JP2003504060A - Human LIM domain protein - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 本発明は、ヒトLIMドメインタンパク質(LIMD)と、LIMDを同定しコードするポリヌクレオチドとを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニスト及びアンタゴニストを提供する。更に、本発明は、LIMDの発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法も提供する。 (57) Abstract The present invention provides human LIM domain proteins (LIMDs) and polynucleotides that identify and encode LIMDs. The present invention also provides expression vectors, host cells, antibodies, agonists and antagonists. Further, the present invention also provides a method for diagnosing, treating or preventing a disease associated with the expression of LIMD.
Description
【0001】
(技術分野)
本発明は、ヒトLIMドメインタンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列に関し、
細胞増殖異常、発達障害及び細胞運動異常の診断、治療並びに予防におけるこれ
らの配列の利用に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a nucleic acid sequence and amino acid sequence of human LIM domain protein,
It relates to the use of these sequences in the diagnosis, treatment and prevention of cell proliferation disorders, developmental disorders and cell motility disorders.
【0002】
(発明の背景)
LIMドメインは、2つのループ構造を形成する約60アミノ酸残基の多システ
インモチーフであり、各ループ構造が亜鉛イオンと結合している(Sanchez-Garc
ia, I. and T. H. Rabbitts (1994) Trends Genet. 10:315-320、Dawid, I. B.
ら (1998) Trends Genet. 14:156-162にレビューされている)。LIMドメイン二
重Znフィンガー構造はGATAのZnフィンガー転写因子に類似しているが、LIMドメ
インがDNAに結合するという直接的な証拠は見つかっていない。その代わり、LIM
ドメインは、SH2、SH3、PDZ及びその他のドメインに類似であって多タンパク質
シグナル伝達複合体の構築を仲介するようなタンパク質相互作用モジュールとし
て機能するようにみえる(Pawson, T. and I. D. Scott (1997) Science 278:20
75-2080)。LIMドメインは、転写因子、細胞骨格タンパク質及びシグナル伝達分
子を含む多様なタンパク質中で同定されてきた。LIMタンパク質は、細胞運命の
決定、成長の調節及び腫瘍形成に関与している。LIMファミリーの60以上のメ
ンバーについて記述がなされており、LIMタンパク質は多様な種で見つかってい
る。BACKGROUND OF THE INVENTION The LIM domain is a multi-cysteine motif of about 60 amino acid residues that forms two loop structures, each loop structure bound to a zinc ion (Sanchez-Garc).
ia, I. and TH Rabbitts (1994) Trends Genet. 10: 315-320, Dawid, IB
(1998) Trends Genet. 14: 156-162). The LIM domain dual Zn finger structure is similar to the GATA Zn finger transcription factor, but no direct evidence for binding of the LIM domain to DNA has been found. Instead, LIM
Domains appear to function as protein interaction modules that are similar to SH2, SH3, PDZ and other domains and mediate the assembly of multiprotein signaling complexes (Pawson, T. and ID Scott (1997 ) Science 278: 20
75-2080). LIM domains have been identified in a variety of proteins including transcription factors, cytoskeletal proteins and signaling molecules. LIM proteins are involved in cell fate determination, growth regulation and tumorigenesis. More than 60 members of the LIM family have been described and LIM proteins have been found in diverse species.
【0003】
LIMタンパク質は、LIMドメインの相同性及びその他の構造的特徴に基づき3つ
の群に分類されてきた(前出のDawid)。1群LIMドメインタンパク質は、以下の
3つのタンパク質ファミリーに分類される。1つはLMOタンパク質であり、2つ
のタンデム型LIMドメインしか含まない。2つ目はLHXタンパク質であり、ホメオ
ドメインに続き2つのタンデム型LIMドメインを含む。3つ目はLIMKタンパク質
であり、タンパク質キナーゼドメインに続き2つのタンデム型LIMドメインを含
む。2群のタンパク質は殆どのLIMドメインを含み、3群のタンパク質は1〜5
個のタンデム型LIMドメインをC末端に有し、その他のタンパク質結合モチーフ
をN末端領域に有し得る。1群LIMドメインタンパク質は主として核に見られ、
2群及び3群LIMドメインタンパク質は主として細胞質に見られる。LIM proteins have been classified into three groups based on the homology and other structural features of the LIM domain (Dawid, supra). Group 1 LIM domain proteins are classified into the following three protein families. One is the LMO protein, which contains only two tandem LIM domains. The second is the LHX protein, which contains two tandem LIM domains following the homeodomain. The third is the LIMK protein, which contains two tandem LIM domains following the protein kinase domain. The second group of proteins contains most of the LIM domain and the third group of proteins contains 1-5
It may have one tandem LIM domain at the C-terminus and other protein binding motifs at the N-terminal region. Group 1 LIM domain proteins are found mainly in the nucleus,
Group 2 and Group 3 LIM domain proteins are found primarily in the cytoplasm.
【0004】
LHXタンパク質は、特定の細胞タイプの分化の調整に関与している。LHXファミ
リーには、3つのタンパク質即ち線虫由来のLin-11、ラット由来のISLi及び線虫
由来のMec-3が含まれ、これらは全て発達中に細胞運命の決定において役割を果
たす転写因子であり、LIMはこれらタンパク質の名を採って命名された。Lin-11
タンパク質は線虫において外陰の発達中に非対称性細胞分裂を制御し、Mec-3は
機械感覚性ニューロンの分化のために必要である。膵島細胞に発現されるISLiは
、インスリン遺伝子のエンハンサーに結合し、おそらくはインスリンの細胞特異
発現を調整する。Lim1/Lhxlは、哺乳動物LHXファミリータンパク質であり、マウ
スにおいてこの遺伝子が破損すると無頭胎児が発生し得ることから、脊椎動物の
胚形成における基礎的な初期の役割を有する。その他の哺乳動物LHX遺伝子は、
様々な組織において固有の機能を示す。マウスにおけるLhx2の破損は眼の欠如を
含む広範囲の脳の異常を導き、Lhx3の破損は脳下垂体の前葉及び中葉の特定切除
の原因となる。LHXタンパク質は、そのホメオドメインを介してDNAに結合する。
LIMドメインは、LHX機能を活性化するために必要なLIMドメインにタンパク質補
助因子を結合し、DNA結合に負の調整効果を発揮するように見える(前出のDawid
)。LHX proteins are involved in regulating the differentiation of specific cell types. The LHX family contains three proteins, Lin-11 from nematode, ISLi from rat and Mec-3 from nematode, all of which are transcription factors that play a role in cell fate decisions during development. Yes, LIM was named after these proteins. Lin-11
The protein regulates asymmetric cell division during vulvar development in C. elegans and Mec-3 is required for mechanosensory neuron differentiation. ISLi expressed in islet cells binds to the enhancer of the insulin gene and probably regulates cell-specific expression of insulin. Lim1 / Lhxl is a mammalian LHX family protein and has a fundamental early role in vertebrate embryogenesis because disruption of this gene in mice can result in headless fetuses. Other mammalian LHX genes are
It shows unique functions in various organizations. Lhx2 disruption in mice leads to widespread brain abnormalities, including lack of eyes, and Lhx3 disruption causes specific excision of the anterior and middle lobes of the pituitary gland. The LHX protein binds to DNA through its homeodomain.
The LIM domain binds protein cofactors to the LIM domain required to activate LHX function and appears to exert a negative regulatory effect on DNA binding (Dawid, supra).
).
【0005】
LMO遺伝子は、本来、ヒト腫瘍に見られる染色体転座による活性化の結果とし
て同定されるものであった。LMO1及びLMO2は、再発性染色体転座に関連している
ので、或る種のヒトT細胞急性白血病に関与していると信じられている。更に、L
MO1またはLMO2の遺伝子組換え発現は、マウス中で白血病及びリンパ腫を産出す
る(MeGuire, E.A. ら (1992) Mol. Cell. Biol. 12:4186-4196、Fisch, P. ら
(1992) Oncogene 7:238-2397)。LMO2の無発現変異を有するノックアウトマウス
は赤血球系の分化が不完全であるので、LMO2の通常の機能は造血系統の発達にあ
る。LMO2遺伝子の産物は、DNAに直接結合しているようには見えないが、転写を
制御する多タンパク質複合体に見られ、ここではLMO2遺伝子の産物が複合体の2
つのDNA結合アームを架橋している外観を呈している。T細胞におけるLMO2の不適
当な発現は、白血病を引き起こす異常なDNA転写複合体の形成の原因となると信
じられている(Rabbitts, T. H. ら (1999) Cancer Res. 59 (7 suppl.): 1794s
-1798s)。The LMO gene was originally identified as a result of activation by chromosomal translocations found in human tumors. LMO1 and LMO2 are believed to be involved in some human T-cell acute leukemias because they are associated with recurrent chromosomal translocations. Furthermore, L
Recombinant expression of MO1 or LMO2 produces leukemia and lymphoma in mice (MeGuire, EA et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12: 4186-4196, Fisch, P. et al.
(1992) Oncogene 7: 238-2397). The normal function of LMO2 lies in the development of hematopoietic lineages, since knockout mice with LMO2 non-expressing mutations have incomplete erythroid differentiation. The product of the LMO2 gene does not appear to be directly bound to DNA, but is found in a multiprotein complex that regulates transcription, where the product of the LMO2 gene is 2 of the complex.
It has the appearance of bridging two DNA-binding arms. Inappropriate expression of LMO2 in T cells is believed to cause the formation of aberrant DNA transcription complexes that cause leukemia (Rabbitts, TH et al. (1999) Cancer Res. 59 (7 suppl.): 1794s.
-1798s).
【0006】
2群LIMドメインタンパク質には多システインタンパク質(CRP)ファミリーが
あり、これは2つのLIMドメインを表示し、筋肉の発達に結びつけられる。この
群において最近特徴付けられたファミリーは、FHL(four and a half LIMドメイ
ン)タンパク質であり、これは、4つのLIMドメインと、LIMドメインのC末端半
分に似た1つのN末端Znフィンガーとから構成されている。FHLタンパク質は、
筋形成において重大な意味を持つ諸現象と同等であるような外観を呈する方法で
骨格筋及び心筋に発現される(Morgan, M. J. and A. J. A. Magwick (1999) Bi
ochern. Biophys. Res. Commun. 255:245-250)。[0006] There are two cysteine protein (CRP) families of group 2 LIM domain proteins, which display two LIM domains and are linked to muscle development. A recently characterized family in this group is the FHL (four and a half LIM domain) proteins, which consist of four LIM domains and one N-terminal Zn finger that resembles the C-terminal half of the LIM domain. It is configured. FHL protein is
It is expressed in skeletal muscle and myocardium in a manner that appears to be equivalent to phenomena that have significant significance in myogenesis (Morgan, MJ and AJA Magwick (1999) Bi
ochern. Biophys. Res. Commun. 255: 245-250).
【0007】
多くの3群LIMドメインタンパク質は、主として、細胞外マトリックス受容体
と細胞骨格との接触を仲介する高分子複合体である焦点接着(focal adhesion)
に位置する。このようなタンパク質には、zyxin及びパキシリンがある。パキシ
リンは、c-Src腫瘍遺伝子産物のSH3ドメイン及びv-Crk腫瘍遺伝子産物のSH2ドメ
インに対する結合部位及び4つのタンデム型LIMドメインを含む68キロダルト
ンのタンパク質である。パキシリンは、焦点接着チロシンキナーゼを含む種々の
チロシンキナーゼ及び造血性c-Abl腫瘍遺伝子産物のための基質である。パキシ
リンのチロシンリン酸化は、成長因子刺激作用及び腫瘍遺伝子形質転換に応じて
誘発される。そのようなリン酸化現象は、アクチンの細胞骨格における変化と関
連がある(Salgia, R. ら (1995) J. Biol. Chem. 270:5039-5047)。Zyxinは、
アクチンアセンブリの空間制御において役割を果たす。Zyxinには3つのタンデ
ム型LIMドメインが含まれ、zyxinはこのドメインを介してCRPファミリーのタン
パク質に結合する。Zyxinはまた、多プロリンN末端を介してアクチンフィラメ
ントの架橋結合剤であるαアクチニンと相互作用する(Beckerle, M. C. (1997)
BloEssays 19:949-957)。[0007] Many Group 3 LIM domain proteins are focal macromolecule complexes that mainly mediate the contact between extracellular matrix receptors and the cytoskeleton, focal adhesion.
Located in. Such proteins include zyxin and paxillin. Paxillin is a 68 kilodalton protein containing a binding site for the SH3 domain of the c-Src oncogene product and the SH2 domain of the v-Crk oncogene product and four tandem LIM domains. Paxillin is a substrate for various tyrosine kinases including focal adhesion tyrosine kinases and hematopoietic c-Abl oncogene products. Paxillin tyrosine phosphorylation is induced in response to growth factor stimulation and oncogene transformation. Such phosphorylation events are associated with changes in the actin cytoskeleton (Salgia, R. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 5039-5047). Zyxin is
It plays a role in the spatial control of actin assembly. Zyxin contains three tandem LIM domains, through which zyxin binds to proteins of the CRP family. Zyxin also interacts with α-actinin, a cross-linker of actin filaments, through the N-terminus of multiple prolines (Beckerle, MC (1997)
BloEssays 19: 949-957).
【0008】
その他のLIMドメインタンパク質には、1つのC末端LIMドメインを有するラッ
トからの復帰突然変異誘導LIM(RIL)タンパク質がある。RILは、線維芽細胞内
で高度に発現され、H-ras形質転換細胞内で減少する。RILの発現は、H-ras形質
転換細胞由来の表現型復帰突然変異体に保存される。従って、RILは正常な細胞
成長の維持への関与を提唱されている(Kiess, M. ら (1995) Oncogene 10:61-6
8)。Other LIM domain proteins include the reverse mutagenesis LIM (RIL) protein from rat that has one C-terminal LIM domain. RIL is highly expressed in fibroblasts and reduced in H-ras transformed cells. Expression of RIL is conserved in phenotypic revertants from H-ras transformed cells. Therefore, RIL has been proposed to be involved in maintaining normal cell growth (Kiess, M. et al. (1995) Oncogene 10: 61-6.
8).
【0009】
新たなヒトLIMドメインタンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチドの
発見は、細胞増殖異常、発達障害及び細胞運動異常の診断、治療並びに予防にお
いて有用である新たな組成を提供することにより、当分野における要求を満たす
。The discovery of new human LIM domain proteins and polynucleotides encoding them, by providing new compositions useful in the diagnosis, treatment and prevention of cell proliferative disorders, developmental disorders and cell motility disorders. Meet demands in the field.
【0010】
(発明の概要)
本発明は、集合的には「LIMD」、個別には「LIMD-1」及び「LIMD-2」と呼ばれるよ
うな、実質上精製されたポリペプチドである細胞内シグナル伝達分子に特徴があ
る。或る実施態様において本発明は、(a)配列番号1乃至2を有する群から選
択したアミノ酸配列、(b)配列番号1乃至2を有する群から選択したアミノ酸
配列と少なくとも95%の相同性を有する天然のアミノ酸配列、(c)配列番号
1乃至2を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または(d
)配列番号1乃至2を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含
む、実質上単離されたポリペプチドを提供する。一実施態様では、配列番号1乃
至2を有する群から選択したアミノ酸配列を含む実質上単離されたポリペプチド
を提供する。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to intracellularly-substantially purified polypeptides, such as collectively referred to as "LIMD" and individually as "LIMD-1" and "LIMD-2". Characterized by signaling molecules. In certain embodiments, the invention provides at least 95% homology with (a) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1-2 and (b) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1-2. Having a natural amino acid sequence, (c) a biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1 or 2, or (d)
3.) A substantially isolated polypeptide comprising an immunogenic fragment of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-2. In one embodiment, there is provided a substantially isolated polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 1-2.
【0011】
また、本発明は(a)配列番号1乃至2を有する群から選択したアミノ酸配列
、(b)配列番号1乃至2を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも9
5%の相同性を有する天然のアミノ酸配列、(c)配列番号1乃至2を有する群
から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または(d)配列番号1乃至2
を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプチドをコ
ードするような実質上単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では
、ポリヌクレオチドは配列番号1乃至2を有する群から選択したポリペプチドを
コードする。別の実施態様では、ポリヌクレオチドは配列番号3乃至4を有する
群から選択される。The present invention also provides at least 9 amino acid sequences selected from the group having (a) SEQ ID NOS: 1 and 2, and (b) the amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1 and 2.
A natural amino acid sequence having 5% homology, (c) a biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1 or (d) SEQ ID NOS: 1
A substantially isolated polynucleotide encoding a polypeptide comprising an immunogenic fragment of an amino acid sequence selected from the group having: In one embodiment, the polynucleotide encodes a polypeptide selected from the group having SEQ ID NOs: 1-2. In another embodiment, the polynucleotide is selected from the group comprising SEQ ID NOs: 3-4.
【0012】
本発明は更に、(a)配列番号1乃至2を有する群から選択したアミノ酸配列
、(b)配列番号1乃至2を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも9
5%の相同性を有する天然のアミノ酸配列、(c)配列番号1乃至2を有する群
から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または(d)配列番号1乃至2
を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプチドをコ
ードするような実質上単離されたポリヌクレオチドと機能的に結合したプロモー
ター配列を有する組換えポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、本発明
は組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。別の実施態様
では、本発明は組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体を提供する。The present invention further comprises at least 9 amino acid sequences selected from the group having (a) SEQ ID NOS: 1 and 2, and (b) the amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1 and 2.
A natural amino acid sequence having 5% homology, (c) a biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1 or (d) SEQ ID NOS: 1
Recombinant polynucleotides having a promoter sequence operably linked to a substantially isolated polynucleotide encoding a polypeptide comprising an immunogenic fragment of an amino acid sequence selected from the group comprising: In one embodiment, the invention provides cells transformed with the recombinant polynucleotide. In another embodiment, the present invention provides a genetic transformant containing the recombinant polynucleotide.
【0013】
また、本発明は(a)配列番号1乃至2を有する群から選択したアミノ酸配列
、(b)配列番号1乃至2を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも9
5%の相同性を有する天然のアミノ酸配列、(c)配列番号1乃至2を有する群
から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または(d)配列番号1乃至2
を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含む実質上単離された
ポリペプチドを製造する方法を提供する。製造方法は、(a)組換えポリヌクレ
オチドを用いて形質転換した細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養す
る過程と、(b)そのように発現したポリペプチドを受容する過程とを有し、組
換えポリヌクレオチドはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に
結合したプロモーター配列を有する。The present invention also includes (a) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1 and 2, and (b) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1 and 2, and at least 9
A natural amino acid sequence having 5% homology, (c) a biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1 or (d) SEQ ID NOS: 1
A method of producing a substantially isolated polypeptide comprising an immunogenic fragment of an amino acid sequence selected from the group having The production method comprises: (a) culturing cells transformed with a recombinant polynucleotide under conditions suitable for expression of the polypeptide; and (b) receiving the polypeptide thus expressed. And the recombinant polynucleotide has a promoter sequence operably linked to the polynucleotide encoding the polypeptide.
【0014】
本発明は更に、(a)配列番号1乃至2を有する群から選択したアミノ酸配列
、(b)配列番号1乃至2を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも9
5%の相同性を有する天然のアミノ酸配列、(c)配列番号1乃至2を有する群
から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または(d)配列番号1乃至2
を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプチドに特
異結合するような実質上単離された抗体を提供する。The present invention further comprises (a) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1 and 2, and (b) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1 and 2, and at least 9
A natural amino acid sequence having 5% homology, (c) a biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1 or (d) SEQ ID NOS: 1
A substantially isolated antibody which specifically binds to a polypeptide comprising an immunogenic fragment of an amino acid sequence selected from the group comprising:
【0015】
本発明は更に、(a)配列番号3乃至4を有する群から選択したポリヌクレオ
チド配列、(b)配列番号3乃至4を有する群から選択したポリヌクレオチド配
列と少なくとも90%の相同性を有する天然のポリヌクレオチド配列、(c)(
a)に相補的なポリヌクレオチド配列、(d)(b)に相補的なポリヌクレオチ
ド配列、または(e)(a)〜(d)のRNA等価物を含む実質上単離されたポリ
ヌクレオチドを提供する。一実施態様では、ポリヌクレオチドは少なくとも60
の連続したヌクレオチドを有する。The present invention further provides at least 90% homology with (a) a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 3-4 and (b) a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 3-4. A natural polynucleotide sequence having (c) (
a polynucleotide sequence complementary to a), (d) a polynucleotide sequence complementary to (b), or (e) a substantially isolated polynucleotide comprising the RNA equivalent of (a)-(d). provide. In one embodiment the polynucleotide is at least 60
Of consecutive nucleotides.
【0016】
本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する
。ここで、標的ポリヌクレオチドは(a)配列番号3乃至4を有する群から選択
したポリヌクレオチド配列、(b)配列番号3乃至4を有する群から選択したポ
リヌクレオチド配列と少なくとも90%の相同性を有する天然のポリヌクレオチ
ド配列、(c)(a)に相補的なポリヌクレオチド配列、(d)(b)に相補的
なポリヌクレオチド配列、または(e)(a)〜(d)のRNA等価物を含む実質
上単離されたポリヌクレオチドを提供する。検出方法は、(a)サンプル中の標
的ポリヌクレオチドに相補的な配列からなる少なくとも20の連続したヌクレオ
チドを含むプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、(b)ハ
イブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、複合体が存在する場合に
はオプションでその量を検出する過程からなり、プローブと標的ポリヌクレオチ
ドの間にハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブ
は標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。一実施態様では、プロ
ーブは少なくとも60の連続したヌクレオチドを含む。The invention further provides a method of detecting a target polynucleotide in a sample. Here, the target polynucleotide has at least 90% homology with (a) a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 3 to 4 and (b) a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 3 to 4. A natural polynucleotide sequence having, a polynucleotide sequence complementary to (c) (a), a polynucleotide sequence complementary to (d) (b), or RNA equivalents of (e) (a)-(d) Providing a substantially isolated polynucleotide comprising. The detection method includes (a) a step of hybridizing the sample with a probe containing at least 20 consecutive nucleotides having a sequence complementary to the target polynucleotide in the sample, and (b) the presence of a hybridization complex. A probe is provided under conditions that detect the absence and optionally detect the amount of complex, if present, under conditions such that a hybridization complex is formed between the probe and the target polynucleotide. It specifically hybridizes to the target polynucleotide. In one embodiment, the probe comprises at least 60 contiguous nucleotides.
【0017】
本発明はまた、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する
。ここで、標的ポリヌクレオチドは(a)配列番号3乃至4を有する群から選択
したポリヌクレオチド配列、(b)配列番号3乃至4を有する群から選択したポ
リヌクレオチド配列と少なくとも90%の相同性を有する天然のポリヌクレオチ
ド配列、(c)(a)に相補的なポリヌクレオチド配列、(d)(b)に相補的
なポリヌクレオチド配列、または(e)(a)〜(d)のRNA等価物を含む実質
上単離されたポリヌクレオチドを提供する。検出方法は、(a)ポリメラーゼ連
鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、(
b)標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリ
ヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する
過程を含む。The invention also provides a method of detecting a target polynucleotide in a sample. Here, the target polynucleotide has at least 90% homology with (a) a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 3 to 4 and (b) a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 3 to 4. A natural polynucleotide sequence having, a polynucleotide sequence complementary to (c) (a), a polynucleotide sequence complementary to (d) (b), or RNA equivalents of (e) (a)-(d) Providing a substantially isolated polynucleotide comprising. The detection method includes (a) a step of amplifying a target polynucleotide or a fragment thereof using polymerase chain reaction amplification, and
b) Detecting the presence or absence of the target polynucleotide or its fragment, and optionally detecting the amount of the target polynucleotide or its fragment, if any.
【0018】
本発明は更に、有効量のポリペプチドと薬剤として許容できる賦形剤とを含む
医薬品成分を提供する。有効量のポリペプチドは、(a)配列番号1乃至2を有
する群から選択したアミノ酸配列、(b)配列番号1乃至2を有する群から選択
したアミノ酸配列と少なくとも95%の相同性を有する天然のアミノ酸配列、(
c)配列番号1乃至2を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片
、または(d)配列番号1乃至2を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗
原性断片を含む。一実施態様では、医薬品成分は配列番号1乃至2を有する群か
ら選択したアミノ酸配列を含む。更に本発明は、機能性LIMDの発現低下に関連す
る疾患又は病状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対
して医薬品成分を投与する過程を有する方法を提供する。The invention further provides a pharmaceutical ingredient comprising an effective amount of the polypeptide and a pharmaceutically acceptable excipient. The effective amount of the polypeptide is a natural product having at least 95% homology with (a) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1 to 2 and (b) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1 to 2. Amino acid sequence of, (
c) A biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1 to 2, or (d) an immunogenic fragment of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1 to 2. In one embodiment, the pharmaceutical ingredient comprises an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1-2. The invention further provides a method of treating a disease or medical condition associated with reduced expression of functional LIMD, the method comprising the step of administering a pharmaceutical ingredient to a patient in need of such treatment.
【0019】
本発明はまた、(a)配列番号1乃至2を有する群から選択したアミノ酸配列
、(b)配列番号1乃至2を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも9
5%の相同性を有する天然のアミノ酸配列、(c)配列番号1乃至2を有する群
から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または(d)配列番号1乃至2
を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプチドのア
ゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提
供する。スクリーニング方法は、(a)ポリペプチドを有するサンプルを化合物
に曝す過程と、(b)サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含む。一
実施態様では、本発明は機能性LIMDの発現低下に関連する疾患又は病状を治療す
る方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して医薬品成分を投与す
る過程を含む方法を提供する。The present invention also includes at least 9 amino acid sequences selected from the group having (a) SEQ ID NOS: 1 and 2, and (b) the amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1 and 2.
A natural amino acid sequence having 5% homology, (c) a biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1 or (d) SEQ ID NOS: 1
A method of screening a compound for confirming the effectiveness as a agonist of a polypeptide comprising an immunogenic fragment of an amino acid sequence selected from the group having The screening method includes (a) exposing a sample having a polypeptide to a compound, and (b) detecting an agonist activity in the sample. In one embodiment, the invention provides a method of treating a disease or condition associated with reduced expression of functional LIMD, the method comprising the step of administering a pharmaceutical ingredient to a patient in need of such treatment. provide.
【0020】
本発明は更に、(a)配列番号1乃至2を有する群から選択したアミノ酸配列
、(b)配列番号1乃至2を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも9
5%の相同性を有する天然のアミノ酸配列、(c)配列番号1乃至2を有する群
から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または(d)配列番号1乃至2
を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプチドのア
ンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法
を提供する。スクリーニング方法は、(a)ポリペプチドを含むサンプルを化合
物に曝す過程と、(b)サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程とを含
む。一実施態様で本発明は、この方法によって同定したアンタゴニスト化合物と
薬剤として許容できる賦形剤とを含む医薬品成分を提供する。別の実施態様では
、機能性LIMDの過剰発現に関連する疾患又は病状を治療する方法であって、その
ような治療を必要とする患者に対して医薬品成分を投与する過程を含む方法を提
供する。The present invention further comprises (a) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1 and 2, and (b) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1 and 2, and at least 9
A natural amino acid sequence having 5% homology, (c) a biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1 or (d) SEQ ID NOS: 1
A method of screening a compound for confirming the effectiveness as a antagonist of a polypeptide comprising an immunogenic fragment of an amino acid sequence selected from the group having: The screening method includes (a) exposing the sample containing the polypeptide to the compound, and (b) detecting the antagonist activity in the sample. In one embodiment, the invention provides a pharmaceutical ingredient comprising an antagonist compound identified by this method and a pharmaceutically acceptable excipient. In another embodiment, there is provided a method of treating a disease or condition associated with overexpression of functional LIMD comprising the step of administering a pharmaceutical ingredient to a patient in need of such treatment. .
【0021】
本発明は更に、(a)配列番号1乃至2を有する群から選択したアミノ酸配列
、(b)配列番号1乃至2を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも9
5%の相同性を有する天然のアミノ酸配列、(c)配列番号1乃至2を有する群
から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または(d)配列番号1乃至2
を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプチドに特
異結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は
、(a)ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも1つの試験化合物に結合させ
る過程と、(b)試験化合物とのポリペプチドの結合を検出し、それによってポ
リペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含む。The present invention further comprises (a) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1 and 2, and (b) at least 9 amino acid sequences selected from the group having SEQ ID NOS: 1 and 2.
A natural amino acid sequence having 5% homology, (c) a biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1 or (d) SEQ ID NOS: 1
A method for screening a compound that specifically binds to a polypeptide containing an immunogenic fragment of an amino acid sequence selected from the group having: The screening method comprises: (a) a process of binding the polypeptide to at least one test compound under appropriate conditions; and (b) a compound that detects the binding of the polypeptide to the test compound and thereby specifically binds to the polypeptide. And a process of identifying.
【0022】
本発明は更に、(a)配列番号1乃至2を有する群から選択したアミノ酸配列
、(b)配列番号1乃至2を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも9
5%の相同性を有する天然のアミノ酸配列、(c)配列番号1乃至2を有する群
から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または(d)配列番号1乃至2
を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプチドの活
性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法
は、(a)ポリペプチドの活性が許容された条件下で、ポリペプチドを少なくと
も1つの試験化合物に結合させる過程と、(b)ポリペプチドの活性を試験化合
物の存在下で算定する過程と、(c)試験化合物の存在下でのポリペプチドの活
性を試験化合物の不存在下でのポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試
験化合物の存在下でのポリペプチドの活性の変化は、ポリペプチドの活性を調節
する化合物を標示する。The present invention further comprises (a) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1 and 2, and (b) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1 and 2, and at least 9
A natural amino acid sequence having 5% homology, (c) a biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 1 or (d) SEQ ID NOS: 1
A method of screening a compound that regulates the activity of a polypeptide comprising an immunogenic fragment of an amino acid sequence selected from the group having: The screening method includes (a) a step of binding the polypeptide to at least one test compound under conditions where the activity of the polypeptide is allowed, and (b) a step of calculating the activity of the polypeptide in the presence of the test compound. And (c) comparing the activity of the polypeptide in the presence of the test compound with the activity of the polypeptide in the absence of the test compound, the change in the activity of the polypeptide in the presence of the test compound. Indicates compounds that modulate the activity of the polypeptide.
【0023】
本発明は更に、標的ポリヌクレオチドの変異発現の有効性を確認するために化
合物をスクリーニングする方法を提供する。標的ポリヌクレオチドは、配列番号
3乃至4を有する群から選択した配列を含む。スクリーニング方法は、(a)標
的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、(b)標的ポリヌク
レオチドの変異発現を検出する過程とを含む。The invention further provides methods of screening compounds to confirm the efficacy of mutated expression of a target polynucleotide. The target polynucleotide comprises a sequence selected from the group having SEQ ID NOs: 3-4. The screening method includes (a) exposing a sample containing a target polynucleotide to a compound, and (b) detecting a mutant expression of the target polynucleotide.
【0024】
本発明は更に、試験化合物の毒性を評価する方法を提供する。毒性評価方法は
、(a)核酸を含む生物学的サンプルを試験化合物で処理する過程と、(b)(
i)配列番号3乃至4を有する群から選択したポリヌクレオチド配列、(ii)配
列番号3乃至4を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90
%の相同性を有する天然のポリヌクレオチド配列、(iii)(i)に相補的なポリ
ヌクレオチド配列、(iv)(ii)に相補的なポリヌクレオチド配列、または(v
)(i)〜(iv)のRNA等価物を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を有
するポリヌクレオチドの少なくとも20の連続したヌクレオチドを含むプローブ
を用いて処理生物学的サンプルの核酸をハイブリダイズする過程とからなる。ハ
イブリダイゼーションは、生物学的サンプルにおいて前記プローブと標的ポリヌ
クレオチドの間に固有のハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件
下で発生し、前記標的ポリヌクレオチドには、(i)配列番号3乃至4を有する
群から選択したポリヌクレオチド配列、(ii)配列番号3乃至4を有する群から
選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90%の相同性を有する天然のポリ
ヌクレオチド配列、(iii)(i)に相補的なポリヌクレオチド配列、(iv)(ii
)に相補的なポリヌクレオチド配列、及び(v)(i)〜(iv)のRNA等価物が含
まれる。或いは、標的ポリヌクレオチドは、上記ポリヌクレオチド配列の断片と
、(c)ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、(d)処理生物
学的サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量を非処理生物学的サンプル
中のハイブリダイゼーション複合体と比較する過程とを有し、処理生物学的サン
プル中のハイブリダイゼーション複合体の量の差は試験化合物の毒性を示す。The present invention further provides a method of assessing the toxicity of a test compound. The toxicity evaluation method includes (a) a step of treating a biological sample containing a nucleic acid with a test compound, and (b) (
i) a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 3 to 4, and (ii) a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 3 to 4 and at least 90
A natural polynucleotide sequence having% homology, (iii) a polynucleotide sequence complementary to (i), (iv) a polynucleotide sequence complementary to (ii), or (v
) (I)-(iv) hybridizing nucleic acid of a treated biological sample with a probe comprising at least 20 contiguous nucleotides of a polynucleotide having a polynucleotide sequence selected from the group having RNA equivalents Consists of. Hybridization occurs under conditions such that a unique hybridization complex is formed between the probe and the target polynucleotide in the biological sample, and the target polynucleotide includes (i) SEQ ID NO: 3 to A polynucleotide sequence selected from the group having 4), (ii) a natural polynucleotide sequence having at least 90% homology to the polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NOS: 3 to 4, (iii) (i) A complementary polynucleotide sequence, (iv) (ii
), And the RNA equivalents of (v) (i)-(iv). Alternatively, the target polynucleotide comprises a fragment of the above polynucleotide sequence, (c) a step of quantifying the amount of hybridization complex, and (d) an amount of the hybridization complex in the treated biological sample that has not been treated. The difference in the amount of hybridization complex in the treated biological sample is indicative of the toxicity of the test compound.
【0025】
(発明を実施するための形態)
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列及び方法について説明するが、その前
に、説明した特定の装置、材料及び方法に本発明が限定されるものではなく、改
変し得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施例を
説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の
範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。(Modes for Carrying Out the Invention) The protein, nucleotide sequence and method of the present invention will be described, but the present invention is not limited to the specific devices, materials and methods described above. It should be understood that modifications can be made. Further, the technical terms used herein are merely used for the purpose of describing specific examples, and are not intended to limit the scope of the present invention which is limited only by the claims. Please also understand.
【0026】
請求の範囲及び明細書中で用いている単数形の「或る」及び「その(この)」
の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す
場合もあることに注意しなければならない。従って、例えば「或る宿主細胞」と
記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」
と記されている場合には単数または複数の抗体、及び、当業者に公知の抗体の等
価物等についても言及しているのである。As used in the claims and specification, the singular forms “a” and “the (this)”
It should be noted that the notation of may refer to more than one, unless the context clearly indicates otherwise. Thus, for example, where the phrase "a host cell" is used, there may be more than one such host cell, and "a antibody"
When it is described, it also refers to one or more antibodies, and antibody equivalents known to those skilled in the art.
【0027】
本明細書中で用いる全ての専門用語及び科学用語は、特に定義されている場合
を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説
明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料及び方法を用いて本発明の実
施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について
説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本
発明に関係があるであろう細胞、プロトコル、試薬及びベクターについて説明及
び開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本
発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられ
ていないことを認めるものではない。All technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art, unless otherwise defined. Although any apparatus, material, or method similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, suitable apparatus, materials, or methods are described herein. All publications mentioned in this invention are cited for the purpose of describing and disclosing the cells, protocols, reagents and vectors that were reported in the publications and which may be relevant to the invention. . Nothing herein is to be admitted that the present invention is not entitled to antedate such disclosure by virtue of prior art.
【0028】
定義
「LIMD」は、実質上精製されたLIMDのアミノ酸配列であって、任意の種、特に
ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物の種から得たもので
、任意の天然物、合成物、半合成物或いは組換え物を起源とするものを指す。The definition "LIMD" is the amino acid sequence of substantially purified LIMD, obtained from any species, especially mammalian species including bovine, ovine, porcine, murine, equine and human. It refers to any natural, synthetic, semi-synthetic or recombinant origin.
【0029】
「アゴニスト」の語は、LIMDの生物学的活性を強化または擬態する分子を指す
。アゴニストの例として、タンパク質、核酸、糖質、小分子その他の任意の化合
物や成分を挙げることができるが、これらはLIMDと直接相互作用することによっ
て、或いはLIMDが関与する生物学的経路の構成エレメントに作用することによっ
て、LIMDの活性を調節する。The term “agonist” refers to a molecule that enhances or mimics the biological activity of LIMD. Examples of agonists include proteins, nucleic acids, carbohydrates, small molecules and any other compounds or components, which either interact directly with LIMD or are involved in the formation of biological pathways in which LIMD is involved. Acts on the element to regulate the activity of LIMD.
【0030】
「対立遺伝子変異体」は、LIMDをコードする遺伝子の別の形態である。対立遺
伝子変異体は、核酸配列における少なくとも1の突然変異から作製し得る。また
、変異RNAまたはポリペプチドからも作製し得る。ポリペプチドの構造または機
能は、変異することもしないこともある。遺伝子は、天然の対立遺伝子変異体を
全く有しないか、1若しくは数個の天然の対立遺伝子変異体を有し得る。一般に
対立遺伝子変異体を生じさせる通常の突然変異性変化は、ヌクレオチドの自然欠
失、付加または置換に帰するものである。これら各変化は、単独或いは他の変化
と共に、所定の配列内で1若しくは数回生じ得る。“Allelic variants” are another form of the gene encoding LIMD. Allelic variants may be created from at least one mutation in the nucleic acid sequence. It can also be made from mutant RNA or polypeptides. The structure or function of the polypeptide may or may not be mutated. A gene may have no natural allelic variants, or one or several natural allelic variants. Common mutagenic changes, which generally give rise to allelic variants, are ascribed to spontaneous deletions, additions or substitutions of nucleotides. Each of these changes, alone or in combination with other changes, can occur one or more times within a given sequence.
【0031】
LIMDをコードする「変異(altered)」核酸配列は、種々のヌクレオチドを欠失
、挿入または置換する核酸配列を有し、LIMDと同一またはLIMDの機能的特徴を少
なくとも1つ有するポリペプチドを産出する。この定義に含まれるのは、LIMDを
コードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易
に検出可能或いは検出困難な多型現象と、LIMDをコードするポリヌクレオチド配
列のための正常な染色体遺伝子座以外の遺伝子座に占めるような、対立遺伝子変
異体に対する不適切或いは不測のハイブリダイゼーションである。コードされた
タンパク質も「変異」し得るものであり、サイレント変化を生ぜしめて結果的に
機能的に等価なLIMDとなるようなアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を含み得
る。計画的アミノ酸置換は、LIMDの生物学的または免疫学的活性が保持される限
りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び/または両親媒性
特性の類似性に基づき行い得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギ
ン酸及びグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジン及びアルギニン
がある。親水性値が近似している非荷電極性側鎖を有するアミノ酸には、アスパ
ラギンとグルタミン、セリンとスレオニンがある。親水性値が近似している非荷
電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとア
ラニン、フェニルアラニンとチロシンがある。A “altered” nucleic acid sequence that encodes LIMD has a nucleic acid sequence that deletes, inserts, or replaces various nucleotides, and is a polypeptide having the same or at least one functional characteristic of LIMD. Produce. Included in this definition are polymorphisms that are easily or difficult to detect using specific oligonucleotide probes for LIMD-encoding polynucleotides and normal chromosomal genes for LIMD-encoding polynucleotide sequences. Inappropriate or unexpected hybridization to allelic variants that occupy loci other than loci. The encoded protein may also be "mutated" and may contain deletions, insertions or substitutions of amino acid residues which result in silent changes, resulting in a functionally equivalent LIMD. Planned amino acid substitutions are based on the similarity of the polarities, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and / or amphipathic properties of the residues, so long as the biological or immunological activity of LIMD is retained. obtain. For example, negatively charged amino acids include aspartic acid and glutamic acid, and positively charged amino acids include lysine and arginine. Amino acids having uncharged polar side chains with similar hydrophilicity values include asparagine and glutamine, and serine and threonine. Amino acids having uncharged side chains with similar hydrophilicity values include leucine, isoleucine and valine, glycine and alanine, phenylalanine and tyrosine.
【0032】
「アミノ酸」または「アミノ酸配列」の語は、オリゴペプチド、ペプチド、ポ
リペプチド若しくはタンパク質の配列またはその断片を指し、天然または合成分
子を指す。ここで、「アミノ酸配列」は天然のタンパク質分子のアミノ酸配列を
指すものであり、「アミノ酸配列」及び類似の語は、アミノ酸配列を、列挙した
タンパク質分子に会合する完全な本来のアミノ酸配列に限定しようとするもので
はない。The term “amino acid” or “amino acid sequence” refers to a sequence of oligopeptides, peptides, polypeptides or proteins or fragments thereof, which refers to natural or synthetic molecules. As used herein, "amino acid sequence" refers to the amino acid sequence of a naturally occurring protein molecule, and "amino acid sequence" and similar terms limit an amino acid sequence to the complete native amino acid sequence that associates with the listed protein molecules. Not what you are trying to do.
【0033】
「増幅」は、核酸配列の追加複製に関連する。増幅は通常、当業者によく知ら
れたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術を用いて行う。“Amplification” refers to the additional replication of nucleic acid sequences. Amplification is typically performed using the polymerase chain reaction (PCR) technique well known to those skilled in the art.
【0034】
「アンタゴニスト」の語は、LIMDの生物学的活性を阻害或いは弱める分子を指
す。アンタゴニストとしては、抗体などのタンパク質、核酸、糖質、小分子また
はその他の任意の化合物や成分を挙げることができるが、これらはLIMDと直接相
互作用することによって、或いはLIMDが関与する生物学的経路の構成エレメント
に作用することによって、LIMDの活性を調節する。The term “antagonist” refers to a molecule that inhibits or attenuates the biological activity of LIMD. Antagonists can include proteins such as antibodies, nucleic acids, carbohydrates, small molecules or any other compound or moiety, which are either directly interacting with LIMD or are biologically involved in LIMD. It regulates the activity of LIMD by acting on components of the pathway.
【0035】
「抗体」の語は、無損傷免疫グロブリンやその断片、例えばFa、F(ab')2 及びF
v断片を指すが、これらはエピトープの決定基と結合することができる。LIMDポ
リペプチドを結合する抗体は、無損傷ポリペプチドを用いるか或いは免疫抗原と
して感心のある小ペプチドを含む断片を用いるかして調製することができる。動
物(マウス、ラット、ウサギ等)を免疫化するために用いるポリペプチドまたは
オリゴペプチドは、翻訳または化学合成されたRNAに由来し得るもので、好みに
応じて担体タンパク質に接合することも可能である。通常用いられる担体であっ
てペプチドと化学結合するものは、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン及び
キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)等がある。結合ペプチドは、動物を
免疫化するために用いる。The term “antibody” refers to intact immunoglobulins and fragments thereof, such as Fa, F (ab ′) 2 and F.
v Fragments, which are capable of binding epitope determinants. Antibodies that bind LIMD polypeptides can be prepared using intact polypeptides or using fragments containing small peptides of interest as the immunizing antigen. The polypeptide or oligopeptide used to immunize an animal (mouse, rat, rabbit, etc.) can be derived from translated or chemically synthesized RNA, and can be conjugated to a carrier protein if desired. is there. Commonly used carriers that chemically bond with peptides include bovine serum albumin, thyroglobulin, and keyhole limpet hemocyanin (KLH). The binding peptide is used to immunize the animal.
