JP2003506046A - １−デオキシ−ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼおよび１−デオキシ−ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ活性の決定方法 - Google Patents

１−デオキシ−ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼおよび１−デオキシ−ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ活性の決定方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の１−デオキシ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼをコードするＤＮＡ、ならびに１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼおよび１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ活性のモジュレーターを同定する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、アラビドプシス［（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、シロイヌナズナ属
］１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼをコード
するＤＮＡ、ならびに１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイ
ソメラーゼ活性をもつ酵素および１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸
シンターゼ活性をもつ酵素のモジュレーターを同定する方法に関する。
【０００２】 望ましくない植生は除草剤を使用することによって防除することができる。除
草剤製造の要求は、常に、活性、コストおよび環境適合性に関して生じた。した
がって、新規な強力な除草剤に発展できる新規物質への要求が存在する。一般に
、温室試験においてそのような新規な先導構造物を探索するのが普通である。し
かしながら、そのような試験は労力を要し、そして費用がかかる。したがって、
温室において試験できる物質の数は限定される。
【０００３】 探索は、除草剤のための有利な作用部位を構成し、そして動物体においては存
在しない植物に特異的な生合成経路について進行中である。
【０００４】 近年、植物が、動物体において見いだせるメバロン酸生合成経路を利用せず、
微生物の１−デオキシ−キシルロース−５−リン酸生合成経路を利用して必須色
素体イソプレノイドを合成することが発見された（Ｌｉｃｈｔｅｎｔｈａｌｅｒ
，Ｋ，（１９９８），Ｆｅｔｔ／Ｌｉｐｉｄ １００，１２８−１３８；Ｅｉｓ
ｅｎｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ ５，Ｒ２２１−Ｒ２３３）。
【０００５】 この生合成経路は、最終的には、なかんずくカロテノイド：およびプラストキ
ノンおよびクロロフィルの側鎖の合成へと導く。これらの生産物は、植物の光合
成には必須である。この生合成経路の１段階の阻害は植物の成長の停止をもたら
す。
【０００６】 これが、１−デオキシ−キシルロース−５−リン酸生合成経路が、新規な除草
活性化合物の探索において特別な興味がある理由である。特に、２種の酵素１−
デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＰＳ）および１−デ
オキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＤＸＰＲ）は中
心的な重要性を有する。ＤＸＰＳ（ＣＬＡ Ｉ）は正常な植物の発育には必須で
あることが既に例証されている（Ｍａｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｐ
ｌａｎｔ Ｊ．９，６４９−６５８）。この発見は、ＤＸＰＳ活性に影響を及ぼ
す除草化合物が除草作用をもつという期待を支持する。また、細菌のＤＸＦＲが
既知の除草化合物ホスミドマイシンによって阻害されることが例証されている（
Ｚｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．５ ３ ，９８０−９８６；Ｋｕｚｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３９，７９１３−７９１６）。しかしながら、ＤＸ
ＰＳもしくはＤＸＰＲ活性に影響を及ぼす商業的に使用できる除草剤は存在して
いない。したがって、新規な改良された除草剤の探索では、両酵素は、作用部位
として高い重要性を有する。また、１−デオキシ−キシルロース−５−リン酸生
合成経路は、微生物、特に寄生微生物、例えば細菌もしくは変形体（ｐｌａｓｍ
ｏｄｉａ）において重要性を有する。感染性疾病の治療、特にマラリアの治療は
、この代謝経路の阻害に基づいている（Ｊｏｍａａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）
，Ｓｃｉｎｃｅ ２８５，１５７３−１５７６）。
【０００７】 今までは、酵素１−デオキシ−キシルロース−５−リン酸シンターゼの酵素活
性を簡単な試験システムで決定することは出来なかったが、その理由は、この反
応が吸光度において測定可能な変化をもたらさず、また色彩変化または蛍光変化
と平易な方式において共役させることができないからである（図１）。１−デオ
キシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼの酵素活性は、補助
基質ＮＡＤＰＨの光学的吸収における測定可能な変化をもたらす。しかしながら
、基質１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸は、合成することが非常に
困難である（図１）。１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸は、化学的
もしくは生化学的経路を介して作成出来るけれども、両方法とも費用を要し、そ
