JP2003507489A - 高純度２−メトキシエストラジオールの生成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ９８％より高い純度を有する２−メトキシエストラジオールが、合成又は精製法により生成される。エストロゲン性構成成分を欠くこの高純度２−メトキシエストラジオールは、ヒトにおける臨床的使用に特に適している。本発明の精製方法は、他の化合物から２−ＭＥ２を分離するための液体−固体クロマトグラフィー(ＬＳＣ)の使用を包含する。クロマトグラフィー媒質は、好ましくはシリカである。溶媒系は、非極性溶媒、例えばクロロホルム、並びに極性溶媒、例えばメタノールを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 ［関連出願］ 本出願は、米国特許暫定出願第６０／１５０，２９３号(1999年8月23日提出)
に対する優先権を主張する。

【０００２】 ［発明の分野］ 本発明は、エストラジオール代謝物質２−メトキシエストラジオール、並びに
精製２−メトキシエストラジオールの生成方法に関する。

【０００３】 ［発明の背景］ ２−メトキシエストラジオール、１，３，５（１０）−エストラトリエン−２
，３，１７β−トリオール−２−メチル−エーテル（２−ＭＥ２）は、主要卵巣
エストロゲンであるエストラジオールの内因性代謝物質である。２−ＭＥ２の化
学式はＣ₁₉Ｈ₂₆Ｏ₃であり、化合物は３０２．４の分子量を有する。２−ＭＥ２
は、低エストロゲン性活性を有するが、しかし他の生物学的作用を有することが
見出されている。

【０００４】 D'Amato等に対する米国特許第５，５０４，０７４号、第５，６６１，１４３
号及び第５，８９２，０６９号は、２−ＭＥ２を用いた、異常細胞有糸分裂によ
り特性化される哺乳類疾患の治療方法を開示する。望ましくない細胞有糸分裂は
、限定されないが、癌、アテローム硬化症、固形腫瘍の増殖、血管機能不全、子
宮内膜症、網膜症、関節症、及び異常創傷治癒を含む多数の疾患に特徴的である
。さらに細胞有糸分裂は、限定されないが胚の正常発生、黄体形成、子宮内膜の
周期性増殖、創傷治癒及び炎症、及び免疫応答を含む、広範な種々の生物学的機
能において重要である。

【０００５】 Clarkに対する米国特許第５，５２１，１６８号は、眼内圧を下げるための２
−ＭＥ２の使用を開示する。２−ＭＥ２はさらに、エストロゲン誘発性下垂体腫
瘍新脈管形成を阻害し、Banerjee,S.K. et al., Proc. Amer. Assoc. Cancer Re
s. 39, March 1998に報告されたようにフィッシャー３４４ラットにおける腫瘍
増殖を抑制する。

【０００６】 現在、２−ＭＥ２の市販製剤は純度９８％未満であるか、又は医薬的使用に影
響を及ぼす望ましくないステロイド夾雑物を含有する。これらの製剤の重要な夾
雑物は、エストラジオール、４−ヒドロキシエストラジオール、４−メトキシエ
ストラジオール、２−ヒドロキシエストラジオール、エストロン、及び２−メト
キシエストロンである。現在入手可能な２−ＭＥ２製剤中に見出される、これら
の夾雑物の量は、医薬的用途にとって許容不可能である。

【０００７】 ヒトにおける２−ＭＥ２の任意の療法的使用は、高レベルの純度を有する２−
ＭＥ２を要する。一般に、治療薬は、夾雑物の負の副作用を回避するために実質
的に純粋であることを必要とされる。特に、２−ＭＥ２はエストラジオール及び
その他のエストロゲン性代謝物質により中和される作用を有するため、このよう
な夾雑物を実質的に含有しない２−ＭＥ２製剤を有することが極めて重要である
。エストラジオール、エストロン及び２−ヒドロキシエストラジオールの夾雑に
より観察され得る作用は、雌性化、子宮内膜増殖、子宮及び乳癌の危険性増大、
性的器官に及ぼす発生性作用、白血球産生の抑制、並びに造血細胞に及ぼす作用
のようなエストロゲン性作用を含む。４−ヒドロキシエストラジオール、４−メ
トキシエストラジオール及びエストラジオールは、既知の突然変異誘発物質及び
発ガン物質である。

【０００８】 したがって、必要とされるものは、９８％より高い純度であり、かつエストロ
ゲン性又は発癌性作用を有するエストラジオール又はその他のステロイドを実質
的に含有しない２−ＭＥ２の組成物である。

【０００９】 さらに必要とされるものは、純度が９９．５％より高い２−ＭＥ２を含有する
組成物である。

【００１０】 さらに必要とされるのは、純度が９８％より高く、エストロゲン性又は発癌性
作用を有するエストラジオール又はその他のステロイドを実質的に含有しない２
−ＭＥ２の製造方法である。

【００１１】 エストラジオール、関連分子、及びその他の夾雑物から２−ＭＥ２を実質的に
分離して、９９．５％より高い純度を有する２−ＭＥ２を生じる方法も必要とさ
れる。

【００１２】 ［発明の要旨］ 本発明は、９８％より高い純度、さらに好ましくは９９％より高い純度、最も
好ましくは９９．５％より高い純度を有する２−ＭＥ２を提供する。２−ＭＥ２
製剤は、好ましくは０．０３％未満のエストラジオール、０．０２％又はそれ以
下の２−ヒドロキシエストラジオール、０．０２％又はそれ以下の４−ヒドロキ
シエストラジオール、０．０２％又はそれ以下の４−メトキシエストラジオール
、及び０．０２％未満のエストロンを含有する。さらに好ましくは、２−ＭＥ２
製剤は、０．０１％又はそれ以下のエストラジオール、０．０２％又はそれ以下
の２−ヒドロキシエストラジオール、０．０１％又はそれ以下の４−ヒドロキシ
エストラジオール、０．０１％又はそれ以下の４−メトキシエストラジオール、
及び０．０１％又はそれ以下のエストロンを含有する。

