番号５）オリゴヌクレオ
チドは、次の操作のためにＢａｍＨＩ部位（下線）を含んだ。アンチセンス

【００９２】

【化４】 （配列番号９）オリゴヌクレオチドは、停止コドン（下線）および挿入されるＨ
Ａタグアミノ酸のＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号１０）に特定した配列（イタリ
ック）を組込んだ。ｐＧＥＭ−７（Promega、ウィスコンシン州マジソン）ベク
ター中に修飾されたＪＡＭ２−ＨＡを、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ（ポリリンカ
ー）で消化し、ｐｃＤＮＡ６／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｂ）（Invitrogen、カリフォルニ
ア州カールスバッド）のＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位に連結した。このベクタ
ーは、蛋白質発現を駆動するためにＣＭＶプロモーターを利用している。

【００９３】 ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、挿入物の無いベクター１０μｇまたはＦｕＧＥＮＥ（商
標）６試薬（Roche Diagnostics社、インディアナ州インディアナポリス）を用
いてｐｃＤＮＡ６−ＪＡＭ２により形質移入された。安定な細胞系、対照および
ＪＡＭ２は、ブラスチシジンの５〜１０μｇ／ｍｌにより選ばれた。ウェスタン
ブロット分析のために、細胞をプロテアーゼ阻害剤（カクテルセットＩＩＩ、Ca
lbiochem、カリフォルニア州ラジョラ）の存在下１％ＴＸ−１００緩衝液中で溶
解した。約３６μｇの蛋白質を、１０％ポリアクリルアミドゲル中電気泳動し、
免疫前または抗ＪＡＭ２ポリクローナル血清の１：２０００倍希釈によりプロー
ブした。特定バンドが、ＧＡＭ−ＨＲＰ（Fischer、ペンシルベニア州ピッツバ
ーグ）の１：３０，０００倍希釈による強化化学発光を用いて可視化された。

【００９４】 ３．染色体中の部位決定およびイントロン／エキソン ゲノム配列を特定するために、公開の非多重複データベースが、ＪＡＭ２ｃＤ
ＮＡ配列を用いてＢｌａｓｔｎプログラムを使用して探査された。この結果、幾
つかのエクソン境界の末端における単離された塩基の２重指定による小さな手動
修飾が必要となった。５’および３’スプライス部位のコンセンサス配列に基づ
いて正しい指定が行なわれた。ゲノム配列の２つ以上の寄託から同一情報を引き
出すことにより全イントロン／エキソン境界を確認することが可能であった。

【００９５】 ４．抗体 メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢；Harlan、インディアナ州インディアナポ
リス）を免疫化し、次いで２８日間隔で、等量のフロイントアジュバントにより
乳化した１００μｇの精製ＪＡＭ２細胞外ドメインの腹腔内注射または皮下注射
により３回増強した。完全フロイントアジュバントが、最初の免疫化のために用
いられ、次の注射に不完全フロイントアジュバントを用いた。血清は、各増強１
０日後に採取した。

【００９６】 ５．免疫蛍光 ガラススライド上で集密になるまで増殖させたＣＨＯ−Ｋ１、対照またはＪＡ
Ｍ２発現を、１％パラホルムアルデヒドで固定し、免疫前血清または抗ＪＡＭ２
マウスポリクローナル血清の１：１００倍希釈で染色した。１：１００ＸのＧＡ
Ｍ−ＦＩＴＣを二次染色として用いた。蛍光は、アルゴンレーザーおよび適当な
光学およびＦＩＴＣ検出用のフィルターモジュールで装備されたNoran TM共焦点
レーザー走査顕微鏡（Noran Instruments、ウィスコンシン州ミドルトン）を用
いて観察された。デジタル画像が、０．７５Ｎ／Ａニコン×２０レンズを用いて
×４００にて得られた。倒立顕微鏡台に取り付けたＺ軸モーターを、サンプルを
通して０．４μｍステップで焦点面を動かして較正した。書き換えできる光学ハ
ードディスクに保存された５１２×４８０解像度で集められた１２ビットグレイ
スケール画像は、Image-1／Metamorph TM 3-Dモジュール（Universal Imaging社
、パンシルベニア州ブランディーワイン、パークウェイ）を用いて容量的に再構
築された。

