JP2004500804A - Cell cycle and cell growth proteins - Google Patents
Cell cycle and cell growth proteins Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004500804A JP2004500804A JP2001512554A JP2001512554A JP2004500804A JP 2004500804 A JP2004500804 A JP 2004500804A JP 2001512554 A JP2001512554 A JP 2001512554A JP 2001512554 A JP2001512554 A JP 2001512554A JP 2004500804 A JP2004500804 A JP 2004500804A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- ccypr
- polynucleotide
- polypeptide
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 210
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 113
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 230
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 230
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 230
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 212
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 130
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 80
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 62
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims abstract description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 140
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 132
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 122
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 114
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 111
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 92
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 85
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 84
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 79
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 76
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 75
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 62
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 61
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 50
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 45
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 40
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 40
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 39
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 37
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 30
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 27
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 16
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 claims description 14
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 claims description 14
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 13
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 10
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims description 8
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 5
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 191
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 23
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 abstract description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 99
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 62
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 62
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 56
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 55
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 54
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 42
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 40
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 36
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 35
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 32
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 31
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 29
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 29
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 28
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 28
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 27
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 26
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 25
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 21
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 21
- 230000006870 function Effects 0.000 description 21
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 21
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 20
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 20
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 20
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 19
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 description 18
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 18
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 18
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 17
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 17
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 16
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 16
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 16
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 16
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 16
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 15
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- -1 translation factors Proteins 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 13
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 13
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 13
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 13
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 13
- 230000004044 response Effects 0.000 description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 13
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 12
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 11
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 11
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 11
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 11
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 11
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 11
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 11
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 11
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 11
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 11
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 10
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 9
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 9
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 9
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 9
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 9
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 9
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 9
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 9
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 9
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 9
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 8
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 8
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 8
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 8
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 8
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 8
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 8
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 8
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 208000012239 Developmental disease Diseases 0.000 description 7
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 7
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 7
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 7
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 7
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 7
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 7
- 210000000688 human artificial chromosome Anatomy 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 7
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 6
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 6
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 6
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 6
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 6
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 6
- 208000003250 Mixed connective tissue disease Diseases 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 6
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 6
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 6
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 6
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 6
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 6
- 230000009245 menopause Effects 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 6
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 5
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 5
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 5
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 5
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 5
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 5
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 230000006369 cell cycle progression Effects 0.000 description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 5
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 5
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 5
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 5
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 5
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 5
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 5
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 5
- 108091008819 oncoproteins Proteins 0.000 description 5
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 5
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 5
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 5
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 5
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 5
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 5
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 5
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 5
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 5
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 4
- 208000003200 Adenoma Diseases 0.000 description 4
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 206010006811 Bursitis Diseases 0.000 description 4
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 4
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 208000032027 Essential Thrombocythemia Diseases 0.000 description 4
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 4
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 4
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 4
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 4
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 4
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 description 4
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 description 4
- 101001053710 Homo sapiens Inhibitor of growth protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 4
- 102100024065 Inhibitor of growth protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 4
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 4
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 4
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 4
- 208000000733 Paroxysmal Hemoglobinuria Diseases 0.000 description 4
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102100036050 Phosphatidylinositol N-acetylglucosaminyltransferase subunit A Human genes 0.000 description 4
- ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N PicoGreen Chemical compound CN(C)CCCN(CCCN(C)C)C1=CC(=CC2=[N+](C3=CC=CC=C3S2)C)C2=CC=CC=C2N1C1=CC=CC=C1 ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 4
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 4
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 4
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical group O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010004977 Vasopressins Proteins 0.000 description 4
- 102000002852 Vasopressins Human genes 0.000 description 4
- 208000017733 acquired polycythemia vera Diseases 0.000 description 4
- 208000009621 actinic keratosis Diseases 0.000 description 4
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 4
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 4
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 4
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N argipressin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N1)=O)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)C1=CC=CC=C1 KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 4
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 4
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 4
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 4
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 4
- 206010028537 myelofibrosis Diseases 0.000 description 4
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 4
- 230000027758 ovulation cycle Effects 0.000 description 4
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 4
- 201000003045 paroxysmal nocturnal hemoglobinuria Diseases 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 4
- 208000037244 polycythemia vera Diseases 0.000 description 4
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 4
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 4
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 229960003726 vasopressin Drugs 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 3
- 208000031212 Autoimmune polyendocrinopathy Diseases 0.000 description 3
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 3
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 3
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 3
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 241001635598 Enicostema Species 0.000 description 3
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 3
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 3
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 3
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 102400000050 Oxytocin Human genes 0.000 description 3
- XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N Oxytocin Natural products N1C(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C1CC1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101800000989 Oxytocin Proteins 0.000 description 3
- 102000003946 Prolactin Human genes 0.000 description 3
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102100036407 Thioredoxin Human genes 0.000 description 3
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 3
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 3
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 3
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 3
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 3
- 230000031016 anaphase Effects 0.000 description 3
- 238000003491 array Methods 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 3
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 3
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 3
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 3
- 108060002430 dynein heavy chain Proteins 0.000 description 3
- 102000013035 dynein heavy chain Human genes 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 3
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 210000004996 female reproductive system Anatomy 0.000 description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 3
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 3
- 230000010370 hearing loss Effects 0.000 description 3
- 231100000888 hearing loss Toxicity 0.000 description 3
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 description 3
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 3
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 3
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 3
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004995 male reproductive system Anatomy 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 3
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N oxytocin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](N)C(=O)N1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N 0.000 description 3
- 229960001723 oxytocin Drugs 0.000 description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 3
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 3
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 3
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 3
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 3
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 2
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 2
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 2
- 208000010444 Acidosis Diseases 0.000 description 2
- 206010000599 Acromegaly Diseases 0.000 description 2
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 2
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 2
- 206010001367 Adrenal insufficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000009888 Adrenocortical Adenoma Diseases 0.000 description 2
- 208000005223 Alkalosis Diseases 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 2
- 201000000736 Amenorrhea Diseases 0.000 description 2
- 206010001928 Amenorrhoea Diseases 0.000 description 2
- 102000052583 Anaphase-Promoting Complex-Cyclosome Apc8 Subunit Human genes 0.000 description 2
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 2
- 102100032187 Androgen receptor Human genes 0.000 description 2
- 206010002329 Aneurysm Diseases 0.000 description 2
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 2
- 206010002961 Aplasia Diseases 0.000 description 2
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 2
- 208000004300 Atrophic Gastritis Diseases 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 102100036465 Autoimmune regulator Human genes 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 208000023328 Basedow disease Diseases 0.000 description 2
- 206010004446 Benign prostatic hyperplasia Diseases 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 101100346438 Caenorhabditis elegans mrg-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 2
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 208000002177 Cataract Diseases 0.000 description 2
- 102000005483 Cell Cycle Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010031896 Cell Cycle Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102100039118 Centromere/kinetochore protein zw10 homolog Human genes 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010066551 Cholestenone 5 alpha-Reductase Proteins 0.000 description 2
- 206010008723 Chondrodystrophy Diseases 0.000 description 2
- 206010008748 Chorea Diseases 0.000 description 2
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 2
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 2
- 206010018325 Congenital glaucomas Diseases 0.000 description 2
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 2
- 208000014311 Cushing syndrome Diseases 0.000 description 2
- 108090000266 Cyclin-dependent kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000003903 Cyclin-dependent kinases Human genes 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 2
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 2
- 206010012442 Dermatitis contact Diseases 0.000 description 2
- 206010012565 Developmental glaucoma Diseases 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010013801 Duchenne Muscular Dystrophy Diseases 0.000 description 2
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 2
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 2
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 2
- 208000017701 Endocrine disease Diseases 0.000 description 2
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 201000009273 Endometriosis Diseases 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 2
- 206010014950 Eosinophilia Diseases 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 206010015226 Erythema nodosum Diseases 0.000 description 2
- 208000000571 Fibrocystic breast disease Diseases 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 2
- 102000018898 GTPase-Activating Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006094 GTPase-accelerating proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 2
- 208000036495 Gastritis atrophic Diseases 0.000 description 2
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010018498 Goitre Diseases 0.000 description 2
- 239000000579 Gonadotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 2
- 208000024869 Goodpasture syndrome Diseases 0.000 description 2
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 2
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 description 2
- 208000032041 Hearing impaired Diseases 0.000 description 2
- 206010061201 Helminthic infection Diseases 0.000 description 2
- 208000035186 Hemolytic Autoimmune Anemia Diseases 0.000 description 2
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 2
- 206010020112 Hirsutism Diseases 0.000 description 2
- 101000928549 Homo sapiens Autoimmune regulator Proteins 0.000 description 2
- 101000912124 Homo sapiens Cell division cycle protein 23 homolog Proteins 0.000 description 2
- 101000743902 Homo sapiens Centromere/kinetochore protein zw10 homolog Proteins 0.000 description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 2
- 201000002980 Hyperparathyroidism Diseases 0.000 description 2
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 2
- 208000025315 Hypothalamic and pituitary disease Diseases 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 206010053198 Inappropriate antidiuretic hormone secretion Diseases 0.000 description 2
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 2
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000001126 Keratosis Diseases 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 201000004462 Leydig Cell Tumor Diseases 0.000 description 2
- 206010025327 Lymphopenia Diseases 0.000 description 2
- 208000004059 Male Breast Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 208000036626 Mental retardation Diseases 0.000 description 2
- 101100533725 Mus musculus Smr3a gene Proteins 0.000 description 2
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 2
- 201000003793 Myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 description 2
- 206010028665 Myxoedema Diseases 0.000 description 2
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 208000009905 Neurofibromatoses Diseases 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 206010033266 Ovarian Hyperstimulation Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000016222 Pancreatic disease Diseases 0.000 description 2
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 2
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 2
- 208000004362 Penile Induration Diseases 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 208000020758 Peyronie disease Diseases 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000004403 Prostatic Hyperplasia Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 102000015690 Proto-Oncogene Proteins c-bcr Human genes 0.000 description 2
- 108010024221 Proto-Oncogene Proteins c-bcr Proteins 0.000 description 2
- 206010037075 Protozoal infections Diseases 0.000 description 2
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 2
- 102100027551 Ras-specific guanine nucleotide-releasing factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 108050004793 Ras-specific guanine nucleotide-releasing factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 2
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 201000001388 Smith-Magenis syndrome Diseases 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101000857870 Squalus acanthias Gonadoliberin Proteins 0.000 description 2
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 2
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 2
- 201000009594 Systemic Scleroderma Diseases 0.000 description 2
- 206010042953 Systemic sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102000007000 Tenascin Human genes 0.000 description 2
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 description 2
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 206010043780 Thyroiditis acute Diseases 0.000 description 2
- 208000010641 Tooth disease Diseases 0.000 description 2
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 2
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 206010046798 Uterine leiomyoma Diseases 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- 208000009443 Vascular Malformations Diseases 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010047486 Virilism Diseases 0.000 description 2
- 201000011032 Werner Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 208000008919 achondroplasia Diseases 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000007950 acidosis Effects 0.000 description 2
- 208000026545 acidosis disease Diseases 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 201000006498 acute thyroiditis Diseases 0.000 description 2
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 210000004404 adrenal cortex Anatomy 0.000 description 2
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 2
- 208000017515 adrenocortical insufficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000011341 adult acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 2
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000002340 alkalosis Effects 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000540 amenorrhea Toxicity 0.000 description 2
- 206010002022 amyloidosis Diseases 0.000 description 2
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 2
- 239000003098 androgen Substances 0.000 description 2
- 108010080146 androgen receptors Proteins 0.000 description 2
- 206010002320 anencephaly Diseases 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000008303 aniridia Diseases 0.000 description 2
- 210000004198 anterior pituitary gland Anatomy 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 2
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 201000000448 autoimmune hemolytic anemia Diseases 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 230000008236 biological pathway Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000000625 blastula Anatomy 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 208000030270 breast disease Diseases 0.000 description 2
- 208000011803 breast fibrocystic disease Diseases 0.000 description 2
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 2
- 206010008129 cerebral palsy Diseases 0.000 description 2
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 239000005081 chemiluminescent agent Substances 0.000 description 2
- 201000001352 cholecystitis Diseases 0.000 description 2
- 208000012601 choreatic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000003200 chromosome mapping Methods 0.000 description 2
- 230000024321 chromosome segregation Effects 0.000 description 2
- 208000016644 chronic atrophic gastritis Diseases 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 2
- 208000018631 connective tissue disease Diseases 0.000 description 2
- 208000010247 contact dermatitis Diseases 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000021953 cytokinesis Effects 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 201000001981 dermatomyositis Diseases 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- VZFRNCSOCOPNDB-UHFFFAOYSA-N domoic acid Natural products OC(=O)C(C)C=CC=C(C)C1CNC(C(O)=O)C1CC(O)=O VZFRNCSOCOPNDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 2
- 201000003511 ectopic pregnancy Diseases 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 2
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 2
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 2
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 description 2
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 2
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 2
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 201000003872 goiter Diseases 0.000 description 2
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 2
- 239000003163 gonadal steroid hormone Substances 0.000 description 2
- XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N gonadorelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N 0.000 description 2
- 229940035638 gonadotropin-releasing hormone Drugs 0.000 description 2
- 229940094892 gonadotropins Drugs 0.000 description 2
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 208000003906 hydrocephalus Diseases 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000003532 hypothyroidism Diseases 0.000 description 2
- 230000002989 hypothyroidism Effects 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 201000001881 impotence Diseases 0.000 description 2
- 201000008284 inappropriate ADH syndrome Diseases 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 2
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 208000020082 intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 2
- 208000002551 irritable bowel syndrome Diseases 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000002415 kinetochore Anatomy 0.000 description 2
- 201000010260 leiomyoma Diseases 0.000 description 2
- 210000002332 leydig cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 231100001023 lymphopenia Toxicity 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 2
- 201000003175 male breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000010907 male breast carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 2
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- VKHAHZOOUSRJNA-GCNJZUOMSA-N mifepristone Chemical compound C1([C@@H]2C3=C4CCC(=O)C=C4CC[C@H]3[C@@H]3CC[C@@]([C@]3(C2)C)(O)C#CC)=CC=C(N(C)C)C=C1 VKHAHZOOUSRJNA-GCNJZUOMSA-N 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 2
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 2
- 208000003786 myxedema Diseases 0.000 description 2
- 210000003739 neck Anatomy 0.000 description 2
- 201000008026 nephroblastoma Diseases 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 201000004931 neurofibromatosis Diseases 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 2
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 2
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003924 normoblast Anatomy 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 2
- 208000015124 ovarian disease Diseases 0.000 description 2
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 2
- 230000000624 ovulatory effect Effects 0.000 description 2
- 208000024691 pancreas disease Diseases 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 230000000849 parathyroid Effects 0.000 description 2
- 210000003899 penis Anatomy 0.000 description 2
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 201000010065 polycystic ovary syndrome Diseases 0.000 description 2
- 208000005987 polymyositis Diseases 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 201000009395 primary hyperaldosteronism Diseases 0.000 description 2
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 2
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- 201000007094 prostatitis Diseases 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 231100000527 sperm abnormality Toxicity 0.000 description 2
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 2
- 208000001608 teratocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 2
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 230000008791 toxic response Effects 0.000 description 2
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 2
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 2
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 2
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001086 yeast two-hybrid system Methods 0.000 description 2
- KYRUKRFVOACELK-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(4-hydroxyphenyl)propanoate Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O KYRUKRFVOACELK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PFCLMNDDPTZJHQ-XLPZGREQSA-N 2-amino-7-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-1h-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-one Chemical compound C1=CC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 PFCLMNDDPTZJHQ-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- ZPZDIFSPRVHGIF-UHFFFAOYSA-N 3-aminopropylsilicon Chemical compound NCCC[Si] ZPZDIFSPRVHGIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024223 Adenine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000008190 Agammaglobulinemia Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000007887 Alphavirus Infections Diseases 0.000 description 1
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 1
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 101100001210 Arabidopsis thaliana AGT3 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000800130 Bos taurus Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 108091007914 CDKs Proteins 0.000 description 1
- 101100152433 Caenorhabditis elegans tat-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 102100032346 Cell cycle progression protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 239000005496 Chlorsulfuron Substances 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 108010088874 Cullin 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102000003910 Cyclin D Human genes 0.000 description 1
- 108090000259 Cyclin D Proteins 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000970 DNA cross-linking effect Effects 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 108700000021 Drosophila Zw10 Proteins 0.000 description 1
- 102000012199 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Human genes 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N Ecdysone Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@H]([C@@H](O)CCC(O)(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102100028138 F-box/WD repeat-containing protein 7 Human genes 0.000 description 1
- 102100037584 FAST kinase domain-containing protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 206010016077 Factor IX deficiency Diseases 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- LLQPHQFNMLZJMP-UHFFFAOYSA-N Fentrazamide Chemical group N1=NN(C=2C(=CC=CC=2)Cl)C(=O)N1C(=O)N(CC)C1CCCCC1 LLQPHQFNMLZJMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 208000034951 Genetic Translocation Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 108010067218 Guanine Nucleotide Exchange Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000016285 Guanine Nucleotide Exchange Factors Human genes 0.000 description 1
- 108090001102 Hammerhead ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 208000003923 Hereditary Corneal Dystrophies Diseases 0.000 description 1
- 101000868629 Homo sapiens Cell cycle progression protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001060231 Homo sapiens F-box/WD repeat-containing protein 7 Proteins 0.000 description 1
- 101001028251 Homo sapiens FAST kinase domain-containing protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001112118 Homo sapiens NADPH-cytochrome P450 reductase Proteins 0.000 description 1
- 206010020460 Human T-cell lymphotropic virus type I infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 101001042049 Human herpesvirus 1 (strain 17) Transcriptional regulator ICP22 Proteins 0.000 description 1
- 101000999690 Human herpesvirus 2 (strain HG52) E3 ubiquitin ligase ICP22 Proteins 0.000 description 1
- 241000243251 Hydra Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000563 Hyperlipoproteinemia Type II Diseases 0.000 description 1
- 206010020983 Hypogammaglobulinaemia Diseases 0.000 description 1
- 101150027427 ICP4 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000003781 Inhibitor of growth protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000191 Inhibitor of growth protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000005755 Intercellular Signaling Peptides and Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010070716 Intercellular Signaling Peptides and Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- LZDNBBYBDGBADK-UHFFFAOYSA-N L-valyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 LZDNBBYBDGBADK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005090 Lethal Genes Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102100024640 Low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 108010038049 Mating Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100261636 Methanothermobacter marburgensis (strain ATCC BAA-927 / DSM 2133 / JCM 14651 / NBRC 100331 / OCM 82 / Marburg) trpB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 201000005979 Muir-Torre Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108700005084 Multigene Family Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 241000341511 Nematodes Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 241001028048 Nicola Species 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 108010058765 Oncogene Protein pp60(v-src) Proteins 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 102000000470 PDZ domains Human genes 0.000 description 1