【００１３】 本発明は、９８％より高い純度、さらに好ましくは９９％より高い純度、最も
好ましくは９９．５％より高い純度の２−ＭＥ２の生成方法も提供する。幾つか
の実施形態では、本方法は合成技法を包含する。他の実施形態では、本方法は、
他の化合物から２−ＭＥ２を分離するための精製技法を包含する。さらにその他
の実施形態では、本方法は、本明細書中に記載された合成技法及び精製技法の両
方を包含する。

【００１４】 精製技法は、他の化合物から２−ＭＥ２を分離するための液体−固体クロマト
グラフィー（ＬＳＣ）の使用を包含する。クロマトグラフィー媒質は、好ましく
はシリカである。溶媒系は、非極性溶媒、例えばクロロホルム、及び極性溶媒、
例えばメタノールを含む。

【００１５】 したがって本発明の目的は、９８％より高い純度を有する２−ＭＥ２を提供す
ることである。

【００１６】 本発明の別の目的は、エストラジオール、関連化合物、及びその他の望ましく
ない不純物を実質的に含有しない２−ＭＥ２を提供することである。

【００１７】 本発明のさらに別の目的は、合成技法により実質的に純粋な２−ＭＥ２を生成
する方法を提供することである。

【００１８】 本発明の別の目的は、精製技法により実質的に純粋な２−ＭＥ２を生成する方
法を提供することである。

【００１９】 本発明のその他の特徴及び利点は、その好ましい実施形態の以下の説明から明
らかになる。

【００２０】 ［本発明の詳細な説明］ 本発明は、９８．０％より高い、さらに好ましくは９９．０％より高い、最も
好ましくは９９．５％又はそれ以上の純度を有する２−メトキシエストラジオー
ルに向けられる。２−ＭＥ２は、高純度２−ＭＥ２を生成する本明細書中に記載
された合成方法又は精製方法により得られる。本明細書中に記載された合成方法
は、さらに高純度を有する２−ＭＥ２を生成するために本明細書中に記載される
精製方法によっても補足され得る。

【００２１】 「２−メトキシエストラジオール」という用語及び２−ＭＥ２は、本明細書中
で特定的に用いられるが、本明細書中に開示された方法は、限定されないが、エ
ストラジオール及びその他の構造的関連ステロイドのような他の化合物の合成又
は精製のために用いられ得る、と理解されるべきである。

【００２２】 ＜合成方法＞ 本発明は、９８．０％より高い、さらに好ましくは９９．０％より高い、最も
好ましくは９９．５％又はそれ以上の純度に２−ＭＥ２を合成する方法を提供す
る。本明細書中に記載された合成方法は、例えば４−メトキシエストラジオール
及び４−ヒドロキシエストラジオールのような、エストラジオールのその他の２
−及び４−誘導体又は類似体を合成するためにも、小修正で、用いられ得る。

【００２３】 ９８．０％より高い純度を有する２−ＭＥ２を調製するために採用され得るい
くつかの合成アプローチがある。あるいは、２−ＭＥ２は、９８．０％より高い
純度を有するために、以下の精製方法にしたがって精製され得る。これらの異な
る合成アプローチは、異なる出発物質及び中間物質を利用し、その結果、異なる
収率、副反応及び不純物が得られる。

【００２４】 ２つの同様のアプローチは、Rao, P.N. et al., Synthesis, 1977, 168及びCh
en, S-H et al., Steroids, 1986, 47, 63に教示されているように、出発物質と
してエストラジオールを用い、臭素化された中間物質を利用する。第一のアプロ
ーチは、図１２に説明されている。エストラジオールのフリーのヒドロキシル基
が保護基で保護される。広範囲な保護基が本発明に用いられる。これらの保護基
は、限定されないが、アルキル、アリール、アラルキル基、及び１つ又はそれ以
上のヘテロ原子を含有するアルキル、アリール、及びアラルキル基を含む。例え
ば、保護は、ベンジルブロミドのような、アルキルエーテルを生成するためのハ
ロゲン化アルキルを用いて成し遂げられ得る。ヒドロキシル保護のための適切な
条件は、ＮａＨ及びＴＢＡＩの存在下での、任意にジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）のような溶媒の存在下での、エストラジオールとハロゲン化アルキルの反応
を含む。保護されたエストラジオールは、次に、例えば酢酸の存在下で臭素と反
応させられる。臭素化中のフリーのヒドロキシルの保護は、高収率の２−臭素化
中間物質を生じる（保護基なしの場合の約２０％に対して約７０％）（Cushman,
M. et al., J. Med. Chem. 1997, 40, 2323参照）。

【００２５】 臭素は、次に、銅触媒を用いてメトキシド基に置き換えられる。例えば、臭素
化された中間物質は、ＣｕＩのような銅触媒の存在下でＮａＯＭｅと反応され得
る。反応は、好ましくはＤＭＦのような溶媒中で、任意に促進剤の存在下で実行
される。許容可能な促進剤は、限定されないが、ベンゾ−１５−クラウン−５の
ようなクラウンエーテルを含む。

【００２６】 例えば、アルキル部分の接触水素化による保護基の除去は、２−ＭＥ２を生じ
る。残念ながら、この合成経路は、メトキシル化段階から約１〜２％のエストラ
ジオールの不純物を生じる（水素化物は、メトキシドよりむしろ反応性銅錯体を
抑制する）。エストラジオールは、下記のようなクロマトグラフィーにより検出
できないレベルに除去され得るか、又はクロロホルム中での連続結晶化により著
しく低減される。