して高い処理量をもつ試験システムにおける使用には十分適合しない（Ｔａｙｌ
ｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３，２３７５−２
３７７；Ｂｌａｇｇ ａｎｄ Ｐｏｕｌｔｅｒ（１９９９），Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈ
ｅｍ．６４，１５０８−１５１１）。
【０００８】 本発明は、１つの試験システムに２種の酵素を組み合わせることによってこの
問題を解決する。アラビドプシス・タリアナ［（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈ ａｌｉａｎａ ）、シロイヌナズナ］の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リ
ン酸シンターゼ遺伝子は、名称ＣＬＡＩとして既に知られている（Ｍａｎｄｅｌ
ｅｔ ａｌ．（１９９６）、Ｐｌａｎｔ Ｊ．５，６４９−６５８）。１−デ
オキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ遺伝子は、メンタ
・ピペリタ（Ｍｅｎｔｈａ ｐｉｐｅｒｉｔａ）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．
（１９９８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．５，２１
００−２１０４）および種々の微生物由来がこれまで知られているだけである。
シロイヌナズナの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメ
ラーゼもまた記述されており、そしてアミノ酸配列のフラグメントが公表されて
いる（Ｌａｎｇｅ ｕｎｄ Ｃｒｏｔｅａｕ（１９９９）、Ａｒｃｈｉｖｅｓ
ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．３６５，１７０−１７４）。
２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトロール−４−リン酸を生成するピルビン酸およびグ
リセルアルデヒド−３−リン酸の組み合わせ反応は、ＮＡＤＰＨ消費を可視的に
検出することによってモニターされる（図１）。試験システムは、両酵素のモジ
ュレーター、すなわち酵素の活性を阻害するかまたは促進する物質を探索するの
に適しており、そして高い処理量をもつ試験シリーズ（高処理スクリーニング、
ＨＴＳ）のために使用することができる。ＨＴＳシステムにおける２種の酵素の
１つによるモジュレーターの検出後、２種の酵素のモジュレーターは、２種の酵
素の活性を測定する実在する方法を使用ことによって互いに区別することができ
る（Ｓｐｒｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４，１２８５７−１２８６２；Ｋｕｚｕｙａｍａ
ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３９，４５
０９−４５１２；ドイツ特許第１９７ ５２ ７００−Ａ１号）。
【０００９】 本発明は、アラビドプシスの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レ
ダクトイソメラーゼ、特にアラビドプシス・タリアナの１−デオキシ−Ｄ−キシ
ルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼをコードするＤＮＡ、および１−デ
オキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼの機能性サブユニ
ットをコードするこのＤＮＡのフラグメントに関する。
【００１０】 さらにまた、本発明は、配列番号：２または配列番号：６において示されるア
ミノ酸配列をもつアラビドプシスの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン
酸レダクトイソメラーゼをコードするＤＮＡに関する。
【００１１】 さらにまた、本発明は、シロイヌナズナの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−
５−リン酸レダクトイソメラーゼをコードする、配列番号：１または配列番号：
５において記述されるＤＮＡに関する。
【００１２】 さらにまた、本発明は、配列番号：１または配列番号：５において記述される
ＤＮＡに８０％、好ましくは９０％の相同性を示し、そして植物の１−デオキシ
−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼをコードするＤＮＡに関
する。
【００１３】 さらにまた、本発明は、シロイヌナズナの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−
５−リン酸レダクトイソメラーゼをコードするＤＮＡに相補的であるＤＮＡ、お
よびシロイヌナズナの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイ
ソメラーゼをコードするＤＮＡに相補的であるＲＮＡに関する。
【００１４】 さらにまた、本発明は、シロイヌナズナの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−
５−リン酸レダクトイソメラーゼをコードし、そして配列番号：１または配列番
号：５において記述されているＤＮＡを包含している発現構築物、およびこれに
機能的に結合されていて、そして１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸
レダクトイソメラーゼを発現させる配列に関する。
【００１５】 さらにまた、本発明は、シロイヌナズナの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−
５−リン酸レダクトイソメラーゼをコードし、そして／または配列番号：１また
は配列番号：５において記述されているＤＮＡを含有していて、そして１−デオ
キシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼを宿主細胞において
発現させるベクターに関する。
【００１６】 さらにまた、本発明は、上記ＤＮＡ、上記発現構築物、または１−デオキシ−
Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼを発現させるベクターを含
有している宿主細胞に関する。
【００１７】 さらにまた、本発明は、除草剤、抗生物質剤または抗マラリア剤としてのＤＸ
ＰＲおよび／またはＤＸＰＳモジュレーターの使用に関する。
【００１８】 また、本発明は、改良されるモジュレーターの化学的最適化および開発のため
の先導構造物としてのＤＸＰＲおよび／またはＤＸＰＳモジュレーターの使用に
関する。
【００１９】 また、本発明は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソ
メラーゼおよび１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼの活性
を決定する方法であって、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンタ
ーゼによって１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸を生成するためのピ
ルビン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸の変換と、１−デオキシ−Ｄ−
キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼによって２−Ｃ−メチル−Ｄ−
エリトロール−４−リン酸を生成するための得られる１−デオキシ−Ｄ−キシル
ロース−５−リン酸の変換とを１つの試験システムにおいて組み合わせることに
基づく方法に関する。
【００２０】 全体の反応経路、すなわち２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトロール−４−リン酸へ
の、ピルビン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸の変換は、１−デオキシ
−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼのコファクターＮＡＤＰ
Ｈにおける減少による光学的変化に関してモニターされる。
【００２１】 また、本発明は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソ
メラーゼまたは１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼの活性
を改変する物質の同定方法に関していて、この方法では、１−デオキシ−Ｄ−キ
シルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼおよび１−デオキシ−Ｄ−キシル
ロース−５−リン酸シンターゼの活性を決定するための上記試験システムが使用
される。試験システムは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトロール−４−リン酸を生
成するためのピルビン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸の最適な変換が
確保されるように最適化される。反応は、関与する酵素の１つの活性を改変する
物質の存在および不在下で実施することができる。かくして、ＮＡＤＰＨ消費に
関してそのような物質の存在および不在下での反応の比較が、１−デオキシ−Ｄ
−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼおよび／または１−デオキシ
−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼの活性をモジュレートする、好まし
くは阻害する物質の同定を可能にさせる。
【００２２】 また、本発明は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソ
メラーゼを阻害することが既に知られているホスミドマイシン（Ｚｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．５３，９８０−９
８６）を除いて、上記方法によって見いだされる物質に関する。
【００２３】 また、本発明は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソ
メラーゼおよび／または１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンター
ゼの酵素活性のモジュレーター、好ましくは阻害剤として使用するための、上記
方法によって見いだされる物質の使用に関する。
【００２４】 また、本発明は、除草剤、抗生物質剤または抗マラリア剤として使用するため
の、上記方法によって見いだされる物質の使用に関する。
【００２５】 用語「機能性フラグメント」は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン
酸レダクトイソメラーゼ活性をなおもっているポリペプチド、またはこの活性を
なおもっている１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラ
ーゼのフラグメントをコードするそれらのＤＮＡフラグメントを述べている。
ＤＮＡに関して用語「相同性」は、ＤＮＡに相補的である少なくとも１５塩基対
の長さまたは鎖であるＤＮＡセグメントが、ヌクレオチドの少なくとも８０％、
好ましくは９０％において、対応するＤＮＡに合致することを意味する。そのよ
うな相同性は、中でも、ＧＣＧプログラムのようなコンピュータープログラムに
よって決定される（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９８３），Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，３８７−３９５）。
【００２６】 「相同性」は、ＤＮＡセグメントが問題のＤＮＡ鎖またはその相補鎖とハイブ
リダイズすることができる場合にまた存在する。
【００２７】 用語「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイゼーション』は、一本鎖核
酸分子が相補的ＤＮＡ鎖と塩基対合を受ける過程を記し、この場合、一本鎖核酸