【００９７】 ６．接着アッセイ インビトロ接着アッセイを、ここに引用として組込まれたTodderud, G., J. J
. Leukoc. Biol. 52:85 (1992) に記載されているように、本質的には９６穴プ
レート中で実行された。手短に言えば、ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａの５０μｇをＰ
ＢＳ中５μｇ／ｍｌで被覆し、４．８ピコモルのＪＡＭ２−ＦｃまたはｍＩｇＧ
２ａ（対照）を捕捉するために用いられた。種々の白血球細胞系、すなわちＴリ
ンパ球、ＨＳＢ、ＨＰＢ−ＡＬＬ；Ｂリンパ球、ＲＡＭＯＳ；単球細胞、ＨＬ６
０、ＴＨＰ−１および赤白血病細胞Ｋ５６２系は、トリスバッファー生理食塩水
プラス各１ｍＭのＣａＣｌ_２，ＭｇＣｌ_２およびＭｎＣｌ_２から成る結合緩衝液
中２５０，０００個の細胞／ウエルを用いて３７℃で２５分間５０μｇ／ｍｌの
カルセイン（Molecular Probe社、オレゴン州ユージン）で標識した。ウエルを
、３回洗浄し、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ４
０で溶解し、蛍光を、４８５／２０ｎｍでの励起および５３０／２５ｎｍでの発
光でのCytofluorで読取った。特異的結合は、ＪＡＭ２−Ｆｃの蛍光マイナスｍ
ＩｇＧ２ａの蛍光として算出された。抗体阻害に関して、ウエル上で捕捉された
蛋白質またはＨＳＢ細胞を、免疫前血清（正常マウス血清）または抗ＪＡＭ２マ
ウスポリクローナル血清の１：１００倍希釈で結合緩衝液中室温３０分間インキ
ュベートした。次いで、アッセイの継続の前に、３×洗浄によって余分の抗体を
除去した。各パラメーターに関する実験群間の総体的な差は、最初に１方向分散
解析（ＡＮＯＶＡ）により評価し、個々の対ごとの群比較は、ｈｏｃ検定後フィ
ッシャーの保護最小有意差（ＰＬＳＤ）により解析した。

【００９８】 ７．細胞表面のビオチン化 ＨＳＢ細胞またはＫ５６２細胞を、製造元の取扱い説明書に従ってＥＺ−リン
クスルホ−ＮＨＳ−ビオチン（Pierce、イリノイ州ロックフォード）を用いて表
面のビオチン化した。細胞（２．５×１０^７／ｍｌ）を、０．５ｍｇ／ｍｌスル
ホ−ＮＨＳ−ビオチンで室温３０分間培養後３回洗浄した。細胞溶解は、プロテ
アーゼ阻害剤ッカクテルセットＩＩＩ（Calbiochem、カリフォルニア州ラジョラ
）を含有したトリスバッファー生理食塩水（ｐＨ７．５）、１％トリトンＸ−１
００、１ｍＭ ＭｎＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＣａＣｌ_２中にて達
成した。ＪＡＭ−Ｆｃ融合の約５μｇを、約１μｇの溶解液に加え、４℃でイン
キュベートした。ＪＡＭに結合した蛋白質を、プロテインＡセファロース（３０
μｌ）で沈殿させ、ＳＤＳサンプル緩衝液中１０ｍＭ ＤＴＴと共に５分間沸騰
させ、９％ＳＤＳゲル上で分離した。ＰＤＶＦ膜に移した後、ビオチン化蛋白質
を、ストレプタビジン−ＨＲＰ（１：４０００）および増強化学発光（ＥＣＬ）
（Amersham Pharmacia Biotech、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて
検出した。

【００９９】 Ｂ．結果 ＪＡＭ２を、公表データベースを用いてｑ２１．２位の染色体２１に位置付け
した。配列は、各１００，０００ｂｐ（アクセス番号ＡＰ００００８７．１およ
びＡＰ００００８６．１）の２種の隣接した非重なり配列から１００％同一性で
検索された。８９７ｂｐを構成するＪＡＭ２のコーディング領域は、下記の表２
に示されるように１０種のエキソンに亘り分布している。