【0036】
「抗原決定基」の語は、特定の抗体と接触している分子の領域(即ちエピトー
プ)を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場
合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基(タンパク質の特定の領域または3
次元構造)に特異結合する抗体の産生を誘導し得る。抗原決定基は、抗体に結合
するための無損傷抗原(即ち免疫応答を誘導するために用いられる免疫原)と競
合し得る。The term “antigenic determinant” refers to the region of the molecule (ie, the epitope) that is in contact with a particular antibody. When a host animal is immunized with a protein or protein fragment, a large number of regions of the protein are associated with antigenic determinants (specific regions of the protein or 3
Can induce the production of antibodies that specifically bind to (dimensional structure). An antigenic determinant can compete with an intact antigen for binding to an antibody (ie, an immunogen used to induce an immune response).
【0037】
「アンチセンス」の語は、特定の核酸配列の「センス」鎖(コーディング鎖)
と塩基対を形成することが可能な任意の成分を指す。アンチセンス成分には、DN
Aや、RNAや、ペプチド核酸(PNA)や、ホスホロチオ酸、メチルホスホン酸また
はベンジルホスホン酸等の修飾されたバックボーン連鎖を有するオリゴヌクレオ
チドや、2'-メトキシエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖等の修飾された糖類
を有するオリゴヌクレオチドや、或いは5-メチルシトシン、2'-デオキシウラシ
ルまたは7-デアザ-2'-デオキシグアノシン等の修飾された塩基を有するオリゴヌ
クレオチドがある。アンチセンス分子は、化学合成または転写を含む任意の方法
で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、ひとたび細胞に導入され
たら、細胞が形成した天然の核酸配列と塩基対を形成し、転写または翻訳を妨害
する二重鎖を形成する。「負」若しくは「マイナス(−)」の語がアンチセンス
鎖を、「正」若しくは「プラス(+)」がセンス鎖を指すことがある。The term “antisense” refers to the “sense” strand (coding strand) of a particular nucleic acid sequence.
Refers to any component capable of forming base pairs with. For the antisense component, DN
A, RNA, peptide nucleic acid (PNA), oligonucleotides having a modified backbone chain such as phosphorothioic acid, methylphosphonic acid or benzylphosphonic acid, and 2'-methoxyethyl sugar or 2'-methoxyethoxy sugar There are oligonucleotides having modified sugars, and oligonucleotides having modified bases such as 5-methylcytosine, 2'-deoxyuracil or 7-deaza-2'-deoxyguanosine. Antisense molecules can be produced by any method including chemical synthesis or transcription. Once introduced into a cell, the complementary antisense molecule base pairs with the native nucleic acid sequence formed by the cell to form a duplex that interferes with transcription or translation. The term "negative" or "minus (-)" may refer to the antisense strand, and "positive" or "plus (+)" may refer to the sense strand.
【0038】
「生物学的に活性」の語は、天然分子の構造的機能、調節機能または生化学的
機能を有するタンパク質を指す。同様に「免疫学的に活性」は、天然、組換えま
たは合成のLIMD、或いはその任意のオリゴペプチドの能力であって、適切な動物
または細胞において特定の免疫反応を誘導して特定の抗体と結合し得る能力を指
す。The term “biologically active” refers to a protein having the structural, regulatory or biochemical functions of a naturally occurring molecule. Similarly, "immunologically active" is the ability of natural, recombinant or synthetic LIMD, or any oligopeptide thereof, to induce a specific immune response in a suitable animal or cell to induce a specific antibody. Refers to the ability to combine.
【0039】
「相補(的)」または「相補性」の語は、塩基対形成によりアニールする2つの
一本鎖分子間の関係を説明する。例として、「5'A-G-T3'」とその相補配列「3'T
-C-A5'」がある。The terms “complementary” or “complementarity” describe the relationship between two single-stranded molecules that anneal by base pairing. As an example, "5'AG-T3 '" and its complementary sequence "3'T
-There is a C-A5 '.
【0040】
「所与のポリヌクレオチド配列からなる成分」及び「所与のアミノ酸配列から
なる成分」は、大まかに所与のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有す
る任意の成分を指す。この成分には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。LIMD
またはLIMD断片をコードするポリヌクレオチドからなる成分は、ハイブリダイゼ
ーションプローブとして利用することができる。このプローブは凍結乾燥状態で
保存し得るものであり、糖質等の安定化剤と会合し得る。ハイブリダイゼーショ
ンにおいては、塩(例えばNaCl)、洗浄剤(例えばドデシル硫酸ナトリウム;SD
S)及びその他の構成エレメント(例えばデンハート液、脱脂粉乳、サケの精子
のDNA等)を含む水溶液中にプローブを分散させることができる。“Component consisting of a given polynucleotide sequence” and “component consisting of a given amino acid sequence” refer broadly to any component having the given polynucleotide or amino acid sequence. This component may include a dry formulation or an aqueous solution. LIMD
Alternatively, a component consisting of a polynucleotide encoding a LIMD fragment can be used as a hybridization probe. This probe can be stored in a freeze-dried state and can be associated with a stabilizer such as sugar. In hybridization, salt (eg NaCl), detergent (eg sodium dodecyl sulfate; SD
The probe can be dispersed in an aqueous solution containing S) and other constituent elements (eg Denhardt's solution, skim milk powder, salmon sperm DNA, etc.).
【0041】
「コンセンサス配列」は、不必要な塩基を分離するために再配列し、XL-PCRキ
ット(PE Biosystems, Foster City CA)を用いて5'方向及び/または3'方向
に伸長させ、更に再配列した核酸配列を指す。或いは、断片アセンブルのコンピ
ュータプログラムを用いて、1若しくは数個のIncyteクローンの、場合によって
は1若しくは数個のパブリックドメインESTの、オーバーラップした配列から組
み立てた核酸配列を指す。コンピュータプログラムの例としては、GELVIEW断片
アセンブルシステム(GCG, Madison WI)やPhrap(University of Washington,
Seattle WA)が挙げられる。伸長及びアセンブルを共に行ってコンセンサス配列
を決定する配列もある。The “consensus sequence” is rearranged to separate unnecessary bases, extended in 5 ′ direction and / or 3 ′ direction using XL-PCR kit (PE Biosystems, Foster City CA), It also refers to rearranged nucleic acid sequences. Alternatively, it refers to nucleic acid sequences assembled from overlapping sequences of one or several Incyte clones, optionally one or several public domain ESTs, using a fragment assembly computer program. Examples of computer programs include the GELVIEW fragment assembly system (GCG, Madison WI) and Phrap (University of Washington,
Seattle WA). Some sequences are extended and assembled together to determine consensus sequences.
【0042】
「保存的なアミノ酸置換」は、置換がなされた時に元のタンパク質の特性を殆
ど損なわないような置換、即ちタンパク質の構造と特に機能が保存され、そのよ
うな置換による大きな変化がない置換を指す。下表は、タンパク質中で元のアミ
ノ酸と置換され得るアミノ酸と、保存アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示し
ている。
元の残基 保存的な置換
Ala Gly, Set
Arg His, Lys
Asn Asp, Gln, His
Asp Asn, Glu
Cys Ala, Ser
Gln Asn, Glu, His
Glu Asp, Gln, His
Gly Ala
His Asn, Arg, Gln, Glu
Ile Leu, Val
Leu Ile, Val
Lys Arg, Gln, Glu
Met Leu, Ile
Phe His, Met, Leu, Trp, Tyr
Ser Cys, Thr
Thr Ser, Val
Trp Phe, Tyr
Tyr His, Phe, Trp
Val Ile, Leu, Thr
保存アミノ酸置換では通常、(a)置換領域におけるポリペプチドのバックボ
ーン構造、例えばβシートやα螺旋構造、(b)置換部位における分子の電荷ま
たは疎水性、及び/または(c)側鎖の大部分を保持する。A “conservative amino acid substitution” is a substitution that does not impair the properties of the original protein when the substitution is made, that is, the structure and especially the function of the protein are conserved, and there is no significant change due to such substitution. Refers to substitution. The table below shows the amino acids that can be substituted for the original amino acids in the protein and the amino acids that are recognized as conservative amino acid substitutions. Original residue Conservative substitution Ala Gly, Set Arg His, Lys Asn Asp, Gln, His Asp Asn, Glu Cys Ala, Ser Gln Asn, Glu, His Glu Asp, Gln, His Gly Ala His Asn, Arg, Gln , Glu Ile Leu, Val Leu Ile, Val Lys Arg, Gln, Glu Met Leu, Ile Phe His, Met, Leu, Trp, Tyr Ser Cys, Thr Thr Ser, Val Trp Phe, Tyr Tyr His, Phe, Trp Val Ile , Leu, Thr Conservative amino acid substitutions usually involve (a) a backbone structure of the polypeptide in the substitution region, such as β-sheet or α-helical structure, (b) charge or hydrophobicity of the molecule at the substitution site, and / or (c) side. Holds most of the chains.
【0043】
「欠失」は、結果的に1若しくは数個のアミノ酸またはヌクレオチドが失われ
てなくなるようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を指す。“Deletion” refers to a change in an amino acid or nucleotide sequence that results in the loss of one or several amino acids or nucleotides.
【0044】
「誘導体」の語は、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の化学修飾
を指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による
水素の置換は、ポリヌクレオチド配列の化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチ
ド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも1つは保持し
ているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリ
エチレングリコール化(pegylation)、或いは任意の同様なプロセスであって誘
導起源のポリペプチドから少なくとも1つの生物学的若しくは免疫学的機能を保
持しているプロセスによって、修飾されたポリペプチドである。The term “derivative” refers to a chemical modification of a polypeptide or polynucleotide sequence. For example, replacement of hydrogen by an alkyl, acyl, hydroxyl or amino group can be included in the chemical modification of the polynucleotide sequence. A polynucleotide derivative encodes a polypeptide that retains at least one biological or immunological function of the natural molecule. A polypeptide derivative is modified by glycosylation, polyethylene pegylation, or any similar process that retains at least one biological or immunological function from the polypeptide of derived origin. Is a polypeptide that has been deleted.
【0045】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を生成することができ、ポリヌクレオ
チドまたはポリペプチドに共有結合または非共有結合するようなレポーター分子
または酵素を指す。“Detectable label” refers to a reporter molecule or enzyme that is capable of producing a measurable signal and is covalently or non-covalently attached to a polynucleotide or polypeptide.
【0046】
「断片」は、LIMDまたはLIMDをコードするポリヌクレオチドの固有部分であっ
て、親配列と同一配列であるが親配列よりも長さが短い配列を指す。断片は、画
定された配列の全長から1ヌクレオチド/アミノ酸残基を差し引いた長さよりも
短い長さを有し得る。例えば或る断片は、5〜1000の連続したヌクレオチド
またはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子とし
て、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも5、10、15
、16、20、25、30、40、50、60、75、100、150、250
若しくは少なくとも500の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基長さとし
得る。断片は、分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、ポリペプチド
断片は、所定の配列に示すような最初の250または500アミノ酸(またはポ
リペプチドの最初の25%または50%)から選択された或る長さの連続したア
ミノ酸を有し得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本
発明の実施例では、配列表、表及び図面を含む明細書に裏付けされた任意の長さ
であってよい。“Fragment” refers to a unique portion of a LIMD or polynucleotide encoding a LIMD that is identical to the parent sequence but shorter in length than the parent sequence. Fragments can have a length that is less than the total length of the defined sequence minus one nucleotide / amino acid residue. For example, a fragment may have 5 to 1000 consecutive nucleotides or amino acid residues. Fragments used as probes, primers, antigens, therapeutic molecules or for other purposes should be at least 5,10,15
, 16, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 250
Alternatively, it may be at least 500 contiguous nucleotides or amino acid residues in length. Fragments can be preferentially selected from specific regions of the molecule. For example, a polypeptide fragment may have a length of contiguous amino acids selected from the first 250 or 500 amino acids (or the first 25% or 50% of the polypeptide) as shown in the given sequence. These lengths are explicitly given by way of example, and in the embodiments of the present invention they may be of any length supported by the specification including the sequence listings, tables and figures.
【0047】
配列番号3乃至4の断片には、固有のポリヌクレオチド配列領域が含まれる。
この領域は、配列番号3乃至4を特異的に同定するものであり、例えば同一ゲノ
ム中の配列番号3乃至4以外の配列とは異なるものである。配列番号3乃至4の
断片は、例えば、ハイブリダイゼーション及び増幅技術において、或いは関連す
るポリヌクレオチド配列から配列番号3乃至4を区別する類似の方法において有
用である。配列番号3乃至4の断片の正確な長さ及び断片に対応する配列番号3
乃至4の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定する
ことが可能である。The fragments of SEQ ID NOs: 3-4 include unique polynucleotide sequence regions.
This region uniquely identifies SEQ ID NOS: 3 to 4, and is different from sequences other than SEQ ID NOS: 3 to 4 in the same genome, for example. Fragments of SEQ ID NOS: 3-4 are useful, for example, in hybridization and amplification techniques, or in similar methods of distinguishing SEQ ID NOS: 3-4 from related polynucleotide sequences. Exact lengths of fragments of SEQ ID NOs: 3-4 and SEQ ID NO: 3 corresponding to fragments
Areas 4 to 4 can be routinely determined by a person skilled in the art based on the intended purpose for the fragment.
【0048】
配列番号1乃至2の断片は、配列番号3乃至4の断片によってコードされる。
配列番号1乃至2の断片には、配列番号1乃至2を特異的に同定する固有のアミ
ノ酸配列領域が含まれている。例えば、配列番号1乃至2の断片は、配列番号1
乃至2を特異認識する抗体を産出するための免疫抗原性ペプチドとして有用であ
る。配列番号1乃至2の断片及び断片に対応する配列番号1乃至2の領域の正確
な長さは、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが
可能である。The fragments of SEQ ID NO: 1 to 2 are encoded by the fragments of SEQ ID NO: 3 to 4.
The fragments of SEQ ID NOS: 1 and 2 include unique amino acid sequence regions that specifically identify SEQ ID NOS: 1 and 2. For example, the fragments of SEQ ID NO: 1-2 are SEQ ID NO: 1
It is useful as an immunogenic peptide for producing an antibody that specifically recognizes 1 to 2. The exact lengths of the fragments of SEQ ID Nos. 1-2 and the regions of SEQ ID Nos. 1-2 corresponding to the fragments can be routinely determined by a person skilled in the art based on the intended purpose for the fragment.
【0049】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも1つの翻訳開始コドン(例
えばメチオニン)、オープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する
配列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペプチド配列
をコードする。A “full length” polynucleotide sequence is a sequence that has at least one translation initiation codon (eg, methionine), an open reading frame and a translation stop codon. A "full length" polynucleotide sequence encodes a "full length" polypeptide sequence.
【0050】
「相同性」の語は、配列類似性即ち2つ以上のポリヌクレオチド配列または2
つ以上のポリペプチド配列の配列間で互換可能な配列同一性である。The term “homology” refers to sequence similarity, that is, two or more polynucleotide sequences or two.
Compatible sequence identity between sequences of two or more polypeptide sequences.
【0051】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」または「一致%」の語は、標準
化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも2つ以上のポリ
ヌクレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。このようなアルゴリズム
は、両配列間のアラインメントを最適化するために比較する配列において、標準
化された再現性のある方法でギャップを挿入するので、2つの配列をより有意に
比較できる。The term “match rate” or “% match” applied to a polynucleotide sequence refers to the percentage of residues that match between at least two or more polynucleotide sequences aligned using a standardized algorithm. means. Such algorithms insert gaps in the sequences being compared in order to optimize the alignment between the two sequences in a standardized and reproducible manner, thus allowing more significant comparisons of the two sequences.
【0052】
ポリヌクレオチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメ
ントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトパ
ラメータを用いて決定できる。このプログラムはLASERGENEソフトウェアパッケ
ージの一部であり、一式の分子生物学分析プログラム(DNASTAR, Madison WI)
である。CLUSTAL Vについては、Higgins, D.G. and P.M. Sharp (1989) CABIOS
5:151-153及びHiggins, D.G. ら (1992) CABIOS 8:189-191の文献に記載されて
いる。ポリヌクレオチド配列の対をなすアラインメントの場合、デフォルトパラ
メータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定
する。デフォルトとして「重みづけされた」残基の重みづけ表を選択する。CLUS
TAL Vは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列対間の「類似率」として
一致率を報告する。The percent match between polynucleotide sequences can be determined using the default parameters of the CLUSTAL V algorithm as incorporated in the MEGALIGN version 3.12e sequence alignment program. This program is part of the LASERGENE software package and is a suite of molecular biology analysis programs (DNASTAR, Madison WI).
Is. For CLUSTAL V, Higgins, DG and PM Sharp (1989) CABIOS
5: 151-153 and Higgins, DG et al. (1992) CABIOS 8: 189-191. For pairwise alignments of polynucleotide sequences, the default parameters are set as Ktuple = 2, gap penalty = 5, window = 4, "diagonals saved" = 4. Select the "weighted" residue weighting table as the default. CLUS
TAL V reports concordance as the "similarity" between aligned polynucleotide sequence pairs.
【0053】
或いは、通常用いられ且つ無料で入手可能な配列比較アルゴリズム一式が米国
国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のBasic Local Alignment Search
Tool(BLAST)から提供されている(Altschul, S.F. ら (1990) J. Mol. Biol.
215:403-410)。このアルゴリズムは、メリーランド州ベセスダにあるNCBIを含
めた幾つかの情報源から入手可能であり、インターネット(http://www.ncbi.nl
m.nih.gov/BLAST/)上でも入手可能である。BLASTソフトウェア一式には様々な
配列分析プログラムが含まれており、既知のポリヌクレオチド配列を種々のデー
タベースから得た別のポリヌクレオチド配列とアラインメントする「blastn」も
その1つである。その他にも、2つのヌクレオチド配列を対で直接比較するため
に用いる「BLAST 2 Sequences」と称されるツールも利用可能である。「BLAST 2
Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして
対話形式で利用することが可能である。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blast
n と blastp(後述)の両者に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的
には、ギャップ及びデフォルト設定に設定された他のパラメータと共に用いる。
例えば、2つのヌクレオチド配列を比較するために、デフォルトパラメータとし
て設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12(2000年4月21日)を
用いてblastnを実行してもよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: −2
Open Gap: 5 及び Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
一致率は、完全に画定された(例えば特定の配列番号で画定された)配列長さ
と比較して測定し得る。或いは、より短い長さ、例えばより大きな画定された配
列から得られた断片(例えば少なくとも20、30、40、50、70、100
または200の連続したヌクレオチドの断片)の長さと比較して一致率を測定し
てもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リ
ストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を
用いて、一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。Alternatively, a set of commonly used and freely available sequence comparison algorithms can be found in the Basic Local Alignment Search of the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
Tool (BLAST) (Altschul, SF et al. (1990) J. Mol. Biol.
215: 403-410). The algorithm is available from several sources, including NCBI in Bethesda, Maryland, and can be found on the Internet (http://www.ncbi.nl
It is also available on m.nih.gov/BLAST/). The BLAST suite of software includes a variety of sequence analysis programs, one of which is "blastn," which aligns a known polynucleotide sequence with another polynucleotide sequence obtained from a variety of databases. In addition, a tool called "BLAST 2 Sequences" used for directly comparing two nucleotide sequences in pairs is also available. "BLAST 2
"Sequences" can be used interactively by accessing http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html. "BLAST 2 Sequences" tool, blast
It can be used for both n and blastp (described later). The BLAST program is typically used with gaps and other parameters set to default settings.
For example, blastn may be performed using the "BLAST 2 Sequences" tool Version 2.0.12 (April 21, 2000) set as default parameters to compare two nucleotide sequences. An example of setting default parameters is shown below. Matrix: BLOSUM62 Reward for match: 1 Penalty for mismatch: −2 Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 11 Filter: on Match rate is fully defined It can be measured relative to the sequence length (eg defined by a particular SEQ ID NO). Alternatively, fragments derived from shorter lengths, eg, larger defined sequences (eg, at least 20, 30, 40, 50, 70, 100).
Alternatively, the concordance rate may be determined by comparison with the length of 200 consecutive nucleotide fragments). The lengths listed here are merely exemplary and are used to determine the percent match using fragments of any sequence length supported by the sequences described herein, including tables, figures and sequence listings. It should be understood that this may account for the length that can be measured.
【0054】
高度の一致率を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重
が原因で類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸
配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコード
するような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。Nucleic acid sequences that do not exhibit a high degree of identity may nevertheless encode similar amino acid sequences due to the degeneracy of the genetic code. It is to be understood that this degeneracy can be utilized to produce changes in a nucleic acid sequence to produce multiple nucleic acid sequences such that all nucleic acid sequences encode substantially the same protein.
【0055】
ポリペプチド配列に適用される「一致率」または「一致%」の語は、標準化さ
れたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも2以上のポリペプチ
ド配列間で一致する残基の割合を意味する。ポリペプチド配列アラインメントの
方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。
既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の酸性度及び疎水性を保存
するので、ポリペプチドの構造を(従って機能も)保存する。The term “match rate” or “% match” as applied to a polypeptide sequence means the percentage of matching residues between at least two or more polypeptide sequences aligned using a standardized algorithm. To do. Methods for polypeptide sequence alignment are known. There are also alignment methods that consider conservative amino acid substitutions.
Such conservative substitutions detailed above generally preserve the acidity and hydrophobicity of the site of substitution and thus the structure (and thus function) of the polypeptide.
【0056】
ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメント
プログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラ
メータを用いて決定できる(既に説明したのでそれを参照されたい)。CLUSTAL
Vを用いて、ポリぺプチド配列を2つ1組でアラインメントする際のデフォルト
パラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と
設定する。デフォルトの残基重み付け表としてPAM250マトリクスを選択する。ポ
リヌクレオチドアラインメントと同様に、CLUSTAL Vは、アラインメントされた
ポリペプチド配列対間の「類似率」として一致率を報告する。The degree of concordance between polypeptide sequences can be determined using the default parameters of the CLUSTAL V algorithm as incorporated in the MEGALIGN version 3.12e sequence alignment program (see it previously described). CLUSTAL
The default parameters for aligning two pairs of polypeptide sequences using V are set as Ktuple = 1, gap penalty = 3, window = 5, and “diagonals saved” = 5. Select the PAM250 matrix as the default residue weight table. Like polynucleotide alignments, CLUSTAL V reports concordance as the "similarity" between aligned polypeptide sequence pairs.
【0057】
或いは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用いてもよい。例えばポリペプチド配
列を2つ1組で比較をする場合、デフォルトパラメータとして設定されたblastp
と共に「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12(2000年4月21日)を使用し
てもよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 及び Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
一致率は、完全に画定された(例えば特定の配列番号で画定された)ポリペプ
チド配列の長さと比較して測定し得る。一致率は、配列或いは、より短い長さ、
例えばより大きな画定されたポリペプチド配列から得られた断片(例えば少なく
とも15、20、30、40、50、70または150の連続した残基の断片)
の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的な
ものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付
けられた任意の配列長さの断片を用いて、或る長さであってその長さに対して一
致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。Alternatively, the NCBI BLAST software suite may be used. For example, when comparing polypeptide sequences in pairs, the blastp set as a default parameter
The "BLAST 2 Sequences" tool Version 2.0.12 (April 21, 2000) may be used with. An example of setting default parameters is shown below. Matrix: BLOSUM62 Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 3 Filter: on It can be measured relative to the length of the polypeptide sequence. The concordance rate is a sequence or shorter length,
For example, a fragment obtained from a larger defined polypeptide sequence (eg, a fragment of at least 15, 20, 30, 40, 50, 70 or 150 contiguous residues).
The match rate may be measured by comparing with the length of the. The lengths given here are merely exemplary and may be used with fragments of any sequence length backed by the sequences described herein, including tables, figures and sequence listings. It should be understood that it can be described as a length, for which a match rate can be measured.
【0058】
「ヒト人工染色体」(HAC)は直鎖状の小染色体であり、6kb〜10Mbのサイ
ズのDNA配列を含み、安定した有糸分裂染色体の分離及び維持に必要な全てのエ
レメントが含まれている。“Human Artificial Chromosome” (HAC) is a linear, small chromosome containing a DNA sequence of 6 kb to 10 Mb in size and containing all elements necessary for stable segregation and maintenance of mitotic chromosomes. Has been.
【0059】
「ヒト化抗体」の語は、非抗体結合領域におけるアミノ酸配列はヒト抗体によ
り近づくように変異させた抗体分子であって、本来の結合能力はそのまま保持し
ているような抗体分子を指す。The term “humanized antibody” refers to an antibody molecule in which the amino acid sequence in the non-antibody binding region has been mutated so that it is closer to that of a human antibody, and the original binding ability is retained. Point to.
【0060】
「ハイブリダイゼーション」は、所定のハイブリダイゼーション条件下で塩基
対を形成することによって、一本鎖ポリヌクレオチドが相補的鎖とアニーリング
するプロセスを指す。特異的ハイブリダイゼーションは、2つの核酸配列が高い
相同性を共有することを示すものである。特異的ハイブリダイゼーション複合体
は許容されるアニーリング条件下で形成され、「洗浄」ステップ後もハイブリダ
イズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのス
トリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、更にストリンジェントな条件
では、非特異結合(即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合)が減少する。
核酸配列のアニーリングに対する許容条件は、当分野における当業者が慣例的に
決定する。許容条件はハイブリダイゼーション実験の間は一定でよいが、洗浄条
件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーション特
異性も得るように実験中に変更することができる。アニーリング許容条件は、例
えば約6×SSC、約1%(w/v)のSDS及び約100μg/mlの変性サケ精子DNAの存
在下で温度68℃において成立する。“Hybridization” refers to the process by which a single-stranded polynucleotide anneals with a complementary strand by forming base pairs under defined hybridization conditions. Specific hybridization is an indication that two nucleic acid sequences share high homology. The specific hybridization complex is formed under acceptable annealing conditions and remains hybridized after the "wash" step. The wash step is particularly important in determining the stringency of the hybridization process, and more stringent conditions reduce non-specific binding (ie, pair binding between inconsistent nucleic acid strands).
Permissive conditions for the annealing of nucleic acid sequences are routinely determined by those of ordinary skill in the art. Permissive conditions may be constant during the hybridization experiment, but wash conditions can be varied during the experiment to obtain the desired stringency, and thus hybridization specificity. The annealing permissive conditions are satisfied at a temperature of 68 ° C. in the presence of, for example, about 6 × SSC, about 1% (w / v) SDS and about 100 μg / ml denatured salmon sperm DNA.
【0061】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、或る程度、洗浄ス
テップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通
常、所定のイオン強度及びpHにおける特異配列の融点(Tm)より約5〜20℃低
くなるように選択する。このTmは、所定のイオン強度及びpHの下で、完全に一致
するプローブに標的配列の50%がハイブリダイズする温度である。Tmを計算す
る式及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook ら
(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring
Harbor Press, Plainview NYに記載されており、特に2巻の9章を参照されたい
。In general, hybridization stringency can be expressed in part to the temperature at which the wash step is performed. Such washing temperatures are usually selected to be about 5 to 20 ° C. below the melting point (Tm) of the specific sequence at a given ionic strength and pH. This Tm is the temperature at which 50% of the target sequence hybridizes to a perfectly matched probe under a given ionic strength and pH. The formula for calculating the Tm and the hybridization conditions for nucleic acids are well known and are described by Sambrook et al.
(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2nd edition, Volume 1-3, Cold Spring
See Harbor Press, Plainview NY, see in particular Volume 2, Chapter 9.
【0062】
本発明のポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションに対する高ストリンジ
ェンシー条件には、約0.2×SSC及び約1%のSDS存在下で約68℃において1
時間の洗浄条件が含まれる。或いは、65℃、60℃、55℃または42℃の温
度で行ってもよい。SSC濃度は、約0.1%のSDS存在下で、約0.1〜2×SSCの
範囲で変化し得る。通常は、遮断剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻
止する。このような遮断剤には、例えば、約100〜200μg/mlの変性サケ精
子DNAがある。特定条件下で、例えばRNAとDNAのハイブリダイゼーションに有機
溶剤、例えば約35〜50%v/vの濃度のホルムアミドを用いることもできる。
洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼ
ーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類
似性を示唆し得る。このような類似性は、ヌクレオチド及びヌクレオチドにコー
ドされるポリペプチドに対する類似の役割を強く示唆している。High stringency conditions for hybridization between polynucleotides of the invention include 1 at about 68 ° C. in the presence of about 0.2 × SSC and about 1% SDS.
Time wash conditions are included. Alternatively, it may be performed at a temperature of 65 ° C, 60 ° C, 55 ° C or 42 ° C. The SSC concentration can vary in the range of about 0.1 to 2 × SSC in the presence of about 0.1% SDS. Blockers are usually used to block non-specific hybridization. Such blocking agents include, for example, about 100-200 μg / ml denatured salmon sperm DNA. Under certain conditions, it is also possible to use organic solvents, eg formamide at a concentration of about 35-50% v / v, for the hybridization of eg RNA and DNA.
Useful variations of wash conditions will be apparent to those of skill in the art. Hybridization can suggest evolutionary similarities between nucleotides, especially under conditions of high stringency. Such similarities strongly suggest a similar role for nucleotides and nucleotide-encoded polypeptides.
【0063】
「ハイブリダイゼーション複合体」の語は、相補的塩基対間の水素結合の形成
力によって2つの核酸配列間に形成された複合体を指す。ハイブリダイゼーショ
ン複合体は、溶解状態で形成し得る(C0tまたはR0t解析等)。或いは、一方の核
酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体(例えば紙、膜、
フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、或いは他の適切な基質であって
細胞若しくはその核酸が固定される基質)に固定されているような2つの核酸配
列間に形成され得る。The term “hybridization complex” refers to a complex formed between two nucleic acid sequences by virtue of the ability to form hydrogen bonds between complementary base pairs. A hybridization complex may be formed in solution (C 0 t or R 0 t analysis, etc.). Alternatively, one nucleic acid sequence is present in solution and the other nucleic acid sequence is present on a solid support (eg paper, membrane,
It may be formed between two nucleic acid sequences such as filters, chips, pins or glass slides, or other suitable substrate that is immobilized on a substrate on which cells or their nucleic acids are immobilized).
【0064】
「挿入」及び「付加」の語は、1若しくは数個のアミノ酸残基またはヌクレオ
チド配列を各々付加するようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を
指す。The terms "insertion" and "addition" refer to changes in amino acid or nucleotide sequences that add one or several amino acid residues or nucleotide sequences, respectively.
【0065】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関
連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種
々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現
によって特徴づけることができる。“Immune response” may refer to a condition associated with inflammation, trauma, immune disorders, contagious diseases or genetic disorders. These conditions can be characterized by the expression of various factors, such as cytokines, chemokines, and other signaling molecules that can act on the cellular and systemic defense system.
【0066】
「免疫抗原性断片」とは、哺乳動物等の生命体に導入されると免疫応答を誘発
し得るようなLIMDのポリペプチドまたはオリゴペプチド断片である。「免疫抗原
性断片」の語には、本明細書中で開示したような或いは当分野で既知であるよう
な任意の抗体産出方法において有用なLIMDの任意のポリペプチドまたはオリゴペ
プチド断片も含まれる。“Immune antigenic fragment” is a polypeptide or oligopeptide fragment of LIMD capable of eliciting an immune response when introduced into an organism such as a mammal. The term "immunogenic fragment" also includes any polypeptide or oligopeptide fragment of LIMD useful in any method of raising antibodies as disclosed herein or as known in the art. .
【0067】
「マイクロアレイ」の語は、基質上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチド
またはその他の化合物の構成を指す。The term “microarray” refers to a composition of multiple polynucleotides, polypeptides or other compounds on a substrate.
【0068】
「エレメント」または「アレイエレメント」の語は、マイクロアレイの環境に
おいて、基質の表面上に配置されたハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを指
す。The term “element” or “array element” refers to a hybridizable polynucleotide located on the surface of a substrate in the environment of a microarray.
【0069】
「調節(する)」の語は、LIMDの活性の変化を指す。調節することによって例え
ば、LIMDのタンパク質活性、結合特性その他の生物学的、機能的または免疫学的
特性が増大または低下し得る。The term “modulate” refers to a change in the activity of LIMD. Modulation may, for example, increase or decrease the protein activity, binding properties and other biological, functional or immunological properties of LIMD.
【0070】
「核酸」及び「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリ
ヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」及び「核酸配列」の語は、ゲ
ノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるか或
いはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド
核酸(PNA)や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。The terms “nucleic acid” and “nucleic acid sequence” refer to nucleotides, oligonucleotides, polynucleotides or fragments thereof. The terms "nucleic acid" and "nucleic acid sequence" refer to DNA or RNA of genomic or synthetic origin, which may be single-stranded or double-stranded, or represent the sense or antisense strand, or It may also refer to peptide nucleic acid (PNA) or any DNA-like or RNA-like substance.
【0071】
「機能的に結合した」は、第1核酸配列が第2核酸配列と機能的な関係がある
ように配置された状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または
発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に結
合している。同一のリーディングフレーム内で2つのタンパク質コード領域を結
合する必要がある場合、一般に、機能的に結合したDNA配列は非常に近接するか
、或いは連続し得る。“Operably linked” refers to the state in which a first nucleic acid sequence is placed into a functional relationship with a second nucleic acid sequence. For example, a promoter is operably linked to a coding sequence if the promoter affects the transcription or expression of the coding sequence. Generally, operably linked DNA sequences may be in close proximity or contiguous if it is necessary to join the two protein coding regions in the same reading frame.
【0072】
「ペプチド核酸」(PNA)は、アンチセンス分子または抗遺伝子物質であって
、リジンを末端とするアミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合した、少なく
とも約5ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドからなるものを指す。末端の
リジンは、成分に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的
に結合して転写の拡張を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細
胞におけるPNAの寿命を延長し得る。“Peptide nucleic acid” (PNA) is an antisense molecule or anti-gene substance, consisting of an oligonucleotide of at least about 5 nucleotides in length linked to a peptide backbone of lysine-terminated amino acid residues. Refers to something. The terminal lysine confers solubility to the components. PNAs preferentially bind complementary single-stranded DNA or RNA to stop the expansion of transcription, and can be polyethylene glycolated to prolong PNA lifespan in cells.
【0073】
LIMDの「翻訳後修飾」は、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラ
セミ化、タンパク分解性分割及びその他の当分野で既知の修飾を含み得る。これ
らのプロセスは、合成的または生化学的に発生し得る。生化学的修飾は、LIMDの
酵素環境に依存し、細胞タイプによって変化し得る。“Post-translational modifications” of LIMD can include lipidation, glycosylation, phosphorylation, acetylation, racemization, proteolytic resolution and other modifications known in the art. These processes can occur synthetically or biochemically. Biochemical modifications depend on the enzymatic environment of LIMD and can vary by cell type.
【0074】
「プローブ」は、LIMD、LIMDの相補配列またはこれらの断片をコードする核酸
配列を指し、同一核酸配列、対立遺伝子核酸配列または関連する核酸配列の検出
に用いられる。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオ
チドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合したものである。典
型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬及び酵素がある
。「プライマー」は、短い核酸、通常はDNAオリゴヌクレオチドであり、相補的
塩基対を形成することで標的ポリヌクレオチドにアニーリングされ得る。プライ
マーは次に、DNAポリメラーゼ酵素によって標的DNA鎖に延在し得る。プライマー
対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による核酸配列の増幅(及び同定)
に用い得る。“Probe” refers to a nucleic acid sequence that encodes LIMD, a complementary sequence to LIMD, or a fragment thereof, and is used to detect identical nucleic acid sequences, allelic nucleic acid sequences, or related nucleic acid sequences. A probe is an isolated oligonucleotide or polynucleotide attached to a detectable label or reporter molecule. Typical labels include radioactive isotopes, ligands, chemiluminescent reagents and enzymes. A "primer" is a short nucleic acid, usually a DNA oligonucleotide, which can anneal to a target polynucleotide by forming complementary base pairs. The primer can then extend to the target DNA strand by a DNA polymerase enzyme. Primer pairs are used to amplify (and identify) nucleic acid sequences by, for example, polymerase chain reaction (PCR).
Can be used for.
【0075】
本発明に用いるようなプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の少なくと
も15の連続したヌクレオチドを含んでいる。特異性を高めるために長めのプロ
ーブ及びプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも20、25、30、
40、50、60、70、80、90、100または少なくとも150の連続し
たヌクレオチドからなるようなプローブ及びプライマーを用いてもよい。これよ
りもかなり長いプローブ及びプライマーもある。表、図面及び配列リストを含む
本明細書に裏付けされた任意の長さのヌクレオチドを用いることができるものと
理解されたい。Probes and primers as used in the present invention typically contain at least 15 contiguous nucleotides of known sequence. Longer probes and primers to increase specificity, eg at least 20, 25, 30, of the disclosed nucleic acid sequences,
Probes and primers that consist of 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 or at least 150 contiguous nucleotides may be used. Some probes and primers are much longer than this. It is understood that any length of nucleotides supported herein, including tables, figures and sequence listings, can be used.
【0076】
プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Sambrook, J. ら (1
989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring H
arbor Press, Plainview NY、Ausubel, F.M. ら, (1987) Current Protocols in Molecular Biology
, Greene Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York
NY、Innisら (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications Ac
ademic Press, San Diego CA等を参照されたい。PCRプライマー対は、その目的
のためのコンピュータプログラム、例えばPrimer(Version 0.5, 1991, Whitehe
ad Institute for Biomedical Research, Cambridge MA)を用いるなどして既知
の配列から得ることができる。For preparation and use of probes and primers, see Sambrook, J. et al. (1.
989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2nd edition, Volume 1-3, Cold Spring H
arbor Press, Plainview NY, Ausubel, FM et al., (1987) Current Protocols in Molecular Biology , Greene Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York.
NY, Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications Ac
See ademic Press, San Diego CA, etc. PCR primer pairs are computer programs for that purpose, such as Primer (Version 0.5, 1991, Whitehe
Ad Institute for Biomedical Research, Cambridge MA).
【0077】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは、そのような目的のために当分
野でよく知られているソフトウェアを用いて選択する。例えばOLIGO 4.06ソフト
ウェアは、各100ヌクレオチドまでのPCRプライマー対の選択に有用であり、
オリゴヌクレオチド及び最大5,000までの大きめのポリヌクレオチドであっ
て32キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得たものを分析す
るのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための
追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム(テキサ
ス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向
けに入手可能)は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能
であり、従ってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Prim
er3プライマー選択プログラム(マサチューセッツ州ケンブリッジのWhitehead I
nstitute/MITゲノム研究センターから一般向けに入手可能)ではユーザーが「
ミスプライミング・ライブラリ」をインプットすることができ、ここでプライマ
ー結合部位として避けたい配列はユーザーが指定する。Primer3は特に、マイク
ロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である(後二者のプライマー
選択プログラムのソースコードは、各自のソースから得てユーザー固有のニーズ
を満たすように変更してもよい)。PrimerGenプログラム(英国ケンブリッジ市
の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト-リソースセンターから一般向けに入
手可能)は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それに
よって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域の何
れかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、この
プログラムは、固有であって保存されたオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチ
ドの断片の同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴ
ヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片は、ハイブリダイゼーション技術にお
いて、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエ
レメントとして、或いは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌ
クレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選
択方法は、上記の方法に限定されるものではない。Oligonucleotides used as primers are selected using software well known in the art for such purposes. For example, OLIGO 4.06 software is useful for selecting PCR primer pairs of up to 100 nucleotides each,
It is also useful for analyzing oligonucleotides and polynucleotides of up to 5,000 sizes obtained from input polynucleotide sequences of up to 32 kilobases. A similar primer selection program incorporates additional functionality for expanded capacity. For example, the PrimOU primer selection program (available to the public from the Genome Center at the University of Texas Southwestern Medical Center in Dallas, Texas) is capable of selecting a particular primer from a megabase sequence, thus covering the entire genome. Useful for designing primers. Prim
er3 Primer Selection Program (Whitehead I, Cambridge, MA)
(available publicly from the Institute / MIT Genome Research Center)
A "mispriming library" can be input, and the user specifies the sequence to be avoided as a primer binding site. Primer3 is particularly useful for the selection of oligonucleotides for microarrays (the source code of the latter two primer selection programs may be modified from individual sources to meet user-specific needs). The PrimerGen Program (UK Human Genome Mapping Project in Cambridge, UK-Publicly available from the Resource Center) designs primers based on multiple sequence alignments, thereby maximally or minimally conserving the aligned nucleic acid sequences. Allows selection of primers to hybridize with any of the regions. Therefore, this program is useful for identifying unique and conserved fragments of oligonucleotides and polynucleotides. Oligonucleotide and polynucleotide fragments identified by any of the above selection methods can be used to identify fully or partially complementary polynucleotides in hybridization techniques, such as PCR or sequencing primers, as microarray elements, or in nucleic acid samples. It is useful as a specific probe. The method for selecting the oligonucleotide is not limited to the above method.
【0078】
「組換え核酸」は天然配列ではない配列であるか或いは人為的に組み合わせな
ければ離隔しているような配列の2以上のセグメントを人為的に組み合わせて産
出した配列を有する配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって
達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例え
ば前出のSambrookらの文献に記載されているような遺伝子工学的手法によって達
成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部を付加、置換または欠失した変異核
酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に結合した核酸
配列が含まれる。このような組換え核酸は、ベクターの不可欠なエレメントであ
って例えばある細胞を形質転換するために用いられるようなものであり得る。A “recombinant nucleic acid” is a sequence that is either a non-native sequence or a sequence that has been produced by artificially combining two or more segments of a sequence that would be separated unless artificially combined. . This artificial combination is often accomplished by chemical synthesis, but more commonly by artificial manipulation of isolated segments of nucleic acids, such as by genetic engineering techniques such as those described in Sambrook et al., Supra. To do. The term recombinant nucleic acid also includes mutant nucleic acids in which a portion of the nucleic acid is simply added, substituted or deleted. Frequently, recombinant nucleic acids include a nucleic acid sequence operably linked to a promoter sequence. Such recombinant nucleic acid may be an integral element of the vector, such as that used to transform a cell.
【0079】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの不可欠なエレメントであ
って例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。ワクシニアウイルスは
組換え核酸が発現される哺乳動物のワクチン接種に用いるもので、哺乳動物の防
御免疫応答を誘導する。Alternatively, such recombinant nucleic acid may be an integral element of the viral vector, for example based on vaccinia virus. Vaccinia virus is used for vaccination of mammals in which recombinant nucleic acid is expressed and induces a protective immune response in mammals.
【0080】
「調節エレメント」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり
、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び5'及び3'の非翻訳領域(UTR
)を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはRNA安定性を調節する宿主また
はウイルスタンパク質と相互作用する。A “regulatory element” is a nucleic acid sequence usually derived from the untranslated region of a gene, including enhancers, promoters, introns and 5 ′ and 3 ′ untranslated regions (UTRs).