分子の能力はハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。
【００２８】 用語「ストリンジェンシー」はハイブリダイゼーション条件に関する。「高ス
トリンジェンシー」は塩基対合を困難にさせる。これを行うには、４２℃以下の
高温、２０％未満のホルムアミド濃度および低塩（ＳＳＣ）濃度が使用される。
あるいはまた、低塩濃度（ＳＳＰＥ）と組み合わせて６５℃以下の温度が使用さ
れてもよい。「低ストリンジェンシー」条件は塩基対の形成に好ましい。ここで
使用される温度は３７℃以下であり、ホルムアミド濃度は５０％未満、そして塩
濃度（ＳＳＣ）は中等度である。あるいはまた、高塩濃度（ＳＳＰＥ）までの媒
質と組み合わせて温度５０℃以下が使用される。
【００２９】 用語「相補的」は、水素結合を介して互いに塩基対を形成するプリンおよびピ
リミジンヌクレオチドの能力に関する。相補的塩基対は、中でも、グアニンとシ
トシン、アデニンとチミン、およびアデニンとウラシルである。
【００３０】 用語「プラスミド」は、染色体外の遺伝要素に関する。本発明のために使用さ
れる本来のプラスミドは、市販のものを入手しても自由に得てもよく、またはそ
のようなプラスミドから既知の方法によって誘導されてもよい。
【００３１】 用語「ベクター」は、宿主細胞中に外因性ＤＮＡを導入するために使用される
ＤＮＡ要素を述べている。ベクターは１個以上のポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列を含有する。
【００３２】 当業者は、縮重遺伝コード（すなわち、６４コードンが２０アミノ酸をコード
する）が、それによってコードされているタンパク質生産物の同一性を変えるこ
となく、ここに示される配列中に導入されるヌクレオチド塩基対の多数の「サイ
レント」置換を可能にさせることを理解している。本発明の範囲は、すべてのそ
のような置換を包含する。
【００３３】 ＤＮＡの単離 ここに述べれれる核酸は、完全な細胞において、細胞溶解物において、部分精
製形態において、または生物学的に純粋な形態において、すなわち、他の細胞成
分または化学的ＤＮＡ合成の場合の化学的前駆物質および副生物が除去された形
態において存在することができる。
【００３４】 ここに述べられるＤＮＡは、一連の遺伝的および組み換えＤＮＡ技術、例えば
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる増幅によるか、あるいはまたはド・ノ
ボＤＮＡ合成によって得ることができる。ここに述べられるＤＮＡは、配列番号
：１または配列番号：５の適当な領域に対向されるオリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いて、適当な植物細胞由来のゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅手段によって単離
することができる（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅ
ｒ １４、参照）。
【００３５】 タンパク質の取得および精製 本発明はまた、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメ
ラーゼ活性をもち、そして上記ＤＮＡによってコードされているポリペプチドに
関する。
【００３６】 熟達した研究者は、本発明のポリペプチドが、種々の経路によって、例えば固
相法のような化学的方法によって得られることを知っている。大量のタンパク質
を得るために、組み換え方法の使用が推奨される。クローン化された１−デオキ
シ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ遺伝子またはそのフラ
グメントの発現は、当業者には既知である一連の適当な宿主細胞において起こす
ことができる。この最後に、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダ
クトイソメラーゼ遺伝子が、既知の方法によって宿主細胞中に導入される。
【００３７】 宿主細胞の染色体におけるクローン化された１−デオキシ−Ｄ−キシルロース
−５−リン酸レダクトイソメラーゼ遺伝子の組み込みは、本発明の範囲内である
。好ましくは、遺伝子またはそのフラグメントがプラスミド中に挿入され、そし
て１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ遺伝子ま
たはそのフラグメントのコーディング領域が、構成または誘導プロモーターに機
能的に結合される。
【００３８】 組み換え１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ
を作成するための基礎的段階は次のとおりである： １． １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼをコ
ードする天然、合成または半合成ＤＮＡを取得すること。 ２． それ自体でも、また融合タンパク質としても、１−デオキシ−Ｄ−キシル
ロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼを発現するために適当である発現ベク
ター中へこのＤＮＡを導入すること。 ３． この発現ベクターによる、適当な宿主細胞、好ましくは原核生物の宿主細
胞の形質転換。 ４． １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼを発
現するために適当である方式でこの形質転換された宿主細胞の増殖。 ５． 細胞を収穫し、そして適当な既知の方法によって１−デオキシ−Ｄ−キシ
ルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼの精製すること。
【００３９】 １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼおよび１
−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼのコーディング領域は、
別々でも一緒でも、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において慣用の方法によって発現す
ることができる。大腸菌の適当な発現系は、市販品、例えば、ｐＥＴシリーズの
発現ベクター、例えばｐＥＴ３ａ，ｐＥＴ２３ａ，ｈｉｓタグをもつｐＥＴ２８