- 108050008994 PDZ domains Proteins 0.000 description 1
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 101100124346 Photorhabdus laumondii subsp. laumondii (strain DSM 15139 / CIP 105565 / TT01) hisCD gene Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000881705 Porcine endogenous retrovirus Species 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020471 RNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 108700025701 Retinoblastoma Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 102000014400 SH2 domains Human genes 0.000 description 1
- 108050003452 SH2 domains Proteins 0.000 description 1
- 102000000395 SH3 domains Human genes 0.000 description 1
- 108050008861 SH3 domains Proteins 0.000 description 1
- 101100059543 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) CDC53 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100383104 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GAB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000242678 Schistosoma Species 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 206010043189 Telangiectasia Diseases 0.000 description 1
- 102100028644 Tenascin-R Human genes 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 208000002903 Thalassemia Diseases 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 241000287433 Turdus Species 0.000 description 1
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 206010045261 Type IIa hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 102100022596 Tyrosine-protein kinase ABL1 Human genes 0.000 description 1
- 101710098624 Tyrosine-protein kinase ABL1 Proteins 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036029 Uterine contractions during pregnancy Diseases 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000011256 aggressive treatment Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 230000000181 anti-adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- OGBVRMYSNSKIEF-UHFFFAOYSA-L benzyl-dioxido-oxo-$l^{5}-phosphane Chemical compound [O-]P([O-])(=O)CC1=CC=CC=C1 OGBVRMYSNSKIEF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- VJYIFXVZLXQVHO-UHFFFAOYSA-N chlorsulfuron Chemical compound COC1=NC(C)=NC(NC(=O)NS(=O)(=O)C=2C(=CC=CC=2)Cl)=N1 VJYIFXVZLXQVHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 206010011005 corneal dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000007878 drug screening assay Methods 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N ecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H]([C@H](O)CCC(C)(C)O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N 0.000 description 1
- 210000001705 ectoderm cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 1
- 210000004039 endoderm cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005183 environmental health Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 201000001386 familial hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 1
- 230000009969 flowable effect Effects 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 238000012203 high throughput assay Methods 0.000 description 1
- 101150113423 hisD gene Proteins 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000009001 hormonal pathway Effects 0.000 description 1
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000009390 immune abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 210000005061 intracellular organelle Anatomy 0.000 description 1
- 244000000056 intracellular parasite Species 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 101710130522 mRNA export factor Proteins 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- SKEFKEOTNIPLCQ-LWIQTABASA-N mating hormone Chemical compound C([C@@H](C(=O)NC(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCS(C)=O)C(=O)NC(CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CN=CN1 SKEFKEOTNIPLCQ-LWIQTABASA-N 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 101150024228 mdm2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 230000002175 menstrual effect Effects 0.000 description 1
- 230000005906 menstruation Effects 0.000 description 1
- 210000001704 mesoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012775 microarray technology Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 229960003248 mifepristone Drugs 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036456 mitotic arrest Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 229940125645 monoclonal antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000004412 neuroendocrine cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000002974 pharmacogenomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQVCCPGCDUSGOE-UHFFFAOYSA-N phenylarsine oxide Chemical compound O=[As]C1=CC=CC=C1 BQVCCPGCDUSGOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004214 philadelphia chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000000206 photolithography Methods 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 235000008476 powdered milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 230000009993 protective function Effects 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 1
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000009712 regulation of translation Effects 0.000 description 1
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 1
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000013391 scatchard analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000036299 sexual function Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 1
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- YZHUMGUJCQRKBT-UHFFFAOYSA-M sodium chlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)=O YZHUMGUJCQRKBT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 238000013179 statistical model Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 108010038751 tax Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 208000009056 telangiectasis Diseases 0.000 description 1
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 1
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 1
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 1
- 108010020387 tenascin R Proteins 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 238000012090 tissue culture technique Methods 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 230000007838 tissue remodeling Effects 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000563 toxic property Toxicity 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 230000037426 transcriptional repression Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 1
- 101150081616 trpB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150111232 trpB-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 239000000225 tumor suppressor protein Substances 0.000 description 1
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- QAOHCFGKCWTBGC-UHFFFAOYSA-N wybutosine Natural products C1=NC=2C(=O)N3C(CCC(NC(=O)OC)C(=O)OC)=C(C)N=C3N(C)C=2N1C1OC(CO)C(O)C1O QAOHCFGKCWTBGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAOHCFGKCWTBGC-QHOAOGIMSA-N wybutosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)N3C(CC[C@H](NC(=O)OC)C(=O)OC)=C(C)N=C3N(C)C=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O QAOHCFGKCWTBGC-QHOAOGIMSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/08—Bronchodilators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/12—Keratolytics, e.g. wart or anti-corn preparations
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
- A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
- A61P27/12—Ophthalmic agents for cataracts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/16—Otologicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/10—Antimycotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Neurology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Oncology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Immunology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Hematology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
Abstract
本発明は、ヒト細胞周期および細胞増殖タンパク質(CCYPR)と、CCYPRを同定及びコードするポリヌクレオチドとを提供する。本発明はまた、発現ベクター及び宿主細胞、抗体、アゴニスト、アンタゴニストを提供する。更に、本発明は、CCYPRの発現に関連する疾患の診断・治療・予防方法を提供する。The present invention provides human cell cycle and cell growth proteins (CCYPR) and polynucleotides that identify and encode CCYPR. The invention also provides expression vectors and host cells, antibodies, agonists, antagonists. Further, the present invention provides a method for diagnosing, treating, and preventing a disease associated with the expression of CCYPR.
Description
【0001】
(技術分野)
本発明は、細胞周期及び細胞増殖タンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列に関し、また、免疫異常、発達障害、細胞シグナル伝達の障害、および癌を含む細胞増殖異常の診断・治療・予防におけるこれらの配列の利用に関する。
【0002】
(発明の背景)
細胞分裂は、すべての生物の成長および生殖における基本的なプロセスである。酵母や細菌などの単細胞生物では、細胞が分裂すると生物の数が2倍になる。ところが、多細胞生物は、損耗やプログラム細胞死によって失われた細胞を補充するため、また細胞分化して新しい組織や器官を形成するために何度も細胞分裂する必要がある。細胞分裂周期の細部は変動するが、基本的なプロセスは3つの主な現象からなる。第一の現象である静止期では、細胞分裂の準備、DNAの複製、必須タンパク質の合成が行われる。第2の現象である有糸分裂期では、核の成分が分裂して細胞の相反する両端に分かれる。最後の現象である細胞質分裂期では、細胞質の分裂及び核分裂が起こる。細胞周期の移行の進行やタイミングは、細胞周期調節系の制御下にある。この細胞周期調節系は、様々なチェックポイントにおいて正または負の調節回路を制御する。
【0003】
有糸分裂期は静止期の終わりを告げ、その後に細胞質分裂期が始まる。有糸分裂には4つの段階があり、核分裂の前期、中期、後期、および終期の順で起こる。核分裂前期では、微小管やダイニンなどの関連タンパク質からなる両極紡錘体が極性分裂センターを起点に形成される。分裂中期では、核となる成分が凝縮し、紡錘体への物理的な付着を助ける動原体線維が成長する。分裂後期では、核成分が紡錘体に沿った相反する両極へ移動する。分裂終期では、核成分の動原体線維及び紡錘体が消滅する。有糸分裂は、多数のタンパク質の相互作用に依存する。例えば、キイロショウジョウバエのzw10遺伝子における突然変異によって、染色体の分離が起こらなくなることが分かった。ZW10タンパク質は、分裂後期の開始時に動原体において張力検出チェックポイントとして働くと思われる。ZW10タンパク質はまた、ダイニンの動原体への補充において、また後期開始時の染色体の分離および/または極への移動の調整におけるダイニンの関与において、直接的な役割を果たしていると思われる(Starr, D. A. 他 (1998)J. Cell Biol. 142: 763−774)。
【0004】
制御下の細胞周期の進行は、成長調節経路と基本的な細胞周期機構とによって決まる。細胞周期制御因子は、過剰に分泌された場合に酵母交配ホルモン経路における細胞周期阻止シグナルをブロック或いは活性化するヒトcDNA及び酵母cDNAを選択することによって同定された。既知の制御因子には、阻止シグナルをブロックするCDC91を含む酵母CDC(細胞分裂調節)遺伝子や、CPR8およびCPR2などのヒトCPR(細胞周期進行回復)遺伝子がある。CPR遺伝子は、サイクリン、癌抑制遺伝子結合タンパク質、シャペロン、転写因子、翻訳因子、およびRNA結合タンパク質を含む様々なタンパク質がある(Edwards, M. C. 他 (1997) Genetics 147: 1063−1076)。
【0005】
ヒトCDCタンパク質であるCDC23は、分裂中期から分裂後期への移行において機能し、また有糸分裂から外れる際にも機能するS. cerevisiaeタンパク質CDC23に相同である(Zhao, N. 他 (1998) Genomics 53: 184−190)。C. elegans遺伝子cullin−1(cull)は、細胞周期の負の制御因子である。cullはG1期からS期への移行を調節する。cullが突然変異したC. elegans では、有糸分裂阻止のオーバーライドによってこの移行が加速され、すべての組織において過形成が起こる。cullは、S. cerevisiae、線虫、およびヒトにまたがる保存された遺伝子ファミリーのメンバーである(Kipreos, E. T. 他 (1996) Cell 85: 929−839)。
【0006】
細胞が有糸分裂に入ることや有糸分裂から外れることを含む幾つかの細胞周期の移行は、サイクリン依存性キナーゼ(Cdks)の活性化および抑制に依存する。Cdkは、キナーゼサブユニットであるCdkと活性化サブユニとであるサイクリンとからなる複合体であり、様々なレベルの制御を受ける。Saccharomyces cerevisiae および Schizosaccharomyces pombeには一種類のCdkが存在するのみであるが、多細胞生物には多数の分化したCdkが存在する。サイクリンが、サイクリン依存性プロテインキナーゼに結合して活性化させ、次に有糸分裂プロセスに関与する選択されたタンパク質がリン酸化されて活性化する。Cdk−サイクリン複合体は、リン酸化及び標的分解によって正及び負の両方に制御される。この標的分解にはCDC4やCDC53などの分子が関与する。加えて、Cdkは、特異性や制御因子へのアクセスを変えるインヒビターやSuc1などのタンパク質への結合によって制御される(Patra, D. and W. G. Dunphy (1996) Genes Dev. 10: 1503−1515; and Mathias, N. 他 (1996) Mol. Cell Biol. 16: 6634−6643)。
【0007】
生殖
オスおよびメスの生殖系は複雑であり、成長および発達の様々な点に関与する。オスおよびメスの生殖系の解剖学及び生理学についてはGuyton, A.C.を参照されたい((1991) Textbook of Medical Physiology, W. B. Saunders Co., Philadelphia PA, pp. 899−928)。
【0008】
オスの生殖系では、精子形成プロセスで精子が形成される。オスの生殖機能は、様々なホルモンによって制御される。これらのホルモンは副生殖器に作用し、細胞代謝、成長、及びその他の身体機能に関与する。
【0009】
下垂体前葉から放出された性腺刺激ホルモンによる刺激の結果として、思春期に精子形成が始まる。未成熟精子(精原細胞)は、減数分裂をして完全に成熟する前に有糸細胞分裂する。精巣から男性ホルモンが分泌される。最も多く存在するテストステロンは、未成熟精子の成長および分化、ならびに男性の体の男性性徴に必須である。生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)、黄体形成ホルモン(LH)、および卵胞刺激ホルモン(FSH)の3種類の他の男性ホルモンは性機能を制御する。
【0010】
子宮、卵巣、ファロピウス管、膣、および乳房から女性生殖系が構成される。卵巣から卵子が供給され、子宮で胎児が成長する。ファロピウス管および膣はそれぞれ、子宮の上部および底部に位置する副器官である。子宮および卵巣の両方はさらに、女性の生涯に渡る生殖能力の成長および喪失においても役割を果たす。乳房の主な機能は乳汁分泌である。卵巣、子宮、脳下垂体、視床下部、副腎、およびその他の組織からの多数の内分泌シグナルによって、生殖および乳汁分泌が調整される。これらのシグナルは、月経周期および女性の生涯に渡って変化する。同様に、これらの内分泌信号に対する生殖器官の感受性も女性の生涯に渡って変化する。
【0011】
卵巣、脳下垂体、および視床下部に対する正および負のフィードバックの組合わせによって、毎月の排卵周期および子宮内膜周期における生理学的な変化が制御される。下垂体前葉は、卵胞刺激ホルモン(FSH)および黄体形成ホルモン(LH)の二種類の主な性腺刺激ホルモンを分泌する。これらのホルモンの分泌は、卵巣エストラジオールとしてよく知られているステロイドの負のフィードバックによって制御される。受精が起こらない場合は、エストロゲンおよびプロゲステロンのレベルが低下する。この卵巣ホルモンの突然の低下によって、月経即ち子宮内膜の薄利が起こる。
【0012】
ホルモンはさらに、妊娠、分娩、乳汁分泌、および閉経の全てのステップを司る。妊娠中は、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG)、エストロゲン、プロゲステロン、およびヒト絨毛性ソマトマンモトロピン(hCS)が胎盤で大量に生成される。また、黄体形成ホルモンに類似の糖タンパク質であるhCGが、卵子が受精しなかった場合とは異なって、黄体を刺激してエストロゲンおよびプロゲステロンを生成し続ける。hCSは、成長ホルモンに類似しており、胎児の栄養のために極めて重要である。
【0013】
女性の乳房もまた妊娠中に成熟する。胎盤から分泌される大量のエストロゲンによって乳汁管系の成長および枝分かれが始まり、脳下垂体から分泌されるプロラクチンによって乳汁の分泌が始まる。
【0014】
分娩には、妊娠を終了させるべく子宮収縮を増大させるいくつかのホルモン(後述する)の変化が関係する。エストロゲンのレベルは、プロゲステロンのレベルより上昇する。オキシトシンが神経下垂体から分泌される。同時に、オキシトシンに対する子宮の感受性も上昇する。胎児自体も、オキシトシン、コルチゾル(副腎から)、およびプロスタグランジンを分泌する。
【0015】
閉経は、卵胞の殆どが退縮してから起こる。次に、卵巣でのエストラジオールの生成量が低下し、脳下垂体および視床下部における負のフィードバックが減少する。排卵性周期が続いても、循環中のFSH及びLHの平均レベルは上昇する。したがって、ゴナドトロピンに対する卵巣の応答性が低下し、月経周期の間隔が長くなる。それに続いて、月経時の出血量が減少し、生殖能力が失われる。
【0016】
分化および増殖
組織の成長には、細胞増殖、細胞分化、及びアポトーシスの複雑かつ規則的なパターンが必要である。細胞増殖は、細胞の数および細胞の空間的な構成を維持するべく制御されなければならない。この制御は、成長因子やマイトジェンなどの細胞外シグナル、およびDNA損傷や栄養飢餓などの細胞内のキュー(手がかり)に応答して細胞周期の進行を制御するタンパク質の適正な発現に依存する。細胞周期の進行を直接或いは間接的に調節する分子は幾つかの群に分類される。その群の中には、成長因子およびそれらの受容体、セカンドメッセンジャーおよびシグナル伝達タンパク質、癌遺伝子産物、癌抑制タンパク質、および有糸分裂促進因子が含まれる。
【0017】
胚形成は、固有のタンパク質発現パターンが適正な発達を制御するプロセスである。このプロセスには、それぞれが固有かつ高度に協調的な発現パターンをもつ多数のタンパク質が関与する。例えば、マウスにおいて、2つの関連するMsg1およびMrg1の一時的に制御された発現が正常な胚発達に必要である。Msg1は発達中の中胚葉の後部領域で発現し、一方、Mrg1は前部内胚葉で発現する。胚形成中において、各タンパク質が適正に協調されて発現することが、組織や器官の適切な形成にとって必須である(Dunwoodie, S. L. 他 (1998) Mech. Dev. 72: 27−40)。
【0018】
成長因子は初め、細胞増殖の促進に必要な血清因子であると報告された。大抵の成長因子は、局所環境において細胞に作用する大きな分泌ポリペプチドである。成長因子は、特定の細胞表面受容体に結合してそれを活性化し、それによって細胞内シグナル伝達カスケードが始まる。多くの成長因子受容体は、リガンドと結合すると自己リン酸化する受容体チロシンキナーゼに分類される。自己リン酸化によってこれらの受容体は、SH2またはSH3ドメイン(Src相同領域2または3)の存在によって特徴付けられるシグナル伝達タンパク質と相互作用するようになる。次に、これらのタンパク質は、GTPアーゼ活性化タンパク質(GAP)、グアニンヌクレオチド放出タンパク質(GNRP)、およびその他のグアニンヌクレオチド交換因子とともに、Ras、Rab、及びRhoなどの低分子量Gタンパク質の活性状態を調節する。低分子量Gタンパク質は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPキナーゼ)カスケードなどの他の下流の現象を活性化する分子スイッチとして作用する。MAPキナーゼは最終的には、有糸分裂促進因子の転写を活性化する。
【0019】
成長因子に加えて小さなシグナル伝達ペプチドおよびホルモンもまた細胞増殖に影響を及ぼす。これらの分子は、別のクラスの受容体である三量体Gタンパク質結合受容体(GPCR)と初めに結合する。このGPCRは、免疫細胞、神経細胞、および神経内分泌細胞の表面に主に見られる。リガンドが結合すると、GPCRが三量体Gタンパク質を活性化し、それによってホスホリパーゼC、Ca2+、およびサイクリックAMPなどの細胞内セカンドメッセンジャーのレベルが上昇する。大抵のGPCR仲介性シグナル伝達経路は、直接的な分裂促進効果を有する他のシグナル伝達分子を分泌したり、分解したりすることによって間接的に細胞増殖を促進する。これらのシグナル伝達カスケードは、キナーゼ及びホスファターゼの活性化を含む場合が多い。トランスフォーミング成長因子β(TGF−β)ファミリーの幾つかのメンバーなどのある種の成長因子は、ある種類の細胞には細胞増殖を刺激し、別の種類の細胞には細胞増殖を抑制するように作用する。成長因子はまた、ある濃度である細胞を刺激し、別の濃度でその同じ細胞を抑制しうる。殆どの成長因子はまた、細胞の成長や分裂を調節する以外に様々な働きをもち、状況によって細胞の増殖、生存、分化、遊走、または機能を調節しうる。例えば、腫瘍壊死因子/神経成長因子(TNF/NGF)ファミリーは、細胞増殖や分化の制御はもちろん、細胞死を促進したり抑制したりする。細胞の応答は、表面の受容体が刺激を受けた細胞の種類、細胞の分化やトランスフォーメーションの段階、および細胞に作用する刺激の種類に依る(Smith, A. 他 (1994) Cell 76: 959−962; and Nocentini, G.他 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 6216−6221)。
【0020】
ある組織における隣接する細胞は、成長因子のために競合し、潅流系において無制限の量が供給されると、細胞分裂が濃度依存的に抑制されるまで成長して細胞濃度が上昇する。細胞はまた、細胞分裂の足場依存性を示す場合も多い。この足場依存性は、細胞骨格を細胞外マトリックス(ECM)に連結する接着域の形成に関連しうる。ECM成分の発現は、成長因子によって刺激される。例えば、TGF−βは線維芽細胞を刺激して、フィブロネクチン、コラーゲン、およびテネイシンを含む様々なECMタンパク質を生成する(Pearson, C. A. 他 (1988) EMBO J. 7: 2977−2981)。実際、ある種の細胞型の場合、ラミニンやフィブロネクチンなどの特定のECM分子が、成長因子として作用しうる。成長中の神経組織及び傷害を受けた神経組織で発現するテネイシン−C及びテネイシン−Rはそれぞれ、刺激/抗接着特性及び抑制特性を軸索にその成長において与える(Faissner, A. (1997) Cell Tissue Res. 290: 331−341)。
【0021】
癌および免疫異常は無制限の細胞増殖によって特徴付けられる。癌は、正常な細胞の遺伝子に由来する癌遺伝子の活性化に関連する。これらの癌遺伝子は、正常な細胞を悪性細胞に変える腫瘍タンパク質をコードする。ある種の腫瘍タンパク質は正常なタンパク質の突然変異型アイソフォームであり、また、別の腫瘍タンパク質は、異常な部位や異常な発現量で発現される。後者に属する腫瘍タンパク質は、細胞増殖の転写調節を変えて癌を引き起す。5つのクラスの腫瘍タンパク質が、細胞周期の調節に影響を及ぼすとして知られている。これらのクラスには、成長因子、成長因子受容体、細胞内シグナル伝達物質、核転写因子、および細胞周期調節タンパク質が含まれる。ウイルス癌遺伝子は、あるウイルスがヒトの細胞に感染した後ヒトゲノムの中に組み込まれる。ウイルス癌遺伝子には、v−src、v−abl、およびv−fpsが含まれる。ある種の細胞増殖異常は、細胞周期によって通常は細胞増殖の進行を調節するタンパク質複合体の変化によって同定されうる。主な治療方法には、細胞周期の調節に関与するタンパク質を操作することによって、細胞周期進行における調節を回復させることが含まれる(Nigg, E. A. (1995) BioEssays 17: 471−480)。
【0022】
多数の癌遺伝子が同定され、その特徴が明らかにされた。その中には、sis、erbA、erbB、her2、突然変異型のGδ、src、abl、ras、crk、jun、fos、mycや、RB、p53、mdm2、Cipl、pi 6、およびサイクリンDなどの突然変異型癌抑制遺伝子が含まれる。正常な遺伝子の癌遺伝子への形質転換は、染色体転座によっても起こりうる。慢性骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病の亜集団の特徴であるPhiladelphia染色体は、癌原遺伝子であるc−ablの切断部分が第22染色体のブレークポイントクラスター領域(bcr:breakpoint cluster region)に移動する第9染色体と第22染色体の相互転座によって生じる。
【0023】
癌遺伝子を過剰に活性化させる突然変異は細胞増殖につながる。成長因子によって細胞が刺激されると、初期応答遺伝子群と遅延型応答遺伝子(delayed−response gene)群の2群の遺伝子産物が活性化される。初期応答遺伝子産物には、myc、fos、およびjunが含まれ、それらすべてが遺伝子調節タンパク質をコードする。これらの調節タンパク質が、細胞周期制御因子であるCdkおよびサイクリンを含む遅延型応答遺伝子の転写を活性化させる。例えば、ヒトT細胞白血病ウイルスI型(HTLV−I:human T−cell leukemia virus type I)Taxトランス活性化因子タンパク質は、細胞内の転写因子の活性を促進させる初期応答遺伝子として作用する。Taxタンパク質の癌遺伝子の特性には、GTP結合タンパク質であるRasとの協働による一次Tリンパ球および線維芽細胞の形質転換が含まれる。近年、研究者によってTaxがいくつかのPDZ含有タンパク質と相互作用することが報告された。初めはショウジョウバエ癌抑制遺伝子Discs−Largeと呼ばれたPDZドメインは、膜タンパク質に共通し、成長因子シグナル伝達経路における受容体のクラスター化に関与していると考えられている(Rousset, R. 他 (1998) Oncogene 16: 643−654)。
【0024】
癌抑制遺伝子は細胞増殖の調節に関与する。癌抑制遺伝子の機能を低下或いは不全にする突然変異は、無制限の細胞増殖につながりうる。例えば、非リン酸化状態の網膜芽腫遺伝子産物(RB)は、いくつかの初期応答遺伝子に結合してそれらの転写を抑制し、それによって細胞分裂を阻止する。リン酸化すると、RBはこれらの初期応答遺伝子から離れるため、転写の抑制が解除されて細胞分裂が進行する。
【0025】
細胞増殖、分化、およびアポトーシスに関与するその他の遺伝子産物はまだ発見されていない。このような新規の分子の同定を助けるために現在用いられている方法では、静止状態の組織と増殖組織とを比較する。例えば、ヒト胎盤栄養膜細胞層の細胞の差引きハイブリダイゼーションのスクリーンによって、細胞増殖のEGF誘導によって発現レベルが上昇する20の遺伝子が同定された(Morrish, D. W. 他 (1996) Placenta 17: 431−441)。別の方法は、dithiolethionesなどの抗腫瘍化剤で処置した細胞で生成される分子の同定を含む。抗腫瘍化剤の保護作用は、癌抑制遺伝子産物の誘導に関連すると推定される(Primiano, T. 他 (1996) Carcinogenesis 17: 2297−2303)。
【0026】
別の例では、核タンパク質p33ING1をコードする候補癌抑制遺伝子ING1が、細胞増殖の負の制御に関与する。p33ING1の作用は、別の癌抑制遺伝子p53の活性に依存する。このp53遺伝子は、p33ING1の活性を必要とする細胞ストレス応答性遺伝子であり、細胞の成長の抑制を効果的に誘導する。p33ING1とp53が物理的に結合することが免疫沈降を用いた実験によって示された(Garkavtsev, I. 他 (1998) Nature 391: 295−298)。
【0027】
アポトーシス
アポトーシスは、不必要な細胞や欠損細胞をプログラム細胞死に導く遺伝子によって制御されるプロセスである。形態形成及び組織の再形成において、細胞の選択的な排除は、細胞増殖や分化と同様に重要である。アポトーシスが起こらないと、細胞増殖の増大に関連して過形成やその他の障害が起こりうる。アポトーシスはまた、免疫反応の重要な一部である。細胞障害性T細胞やナチュラルキラーなどの免疫細胞は、癌細胞およびウイルス感染細胞においてアポトーシスを誘導して疾患の拡大を防ぐ。さらに、外来分子と自己分子とを区別できない免疫細胞は、自己免疫反応が起こらないようにするべくアポトーシスによって排除されなければならない。
【0028】
アポトーシス細胞は、著しい形態変化を受ける。アポトーシスの顕著な特徴は、細胞の収縮、核および細胞質の凝縮、ならびに細胞膜の形態変化である。生化学的なアポトーシス細胞の特徴は、細胞内のカルシウム濃度の上昇、染色体DNAの断片化、および新しい細胞表面成分の発現である。
【0029】
アポトーシスの分子機構は高度に保存されている。これまでに多くの重要なタンパク質制御因子およびアポトーシスのエフェクターが同定された。アポトーシスは通常、細胞内に伝達され遺伝子発現パターンやタンパク質の活性を変化させるシグナルに応答して始まる。ホルモンやサイトカインなどのシグナル伝達分子は、細胞表面受容体と相互作用してアポトーシスを引き起こしたり、抑制したりすることが知られている。転写因子もまた、アポトーシスの開始に重要な役割を果たす。複数の下流のエフェクター分子、特にカスパーゼと呼ばれるシステインプロテアーゼなどのプロテアーゼが、細胞成分の分解および他のアポトーシスエフェクターの蛋白分解活性に関与する。
【0030】
老化及び老化現象
老化プロセスや老化現象の研究から幾つかの特徴的な細胞の変化および分子の変化が報告された(Fauci, A. S. 他 (1998) Harrison’s Principles of Internal Medicine, McGraw−Hill, New York NY, p. 37)。これらの特徴には、染色体構造の異常、DNAのクロスリンク、DNAの一本鎖の損傷、およびテロメア領域の分解の増大、ならびにDNAのメチル化の減少が含まれる。これらのDNAの変化に加えて、アミド分解、酸化、架橋結合、および非酵素的グリコシル化を含むタンパク質の翻訳後修飾等が増大する。さらに、構造の変質によって老化細胞のミトコンドリア内の分子に変化が起こる。これらの変化によって、最終的に体の各器官の機能が低下する。
【0031】
新たな複数の細胞周期及び細胞増殖タンパク質及びそれらをコードするポリヌクレオチドの発見によって、免疫異常、発達障害、細胞シグナル伝達の障害、および癌を含む細胞増殖異常の診断・治療・予防において有用な新規の組成物を提供することにより、当分野におけるニーズが満たされる。
【0032】
(発明の要約)
本発明は、総称して「CCYPR」、個別にはそれぞれ「CCYPR:1」、「CCYPR:2」、「CCYPR:3」、「CCYPR:4」、「CCYPR:5」、「CCYPR:6」、「CCYPR:7」、「CCYPR:8」、「CCYPR:9」、「CCYPR:10」、「CCYPR:11」、「CCYPR:12」、「CCYPR:13」、「CCYPR:14」、「CCYPR:15」、「CCYPR:16」、「CCYPR:17」、「CCYPR:18」、「CCYPR:19」、「CCYPR:20」、「CCYPR:21」、「CCYPR:22」、「CCYPR:23」、「CCYPR:24」、「CCYPR:25」、「CCYPR:26」、「CCYPR:27」、「CCYPR:28」、「CCYPR:29」、「CCYPR:30」、「CCYPR:31」、「CCYPR:32」、「CCYPR:33」、「CCYPR:34」、「CCYPR:35」、「CCYPR:36」、「CCYPR:37」、「CCYPR:38」、「CCYPR:39」、「CCYPR:40」、「CCYPR:41」、「CCYPR:42」、「CCYPR:43」、「CCYPR:44」、「CCYPR:45」、「CCYPR:46」、「CCYPR:47」、「CCYPR:48」、「CCYPR:49」、「CCYPR:50」、「CCYPR:51」、「CCYPR:52」、「CCYPR:53」、および「CCYPR:54」と呼ぶ細胞周期及び細胞増殖タンパク質である精製されたポリペプチドを提供する。本発明の一実施態様では、(a)SEQ ID NO:1乃至54(SEQ ID NO:1−54)からなる一群から選択されたアミノ酸配列と、(b)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、(c)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、(d)SEQ ID NO:1−54とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。別法では、SEQ ID NO:1−54のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【0033】
更に本発明は、(a)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列と、(b)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、(c)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、(d)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。別法では、このポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたポリペプチドをコードする。別法では、このポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:55−108からなる一群から選択される。
【0034】
更に、本発明は、(a)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列と、(b)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、(c)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、(d)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に結合されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドを提供する。別法では、本発明は、この組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を提供する。更なる別法では、本発明は、この組換えポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え生物を提供する。
【0035】
また、本発明は、(a)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列と、(b)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、(c)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、(d)SEQ ID NO:1−54とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドの生産方法を提供する。この方法は、(a)このポリペプチドの発現に好適な条件下で、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に結合されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養するステップと、(b)このように発現したポリペプチドを回収するステップとを含む。
【0036】
更に、本発明は、(a)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列と、(b)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、(c)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、(d)SEQ ID NO:1−54とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体を提供する。
【0037】
更に、本発明は、(a)SEQ ID NO:55−108からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と、(b)SEQ ID NO:55−108からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と70%以上の配列同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列と、(c)前記(a)に相補的なポリヌクレオチド配列と、(d)前記(b)に相補的なポリヌクレオチド配列と、(e)前記(a)乃至(d)のRNA等化物とで構成される一群から選択されたポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。別法では、このポリヌクレオチドは、少なくとも60個の連続するヌクレオチドを含む。
【0038】
更に本発明は、(a)SEQ ID NO:55−108からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と、(b)SEQ ID NO:55−108からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と70%以上の配列同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列と、(c)前記(a)に相補的なポリヌクレオチド配列と、(d)前記(b)に相補的なポリヌクレオチド配列と、(e)前記(a)乃至(d)のRNA等化物とで構成される一群から選択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプルにおいて検出する方法を提供する。この方法は、(a)前記サンプル内の標的ポリヌクレオチドと相補的な配列を構成する少なくとも20個の連続するヌクレオチドを含むプローブと前記サンプルをハイブリダイズさせるステップであって、前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片とでハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、前記プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする、該ステップと、(b)前記ハイブリダイゼーション複合体の存在するか否かを検出し、存在する場合には随意選択でその収量を測定するステップとを含む。別法では、前記プローブは、少なくとも60個の連続するヌクレオチドを含む。
【0039】
更に本発明は、(a)SEQ ID NO:55−108からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と、(b)SEQ ID NO:55−108からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と70%以上の配列同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列と、(c)前記(a)に相補的なポリヌクレオチド配列と、(d)前記(b)に相補的なポリヌクレオチド配列と、(e)前記(a)乃至(d)のRNA等化物とで構成される一群から選択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプルにおいて検出する方法を提供する。この方法は、(a)ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて、前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅するステップと、(b)増幅された前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在するか否かを検出し、存在する場合には随意選択でその収量を測定するステップとを含む。
【0040】
更に本発明は、(a)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列と、(b)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、(c)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、(d)SEQ ID NO:1−54とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含む効果的な量のポリペプチド及び好適な医薬用賦形剤を含む医薬組成物を提供する。一実施例では、SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含む医薬組成物を提供する。更に、本発明は、患者にこの医薬組成物を投与することを含む、機能的CCYPRの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【0041】
更に本発明は、(a)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列と、(b)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、(c)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、(d)SEQ ID NO:1−54とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドのアゴニストとして効果的な化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、(a)このポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、(b)このサンプルのアゴニスト活性を検出するステップとを含む。別法では、本発明は、この方法によって同定されたアゴニスト化合物と好適な医薬用賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、この医薬組成物の患者への投与を含む、機能的CCYPRの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【0042】
更に、本発明は、(a)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列と、(b)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、(c)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、(d)SEQ ID NO:1−54とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドのアンタゴニストとして効果的な化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、(a)このポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、(b)このサンプルのアンタゴニスト活性を検出するステップとを含む。別法では、本発明は、この方法によって同定されたアンタゴニスト化合物と好適な医薬用賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、この医薬組成物の患者への投与を含む、機能的CCYPRの過剰な発現に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【0043】
更に本発明は、(a)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列と、(b)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、(c)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、(d)SEQ ID NO:1−54とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、(a)このポリペプチドを好適な条件下で少なくとも1つの化合物と結合させるステップと、(b)このポリペプチドとこの試験化合物との結合を検出して、このポリペプチドと特異的に結合する化合物を同定するステップとを含む。
【0044】
更に本発明は、(a)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列と、(b)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、(c)SEQ ID NO:1−54からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、(d)SEQ ID NO:1−54とからなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。このスクリーニング方法は、(a)このポリペプチドを、その活性が許容される条件下で少なくとも1つの化合物と結合させるステップと、b)この試験化合物の存在下でのこのポリペプチドの活性を評価するステップと、(c)この試験化合物の存在下でのこのポリペプチドの活性と、この試験化合物の不在下でのこのポリペプチドの活性とを比較するステップとを含み、この試験化合物の存在下でのこのポリペプチドの活性の変化が、このポリペプチドの活性を調節する化合物の存在を示唆するという特徴を有する。
【0045】
更に本発明は、SEQ ID NO:55−108からなる一群から選択された配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を変化させるのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、(a)この標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、(b)この標的ポリヌクレオチドの発現の変化を検出するステップとを含む、該スクリーニング方法を提供する。
【0046】
本発明はさらに、試験化合物の毒性を評価する方法を提供する。この方法は、(a)核酸を含む生体サンプルを前記試験化合物で処置するステップと、(b)処置した前記生体サンプルの核酸をプローブとハイブリダイズするステップと、(c)ハイブリダイゼーション複合体の収量を測定するステップと、(d)前記処置した生体サンプルにおけるハイブリダイゼーション複合体の収量を、未処置の生体サンプルにおけるハイブリダイゼーション複合体の収量とを比較するステップとを含み、前記処置した生体サンプルにおけるハイブリダイゼーション複合体の収量の差異が試験化合物の毒性を示唆する。この方法における前記プローブは、(1)SEQ ID NO:55−108からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と、(2)SEQ ID NO:55−108からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と少なくとも70%の配列同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列と、(3)前記(1)に相補的なポリヌクレオチド配列と、(4)前記(2)に相補的なポリヌクレオチド配列と、(5)前記(1)乃至(4)のRNA等価物とで構成される一群から選択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの連続する少なくとも20個のヌクレオチドを含む。また、前記ハイブリダイゼーションは、前記プローブと前記生体サンプルの標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で行わる。また、前記標的ポリヌクレオチドが、(1)SEQ ID NO:55−108からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と、(2)SEQ ID NO:55−108からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と少なくとも70%の配列同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列と、(3)前記(1)に相補的なポリヌクレオチド配列と、(4)前記(2)に相補的なポリヌクレオチド配列と、(5)前記(1)乃至(5)のRNA等価物とを含む。代替的に前記標的ポリヌクレオチドは前記ポリヌクレオチド配列の断片である。
【0047】
(本発明の記載について)
本発明のタンパク質及び核酸配列、方法について説明する前に、本発明は、ここに開示した特定の装置及び材料、方法に限定されず、その実施形態を変更できることを理解されたい。また、ここで用いられる用語は、特定の実施例のみを説明する目的で用いられたものであり、後述の請求の範囲によってのみ限定され、本発明の範囲を限定することを意図したものではないということも理解されたい。
【0048】
本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その(この等)」は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って、例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体は含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。
【0049】
本明細書で用いた全ての科学技術用語は、別の方法で定義されていない限り、本発明の属する技術分野の一般的な技術者が普通に解釈する意味と同じである。本明細書で記述したものと類似、或いは同等の全ての装置及び材料、方法は本発明の実施及びテストに使用できるが、好適な装置及び材料、方法をここに記す。本明細書に記載の全ての文献は、本発明に関連して使用する可能性のある文献に記載された細胞系、プロトコル、試薬、ベクターを記述し開示するために引用した。従来の発明を引用したからと言って、本発明の新規性が損なわれると解釈されるものではない。
【0050】
(定義)
用語「CCYPR」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種(特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物)から得られる実質的に精製されたCCYPRのアミノ酸配列を指す。
【0051】
用語「アゴニスト」は、CCYPRの生物学的活性を強化したり、模倣する分子を指す。このアゴニストは、CCYPRに直接相互作用するか、或いはCCYPRが関与する生物学的経路の成分と作用して、CCYPRの活性を調節するタンパク質、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。
【0052】
用語「アレル変異配列」は、CCYPRをコードする遺伝子の別の形を指す。アレル変異配列は、核酸配列における少なくとも1つの変異によって生じ、変異mRNA若しくは変異ポリペプチドになり、これらの構造や機能は変わる場合もあれば変わらない場合もある。ある遺伝子は、天然型のアレル変異配列が存在しないもの、1つ或いは多数存在するものがある。一般にアレル変異配列を生じる変異は、ヌクレオチドの自然な欠失、付加、或いは置換による。これらの各変異は、単独或いは他の変異と同時に起こり、所定の配列内で一回或いはそれ以上生じる。
【0053】
CCYPRをコードする「変異」核酸配列は、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或いは置換が起こっても、CCYPRと同じポリペプチド或いはCCYPRの機能特性の少なくとも1つを備えるポリペプチドを指す。この定義には、CCYPRをコードするポリヌクレオチド配列の正常な染色体の遺伝子座ではない位置でのアレル変異配列との不適当或いは予期しないハイブリダイゼーション、並びにCCYPRをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或いは検出困難な多形性を含む。コードされたタンパク質も変異され得り、サイレント変化を生じCCYPRと機能的に等価となるアミノ酸残基の欠失、挿入、或いは置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にCCYPRの活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び/または両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。例えば、負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリシン及びアルギニンが含まれ得る。類似の親水性の値をもち極性非荷電側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニンが含まれ得る。類似の親水性の値をもち非荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、フェニルアラニン及びチロシンが含まれ得る。
【0054】
用語「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、或いはそれらの任意の断片を指し、天然の分子及び合成分子を含む。「アミノ酸配列」が天然のタンパク質分子の配列を指す場合、「アミノ酸配列」及び類似の用語は、アミノ酸配列を記載したタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【0055】
用語「増幅」は、核酸配列の複製物を作製することに関連する。一般に増幅は、この技術分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術によって行われる。
【0056】
用語「アンタゴニスト」は、CCYPRの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子である。アンタゴニストは、CCYPRに直接相互作用するか、或いはCCYPRが関与する生物学的経路の成分と作用して、CCYPRの活性を調節する抗体、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。
【0057】
用語「抗体」は、抗原決定基と結合可能なFab及びF(ab’)2、及びそれらの断片、Fv断片などの無傷の分子を指す。CCYPRポリペプチドと結合する抗体は、抗体を免疫する小ペプチドを含む無傷の分子またはその断片を用いて産生可能である。動物(例えば、マウス、ラット、若しくはウサギ)を免疫化するのに使用されるポリペプチド或いはオリゴペプチドは、RNAの翻訳から、或いは化学的に合成可能であり、必要に応じて担体タンパク質と結合させることも可能である。ペプチドと化学的に結合した一般に用いられる担体は、ウシ血清アルブミン、チログロブリン、及びキーホールリンペットヘモニアン(KLH)を含む。次ぎに、この結合したペプチドを用いて動物を免疫化する。
【0058】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の領域(即ちエピトープ)を指す。タンパク質或いはタンパク質の断片が、宿主動物を免疫化するのに用いられるとき、このタンパク質の種々の領域は、抗原決定基(タンパク質上の特定の領域或いは三次元構造体)に特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原決定基は、抗体と結合するために無傷の抗原(即ち、免疫応答を引き出すために用いられる免疫原)と競合し得る。
【0059】
本明細書において「アンチセンス」は、特定の核酸配列のセンス(コーディング)鎖と塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス成分には、DNAと、RNAと、ペプチド核酸(PNA)と、ホスホロチオネートやメチルホスホネート、ベンジルホスホネート(benzylphosphonate)などの修飾された骨格(backbone linkage)を有するオリゴヌクレオチドと、2’−メトキシエチル糖または2’−メトキシエトキシ糖などの修飾された糖を有するオリゴヌクレオチドと、5−メチルシトシンまたは2’−deoxyuracil、7−deaza−2’−deoxyguanosineなどの修飾された塩基を有するオリゴヌクレオチドを含み得る。アンチセンス分子は、化学合成や転写を含む任意の方法で作り出すことができる。相補的アンチセンス分子は、一度細胞に導入されると、細胞によって作られた天然の核酸配列と塩基対となって二重鎖を形成し、転写や翻訳を阻害する。「負」または「マイナス」という表現はアンチセンス鎖であり、「正」または「プラス」という表現はセンス鎖である。
【0060】
用語「生物学的に活性」は、天然分子の構造的、調節的、或いは生化学的な機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然或いは組換え体のCCYPR、合成のCCYPRまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【0061】
用語「相補的」は、塩基対合によってアニールする2つの一本鎖核酸配列間の関係を指す。例えば、配列「5’AGT3’」が相補的な配列「3’TCA5’」と対をなす。
【0062】
「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のアミノ酸配列を含む組成物」は広い意味で、所定のヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を含む任意の組成物を指す。この組成物は、乾燥した製剤或いは水溶液を含み得る。CCYPR若しくはCCYPRの断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることが可能である。ハイブリダイゼーションにおいて、プローブは、塩(例えば、NaCl)及び界面活性剤(例えば、SDS:ドデシル硫酸ナトリウム)、その他の物質(例えば、デンハート液、乾燥ミルク、サケ精子DNAなど)を含む水溶液に展開され得る。
【0063】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにDNA配列の解析を繰り返し行い、XL−PCRキット(PE Biosystems,Foster City CA)を用いて5’及び/または3’の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGELVIEW 断片構築システム(GCG, Madison, WI)またはPhrap (University of Washington, Seattle WA)等の断片構築用のコンピュータプログラムを用いて1つ或いはそれ以上の重複するcDNAやEST、またはゲノムDNA断片から構築された核酸配列を指す。伸長及び重複の両方によって構築されるコンセンサス配列もある。
【0064】
用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えない置換を指す。即ち、置換によってそのタンパク質の構造や機能が大きくは変わらず、そのタンパク質の構造、特にその機能が保存される。以下に、あるタンパク質の元のアミノ酸が別のアミノ酸に置換される保存的なアミノ酸置換を示す。
元の残基 保存的な置換
Ala Gly, Set
Arg His, Lys
Asn Asp, Gln, His
Asp Asn, Glu
Cys Ala, Ser
Gln Asn, Glu, His
Glu Asp, Gln, His
Gly Ala
His Asn, Arg, Gln, Glu
Ile Leu, Val
Leu Ile, Val
Lys Arg, Gln, Glu
Met Leu, Ile
Phe His, Met, Leu, Trp, Tyr
Ser Cys, Thr
Thr Ser, Val
Trp Phe, Tyr
Tyr His, Phe, Trp
Val Ile. Leu, Thr
一般に、保存されたアミノ酸置換の場合は、a)置換された領域のポリペプチドの骨格構造、例えば、βシートやαヘリックス高次構造、b)置換された部位の分子の電荷または疎水性、及び/または、c)側鎖の大半が維持される。
【0065】
用語「欠失」は、1個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列の変化、或いは1個以上のヌクレオチドが欠如する核酸配列の変化を指す。
【0066】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基、或いはアミノ基による水素の置換がある。誘導体ポリヌクレオチドは、自然分子(未修飾の分子)の生物学的或いは免疫学的機能の少なくとも1つを維持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドとは、もとのポリペプチドの生物学的機能、或いは免疫学的機能の少なくとも1つを維持する、グリコシル化、ポリエチレングリコール化、或いは任意の同様のプロセスによって修飾されたポリペプチドのことである。
【0067】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を生成し得る、ポリヌクレオチドやポリペプチドに共有結合或いは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。
【0068】
用語「断片」は、CCYPRまたはCCYPRをコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列(parent sequence)と同一であるがその配列より長さが短いものを指す。「断片」の最大の長さは、親配列から1つのヌクレオチド/アミノ酸残基を差し引いた長さである。例えば、ある断片は、5〜1000個の連続するヌクレオチド或いはアミノ酸残基を含む。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子、またはその他の目的に用いる断片は、少なくとも5、10、15、16、20、25、30、40、50、60、75、100、150、250若しくは500個の連続するヌクレオチド或いはアミノ酸残基の長さである。断片は、優先的に分子の特定の領域から選択される場合もある。例えば、ポリペプチド断片は、所定の配列に示された最初の250若しくは500のアミノ酸(或いは、ポリペプチドの最初の25%または50%)から選択された連続するアミノ酸の所定の長さを含み得る。これらの長さは一例であり、配列表及び表、図面を含む明細書に記載の任意の長さが、本発明の実施例に含まれ得る。
【0069】
SEQ ID NO:55−108の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、SEQ ID NO:55−108を明確に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を含む。SEQ ID NO:55−108のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術、またはSEQ ID NO:55−108を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用である。ある断片と一致するSEQ ID NO:55−108の正確な断片の長さや領域は、その断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に測定できる。
【0070】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも1つの翻訳開始コドン(例えばメチオニン)、それに続くオープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する配列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【0071】
「相同性」は、2つ以上のポリヌクレオチド配列間または2つ以上のポリペプチド配列間の配列類似性である。この配列類似性は配列同一性と言い換えることができる。
【0072】
SEQ ID NO:1−54のある断片は、SEQ ID NO:55−108のある断片によってコードされる。SEQ ID NO:1−54のある断片は、特異的にSEQ ID NO:1−54を同定する固有のアミノ酸配列の領域を含む。例えば、SEQ ID NO:1−54のある断片は、特異的にSEQ ID NO:1−54を認識する抗体の作製用の免疫原性ペプチドとして有用である。ある断片と一致するSEQ ID NO:1−54の正確な断片の長さや領域は、その断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に測定できる。
【0073】
用語「類似性」は相補性の程度を表す。これには、部分的類似性と完全な類似性とがある。用語「同一性」を「類似性」とも言える。同一の配列と標的の核酸とのハイブリダイゼーションが少なくとも部分的に阻止される部分的に相補的な配列は、「実質的に類似」と呼ばれる。完全に相補的な配列と標的の配列とのハイブリダイゼーションの阻止は、緩いストリンジェントな条件の下、ハイブリダイゼーションアッセイ(サザンブロッティング或いはノーザンブロッティング法、溶液ハイブリダイゼーション等)を用いて検査される。実質的に類似の配列或いはハイブリダイゼーションプローブは、緩いストリンジェントな条件の下、完全に類似(同一)の配列と標的の配列との結合に対して競合して抑制する。これは、緩いストリンジェントな条件下では非特異的な結合が許容されるということではなく、緩いストリンジェントな条件では、2つの配列の互いへの結合が特異的(即ち、選択的)に相互作用しなけらばならい。部分的な相補性ともいえない(例えば、30%未満の類似性或いは同一性)第2の標的配列を用いて、非特異的結合が存在しないことの検査が可能である。非特異的結合が存在しない場合は、実質的に類似配列或いはプローブが第2の非相補的標的配列とハイブリダイズしない。
【0074】
ポリヌクレオチド配列についての用語「パーセントの同一性」又は「%の同一性」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる、2つ以上のポリヌクレオチド配列間の一致する残基の百分率のことである。このようなアルゴリズムは、標準化され再現できる方法で、2つの配列間のアラインメントを最適化するべく、配列にギャップを挿入して、より意味をもつ2つの配列間の比較を行うことができる。
【0075】
ポリヌクレオチド配列間の同一性のパーセントは、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれるCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトパラメータを用いて決定可能である。このプログラムはLASERGENEソフトウェアパッケージの一部であり、分子生物学分析プログラム一式(DNASTAR, Madison WI)である。このCLUSTAL Vは、Higgins, D.G. 及び P.M. Sharp (1989) CABIOS 5:151−153、Higgins, D.G. 他 (1992) CABIOS 8:189−191に記載されている。ポリヌクレオチド配列の対のアライメントの場合、デフォルトパラメーターは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。「重み付けされた」残基重み付け表が、デフォルトとして選択された。同一性のパーセントは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列間の「類似性のパーセント」としてCLUSTAL Vによって報告される。
【0076】
別法では、一般に用いられ、無料で入手可能な配列比較アルゴリズム一式が、NCBI、Bethesda、MD、及びインターネット(http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)などから入手できるNational Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul, S.F. 他 (1990) J. Mol. Biol. 215:403−410)によって得られる。このBLASTソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いられる「blastn」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「BLAST 2 Sequences」と呼ばれるツールが入手可能であり、2つのヌクレオチド配列の対を直接比較するために用いられる。「BLAST 2 Sequences」は、http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.htmlにアクセスして、対話形式で利用ができる。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn 及び blastp(以下に記載)の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的には、デフォルトを設定するギャップ及び他のパラメーターと共に用いられる。例えば、2つのヌクレオチド配列を比較する場合、ある者は、デフォルトパラメータに設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (April−21−2000)でblastnを使用するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のようにする。
【0077】
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: −2
Open Gap: 5 及び Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop−off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で決められた、所定の配列の全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例えば、ある大きな所定の配列から得られた断片、例えば、連続する少なくとも、20または30、40、50、70、100、200のヌクレオチドの断片の長さに対して測定してもよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図面を含む明細書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセントが測定される長さを示すことができる。
【0078】
高い同一性を示さない核酸配列でも、遺伝子コードの縮重によって類似のアミノ酸配列をコードし得る。縮重を利用して核酸配列を変え、それぞれが実質的に同じタンパク質をコードする様々な核酸配列を作製できることを理解されたい。
【0079】