)including. Regulatory elements interact with host or viral proteins that regulate transcription, translation or RNA stability.
【0081】
「レポーター分子」とは、核酸、アミノ酸または抗体を標識するのに用いられ
る化学的または生化学的成分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、
蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子及びその他
の当分野で既知の成分がある。A “reporter molecule” is a chemical or biochemical moiety used to label nucleic acids, amino acids or antibodies. Reporter molecules include radionuclides, enzymes,
Fluorescent agents, chemiluminescent agents, chromogenic agents, substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles and other ingredients known in the art.
【0082】
DNA配列に関する「RNA等価物」は、発生した窒素塩基チミンが全てウラシルに
置換されていることと、糖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボース
から構成されていることを除いて、参照DNA配列と同一のヌクレオチド線形配列
から構成されている。An “RNA equivalent” with respect to a DNA sequence is a reference DNA, except that all of the generated nitrogen base thymine is replaced by uracil and that the sugar backbone is composed of ribose rather than deoxyribose. It is composed of a linear nucleotide sequence identical to the sequence.
【0083】
「サンプル」の語は、その最も広い意味で用いられる。LIMDをコードする核酸
若しくはその断片、またはLIMD自体を含む疑いのあるサンプルは、体液や、細胞
から単離された細胞、染色体、細胞小器官または膜からの抽出物や、細胞や、溶
解しているか基質に結合しているゲノムDNA、RNAまたはcDNAや、組織や、組織プ
リント等から構成され得る。The term “sample” is used in its broadest sense. A sample suspected of containing LIMD-encoding nucleic acid or a fragment thereof, or LIMD itself, may be extracted from body fluids, cells isolated from cells, chromosomes, organelles or membranes, cells or lysed. Or may be composed of genomic DNA, RNA or cDNA bound to a substrate, tissue, tissue print, or the like.
【0084】
「特異結合」または「特異的に結合する」の語は、タンパク質またはペプチド
と、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、任意の天然成分または合成結
合成分との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造(例
えば抗原決定基即ちエピトープ)であって結合分子が認識するものが存在するか
否かに依存していることを意味している。例えば、抗体がエピトープ「A」に対
して特異的であれば、エピトープA即ち遊離の非標識A及び抗体を含む反応にお
いて、遊離の非標識Aを含むポリヌクレオチドの存在が、抗体に結合する標識A
の量を低減させることになる。The term “specific binding” or “specifically binds” refers to the interaction between a protein or peptide and an agonist, antibody, antagonist, small molecule, any natural or synthetic binding moiety. This interaction is meant to depend on the presence or absence of a particular structure of the protein (eg an antigenic determinant or epitope) that the binding molecule recognizes. For example, if the antibody is specific for epitope "A", the presence of the polynucleotide containing free unlabeled A in a reaction involving epitope A, free unlabeled A, and the antibody will result in a label that binds to the antibody. A
Will be reduced.
【0085】
「実質上精製された」の語は、自然環境から取り除かれ、或いは単離または分
離された核酸またはアミノ酸配列であって、自然に会合するその他の構成エレメ
ントの少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約75%、最も好ましいのは
少なくとも約90%が遊離しているものを指す。The term “substantially purified” is a nucleic acid or amino acid sequence that has been removed or isolated or separated from its natural environment and is at least about 60%, preferably at least 60%, of the other naturally associated components. Indicates at least about 75%, and most preferably at least about 90% free.
【0086】
「置換」は、1若しくは数個のアミノ酸またはヌクレオチドを各々別のアミノ
酸またはヌクレオチドに置換することを意味する。“Substitution” means the replacement of one or several amino acids or nucleotides by different amino acids or nucleotides.
【0087】
「基質」は、任意の好適な固体または半固体の支持体を指すものであって、膜
、フィルタ、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁性非磁性ビーズ、ゲル
、管、プレート、ポリマー、微細粒子、毛管が含まれる。基質は、壁、溝、ピン
、チャネル、孔等、様々な表面形態を有することができ、基質表面にはポリヌク
レオチドやポリペプチドが結合する。“Substrate” refers to any suitable solid or semi-solid support, including membranes, filters, chips, slides, wafers, fibers, magnetic non-magnetic beads, gels, tubes, plates, polymers. , Fine particles, capillaries are included. The substrate can have various surface morphologies such as walls, grooves, pins, channels, pores, etc., on which the polynucleotide or polypeptide binds.
【0088】
「転写イメージ」は、所与の時間、条件での固有の細胞タイプまたは組織によ
る遺伝子発現の集合的パターンを指す。“Transcriptional image” refers to the collective pattern of gene expression by a unique cell type or tissue at a given time, condition.
【0089】
「形質転換」は、外来性のDNAが宿主細胞に入り込み、宿主細胞を変化させる
プロセスを表す。形質転換は、当分野で知られている種々の方法に従って自然条
件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核または真核
宿主細胞に挿入する任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転
換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法
には、ウイルス感染、電気穿孔法(エレクトロポレーション)、熱ショック、リ
ポフェクション及び微粒子照射を用いる方法がある。「形質転換された」細胞の
語には、限られた時間内に挿入されたDNAやRNAを発現するような一時的に形質転
換された細胞のみならず、安定的に形質転換された細胞であってその中に挿入さ
れたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主の染色体の一部として
複製可能であるものも含まれる。“Transformation” refers to the process by which exogenous DNA enters a host cell and modifies the host cell. Transformation can occur under natural or artificial conditions according to various methods known in the art and is based on any known method of inserting an exogenous nucleic acid sequence into a prokaryotic or eukaryotic host cell. You can The method of transformation is selected according to the type of host cell to be transformed. Transformation methods include, but are not limited to, methods using viral infection, electroporation, heat shock, lipofection and particulate irradiation. The term "transformed" cell includes not only transiently transformed cells that express the inserted DNA or RNA within a limited time, but also stably transformed cells. There is also included one in which the DNA inserted therein is capable of replicating autonomously as a plasmid or as a part of the host chromosome.
【0090】
本明細書中で用いられる「遺伝形質転換体」とは任意の有機体であり、限定す
るものではないが動植物を含み、有機体の1若しくは数個の細胞が、ヒトの関与
によって、例えば当分野でよく知られている形質転換技術によって導入された異
種核酸を有する。核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質
に導入することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によ
って或いは組換えウイルスの導入によって行う。遺伝子操作の語は、古典的な交
雑育種或いはin vitro受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指すも
のである。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シア
ノバクテリア、真菌及び動植物がある。本発明の単離されたDNAは、当分野で知
られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって
宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような有機体に移入する技術
はよく知られており、前出のSambrook ら (1989) 等の参考文献に与えられてい
る。As used herein, a “genetic transformant” is any organism, including, but not limited to, plants and animals, in which one or a few cells of the organism are associated with human involvement. , Having a heterologous nucleic acid introduced, for example, by transformation techniques well known in the art. The introduction of the nucleic acid into the cells is carried out directly or indirectly by introducing them into the precursors of the cells, by deliberate genetic manipulation, for example by microinjection or by introduction of recombinant virus. The term genetic engineering does not refer to classical cross breeding or in vitro fertilization, but to the introduction of recombinant DNA molecules. Genetic transformants contemplated according to the present invention include bacteria, cyanobacteria, fungi and plants and animals. The isolated DNA of the present invention can be introduced into the host by methods known in the art, such as infection, transfection, transformation or transconjugation. Techniques for transferring the DNA of the invention to such organisms are well known and provided in the references such as Sambrook et al. (1989) supra.
【0091】
特定の核酸配列の「変異体」は、核酸配列1本全部の長さに対して特定の核酸
配列と少なくとも40%の配列相同性を有する核酸配列であると定義する。その
際、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0
.9(1999年5月7日)と共にblastnを用いる。このような核酸対は、所定の長さに
対して、例えば少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、
95%、98%またはそれ以上の相同性を示し得る。或る変異体は、例えば「対
立遺伝子」変異体(前述)、「スプライス」変異体、「種」変異体または「多型
」変異体として説明し得る。スプライス変異体は参照分子とかなりの相同性を有
し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソンの交互スプライシングによって通常
多数の或いは僅かな数のポリヌクレオチドを有することになる。対応するポリペ
プチドは、追加機能ドメインを有するか或いは参照分子に存在するドメインが欠
落していることがある。種変異体は、種相互に異なるポリヌクレオチド配列であ
る。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互にかなりのアミノ酸相同性を有す
る。多型変異体は、与えられた種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチド配
列が異なる。また、多型変異体は、1つのヌクレオチド塩基によってポリヌクレ
オチド配列が変化する「一塩基多型」(SNP)を含み得る。SNPの存在は、例えば
特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。A “variant” of a particular nucleic acid sequence is defined as a nucleic acid sequence having at least 40% sequence homology with the particular nucleic acid sequence over the length of the entire nucleic acid sequence. At that time, "BLAST 2 Sequences" tool Version 2.0 set to default parameters
.9 (May 7, 1999) with blastn. Such nucleic acid pairs may be, for example, at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, for a given length.
It may show 95%, 98% or more homology. Certain variants may be described as, for example, "allelic" variants (supra), "splice" variants, "species" variants or "polymorphic" variants. Splice variants may have considerable homology to the reference molecule, but will typically have a large or small number of polynucleotides due to the alternative splicing of exons during mRNA processing. The corresponding polypeptide may have additional functional domains or may lack domains present in the reference molecule. Species variants are polynucleotide sequences that differ from one another. The resulting polypeptides usually have significant amino acid homology to each other. Polymorphic variants differ in the polynucleotide sequence of a particular gene between individuals of a given species. Polymorphic variants may also include "single nucleotide polymorphisms" (SNPs) in which the polynucleotide sequence changes by one nucleotide base. The presence of SNPs may indicate, for example, a particular population, medical condition or propensity.
【0092】
特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の1本の長さ全体
で特定のポリペプチド配列に対して少なくとも40%の相同性を有するポリペプ
チド配列として画定される。ここで、デフォルトパラメータに設定した「BLAST
2 Sequences」ツールVersion 2.0.9(1999年5月7日)を用いてblastpを実行する
。このようなポリペプチド対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも50%
、60%、70%、80%、90%、95%、98%またはそれ以上の相同性を
示し得る。A “variant” of a particular polypeptide sequence is defined as a polypeptide sequence that has at least 40% homology to the particular polypeptide sequence over the length of one of the polypeptide sequences. Here, "BLAST
2 Sequences ”tool Version 2.0.9 (May 7, 1999) to run blastp. Such a polypeptide pair may have, for example, at least 50% for a given length.
, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% or more homology.
【0093】
発明
本発明は、新規なヒトLIMドメインタンパク質(LIMD)、LIMDをコードするポ
リヌクレオチド、及び、細胞増殖異常、発達障害及び細胞運動異常の診断、治療
並びに予防にこれらの配列を利用する方法の発見に基づくものである。 Invention The present invention utilizes a novel human LIM domain protein (LIMD), a polynucleotide encoding LIMD, and these sequences for the diagnosis, treatment and prevention of cell proliferation disorders, developmental disorders and cell motility disorders. It is based on the discovery of methods.
【0094】
表1は、LIMDをコードする完全長のヌクレオチド配列の構築に用いたIncyteク
ローンを示す。列1及び列2は、ポリペプチド及びポリヌクレオチドの配列番号
(SEQ ID NO)を各々示している。列3はIncyteクローンのクローンIDを示して
おり、各LIMDをコードする核酸はここで同定されたものである。列4はcDNAライ
ブラリを示しており、列3のクローンはここから単離したものである。列5は、
Incyteクローン及びこれに対応するcDNAライブラリを示している。cDNAライブラ
リが示されていないIncyteクローンは、プールされているcDNAライブラリから得
られたものである。列5のIncyteクローンを用いて各LIMDのコンセンサスヌクレ
オチド配列を構築した。列5のIncyteクローンは、ハイブリダイゼーション技術
における断片として有用である。Table 1 shows the Incyte clones used to construct the full length nucleotide sequence encoding LIMD. Columns 1 and 2 show the SEQ ID NOs for the polypeptides and polynucleotides, respectively (SEQ ID NO). Column 3 shows the clone ID of the Incyte clone, the nucleic acid encoding each LIMD is the one identified here. Column 4 shows the cDNA library and the clone in column 3 was isolated from it. Column 5 is
Incyte clones and corresponding cDNA libraries are shown. The Incyte clone for which the cDNA library is not shown was obtained from a pooled cDNA library. The Incyte clone in row 5 was used to construct a consensus nucleotide sequence for each LIMD. The Incyte clone in row 5 is useful as a fragment in hybridization techniques.
【0095】
表2の列は、本発明の各ポリペプチドの様々な特性を示している。列1は配列
番号(SEQ ID NO)を、列2は各ポリペプチド中のアミノ酸残基の数を、列3は
潜在的リン酸化部位を、列4は潜在的グリコシル化部位を、列5はサイン(sign
ature)配列及びモチーフを有するアミノ酸残基を、列6はBLAST分析によって同
定された相同配列、列7は分析方法と場合によってはその分析方法が利用できる
検索可能なデータベースを示している。列7の分析方法を用いて、配列相同性及
びタンパク質モチーフから各ポリペプチドの特徴付けを行った。図3A及び3B
に示すように、LIMD-1はヒトFHL-1(GI 2853224、SEQ ID NO:5)と化学的及び構
造的相同性を有する。特に、LIMD-1及びヒトFHL-1は全体で93%の同一性を共
有している。尤も、LIMD-1の方が短いので、配列番号5の最初の90残基との類
似性に欠けている。図4A、4B及び4Cに示すように、LIMD-2はヒトLIM型Zn
フィンガータンパク質(GI 2624922、SEQ ID NO:6)と化学的及び構造的相同性
を有する。特に、LIMD-2及びヒトLIM型Znフィンガータンパク質は全体で18%
の同一性を共有し、配列番号2ではC501からS564まで及び配列番号6ではC272か
らS335までC末端LIMドメインにおいて58%の同一性を共有している。The columns of Table 2 show various properties of each polypeptide of the invention. Column 1 is the SEQ ID NO, column 2 is the number of amino acid residues in each polypeptide, column 3 is the potential phosphorylation site, column 4 is the potential glycosylation site, column 5 is Sign
ature) amino acid residues having a sequence and a motif, column 6 shows a homologous sequence identified by BLAST analysis, and column 7 shows an analytical method and, in some cases, a searchable database in which the analytical method can be used. The analytical methods in column 7 were used to characterize each polypeptide from sequence homology and protein motifs. 3A and 3B
As shown in, LIMD-1 has chemical and structural homology with human FHL-1 (GI 2853224, SEQ ID NO: 5). In particular, LIMD-1 and human FHL-1 share 93% overall identity. However, because LIMD-1 is shorter, it lacks similarity to the first 90 residues of SEQ ID NO: 5. As shown in FIGS. 4A, 4B and 4C, LIMD-2 is human LIM type Zn.
It has chemical and structural homology with the finger protein (GI 2624922, SEQ ID NO: 6). In particular, LIMD-2 and human LIM-type Zn finger proteins account for 18% in total.
SEQ ID NO: 2 shares C501 to S564 and SEQ ID NO: 6 shares C272 to S335 with 58% identity in the C-terminal LIM domain.
【0096】
表3の列は、組織特異性と、LIMDをコードするヌクレオチド配列に関係がある
疾患、障害または症状とを示している。表3の列1はヌクレオチドの配列番号を
、列2は列1のヌクレオチド配列の断片を示している。これらの断片は、例えば
配列番号3乃至4を同定し、配列番号3乃至4と関連するポリヌクレオチド配列
を区別するためのハイブリダイゼーションまたは増幅の技術において有用である
。これらの断片によりコードされるポリヌクレオチドは、例えば免疫抗原性ペプ
チドとして有用である。列3は、LIMDを発現する組織カテゴリーを組織全体に対
するLIMD発現割合として示している。列4は、LIMDを発現する組織に関連する疾
患、障害または症状を、LIMDを発現する組織全体に対する割合として示している
。列5は、各cDNAライブラリをサブクローニングするために用いたベクターを示
している。The columns of Table 3 show the tissue specificity and the disease, disorder or condition associated with the nucleotide sequence encoding LIMD. Column 3 of Table 3 shows the nucleotide sequence numbers and column 2 shows the fragments of the nucleotide sequences of column 1. These fragments are useful in, for example, hybridization or amplification techniques to identify SEQ ID NOS: 3-4 and distinguish polynucleotide sequences related to SEQ ID NOS: 3-4. Polynucleotides encoded by these fragments are useful, for example, as immunogenic peptides. Column 3 shows the tissue categories that express LIMD as a percentage of LIMD expression over the whole tissue. Column 4 shows diseases, disorders or conditions associated with LIMD expressing tissues as a percentage of total LIMD expressing tissues. Column 5 shows the vector used to subclon each cDNA library.
【0097】
表4の列では、cDNAライブラリの作製に用いた組織の説明を示している。LIMD
をコードするcDNAのクローンは、このcDNAライブラリから単離したものである。
列1は、ヌクレオチドの配列番号を、列2はクローン単離源であるcDNAライブラ
リを、列3は列2のcDNAライブラリに関連する組織の採取源その他の書誌的情報
を示している。The columns of Table 4 provide a description of the tissues used to create the cDNA library. LIMD
The clone of the cDNA coding for was isolated from this cDNA library.
Column 1 shows the nucleotide sequence number, column 2 shows the cDNA library that is the clonal isolation source, and column 3 shows the source of tissue and other bibliographic information related to the cDNA library in column 2.
【0098】
配列番号3は、173.6から179.8センチモルガンの間隔内で染色体Xに
マッピングする。この間隔には、眼脳腎症候群、シンプソン異形症症候群、レッ
シュ‐ナイハン症候群及び脆弱X染色体精神遅滞に関連する遺伝子も含まれる。SEQ ID NO: 3 maps to chromosome X within the interval of 173.6 to 179.8 centimorgans. This interval also includes genes associated with ocular-brain kidney syndrome, Simpson's dysmorphic syndrome, Lesch-Nyhan syndrome and fragile X chromosome mental retardation.
【0099】
配列番号4は、56.7から60.5センチモルガンの間隔内で染色体16にマ
ッピングする。この間隔には、家族性高コレステロール血症に関連する遺伝子も
含まれる。SEQ ID NO: 4 maps to chromosome 16 within the interval of 56.7 to 60.5 centimorgans. This interval also includes genes associated with familial hypercholesterolemia.
【0100】
本発明には、LIMDの変異体も含まれる。好適なLIMDの変異体のアミノ酸配列は
、LIMDアミノ酸配列と少なくとも約85%、約90%、または約95%もの一致
率を有し、LIMDの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも1つ有するような変異
体である。The present invention also includes variants of LIMD. A preferred LIMD variant amino acid sequence has at least about 85%, about 90%, or even about 95% concordance with the LIMD amino acid sequence, such that it has at least one functional or structural characteristic of LIMD. It is a mutant.
【0101】
本発明には、LIMDをコードするポリヌクレオチドも含まれる。一実施例では、
本発明には、図1A、1B、1C及び1Dに示すような、LIMDをコードする配列
番号3の配列を有するポリヌクレオチド配列が含まれている。別の実施例では、
本発明には、図2A、2B、2C、2D、2E、2F及び2Gに示すような、LI
MDをコードする配列番号4の配列を有するポリヌクレオチド配列が含まれている
。配列表に示したような配列番号3乃至4のポリヌクレオチド配列は、配列表に
示されているように等価RNA配列と同等の価値を有しているが、窒素塩基チミン
の出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデオキシリボースではなくシ
リボースから構成されている。The present invention also includes polynucleotides encoding LIMD. In one embodiment,
The present invention includes a polynucleotide sequence having the sequence of SEQ ID NO: 3 encoding LIMD, as shown in Figures 1A, 1B, 1C and 1D. In another embodiment,
The present invention provides LI as shown in FIGS. 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F and 2G.
A polynucleotide sequence having the sequence of SEQ ID NO: 4 encoding MD is included. The polynucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3 to 4 as shown in the sequence listing have the same value as the equivalent RNA sequence as shown in the sequence listing, but the appearance of the nitrogen base thymine is replaced with uracil. And the sugar backbone is composed of siribose rather than deoxyribose.
【0102】
本発明には、LIMDをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列も含まれる。
具体的には、そのようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、LIMDをコードする
ポリヌクレオチド配列と少なくとも約85%、或いは少なくとも約90%、また
は少なくとも約95%もの一致率を有する。本発明の或る実施態様では、配列番
号3乃至4からなる群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも約85%、或い
は少なくとも約90%、または少なくとも約95%もの一致率を有するような配
列番号3乃至4からなる群から選択された配列を有するポリヌクレオチド配列の
変異配列を含む。上記の任意のポリヌクレオチドの変異体は、LIMDの機能的若し
くは構造的特徴を少なくとも1つ有するアミノ酸配列をコードし得る。The present invention also includes mutant sequences of the polynucleotide sequence encoding LIMD.
Specifically, the variant sequences of such polynucleotide sequences have at least about 85%, or at least about 90%, or even at least about 95% identity with the LIMD-encoding polynucleotide sequence. In some embodiments of the invention, SEQ ID NO: 3 having at least about 85%, or at least about 90%, or even at least about 95% identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 3-4. A variant sequence of a polynucleotide sequence having a sequence selected from the group consisting of Variants of any of the above polynucleotides may encode an amino acid sequence having at least one functional or structural characteristic of LIMD.
【0103】
当業者であれば、遺伝暗号の縮重の結果、LIMDをコードする多数のポリヌクレ
オチド配列(既知の遺伝子または天然の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最低限
の類似性しか有しないポリヌクレオチド配列もある)を産出し得ることは理解で
きよう。従って本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出
し得るようなありとあらゆる可能性のあるポリヌクレオチド配列変異体を網羅し
得る。これらの組合せは、天然のLIMDのポリヌクレオチド配列に適用されるよう
な標準トリプレット遺伝暗号を基に作られるものであり、このような変異は全て
明確に開示されているものと考えられる。Those skilled in the art will appreciate that, as a result of the degeneracy of the genetic code, a large number of polynucleotide sequences encoding LIMD (polynucleotide sequences with minimal similarity to those of known or naturally occurring genes) Understand that it can produce Thus, the invention may cover any and all possible polynucleotide sequence variants that may be produced by the selection of combinations based on possible codon choices. These combinations are made on the basis of the standard triplet genetic code as applied to the native LIMD polynucleotide sequences, and all such mutations are considered to be explicitly disclosed.
【0104】
LIMD及びその変異体をコードするヌクレオチド配列は通常、好適に選択された
ストリンジェントな条件下で天然のLIMDのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可
能であるが、LIMDまたはその誘導体であって実質上異なるコドンの使用法がある
もの、例えば天然に存在しないコドンの封入があるものをコードするヌクレオチ
ド配列を作り出すことは有益であろう。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基
づいて、特定の真核又は原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコ
ドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えることなく
LIMD及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質上変更する別の理由に
は、天然の配列から作製される転写物より好ましい、例えば半減期が長いなどの
特性を有するRNA転写物の作製がある。The nucleotide sequence encoding LIMD and variants thereof will generally be hybridizable to the nucleotide sequence of naturally occurring LIMD under suitably selected stringent conditions, but will be substantially LIMD or a derivative thereof. It would be beneficial to create nucleotide sequences that code for different codon usages, eg, for inclusion of non-naturally occurring codons. Based on the frequency with which the host utilizes a particular codon, the codon can be selected to increase the expression rate of the peptide occurring in a particular eukaryotic or prokaryotic host. Without changing the encoded amino acid sequence
Another reason for substantially altering the nucleotide sequence encoding LIMD and its derivatives is the production of RNA transcripts with properties that are preferable to those produced from the native sequence, eg, have a long half-life.
【0105】
本発明には、LIMD、LIMD誘導体及びこれらの断片をコードするDNA配列または
それらの断片を完全に合成化学によって作製することも含まれる。作製後、当分
野でよく知られている試薬を用いて、この合成配列を任意の様々な入手可能な発
現ベクター及び細胞系中に挿入し得る。更に、合成化学を用いてLIMDまたはその
任意の断片をコードする配列に突然変異を誘導し得る。The present invention also includes the production of DNA sequences encoding LIMD, LIMD derivatives and fragments thereof, or fragments thereof, entirely by synthetic chemistry. After construction, the synthetic sequence may be inserted into any of a variety of available expression vectors and cell lines using reagents well known in the art. In addition, synthetic chemistry may be used to induce mutations in the sequence encoding LIMD or any fragment thereof.
【0106】
更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載のポリヌ
クレオチド配列、特に配列番号3乃至4で示される配列及びそれらの断片にハイ
ブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列も含まれる(Wahl, G.M. and S.L. Berg
er (1987) Methods Enzymol. 152:399-407、Kimmel. A.R. (1987) Methods Enzy
mol. 152:507-511.等を参照)。アニーリング条件及び洗浄条件を含めたハイブ
リダイゼーション条件は、「定義」の項に記載されている。Furthermore, the present invention also provides a polynucleotide sequence capable of hybridizing to the polynucleotide sequences according to the claims, particularly the sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 4 and fragments thereof under various stringent conditions. Included (Wahl, GM and SL Berg
er (1987) Methods Enzymol. 152: 399-407, Kimmel. AR (1987) Methods Enzy
mol. 152: 507-511. Hybridization conditions, including annealing and washing conditions, are described in the "Definition" section.
【0107】
DNAシークエンシングの方法は当分野でよく知られており、DNAシークエンシン
グ方法を用いて本発明の任意の実施例を実施し得る。DNAシークエンシング方法
には酵素を用いることができ、例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、SEQUEN
ASE(US Biochemical, Cleveland OH)、Taqポリメラーゼ(PE Biosystems, Fos
ter City CA)、熱安定性T7ポリメラーゼ(Amersham, Pharmacia Biotech, Pisc
ataway NJ)を用いることができる。或いは、例えばELONGASE増幅システム(Lif
e Technologies, Gaithersburg MD)において見られるように、ポリメラーゼと
校正エキソヌクレアーゼを併用することができる。好適には、MICROLAB2200液体
転移システム(Hamilton, Reno, NV)、PTC200サーマルサイクラー(MJ Researc
h, Watertown MA)及びABI CATALYST 800サーマルサイクラー(PE Biosystems)
等の装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373 或いは 377 DNAシー
クエンシングシステム(PE Biosystems)、MEGABACE 1000 DNAシークエンシング
システム(Molecular Dynamics, Sunnyvale CA)または当分野でよく知られてい
る他の方法を用いてシークエンシングを行う。結果として得られた配列を当分野
でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する。(Ausubel, F.M. (1
997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York N
Y, unit 7.7、Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wi
ley VCH, New York NY, pp. 856-853.等を参照)。Methods of DNA sequencing are well known in the art and any method of the present invention may be practiced with DNA sequencing methods. Enzymes can be used in the DNA sequencing method, such as the Klenow fragment of DNA polymerase I, SEQUEN.
ASE (US Biochemical, Cleveland OH), Taq polymerase (PE Biosystems, Fos
ter City CA), thermostable T7 polymerase (Amersham, Pharmacia Biotech, Pisc
ataway NJ) can be used. Alternatively, for example, the ELONGASE amplification system (Lif
A polymerase and a proofreading exonuclease can be used together, as found in e Technologies, Gaithersburg MD). MICROLAB 2200 liquid transfer system (Hamilton, Reno, NV), PTC200 thermal cycler (MJ Researc)
h, Watertown MA) and ABI CATALYST 800 Thermal Cycler (PE Biosystems)
Etc. to automate sequence preparation. Sequencing is then performed using the ABI 373 or 377 DNA Sequencing System (PE Biosystems), MEGABACE 1000 DNA Sequencing System (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA) or other methods well known in the art. The resulting sequences are analyzed using various algorithms well known in the art. (Ausubel, FM (1
997) Short Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, New York N
Y, unit 7.7, Meyers, RA (1995) Molecular Biology and Biotechnology , Wi
ley VCH, New York NY, pp. 856-853.
【0108】
LIMDをコードする核酸配列を、部分的ヌクレオチド配列を利用し且つ当分野で
よく知られているPCR法をベースにした種々の方法を用いて伸長させ、プロモー
ター及び調節要素等の上流配列を検出することができる。例えば、使用し得る方
法の1つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマー及びネステッドプラ
イマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAから未知の配列を増幅する
方法である(Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic 2:318-322等を参照)。別
の方法に逆PCR法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて環
状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、既知のゲノム遺伝
子座及びその周辺の配列からなる制限断片から得る(Triglia, T.ら (1988) Nuc
leic Acids Res 16:8186等を参照)。第3の方法としてキャプチャPCR法があり
、これはヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接するDNA断片をPCR増
幅する方法に関与している(Lagerstrom, M.ら(1991) PCR Methods Applic 1:11
1-119等を参照)。この方法では、PCRを行う前に多重制限酵素の消化及び連結反
応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。
また、未知の配列を検索するために用い得る別の方法については当分野で知られ
ている。(Parker, J.D.ら (1991) Nucleic Acids Res. 19:3055-3060等を参照
)。更に、PCR、ネステッドプライマー及びPromoterFinderライブラリ(Clontec
h, Palo Alto CA)を用いてゲノムDNAをウォーキングすることができる。この手
順は、ライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン/エキソン接合
部を見付けるのに有用である。全てのPCRベースの方法に対して、市販されてい
るソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア(National Bio
sciences, Plymouth MN)或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約22
〜30ヌクレオチド、GC含有率が約50%以上、温度約68℃〜72℃で鋳型に
対してアニーリングするようにプライマーを設計し得る。The LIMD-encoding nucleic acid sequence is extended using various methods based on PCR methods that utilize partial nucleotide sequences and are well known in the art to provide upstream sequences such as promoters and regulatory elements. Can be detected. For example, the restriction site PCR method, which is one of the methods that can be used, is a method of amplifying an unknown sequence from genomic DNA in a cloning vector using universal primers and nested primers (Sarkar, G. (1993) PCR. See Methods Applic 2: 318-322). Another method is the inverse PCR method, which is a method of amplifying an unknown sequence from a circularized template using primers extended in a wide range of directions. The template is derived from a restriction fragment consisting of a known genomic locus and its surrounding sequences (Triglia, T. et al. (1988) Nuc
leic Acids Res 16: 8186 etc.). The third method is a capture PCR method, which is involved in a method of PCR-amplifying a DNA fragment adjacent to a known sequence of human and yeast artificial chromosome DNA (Lagerstrom, M. et al. (1991) PCR Methods). Applic 1:11
See 1-119 etc.). In this method, it is possible to insert a recombinant double-stranded sequence into an unknown sequence region using digestion with multiple restriction enzymes and a ligation reaction before performing PCR.
Also, there are other methods known in the art that can be used to search for unknown sequences. (See Parker, JD et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 3055-3060 etc.). In addition, PCR, nested primers and PromoterFinder library (Clontec
h, Palo Alto CA) can be used to walk genomic DNA. This procedure is useful for finding intron / exon junctions without the need to screen the library. For all PCR-based methods, commercially available software such as OLIGO 4.06 primer analysis software (National Bio
sciences, Plymouth MN) or another suitable program,
The primer can be designed to anneal to the template at ~ 30 nucleotides, a GC content of about 50% or greater, and a temperature of about 68 ° C to 72 ° C.
【0109】
完全長cDNAをスクリーニングする際は、より大きなcDNAを含むようにサイズ選
択したライブラリを用いるのが好ましい。更に、ランダムに初回抗原刺激を受け
たライブラリは、しばしば遺伝子の5'領域を有する配列を含み、オリゴd(T)ラ
イブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラ
リは、5'非転写調節領域への配列の伸長に有用となり得る。When screening for full-length cDNAs, it is preferable to use libraries that are size-selected to contain larger cDNAs. Furthermore, randomly primed libraries often contain sequences with the 5'regions of genes, which is suitable for situations where oligo d (T) libraries are unable to produce full-length cDNA. Genomic libraries can be useful for extension of sequences into 5'non-transcribed regulatory regions.
【0110】
市販されているキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングま
たはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することが
できる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離の
ための流動性ポリマーと、4つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レ
ーザで活性化される蛍光色素と、放出された波長の検出に用いるCCDカメラとを
有し得る。出力/光の強度は、適切なソフトウェア(PE Biosystems社のGENOTYP
ER、SEQUENCE NAVIGATOR等)を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロード
からコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御
可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しない
ようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。Commercially available capillary electrophoresis systems can be used to analyze the size of, or confirm the nucleotide sequence of, sequencing or PCR products. Specifically, capillary sequencing consists of a flowable polymer for electrophoretic separation, a laser-activated fluorescent dye, such as is specific for four different nucleotides, and detection of emitted wavelengths. And a CCD camera used for. Output / light intensity is measured with the appropriate software (PE Biosystems GENOTYP
ER, SEQUENCE NAVIGATOR, etc.) can be used to convert into an electric signal. The entire process from sample loading to computer analysis and electronic data display is computer controllable. Capillary electrophoresis is particularly suitable for sequencing small DNA fragments that may be present in low amounts in a particular sample.
【0111】
本発明の別の実施例では、LIMDをコードするポリヌクレオチド配列またはその
断片を、適切な宿主細胞内でLIMD、LIMDの断片またはその機能的等価物を発現さ
せるような組換えDNA分子内でクローニングし得る。遺伝暗号固有の宿重に起因
して実質的同一或いは機能的等価のアミノ酸配列をコードするような別のDNA配
列を作製し、LIMDの発現に利用し得る。In another embodiment of the invention, a polynucleotide sequence encoding LIMD or a fragment thereof is used to express a LIMD, a fragment of LIMD or a functional equivalent thereof in a suitable host cell. Can be cloned in. Another DNA sequence encoding a substantially identical or functionally equivalent amino acid sequence due to the unique duplication of the genetic code may be prepared and used for the expression of LIMD.
【0112】
種々の目的(限定するものではないが遺伝子産物のクローニング、プロセッシ
ング、発現の調節を含む)のために、LIMDコード化配列を変えるための、当分野
で通常知られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組み換えること
が可能である。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメン
テーション及びPCR再アセンブリによるDNAシャッフリングを用い、ヌクレオチド
配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチド媒介定方向突
然変異誘導を利用して、新規な制限部位の生成、グリコシル化パターンの変更、
コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を行う突然変異を導入し得る。Using methods commonly known in the art for altering the LIMD coding sequence for a variety of purposes including, but not limited to, cloning, processing, regulation of expression of gene products. Thus, the nucleotide sequences of the present invention can be recombined. Nucleotide sequences can be recombined using random fragmentation of gene fragments and synthetic oligonucleotides and DNA shuffling by PCR reassembly. For example, utilizing oligonucleotide-mediated directed mutagenesis to create new restriction sites, alter glycosylation patterns,
Mutations may be introduced that alter codon preferences, generate splice variants, and the like.
【0113】
本発明のヌクレオチドは、MolecularBreeding(Maxygen Inc., Santa Clara C
A、米国特許第5,837,458号、Chang, C.-C.ら (1999) Nat. Biotechnol. 17:793-
797、Christians, F.C.ら (1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264、Crameri, A.
ら (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319 に記載)等のDNAシャッフリング技術
の対象となり、LIMDの生物学的特性、例えば生物活性、酵素力、或いは他の分子
や化合物との結合力等を変更または向上させ得る。DNAシャッフリングは、遺伝
子断片のPCR媒介再組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを生成するプロセ
スである。ライブラリはその後、その遺伝子変異体を所望の特性に同定するよう
な選択またはスクリーニングにかける。次にこれらの好適な変異体をプールし、
更に反復してDNAシャッフリング及び選択/スクリーニングを行ってもよい。こ
のように、遺伝の多様性は「人為的」品種改良及び急速な分子の進化を経て創生
される。例えば、ランダムポイント突然変異を有する単一の遺伝子の断片を再結
合し、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリング
することができる。或いは、所定の遺伝子を同種または異種のいずれかから得た
同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子と再結合し、それによって天然に存在する複
数の遺伝子の遺伝多様性を、指図された制御可能な方法で最大化させることがで
きる。Nucleotides of the present invention are described in Molecular Breeding (Maxygen Inc., Santa Clara C
A, U.S. Patent No. 5,837,458, Chang, C.-C. et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17: 793-.
797, Christians, FC et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17: 259-264, Crameri, A.
(1996) Nat. Biotechnol. 14: 315-319), etc., and the biological properties of LIMD, such as biological activity, enzymatic activity, or binding ability to other molecules or compounds. Can be changed or improved. DNA shuffling is the process of generating a library of gene variants using PCR-mediated recombination of gene fragments. The library is then subjected to selection or screening to identify the gene variant with the desired property. Then pool these suitable variants,
Additional iterations of DNA shuffling and selection / screening may be performed. Thus, genetic diversity is created through "artificial" breeding and rapid molecular evolution. For example, fragments of a single gene with random point mutations can be recombined, screened, and then shuffled until the desired property is optimized. Alternatively, a given gene can be recombined with a homologous gene from the same gene family, either homologous or heterologous, thereby maximizing the genetic diversity of multiple naturally occurring genes in a directed and controllable manner. Can be transformed.
【0114】
別の実施例によれば、当分野でよく知られている化学的方法を用いて、LIMDを
コードする配列の全部或いは一部を合成し得る(Caruthers. M.H.ら (1980) Nuc
leic. Acids Symp. Ser 7:215-223、Horn, T.ら (1980) Nucleic. Acids Symp.
Ser. 7:225-232等を参照)。或いは、化学的方法を用いてLIMDそれ自体またはそ
の断片を合成し得る。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成
を行うことができる(Creighton, T. (1984) Proteins, Structures and Molecu lar Properties
, WH Freeman, New York NY, pp. 55-60、Roberge, J.Y. ら (19
95) Science 269:202-204等を参照)。自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイ
ザ(Perkin Elmer)を用いて達成し得る。更にLIMDのアミノ酸配列またはその任
意の一部は、直接合成する間及び/または他のタンパク質から得た配列またはそ
の任意の一部と結合する間に変更し、変異型ポリペプチドを生成し得る。According to another embodiment, all or part of the sequence encoding LIMD can be synthesized using chemical methods well known in the art (Caruthers. MH et al. (1980) Nuc).
leic. Acids Symp. Ser 7: 215-223, Horn, T. et al. (1980) Nucleic. Acids Symp.
Ser. 7: 225-232 etc.). Alternatively, chemical methods may be used to synthesize LIMD itself or fragments thereof. For example, peptide synthesis can be performed using various liquid or solid phase techniques (Creighton, T. (1984) Proteins, Structures and Molecular Properties , WH Freeman, New York NY, pp. 55-60, Roberge. , JY et al. (19
95) Science 269: 202-204 etc.). Automated synthesis can be accomplished using the ABI 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer). In addition, the amino acid sequence of LIMD, or any portion thereof, may be altered during direct synthesis and / or binding to sequences obtained from other proteins or any portion thereof to produce variant polypeptides.
【0115】
ペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質上精製し得る(
Chiez, R.M.and F.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421等を参照
)。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認
することができる(前出のCreighton, pp.28-53等を参照)。Peptides can be substantially purified using preparative high performance liquid chromatography (
Chiez, RMand FZ Regnier (1990) Methods Enzymol. 182: 392-421 etc.). The composition of synthetic peptides can be confirmed by amino acid analysis or sequencing (see Creighton, pp. 28-53, etc., supra).
【0116】
生物学的に活性なLIMDを発現させるために、LIMDをコードするヌクレオチド配
列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入することができる。好適な発現
ベクターとは即ち好適な宿主内で挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の
調節に必要な要素を含むベクターである。必要な要素には、ベクター及びLIMDを
コードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型
プロモーター、5'及び3'の非翻訳領域などの調節配列がある。このような要素
は、長さ及び特異性が様々である。固有開始シグナルを用いて、LIMDをコードす
る配列をより効果的に翻訳することが可能もある。このようなシグナルには、AT
G開始コドンと、コザック配列などの近傍の配列が含まれる。LIMDをコードする
配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場
合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。し
かしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフ
レームのATG開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含ま
れるようにすべきである。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、様々な天然物及
び合成物を起源とし得る。発現の効率は、用いられる特定の宿主細胞系に好適な
エンハンサーを包含することによって高めることができる(Scharf, D. ら (199
4) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162.等を参照)。To express a biologically active LIMD, the nucleotide sequence encoding LIMD or a derivative thereof can be inserted into a suitable expression vector. A preferred expression vector is a vector containing the elements necessary for the regulation of transcription and translation of the inserted coding sequence in a suitable host. Required elements include regulatory sequences such as enhancers, constitutive and expression-inducible promoters, 5'and 3'untranslated regions in the vector and polynucleotide sequences encoding LIMD. Such elements vary in length and specificity. It is also possible to use the unique initiation signal to more efficiently translate sequences encoding LIMD. AT for such signals
It includes the G start codon and nearby sequences such as the Kozak sequence. If the LIMD coding sequence and its initiation codon, upstream regulatory sequences are inserted into a suitable expression vector, no additional transcriptional or translational regulatory signals will be required. However, if only the coding sequence or a fragment thereof is inserted, an exogenous translational control signal containing an in-frame ATG initiation codon should be included in the expression vector. Exogenous translational elements and initiation codons can originate from a variety of natural and synthetic sources. The efficiency of expression can be enhanced by the inclusion of enhancers suitable for the particular host cell line used (Scharf, D. et al. (199
4) Results Probl. Cell Differ. 20: 125-162.
【0117】
当業者によく知られている方法を用いて、LIMDをコードする配列と、好適な転
写及び翻訳調節要素とを含む発現ベクターを構築し得る。この方法には、in vit ro
組換えDNA技術、合成技術及びin vivo遺伝子組換え技術がある(Sambrook, J.
ら (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Pr
ess, Plainview NYの4, 8, 16-17章、Ausubel, F.M. ら. (1995) Current Proto cols in Molecular Biology
, John Wiley & Sons, New York NYの9, 13, 16章等
を参照)。Methods which are well known to those skilled in the art can be used to construct expression vectors containing sequences encoding LIMD and suitable transcriptional and translational regulatory elements. The method, in vit ro recombinant DNA techniques, synthetic techniques and in vivo genetic recombination technique (Sambrook, J.
Et al. (1989) Molecular Cloning.A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Pr
ess, Plainview NY, chapters 4, 8, 16-17; Ausubel, FM et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, New York NY, chapters 9, 13, 16).
【0118】
種々の発現ベクター/宿主系を利用して、LIMDをコードする配列を保持及び発
現し得る。限定するものではないがこのような発現ベクター/宿主系には、組換
えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換
させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベ
クター(例えばバキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベク
ター(例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMVまたはタバコモザイクウイルス
TMV)または細菌発現ベクター(例えばTiまたはpBR322プラスミド)で形質転換
させた植物細胞系、動物細胞系などの微生物等がある(前出のSambrook、前出の
Ausubel、Van Heeke, G. and S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-
5509、Bitter, G.A.ら (1987) Methods Enzymol. 153:516-544; Scorer、C.A.
ら (1994) Bio/Technology 12:18 1-184; Engelhard、E.K. ら (1994) Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V. ら (1996) Hum. Gene Ther. 7:
1937-1945、タカマツ, N. (1987) EMBOJ. 6:307-311、Coruzzi, G. ら (1984) E
MBOJ. 3:1671-1680、Broglie, R. ら (1984) Science 224:838-843、Winter, J.