【００２７】 臭素化中間物質を利用し、かつ出発物質としてエストラジオールを用いる別の
合成方法は、図１３に説明されている。この合成反応では、エストラジオールは
ヒドロキシル基を最初に保護することなく環臭素化される。臭素は、次に、銅触
媒を用い上記と同様の方法でメトキシドに置換される。

【００２８】 別のアプローチでは、エストラジオール又はエストロンは、ニトロ／アミン中
間物質を利用する反応図における出発物質として用いられ得る（Cushman, M. et
al., J. Med. Chem. 1995, 38, 2041を参照）。これらの合成アプローチは、図
１４（エストラジオール出発物質）及び図１５（エストロン出発物質）に説明さ
れている。これらのアプローチでは、フリーのヒドロキシル基が保護される。こ
の保護は、例えばベンジルブロミドのような、アルキルエーテルを生成するため
のハロゲン化アルキルを用いて成し遂げられ得る。ヒドロキシル保護の適切な条
件は、ＮａＨ及びＴＢＡＩの存在下での、任意にジメチルホルムアミド（ＤＭＦ
）のような溶媒の存在下での出発物質とハロゲン化アルキルの反応を含む。

【００２９】 保護された出発物質は、次に、例えば、硝酸及び酢酸を用いて、又は硝酸及び
硫酸を用いてニトロ化され、対応する２−ニトロ生成物を生成する。ニトロ基は
、次に、還元される。選択的還元は、接触水素化、例えば、Ｐｄ／Ｃの存在下で
の水素化、により成し遂げられ、対応する２−アミンを生成する。接触還元は、
最適には１時間実行される。ザンドマイヤー条件（亜硝酸及びナトリウムメトキ
シド）を用いて、２−アミノ基は、２−メトキシ置換基に転換され得る。接触水
素化は、保護基を除去して、出発物質がエストラジオールの場合には２−ＭＥ２
を、出発物質がエストロンの場合には２−メトキシエストロンを生じる。ホウ水
素化ナトリウムによる２−メトキシエストロンの１７−ケト基の還元は、２−Ｍ
Ｅ２を生じる。

【００３０】 さらに別の方法は、出発物質としてエストラジオールを用い、そして臭素化中
間物質を利用する。この合成反応では、エストラジオールは、ヒドロキシル基を
初めに保護することなく環臭素化される。臭素化は、例えば、ＴＨＦのような溶
媒中で臭素及び酢酸を用いて成し遂げられる。この反応は、複数箇所が臭素化さ
れた種類を含む、環上の異なる部位での臭素化を生じる。２−ブロモ−エストラ
ジオールは、次に、例えば、クロマトグラフィー又は結晶化により他の臭素化中
間物質から単離することができ、その後、メトキシドで臭素を置換することがで
きる。臭素は、例えば、ＣｕＩのような銅触媒の存在下でナトリウムメトキシド
及びメタノールを用い、上記と同様の方法で、メトキシド基に置換され得る。あ
るいは、中間物質は、反応されて、対応するメトキシドを生成し、その後上記の
方法により２−メトキシエストラジオールが単離される。

【００３１】 ＜精製方法＞ 本発明は、９８．０％より高い、さらに好ましくは９９．０％より高い、最も
好ましくは９９．５％又はそれ以上の純度に２−ＭＥ２を精製する方法を提供す
る。２−ＭＥ２製剤は、好ましくは０．０３％未満のエストラジオール、０．０
２％又はそれ以下の２−ヒドロキシエストラジオール、０．０２％又はそれ以下
の４−ヒドロキシエストラジオール、０．０２％又はそれ以下の４−メトキシエ
ストラジオール、及び０．０２％未満のエストロンを含有する。最も好ましくは
、２−ＭＥ２製剤は、０．０１％又はそれ以下のエストラジオール、０．０２％
又はそれ以下の２−ヒドロキシエストラジオール、０．０１％又はそれ以下の４
−ヒドロキシエストラジオール、０．０１％又はそれ以下の４−メトキシエスト
ラジオール、及び０．０１％又はそれ以下のエストロンを含有する。

【００３２】 本発明の精製方法は、極性及び非極性溶媒を含む溶媒系を用いた、シリカのよ
うな吸着／分配媒質上での液体クロマトグラフィーを包含する。本明細書中に記
載した精製方法は、小さい修正を加えるだけで、例えば、４−メトキシエストラ
ジオール、４−ヒドロキシエストラジオール、２−ヒドロキシエストラジオール
、エストラジオール、エストロン、２−メトキシエストロン、及び４−メトキシ
エストロンのような、２−ＭＥ２と同様の化合物を精製するためにも用いられ得
る。

【００３３】 ＜試料＞ 精製される試料は、合成されるか又は生物学的供給源から得ることができる。
試料は、Sigma-Aldrich Chemicals(St. Louis, Missouri)、Rearch Plus, Inc.(
Bayonne, NJ)又はCalbiochem(San Diego, CA)により販売されているような２−
ＭＥ２市販製剤であってもよい。試料は、好ましくは少なくとも約５０％純粋、
より好ましくは約７５％純粋、さらにより好ましくは約９０％純粋、最も好まし
くは約９８％純粋である。試料は、本明細書中に記載された方法の前に、選択的
結晶化のような他の精製工程に付され得る。

【００３４】 試料は、好ましくは、さらに以下で説明されるように、負荷溶媒中で、溶解さ
れるか又は溶媒交換される。試料は、好ましくは約０．０１〜２ｇ／ｍｌ、好ま
しくは約０．０１〜１ｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約０．０５〜０．２ｇ／ｍｌ
の範囲の濃度である。

【００３５】 ＜クロマトグラフィー媒質＞ シリカは、好ましくはクロマトグラフィー媒質として用いられる。約７０〜４
００メッシュのシリカゲルが好ましく、最も好ましくはMerck及びその他の販売
元により供給されるような約７０〜２３０メッシュである。媒質は、バッチクロ
マトグラフィーにおいてバラで用いられ得るし、又はカラムに充填され得る。プ
レ充填カラム、例えばBiotage(Charlottesville, VA)により販売されているもの
も用いられ得る。媒質は、以下でさらに考察されるように、媒質への試料の適用
前に、適切な溶媒中で平衡されるべきである。