ポリペプチド配列に用いられる用語「パーセントの同一性」又は「%の同一性」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる2つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は周知である。アラインメント方法の中には、保存的なアミノ酸置換を考慮したものもある。詳細に上述したこのような保存的な置換は、一般に、置換部位の電荷や疎水性が保存され、ポリペプチドの構造(従って機能も)が保存される。
【0080】
ポリペプチド配列間の同一性のパーセントは、MEGALIGN バージョン3.12e配列アラインメントプログラム(上記)に組込まれるCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトパラメータを用いて決定可能である。CLUSTAL Vを用いる対方式のポリぺプチド配列のアライメントの場合、デフォルトパラメーターは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、及び「diagonals saved」=5と設定する。PAM250マトリクスが、デフォルトの残基重み付け表として選択される。ポリヌクレオチドアラインメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の同一性のパーセントは、「類似性のパーセント」としてCLUSTAL Vによって報告される。
【0081】
別法では、NCBI BLASTソフトウェア一式が用いられる。例えば、2つのポリペプチド配列を対で比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (Apr−21−2000)でblastpを使用するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のようにする。
【0082】
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 及び Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop−off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で決められた、所定のポリペプチド配列の全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例えば、ある大きな所定のポリペプチド配列から得られた断片、例えば、連続する少なくとも15、20または30、40、50、70、150の残基の断片の長さに対して測定してもよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図面を含む明細書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセントが測定される長さを示すことができる。
【0083】
「ヒト人工染色体(HAC)」は、約6kb(キロベース)〜10MbのサイズのDNA配列を含み得る、安定した有糸分裂染色体の分離及び維持に必要な全てのエレメントを含む直鎖状の小染色体である。
【0084】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【0085】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的なハイブリダイゼーションとは、2つの核酸配列が高い相同性を有することを意味する。アニーリングが許容される条件下で、特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成され、洗浄過程の後もハイブリダイズしたままである。洗浄過程は、ハイブリダイゼーションプロセスの厳密性即ちストリンジェント(stringency)の決定において特に重要であり、よりストリンジェントな条件では、非特異的な結合、即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合が減少する。核酸配列間のアニーリングが許容される条件は、当業者によって日常的に決定され、ハイブリダイゼーションの間は一定であるが、洗浄過程は、目的のストリンジェントにするためにその最中に条件の変更が可能であり、ハイブリダイゼーション特異性が得られる。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が68℃で、約6×SSC、約1%(w/v)のSDS、並びに約100μg/mlのせん断して変性したサケ精子DNAが含まれる。
【0086】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、洗浄過程を行う際の温度によっても左右される。この洗浄温度は通常、所定のイオン強度とpHにおける特定の配列の熱融点(Tm)より約5〜20℃低く選択される。このTmは、(所定のイオン強度とpHの下)標的の配列の50%が完全に一致するプローブとハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーションの条件は、周知であり、Sambrook, J. 他による, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版の1−3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY; 特に2巻の9章に記載されている。
【0087】
本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションでは、約0.2x SSC及び約1%のSDSの存在の下、約68℃で1時間の洗浄過程を含む。別法では、65℃、60℃、55℃、42℃の温度で行う。SSCの濃度は、約0.1%のSDSが存在の下、約0.1〜2x SSCの範囲である。通常は、ブロッキング試薬を用いて非特異的なハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング試薬には、例えば、約100〜200μg/mlの切断され変性したサケ精子DNAが含まれる。約35〜50%v/vの濃度のホルムアミドなどの有機溶剤が、例えば、RNAとDNAのハイブリダイゼーションなどの特定の場合に用いることができる。これらの洗浄条件の有用な改変は、当業者には周知である。特に高いストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド間の進化における類似性を示唆し得る。このような類似性は、それらのヌクレオチド及びコードされたポリペプチドが類似の役割を果たしていることを強く示唆する。
【0088】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によって、形成された2つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は溶液中(例えば、C0tまたはR0t分析)で形成されるか、或いは溶液中の1つの核酸配列と固体の支持物(例えば、紙、膜、フィルター、チップ、ピン、或いはスライドガラス、または細胞及びその核酸を固定する任意の適当な基板)に固定されたもう一つの核酸配列とで形成され得る。
【0089】
用語「挿入」或いは「付加」は、1個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。
【0090】
「免疫応答」は、炎症性疾患及び外傷、免疫異常、感染症、遺伝病などに関連する症状を指す。これらの症状は、細胞系及び全身防衛系に影響を及ぼすサイトカイン及びケモカイン、別の情報伝達分子などの様々な因子の発現という特徴をもつ。
【0091】
用語「マイクロアレイ」は、基質上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【0092】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物を指す。
【0093】
用語「変調」は、CCYPRの活性の変化を指す。例えば、変調によって、CCYPRのタンパク質活性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化が起こる。
【0094】
用語「核酸」及び「核酸配列」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、或いはそれらの断片を指し、一本鎖若しくは二本鎖であって、センス鎖或いはアンチセンス鎖であるゲノム起源若しくは合成起源のDNA或いはRNA、ペプチド核酸(PNA)、任意のDNA様物質、及びRNA様物質である。
【0095】
「機能的に結合した」は、第1の核酸配列と第2の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に結合している。一般に、機能的に結合したDNA配列は、同じ読み枠内で2つのタンパク質をコードする領域が結合する必要がある場合は、非常に近接或いは連続する。
【0096】
「ペプチド核酸(PNA)」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチド骨格に結合した、少なくとも約5ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子又は抗遺伝子剤を指す。この末端のリシンにより、この組成物が溶解性となる。PNAは、相補的な一本鎖DNAやRNAに優先的に結合して転写物の伸長を止め、ポリエチレングリコール化して細胞における寿命を延ばし得る。
【0097】
CCYPRの「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、蛋白分解性切断及びその他の当分野で既知の修飾を含まれ得る。これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、CCYPRの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なり得る。
【0098】
「プローブ」とは、同一配列或いはアレル核酸配列、関連する核酸配列の検出に用いる、CCYPRやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列のことである。プローブは、検出可能な標識またはレポーター分子が結合され単離されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドである。典型的な標識には、放射性アイソトープ及びリガンド、化学発光試薬、酵素がある。「プライマー」とは、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチドにアニーリング可能な、通常はDNAオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーがポリヌクレオチドにアニーリングした後、あるDNAポリメラーゼ酵素によって、標的のDNA一本鎖に沿って伸長される。プライマーの組は、例えば、PCR法における核酸配列の増幅(及び同定)に用いることができる。
【0099】
本発明に用いられるプローブ及びプライマーは、既知の配列の少なくとも15の連続するヌクレオチドを含む。特異性を高めるために、より長いプローブ及びプライマーが用いることも可能である。例えば、開示した核酸配列の連続する少なくとも20または25、30、40、50、60、70、80、90、100、150のヌクレオチドを含む。プローブ及びプライマーは、上記した例より相当長いものも用いることができ、本明細書の表及び図面、配列表に示された任意の長さのヌクレオチドも用いることができることを理解されたい。
【0100】
プローブ及びプライマーの準備及び使用方法については、例えば、Sambrook, J.他による、1989年、名称「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第2版の1−3巻(Cold Spring Harbor Press, Plainview NY)、またはAusubel, F.M. 他による、1987年、名称「Current Protocols in Molecular Biology」(Greene Pubi. Assoc. & Wiley−Intersciences, New York NY)、並びに Innis他による、1990年、名称「PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications」(Academic Press, San Diego CA.)を参照されたい。PCR用のプライマーの組は、例えば、Primer (Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA)などのそのような目的のためのコンピュータプログラムを用いて、ある既知の配列から引き出すことができる。
【0101】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは、当分野で周知のプライマー選択用のコンピュータプログラムで選択される。例えば、OLIGO 4.06ソフトウェアは、それぞれが最大100ヌクレオチドまでのPCR用のプライマーの対の選択、及び32,000塩基までの入力ポリヌクレオチド配列から最大5,000ヌクレオチドまでの大きなポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの分析に有用である。類似のプライマー選択用プログラムには、能力を拡大する追加の機能が含まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム(Genome Center at University of Texas South West Medical Center, Dallas TXより入手可能)は、メガベース配列から特定のプライマーを選択できるため、ゲノムワイドスコープ(genome−wide scope)におけるプライマーの設計に有用である。Primer3プライマー選択プログラム(Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research, Cambridge MA1より入手可能)によって、ユーザーは、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ(mispriming libaray)」を入力できる。また、Primer3は、特にマイクロアレイのオリゴヌクレオチドの選択に有用である(後の方の2つのプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれのソースから得ることができ、ユーザーのニーズを満たすように変更することもできる)。PrimerGenプログラム(UK Human Genome Mapping Project Resource Centre, Cambridge UK より入手可能)は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計するため、アラインメントされた核酸配列の最も保存された領域或いは最も保存されていない領域のどちらかとハイブリダイズするプライマーを選択することができる。従って、このプログラムは、固有及び保存されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドの断片の同定に有用である。上記した任意の選択方法で同定されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドの断片は、例えば、PCR法やシークエンシングプライマー、マイクロアレイエレメント、或いはサンプルの核酸の完全或いは部分的に相補的なポリヌクレオチドを同定する特定のプローブなどの、ハイブリダイゼーション技術に有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記した方法に制限されるものではない。
【0102】
本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、2つ以上の配列の離れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人工の組み合せは、化学合成によって作られる場合も多いが、前出のSambrook に記載されたような遺伝子工学の技術を用いて核酸の離れたセグメントを人工的に操作する方がより一般的である。この「組換え核酸」には、単に核酸の一部の追加または置換、欠失によって変更された核酸も含む。組換え核酸は、あるプロモーター配列に機能的に結合した核酸配列を含む場合もある。このような組換え核酸は、例えば、ある細胞を形質転換するのに用いられるベクターの一部であり得る。
【0103】
別法では、このような組換え核酸は、この組換え核酸を発現する哺乳動物のワクチン接種に用いると、その哺乳動物の防衛的な免疫応答を誘発する、ワクシニアウイルスに基づいたウイルスベクターの一部であり得る。
【0104】
「調節エレメント」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び5’及び3’の非翻訳領域(UTR)を含む。調節エレメントは、転写や翻訳、またはRNAの安定性を調節する宿主またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【0105】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いられる化学的または生化学的な部分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子及びその他の当分野で既知の成分が含まれる。
【0106】
本明細書において、DNA配列に対する「RNA等価物」とは、基準となるDNA配列と同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、窒素性塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖の背骨がデオキシリボースではなくリボースからなる。
【0107】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。CCYPRをコードする核酸若しくはその断片、CCYPR自体を含むと推定されるサンプルには、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶液中に存在する又は基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織又は組織プリント等も含まれ得る。
【0108】
用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、結合する分子によって認識される、例えば、抗原決定基つまりエピトープなどのタンパク質の特定の構造の存在によって左右される。例えば、抗体がエピトープ「A」に対して特異的である場合、結合していない標識した「A」及び抗体を含む反応液に、エピトープAを含むポリペプチド或いは結合していない無標識の「A」が存在すると、抗体と結合する標識Aの量が減少する。
【0109】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも約60%除去されたものであり、好ましくは約75%以上の除去、最も好ましいくは90%以上除去されたものを指す。
【0110】
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【0111】
用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビード、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。この基板には、壁または塹壕、ピン、チャンネル、細孔などの様々な表面形態があり、そこにポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【0112】
「転写イメージ」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。
【0113】
「形質転換」とは、外来DNAが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形質転換は、当分野で周知の種々の方法により、自然或いは人工の条件下で起こり得り、原核宿主細胞若しくは真核宿主細胞の中に外来核酸配列を挿入する任意の周知の方法によって行うことができる。この形質転換の方法は、形質転換される宿主細胞のタイプによって選択される。この方法には、バクテリオファージまたはウイルス感染、電気穿孔法(エレクトロポレーション)、リポフェクション、及び微粒子照射が含まれるが、これらに限定されるものではない。「形質転換された」細胞には、導入されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時間に一時的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【0114】
本明細書における「遺伝子組換え生物」とは、当分野で周知の遺伝子組換え技術などを用いて、人間が生物の1つ以上の細胞に異種の核酸を導入した任意の生物であり、動物及び植物を含むが、それらに限定されるものではない。微量注入や組換えウイルスに感染させるなどの慎重な遺伝子操作によって、細胞の前駆体に直接或いは間接的に異種核酸を細胞に導入する。「遺伝子操作」とは、典型的な交雑育種やin vitroでの受精ではなく、組換えDNA分子を導入することである。本発明に従った遺伝子組換え生物には、細菌及びラン藻類、菌類、植物、動物が含まれる。本発明の単離されたDNAは、当分野で周知の、例えば、感染、形質移入、形質転換、トランス接合(transconjugation)などの方法によって、宿主に導入することができる。本発明のDNAをそのような生物に導入する技術は周知であり、前出のSambrook他(1989)に記載されている。
【0115】
特定の核酸配列の「変異配列」とは、デフォルトパラメーター設定の「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9 (May−07−1999)を用いるblastnによって、ある核酸配列のある長さに対する該特定の核酸配列の同一性が、少なくとも40%と決定された核酸配列のことである。このような核酸の対は、ある長さにおいて、例えば、少なくとも50%または60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%、或いはそれ以上の同一性を示し得る。ある変異配列は、例えば、「アレル」変異配列(上述)または「スプライス」変異配列、「種」変異配列、「多型」変異配列と表すことができる。スプライス変異配列は基準分子と同一性が極めて高い可能性があるが、mRNAプロセッシング中のエキソンの択一的スプライシングによってポリヌクレオチドの数が多くなったり、少なくなったりする。対応するポリペプチドは、基準分子に存在する追加の機能ドメインを有したり、基準分子に存在するドメインが欠落したりし得る。種変異配列は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。得られるポリペプチドは、互いに高いアミノ酸同一性を有する。多型変異配列は、所定の種と種における特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が異なる。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の1つのヌクレオチドが異なる「1ヌクレオチド多型」(SNP)も含み得る。SNPの存在は、例えば、或る集団、病態、病態の性向を示唆し得る。
【0116】
特定のポリペプチド配列の「変異体」とは、デフォルトパラメーター設定の「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9 (May−07−1999)を用いるblastpによって、ある核酸配列のある長さに対する該特定のポリペプチド配列の同一性が、少なくとも40%と決定されたポリペプチド配列のことである。このようなポリペプチドの対は、ある長さにおいて、例えば、少なくとも50%または60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%、或いはそれ以上の同一性を示し得る。
【0117】
(発明)
本発明は、新規のヒト細胞周期及び細胞増殖タンパク質(CCYPR)及びCCYPRをコードするポリヌクレオチドの発見に基づいた、免疫異常、発達障害、細胞シグナル伝達の障害、および癌を含む細胞増殖異常の診断、治療、及び予防におけるそれらの組成物の使用に関する。
【0118】
表1は、CCYPRをコードする完全長のヌクレオチド配列の構築に用いたインサイト社クローンを示す。列1及び列2はそれぞれ、ポリペプチド配列及びヌクレオチド配列の配列番号(SEQ ID NO)を示す。列3は、各CCYPRをコードする核酸が同定されたIncyteクローンのクローンIDを示し、列4は、それらのクローンが単離されたcDNAライブラリを示す。列5は、Incyteクローン及びそれらに対応するcDNAライブラリを示す。cDNAライブラリが示されていないインサイト社クローンは、プールされたcDNAライブラリに由来する。列5に示されているインサイト社クローンは、各CCYPRのコンセンサスヌクレオチド配列の構築に用いられ、ハイブリダイゼーション技術における断片として有用である。
【0119】
表2の各列は、本発明の各ポリペプチドの様々な特性を示す。列1は配列番号(SEQ ID NO)、列2は各ポリペプチドにおけるアミノ酸残基の数、列3は潜在的なリン酸化部位、列4は潜在的なグリコシル化部位、列5はシグネチャ(signature)配列及びモチーフを有するアミノ酸残基、列6は、BLAST分析によって同定された相同配列、及び相当する引用を示す。また、引用することを持って本明細書のの一部とする。列7は、分析方法、場合によってはその分析方法が適用できる検索可能なデータベースを示す。列7の分析方法は、配列相同性及びタンパク質モチーフによって各ポリペプチドを特長つけるために用いられた。
【0120】
表3の列は、CCYPRをコードするヌクレオチド配列に関連した組織特異性及び疾患、異常症、症状を示している。表3の列1は、ヌクレオチドの配列番号(SEQ ID NO)を示している。列2は、列1のヌクレオチド配列の断片を示している。これらの断片は、例えば、SEQ ID NO:55−108を同定し、SEQ ID NO:55−108と関連するポリヌクレオチド配列とを区別する、ハイブリダイゼーション若しくは増幅の技術において有用である。これらの断片によってコードされるポリペプチドは、例えば、免疫原性ペプチドとして有用である。列3は、CCYPRを発現する組織名、及びCCYPRを発現する全組織におけるその割合を示す。列4は、CCYPRを発現する組織に関連する疾患若しくは異常症、症状、並びにCCYPRを発現する全組織におけるそれらの割合を示す。列5は、各cDNAライブラリのサブクローニングに用いたベクターを示す。SEQ ID NO:66が炎症組織で発現することに特に注目されたい。また、SEQ ID NO:76が主に神経組織で発現することにも注目されたい。
【0121】
表4の各列は、CCYPRをコードするcDNAのクローンが単離されたcDNAライブラリの作製に用いられた組織についての説明である。列1は、ヌクレオチドのSEQ ID NOを示し、列2はそれらのクローンが単離されたcDNAライブラリを示し、列3は列2のcDNAライブラリに対応する組織の由来及び詳細を示す。
【0122】
SEQ ID NO:61は、第5染色体の141.40〜142.60センチモルガンの範囲内にマッピングされる。この範囲には角膜ジストロフィー及び難聴に関連する遺伝子及び/またはESTも含まれる。
【0123】
SEQ ID NO:73は、第2染色体の73.80〜83.50センチモルガンの範囲内にマッピングされる。この範囲には遺伝非ポリープ性結腸直腸癌及びMuir−Torre症候群に関連する遺伝子及び/またはESTも含まれる。SEQ ID NO:74は、第19染色体の41.70〜58.70センチモルガンの範囲内にマッピングされる。SEQ ID NO:75は、第17染色体の62.90〜64.20センチモルガン範囲内にマッピングされる。この範囲には、ヒト乳癌(BRCA−1)遺伝子領域内にある遺伝子及び/またはESTも含まれる。SEQ ID NO:76は、第1染色体の143.30〜153.90センチモルガン、第3染色体の156.20〜160.00センチモルガン、及び第10染色体の112.80〜139.40センチモルガンの範囲内にマッピングされる。この第10染色体の112.80〜139.40センチモルガンの範囲には、伴性無ガンマロブリン血症に関連する遺伝子及び/またはESTも含まれる。
【0124】
SEQ ID NO:77は、第23染色体の173.60〜179.80センチモルガン及び第11染色体の136.90センチモルガンから長腕(q)末端までの範囲内にマッピングされる。SEQ ID NO:78は、第3染色体の200.00〜213.70センチモルガンの範囲内にマッピングされる。SEQ ID NO:81は、第7染色体の167.60センチモルガンから長腕(q)末端までの範囲内にマッピングされる。SEQ ID NO:90は、第2染色体の236.10〜240.20センチモルガン、第3染色体の16.50〜43.00センチモルガン、及び第6染色体の124.20〜126.50センチモルガンの範囲内にマッピングされる。SEQ ID NO:91は、第2染色体の22.40〜40.70センチモルガンの範囲内にマッピングされる。SEQ ID NO:98は、第8染色体の40.30〜60.00センチモルガンの範囲内にマッピングされる。SEQ ID NO:100は、第14染色体の95.50〜103.70センチモルガン及び第6染色体の158.50センチモルガンから長腕(q)末端までの範囲内にマッピングされる。SEQ ID NO:104は、第18染色体の32.40〜42.70センチモルガンの範囲内にマッピングされる。SEQ ID NO:105は、第19染色体の69.90〜81.20センチモルガンの範囲内にマッピングされる。
【0125】
本発明はまた、CCYPRの変異体も含む。好適なCCYPRの変異体は、CCYPRの機能的或いは構造的特徴の少なくともどちらか一方を有し、かつCCYPRアミノ酸配列に対して少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性、更には少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性を有する。
【0126】
本発明はまた、CCYPRをコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の実施例において、本発明は、CCYPRをコードするSEQ ID NO:55−108からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。配列表に示したSEQ ID NO:55−108のポリヌクレオチド配列は、窒素系塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖の背骨がデオキシリボースではなくリボースからなる等価RNA配列を含む。
【0127】
本発明はまた、CCYPRをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、CCYPRをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも70%のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも85%のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも95%ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定の実施形態は、SEQ ID NO:55−108からなる一群から選択された核酸配列と少なくとも70%のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも85%のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも95%ものポリヌクレオチド配列同一性を有するSEQ ID NO:55−108からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を提供する。上記したポリヌクレオチド変異配列は何れも、CCYPRの機能的或いは構造的特徴の少なくとも1つを有するアミノ酸配列をコードする。
【0128】
遺伝暗号の縮重により作り出され得るCCYPRをコードする種々のポリヌクレオチド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したがって本発明には、可能なコドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作り出され得る可能なポリヌクレオチド配列の変異の全てが含まれ得る。これらの組み合わせは、天然のCCYPRのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考慮する。
【0129】
CCYPRをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は一般に、好適に選択されたストリンジェントな条件下で、天然のCCYPRのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、非天然のコドンを含めるなどの実質的に異なった使い方のコドンを有するCCYPR或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作ることは有利となり得る。特定のコドンが宿主によって利用される頻度に基づいてコドンを選択して、ペプチドの発現が特定の真核細胞又は原核宿主に発生する割合を高めることが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、CCYPR及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、天然の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるRNA転写物を作ることにある。
【0130】
本発明はまた、CCYPR及びその誘導体をコードするDNA配列又はそれらの断片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、当分野で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れの中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、CCYPRまたはその任意の断片をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。
【0131】
更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特に、SEQ ID NO:55−108及びそれらの断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399−407; and Kimmel. A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507−511.を参照)。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載されている。
【0132】
当分野で周知のDNAのシークエンシング方法を用いて、本発明の何れの実施例も実行可能である。この方法には、例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、SEQUENASE(US Biochemical, Cleveland OH)、Taqポリメラーゼ(PE Biosystems, Foster City CA)、熱安定性T7ポリメラーゼ(Amersham, Pharmacia Biotech Piscataway NJ)、或いはELONGASE増幅システム(Life Technologies, Gaithersburg MD)にみられるような校正エキソヌクレアーゼとポリメラーゼとの組み合わせなどの酵素が用いられる。好ましくは、MICROLAB2200液体転移システム(Hamilton, Reno, NV)、PTC200 Thermal Cycler200(MJ Research, Watertown MA)及びABI CATALYST 800 (PE Biosystems) などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373或いは377 DNAシークエンシングシステム(PE Biosystems)、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム(Molecular Dynamics. Sunnyvale CA)または当分野で周知の他の方法を用いてシークエンシングを行う。得られた配列を当分野で周知の様々なアルゴリズムを用いて分析する(例えば、Ausubel, F.M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7; Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, pp. 856−853.を参照)。
【0133】
当分野で周知のPCR法をベースにした種々の方法で、部分的なヌクレオチド配列を利用して、CCYPRをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節エレメントなどの上流にある配列を検出する。例えば制限部位PCR法を利用する1つの方法では、一般的なプライマー及び入れ子プライマー(nested primer)を用いてクローニングベクター内のゲノムDNAから未知の配列を増幅する(例えば、Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic 2:318−322を参照)。逆PCR法を用いる別法では、広範な方向に伸長して環状化した鋳型から未知の配列を増幅するプライマーを用いる。この鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限断片に由来する(例えば、Triglia, T.等(1988)Nucleic Acids Res 16:8186を参照)。キャプチャPCR法を用いる第3の方法は、ヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接するDNA断片のPCR増幅を含む(例えば、Lagerstrom, M.他(1991)PCR Methods Applic 1:111−119を参照)。この方法では、多数の制限酵素による消化及びライゲ−ションを用いて、PCRを行う前に未知の配列の領域の中に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、当分野で周知の別の方法を用いて未知の配列を得ることも可能である。(例えば、Parker, J.D. 他 (1991)Nucleic Acids Res. 19:3055−3060を参照)。更に、PCR、ネスト化プライマー、PROMOTERFINDERライブラリ(Clontech, Palo Alto CA)を用いれば、ゲノムDNA内の歩行が可能である。この方法ではライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン/エキソン接合部を探すのに有用である。全てのPCR法をベースにした方法では、プライマーは、市販のOLIGO 4.06 Primer Analysis software(National Biosciences, Plymouth MN)或いは別の好適なプログラムなどを用いて、長さが22〜30ヌクレオチド、GC含量が50%以上、約68℃〜72℃の温度で鋳型に対してアニーリングするよう設計される。
【0134】
完全長のcDNAをスクリーニングする場合は、大きなcDNAを含むようにサイズが選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、オリゴd(T)ライブラリが完全な長さのcDNAを産生できない場合は、遺伝子の5’領域を有する配列を含むものが多いランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリが有用である。ゲノムライブラリは、5’非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【0135】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはPCR産物のヌクレオチド配列のサイズの分析、または確認が可能である。詳しくは、キャピラリーシークエンシングには、電気泳動による分離のための流動性ポリマー、及び4つの異なったヌクレオチドに特異的なレーザーで活性化される蛍光色素、放出された波長の検出に利用するCCDカメラを使用することが可能である。出力/光強度は、適切なソフトウェア(例えば、GENOTYPER及びSEQUENCE NAVIGATOR、PE Biosystems)を用いて電気信号に変換され、サンプルのローディングからコンピュータ分析までのプロセス及び電子データ表示がコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しない場合もあるDNAの小片のシークエンシングに特に適している。
【0136】
本発明の別の実施例では、CCYPRをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えDNA分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にCCYPR、その断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のDNA配列が作られ得り、これらの配列をCCYPRのクローン化及び発現に利用可能である。
【0137】
種々の目的でCCYPRをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び/または発現の調節が含まれるが、これらに限定されるものではない。ランダムな断片によるDNAの混合や遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドのPCR再組み立てを用いて、ヌクレオチド配列の組換えが可能である。例えば、オリゴヌクレオチド媒介性定方向突然変異誘発を利用して、新しい制限部位を生成する突然変異の導入、グリコシル化パターンの変更、コドン選択の変更、スプライスバリアントの作製等が可能である。
【0138】
本発明のヌクレオチドを、MOLECULARBREEDING (Maxygen Inc., Santa Clara CA; 米国特許第5,837,458号; Chang, C.−C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:793−797; Christians, F.C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:259−264; Crameri, A. 他 (1996) Nat. Biotechnol. 14:315−319)などのDNAシャフリング技術を用いてシャフリングして、CCYPRの生物学的または酵素的な活性、或いは他の分子や化合物と結合する能力などのCCYPRの生物学的特性を変更或いは改良することができる。DNAシャフリングは、PCR法による遺伝子断片の組換えで遺伝子変異体のライブラリを作製するプロセスである。次に、このライブラリを、目的の特性を有する遺伝子変異体を同定するために選択或いはスクリーニングする。これらの好ましい変異体をプールし、DNAシャフリング及び選択/スクリーニングを繰り返す。従って、人工的な育種及び急速な分子の進化によって多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムな位置に変異がある1つの遺伝子の断片を、目的の特性が最適化するまで、組換え及びスクリーニング、シャフリングを実施することもできる。別法では、所定の遺伝子の断片を、同じ或いは異なった種の同じ遺伝子ファミリーの相同な遺伝子の断片で組換え、それによってプロトコルに従った調節可能な方法で、多数の天然遺伝子の遺伝子多様性を最大にすることができる。
【0139】
別の実施例によれば、CCYPRをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である(例えば、Caruthers. M.H.等(1980)Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7:215−223; 及びHorn, T.他(1980)Nucl. Acids Res. Symp. Ser.225−232を参照)。別法として、化学的方法を用いてCCYPR自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、ペプチド合成は種々の固相技術を用いて実行可能である(例えば、Creighton, T. (1984) Proteins. Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY, pp. 55−60; Roberge, J.Y.等(1995) Science 269:202−204を参照)。また、合成の自動化は例えばABI 431Aペプチドシンセサイザー(PE Biosystems)を用いて達成し得る。更にCCYPRのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び/または化学的方法を用いた他のタンパク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドまたは変異体ポリペプチドを作製することが可能である。
【0140】
このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー(例えば、Chiez, R.M. 及び F.Z. Regnier (1990)Methods Enzymol. 182:392−421を参照)を用いて実質的に精製可能である。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸分析或いはシークエンシングにより確認することができる(例えば、Creighton、前出、pp28−53を参照)。
【0141】
生物学的に活性なCCYPRを発現させるために、CCYPRをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクターは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要なエレメントを含む。これらのエレメントには、ベクター及びCCYPRをコードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、5’及び3’の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。このようなエレメントは、その長さ及び特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、CCYPRをコードする配列のより効果的な翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、ATG開始コドン及びコザック配列などの近傍の配列が含まれる。CCYPRをコードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのATG開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれなければならない。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、自然及び合成の様々なものから得ることが可能である。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である。(例えば、Scharf, D. 他 (1994) Results Probl. Cell Differ. 201−18−162.を参照)。
【0142】
当業者に周知の方法を用いて、CCYPRをコードする配列、好適な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、in vitro組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術が含まれる。(例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4章及び8章, 及び16−17章; 及び Ausubel, F.M. 他. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, ch. 9章及び13章1−4章を参照)。
【0143】
種々の発現ベクター/宿主系を利用して、CCYPRをコードする配列の保持及び発現が可能である。これらには、限定するものではないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換された酵母菌や、ウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)または細菌発現ベクター(例えば、TiまたはpBR322プラスミド)で形質転換された植物細胞系や、動物細胞系などが含まれる(前出のSambrook、前出のAusubel、Van Heeke, G. and S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503−5509、Bitter, G.A.他 (1987) Methods Enzymol. 153:516−544; Scorer、C.A. ら (1994) Bio/Technology 12:18 1−184; Engelhard、E.K. 他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224−3227、Sandig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937−1945、タカマツ, N. (1987) EMBOJ. 6:307−311、Coruzzi, G. 他 (1984) EMBOJ. 3:1671−1680、Broglie, R. 他 (1984) Science 224:838−843、Winter, J. 他 (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85−105、『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY, pp.191−196、Logan, J. and T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655−3659、Harrington, J.J. 他 (1997) Nat. Genet. 15:345−355等を参照)。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ輸送することができる(Di Nicola, M. 他 (1998) Cancer Gen. Ther. 5(6):350−356、Yu, M. 他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(13):6340−6344、Buller, R.M. 他(1985) Nature 317(6040):813−815; McGregor, D.P. 他(1994) Mol. Immunol. 31(3):219−226、Verma, I.M. and N. Somia (1997) Nature 389:239−242等を参照)。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【0144】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、CCYPRをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、CCYPRをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、増殖には、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはpSPORT1プラスミド(GIBCO BRL)などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの多数のクローニング部位にCCYPRをコードする配列をライゲーションするとlacZ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更に、これらのベクターを用いて、クローニングされた配列のin vitroでの転写、ジデオキシンスクリーニング、ヘルパーファージによる一本鎖の救出、入れ子状態の欠失を作り出すことが可能である(例えば、Van Heeke, G.及びS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503−5509.を参照)。例えば、抗体の産生のためなどに多量のCCYPRが必要な場合は、CCYPRの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力に発現を誘発するT5またはT7バクテリオファージプロモーターを含むベクターを使用できる。
【0145】
CCYPRの発現に酵母の発現系の使用が可能である。α因子やアルコールオキシダーゼやPGHプロモーターなどの構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多種のベクターが、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはPichia pastorisに使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内への保持のどちらかを誘導し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込む。(例えば、上記のAusubel.; 及びBitter, G.A. 他 (1987) Methods Enzymol.153:51−794: Scorer. C. A. 他 (1994) Bio/Technology 121−181−184.を参照)
植物系もCCYPRの発現に使用可能である。CCYPRをコードする配列の転写は、例えば、CaMV由来の35S及び19Sプロモーターなどのウイルスプロモーターが単独で、或いはTMV(例えば、Coruzzi, 前出、Broglie, 前出、Winter, 前出を参照)由来のオメガリーダー配列と組み合わせて促進される。これらの作製物は、直接のDNA形質転換或いは病原体を介したトランスフェクションによって、植物細胞の中に導入可能である。(例えば、The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992)McGraw Hill NY, pp.191−196を参照)。
【0146】
哺乳動物細胞では、多種のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び3連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物/翻訳複合体にCCYPRをコードする配列を結合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のE1またはE3領域への挿入により、感染した宿主細胞にCCYPRを発現する生ウイルスを得ることが可能である(Logan, J.及びShenk, T.(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655−3659を参照)。さらに、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させることが可能である。タンパク質を高レベルで発現させるために、SV40またはEBVを基にしたベクターを用いることが可能である。
【0147】
ヒト人工染色体(HAC)を用いて、プラスミドで発現しそれに含まれているものより大きなDNAの断片を供給可能である。治療のために約6kb〜10MbのHACsを作製し、従来の輸送方法(リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル)で供給する。(例えば、Harrington. J.J. 他 (1997) Nat Genet.15:345−355.を参照)。
【0148】
哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞におけるCCYPRの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、CCYPRをコードする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。このような発現ベクターは、ウイルス起源の複製及び/または内在性の発現要素や、同じ或いは別のベクターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入の後、細胞を選択培地に移す前に、強化培地で約1〜2日の間増殖させる。選択マーカーの目的は選択的な媒介物に対する抵抗性を与えるとともに、その存在により導入された配列を確実に発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に好適な組織培養技術を用いて増殖可能である。
【0149】
任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収することが可能である。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ、それぞれtk−又はapr−細胞において使用される。(例えば、Wigler, M. 他 (1977) Cell 11:223−232; 及びLowy, I. 他(1980) Cell 22:817−823を参照)。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択のベースとして用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシッドネオマイシン及びG−418に対する耐性を与え、als或いはpatはクロルスルフロン(cCCYPRsulfuron)、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(phosphinotricin acetyltransferase)に対する耐性を与える(例えば、Wigler, M. 他. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567−3570; Colbere−Garapin, F. 他(1981) J. Mol. Biol. 150:1−14を参照)。さらに選択に利用できる遺伝子、例えば、代謝のために細胞が必要なものを変えるtrpB及びhisDが文献に記載されている(例えば、Hartman, S.C.及びR.C. Mulligan(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047−51を参照)。アニトシアニン、緑色蛍光タンパク質(GFP;Clontech)、βグルクロニダーゼ及びその基質GUS,ルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリンなどの可視マーカーが用いられる。緑色蛍光タンパク質(GFP)(Clontech, Palo Alto, CA)も使用できる。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能である(例えば、Rhodes, C.A.他(1995)Methods Mol. Biol. 55:121−131を参照)。
【0150】
マーカー遺伝子の発現の存在/不在によって目的の遺伝子の存在が示されても、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、CCYPRをコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、CCYPRをコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能である。または、1つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がCCYPRをコードする配列と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、通常タンデム遺伝子の発現も示す。
【0151】
一般に、CCYPRをコードする核酸配列を含み、CCYPRを発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。これらの方法には、DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーションや、PCR法、核酸或いはタンパク質の検出及び/または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0152】
特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるCCYPRの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。このような技法には、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、蛍光標示式細胞分取器(FACS)などがある。CCYPR上の2つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、2部位のモノクローナルベースイムノアッセイ(two−site, monoclonal−based immunoassay)が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びその他のアッセイは、当分野では十分に知られている。(例えば、 Hampton. R. 他.(1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul. MN, Sect. IV; Coligan, J. E. 他Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and Wiley−Interscience, New York. NY; 及びPound, J.D. (1990) Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ)。
【0153】
種々の標識技術及び結合技術が当業者には周知であり、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイに用いられ得る。CCYPRをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。別法として、CCYPRをコードする配列、またはその任意の断片をmRNAプローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。当分野では周知であり市販されているこのようなベクターを、T7,T3,またはSP6などの好適なRNAポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドの追加によって、in vitroでのRNAプローブの合成に用いることができる。これらの方法は、例えば、Amersham Pharmacia Biotech及びPromega(Madison WI)、U.S. Biochemical Corp(Cleveland OH)が市販する種々のキットを用いて行うことができる。容易な検出のために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、コファクター、インヒビター、磁気粒子、及び放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色素産生剤などが含まれる。
【0154】
CCYPRをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養される。形質転換された細胞から産生されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用されるその配列及び/またはそのベクターによる。CCYPRをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するCCYPRの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【0155】
更に、挿入した配列の発現調節能力または発現したタンパク質を所望の形にプロセシングする能力によって宿主細胞株が選択される。このようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化(lipidation)、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、標的タンパク質、折りたたみ及び/または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための特定の細胞装置及び特徴のある機構をもつ種種の宿主細胞(例えば、CHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38)がAmerican Type Culture Collection(ATCC; Bethesda, MD)より入手可能であり、外来のタンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にするために選択される。
【0156】
本発明の別の実施例では、CCYPRをコードする自然或いは変更された、または組換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラCCYPRタンパク質が、CCYPRの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分が、市販の親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。このような部分には、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、チオレドキシン(Trx)、カルモジュリン結合ペプチド(CBP)、6−His、FLAG、c−mc、赤血球凝集素(HA)が含まれるが、これらに限定されるものではない。GST及びMBP、Trx、CBP、6−Hisによって、固定されたグルタチオン、マルトース、フェニルアルシン酸化物(phenylarsine oxide)、カルモジュリン、金属キレート樹脂のそれぞれで同族の融合タンパク質の精製が可能となる。FLAG、c−mc、及び赤血球凝集素(HA)によって、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いた融合タンパク質の免疫親和性の精製ができる。また、CCYPRをコードする配列と異種タンパク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、CCYPRが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現と精製の方法は、Ausubel. (1995、前出 ch 10).に記載されている。市販されている様々なキットを用いて、融合タンパク質の発現及び精製を促進できる。
【0157】
本発明の別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系(Promega)を用いてin vitroで放射能標識したCCYPRの合成が可能である。これらの系は、T7またはT3、SP6プロモーターと機能的に結合したタンパク質をコードする配列の転写と翻訳をつなげる。翻訳は、例えば、35Sメチオニンである放射能標識されたアミノ酸前駆体の存在の下で起こる。
【0158】
本発明のCCYPRまたはその断片を用いて、CCYPRに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも1つまたは複数の試験化合物を用いて、CCYPRへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物の例には、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質(例えば受容体)または小分子が挙げられる。
【0159】
一実施例では、このように同定された化合物は、例えばリガンドやその断片などのCCYPRの天然のリガンド、または天然の基質、構造的または機能的な擬態性または自然結合パートナーに密接に関連している(Coligan, J.E. 他 (1991) Current Protocols in Immunology 1(2)の5章等を参照)。同様に、化合物は、CCYPRが結合する天然受容体、或いは例えばリガンド結合部位などの少なくとも受容体のある断片に密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物を合理的に設計することができる。一実施例では、このような化合物に対するスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてCCYPRを発現する好適な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、大腸菌からの細胞が含まれる。CCYPRを発現する細胞またはCCYPRを含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、CCYPRまたは化合物の何れかの結合、刺激または阻害を分析する。
【0160】
あるアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、結合を、フルオロフォア、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識により検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも1つの試験化合物を、溶液中の或いは固体支持物に固定されたCCYPRと結合させるステップと、CCYPRとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出及び測定を行うことができる。更にこのアッセイでは、細胞遊離剤、化学ライブラリまたは天然の生成混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定させる。
【0161】
本発明のCCYPRまたはその断片を用いて、CCYPRの活性を調整する化合物をスクリーニングすることが可能である。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト、或るいは部分的または逆アゴニスト等が含まれる。一実施例では、CCYPRが少なくとも1つの試験化合物と結合する、CCYPRの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、試験化合物の存在下でのCCYPRの活性が試験化合物不在下でのCCYPRの活性と比較する。試験化合物の存在下でのCCYPRの活性の変化は、CCYPRの活性を調整する化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物をCCYPRの活性に適した条件下でCCYPRを含むin vitroまたは細胞遊離系と結合させてアッセイを実施する。これらアッセイの何れかにおいて、CCYPRの活性を調整する試験化合物は間接的に結合することが可能であり、試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも1つから複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【0162】
別の実施例では、胚性幹細胞(ES細胞)における相同組換えを用いて動物モデル系内で、CCYPRまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である(米国特許第5,175,383号及び第5,767,337号等を参照)。例えば129/SvJ細胞株等のマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(neo: Capecchi, M.R. (1989) Science 244:1288−1292)等のマーカー遺伝子で破壊した目的の遺伝子を含むベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。別法では、Cre−loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする(Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999−2002; Wagner, K.U. 他 (1997) Nucleic Acids Res. 25:4323−43 30)。形質転換したES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス系等から採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を決め、これを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、潜在的な治療薬や毒性薬剤で検査することができる。
【0163】
CCYPRをコードするポリヌクレオチドをin vitroでヒト胚盤胞由来のES細胞において操作することが可能である。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞の種類を含む少なくとも8つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する(Thomson, J.A. 他 (1998) Science 282:1145−1 147)。
【0164】
CCYPRをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物(ブタ)または遺伝子組換え動物(マウスまたはラット)を作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、CCYPRをコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について研究し、潜在的な医薬品を用いて処置し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばCCYPRを乳汁内に分泌するなどCCYPRを過剰発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る(Janne, J. 他 (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55−74)。
【0165】
(治療)
CCYPRのある領域と細胞周期及び細胞増殖タンパク質のある領域との間に、例えば配列及びモチーフの文脈における化学的及び構造的類似性が存在する。更に、CCYPRの発現は、炎症、外傷、細胞増殖、および癌に密接に関連する。従って、CCYPRは、免疫異常、発達障害、細胞シグナル伝達の障害、および癌を含む細胞増殖異常においてある役割を果たすと考えられる。CCYPRの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、CCYPRの発現または活性を低下させることが望ましい。また、CCYPRの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、CCYPRの発現または活性を増大させることが望ましい。
【0166】
従って、一実施例において、CCYPRの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にCCYPRまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には免疫異常が含まれ、その中には炎症及び日光性角化症、後天性免疫不全症候群(AIDS)及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、動脈硬化、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ(APECED)、気管支炎、滑液包炎、胆嚢炎、硬変、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、発作性夜間血色素尿症、肝炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、混合型結合織病(MCTD)、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨髄線維症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、真性多血症、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、原発性血小板血症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷と、リンパ腫及び白血病、骨髄腫を含む造血性の癌が含まれ、また、発達障害も含まれ、その中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群(ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱)、スミス‐マジェニス症候群(Smith− Magenis syndrome)、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、Syndenham舞踏病(Syndenham’s chorea)及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれ、また、細胞シグナル伝達の障害が含まれ、その中には原発脳腫瘍及び腺腫、妊娠性梗塞、下垂体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、感染症、免疫異常、頭部外傷による合併症などの病変から起こる視床下部及び下垂体の障害と、良性腺腫によって発生しやすい不適当抗利尿ホルモン(ADH)分泌症候群(SIADH)及び先端巨大症、巨人症を含む下垂体亢進に関連した障害と、甲状腺腫及び粘液水腫、細菌感染性急性甲状腺炎を含む甲状腺機能低下症に関連した障害と、Conn病(chronic hypercalemia)を含む副甲状腺機能亢進症と、I型及びII型糖尿病及び合併症などの膵臓疾患と、過形成及び副腎皮質の癌腫や腺腫、アルカローシスに関連した高血圧などの副腎に関連した障害と、女性における異常プロラクチン産生、卵管の疾患や排卵の障害および子宮内膜症を含む不妊症、月経周期の摂動、多嚢胞性卵巣疾患、卵巣の疾患、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜または卵巣の癌、子宮筋腫、自己免疫疾患、異所性妊娠、奇形発生、高プロラクチン血症、選択的性腺刺激ホルモン不全(isolated gonadotropin deficiency)、無月経、乳汁漏出症、半陰陽、多毛症及び男性化、乳癌、線維嚢胞性乳腺症(fibrocystic breast disease)、閉経期後の骨粗鬆症、男性のライジッヒ細胞過形成、男性更年期、生殖細胞無形成症、ライジッヒ細胞腫瘍に関連した性機能亢進、アンドロゲン受容体の欠如に関連したアンドロゲン耐性、5α−還元酵素症候群、精子形成の障害、生理的な精子障害(abnormal sperm physiology)、精巣癌、前立腺癌、良性前立腺肥大症、前立腺炎、ペーロニー病、インポテンス、男性乳房癌、女性乳房症などの生殖腺ステロイドホルモンに関連した疾患とを含む内分泌障害が含まれ、細胞増殖異常が含まれ、その中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病(MCTD)、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれる。
【0167】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むCCYPRの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、CCYPRまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。
【0168】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むCCYPRの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたCCYPRを含む医薬組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与することも可能である。
【0169】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むCCYPRの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、CCYPRの活性を調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。
【0170】