ら (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105、『マグローヒル科学技術
年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw
Hill New York NY, pp.191-196、Logan, J. and T. Shenk (1984) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81:3655-3659、Harrington, J.J. ら (1997) Nat. Genet. 15:
345-355等を参照)。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまた
はワクシニアウイルス由来の発現ベクターまたは種々の細菌性プラスミド由来の
発現ベクターを用いて、ポリヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団
へ輸送することができる(Di Nicola, M. ら (1998) Cancer Gen. Ther. 5(6):3
50-356、Yu, M. ら (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(13):6340-6344、Bu
ller, R.M. ら (1985) Nature 317(6040):813-815; McGregor, D.P. ら (1994)
Mol. Immunol. 31(3):219-226、Verma, I.M. and N. Somia (1997) Nature 389:
239-242等を参照)。本発明は、使用する宿主細胞によって限定されるものでは
ない。A variety of expression vector / host systems may be utilized to contain and express sequences encoding LIMD. Such expression vectors / host systems include, but are not limited to, bacteria transformed with recombinant bacteriophage, plasmids or cosmid DNA expression vectors, yeasts transformed with yeast expression vectors, and viruses. Insect cell lines infected with expression vectors (eg baculovirus) and viral expression vectors (eg cauliflower mosaic virus CaMV or tobacco mosaic virus)
TMV) or bacterial expression vectors (eg Ti or pBR322 plasmids) transformed microorganisms such as plant cell lines, animal cell lines etc. (Sambrook, supra, supra).
Ausubel, Van Heeke, G. and SM Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-
5509, Bitter, GA et al. (1987) Methods Enzymol. 153: 516-544; Scorer, CA.
(1994) Bio / Technology 12:18 1-184; Engelhard, EK et al. (1994) Proc. Na.
tl. Acad. Sci. USA 91: 3224-3227, Sandig, V. et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7:
1937-1945, Takamatsu, N. (1987) EMBOJ. 6: 307-311, Coruzzi, G. et al. (1984) E
MBOJ. 3: 1671-1680, Broglie, R. et al. (1984) Science 224: 838-843, Winter, J.
Et al (1991) Results Probl. Cell Differ. 17: 85-105, The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw
Hill New York NY, pp.191-196, Logan, J. and T. Shenk (1984) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81: 3655-3659, Harrington, JJ et al. (1997) Nat. Genet. 15:
See 345-355 etc.). Expression vectors derived from retroviruses, adenoviruses, herpesviruses or vaccinia viruses or expression vectors derived from various bacterial plasmids can be used to deliver polynucleotide sequences to target organs, tissues or cell populations (Di Nicola, M. et al. (1998) Cancer Gen. Ther. 5 (6): 3
50-356, Yu, M. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (13): 6340-6344, Bu.
ller, RM et al. (1985) Nature 317 (6040): 813-815; McGregor, DP et al. (1994).
Mol. Immunol. 31 (3): 219-226, Verma, IM and N. Somia (1997) Nature 389:
See 239-242 etc.). The present invention is not limited by the host cell used.
【0119】
細菌系では、LIMDをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて多数
のクローニングベクター及び発現ベクターを選択し得る。例えば、LIMDをコード
するポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング及び増殖
には、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはPSPORT1プラスミド(Li
fe Technologies)などの多機能大腸菌ベクターを用いることができる。LIMDを
コードする配列の、ベクターの多数のクローニング部位への連結反応によって、
lacZ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌を同定するため
の比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニング
された配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーフ
ァージによる一本鎖の救出、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう(Van He
eke, G. and S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509.等を参照)
。多量のLIMDが必要な場合、例えば抗体を生成する場合などには、LIMDの発現を
ハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導性のT5または
T7バクテリオファージプロモーターを含むベクターを使用し得る。In bacterial systems, a number of cloning and expression vectors may be chosen depending upon the use intended for the polynucleotide sequence encoding LIMD. For example, for routine cloning, subcloning and propagation of polynucleotide sequences encoding LIMD, PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla CA) or PSPORT1 plasmid (Li
multi-functional E. coli vectors such as fe Technologies) can be used. By the ligation reaction of the sequence encoding LIMD to multiple cloning sites of the vector,
The lacZ gene is disrupted, allowing a colorimetric screening method to identify transformed bacteria containing recombinant molecules. In addition, these vectors may also be useful for in vitro transcription of cloned sequences, dideoxy sequencing, single-stranded rescue by helper phage, and generation of nested deletions (Van He
eke, G. and SM Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509.
. When a large amount of LIMD is required, for example, when producing an antibody, a vector which induces LIMD expression at a high level can be used. For example, strong inducible T5 or
A vector containing the T7 bacteriophage promoter may be used.
【0120】
酵母の発現系を使用してLIMDを生成し得る。α因子、アルコールオキシダーゼ
、PGHプロモーター等の構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多数のベクタ
ーが、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはPichia pastorisに使用可能で
ある。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質を分泌或いは細胞内へ
の保持のいずれかに誘導し、安定した増殖のために外来配列の宿主ゲノムへの組
込みを可能にする(前出のAusubel (1995)、前出のBitter、前出のScorer等を参
照)。Yeast expression systems can be used to produce LIMD. A large number of vectors containing constitutive or inducible promoters such as α-factor, alcohol oxidase, and PGH promoter can be used for yeast Saccharomyces cerevisiae or Pichia pastoris . Moreover, such vectors direct the expressed protein either to be secreted or retained intracellularly, allowing the integration of foreign sequences into the host genome for stable growth (see Ausubel (supra. 1995), Bitter, Scorer, etc., supra).
【0121】
植物系を使用してLIMDを発現することも可能である。LIMDをコードする配列の
転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独或いはTMV(タカマツ, N. (1987) E
MBO J 6:307-311)由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなC
aMV由来の35S及び19Sプロモーターによって促進される。或いは、RUBISCOの小サ
ブユニット等の植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを用いてもよい
(前出のCoruzzi、前出のBroglie、前出のWinter等を参照)。これらの構成物は
、直接DNA形質転換または病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に
導入可能である(『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology
) (1992) McGraw Hill New York NY, pp.191-196等を
参照)。It is also possible to express LIMD using a plant system. Transcription of the sequence encoding LIMD may be achieved by viral promoters, such as alone or TMV (Takamatsu, N. (1987) E.
C as used in combination with the omega leader sequence from MBO J 6: 307-311)
Promoted by the 35S and 19S promoters from aMV. Alternatively, a plant promoter such as the small subunit of RUBISCO or a heat shock promoter may be used (see Coruzzi, supra, Broglie, supra, Winter, supra). These constructs can be introduced into plant cells by direct DNA transformation or pathogen-mediated transfection ( The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill See New York NY, pp. 191-196).
【0122】
哺乳動物細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。発現
ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合、LIMDをコードする配列は、後発プ
ロモーター及び3連リーダー配列からなるアデノウイルス転写/翻訳複合体に連
結反応され得る。可欠E1またはE3領域へウイルスのゲノムを挿入し、宿主細胞で
LIMDを発現する感染ウイルスを得ることが可能である(Logan, J.and T. Shenk
(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659等を参照)。更に、ラウス肉腫ウ
イルス(RSV)エンハンサー等の転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞
における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いて
タンパク質を高レベルで発現させることもできる。In mammalian cells, a number of virus-based expression systems are available. When using adenovirus as an expression vector, the sequence encoding LIMD can be ligated to an adenovirus transcription / translation complex consisting of a late promoter and a triple leader sequence. Insert the viral genome into the essential E1 or E3 region and
It is possible to obtain infectious virus expressing LIMD (Logan, J. and T. Shenk
(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3655-3659 etc.). In addition, transcription enhancers such as the Rous Sarcoma Virus (RSV) enhancer can be used to increase expression in mammalian host cells. Proteins can also be expressed at high levels using SV40 or EBV based vectors.
【0123】
ヒト人工染色体(HAC)を用いて、プラスミドに含まれ且つプラスミドから発
現するものより大きなDNAの断片を輸送することもできる。治療目的のために約
6kb〜10MbのHACを作製し、従来の輸送方法(リポソーム、ポリカチオンアミ
ノポリマーまたはベシクル)で供給する(Harrington. J.J. ら (1997) Nat Gen
et.15:345-355.等を参照)。Human artificial chromosomes (HACs) can also be used to transport fragments of DNA larger than those contained in and expressed from the plasmid. HACs of about 6 kb to 10 Mb were prepared for therapeutic purposes and supplied by conventional delivery methods (liposomes, polycationic amino polymers or vesicles) (Harrington. JJ et al. (1997) Nat Gen
et.15: 345-355.).
【0124】
長期にわたり哺乳動物系内で組換えタンパク質を産出するためには、株化細胞
内でのLIMDの安定発現が望ましい。例えば、発現ベクターであって複製及び/ま
たは内在性発現因子のウイルス起源を含むものと、同一或いは別のベクター上の
選択可能マーカー遺伝子とを用いて、LIMDをコードする配列を細胞株に形質転換
することが可能である。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約1
〜2日間細胞を増殖させることができる。選択可能マーカーの目的は選択培地へ
の抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーが存在することにより、導入さ
れた配列をうまく発現するような細胞の成長及び回収が可能となる。安定的に形
質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて
増殖可能である。For long-term production of recombinant proteins in mammalian systems, stable expression of LIMD in cell lines is desirable. For example, a cell line is transformed with a sequence encoding LIMD using an expression vector containing a viral origin of replication and / or endogenous expression factors and a selectable marker gene on the same or another vector. It is possible to Approximately 1 in enriched medium after transfer of vector and before transfer to selective medium
Allow the cells to grow for ~ 2 days. The purpose of the selectable marker is to confer resistance to selective medium, and the presence of the selectable marker enables growth and recovery of cells which successfully express the introduced sequences. Resistant clones of stably transformed cells can be propagated using tissue culture techniques appropriate to the cell type.
【0125】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものでは
ないがこのような選択系には、tk−単純細胞のために用いられるヘルペスウイル
スチミジンキナーゼ遺伝子と、apr−細胞のために用いられるアデニンホスホリ
ボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある(Wigler, M. ら (1977) Cell 11:223-2
32、Lowy, I. ら (1980) Cell 22:817-823等を参照)。また、選択の基礎として
代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdh
frはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシッドネオマイ
シン及びG-418に対する耐性を与え、alsはクロルスルフロンに対する耐性を、pa
tはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える
(Wigler, M. ら (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570、Colbere-
Garapin, F. ら (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14 等を参照)。この他の選択可
能遺伝子、例えば、代謝のための細胞要求を変えるtrpB及びhisDは、文献に記載
されている(Hartman, S.C.and R.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85:8047-8051等を参照)。可視マーカー、例えばアニトシアニン、緑色蛍
光タンパク質(GFP;Clontech)、βグルクロニダーゼ及びその基質βグルクロ
ニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい。これ
らのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベ
クター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能
である(Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131等を参照)。Transformed cell lines can be recovered using any number of selection systems. Such selection systems include, but are not limited to, the herpesvirus thymidine kinase gene used for tk - simple cells and the adenine phosphoribosyl transferase gene used for apr - cells (Wigler, M. Et al (1977) Cell 11: 223-2
32, Lowy, I. et al. (1980) Cell 22: 817-823). Also, resistance to antimetabolites, antibiotics or herbicides can be used as the basis for selection. Eg dh
fr confers resistance to methotrexate, neo confers resistance to aminoglycosid neomycin and G-418, als chlorsulfuron and pa
t confers resistance to phosphinothricin acetyltransferase (Wigler, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567-3570, Colbere-
Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150: 1-14). Other selectable genes, such as trpB and hisD that alter cellular requirements for metabolism, have been described in the literature (Hartman, SC and RC Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85: 8047-8051 etc.). Visible markers such as anitocyanin, green fluorescent protein (GFP; Clontech), β-glucuronidase and its substrate β-glucuronide, or luciferase and its substrate luciferin may be used. These markers can be used to not only identify transformants but also quantify transient or stable protein expression due to a particular vector system (Rhodes, CA (1995) Methods Mol. Biol. . 55: 121-131 etc.).
【0126】
マーカー遺伝子発現の存在/不存在によって目的の遺伝子の存在が示唆されて
も、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、LIMDをコー
ドする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、LIMDをコードする配列を
含む形質転換細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定することが可能であ
る。または単一プロモーター制御下で、LIMDをコードする配列とタンデムにマー
カー遺伝子を配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺
伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。Although the presence / absence of marker gene expression suggests the presence of the gene of interest, it may be necessary to confirm the presence and expression of that gene. For example, if the sequence encoding LIMD is inserted within a marker gene sequence, transformed cells containing the sequence encoding LIMD can be identified by the lack of marker gene function. Alternatively, a marker gene can be placed in tandem with the LIMD coding sequence under the control of a single promoter. Expression of the marker gene in response to induction or selection usually also indicates expression of the tandem gene.
【0127】
一般に、LIMDをコードする核酸配列を含み且つLIMDを発現する宿主細胞は、当
業者によく知られている種々の方法を用いて同定することが可能である。限定す
るものではないが当業者によく知られている方法には、DNA-DNA或いはDNA-RNAハ
イブリダイゼーション、PCR法、核酸或いはタンパク質の検出及び/または定量
を行うための膜系、溶液ベース或いはチップベースの技術を含むタンパク質バイ
オアッセイまたはイムノアッセイ技術がある。In general, host cells containing a LIMD-encoding nucleic acid sequence and expressing LIMD can be identified using a variety of methods well known to those of skill in the art. Methods well known to those skilled in the art include, but are not limited to, DNA-DNA or DNA-RNA hybridization, PCR methods, membrane systems for performing detection and / or quantification of nucleic acids or proteins, solution-based or There are protein bioassays or immunoassay technologies, including chip-based technologies.
【0128】
特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体を用いてLIMDの発
現の検出及び計測を行うための免疫学的方法は、当分野で公知である。このよう
な技術の例としては、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ(ELISA)、ラ
ジオイムノアッセイ(RIA)、蛍光活性化細胞選別(FACS)などが挙げられる。L
IMD上の2つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、2部
位モノクローナルベースのイムノアッセイ(two-site, monoclonal-based immun
oassay)が好ましいが、競合結合アッセイも用いることもできる。これらのアッ
セイ及びこれ以外のアッセイは、当分野で公知である(Hampton. R. ら (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual.
APS Press. St Paul. MN, Sect.
IV、Coligan, J. E. ら (1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub
. Associates and Wiley-Interscience, New York NY、Pound, J.D. (1998) Imm unochemical Protocols
, Humans Press, Totowa NJ等を参照)。[0128]
Development of LIMD using specific polyclonal antibody or specific monoclonal antibody
Immunological methods for performing current detection and counting are known in the art. like this
Examples of such techniques include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA),
Examples include geoimmunoassay (RIA) and fluorescence activated cell sorting (FACS). L
Two parts using a monoclonal antibody reactive to two non-interfering epitopes on IMD
Two-site, monoclonal-based immun
oassay) is preferred, but competitive binding assays can also be used. These
Say and other assays are known in the art (Hampton. R. et al. (1990). Serological Methods, a Laboratory Manual.
APS Press. St Paul. MN, Sect.
IV, Coligan, J. E. et al. (1997)Current Protocols in Immunology, Greene Pub
.Associates and Wiley-Interscience, New York NY, Pound, J.D. (1998)Imm unochemical Protocols
, Humans Press, Totowa NJ, etc.).
【0129】
多岐にわたる標識方法及び結合方法が当業者に既知であり、これらの方法は様
々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイに用い得る。LIMDをコードするポリヌ
クレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーショ
ンプローブ或いはPCRプローブを産出する方法には、オリゴ標識化、ニックトラ
ンスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR法が
ある。或いは、LIMDをコードする配列またはその任意の断片を、mRNAプローブを
産出するためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベク
ターは、当分野において知られており、市販もされており、T7、T3またはSP6等
の好適なRNAポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えて、in vitroでRNA
プローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばAmersham Pha
rmacia Biotech、Promega(Madison WI)、U.S. Biochemical等から市販されて
いる種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用い
得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁
気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤等がある。A wide variety of labeling and conjugation methods are known to those of skill in the art and can be used in various nucleic acid and amino acid assays. Methods for producing labeled hybridization or PCR probes for detecting sequences related to LIMD-encoding polynucleotides include oligo-labeling, nick-translation, end-labeling, or labeled nucleotides. There is a PCR method to use. Alternatively, the LIMD coding sequence or any fragment thereof can be cloned into a vector for producing an mRNA probe. Such vectors are known in the art and are commercially available, and in addition to a suitable RNA polymerase such as T7, T3 or SP6 and labeled nucleotides, RNA is expressed in vitro .
It can be used for probe synthesis. Such a method is, for example, Amersham Pha.
It can be carried out using various kits commercially available from rmacia Biotech, Promega (Madison WI), US Biochemical and the like. Suitable reporter molecules or labels that can be used to facilitate detection include substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles, as well as radionuclides, enzymes, fluorescent agents, chemiluminescent agents, chromogenic agents and the like.
【0130】
LIMDをコードするヌクレオチド配列を用いて形質転換した宿主細胞は、細胞培
地からのタンパク質の回収及び発現に適した条件下で培養し得る。形質転換細胞
から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列
、ベクター、或いはその両者に依存する。当業者であれば理解し得るように、LI
MDをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、原核細胞膜または真核
細胞膜を透過するLIMDの直接分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計し得
る。Host cells transformed with a nucleotide sequence encoding LIMD may be cultured under conditions suitable for the recovery and expression of the protein from cell culture. Whether a protein produced by a transformed cell is secreted or remains intracellular depends on the sequence used, the vector, or both. As those skilled in the art will appreciate, LI
Expression vectors containing a polynucleotide encoding MD can be designed to contain a signal sequence that directs the direct secretion of LIMD across prokaryotic or eukaryotic cell membranes.
【0131】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現し
たタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではな
いがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコ
シル化、リン酸化、脂質化及びアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」また
は「プロ」形を切断するような翻訳後処理を利用して、タンパク質のターゲティ
ング、折りたたみ及び/または活性を特定することも可能である。翻訳後の活性
のための固有の細胞装置及び特徴のある機構を有する種々の宿主細胞(例えばCH
O、HeLa、MDCK、MEK293、WI38等)は、American Type Culture Collection(ATC
C, Bethesda, VA)から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及び処理
を確実にするように選択し得る。In addition, the choice of host cell line may be made by the ability to regulate expression of the inserted sequences or to process the expressed protein in the desired fashion. Modifications of such polypeptides include, but are not limited to, acetylation, carboxylation, glycosylation, phosphorylation, lipidation and acylation. Post-translational processing such as cleaving the "prepro" or "pro" form of the protein can also be utilized to identify protein targeting, folding and / or activity. A variety of host cells (eg, CH 2) with unique cellular machinery and characteristic mechanisms for post-translational activity.
O, HeLa, MDCK, MEK293, WI38, etc.) are American Type Culture Collection (ATC
C, Bethesda, VA) and can be selected to ensure correct modification and processing of foreign proteins.
【0132】
本発明の別の実施例では、LIMDをコードする天然の核酸配列、修飾核酸配列ま
たは組換え核酸配列を、上記任意の宿主系において融合タンパク質の翻訳をもた
らす異種配列に連結反応させることができる。例えば、市販されている抗体を用
いて認識可能な異種部分を含むキメラLIMDタンパク質は、LIMD活性阻害剤に対す
るペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部
分及び異種ペプチド部分も、市販されている親和性基質を用いて融合タンパク質
の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチ
オンSトランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、チオレ
ドキシン(Trx)、カルモジュリン結合ペプチド(CBP)、6-His、FLAG、c-myc、
赤血球凝集素(HA)がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上
で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6-
Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG
、c-myc及び赤血球凝集素(HA)は、これらのエピトープ標識を特異的に認識す
る市販されているモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて、融合タ
ンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、融合タンパク質を遺伝子操作し
、LIMDが精製後に異種部分から切断され得るように、LIMDコード配列と異種タン
パク質配列の間にタンパク質分解切断部位を含めることもできる。融合タンパク
質の発現及び精製方法は、前出のAusubel (1995) 10章に記載されている。市販
されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現及び精製を促進すること
もできる。In another embodiment of the invention, ligating a natural, modified or recombinant nucleic acid sequence encoding LIMD to a heterologous sequence which results in translation of the fusion protein in any of the above host systems. You can For example, a chimeric LIMD protein containing a heterologous moiety that can be recognized using commercially available antibodies can facilitate the screening of peptide libraries for inhibitors of LIMD activity. Heterologous protein moieties and heterologous peptide moieties may also facilitate the purification of fusion proteins using commercially available affinity substrates. Such moieties include, but are not limited to, glutathione S transferase (GST), maltose binding protein (MBP), thioredoxin (Trx), calmodulin binding peptide (CBP), 6-His, FLAG, c-myc,
Has hemagglutinin (HA). GST on immobilized glutathione, MBP on maltose, Trx on phenylarsine oxide, CBP on calmodulin, and 6-
His allows the purification of cognate fusion proteins on metal chelating resins. FLAG
, C-myc and hemagglutinin (HA) allow immunoaffinity purification of fusion proteins using commercially available monoclonal and polyclonal antibodies that specifically recognize these epitope tags. The fusion protein can also be genetically engineered to include a proteolytic cleavage site between the LIMD coding sequence and the heterologous protein sequence so that the LIMD can be cleaved from the heterologous moiety after purification. Methods for expressing and purifying fusion proteins are described in Ausubel (1995), supra, Chapter 10. A variety of commercially available kits can also be used to facilitate expression and purification of the fusion protein.
【0133】
本発明の更に別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚
芽抽出系(Promega)を用いて、放射能標識したLIMDの合成がin vitroで可能で
ある。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターと機能的に結合したタンパ
ク質コード配列の転写及び翻訳を結合する。翻訳は、例えば35Sメチオニンのよ
うな放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。In yet another embodiment of the present invention, radiolabeled LIMD can be synthesized in vitro using TNT rabbit reticulocyte lysate or wheat germ extraction system (Promega). These systems couple transcription and translation of protein coding sequences operably linked to the T7, T3 or SP6 promoters. Translation occurs in the presence of radiolabeled amino acid precursors such as 35 S methionine.
【0134】
本発明のLIMDまたはその断片を用いて、LIMDに特異結合する化合物をスクリー
ニングし得る。少なくとも1個から複数個の試験化合物を用いて、LIMDへの特異
結合をスクリーニングし得る。試験化合物の例としては、抗体、オリゴヌクレオ
チド、タンパク質(例えば受容体)または小分子が挙げられる。The LIMD of the present invention or fragments thereof may be used to screen for compounds that specifically bind to LIMD. At least one and more than one test compound can be used to screen for specific binding to LIMD. Examples of test compounds include antibodies, oligonucleotides, proteins (eg receptors) or small molecules.
【0135】
一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドまたはその断
片などのLIMDの天然リガンド、天然の基質、構造的または機能的な擬態性または
自然結合パートナーに密接に関連している(Coligan, J.E. ら (1991) Current Protocols in Immunology
1 (2) の5章等を参照)。同様にして化合物は、LIMD
が結合する天然受容体に関連し得るか或いは例えばリガンド結合部位などの少な
くとも受容体の断片に密接に関連し得る。いずれの場合にも、化合物は既知の技
術を用いて合理的にデザインし得る。一実施例では、このような化合物に対する
スクリーニングは、分泌タンパク質としてまたは細胞膜上のいずれかでLIMDを発
現する好適な細胞の生成に関与している。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、シ
ョウジョウバエまたは大腸菌からの細胞がある。LIMDを発現する細胞またはLIMD
を含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させ、LIMDまたは化合物のいずれかの
結合、刺激または阻害を分析する。In one example, a compound thus identified is closely related to a natural ligand of LIMD, such as a ligand or fragment thereof, a natural substrate, a structural or functional mimetic or natural binding partner. (See Chapter 5 of Coligan, JE et al. (1991) Current Protocols in Immunology 1 (2)). Similarly, the compound is LIMD
May be associated with the natural receptor to which it binds, or may be closely associated with at least a fragment of the receptor, eg, the ligand binding site. In any case, the compound may be rationally designed using known techniques. In one example, screening for such compounds involves producing suitable cells that express LIMD, either as a secreted protein or on the cell membrane. Suitable cells include cells from mammals, yeast, Drosophila or E. coli. LIMD expressing cells or LIMD
A cell membrane fragment containing the is contacted with a test compound and analyzed for binding, stimulation or inhibition of either LIMD or the compound.
【0136】
アッセイは、試験化合物をポリペプチドに単純に試験結合し得る。ここで、結
合は、フルオロフォア、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標
識により検出される。例えば、アッセイは少なくとも1つの試験化合物を溶液中
でLIMDと結合するか固体支持体に固定するかのいずれかのステップ及びLIMDの化
合物への結合を検出するステップを有し得る。或いはアッセイは、標識された競
争相手の存在下で試験化合物の結合を検出または測定し得る。更にアッセイは、
細胞遊離製剤、化学ライブラリまたは天然の生成混合物を用いて実行することが
でき、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定し得る。The assay may simply test bind a test compound to the polypeptide. Here, binding is detected by fluorophores, radioisotopes, enzyme conjugates or other detectable labels. For example, the assay may comprise either binding at least one test compound in solution to LIMD or immobilizing it on a solid support and detecting the binding of LIMD to the compound. Alternatively, the assay may detect or measure binding of the test compound in the presence of labeled competitor. Furthermore, the assay
It can be carried out with cell free preparations, chemical libraries or natural product mixtures, test compounds can be released in solution or immobilized on a solid support.
【0137】
本発明のLIMDまたはその断片を用いて、LIMDの活性を調整する化合物をスクリ
ーニングし得る。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト、或るい
は部分的または逆アゴニスト等がある。一実施例においては、LIMDが少なくとも
1つの試験化合物と結合しているような、LIMDの活性を許容する条件下でアッセ
イが実行され、試験化合物存在下でのLIMDの活性が試験化合物不存在下でのLIMD
の活性と比較される。試験化合物存在下でのLIMDの活性の変化は、LIMDの活性を
調整する化合物を示す。或いは、試験化合物はLIMDの活性に適した条件下で活性
に適した条件下でLIMDを含むin vitroまたは細胞遊離系と結合し、アッセイが実
行される。これらアッセイのいずれかにおいて、LIMDの活性を調整する試験化合
物は間接的にそのようにすることができ、試験化合物と直接接触する必要がなく
なる。少なくとも1個から複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。The LIMD of the present invention or fragments thereof can be used to screen for compounds that modulate the activity of LIMD. Such compounds include agonists, antagonists, partial or inverse agonists and the like. In one example, the assay is performed under conditions that permit the activity of LIMD such that LIMD is bound to at least one test compound, and the activity of LIMD in the presence of the test compound is in the absence of the test compound. LIMD at
Compared to the activity of. The change in the activity of LIMD in the presence of the test compound indicates a compound that modulates the activity of LIMD. Alternatively, the test compound is bound under conditions suitable for activity of LIMD to an in vitro or cell release system containing LIMD and the assay is performed. In any of these assays, the test compound that modulates the activity of LIMD can do so indirectly, eliminating the need for direct contact with the test compound. At least one to multiple test compounds can be screened.
【0138】
別の実施例では、LIMDまたはその哺乳類同族体をコードするポリヌクレオチド
は、胚幹(ES)細胞において相同的組換えを用いて動物モデル系内で「ノックア
ウト」される。このような技術は当技術分野において公知であり、ヒト疾病の動
物モデルの生成に有用である(米国特許第5,175,383号及び第5,767,337号等を参
照)。例えば129/SvJ株化細胞等のマウスES細胞は、初期のマウス胎仔に由来し
、培養液中で成長する。ES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝
子等のマーカー遺伝子により分裂させた対象遺伝子(gene of interest)を含む
ベクターを用いて形質転換される(neo: Capecchi, M.R. (1989) Science 244:1
288-1292)。ベクターは、相同的組換えにより宿主ゲノムの対応する領域に統合
される。或いは、組織特異的または発達段階特異的な様式で対象遺伝子をノック
アウトするCre-loxP系を用いて相同的組換えが発生する(Marth, J.D. (1996) C
lin. Invest. 97:1999-2002; Wagner, K.U. ら (1997) Nucleic Acids Res. 25:
4323-43 30)。形質転換されたES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス系統から
採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。胚盤胞を偽妊娠種雌に外科的に導入
し、結果として得られるキメラ子孫の遺伝形質を決め、これを繁殖させてヘテロ
接合性系統またはホモ接合性系統を生成する。このようにして産出した遺伝子導
入動物は、潜在的治療薬または毒性薬剤を用いて試験し得る。In another example, a polynucleotide encoding LIMD or a mammalian homolog thereof is “knocked out” in an animal model system using homologous recombination in embryonic stem (ES) cells. Such techniques are known in the art and are useful in generating animal models of human disease (see, eg, US Pat. Nos. 5,175,383 and 5,767,337). Mouse ES cells, such as the 129 / SvJ cell line, are derived from early mouse fetuses and grow in culture. ES cells are transformed with a vector containing a gene of interest divided by a marker gene such as neomycin phosphotransferase gene (neo: Capecchi, MR (1989) Science 244: 1).
288-1292). The vector integrates into the corresponding region of the host genome by homologous recombination. Alternatively, homologous recombination occurs using the Cre-loxP system, which knocks out the gene of interest in a tissue-specific or developmental stage-specific manner (Marth, JD (1996) C
lin. Invest. 97: 1999-2002; Wagner, KU et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:
4323-43 30). Transformed ES cells are identified and microinjected into, for example, mouse cell blastocysts taken from the C57BL / 6 mouse strain. Blastocysts are surgically introduced into pseudopregnant females and the resulting chimeric progeny are determined and propagated to produce heterozygous or homozygous lines. The transgenic animals thus produced may be tested with potential therapeutic or toxic agents.
【0139】
LIMDをコードするポリヌクレオチドは、ヒト胚盤胞由来のES細胞におけるin v itro
でも操作し得る。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞タイプを
含む少なくとも8つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。この細胞系統
は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する(Thomson, J.A. ら (19
98) Science 282:1145-1147)。Polynucleotides encoding LIMD can also be engineered in vitro in human blastocyst-derived ES cells. Human ES cells have the potential to differentiate into at least eight separate cell lineages, including endoderm, mesoderm and ectoderm cell types. This cell lineage differentiates into, for example, neural cells, hematopoietic lineages, and cardiomyocytes (Thomson, JA et al. (19
98) Science 282: 1145-1147).
【0140】
LIMDをコードするポリヌクレオチドは、モデルヒト疾病への「ノックイン」ヒ
ト化動物(ブタ)または遺伝子導入動物(マウスまたはラット)も生成し得る。
ノックイン技術を用いて、LIMDをコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物
ES細胞に注入し、注入された配列は動物細胞ゲノムに統合する。形質転換された
細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。ヒトの疾病の治療に関する
情報を得るために、遺伝子導入子孫または近交系について研究し、強力な医薬品
を用いて遺伝子導入子孫または近交系を処理する。或いは、LIMDを過剰発現させ
るべく例えばLIMDを乳内に分泌するなどして同系交配させた哺乳動物は、タンパ
ク質の簡便な源としても役立ち得る(Janne, J. ら (1998) Biotechnol. Annu.
Rev. 4:55-74)。Polynucleotides encoding LIMD may also generate “knock-in” humanized animals (pigs) or transgenic animals (mouse or rat) into model human diseases.
Using knock-in technology, a region of the polynucleotide encoding LIMD was
It is injected into ES cells and the injected sequences integrate into the animal cell genome. The transformed cells are injected into the blastula and the blastula is transplanted as described above. In order to obtain information on the treatment of human diseases, transgenic offspring or inbred lines are studied, and powerful drugs are used to treat the transgenic offspring or inbred lines. Alternatively, mammals inbred to overexpress LIMD, for example by secreting LIMD into the milk, can also serve as a convenient source of protein (Janne, J. et al. (1998) Biotechnol. Annu.
Rev. 4: 55-74).
【0141】
治療
LIMDの領域と細胞内シグナル伝達分子間には、化学的及び構造的類似性、例え
ば配列及びモチーフとの関連における類似性が存在する。更にLIMDの発現は、造
血/炎症系、神経系、胃腸系及び生殖系の癌に密接に関連している。従ってLIMD
は、細胞増殖異常、発達障害及び細胞運動異常において或る役割を果たすものと
考えられる。LIMDの発現または活性の増大に関連する疾患の治療においては、LI
MDの発現または活性を低下させることが望ましい。また、LIMDの発現または活性
の低下に関連する疾患の治療においては、LIMDの発現または活性を増大させるこ
とが望ましい。There are chemical and structural similarities between regions of therapeutic LIMD and intracellular signaling molecules, such as in the context of sequences and motifs. In addition, LIMD expression is closely associated with hematopoietic / inflammatory, nervous, gastrointestinal and reproductive cancers. Therefore LIMD
Are thought to play a role in cell proliferation disorders, developmental disorders and cell motility disorders. In the treatment of diseases associated with increased LIMD expression or activity, LI
It is desirable to reduce the expression or activity of MD. In addition, in treating a disease associated with a decrease in LIMD expression or activity, it is desirable to increase LIMD expression or activity.
【0142】
従って、或る実施例において、LIMDの発現または活性の低下に関連した疾患の
治療または予防のために、患者にLIMDまたはその断片や誘導体を投与することが
可能である。限定するものではないがこのような疾患の例として細胞増殖異常が
含まれ、その中には日光性角化症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、滑液
包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病(MCTD)、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグ
ロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症と、腺癌、白血病、リンパ腫
、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌を含む癌、具体的には副腎、膀胱、骨、骨髄、
脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、
膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子
宮の癌等が含まれ、また発達障害も含まれ、その中には尿細管性アシドーシス、
貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋
ジストロフィ、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群(ウィルムス腫瘍、無虹彩症、
尿生殖器異常及び精神薄弱)、スミス‐マジェニス症候群(Smith-Magenis synd
rome)、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコ
ー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症
、水頭症、舞踏病(Syndenham's chorea)及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊
髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失
とが含まれ、また細胞運動異常も含まれ、その中には強直性脊椎炎、チェディア
ック-東症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィ及びベッカー筋ジストロフィ、
肝内胆汁うっ滞、心筋過形成、心筋症、早期発症型歯周炎、腺癌、卵巣癌及び慢
性骨髄性白血病などの癌、細菌感染及び寄生虫感染が含まれる。Thus, in certain embodiments, LIMD or a fragment or derivative thereof can be administered to a patient for the treatment or prevention of disorders associated with decreased LIMD expression or activity. Non-limiting examples of such diseases include abnormal cell proliferation, including actinic keratoses, arteriosclerosis, atherosclerosis, bursitis, cirrhosis, hepatitis, Mixed connective tissue disease (MCTD), myelofibrosis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, polycythemia vera, psoriasis, primary thrombocythemia and adenocarcinoma, leukemia, lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, malformation Cancer, including cancer, specifically adrenal gland, bladder, bone, bone marrow,
Brain, breast, cervix, gallbladder, ganglion, digestive tract, heart, kidney, liver, lung, muscle, ovary,
Includes pancreatic, parathyroid, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen, testis, thymus, thyroid, uterine cancer, and developmental disorders, including tubular acidosis,
Anemia, Cushing's syndrome, dyschondrosis dwarfism, Duchenne-Becker muscular dystrophy, epilepsy, gonadal dysplasia, WAGR syndrome (Wilms tumor, aniridia,
Urogenital abnormalities and mental retardation), Smith-Magenis synd
rome), myelodysplastic syndrome, hereditary mucosal epithelial dysplasia, hereditary keratoderma, hereditary neurological diseases such as Charcot-Marie-Tooth disease and neurofibromatosis, hypothyroidism, hydrocephalus, chorea ( Syndenham's chorea) and cerebral palsy and other seizure disorders, spinal schizophrenia, anencephaly, cranio-spinal dissection, congenital glaucoma, cataract, sensorineural hearing loss, and also cell dyskinesia, among them. Is ankylosing spondylitis, Chediak-East syndrome, Duchenne muscular dystrophy and Becker muscular dystrophy,
Intrahepatic cholestasis, myocardial hyperplasia, cardiomyopathy, early-onset periodontitis, cancers such as adenocarcinoma, ovarian cancer and chronic myelogenous leukemia, bacterial infections and parasitic infections are included.
【0143】
別の実施例では、LIMDまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に
投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むLIMDの発現または活性の
低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。In another example, a vector capable of expressing LIMD or a fragment or derivative thereof is administered to a patient to treat a disease associated with decreased LIMD expression or activity, including, but not limited to, those described above. Treatment or prevention is also possible.
【0144】
更に別の実施例では、実質的に精製されたLIMDを含む医薬品成分を好適な医薬
用担体と共に患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むLIMD
の発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である
。In yet another embodiment, a pharmaceutical composition comprising substantially purified LIMD is administered to a patient together with a suitable pharmaceutical carrier to produce LIMD including, but not limited to, the disorders described above.
It is also possible to treat or prevent diseases associated with decreased expression or activity of.
【0145】
更に別の実施例では、LIMDの活性を調節するアゴニストを患者に投与して、限
定するものではないが上記した疾患を含むLIMDの発現または活性の低下に関連し
た疾患を治療または予防することも可能である。In yet another embodiment, an agonist that modulates the activity of LIMD is administered to a patient to treat or prevent a disease associated with decreased expression or activity of LIMD, including but not limited to the above mentioned diseases. It is also possible to do so.
【0146】
更に別の実施例では、患者にLIMDのアンタゴニストを投与して、LIMDの発現ま
たは活性の増大に関連した疾患を治療または予防することが可能である。限定す
るものではないがこのような疾患の例には、上記した細胞増殖異常、発達障害及
び細胞運動異常がある。一実施態様においては、アンタゴニストとして直接的に
、或いはLIMDを発現する細胞または組織に薬剤を輸送するターゲティングまたは
輸送機構として間接的にLIMDと特異結合する抗体を用いることができる。In yet another embodiment, patients can be administered an antagonist of LIMD to treat or prevent a disorder associated with increased LIMD expression or activity. Non-limiting examples of such diseases include the abnormal cell proliferation, developmental disorders and abnormal cell motility described above. In one embodiment, an antibody that specifically binds to LIMD can be used directly as an antagonist or indirectly as a targeting or transport mechanism that transports the drug to cells or tissues that express LIMD.
【0147】
別の実施例では、LIMDをコードするポリヌクレオチドの相補体を発現するベク
ターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むLIMDの発現
または活性の増大に関連した疾患を治療または予防することも可能である。In another example, a vector expressing a complement of a polynucleotide encoding LIMD was administered to a patient and was associated with increased expression or activity of LIMD, including, but not limited to, the disorders described above. It is also possible to treat or prevent the disease.
【0148】
別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ
スト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与する
こともできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従
ってを選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治
療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いることにより少量の各
薬剤で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減
し得る。In another example, any protein, antagonist, antibody, agonist, complementary sequence, or vector of the invention can be administered in combination with another suitable therapeutic agent. Suitable therapeutic agents for use in combination therapy may be selected by those of ordinary skill in the art according to conventional pharmaceutical principles. When combined with a therapeutic agent, a synergistic effect can be brought about in the treatment or prevention of various diseases mentioned above. By using this method, it is possible to obtain a medicinal effect with a small amount of each drug, thereby reducing the possibility of side effects.
【0149】
LIMDのアンタゴニストは、当分野で一般的に知られている方法を用いて製造し
得る。具体的には、精製されたLIMDを用いて抗体を作るか、治療薬のライブラリ
をスクリーニングして、LIMDと特異結合するものを同定することが可能である。
LIMDの抗体も、当分野で一般的に知られている方法を用いて製造することが可能
である。限定するものではないがこのような抗体には、ポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片及びFab発現ライブラリに
よって作られた断片が含まれ得る。中和抗体(即ち二量体の形成を阻害する抗体
)は通常、治療用に好適である。LIMD antagonists may be prepared using methods generally known in the art. Specifically, purified LIMD can be used to make antibodies or to screen libraries of therapeutics to identify those that specifically bind to LIMD.
LIMD antibodies can also be produced using methods generally known in the art. Such antibodies may include, but are not limited to, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, Fab fragments and fragments produced by Fab expression libraries. Neutralizing antibodies (ie, antibodies that inhibit dimer formation) are usually suitable for treatment.
【0150】
抗体を産生するために、LIMD、またはLIMDの任意の断片またはオリゴペプチド
であって免疫抗原性の特性を有するものを注入することによって、ヤギ、ウサギ
、ラット、マウス、ヒト、その他を含む種々の宿主を免疫化することができる。
宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる
。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバン
トと、水酸化アルミニウム等のミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プ
ルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペッ
トヘモシニアン、ジニトロフェノール等の洗浄剤とがある。ヒトに用いられるア
ジュバントの中では、BCG(カルメット‐ゲラン杆菌)及びコリネバクテリウム
‐パルヴムが特に好ましい。To produce antibodies, goat, rabbit, rat, mouse, human, etc. are injected by injecting LIMD, or any fragment or oligopeptide of LIMD having immunogenic properties. A variety of hosts can be immunized, including.
Depending on the host species, various adjuvants may be used to enhance the immune response. Such adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant, mineral gel adjuvants such as aluminum hydroxide, lysolecithin, pluronic polyol, polyanions, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin, dinitrophenol. There is a cleaning agent such as. Among the adjuvants used in humans, BCG (bacillus Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum are particularly preferred.
【0151】
LIMDに対する抗体を誘導するために用いるオリゴペプチド、ペプチドまたは断
片は、少なくとも約5アミノ酸からなり、一般的には少なくとも約10アミノ酸
からなるアミノ酸配列を有するものが好ましい。これらのオリゴペプチド、ペプ
チドまたは断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり且つ小
さな天然の分子の全アミノ酸配列を含むことが望ましい。LIMDアミノ酸の短い伸
長部を別のタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシニアンの配列と融合
し、キメラ分子に対する抗体を産生し得る。The oligopeptides, peptides or fragments used to induce antibodies to LIMD are preferably those having an amino acid sequence of at least about 5 amino acids, generally at least about 10 amino acids. Desirably, these oligopeptides, peptides or fragments are identical to a portion of the amino acid sequence of the native protein and include the entire amino acid sequence of a small naturally occurring molecule. A short stretch of LIMD amino acids can be fused to the sequence of another protein, such as keyhole limpet hemocyanin, to produce antibodies to the chimeric molecule.
【0152】
LIMDに対するモノクローナル抗体は、抗体分子を産生する任意の技術を用いて
、培地内の連続した細胞株によって作製し得る。限定するものではないがこのよ
うな技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術及びEBV-ハ
イブリドーマ技術がある(Kohler, G. ら. (1975) Nature 256:495-497、Kozbor
, D. ら (1985) .J. Immunol. Methods 81:31-42、Cote, R.J. ら (1983) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030、Cole, S.P. ら (1984) Mol. Cell Biol.
62:109-120等を参照)。Monoclonal antibodies against LIMD can be produced by continuous cell lines in culture, using any technique that produces antibody molecules. Such techniques include, but are not limited to, hybridoma technology, human B cell hybridoma technology and EBV-hybridoma technology (Kohler, G. et al. (1975) Nature 256: 495-497, Kozbor.
, D. et al. (1985) .J. Immunol. Methods 81: 31-42, Cote, RJ et al. (1983) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030, Cole, SP et al. (1984) Mol. Cell Biol.