【００３６】 ＜カラム寸法＞ 本明細書中に記載したクロマトグラフィー法は、バッチ又はカラムクロマトグ
ラフィーを用いて成し遂げられ得る。バッチクロマトグラフィーでは、試料及び
クロマトグラフィー媒質は、２−ＭＥ２を媒質に保持させるのに十分な時間、容
器中で合わされる。媒質は、次に、好ましくは洗浄溶媒で洗浄される。溶出溶媒
は、次に、媒質に適用される。負荷、洗浄及び溶出段階後、溶媒は、例えば濾過
により媒質から除去される。

【００３７】 カラムクロマトグラフィーに関しては、適切な寸法を有するカラムにクロマト
グラフィー媒質が充填される。カラムは、適切な溶媒で平衡後、カラムの上部又
は入り口に試料を適用することにより、試料を負荷される。カラム直径に対する
試料容積の比は、最善の結果を得るためには、好ましくは約０．２〜３ｍｌ／ｃ
ｍ、さらに好ましくは約０．５〜１．５ｍｌ／ｃｍであるべきである。

【００３８】 ＜溶媒＞ メタノール（ＭｅＯＨ）のような極性溶媒、及びクロロホルム（ＣＨＣｌ₃）
のような非極性溶媒を含む溶媒系が用いられる。用いられ得るその他の極性溶媒
は、限定されないが、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、エチルアセテート、イソ
プロパノール、エタノール、プロパノール、及びそれらの組み合わせを含む。用
いられ得るその他の非極性溶媒は、限定されないが、ヘキサン、ジクロロメタン
、シクロヘキサン、ペンタン、及びそれらの組み合わせを含む。より具体的には
、用いられ得る溶媒系は、ＴＨＦ／ヘキサン、エチルアセテート／ヘキサン、イ
ソプロパノール／ヘキサン、エタノール／ＣＨＣｌ₃、プロパノール／ＣＨＣｌ₃ 、イソプロパノール／ＣＨＣｌ₃、及びそれらの組み合わせを含む。

【００３９】 試料は、極性溶媒中で可溶性である。多少量、一般的には約１０％、の極性溶
媒が、負荷溶媒中で試料を可溶性にさせるために必要とされる。一例として、負
荷溶媒は、約１０％までの極性溶媒及び約９０％の非極性溶媒を含む。

【００４０】 試料が媒質に負荷された後、媒質は、媒質から夾雑物を洗い落とすが２−ＭＥ
２を溶出しない洗浄溶媒で洗浄され得る。洗浄溶媒は、２−ＭＥ２が沈殿するの
を防止するのに十分であるが２−ＭＥ２を溶出するには十分でない極性溶媒を伴
う非極性溶媒を主として含む。

【００４１】 試料は、媒質から２−ＭＥ２を溶出するのに十分な極性溶媒を含有する溶出溶
媒で溶出される。溶出溶媒は、下記で説明するように、段階勾配として又は線形
勾配として適用され得る。

【００４２】 ＜カラム条件＞ 洗浄及び溶出溶媒は、段階勾配で、又は線形勾配でカラムに適用され得る。好
ましい実施形態では、溶媒は、極性溶媒の濃度を増加させる段階勾配を用いて適
用され得る。

【００４３】 カラムは、重力を用いて操作され得るか、又はカラムに液体を通させるポンプ
を用いて操作され得る。カラムが操作される速度は、カラムの容積及び寸法並び
にシリカゲル粒径に依存している。一般に、カラムは、約０．５〜５ｍｌ／分の
速度で操作され得る。

【００４４】 溶離液は、視覚的に監視され得るか、又は２−ＭＥ２の最大吸光度である約２
８８ｎｍの波長で、分光計を用いて監視され得、カラムから溶出する２−ＭＥ２
として収集され得る。

【００４５】 カラムは、圧力下で任意に操作され、かつ任意に加熱され得る。順相又は逆相
の分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、あるいは高速液体クロマトグ
ラフィー（ＦＰＬＣ）技法が用いられ得る。市販の分取クロマトグラフィー装置
、例えばBiotage(Charlottesville, VA)により販売されているものも用いられ得
る。カラム効率及び／又は速度を改良するためのその他の既知の方法も用いられ
得る。

【００４６】 ＜試料収集及び処理＞ 溶離液は、次に２−ＭＥ２含量及び純度に関して分析される分画として収集さ
れ得る。これらの分画は、次に２−ＭＥ２の所望の純度を達成するために併合さ
れ得る。分画は、Ｃ−１８カラム（Waters）及び３０：６９：１のアセトニトリ
ル：水：酢酸のアイソクラチック溶媒系を用いた逆相ＨＰＬＣを用いて、純度に
関して分析され得る。その他の系、例えばアイソクラチック溶媒系の代わりに溶
媒勾配を用いるもの、酢酸ではなくてトリフルオロ酢酸又はギ酸を用いるもの、
及びアセトニトリルでなくメタノールを用いるもの、が試料分析に使用され得る
。

【００４７】 代わりに、又は組み合わせて、溶離液は、リアルタイムで監視することができ
、カラムから所望純度の２−ＭＥ２が溶出したときに試料収集が開始され得る。

【００４８】 溶媒は、真空及び／又はその他の溶媒除去法の使用によりプール分画から除去
される。凍結乾燥法及びその他の蒸発法が用いられ得る。

【００４９】 ＜好ましい実施形態＞ 好ましい実施形態では、媒質は、カラムに充填されるシリカである。試料は、
２−ＭＥ２を溶解するのに十分なＭｅＯＨを伴う、一般にＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨ
が約９０：１０であるＣＨＣｌ₃及びＭｅＯＨの混合物中に溶解される。溶出条
件は、９９：１のＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨから９８：２のＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨまで
の段階勾配である。