【０１００】

【表５】

【０１０１】 図２に示されているＪＡＭ２ｃＤＮＡ配列の範囲は、ゲノムＤＮＡの約７４，
８５３ｂｐに及ぶ。種々のエキソンがＡＰ０００２２３（コーディングエキソン
１）、ＡＰ０００２２５（コーディングエキソン２、３、４、５、６）およびＡ
Ｐ０００２２６（コーディングエキソン６、７、８、９、１０）において見出さ
れた。完全ＪＡＭ２転写物は８９７ｂｐより相当大きいため（図４）、上流およ
び／または下流でもさらに未翻訳領域のエキソンがまだ同定されていない。全て
のイントロン／エキソン境界はＣＴ／ＡＧ則に一致している（Breathnach, Rら
、Annu. Rev. Biochem., 50:359 (1981)を参照）。

【０１０２】 蛋白質発現と局在部位を調べるために、ＪＡＭ２の外表ドメインに対するマウ
スポリクローナル血清を作成した。天然組織内のＪＡＭ２内在レベルを調べるの
に、抗体は有用ではなかった。さらなる洞察を得るために、ＪＡＭ２を過剰発現
する安定したＣＨＯ細胞系を生成させた。これらの細胞を用いるとＪＡＭ２蛋白
質の検出はウェスタンブロット分析により可能であった。図５によりＪＡＭ２の
分子質量は４８ｋＤＡと推定される。これはペプチド鎖から予測されるサイズよ
り約１４ｋＤａ大きい。この減少は、３箇所のＮ系グリコシル化一致部位のうち
少なくとも１箇所でのＪＡＭ２のグリコシル化と解釈できる。

【０１０３】 ＣＨＯの安定細胞系はまた、集密単層における細胞局在部位の測定にも使用し
た。図６は、ＪＡＭ２が細胞間接触に加えて双方の表面膜に分割していることを
示している。染色の境界パターンは、ＣＨＯ細胞において発現したマウスＪＡＭ
（ＪＡＭ１）およびＨＵＶＥＣ中内在ヒトＪＡＭ（ＪＡＭ１）によって示される
パターン（Martin-Padura, I.ら、J. Cell Biol. 142:117 (1998)を参照）と同
一である。

【０１０４】 次に静的条件下で行われる、以前に確立されたインビトロ結合アッセイに従っ
て、種々の白血球細胞に対して接着するＪＡＭ２細胞外ドメインの能力を調べた
（Todderud, G., J. Leukoc. Biol. 52:85 (1992)を参照）。ＴＢＳに加えて１
ｍＭカルシウム、マグネシウム、マンガンを含む結合緩衝液（以後、「ＢＢ」）
中、カルセイン負荷細胞を９６穴プレートに捕捉したＪＡＭ２−Ｆｃと反応させ
た。捕捉されたｍＩｇＧ２ａへの細胞の非特異的結合を同時に測定し、差し引い
た。図７は、ＪＡＭ２−Ｆｃは、Ｂリンパ球（ＲＡＭＯＳ）および単球ＨＬ６０
、ＴＨＰ−１との相互作用と比較して、Ｔリンパ球系のＨＳＢとＨＰＢ−ＡＬＬ
を非常に効率よく捕捉できることを示している。赤血球病Ｋ５６２細胞系との結
合は存在しなかった。

【０１０５】 この接着をさらに特性化するために、カチオン独立性を調べた。結合がカチオ
ンの存在下で、またはカルシウム、マグネシウムまたはマンガンのみで行われる
ように緩衝液を変化させた（図８を参照）。接着性には２つの要素がある。第１
に、ＥＤＴＡは、３種のカチオン全ての存在下で得られた結合以下に結合を阻害
することはないということから、カチオン独立性の相互作用が示される。第２に
、ＴＢＳまたはＴＢＳ＋ＥＤＴＡ中で得られた結合以上にマンガンの特異的結合
増大があることから、カチオン依存性の相互作用が示される。後者は、インテグ
リンの関与を示唆している。図７で行われたスクリーンは、カチオン独立性の結
合に好ましい条件下で実施されたことから、ＴＢＳプラスマンガン中の全ての細
胞の相互作用を再分析した。他の細胞種では、マンガンの結合増大は明らかでは
なかった。