ａまたは簡単な精製のためのｈｉｓタグと発現された酵素の溶解性を改良するた
めのチオレドキシン融合物をもつｐＥＴ３２ａ、およびグルタチオンシンテター
ゼ融合物をもつｐＧＥＸの発現ベクターである。発現ベクターは、ＸＤＥ３溶原
性大腸菌の菌株、例えばＢＬ２１（ＤＥ３），ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）またはＡ
Ｄ４９４（ＤＥ３）中にトランスフォームされる。細胞が付着性（ａｔｔａｃｈ
ｅｄ）になった後、熟達した研究者には周知の標準条件下で発現がＩＰＴＧを用
いて誘導される。細胞の誘導後、培養が温度１８〜３７℃で３〜２４時間実施さ
れる。細胞は、破壊バッファー（１０〜２００ｍＭリン酸ナトリウム、１００〜
５００ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ５〜８）中で音波処理によって破壊される。発現され
たタンパク質がクロマトグラフィー法によって、ｈｉｓタグをもって発現された
タンパク質の場合にはＮｉ−ＮＴＡカラムにおけるクロマトグラフィーによって
精製することができる。
【００４０】 現在の知識によれば、１−デオキシ−キシルロース−５−リン酸経路は、動物
および酵母においては存在しないので、市販される酵母菌株（例えばピヒア・パ
ストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ））または昆虫細胞培養物（例えば
Ｓｆ９細胞）におけるタンパク質の発現は、その他の好ましい選択肢である。
【００４１】 あるいはまた、タンパク質は植物において発現されてもよい。
【００４２】 １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼおよび／ または１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ活性の決定、お よび両酵素の酵素活性のモジュレーターの同定 除草的に活性な物質を同定および開発するために、１−デオキシ−Ｄ−キシル
ロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼおよび１−デオキシ−Ｄ−キシルロー
ス−５−リン酸シンターゼ活性に及ぼす種々の候補物質の効果を決定する方法を
見い出すことが必要である。
【００４３】 １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼおよび／
または１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼの酵素反応に及
ぼす物質の効果を決定する１つの方法は、精製された１−デオキシ−Ｄ−キシル
ロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼおよび１−デオキシ−Ｄ−キシルロー
ス−５−リン酸シンターゼ、または１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン
酸レダクトイソメラーゼ活性をもつフラグメントおよび１−デオキシ−Ｄ−キシ
ルロース−５−リン酸シンターゼ活性をもつフラグメントを、試験物質と接触さ
せ、そして両酵素の活性をチェックすることである。
【００４４】 本発明によれば、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソ
メラーゼおよび１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ活性は
、両１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼおよび
１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼを含有する組み合わせ
試験システムにおいて決定される。この試験システムでは、１−デオキシ−Ｄ−
キシルロース−５−リン酸シンターゼが、ピルビン酸およびグリセルアルデヒド
−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸に変換し、これが
直接１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼによっ
てＮＡＤＰＨの消費とともに２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトロール−４−リン酸に
変換される。ＮＡＤＰＨ濃度における減少は、光学的測定法によってモニターす
ることができる（図１）。
【００４５】 １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼおよび／
または１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ活性をモジュレ
ート、好ましくは阻害する物質を試験するために、試験システムおよび酵素濃度
は、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトロール−４−リン酸を生成すべきピルビン酸お
よびグリセルアルデヒド−３−リン酸の最適な変換が確保されるように設計され
る。関与する酵素の１つが候補物質によって阻害または活性化される場合は、こ
れは、ＮＡＤＰＨ変換における低下または増強によって検出できる。
【００４６】 次に、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼま
たは１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼについての別々の
活性試験が、２つの酵素のどちらが、見い出された物質によってその活性におい
て影響されるかを決定するために、既知の方式において実施されてもよい。
【００４７】 既知の別々の活性試験に対する選択として、ＨＰＬＣは、材料ピルビン酸およ
びグリセルアルデヒド−３−リン酸から出発して生成物または中間体のどちらが
形成されたかを、合わされた活性試験から出発して決定することを可能にさせる
。１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸が見いだされ、２−Ｃ−メチル
−Ｄ−エリトロール−４−リン酸が見いだされない場合は、阻害されたのはＤＸ