【００５０】 本発明は、本発明の範囲の限定を強いる方向に解釈されるべきではない以下の
実施例によりさらに説明される。それどころか、本明細書を読めば、種々のその
他の実施形態、変形例、及び等価物を採ることができ、それらを、本発明の趣旨
及び／又は添付されたクレームの範囲から逸脱することなく当業者に示唆し得る
ことが明確に理解される。

【００５１】 ＜実施例１＞ 分析用ＨＰＬＣにより２−ＭＥ２の市販試料を分析して、ある種の夾雑物の全
て、即ちエストラジオール、４−ヒドロキシエストラジオール、４−メトキシエ
ストラジオール、２−ヒドロキシエストラジオール、エストロン及び２−メトキ
シエストロンの純度及び量を測定した。

【００５２】 これらの分析用ＨＰＬＣクロマトグラムは、Ｃ−１８カラム（Waters）及び溶
媒勾配（３０分間で２０→５０％アセトニトリル、５分間で５０→８０％アセト
ニトリル、１％酢酸、残余量の水）を用いる逆相ＨＰＬＣを使用して形成された
。２８８ｎｍの波長で溶離液を監視した。この系では、２−ＭＥ２は約２１．５
分で溶出し、エストラジオールは約２０．０分で溶出し、エストロンは約２３．
２分で溶出し、４−ヒドロキシエストラジオールは約１５．０分で溶出し、４−
メトキシエストラジオールは約２０．４分で溶出し、２−ヒドロキシエストラジ
オールは約１５．４分で溶出し、そして２−メトキシエストロンは約２４．４分
で溶出する。

【００５３】 Sigma-Aldrich Chemicals(St. Louis, Missouri)からの試料のクロマトグラム
を図１に示す。試料は９９．２％の全体純度を有するが、許容不可能な量である
約０．０３４％の夾雑エストラジオールを有する。図２は、図１のクロマトグラ
ムの拡大図である。

【００５４】 図３は、Rearch Plus, Inc.(Bayonne, NJ)から入手した試料のクロマトグラム
であり、２−ＭＥ２が９８．６％の純度を有することを示す。自動ピーク算定器
及び図４に示した拡大図は、本製剤が、この夾雑物の許容不可能な量である０．
０２４％のエストロンを含有することを示す。Rearch Plusから入手した二次バ
ッチ（９７．２％２−ＭＥ２）及びCalbiochem(San Diego,California)からの試
料（９１．８％２−ＭＥ２）を含む、試験されたその他の試料は、９８％未満の
２−ＭＥ２純度を示した。

【００５５】 下記の表１は、２−ＭＥ２のこれら市販試料の純度及び夾雑物、並びに本発明
の精製２−ＭＥ２を示す。

【００５６】

【表１】

【００５７】 ＜実施例２＞ 直径５５ｃｍ（高さ６０ｃｍ）のガラスカラムに、９０：１０のＣＨＣｌ₃：
ＭｅＯＨ中の６００ｇのシリカゲル（７０〜２３０メッシュ、Merck）を充填し
た。カラムを１リットルのＣＨＣｌ₃で洗浄し、カラムからＭｅＯＨを除去した
。

【００５８】 試料は、９０：１０のＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨ６０ｍｌ中の３．５gの２−ＭＥ２
であった。２−ＭＥ２は、PharmEco Labortories, Inc.(Lexington, MA)から入
手し、分析用ＨＰＬＣによる測定によれば純度９７．８％であった（図５）。１
０．９１７で溶出するピークはエストラジオール（２．２％）である。

【００５９】 Ｃ−１８カラム（Waters）及び３０：６９：１のアセトニトリル：水：酢酸の
、２−ＭＥ２及びエストラジオールの良好な分離を提供するアイソクラチック勾
配を用いた逆相ＨＰＬＣを用いて、出発物質、カラム分画及びそのプールされた
成分の分析用ＨＰＬＣを実施した。２８８ｎｍの波長で溶離液を監視した。

【００６０】 試料は、カラムの頂部に注がれ、カラム体積に入れられた。カラムは、１リッ
トルの９９：１のＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨで溶出され、次に１．５Ｌの９８：２の
ＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨで溶出された。各々５０ｍｌの分画を収集し、２−ＭＥ２
を含有する１５の分画を、上記の分析用アイソクラチックＨＰＬＣ系を用いて、
２−ＭＥ２純度に関して分析した。エストラジオール量を示さなかった９〜１０
分画を一緒にプールし、溶媒を蒸発させた。真空下で４時間乾燥後、３．２ｇの
黄色／白色結晶を、収率９１％で収集した。

【００６１】 上記のアイソクラチック技法を用いて、分析用ＨＰＬＣによりプールされた分
画の純度は９９．９８４％と測定された。そのＨＰＬＣクロマトグラムを図６〜
９に示す。図６は、非過剰負荷量の試料７５．６μｇ（５．４μｌ／ｍｌで１４
μｌ）を用いて得た。図７は図６のクロマトグラムの拡大図である。自動ピーク
検出器は、２−ＭＥ２を１００．０％であると算定したが、しかし、２−ＭＥ２
の前に溶出した、小さい未知の不純物ピークが拡大図で認められた。図８は、過
剰負荷量の試料２７０μｇ（５．４μｌ／ｍｌで５０μｌ）を用いて得た。図９
は図８のクロマトグラムの拡大図である。自動ピーク検出器は、２−ＭＥ２の前
及びエストラジオールの後に溶出し０．０１６％であると算定された、小さい未
知の不純物ピークと共に、２−ＭＥ２を純度９９．９８４％であると算定した。
図９に示した拡大図は、この不純物ピークをより明確に示し、２−ＭＥ２ピーク
が非常に滑らかであることを示す。