【０１０６】 カルシウムとマグネシウムの存在下では（例えば、結合緩衝液中では）ＪＡＭ
２／ＨＳＢのマンガン刺激結合の要素は実質的に廃棄される。マンガンの結合増
大性を阻害するのは、これらカチオンの１種だけかそれとも双方かを確認するた
めに、種々のカチオンの組合せを用いてアッセイを実施した（図９を参照）。そ
のデータにより、マンガンのみの緩衝液中にカルシウムを入れると相互作用がか
なり減少したことが示される（ｐ＜０．００１）。マグネシウムの効果は、統計
的に有意ではなかった。

【０１０７】 マウスＪＡＭ（ＪＡＭ１）は、同型的相互作用をする能力がある。したがって
、ＪＡＭ２外表ドメインがこの機構を介してＨＳＢ細胞と結合したかどうかを調
べた。図４によると、ヒトＪＡＭ（ＪＡＭ１）とは異なり、ＪＡＭ２は末梢血白
血球において発現を示さない。それにもかかわらず、ＨＳＢ細胞における発現欠
如を確立するために、マウスポリクローナル血清を用いて、ウェスタンブロット
によりＪＡＭ２蛋白質の発現を探索した。蛋白質は検出されなかった（図５）。
さらなる立証のため、以下のより高感度の試験を用いて表面ＪＡＭ２発現レベル
を比較した。ＣＨＯ細胞を発現するＨＳＢ、対照、およびＪＡＭ２にカルセイン
を負荷し、ＮＭＳまたは抗ＪＡＭ２血清の何れかと共にインキュベートした。ヤ
ギ抗マウス二次抗体を塗布した９６穴プレートで捕捉した細胞により、細胞表面
に結合したＪＡＭ２抗体を検出した。表３により、抗ＪＡＭ２血清がＪＡＭ２蛋
白質を発現するＣＨＯ細胞を非常に効率的に捕捉するのに対し、ＨＳＢ細胞の結
合は明らかに存在しないことが示されている。

【０１０８】

【表６】

【０１０９】 これらの研究を拡張するために、組換えＪＡＭ２へのＨＳＢ結合を中和するマ
ウス抗ＪＡＭ２血清の能力を試験した。抗体は、９６穴プレート上で捕捉した組
換えＪＡＭ２上のエピトームを遮断するのに用いられた。表４は、免疫前血清は
無効であるが、抗ＪＡＭ２血清はＨＳＢ結合を首尾よく妨げることを示す。ＪＡ
Ｍ２の比較的高レベルが、これらのウエル上で被覆されことから、低レベルがＨ
ＳＢ細胞に発現されたならば、抗体は、ＨＳＢ細胞と直接インキュベートされれ
ば、阻害を生じることができるはずであると我々は確信している。この実験設定
下で予測されるように、抗ＪＡＭ２抗体は、組換えＪＡＭ２とのＨＳＢ相互作用
を阻害することはできない。

【０１１０】

【表７】

【０１１１】 Ｉｇスーパーファミリーに属する多くの接着蛋白質は、接着を成就するために
Ｎ−最末端Ｉｇドメインを利用する。ＪＡＭ２の第１のＩｇドメイン結合能を評
価するために、それは、昆虫細胞における分泌蛋白質として合成され、結合を完
全細胞外ドメインと比較した。図１０は、ＪＡＭ２のこのＮ末端Ｉｇの折りたた
みが、実際ＨＳＢ細胞に接着できることを示す。さらに、マンガン存在下での結
合増進も維持されている。

【０１１２】 発明者らは、ＨＳＢ細胞がＪＡＭ２に係るカウンター受容体（counter-recept
or）を発現することを仮定する。この仮説を強固にし、蛋白質の予備的特性研究
のために、発明者らは、ＪＡＭ２−Ｆｃを用いて沈殿実験を実行した。ＨＳＢ細
胞を表面ビオチン化し、洗浄し、溶解して、結合緩衝液中ＪＡＭ２−Ｆｃとイン
キュベートした。結合蛋白質は、プロテインＡを用いて沈殿させ、アビジン−Ｈ
ＲＰとのウェスタンブロットで観察した。図１１は、実際ＪＡＭ２が、凡そ４３
ｋＤａのＨＳＢ細胞からの表面蛋白質を特異的に捕捉できることを明らかにして
いる。上記の細胞接着研究と一致して、このバンドは、表面ビオチン化Ｋ５６２
細胞において明らかではない。さらに、カルセイン負荷ＨＳＢ細胞に結合できな
いヒトＪＡＭ１−Ｆｃは、この蛋白質を沈殿しない。発明者らは、この蛋白質が
ＪＡＭ２のＨＳＢ細胞へのカチオン−独立結合に応答できることと予測する。