ＰＲであった。１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸もまた見いだされ
ない場合は、ＤＸＰＳが（また）阻害された。
【００４８】 実施例１ シロイヌナズナの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼを 発現するためのベクターの構築 位置＋１〜＋２１５４のシロイヌナズナＣＬＡ１遺伝子のコーディング配列が
、次の配列番号：３および配列番号：４において示される配列のプライマーを用
いてＰＣＲ技術によって増幅された（Ｍａｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９６）
ＣＬＡ１，ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｃｈｌｏｒｏｐ
ｌａｓｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｉｓ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ
ｉｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ；Ｐｌａｎｔ Ｊ．５，６４９−６５８；Ｌａｎｇ
ｅ Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｔｒａｎｓｋｅｔ
ｏｌａｓｅｓ ｔｈａｔ ｄｉｒｅｃｔｓ ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ ｖｉａ ａ ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ｐａｔｈｗａｙ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．５，
２１００−２１０４）。
【００４９】 使用されたテンプレートは、４週令実生苗からのシロイヌナズナ一本鎖ｃＤＮ
Ａであった。
【００５０】 シロイヌナズナＤＸＰＳのコーディング配列を保持する増幅されたフラグメン
トが、次いで、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを用いて切断された。得られ
るＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ−ＤＸＰＳフラグメントは、線状にされ、そして脱リン
酸された細菌発現ベクターｐＥＴ３２ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に連結された
。得られる構築物ｐＥＴ３２−ＤＸＰＳは、細菌チオレドキシン遺伝子のフラグ
メントとともに読み枠内にコーディングＤＸＰＳ配列を含有する。
【００５１】 実施例２ シロイヌナズナの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソ メラーゼを発現するためのベクターの構築 シロイヌナズナの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソ
メラーゼのコーディング配列が、配列番号：３および配列番号：４において示さ
れる配列をもつプライマーを用いてＰＣＲ技術によって増幅された。増幅された
フラグメントは、次いで、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを
用いて切断された。得られるＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ−ＤＸＲフラグメントは、線
状にされ、そして脱リン酸された細菌発現ベクターｐＥＴ３２ａ（＋）（Ｎｏｖ
ａｇｅｎ）に連結された。得られる構築物ｐＥＴ３２−ＤＸＲにおいて、コーデ
ィングＤＸＲ配列は、細菌チオレドキシン遺伝子のフラグメントとともに読み枠
内に存在する。
【００５２】 実施例３ ＨＴＳにおいて１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメ ラーゼおよび／または１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ モジュレーターを同定するための試験システム ミクロタイタープレート（９６穴形式）が、サイアミン二リン酸（０．１−１
０ｍＭ）およびＭｇ2Ｃｌ2（０．５−５０ｍＭ）を含有する慣用のバッファー（
１０−２００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ５−８）中１−デオキシ−Ｄ−キシルロ
ース−５−リン酸シンターゼ（精製酵素０．１−１０μｇ／１００μｌ）および
１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ（精製酵素
０．１−１０μｇ／１００μｌ）ならびに補助基質ＮＡＤＰＨ（０．１−１０ｍ
Ｍ）の溶液を用いて満たされる。すべての濃度（また、さらに以下に与えられる
）は全アッセイ成分の添加後の濃度に基づく。候補化学物質、または対照として
のバッファーが、ミクロタイタープレートの各穴にピペットで添加される。慣用
のバッファー（上記のとおりであるが、ＮＡＤＰＨ不含およびサイアミン二リン
酸不含）中基質ピルビン酸（１−１００ｍＭ）およびグリセルアルデヒド−３−
リン酸（１−１００ｍＭ）の添加後、容易に測定できる３４０ｎｍにおけるＮＡ
ＤＰＨの光学濃度における低下が達せられるまで、プレートは１８℃〜４５℃で
インキュベートされる。次いで、光学濃度が慣用のミクロタイタープレートリー
ダーにおいて読み取られる。関与している２種の酵素の１つを阻害する物質は、
光学濃度測定によってＮＡＤＰＨ濃度の低下の減少によって同定される。
【００５３】 比較的大きい密度のミクロタイタープレート（３８４ウエル、１５３６ウエル
等）では、前記容量はシステムに適するように適応させられる。
【００５４】 図および配列データの説明 図１は、酵素１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼおよび
１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼによって触
媒される、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸を介するピルビン酸お