【００６２】 当該プールを、勾配（２５分間で２０→７０％アセトニトリル、１％酢酸、残
余量の水）を用いても分析した。４３．２μｇ（５．４μｌ／ｍｌ試料の８μｌ
）を注入した。クロマトグラムを図１０に示す。自動ピーク検出器は、２−ＭＥ
２を純度９９．８２５％であると算定した。しかしながら、ブランク実験で２９
．４５分で認められた人為的ピークを検討から除外すると、算定純度は９９．９
％である。図１１はこのクロマトグラムの拡大図である。１３．４３分での未知
の不純物は、０．０１２％であると算定された。エストラジオールが存在する場
合、それは未知純度と２−ＭＥ２ピークの間に溶出する。したがってエストラジ
オールが存在する場合には、それは未知のピークの量の１／３〜１／４以下で存
在し得る。したがって、エストラジオール量は、０．００４％以下であると概算
された。本製剤は、予測保持時間で任意の測定可能ピークの欠如について実証さ
れるように、０．０２％又はそれ以下の２−ヒドロキシエストラジオール、０．
０１％又はそれ以下の４−ヒドロキシエストラジオール、０．０１％又はそれ以
下の４−メトキシエストラジオール、及び０．０１％又はそれ以下のエストロン
を含有した。

【００６３】 精製試料は元素分析にもかけられ、その結果を表２に示す。

【００６４】

【表２】

【００６５】 上記の記載内容は説明のためのものであり、本発明を限定するものではない。
上記の記載内容を読めば、多数の実施形態が当業者には明らかになる。したがっ
て、本発明の範囲は、上記の説明に関して確定されるべきでなく、添付されたク
レーム、並びにこのようなクレームで表される等価物の全範囲に関して確定され
るべきである。特許、特許出願、及び公告を含めた全論文及び参考文献の開示内
容は、参照により本明細書中に援用される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 Sigma Chemical Companyから入手可能な２−メトキシエストラジオール（４５
Ｈ４０３３）の逆相ＨＰＬＣ分析からのクロマトグラムである。このグラフは、
Sigma社製品が約０．０３４％のエストラジオールを含有することを示す。

【図２】 エストラジオール不純物を示す図１のクロマトグラムの拡大図である。

【図３】 Research Plusから入手可能な２−メトキシエストラジオール（１０６９９）
の逆相ＨＰＬＣ分析からのクロマトグラムである。このグラフは、Research Plu
s社製品が約０．０２４％のエストロン及び約０．９３％のその他の望ましくな
いエストロゲンを含有することを示す。

【図４】 エストロン不純物を示す図３のクロマトグラムの拡大図である。

【図５】 本発明の実施例２における出発物質として用いられる非精製２−メトキシエス
トラジオールの逆相ＨＰＬＣ分析からのクロマトグラムである。

【図６】 実施例２において生成された本発明の２−ＭＥ２のクロマトグラムである。Ｈ
ＰＬＣは、非過剰負荷量の試料７５．６μｇ（５．４μｌ／ｍｌで１４μｌ）を
用いて実行した。

【図７】 図６のクロマトグラムの拡大図である。

【図８】 実施例２において生成された本発明の２−ＭＥ２のクロマトグラムである。Ｈ
ＰＬＣは、過剰負荷量の試料２７０μｇ（５．４μｌ／ｍｌで５０μｌ）を用い
て実行した。

【図９】 図８のクロマトグラムの拡大図である。

【図１０】 勾配（２５分間で２０→７０％アセトニトリル、１％酢酸、及び残余量の水）
を用いて分析された、実施例２からのプール分画のクロマトグラムである。４３
．２μｇ（５．４μｌ／ｍｌ試料の８μｌ）を注入した。

【図１１】 図１０のクロマトグラムの拡大図である。

【図１２】 出発物質としてエストラジオールを用い、臭素、クラウンエーテル、並びにエ
ストラジオールの３−及び１７−位置ヒドロキシル酸素原子上の保護基を用いた
、本発明の２−メトキシエストラジオールの生成に関する合成反応図を示す。

【図１３】 出発物質としてエストラジオールを用い、保護されていないエストラジオール
のＡ環の２−位置の臭素化、及びクラウンエーテルを用いた、本発明の２−メト
キシエストラジオールの生成に関する合成反応図を示す。

【図１４】 出発物質としてエストラジオールを用い、エストラジオールの３−及び１７−
位置ヒドロキシル酸素原子上の保護基、ニトロ化、及びザンドマイヤー反応を用
いた、本発明の２−メトキシエストラジオールの生成に関する合成反応図を示す
。

【図１５】 出発物質としてエストロンを用い、３−位置ヒドロキシル酸素原子上の保護基
、ニトロ化、及びザンドマイヤー反応を用いた、本発明の２−メトキシエストラ
ジオールの生成に関する合成反応図を示す。

【図１６】 出発物質としてエストラジオールを用い、保護されていないエストラジオール
のＡ環の２−位置の臭素化、及びメタノールとの反応を用いた、本発明の２−メ
トキシエストラジオールの生成に関する合成反応図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 15/00 Ａ６１Ｐ 15/00 15/08 15/08 17/02 17/02 19/02 19/02 27/02 27/02 29/00 29/00 35/00 35/00 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｂ 61/00 ３００ Ｃ０７Ｂ 61/00 ３００ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 シャー，ジャムシェッド エイチ． アメリカ合衆国 メリーランド 21045 コロンビア パウンド アップル コート 6443 Ｆターム(参考） 4C086 DA09 MA01 MA04 NA06 ZA36 ZA81 ZA96 ZB07 ZB11 ZB26 4C091 AA02 BB02 CC01 DD03 DD13 EE04 FF01 GG01 HH01 JJ01 LL01 MM03 NN01 PA02 PA09 QQ01 RR12 4H039 CA61 CD20