62: 109-120 etc.).
【0153】
更に、「キメラ抗体」を作製するために開発した技術、例えば好適な抗原特異
性及び生物学的活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝
子へのスプライシングを用いることが可能である(Morrison, S.L.ら. (1984) P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855、Neuberger, M.S.ら (1984) Nature
312:604-608、タケダ, S.ら (1985) Nature 314:452-454等を参照)。或いは、
一本鎖抗体を産生するために説明された技術を適用し、当分野で知られている方
法を用いて、LIMD特異性一本鎖抗体を産生し得る。関連特異性を有するがイディ
オタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブ
ラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる(Burton D.R.
(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137等を参照)。In addition, it may be possible to use techniques developed to produce “chimeric antibodies”, such as splicing of a mouse antibody gene into a human antibody gene to obtain a molecule with suitable antigen specificity and biological activity. Possible (Morrison, SL et al. (1984) P
Roc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855, Neuberger, MS et al. (1984) Nature.
312: 604-608, Takeda, S. et al. (1985) Nature 314: 452-454 etc.). Alternatively,
The techniques described for producing single chain antibodies can be applied to produce LIMD specific single chain antibodies using methods known in the art. Antibodies with related specificities but different idiotypic composition can also be produced by chain shuffling from random combinatorial immunoglobulin libraries (Burton DR
(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10134-10137).
【0154】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは免
疫グロブリンライブラリのスクリーニングまたは文献に開示されているような高
特異結合試薬のパネルのスクリーニングによっても行い得る(Orlandi, R. ら (
1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837、Winter, G. ら (1991) Nat
ure 349:293-299等を参照)。The production of antibodies may also be carried out by inducing in vivo production in a lymphocyte population or by screening immunoglobulin libraries or panels of high specific binding reagents as disclosed in the literature (Orlandi, R . Et (
1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837, Winter, G. et al. (1991) Nat.
ure 349: 293-299 etc.).
【0155】
LIMDのための特異結合部位を有する抗体断片を産生することもできる。例えば
、限定するものではないがこのような断片には、抗体分子のペプシン消化によっ
て作製されるF(ab')2 断片と、F(ab')2 断片のジスルフィド架橋を減らすことに
よって作製されるFab断片とがある。或いは、Fab発現ライブラリを作製すること
によって、モノクローナルFab断片を所望の特異性と迅速且つ容易に同定するこ
とが可能となる(Huse, W.D. ら (1989) Science 256:1275-1281等を参照)。Antibody fragments with specific binding sites for LIMD can also be produced. For example, without limitation, such fragments are made by reducing the disulfide bridges of the F (ab ') 2 fragment and the F (ab') 2 fragment produced by pepsin digestion of the antibody molecule. There are Fab fragments. Alternatively, it is possible to rapidly and easily identify a monoclonal Fab fragment with a desired specificity by preparing a Fab expression library (see Huse, WD et al. (1989) Science 256: 1275-1281 etc.).
【0156】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体
を同定することができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体または
モノクローナル抗体の何れかを用いる免疫放射線アッセイまたは競合結合アッセ
イに対する数々のプロトコルは、当分野において公知である。このようなイムノ
アッセイは通常、LIMDとその特異性抗体間の複合体形成の計測に関与している。
2つの非干渉性LIMDエピトープに反応するモノクローナル抗体を用いるような、
2部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合結合
アッセイを利用してもよい(前出のPoundの文献)。[0156] Various immunoassays can be used to screen to identify antibodies with the desired specificity. Numerous protocols for immunoradiometric or competitive binding assays using either polyclonal or monoclonal antibodies with established specificity are known in the art. Such immunoassays typically involve measuring complex formation between LIMD and its specific antibody.
Using a monoclonal antibody reactive to two non-interfering LIMD epitopes,
Two-site monoclonal-based immunoassays are commonly used, but competitive binding assays may be used (Pound, supra).
【0157】
ラジオイムノアッセイ技術と共に様々な方法、例えばスキャッチャード分析を
用いて、LIMDに対する抗体の親和性を評価し得る。親和性は結合定数Kaで表す。
Kaは、平衡状態においてLIMD抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル
濃度で除した値であると定義する。ポリクローナル抗体は多様なLIMDエピトープ
に対する親和性が不均一であり、ポリクローナル抗体試薬のために決定したKaは
、LIMD抗体の平均親和性または結合活性を表す。モノクローナル抗体は特定のLI
MDエピトープに対して単一特異的であり、モノクローナル抗体試薬のために決定
したKaは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が約109〜1012 L/molの範囲に
あるような高親和性抗体試薬は、LIMD抗体複合体が激しい操作に耐えなければな
らないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が約106〜107 L/molの範
囲にあるような低親和性抗体試薬は、LIMDが抗体から最終的に活性化状態で解離
する必要がある免疫精製及び類似の処理に用いるのが好ましい(Catty, D. (198
8) Antibodies, Volume I: A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC
、Liddell, J. E.and Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Ant ibodies
, John Wiley & Sons, New York NY)。Various methods can be used in conjunction with radioimmunoassay techniques, such as Scatchard analysis, to assess the affinity of the antibody for LIMD. Affinity is represented by the binding constant Ka.
Ka is defined as the molar concentration of LIMD antibody complex divided by the molar concentration of free antibody and free antigen at equilibrium. Polyclonal antibodies have heterogeneous affinities for various LIMD epitopes, and the Ka determined for polyclonal antibody reagents represents the average affinity or avidity of LIMD antibodies. Monoclonal antibodies are specific LI
The Ka, which is monospecific for the MD epitope and determined for the monoclonal antibody reagent, represents a true measure of affinity. High affinity antibody reagents with Ka values in the range of about 10 9 to 10 12 L / mol are preferably used in immunoassays in which the LIMD antibody complex must withstand vigorous manipulation. Low affinity antibody reagents with Ka values in the range of about 10 6 to 10 7 L / mol are used in immunopurification and similar procedures where LIMD must ultimately dissociate from the antibody in its activated state. Preferred (Catty, D. (198
8) Antibodies, Volume I: A Practical Approach , IRL Press, Washington, DC
, Liddell, JEand Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Ant ibodies , John Wiley & Sons, New York NY).
【0158】
ポリクローナル抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、或る下流の適
用例に対するこのような試薬の品質及び適性を決定することができる。例えば、
少なくとも1〜2mg/ml、好ましくは5〜10mg/mlの特異抗体を含むポリクロー
ナル抗体試薬は、LIMD抗体複合体を沈殿させる必要がある処理において通常用い
られる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や
使用に対する指針については、一般に入手可能である(前出のCattyの文献、同C
oligan らの文献等を参照)。The titer and avidity of polyclonal antibody reagents can be further evaluated to determine the quality and suitability of such reagents for certain downstream applications. For example,
Polyclonal antibody reagents containing at least 1-2 mg / ml, preferably 5-10 mg / ml, of specific antibody are commonly used in processes requiring precipitation of LIMD antibody complexes. Specificity of antibodies, antibody titer, avidity, and guidelines for antibody quality and use in various applications are publicly available (Catty, supra, ibid.
(See oligan et al.).
【0159】
本発明の別の実施例では、LIMDをコードするポリヌクレオチド、LIMDの任意の
断片または相補配列を治療目的で使用することができる。ある実施形態では、LI
MDをコードするポリヌクレオチドの相補配列がmRNAの転写を阻止するのに好適で
ある場合にこれを使用し得る。具体的には、LIMDをコードするポリヌクレオチド
に相補的な配列で細胞を形質転換し得る。従って、相補的分子または断片は、LI
MD活性を調節するため、または遺伝子機能を調節するために使用し得る。このよ
うな技術は既に当分野ではよく知られており、センスまたはアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドまたは大きな断片を、LIMDをコードする配列のコード領域または制
御領域に延在する様々な位置から設計することが可能である(Agrawal, S., ed.
(1996) Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJ等を参照)。In another embodiment of the invention, the polynucleotide encoding LIMD, any fragment of LIMD or the complementary sequence may be used for therapeutic purposes. In some embodiments, the LI
It may be used if the complementary sequence of the polynucleotide encoding MD is suitable for blocking the transcription of mRNA. Specifically, cells can be transformed with a sequence complementary to the polynucleotide encoding LIMD. Therefore, a complementary molecule or fragment is a LI
It can be used to regulate MD activity or to regulate gene function. Such techniques are already well known in the art, and sense or antisense oligonucleotides or large fragments can be designed from various positions extending into the coding or control region of the LIMD coding sequence. (Agrawal, S., ed.
(1996) Antisense Therapeutics , Humana Press Inc., Totawa NJ, etc.).
【0160】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な
任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的
タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を発現する発
現プラスミドの形で細胞内に輸送することが可能である(Slater, J.E. ら (199
8) J. Allergy Clin. Immunol. 102(3):469-475、Scanlon, K.J. ら (1995)9(13
):1288-1296.等を参照)。アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやア
デノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて細胞内に導入すること
もできる(Miller, A.D. (1990) Blood 76:271、前出のAusubel、Uckert, W. an
d W. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63(3):323-347等を参照)。その他の遺
伝輸送機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープ及び当分野で公
知のその他の系が含まれる(Rossi, J.J. (1995) Br. Med. Bull. 51(1):217-22
5; Boado、R.J.ら (1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1315、Morris, M.C. ら
(1997) Nucleic Acids Res. 25(14):2730-2736. 等を参照)。When used in therapy, any gene delivery system suitable for introducing antisense sequences into suitable target cells can be used. Antisense sequences can be transported intracellularly in the form of expression plasmids that express sequences complementary to at least a portion of the cellular sequence encoding the target protein during transcription (Slater, JE et al. (199
8) J. Allergy Clin. Immunol. 102 (3): 469-475, Scanlon, KJ et al. (1995) 9 (13).
): 1288-1296.). Antisense sequences can also be introduced into cells using viral vectors such as retroviruses and adeno-associated viral vectors (Miller, AD (1990) Blood 76: 271, Ausubel, Uckert, W., supra). an
d W. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63 (3): 323-347 etc.). Other gene transfer mechanisms include liposome systems, artificial viral envelopes and other systems known in the art (Rossi, JJ (1995) Br. Med. Bull. 51 (1): 217-22.
5; Boado, RJ et al. (1998) J. Pharm. Sci. 87 (11): 1308-1315, Morris, MC et al.
(1997) Nucleic Acids Res. 25 (14): 2730-2736.
【0161】
本発明の別の実施例では、LIMDをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若し
くは生殖細胞遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことによ
り、(i)遺伝子欠損症(例えばX染色体鎖遺伝(Cavazzana-Calvo, M. ら (200
0) Science 288:669-672)により特徴付けられる重度の複合型免疫欠損(SCID)-X
1の場合)、先天性アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症に関連する重度の複合
型免疫欠損(Blaese, R.M. ら (1995) Science 270:475-480、Bordignon, C. ら
(1995) Science 270:470-475)、嚢胞性繊維症(Zabner, J. ら (1993) Cell 7
5:207-216: Crystal、R.G. ら (1995) Hum. Gene Therapy 6:643-666、Crystal
, R.G. ら. (1995) Hum. Gene Therapy 6:667-703)、サラセミア(thalassamia
)、家族性高コレステロール血症、第VIII因子若しくは第IX因子欠損に起因する
血友病(Crystal, 35 R.G. (1995) Science 270:404-410、Verma, I.M. and So
mia. N. (1997) Nature 389:239-242)を治療し、(ii)条件的致死性遺伝子産
物を発現させ(例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合)、(iii)細胞
内の寄生虫(例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)(Baltimore, D. (1988) Nature
335:395-396、Poescbla, E. ら (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:1139
5-11399)、B型若しくはC型肝炎ウイルス(HBV、HCV)、Candida albicans及びP aracoccidioides brasiliensis
等の真菌寄生虫、並びにPlasmodium falciparum
及びTrypanosoma cruzi等の原虫寄生体に対する防御機能を有するタンパク質を
発現させることができる。LIMDの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患
を発生させる場合、形質導入した細胞の好適な集団からLIMDを発現することによ
り、遺伝子欠損に起因する症状の発現を緩和し得る。In another embodiment of the invention, the polynucleotide encoding LIMD can be used for somatic or germ cell gene therapy. By carrying out gene therapy, (i) gene deficiency (for example, X chromosome chain inheritance (Cavazzana-Calvo, M. et al.
0) Severe combined immunodeficiency (SCID) -X characterized by Science 288: 669-672)
1), severe combined immunodeficiency associated with congenital adenosine deaminase (ADA) deficiency (Blaese, RM et al. (1995) Science 270: 475-480, Bordignon, C. et al.
(1995) Science 270: 470-475), cystic fibrosis (Zabner, J. et al. (1993) Cell 7).
5: 207-216: Crystal, RG et al. (1995) Hum. Gene Therapy 6: 643-666, Crystal
, RG et al. (1995) Hum. Gene Therapy 6: 667-703), thalassamia.
), Familial hypercholesterolemia, hemophilia caused by factor VIII or IX deficiency (Crystal, 35 RG (1995) Science 270: 404-410, Verma, IM and So
mia. N. (1997) Nature 389: 239-242), (ii) expressing a conditionally lethal gene product (eg in the case of cancer due to uncontrolled cell growth), (iii) intracellular Parasites such as human immunodeficiency virus (HIV) (Baltimore, D. (1988) Nature
335: 395-396, Poescbla, E. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 1139.
5-11399), hepatitis B or C virus (HBV, HCV), fungal parasites such as Candida albicans and P aracoccidioides brasiliensis , and Plasmodium falciparum
And a protein having a protective function against protozoan parasites such as Trypanosoma cruzi can be expressed. When a deficiency of a gene required for expression or regulation of LIMD causes a disease, expression of LIMD from a suitable population of transduced cells may alleviate the onset of symptoms due to the gene deficiency.
【0162】
本発明の更なる実施例では、LIMDをコードする哺乳動物発現ベクターを作製し
、これらのベクターを機械的手段によってLIMD欠損細胞に導入することによって
、LIMDの欠損による疾患や異常症を治療する。in vivo或いはex vitroの細胞に
用いる機械的導入技術には、(i)個々の細胞内への直接的なDNA微量注射法、(
ii)バリスティック金粒子輸送(ballistic gold particle delivery)、(iii
)リポソーム媒介形質移入、(iv)受容体媒介遺伝子導入、及び(v)DNAトラン
スポソンの使用(Morgan, R.A. and W.F. Anderson (1993) Annu. Rev. Biochem
. 62:191-217、Ivics, Z. (1997) Cell 91:501-510; Boulay, J-L. and H. Reci
pon (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:445-450)がある。In a further embodiment of the present invention, mammalian expression vectors encoding LIMD are prepared and introduced into LIMD-deficient cells by mechanical means, whereby diseases and abnormalities due to LIMD deficiency are induced. treat. Mechanical transfer techniques used for cells in vivo or ex vitro include (i) direct DNA microinjection into individual cells, (
ii) ballistic gold particle delivery, (iii
) Liposome-mediated transfection, (iv) Receptor-mediated gene transfer, and (v) Use of DNA transposons (Morgan, RA and WF Anderson (1993) Annu. Rev. Biochem
.62: 191-217, Ivics, Z. (1997) Cell 91: 501-510; Boulay, JL. And H. Reci
pon (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9: 445-450).
【0163】
LIMDの発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、限定するものではないがPC
DNA 3.1、EPITAG、PRCCMV2、PREP、PVAXベクター(Invitrogen, Carlsbad CA)
、PCMV-SCRIPT、PCMV-TAG、PEGSH/PERV(Stratagene, La Jolla CA)及びPTET-O
FF、PTET-ON、PTRE2、PTRE2-LUC、PTK-HYG(Clontech, Palo Alto CA)がある。
LIMDは、(i)恒常的に活性なプロモーター(例えばサイトメガロウイルス(CMV
)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ(TK)また
はβアクチン遺伝子)、(ii)誘導性プロモーター(例えばテトラサイクリン調節
性プロモーター(Gossen, M. and H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U
.S.A. 89:5547-5551、Gossen, M. ら (1995) Science 268:1766-1769、Rossi, F
.M.V. and H.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456)、市販のIn
vitrogen社のT-REXプラスミドに含まれる)、エクジソン誘導性プロモーター(I
nvitrogen社のプラスミドPVGRXR及びPINDから得られる)、FK506/ラパマイシン
誘導性プロモーターまたはRU486/ミフェプリストーン誘導性プロモーター(前
出のRossi, F.M.V. and H.M. Blau)、または(iii)正常個体由来の、LIMDをコ
ードする内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを
用いて、発現させることができる。Expression vectors that can influence the expression of LIMD include, but are not limited to, PC
DNA 3.1, EPITAG, PRCCMV2, PREP, PVAX vector (Invitrogen, Carlsbad CA)
, PCMV-SCRIPT, PCMV-TAG, PEGSH / PERV (Stratagene, La Jolla CA) and PTET-O
There are FF, PTET-ON, PTRE2, PTRE2-LUC and PTK-HYG (Clontech, Palo Alto CA).
LIMD is (i) a constitutively active promoter (eg cytomegalovirus (CMV
), Rous sarcoma virus (RSV), SV40 virus, thymidine kinase (TK) or β-actin gene), (ii) an inducible promoter (eg, tetracycline-regulated promoter (Gossen, M. and H. Bujard (1992) Proc. Natl . Acad. Sci. U
.SA 89: 5547-5551, Gossen, M. et al. (1995) Science 268: 1766-1769, Rossi, F.
.MV and HM Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9: 451-456), commercially available In
Vitrogen's T-REX plasmid), ecdysone inducible promoter (I
nvitrogen plasmids PVGRXR and PIND), FK506 / rapamycin inducible promoter or RU486 / mifepristone inducible promoter (Rossi, FMV and HM Blau, supra), or (iii) LIMD from normal individuals. It can be expressed using the natural promoter or the tissue-specific promoter of the endogenous gene encoding the gene.
【0164】
市販のリポソーム形質転換キット(例えばInvitrogen社から入手可能なPerFec
t Lipid Transfection Kit)を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでも
ポリヌクレオチドを培養中の標的細胞に導入することが可能になる。別の実施例
では、リン酸カルシウム法(Graham. F.L. and A.J. Eb (1973) Virology 52:45
6-467)若しくは電気穿孔法(Neumann, B. ら (1982) EMBO J. 1:841-845)を用
いて形質転換を行う。初代細胞にDNAを導入するためには、標準化された哺乳動
物の形質移入プロトコルの修飾が必要である。Commercially available liposome transformation kits (eg PerFec available from Invitrogen)
t Lipid Transfection Kit) allows one of skill in the art to introduce polynucleotides into target cells in culture without resorting to much experience. In another embodiment, the calcium phosphate method (Graham. FL and AJ Eb (1973) Virology 52:45.
6-467) or electroporation (Neumann, B. et al. (1982) EMBO J. 1: 841-845). Introducing DNA into primary cells requires modification of standardized mammalian transfection protocols.
【0165】
本発明の別の実施例では、LIMDの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾
患や異常症は、(i)レトロウイルス末端反復配列(LTR)プロモーターまたは独
立プロモーターの制御下でLIMDをコードするポリヌクレオチドと、(ii)好適な
RNAパッケージングシグナルと、(iii)追加レトロウイルス・シス作用性RNA配
列及び効率的なベクターの増殖に必要なコード配列を伴うRev応答性エレメント
(RRE)とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。
レトロウイルスベクター(例えばPFB及びPFBNEO)は、Stratagene社から市販さ
れており、刊行データ(Riviere, I. ら. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.
A. 92:6733-6737)に基づいている。上記データを引用することをもって本明細
書の一部とする。ベクターは、好適なベクター産生細胞系(VPCL)において増殖
され、VPCLは、標的細胞上の受容体に対する向性を有するエンベロープ遺伝子ま
たはVSVg等の乱交雑エンベロープタンパク質を発現する(Armentano, D. ら (19
87) J. Virol. 61:1647-1650、Bender, M.A. ら (1987) J. Virol. 61:1639-164
6、Adam, M.A. and A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-3806、Dull, T. ら
(1998) J. Virol. 72:8463-8471、Zufferey, R. ら (1998) J. Virol. 72:9873
-9880)。Riggに付与された米国特許第5,910,434号("Method for obtaining re
trovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retr
oviral supernatant")は、レトロウイルスパッケージング細胞系を得るための
方法について開示しており、これを引用することをもって本明細書の一部とする
。レトロウイルスベクターの増殖、細胞集団(例えばCD4+ T細胞)の形質導入
、及び形質導入した細胞の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に公知
の方法であり、多数の文献に記載されている(Ranga, U. ら. (1997) J. Virol.
71:7020-7029、Bauer, G. ら (1997) Blood 89:2259-2267、Bonyhadi, M.L. (1
997) J. Virol. 71:4707-4716、Ranga, U. ら (1998) Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 95:1201-1206、Su, L. (1997) Blood 89:2283-2290)。In another embodiment of the present invention, the disease or disorder caused by the gene defect associated with LIMD expression encodes LIMD under the control of (i) a retroviral terminal repeat (LTR) promoter or an independent promoter. (Ii) suitable polynucleotide
Preparation and treatment of retroviral vector consisting of RNA packaging signal and (iii) Rev responsive element (RRE) with additional retroviral cis-acting RNA sequence and coding sequence required for efficient vector growth can do.
Retroviral vectors (eg PFB and PBF NEO) are commercially available from Stratagene and published data (Riviere, I. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. US
A. 92: 6733-6737). Reference to the above data is made a part of this specification. The vector is propagated in a suitable vector-producing cell line (VPCL), which expresses an envelope gene with tropism for the receptor on the target cell or a promiscuous envelope protein such as VSVg (Armentano, D. et al. 19
87) J. Virol. 61: 1647-1650, Bender, MA et al. (1987) J. Virol. 61: 1639-164
6, Adam, MA and AD Miller (1988) J. Virol. 62: 3802-3806, Dull, T. et al.
(1998) J. Virol. 72: 8463-8471, Zufferey, R. et al. (1998) J. Virol. 72: 9873.
-9880). U.S. Pat. No. 5,910,434 ("Method for obtaining regi
trovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retr
oviral cells ") disclose methods for obtaining retroviral packaging cell lines, which are incorporated herein by reference. Propagation of retroviral vectors, cell populations (eg CD4 + Transduction of (T cells) and returning the transduced cells to the patient is a method known to those skilled in the art of gene therapy and has been described in numerous references (Ranga, U. et al. (1997). ) J. Virol.
71: 7020-7029, Bauer, G. et al. (1997) Blood 89: 2259-2267, Bonyhadi, ML (1
997) J. Virol. 71: 4707-4716, Ranga, U. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 95: 1201-1206, Su, L. (1997) Blood 89: 2283-2290).
【0166】
別の実施例では、アデノウイルス系遺伝子治療の輸送系を用いて、LIMDの発現
に関連する1若しくは複数の遺伝子異常を有するような細胞にLIMDをコードする
ポリヌクレオチドを輸送する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージ
ングについては、当業者に公知である。複製欠損型アデノウイルスベクターは、
免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島内に導入するため
に可変性であることが証明された(Csete, M.E. ら. (1995) Transplantation 2
7:263-268)。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Armentanoに
付与された米国特許第5,707,618号("Adenovirus vectors for gene therapy")
に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイル
スベクターについては、Antinozzi, P.A. ら (1999) Annu. Rev. Nutr. 19:511-
544 及び Verma, I.M. and N. Somia (1997) Nature 18:389:239-242も参照され
たい。両文献は、引用することをもって本明細書の一部とする。In another example, an adenovirus-based gene therapy delivery system is used to deliver a LIMD-encoding polynucleotide to cells that have one or more genetic abnormalities associated with LIMD expression. The construction and packaging of adenovirus-based vectors is known to those of skill in the art. Replication-defective adenovirus vector
It has been shown to be variable for the introduction of genes encoding immunomodulatory proteins into intact pancreatic islets (Csete, ME et al. (1995) Transplantation 2
7: 263-268). A possible adenovirus vector is US Pat. No. 5,707,618 (“Adenovirus vectors for gene therapy”) to Armentano.
, Which is incorporated herein by reference. Regarding the adenovirus vector, Antinozi, PA et al. (1999) Annu. Rev. Nutr. 19: 511-
See also 544 and Verma, IM and N. Somia (1997) Nature 18: 389: 239-242. Both documents are incorporated herein by reference.
【0167】
更に別の実施例では、ヘルペス系遺伝子治療の輸送系を用いて、LIMDの発現に
関連する1若しくは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にLIMDをコードするポリ
ヌクレオチドを輸送する。HSVが向性を有するような中枢神経系の細胞にLIMDを
導入する際には、単純ヘルペスウイルス(HSV)系のベクターの使用は特に役立
つ。ヘルペス系ベクターの作製及びパッケージングは、当業者に公知である。複
製適格性単純ヘルペスウイルス(HSV)I型系のベクターは、レポーター遺伝子を
霊長類の眼に輸送するために用いられてきた(Liu, X. ら (1999) Exp. Eye Res
.169:385-395)。HSV-1ウイルスベクターの作製についても、DeLucaに付与され
た米国特許第5,804,413号("Herpes simplex virus swains for gene transfer"
)に開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。米国特許第
5,804,413号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制
御下において細胞に導入される少なくとも1つの内在性遺伝子を有するゲノムを
含む組換えHSV d92についての記載がある。上記特許はまた、ICP4、ICP27及びIC
P22のために除去される組換えHSV系統の作製及び使用について開示している。HS
Vベクターについては、Goins, W.F. ら (1999) J. Virol. 73:519-532 及び Xu,
H. ら (1994) Dev. Biol. 163:152-161も参照されたい。両文献は、引用をもっ
て本明細書の一部とする。クローン化ヘルペスウイルス配列の操作、巨大ヘルペ
スウイルスのゲノムの異なった部分を含む多数のプラスミドを形質移入した後の
組換えウイルスの継代、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイ
ルスの細胞への感染は、当業者に公知の技術である。In yet another embodiment, a herpes gene therapy delivery system is used to deliver a LIMD-encoding polynucleotide to a target cell having one or more genetic abnormalities associated with LIMD expression. The use of herpes simplex virus (HSV) based vectors is particularly useful in introducing LIMD into cells of the central nervous system where HSV is tropic. Construction and packaging of herpes-based vectors is known to those of skill in the art. Vectors of the replication competent herpes simplex virus (HSV) type I system have been used to deliver reporter genes to the primate eye (Liu, X. et al. (1999) Exp. Eye Res.
.169: 385-395). For the production of HSV-1 viral vectors, US Pat. No. 5,804,413 (“Herpes simplex virus swains for gene transfer”) was granted to DeLuca.
), Which is incorporated herein by reference. US Patent No.
No. 5,804,413 describes recombinant HSV d92 containing a genome with at least one endogenous gene that is introduced into cells under the control of a promoter suitable for purposes including human gene therapy. The above patents also include ICP4, ICP27 and IC
Disclosed is the generation and use of a recombinant HSV line that is eliminated for P22. HS
For V vectors, Goins, WF et al. (1999) J. Virol. 73: 519-532 and Xu,
See also H. et al. (1994) Dev. Biol. 163: 152-161. Both documents are incorporated herein by reference. Manipulation of cloned herpesvirus sequences, passage of recombinant virus after transfection of multiple plasmids containing different parts of the giant herpesvirus genome, growth and multiplication of herpesvirus, and infection of cells with herpesvirus. Is a technique known to those skilled in the art.
【0168】
別の実施例では、アルファウイルス(正の一本鎖RNAウイルス)ベクターを用
いてLIMDをコードするポリヌクレオチドを標的細胞に輸送する。プロトタイプの
アルファウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス(SFV)の生物学的研究が広範
に行われており、遺伝子導入ベクターがSFVゲノムに基づいていることが分かっ
た(Garoff, H. and K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464-469)。アル
ファウイルスのRNAを複製中に、通常はウイルスカプシドタンパク質をコードす
るサブゲノムRNAが産出される。このサブゲノムRNAは、完全長のゲノムRNAより
高いレベルに複製されるため、酵素活性(例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ
)を有するウイルスタンパク質に比べてカプシドタンパク質が過剰産生される。
同様に、LIMDに対するコード配列をカプシドコード領域のアルファウイルスゲノ
ムに導入することにより、ベクター導入細胞において多数のLIMDコードRNAが産
生され、高レベルのLIMDが合成される。通常はアルファウイルスの感染が数日以
内での細胞溶解に関係する一方で、シンドビスウイルス(SIN)の変異体を有す
るハムスター正常腎臓細胞(BHK-21)の持続的な感染を確立する能力は、アルフ
ァウイルスの溶解複製を遺伝子治療に適用できるように好適に変更可能であるこ
とを示唆している(Dryga, S.A. ら. (1997) Virology 228 :74-83)。アルファ
ウイルスの宿主の範囲が広いことにより、様々な細胞タイプへのLIMDの導入が可
能になる。或る集団におけるサブセットの細胞の特定形質導入は、形質導入前に
細胞の選別を必要とし得る。アルファウイルスの感染性cDNAクローンの処置方法
、アルファウイルスのcDNA及びRNAの形質移入方法及びアルファウイルスの感染
方法は、当業者に公知である。In another example, an alphavirus (positive single-stranded RNA virus) vector is used to deliver a polynucleotide encoding LIMD to target cells. Extensive biological studies of the prototype alphavirus Semliki Forest Fever virus (SFV) have shown that the gene transfer vector is based on the SFV genome (Garoff, H. and K.-J. . Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9: 464-469). During replication of alphavirus RNA, subgenomic RNA that normally encodes the viral capsid protein is produced. This subgenomic RNA replicates to higher levels than full-length genomic RNA, resulting in overproduction of capsid proteins relative to viral proteins with enzymatic activity (eg, proteases and polymerases).
Similarly, by introducing the coding sequence for LIMD into the alphavirus genome of the capsid coding region, a large number of LIMD-encoding RNAs are produced in vector-transfected cells, and a high level of LIMD is synthesized. The ability to establish a persistent infection of hamster normal kidney cells (BHK-21) with mutants of Sindbis virus (SIN), while alphavirus infection is usually associated with cell lysis within days, is not Have suggested that the lytic replication of alphavirus can be suitably modified so that it can be applied to gene therapy (Dryga, SA et al. (1997) Virology 228: 74-83). The wide range of alphavirus hosts allows the introduction of LIMD into a variety of cell types. Specific transduction of a subset of cells in a population may require selection of cells prior to transduction. Methods of treating alphavirus infectious cDNA clones, transfection of alphavirus cDNA and RNA, and methods of infection with alphavirus are known to those of skill in the art.
【0169】
例えば開始部位から数えて約−10と約+10の間にある転写開始部位に由来
するオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。同様
に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対
形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開くよう
な二重らせんの能力を阻害するので、三重らせん塩基対形成は有用である。三重
らせんDNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある(Gee, J.E.
ら (1994) in: Huber, B.E.and B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approa ches
, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY, pp.163-177等を参照)。相補配
列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止する
ことによってmRNAの翻訳を阻止するべく設計することができる。It is also possible to inhibit gene expression using, for example, an oligonucleotide derived from a transcription start site that is between about −10 and about +10 counted from the start site. Similarly, inhibition is possible using the triple helix base pair formation method. Triple helix base pairing is useful because it inhibits the ability of the double helix to open sufficiently for the binding of polymerases, transcription factors or regulatory molecules. Recent advances in treatment with triple helix DNA have been described in the literature (Gee, JE
(1994) in: Huber, BEand BI Carr, Molecular and Immunologic Approaches , Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY, pp. 163-177 , etc.). Complementary sequences or antisense molecules can also be designed to block translation of mRNA by blocking the binding of transcripts to ribosomes.
【0170】
リボザイムは、酵素性RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するために用い
得る。リボザイム作用のメカニズムは、ヌクレオチド鎖切断に先立つ相補的標的
RNAへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションに関与している。
例えば、組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子は、LIMDをコードする配列
のヌクレオチド鎖切断を特異的且つ効果的に触媒する。Ribozymes are enzymatic RNA molecules that can be used to catalyze the specific cleavage of RNA. The mechanism of ribozyme action is a complementary target that precedes nucleotide breaks.
It is involved in the sequence-specific hybridization of ribozyme molecules to RNA.
For example, recombinant hammerhead ribozyme molecules specifically and effectively catalyze nucleotide scission of sequences encoding LIMD.
【0171】
任意の潜在的RNAターゲット内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC
配列を含めたリボザイム切断部位に対する標的分子をスキャンすることによって
先ず同定される。一度同定されると、オリゴヌクレオチドを機能不全にするよう
な2次構造の特徴に対して切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する15〜2
0リボヌクレオチドの短いRNA配列を、評価することが可能になる。候補標的の
適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオ
チドとのハイブリダイゼーションの実施容易性をテストすることによって行うこ
とができる。Specific ribozyme cleavage sites within any potential RNA target are GUA, GUU, GUC
It is first identified by scanning the target molecule for ribozyme cleavage sites, including sequences. Once identified, 15-2 corresponding to the region of the target gene containing the cleavage site for secondary structural features that render the oligonucleotide dysfunctional
It allows the evaluation of short RNA sequences of 0 ribonucleotides. The suitability of candidate targets can also be evaluated by testing the operability of hybridization with complementary oligonucleotides using a ribonuclease protection assay.
【0172】
本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子合成のために当分野
でよく知られている任意の方法を用いて作製し得る。任意の方法には、固相ホス
ホラミダイト化合物等のオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或
いは、HRIPをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo転写によってRNA分子を
産出し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6等の好適なRNAポリメラーゼプロモ
ーターを用いて多様なベクター内に組み入れることが可能である。或いは、相補
的RNAを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらcDNA産物を、細胞系、細胞
または組織内に導入することができる。Complementary ribonucleic acid molecules and ribozymes of the invention can be made using any method well known in the art for nucleic acid molecule synthesis. An optional method is to chemically synthesize an oligonucleotide such as a solid phase phosphoramidite compound. Alternatively, RNA molecules may be produced by in vitro and in vivo transcription of the DNA sequence encoding HRIP. Such DNA sequences can be incorporated into a wide variety of vectors using suitable RNA polymerase promoters such as T7 and SP6. Alternatively, those cDNA products that synthesize complementary RNA constitutively or inducibly can be introduced into cell lines, cells or tissues.
【0173】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにRNA分子を修飾し得る。限定
するものではないが可能な修飾には、分子の5'末端及び/または3'末端におい
てフランキング配列を追加したり、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ
結合ではなくホスホロチオネートまたは2' Oメチルを使用したりすることが含ま
れる。この概念は、PNAの産出に固有のものであり、これら全ての分子に拡大す
ることができる。それには、内在性エンドヌクレアーゼによって容易には認識さ
れないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンにアセチル−、メ
チル−、チオ−及び同様の修飾をしたものに加えて、非従来型塩基、例えばイノ
シン、クエオシン(queosine)、ワイブトシン(wybutosine)等を包含すること
による。RNA molecules may be modified to increase intracellular stability and half-life. Possible modifications include, but are not limited to, flanking sequences at the 5'and / or 3'ends of the molecule, or phosphorothionate or 2'O rather than phosphodiesterase linkages within the backbone of the molecule. Use of methyl is included. This concept is unique to the production of PNA and can be extended to all these molecules. It includes acetyl-, methyl-, thio-, and similar modifications of adenine, cytidine, guanine, thymine, and uridine, which are not readily recognized by endogenous endonucleases, as well as non-conventional bases such as inosine. , By including queosin (queosine), wybutosine (wybutosine) and the like.
【0174】
本発明の追加実施例には、LIMDをコードするポリヌクレオチドの変異発現に有
効な化合物をスクリーニングする方法が含まれる。限定するものではないが特異
ポリヌクレオチドの変異発現に有効な化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチ
センスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その
他のポリペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得
る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒ
ビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチ
ド発現を変異し得る。従って、LIMDの発現または活性の増加に関連する疾病の治
療においては、LIMDをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化
合物が治療上有益であり、LIMDの発現または活性の低下に関連する疾病の治療に
おいては、LIMDをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物
が治療上有益であり得る。Additional embodiments of the invention include methods of screening for compounds that are effective in mutating expression of a polynucleotide encoding LIMD. Compounds effective for, but not limited to, variant expression of specific polynucleotides include oligonucleotides, antisense oligonucleotides, triple helix-forming oligonucleotides, transcription factors and other polypeptide transcription control factors, and specific polynucleotide sequences that interact with them. There are non-polymeric chemical entities that can act. Effective compounds may mutate polynucleotide expression by acting as either inhibitors or enhancers of polynucleotide expression. Therefore, in the treatment of diseases associated with increased LIMD expression or activity, compounds that specifically inhibit the expression of polynucleotides encoding LIMD would be therapeutically beneficial and associated with decreased LIMD expression or activity. In treating diseases, compounds that specifically promote the expression of polynucleotides encoding LIMD may be of therapeutic benefit.
【0175】
特異ポリヌクレオチドの変異発現における有効性に対して、少なくとも1個か
ら複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知
られている任意の方法により得られる。このような方法には、ポリヌクレオチド
の発現を変異させる場合と、既存の、市販のまたは専売の、天然または非天然の
化合物ライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び/ま
たは構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまた
は無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効であることが知
られているような化合物の化学修飾がある。LIMDをコードするポリヌクレオチド
を含むサンプルは、少なくとも1つの試験化合物に曝され、このように得られる
。サンプルには例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、in vitro細胞遊離また
は再構成された生化学系を有し得る。LIMDをコードするポリヌクレオチドの発現
における変化は、当分野で通常知られている任意の方法でアッセイする。通常、
LIMDをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有する
プローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特異ヌクレオチドの発現を検
出する。ハイブリダイゼーション量を定量し、それによって1若しくは複数の試
験化合物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較に対する
基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変
化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を変異する際に試験化合物が有効であるこ
とを示している。特異ポリヌクレオチドの変異発現に有効な化合物に対して、例
えばSchizosaccharomyces pombe遺伝子発現系(Atkins, D. ら (1999) 米国特許
第5,932,435号、Arndt, G.M. ら (2000) Nucleic Acids Res. 28:E15)またはHe
La細胞等のヒト細胞系(Clarke, M.L. ら (2000) Biochem. Biophys. Res. Comm
un. 268:8-13)を用いてスクリーニングを実行する。本発明の特定の実施例は、
特異的ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性のためのオリゴヌクレオ
チド(デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾オリ
ゴヌクレオチド)の組合せライブラリをスクリーニングすることに関与している
(Bruice, T.W. ら (1997) の米国特許第5,686,242号、Bruice, T.W. ら (2000)
の米国特許第6,022,691号)。At least one to a plurality of test compounds may be screened for effectiveness in mutating a specific polynucleotide. The test compound is obtained by any method commonly known in the art. Such methods include mutating the expression of the polynucleotide, selecting from existing, commercially available or proprietary, natural or unnatural compound libraries, and chemical and / or structural analysis of the target polynucleotide. There are chemical modifications of compounds that are known to be effective in the rational design of compounds based on properties and in the selection of combinatorially or randomly generated libraries of compounds. A sample containing a polynucleotide encoding LIMD is exposed to at least one test compound and is thus obtained. The sample can have, for example, intact cells, permeabilized cells, in vitro cell release or reconstituted biochemical systems. Changes in expression of a polynucleotide encoding LIMD are assayed by any method commonly known in the art. Normal,
Expression of specific nucleotides is detected by hybridization with a probe having a nucleotide sequence complementary to the sequence of the polynucleotide encoding LIMD. The amount of hybridization can be quantified and thereby form the basis for comparison of the expression of polynucleotides exposed and unexposed to one or more test compounds. Detection of changes in expression of the polynucleotide exposed to the test compound indicates that the test compound is effective in mutating expression of the polynucleotide. For compounds effective for mutating specific polynucleotides, for example, Schizosaccharomyces pombe gene expression system (Atkins, D. et al. (1999) U.S. Patent No. 5,932,435, Arndt, GM et al. (2000) Nucleic Acids Res .28: E15) or He
Human cell lines such as La cells (Clarke, ML et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Comm.
un. 268: 8-13). A particular embodiment of the invention is
Involved in screening combinatorial libraries of oligonucleotides (deoxyribonucleotides, ribonucleotides, peptide nucleic acids, modified oligonucleotides) for antisense activity against specific polynucleotide sequences (Bruice, TW et al. (1997) US Patent 5,686,242, Bruice, TW et al. (2000)
U.S. Pat. No. 6,022,691).
【0176】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo
、in vitro及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合
、ベクターを患者から採取した肝細胞内に導入し、クローニング増殖して同一患
者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクション、リボソーム注入また
はポリカチオンアミノポリマーによる輸送は、当分野でよく知られている方法を
用いて実行することができる(Goldman, C.K. ら (1997) Nat. Biotechnol. 15:
462-466.等を参照)。A number of methods are available for introducing vectors into cells or tissues, in vivo
Equally suitable for in vitro and ex vivo use. For ex vivo therapy, the vector can be introduced into hepatocytes taken from a patient, cloned and propagated and autologously transplanted back into the same patient. Transfection, ribosome injection or transport by polycationic aminopolymers can be performed using methods well known in the art (Goldman, CK et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15:
462-466. Etc.).
【0177】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ
、サル等の哺乳動物を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。Any of the above treatment methods can be applied to all subjects in need of treatment including mammals such as humans, dogs, cats, cows, horses, rabbits and monkeys.
【0178】
本発明の追加実施例は、通常薬剤として許容できる賦形剤で処方される活性成
分を有する医薬品成分の投与に関連する。賦形剤には例えば、セルロース、ゴム
及びタンパク質がある。様々な処方が通常知られており、詳細はRemington's Ph armaceutical Sciences
(Maack Publishing, Easton PA)の最新版に記載されて
いる。このような医薬品成分は、LIMD、LIMDに対する抗体、擬態、アゴニスト、
アンタゴニスト、またはLIMDインヒビターから構成し得る。An additional embodiment of the invention relates to the administration of pharmaceutical ingredients having the active ingredient usually formulated with pharmaceutically acceptable excipients. Excipients include, for example, cellulose, gums and proteins. Various formulations are commonly known and details are given in the latest edition of Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing, Easton PA). Such pharmaceutical ingredients include LIMD, antibodies against LIMD, mimetics, agonists,
It may consist of an antagonist, or a LIMD inhibitor.
【0179】
本発明に用いられる医薬品成分は、任意の数の経路によって投与することがで
き、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内
、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下
または直腸がある。The pharmaceutical ingredients used in the present invention can be administered by any number of routes including, but not limited to, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, arachnoid. Intracavitary, intraventricular, pulmonary, percutaneous, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, enteral, topical, sublingual or rectal.
【0180】
肺から投与する医薬品成分は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このよう
な医薬品成分は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子(例えば
伝統的な低分子重量有機薬)の場合には、速効製剤のエアロゾル輸送は当分野で
公知である。高分子(例えばより大きなペプチド及びタンパク質)の場合には、
当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺輸送が最近向上したことにより、イ
ンスリン等の薬剤を実質的に血液循環へ輸送することが可能になった(Patton,
J.S. らの米国特許第5,997,848号等を参照)。肺輸送は、針注射なしに投与する
点で優れており、潜在的に有毒な浸透エンハンサーの必要性をなくす。Pulmonary administration pharmaceutical ingredients may be prepared in liquid or dry powder form. Such pharmaceutical ingredients are typically aerosolized shortly before inhalation by the patient. In the case of small molecules (eg traditional low molecular weight organic drugs), aerosol delivery of fast-acting formulations is known in the art. In the case of macromolecules (eg larger peptides and proteins)
Recent improvements in pulmonary transport through the alveolar region of the lung in the field have made it possible to substantially transport drugs such as insulin into the blood circulation (Patton,
See JS et al., US Pat. No. 5,997,848). Pulmonary transport is superior in that it is administered without needle injection, obviating the need for potentially toxic penetration enhancers.