よびグリセルアルデヒド−３−リン酸の２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトロール−４
−リン酸を生成する変換を示す。１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸
レダクトイソメラーゼによって触媒される反応は、コファクターとしてＮＡＤＰ
Ｈを必要とする。触媒される反応は、植物におけるイソプレノイド合成には必須
である。
【００５５】 配列番号：１ シロイヌナズナの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソ
メラーゼをコードするＤＮＡ配列。示される他の配列はＤＮＡによってコードさ
れているアミノ酸配列である。
【００５６】 配列番号：２ ４７７アミノ酸をもつシロイヌナズナの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５
−リン酸レダクトイソメラーゼのアミノ酸配列。
【００５７】 配列番号：３ ＢａｍＨＩクローニング部位のためのヌクレオチドを含む、ＰＣＲ技術によっ
てシロイヌナズナＣＬＡＩ遺伝子を増幅するためのシロイヌナズナＣＬＡＩ遺伝
子のコーディング配列から誘導されたオリゴヌクレオチド。
【００５８】 配列番号：４ ＮｏｔＩクローニング部位のためのヌクレオチドを含む、ＰＣＲ技術によって
シロイヌナズナＣＬＡＩ遺伝子を増幅するためのシロイヌナズナＣＬＡＩ遺伝子
のコーディング配列から誘導されたオリゴヌクレオチド。
【００５９】 配列番号：５ シロイヌナズナの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソ
メラーゼをコードするその他のコーディング配列。ヌクレオチド８９０−８９２
における変化。示される他の配列はＤＮＡによってコードされているアミノ酸配
列である。
【００６０】 配列番号：６ ４７７アミノ酸をもつシロイヌナズナの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５
−リン酸レダクトイソメラーゼのその他のアミノ酸配列。アミノ酸２９２におけ
る変化。
【００６１】 配列番号：７ ＰＣＲ技術によってシロイヌナズナの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−
リン酸レダクトイソメラーゼ遺伝子を増幅するためのシロイヌナズナの１−デオ
キシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ遺伝子のコーディン
グ配列から誘導されたオリゴヌクレオチド。
【００６２】 配列番号：８ ＰＣＲ技術によってシロイヌナズナの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−
リン酸レダクトイソメラーゼ遺伝子を増幅するためのシロイヌナズナの１−デオ
キシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ遺伝子のコーディン
グ配列から誘導されたオリゴヌクレオチド。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/25 ４Ｃ０８４ 1/21 1/533 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 9/90 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/25 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/533 5/00 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 37/58 33/50 37/48 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ハイン，リユデイガー ドイツ・デー−40764ランゲンフエルト・ タルシユトラーセ53アー (72)発明者 テイートエン，クラウス−ギユンター ドイツ・デー−40764ランゲンフエルト・ アムアルテンブロイヒ98 (72)発明者 ブツシユ，マルコ ドイツ・デー−51399ブルシヤイト・ベニ ングハウゼン59べー (72)発明者 マーテイン，ウイリアム・エフ ドイツ・デー−41469ノイス・リルケシユ トラーセ13 (72)発明者 クレテイ，アンドレアス・エス アメリカ合衆国ノースカロライナ州27713 ダーハム・フオレストクリークドライブ６ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 FB01 4B024 AA01 AA07 BA07 CA04 CA11 HA03 4B050 CC03 DD09 LL01 LL03 4B063 QA01 QA18 QQ64 QQ95 QR19 QR20 QX01 4B065 AB01 BA02 CA34 CA47 4C084 AA02 BA44 DC01 DC27 DC29 MA02 NA20 ZB382

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の１−デオキシ
    −Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼまたはその機能性フラグ
    メントをコードするＤＮＡ。
  2. 【請求項２】 ＤＮＡが、配列番号：２または配列番号：６において示され
    るアミノ酸配列の全部または機能性フラグメントをコードすることを特徴とする
    、請求項１記載のＤＮＡ。
  3. 【請求項３】 ＤＮＡが、アラビドプシス・タリアナ［Ａｒａｂｉｄｏｐｓ
    ｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ：シロイヌナズナ］の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース
    −５−リン酸レダクトイソメラーゼをコードすることを特徴とする、請求項１も
    しくは２記載のＤＮＡ。
  4. 【請求項４】 配列番号：１、配列番号：５において示される配列またはそ
    のフラグメントをもつ請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ。