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ９９．５％より高い純度を有する２−メトキシエストラジオ
   ールを含む組成物。
2. 【請求項２】 ０．０３％未満のエストラジオール及び０．０２％未満のエ
   ストロンを含有する請求項１記載の組成物。
3. 【請求項３】 ０．０１％未満のエストラジオール及び０．０１％未満のエ
   ストロンを含有する請求項２記載の組成物。
4. 【請求項４】 さらに０．０２％未満の２−ヒドロキシエストラジオールを
   含有する請求項２記載の組成物。
5. 【請求項５】 さらに０．０２％未満の４−ヒドロキシエストラジオールを
   含有する請求項２記載の組成物。
6. 【請求項６】 さらに０．０２％未満の４−メトキシエストラジオールを含
   有する請求項２記載の組成物。
7. 【請求項７】 ０．０１％又はそれ以下のエストラジオール、０．０２％又
   はそれ以下の２−ヒドロキシエストラジオール、０．０１％又はそれ以下の４−
   ヒドロキシエストラジオール、０．０１％又はそれ以下の４−メトキシエストラ
   ジオール、及び０．０１％又はそれ以下のエストロンを含有する請求項１記載の
   組成物。
8. 【請求項８】 ９８．０％より高い純度を有し、かつ０．０３％未満のエス
   トラジオール及び０．０２％未満のエストロンを含有する２−メトキシエストラ
   ジオールを含む組成物。
9. 【請求項９】 ０．０１％未満のエストラジオール及び０．０１％未満のエ
   ストロンを含む請求項８記載の組成物。
10. 【請求項１０】 ０．０１％又はそれ以下のエストラジオール、０．０２％
    又はそれ以下の２−ヒドロキシエストラジオール、０．０１％又はそれ以下の４
    −ヒドロキシエストラジオール、０．０１％又はそれ以下の４−メトキシエスト
    ラジオール、及び０．０１％又はそれ以下のエストロンを含有する請求項８記載
    の組成物。
11. 【請求項１１】 前記２−メトキシエストラジオールは９９．０％より高い
    純度を有する請求項８記載の組成物。
12. 【請求項１２】 ０．０１％未満のエストラジオール及び０．０１％未満の
    エストロンを含有する請求項１１記載の組成物。
13. 【請求項１３】 ０．０１％又はそれ以下のエストラジオール、０．０２％
    又はそれ以下の２−ヒドロキシエストラジオール、０．０１％又はそれ以下の４
    −ヒドロキシエストラジオール、０．０１％又はそれ以下の４−メトキシエスト
    ラジオール、及び０．０１％又はそれ以下のエストロンを含有する請求項１１記
    載の組成物。
14. 【請求項１４】 ９８％より高い純度を有し、かつ０．０３％未満のエスト
    ラジオール及び０．０２％未満のエストロンを含有する２−メトキシエストラジ
    オールを生成するための２−メトキシエストラジオールの精製方法であって、 ２−メトキシエストラジオールを含む溶液をクロマトグラフィー媒質に付加す
    る工程と、 極性溶媒及び非極性溶媒を含む溶媒系を用いて前記媒質から２−メトキシエス
    トラジオールを溶出する工程と、 を含む方法。
15. 【請求項１５】 前記媒質はシリカであり、前記２−メトキシエストラジオ
    ールは９９：１のＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨから９８：２のＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨの段
    階勾配を用いて溶出される請求項１４記載の方法。
16. 【請求項１６】 ９８％より高い純度を有し、かつ０．０３％未満のエスト
    ラジオール及び０．０２％未満のエストロンを含有する２−メトキシエストラジ
    オールの生成方法であって、 エストラジオールの３−及び１７−ヒドロキシル基を保護する工程と、 保護されたエストラジオールを臭素及び酢酸と反応させてエストラジオールの
    ２−臭素化誘導体を生成する工程と、 エストラジオールの２−臭素化誘導体を銅触媒の存在下でナトリウムメトキシ
    ドと反応させる工程と、 ３−及び１７−ヒドロキシル基上の保護基を除去して２−メトキシエストラジ
    オールを生成する工程と、 極性及び非極性溶媒を含む溶媒系を用いた吸着／分配媒質上での液体クロマト
    グラフィーを用いて２−メトキシエストラジオールを精製する工程と、 を含む方法。
17. 【請求項１７】 ９８％より高い純度を有し、かつ０．０３％未満のエスト
    ラジオール及び０．０２％未満のエストロンを含有する２−メトキシエストラジ
    オールの生成方法であって、 酢酸の存在下でエストラジオールを臭素と反応させることによりエストラジオ
    ールを環臭素化して環臭素化中間物質を生成する工程と、 銅触媒の存在下で前記環臭素化中間物質をナトリウムメトキシドと反応させて
    ２−メトキシエストラジオールを生成する工程と、 極性及び非極性溶媒を含む溶媒系を用いた吸着／分配媒質上での液体クロマト
    グラフィーを用いて２−メトキシエストラジオールを精製する工程と、 を含む方法。
18. 【請求項１８】 ９８％より高い純度を有し、かつ０．０３％未満のエスト
    ラジオール及び０．０２％未満のエストロンを含有する２−メトキシエストラジ
    オールの生成方法であって、 エストラジオールの３−及び１７−ヒドロキシル基を保護する工程と、 保護されたエストラジオールを硝酸及び酢酸と反応させてエストラジオールの
    ２−ニトロ誘導体を生成する工程と、 エストラジオールの２−ニトロ誘導体を還元してエストラジオールの対応する
    ２−アミノ誘導体を生成する工程と、 ザンドマイヤー条件下でエストラジオールの２−アミノ誘導体を反応させて３