【0181】
本発明での使用に適した医薬品成分には、所定の目的を達成するために必要な
だけの量の活性成分を含有する成分が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の
能力の範囲内で行う。Pharmaceutical ingredients suitable for use in the present invention include those ingredients that contain the active ingredient in an amount sufficient to achieve the intended purpose. Determination of the effective dose is within the ability of those skilled in the art.
【0182】
医薬品成分の特殊形状は、LIMDまたはその断片を含む高分子を直接細胞内輸送
するために調製される。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、
細胞融合及び高分子の細胞内輸送を促進し得る。或いは、LIMDまたはその断片を
HIV Tat-1タンパク質から陽イオンN末端部に結合することもできる。このように
して生成された融合タンパク質は、マウスモデル系の脳を含む全ての組織の細胞
に形質導入することがわかっている(Schwarze, S.R. ら (1999) Science 285:1
569-1572)。A special form of pharmaceutical ingredient is prepared for direct intracellular delivery of macromolecules, including LIMD or fragments thereof. For example, a liposome preparation containing a cell-impermeable polymer is
It can promote cell fusion and intracellular transport of macromolecules. Alternatively, LIMD or its fragment
It is also possible to bind from the HIV Tat-1 protein to the cationic N-terminal part. The fusion protein thus produced is known to transduce cells of all tissues including the mouse model system brain (Schwarze, SR et al. (1999) Science 285: 1.
569-1572).
【0183】
任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養ア
ッセイにおいて、或いは、動物モデル、例えばマウス、ウサギ、イヌまたはブタ
等において、先ず治療の有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた
、好適な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を
用いて、次にヒトに対する有益な投与量及び投与経路を決定することができる。For any compound, the effective therapeutic dose is first estimated in a cell culture assay, eg, a cell culture assay for neoplastic cells, or in an animal model, eg, mouse, rabbit, dog or pig. be able to. The animal model may also be used to determine the appropriate concentration range and route of administration. Such information can then be used to determine useful doses and routes for administration in humans.
【0184】
治療上の有効投与量は、症状や容態を回復させるような活性成分量を参考にす
る。そのような活性成分の例としては、LIMDまたはその断片、LIMDの抗体、LIMD
のアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターがある。薬用有効度及び毒性
は、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって、例えばED50(
集団の50%の医薬的有効量)またはLD50(集団の50%の致死量)を測定する
などして決定することができる。毒性効果の治療効果に対する投与量の比は、治
療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示すよう
な医薬品成分が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは
、ヒトに用いるための投与量の範囲を調剤するのに用いられる。このような組成
物が含まれる投与量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ED50を含むような血中濃
度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性及び投与の
経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。The therapeutically effective dose refers to the amount of the active ingredient that recovers symptoms and conditions. Examples of such active ingredients are LIMD or fragments thereof, antibodies to LIMD, LIMD
There are agonists, antagonists or inhibitors of. Medicinal efficacy and toxicity are determined by standard drug techniques in cell culture or animal studies, eg, ED 50 (
It can be determined, for example, by measuring the pharmaceutically effective amount of 50% of the population) or LD 50 (lethal dose of 50% of the population). The dose ratio relative to the therapeutic effect of toxic effects is the therapeutic index and it can be expressed as the ratio LD 50 / ED 50. Pharmaceutical ingredients that exhibit a high therapeutic index are desirable. The data obtained from cell culture assays and animal studies are used in formulating a range of dosage for use in humans. The dosage contained in such compositions is preferably within a range of circulating concentrations that include the ED 50 with little or no toxicity. The dosage will vary within this range depending upon the dosage form employed, the sensitivity of the patient and the route of administration.
【0185】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が
決定することになる。効果的なレベルの活性成分を与え、或いは所望の効果を維
持するべく、投与量及び投与を調節する。被験者に関する要素としては、疾患の
重症度、患者の通常の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、投与の時間及び頻
度、薬剤の配合、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮する。作用期間が長
い医薬品成分は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって3〜4日毎に
1度、1週間に1度、或いは2週間に1度の間隔で投与し得る。The exact dosage will be determined by the practitioner, in light of factors related to the subject that requires treatment. Dosage and administration are adjusted to provide effective levels of the active ingredient or to maintain the desired effect. Factors relating to the subject include the severity of the disease, the normal health condition of the patient, the age, weight and sex of the patient, time and frequency of administration, drug combination, reaction sensitivity, response to treatment and the like. Long-acting pharmaceutical ingredients may be administered at intervals of once every 3 to 4 days, once every week, or once every two weeks, depending on the half-life and clearance rate of the particular formulation.
【0186】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約0.1〜100,000μgであり、
合計で約1gまでとする。特定の投与量及び輸送方法に関するガイダンスは文献
に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、
タンパク質またはインヒビターに対する処方とは異なる、ヌクレオチドに対する
処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの輸
送は、特定の細胞、状態、位置等に特異的なものとなる。The usual dose is about 0.1 to 100,000 μg, depending on the route of administration.
The total is up to about 1g. Guidance regarding specific dosages and delivery methods is found in the literature and is usually available to the onsite physician. Those skilled in the art
A recipe for nucleotides that is different than the recipe for proteins or inhibitors will be utilized. Similarly, delivery of polynucleotides or polypeptides will be specific to particular cells, conditions, locations, etc.
【0187】
診断
別の実施例では、LIMDの発現によって特徴付けられる疾患の診断のために、或
いはLIMDやLIMDのアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤で治療を受けている
患者をモニターするためのアッセイにおいて、LIMDを特異的に結合する抗体が用
いられることがある。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方
法と同じ方法で調合される。LIMDの診断アッセイには、抗体及び標識を利用して
ヒトの体液において或いは細胞や組織のエキスにおいてLIMDを検出する方法が含
まれる。抗体は、修飾して或いは修飾しないで使用し、レポーター分子の共有結
合性或いは非共有結合性の接着によって標識化し得る。多様なレポーター分子が
当分野で知られており、それらを用いることができる。幾つかのレポーター分子
については上記した。 Diagnosis In another embodiment, in an assay for the diagnosis of a disease characterized by the expression of LIMD, or for monitoring a patient being treated with LIMD or an agonist, antagonist or inhibitor of LIMD, Antibodies that specifically bind LIMD may be used. Antibodies useful for diagnostic purposes are formulated in the same manner as described in the treatment section above. LIMD diagnostic assays include methods that utilize antibodies and labels to detect LIMD in human body fluids or in cell or tissue extracts. The antibody may be used with or without modification and may be labeled by covalent or non-covalent attachment of the reporter molecule. A wide variety of reporter molecules are known in the art and can be used. Some reporter molecules have been described above.
【0188】
LIMDを測定するための様々なプロトコル、例えばELISA、RIA、FACS等が当分野
において知られており、LIMD発現の修正レベル或いは異常レベルを診断する基準
を提供する。複合体の形成に適した条件下でヒト対象等の正常な哺乳動物対象か
ら採取した体液または細胞とLIMDに対する抗体とを結合させることにより、LIMD
発現の正常値または標準値が決定される。標準複合体形成量は、種々の方法、例
えば測光法で定量できる。対象内で発現したLIMDの量、制御、検体からの病変サ
ンプルを標準値と比較する。標準値と対象との偏差が疾患を診断するパラメータ
となる。Various protocols for measuring LIMD are known in the art, such as ELISA, RIA, FACS, etc., and provide a basis for diagnosing corrected or abnormal levels of LIMD expression. By combining an antibody against LIMD with body fluid or cells collected from a normal mammalian subject such as a human subject under conditions suitable for complex formation, LIMD
Normal or standard values of expression are determined. The amount of standard complex formed can be quantified by various methods such as photometry. The amount of LIMD expressed in the subject, control, and lesion samples from the specimen are compared to standard values. The deviation between the standard value and the subject is the parameter for diagnosing the disease.
【0189】
別の実施例によれば、LIMDをコードするポリヌクレオチドを診断目的に用いる
こともできる。用いられることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオ
チド配列、相補的RNA及びDNA分子、そしてPNAが含まれる。ポリヌクレオチドは
、検体におけるLIMDの発現が疾患と相関し得るような該検体における遺伝子発現
の検出及び定量に用いることができる。診断アッセイは、LIMDの不在、存在及び
過剰発現を測定するために、そして治療インターベンション中にLIMDレベルの調
製をモニターするために用いることができる。According to another embodiment, the polynucleotide encoding LIMD can also be used for diagnostic purposes. Polynucleotides that can be used include oligonucleotide sequences, complementary RNA and DNA molecules, and PNA. The polynucleotides can be used to detect and quantify gene expression in a sample such that expression of LIMD in the sample can be correlated with disease. Diagnostic assays can be used to measure the absence, presence and overexpression of LIMD, and to monitor the preparation of LIMD levels during therapeutic intervention.
【0190】
一実施形態では、LIMDをコードする核酸配列を同定するために、LIMDまたは密
接に関連している分子をコードする、ゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を
検出可能なPCRプローブとのハイブリダイゼーションを用いることができる。プ
ローブが、5'調節領域のような高特異領域を有するにせよ、保存されたモチー
フのような低特異領域を有するにせよ、LIMD、突然変異体または関連配列をコー
ドする天然の配列しか同定しないのかどうかは、プローブの特異性及びハイブリ
ダイゼーション或いは増幅のストリンジェンシーが決定することになる。In one embodiment, to identify a nucleic acid sequence encoding a LIMD, hybridization with a PCR probe capable of detecting a polynucleotide sequence, including a genomic sequence, encoding a LIMD or a closely related molecule. Can be used. Whether the probe has a highly specific region, such as the 5'regulatory region, or a low specific region, such as a conserved motif, identifies only the native sequence encoding a LIMD, mutant or related sequence It depends on the specificity of the probe and the stringency of hybridization or amplification.
【0191】
プローブは、関連する配列の検出にも用いることができ、その配列はLIMDをコ
ードする任意の配列と少なくとも50%の相同性をも有し得る。本発明のハイブ
リダイゼーションプローブはDNAまたはRNAとすることができ、配列番号3乃至4
の配列、或いはLIMD遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲ
ノム配列に由来し得る。The probe can also be used to detect related sequences, which sequences may also have at least 50% homology to any sequence encoding LIMD. The hybridization probe of the present invention may be DNA or RNA, and has SEQ ID NOS: 3 to 4.
Or the genomic sequence containing the promoter, enhancer and intron of the LIMD gene.
【0192】
LIMDをコードするDNAに対する特異的ハイブリダイゼーションプローブを作製
する手段には、LIMDまたはLIMD誘導体をコードするポリヌクレオチド配列を、mR
NAプローブを作製するためのベクターにクローニングする方法が含まれる。mRNA
プローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好
適なRNAポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって
、in vitroでRNAプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーシ
ョンプローブは、種々のレポーターの集団によって標識され得る。レポーター集
団の例としては、32Pまたは35S等の放射性核種、或いはアビジン/ビオチン結合
系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙
げられる。A means for producing specific hybridization probes for DNA encoding LIMD includes the use of a polynucleotide sequence encoding LIMD or a LIMD derivative as an mRNA sequence.
Included is a method of cloning into a vector for making NA probes. mRNA
Vectors for making probes are known to those of skill in the art, are commercially available, and can be used to synthesize RNA probes in vitro by adding a suitable RNA polymerase and suitable labeled nucleotides. . Hybridization probes can be labeled with different populations of reporters. Examples of reporter populations include radionuclides such as 32 P or 35 S, or enzyme labels such as alkaline phosphatase attached to the probe via an avidin / biotin binding system.
【0193】
LIMDをコードするポリヌクレオチド配列は、LIMDの発現に関係する疾患の診断
の為に用い得る。限定するものではないがこのような疾患の例として細胞増殖異
常が含まれ、その中には日光性角化症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、
滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病(MCTD)、骨髄線維症、発作性夜間ヘ
モグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症と、腺癌、白血病、リン
パ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌を含む癌、具体的には副腎、膀胱、骨、骨
髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵
巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺
、子宮の癌等が含まれ、また発達障害も含まれ、その中には尿細管性アシドーシ
ス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー
型筋ジストロフィ、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群(ウィルムス腫瘍、無虹彩
症、尿生殖器異常及び精神薄弱)、スミス‐マジェニス症候群(Smith-Magenis
syndrome)、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャ
ルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低
下症、水頭症、舞踏病(Syndenham's chorea)及び脳性小児麻痺などの発作障害
、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力
損失とが含まれ、また細胞運動異常も含まれ、その中には強直性脊椎炎、チェデ
ィアック-東症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィ及びベッカー筋ジストロフ
ィ、肝内胆汁うっ滞、心筋過形成、心筋症、早期発症型歯周炎、腺癌、卵巣癌及
び慢性骨髄性白血病などの癌、細菌感染及び寄生虫感染が含まれる。LIMDをコー
ドするポリヌクレオチド配列は、サザン法、ノーザン法、ドットブロット法やそ
の他の膜ベースの技術と、PCR法と、ディップスティック(dipstick)法、ピン
及びマルチフォーマットELISA様アッセイと、変異LIMDの発現を検出するために
患者から採取した体液または組織を利用するマイクロアレイとにおいて使用し得
る。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。Polynucleotide sequences encoding LIMD can be used for the diagnosis of diseases associated with the expression of LIMD. Examples of such diseases include, but are not limited to, abnormal cell proliferation, including actinic keratosis, arteriosclerosis, atherosclerosis,
Bursitis, cirrhosis, hepatitis, mixed connective tissue disease (MCTD), myelofibrosis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, polycythemia vera, psoriasis, primary thrombocythemia, adenocarcinoma, leukemia, lymphoma , Cancers including melanoma, myeloma, sarcoma, teratocarcinoma, specifically adrenal gland, bladder, bone, bone marrow, brain, breast, cervix, gallbladder, ganglion, digestive tract, heart, kidney, liver, lung, muscle , Ovary, pancreas, parathyroid gland, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen, testis, thymus, thyroid, uterine cancer, etc., as well as developmental disorders, including tubular acidosis, anemia, Cushing's syndrome, achondroplasia dwarfism, Duchenne-Becker muscular dystrophy, epilepsy, gonadal dysplasia, WAGR syndrome (Wilms tumor, aniridia, genitourinary disorders and mental retardation), Smith-Magenis syndrome
Syndrome, myelodysplastic syndrome, hereditary mucosal epithelial dysplasia, hereditary keratoderma, Charcot-Marie-Tooth disease and hereditary neurological diseases such as neurofibromatosis, hypothyroidism, hydrocephalus, chorea ( Syndenham's chorea) and cerebral palsy and other seizure disorders, spinal schizophrenia, anencephaly, cranio-spinal dissection, congenital glaucoma, cataract, sensorineural hearing loss, and also cell dyskinesia, among them. Is ankylosing spondylitis, Chediak-East syndrome, Duchenne muscular dystrophy and Becker muscular dystrophy, intrahepatic cholestasis, myocardial hyperplasia, cardiomyopathy, early-onset periodontitis, adenocarcinoma, ovarian cancer and chronic myelogenous Includes cancers such as leukemia, bacterial infections and parasitic infections. The LIMD-encoding polynucleotide sequences are derived from Southern, Northern, dot-blot, and other membrane-based techniques, PCR, dipstick, pin and multiformat ELISA-like assays, and mutant LIMD. It can be used in microarrays that utilize bodily fluids or tissues collected from patients to detect expression. Such qualitative or quantitative methods are known in the art.
【0194】
或る形態では、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて
、LIMDをコードするヌクレオチド配列が有用であり得る。LIMDをコードするヌク
レオチド配列は標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形
成に好適な条件下で、患者から採取した体液または組織のサンプルに添加するこ
とができる。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シ
グナルを定量して標準値と比較する。患者サンプルのシグナル量が制御サンプル
と比べて著しく変化している場合は、サンプル内のLIMDをコードするヌクレオチ
ド配列の変異レベルは関連する疾患の存在を示している。このようなアッセイは
、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を推定するため、或いは個々の患
者の治療をモニターするために用いることもできる。In some forms, the nucleotide sequences encoding LIMD may be useful in assays that detect related disorders, particularly those mentioned above. The nucleotide sequence encoding LIMD is labeled by standard methods and can be added to a sample of bodily fluid or tissue taken from a patient under conditions suitable for the formation of hybridization complexes. After a suitable incubation period, the samples are washed and the signal is quantified and compared to standard values. If the amount of signal in the patient sample is significantly altered compared to the control sample, the level of mutation of the nucleotide sequence encoding LIMD in the sample is indicative of the presence of the associated disease. Such assays can also be used to predict the effects of particular treatments in animal studies, clinical trials, or to monitor the treatment of individual patients.
【0195】
LIMDの発現に関連する疾患の診断基準を提供するために、発現のための正常あ
るいは標準概要を確立する。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適
な条件下で、動物或いはヒトの正常な対象から抽出した体液或いは細胞を、LIMD
をコードする配列またはその断片と結合させることにより達成され得る。実質的
に精製されたポリヌクレオチドを既知量用いて行った実験から得た値を正常な対
象から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量するこ
とができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサン
プルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在
を証明する。In order to provide diagnostic criteria for diseases associated with LIMD expression, a normal or standard profile for expression is established. This is because LIMD is used to extract body fluids or cells extracted from a normal animal or human subject under conditions suitable for hybridization or amplification.
Can be achieved by ligating with a sequence coding for or a fragment thereof. Standard hybridizations can be quantitated by comparing the values obtained from experiments performed with known amounts of substantially purified polynucleotide to those obtained from normal subjects. The standard value thus obtained can be compared with the value obtained from a sample obtained from a patient who shows signs of disease. Deviation from standard values is used to verify the presence of disease.
【0196】
疾患の存在が証明されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが
正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイ
ブリダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返し得る。連続アッセイから得
られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。Once the presence of the disease has been demonstrated and the treatment protocol has begun, hybridization assays are routinely used to determine whether the patient's expression levels begin to approach those observed in normal subjects. Get repeat. The results obtained from the serial assays can be used to show the effect of treatment over a period of days to months.
【0197】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物(過少発現また
は過剰発現)の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる
前に疾患を検出する方法を提供したりし得る。この種のより明確な診断により、
医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって
癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。For cancer, the presence of abnormal amounts of transcripts (under- or over-expression) in living tissue from an individual indicates the predisposition to the disease or detects the disease before actual clinical symptoms appear. May provide a method of doing so. With a clearer diagnosis of this kind,
It allows medical professionals to use preventative or aggressive treatment early to prevent the development or further progression of cancer.
【0198】
LIMDをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドを追加的に診断上利
用することは、PCRの利用に関与し得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成
するか、酵素により生産するか、或いはin vitroで産出し得る。オリゴマーは、
好ましくはLIMDをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはLIMDをコードする
ポリヌクレオチドと相補的ポリヌクレオチドの断片を含み、最適条件下で特定の
遺伝子や条件を識別するべく利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリ
ンジェント条件下で、密接に関連しているDNA或いはRNA配列の検出及び/または
定量のため用いることが可能である。The additional diagnostic utility of oligonucleotides designed from the sequence encoding LIMD may involve the use of PCR. These oligomers can be chemically synthesized, enzymatically produced, or produced in vitro . The oligomer is
Preferably, it contains a fragment of a polynucleotide encoding LIMD or a fragment of a polynucleotide complementary to the polynucleotide encoding LIMD, and is used to identify a specific gene or condition under optimal conditions. Also, the oligomers can be used for the detection and / or quantification of closely related DNA or RNA sequences under mildly stringent conditions.
【0199】
或る態様において、LIMDをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌク
レオチドプライマーを用いて一塩基多型(SNP)を検出し得る。SNPは、多くの場
合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入及び欠失で
ある。限定するものではないがSNPの検出方法には、制限酵素切断法(SSCP)及
び蛍光SSCP(fSSCP)がある。SSCPでは、LIMDをコードするポリヌクレオチド配
列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応法(PC
R)を用いたDNAの増幅を行う。DNAは例えば、病変組織または正常組織、生検サ
ンプル、体液その他に由来し得る。DNA内のSNPは、一本鎖形状のPCR生成物の2
次及び3次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を
用いて検出可能である。fSCCPでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に
標識する。それによってDNAシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマ
ー(amplimer)の検出が可能になる。更に、インシリコSNP(in silico SNP, is
SNP)と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列に配列
されるような個々の重畳するDNA断片の配列を比較することにより、多型を同定
し得る。これらのコンピュータベースの方法は、DNAの実験室での調整及び統計
モデル及びDNA配列クロマトグラムの自動分析を用いたシークエンシングのエラ
ーに起因する配列の変異をフィルタリングして除去する。別の態様では、例えば
高処理MASSARRAYシステム(Sequenom, Inc., San Diego CA)を用いた質量分析
によりSNPを検出し、特徴付ける。In certain embodiments, oligonucleotide primers derived from a polynucleotide sequence encoding LIMD can be used to detect single nucleotide polymorphisms (SNPs). SNPs are substitutions, insertions and deletions that often cause congenital or acquired genetic diseases in humans. Without limitation, SNP detection methods include restriction enzyme digestion (SSCP) and fluorescent SSCP (fSSCP). In SSCP, an oligonucleotide primer derived from a polynucleotide sequence encoding LIMD is used to perform polymerase chain reaction (PC
R) is used to amplify the DNA. DNA can be derived, for example, from diseased or normal tissue, biopsy samples, body fluids and the like. The SNPs in the DNA are two single-stranded PCR products.
It makes a difference in the secondary and tertiary structure. Differences can be detected using gel electrophoresis in non-denaturing gels. In fSCCP, oligonucleotide primers are fluorescently labeled. This enables detection of amplimers with high-throughput equipment such as DNA sequencing machines. Furthermore, in silico SNP (in silico SNP, is
A sequence database analysis method called SNP) can identify polymorphisms by comparing the sequences of individual overlapping DNA fragments as aligned to a common consensus sequence. These computer-based methods filter out sequence variations due to laboratory adjustments of DNA and sequencing errors using statistical models and automated analysis of DNA sequence chromatograms. In another embodiment, SNPs are detected and characterized by mass spectrometry, for example using the High Throughput MASSARRAY system (Sequenom, Inc., San Diego CA).
【0200】
LIMDの発現を定量するために用い得る方法には、ヌクレオチドの放射標識また
はビオチン標識、調節核酸の相互増幅(coamplification)及び標準曲線から得
た結果の補間もある(Melby, P.C.ら (1993) J. Immunol. Methods, 159:235-24
4、Duplaa, C.ら (1993) Anal. Biochem. 212:229-236等を参照)。目的のオリ
ゴマーが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または非色応答によって定量が迅
速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数のサン
プルの定量速度を加速することができる。Methods that can be used to quantify the expression of LIMD also include radiolabelling or biotin labeling of nucleotides, coamplification of regulatory nucleic acids and interpolating the results obtained from standard curves (Melby, PC et al. 1993) J. Immunol. Methods, 159: 235-24.
4, Duplaa, C. et al. (1993) Anal. Biochem. 212: 229-236). High-throughput format assays in which the oligomer of interest is present in different dilutions and quantified quickly by spectrophotometric or non-color response can accelerate quantitation rates for multiple samples .
【0201】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来の
オリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として
用いることができる。多数の遺伝子の関連発現レベルを同時にモニターする転写
イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては
、米国特許第5,840,484号のSeilhamer, J.J. らの"Comparative Gene Transcrip
t Analysis"に記載されており、この引用を以って本明細書の一部となす。マイ
クロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異及び多型の同定に用いることができる
。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、
疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行/後退をモニターし、疾病
治療における薬剤の活性を開発及びモニターすることができる。特に、患者にと
って最もふさわしく、有効的な治療法を選択するために、この情報を用いて患者
の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノム
プロフィールに基づき、患者に対して高度に有効的で副作用を殆ど示さない治療
薬を選択し得る。In yet another example, oligonucleotides or longer fragments from any of the polynucleotide sequences described herein can be used as targets in microarrays. Microarrays can be used in transcription imaging techniques that simultaneously monitor the associated expression levels of multiple genes. In this regard, Seilhamer, JJ et al., "Comparative Gene Transcrip," of US Pat. No. 5,840,484.
T Analysis "and incorporated herein by reference. Microarrays can also be used to identify genetic variants, mutations and polymorphisms. Use this information To determine gene function, understand the genetic basis of the disease,
Diseases can be diagnosed, the progression / regression of the disease as a function of gene expression can be monitored, and the activity of the drug in treating the disease can be developed and monitored. In particular, this information can be used to develop a pharmacogenomic profile of a patient in order to select the most appropriate and effective treatment for the patient. For example, based on the patient's pharmacogenomic profile, therapeutic agents can be selected that are highly effective and show few side effects to the patient.
【0202】
別の実施例では、LIMDに特異的な抗体、LIMDまたはその断片をマイクロアレイ
上で要素として用い得る。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質間
相互作用、薬剤−標的相互作用及び遺伝子発現プロフィールをモニターまたは測
定し得る。In another example, antibodies specific to LIMD, LIMD or fragments thereof can be used as elements on the microarray. Microarrays can be used to monitor or measure protein-protein interactions, drug-target interactions and gene expression profiles as described above.
【0203】
一実施例は、組織または細胞タイプの転写イメージを生成する本発明のポリヌ
クレオチドの使用に関係がある。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプ
による遺伝子発現の全体的なパターンを表す。全体的な遺伝子発現パターンは、
複数の発現された遺伝子及びその相対存在量を所与の条件及び時間で定量するこ
とにより分析する(Seilliamerらの米国特許第5,840,484号 "Comparative Gene
Transcript Analysis" を参照。該特許の引用を以って本明細書の一部となす)
。従って、特定の組織または細胞タイプの転写または逆転写の全体に本発明のポ
リヌクレオチドまたはその相補体をハイブリダイズすることにより転写イメージ
を生成し得る。一実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはその相補体が複
数のマイクロアレイ上のエレメントのサブセットを有し、高処理フォーマットで
ハイブリダイゼーションが行われる。結果として生じる転写イメージは、遺伝子
活性のプロフィールを提供することになる。One example pertains to the use of the polynucleotides of the invention to produce a transcriptional image of a tissue or cell type. Transcriptional images represent the overall pattern of gene expression by a particular tissue or cell type. The overall gene expression pattern is
Analysis by quantifying multiple expressed genes and their relative abundance under given conditions and time (Seilliamer et al., US Pat. No. 5,840,484, "Comparative Gene").
Transcript Analysis ", incorporated herein by reference.
. Thus, a transcriptional image may be produced by hybridizing a polynucleotide or a complement thereof of the invention to the entire transcription or reverse transcription of a particular tissue or cell type. In one example, a polynucleotide of the invention or its complement has a subset of elements on a plurality of microarrays and hybridisation occurs in a high throughput format. The resulting transcriptional image will provide a profile of gene activity.
【0204】
転写イメージは、組織、株化細胞、生検または生物学的サンプルから単離した
転写物を用いて生成し得る。転写イメージは、組織または生検サンプルの場合に
はin vivoで、株化細胞の場合にはin vitroで遺伝子発現を反映し得る。Transcriptional images may be generated using transcripts isolated from tissues, cell lines, biopsies or biological samples. Transcriptional images may reflect gene expression in vivo for tissue or biopsy samples and in vitro for cell lines.
【0205】
本発明のポリヌクレオチドの発現プロフィールを作成する転写イメージは、工
業的及び天然の環境化合物の毒性試験のみならずin vitroモデルシステム及び医
薬品の前臨床評価と併せて用い得る。全ての化合物は、しばしば分子フィンガー
プリントまたは毒物サインと名付けられるような、作用及び毒性のメカニズムを
示す特性遺伝子発現パターンを誘導する(Nuwaysir, E.F. ら (1999) Mol. Carc
inog. 24:153-159; Steiner, S. and N.L. Anderson (2000) Toxicol. Lett. 11
2-113:467-471、特別に引用を以って本明細書の一部となす)。試験化合物が、
既知の毒性を有する化合物のサインと類似のサインを有しているのであれば、毒
性の特性を共有している可能性がある。これらのフィンガープリントまたはサイ
ンは、複数の遺伝子及び遺伝子ファミリーからの発現情報が含まれている場合に
は、最も有益且つ洗練されたものである。理想的には、発現をゲノム全体で測定
することにより、最高品質のサインが与えられる。任意の試験化合物により発現
が変異された遺伝子であっても、これらの遺伝子の発現レベルを用いて発現デー
タの残りを規準化し得るので、同様に重要である。規準化手法は、異なる化合物
で処理した後で発現データを比較するのに役立つ。毒物サインのエレメントに対
する遺伝子機能の割当は毒性メカニズムの解釈に役立つが、毒性の予測を導くサ
インを統計学的に一致させるために遺伝子機能の知識は必ずしも必要ではない(
例えば米国環境健康科学研究所(National Institute of Environmental Health
Sciences)から2000年2月29日に発行され、http://www.niehs.nih.gov/oc/news
/toxchip.htmで利用可能なPress Release 00-02を参照)。従って、毒物サイン
を用いた毒物学的スクリーニングにおいては、発現された遺伝子配列を全て含め
ることは重要且つ望ましいことである。Transcriptional images that make up the expression profiles of the polynucleotides of the invention can be used in conjunction with in vitro model systems and preclinical evaluation of pharmaceuticals as well as toxicity studies of industrial and natural environmental compounds. All compounds induce characteristic gene expression patterns that represent mechanisms of action and toxicity, often termed molecular fingerprints or toxic signatures (Nuwaysir, EF et al. (1999) Mol. Carc.
inog. 24: 153-159; Steiner, S. and NL Anderson (2000) Toxicol. Lett. 11
2-113: 467-471, specifically incorporated herein by reference). The test compound is
They may share toxic properties if they have a signature similar to that of a compound with known toxicity. These fingerprints or signatures are most informative and sophisticated when they contain expression information from multiple genes and gene families. Ideally, measuring expression across the genome gives the highest quality signature. Equally important are genes whose expression is mutated by any test compound, since the expression levels of these genes can be used to normalize the rest of the expression data. The normalization procedure serves to compare expression data after treatment with different compounds. Assignment of gene function to elements of the toxic signature helps to interpret toxicity mechanisms, but knowledge of gene function is not necessary to statistically match signatures that lead to predictive toxicity (
For example, National Institute of Environmental Health
Sciences) published on February 29, 2000, http://www.niehs.nih.gov/oc/news
See Press Release 00-02, available at /toxchip.htm). Therefore, in toxicological screening using the toxic signature, it is important and desirable to include all expressed gene sequences.
【0206】
一実施例では、試験化合物内で核酸を含有する生物学的サンプルを処理するこ
とにより、試験化合物の毒性を算定する。処理生物学的サンプル中で発現された
を、本発明のポリヌクレオチドに特異的な1若しくは数個のプローブにハイブリ
ダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量
し得る。処理生物学的サンプルにおける転写レベルを非処理の生物学的サンプル
のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差は、処理サンプル中において
試験化合物により引き起こされる毒性反応を示す。In one example, the toxicity of a test compound is calculated by treating a biological sample containing nucleic acid within the test compound. The expressed in treated biological sample can be hybridized to one or several probes specific for a polynucleotide of the invention, thereby quantifying the transcription level corresponding to the polynucleotide of the invention. Transcript levels in treated biological samples are compared to levels in untreated biological samples. The difference in the transcription level of both samples is indicative of the toxic response caused by the test compound in the treated samples.
【0207】
マイクロアレイは、当分野でよく知られている方法を用いて調製し、使用し、
そして分析する(Brennan, T.M. ら (1995) の米国特許第5,474,796号、Schena,
M. ら (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschweiler
らの (1995) PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.らの (1995) PCT出願第WO95/
35505号、Heller, R.A. ら (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155
、Heller, M.J. らの (1997) 米国特許第5,605,662号等を参照)。様々なタイプ
のマイクロアレイが公知であり、詳細については、DNA Microarrays: A Practic al Approach
, M. Schena, ed. (1999) Oxford University Press, Londonに記載
されている。該文献は、特別に引用することを以って本明細書の一部となす。Microarrays were prepared and used using methods well known in the art,
And analyze (Brennan, TM et al. (1995) U.S. Pat. No. 5,474,796, Schena,
M. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10614-10619, Baldeschweiler.
(1995) PCT application No. WO95 / 251116, Shalon, D. et al. (1995) PCT application No. WO95 /
35505, Heller, RA et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2150-2155.
, Heller, MJ et al. (1997) US Pat. No. 5,605,662). Various types of microarrays are known and are described in detail in DNA Microarrays: A Practical Approach , M. Schena, ed. (1999) Oxford University Press, London. The document is incorporated herein by reference in its entirety.
【0208】
本発明の別の実施例では、天然のゲノム配列をマッピングする際に有効なハイ
ブリダイゼーションプローブを産出するため、LIMDをコードする核酸配列を用い
ることが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることが
でき、或る例では、コード配列全体で非コード配列が好ましい。例えば、多重遺
伝子ファミリーのメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中
に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配列
は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工形成の染色体、例えば、ヒト人
工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC)、細菌P1産
物、或いは単一染色体cDNAライブラリに対してマッピングされる(Harrington,
J.J. ら (1997) Nat Genet. 15:345-355、Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:12
7-134、Trask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154等を参照)。一度マッピ
ングされた本発明の核酸配列は、例えば病状の遺伝を特定の染色体領域の遺伝ま
たは制限断片長多型(RFLP)と相関させるような遺伝子連鎖地図を発生させるの
に用い得る。In another embodiment of the invention, a nucleic acid sequence encoding LIMD can be used to yield a hybridization probe that is effective in mapping the native genomic sequence. Either coding or non-coding sequences can be used, and in some instances non-coding sequences are preferred over coding sequences. For example, conservation of coding sequences within members of a multigene family can result in unwanted cross-hybridization during chromosome mapping. The nucleic acid sequence may be a specific chromosome, a specific region of a chromosome or an artificially formed chromosome, for example, human artificial chromosome (HAC), yeast artificial chromosome (YAC), bacterial artificial chromosome (BAC), bacterial P1 product, or single chromosome cDNA. Maps to the library (Harrington,
JJ et al. (1997) Nat Genet. 15: 345-355, Price, CM (1993) Blood Rev. 7:12.
7-134, Trask, BJ (1991) Trends Genet. 7: 149-154 etc.). Once mapped, the nucleic acid sequences of the present invention can be used, for example, to generate a genetic linkage map that correlates the inheritance of a pathology with the inheritance of a particular chromosomal region or restriction fragment length polymorphism (RFLP).
【0209】
蛍光原位置ハイブリッド形成法(FISH)は、他の物理的及び遺伝地図データと
相関し得る(前出のHeinz-Ulrich, ら (1995) in Meyers, pp. 965-968.等を参
照)。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inher
itance in Man(OMIM)のウェブサイトに見ることができる。物理的染色体地図
上のLIMDをコードする遺伝子の位置と特定の疾患との相関性或いは特定の疾患に
対する素因は、その疾患に関係するDNAの領域を画定するのに役立ち得るもので
あり、従って更に位置クローニングする試みとなり得る。Fluorescence in situ hybridization (FISH) can be correlated with other physical and genetic map data (see Heinz-Ulrich, et al. (1995) in Meyers, pp. 965-968., Supra). ). Examples of genetic map data are available in various scientific journals or the Online Mendelian Inher
It can be found on the itance in Man (OMIM) website. The correlation between the position of the gene encoding LIMD on the physical chromosomal map and the predisposition to a particular disease may serve to define the region of DNA associated with that disease, and thus It can be an attempt to position clone.
【0210】
確証された染色体マーカーを用いた結合分析等の物理的マッピング技術及び染
色体標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる
。例えばマウスなど別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置することにより、特
定のヒト染色体の数或いはアームが分かっていない場合でも関連するマーカーを
明らかにし得る。この情報は、位置クローニングその他の遺伝子発見技術を用い
て遺伝的疾患を調査する研究者にとって価値がある。疾患または症候群が、血管
拡張性失調症の11q22-23領域等、特定の遺伝子領域への遺伝的結合によって大ま
かに位置決めがなされると、該領域に対するいかなるマッピングも、更なる調査
のための関連遺伝子或いは調節遺伝子を表すことができる(Gatti, R.A.ら (198
8) Nature 336:577-580等を参照)。転座、反転等に起因する、健常者、保有者
、感染者の三者間における染色体位置の相違を発見するために、本発明のヌクレ
オチド配列を用いてもよい。[0210] Physical mapping techniques such as binding analysis using validated chromosomal markers and chromosomal specimen in situ hybridization can be used to extend the genetic map. Placing a gene on the chromosome of another mammal, such as a mouse, may reveal related markers even when the number or arm of a particular human chromosome is unknown. This information is valuable to researchers investigating genetic disorders using positional cloning and other gene discovery techniques. Once the disease or syndrome is loosely located by genetic linkage to a particular gene region, such as the 11q22-23 region of ataxia telangiectasia, any mapping to that region will result in relevant genes for further investigation. Alternatively, it can represent a regulatory gene (Gatti, RA et al. (198
8) Nature 336: 577-580, etc.). The nucleotide sequences of the present invention may be used for discovering differences in chromosomal position among healthy persons, carriers, and infected persons due to translocation, inversion, and the like.
【0211】
本発明の別の実施例では、種々の薬剤スクリーニング技術を以って化合物のラ
イブラリをスクリーニングするために、LIMD、LIMDの触媒作用断片、免疫原断片
、またはそのオリゴペプチドを用いることができる。薬剤スクリーニングに用い
る断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に
保持されるか、細胞内に位置することになろう。LIMDとテストされる薬剤との結
合複合の形成は計測できる。In another embodiment of the invention, the use of LIMD, a catalytic fragment of LIMD, an immunogenic fragment, or an oligopeptide thereof to screen a library of compounds using various drug screening techniques. it can. The fragments used for drug screening may be free in solution, immobilized on a solid support, retained on the cell surface, or located intracellularly. The formation of a binding complex between LIMD and the drug under test is measurable.
【0212】
別の薬剤スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性
を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる(Geysen
,らの (1984) PCT出願第WO84/03564号等を参照)。この方法においては、多数の
異なる小さな試験用化合物を固体基質上で合成する。試験用化合物は、LIMD或い
はその断片と反応させ、洗浄する。次に、当分野でよく知られている方法で、結
合したLIMDを検出する。精製したLIMDはまた、上記した薬剤のスクリーニング技
術において用いるプレート上で直接コーティングすることもできる。別の実施例
では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定する
こともできる。Another drug screening method is used for high throughput screening of compounds with suitable binding affinity for the protein of interest (Geysen
, Et al. (1984) PCT application No. WO84 / 03564, etc.). In this method, a large number of different small test compounds are synthesized on a solid substrate. The test compound is reacted with LIMD or a fragment thereof and washed. The bound LIMD is then detected by methods well known in the art. Purified LIMD can also be coated directly on the plates used in the drug screening techniques described above. In another example, non-neutralizing antibodies can be used to capture the peptide and immobilize it on a solid support.
【0213】
別の実施例では、競合薬スクリーニングアッセイを用いることができる。この
アッセイでは、LIMDを結合することができる中和抗体が、LIMDを結合するための
試験化合物と特異的に競合する。この方法では、抗体が、1若しくは数個の抗原
決定因子をLIMDと共有するペプチドの存在を検出する。In another example, a competitive drug screening assay can be used. In this assay, a neutralizing antibody capable of binding LIMD specifically competes with a test compound for binding LIMD. In this method, the antibody detects the presence of peptides that share one or several antigenic determinants with LIMD.
【0214】
別の実施例では、新規技術が現在知られているヌクレオチド配列の特性(限定
するものではないがトリプレット遺伝暗号及び特異的塩基対の相互作用等を含む
)に依存するのであれば、依然として発展すべきいかなる分子生物学技術におい
ても、LIMDをコードするヌクレオチド配列を用いることができる。In another embodiment, if the new technology relies on currently known nucleotide sequence characteristics, including, but not limited to, the triplet genetic code and specific base pair interactions, The nucleotide sequence encoding LIMD can be used in any molecular biology technique that is still to be developed.
【0215】
更に詳細に説明せずとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限
に利用できるであろう。従って、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的に
すぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。Without further elaboration, one of ordinary skill in the art will be able to take full advantage of the present invention from the foregoing description. Therefore, the examples described below are for illustrative purposes only and are not intended to limit the invention in any way.
【0216】
本明細書において開示した全ての特許、特許出願及び刊行物、特に米国特許第
60/143,426号は、言及することをもって本明細書の一部となす。All patents, patent applications and publications disclosed herein, especially US Pat.
No. 60 / 143,426 is hereby incorporated by reference.
【0217】
(実施例)
1 cDNAライブラリの作製
RNAは、表4に列記した組織から単離した。CONFNOT02 cDNAライブラリを作製
するため、凍結組織をホモジナイズし、ポリトロンPT-3000ホモジナイザー(Bri
nkman Instruments, Westbury NY)を用いてフェノール及びグアニジニウムイソ
チオシアネートの単相溶液であるTRIZOL試薬(組織1gm/TRIZOL試薬10ml;Li
fe Technologies)に溶解した。氷上で短くインキュベートした後で、クロロホ
ルムを添加し(1:5v/v)、混合液を遠心分離して相を分離した。上部水性相
を新しいチューブに除去し、イソプロパノールを添加してRNAを沈殿させた。RNA
は、RNアーゼ遊離水中に再懸濁し、DNアーゼで処理した。酸性フェノール−クロ
ロホルムで必要なだけRNAを再抽出して純度を高め、酢酸ナトリウム及びエタノ
ールでRNAを再沈殿した。凍結組織をホモジナイズし、TRIZOL試薬(組織0.8gm
/TRIZOL12ml)中で溶解し、RNAをDNアーゼで処理しなかった以外は同一の方
法でUTRSTMR01 cDNAライブラリの作製を行った。Example 1 Preparation of cDNA Library RNA was isolated from the tissues listed in Table 4. To produce the CONFNOT02 cDNA library, homogenize frozen tissues and use a Polytron PT-3000 homogenizer (Bri
TRIZOL reagent (1 gm tissue / 10 ml TRIZOL reagent), which is a single phase solution of phenol and guanidinium isothiocyanate using nkman Instruments, Westbury NY).
fe Technologies). After brief incubation on ice, chloroform was added (1: 5 v / v) and the mixture was centrifuged to separate the phases. The upper aqueous phase was removed to a new tube and isopropanol was added to precipitate the RNA. RNA
Were resuspended in RNase free water and treated with DNase. RNA was re-extracted with acidic phenol-chloroform to increase the purity as needed, and RNA was re-precipitated with sodium acetate and ethanol. Frozen tissue was homogenized and TRIZOL reagent (tissue 0.8 gm
/ TRIZOL 12 ml) and the UTRSTMR01 cDNA library was prepared by the same method except that RNA was not treated with DNase.