更なる実施例では、CCYPRの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、患者にCCYPRのアンタゴニストを投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した免疫異常、発達障害、細胞シグナル伝達の障害、および癌を含む細胞増殖異常が含まれる。一実施態様では、CCYPRと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはCCYPRを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング或いは運搬機構として間接的に用いられ得る。
【0171】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むCCYPRの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、CCYPRをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与することも可能である。
【0172】
別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補的な配列、ベクターを別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。当業者は、従来の医薬原理にしたがって併用療法で用いる好適な治療薬を選択可能である。治療薬との組み合わせにより、上に列記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いて少ない量の各薬剤で医薬効果をあげることが可能であり、広範囲な副作用の可能性を低減し得る。
【0173】
CCYPRのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。詳しくは、精製されたCCYPRを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラリをスクリーニングしてCCYPRと特異的に結合するものを同定が可能である。CCYPRの抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Fabフラグメント、及びFab発現ライブラリによって作られたフラグメントが含まれる。但し、これらに限定されるものではない。治療用には、中和抗体(即ち、二量体の形成を阻害するもの)が特に好ましい。
【0174】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のものを含む種々の宿主が、CCYPRまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。このようなアジュバントにはフロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバント、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、及びジニトロフェノールなどの界面活性剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒトに用いられるアジュバントの中では、BCG(bacilli Calmette−Guerin)及びCorynebacterium parvumが特に好ましい。
【0175】
CCYPRに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約5個のアミノ酸からなり、一般的には約10個以上のアミノ酸からなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド或いはペプチド、またはそれらの断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。CCYPRアミノ酸の短いストレッチは、KLHなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。
【0176】
CCYPRに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。これらの技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、及びEBV−ハイブリドーマ技術が含まれるが、これらに限定されるものではない(例えば、Kohler, G. 等. (1975) Nature 256:495−497; Kozbor, D. 等. (1985) .J. Immunol. Methods 81−8−42; Cote, R.J. 等. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026−2030; Cole, S.P. 等. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109−120を参照)。
【0177】
更に、「キメラ抗体」作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備える分子を得るために用いられる(例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81−4851−4855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:604−608; Takeda, S.等. (1985) Nature 314:452,454を参照)。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、CCYPR特異性一本鎖抗体を生成する。関連する特異性を備えるが別のイディオタイプの組成の抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリから鎖混合によって生成することもできる(例えば、Burton D.R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120−3を参照)。
【0178】
抗体は、リンパ球集団の中のin vivo産生を誘発することによって、または免疫グロブリンライブラリのスクリーニング又は文献に示されているような、高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって、産生することもできる(例えば、Orlandi, R. 他. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833−3837; Winter, G. 他. (1991) Nature 349:293−299を参照)。
【0179】
CCYPRに対する特異的な結合部位を含む抗体も産生することができる。例えば、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成されるF(ab’)に断片と、F(ab’)に断片のジスルフィド架橋を減じることによって生成されるFab断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。別法では、Fab発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性とモノクローナルFab断片の迅速且つ容易な同定が可能となる(例えば、Huse, W.D. 等. (1989) Science 254:1275−1281を参照)。
【0180】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定する。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のための数々のプロトコルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、CCYPRとその特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。二つの非干渉性CCYPRエピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、2部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用することができる(Pound、前出)。
【0181】
ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、CCYPRに対する抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、平衡状態の下でCCYPR抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除して得られる値である。多数のCCYPRエピトープに対して親和性が不均一なポリクローナル抗体医薬のKaは、CCYPRに対する抗体の平均親和性または結合活性を表す。特定のCCYPRエピトープに単一特異的なモノクローナル抗体医薬のKaは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が109〜1012L/molの高親和性抗体医薬は、CCYPR抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が106〜107L/molの低親和性抗体医薬は、CCYPRが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製(immunopurification)及び類似の処理に用いるのが好ましい。(Catty, D. (1988) Antibodies, Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E. and Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY)。
【0182】
ある下流での適用におけるこのような医薬品の品質及び適性を調べるために、ポリクローナル抗体医薬の抗体価及び結合活性を更に評価する。例えば、少なくとも1〜2mg/mlの特異的な抗体、好ましくは5〜10mg/mlの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体医薬は一般に、CCYPR抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。様々な適用例における抗体の特異性及び抗体価、結合活性、抗体の品質や使用法の指針は一般に入手可能である。(例えば、Catty, 前出, 及びColigan 他、前出を参照)。
【0183】
本発明の別の実施例では、CCYPRをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施態様では、CCYPRをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子(DNA及びRNA、修飾ヌクレオチド)を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、CCYPRをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である。
【0184】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を発現する発現プラスミドの形で細胞内に送達することができる(例えば、Slater, J.E. 他 (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102(3):469−475; and Scanlon, K.J. 他 (1995)9(13):1288−1296.を参照 )。また、アンチセンス配列は、例えばレトロウイルスやアデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる(例えば、Miller, A.D. (1990) Blood 76:271; Ausubel, 前出; Uckert, W. and W. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63(3):323−347を参照)。その他の遺伝送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープ、及び当分野で周知のその他の系が含まれる(Rossi, J.J. (1995) Br. Med. Bull. 51(1):217−225; Boado, R.J.他 (1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308−1315; and Morris, M.C. 他 (1997) Nucleic Acids Res. 25(14):2730−2736.を参照)。
【0185】
本発明の別の実施例では、CCYPRをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療は、(i)遺伝子欠損症(例えば、X染色体連鎖遺伝(Cavazzana−Calvo, M. 他 (2000) Science 288:669−672)によって特徴づけられる重度の複合型免疫欠損(SCID)−X1)、遺伝性アデノシン−デアミナーゼ(ADA)欠損症(Blaese, R.M. 他 (1995) Science 270:475−480; Bordignon, C. 他 (1995) Science 270:470−475)に関連する重度の複合型免疫欠損、嚢胞性繊維症(Zabner, J. 他 (1993) Cell 75:207−216: Crystal, R.G. 他 (1995) Hum. Gene Therapy 6:643−666; Crystal, R.G. 他. (1995) Hum. Gene Therapy 6:667−703)、サラセミア(thalassamia)、家族性高コレステロール血症、第VIII因子若しくは第IX因子欠損による血友病(Crystal, 35 R.G. (1995) Science 270:404−410; Verma, I.M. and Somia. N. (1997) Nature 389:239−242)を治療したり、(ii)条件的致死性遺伝子産物(例えば、細胞増殖の制御不能による癌の場合)を発現させたり、及び(iii)細胞内の寄生虫(例えば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)(Baltimore, D. (1988) Nature 335:395−396; Poescbla, E. 他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:11395−11399)や、B型若しくはC型肝炎ウイルス(HBV、HCV)、Candida albicans及びParacoccidioides brasiliensis等の真菌寄生虫、Plasmodium falciparum及びTrypanosoma cruzi等の原虫寄生体)に対する防御機能を有するタンパク質を発現させて行うことができる。CCYPRの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からCCYPRを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【0186】
本発明の更なる実施例では、CCYPRの欠損による疾患や異常症は、CCYPRをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってCCYPR欠損細胞に導入することによって治療する。in vivo或いはex vitroの細胞に用いる機械的な導入技術には、(i)個々の細胞内へのDNAのマイクロインジェクション、(ii)金粒子の打ち込み、(iii)リポソーム仲介性トランスフェクション、(iv)受容体仲介性遺伝子導入、及び(v)DNAトランスポソン(Morgan, R.A. and W.F. Anderson (1993) Annu. Rev. Biochem. 62:191−217; Ivics, Z. (1997) Cell 91:501−510; Boulay, J−L. and H. Recipon (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:445−450)の使用が含まれる。
【0187】
CCYPRの発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、限定するものではないが、PCDNA 3.1、EPITAG、PRCCMV2、PREP、PVAXベクター(Invitrogen, Carlsbad CA)、PCMV−SCRIPT、PCMV−TAG、PEGSH/PERV (Stratagene, La Jolla CA)、PTET−OFF、PTET−ON、PTRE2、PTRE2−LUC、PTK−HYG (Clontech, Palo Alto CA)が含まれる。CCYPRを発現させるために、(i)恒常的に活性なプロモーター(例えば、サイトメガロウイルス(CMV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ(TK)、若しくはβ−アクチン遺伝子等)、(ii)誘導性プロモーター(例えば、市販されているT−REXプラスミド(Invitrogen)に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター(Gossen, M. and H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547−5551; Gossen, M. 他 (1995) Science 268:1766−1769; Rossi, F.M.V. and H.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451−456))、エクジソン誘導性プロモーター(市販されているプラスミドPVGRXR及びPINDに含まれている:Invitrogen)、FK506/ラパマイシン誘導性プロモーター、またはRU486/ミフェプリストーン誘導性プロモーター(Rossi, F.M.V. and H.M. Blau, 前出)、または(iii)正常な個体に由来するCCYPRをコードする内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【0188】
市販のリポソーム形質転換キット(例えば、Invitrogenが販売しているPERFECT LIPID及びTRANSFECTION KIT)を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでもポリヌクレオチドを培養中の標的細胞に導入することが可能である。別法では、リン酸カルシウム法(Graham. F.L. and A.J. Eb (1973) Virology 52:456−467)若しくは電気穿孔法 (Neumann, B. 他 (1982) EMBO J. 1:841−845)を用いて形質転換を行う。初代細胞にDNAを導入するためには、これらの標準的な哺乳動物トランスフェクションプロトコルを変更する必要がある。
【0189】
本発明の別の実施例では、CCYPRの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異常症は、(i)レトロウイルス末端反復配列(LTR)プロモーター若しくは独立したプロモーターのコントロール下でCCYPRをコードするポリヌクレオチドと、(ii)好適なRNAパッケージングシグナルと、(iii)追加のレトロウイルス・シス作用性RNA配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコーディング配列を伴うRev応答性エレメント(RRE)とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター(例えば、PFB及びPFBNEO)はStratagene社から入手可能であり、公表データ(Riviere, I. 他. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:6733−6737)に基づいている。上記データを引用することをもって本明細書の一部とする。このベクターは、VSVg(Armentano, D. 他 (1987) J. Virol. 61:1647−1650; Bender, M.A. 他 (1987) J. Virol. 61:1639−1646; Adam, M.A. and A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802−3806; Dull, T. 他 (1998) J. Virol. 72:8463−8471; Zufferey, R. 他 (1998) J. Virol. 72:9873−9880)等の乱交雑エンベロープタンパク質若しくは標的細胞上の受容体に対する親和性を有するエンベロープ遺伝子を発現する好適なベクター産生細胞系(VPCL)において増殖される。RIGGに付与された米国特許第5,910,434号(「Method for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant」)において、レトロウイルスパッケージング細胞系を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、ある細胞集団(例えば、CD4+T細胞)の形質導入、並びに形質導入した細胞を患者に戻す方法は、遺伝子治療の分野では周知であり、多数の文献に記載されている(Ranga, U. 他. (1997) J. Virol. 71:7020−7029; Bauer, G. 他 (1997) Blood 89:2259−2267; Bonyhadi, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707−4716; Ranga, U. 他 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:1201−1206: Su, L. (1997) Blood 89:2283−2290)。
【0190】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、CCYPRの発現に関連する1或いは複数の遺伝子異常を有する細胞にCCYPRをコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージングは当分野では周知である。複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島の中に導入するために可変性であることが証明された(Csete, M.E. 他. (1995) Transplantation 27:263−268)。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターが、米国特許第5,707,618号(「Adenovirus vectors for gene therapy」)に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについてはまた、Antinozzi, P.A. 他 (1999) Annu. Rev. Nutr. 19:511−544; and Verma, I.M. and N. Somia (1997) Nature 18:389:239−242を参照し、引用することをもって本明細書の一部とする。
【0191】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、CCYPRの発現に関連する1或いは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にCCYPRをコードするポリヌクレオチドを送達する。単純疱疹ウイルス(HSV)系のベクターは、HSV親和性の中枢神経細胞にCCYPRを導入する際に特に重要である。ヘルペス系ベクターの作製及びパッケージングは当分野では周知である。複製適格性の単純疱疹ウイルス(HSV)I型系のベクターは、霊長類の眼にレポーター遺伝子を送達するために用いられてきた(Liu, X. 他 (1999) Exp. Eye Res.169:385−395)。HSV−1ウイルスベクターの作製は、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号(Herpes simplex virus swains for gene transfer)に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。米国特許第5,804,413号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために、好適なプロモーターのコントロールの下で、細胞に導入される少なくとも1つの内在性遺伝子を含むゲノムからなる組換えHSV d92についての記載がある。また上記特許には、ICP4、ICP27及びICP22のために除去される組換えHSV株の作製及び使用方法が開示されている。HSVベクターについては、Goins, W.F. 他 (1999) J. Virol. 73:519−532 and Xu, H. 他 (1994) Dev. Biol. 163:152−161を参照し、引用することをもって本明細書の一部とする。クローニングされたヘルペスウイルス配列の操作や、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なった部分を含む多数のプラスミドをトランスフェクトした後の組換えウイルスの継代、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は当分野で周知の技術である。
【0192】
別法では、αウイルス(正の一本鎖RNAウイルス)ベクターを用いてCCYPRをコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス(Semliki Forest Virus, SFV)の生物学的な研究が広範に行われ、遺伝子伝達ベクター(gene transfer vector)がSFVゲノムに基づいていることが分かった(Garoff, H. and K.−J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464−469)。αウイルスRNAの複製中に、通常はウイルスカプシドタンパク質をコードするサブゲノムRNAが作り出される。このサブゲノムRNAが完全長のゲノムRNAより高いレベルで複製されるため、酵素活性(例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ)を有するウイルスタンパク質に対してカプシドタンパク質が過剰に産生される。同様に、CCYPRをコードする配列をαウイルスゲノムのカプシドをコードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数のCCYPRをコードするRNAが産生され、高いレベルでCCYPRが合成される。通常はαウイルス感染は2〜3日以内の細胞溶解に関係するが、シンドビスウイルス(SIN)の変異体を有するハムスターの正常な腎細胞(BHK−21)の持続的な感染を確立する能力は、αウイルスの溶解性の複製が遺伝子治療に適用できるように好適に変更することが可能であることを示唆している(Dryga, S.A. 他. (1997) Virology 228 :74−83)。様々な宿主にαウイルスを導入できることから、様々なタイプの細胞にCCYPRを導入することできる。ある集団における細胞のサブセットの特定の形質導入には、形質導入する前に細胞のソーティングを必要とする場合がある。αウイルスの感染性cDNAクローンの操作、αウイルスcDNA及びRNAのトランスフェクション、並びにαウイルスの感染方法は当分野で周知である。
【0193】
例えば開始部位から約−10から約+10までの転写開始部位に由来するオリゴヌクレオチドを用いて、遺伝子の発現を阻害することが可能である。同様に、三重らせん塩基対合法を用いて阻害することができる。三重らせん構造は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結合のために十分に広がるのを阻止するため有用である。三重式DNAを用いる最近の治療の進歩は文献に記載されている(例えば、Gee, J.E. 等. (1994) In: Huber, B.E. 及び B.I. Carr, Molecular and ImmunologiCCYPRproaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NYを参照)。相補的な配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を阻止するように設計できる。
【0194】
酵素性RNA分子であるリボザイムは、RNAの特異的切断を触媒するために用いることができる。リボザイム作用の機構には、相補的な標的RNAへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれ、ヌクレオチド鎖切断が続く。例えば、CCYPRをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。
【0195】
任意の潜在的RNA標的内の特異的なリボザイム切断部位が、後続の配列GUA、GUU、及びGUCを含むリボザイム切断部位に対して、標的分子をスキャニングすることによって初めに同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する15個から20個のリボヌクレオチドの短いRNA配列を、オリゴヌクレオチドの機能を不全にする二次的な構造の特徴について評価することが可能である。候補標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの容易性をテストすることによって評価することが可能である。
【0196】
本発明の相補的なリボ核酸分子及びリボザイムは、当分野で周知の方法を用いて、核酸分子の合成のために作製することができる。これらの方法には、固相ホスホラミダイト化合物などのオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法が含まれる。別法では、RNA分子がin vitro及びin vivoでCCYPRをコードするDNA配列の転写によって生成され得る、このようなDNA配列はT7またはSP6等の好適なRNAポリメラーゼプロモータを用いて、種々のベクターの中に組み入れることが可能である。別法では、相補的なRNAを構成的または誘導的に合成するこれらのcDNA作製物は、細胞株、細胞、または組織の中に導入することができる。
【0197】
RNA分子を修飾することによって、細胞内の安定性を高め、半減期を長くすることができる。可能な修飾には、分子の5’及び/または3’端部でのフランキング配列の追加、または分子のバックボーン内でのホスホジエステラーゼ結合よりむしろホスホロチオネート又は2’Oメチルの使用が含まれるが、これらに限定されるものではない。PNAの生成に固有のこの概念は、内在性のエンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び同様の修飾形態だけでなく、イノシン、キュエオシン(queosine)、及びワイブトシン(wybutosine)などの従来のものでない塩基を含めることによって、これらの分子の全体に拡大することができる。
【0198】
本発明の更なる実施例は、CCYPRをコードするポリヌクレオチドの発現の変化に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。特定のポリヌクレオチドの発現の変化に有効な化合物には、限定するものではないが、特定のポリヌクレオチド配列と相互作用可能な非高分子化学物質、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子やその他のポリペプチド転写調節因子が含まれる。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビター或いはエンハンサーとして作用し、ポリヌクレオチドの発現を変化させ得る。従って、CCYPRの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、CCYPRをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、CCYPRの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、CCYPRをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【0199】
特定のポリヌクレオチドの発現の変化の有効性を調べるために、少なくとも1個から複数個の試験化合物をスクリーニングすることができる。試験化合物は、有効な化合物の化学修飾を含む当分野で周知の任意の方法で得ることができる。このような方法は、ポリヌクレオチドの発現を変化させる場合、一般に市販されている或いは専売の天然または非天然の化合物ライブラリから選択する場合、標的ポリヌクレオチドの化学的及び/または構造的特性に基づいて化合物を合理的にデザインする場合、更に組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効である。CCYPRをコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、少なくとも1つの試験化合物に曝露して得る。サンプルには、例えば無傷細胞、透過化処理した細胞、in vitro細胞遊離系または再構成生化学系が含まれ得る。CCYPRをコードするポリヌクレオチドの発現における変化は、当分野で周知の任意の方法でアッセイする。通常、CCYPRをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特定のヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーションの収量を定量し、その値が1或いは複数の試験化合物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較における基準となり得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現の変化が検出される場合は、ポリヌクレオチドの発現の変化に試験化合物が有効であることを示している。特定のポリヌクレオチドの発現の変化に有効な化合物を調べるために、例えばSchizosaccharomyces pombe遺伝子発現系(Atkins, D. 他 (1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt, G.M. 他 (2000) Nucleic Acids Res. 28:E15)またはHeLa細胞等のヒト細胞株(Clarke, M.L. 他 (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8−13)を用いてスクリーニングする。本発明の特定の実施例は、特異的ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性を調べるための、各オリゴヌクレオチド(デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、及び修飾オリゴヌクレオチド)の組み合わせライブラリのスクリーニングを含む(Bruice, T.W. 他 (1997) 米国特許第5,686,242号、Bruice, T.W. 他 (2000) 米国特許第6,022,691号)。
【0200】
ベクターを細胞又は組織に導入する多数の方法が利用でき、in vivo、in vitro、及びex vivoでの使用に等しく適している。ex vivoでの治療の場合、患者から採取された肝細胞の中にベクターを導入して、自家移植で同じ患者に戻すためにクローニング増殖される。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリカチオンアミノポリマーによる運搬は、当分野で周知の方法を用いて実行することができる(例えば、Goldman, C.K. 他. (1997) Nature Biotechnology 15:462−66:を参照)。
【0201】
上記したいかなる治療方法も、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ及びサルなどの哺乳動物を含む、治療が必要な全ての被験者に適用できる。
【0202】
本発明の別の実施例は、上記した全ての治療効果のために、医学上認められる担体と共に医薬品或いは無菌組成物の投与に関連する。このような医薬組成物は、CCYPR、CCYPRの抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、又はCCYPRのインヒビターなどからなる。この組成物は、単体で、或いは安定剤などの1種類以上の別の薬剤と共に、無菌の生体適合性医薬品担体に投与することができる。このような医薬品担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、及び水などが含まれるがこれらに限定されるものではない。この組成物は、単独或いは薬物又はホルモンなどの別の薬剤と共に投与することができる。
【0203】
本発明に用いられる医薬組成物は、様々な経路を用いて投与するが可能である。この経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、または直腸が含まれるがこれらに限定されるものではない。
【0204】
肺投与用の医薬組成物は、液状または乾燥粉末状に調製することができる。このような医薬組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子(例えば、従来の低分子量有機薬剤)の場合には、速効製剤のエアロゾル輸送が当分野で周知である。高分子(例えばより大きなペプチドやタンパク質)の場合には、肺の肺胞領域を介する肺輸送の技術が近年向上したため、インスリン等の薬剤を実際に血中に輸送することが可能となった(Patton, J.S. 他, 米国特許第5,997,848号等を参照)。肺輸送は、針注射を用いないで投与できるという点で優れており、潜在的に有毒な浸透エンハンサーが必要でなくなる。
【0205】
本発明に用いる好適な医薬組成物には、目的を達成するため、効果的な量の活性処方成分を含む組成物が含まれる。当業者は、十分に自身の能力で効果的な服用量を決めることができる。
【0206】
医薬組成物の特殊な形状は、CCYPRまたはその断片を含む高分子を直接細胞内に輸送するべく調製される。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、細胞融合及び高分子の細胞内輸送を促進し得る。別法では、CCYPRまたはその断片をHIV Tat−1タンパク質の陽イオンN末端部に結合することもできる。このようにして作製された融合タンパク質は、マウスモデル系の脳を含む全ての組織の細胞に形質導入されることが確認されている(Schwarze, S.R. 他 (1999) Science 285:1569−1572)。
【0207】
どのような組成物であっても、治療に効果的な薬用量は、初めは、例えば腫瘍細胞の腫瘍細胞アッセイで、或いは動物モデルのどちらかで推定することができる。通常、動物モデルには、マウス、ウサギ、イヌ、サル、またはブタなどが用いられる。動物モデルはまた、好適な濃縮範囲及び投与の経路を決めるのに用いることができる。このような治療をもとに、ヒトへの有益な薬用量及び投与経路を決定することができる。
【0208】
医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばCCYPR又はその断片、CCYPRの抗体、CCYPRのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなどの活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、たとえば、ED50(服用に対して集団の50%に医薬的効果がある用量)またはLD50(服用に対して集団の50%に致命的である用量)統計を計算するなど、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって決定することができる。毒性効果と治療効果との薬用量比は治療指数であり、LD50/ED50と示すことができる。高い治療指数を示す医薬組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータが、ヒトへの適用のために、薬用量の範囲を調剤するのに用いられる。このような組成物が含まれる薬用量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ED50を含む血中濃度の範囲であることが望ましい。薬用量は、用いられる投与形態及び患者の感受性、投与の経路によって、この範囲内で様々である。
【0209】
正確な薬用量は、治療が必要な患者に関する要素を考慮して、実務者によって決められるであろう。薬用量及び投与は、効果的なレベルの活性成分を与えるため或いは所望の効果を維持するために調節される。薬用量の要素として考慮されるものには、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、年齢、体重、及び患者の性別、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感受性、及び治療に対する応答が含まれる。作用器官が長い医薬組成物は、三日か四日に一度、一週間に一度、二週間に一度、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって左右され、投与され得る。
【0210】
通常の薬用量は投与の経路によって異なるが、約0.1〜100,000μgまでの最大約1グラムまでである。特定の薬用量及び運搬の方法に関するガイダンスは文献に記載されており、一般に当分野の実務者はそれを利用することができる。当業者は、タンパク質またはインヒビターとは異なったヌクレオチドの製剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの運搬は、特定の細胞、状態、位置などに対して特異的であろう。
【0211】
(診断)
別の実施例では、CCYPRに特異的に結合する抗体が、CCYPRの発現によって特徴付けられる疾患の診断、またはCCYPRやCCYPRのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断に有用な抗体は、治療のところで記載した方法と同じ方法で製剤される。CCYPRの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織から採取されたものからCCYPRを検出する方法が含まれる。これらの抗体は、修飾をして或いはしないで使用され、レポーター分子の共有結合性或いは非共有結合性の接着によって標識化され得る。当分野で周知の種々のレポーター分子が用いられるが、その内の幾つかは上記した。
【0212】
CCYPRを測定するためのELISA,RIA,及びFACSを含む種々のプロトコルは、当分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのCCYPRの発現を診断する元となるものを提供する。正常或いは標準的なCCYPRの発現の値は、複合体の形成に適した条件の下、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞とCCYPRに対する抗体とを結合させることによって決定する。標準的な複合体形成の量は、測光法(photometric)などの種々の方法で定量され得る。被験者のCCYPRの発現の量、制御及び疾患、生検組織からのサンプルが基準値と比較される。基準値と被験者との間の偏差が、診断の指標となる。
【0213】
別の実施例によれば、CCYPRをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的なRNA及びDNA分子、及びPNAが含まれる。このポリヌクレオチドを用いて、疾患と相関し得るCCYPRを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出し定量する。この診断アッセイを用いて、CCYPRの存在の有無、更に過剰な発現を調べ、治療中のCCYPR値の調節を監視する。
【0214】
ある実施形態では、CCYPRまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、CCYPRをコードする核酸配列を同定することが可能である。例えば5’調節領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフであるやや特異性の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェントは、プローブがCCYPRをコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いはアレルや関連配列コードする自然界の配列のみを同定するかどうかによって決まるであろう。
【0215】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、CCYPRをコードする任意の配列と少なくとも50%の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:55−108の配列、或いはCCYPR遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【0216】
CCYPRをコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、CCYPR及びCCYPR誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をmRNAプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。このようなベクターは市販されており、当業者には周知であり、好適なRNAポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでRNAプローブを合成するために用いられる。ハイブリダイゼーションプローブは、例えば32P或いは35Sなどの放射性核種、或いはアビジン/ビオチン(biotin)結合系によってプローブに結合されたアルカリホスファターゼなどの酵素標識等の種々のレポーターの集団によって標識され得る。
【0217】
CCYPRをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、CCYPRの発現に関連する疾患を診断することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には免疫異常が含まれ、その中には炎症及び日光性角化症、後天性免疫不全症候群(AIDS)及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、動脈硬化、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ(APECED)、気管支炎、滑液包炎、胆嚢炎、硬変、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、発作性夜間血色素尿症、肝炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、混合型結合織病(MCTD)、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨髄線維症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、真性多血症、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、原発性血小板血症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷と、リンパ腫及び白血病、骨髄腫を含む造血性の癌が含まれ、また、発達障害も含まれ、その中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群(ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱)、スミス‐マジェニス症候群(Smith− Magenis syndrome)、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、Syndenham舞踏病(Syndenham’s chorea)及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれ、また、細胞シグナル伝達の障害が含まれ、その中には原発脳腫瘍及び腺腫、妊娠性梗塞、下垂体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、感染症、免疫異常、頭部外傷による合併症などの病変から起こる視床下部及び下垂体の障害と、良性腺腫によって発生しやすい不適当抗利尿ホルモン(ADH)分泌症候群(SIADH)及び先端巨大症、巨人症を含む下垂体亢進に関連した障害と、甲状腺腫及び粘液水腫、細菌感染性急性甲状腺炎を含む甲状腺機能低下症に関連した障害と、Conn病(chronic hypercalemia)を含む副甲状腺機能亢進症と、I型及びII型糖尿病及び合併症などの膵臓疾患と、過形成及び副腎皮質の癌腫や腺腫、アルカローシスに関連した高血圧などの副腎に関連した障害と、女性における異常プロラクチン産生、卵管の疾患や排卵の障害および子宮内膜症を含む不妊症、月経周期の摂動、多嚢胞性卵巣疾患、卵巣の疾患、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜または卵巣の癌、子宮筋腫、自己免疫疾患、異所性妊娠、奇形発生、高プロラクチン血症、選択的性腺刺激ホルモン不全(isolated gonadotropin deficiency)、無月経、乳汁漏出症、半陰陽、多毛症及び男性化、乳癌、線維嚢胞性乳腺症(fibrocystic breast disease)、閉経期後の骨粗鬆症、男性のライジッヒ細胞過形成、男性更年期、生殖細胞無形成症、ライジッヒ細胞腫瘍に関連した性機能亢進、アンドロゲン受容体の欠如に関連したアンドロゲン耐性、5α−還元酵素症候群、精子形成の障害、生理的な精子障害(abnormal sperm physiology)、精巣癌、前立腺癌、良性前立腺肥大症、前立腺炎、ペーロニー病、インポテンス、男性乳房癌、女性乳房症などの生殖腺ステロイドホルモンに関連した疾患とを含む内分泌障害が含まれ、細胞増殖異常が含まれ、その中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病(MCTD)、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれる。CCYPRをコードするポリヌクレオチド配列は、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、PCR法、ディップスティック(dipstick)、ピン(pin)、ELISA式アッセイ、及び変異CCYPRの発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用することが可能である。このような質的或いは量的方法は、当分野では周知である。
【0218】
ある実施態様では、CCYPRをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。CCYPRをコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができるであろう。好適な培養期間の後、サンプルを洗浄し、シグナルを定量して基準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、制御サンプルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のCCYPRをコードするヌクレオチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイを用いて、動物実験、臨床試験、或いは個人の患者の治療を監視における、特定の治療効果を推定することが可能である。
【0219】
CCYPRの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、正常あるいは標準的な発現の概要が確立される。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出された体液或いは細胞と、CCYPRをコードする配列或いはその断片とを結合させることにより達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被験者から得た値と周知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験からの値とを比較することによって定量可能である。正常なサンプルから得た標準的な値を、疾患の症状を示す被験者から得た値と比較可能である。基準値と被験者の値との偏差を用いて罹患しているかどうを決定する。
【0220】
疾患の存在が確定され、治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な患者に示される値に近づき始めたかどうかを推定することが可能である。繰り返し行ったアッセイの結果を、数日から数ヶ月の期間の治療の効果を見るのに用いることができる。
【0221】
癌では、個体からの生体組織における異常な量の転写物が、疾患の発生の素因を示し、また実際に臨床的症状が出る前に疾患を検出する方法を提供することが可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法或いは積極的な治療法を早くから利用して、癌の発生または進行を防ぐことが可能となる。
【0222】
CCYPRをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、PCRの利用が含まれ得る。このようなオリゴマーは、化学的な合成、酵素を用いた生成、或いはin vitroで生成され得る。オリゴマーは、好ましくはCCYPRをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはCCYPRをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件の下、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェントな条件の下、近縁のDNA或いはRNA配列の検出及び/または定量のため用いることが可能である。
【0223】
或る実施態様において、CCYPRをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、一塩基多型(SNP)を検出し得る。SNPは、ヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となる場合が多いヌクレオチドの置換、挿入及び欠失である。限定するものではないが、SNPの検出方法には、一本鎖立体構造多型(SSCP)及び蛍光SSCP(fSSCP)法が含まれる。SSCPでは、CCYPRをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)でDNAを増幅する。このDNAは、例えば病変或いは正常な組織、生検サンプル、体液等に由来し得る。このDNA内のSNPは、一本鎖形状のPCR産物の2次及び3次構造に差異を生じさせる。この差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。fSCCPでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光標識することによって、DNAシークエンシング装置などのハイスループット機器でアンプリマー(amplimer)の検出をすることが可能になる。更に、インシリコSNP(in silico SNP:isSNP)と呼ばれる配列データベース分析法は、共通のコンセンサス配列の構築に用いられる個々の重複するDNA断片の配列を比較することによって、多型を同定することができる。これらのコンピュータベースの方法は、DNA配列クロマトグラムの自動分析及び統計モデルを用いたシークエンシングエラーや研究室でのDNAの調整に起因する配列のばらつきを排除する。別法では、例えばハイスループットのMASSARRAYシステム(Sequenom, Inc., San Diego CA)を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。
【0224】
CCYPRの発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射標識或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅(coamplification)、及び標準的な曲線に結果が加えられたものが含まれる(例えば、Melby, P.C.等(1993) J. Immunol. Methods, 159:235−44;Duplaa, C.等(1993) Anal. Biochem. 229−236を参照)。多数のサンプルの定量速度は、目的のオリゴマーやポリヌクレオチドが種々の希釈液に含まれ、分光光度法或いは非色応答によって定量が迅速なハイスループット型のアッセイを用いることで加速された。
【0225】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列に由来するオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として用いることができる。マイクロアレイを転写イメージング技術に用いて、多数の遺伝子の相対発現レベルを同時にモニタリングすることができる。これについては、Seilhamer, J.J.他に付与された米国特許第5,840,484号(名称「Comparative Gene Transcript Analysis」)に記載されており、この引用を以って本明細書の一部とする。マイクロアレイはまた、遺伝子変異、突然変異及び多型の同定に用いることができる。この情報を用いて、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を解明し、疾患を診断し、遺伝子発現に関連する疾病の進行/後退をモニタリングし、疾患の治療における治療薬の開発や活性のモニタリングを行うことができる。特に、患者にとって最適かつ有効な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを作成することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロフィールに基づいて、患者に対して極めて効果的でありながら副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【0226】
別の実施例では、CCYPRに特異的な抗体、CCYPRまたはその断片をマイクロアレイ上でエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようにタンパク質間相互作用、薬剤−標的相互作用及び遺伝子発現プロフィールをモニタリング及び測定することが可能である。
【0227】
或る実施例は、或る組織または細胞型の転写イメージを生成する本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞型により遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所定の条件下で所定の時間に発現した遺伝子の数及び相対存在量を定量することにより分析される(Seilliamer 他、米国特許第5,840,484号の”Comparative Gene Transcript Analysis” を参照。この特許に言及することを以って本明細書の一部とする)。従って、特定の組織または細胞型の転写物全体または逆転写物全体に本発明のポリヌクレオチドまたはその相補配列をハイブリダイズすることにより、転写イメージが生成され得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはその相補配列がマイクロアレイ上に複数のエレメントのサブセットを構成するハイスループット型でハイブリダイゼーションさせる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロフィールとなり得る。
【0228】
転写イメージは、組織、細胞株、生検サンプル、またはその他の生体サンプルから単離した転写物を用いて生成し得る。従って、転写イメージは、組織または生検サンプルの場合にはin vivo、または細胞株の場合にはin vitroにおける遺伝子発現を反映する。
【0229】
本発明のポリヌクレオチドの発現プロフィールを示す転写イメージはまた、合成化合物または天然化合物の毒性試験のみならず、in vitroモデル系及び薬剤の前臨床評価に関連して使用され得る。全ての化合物は、作用及び毒性の機構を示唆する、頻繁に分子フィンガープリント若しくは毒性シグネチャと称されるような特徴的な遺伝子発現パターンを引き起こす(Nuwaysir, E.F. 他 (1999) Mol. Carcinog. 24:15 3−159、Steiner, S. and N.L. Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112−113:467−471、また言及することを以って本明細書の一部とする)。試験化合物が、毒性を有する既知の化合物のシグネチャと同一のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性が高い。フィンガープリンまたはシグネチャが、より多くの遺伝子及び遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいれば、より有用かつ正確になる。理想としては、発現のゲノム全域にわたって測定し、最高品質のシグネチャを提供することである。任意の試験化合物によっても発現が変化しない遺伝子も同様に重要である。それは、これらの遺伝子の発現レベルを用いて残りの発現データを標準化することができるためである。標準化処置は、異なる化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒性シグネチャのエレメントへの遺伝子機能を割り当てることは毒性機構の解明に役立つが、毒性の予測につながるシグネチャの統計的な一致には遺伝子機能の知識は必要ではない(例えば2000年2月29日にNational Institute of Environmental Health Sciencesより発行されたPress Release 00−02を参照されたい。これについてはhttp://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htmで入手可能である)。従って、毒性シグネチャを用いる毒性スクリーニングにおいて、全ての発現した遺伝子配列を含めることは重要でありまた望ましいことである。
【0230】
或る実施例では、試験化合物の毒性は、核酸を含有する生体サンプルをその試験化合物で処置して評価する。処置した生体サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な1若しくは複数のプローブでハイブリダイズさせ、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量することができる。処理した生体サンプル中の転写レベルを、非処理生体サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差が、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示唆する。
【0231】
別の実施例は、本発明のポリペプチド配列を用いて組織または細胞型のプロテオームを分析することに関連する。「プロテオーム」という用語は、特定のある組織または細胞型におけるタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームを構成する各タンパク質は、更に個々に分析することができる。プロテオーム発現パターン即ちプロフィールは、所定の条件下で所定の時間に発現したタンパク質の数及びそれらの相対的な存在量を定量することにより分析する。従って、ある細胞のプロテオームのプロフィールは、特定の組織または細胞型のポリペプチドを分離及び分析することにより作成し得る。或る実施例では、このような分離は2次元ゲル電気泳動によって行う。この2次元ゲル電気泳動法では、まず、1次元の等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、次に、2次元のドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に従って分離する(前出のSteiner and Anderson)。これらのタンパク質は、通常クーマシーブルーまたはシルバーまたは蛍光染色などの染色剤を用いてゲルを染色して、分散した個別の位置にあるスポットとしてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処置済みまたは未処置のいずれかの生体サンプルから得られる等位置にあるタンパク質スポットの光学密度を比較し、処置に関連するタンパク質スポット密度の変化を調べる。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的に切断した後、質量分析する標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。スポット内のタンパク質の同一性は、好適には少なくとも5個の連続するアミノ酸残基であるその部分的な配列を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列が得られる。
【0232】
プロテオームのプロフィールは、CCYPRに特異的な抗体を用いてCCYPR発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施例では、マイクロアレイ上のエレメントとして抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝露して各アレイエレメントへのタンパク質結合レベルを検出することによりタンパク質発現レベルを定量する(Lueking, A. ら. (1999) Anal. Biochern. 270:103−111、Mendoze, L.G. ら. (1999) Biotechniques 27:778−788)。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオール反応性またはアミノ反応性蛍光化合物を用いてサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【0233】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行して分析するべきである。或る組織における或るタンパク質では、転写物の存在量とタンパク質の存在量との相関性が低いことがあるため(Anderson, N.L. and J. Seilhamer (1997) Electrophoresis 18:533−537)、プロテオーム毒性シグネチャは、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロフィールを変化させる化合物の分析において有用たり得る。更に、体液中での転写の分析は、mRNAが急速に分解するため困難である。しがたがって、このような場合にはプロテオームのプロフィール作成はより信頼でき、情報価値がある。
【0234】
別の実施例では、試験化合物の毒性は、タンパク質を含む生体サンプルをその試験化合物で処置して評価する。処置された生体サンプル中で発現したタンパク質を分離して、各タンパク質の量が定量できるようにする。各タンパク質の量を、未処置生体サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプル中のタンパク質の量の差は、処置されたサンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示唆する。個々のタンパク質は、それらのアミノ酸残基をシークエンシングし、これらの部分配列を本発明のポリペプチドと比較することで同定する。
【0235】
別の実施例では、試験化合物の毒性は、タンパク質を含む生体サンプルをその試験化合物で処置することにより評価する。生体サンプルから得たタンパク質を、本発明のポリペプチドに特異的な抗体と共にインキュベートする。その抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処置された生体サンプル中のタンパク質の量を、未処置生体サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差が、処置サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示唆する。
【0236】
当分野で周知の方法でマイクロアレイを準備して使用し、分析する。(例えば、Brennan, T.M. 他 (1995) 米国特許第5,474,796号;Schena, M. 他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10614−10619; Baldeschweiler 他(1995) PCT出願番号WO95/251116; Shalon, D.他 (1995) PCT出願番号WO95/35505; Heller, R.A. 他(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150−2155; 及び Heller, M.J. 他 (1997) 米国特許第5,605,662号を参照)。様々なタイプのマイクロアレイが周知であり、詳細については、DNA Microarrays: A Practical Approach, M. Schena, ed. (1999) Oxford University Press, Londonに記載されている。また、この文献を引用することを以って本明細書の一部とする。
【0237】
本発明の別の実施例ではまた、CCYPRをコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コーディング配列または非コーディング配列の何れかを用いることができるが、或る例では、コーディング配列より非コード配列が好ましい。例えば、多重遺伝子ファミリーのメンバー間にコーディング配列が保存されていることにより、染色体マッピング時に望ましくない交差ハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。この配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工の染色体、例えば、ヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC)、細菌P1産物、或いは単一染色体cDNAライブラリに対してマッピングされる(Harrington, J.J. ら (1997) Nat Genet. 15:345−355、Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127−134、Trask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149−154等を参照)。一度マッピングすると、本発明の核酸配列を用いて、例えば病状の遺伝と特定の染色体領域やまたは制限断片長多型(RFLP)の遺伝とが相関するような遺伝子連鎖地図を作成可能である(Lander, E.S. and D. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7353−7357を参照)。
【0238】
in sit蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)は、他の物理的及び遺伝子地図データと相関し得る(例えば、Heinz−Ulrich, 他による(1995) in Meyers, 前出, pp. 965−968を参照)。遺伝子地図データの例は、種々の科学誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man(OMIM)のワールドワイドウェブのサイトで見付けることができる。物理的な染色体地図上のCCYPRをコードする遺伝子の位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の疾患に対する素因が、このような疾患と関連するDNA領域の決定に役立つため、更なる位置を決定するクローニングが行われる。
【0239】
染色体標本のin sitハイブリダイゼーション、及び確定した染色体マーカーを用いた結合分析などの物理的マッピング技術を用いて、遺伝子地図を拡張することもできる。マウスなどの別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置させることにより、たとえ正確なヒト染色体の位置が分かっていなくても、関連するマーカーが明らかになる場合が多い。この情報は、位置クローニング或いは別の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患の研究をしている研究者にとって価値がある。疾患や症候群に関与する1つ或いは複数の遺伝子の位置が、例えば血管拡張性失調症の11q22−23などの特定の遺伝子領域に遺伝子結合によって大まかに決定されると、その領域に対するどの配列マッピングも、さらなる調査のための関連する遺伝子或いは調節遺伝子を表す(例えば、Gatti, R.A.他による(1988)Nature 336:577−580を参照)。また、目的の本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者、保有者、即ち感染者の間の、転位置、反転などによる染色体位置の違いを検出することもある。
【0240】
本発明の別の実施例では、CCYPR、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。このようなスクリーニングに用いる断片は、溶液に遊離、固体支持物に固定、細胞の表面上に保持、或いは細胞内に存在する。CCYPRと検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定してもよい。
【0241】
薬剤スクリーニングに用いる別の方法は、目的のタンパク質に対して、好適な結合親和性を有する化合物のスクリーニング処理能力を高めるために用いられる(例えば、Geysen,他による(1984) PCT出願番号 WO84/03564を参照)。この方法では、相当な数の異なる小さな試験用化合物が、プラスチックピン或いは他の基板の上に合成される。試験用化合物は、CCYPR、或いはその断片と反応してから洗浄される。次ぎに、結合されたCCYPRが、当分野で周知の方法で検出される。精製されたCCYPRはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用いられるプレート上で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いて、ペプチドを捕らえ、固体支持物に固定することもできる。
【0242】
別の実施例では、CCYPRと結合可能な中和抗体がCCYPRと結合するため試験用化合物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体が、CCYPRと1つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチドの存在も検出する。
【0243】
別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にCCYPRをコードするヌクレオチド配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び特異的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を提供することができる。
【0244】
当分野の技術者であれば、更なる説明がなくても前述の説明だけで最大限に本発明を利用できるであろう。したがって、以下に記載する特定の好適な実施例は、例示目的であって本発明を限定するものではない。
【0245】
前述した及び以下に記載した全ての特許出願、特許、刊行物、特に米国特許出願番号60/145,075、60/153,129、60/164,647に言及することをもって本明細書の一部とする。
【0246】
(実施例)
1 cDNA ライブラリの作製
RNAは、Clontech社から購入、或いは表4に列記した組織から単離した。まず、この組織の一部をホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解する一方、この組織の別の一部をホモジナイズしてフェノールに溶解するか、或いはTRIZOL (Life Technologies)、グアニジニウムイソチオシアネート及びフェノールの単相溶液などの好適な変性剤の混合液に溶解した。この溶解物を塩化セシウムにおいて遠心分離によって、或いはクロロホルムで抽出した。イソプロパノール或いは酢酸ナトリウムのどちらかとエタノール、或いは別の方法でこの溶解物からRNAを沈殿させた。
【0247】
RNAの純度を高めるためにRNAのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、DNA分解酵素でRNAを処理する。殆どのライブラリでは、オリゴd(T)連結常磁性粒子(Promega)またはOLIGOTEXラテックス粒子(QIAGEN. Valencia CA)、OLIGOTEX mRNA精製キット(QIAGEN)を用いてポリ(A+)RNAを単離した。別法では、POLY(A)PURE mRNA精製キット(Ambion, Austin TX)などの別のRNA単離キットを用いて組織溶解物から直接単離した。
【0248】
ある場合には、Stratagene社にRNAを提供し、Stratagene社が対応するcDNAライブラリを作製した。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム(Stratagene)またはSUPERSCRIPT プラスミドシステム(Life Technologies)を用いて当分野で周知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成してcDNAライブラリを作製した。(例えば、Ausubel, 1997,前出,ユニット5.1−6.6を参照)。逆転写は、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに結合させてから、好適な1つの制限酵素或いは複数の制限酵素でcDNAを消化した。殆どのライブラリでは、SEPHACRYL S 1000または SEPHAROSE CL2B、SEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィー(Amersham Pharmacia Biotech)、アガロースゲル電気泳動法によってcDNAの大きさ(300〜1000bp)を選択した。PBLUESCRIPTプラスミド(Stratagene)またはpSPORT1プラスミド(Life Technologies)、pcDNA2.1プラスミド(Invitrogen Carlsbad CA)、plNCYプラスミド(Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto CA)などの好適なプラスミドのポリリンカーの適合性制限酵素部位にcDNAを結合させた。この組換えプラスミドを、Stratagene社のXL1−Blue, XL1−BIueMRF、SOLR、またはLife Technologies社のDH5αまたはDH 10B、ELECTROMAX DH 10Bを含むコンピテント大腸菌細胞に導入し組み込んだ。
【0249】
2 cDNA クローンの単離
上記実施例1で記載したように得たプラスミドは、UNIZAPベクターシステム(Stratagene)或いは細胞溶解を利用したin vivo切除によって宿主細胞から回収した。MagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム(Promega)、及びAGTC Miniprep精製キット(Edge Biosystems, Gaithersburg MD)、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus Plasmid、QIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、REAL Prep 96プラスミドキットの内の少なくとも1つを用いてプラスミドを精製した。沈殿させた後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで4℃で保管した。
【0250】
別法では、ハイスループットの直接結合PCR法によって宿主細胞溶解物からプラスミドDNAを増幅した。(Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1−14)。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程を単一反応混合液で行った。サンプルを処理してから384−ウェルプレートに移して保管し、増幅したプラスミドDNAの濃度をPICOGREEN色素(Molecular Probes, Eugene OR)及びFluoroskan II蛍光スキャナー(Labsystems Oy, Helsinki, Finland)を用いて蛍光定量的に測定した。
【0251】
3 シークエンシング及び分析