    −、１７−ヒドロキシル保護化２−メトキシエストラジオールを生成する工程と
    、 ３−及び１７−ヒドロキシル基上の保護基を除去して２−メトキシエストラジ
    オールを生成する工程と、 を含む方法。
19. 【請求項１９】 ９８％より高い純度を有し、かつ０．０３％未満のエスト
    ラジオール及び０．０２％未満のエストロンを含有する２−メトキシエストラジ
    オールの生成方法であって、 エストロンの３−ヒドロキシル基を保護する工程と、 保護されたエストロンを硝酸及び酢酸と反応させてエストロンの２−ニトロ誘
    導体を生成する工程と、 エストロンの２−ニトロ誘導体を還元してエストロンの対応する２−アミノ誘
    導体を生成する工程と、 ザンドマイヤー条件下でエストロンの２−アミノ誘導体を反応させて３−ヒド
    ロキシル保護化２−メトキシエストロンを生成する工程と、 ３−ヒドロキシル基上の保護基を除去して２−メトキシエストロンを生成する
    工程と、 ２−メトキシエストロンの１７−ケト基を還元して２−メトキシエストラジオ
    ールを生成する工程と、 を含む方法。
20. 【請求項２０】 ９８％より高い純度を有し、かつ０．０３％未満のエスト
    ラジオール及び０．０２％未満のエストロンを含有する２−メトキシエストラジ
    オールの生成方法であって、 酢酸の存在下でエストラジオールを臭素化して環臭素化エストラジオールの混
    合物を生成する工程と、 エストラジオールの混合物から２−ブロモエストラジオールを単離する工程と
    、 銅触媒の存在下で２−ブロモエストラジオールをナトリウムメトキシドと反応
    させて２−メトキシエストラジオールを生成する工程と、 を含む方法。
21. 【請求項２１】 ９８％より高い純度を有し、そして０．０３％未満のエス
    トラジオール及び０．０２％未満のエストロンを含有する２−メトキシエストラ
    ジオールであって、 エストラジオールの３−及び１７−ヒドロキシル基を保護する工程と、 保護されたエストラジオールを臭素及び酢酸と反応させてエストラジオールの
    ２−臭素化誘導体を生成する工程と、 エストラジオールの２−臭素化誘導体を銅触媒の存在下でナトリウムメトキシ
    ドと反応させる工程と、 ３−及び１７−ヒドロキシル基上の保護基を除去して２−メトキシエストラジ
    オールを生成する工程と、 極性及び非極性溶媒を含む溶媒系を用いた吸着／分配媒質上での液体クロマト
    グラフィーを用いて２−メトキシエストラジオールを精製する工程と、 を含む方法により生成される２−メトキシエストラジオール。
22. 【請求項２２】 ９８％より高い純度を有し、そして０．０３％未満のエス
    トラジオール及び０．０２％未満のエストロンを含有する２−メトキシエストラ
    ジオールであって、 酢酸の存在下でエストラジオールを臭素と反応させることによりエストラジオ
    ールを環臭素化して環臭素化中間物質を生成する工程と、 銅触媒の存在下で前記環臭素化中間物質をナトリウムメトキシドと反応させて
    ２−メトキシエストラジオールを生成する工程と、 極性及び非極性溶媒を含む溶媒系を用いた吸着／分配媒質上での液体クロマト
    グラフィーを用いて２−メトキシエストラジオールを精製する工程と、 を含む方法により生成される２−メトキシエストラジオール。
23. 【請求項２３】 ９８％より高い純度を有し、そして０．０３％未満のエス
    トラジオール及び０．０２％未満のエストロンを含有する２−メトキシエストラ
    ジオールであって、 エストラジオールの３−及び１７−ヒドロキシル基を保護する工程と、 保護されたエストラジオールを硝酸及び酢酸と反応させてエストラジオールの
    ２−ニトロ誘導体を生成する工程と、 エストラジオールの２−ニトロ誘導体を還元してエストラジオールの対応する
    ２−アミノ誘導体を生成する工程と、 ザンドマイヤー条件下でエストラジオールの２−アミノ誘導体を反応させて３
    −、１７−ヒドロキシル保護化２−メトキシエストラジオールを生成する工程と
    、 ３−及び１７−ヒドロキシル基上の保護基を除去して２−メトキシエストラジ
    オールを生成する工程と、 を含む方法により生成される２−メトキシエストラジオール。
24. 【請求項２４】 ９８％より高い純度を有し、そして０．０３％未満のエス
    トラジオール及び０．０２％未満のエストロンを含有する２−メトキシエストラ
    ジオールであって、 エストロンの３−ヒドロキシル基を保護する工程と、 保護されたエストロンを硝酸及び酢酸と反応させてエストロンの２−ニトロ誘
    導体を生成する工程と、 エストロンの２−ニトロ誘導体を還元してエストロンの対応する２−アミノ誘
    導体を生成する工程と、 ザンドマイヤー条件下でエストロンの２−アミノ誘導体を反応させて３−ヒド
    ロキシル保護化２−メトキシエストロンを生成する工程と、 ３−ヒドロキシル基上の保護基を除去して２−メトキシエストロンを生成する
    工程と、 ２−メトキシエストロンの１７−ケト基を還元して２−メトキシエストラジオ
    ールを生成する工程と、 を含む方法により生成される２−メトキシエストラジオール。
25. 【請求項２５】 ９８％より高い純度を有し、そして０．０３％未満のエス
    トラジオール及び０．０２％未満のエストロンを含有する２−メトキシエストラ
    ジオールであって、 酢酸の存在下でエストラジオールを臭素化して環臭素化エストラジオールの混
    合物を生成する工程と、 エストラジオールの混合物から２−ブロモエストラジオールを単離する工程と
    、 銅触媒の存在下で２−ブロモエストラジオールをナトリウムメトキシドと反応
    させて２−メトキシエストラジオールを生成する工程と、 を含む工程により生成される２−メトキシエストラジオール。