【0218】
各ライブラリに対して、オリゴd(T)連結常磁性粒子(Promega)、OLIGOTEXラ
テックス粒子(QIAGEN, Chatsworth CA)またはOLIGOTEX mRNA精製キット(QIAG
EN)を用いて、ポリ(A+) RNAを単離した。或いは、別のRNA単離キット、例えばP
OLY(A)PURE mRNA精製キット(Ambion, Austin TX)を用いて組織溶解物からRNA
を直接単離した。For each library, oligo d (T) -linked paramagnetic particles (Promega), OLIGOTEX latex particles (QIAGEN, Chatsworth CA) or OLIGOTEX mRNA purification kit (QIAG
EN) was used to isolate poly (A +) RNA. Alternatively, another RNA isolation kit, such as P
RNA from tissue lysates using OLY (A) PURE mRNA purification kit (Ambion, Austin TX)
Was isolated directly.
【0219】
場合によってはStratagene社にRNAを提供し、対応するcDNAライブラリを同社
が作製することもあった。そうでない場合は、当分野で公知の推奨方法または類
似の方法を用いて、UNIZAPベクターシステム(Stratagene)またはSUPERSCRIPT
プラスミドシステム(Life Technologies)を用いてcDNAを合成し、cDNAライブ
ラリを作製した。(前出のAusubel, 1997, unit 5.1-6.6等を参照。)逆転写は
、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオ
チドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素でcDNAを消化した
。殆どのライブラリに対して、cDNAのサイズ(300〜1000bp)選択は、SE
PHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィ
ー(Amersham Pharmacia Biotech)、或いは調製用アガロースゲル電気泳動法を
用いて行った。cDNAは、好適なプラスミドのポリリンカーの適合性制限酵素部位
に連結反応させた。好適なプラスミドは、例えばPBLUESCRIPTプラスミド(Strat
agene)、pSPORT1プラスミド(Life Technologies)またはplNCY(Incyte Pharm
aceuticals, Palo Alto CA)等である。組換えプラスミドは、Stratagene社のXL
1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、或いはLife Technologies社のDH5α、DH10Bま
たはELECTROMAX DH10Bを含むコンピテント大腸菌細胞に形質転換した。[0219] In some cases, RNA was provided to Stratagene and the corresponding cDNA library was produced by the same. If not, use UNIZAP vector system (Stratagene) or SUPERSCRIPT using recommended methods or similar methods known in the art.
CDNA was synthesized using a plasmid system (Life Technologies) to prepare a cDNA library. (See Ausubel, 1997, unit 5.1-6.6, etc., supra.) Reverse transcription was initiated with oligo d (T) or random primers. The synthetic oligonucleotide adapter was ligated to the double-stranded cDNA, and the cDNA was digested with a suitable restriction enzyme. For most libraries, the cDNA size (300-1000 bp) selection is SE
PHACRYL S1000, SEPHAROSE CL2B or SEPHAROSE CL4B column chromatography (Amersham Pharmacia Biotech) or preparative agarose gel electrophoresis was used. The cDNA was ligated to the compatible restriction enzyme sites of the polylinker of the appropriate plasmid. Suitable plasmids include, for example, the PBLUESCRIPT plasmid (Strat
agene), pSPORT1 plasmid (Life Technologies) or plNCY (Incyte Pharm)
aceuticals, Palo Alto CA) etc. The recombinant plasmid is XL from Stratagene.
The cells were transformed into competent E. coli cells containing 1-Blue, XL1-BIueMRF or SOLR, or Life Technologies DH5α, DH10B or ELECTROMAX DH10B.
【0220】
2 cDNAクローンの単離
実施例1で説明したようにして得たプラスミドは、UNIZAPベクターシステム(
Stratagene)を用いたin vivo切除によって、或いは細胞溶解によって宿主細胞
から回収した。MagicまたはWIZARDミニプレップDNA精製システム(Promega)、A
GTCミニプレップ精製キット(Edge Biosystems, Gaithersburg MD)、QIAGEN社
のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus Plasmid及びQIAWELL 8 Ultra Plasmid
精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミドキットの中から少なくとも1つを用
いて、プラスミドを精製した。沈殿させた後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、
凍結乾燥して或いは凍結乾燥せずに、4℃で保管した。 2 Isolation of cDNA Clone The plasmid obtained as described in Example 1 was UNIZAP vector system (
Harvested from host cells by in vivo excision with Stratagene) or by cell lysis. Magic or WIZARD miniprep DNA purification system (Promega), A
GTC miniprep purification kit (Edge Biosystems, Gaithersburg MD), QIAGEN's QIAWELL 8 Plasmid, QIAWELL 8 Plus Plasmid and QIAWELL 8 Ultra Plasmid
Plasmids were purified using at least one of the purification systems, the REAL Prep 96 plasmid kit. After settling, resuspending in 0.1 ml distilled water,
Stored at 4 ° C with or without lyophilization.
【0221】
別の実施例では、高処理フォーマットにおいて直接結合PCR法を用いて宿主細
胞溶解物からプラスミドDNAを増幅した(Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216
:1-14)。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行っ
た。サンプルを処理し、それを384穴プレート内で保管し、増幅したプラスミ
ドDNAの濃度をPICOGREEN色素(Molecular Probes, Eugene OR)及びFluoroskan
II蛍光スキャナ(Labsystems Oy, Helsinki, Finland)を用いて蛍光分析的に定
量した。In another example, plasmid DNA was amplified from host cell lysates using a direct ligation PCR method in a high throughput format (Rao, VB (1994) Anal. Biochem. 216).
: 1-14). Host cell lysis and thermal cycling processes were performed in a single reaction mixture. Samples were processed and stored in 384-well plates and the concentration of amplified plasmid DNA was adjusted to PICOGREEN dye (Molecular Probes, Eugene OR) and Fluoroskan.
Fluorimetric quantification using a II fluorescence scanner (Labsystems Oy, Helsinki, Finland).
【0222】
3 シークエンシング及び分析
実施例2で説明したようにして回収したIncyte cDNAは、以下のように配列決
定した。cDNAのシークエンス反応は、標準的方法或いは高処理装置、例えばABI
CATALYST 800 サーマルサイクラー(PE Biosystems)またはPTC-200 サーマルサ
イクラー(MJ Research)をHYDRAマイクロディスペンサー(Robbins Scientific
)またはMICROLAB 2200(Hamilton)液体転移システムと併用して処理した。cDN
Aのシークエンス反応は、Amersham Pharmacia Biotech社が提供する試薬またはA
BIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequen
cing ready reaction kit(PE Biosystems)に与えられた試薬を用いて準備した
。cDNAのシークエンス反応の電気泳動的分離及び標識したポリヌクレオチドの検
出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム(Molecular Dynamics)
か、標準ABIプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるABI PRISM 373
または377シークエンシングシステム(PE Biosystems)か、或いはその他の当分
野でよく知られている配列解析システムを用いた。cDNA配列内のリーディングフ
レームは、標準的方法(前出のAusubel, 1997, unit 7.7に概説)を用いて決定
した。幾つかのcDNA配列を選択して、実施例6で開示した方法を用いて配列を伸
長させた。 3 Sequencing and Analysis The Incyte cDNA recovered as described in Example 2 was sequenced as follows. The cDNA sequencing reaction can be performed using standard methods or high throughput equipment such as ABI.
CATALYST 800 Thermal Cycler (PE Biosystems) or PTC-200 Thermal Cycler (MJ Research) with HYDRA Microdispenser (Robbins Scientific)
) Or MICROLAB 2200 (Hamilton) liquid transfer system. cDN
A sequencing reaction is performed using reagents provided by Amersham Pharmacia Biotech or A
BI sequencing kit, eg ABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequen
Prepared using the reagents provided in the cing ready reaction kit (PE Biosystems). MEGABACE 1000 DNA Sequencing System (Molecular Dynamics) for electrophoretic separation of cDNA sequencing reactions and detection of labeled polynucleotides
Or ABI PRISM 373 using standard ABI protocol and base pair calling software
Alternatively, the 377 Sequencing System (PE Biosystems) or other sequence analysis system well known in the art was used. Reading frames within the cDNA sequences were determined using standard methods (outlined in Ausubel, 1997, unit 7.7, supra). Several cDNA sequences were selected and the sequences extended using the method disclosed in Example 6.
【0223】
cDNA配列に由来するポリヌクレオチド配列を構築し、当業者によく知られたア
ルゴリズムを利用するソフトウェアの組合せを用いて解析した。利用したツール
、プログラム及びアルゴリズムの概略、適用可能な説明、引用文献、閾値パラメ
ータを表5に示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表5の列1に
、それらの簡単な説明を列2に示す。列3は好適な引用文献であり、全ての文献
はそっくりそのまま引用を以って本明細書の一部となす。適用可能な場合には、
列4は2つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他
のパラメータを示す(スコアが高ければ高いほど2配列間の相同性が高くなる)
。配列の解析は、MACDNASIS PROソフトウェア(日立ソフトウェアエンジニアリ
ング, South San Francisco CA)及びLASERGENEソフトウェア(DNASTAR)を用い
て行った。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列アラインメントは、整列させ
た配列間の一致率をも計算するようなMEGALIGNマルチシーケンスアラインメント
プログラム(DNASTAR)に組み入れられた際に、clustalアルゴリズムにより特定
されたデフォルトパラメータを用いて生成した。Polynucleotide sequences derived from the cDNA sequences were constructed and analyzed using a combination of software utilizing algorithms well known to those skilled in the art. Table 5 shows the outline of tools, programs and algorithms used, applicable explanations, references, and threshold parameters. The tools, programs and algorithms used are shown in column 1 of table 5 and a brief description thereof in column 2. Column 3 is the preferred citation, and all references are incorporated by reference in their entirety. Where applicable,
Column 4 shows the score, probability value and other parameters used to evaluate the strength of the match between the two sequences (the higher the score, the higher the homology between the two sequences).
. Sequence analysis was performed using MACDNASIS PRO software (Hitachi Software Engineering, South San Francisco CA) and LASERGENE software (DNASTAR). Polynucleotide and polypeptide sequence alignments are generated using the default parameters specified by the clustal algorithm when incorporated into the MEGALIGN multi-sequence alignment program (DNASTAR), which also calculates the percent match between aligned sequences. did.
【0224】
ポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリA配列を除去すること
により、またあいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確認した。そ
の際、BLAST、動的プログラミング、及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づく
アルゴリズム及びプログラムを用いた。次に、BLAST、FASTA及びBLIMPSに基づく
プログラムを用いて、プログラム中の注釈を得るべく、公共のデータベース、例
えばGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベ
ースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びPFAMの選択に対する配列を問い合わ
せした。配列はPhred、Phrap及びConsedに基づくプログラムを用いて完全長のポ
リヌクレオチド配列に構築し、GenMark、BLAST及びFASTAに基づくプログラムを
用いてオープンリーディングフレームに対してスクリーニングした。対応する完
全長アミノ酸配列を誘導するべく完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳し、その後
、GenBankデータベース(上記)、SwissProt、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及
びProsite等のデータベース、PFAM等のHidden Markov Model(HMM)ベースのタ
ンパク質ファミリーデータベースに対する問合せによって完全長配列を分析した
。HMMは、遺伝子ファミリーのコンセンサス1次構造を解析する確率的アプロー
チである(Eddy, S.R. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6:361-365等を参照
)。The polynucleotide sequences were validated by removing the vector, linker and polyA sequences and by masking ambiguous base pairs. In doing so, algorithms and programs based on BLAST, dynamic programming, and flanking dinucleotide frequency analysis were used. Then, using BLAST, FASTA and BLIMPS based programs, to obtain annotations in the programs, public databases such as GenBank primates and rodents, mammals, vertebrates, eukaryotic databases, and The array for the choice of BLOCKS, PRINTS, DOMO, PRODOM and PFAM was queried. The sequences were assembled into full-length polynucleotide sequences using programs based on Phred, Phrap and Consed and screened against open reading frames using programs based on GenMark, BLAST and FASTA. The full-length polynucleotide sequence is translated to derive the corresponding full-length amino acid sequence, and then the GenBank database (above), SwissProt, BLOCKS, PRINTS, DOMO, PRODOM and Prosite databases, PFAM and other Hidden Markov Model (HMM ) Full-length sequences were analyzed by querying the base protein family database. HMM is a probabilistic approach for analyzing the consensus primary structure of gene families (see Eddy, SR (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6: 361-365).
【0225】
完全長ポリヌクレオチド及びアミノ酸配列の構築及び分析に用いる上記のプロ
グラムは、配列番号3乃至4からのポリヌクレオチド配列の断片を同定するため
にも使用できる。ハイブリダイゼーション及び増幅に有用な約20〜約4000
のヌクレオチドの断片は、上記「発明」の項で説明した。The programs described above for the construction and analysis of full length polynucleotide and amino acid sequences can also be used to identify fragments of the polynucleotide sequence from SEQ ID NOs: 3-4. About 20 to about 4000 useful for hybridization and amplification
The nucleotide fragment of the above was described in the above "Invention" section.
【0226】
4 ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、転写された遺伝情報の存在を検出するために用いられる実験
技術であり、標識されたヌクレオチド配列の、特定の細胞種または組織からのRN
Aが結合される膜へのハイブリダイゼーションに関与している。(前出のSambroo
k, 7章、同Ausubel. F.M. ら, 4章及び16章等を参照。)
BLASTに適用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenBankやLifeSeq(Incyt
e Pharmaceuticals)等のヌクレオチドデータベースにおいて同一または関連分
子を検索する。ノーザン分析は、多数の膜系ハイブリダイゼーションよりも断然
速い。更に、特定の同一を厳密な或いは相同的なものとして分類するか否かを決
定するため、コンピュータ検索の感度を変更することができる。検索の基準はプ
ロダクトスコアであり、次式で定義される。 4 Analysis of Polynucleotide Expression Northern analysis is an experimental technique used to detect the presence of transcribed genetic information, in which the labeled nucleotide sequences of RNs from a particular cell type or tissue are analyzed.
It is involved in hybridization to the membrane to which A is bound. (Sambroo mentioned above
k, Chapter 7, and Ausubel. FM et al., Chapters 4 and 16, etc. ) Using similar computer technology applied to BLAST, GenBank and LifeSeq (Incyt
searching for identical or related molecules in nucleotide databases such as e Pharmaceuticals). Northern analysis is by far faster than many membrane-based hybridizations. In addition, the sensitivity of computer searches can be modified to determine whether or not a particular identity should be classified as exact or homologous. The search criterion is the product score, which is defined by the following formula.
【0227】[0227]
【数1】 (BLASTスコア×配列一致率) [Equation 1] (BLAST score x sequence matching rate)
【0228】
プロダクトスコアは、2つの配列間の類似度及び配列が一致する長さの両者を考
慮している。プロダクトスコアは、0〜100の規準化された値であり、次のよ
うにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を2
つの配列の短い方の長さの5倍で除する。高スコアリングセグメント対(HSP)
に一致する各塩基に+5のスコアを割り当て、各不適性塩基対に−4を割り当て
ることにより、BLASTスコアを計算する。2つの配列は、2以上のHSPを共有し得
る(ギャップにより離隔され得る)。2以上のHSPがある場合には、最高BLASTス
コアの塩基対を用いてプロダクトスコアを計算する。プロダクトスコアは、断片
的重畳とBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えばプロダクトスコ
ア100は、比較した2つの配列の短い方の長さ全体にわたって100%一致す
る場合のみ得られる。プロダクトスコア70は、一端が100%一致し、70%
重畳しているか、他端が88%一致し、100%重畳しているかのいずれかの場
合に得られる。プロダクトスコア50は、一端が100%一致し、50%重畳し
ているか、他端が79%一致し、100%重畳しているかのいずれかの場合に得
られる。The product score takes into account both the degree of similarity between the two sequences and the length with which the sequences match. The product score is a normalized value of 0 to 100 and is obtained as follows. Multiply the BLAST score by the sequence identity of the nucleotides and multiply the product by 2
Divide by 5 times the length of the shorter of the two sequences. High Scoring Segment Pair (HSP)
The BLAST score is calculated by assigning a score of +5 to each base that matches and a −4 to each mismatch. The two sequences may share more than one HSP (which may be separated by a gap). If there is more than one HSP, calculate the product score using the base pair with the highest BLAST score. The product score represents the balance between fragmentary convolution and quality of BLAST alignment. For example, a product score of 100 is only obtained if there is 100% match over the shorter length of the two sequences compared. The product score 70 has a 100% match at one end and 70%
It is obtained in either case of overlapping, or the other ends are 88% coincident and 100% overlapped. The product score 50 is obtained when either one end is 100% coincident and has 50% overlap, or the other end is 79% coincident and has 100% overlap.
【0229】
ノーザン分析の結果は、LIMDをコードする転写物が作出されたライブラリの分
布パーセンテージとして報告される。分析は、器官/組織及び疾患によるcDNAラ
イブラリのカテゴリー分類に関与している。器官/組織のカテゴリーには、心血
管、皮膚、発生、内分泌、胃腸、造血/免疫、筋骨格、神経、生殖及び泌尿器が
ある。疾患/病状のカテゴリーには、癌、炎症、外傷、細胞増殖、神経、貯留(
pooled)が含まれる。カテゴリー毎に目的の配列を発現するライブラリ数を数え
、それを全カテゴリーのライブラリ数で除した。組織特異発現及び疾患/病状特
異発現のパーセント値を表3に示す。The results of the Northern analysis are reported as the distribution percentage of the library in which the transcript encoding LIMD was produced. The analysis is involved in the categorization of cDNA libraries by organ / tissue and disease. Organ / tissue categories include cardiovascular, skin, development, endocrine, gastrointestinal, hematopoietic / immune, musculoskeletal, neural, reproductive and urological. Disease / condition categories include cancer, inflammation, trauma, cell proliferation, nerves, retention (
pooled) is included. The number of libraries expressing the target sequence was counted for each category and divided by the number of libraries in all categories. Percentages of tissue-specific and disease / condition-specific expression are shown in Table 3.
【0230】
5 ポリヌクレオチドをコードするLIMDの染色体マッピング
配列番号3及び配列番号4を配列するために用いたcDNA配列は、BLAST及びそ
の他のスミス‐ウォーターマンアルゴリズムのインプリメンテーションを用いて
、Incyte LIFESEQのデータベース及びパブリックドメインのデータベースから得
た配列と比較した。配列番号3及び配列番号4に適合するデータベースから得た
配列は、Phrap(表5)等のアセンブリアルゴリズムを用いて隣接する配列及び
オーバーラップする配列のクラスタに配列した。スタンフォード・ヒトゲノムセ
ンター(SHGC)、ホワイトヘッド・ゲノム研究所(WIGR)、Genethon等の公的な
情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、クラス
タ化された配列が予めマッピングされたかを測定した。マッピングされた配列が
クラスタに含まれている結果、個々の配列番号を含めてそのクラスタの全配列が
地図上の位置に割り当てられた。 5 Chromosome Mapping of LIMD Encoding Polynucleotides The cDNA sequences used to sequence SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 were prepared using the Incyte LIFESEQ algorithm using BLAST and other Smith-Waterman algorithm implementations. The sequences were compared to those obtained from databases and public domain databases. Sequences obtained from databases matching SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 were sequenced into clusters of flanking and overlapping sequences using an assembly algorithm such as Phrap (Table 5). Was the clustered sequence pre-mapped using radiation hybrid and genetic map data available from public sources such as the Stanford Human Genome Center (SHGC), Whitehead Genome Institute (WIGR) and Genethon? Was measured. As a result of including the mapped sequence in the cluster, the entire sequence of the cluster including the individual sequence number was assigned to the map position.
【0231】
配列番号3及び配列番号4の遺伝地図上の位置については、ヒト染色体の範囲
または間隔として「発明」の項に記載されている。センチモルガン間隔の地図上
の位置は、染色体のpアームの末端に関連して測定する。(センチモルガン(cM
)は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均すると、1
cMはヒト中のDNAの1メガベース(Mb)にほぼ等しい。尤も、この値は、組換え
のホットスポット及びコールドスポットに起因して広範囲に変化する。)cM距離
は、配列が各クラスタ内に含まれるような放射線ハイブリッドマーカーに対して
境界を提供するようなGenethonによってマッピングされた遺伝マーカーに基づく
。The positions on the genetic map of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 are described in the section "Invention" as the range or interval of the human chromosome. The map position of the centimorgan interval is measured relative to the end of the p-arm of the chromosome. (Centimorgan (cM
) Is a unit of measure based on the recombination frequency between chromosomal markers. On average 1
cM is approximately equal to 1 megabase (Mb) of DNA in humans. However, this value varies widely due to recombination hotspots and coldspots. ) CM distances are based on genetic markers mapped by Genethon to provide a boundary for radiation hybrid markers such that sequences are contained within each cluster.
【0232】
6 ポリヌクレオチドをコードするLIMDの伸長
配列番号3乃至4の完全長の核酸配列は、完全長分子の適切な断片から設計し
たオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該断片を伸長させて生成した。一方の
プライマーは既知の断片の5'伸長を開始するべく合成し、他方のプライマーは
既知の断片の3'伸長を開始するべく合成した。開始プライマーの設計は、長さ
が約22〜30ヌクレオチド、GC含有率が50%以上となり、約68〜72℃の
温度で標的配列にアニーリングするように、OLIGO 4.06ソフトウェア(National
Biosciences)或いは別の適切なプログラムを用いて、cDNAから設計した。ヘア
ピン構造及びプライマー-プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの伸長
は全て回避した。 6 LIMD Extensions Encoding Polynucleotides The full length nucleic acid sequences of SEQ ID NOs: 3-4 were generated by extending the fragments using oligonucleotide primers designed from the appropriate fragment of the full length molecule. One primer was synthesized to initiate 5'extension of the known fragment and the other primer was synthesized to initiate 3'extension of the known fragment. The design of the starting primer was about 22-30 nucleotides in length, had a GC content of 50% or more, and was designed to anneal to the target sequence at a temperature of about 68-72 ° C. with OLIGO 4.06 software (National
Biosciences) or another suitable program to design from cDNA. Hairpin structures and primer extension of the nucleotides that resulted in primer-primer dimers were all avoided.
【0233】
選択したヒトcDNAライブラリを用いて配列を伸長させた。2段階以上の伸長が
必要または望ましい場合には、付加的プライマー或いはプライマーのネステッド
セットを設計した。Sequences were extended with selected human cDNA libraries. Additional primers or nested sets of primers were designed when more than one extension was required or desired.
【0234】
当業者によく知られている方法を利用したPCR法によって、高忠実度の増幅が
得られた。PCRは、PTC-200 サーマルサイクラー(MJ Research, Inc.)を用いて
96穴プレート内で行った。反応混合液には、DNA鋳型、各プライマー200nmo
lと、Mg2+、(NH4)2SO4 及びβ-メルカプトエタノールを含む反応緩衝液と、Taq
DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)と、ELONGASE酵素(Life Tech
nologies)と、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)が含まれていた。プライマ
ー対PCI A、PCI Bに対して用いたパラメータは次の通りである。
ステップ1: 94℃で3分間
ステップ2: 94℃で15秒
ステップ3: 60℃で1分間
ステップ4: 68℃で2分間
ステップ5: ステップ2、3、4を20回繰り返す
ステップ6: 68℃で5分間
ステップ7: 4℃で保存
プライマー対T7、SK+に対しては、上記パラメータに代えて以下のパラメータを
用いた。
ステップ1: 94℃で3分間
ステップ2: 94℃で15秒
ステップ3: 57℃で1分間
ステップ4: 68℃で2分間
ステップ5: ステップ2、3、4を20回繰り返す
ステップ6: 68℃で5分間
ステップ7: 4℃で保存
1X TEに溶解したPICOGREEN定量試薬(0.25%(v/v) PICOGREEN、Molecular
Probes, Eugene OR)100μlと、希釈していないPCR産物0.5μlとを不透明
な蛍光光度計プレート(Coming Costar, Acton MA)の各穴に分配し、DNAを試薬
と結合可能なようにさせることによって各穴内のDNA濃度の測定を行った。サン
プルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量するべくプレートをFluoroskan II (Lab
systems Oy, Helsinki, Finland)でスキャンした。反応混合物のアリコート5
〜10μlを1%アガロースミニゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応
が配列の伸長に成功したかを決定した。High fidelity amplification was obtained by PCR using methods well known to those of skill in the art. PCR was performed in a 96-well plate using a PTC-200 thermal cycler (MJ Research, Inc.). The reaction mixture contains DNA template and 200 nm of each primer.
l, a reaction buffer containing Mg 2+ , (NH 4 ) 2 SO 4 and β-mercaptoethanol, and Taq
DNA polymerase (Amersham Pharmacia Biotech) and ELONGASE enzyme (Life Tech
nologies) and Pfu DNA polymerase (Stratagene). The parameters used for the primer pair PCI A and PCI B are as follows. Step 1: 94 ° C. for 3 minutes Step 2: 94 ° C. for 15 seconds Step 3: 60 ° C. for 1 minute Step 4: 68 ° C. for 2 minutes Step 5: Steps 2, 3, and 4 are repeated 20 times Step 6: 68 ° C. 5 minutes Step 7: Stored at 4 ° C. For the primer pair T7, SK +, the following parameters were used instead of the above parameters. Step 1: 94 ° C. for 3 minutes Step 2: 94 ° C. for 15 seconds Step 3: 57 ° C. for 1 minute Step 4: 68 ° C. for 2 minutes Step 5: Steps 2, 3, 4 repeated 20 times Step 6: 68 ° C. Step 5: Store at 4 ℃ for 5 minutes. PICOGREEN quantitative reagent dissolved in 1X TE (0.25% (v / v) PICOGREEN, Molecular
100 μl of Probes, Eugene OR) and 0.5 μl of undiluted PCR product are distributed into each well of an opaque fluorometer plate (Coming Costar, Acton MA) to allow the DNA to bind to the reagents. The DNA concentration in each well was measured by. Fluoroskan II (Lab
systems Oy, Helsinki, Finland). Aliquot 5 of reaction mixture
-10 μl were analyzed by electrophoresis on a 1% agarose minigel to determine which reaction was successful in extending the sequence.
【0235】
伸長させたヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して384穴プレートに移し、CviJ
Iコレラウイルスエンドヌクレアーゼ(Molecular Biology Research, Madison W
I)を用いて消化し、pUC 18ベクター(Amersham Pharmacia Biotech)への再連
結反応前に音波処理またはせん断した。ショットガン・シークエンシングのため
に、消化したヌクレオチドを低濃度(0.6〜0.8%)のアガロースゲル上で分
離し、断片を切除し、寒天をAgar ACE(Promega)で消化した。伸長させたクロ
ーンをT4リガーゼ(New England Biolabs, Beverly MA)を用いてpUC 18ベクタ
ー(Amersham Pharmacia Biotech)に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratag
ene)で処理して制限部位のオーバーハングを満たし、コンピテント大腸菌細胞
に形質移入した。形質移入した細胞を抗生物質含有培地上で選択し、個々のコロ
ニーを選択してLB/2x carb液体培地の384穴プレート内において37℃で一晩
培養した。The extended nucleotides were desalted and concentrated, transferred to 384-well plates, and CviJ
Cholera virus endonuclease (Molecular Biology Research, Madison W
Digested with I) and sonicated or sheared prior to religation reaction into pUC 18 vector (Amersham Pharmacia Biotech). For shotgun sequencing, the digested nucleotides were separated on a low concentration (0.6-0.8%) agarose gel, the fragments excised and the agar digested with Agar ACE (Promega). The extended clones were religated into pUC 18 vector (Amersham Pharmacia Biotech) using T4 ligase (New England Biolabs, Beverly MA) and Pfu DNA polymerase (Stratag).
ene) to fill the restriction site overhang and transfect competent E. coli cells. Transfected cells were selected on antibiotic containing medium and individual colonies were selected and grown overnight at 37 ° C in 384 well plates in LB / 2x carb liquid medium.
【0236】
細胞を溶解し、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)及びPfu
DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いてPCRによってDNAを増幅した。その際用
いたパラメータは次の通りである。
ステップ1: 94℃で3分間
ステップ2: 94℃で15秒
ステップ3: 60℃で1分間
ステップ4: 72℃で2分間
ステップ5: ステップ2、3、4を29回繰り返す
ステップ6: 72℃で5分間
ステップ7: 4℃で保存
DNAは、上記のPICOGREEN試薬(Molecular Probes)によって定量した。DNAの回
収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは20
%ジメチルスルホキシド(1:2, v/v)で希釈し、DYENAMIC energy transfer
sequencing primer及びDYENAMIC DIRECT kit(Amersham Pharmacia Biotech)ま
たはABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit(PE
Biosystems)を用いてシークエンシングした。Cells are lysed, Taq DNA polymerase (Amersham Pharmacia Biotech) and Pfu
DNA was amplified by PCR using DNA polymerase (Stratagene). The parameters used at that time are as follows. Step 1: 94 ° C. for 3 minutes Step 2: 94 ° C. for 15 seconds Step 3: 60 ° C. for 1 minute Step 4: 72 ° C. for 2 minutes Step 5: Steps 2, 3 and 4 are repeated 29 times Step 6: 72 ° C. 5 minutes Step 7: DNA stored at 4 ° C. was quantified by the PICOGREEN reagent (Molecular Probes) described above. Samples with low DNA recovery were reamplified using the same conditions as above. 20 samples
Dilute with% dimethylsulfoxide (1: 2, v / v) and use DYENAMIC energy transfer
sequencing primer and DYENAMIC DIRECT kit (Amersham Pharmacia Biotech) or ABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit (PE
Biosystems) was used for sequencing.
【0237】
同様に、伸長のために設計されたオリゴヌクレオチド及び適切なゲノムライブ
ラリと共に上記手順を用いて5'調節配列を得るために、配列番号3乃至4のヌ
クレオチド配列が用いられる。Similarly, the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3-4 are used to obtain 5 ′ regulatory sequences using the above procedure with oligonucleotides designed for extension and an appropriate genomic library.
【0238】
7 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用
配列番号3乃至4由来のハイブリダイゼーションプローブを利用して、cDNA、
ゲノムDNAまたはmRNAをスクリーニングする。約20塩基対からなるオリゴヌク
レオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対して
も事実上同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06ソフトウ
ェア(National Biosciences)等の最新ソフトウェアを用いて設計し、50pmol
の各オリゴマーと、250μCiの[γ-32P]アデノシン3リン酸 (Amersham Phar
macia Biotech)と、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(DuPont NEN, Boston MA)と
を結合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G-2
5超細繊分子サイズ排除デキストランビードカラム(Amersham Pharmacia Biotec
h)を用いて実質的に精製する。Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba IまたはPv
u II(DuPont NEN)のいずれか1つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノ
ムDNAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分107カ
ウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。 7 Labeling and use of individual hybridization probes Utilizing the hybridization probes derived from SEQ ID NOS: 3 to 4, cDNA,
Screen genomic DNA or mRNA. Although the labeling of oligonucleotides consisting of about 20 base pairs is specifically described, virtually the same procedure is used for larger nucleotide fragments. Oligonucleotides were designed using the latest software such as OLIGO 4.06 software (National Biosciences) and 50 pmol
Each of the oligomers of [γ- 32 P] adenosine triphosphate (250 μCi) (Amersham Phar
macia Biotech) and T4 polynucleotide kinase (DuPont NEN, Boston MA) by binding. The labeled oligonucleotide is SEPHADEX G-2
5 Ultrafine molecular size exclusion dextran bead column (Amersham Pharmacia Biotec
Substantially purified using h). Ase I, Bgl II, Eco RI, Pst I, Xba I or Pv
In a typical membrane-based hybridization analysis of human genomic DNA digested with any one endonuclease of uII (DuPont NEN), an aliquot containing 10 7 counts of labeled probe per minute is used.
【0239】
各消化物から得たDNAは、0.7%アガロースゲル上で分画してナイロン膜(Ny
tran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH)に移す。ハイブリダイゼーショ
ンは、40℃で16時間行う。非特異的シグナルを除去するため、例えば0.1
×クエン酸ナトリウム食塩水及び0.5%ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条
件下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに
代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、
比較する。The DNA obtained from each digest was fractionated on a 0.7% agarose gel and subjected to nylon membrane (Ny.
tran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH). Hybridization is performed at 40 ° C. for 16 hours. To remove non-specific signals, eg 0.1
Blots are washed sequentially at room temperature under conditions consistent with sodium citrate saline and 0.5% sodium dodecyl sulfate. Visualize the hybridization pattern using autoradiography or alternative imaging means,
Compare.
【0240】
8 マイクロアレイ
マイクロアレイの表面上でアレイエレメントの連鎖または合成は、フォトリソ
グラフィ、圧電印刷(インクジェット印刷、前出のBaldeschweiler等を参照)、
機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成す
ることが可能である。上記各技術において基質は、均一且つ非多孔性の固体とす
るべきである(Schena (1999).前出)。推奨する基質には、シリコン、シリカ、
スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。或いは、ドットブロ
ット法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱的、紫外線的、
化学的または機械的結合手順を用いて基質の表面にエレメントを配置及び結合さ
せてもよい。通常のアレイは、手作業で、または利用可能な方法や機械を用いて
作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る(Schena, M. ら (1995) Scien
ce 270:467-470、Shalon. D. ら (1996) Genome Res. 6:639-645、Marshall, A.
and J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27-31.を参照)。 8 Microarrays Chaining or synthesis of array elements on the surface of microarrays may be performed by photolithography, piezoelectric printing (inkjet printing, see Baldeschweiler et al., Supra),
It can be achieved using mechanical microspotting techniques and their derivatives. In each of the above techniques, the substrate should be a solid, non-porous solid (Schena (1999). Supra). Recommended substrates include silicon, silica,
There are slide glasses, glass chips, and silicon wafers. Alternatively, an array similar to dot blotting or slot blotting can be used to
Elements may be placed and attached to the surface of the substrate using chemical or mechanical attachment procedures. Regular arrays can be produced manually or using available methods and machines and can have any suitable number of elements (Schena, M. et al. (1995) Scien.
ce 270: 467-470, Shalon. D. et al. (1996) Genome Res. 6: 639-645, Marshall, A.
and J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16: 27-31.).
【0241】
完全長cDNA、発現遺伝子配列断片(EST)、またはその断片またはオリゴマー
は、マイクロアレイのエレメントを構成し得る。ハイブリダイゼーションに好適
な断片またはオリゴマーを、LASERGENEソフトウェア(DNASTAR)等の当分野で公
知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメントは、生
物学的サンプル中でポリヌクレオチドを用いてハイブリダイズされる。生物学的
サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識またはその
他の分子タグに接合される。ハイブリダイゼーション後、生物学的サンプルから
ハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各ア
レイエレメントにおいてハイブリダイゼーションを検出する。或いは、レーザ脱
着及び質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。
マイクロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの相補
性の度合及び相対存在度は、算定し得る。一実施例におけるマイクロアレイの調
整及び使用について、以下に詳述する。The full-length cDNA, expressed gene sequence fragment (EST), or fragments or oligomers thereof, may constitute an element of a microarray. Fragments or oligomers suitable for hybridization can be selected using software known in the art such as LASERGENE software (DNASTAR). Array elements are hybridized with a polynucleotide in a biological sample. The polynucleotide in the biological sample is conjugated to a fluorescent label or other molecular tag to facilitate detection. After hybridization, unhybridized nucleotides are removed from the biological sample and hybridization is detected at each array element using a fluorescence scanner. Alternatively, laser desorption and mass spectrometry can also be used to detect hybridization.
The degree of complementarity and relative abundance of each polynucleotide that hybridizes to the elements on the microarray can be calculated. The preparation and use of the microarray in one embodiment is detailed below.
【0242】
組織または細胞サンプルの準備
グアニジウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全RNAを単離し、オ
リゴ(dT)セルロース法を用いてポリ(A)+RNAを精製する。各ポリ(A)+RNAサンプル
は、MMLV逆転写酵素、0.05 pg/μlのオリゴ(dT)プライマー(21mer)、1×
第1鎖緩衝液、0.03unit/μlのRNアーゼ阻害因子、500μMのdATP、500
μMのdGTP、500μMのdTTP、40μMのdCTP、40μMのdCTP-Cy3(BDS)また
はdCTP-Cy5(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて逆転写する。逆転写反応は
、GEMBRIGHTキット(Incyte)を用いてポリ(A)+RNA含有の25体積ml内で行う。特
異制御ポリ(A)+RNAは、370℃で2時間インキュベートした後、in vitro転写
により非コード酵母ゲノムDNAから合成する。各反応サンプル(1つはCy3、もう
1つはCy5標識)は、2.5mlの0.5M水酸化ナトリウムで処理し、850℃で2
0分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを分解する。サンプルは、2つ
の連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム(CLONTECH Laboratories, Inc
. (CLONTECH), Palo Alto CA)を用いて精製し、結合させた後に、1mlのグリコ
ーゲン(1mg/ml)、60mlの酢酸ナトリウム及び300mlの100%エタノー
ルを用いて両反応サンプルをエタノール沈殿させる。次に、SpeedVAC(Savant I
nstruments Inc., Holbrook NY)を用いてサンプルを乾燥して仕上げ、14μl
の5×SSC/0.2%SDS中で再懸濁する。Preparation of Tissue or Cell Samples Total RNA is isolated from tissue samples using the guanidinium thiocyanate method and poly (A) + RNA is purified using the oligo (dT) cellulose method. Each poly (A) + RNA sample contained MMLV reverse transcriptase, 0.05 pg / μl oligo (dT) primer (21mer), 1x
First strand buffer, 0.03 unit / μl RNase inhibitor, 500 μM dATP, 500
Reverse-transcribe using μM dGTP, 500 μM dTTP, 40 μM dCTP, 40 μM dCTP-Cy3 (BDS) or dCTP-Cy5 (Amersham Pharmacia Biotech). The reverse transcription reaction is carried out in 25 volume ml containing poly (A) + RNA using the GEMBRIGHT kit (Incyte). Specific control poly (A) + RNA is synthesized from non-coding yeast genomic DNA by in vitro transcription after incubation at 370 ° C. for 2 hours. Each reaction sample (one labeled with Cy3 and the other labeled with Cy5) was treated with 2.5 ml of 0.5 M sodium hydroxide and incubated at 850 ° C for 2 hours.
Incubate for 0 minutes to stop the reaction and degrade RNA. Samples were prepared from two consecutive CHROMA SPIN 30 gel filtration spin columns (CLONTECH Laboratories, Inc.
(CLONTECH), Palo Alto CA) and after conjugation both reaction samples are ethanol precipitated with 1 ml glycogen (1 mg / ml), 60 ml sodium acetate and 300 ml 100% ethanol. Next, SpeedVAC (Savant I
nstruments Inc., Holbrook NY) to dry and finish the sample, 14 μl
Resuspend in 5X SSC / 0.2% SDS.
【0243】
マイクロアレイの準備
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作成する。各アレイエレメントは
、クローン化cDNAインサートによりベクター含有細菌性細胞から増幅する。PCR
増幅は、cDNAインサートの側面に位置するベクター配列に相補的なプライマーを
用いる。30サイクルのPCRで1〜2ngの初期量から5μgより大きい最終量まで
アレイエレメントを増幅する。増幅したアレイエレメントは、SEPHACRYL-400(A
mersham Pharmacia Biotech)を用いて精製する。 Microarray Preparation The arrays of the invention are used to make array elements. Each array element is amplified from vector-containing bacterial cells with a cloned cDNA insert. PCR
Amplification uses primers complementary to the vector sequences flanking the cDNA insert. Array elements are amplified in 30 cycles of PCR from an initial amount of 1-2 ng to a final amount greater than 5 μg. The amplified array element is SEPHACRYL-400 (A
mersham Pharmacia Biotech).
【0244】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドガラス上に固定
する。処理中及び処理後に、大量の蒸留水洗液を用いて、0.1%のSDS及びアセ
トン中で、超音波により顕微鏡スライドガラス(Corning)を洗浄する。スライ
ドガラスは、4%フッ化水素酸(VWR Scientific Products Corporation (VWR),
West Chester PA)中でエッチングし、蒸留水中で広範囲にわたって洗浄し、9
5%エタノール中で0.05%アミノプロピルシラン(Sigma)を用いてコーティ
ングする。Purified array elements are immobilized on polymer-coated glass slides. During and after the treatment, a large amount of distilled water washing solution is used to ultrasonically wash the microscope slide glass (Corning) in 0.1% SDS and acetone. 4% hydrofluoric acid (VWR Scientific Products Corporation (VWR),
West Chester PA), washed extensively in distilled water,
Coat with 0.05% aminopropylsilane (Sigma) in 5% ethanol.
【0245】
米国特許第5,807,522号で説明されている方法を用いて、コーティングしたガ
ラス基板にアレイエレメントを付加する。該特許は、引用を以って本明細書の一
部となす。平均濃度が100ng/μlのアレイエレメントDNA1μlを高速ロボット
装置により開口キャピラリープリントエレメントに充填する。装置はここで、ス
ライド毎に約5nlのアレイエレメントサンプルをデポジットする。Array elements are added to a coated glass substrate using the method described in US Pat. No. 5,807,522. The patent is incorporated herein by reference. 1 μl of the array element DNA having an average concentration of 100 ng / μl is filled in the open capillary print element by a high speed robot device. The instrument now deposits approximately 5 nl of array element sample per slide.
【0246】
マイクロアレイには、STRATALINKER UV架橋剤(Stratagene)を用いてUV
架橋する。マイクロアレイは、室温において0.2%SDSで1度洗浄し、蒸留水で
3度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)(Tropix, Inc., Bedford MA)中の
0.2%カゼイン中において60℃で30分間マイクロアレイをインキュベート
した後、前に行ったように0.2%SDS及び蒸留水で洗浄することにより、非特異
結合部位をブロックする。For the microarray, use STRATALINKER UV crosslinking agent (Stratagene) for UV.
Crosslink. The microarray is washed once with 0.2% SDS at room temperature and three times with distilled water. After incubating the microarray in 0.2% casein in phosphate buffered saline (PBS) (Tropix, Inc., Bedford MA) for 30 minutes at 60 ° C., 0.2% SDS and Nonspecific binding sites are blocked by washing with distilled water.
【0247】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応には、5×SSC,0.2%SDSハイブリダイゼーショ
ン緩衝液中にCy3及びCy5標識したcDNA合成生成物を各0.2μg含む9μlのサン
プル混合液を用いる。サンプル混合液は、65℃まで5分間加熱し、マイクロア
レイ表面上で等分して1.8cm2 のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡スラ
イドより僅かに大きいキャビティを有する防水チェンバーに移行させる。チェン
バーのコーナーに140μlの5×SSCを加えることにより、チェンバー内部を湿
度100%に保持する。アレイを含むチェンバーは、60℃で約6.5時間イン
キュベートする。アレイは、第1洗浄緩衝液中(1×SSC,0.1%SDS)において
45℃で10分間洗浄し、第2洗浄緩衝液中(0.1×SSC)において45℃で1
0分間各々3度洗浄して乾燥させる。 Hybridization For the hybridization reaction, 9 μl of a sample mixture containing 0.2 μg each of the Cy3 and Cy5-labeled cDNA synthesis products in 5 × SSC, 0.2% SDS hybridization buffer is used. The sample mixture is heated to 65 ° C. for 5 minutes, aliquoted on the surface of the microarray and covered with a 1.8 cm 2 coverslip. The array is transferred to a waterproof chamber with a cavity slightly larger than the microscope slide. The interior of the chamber is kept at 100% humidity by adding 140 μl of 5 × SSC to the corners of the chamber. The chamber containing the array is incubated at 60 ° C. for approximately 6.5 hours. Arrays were washed in the first wash buffer (1 × SSC, 0.1% SDS) for 10 minutes at 45 ° C. and then in the second wash buffer (0.1 × SSC) at 45 ° C. for 1 min.