実施例2に記載したようにプラスミドにおいて回収したインサイト社cDNAのシークエンシング方法は、以下の通りである。cDNAのシークエンシング反応は、標準的な方法で、或いはABI CATALYST 800 (PE Biosystems) thermal cyclerまたはPTC−200 thermal cycler (MJ Research)とHYDRAマイクロディスペンサー(Robbins Scientific) またはMICROLAB 2200 (Hamilton) 液体転移システムとの組み合わせなどのハイスループット装置で行った。cDNAのシークエンシング反応の準備には、Amersham Pharmacia Biotech社の試薬、またはABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reactionキット(PE Biosystems)などのABIシークエンシングキットに含まれる試薬を用いた。cDNAのシークエンシング反応の電気泳動的な分離及び標識したポリヌクレオチドの検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム(Molecular Dynamics)、標準ABIプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステム(PE Biosystems)、当分野で周知のその他の配列解析システムを用いた。cDNA配列の読み枠は、標準的な方法(Ausubel, 1997, 前出, unit 7.7)を用いて決定した。cDNA配列の幾つかを選択して、本実施例の6に記載した方法で配列を伸長した。
【0252】
cDNAのシークエンシングから得たポリヌクレオチド配列の構築及び解析は、当分野の技術者に周知のアルゴリズムを利用したソフトウェアを組合せて行った。表5は、利用したツール、ソフトウェア、アルゴリズム、それらの説明、引用文献、閾値パラメーターの概要を示す。表5の列1は用いたツール及びプログラム、アルゴリズム、列2はそれらの簡単な説明、列3は引用することで本明細書の一部とした引用文献、列4の記載部分は2つの配列の一致度の評価に用いたスコア及び確率値、他のパラメータを示す(確率値が高ければ高いほど配列間の相同性が高くなる)。配列の解析には、MACDNASIS PROソフトウェア(Hitachi Software Engineering, S. San Francisco CA)及びLASERGENEソフトウェア (DNASTAR)を用いた。
【0253】
ポリヌクレオチド配列の確証は、BLAST及び動的計画法、ジヌクレオチド最近接分析に基づいたプログラム及びアルゴリズムを用いて、ベクター及びリンカー、ポリA配列を取り除き、あいまいな塩基対をマスクすることで行った。次に、BLAST及びFASTA、BLIMPSに基づいたプログラムを用いて、公共のデータベースであるGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物のデータベースやBLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びPFAMなどのデータベースから選択した配列に対してこれらの配列を問合わせて注釈を得た。Phred及びPhrap、Consedに基づいたプログラムを用いて完全長のポリヌクレオチド配列の中にこれらの配列を構築して、BLAST及びFASTA、BLIMPSに基づいたプログラムでオープンリーディングフレームのためにスクリーニングした。完全長のポリヌクレオチド配列を翻訳して対応する完全長のアミノ酸配列を引き出し、GenBankデータベース(上記)及びSwissProt、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びPrositeなどのデータベース、またはPFAMなどの隠れマルコフモデル(HMM)に基づいたタンパク質ファミリーデータベースに対して問い合わせてこれらの完全長の配列を分析した。HMMは、確率を利用して遺伝子ファミリーのコンセンサス一次構造を解析する(例えば、Eddy, S.R. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6:361−365を参照)。
【0254】
完全長のポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の構築及び分析に用いる上記のプログラムは、SEQ ID NO:55−108からのポリヌクレオチド配列の断片の同定にも使用できる。約20〜4000個までのヌクレオチドの断片はハイブリダイゼーション及び増幅に有用であり、上記の発明で説明した。
【0255】
4 ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技術であり、特定の細胞種或いは組織からのRNAが結合されている膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う(例えば、Sambrook,前出, 7章; 及び Ausubel. F.M. 他、前出, 4章及び16章を参照)。
【0256】
BLASTに用いる類似のコンピュータ技術を用いて、GenBank或いはLIFESEQ(Incyte Pharmaceuticals)のようなcDNAデータベース内の同一或いは関連する分子を検索する。この分析は多くの膜系ハイブリダイゼーションより非常に速度が速い。さらにコンピュータ検索の感度を変更して、任意の特定の一致が、厳密な一致或いは相同的一致の何れかとして分類されるかを確定することができる。検索の基準は、
【0257】
【数1】
として定義される積スコアである。積スコアは、0〜100の標準化された値であり、以下のように求める。BLASTスコアにヌクレオチド配列の一致率を乗じ、その積を2つの配列の短い方の長さの5倍で除する。高スコアのセグメントの対(HSP)において一致する各塩基に+5のスコアを割り当て、各不適性塩基対に−4を割り当てることにより、BLASTスコアを計算する。2つの配列は、2以上のHSPを共有し得る(ギャップにより離隔される)。2以上のHSPがある場合には、最高BLASTスコアの塩基対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、BLASTアラインメントの断片的重複と質とのバランスを表す。例えば積スコア100は、比較した2つの配列の短い方の長さ全体にわたって100%一致する場合にのみ得られる。積スコア70は、100%の一致で一端が70%重畳しているか、或いは88%一致で他端が100%重畳しているかの何れかの場合である。積スコア50は、100%の一致で一端が50%重畳しているか、或いは79%の一致で他端が100%重畳しているかの何れかの場合である。
【0258】
ノーザン分析の結果は、CCYPRをコードする転写物が発生したライブラリの分布割合として報告される。分析には、器官/組織及び疾患によるcDNAライブラリの分類も含まれる。器官/組織のカテゴリーには、心血管、皮膚、発生、内分泌、胃腸、造血/免疫、筋骨格、神経、生殖、泌尿器が含まれる。疾患のカテゴリーには、癌、炎症、外傷、細胞増殖、神経、プール(pooled)が含まれる。カテゴリー別に、目的の配列を発現するライブラリの数を数えて、それを全ての範囲のライブラリの数で除した。各組織に特異的に発現する割合(パーセント)と各疾患で発現する割合を表3に示した。
【0259】
5 CCYPR をコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
SEQ ID NO:55−108を構築するために用いたcDNA配列を、BLAST及びSmith−Watermanアルゴリズムを用いて、インサイト社LIFESEQデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。SEQ ID NO:55−108と一致するこれらのデータベースの配列を、Phrap(表5)などの構築アルゴリズムを使用して、連続及び重複した配列のクラスターに組み入れた。Stanford Human Genonse Center (SHGC)、Whitehead Institute for Genome Research (WIGR)及びGenethonなどの公共の情報源から入手できる放射線ハイブリッド(radiation hybrid)及び遺伝子マッピングのデータを用いて、クラスター化した配列がすでにマッピングされているかを調べる。クラスターにマッピングされた配列が含まれている場合は、そのクラスターの全ての配列(特定のSEQ ID NOを含む)をそのマッピング位置に割り当てた。
【0260】
SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、 SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、 SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:104、およびSEQ ID NO:105の遺伝子地図の位置は、ヒト染色体の区間即ち範囲として本明細書の発明の部分に記載した。SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:90、およびSEQ ID NO:100では、2つ以上のマッピング位置を記載したが、これは、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:90、およびSEQ ID NO:100と類似性を有する完全には一致していないが既にマッピングされた配列が、それぞれのクラスターに組み入れられたことを示唆するものである。センチモルガンで示したマッピング位置の範囲は、染色体の短腕(p)の末端から測定した(センチモルガン(cM)は、同一染色体上の遺伝子間の乗換え率に基づいた距離を表す単位である。平均すると、1cMはヒトの染色体の1メガベースに概ね等しいいが、組換え率の高い部分と低い部分があるため、大きく変化し得る)。距離cMは、配列がそれぞれのクラスターに含まれている放射線ハイブリッドマーカーの境界を検出できるGenethonによってマッピングされた遺伝子マーカーに基づいている。ヒトゲノム地図やNCBI 「GeneMap’99」World Wide Web site (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/)などの公衆が入手可能な情報を用いて、既に同定された疾患遺伝子が上記した区間内或いは隣接部に存在するかを決定することができる。
【0261】
6 CCYPR をコードするポリヌクレオチドの伸長
SEQ ID NO:55−108の完全長の核酸配列は、完全長分子の好適な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてその完全長分子の好適な断片を伸長して作製した。一方のプライマーは既知の断片の5’の伸長を開始するために合成し、他方のプライマーは既知の断片の3’の伸長を開始するために合成した。開始プライマーは、OLIGO 4.06ソフトウェア(National Biosciences)或いは他の適切なプログラムを用いて、約22個から約30個のヌクレオチドの長さで約50%以上のGC含量を有し、かつ約68〜72℃の温度で標的配列にアニールするように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体が生じないようにヌクレオチドを伸長した。
【0262】
選択されたヒトcDNAライブラリを用いてこの配列を伸長した。2段階以上の伸長が必要な場合、若しくは望ましい場合は、追加或いはネスト化プライマーの組を設計する。
【0263】
当分野で既知の方法を利用したPCR法で高い忠実度で増幅した。PCRはPTC−200 thermal cycler (MJ Research, Inc.)用いて96ウェルブロックプレートで行った。反応混合液は、鋳型DNA及び200 nmolの各プライマー、Mg2 +と(NH4)2SO4とβ−メルカプトエタノールを含むバッファー、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)、ELONGASE酵素(Life Technologies)、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を含む。プライマーの組、PCI AとPCI Bに対して以下のパラメーターで増幅を行った。
ステップ1 94℃で3分間
ステップ2 94℃で15秒
ステップ3 60℃で1分間
ステップ4 68℃で2分間
ステップ5 ステップ2、3、及び4を20回繰り返す
ステップ6 68℃で5分間
ステップ7 4℃で保管
別法では、プライマーの組、T7とSK+に対して以下のパラメーターで増幅を行った。
ステップ1 94℃で3分間
ステップ2 94℃で15秒
ステップ3 57℃で1分間
ステップ4 68℃で2分間
ステップ5 ステップ2、3、及び4を20回繰り返す
ステップ6 68℃で5分間
ステップ7 4℃で保管。
【0264】
各ウェルのDNA濃度は、1X TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25% (v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Coming Costar, Acton MA)の各ウェルに分配してDNAが試薬と結合できるようにして測定する。このプレートをFluoroskan II (Labsystems Oy, Helsinki, Finland)でスキャンして、サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量化する。反応混合物の5〜10μlのアリコットを1%のアガロースミニゲル上での電気泳動によって解析し、何れの反応物が配列を伸長することに成功したかを決定する。
【0265】
伸長したヌクレオチドを脱塩及び濃縮してから384ウェルプレートに移し、CviJIコレラウィルスエンドヌクレアーゼ(Molecular Biology Research, Madison WI)で消化し、pUC 18ベクター(Amersham Pharmacia Biotech)に再連結する前に音波処理またはせん断を行った。ショットガンシークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度(0.6〜0.8%)のアガロースゲル上に分離して断片を切断し、寒天をAgar ACE (Promega)で消化した。T4リガーゼ(New England Biolabs, Beverly MA)を用いて伸長したクローンをpUC 18ベクター(Amersham Pharmacia Biotech)に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)で制限部位の延び出しを処理してコンピテント大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB/2Xカルベニシリン培養液の384ウェルプレートに37℃で一晩培養した。
【0266】
細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。
ステップ1 94℃で3分間
ステップ2 94℃で15秒
ステップ3 60℃で1分間
ステップ4 72℃で2分間
ステップ5 ステップ2、3、及び4を29回繰り返す
ステップ6 72℃で5分間
ステップ7 4℃で保管。
上記したようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量化した。DNA回収率の悪いサンプルは、上記した条件で再び増幅した。サンプルを20%のジメチルサルホサイド(dimethysulphoxide)(1:2, v/v)で希釈し、DYENAMIC DIRECTキット(Amersham Pharmacia Biotech)またはABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reactionキット(PE Biosystems)を用いてシークエンシングした。
【0267】
同様に上述の手順で、SEQ ID NO:55−108のヌクレオチド配列を利用し、この伸長のために設計したオリゴヌクレオチドと好適なゲノムライブラリを用いて5′調節配列を得た。
【0268】
7 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用法
SEQ ID NO:55−108から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約20塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、より大きなcDNAフラグメントの場合でも基本的に同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、OLIGO4.06ソフトウェア(National Bioscience)のような最新式のソフトウェアを用いてデザインし、50pmolの各オリゴマーと、250μCiの[γ‐32P]アデノシン三リン酸(Amersham, Chicago, IL)及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ(DuPont NEN、Boston MA)とを組み合わせて用いることにより標識する。標識されたオリゴヌクレオチドを、SEPHADEX G−25超精細排除デキストランビードカラム(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて実質的に精製する。毎分107カウントの標識されたプローブを含むアリコットを、次のエンドヌクレアーゼ、Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba1或いはPvu II(DuPont NEN)の1つを用いて切断したヒトゲノムDNAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において用いる。
【0269】
各切断物からのDNAを、0.7%アガロースゲル上で分画して、ナイロン製メンブラン(Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH)に転写する。ハイブリダイゼーションは40℃で16時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くため、例えば、最大0.1xクエン酸ナトリウム食塩水及び0.5%ドデシル硫酸ナトリウムの条件の下、ブロットを順次室温にて洗浄する。ハイブリダイゼーションパターンをオートラジオグラフィー或いは別のイメージ化手段で視覚化して比較する。
【0270】
8 マイクロアレイ
マイクロアレイ上のアレイエレメントの連結または合成は、フォトリソグラフィ、ピエゾプリント(インクジェットプリンター、前出のBaldeschweiler等を参照)、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成することが可能である。上記各技術において基板は、均一な非多孔性の固体とするべきである(Schena (1999).前出)。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。別法では、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱や紫外線、または化学的或いは機械的な結合手段で基板の表面にエレメントを配置して結合させることができる。通常のアレイは利用可能な方法や機械を用いて作製でき、任意の適正な数のエレメントを含めることができる(Schena, M. 他 (1995) Science 270:467−470、Shalon. D. 他 (1996) Genome Res. 6:639−645、Marshall, A. and J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27−31.を参照)。
【0271】
完全長cDNA、発現遺伝子配列断片(EST)、或いはそれらの断片やオリゴマーが、マイクロアレイのエレメントとなり得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片やオリゴマーを、LASERGENEソフトウェア(DNASTAR)などの当分野で周知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。このアレイエレメントを、生体サンプル中のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせる。生体サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識またはその他の分子タグに結合する。ハイブリダイゼーションの後、生体サンプルからハイブリダイズしなかったヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントにおけるハイブリダイゼーションを検出する。別法では、レーザー脱離及び質量スペクトロメトリーを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの相補性の程度及び相対的存在量は、算定することができる。一実施例におけるマイクロアレイの調整及び使用について、以下に詳述する。
【0272】
組織または細胞サンプルの準備
グアニジウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全RNAを単離し、オリゴ(dT)セルロース法を用いてポリ(A)+RNAを精製する。各ポリ(A)+RNAサンプルは、MMLV逆転写酵素、0.05 pg/μlのオリゴ(dT)プライマー(21mer)、1×第1鎖緩衝液、0.03単位/μlのRNアーゼインヒビター、500μM dATP、500μM dGTP、500μM dTTP、40μM dCTP、40μM dCTP−Cy3(BDS)またはdCTP−Cy5(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて逆転写する。この逆転写反応は、GEMBRIGHTキット(Incyte)を用いて、200 ngのポリ(A)+RNAを含む25 ml容量で行う。特異的なコントロールポリ(A)+RNAは、in vitro転写により非コーディング酵母ゲノムDNAから合成する。370℃で2時間インキュベートした後、各反応サンプル(一方はCy3標識、他方はCy5標識)は、2.5mlの0.5M 水酸化ナトリウムで処理し、850℃で20分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを変性する。サンプルは、2つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム(CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA)を用いて精製する。結合後、2つの反応サンプルを、1mlのグリコーゲン(1mg/ml)、60mlの酢酸ナトリウム及び300mlの100%エタノールを用いてエタノール沈殿させる。サンプルは次に、SpeedVAC(Savant Instruments Inc., Holbrook NY)を用いて乾燥して仕上げ、14μl 5×SSC/0.2% SDS中で再懸濁する。
【0273】
マイクロアレイの準備
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは、クローン化cDNA挿入断片を含むベクターを含有する細菌性細胞から増幅する。PCR増幅は、cDNA挿入断片に隣接するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。30サイクルのPCRによって、1〜2ngの初期量から5μgを超える最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅されたアレイエレメントは、SEPHACRYL−400(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて精製する。
【0274】
精製したアレイエレメントを、ポリマーコートされたスライドガラス上に固定する。顕微鏡スライドガラス(Corning)は、処理中及び処理後に大量の蒸留水での洗浄と、0.1%のSDS及びアセトン中で超音波による洗浄を行う。スライドガラスは、4%フッ化水素酸(VWR Scientific Products Corporation (VWR), West Chester PA)中でエッチングし、蒸留水中で広範囲にわたって洗浄し、95%エタノール中の0.05%アミノプロピルシラン(Sigma)でコーティングする。コーティングしたスライドガラスは、110℃の天火で硬化させる。
【0275】
米国特許第5,807,522号に記載されている方法を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメントを付加する。この特許に引用することを以って本明細書の一部とする。平均濃度が100ng/μlのアレイエレメントDNA1μlを高速機械装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント(open capillary printing element)に充填する。次にこの装置が、スライド毎に約5nlのアレイエレメントサンプルを分注する。
【0276】
マイクロアレイには、STRATALINKER UVクロスリンカー(Stratagene)を用いてUV架橋する。マイクロアレイは、室温において0.2%SDSで1回洗浄し、蒸留水で3回洗浄する。非特異的な結合部位は、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)(Tropix, Inc., Bedford MA)における0.2%カゼイン中で60℃で30分間マイクロアレイをインキュベートし、その後上述したように0.2%SDS及び蒸留水で洗浄することによってブロックする。
【0277】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応液は、5×SSC、0.2%SDSハイブリダイゼーション緩衝液にCy3及びCy5標識したcDNA合成産物を各0.2μg含む9μlのサンプル混合体を含めたものである。サンプル混合液を、65℃で5分間加熱し、マイクロアレイ表面上に一定量分注してから1.8cm2 のカバーガラスで覆う。このアレイを、顕微鏡スライドより僅かに大きいキャビティを有する防水チェンバーに移す。チャンバーの角に140μlの5×SSCを加えて、チャンバー内を湿度100%に保持する。このアレイを含むチャンバーを、60℃で約6.5時間インキュベートする。アレイは、第1洗浄緩衝液中(1×SSC,0.1%SDS)において45℃で10分間、第2洗浄緩衝液中(0.1×SSC)において45℃で10分間それぞれ3回洗浄し、その後乾燥させる。
【0278】
検出
レポーター標識されたハイブリダイゼーション複合体は、Cy3を励起するための488nm、及びCy3を励起するための632nmのスペクトル線を生成し得るInnova 70混合ガス10 Wレーザー(Coherent, Inc., Santa Clara CA)を備えた顕微鏡で検出する。20倍の顕微鏡対物レンズ(Nikon, Inc., Melville NY)を用いて、アレイ上に励起レーザー光を集中させる。このアレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御X−Yステージに置き、対物レンズを通してラスタスキャンする。本実施例で用いた1.8cm×1.8cmのアレイは、20μmの解像度でスキャンする。
【0279】
2つの異なるスキャンにおいて、混合ガスマルチラインレーザーは2つの蛍光体を連続的に励起する。放射された光は、波長に基づいて2つの蛍光体に対応する2つの光電子増倍管検出器(PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ)に分割される。アレイと光電子増倍管との間に配設された好適なフィルターを用いて信号をフィルタリングする。用いる蛍光体の最大発光は、Cy3では565nm、Cy5では650nmである。装置は両方の蛍光体からのスペクトルを同時に記録できるが、レーザー源に好適なフィルターを用いて、蛍光体1つにつき1回スキャンし、各アレイを通常2回スキャンする。
【0280】
スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるcDNAコントロール種により生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的DNA配列を含め、その位置におけるシグナルの強度がハイブリダイズする種の重量比1:100,000に相関するようにする。異なる試料(例えば検査細胞及びコントロール細胞を代表する)からの2つのサンプルを、各々異なる蛍光体で標識し、他と異なって発現する遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズさせる場合には、較正は2つの蛍光体を有する較正するcDNAのサンプルを標識して、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えて行う。
【0281】
光電子増倍管の出力は、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールされた12ビットRTI−835Hアナログ−ディジタル(AID)変換ボード(Analog Devices, Inc., Norwood MA)を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデータは、リニア20色変換を用いてシグナル強度が青色(低シグナル)から赤色(高シグナル)までの擬似カラー範囲にマッピングされるイメージとして表示される。データはまた、定量的に分析される。2つの異なる蛍光体を同時に励起して測定する場合には、各蛍光体の発光スペクトルを用いて、先ずデータは蛍光体間の光学的漏話(重複発光スペクトルに起因する)に対して補正される。
【0282】
グリッドを蛍光シグナルイメージ上に重畳して、各スポットからのシグナルがグリッドの各エレメントに中央に位置するようにする。各エレメント内の蛍光シグナルを統合し、シグナルの平均強度に対応する数値を得る。シグナル分析に用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム(Incyte)である。
【0283】
9 相補的ポリヌクレオチド
CCYPRをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然のCCYPRの発現を低下させるため即ち阻害するために用いられる。約15〜約30個の塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、より小さな或いはより大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Oligo4.06ソフトウェア(National Biosciences)及びCCYPRのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な5′配列から相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがCCYPRをコードする転写物に結合するのを阻害する。
【0284】
10 CCYPR の発現
CCYPRの発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌でCCYPRが発現するために、抗生物質耐性及びcDNAの転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにcDNAをサブクローニングする。このようなプロモーターには、lacオペレーター調節エレメントに関連するT5またはT7バクテリオファージプロモーター及びtrp−lac(tac)ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。組換えベクターを、BL21(DE3)などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発されるとCCYPRを発現する。真核細胞でのCCYPRの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一般にバキュロウイスルスとして知られているAutographica californica核多面性ウイルス(AcMNPV)を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、CCYPRをコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強いポリヘドリンプロモータによって高いレベルのcDNAの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodoptera frugiperda (Sf9)昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。(例えば、Engelhard. E. K.他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224−3227; Sandig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937−1945.を参照)。
【0285】
殆どの発現系では、CCYPRが、例えばグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、またはFLAGや6−Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製が素早く1回で行うことができる。Schistosoma japonicumからの26キロダルトンの酵素GSTによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で固定されたグルタチオンで融合タンパク質の精製が可能となる(Amersham Pharmacia Biotech)。精製の後、GST部分を特定の操作部位でCCYPRからタンパク分解的に切断できる。アミノ酸8個のペプチドであるFLAGで、市販のモノクローナル及びポリクローナル抗FLAG抗体(Eastman Kodak)を用いた免疫親和性の精製が可能となる。6個の連続するヒスチジン残基のストレッチである6−Hisによって、金属キレート樹脂(QIAGEN)で精製が可能となる。タンパク質の発現及び精製の方法は、Ausubel (1995,前出, ch 10, 16)に記載されている。これらの方法で精製したCCYPRを直接用いて以下の実施例11及び15のアッセイを行うことができる。
【0286】
11 CCYPR の活性の実証
CCYPRの活性では、細胞増殖をSwissマウス3T3細胞における新規に開始したDNA合成として測定する。当分野で周知の方法を用いて、CCYPRをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを静止状態の3T3細胞内にトランスフェクトする。次に、一過性にトランスフェクトした細胞を、放射性DNA前駆体である[3H]チミジンの存在下でインキュベートする。適切に様々な量のCCYPRリガンドをトランスフェクト細胞に加える。適当な時間間隔で酸不溶性DNAの中に取り込まれた[3H]チミジンを測定する。この取り込まれた[3H]チミジンの量が、新規に合成されたDNA、従ってCCYPRの活性に比例する。
【0287】
12 機能のアッセイ
CCYPRの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのCCYPRをコードする配列の発現によって評価する。cDNAを、cDNAを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。このようなベクターには、pCMV SPORTTM (Life Technologies.)及びpCR 3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを含んでいる。5〜10μgの組換えベクターを、例えば内皮由来か造血由来のヒト細胞株にリポソーム製剤或いは電気穿孔法によって一時的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む1〜2μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入された細胞と形質移入されていない細胞とを区別できる。また、標識タンパク質の発現によって、cDNAの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。このような標識タンパク質には、緑色蛍光タンパク質(GFP;Clontech)、及びCD64またはCD64−GFP融合タンパク質が含まれる。レーザー光学に基づいた技術を利用した自動流動細胞計測法(FCM)を用いて、GFPまたはCD64−GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。また、FCMで、先行した或いは同時の細胞死の現象を診断する蛍光分子の取り込みを検出して計量する。これらの現象には、プロピジウムヨウ化物でのDNAの染色によって計測される核DNA内容物の変化と、ブロモデオキシウリジンの取り込み量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節と、特異的な抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内のタンパンク質の発現の変化と、蛍光複合アネキシンVタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とが含まれる。流動細胞計測法は、Ormerod, M. G.による (1994) Flow Cytometry Oxford, New York, NY.に記載されている。
【0288】
遺伝子発現におけるCCYPRの影響は、CCYPRをコードする配列とCD64またはCD64−GFPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。CD64またはCD64−GFPは形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンG(IgG)の保存された領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換されない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビードを用いて分離することができる(DYNAL. Lake Success. NY)。mRNAは、当分野で周知の方法で細胞から精製することができる。CCYPR及び目的の他の遺伝子をコードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【0289】
13 CCYPR に特異的な抗体の産生
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE;例えば、Harrington, M.G. (1990) Methods Enzymol. 1816−3088−495を参照)または他の精製技術で実質的に精製されたCCYPRを用いて、標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す。
【0290】
別法では、CCYPRアミノ酸配列をLASERGENEソフトウェア(DNASTAR)を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを用いて当業者に周知の方法で抗体を生産する。C末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分野で周知である(例えば、前出のAusubel, 1995,11章を参照)。
【0291】
通常、約15残基の長さのオリゴペプチドを、Applied BiosystemsのABI 431Aペプチドシンセサイザー(PE Biosystems)を用いてfmoc法のケミストリにより合成し、N−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)を用いた反応によりKLH(Sigma−Aldrich, St. Louis MO)に結合させて、免疫原性を高める(例えば、前出のAusubel, 1995を参照)。フロイントの完全アジュバントにおいてオリゴペプチド−KLH複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗CCYPR活性を検査するには、ペプチドまたはCCYPRを基板に結合し、1%BSAを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【0292】
14 特異的抗体を用いる天然 CCYPR の精製
天然CCYPR或いは組換えCCYPRを、CCYPRに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、CNBr−活性化SEPHAROSE(Amersham Pharmacia Biotech)のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗CCYPR抗体とを共有結合させることにより形成する。結合の後、そのレジンを製造者の使用説明書に従ってブロッキング処理し洗浄する。
【0293】
CCYPRを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、CCYPRを優先的に吸着できる条件で(例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで)そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とCCYPRとの結合を切るような条件で(例えば、pH2〜3のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで)溶出させ、CCYPRを回収する。
【0294】
15 CCYPR と相互作用する分子の同定
CCYPR又は生物学的に活性なその断片を、125Iボルトンハンター試薬(例えば、Bolton A.E.及びW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529を参照)で標識する。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したCCYPRと共にインキュベートし、洗浄して、標識したCCYPR複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なCCYPR濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したCCYPRの数量及び親和性、会合についての値を計算する。
【0295】
別法では、CCYPRと相互作用する分子を、Fields, S.及びO. Song(1989, Nature 340:245−246)に記載の酵母2−ハイブリッドシステム(yeast two−hybrid system)やMATCHMAKERシステム(Clontech)などの2−ハイブリッドシステムに基づいた市販のキットを用いて分析する。
【0296】
CCYPRはまた、ハイスループット型の酵母2ハイブリッドシステムを使用するPATHCALLINGプロセス(CuraGen Corp., New Haven CT)に用いて、遺伝子の2つの大きなライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定することができる(Nandabalan, K. 他 (2000) 米国特許第6,057,101号)。
【0297】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。特定の好適実施例に基づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連する分野の専門家には明らかな、本明細書に記載の本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲に含まれる。
【0298】
(表の簡単な説明)
表1は、CCYPRをコードする完全長の配列を作り出すために用いた、ポリペプチド配列及びヌクレオチド配列の配列番号(SEQ ID NO)、クローン識別番号、cDNAライブラリ、及びcDNA断片を示す。
【0299】
表2は、潜在モチーフ及び相同配列を含む各ポリペプチド配列の特徴、並びにCCYPRの解析に用いた方法、アルゴリズム、及び検索可能なデータベースを示す。
【0300】
表3は、各核酸配列の選択された断片と、ノーザン分析によって決定された各核酸配列の組織特異的発現パターンと、これらの組織に関連した疾患、異常症及び症状と、各DNAがクローニングされたベクターとを示す。
【0301】
表4は、CCYPRをコードするcDNAクローンを単離したcDNAライブラリの作製に用いた組織を示す。
【0302】
表5は、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、及びアルゴリズム、並びにその説明、引用文献、閾値パラメーターを示す。
【0303】
【表1】
【0304】
【表2】
【0305】
【表3】
【0306】
【表4】
【0307】
【表5】
【0308】
【表6】
【0309】
【表7】
【0310】
【表8】
【0311】
【表9】
【0312】
【表10】
【0313】
【表11】
【0314】
【表12】
【0315】
【表13】
【0316】
【表14】
【0317】
【表15】
【0318】
【表16】
【0319】
【表17】
【0320】
【表18】
【0321】
【表19】
【0322】
【表20】
【0323】
【表21】
【0324】
【表22】
【0325】
【表23】
【0326】
【表24】
【0327】
【表25】
【0328】
【表26】
【0329】
【表27】
【0330】
【表28】
【0331】
【表29】
【0332】
【表30】
【0333】
【表31】
【0334】
【表32】
【0335】
【表33】
【0336】
【表34】
【0337】
【表35】
【0338】[0001]
(Technical field)
The present invention relates to the nucleic acid and amino acid sequences of cell cycle and cell growth proteins, and to the use of these sequences in the diagnosis, treatment and prevention of cell growth abnormalities including immune disorders, developmental disorders, disorders of cell signaling, and cancer. About use.
[0002]
(Background of the Invention)
Cell division is a fundamental process in the growth and reproduction of all organisms. In unicellular organisms such as yeasts and bacteria, the number of organisms doubles as the cells divide. However, multicellular organisms need to divide many times to replenish cells lost due to attrition or programmed cell death, and to differentiate into new tissues and organs. Although the details of the cell division cycle vary, the basic process consists of three main phenomena. In the quiescent phase, the first phenomenon, preparation for cell division, DNA replication, and synthesis of essential proteins are performed. In mitosis, the second phenomenon, the components of the nucleus divide and divide into opposing ends of the cell. In the last event, the cytokinesis phase, cytoplasmic division and nuclear division occur. The progress and timing of cell cycle transition is under the control of the cell cycle regulatory system. The cell cycle regulatory system controls positive or negative regulatory circuits at various checkpoints.
[0003]
Mitosis signals the end of the quiescent phase, followed by the cytokinesis phase. Mitosis has four stages, which occur in the early, middle, late, and end stages of fission. In the early phase of fission, a bipolar spindle consisting of microtubules and related proteins such as dynein is formed from the polar fission center. In metaphase, nucleus components condense and kinetochore fibers grow, which aid in physical attachment to the spindle. During anaphase, nuclear components move to opposite poles along the spindle. At the end of mitosis, the kinetochore fibers and spindles of the nuclear components disappear. Mitosis depends on the interaction of many proteins. For example, it was found that mutations in the Drosophila zw10 gene did not result in chromosome segregation. The ZW10 protein appears to serve as a tension detection checkpoint in the centromere at the onset of anaphase. The ZW10 protein also appears to play a direct role in the recruitment of dynein to the centromere and in the involvement of dynein in regulating chromosome segregation and / or pole migration during late onset (Starr). , DA, et al. (1998) J. Cell Biol. 142: 763-774).
[0004]
Controlled cell cycle progression is determined by growth regulatory pathways and basic cell cycle mechanisms. Cell cycle regulators were identified by selecting human and yeast cDNAs that, when oversecreted, block or activate cell cycle arrest signals in the yeast mating hormone pathway. Known regulators include the yeast CDC (cell division regulation) gene, which includes CDC91, which blocks blocking signals, and the human CPR (restored cell cycle progression) genes, such as CPR8 and CPR2. CPR genes include a variety of proteins including cyclins, tumor suppressor gene binding proteins, chaperones, transcription factors, translation factors, and RNA binding proteins (Edwards, MC et al. (1997) Genetics 147: 1063-1076).
[0005]
CDC23, a human CDC protein, functions in the transition from metaphase to anaphase, and also functions out of mitosisS. cerevisiaeIt is homologous to the protein CDC23 (Zhao, N. et al. (1998) Genomics 53: 184-190).C. elegansThe gene cullin-1 (cull) is a negative regulator of the cell cycle. Cul regulates the transition from G1 to S phase. cull is mutatedC. elegans In mitotic arrest, this transition is accelerated by overriding mitosis, resulting in hyperplasia in all tissues. cull isS. cerevisiae, Nematodes, and members of a conserved gene family across humans (Kipreos, ET et al. (1996) Cell 85: 929-839).
[0006]
Some cell cycle transitions, including the entry and exit of mitosis by cells, depend on the activation and repression of cyclin-dependent kinases (Cdks). Cdk is a complex composed of Cdk, a kinase subunit, and cyclin, an activation subunit, and is regulated at various levels.Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombeThere is only one type of Cdk, but multicellular organisms have many differentiated Cdks. Cyclin binds and activates cyclin-dependent protein kinase, which then phosphorylates and activates selected proteins involved in the mitotic process. The Cdk-cyclin complex is both positively and negatively regulated by phosphorylation and targeted degradation. Molecules such as CDC4 and CDC53 are involved in this targeted degradation. In addition, Cdks are regulated by inhibitors that alter specificity and access to regulatory factors, and by binding to proteins such as Suc1 (Patra, D. and WGG Dunphy (1996) Genes Dev. 10: 1503- 1515; and Mathias, N. et al. (1996) Mol. Cell Biol. 16: 6634-6643).
[0007]
Reproduction
The male and female reproductive systems are complex and are involved in various aspects of growth and development. Guyton, A., for the anatomy and physiology of the male and female reproductive systems. C. Please refer to ((1991)Textbook of Medical Physiology, W.S. B. Saunders Co. , Philadelphia PA, pp. 899-928).
[0008]
In the male reproductive system, sperm is formed during the process of spermatogenesis. Male reproductive function is controlled by various hormones. These hormones act on the accessory genitalia and are involved in cell metabolism, growth, and other bodily functions.
[0009]
Spermatogenesis begins at puberty as a result of stimulation by gonadotropins released from the anterior pituitary gland. Immature spermatozoa (spermatogonia) undergo mitosis before meiosis and full maturation. Testicular secretion of male hormones. The most abundant testosterone is essential for immature sperm growth and differentiation, and male sexual characteristics of the male body. Gonadotropin-releasing hormone (GnRH), luteinizing hormone (LH), and three other male hormones, follicle-stimulating hormone (FSH), control sexual function.
[0010]
The uterus, ovaries, fallopian tubes, vagina, and breasts make up the female reproductive system. Oocytes are supplied from the ovaries, and the fetus grows in the uterus. The fallopian tubes and vagina are sub-organs located at the top and bottom of the uterus, respectively. Both the uterus and ovaries also play a role in the growth and loss of fertility over the life of a woman. The primary function of the breast is lactation. Numerous endocrine signals from the ovaries, uterus, pituitary gland, hypothalamus, adrenal glands, and other tissues regulate reproduction and lactation. These signals change over the menstrual cycle and the life of a woman. Similarly, the sensitivity of the reproductive tract to these endocrine signals varies over the life of a woman.
[0011]
The combination of positive and negative feedback on the ovaries, pituitary gland, and hypothalamus controls physiological changes in the monthly ovulatory and endometrial cycles. The anterior pituitary gland secretes two major gonadotropins, follicle stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH). Secretion of these hormones is controlled by the negative feedback of steroids, well known as ovarian estradiol. If fertilization does not occur, estrogen and progesterone levels fall. This sudden drop in ovarian hormones results in menstruation, or diminution of the endometrium.
[0012]
Hormones are also responsible for all steps of pregnancy, labor, lactation, and menopause. During pregnancy, human chorionic gonadotropin (hCG), estrogen, progesterone, and human chorionic somatomanmotropin (hCS) are produced in large quantities in the placenta. Also, hCG, a glycoprotein similar to luteinizing hormone, stimulates the luteum to continue producing estrogen and progesterone, unlike when the egg is not fertilized. hCS is similar to growth hormone and is crucial for fetal nutrition.
[0013]
Women's breasts also mature during pregnancy. Large amounts of estrogen secreted by the placenta initiate the growth and branching of the milk duct system, and prolactin secreted by the pituitary gland initiates milk secretion.
[0014]
Delivery involves changes in several hormones (described below) that increase uterine contractions to end pregnancy. Estrogen levels are higher than progesterone levels. Oxytocin is secreted from the pituitary gland. At the same time, the sensitivity of the uterus to oxytocin increases. The fetus itself secretes oxytocin, cortisol (from the adrenal gland), and prostaglandins.
[0015]
Menopause occurs when most follicles have regressed. Second, the production of estradiol in the ovaries is reduced, and the negative feedback in the pituitary and hypothalamus is reduced. As the ovulatory cycle continues, the mean levels of circulating FSH and LH increase. Thus, the ovary's responsiveness to gonadotropin decreases and the interval between menstrual cycles increases. Subsequently, the amount of menstrual bleeding decreases and fertility is lost.
[0016]
Differentiation and proliferation
Tissue growth requires a complex and regular pattern of cell proliferation, cell differentiation, and apoptosis. Cell growth must be controlled to maintain the number of cells and the spatial organization of the cells. This regulation depends on the proper expression of proteins that control cell cycle progression in response to extracellular signals such as growth factors and mitogens, and intracellular cues such as DNA damage and nutrient starvation. Molecules that directly or indirectly regulate cell cycle progression fall into several groups. Within that group are growth factors and their receptors, second messengers and signaling proteins, oncogene products, tumor suppressor proteins, and mitogens.
[0017]
Embryogenesis is a process in which an intrinsic protein expression pattern controls proper development. This process involves a number of proteins, each with a unique and highly coordinated expression pattern. For example, in mice, transiently regulated expression of two related Msg1 and Mrg1 is required for normal embryo development. Msg1 is expressed in the posterior region of the developing mesoderm, while Mrg1 is expressed in the anterior endoderm. During embryogenesis, proper coordinated expression of each protein is essential for proper formation of tissues and organs (Dunwoodie, SL et al. (1998) Mech. Dev. 72: 27-40). .
[0018]
Growth factors were initially reported to be serum factors required for promoting cell proliferation. Most growth factors are large secreted polypeptides that act on cells in the local environment. Growth factors bind to and activate specific cell surface receptors, thereby initiating an intracellular signaling cascade. Many growth factor receptors are classified as receptor tyrosine kinases that autophosphorylate upon binding to a ligand. Autophosphorylation causes these receptors to interact with signaling proteins characterized by the presence of SH2 or SH3 domains (Src homology regions 2 or 3). In turn, these proteins, along with GTPase activating protein (GAP), guanine nucleotide releasing protein (GNRP), and other guanine nucleotide exchange factors, activate the activity of low molecular weight G proteins such as Ras, Rab, and Rho. Adjust. Low molecular weight G proteins act as molecular switches that activate other downstream phenomena, such as the mitogen-activated protein kinase (MAP kinase) cascade. MAP kinase ultimately activates mitogen transcription.
[0019]
In addition to growth factors, small signaling peptides and hormones also affect cell proliferation. These molecules initially bind to another class of receptors, the trimeric G protein-coupled receptors (GPCRs). This GPCR is found primarily on the surface of immune, neuronal, and neuroendocrine cells. Upon binding of the ligand, the GPCR activates the trimeric G protein, thereby causing phospholipase C, Ca2+, And the level of intracellular second messengers such as cyclic AMP are increased. Most GPCR-mediated signaling pathways promote cell proliferation indirectly by secreting or degrading other signaling molecules that have direct mitogenic effects. These signaling cascades often involve the activation of kinases and phosphatases. Certain growth factors, such as some members of the transforming growth factor beta (TGF-beta) family, stimulate cell proliferation in some cell types and inhibit cell proliferation in other cell types. Act on. Growth factors can also stimulate one cell at one concentration and suppress the same cell at another. Most growth factors also have a variety of functions in addition to regulating cell growth and division, and may regulate cell growth, survival, differentiation, migration, or function in some situations. For example, the tumor necrosis factor / nerve growth factor (TNF / NGF) family promotes or suppresses cell death as well as controls cell proliferation and differentiation. The cellular response depends on the type of cell to which the surface receptor has been stimulated, the stage of differentiation and transformation of the cell, and the type of stimulus acting on the cell (Smith, A. et al. (1994) Cell 76: 959). And Nocentini, G. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 6216-6221).
[0020]
Neighboring cells in certain tissues compete for growth factors and, when supplied in unlimited quantities in the perfusion system, grow and increase cell concentration until cell division is inhibited in a concentration-dependent manner. Cells also often exhibit anchorage dependence of cell division. This anchorage dependence may be related to the formation of an adhesion zone linking the cytoskeleton to the extracellular matrix (ECM). Expression of the ECM component is stimulated by growth factors. For example, TGF-β stimulates fibroblasts to produce various ECM proteins including fibronectin, collagen, and tenascin (Pearson, CA et al. (1988) EMBO J. 7: 2977-2981). Indeed, for certain cell types, certain ECM molecules, such as laminin and fibronectin, can act as growth factors. Tenascin-C and tenascin-R, expressed in growing and injured nerve tissue, confer stimulatory / anti-adhesive and inhibitory properties to axons in their growth, respectively (Faissner, A. (1997) Cell). Tissue Res. 290: 331-341).
[0021]
Cancer and immune disorders are characterized by unrestricted cell growth. Cancer is associated with activation of oncogenes derived from genes of normal cells. These oncogenes encode oncoproteins that turn normal cells into malignant cells. Certain oncoproteins are mutated isoforms of the normal protein, while other oncoproteins are expressed at abnormal sites and at abnormal levels. Oncoproteins belonging to the latter alter the transcriptional regulation of cell growth and cause cancer. Five classes of oncoproteins are known to affect cell cycle regulation. These classes include growth factors, growth factor receptors, intracellular signal transducers, nuclear transcription factors, and cell cycle regulatory proteins. Viral oncogenes are integrated into the human genome after a virus infects human cells. Viral oncogenes include v-src, v-abl, and v-fps. Certain cell growth abnormalities can be identified by changes in protein complexes that regulate the progress of cell growth by the cell cycle, usually. The main therapeutic approach involves restoring regulation in cell cycle progression by manipulating proteins involved in cell cycle regulation (Nigg, EA (1995) BioEssays 17: 471-480). .
[0022]
A number of oncogenes have been identified and characterized. Among them, sis, erbA, erbB, her2, mutant Gδ, Src, abl, ras, crk, jun, fos, myc, and mutated tumor suppressor genes such as RB, p53, mdm2, Cipl, pi6, and cyclin D. Transformation of a normal gene into an oncogene can also occur by chromosomal translocation. In the Philadelphia chromosome, which is a feature of the subpopulations of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia, the cleaved portion of the proto-oncogene c-abl has a breakpoint cluster region (bcr: breakpoint cluster region) on chromosome 22. It results from the reciprocal translocation of chromosome 9 and chromosome 22 that migrate.