【０１１３】 本発明は、前記説明および実施例により例証される。その観点から多くの変化
が当業者にとって明らかになることから、前記説明は、非限定の例証として意図
される。添付の特許請求の範囲および精神の中でこのような全変化は、それによ
り包含されることが意図されている。

【０１１４】 以下の請求の範囲に定義されるように、本発明の概念および範囲から逸脱する
ことなくここに記載された本発明の方法の組成物、操作および方法のアレンジメ
ントに対して変化を与えることができる。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ａは、マウスＪＡＭとＥＳＴの整列を示す。 Ｂは、停止コドンを含むヒトＪＡＭ２の３’末端をエンコードする重複ＥＳＴ
の整列を示す。 Ｃは、ヒトＪＡＭ２の完全オープンリーディングフレームを得るのに使用され
る要約である。各反応から同定された最長クローンをマウスＪＡＭと整列する。

【図２】 ヒトＪＡＭ２のオープンリーディングフレームの完全ｃＤＮＡとアミノ酸配列
を示す。

【図３】 ヒトＪＡＭ２（上段）およびマウスＪＡＭ（下段）のオープンリーディングフ
レームの整列を示す。

【図４Ａ】 アクチン[α^３２Ｐ]ｄＣＴＰ標識プローブを用いた、高緊縮下で探索された正
常化多組織ノーザンブロットにおけるヒトＪＡＭ２転写体の同定を示す。

【図４Ｂ】 ＧＡＰＤＨ[α^３２Ｐ]ｄＣＴＰ標識プローブを用いた、高緊縮下で探索された
正常化多組織ノーザンブロットにおけるヒトＪＡＭ２転写体の同定を示す。

【図５】 ＪＡＭ２のウェスタンブロット分析を示す。

【図６】 チャイニーズハムスターの卵巣細胞に発現されたＪＡＭ２の免疫蛍光による局
在部位決定を示す。Ａは完全長ＪＡＭ２発現細胞について、Ｂは対照細胞につい
て、示す。

【図７】 種々の白血球細胞系におけるＪＡＭ２カウンター受容体についてのスクリーニ
ングを示す。

【図８】 ＪＡＭ２接着のカチオン依存性を示す。

【図９】 マンガン刺激ＪＡＭ２接着におけるカチオンの効果を示す。

【図１０】 ＨＳＢ細胞へのＪＡＭ２Ｉｇドメインの接着を示す。

【図１１】 ＨＳＢ細胞からの表面ビオチン化蛋白質の沈殿を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ｂ Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA61 BA80 CA04 DA01 DA02 DA05 DA06 EA04 FA02 FA15 GA03 GA05 GA11 4B065 AA26X AA90Y AA91X AA94X AB01 AB05 BA02 BA08 BA25 CA23 CA24 CA44 4H045 AA10 AA11 AA30 CA40 DA50 DA75 EA20 EA28 EA54

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトＪＡＭ２ポリペプチドまたはそのフラグメントをエンコ
   ードする単離精製されたヒトＪＡＭ２ポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 配列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る単離精製された
   ポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 単離精製されたヒトＪＡＭ２ポリペプチドまたはそのフラグ
   メント。
4. 【請求項４】 配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる単離精製されたポリ
   ペプチド。
5. 【請求項５】 ヒトのＪＡＭ２ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを
   含み、前記ポリヌクレオチドが前記ポリヌクレオチド配列の発現を制御するプロ
   モーターおよび終結セグメントに作動可能に連結されている組換えベクター。
6. 【請求項６】 プロモーターが、ＬＴＲ、ＳＶ４０、大腸菌、ｌａｃ、ｔｒ
   ｐ、またはラムダファージＰ_Ｌプロモーターである請求項５に記載のベクター。
7. 【請求項７】 請求項５に記載の組換えベクターを含んで成る宿主細胞。
8. 【請求項８】 宿主細胞が、細菌細胞、動物細胞または植物細胞である請求
   項７に記載の宿主細胞。
9. 【請求項９】 請求項５に記載の組換えベクターを含んで成る形質転換哺乳
   類。
10. 【請求項１０】 請求項３または４に記載のポリペプチドに結合する抗体。