Wash 3 times for 0 minutes each and dry.
【0248】
検出
レポーター標識ハイブリダイゼーション複合体は、Cy3の励起のためには48
8nm、Cy3の励起のためには632nmでスペクトル線を生成し得るInnova 70混合
ガス10 Wレーザ(Coherent, Inc., Santa Clara CA)を備えた顕微鏡で検出する
。20×顕微鏡対物レンズ(Nikon, Inc., Melville NY)を用いて、アレイ上に
励起レーザ光を集中させる。アレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御
X-Yステージに置き、対物レンズを通過してラスタスキャンする。本実施例で用
いた1.8cm×1.8cmのアレイは、20μmの解像度でスキャンした。The detection reporter-labeled hybridization complex is 48 for excitation of Cy3.
Detection with a microscope equipped with an Innova 70 mixed gas 10 W laser (Coherent, Inc., Santa Clara CA) capable of producing spectral lines at 8 nm and 632 nm for excitation of Cy3. A 20 × microscope objective (Nikon, Inc., Melville NY) is used to focus the pump laser light on the array. Computer-controlled microscope with slide containing array
Place it on the XY stage and pass the objective lens for raster scanning. The 1.8 cm × 1.8 cm array used in this example was scanned at a resolution of 20 μm.
【0249】
2つの異なるスキャンのうち、混合ガスマルチラインレーザは2つの蛍光体を
連続的に励起する。放射された光は、2つの蛍光体に応じて波長に基づき2つの
光電子増倍管検出器(PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater
NJ)に分割される。アレイと光電子増倍管間に設置された好適なフィルタを用い
て、シグナルをフィルタリングする。用いる蛍光体の最大発光は、Cy3では56
5nm、Cy5では650nmである。装置は両蛍光体からのスペクトルを同時に記録
し得るが、レーザ源において好適なフィルタを用いて各アレイを通常2度スキャ
ンし、蛍光体1つにつき1度スキャンする。Of the two different scans, the mixed gas multi-line laser continuously excites two phosphors. The emitted light is based on the wavelength depending on the two phosphors and two photomultiplier tube detectors (PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater
NJ). The signal is filtered using a suitable filter placed between the array and the photomultiplier tube. The maximum emission of the phosphor used is 56 for Cy3.
It is 5 nm and 650 nm for Cy5. The device can record spectra from both phosphors simultaneously, but typically scans each array twice with a suitable filter in the laser source, once for each phosphor.
【0250】
スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合液に添加されたcDNA対照種が
発するシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的DNA配
列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度をハイブリダイジング種の重量比
1:100,000に相関させる。異なる源からの2つのサンプル(例えば代表的な試験
細胞及び制御細胞)であって各々異なる蛍光体で標識したものを単一のアレイに
ハイブリダイズし、他と異なって発現された遺伝子を同定する場合には、2つの
蛍光体を有する較正cDNAの標識サンプルを標識し、各々等量をハイブリダイゼー
ション混合液に加えて較正を行う。Scan sensitivity is typically calibrated using the signal intensity emitted by a cDNA control species added to a sample mixture of known concentration. A specific position on the array contains a complementary DNA sequence, and the intensity of the signal at that position is determined by the weight ratio of the hybridizing species.
1: Correlate to 100,000. Two samples from different sources (eg representative test cells and control cells), each labeled with a different fluorophore, are hybridized to a single array to identify differentially expressed genes. In some cases, a labeled sample of calibrated cDNA with two fluorophores is labeled and an equal volume is added to the hybridization mixture to perform the calibration.
【0251】
光電子増倍管の出力は、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールされ
た12ビットRTI-835Hアナログ−ディジタル(A/D)変換ボード(Analog Device
s, Inc., Norwood MA)を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデー
タは、或るイメージとして表示され、シグナル強度は、リニア20色変換を用い
て、青色(低シグナル)から赤色(高シグナル)までに及ぶ擬似カラー範囲にマ
ッピングされる。データは、定量的にも分析される。2つの異なる蛍光体の励起
及び測定を同時に行う場合には、先ず、各蛍光体の発光スペクトルを用いて両蛍
光体間の(重複発光スペクトルに起因する)光学クロストークにデータを補正す
る。The output of the photomultiplier tube is a 12-bit RTI-835H analog-digital (A / D) conversion board (Analog Device) installed in an IBM compatible PC computer.
s, Inc., Norwood MA). The digitized data is displayed as an image and the signal intensities are mapped using a linear 20 color transform to a pseudo color range that extends from blue (low signal) to red (high signal). The data are also analyzed quantitatively. When simultaneously exciting and measuring two different phosphors, the emission spectrum of each phosphor is first used to correct the data for optical crosstalk between the phosphors (due to the overlapping emission spectrum).
【0252】
グリッドは蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットから
のシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグ
ナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に
用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム(Incyte)である。The grid is overlaid on the fluorescent signal image, whereby the signal from each spot is collected at each element of the grid. The fluorescent signals within each element are integrated and a number is obtained depending on the average intensity of the signal. The software used for signal analysis is the GEMTOOLS gene expression analysis program (Incyte).
【0253】
9 相補的ポリヌクレオチド
LIMDをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的配列は、天然のLI
MDの発現を検出し、低下させ、または阻害するために用いられる。約15〜30
塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さな或いは
大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Oligo4.0
6ソフトウェア(National Biosciences)、及びLIMDをコードする配列を用いて
、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な
5' 配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターが
コーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、LIMDをコ
ードする転写物にリボソームが結合しないように相補的オリゴヌクレオチドをデ
ザインする。 9 A complementary polynucleotide to the sequence encoding the complementary polynucleotide LIMD, or any portion thereof, is a natural LI
Used to detect, reduce or inhibit the expression of MD. About 15-30
Although the use of oligonucleotides containing base pairs is described, essentially the same method can be used for smaller or larger sequence fragments. Oligo4.0
6 Software (National Biosciences) and sequences encoding LIMD are used to design appropriate oligonucleotides. To inhibit transcription, a complementary oligonucleotide is designed from the most unique 5'sequence and used to prevent the promoter from binding to the coding sequence. To inhibit translation, complementary oligonucleotides are designed so that the ribosome does not bind to the transcript encoding LIMD.
【0254】
10 LIMDの発現
LIMDの発現及び精製は、細菌またはウイルスをベースにした発現系を用いて行
うことができる。細菌でLIMDを発現するために、抗生物質耐性及びcDNAの転写レ
ベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにcDNAをサブクローニ
ングする。このようなプロモーターには、lacオペレーター調節エレメントに関
連するT5またはT7バクテリオファージプロモーター及びtrp-lac(tac)ハイブリッ
ドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクター
を、BL21(DE3)等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌
が、イソプロピルβ-Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導されるとLIMDを発
現する。真核細胞でのLIMDの発現は、一般にバキュロウイルスとして知られてい
るAutographica californica核多面性ウイルス(AcMNPV)を昆虫細胞株または哺
乳動物細胞株に感染させて行う。バキュロウイルスの可欠ポリヘドリン遺伝子を
、相同的組換え、或いは転移プラスミドの媒介に関与する細菌媒介遺伝子転移の
どちらかによって、LIMDをコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力は維持
され、強いポリヘドリンプロモーターによって高いレベルのcDNAの転写が行われ
る。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodoptera frugiperda(Sf9)昆
虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後
者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。(Enge
lhard. E. K.ら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V
. ら (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945.等を参照)。 10 Expression of LIMD Expression and purification of LIMD can be performed using a bacterial or virus-based expression system. For expression of LIMD in bacteria, the cDNA is subcloned into a suitable vector containing an inducible promoter that enhances antibiotic resistance and the transcription level of the cDNA. Such promoters include, but are not limited to, the T5 or T7 bacteriophage promoter associated with the lac operator regulatory element and the trp-lac (tac) hybrid promoter. The recombinant vector is transformed into a suitable bacterial host such as BL21 (DE3). Bacteria with antibiotic resistance express LIMD when induced with isopropyl β-D thiogalactopyranoside (IPTG). Expression of LIMD in eukaryotic cells is performed by infecting an insect cell line or a mammalian cell line with Autographica californica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV), which is generally known as baculovirus. The baculovirus integral polyhedrin gene is replaced with the cDNA encoding LIMD, either by homologous recombination or by bacterial-mediated gene transfer involving transfer plasmid mediated. Viral infectivity is maintained and high levels of cDNA transcription are driven by the strong polyhedrin promoter. Recombinant baculovirus is often used to infect Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells, but can also be used to infect human hepatocytes. In the case of the latter infection, further genetic modification of the baculovirus is required. (Enge
lhard. EK et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-3227, Sandig, V
(1996) Hum. Gene Ther. 7: 1937-1945.
【0255】
殆どの発現系では、融合タンパク質としてLIMDを合成するのに例えばグルタチ
オンSトランスフェラーゼ(GST)またはペプチドエピトープ標識、例えばFLAGや
6-Hisを用いる。これらを用いることにより、未精製細胞溶解物から組換え融合
タンパク質の親和性ベースの精製を迅速に1ステップで行うことができる。GST
は日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性及び抗原性を維持
した状態で、固定化グルタチオン上で融合タンパク質の精製を可能とする(Amer
sham Pharmacia Biotech)。精製後、GSTの部分を特定の開発部位においてLIMD
からタンパク分解的に切断することが可能である。FLAGは8アミノ酸のペプチド
であり、市販されているモノクローナル及びポリクローナル抗FLAG抗体(Eastma
n Kodak)を用いて免疫親和性精製を可能にする。6ヒスチジン残基が連続して
伸長した6-Hisは、金属キレート樹脂(QIAGEN)上での精製を可能にする。タン
パク質の発現及び精製の方法は、前出のAusubel(1995)10章、16章に記載され
ている。これらの方法で精製したLIMDを直接用いて実施例11及び15のアッセ
イを行うことができる。In most expression systems, the synthesis of LIMD as a fusion protein may be performed using eg glutathione S transferase (GST) or peptide epitope tags such as FLAG or
Use 6-His. By using these, affinity-based purification of recombinant fusion proteins from crude cell lysates can be performed rapidly in one step. GST
Is a 26kDa enzyme from Schistosoma japonicum, which allows purification of the fusion protein on immobilized glutathione while maintaining protein activity and antigenicity (Amer
sham Pharmacia Biotech). After purification, the GST part was LIMD at a specific development site.
Can be proteolytically cleaved from. FLAG is an 8-amino acid peptide that is commercially available monoclonal and polyclonal anti-FLAG antibody (Eastma
n Kodak) to allow immunoaffinity purification. 6-His, which is a continuous extension of 6 histidine residues, allows purification on a metal chelate resin (QIAGEN). Methods for protein expression and purification are described in Ausubel (1995), chapters 10 and 16 above. The LIMD purified by these methods can be used directly to perform the assays of Examples 11 and 15.
【0256】
11 LIMD活性の実証
Zn2+のLIMDへの結合は、等温滴定微小熱量計におけるエンタルピー(発熱及び
吸熱)の結果の変化をモニターすることによりアッセイを行う(Micro-Cal Inc.
, Northampton, MA)。滴定微小熱量計測定は、リガンドまたは受容体分子の標
識化を必要とせず、検出は、結合時におけるエンタルピーの熱の固有変化にのみ
基づく。既知の値のZnCl2 溶液の多重コンピュータ制御注入は、LIMDを含む熱的
に制御されたチャンバーに向けられる。各注入後にエンタルピーの変化を注入数
に対してプロットし、結合等温線を作成する。注入されたZnCl2 溶液及びLIMD溶
液の体積及び濃度を結合等温線と共に用いて、Zn2+リガンドを有するLIMDの数、
親和性及び結合定数の値を計算する。 11 Demonstration of LIMD Activity Zn 2+ binding to LIMD is assayed by monitoring changes in enthalpy (exothermic and endothermic) results in an isothermal titration microcalorimeter (Micro-Cal Inc.
, Northampton, MA). Titration microcalorimetric measurements do not require labeling of ligand or receptor molecules, and detection is based solely on the intrinsic change in heat of enthalpy upon binding. Multiple computer controlled injections of known values of ZnCl 2 solution are directed into a thermally controlled chamber containing a LIMD. The change in enthalpy is plotted against the number of injections after each injection to create a binding isotherm. Using the volume and concentration of injected ZnCl 2 and LIMD solutions together with the binding isotherm, the number of LIMD with Zn 2+ ligands,
Calculate the values of affinity and binding constants.
【0257】
12 機能的アッセイ
LIMD機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのLI
MDをコードする配列の発現によって評価する。cDNAを、cDNAを高いレベルで発現
する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。選
り抜きのベクターには、pCMV SPORTプラスミド(Life Technologies)及びpCR 3
.1プラスミド(Invitrogen)が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモー
ターを有する。リポソーム製剤或いは電気穿孔法を用いて、5〜10μgの組換
えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に一時的に形
質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む1〜2μgのプラス
ミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形
質移入細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって
、cDNAの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例
えば緑色蛍光タンパク質(GFP;Clontech)、CD64またはCD64-GFP融合タンパク
質から選択できる。自動化された、レーザ光学に基づく技術であるフローサイト
メトリー(FCM)を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を
同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、細胞
死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して
計量する。このような現象として挙げられるのは、プロピジウムヨウ化物による
DNA染色によって計測される核DNA内容物の変化、ブロモデオキシウリジンの取込
量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によって
計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパンク質の発現の変化、及び蛍光複
合アネキシンVタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成
の変化とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M. G. (1994) Flow Cytometry
Oxford, New York, NY.に記述がある。[0257]
12 Functional assays
LIMD function is a function of LIMD at physiologically elevated levels in mammalian cell culture systems.
Evaluation is by expression of the MD coding sequence. High level expression of cDNA and cDNA
Subcloning into a mammalian expression vector containing a strong promoter. Election
For the vector to be excised, pCMV SPORT plasmid (Life Technologies) and pCR 3
.1 plasmid (Invitrogen), both of which are cytomegalovirus promoted
Have a tar. 5-10 μg recombinant using liposome preparation or electroporation
Of the E. coli vector into a human cell line, such as an endothelium-derived or hematopoietic-derived cell line.
Pour in. Furthermore, 1 to 2 μg of plus containing the sequence encoding the labeled protein
Mido is co-transfected. Expression of the labeled protein allows it to
Means are provided to distinguish the transfected cells. Also, depending on the expression of the labeled protein
, The expression of the cDNA from the recombinant vector can be accurately predicted. Labeled proteins are examples
For example, green fluorescent protein (GFP; Clontech), CD64 or CD64-GFP fusion protein
You can choose from quality. Flow site, an automated, laser-optics-based technology
Transformed cells expressing GFP or CD64-GFP using metric (FCM)
Identify and assess the apoptotic state of the cell and other cellular characteristics. FCM is a cell
Detecting the uptake of fluorescent molecules to diagnose phenomena that precede or coincide with death
Weigh. Such a phenomenon is caused by propidium iodide.
Changes in nuclear DNA content measured by DNA staining, incorporation of bromodeoxyuridine
Down-regulation of DNA synthesis, measured by decreased amount, by reactivity with specific antibodies
Changes in measured protein expression on the surface and inside the cell, and fluorescence
Plasma membrane composition measured by binding of combined annexin V protein to cell surface
There is a change of. For flow cytometry methods, Ormerod, M. G. (1994). Flow Cytometry
There is a description in Oxford, New York, NY.
【0258】
遺伝子発現におけるLIMDの影響は、LIMDをコードする配列とCD64またはCD64-G
FPのいずれかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価すること
ができる。CD64またはCD64-GFPは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫
グロブリンG(IgG)の保存領域と結合する。形質転換細胞と非形質転換細胞は、
ヒトIgGまたはCD64に対する抗体(DYNAL, Lake Success. NY)で覆われた磁気ビ
ーズを用いて有効に分離することができる。mRNAは、当分野で公知の方法で細胞
から精製することができる。LIMDその他の目的の遺伝子をコードするmRNAの発現
は、ノーザン分析或いはマイクロアレイ技術で分析することができる。The effect of LIMD on gene expression depends on the sequence encoding LIMD and CD64 or CD64-G.
Highly purified cell populations transfected with either FP can be evaluated. CD64 or CD64-GFP is expressed on the surface of transformed cells and binds to the conserved region of human immunoglobulin G (IgG). Transformed cells and non-transformed cells are
Effective separation can be achieved using magnetic beads coated with human IgG or antibodies against CD64 (DYNAL, Lake Success. NY). mRNA can be purified from cells by methods known in the art. Expression of mRNA encoding LIMD and other genes of interest can be analyzed by Northern analysis or microarray technology.
【0259】
13 LIMD特異抗体の産生
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE;Harrington, M.G. (1990) Method
s Enzymol. 182:488-495等を参照)または他の精製技術を用いて実質上精製され
たLIMDは、ウサギの免疫化及び標準プロトコルを用いた抗体産出に用いる。 13 Production of LIMD-specific antibody Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE; Harrington, MG (1990) Method
S. Enzymol. 182: 488-495 et al.) or other purification techniques, LIMD is used for rabbit immunization and antibody production using standard protocols.
【0260】
或いは、LASERGENEソフトウェア(DNASTAR)を用いてLIMDアミノ酸配列を解析
し、免疫抗原性の高い領域を決定する。そして対応するオリゴペプチドを合成し
、このオリゴペプチドを用いて当業者によく知られている方法で抗体を生成する
。適切なエピトープ、例えばC末端付近或いは隣接する親水性領域にあるエピト
ープの選択については、当分野で公知である(前出のAusubel, 1995, 11章等を
参照)。Alternatively, the LIMD amino acid sequence is analyzed using LASERGENE software (DNASTAR) to determine regions of high immunogenicity. Then, a corresponding oligopeptide is synthesized, and this oligopeptide is used to generate an antibody by a method well known to those skilled in the art. The selection of appropriate epitopes, for example those near the C-terminus or in adjacent hydrophilic regions, is known in the art (see Ausubel, 1995, supra, chapter 11, etc.).
【0261】
通常は、長さ約15残基のオリゴペプチドを、Fmocケミストリを用いるABI 43
1A ペプチドシンセサイザ(PE Biosystems)を用いて合成し、N-マレイミドベン
ゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)を用いた反応によってKLH
(Sigma-Aldrich, St. Louis MO)に結合させて、免疫抗原性を高める(前出のA
usubel, 1995 等を参照)。完全フロイントアジュバントにおいてオリゴペプチ
ド-KLM複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及
び抗LIMD活性を検査するには、ペプチドまたはLIMDを基質に結合し、1%BSAを
用いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素で標
識したヤギ抗ウサギIgGと反応させる。Normally, oligopeptides of about 15 residues in length are labeled with ABI 43 using Fmoc chemistry.
Synthesized using a 1A Peptide Synthesizer (PE Biosystems) and reacted with N-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS) to produce KLH
(Sigma-Aldrich, St. Louis MO) to enhance immunogenicity (see A above).
See usubel, 1995, etc.). Rabbits are immunized with the oligopeptide-KLM complex in complete Freund's adjuvant. To test the anti-peptide activity and anti-LIMD activity of the obtained antiserum, the peptide or LIMD was bound to a substrate, blocked with 1% BSA, reacted with rabbit antiserum, washed, and further treated with radioactive iodine. React with goat anti-rabbit IgG labeled with.
【0262】
14 特異抗体を用いた天然のLIMDの精製
天然または組換えLIMDを、LIMD特異抗体を用いたイムノアフィニティークロマ
トグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、抗LIMD抗
体を活性化クロマトグラフィー用樹脂、例えばCNBr活性化セファロース(Amersh
am Pharmacia Biotech)と共有結合させることにより構築する。結合後に、製造
者の使用説明書に従って樹脂をブロックし、洗浄する。 Purification of Native LIMD Using 14 Specific Antibodies Native or recombinant LIMD is substantially purified by immunoaffinity chromatography using LIMD specific antibodies. An immunoaffinity column is a resin for activation chromatography of anti-LIMD antibody, such as CNBr-activated Sepharose (Amersh).
am Pharmacia Biotech). After binding, the resin is blocked and washed according to the manufacturer's instructions.
【0263】
LIMDを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、LIMDを優先的に吸着
する条件下(例えば洗浄剤が存在する高イオン強度緩衝液)でカラムを洗浄する
。抗体とLIMDの結合を破壊する条件(例えばpH2〜3の緩衝液、或いは尿素また
はチオシアン酸塩イオン等の高濃度のカオトロープ剤)でカラムを溶出させ、LI
MDを回収する。The culture medium containing LIMD is passed through an immunoaffinity column, and the column is washed under conditions that preferentially adsorb LIMD (eg, high ionic strength buffer in the presence of detergent). Elute the column under conditions that destroy the binding between the antibody and LIMD (for example, a buffer solution of pH 2-3 or a high-concentration chaotropic agent such as urea or thiocyanate ion).
Collect MD.
【0264】
15 LIMDと相互作用する分子の同定
LIMDまたは生物学的に活性であるLIMD断片を125Iボルトンハンター試薬で標識
する(Bolton A.E.and W.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529-539等を参照
)。マルチウェルプレートの穴の中に予め配列しておいた候補分子を、標識した
LIMDと共にインキュベートして洗浄し、標識したLIMD複合体を有する任意の穴を
アッセイする。LIMD濃度を変えて得たデータを用いて、候補分子とのLIMDの数、
親和性及び会合の値を計算する。 Identification of Molecules that Interact with 15 LIMD Labeling LIMD or a biologically active LIMD fragment with 125 I Bolton Hunter reagent (Bolton AE and WM Hunter (1973) Biochem. J. 133: 529-539 et al. See). Pre-arranged candidate molecules labeled in the wells of a multi-well plate
Incubate with LIMD, wash and assay any wells with labeled LIMD complex. Using the data obtained by changing the LIMD concentration, the number of LIMD with the candidate molecule,
Calculate affinity and association values.
【0265】
或いは、LIMDと相互作用する分子は、Fields, S. 及び O. Song(1989, Natur
e 340:245-246)に記載されているような酵母2ハイブリッドシステムを用いて
分析するか、またはMATCHMAKERシステム(Clontech)等の2ハイブリッドシステ
ムに基づく市販のキットを用いて分析する。Alternatively, molecules that interact with LIMD are described in Fields, S. and O. Song (1989, Natur.
e 340: 245-246) or using a commercially available kit based on a two-hybrid system such as the MATCHMAKER system (Clontech).
【0266】
高処理の方法で酵母2ハイブリッドシステムを利用し、遺伝子の2大ライブラ
リにコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定するようなPATHCALLING
プロセス(CuraGen Corp., New Haven CT)にもLIMDを用い得る(Nandabalan, K
. ら (2000) 米国特許第6,057,101号)。PATHCALLING, which utilizes the yeast two-hybrid system in a high-throughput manner to determine all interactions between proteins encoded by two large libraries of genes
LIMD can also be used for the process (CuraGen Corp., New Haven CT) (Nandabalan, K
(2000) U.S. Patent No. 6,057,101).
【0267】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法
及びシステムの種々の改変を行い得る。本発明について説明するにあたり特定の
好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施
例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学ま
たは関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方
法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。Those skilled in the art can make various modifications of the described methods and systems of the present invention without departing from the scope and spirit of the invention. Although the invention has been described with reference to particular preferred embodiments, it should be understood that the scope of the invention should not be unduly limited to such particular embodiments. Indeed, various modifications of the described modes for carrying out the invention which are obvious to those skilled in molecular biology or related fields are intended to be within the scope of the following claims.
【0268】
(表の簡単な説明)
表1は、LIMDをコードする完全長の配列をアセンブルするために用いた、ポリ
ペプチド配列及びヌクレオチド配列の配列番号(SEQ ID NO)、クローン識別番
号(クローンID)、cDNAライブラリ及びcDNA断片を示す。BRIEF DESCRIPTION OF THE TABLES Table 1 shows the sequence numbers (SEQ ID NO), clone identification numbers (clones) of the polypeptide and nucleotide sequences used to assemble the full length sequence encoding LIMD. ID), cDNA library and cDNA fragment.
【0269】
表2は、潜在モチーフと、相同配列と、LIMDの解析に用いた方法、アルゴリズ
ム及び検索可能なデータベースとを含む各ポリペプチド配列の特徴を示す。Table 2 shows the characteristics of each polypeptide sequence, including latent motifs, homologous sequences, methods used for LIMD analysis, algorithms and searchable databases.
【0270】
表3は、各核酸配列の選択された断片と、ノーザン分析によって決定された各
核酸配列の組織特異的発現パターンと、これらの組織に関連した疾患、異常症ま
たは症状と、各DNAのクローニング先のベクターとを示す。Table 3 lists selected fragments of each nucleic acid sequence, tissue-specific expression patterns of each nucleic acid sequence determined by Northern analysis, diseases, disorders or conditions associated with these tissues, and each DNA. And the vector to which it is cloned.
【0271】
表4は、cDNAライブラリの作製に用いた組織を示す。LIMDをコードするcDNAク
ローンはここから単離した。Table 4 shows the tissues used for the construction of the cDNA library. The cDNA clone encoding LIMD was isolated from here.
【0272】
表5は、LIMDの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能
な説明、引用文献及び閾値パラメータと共に示す。Table 5 shows the tools, programs and algorithms used in the analysis of LIMD, along with applicable explanations, references and threshold parameters.
【表1】 [Table 1]
【表2】 [Table 2]
【表3】 [Table 3]
【表4】 [Table 4]
【表5】 [Table 5]
【表6】 [Table 6]
【配列表】 [Sequence list]
【図1A】
LIMD-1のアミノ酸配列(配列番号1)及び核酸配列(配列番号3)を示す図で
ある。アライメントは、MACDNASIS PROソフトウェア(日立ソフトウェアエンジ
ニアリング, San Bruno, CA)を用いて作成した。FIG. 1A shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) and nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 3) of LIMD-1. Alignments were created using MACDNASIS PRO software (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA).
【図1B】
LIMD-1のアミノ酸配列(配列番号1)及び核酸配列(配列番号3)を示す図で
ある。FIG. 1B shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) and nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 3) of LIMD-1.
【図1C】
LIMD-1のアミノ酸配列(配列番号1)及び核酸配列(配列番号3)を示す図で
ある。FIG. 1C shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) and nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 3) of LIMD-1.
【図1D】
LIMD-1のアミノ酸配列(配列番号1)及び核酸配列(配列番号3)を示す図で
ある。FIG. 1D shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) and nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 3) of LIMD-1.
【図2A】
LIMD-2のアミノ酸配列(配列番号2)及び核酸配列(配列番号4)を示す図で
ある。FIG. 2A shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) and nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 4) of LIMD-2.
【図2B】
LIMD-2のアミノ酸配列(配列番号2)及び核酸配列(配列番号4)を示す図で
ある。FIG. 2B shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) and nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 4) of LIMD-2.
【図2C】
LIMD-2のアミノ酸配列(配列番号2)及び核酸配列(配列番号4)を示す図で
ある。FIG. 2C shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) and nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 4) of LIMD-2.
【図2D】
LIMD-2のアミノ酸配列(配列番号2)及び核酸配列(配列番号4)を示す図で
ある。FIG. 2D shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) and nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 4) of LIMD-2.
【図2E】
LIMD-2のアミノ酸配列(配列番号2)及び核酸配列(配列番号4)を示す図で
ある。FIG. 2E shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) and nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 4) of LIMD-2.
【図2F】
LIMD-2のアミノ酸配列(配列番号2)及び核酸配列(配列番号4)を示す図で
ある。FIG. 2F shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) and nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 4) of LIMD-2.
【図2G】
LIMD-2のアミノ酸配列(配列番号2)及び核酸配列(配列番号4)を示す図で
ある。FIG. 2G shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) and nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 4) of LIMD-2.
【図3A】
LIMD-1(Incyteクローン番号4084014、配列番号1)及びヒトFHL-1(GI 28532
24、配列番号5)間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。アライメント
は、LASERGENEソフトウェア(DNASTAR Inc., Madison WI)のマルチシークエン
スアライメントプログラムを用いて作成した。FIG. 3A: LIMD-1 (Incyte clone number 4084014, SEQ ID NO: 1) and human FHL-1 (GI 28532
FIG. 24 is a diagram showing an amino acid sequence alignment between 24 and SEQ ID NO: 5). Alignments were created using the LASERGENE software (DNASTAR Inc., Madison WI) multi-sequence alignment program.
【図3B】
LIMD-1(Incyteクローン番号4084014、配列番号1)及びヒトFHL-1(GI 28532
24、配列番号5)間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。FIG. 3B. LIMD-1 (Incyte clone number 4084014, SEQ ID NO: 1) and human FHL-1 (GI 28532.
FIG. 24 is a diagram showing an amino acid sequence alignment between 24 and SEQ ID NO: 5).
【図4A】
LIMD-2(Incyteクローン番号5640004、配列番号2)及びLIM型Znフィンガータ
ンパク質(GI 2624922、配列番号6)間のアミノ酸配列アライメントを示す図で
ある。FIG. 4A is a diagram showing an amino acid sequence alignment between LIMD-2 (Incyte clone number 5640004, SEQ ID NO: 2) and LIM type Zn finger protein (GI 2624922, SEQ ID NO: 6).
【図4B】
LIMD-2(Incyteクローン番号5640004、配列番号2)及びLIM型Znフィンガータ
ンパク質(GI 2624922、配列番号6)間のアミノ酸配列アライメントを示す図で
ある。FIG. 4B shows an amino acid sequence alignment between LIMD-2 (Incyte clone number 5640004, SEQ ID NO: 2) and LIM type Zn finger protein (GI 2624922, SEQ ID NO: 6).
【図4C】
LIMD-2(Incyteクローン番号5640004、配列番号2)及びLIM型Znフィンガータ
ンパク質(GI 2624922、配列番号6)間のアミノ酸配列アライメントを示す図で
ある。FIG. 4C shows an amino acid sequence alignment between LIMD-2 (Incyte clone number 5640004, SEQ ID NO: 2) and LIM type Zn finger protein (GI 2624922, SEQ ID NO: 6).
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 9/10 A61P 15/00 4C084 13/00 17/16 4H045 15/00 19/00 17/16 21/00 19/00 25/08 21/00 27/02 25/08 31/00 27/02 35/00 31/00 35/02 35/00 C07K 14/47 35/02 16/18 C07K 14/47 C12N 1/15 16/18 1/19 C12N 1/15 1/21 1/19 C12P 21/02 C 1/21 C12Q 1/68 A 5/10 G01N 33/15 Z C12P 21/02 33/50 Z C12Q 1/68 33/53 M G01N 33/15 33/566 33/50 C12N 15/00 ZNAA 33/53 5/00 A 33/566 A61K 37/02 (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ,UG ,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD, RU,TJ,TM),AE,AL,AM,AT,AU, AZ,BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,C N,CU,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB ,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID,IL, IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,L C,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MD,MG ,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,PL,PT, RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL,T J,TM,TR,TT,UA,UG,US,UZ,VN ,YU,ZA,ZW (72)発明者 アジムザイ、ヤルダ アメリカ合衆国カリフォルニア州94545・ ヘイワード・ロックスプリングスドライブ 2045 Fターム(参考) 2G045 AA34 AA35 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA02 EA02 GA11 HA12 HA15 4B063 QA19 QA20 QQ43 QR08 QR42 QR56 QS25 QS34 QX02 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA72X AA90X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA17 BA01 BA08 BA22 BA23 BA44 CA18 CA53 CA56 CA59 NA01 NA13 NA14 ZA062 ZA332 ZA342 ZA452 ZA512 ZA752 ZA812 ZA892 ZA942 ZA962 ZB262 ZB272 ZB352 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA75 EA20 EA50 FA72 FA74 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme code (reference) A61P 9/10 A61P 15/00 4C084 13/00 17/16 4H045 15/00 19/00 17/16 21 / 00 19/00 25/08 21/00 27/02 25/08 31/00 27/02 35/00 31/00 35/02 35/00 C07K 14/47 35/02 16/18 C07K 14/47 C12N 1 / 15 16/18 1/19 C12N 1/15 1/21 1/19 C12P 21/02 C 1/21 C12Q 1/68 A 5/10 G01N 33/15 Z C12P 21/02 33/50 Z C12Q 1 / 68 33/53 MG 01N 33/15 33/566 33/50 C12N 15/00 ZNAA 33/53 5/00 A 33/566 A61K 37/02 (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE) , DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, C) , CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW) ), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, C N, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL , T J, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Akira Zimzai, Yalda United States California 94545 Hayward Rock Springs Drive 2045 F Term (Reference) 2G045 AA34 AA35 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA02 EA02 GA11 HA12 HA15 4B063 QA19 QA20 QQ43 QR08 QR40 QR10 QR34 QR56 QR25 QR56 QR02 QR56 QR02 QR25 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA72X AA90X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA17 BA01 BA08 BA22 BA23 BA44 CA18 CA53 CA56 CA59 A59 A59 A52 A52 A52 A52 A2 AA72A52 A2 AA72A52A2 CA40 DA75 EA20 EA50 FA72 FA74
Claims (28)
離されたポリペプチド。 (a)配列番号1を有する群から選択したアミノ酸配列 (b)配列番号1を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも95%が
同一であるようなアミノ酸配列を有する天然のアミノ酸配列 (c)配列番号1を有する群から選択したアミノ酸配列を有するアミノ酸配列
の生物学的活性断片 (d)配列番号1を有する群から選択したアミノ酸配列を有する免疫抗原性断
片1. A substantially isolated polypeptide selected from the group comprising the following (a) to (d): (A) an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1 (b) a natural amino acid sequence having an amino acid sequence that is at least 95% identical to the amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1 (c) sequence A biologically active fragment of an amino acid sequence having an amino acid sequence selected from the group having No. 1 (d) An immunogenic fragment having an amino acid sequence selected from the group having No. 1
されたポリペプチド。2. The isolated polypeptide of claim 1 selected from the group having SEQ ID NO: 1.
レオチド。3. An isolated polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1.
レオチド。4. An isolated polynucleotide encoding the polypeptide of claim 2.
されたポリヌクレオチド。5. The isolated polynucleotide of claim 4, selected from the group having SEQ ID NO: 3.
ロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。6. A recombinant polynucleotide comprising a promoter sequence operably linked to the polynucleotide of claim 3.
換した細胞。7. A cell transformed with the recombinant polynucleotide according to claim 6.
転換体。8. A genetic transformant containing the recombinant polynucleotide according to claim 6.
の発現に適した条件下で培養する過程と、 (b)そのように発現した前記ポリペプチドを受容する過程とからなり、 前記組換えポリヌクレオチドが、請求項1に記載の前記ポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドに機能的に結合したプロモーター配列を有することを特徴
とする方法。9. A method for producing the polypeptide according to claim 1, comprising the step of: (a) culturing cells transformed with the recombinant polynucleotide under conditions suitable for expression of the polypeptide. And (b) a step of receiving the polypeptide so expressed, wherein the recombinant polynucleotide is a promoter sequence operably linked to the polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1. A method comprising:
離された抗体。10. An isolated antibody which specifically binds to the polypeptide of claim 1.
単離されたポリヌクレオチド。 (a)配列番号3を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリ
ヌクレオチド配列 (b)配列番号3を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも
90%が同一であるような天然のポリヌクレオチド配列 (c)(a)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド (d)(b)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド (e)(a)〜(d)のRNA等価物11. A substantially isolated polynucleotide selected from the group comprising the following (a) to (e): (A) a polynucleotide sequence having a polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NO: 3 (b) a natural polynucleotide sequence at least 90% identical to the polynucleotide sequence selected from the group having SEQ ID NO: 3 (C) Polynucleotide complementary to the polynucleotide of (a) (d) Polynucleotide complementary to the polynucleotide of (b) (e) RNA equivalent of (a) to (d)
の連続したヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。12. At least 60 of the polynucleotide of claim 11.
An isolated polynucleotide comprising a contiguous nucleotide of.
的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、 (a)前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を有する少
なくとも20の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて前記サンプルをハ
イブリダイズする過程と、 (b)前記ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、該複合体
が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程からなり、 前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドの間でハイブリダイゼーション複合
体が形成されるような条件下で、前記プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特
異的にハイブリダイズすることを特徴とする方法。13. A method for detecting a target polynucleotide having the sequence of the polynucleotide according to claim 11 in a sample, comprising: (a) at least having a sequence complementary to the target polynucleotide in the sample. A step of hybridizing the sample using a probe containing 20 consecutive nucleotides, and (b) detecting the presence or absence of the hybridization complex, and optionally the amount of the complex, if any. And the probe specifically hybridizes to the target polynucleotide under conditions such that a hybridization complex is formed between the probe and the target polynucleotide. Method.
を含むことを特徴とする請求項13に記載の方法。14. The method of claim 13, wherein the probe comprises at least 60 contiguous nucleotides.
的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、 (a)ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはそ
の断片を増幅する過程と、 (b)前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該
標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を
検出する過程を含むことを特徴とする方法。15. A method for detecting a target polynucleotide having the sequence of the polynucleotide according to claim 11 in a sample, comprising: (a) amplifying the target polynucleotide or a fragment thereof using polymerase chain reaction amplification. And (b) detecting the presence / absence of the target polynucleotide or its fragment, and optionally detecting the amount of the target polynucleotide or its fragment, if any. how to.
きる賦形剤とを有することを特徴とする成分。16. A component, which comprises an effective amount of the polypeptide of claim 1 and a pharmaceutically acceptable excipient.
たアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項16に記載の成分。17. The component of claim 16, wherein the polypeptide comprises an amino acid sequence selected from the group having SEQ ID NO: 1.
る方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項16に記載の
成分を投与する過程を含むことを特徴とする方法。18. A method for treating a disease or medical condition associated with reduced expression of functional LIMD, comprising the step of administering the component of claim 16 to a patient in need of such treatment. A method characterized by the following.
性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、 (a)請求項1に記載のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、 (b)前記サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含むことを特徴と
する方法。19. A method for screening a compound for confirming its effectiveness as an agonist of the polypeptide according to claim 1, comprising: (a) exposing a sample containing the polypeptide according to claim 1 to the compound. A method comprising the steps of: (b) detecting an agonist activity in the sample.
合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする成分。20. A component comprising an agonist compound identified by the method of claim 19 and a pharmaceutically acceptable excipient.
る方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項20に記載の
成分を投与する過程を含むことを特徴とする方法。21. A method of treating a disease or medical condition associated with reduced expression of functional LIMD, comprising the step of administering a component of claim 20 to a patient in need of such treatment. A method characterized by the following.
有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、 (a)請求項1に記載のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、 (b)前記サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程とを含むことを特
徴とする方法。22. A method of screening a compound for confirming its efficacy as an antagonist of the polypeptide of claim 1, comprising: (a) exposing a sample containing the polypeptide of claim 1 to the compound. A method comprising the steps of: (b) detecting an antagonist activity in the sample.
ト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする成分。23. A component comprising an antagonist compound identified by the method of claim 22 and a pharmaceutically acceptable excipient.
法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項23に記載の成分
を投与する過程を含むことを特徴とする方法。24. A method of treating a disease or medical condition associated with overexpression of functional LIMD, comprising the step of administering a component of claim 23 to a patient in need of such treatment. A method characterized by.
スクリーニングする方法であって、 (a)適切な条件下で請求項1に記載のポリペプチドを少なくとも1つの試験
化合物に結合させる過程と、 (b)請求項1に記載のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それに
よって請求項1に記載のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを
含むことを特徴とする方法。25. A method for screening a compound that specifically binds to the polypeptide of claim 1, comprising: (a) binding the polypeptide of claim 1 to at least one test compound under suitable conditions. And a step of (b) detecting the binding of the polypeptide of claim 1 to a test compound, thereby identifying a compound that specifically binds to the polypeptide of claim 1. And how to.
をスクリーニングする方法であって、 (a)請求項1に記載のポリペプチドの活性が許容された条件下で、請求項1
に記載のポリペプチドを少なくとも1つの試験化合物に結合させる過程と、 (b)請求項1に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する
過程と、 (c)試験化合物の存在下での請求項1に記載のポリペプチドの活性を、試験
化合物の不存在下での請求項1に記載のポリペプチドの活性と比較する過程とを
含み、 試験化合物の存在下での請求項1に記載のポリペプチドの活性の変化が、請求
項1に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示することを特徴とする
方法。26. A method for screening a compound that regulates the activity of the polypeptide according to claim 1, which comprises (a) a condition under which the activity of the polypeptide according to claim 1 is allowed. 1
Binding the polypeptide of claim 1 to at least one test compound, (b) calculating the activity of the polypeptide of claim 1 in the presence of the test compound, and (c) in the presence of the test compound. Comparing the activity of the polypeptide of claim 1 with the activity of the polypeptide of claim 1 in the absence of the test compound in the presence of the test compound. 9. A method wherein the altered activity of the polypeptide of claim 1 is indicative of a compound that modulates the activity of the polypeptide of claim 1.
変異発現の有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、 (a)前記標的ポリヌクレオチドの発現に適した条件下で、該標的ポリヌクレ
オチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、 (b)前記標的ポリヌクレオチドの変異発現を検出する過程とを含むことを特
徴とする方法。27. A method of screening a compound for confirming the effectiveness of mutant expression of a target polynucleotide having the sequence according to claim 5, comprising: (a) conditions suitable for expression of the target polynucleotide. A method comprising the following: exposing a sample containing the target polynucleotide to a compound, and (b) detecting a mutant expression of the target polynucleotide.
レオチドを含むプローブと、請求項11に記載のポリヌクレオチドまたはその断
片のポリヌクレオチド配列を有する前記生物学的サンプルの標的ポリヌクレオチ
ドとの間に、特定のハイブリタイゼーション複合体が形成されるような条件下で
、前記処理されたサンプルの核酸を前記プローブでハイブリタイズする過程と、 (c)前記ハイブリタイゼーション複合体の量を定量する過程と、 (d)前記処理された生物学的サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合
体の量を、処理されていない生物学的サンプル中の前記ハイブリタイゼーション
複合体の量と比較する過程とを含み、 前記処理された生物学的サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量
の差が、前記試験化合物の毒性を標示することを特徴とする方法。28. A method for calculating the toxicity of a test compound, comprising: (a) treating a biological sample containing nucleic acid with the test compound, and (b) at least the polynucleotide of claim 11. A specific hybridization complex is formed between a probe containing 20 contiguous nucleotides and a target polynucleotide of the biological sample having the polynucleotide sequence of the polynucleotide of claim 11 or a fragment thereof. Under the conditions as described above, the step of hybridizing the nucleic acid of the treated sample with the probe, (c) the step of quantifying the amount of the hybridization complex, and (d) the treated organism. The amount of the hybridization complex in the biological sample is determined by the amount of the hybridization complex in the untreated biological sample. Comparing the amount of the Retantiation Complex with the difference in the amount of the Hybridization Complex in the treated biological sample is indicative of toxicity of the test compound. .
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