[0023]
Mutations that overactivate oncogenes lead to cell proliferation. When cells are stimulated by growth factors, two groups of gene products, an early response gene group and a delayed-response gene group, are activated. Early response gene products include myc, fos, and jun, all of which encode gene regulatory proteins. These regulatory proteins activate the transcription of delayed response genes, including the cell cycle regulators Cdk and cyclins. For example, the human T-cell leukemia virus type I (HTLV-I: human T-cell leukemia virus type I) Tax transactivator protein acts as an early response gene that promotes the activity of intracellular transcription factors. Oncogene properties of the Tax protein include transformation of primary T lymphocytes and fibroblasts in cooperation with Ras, a GTP-binding protein. Recently, researchers have reported that Tax interacts with several PDZ-containing proteins. The PDZ domain, originally called the Drosophila tumor suppressor gene Discs-Large, is common to membrane proteins and is thought to be involved in the clustering of receptors in growth factor signaling pathways (Rousset, R. et al. (1998) Oncogene 16: 643-654).
[0024]
Tumor suppressor genes are involved in regulating cell growth. Mutations that diminish or fail the function of tumor suppressor genes can lead to unrestricted cell growth. For example, the unphosphorylated retinoblastoma gene product (RB) binds to some early response genes and represses their transcription, thereby preventing cell division. Upon phosphorylation, the RB separates from these early response genes, thus releasing transcriptional repression and promoting cell division.
[0025]
Other gene products involved in cell growth, differentiation, and apoptosis have not yet been discovered. Methods currently used to help identify such novel molecules compare quiescent versus proliferating tissue. For example, a screen for subtractive hybridization of cells in the human placental trophoblast cell layer identified 20 genes whose expression levels were increased by EGF induction of cell proliferation (Morish, DW et al. (1996) Placenta 17) : 431-441). Another method involves the identification of molecules produced in cells treated with an anti-tumor agent such as dithiolethiones. The protective effect of the antitumor agent is presumed to be related to the induction of tumor suppressor gene products (Primiano, T. et al. (1996) Carcinogenesis 17: 2297-2303).
[0026]
In another example, the candidate tumor suppressor gene ING1 encoding the nuclear protein p33ING1 is involved in negative control of cell growth. The action of p33ING1 depends on the activity of another tumor suppressor gene, p53. This p53 gene is a cell stress responsive gene that requires the activity of p33ING1, and effectively induces suppression of cell growth. Experiments using immunoprecipitation have shown that p33ING1 and p53 are physically associated (Garkavtsev, I. et al. (1998) Nature 391: 295-298).
[0027]
Apoptosis
Apoptosis is a process controlled by genes that lead unwanted and defective cells to programmed cell death. In morphogenesis and tissue remodeling, selective elimination of cells is as important as cell proliferation and differentiation. If apoptosis does not occur, hyperplasia and other disorders can occur in connection with increased cell proliferation. Apoptosis is also an important part of the immune response. Immune cells, such as cytotoxic T cells and natural killers, induce apoptosis in cancer cells and virus-infected cells to prevent the spread of disease. In addition, immune cells that cannot distinguish between foreign and self molecules must be eliminated by apoptosis to prevent an autoimmune response from taking place.
[0028]
Apoptotic cells undergo significant morphological changes. Prominent features of apoptosis are cell shrinkage, nuclear and cytoplasmic condensation, and changes in cell membrane morphology. Biochemical characteristics of apoptotic cells are elevated intracellular calcium levels, fragmentation of chromosomal DNA, and the expression of new cell surface components.
[0029]
The molecular mechanism of apoptosis is highly conserved. A number of important protein regulators and apoptotic effectors have been identified to date. Apoptosis usually begins in response to signals that are transmitted intracellularly and alter gene expression patterns and protein activity. Signaling molecules such as hormones and cytokines are known to interact with cell surface receptors to cause or suppress apoptosis. Transcription factors also play an important role in initiating apoptosis. A number of downstream effector molecules, particularly proteases such as cysteine proteases called caspases, are involved in the degradation of cellular components and the proteolytic activity of other apoptotic effectors.
[0030]
Aging and aging phenomenon
Studies of the aging process and aging phenomena have reported some characteristic cellular and molecular changes (Fauci, AS et al., 1998).Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, New York NY, p. 37). These features include abnormal chromosomal structure, DNA cross-linking, single-stranded DNA damage, and increased degradation of the telomere region, and reduced DNA methylation. In addition to these DNA changes, post-translational modifications of proteins, including amidolysis, oxidation, cross-linking, and non-enzymatic glycosylation, are increased. In addition, structural alterations cause changes in molecules within the mitochondria of senescent cells. These changes ultimately reduce the function of each organ of the body.
[0031]
New discovery of multiple cell cycle and cell growth proteins and polynucleotides encoding them, useful for diagnosis, treatment, and prevention of cell disorders including immune disorders, developmental disorders, cell signaling disorders, and cancer The need in the art is met by providing a composition of
[0032]
(Summary of the Invention)
The present invention collectively refers to “CCYPR”, and individually refers to “CCYPR: 1”, “CCYPR: 2”, “CCYPR: 3”, “CCYPR: 4”, “CCYPR: 5”, “CCYPR: 6”. , "CCYPR: 7", "CCYPR: 8", "CCYPR: 9", "CCYPR: 10", "CCYPR: 11", "CCYPR: 12", "CCYPR: 13", "CCYPR: 14", "CCYPR: 14" "CCYPR: 15", "CCYPR: 16", "CCYPR: 17", "CCYPR: 18", "CCYPR: 19", "CCYPR: 20", "CCYPR: 21", "CCYPR: 22", "CCYPR:" 23 "," CCYPR: 24 "," CCYPR: 25 "," CCYPR: 26 "," CCYPR: 27 "," CCYPR: 28 "," CCYPR: 29 " , “CCYPR: 30”, “CCYPR: 31”, “CCYPR: 32”, “CCYPR: 33”, “CCYPR: 34”, “CCYPR: 35”, “CCYPR: 36”, “CCYPR: 37”, “CCYPR: 37” "CCYPR: 38", "CCYPR: 39", "CCYPR: 40", "CCYPR: 41", "CCYPR: 42", "CCYPR: 43", "CCYPR: 44", "CCYPR: 45", "CCYPR:" 46, CCYPR: 47, CCYPR: 48, CCYPR: 49, CCYPR: 50, CCYPR: 51, CCYPR: 52, CCYPR: 53, and CCYPR: 54 A purified polypeptide which is a cell cycle and cell growth protein referred to as "". In one embodiment of the present invention, (a) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 54 (SEQ ID NOs: 1-54); and (b) SEQ ID NOs: 1-54. A natural amino acid sequence having at least 90% sequence identity with an amino acid sequence selected from the group; and (c) a biologically active fragment of the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-54. And (d) an immunogenic fragment of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-54. . Alternatively, an isolated polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1-54 is provided.
[0033]
Furthermore, the present invention relates to (a) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-54, and (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-54 by 90% or more. A natural amino acid sequence having sequence identity, (c) a biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-54, and (d) a SEQ ID NO: 1-54. And an immunogenic fragment of an amino acid sequence selected from the group consisting of: an isolated polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of: Alternatively, the polynucleotide encodes a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-54. Alternatively, the polynucleotide is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 55-108.
[0034]
Furthermore, the present invention relates to (a) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-54 and (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-54 by 90% or more. A natural amino acid sequence having the sequence identity of: (c) a biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-54; and (d) a SEQ ID NO: 1- And a recombinant polypeptide comprising a promoter sequence operably linked to a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of: an immunogenic fragment of the amino acid sequence selected from the group consisting of: Provide nucleotides. Alternatively, the invention provides a cell transformed with the recombinant polynucleotide. In yet another alternative, the invention provides a transgenic organism comprising the recombinant polynucleotide.
[0035]
Further, the present invention relates to (a) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-54 and (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-54 by 90% or more. A natural amino acid sequence having the sequence identity of: (c) a biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-54; and (d) a SEQ ID NO: 1- 54. A method for producing a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of: an immunogenic fragment of the amino acid sequence selected from the group consisting of: The method comprises the steps of (a) culturing cells transformed with a recombinant polynucleotide comprising a promoter sequence operably linked to a polynucleotide encoding the polypeptide under conditions suitable for expression of the polypeptide. And (b) recovering the polypeptide thus expressed.
[0036]
Furthermore, the present invention relates to (a) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-54 and (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-54 by 90% or more. A natural amino acid sequence having the sequence identity of: (c) a biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-54; and (d) a SEQ ID NO: 1- 54. An isolated antibody that specifically binds to a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of an immunogenic fragment of the amino acid sequence selected from the group consisting of:
[0037]
Further, the present invention relates to (a) a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 55-108, and (b) a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 55-108. (E) a polynucleotide sequence complementary to (a), (d) a polynucleotide sequence complementary to (b), and (e) a polynucleotide sequence complementary to (a). The present invention provides an isolated polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of the RNA equivalents (a) to (d). Alternatively, the polynucleotide comprises at least 60 contiguous nucleotides.
[0038]
Furthermore, the present invention relates to (a) a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 55-108, and (b) a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 55-108, and 70% A natural polynucleotide sequence having the above sequence identity, (c) a polynucleotide sequence complementary to (a), (d) a polynucleotide sequence complementary to (b), (e) Provided is a method for detecting in a sample a target polynucleotide having a polynucleotide sequence that includes a polynucleotide sequence selected from the group consisting of the RNA equivalents of (a) to (d). The method comprises the steps of: (a) hybridizing a sample containing at least 20 contiguous nucleotides constituting a sequence complementary to a target polynucleotide in the sample with the sample, the method comprising: Said step of specifically hybridizing said probe to said target polynucleotide under conditions in which a hybridization complex is formed with nucleotides or fragments thereof, and (b) whether said hybridization complex is present And optionally measuring its yield, if present. Alternatively, the probe comprises at least 60 contiguous nucleotides.
[0039]
Furthermore, the present invention relates to (a) a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 55-108, and (b) a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 55-108, and 70% A natural polynucleotide sequence having the above sequence identity, (c) a polynucleotide sequence complementary to (a), (d) a polynucleotide sequence complementary to (b), (e) Provided is a method for detecting in a sample a target polynucleotide having a polynucleotide sequence that includes a polynucleotide sequence selected from the group consisting of the RNA equivalents of (a) to (d). The method comprises: (a) amplifying the target polynucleotide or a fragment thereof using polymerase chain reaction amplification; and (b) detecting whether the amplified target polynucleotide or a fragment thereof is present. Optionally measuring the yield, if present.
[0040]
Furthermore, the present invention relates to (a) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-54, and (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-54 by 90% or more. A natural amino acid sequence having sequence identity, (c) a biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-54, and (d) a SEQ ID NO: 1-54. And an immunogenic fragment of an amino acid sequence selected from the group consisting of: a pharmaceutical composition comprising an effective amount of a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of: provide. In one embodiment, there is provided a pharmaceutical composition comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-54. Further, the present invention provides a method for treating a disease or a symptom thereof associated with a decrease in the expression of functional CCYPR, which comprises administering the pharmaceutical composition to a patient.
[0041]
Furthermore, the present invention relates to (a) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-54, and (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-54 by 90% or more. A natural amino acid sequence having sequence identity, (c) a biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-54, and (d) a SEQ ID NO: 1-54. And an immunogenic fragment of an amino acid sequence selected from the group consisting of: and a method for screening a compound effective as an agonist of a polypeptide containing an amino acid sequence selected from the group consisting of: The method comprises: (a) exposing a sample comprising the polypeptide to a compound; and (b) detecting agonist activity of the sample. Alternatively, the invention provides a pharmaceutical composition comprising an agonist compound identified by this method and a suitable pharmaceutical excipient. In yet another alternative, the invention provides a method of treating a disease or condition associated with reduced expression of functional CCYPR, comprising administering the pharmaceutical composition to a patient.
[0042]
Furthermore, the present invention relates to (a) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-54 and (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-54 by 90% or more. A natural amino acid sequence having the sequence identity of: (c) a biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-54; and (d) a SEQ ID NO: 1- 54. A method for screening for a compound effective as an antagonist of a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of an immunogenic fragment of an amino acid sequence selected from the group consisting of: The method includes: (a) exposing a sample containing the polypeptide to a compound; and (b) detecting the antagonist activity of the sample. Alternatively, the invention provides a pharmaceutical composition comprising an antagonist compound identified by this method and a suitable pharmaceutical excipient. In yet another alternative, the invention provides a method of treating a disease or condition associated with overexpression of functional CCYPR, comprising administering the pharmaceutical composition to a patient.
[0043]
Furthermore, the present invention relates to (a) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-54, and (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-54 by 90% or more. A natural amino acid sequence having sequence identity, (c) a biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-54, and (d) SEQ ID NOs: 1-54. A method of screening for a compound that specifically binds to a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of: an immunogenic fragment of an amino acid sequence selected from the group consisting of: The method comprises the steps of: (a) binding the polypeptide to at least one compound under suitable conditions; and (b) detecting binding of the polypeptide to the test compound to specifically bind the polypeptide to the test compound. Identifying a compound that binds to.
[0044]
Furthermore, the present invention relates to (a) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-54, and (b) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-54 by 90% or more. A natural amino acid sequence having sequence identity, (c) a biologically active fragment of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-54, and (d) a SEQ ID NO: 1-54. A method of screening for a compound that modulates the activity of a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of an immunogenic fragment of an amino acid sequence selected from the group consisting of: The screening method comprises: (a) binding the polypeptide to at least one compound under conditions where the activity is permissible; and b) assessing the activity of the polypeptide in the presence of the test compound. And (c) comparing the activity of the polypeptide in the presence of the test compound with the activity of the polypeptide in the absence of the test compound, wherein in the presence of the test compound Is characterized by the fact that an alteration in the activity of the polypeptide indicates the presence of a compound that modulates the activity of the polypeptide.
[0045]
The invention further provides a method of screening for a compound effective to alter expression of a target polynucleotide comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 55-108, comprising: The present invention provides the screening method, comprising: exposing a sample containing nucleotides to a compound; and (b) detecting a change in expression of the target polynucleotide.
[0046]
The invention further provides a method for assessing the toxicity of a test compound. The method comprises the steps of: (a) treating a biological sample containing nucleic acid with the test compound; (b) hybridizing the nucleic acid of the treated biological sample with a probe; and (c) yield of a hybridization complex. And (d) comparing the yield of hybridization complex in the treated biological sample with the yield of hybridization complex in an untreated biological sample, Differences in the yield of hybridization complexes indicate toxicity of the test compound. The probe in this method comprises: (1) a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 55-108; and (2) a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 55-108. A naturally occurring polynucleotide sequence having at least 70% sequence identity, (3) a polynucleotide sequence complementary to (1), (4) a polynucleotide sequence complementary to (2), (5) And) at least 20 consecutive nucleotides of a polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of the RNA equivalents of (1) to (4). In addition, the hybridization is performed under a condition where a specific hybridization complex is formed between the probe and a target polynucleotide of the biological sample. The target polynucleotide may be (1) a polynucleotide sequence selected from a group consisting of SEQ ID NO: 55-108, and (2) a polynucleotide sequence selected from a group consisting of SEQ ID NO: 55-108. (3) a polynucleotide sequence complementary to (1), (4) a polynucleotide sequence complementary to (2), and (3) a polynucleotide sequence complementary to (1). 5) RNA equivalents of the above (1) to (5). Alternatively, said target polynucleotide is a fragment of said polynucleotide sequence.
[0047]
(About the description of the present invention)
Before describing the protein and nucleic acid sequences and methods of the present invention, it is to be understood that this invention is not limited to particular devices, materials, and methods disclosed herein, which may vary in its embodiments. Further, the terms used herein are used only for the purpose of describing a specific embodiment, and are limited only by the claims described below, and are not intended to limit the scope of the present invention. It should be understood that.
[0048]
It should be noted that in the specification and claims, the terms "a", "an", and the like include "a", "an" and "the" include plural referents unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, “a host cell” includes a plurality of host cells, and the “antibody” includes a plurality of antibodies, including equivalents well known to those skilled in the art.
[0049]
Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although all devices and materials and methods similar or equivalent to those described herein can be used in the practice and testing of the present invention, the preferred devices, materials and methods are described here. All references mentioned herein have been cited to describe and disclose the cell lines, protocols, reagents, and vectors described in the literature that may be used in connection with the present invention. Citing a conventional invention does not, however, be construed as impairing the novelty of the present invention.
[0050]
(Definition)
The term "CCYPR" refers to substantially purified CCYPR amino acids obtained from all species, including natural, synthetic, semi-synthetic or recombinant, especially mammals, including cows, sheep, pigs, mice, horses and humans. Points to an array.
[0051]
The term “agonist” refers to a molecule that enhances or mimics the biological activity of CCYPR. The agonist may interact directly with CCYPR or interact with components of the biological pathways involving CCYPR to regulate the activity of CCYPR, such as proteins, nucleic acids, carbohydrates, small molecules, any other compounds, It may include a composition.
[0052]
The term "allelic variant" refers to another form of the gene encoding CCYPR. Allelic variant sequences result from at least one mutation in the nucleic acid sequence, resulting in a variant mRNA or variant polypeptide, whose structure and function may or may not change. Some genes have no natural allelic variant, one or a large number thereof. In general, mutations that result in allelic variants are due to natural deletions, additions, or substitutions of nucleotides. Each of these mutations may occur alone or concurrently with other mutations, and may occur one or more times within a given sequence.
[0053]
A “mutant” nucleic acid sequence encoding CCYPR refers to a polypeptide that has the same polypeptide as CCYPR or a polypeptide that has at least one of the functional properties of CCYPR, despite deletions, insertions, or substitutions of various nucleotides. This definition includes inappropriate or unexpected hybridization of the polynucleotide sequence encoding CCYPR with an allelic variant at a position that is not a normal chromosomal locus, as well as specific oligonucleotide probes of the polynucleotide encoding CCYPR. And polymorphisms that are easily detectable or difficult to detect using The encoded protein can also be mutated and contain deletions, insertions, or substitutions of amino acid residues that produce a silent change and are functionally equivalent to CCYPR. Intentional amino acid substitutions are similar to residues in terms of polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and / or amphipathicity, as long as CCYPR activity is retained biologically or immunologically. It can be done based on For example, negatively charged amino acids can include aspartic acid and glutamic acid, and positively charged amino acids can include lysine and arginine. Amino acids with similar hydrophilicity values and polar uncharged side chains may include asparagine, glutamine, serine, threonine. Amino acids with similar hydrophilicity values and uncharged side chains may include leucine, isoleucine, valine, glycine, alanine, phenylalanine and tyrosine.
[0054]
The terms "amino acid" and "amino acid sequence" refer to oligopeptides, peptides, polypeptides, protein sequences, or any fragment thereof, and include natural and synthetic molecules. Where "amino acid sequence" refers to the sequence of a naturally occurring protein molecule, "amino acid sequence" and similar terms are not limited to the complete, intact amino acid sequence associated with the described protein molecule.
[0055]
The term "amplification" relates to making a copy of a nucleic acid sequence. Generally, amplification is performed by the polymerase chain reaction (PCR) technique well known in the art.
[0056]
The term "antagonist" is a molecule that inhibits or attenuates the biological activity of CCYPR. Antagonists directly interact with CCYPR or interact with components of the biological pathways involving CCYPR to modulate the activity of CCYPR, such as antibodies, nucleic acids, carbohydrates, small molecules, any other compounds or compositions. It can include proteins such as objects.
[0057]
The term "antibody" refers to Fab and F (ab ') that are capable of binding an antigenic determinant.2, And their fragments, Fv fragments and the like. Antibodies that bind CCYPR polypeptides can be produced using intact molecules or fragments thereof, including small peptides that immunize the antibodies. The polypeptide or oligopeptide used to immunize an animal (eg, a mouse, rat, or rabbit) can be synthesized from the translation of RNA or chemically, and can be coupled to a carrier protein if necessary. It is also possible. Commonly used carriers that are chemically coupled to the peptide include bovine serum albumin, thyroglobulin, and keyhole limpet haemonian (KLH). The animal is then immunized with the conjugated peptide.
[0058]
The term "antigenic determinant" refers to a region of a molecule (ie, an epitope) that contacts a particular antibody. When a protein or a fragment of a protein is used to immunize a host animal, various regions of the protein may be antibodies that specifically bind to an antigenic determinant (a specific region or three-dimensional structure on the protein). Can be induced. Antigenic determinants can compete with the intact antigen (ie, the immunogen used to elicit the immune response) to bind the antibody.
[0059]
As used herein, "antisense" refers to any composition capable of base-pairing with the sense (coding) strand of a particular nucleic acid sequence. Antisense components include DNA, RNA, peptide nucleic acids (PNA), oligonucleotides having a modified backbone linkage such as phosphorothionate, methylphosphonate, benzylphosphonate, and 2 ′. Oligonucleotides having a modified sugar, such as -methoxyethyl sugar or 2'-methoxyethoxy sugar, and oligos having a modified base, such as 5-methylcytosine or 2'-deoxyuracil, 7-deaza-2'-deoxyguanosine May contain nucleotides. Antisense molecules can be created by any method, including chemical synthesis and transcription. Once introduced into a cell, a complementary antisense molecule base pairs with a natural nucleic acid sequence created by the cell to form a duplex and inhibit transcription and translation. The expression "negative" or "minus" is the antisense strand, and the expression "positive" or "plus" is the sense strand.
[0060]
The term "biologically active" refers to a protein having structural, regulatory, or biochemical functions of a natural molecule. Similarly, the term "immunologically active" or "immunogenic" refers to natural or recombinant CCYPR, synthetic CCYPR, or any of their oligopeptides, that is capable of inducing a particular animal or cell-specific immune response. Refers to the ability to trigger and bind to a particular antibody.
[0061]
The term "complementary" refers to the relationship between two single-stranded nucleic acid sequences that anneal by base pairing. For example, the sequence "5'AGT3 '" pairs with the complementary sequence "3'TCA5'."
[0062]
"Composition comprising a given polynucleotide sequence" or "composition comprising a given amino acid sequence" refers in a broad sense to any composition comprising a given nucleotide or amino acid sequence. The composition may include a dry formulation or an aqueous solution. Compositions comprising a polynucleotide sequence encoding CCYPR or a fragment of CCYPR can be used as a hybridization probe. This probe can be stored in a lyophilized state, and can be bound to a stabilizer such as a carbohydrate. In hybridization, the probe is developed in an aqueous solution containing a salt (eg, NaCl), a surfactant (eg, SDS: sodium dodecyl sulfate), and other substances (eg, Denhardt's solution, dried milk, salmon sperm DNA, etc.). obtain.
[0063]
The “consensus sequence” is repeatedly subjected to DNA sequence analysis to separate unnecessary bases, and is extended in the 5 ′ and / or 3 ′ direction using an XL-PCR kit (PE Biosystems, Foster City CA), One or more overlapping cDNAs using a resequenced nucleic acid sequence or a computer program for fragment construction such as the GELVIEW fragment construction system (GCG, Madison, WI) or Phrap (University of Washington, Seattle WA). And ESTs, or nucleic acid sequences constructed from genomic DNA fragments. Some consensus sequences are constructed by both extension and duplication.
[0064]
The term "conservative amino acid substitution" refers to a substitution that does not significantly alter the properties of the original protein. That is, the structure and function of the protein are not significantly changed by the substitution, and the structure of the protein, particularly its function, is preserved. The following shows conservative amino acid substitutions in which the original amino acid of one protein is replaced by another amino acid.
Original residue conservative substitution
Ala @ Gly, Set
Arg @ His, Lys
Asn @ Asp, Gln, His
Asp @ Asn, Glu
Cys @ Ala, Ser
Gln @ Asn, Glu, His
Glu @ Asp, Gln, His
Gly @ Ala
His @ Asn, Arg, Gln, Glu
Ile @ Leu, Val
Leu @ Ile, Val
Lys @ Arg, Gln, Glu
Met @ Leu, Ile
Phe @ His, Met, Leu, Trp, Tyr
Ser @ Cys, Thr
Thr @ Ser, Val
Trp @ Phe, Tyr
Tyr @ His, Phe, Trp
Val @ Ile. Leu, Thr
In general, for conserved amino acid substitutions, a) the backbone structure of the polypeptide in the substituted region, for example, a β-sheet or α-helical conformation; b) the charge or hydrophobicity of the molecule at the substituted site; And / or c) the majority of the side chains are maintained.
[0065]
The term "deletion" refers to a change in the amino acid sequence that lacks one or more amino acid residues, or a change in the nucleic acid sequence that lacks one or more nucleotides.
[0066]
The term “derivative” refers to a chemically modified polynucleotide or polypeptide. Chemical modifications of a polynucleotide sequence include, for example, replacement of hydrogen by an alkyl, acyl, hydroxyl, or amino group. A derivative polynucleotide encodes a polypeptide that retains at least one of the biological or immunological functions of the native molecule (the unmodified molecule). A derivative polypeptide is a polypeptide modified by glycosylation, polyethyleneglycolation, or any similar process that maintains at least one of the biological or immunological functions of the original polypeptide. That is.
[0067]
"Detectable label" refers to a reporter molecule or enzyme that is capable of producing a measurable signal, covalently or non-covalently linked to a polynucleotide or polypeptide.
[0068]
The term "fragment" refers to a unique portion of CCYPR or a polynucleotide encoding CCYPR that is identical to, but shorter in length than, its parent sequence. The maximum length of a "fragment" is the parent sequence minus one nucleotide / amino acid residue. For example, some fragments contain from 5 to 1000 contiguous nucleotide or amino acid residues. At least 5, 10, 15, 16, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 250, or 500 probes, primers, antigens, therapeutic molecules, or fragments used for other purposes Is the length of consecutive nucleotides or amino acid residues. Fragments may be preferentially selected from particular regions of the molecule. For example, a polypeptide fragment can include a predetermined length of contiguous amino acids selected from the first 250 or 500 amino acids set forth in the predetermined sequence (or the first 25% or 50% of the polypeptide). . These lengths are examples, and any length described in the specification including the sequence listing and the tables and drawings can be included in the examples of the present invention.
[0069]
Fragments of SEQ ID NOs: 55-108 include, for example, regions of the unique polynucleotide sequence that uniquely identify SEQ ID NOs: 55-108, which are different from other sequences in the genome from which the fragment was obtained. Certain fragments of SEQ ID NOs: 55-108 are useful, for example, in hybridization and amplification techniques, or similar methods that distinguish SEQ ID NOs: 55-108 from related polynucleotide sequences. The exact fragment length or region of SEQ ID NOs: 55-108 that matches a fragment can be routinely determined by techniques common in the art based on the purpose of the fragment.
[0070]
A “full-length” polynucleotide sequence is a sequence that has at least one translation initiation codon (eg, methionine) followed by an open reading frame and a translation stop codon. A "full length" polynucleotide sequence encodes a "full length" polypeptide sequence.
[0071]
"Homology" is sequence similarity between two or more polynucleotide sequences or two or more polypeptide sequences. This sequence similarity can be translated into sequence identity.
[0072]
A fragment with SEQ ID NO: 1-54 is encoded by a fragment with SEQ ID NO: 55-108. Certain fragments of SEQ ID NOs: 1-54 include regions of the unique amino acid sequence that specifically identify SEQ ID NOs: 1-54. For example, certain fragments of SEQ ID NOs: 1-54 are useful as immunogenic peptides for the production of antibodies that specifically recognize SEQ ID NOs: 1-54. The exact fragment length or region of SEQ ID NO: 1-54 that matches a fragment can be routinely determined by techniques common in the art based on the purpose of the fragment.
[0073]
The term "similarity" refers to a degree of complementarity. This includes partial similarities and complete similarities. The term “identity” can also be referred to as “similarity”. Partially complementary sequences that at least partially block hybridization of the same sequence to the target nucleic acid are termed "substantially similar." The inhibition of hybridization between the completely complementary sequence and the target sequence is tested using a hybridization assay (Southern or Northern blotting, solution hybridization, etc.) under mildly stringent conditions. Substantially similar sequences or hybridization probes compete under mild stringent conditions for binding of the completely similar (identical) sequence to the target sequence. This does not mean that non-specific binding is tolerated under mildly stringent conditions, but under mildly stringent conditions the binding of the two sequences to each other is specific (ie, selective). It has to work. Using a second target sequence that is not even partially complementary (eg, less than 30% similarity or identity), it is possible to test for the absence of non-specific binding. In the absence of non-specific binding, substantially similar sequences or probes do not hybridize to the second non-complementary target sequence.
[0074]
The terms "percent identity" or "% identity" with respect to polynucleotide sequences refer to the percentage of matching residues between two or more polynucleotide sequences that are aligned using a standardized algorithm. It is. Such an algorithm can insert gaps in the sequences to make a more meaningful comparison between the two sequences in a standardized and reproducible manner to optimize the alignment between the two sequences.
[0075]
The percent identity between polynucleotide sequences can be determined using the default parameters of the CLUSTAL V algorithm incorporated into the MEGALIGN version 3.12e sequence alignment program. This program is part of the LASERGENE software package and is a suite of molecular biology analysis programs (DNASTAR, Madison WI). This CLUSTAL V is available from Higgins, D.W. G. FIG. And P.A. M. Sharp (1989) CABIOS 5: 151-153; Higgins, D.W. G. FIG. Et al. (1992) CABIOS 8: 189-191. For alignment of pairs of polynucleotide sequences, the default parameters are set as Ktuple = 2, gap penalty = 5, window = 4, “diagonals saved” = 4. A "weighted" residue weight table was selected as the default. Percent identity is reported by CLUSTAL V as "percent similarity" between the aligned polynucleotide sequences.
[0076]
Alternatively, a set of commonly used and freely available sequence comparison algorithms are available from NCBI, Bethesda, MD, and the National (http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) and the like. Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul, SF, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410). The BLAST software suite includes various sequence analysis programs, including "blastn" used to align known polynucleotide sequences with other polynucleotide sequences in various databases. A tool called "BLAST 2 Sequences" is available and is used to directly compare pairs of two nucleotide sequences. “BLAST 2 Sequences” is available at http: // www. ncbi. nlm. nih. gov / gorf / b12. You can access html and use it interactively. The "BLAST 2 Sequences" tool can be used for both blastn and blastp (described below). BLAST programs are typically used with gaps and other parameters to set defaults. For example, when comparing two nucleotide sequences, one would use blastn with the "BLAST 2 Sequences" tool Version 2.0.12 (April-21-2000) set to default parameters. Such default parameters are, for example, as follows.
[0077]
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for Mismatch: -2
Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
Percent identity may be measured, for example, for the entire length of a given sequence, as determined by a particular SEQ ID NO: or for a shorter length, for example, from a larger given sequence. It may be measured against the length of a given fragment, for example a fragment of at least 20 or 30, 40, 50, 70, 100, 200 nucleotides in a row. Such lengths are merely examples, and any length fragment of the sequences set forth in the specification, including the sequence listing and the tables and drawings, may be used to indicate the length at which percent identity is measured. it can.
[0078]
Nucleic acid sequences that do not show a high degree of identity may encode similar amino acid sequences due to the degeneracy of the genetic code. It should be understood that degeneracy can be used to alter nucleic acid sequences to produce various nucleic acid sequences, each encoding substantially the same protein.
[0079]
The terms "percent identity" or "% identity" as used in polypeptide sequences refer to the percentage of matching residues between two or more polypeptide sequences that are aligned using a standardized algorithm. It is. Methods for polypeptide sequence alignment are well known. Some alignment methods take into account conservative amino acid substitutions. Such conservative substitutions, as described in detail above, generally preserve the charge and hydrophobicity of the substitution site and preserve the structure (and therefore function) of the polypeptide.
[0080]
The percent identity between polypeptide sequences can be determined using the default parameters of the CLUSTAL V algorithm incorporated in the MEGALIGN version 3.12e sequence alignment program (described above). In the case of paired polypeptide sequence alignment using CLUSTAL V, the default parameters are set as Ktuple = 1, gap penalty = 3, window = 5, and “diagonals saved” = 5. The PAM250 matrix is selected as the default residue weight table. As with polynucleotide alignments, the percent identity of a pair of aligned polypeptide sequences is reported by CLUSTAL V as "percent similarity".
[0081]
Alternatively, the NCBI BLAST software suite is used. For example, when comparing two polypeptide sequences in pairs, one may use blastp with the "BLAST 2 Sequences" tool Version 2.0.12 (Apr-21-2000) set with default parameters. There will be. Such default parameters are, for example, as follows.
[0082]
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
Percent identity may be measured, for example, over the entire length of a given polypeptide sequence, as determined by a particular SEQ ID NO: It may be measured against the length of fragments obtained from the peptide sequence, for example fragments of at least 15,20 or 30,40,50,70,150 contiguous residues. Such lengths are merely examples, and any length fragment of the sequences set forth in the specification, including the sequence listing and the tables and drawings, may be used to indicate the length at which percent identity is measured. it can.
[0083]
"Human artificial chromosomes (HACs)" are linear, small elements containing all the elements necessary for the separation and maintenance of stable mitotic chromosomes, which can include DNA sequences of about 6 kb (kilobases) to 10 Mb in size. It is a chromosome.
[0084]
The term "humanized antibody" refers to an antibody molecule in which the amino acid sequence of the non-antigen binding region has been changed to more closely resemble a human antibody while retaining its original binding ability.
[0085]
“Hybridization” is the process of annealing in which a single-stranded polynucleotide forms a base pair with a complementary single-strand under predetermined hybridization conditions. Specific hybridization means that two nucleic acid sequences have high homology. Under conditions that permit annealing, a specific hybridization complex is formed and remains hybridized after the washing step. The washing step is particularly important in determining the stringency or stringency of the hybridization process; in more stringent conditions, non-specific binding, ie, binding of pairs between nucleic acid strands that are not perfectly matched. Decrease. The conditions under which annealing between nucleic acid sequences is permissible are routinely determined by those skilled in the art, and are constant during hybridization, but the washing process can be altered during the process to achieve the desired stringency. And hybridization specificity is obtained. Conditions that permit annealing include, for example, about 6 × SSC, about 1% (w / v) SDS at about 68 ° C., and about 100 μg / ml shear denatured salmon sperm DNA.
[0086]
In general, the stringency of hybridization also depends on the temperature at which the washing step is performed. This washing temperature is usually selected to be about 5-20C below the thermal melting point (Tm) of the particular arrangement at a given ionic strength and pH. This Tm is the temperature (under a given ionic strength and pH) at which 50% of the target sequence hybridizes with a perfectly matched probe. The equation for calculating the Tm and the conditions for nucleic acid hybridization are well known and are described in Sambrook, J. et al. By others, 1989,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Volume 1-3, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY;
[0087]
High stringency hybridization between polynucleotides of the present invention involves a washing step at about 68 ° C. for 1 hour in the presence of about 0.2 × SSC and about 1% SDS. Alternatively, it is performed at a temperature of 65 ° C, 60 ° C, 55 ° C, 42 ° C. The concentration of SSC ranges from about 0.1 to 2x SSC in the presence of about 0.1% SDS. Usually, blocking reagents are used to block non-specific hybridization. Such blocking reagents include, for example, about 100-200 μg / ml of cleaved and denatured salmon sperm DNA. Organic solvents such as formamide at a concentration of about 35-50% v / v can be used in certain cases, such as, for example, hybridization of RNA and DNA. Useful modifications of these washing conditions are well known to those skilled in the art. Hybridization under particularly high stringency conditions can indicate evolutionary similarities between nucleotides. Such similarities strongly suggest that their nucleotides and encoded polypeptides play a similar role.
[0088]
The term "hybridization complex" refers to a complex of two nucleic acid sequences formed by hydrogen bonding between complementary bases. The hybridization complex is in solution (eg, C0t or R0t-analysis) or one nucleic acid sequence in solution and a solid support (eg, paper, membrane, filter, chip, pin, or glass slide, or any suitable fixation of cells and their nucleic acids) And another nucleic acid sequence immobilized on another substrate.
[0089]
The term "insertion" or "addition" refers to a change in the amino acid or nucleic acid sequence to which one or more amino acid residues or nucleotides are added, respectively.
[0090]
"Immune response" refers to symptoms associated with inflammatory diseases and trauma, immune disorders, infectious diseases, genetic diseases, and the like. These conditions are characterized by the expression of various factors, such as cytokines and chemokines, and other signaling molecules, that affect the cell line and the systemic defense system.
[0091]
The term "microarray" refers to an arrangement of a plurality of polynucleotides, polypeptides or other compounds on a substrate.
[0092]
The term "element" or "array element" refers to a polynucleotide, polypeptide or other compound that has a unique, designated location on a microarray.
[0093]
The term "modulation" refers to a change in the activity of CCYPR. For example, the modulation results in a change in the protein activity or binding properties of CCYPR, or other biological, functional or immunological properties.
[0094]
The terms "nucleic acid" and "nucleic acid sequence" refer to nucleotides, oligonucleotides, polynucleotides, or fragments thereof, single or double stranded, of genomic or synthetic origin that are sense or antisense strands DNA or RNA, peptide nucleic acid (PNA), any DNA-like substance, and RNA-like substance.
[0095]
"Operably linked" refers to the state in which a first nucleic acid sequence and a second nucleic acid sequence are in a functional relationship. For example, when a promoter affects the transcription or expression of a coding sequence, the promoter is operably linked to the coding sequence. Generally, operably linked DNA sequences are very close together or contiguous if, in the same reading frame, the regions encoding the two proteins need to be joined.
[0096]
“Peptide nucleic acid (PNA)” refers to an antisense molecule or an antigenic agent that comprises an oligonucleotide at least about 5 nucleotides in length attached to a peptide backbone of amino acid residues terminating in lysine. This terminal lysine renders the composition soluble. PNAs can preferentially bind to complementary single-stranded DNA or RNA, stop transcript elongation, and become polyethylene glycolated to extend cell life.
[0097]
"Post-translational modifications" of CCYPR may include lipidation, glycosylation, phosphorylation, acetylation, racemization, proteolytic cleavage and other modifications known in the art. These processes can occur synthetically or biochemically. Biochemical modifications depend on the enzymatic environment of CCYPR and may vary from cell type to cell type.
[0098]
The term "probe" refers to a nucleic acid sequence encoding CCYPR, its complementary sequence, or a fragment thereof, which is used to detect the same or allele nucleic acid sequence or a related nucleic acid sequence. A probe is an isolated oligonucleotide or polynucleotide to which a detectable label or reporter molecule has been attached. Typical labels include radioisotopes and ligands, chemiluminescent reagents, and enzymes. A “primer” is a short nucleic acid, usually a DNA oligonucleotide, capable of forming complementary base pairs and annealing to a target polynucleotide. After the primer anneals to the polynucleotide, it is extended along the target DNA single strand by a DNA polymerase enzyme. The set of primers can be used, for example, for amplification (and identification) of a nucleic acid sequence in a PCR method.
[0099]
Probes and primers used in the present invention comprise at least 15 contiguous nucleotides of a known sequence. Longer probes and primers can be used to increase specificity. For example, it comprises at least 20 or 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 contiguous nucleotides of the disclosed nucleic acid sequences. It is to be understood that probes and primers can be used which are considerably longer than the examples described above, and that nucleotides of any length shown in the tables, drawings and sequence listings herein can be used.
[0100]
For the preparation and use of probes and primers, see, for example, Sambrook, J. et al. 1989, entitled "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition, Volume 1-3 (Cold Spring Harbor Press, Plainview NY), or Ausubel, F.C. M. In 1987, "Current Protocols in Molecular Biology" (Greene Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY), and in 1990, by Innis et al. (Academic Press, San Diego CA.). A set of primers for PCR can be derived from a known sequence using a computer program for such purposes, such as Primer (Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA). Can be.
[0101]
Oligonucleotides to be used as primers are selected by a computer program for selecting primers well known in the art. For example, OLIGO 4.06 software can select primer pairs for PCR up to 100 nucleotides each, and large polynucleotides and oligonucleotides up to 5,000 nucleotides from input polynucleotide sequences of up to 32,000 bases. It is useful for analysis. Similar primer selection programs include additional features to expand capacity. For example, the PrimOU primer selection program (available from the Genome Center at University of Texas South West Medical Center, Dallas TX) allows the selection of specific primers from the megabase sequence, thus providing a primer for genome-wide design. Useful for The Primer3 primer selection program (available from Whitehead Institute / MIT Center for Genome Research, Cambridge MA1) allows the user to enter a "non-priming library" that allows the designation of sequences to be avoided as primer binding sites. In addition, Primer 3 is particularly useful for selecting oligonucleotides for microarrays (the source code of the latter two primer selection programs can be obtained from the respective sources and modified to meet the needs of the user. You can also). The PrimerGen program (available from the UK Human Genome Mapping Project Resource Center, Cambridge UK) designs the primers based on multiple sequence alignments, and therefore the most conserved or least conserved regions of the aligned nucleic acid sequences. Can be selected. Thus, the program is useful for identifying unique and conserved oligonucleotide and polynucleotide fragments. Oligonucleotide or polynucleotide fragments identified by any of the selection methods described above may be used, for example, to identify polynucleotides, sequencing primers, microarray elements, or polynucleotides that completely or partially complement the nucleic acids of the sample. Useful for hybridization techniques, such as a probe. The method for selecting the oligonucleotide is not limited to the method described above.