  5. 【請求項５】 配列番号：１または配列番号：５において示される配列に対
    するＤＮＡの相同性が少なくとも８０％であることを特徴とする、ＤＮＡ。
  6. 【請求項６】 配列番号：１または配列番号：５において示される配列に対
    するＤＮＡの相同性が少なくとも９０％であることを特徴とする、請求項５記載
    のＤＮＡ。
  7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれかに記載のＤＮＡに相補的であること
    を特徴とする、ＤＮＡ。
  8. 【請求項８】 請求項１〜６のいずれかに記載のＤＮＡに相補的であること
    を特徴とする、ＲＮＡ。
  9. 【請求項９】 請求項１〜６のいずれかに記載のＤＮＡおよびこれに機能的
    に結合されていて、そして該ＤＮＡの発現を可能にする配列を包含していること
    を特徴とする、発現構築物。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜７および９のいずれかに記載のＤＮＡを含有し
    ていることを特徴とする、ベクター。
  11. 【請求項１１】 請求項１〜７のいずれかに記載のＤＮＡ、請求項９記載の
    発現構築物または請求項１０記載のベクターを含有する宿主細胞。
  12. 【請求項１２】 除草剤、抗生物質剤または抗マラリア剤としての１−デオ
    キシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼおよび／または１−
    デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼモジュレーターの使用。
  13. 【請求項１３】 （ａ）ピルビン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸
    が、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼによって１−デオ
    キシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸に変換され、そして （ｂ）得られる１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸が、１−デオキシ
    −Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼによって２−Ｃ−メチル
    −Ｄ−エリトロール−４−リン酸に変換されることを特徴とする、 １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼおよび／ま
    たは１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼの活性を決定する
    方法。
  14. 【請求項１４】 １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸の２−Ｃ−
    メチル−Ｄ−エリトロール−４−リン酸への変換が、この変換の間に消費される
    ＮＡＤＰＨに関して測定されることを特徴とする、請求項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイ
    ソメラーゼ活性が決定されることを特徴とする、請求項１３または１４記載の方
    法。
  16. 【請求項１６】 １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ
    活性が決定されることを特徴とする、請求項１３または１４記載の方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法を試験物質の存
    在および不在下で実施し、そして各場合に見いだされる活性を相互に比較するこ
    とを特徴とする、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメ
    ラーゼおよび／または１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ
    の活性を改変する物質の同定方法。
  18. 【請求項１８】 ホスミドマイシンを除いて、請求項１７記載の方法によっ
    て同定される物質。
  19. 【請求項１９】 １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイ
    ソメラーゼおよび／または１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンタ
    ーゼの酵素活性のモジュレーターとしての、請求項１７記載の方法によって同定
    される物質の使用。
  20. 【請求項２０】 除草剤、抗生物質剤または抗マラリア剤としての、請求項
    １８記載の方法によって同定される物質の使用。
  21. 【請求項２１】 配列番号：２または配列番号：６によって表されるポリペ
    プチド。
JP2001514133A 1999-07-30 2000-07-21 １−デオキシ−ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼおよび１−デオキシ−ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ活性の決定方法 Pending JP2003506046A (ja)

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DE19935967A DE19935967A1 (de) 1999-07-30 1999-07-30 Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von 1-Desoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Reduktionsomerase und 1-Desoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Synthase
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