[0102]
As used herein, a “recombinant nucleic acid” is not a natural sequence, but a sequence in which two or more separate segments of a sequence are artificially combined. Although this artificial combination is often made by chemical synthesis, it is more common to artificially manipulate discrete segments of nucleic acids using genetic engineering techniques such as those described in Sambrook, supra. is there. The “recombinant nucleic acid” also includes a nucleic acid that has been changed simply by adding, replacing, or deleting a part of the nucleic acid. A recombinant nucleic acid may include a nucleic acid sequence operably linked to a promoter sequence. Such a recombinant nucleic acid can be, for example, part of a vector used to transform a cell.
[0103]
Alternatively, such a recombinant nucleic acid may be one of vaccinia virus-based viral vectors that, when used for vaccination of a mammal expressing the recombinant nucleic acid, elicits a protective immune response in the mammal. Department.
[0104]
A "regulatory element" is a nucleic acid sequence usually derived from the untranslated region of a gene, and includes enhancers, promoters, introns, and 5 'and 3' untranslated regions (UTRs). Regulatory elements interact with host or viral proteins that regulate transcription or translation, or RNA stability.
[0105]
A “reporter molecule” is a chemical or biochemical moiety used to label nucleic acids, amino acids or antibodies. Reporter molecules include radionuclides, enzymes, fluorescent agents, chemiluminescent agents, chromogenic agents, substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles, and other components known in the art.
[0106]
As used herein, the term "RNA equivalent" for a DNA sequence is composed of the same linear nucleic acid sequence as the reference DNA sequence, but the thymine of the nitrogenous base is replaced with uracil, and the backbone of the sugar chain is Consists of ribose, not deoxyribose.
[0107]
The term "sample" is used in its broadest sense. Examples of a sample presumed to contain a CCYPR-encoding nucleic acid or a fragment thereof and CCYPR itself include body fluids, extracts from cells and chromosomes and intracellular organelles isolated from cells, membranes, cells, Genomic DNA, RNA, cDNA present in or immobilized on a substrate, and tissues or tissue prints, etc., may also be included.
[0108]
The terms "specific binding" and "specifically bind" refer to the interaction between a protein or peptide and an agonist, antibody, antagonist, small molecule, or any natural or synthetic binding composition. This interaction depends on the presence of specific structures of the protein, such as, for example, antigenic determinants or epitopes, recognized by the binding molecule. For example, if the antibody is specific for the epitope "A", the unbound labeled "A" and the reaction solution containing the antibody may contain the polypeptide containing epitope A or the unlabeled "A" ”Reduces the amount of label A that binds to the antibody.
[0109]
The term "substantially purified" refers to an isolated or isolated nucleic acid or amino acid sequence that has been removed from its natural environment and has at least about 60% of its naturally associated composition removed. Preferably at least about 75% removed, most preferably at least 90% removed.
[0110]
"Substitution" refers to the replacement of one or more amino acids or nucleotides with another amino acid or nucleotide, respectively.
[0111]
The term "substrate" refers to any suitable solid or semi-solid support, including membranes and filters, chips, slides, wafers, fibers, magnetic or non-magnetic beads, gels, tubes, plates, polymers, microparticles, capillaries. Is included. The substrate has various surface features, such as walls or trenches, pins, channels, pores, etc., to which polynucleotides or polypeptides bind.
[0112]
"Transcription image" refers to the pattern of collective gene expression by a particular cell type or tissue at a given time under given conditions.
[0113]
"Transformation" refers to the process by which foreign DNA is introduced into recipient cells. Transformation can occur under natural or artificial conditions by a variety of methods known in the art, and can be performed by any known method of inserting a foreign nucleic acid sequence into a prokaryotic or eukaryotic host cell. Can be. The method of transformation is selected according to the type of host cell to be transformed. The methods include, but are not limited to, bacteriophage or viral infection, electroporation, lipofection, and microparticle irradiation. "Transformed" cells include stably transformed cells in which the introduced DNA is capable of replicating autonomously as a plasmid or as part of the host chromosome. Furthermore, cells that express the introduced DNA or introduced RNA temporarily for a limited time are also included.
[0114]
As used herein, a "genetically modified organism" is any organism in which a human has introduced a heterologous nucleic acid into one or more cells of the organism, using genetically well-known techniques in the art, and the like. And plants, but is not limited thereto. Heterologous nucleic acids are introduced into cells directly or indirectly into their precursors by careful genetic manipulation, such as microinjection or infection with recombinant viruses. "Genetic manipulation" refers to typical cross breeding andin in vitroIs to introduce a recombinant DNA molecule instead of fertilization at Genetically modified organisms according to the present invention include bacteria and cyanobacteria, fungi, plants and animals. The isolated DNA of the present invention can be introduced into a host by methods well known in the art, for example, infection, transfection, transformation, transconjugation, and the like. Techniques for introducing the DNA of the present invention into such organisms are well known and are described in Sambrook et al. (1989), supra.
[0115]
The “variant sequence” of a specific nucleic acid sequence is defined as a specific sequence for a certain nucleic acid sequence by blastn using a “BLAST 2 Sequences” tool Version 2.0.9 (May-07-1999) with default parameter settings. Is a nucleic acid sequence whose identity is determined to be at least 40%. Such pairs of nucleic acids may exhibit, for example, at least 50% or 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or more identity in certain lengths. Certain variant sequences can be referred to, for example, as "allelic" variant sequences (described above) or "splice" variant sequences, "species" variant sequences, "polymorphic" variant sequences. A splice variant may have very high identity to a reference molecule, but will have more or less polynucleotides due to alternative splicing of exons during mRNA processing. The corresponding polypeptide may have additional functional domains present in the reference molecule, or may lack domains present in the reference molecule. Species variant sequences are polynucleotide sequences that vary from species to species. The resulting polypeptides have high amino acid identity with each other. Polymorphic variant sequences differ in the polynucleotide sequence of a particular gene in a given species. Polymorphic variant sequences can also include "single nucleotide polymorphisms" (SNPs) in which one nucleotide of the polynucleotide sequence differs. The presence of a SNP may, for example, indicate a certain population, condition, or propensity for the condition.
[0116]
A “variant” of a particular polypeptide sequence is defined as a blastp using a “BLAST 2 Sequences” tool Version 2.0.9 (May-07-1999) with default parameter settings, for a given length of a nucleic acid sequence. A polypeptide sequence whose identity is determined to be at least 40% for a particular polypeptide sequence. Such pairs of polypeptides may exhibit, for example, at least 50% or 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% or more identity in a certain length. .
[0117]
(invention)
The present invention is based on the discovery of a novel human cell cycle and cell growth protein (CCYPR) and a polynucleotide encoding CCYPR, which is used to diagnose immune disorders, developmental disorders, cell signaling disorders, and cell growth disorders including cancer. , Treatment, and prophylaxis.
[0118]
Table 1 shows the Incyte clones used to construct the full length nucleotide sequence encoding CCYPR. Columns 1 and 2 show the SEQ ID NOs of the polypeptide and nucleotide sequences, respectively. Column 3 shows the clone ID of the Incyte clone from which the nucleic acid encoding each CCYPR was identified, and column 4 shows the cDNA library from which those clones were isolated. Column 5 shows Incyte clones and their corresponding cDNA libraries. Incyte clones for which no cDNA library is shown are derived from the pooled cDNA library. The Incyte clone shown in column 5 is used to construct the consensus nucleotide sequence for each CCYPR and is useful as a fragment in hybridization techniques.
[0119]
Each column of Table 2 shows various properties of each polypeptide of the invention. Column 1 is SEQ ID NO, column 2 is the number of amino acid residues in each polypeptide, column 3 is a potential phosphorylation site, column 4 is a potential glycosylation site, and column 5 is the signature. 3.) Amino acid residues with sequence and motif, row 6 shows the homologous sequence identified by BLAST analysis and the corresponding citation. In addition, it is incorporated herein by reference. Column 7 indicates the analysis method, and possibly a searchable database to which the analysis method can be applied. The analysis method in column 7 was used to characterize each polypeptide by sequence homology and protein motif.
[0120]
The columns in Table 3 show the tissue specificities and diseases, disorders, and conditions associated with the nucleotide sequence encoding CCYPR. Column 1 of Table 3 shows the nucleotide sequence number (SEQ ID NO). Column 2 shows a fragment of the nucleotide sequence of column 1. These fragments are useful, for example, in hybridization or amplification techniques to identify SEQ ID NOs: 55-108 and to distinguish SEQ ID NOs: 55-108 from related polynucleotide sequences. The polypeptides encoded by these fragments are useful, for example, as immunogenic peptides. Column 3 shows the name of the tissue expressing CCYPR and its percentage in all tissues expressing CCYPR. Column 4 shows diseases or disorders, symptoms associated with tissues that express CCYPR, and their percentage in all tissues that express CCYPR. Column 5 shows the vectors used for subcloning each cDNA library. Of particular note is that SEQ ID NO: 66 is expressed in inflamed tissues. Also note that SEQ ID NO: 76 is expressed primarily in neural tissue.
[0121]
Each row in Table 4 describes the tissues used to construct a cDNA library from which a clone of the cDNA encoding CCYPR was isolated. Column 1 shows the nucleotide SEQ ID NO, column 2 shows the cDNA library from which the clones were isolated, and column 3 shows the origin and details of the tissue corresponding to the cDNA library in column 2.
[0122]
SEQ ID NO: 61 maps to chromosome 5 within the range of 141.40-142.60 centiMorgan. This range also includes genes and / or ESTs associated with corneal dystrophy and hearing loss.
[0123]
SEQ ID NO: 73 maps to chromosome 2 within the range 73.80-83.50 centiMorgan. This range also includes genes and / or ESTs associated with hereditary non-polyptic colorectal cancer and Muir-Torre syndrome. SEQ ID NO: 74 maps to chromosome 19 within the range of 41.70-58.70 centiMorgan. SEQ ID NO: 75 maps to chromosome 17 within the 62.90-64.20 centiMorgan range. This range also includes genes and / or ESTs within the human breast cancer (BRCA-1) gene region. SEQ ID NO: 76 shows 143.30 to 153.90 centiMorgan on chromosome 1, 156.20 to 160.00 centiMorgan on chromosome 3, and 112.80 to 139.40 centiMorgan on chromosome 10. Maps within a range. The range from 112.80 to 139.40 centiMorgan on chromosome 10 also includes genes and / or ESTs associated with sex-linked agammaglobulinemia.
[0124]
SEQ ID NO: 77 maps from 173.60 to 179.80 centiMorgan on chromosome 23 and 136.90 centiMorgan on chromosome 11 to the long arm (q) end. SEQ ID NO: 78 maps to chromosome 3 within the range of 200.00 to 213.70 centiMorgans. SEQ ID NO: 81 maps to chromosome 7 from 167.60 centiMorgan to the long arm (q) end. SEQ ID NO: 90 shows 236.10 to 240.20 centiMorgan on chromosome 2, 16.50 to 43.00 centiMorgan on chromosome 3, and 124.20 to 126.50 centiMorgan on chromosome 6. Maps within a range. SEQ ID NO: 91 maps to chromosome 2 within the range of 22.40-40.70 centiMorgans. SEQ ID NO: 98 maps to chromosome 8 within the range of 40.30 to 60.00 centiMorgans. SEQ ID NO: 100 maps from 95.50 to 103.70 centiMorgan on chromosome 14 and 158.50 centiMorgan on chromosome 6 to the long arm (q) end. SEQ ID NO: 104 maps to chromosome 18 within the range of 32.40 to 42.70 centiMorgans. SEQ ID NO: 105 maps to chromosome 19 within the range 69.90-81.20 centiMorgan.
[0125]
The present invention also includes variants of CCYPR. Preferred CCYPR variants have at least one of CCYPR functional and / or structural characteristics and have at least about 80% amino acid sequence identity to the CCYPR amino acid sequence, or at least about 90% amino acid sequence. Have identity, and even at least about 95% amino acid sequence identity.
[0126]
The present invention also provides a polynucleotide encoding CCYPR. In certain embodiments, the invention provides a polynucleotide sequence comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 55-108 encoding CCYPR. The polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 55-108 shown in the sequence listing includes an equivalent RNA sequence in which thymine of a nitrogenous base is substituted with uracil and the backbone of the sugar chain is composed of ribose instead of deoxyribose.
[0127]
The invention also includes mutant sequences of the polynucleotide sequence encoding CCYPR. In particular, such a variant of the polynucleotide sequence will have at least 70% polynucleotide sequence identity to the polynucleotide sequence encoding CCYPR, or at least 85% polynucleotide sequence identity, or even at least 95%. Has polynucleotide sequence identity. Certain embodiments of the present invention provide that at least 70% polynucleotide sequence identity, or at least 85% polynucleotide sequence identity, or even at least 85% polynucleotide sequence identity to a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 55-108. A variant sequence of a polynucleotide sequence comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 55-108 having as much as 95% polynucleotide sequence identity is provided. Each of the above-described polynucleotide variants encodes an amino acid sequence having at least one of the functional or structural characteristics of CCYPR.
[0128]
One of skill in the art will appreciate that the various polynucleotide sequences encoding CCYPR that can be created by the degeneracy of the genetic code include those that have minimal similarity to the polynucleotide sequences of any known, naturally occurring genes. Will understand. Thus, the present invention may include all possible polynucleotide sequence variations that may be made by selecting combinations based on possible codon choices. These combinations are made on the basis of the standard triplet genetic code as applied to the native CCYPR polynucleotide sequence, and all variations are considered to be expressly disclosed.
[0129]
Nucleotide sequences encoding CCYPR and mutant sequences thereof are generally capable of hybridizing to the nucleotide sequence of native CCYPR under suitably selected stringent conditions, but are substantially free of non-naturally occurring codons, including codons. It may be advantageous to generate nucleotide sequences encoding CCYPR or derivatives thereof with different usage codons. Codons can be selected based on the frequency with which particular codons are utilized by the host to increase the rate at which expression of the peptide occurs in a particular eukaryotic or prokaryotic host. Another reason to substantially alter the nucleotide sequence encoding CCYPR and its derivatives without altering the encoded amino acid sequence is that RNA transcripts with favorable properties, such as longer half-lives, than transcripts made from the native sequence Is to make things.
[0130]
The present invention also includes generating DNA sequences encoding CCYPR and its derivatives, or fragments thereof, entirely by synthetic chemistry. After construction, the synthetic sequence can be inserted into any of a variety of available expression vectors and cell lines using reagents well known in the art. In addition, synthetic chemistry can be used to introduce mutations in the sequence encoding CCYPR or any fragment thereof.
[0131]
The invention further includes polynucleotide sequences that are capable of hybridizing under various stringent conditions to the claimed polynucleotide sequences, particularly SEQ ID NOs: 55-108 and fragments thereof ( See, e.g., Wahl, GM and SL Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 399-407; and Kimmel.AR (1987) Methods Enzymol. 152: 507-511.). Hybridization conditions, including annealing and washing conditions, are described in Definitions.
[0132]
Any of the embodiments of the present invention can be performed using DNA sequencing methods well known in the art. This method includes, for example, the Klenow fragment of DNA polymerase I, SEQUENASE (US Biochemical, Cleveland OH), Taq polymerase (PE Biosystems, Foster City CA), thermostable T7 polymerase (Amersham, Pharmacia Biosia, P.A. Enzymes such as a combination of a proofreading exonuclease and a polymerase, such as those found in the system (Life Technologies, Gaithersburg MD), are used. Preferably, a device such as MICROLAB2200 liquid transfer system (Hamilton, Reno, NV), PTC200 Thermal Cycler200 (MJ Research, Watertown MA) and ABI CATARYST 800 (PE Biosystems) are used to automatically prepare and arrange devices. Next, sequencing is performed using an ABI 373 or 377 DNA sequencing system (PE Biosystems), a MEGABACE 1000 DNA sequencing system (Molecular Dynamics. Sunnyvale CA), or another method known in the art. The resulting sequence is analyzed using various algorithms well known in the art (eg, Ausubel, FM (1997)).Short Protocols in Molecular BiologyMeyers, R., John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7; A. (1995)Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, pp. 856-853. See).
[0133]
Various methods based on the PCR method known in the art are used to extend a nucleic acid sequence encoding CCYPR using partial nucleotide sequences to detect sequences upstream of promoters and regulatory elements. For example, one method utilizing restriction site PCR involves amplifying an unknown sequence from genomic DNA in a cloning vector using common and nested primers (eg, Sarkar, G. (1993)). PCR Methods Appl. 2: 318-322). Another method using the inverse PCR method uses primers that amplify an unknown sequence from a circularized template that has been extended in a wide range of directions. This template is derived from restriction fragments containing known genomic loci and surrounding sequences (see, for example, Triglia, T. et al. (1988) Nucleic Acids Res 16: 8186). A third method using the capture PCR method involves PCR amplification of DNA fragments adjacent to known sequences of human and yeast artificial chromosomal DNA (eg, Lagerstrom, M. et al. (1991) PCR Methods Applic 1: 111-). 119). In this method, it is possible to insert the recombinant double-stranded sequence into a region of unknown sequence before performing PCR using digestion and ligation with a number of restriction enzymes. It is also possible to obtain unknown sequences using other methods well known in the art. (See, e.g., Parker, JD, et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 3055-3060). Furthermore, the use of PCR, nested primers, and a PROMOTERFINDER library (Clontech, Palo Alto CA) allows walking within genomic DNA. This method eliminates the need to screen libraries and is useful for finding intron / exon junctions. In all PCR-based methods, the primers are 22-30 nucleotides in length using a commercially available OLIGO 4.06 Primer Analysis software (National Biosciences, Plymouth MN) or another suitable program. It is designed to anneal to the mold at a temperature of about 68 ° C to 72 ° C with a content of 50% or more.
[0134]
When screening for full-length cDNAs, it is preferable to use libraries whose size has been selected to include large cDNAs. In addition, if the oligo d (T) library cannot produce full-length cDNA, a randomly primed library, often containing a sequence having the 5 'region of the gene, is useful. Genomic libraries will be useful for extension of sequence into 5 'non-transcribed regulatory regions.
[0135]
Using a commercially available capillary electrophoresis system, it is possible to analyze or confirm the size of the nucleotide sequence of the sequencing or PCR product. Specifically, for capillary sequencing, a flowable polymer for electrophoretic separation, a laser-activated fluorescent dye specific for four different nucleotides, and a CCD camera for detecting the emitted wavelength It is possible to use The output / light intensity is converted to an electrical signal using appropriate software (eg, GENOTYPER and SEQUENCE NAVIGATOR, PE Biosystems), and the process from sample loading to computer analysis and electronic data display are computer controllable. Capillary electrophoresis is particularly suitable for sequencing small pieces of DNA that may be present in small amounts in a particular sample.
[0136]
In another embodiment of the invention, a polynucleotide sequence encoding CCYPR, or a fragment thereof, can be cloned into a recombinant DNA molecule to express CCYPR, a fragment thereof, or a functional equivalent in a suitable host cell. It is. Due to the inherent degeneracy of the genetic code, alternative DNA sequences encoding substantially the same or functionally equivalent amino acid sequences can be made, and these sequences can be used for cloning and expression of CCYPR.
[0137]
The nucleotide sequences of the present invention can be recombined using methods generally known in the art to alter the sequence encoding CCYPR for various purposes. This purpose includes, but is not limited to, cloning, processing and / or regulating expression of the gene product. Recombination of nucleotide sequences is possible using mixing of DNA with random fragments or PCR reassembly of gene fragments and synthetic oligonucleotides. For example, oligonucleotide-mediated directed mutagenesis can be used to introduce mutations that create new restriction sites, alter glycosylation patterns, alter codon choices, create splice variants, and the like.
[0138]
The nucleotides of the present invention may be synthesized using MOLECULARBREEDING (Maxygen Inc., Santa Clara CA; U.S. Pat. No. 5,837,458; Chang, C.-C. et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17: 793-797; Christians, F. (1999) Nat. Biotechnol. 17: 259-264; Crameri, A. et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14: 315-319). Biological properties of CCYPR, such as its biological or enzymatic activity, or its ability to bind to other molecules or compounds. DNA shuffling is a process for preparing a library of gene variants by recombination of gene fragments by the PCR method. Next, the library is selected or screened to identify gene variants having the desired properties. These preferred variants are pooled and the DNA shuffling and selection / screening is repeated. Thus, diverse genes are created by artificial breeding and rapid molecular evolution. For example, recombination, screening, and shuffling of a single gene fragment having a mutation at a random position can be performed until the desired property is optimized. Alternatively, a given gene fragment may be recombined with a homologous gene fragment of the same gene family of the same or a different species, thereby controlling the genetic diversity of the large number of native genes in a controllable manner according to the protocol. Can be maximized.
[0139]
According to another embodiment, the sequence encoding CCYPR can be synthesized in whole or in part using chemical methods well known in the art (eg, Caruthers. MH et al. (1980) Nucl). Acids Res. Symp. Ser 7: 215-223; and Horn, T. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232. Alternatively, CCYPR itself or a fragment thereof can be synthesized using chemical methods. For example, peptide synthesis can be performed using a variety of solid-phase techniques (eg, Creighton, T. (1984)).Proteins. Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY, pp. 55-60; Roberte, J .; Y. (1995) Science 269: 202-204). Automation of the synthesis can also be achieved using, for example, an ABI 431A peptide synthesizer (PE Biosystems). Furthermore, the amino acid sequence of CCYPR, or any portion thereof, may be altered by direct synthesis and / or in combination with sequences from other proteins or any portion thereof, using chemical methods, to produce the natural sequence. It is possible to produce a polypeptide having a polypeptide sequence or a variant polypeptide.
[0140]
This peptide can be substantially purified using preparative high performance liquid chromatography (see, for example, Chiez, RM and FZ Regnier (1990) Methods Enzymol. 182: 392-421). The composition of the synthesized peptide can be confirmed by amino acid analysis or sequencing (see, eg, Creighton, supra, pp. 28-53).
[0141]
To express a biologically active CCYPR, the nucleotide sequence encoding CCYPR or a derivative thereof is inserted into a suitable expression vector. This expression vector contains the necessary elements for the regulation of transcription and translation of the coding sequence inserted in a suitable host. These elements include regulatory sequences such as enhancers, constitutive and inducible promoters, 5 'and 3' untranslated regions in the vector and polynucleotide sequences encoding CCYPR. Such elements vary in their length and specificities. With certain initiation signals, it is possible to achieve more efficient translation of the sequence encoding CCYPR. Such signals include the ATG start codon and nearby sequences such as the Kozak sequence. If the sequence encoding CCYPR, its initiation codon and upstream regulatory sequences were inserted into a suitable expression vector, no additional transcriptional or translational regulatory signals would be needed. However, if only the coding sequence or a fragment thereof is inserted, an exogenous translational control signal including an in-frame ATG initiation codon must be included in the expression vector. Exogenous translational elements and initiation codons can be obtained from a variety of sources, both natural and synthetic. Inclusion of suitable enhancers for the particular host cell line used can increase the efficiency of expression. (See, e.g., Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 201-18-162.).
[0142]
Using methods well known to those skilled in the art, it is possible to create an expression vector containing a sequence encoding CCYPR and suitable transcriptional and translational regulatory elements. These methods include:in in vitroRecombinant DNA technology, synthetic technology, andin VivoGenetic recombination techniques are included. (See, for example, Sambrook, J. et al. (1989)Molecular Cloning. A Laboratory ManualAusubel, F., Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, Chapters 4 and 8, and 16-17; M. other. (1995)Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, ch. (See Chapters 9 and 13 1-4).
[0143]
A variety of expression vector / host systems can be used to retain and express the sequence encoding CCYPR. These include, but are not limited to, microorganisms such as bacteria transformed with recombinant bacteriophage, plasmid, or cosmid DNA expression vectors, yeast transformed with yeast expression vectors, and viral expression vectors. (E.g., baculovirus) -infected insect cell lines, and plants transformed with a viral expression vector (e.g., cauliflower mosaic virus, CaMV; tobacco mosaic virus, TMV) or a bacterial expression vector (e.g., Ti or pBR322 plasmid). Cell lines, animal cell lines, etc. (Sambrook, supra, Ausubel, Van Heeke, G. and SM Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509, Bitter,(1987) Methods Enzymol. 153: 516-544; Scorer, CA et al. (1994) Bio / Technology 12: 181-184; Engelhard, EK et al. (1994) Proc. USA 91: 3224-2227, Sandig, V. et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7: 1937-1945, Takamatsu, N. (1987) EMBOJ. 6: 307-311, Coruzzi, G. et al. (1984) EMBOJ. 3: 1671-1680, Broglie, R., et al. (1984) Science 224: 838-843, Winter, J. et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17: 85-105, The McGraw-Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw-Hill New York NY, pp. 191-196, Hong Kong, 1992. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659, Harrington, JJ et al. (1997) Nat. Genet. 15: 345-355). Expression vectors derived from retroviruses, adenoviruses, herpesviruses or vaccinia viruses, or expression vectors derived from various bacterial plasmids can be used to transport nucleotide sequences to target organs, tissues or cell populations (Di Nicola, 5 (6): 350-356, Yu, M. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (13): 6340-6344, Buller, R. M. et al. (1998) Cancer Gen. Ther. McGregor, DP et al. (1994) Mol. Immunol. 31 (3): 219-226, Verma, IM and N. Somia (1985) Nature 317 (6040): 813-815; 1997) Na See 239-242, etc.): ure 389. The present invention is not limited by the host cell used.
[0144]
In bacterial systems, a number of cloning and expression vectors are available for selection depending on the intended use of the polynucleotide sequence encoding CCYPR. For example, for routine cloning, subcloning, and propagation of a polynucleotide sequence encoding CCYPR, a multifunctional E. coli vector such as PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla CA) or pSPORT1 plasmid (GIBCO BRL) can be used. Ligation of the sequence encoding CCYPR into the multiple cloning sites of the vector disrupts the lacZ gene, allowing a colorimetric screening method to identify transformed bacteria containing the recombinant molecule. In addition, using these vectors,in in vitroTranscription, dideoxin screening, single-stranded rescue by helper phage, and nested deletions can be created (eg, Van Heeke, G. and SM Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509.). For example, when a large amount of CCYPR is required, for example, for the production of an antibody, a vector that induces CCYPR expression at a high level can be used. For example, vectors containing a T5 or T7 bacteriophage promoter that strongly induces expression can be used.
[0145]
A yeast expression system can be used for the expression of CCYPR. A variety of vectors containing constitutive or inducible promoters, such as α-factor, alcohol oxidase, and PGH promoter, have been used for yeast Saccharomyces cerevisiaePichia pastorisIt can be used for Furthermore, such vectors induce either the secretion of the expressed protein or its retention in cells, incorporating foreign sequences into the host genome for stable growth. (See, e.g., Ausubel .; and Bitter, GA, et al. (1987) Methods Enzymol. 153: 51-794: Scorer. CA. et al. (1994) Bio / Technology 121-181-184.).
Plant systems can also be used for expression of CCYPR. Transcription of the sequence encoding CCYPR may be, for example, from viral promoters such as CaMV-derived 35S and 19S promoters alone or from TMV (see, eg, Coruzzi, supra, Broglie, supra, Winter, supra). Promoted in combination with the omega leader sequence. These constructs can be introduced into plant cells by direct DNA transformation or pathogen-mediated transfection. (For example,The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992) McGraw-Hill NY, pp. 191-196).
[0146]
In mammalian cells, a variety of virus-based expression systems may be utilized. When an adenovirus is used as an expression vector, a sequence encoding CCYPR may be ligated to an adenovirus transcript / translation complex consisting of the late promoter and tripartite leader sequence. Insertion of the viral genome into a non-essential E1 or E3 region makes it possible to obtain a live virus expressing CCYPR in infected host cells (Logan, J. and Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3655-3659). In addition, transcription enhancers such as the Rous sarcoma virus (RSV) enhancer can be used to increase expression in mammalian host cells. To express proteins at high levels, vectors based on SV40 or EBV can be used.
[0147]
Human artificial chromosomes (HACs) can be used to provide fragments of DNA larger than those expressed and contained in a plasmid. Approximately 6 kb to 10 Mb of HACs are made for treatment and supplied by conventional delivery methods (liposomes, polycationic amino polymers, or vesicles). (See, e.g., Harrington. JJ, et al. (1997) Nat Genet. 15: 345-355.).
[0148]
For long-term production of mammalian-based recombinant proteins, stable expression of CCYPR in cell lines is desirable. For example, it is possible to transform a CCYPR-encoding sequence into a cell line using an expression vector. Such expression vectors include replication and / or endogenous expression elements of viral origin and a selectable marker gene on the same or another vector. After the introduction of the vector, the cells are allowed to grow for about 1-2 days in an enriched medium before being transferred to a selective medium. The purpose of the selectable marker is to confer resistance to the selective mediator, and its presence allows the growth and recovery of cells that reliably express the introduced sequence. Resistant clones of stably transformed cells can be propagated using tissue culture techniques appropriate for the cell type.
[0149]
The transformed cell lines can be recovered using any number of selection systems. Selection systems include, but are not limited to, the herpes simplex virus thymidine kinase gene and the adenine phosphoribosyltransferase gene, each with a tk−Or apr−Used in cells. (See, e.g., Wigler, M. et al. (1977) Cell 11: 223-232; and Lowy, I. et al. (1980) Cell 22: 817-823). Also, resistance to antimetabolites, antibiotics or herbicides can be used as a basis for selection. For example, dhfr confers resistance to methotrexate, neo confers resistance to aminoglycoside neomycin and G-418, als or pat confers resistance to chlorsulfuron (cCCYPRsulfuron), phosphinothricin acetyltransferase (eg, phosphinotricin acetyltransferase). (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 3567-3570; Colbere-Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150: 1-14). In addition, genes available for selection, such as trpB and hisD, which alter what cells need for metabolism, have been described in the literature (eg, Hartman, SC and RC Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8047-51). Visible markers such as anitocyanin, green fluorescent protein (GFP; Clontech), β-glucuronidase and its substrate GUS, luciferase and its substrate luciferin are used. Green fluorescent protein (GFP) (Clontech, Palo Alto, CA) can also be used. These markers can be used to not only identify transformants, but also quantify transient or stable protein expression due to particular vector systems (see, eg, Rhodes, CA et al. 1995) Methods Mol. Biol. 55: 121-131).
[0150]
Even if the presence / absence of marker gene expression indicates the presence of the gene of interest, it may be necessary to confirm the presence and expression of that gene. For example, if a sequence encoding CCYPR is inserted into a marker gene sequence, transformed cells containing the sequence encoding CCYPR can be identified by a lack of marker gene function. Alternatively, the marker gene can be aligned with the sequence encoding CCYPR under the control of one promoter. Expression of the marker gene in response to induction or selection usually also indicates expression of the tandem gene.
[0151]
In general, host cells that contain a nucleic acid sequence encoding CCYPR and that express CCYPR can be identified using a variety of methods well known to those skilled in the art. These methods include DNA-DNA or DNA-RNA hybridization, PCR, and protein biology including membrane-based, solution-based, or chip-based techniques for the detection and / or quantification of nucleic acids or proteins. Test methods or immunological assays include, but are not limited to.
[0152]
Immunological methods for detecting and measuring CCYPR expression using either specific polyclonal or monoclonal antibodies are well known in the art. Such techniques include immunosorbent assays (ELISA), radioimmunoassays (RIAs), and fluorescence activated cell sorters (FACS) coupled to enzymes. A two-site, monoclonal-based immunoassay using monoclonal antibodies reactive to two non-interfering epitopes on CCYPR is preferred, but a competitive binding assay can also be used. These and other assays are well known in the art. (For example, Hampton. R. et al. (1990)Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul. MN, Sect. IV; Coligan, J .; E. FIG. otherCurrent Protocols in Immunology, Green Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York. NY; and Pound, J .; D. (1990)Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ).
[0153]
Various labeling and conjugation techniques are well known to those skilled in the art and can be used in various nucleic acid and amino acid assays. Methods for generating labeled hybridization or PCR probes for detecting sequences related to the polynucleotide encoding CCYPR include oligo-labeling, nick translation, end-labeling, or labeled nucleotides. The PCR amplification used is included. Alternatively, the sequence encoding CCYPR, or any fragment thereof, can be cloned into a vector for generating an mRNA probe. Such vectors, which are well known and commercially available in the art, can be prepared by adding a suitable RNA polymerase such as T7, T3 or SP6 and labeled nucleotides.in in vitroCan be used for the synthesis of RNA probes. These methods are described, for example, in Amersham Pharmacia Biotech and Promega (Madison WI), U.S. Pat. S. Biochemical Corp (Cleveland OH) can use various kits commercially available. Suitable reporter molecules or labels that can be used for easy detection include substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles, and radionuclides, enzymes, fluorescent agents, chemiluminescent agents, chromogenic agents, and the like.
[0154]
Host cells transformed with the nucleotide sequence encoding CCYPR are cultured under conditions suitable for the expression and recovery of the protein from cell culture. Whether a protein produced from a transformed cell is secreted or remains in the cell depends on the sequence used and / or the vector. Those skilled in the art will appreciate that expression vectors containing a polynucleotide encoding CCYPR can be designed to include a signal sequence that directs secretion of CCYPR across prokaryotic and eukaryotic cell membranes.
[0155]
In addition, a host cell strain may be chosen for its ability to modulate expression of the inserted sequences or to process the expressed protein in the desired fashion. Such modifications of the polypeptide include, but are not limited to, acetylation, carboxylation, glycosylation, phosphorylation, lipidation, and acylation. Post-translational processing that cleaves the "prepro" or "pro" form of the protein can be used to identify the target protein, folding and / or activity. A variety of host cells (eg, CHO, HeLa, MDCK, MEK293, WI38) with specific cellular devices and characteristic mechanisms for post-translational activity are available from the American Type Culture Collection (ATCC; Bethesda, MD). And selected to ensure correct modification and processing of the foreign protein.
[0156]
In another embodiment of the present invention, a natural or modified or recombinant nucleic acid sequence encoding CCYPR is linked to a heterologous sequence which translates into a fusion protein in any of the host systems described above. For example, a chimeric CCYPR protein containing a heterologous portion that can be recognized by a commercially available antibody can facilitate screening of a peptide library for inhibitors of CCYPR activity. Also, the heterologous protein portion and the heterologous peptide portion can facilitate purification of the fusion protein using commercially available affinity substrates. Such portions include glutathione S-transferase (GST), maltose binding protein (MBP), thioredoxin (Trx), calmodulin binding peptide (CBP), 6-His, FLAG, c-mc, hemagglutinin (HA). Including, but not limited to. GST and MBP, Trx, CBP, 6-His allow the purification of homologous fusion proteins with immobilized glutathione, maltose, phenylarsine oxide, calmodulin, and metal chelating resins, respectively. FLAG, c-mc, and hemagglutinin (HA) allow immunoaffinity purification of the fusion protein using commercially available monoclonal and polyclonal antibodies that specifically recognize these epitope tags. Alternatively, if the fusion protein is genetically engineered to contain a proteolytic cleavage site between the sequence encoding CCYPR and the heterologous protein sequence, CCYPR may be cleaved from the heterologous portion after purification. Methods for expression and purification of the fusion protein are described in Ausubel. (1995, supra ch 10). It is described in. Various commercially available kits can be used to facilitate expression and purification of the fusion protein.
[0157]
In another embodiment of the invention, a TNT rabbit reticulocyte lysate or a wheat germ extract system (Promega) is used.in in vitroCan synthesize radioactively labeled CCYPR. These systems link the transcription and translation of sequences encoding proteins operably linked to the T7 or T3, SP6 promoter. Translation, for example,35It occurs in the presence of a radiolabeled amino acid precursor that is S-methionine.
[0158]
The compound that specifically binds to CCYPR can be screened using the CCYPR of the present invention or a fragment thereof. At least one or more test compounds can be used to screen for specific binding to CCYPR. Examples of test compounds include antibodies, oligonucleotides, proteins (eg, receptors) or small molecules.
[0159]
In one embodiment, the compound so identified is closely related to a natural ligand of CCYPR, eg, a ligand or fragment thereof, or a natural substrate, structural or functional mimetic or natural binding partner. (Coligan, JE, et al. (1991)Current Protocols in Immunology (See Chapter 5 of 1 (2)). Similarly, the compound may be closely related to the natural receptor to which CCYPR binds, or at least some fragment of the receptor, eg, a ligand binding site. In each case, the compound can be rationally designed using known techniques. In one embodiment, screening for such compounds involves generating suitable cells that express CCYPR as either a secreted protein or a protein on the cell membrane. Suitable cells include cells from mammals, yeast, E. coli. Cells expressing CCYPR or cell membrane fragments containing CCYPR are contacted with a test compound and analyzed for binding, stimulation or inhibition of either CCYPR or the compound.
[0160]
Some assays simply allow the test compound to be experimentally bound to the polypeptide and the binding detected by a fluorophore, radioisotope, enzyme conjugate or other detectable label. For example, the assay may include binding at least one test compound to CCYPR, either in solution or immobilized on a solid support, and detecting binding of CCYPR to the compound. Alternatively, detection and measurement of binding of a test compound in the presence of a labeled competitor can be performed. In addition, this assay can be performed using cell release agents, chemical libraries or natural product mixtures, wherein the test compound is released in solution or immobilized on a solid support.
[0161]
Using the CCYPR of the present invention or a fragment thereof, it is possible to screen for a compound that regulates the activity of CCYPR. Such compounds include agonists, antagonists, or partial or inverse agonists and the like. In one example, the assay is performed under conditions where CCYPR binds to at least one test compound, where the activity of CCYPR is permissive, and the activity of CCYPR in the presence of the test compound is determined by the activity of CCYPR in the absence of the test compound. Compare with activity. A change in the activity of CCYPR in the presence of the test compound indicates the presence of a compound that modulates the activity of CCYPR. Alternatively, the test compound comprises CCYPR under conditions suitable for the activity of CCYPR.in in vitroAlternatively, the assay is performed in combination with a cell release system. In any of these assays, the test compound that modulates the activity of CCYPR can bind indirectly and does not need to be in direct contact with the test compound. At least one and a plurality of test compounds can be screened.
[0162]
In another example, a polynucleotide encoding CCYPR or a mammalian homolog thereof is "knocked out" in an animal model system using homologous recombination in embryonic stem cells (ES cells). Such techniques are well known in the art and are useful for generating animal models of human disease (see, eg, US Pat. Nos. 5,175,383 and 5,767,337). For example, mouse ES cells such as the 129 / SvJ cell line are derived from an early mouse embryo and can be grown in a medium. These ES cells are transformed with a vector containing a gene of interest disrupted with a marker gene such as the neomycin phosphotransferase gene (neo: Capecchi, MR (1989) Science 244: 1288-1292). This vector is integrated into the corresponding region of the host genome by homologous recombination. In another method, homologous recombination is performed using the Cre-loxP system to knock out the target gene in a tissue-specific or developmental stage-specific manner (Marth, JD (1996) Clin. Invest. 97: 1999-2002). Wagner, KU, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4323-4330). The transformed ES cells are identified and microinjected into mouse cell blastocysts collected, for example, from the C57BL / 6 mouse line. The blastocysts are surgically introduced into pseudopregnant females, the genetic traits of the resulting chimeric progeny are determined, and they are bred to produce heterozygous or homozygous lines. The transgenic animals thus produced can be tested for potential therapeutic or toxic agents.
[0163]
A polynucleotide encoding CCYPRin in vitroIt is possible to operate on ES cells derived from human blastocysts. Human ES cells have the potential to differentiate into at least eight distinct cell lineages, including endoderm, mesoderm and ectoderm cell types. These cell lines differentiate into, for example, neurons, hematopoietic lineages and cardiomyocytes (Thomson, JA, et al. (1998) Science 282: 1145-1147).
[0164]
Using a polynucleotide encoding CCYPR, it is possible to create a “knock-in” humanized animal (pig) or transgenic animal (mouse or rat) using human disease as a model. Using knock-in technology, a region of the polynucleotide encoding CCYPR is injected into animal ES cells and the injected sequence is integrated into the animal cell genome. The transformed cells are injected into a blastula and the blastula is implanted as described above. Study transgenic progeny or inbreds, treat with potential medicines, and get information about the treatment of human disease. Alternatively, mammalian inbred lines that overexpress CCYPR, such as secreting CCYPR into milk, can be a convenient source of protein (Janne, J. et al. (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4: 55-). 74).
[0165]
(Treatment)
There are chemical and structural similarities, for example, in the context of sequences and motifs, between certain regions of the CCYPR and certain regions of the cell cycle and cell growth proteins. In addition, CCYPR expression is closely linked to inflammation, trauma, cell proliferation, and cancer. Thus, CCYPR is thought to play a role in immune abnormalities, developmental disorders, impaired cell signaling, and abnormal cell proliferation including cancer. In the treatment of a disease associated with an increase in the expression or activity of CCYPR, it is desirable to reduce the expression or activity of CCYPR. In the treatment of a disease associated with a decrease in the expression or activity of CCYPR, it is desirable to increase the expression or activity of CCYPR.
[0166]
Thus, in one embodiment, it is possible to administer CCYPR or a fragment or derivative thereof to a patient for the treatment or prevention of a disease associated with reduced expression or activity of CCYPR. Examples of such diseases include, but are not limited to, immune disorders, including inflammation and actinic keratosis, acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and adrenal insufficiency, adult respiratory distress syndrome , Allergies, ankylosing spondylitis, amyloidosis, anemia, arteriosclerosis, asthma, atherosclerosis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thyroiditis, autoimmune polyglandular endocrine candidal ectoderm dystrophy ( APECED), bronchitis, bursitis, cholecystitis, cirrhosis, contact dermatitis, Crohn's disease, atopic dermatitis, dermatomyositis, diabetes, emphysema, lymphocotoxin temporary lymphopenia, erythroblasts Disease, erythema nodosum, atrophic gastritis, glomerulonephritis, Goodpasture's syndrome, gout, Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, hepatitis, hypereosinophilia, irritable bowel syndrome, Combined connective tissue disease (MCTD), multiple sclerosis, myasthenia gravis, myocardial or pericardial inflammation, myelofibrosis, osteoarthritis, osteoporosis, pancreatitis, polycythemia vera, polymyositis, psoriasis, lighter Syndrome, rheumatoid arthritis, scleroderma, Sjogren's syndrome, systemic anaphylaxis, systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis, primary thrombocythemia, thrombocytopenia, ulcerative colitis, Werner syndrome, cancer complications, Includes hemodialysis, extracorporeal circulation, viral infections, bacterial infections, fungal infections, parasitic infections, protozoal infections, helminthic infections, trauma, and hematopoietic cancers including lymphoma and leukemia, myeloma, It also includes developmental disorders, including tubular acidosis, anemia, Cushing's syndrome, achondroplasia dwarfism, Duchenne-Becker muscular dystrophy, epilepsy, gonad dysplasia, AGR syndrome (Wilms tumor, aniridia, genitourinary disorders, mental retardation), Smith-Magenis syndrome, myelodysplastic syndrome, hereditary mucosal epithelial dysplasia, hereditary keratoderma, Charcot-Marie -Hereditary neuropathies such as tooth disease and neurofibromatosis, hypothyroidism, hydrocephalus, seizure disorders such as Syndenham's chorea and cerebral palsy, spinal cord fission, anencephaly, cranial spine Includes arytenosis, congenital glaucoma, cataract, sensory nerve hearing loss, and impaired cell signaling, including primary brain tumors and adenomas, gestational infarction, pituitary resection, aneurysms, vascular malformations Hypothalamic and pituitary disorders resulting from lesions such as thrombosis, infection, Inappropriate antidiuretic hormone (ADH) secretion syndrome (SIADH) and disorders associated with hyperpituitary gland including acromegaly, giantosis, goiter and myxedema, bacterial infectious acute thyroiditis And hyperparathyroidism including Conn's disease (chronic hypercalemia); pancreatic diseases such as type I and type II diabetes and complications; and carcinomas of the hyperplasia and adrenal cortex. Adrenal-related disorders such as adenomas, alkalosis-related hypertension, and abnormal prolactin production in women, infertility including disorders of the fallopian tubes and ovulation and endometriosis, menstrual cycle perturbations, and polycystic ovarian disease Ovarian disease, ovarian hyperstimulation syndrome, endometrial or ovarian cancer, uterine fibroids, autoimmune disease, ectopic pregnancy, malformation, high Prolactinemia, selective gonadotropin definition, amenorrhea, milk leakage, semi-yin yang, hirsutism and virilization, breast cancer, fibrocystic breast disease, osteoporosis after menopause , Male Leydig cell hyperplasia, male menopause, germ cell aplasia, hypersexual function associated with Leydig cell tumors, androgen resistance, 5α-reductase syndrome associated with lack of androgen receptor, impaired spermatogenesis, physiology Endocrine disorders including gonadal steroid hormone-related diseases such as abnormal sperm physiology, testicular cancer, prostate cancer, benign prostatic hyperplasia, prostatitis, Peyronie's disease, impotence, male breast cancer, and female breast disease. Harm, including cell proliferation abnormalities, including actinic keratosis and atherosclerosis, bursitis, cirrhosis, hepatitis, mixed connective tissue disease (MCTD), myelofibrosis, Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, polycythemia vera, psoriasis, primary thrombocythemia, and adenocarcinoma and leukemia, lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, and teratocarcinoma, specifically, adrenal gland, bladder, bone , Bone marrow, brain, breast, neck, gallbladder, ganglion, digestive tract, heart, kidney, liver, lung, muscle, ovary, pancreas, parathyroid, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen, testis, thymus, thyroid, Includes uterine cancer.
[0167]
In another embodiment, a vector capable of expressing CCYPR or a fragment or derivative thereof for the treatment or prevention of a disease associated with reduced expression or activity of CCYPR, including but not limited to the diseases listed above, is provided. It can also be administered to patients.
[0168]
In yet another embodiment, a pharmaceutical composition comprising substantially purified CCYPR for the treatment or prevention of a disease associated with reduced expression or activity of CCYPR, including but not limited to the diseases listed above. The substance can be administered to a patient together with a suitable pharmaceutical carrier.
[0169]
In yet another embodiment, an agonist that modulates the activity of CCYPR is administered to a patient for the treatment or prevention of a disease associated with decreased expression or activity of CCYPR, including but not limited to the diseases listed above. It is also possible.
[0170]
In a further example, a patient can be administered an antagonist of CCYPR for the treatment or prevention of a disease associated with increased expression or activity of CCYPR. Examples of such diseases include, but are not limited to, the above-mentioned immune disorders, developmental disorders, disorders of cell signaling, and abnormal cell proliferation, including cancer. In one embodiment, an antibody that specifically binds to CCYPR can be used directly as an antagonist or indirectly as a targeting or delivery mechanism to deliver an agent to cells or tissues that express CCYPR.
[0171]
In another embodiment, the complement of a polynucleotide encoding CCYPR is expressed for the treatment or prevention of a disease associated with increased expression or activity of CCYPR, including but not limited to the diseases listed above. The vector can be administered to the patient.
[0172]
In another embodiment, any of the proteins, antagonists, antibodies, agonists, complementary sequences, and vectors of the invention may be administered in combination with another suitable therapeutic agent. One skilled in the art can select a suitable therapeutic agent to use in combination therapy according to conventional pharmaceutical principles. Combinations with therapeutic agents can have synergistic effects in the treatment or prevention of the various diseases listed above. Using this method, it is possible to achieve a medicinal effect with a small amount of each drug, and to reduce the possibility of a wide range of side effects.
[0173]
An antagonist of CCYPR can be produced using methods common in the art. Specifically, antibodies can be produced using purified CCYPR, or therapeutic drug libraries can be screened to identify those that specifically bind to CCYPR. CCYPR antibodies can also be produced using methods common in the art. Such antibodies include polyclonal, monoclonal, chimeric, single chain, Fab fragments, and fragments produced by Fab expression libraries. However, it is not limited to these. For therapeutic use, neutralizing antibodies (ie, those that inhibit dimer formation) are particularly preferred.
[0174]
For the production of antibodies, various hosts, including goats, rabbits, rats, mice, humans and others, are immunized by injection of CCYPR or any fragment or its oligopeptide with immunogenic properties. Can be done. Depending on the host species, various adjuvants can be used to enhance the immune response. Such adjuvants include surfactants such as Freund's adjuvant, mineral gel adjuvants such as aluminum hydroxide, lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oily emulsions, keyhole limpet hemocyanin, and dinitrophenol. However, the present invention is not limited to these. Among adjuvants used in humans, BCG (bacilli Calmette-Guerin) andCorynebacterium parvumIs particularly preferred.
[0175]
The oligopeptide, peptide, or fragment used to elicit antibodies to CCYPR consists of at least about 5 amino acids, and generally is preferably about 10 or more amino acids. Desirably, these oligopeptides or peptides, or fragments thereof, are identical to a portion of the amino acid sequence of the native protein. Short stretches of CCYPR amino acids can be fused to sequences of another protein, such as KLH, to produce antibodies against the chimeric molecule.
[0176]
Monoclonal antibodies against CCYPR can be produced by continuous cell lines in culture using any technique that produces antibody molecules. These techniques include, but are not limited to, hybridoma technology, human B cell hybridoma technology, and EBV-hybridoma technology (eg, Kohler, G. et al. (1975) Nature 256: 495-495). Kozbor, D. et al. (1985) J. Immunol. Methods 81-8-42; Cote, RJ. Et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026-2030; SP et al. (1984) Mol. Cell Biol. 62: 109-120).
[0177]
In addition, techniques such as splicing a mouse antibody gene to a human antibody gene developed for the production of a “chimeric antibody” are used to obtain molecules with suitable antigen specificity and biological activity (eg, Morrison (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81-4855-14855; Neuberger, MS, et al. (1984) Nature 312: 604-608; Takeda, S. et al. ) Nature 314: 452,454). Alternatively, the techniques described for the production of single-chain antibodies are applied using methods well known in the art to generate CCYPR-specific single-chain antibodies. Antibodies of related idiotype composition with related specificity can also be generated by chain mixing from random combinations of immunoglobulin libraries (see, eg, Burton DR (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 11120-3).
[0178]
Antibodies in lymphocyte populationsin VivoIt can also be produced by inducing production, or by screening immunoglobulin libraries or by screening a panel of highly specific binding reagents as indicated in the literature (see, eg, Orlandi, R. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833-3837; Winter, G. et al. (1991) Nature 349: 293-299).
[0179]
Antibodies containing specific binding sites for CCYPR can also be produced. For example, such fragments include a fragment at F (ab ') generated by pepsin digestion of an antibody molecule and a Fab fragment at F (ab') generated by reducing the disulfide bridges of the fragment. However, the present invention is not limited to these. Alternatively, creating a Fab expression library allows for the rapid and easy identification of monoclonal Fab fragments with the desired specificity (eg, Huse, WD, et al. (1989) Science 254: 1275-). 1281).
[0180]
Screening is performed using various immunoassays to identify antibodies with the desired specificity. Numerous protocols for competitive binding, using either polyclonal or monoclonal antibodies with sequestered specificity, or immunoradioactivity, are well known in the art. Usually, such immunoassays involve the measurement of complex modulation between CCYPR and its specific antibody. A two-site, monoclonal-based immunoassay using monoclonal antibodies reactive to two non-interfering CCYPR epitopes is generally employed, but a competitive binding assay can also be employed (Pound, supra).
[0181]
Various methods such as Scatchard analysis are used with radioimmunoassay techniques to assess the affinity of the antibody for CCYPR. Affinity is represented by the binding constant Ka, which is the value obtained by dividing the molar concentration of the CCYPR antibody complex by the molar concentration of free antibody and free antigen under equilibrium conditions. The Ka of a polyclonal antibody drug with heterogeneous affinity for multiple CCYPR epitopes indicates the average affinity or avidity of the antibody for CCYPR. The Ka of a monoclonal antibody drug monospecific for a particular CCYPR epitope represents a true measure of affinity. Ka value is 109-1012The L / mol high affinity antibody drug is preferably used in immunoassays where the CCYPR antibody conjugate must withstand severe manipulations. Ka value is 106-107The L / mol low affinity antibody drug is preferably used for immunopurification and similar treatments where CCYPR must eventually dissociate from the antibody in an activated state. (Catty, D. (1988)Antibodies, Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC; E. FIG. and Cryer, A.C. (1991)A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY).
[0182]
To determine the quality and suitability of such drugs for certain downstream applications, the antibody titer and avidity of the polyclonal antibody drug are further evaluated. For example, polyclonal antibody medicaments containing at least 1-2 mg / ml of specific antibody, preferably 5-10 mg / ml of specific antibody, are generally used in processes where CCYPR antibody complexes must be precipitated. Guidance on antibody specificity and titer, binding activity, antibody quality and usage in various applications is generally available. (See, eg, Catty, supra, and Colligan et al., Supra).
[0183]
In another embodiment of the present invention, a polynucleotide encoding CCYPR, or any fragment or complement thereof, can be used for therapeutic purposes. In one embodiment, gene expression can be altered by designing sequences and antisense molecules (DNA and RNA, modified nucleotides) that are complementary to the coding and regulatory regions of the gene encoding CCYPR. Such techniques are well known in the art, and sense or antisense oligonucleotides or large fragments can be designed from the control region of the sequence encoding CCYPR, or from various locations along the coding region.
[0184]
For use in therapy, any gene delivery system suitable for introducing the antisense sequences into suitable target cells can be used. Antisense sequences can be delivered intracellularly in the form of an expression plasmid that, upon transcription, expresses a sequence that is complementary to at least a portion of the cell sequence encoding the target protein (see, eg, Slater, JE. Et al. 1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102 (3): 469-475; and Scanlon, KJ. Et al. (1995) 9 (13): 1288-1296. Antisense sequences can also be introduced into cells using, for example, viral vectors such as retroviruses and adeno-associated virus vectors (eg, Miller, AD (1990) Blood 76: 271; Ausubel, supra). Uckert, W. and W. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63 (3): 323-347). Other genetic delivery mechanisms include liposome systems, artificial viral envelopes, and other systems well known in the art (Rossi, JJ (1995) Br. Med. Bull. 51 (1): 217-225; Boado, RJ, et al. (1998) J. Pharm. Sci. 87 (11): 1308-1315; and Morris, MC, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25 (14): 2730. -2736.).
[0185]
In another embodiment of the invention, the polynucleotide encoding CCYPR can be used for somatic or germ cell gene therapy. Gene therapy involves (i) a severe combined immunodeficiency (SCID) -X1 characterized by a genetic deficiency (eg, X chromosome linkage (Cavazzana-Calvo, M. et al. (2000) Science 288: 669-672)). ), A hereditary adenosine-deaminase (ADA) deficiency (Blaese, RM et al. (1995) Science 270: 475-480; Bordignon, C. et al. (1995) Science 270: 470-475). Complex immunodeficiency, cystic fibrosis (Zabner, J. et al. (1993) Cell 75: 207-216: Crystal, RG et al. (1995) Hum. Gene @ Therapy 6: 643-666; Crystal, RG Others (199 Hum. Gene Therapy 6: 667-703), thalassemia, familial hypercholesterolemia, hemophilia due to factor VIII or factor IX deficiency (Crystal, 35 ° RG (1995) Science 270: Verma, IM and Somia, N. (1997) Nature 389: 239-242), or (ii) a conditional lethal gene product (eg, in cancer due to uncontrolled cell proliferation). And (iii) intracellular parasites such as the human immunodeficiency virus (HIV) (Baltimore, D. (1988) Nature 335: 395-396; Poescbla, E. et al. (1996) Proc. Natl.Aca USA 93: 11395-11399), hepatitis B or C virus (HBV, HCV),Candida albicansas well asParacoccidioides brasiliensisFungal parasites, such asPlasmodium falciparumas well asTrypanosoma cruziEtc.) can be carried out by expressing a protein having a protective function against parasite parasites such as When deficiency of a gene required for expression or regulation of CCYPR causes a disease, CCYPR can be expressed from a suitable population of the introduced cells to alleviate the onset of symptoms caused by the gene deficiency.
[0186]
In a further embodiment of the invention, diseases and disorders due to CCYPR deficiency are treated by creating mammalian expression vectors encoding CCYPR and introducing these vectors into CCYPR deficient cells by mechanical means. .in VivoOrex in vitroMechanical transfection techniques used for cells of (i) include (i) microinjection of DNA into individual cells, (ii) bombardment of gold particles, (iii) liposome-mediated transfection, (iv) receptor-mediated Gene transfer and (v) DNA transposon (Morgan, RA and WF Anderson (1993) Annu. Rev. Biochem. 62: 191-217; Ivics, Z. (1997) Cell 91: 501-). 510; Boulay, JL and H. Recipon (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9: 445-450).
[0187]
Expression vectors that can affect CCYPR expression include, but are not limited to, PCDNA3.1, EPITAG, PRCCMV2, PREP, PVAX vector (Invitrogen, Carlsbad CA), PCMV-SCRIPT, PCMV-TAG, PEGSH / PERV (Stratagene, La Jolla CA), PTT-OFF, PTTET-ON, PTRE2, PTRE2-LUC, PTK-HYG (Clontech, Palo Alto CA). To express CCYPR, (i) a constitutively active promoter (eg, cytomegalovirus (CMV), rous sarcoma virus (RSV), SV40 virus, thymidine kinase (TK), or β-actin gene); (Ii) Inducible promoters (eg, a tetracycline-regulated promoter (Gossen, M. and H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. Inc.) contained in a commercially available T-REX plasmid (Invitrogen). U.S.A. 89: 5547-5551; Gossen, M. et al. (1995) Science 268: 1766-1769; Rossi, FMV and HM Blau (1998) Curr. Opin. Biotech. 9: 451-456), an ecdysone inducible promoter (included in commercially available plasmids PVGRXR and PIND: Invitrogen), an FK506 / rapamycin inducible promoter, or a RU486 / mifepristone inducible promoter ( Rossi, FMV and HM Blau, supra), or (iii) the natural or tissue-specific promoter of the endogenous gene encoding CCYPR from a normal individual. It is.
[0188]
Using commercially available liposome transformation kits (eg, PERFECT LIPID and TRANSFECTION KIT sold by Invitrogen), one skilled in the art can introduce polynucleotides into target cells in culture without much recourse to experience. . Alternative methods include the calcium phosphate method (Graham. FL and AJ Eb (1973) Virology 52: 456-467) or the electroporation method (Neumann, B. et al. (1982) EMBO J. 1: 841-845. ). In order to introduce DNA into primary cells, these standard mammalian transfection protocols need to be modified.
[0189]
In another embodiment of the present invention, the disease or disorder caused by a genetic defect associated with the expression of CCYPR comprises: (i) polymorphism encoding CCYPR under the control of a retroviral terminal repeat (LTR) promoter or an independent promoter. Nucleotides and (ii) a suitable RNA packaging signal, and (iii) a Rev responsive element (RRE) with additional retroviral cis-acting RNA sequences and coding sequences required for efficient vector propagation. Retroviral vectors can be made and treated. Retroviral vectors (eg, PFB and PFBNEO) are available from Stratagene and published data (Riviere, I. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6733-6737). ) Based on. The above data is incorporated herein by reference. This vector is VSVg (Armentano, D. et al. (1987) J. Virol. 61: 1647-1650; Bender, MA. Et al. (1987) J. Virol. 61: 1639-1646; Adam, MA. and AD Miller (1988) J. Virol. 62: 3802-3806; Dull, T. et al. (1998) J. Virol. 72: 8463-8471; Zufferey, R. et al. (1998) J. Virol. : 9873-9880) or a suitable vector producing cell line (VPCL) that expresses a promiscuous envelope protein or an envelope gene that has an affinity for the receptor on the target cell. U.S. Patent No. 5,910,434 to RIGG ("Method for observing retrovirus packaging cell lines producing high transducing effect"; a method for disseminating the virus in a retrospective system) Citation is incorporated herein by reference. Propagation of retroviral vectors, certain cell populations (eg, CD4+Methods for transducing T cells) and returning the transduced cells to the patient are well known in the field of gene therapy and are described in numerous references (Ranga, U. et al. (1997) J. Virol. 71: 7020-7029; Bauer, G. et al. (1997) Blood 89: 2259-2267; Bonyhadi, M. L. (1997) J. Virol. 71: 4707-4716; Ranga, U. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1201-1206: Su, L. (1997) Blood 89: 2283- 2290).
[0190]
Alternatively, an adenovirus-based gene therapy delivery system is used to deliver a polynucleotide encoding CCYPR to cells having one or more genetic abnormalities associated with CCYPR expression. The production and packaging of adenovirus-based vectors is well known in the art. Replication-defective adenovirus vectors have been shown to be variable to introduce genes encoding immunomodulatory proteins into intact pancreatic islets of the pancreas (Csete, ME et al. (1995)). Transplantation 27: 263-268). Adenovirus vectors that may be used are described in US Pat. No. 5,707,618 (“Adenovirus vectors for gene therapy”), which is hereby incorporated by reference. For adenovirus vectors, see also Antinozzi, P. et al. A. Et al. (1999) Annu. Rev .. Nutr. 19: 511-544; and Verma, I .; M. and N.M. Somia (1997) Nature 18: 389: 239-242, which is hereby incorporated by reference.
[0191]
Alternatively, a herpes-based gene therapy delivery system is used to deliver a polynucleotide encoding CCYPR to target cells having one or more genetic abnormalities associated with CCYPR expression. Herpes simplex virus (HSV) -based vectors are particularly important in introducing CCYPR into HSV-affected central nervous cells. The production and packaging of herpes-based vectors is well known in the art. Vectors of the replication-competent herpes simplex virus (HSV) type I system have been used to deliver reporter genes to primate eyes (Liu, X. et al. (1999) Exp. Eye Res. 169: 385). -395). The construction of the HSV-1 viral vector is described in U.S. Pat. No. 5,804,413 to DeLuca (Herpes simple viruses against genes transfer), which is incorporated herein by reference. . U.S. Patent No. 5,804,413 discloses a recombinant HSV comprising a genome containing at least one endogenous gene introduced into a cell under the control of a suitable promoter for purposes including human gene therapy. There is a description about d92. The patent also discloses methods for making and using recombinant HSV strains that are removed for ICP4, ICP27 and ICP22. For HSV vectors, see Goins, W. et al. F. Et al. (1999) J. Am. Virol. 73: 519-532 and Xu, H .; Et al. (1994) Dev. Biol. 163: 152-161, which are hereby incorporated by reference. Manipulation of cloned herpesvirus sequences, passage of recombinant virus after transfection of multiple plasmids containing different parts of the genome of the herpesvirus giant, growth and propagation of herpesvirus, and transfer to herpesvirus cells Infection is a technique well known in the art.
[0192]
Alternatively, a polynucleotide encoding CCYPR is delivered to target cells using an alphavirus (positive single-stranded RNA virus) vector. Biological studies of the prototype alphavirus, Semliki Forest Virus (SFV), have been performed extensively and found that the gene transfer vector is based on the SFV genome (Garoff). , H. and K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9: 464-469). During the replication of alpha viral RNA, subgenomic RNA is usually created that encodes the viral capsid protein. Because this subgenomic RNA is replicated at a higher level than full-length genomic RNA, capsid proteins are produced in excess of viral proteins having enzymatic activity (eg, proteases and polymerases). Similarly, by introducing a sequence encoding CCYPR into the region encoding the capsid of the α virus genome, a large number of RNAs encoding CCYPR are produced in the vector-transfected cells, and CCYPR is synthesized at a high level. Alpha virus infection usually involves cell lysis within 2-3 days, but the ability to establish persistent infection of normal kidney cells of hamsters (BHK-21) with Sindbis virus (SIN) variants Suggest that the lytic replication of the α virus can be suitably altered to be applicable to gene therapy (Dryga, SA et al. (1997) Virology 228: 74-83). ). Since the α virus can be introduced into various hosts, CCYPR can be introduced into various types of cells. Specific transduction of a subset of cells in a population may require sorting of the cells before transduction. The manipulation of infectious cDNA clones of α-virus, transfection of α-virus cDNA and RNA, and methods of infecting α-virus are well known in the art.
[0193]
For example, oligonucleotides derived from the transcription initiation site from about -10 to about +10 from the start site can be used to inhibit gene expression. Similarly, inhibition can be achieved using triple helix base pairing. Triple helix structures are useful because they prevent the double helix from spreading sufficiently for the binding of polymerases, transcription factors, or regulatory molecules. Recent therapeutic advances using triple-DNA have been described in the literature (eg, Gee, JE et al. (1994) In: Huber, BE and BI Carr,Molecular and ImmunologyCCYPRproaches, Futura Publishing Co., Ltd. , Mt. Kisco, NY). Complementary sequences or antisense molecules can also be designed to prevent translation of the mRNA by preventing the transcript from binding to the ribosome.
[0194]
Ribozymes, which are enzymatic RNA molecules, can be used to catalyze the specific cleavage of RNA. The mechanism of ribozyme action involves sequence-specific hybridization of the ribozyme molecule to complementary target RNA, followed by nucleotide strand breaks. For example, a recombinant hammerhead ribozyme molecule that specifically and effectively catalyzes nucleotide chain cleavage of a sequence encoding CCYPR is included.
[0195]
Specific ribozyme cleavage sites within any potential RNA target are initially identified by scanning the target molecule for ribozyme cleavage sites that include the following sequences GUA, GUU, and GUC. Once identified, the short RNA sequence of 15-20 ribonucleotides corresponding to the region of the target gene containing the cleavage site is evaluated for secondary structural features that render the oligonucleotide dysfunctional Is possible. The suitability of a candidate target can also be assessed by using a ribonuclease protection assay to test the ease of hybridization with a complementary oligonucleotide.
[0196]
The complementary ribonucleic acid molecules and ribozymes of the invention can be made for synthesis of the nucleic acid molecule using methods well known in the art. These methods include methods for chemically synthesizing oligonucleotides such as solid phase phosphoramidite compounds. Alternatively, the RNA moleculein in vitroas well asin VivoSuch DNA sequences can be incorporated into a variety of vectors using a suitable RNA polymerase promoter such as T7 or SP6. Alternatively, those cDNA constructs that synthesize complementary RNA constitutively or inducibly can be introduced into a cell line, cell, or tissue.
[0197]
Modification of an RNA molecule can increase intracellular stability and increase half-life. Possible modifications include the addition of flanking sequences at the 5 'and / or 3' ends of the molecule, or the use of phosphorothioate or 2'O methyl rather than phosphodiesterase linkages in the backbone of the molecule. However, the present invention is not limited to these. This concept inherent in the production of PNAs includes acetyl-, methyl-, thio-, and similar modified forms of adenine, cytidine, guanine, thymine, and uridine that are not readily recognized by endogenous endonucleases, as well as These molecules can be expanded throughout by including non-conventional bases such as inosine, queosine, and wybutosine.
[0198]
A further embodiment of the invention includes a method of screening for a compound that is effective in altering the expression of a polynucleotide encoding CCYPR. Compounds that are effective in altering the expression of a particular polynucleotide include, but are not limited to, non-polymeric chemicals, oligonucleotides, antisense oligonucleotides, triple helix-forming oligonucleotides that can interact with a particular polynucleotide sequence. Includes nucleotides, transcription factors and other polypeptide transcription regulators. An effective compound can act as an inhibitor or enhancer of polynucleotide expression and alter polynucleotide expression. Accordingly, in the treatment of diseases associated with increased CCYPR expression or activity, compounds that specifically inhibit the expression of a polynucleotide encoding CCYPR are therapeutically useful, and are associated with decreased CCYPR expression or activity. In treating disease, compounds that specifically enhance the expression of a polynucleotide encoding CCYPR may be therapeutically useful.
[0199]
At least one to a plurality of test compounds can be screened to determine the effectiveness of an alteration in the expression of a particular polynucleotide. Test compounds can be obtained by any method known in the art, including chemical modification of an effective compound. Such methods may be based on the chemical and / or structural properties of the target polynucleotide when altering the expression of the polynucleotide, selecting from a library of commercially available or proprietary natural or non-natural compounds, and altering the expression of the polynucleotide. It is effective when designing a compound rationally and further selecting from a library of compounds generated in combination or randomly. A sample comprising a polynucleotide encoding CCYPR is obtained by exposure to at least one test compound. Samples include, for example, intact cells, permeabilized cells,in in vitroCell free or reconstituted biochemical systems may be included. Changes in the expression of a polynucleotide encoding CCYPR are assayed by any method known in the art. Usually, the expression of a specific nucleotide is detected by hybridization using a probe having a nucleotide sequence complementary to the sequence of the polynucleotide encoding CCYPR. The hybridization yield is quantified, and that value can be a basis for comparing the expression of polynucleotides exposed and unexposed to one or more test compounds. A change in the expression of a polynucleotide that is exposed to the test compound is detected, indicating that the test compound is effective in altering the expression of the polynucleotide. To determine compounds that are effective at altering the expression of a particular polynucleotide, for example,Schizosaccharomyces pombeGene expression system (Atkins, D. et al. (1999) U.S. Pat. No. 5,932,435, Arndt, GM et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28: E15) or human cell lines such as HeLa cells (Clarke) , ML, et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268: 8-13). A particular embodiment of the present invention involves screening a combinatorial library of each oligonucleotide (deoxyribonucleotides, ribonucleotides, peptide nucleic acids, and modified oligonucleotides) for antisense activity against a specific polynucleotide sequence (Bruice). (1997) U.S. Patent No. 5,686,242, Bruice, TW et al. (2000) U.S. Patent No. 6,022,691).
[0200]
Numerous methods for introducing vectors into cells or tissues are available,in Vivo,in in vitro,as well asex VivoEqually suitable for use inex VivoIn the case of treatment with, the vector is introduced into hepatocytes collected from a patient and cloned and propagated to return the same patient by autologous transplantation. Transfection, ribosome injection, or delivery by polycation amino polymer can be performed using methods well known in the art (eg, Goldman, CK et al. (1997) Nature Biotechnology 15: 462-66: See).
[0201]
Any of the treatment methods described above can be applied to all subjects in need of treatment, including, for example, mammals such as humans, dogs, cats, cows, horses, rabbits, and monkeys.
[0202]
Another embodiment of the present invention relates to the administration of a medicament or sterile composition with a pharmaceutically acceptable carrier for all of the above-mentioned therapeutic effects. Such a pharmaceutical composition comprises CCYPR, an antibody, a mimetic, an agonist, an antagonist of CCYPR, an inhibitor of CCYPR, or the like. The composition can be administered alone or in combination with one or more other agents, such as stabilizers, to a sterile, biocompatible pharmaceutical carrier. Such pharmaceutical carriers include, but are not limited to, saline, buffered saline, glucose, water, and the like. The composition can be administered alone or with another drug, such as a drug or hormone.
[0203]
The pharmaceutical composition used in the present invention can be administered using various routes. This route includes oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intraventricular, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual, or rectal Is not limited to these.
[0204]
Pharmaceutical compositions for pulmonary administration can be prepared in liquid or dry powder form. Such pharmaceutical compositions usually aerosolize shortly before inhalation by the patient. In the case of small molecules (eg, conventional low molecular weight organic drugs), aerosol delivery of fast acting formulations is well known in the art. In the case of macromolecules (e.g., larger peptides and proteins), the technology for pulmonary transport through the alveolar region of the lung has improved in recent years, making it possible to actually transport drugs such as insulin into the blood ( See Patton, JS, et al., US Patent No. 5,997,848). Pulmonary delivery is advantageous in that it can be administered without needle injection, eliminating the need for potentially toxic penetration enhancers.
[0205]
Suitable pharmaceutical compositions for use in the present invention include compositions that contain an effective amount of the active ingredient to achieve its intended purpose. One skilled in the art can determine the effective dose with sufficient ability.
[0206]
Particular forms of the pharmaceutical composition are prepared for delivering macromolecules, including CCYPR or a fragment thereof, directly into cells. For example, a liposome formulation containing a cell-impermeable polymer can promote cell fusion and intracellular transport of the polymer. Alternatively, CCYPR or a fragment thereof can be attached to the cationic N-terminus of the HIV Tat-1 protein. It has been confirmed that the fusion protein thus produced is transduced into cells of all tissues including the mouse model system brain (Schwarze, SR, et al. (1999) Science 285: 1569-). 1572).
[0207]
For any composition, a therapeutically effective dose can be estimated initially either in tumor cell assays, for example, on tumor cells, or in animal models. Usually, a mouse, rabbit, dog, monkey, pig, or the like is used as an animal model. Animal models can also be used to determine suitable enrichment ranges and routes of administration. Based on such treatment, beneficial dosages and routes for administration in humans can be determined.
[0208]
A medically effective dose relates to the amount of active ingredient that ameliorates a symptom or condition, eg, CCYPR or a fragment thereof, an antibody of CCYPR, an agonist or antagonist of CCYPR, an inhibitor, and the like. Medicinal efficacy and toxicity are, for example, ED50(Dose that is pharmaceutically effective in 50% of the population for taking) or LD50(Dose that is lethal to 50% of the population for dosing) can be determined by standard pharmaceutical techniques in cell culture or animal studies, such as calculating statistics. The dose ratio between toxic and therapeutic effects is the therapeutic index and the LD50/ ED50It can be shown. Pharmaceutical compositions that exhibit high therapeutic indices are desirable. The data obtained from the cell culture assays and animal studies is used in formulating a range of dosage for human application. Dosages in which such compositions are included may have little or no toxicity, ED50It is desirable that the concentration be in the blood concentration range containing The dosage varies within this range depending upon the dosage form employed, the sensitivity of the patient, and the route of administration.
[0209]
The exact dosage will be determined by the practitioner, in light of factors related to the patient requiring treatment. Dosage and administration are adjusted to provide effective levels of the active ingredient or to maintain the desired effect. Factors to consider include dose severity, general health of the patient, age, weight, and gender of the patient, time and frequency of administration, concomitant medications, response sensitivities, and Response is included. Long-acting pharmaceutical compositions can be administered once every three or four days, once a week, once every two weeks, depending on the half-life and clearance rate of the particular formulation.
[0210]
Normal dosage amounts will vary depending on the route of administration, but will range up to about 0.1-100,000 μg up to about 1 gram. Guidance on specific dosages and methods of delivery is provided in the literature and is generally available to practitioners in the art. One skilled in the art will utilize formulations of nucleotides that are different from the protein or inhibitor. Similarly, delivery of a polynucleotide or polypeptide will be specific to a particular cell, condition, location, etc.
[0211]
(Diagnosis)
In another embodiment, an assay for diagnosing a disease characterized by expression of CCYPR, or monitoring a patient being treated with CCYPR or an agonist or antagonist or inhibitor of CCYPR, wherein the antibody that specifically binds to CCYPR is used. Used for Antibodies useful for diagnosis are formulated in the same manner as described for therapy. CCYPR diagnostic assays include methods of using antibodies and labels to detect CCYPR from human body fluids or those collected from cells or tissues. These antibodies can be used with or without modification, and can be labeled by covalent or non-covalent attachment of a reporter molecule. Various reporter molecules known in the art may be used, some of which are described above.
[0212]
Various protocols for measuring CCYPR, including ELISA, RIA, and FACS, are well known in the art and provide a basis for diagnosing abnormal or abnormal levels of CCYPR expression. The value of normal or standard CCYPR expression is determined by combining an antibody against CCYPR with a body fluid or cells collected from a subject, such as a normal mammal, eg, a human, under conditions suitable for complex formation. I do. The amount of standard complex formation can be quantified by various methods such as photometric. The amount of CCYPR expression in the subject, control and disease, samples from biopsy tissue are compared to baseline values. The deviation between the reference value and the subject is a diagnostic indicator.
[0213]
According to another embodiment, a polynucleotide encoding CCYPR can be used for diagnosis. Polynucleotides used include oligonucleotide sequences, complementary RNA and DNA molecules, and PNA. The polynucleotide is used to detect and quantify the expression of the gene in biopsy tissues that express CCYPR, which can be correlated with disease. This diagnostic assay is used to check for the presence of CCYPR, as well as its overexpression, and to monitor the modulation of CCYPR levels during treatment.
[0214]
In certain embodiments, a nucleic acid sequence encoding CCYPR can be identified by hybridization with a PCR probe capable of detecting a polynucleotide sequence comprising the gene sequence encoding CCYPR or a closely related molecule. The specificity of a probe, whether it is made of a highly specific region, for example, a 5 'regulatory region, or a region of relatively low specificity, for example, a conserved motif, and the stringency of hybridization or amplification, Will identify only the natural sequence encoding CCYPR, or only the natural sequence encoding the allele or related sequence.
[0215]
Probes may also be used to detect related sequences and have at least 50% sequence identity with any sequence encoding CCYPR. The target hybridization probe of the present invention can be DNA or RNA, and can be derived from the sequence of SEQ ID NO: 55-108, or the genomic sequence containing the promoter, enhancer, and intron of the CCYPR gene.
[0216]
As a method of preparing a hybridization probe specific to DNA encoding CCYPR, there is a method of cloning a polynucleotide sequence encoding CCYPR and a CCYPR derivative into a vector for preparing an mRNA probe. Such vectors are commercially available and are well known to those skilled in the art, and by adding a suitable RNA polymerase and a suitable labeled nucleotide,in in vitroUsed to synthesize RNA probes. Hybridization probes are, for example,32P or35It can be labeled with a population of various reporters, such as radionuclides such as S, or enzymatic labels such as alkaline phosphatase linked to the probe by an avidin / biotin binding system.
[0217]
The polynucleotide sequence encoding CCYPR can be used to diagnose a disease associated with CCYPR expression. Examples of such diseases include, but are not limited to, immune disorders, including inflammation and actinic keratosis, acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and adrenal insufficiency, adult respiratory distress syndrome , Allergies, ankylosing spondylitis, amyloidosis, anemia, arteriosclerosis, asthma, atherosclerosis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thyroiditis, autoimmune polyglandular endocrine candidal ectoderm dystrophy ( APECED), bronchitis, bursitis, cholecystitis, cirrhosis, contact dermatitis, Crohn's disease, atopic dermatitis, dermatomyositis, diabetes, emphysema, lymphocotoxin temporary lymphopenia, erythroblasts Disease, erythema nodosum, atrophic gastritis, glomerulonephritis, Goodpasture's syndrome, gout, Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, hepatitis, hypereosinophilia, irritable bowel syndrome, Combined connective tissue disease (MCTD), multiple sclerosis, myasthenia gravis, myocardial or pericardial inflammation, myelofibrosis, osteoarthritis, osteoporosis, pancreatitis, polycythemia vera, polymyositis, psoriasis, lighter Syndrome, rheumatoid arthritis, scleroderma, Sjogren's syndrome, systemic anaphylaxis, systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis, primary thrombocythemia, thrombocytopenia, ulcerative colitis, Werner syndrome, cancer complications, Includes hemodialysis, extracorporeal circulation, viral infections, bacterial infections, fungal infections, parasitic infections, protozoal infections, helminthic infections, trauma, and hematopoietic cancers including lymphoma and leukemia, myeloma, It also includes developmental disorders, including tubular acidosis, anemia, Cushing's syndrome, achondroplasia dwarfism, Duchenne-Becker muscular dystrophy, epilepsy, gonad dysplasia, AGR syndrome (Wilms tumor, aniridia, genitourinary disorders, mental retardation), Smith-Magenis syndrome, myelodysplastic syndrome, hereditary mucosal epithelial dysplasia, hereditary keratoderma, Charcot-Marie -Hereditary neuropathies such as tooth disease and neurofibromatosis, hypothyroidism, hydrocephalus, seizure disorders such as Syndenham's chorea and cerebral palsy, spinal cord fission, anencephaly, cranial spine Includes arytenosis, congenital glaucoma, cataract, sensory nerve hearing loss, and impaired cell signaling, including primary brain tumors and adenomas, gestational infarction, pituitary resection, aneurysms, vascular malformations Hypothalamic and pituitary disorders resulting from lesions such as thrombosis, infection, Inappropriate antidiuretic hormone (ADH) secretion syndrome (SIADH) and disorders associated with hyperpituitary gland including acromegaly, giantosis, goiter and myxedema, bacterial infectious acute thyroiditis And hyperparathyroidism including Conn's disease (chronic hypercalemia); pancreatic diseases such as type I and type II diabetes and complications; and carcinomas of the hyperplasia and adrenal cortex. Adrenal-related disorders such as adenomas, alkalosis-related hypertension, and abnormal prolactin production in women, infertility including disorders of the fallopian tubes and ovulation and endometriosis, menstrual cycle perturbations, and polycystic ovarian disease Ovarian disease, ovarian hyperstimulation syndrome, endometrial or ovarian cancer, uterine fibroids, autoimmune disease, ectopic pregnancy, malformation, high Prolactinemia, selective gonadotropin definition, amenorrhea, milk leakage, semi-yin yang, hirsutism and virilization, breast cancer, fibrocystic breast disease, osteoporosis after menopause , Male Leydig cell hyperplasia, male menopause, germ cell aplasia, hypersexual function associated with Leydig cell tumors, androgen resistance, 5α-reductase syndrome associated with lack of androgen receptor, impaired spermatogenesis, physiology Endocrine disorders including gonadal steroid hormone-related diseases such as abnormal sperm physiology, testicular cancer, prostate cancer, benign prostatic hyperplasia, prostatitis, Peyronie's disease, impotence, male breast cancer, and female breast disease. Harm, including cell proliferation abnormalities, including actinic keratosis and atherosclerosis, bursitis, cirrhosis, hepatitis, mixed connective tissue disease (MCTD), myelofibrosis, Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, polycythemia vera, psoriasis, primary thrombocythemia, and adenocarcinoma and leukemia, lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, and teratocarcinoma, specifically, adrenal gland, bladder, bone , Bone marrow, brain, breast, neck, gallbladder, ganglion, digestive tract, heart, kidney, liver, lung, muscle, ovary, pancreas, parathyroid, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen, testis, thymus, thyroid, Includes uterine cancer. The polynucleotide sequence encoding CCYPR can be obtained by Southern, Northern, dot blot, or other membrane-based techniques, PCR, dipstick, pin, ELISA, and expression of mutant CCYPR. Can be used for microarrays utilizing body fluids or tissues collected from patients to detect Such qualitative or quantitative methods are well known in the art.
[0218]
In certain embodiments, the nucleotide sequence encoding CCYPR will be useful in assays that detect related diseases, particularly those described above. The nucleotide sequence encoding CCYPR could be labeled by standard methods and added to a body fluid or tissue sample taken from a patient under conditions suitable for the formation of hybridization complexes. After a suitable incubation period, the sample is washed and the signal is quantified and compared to a reference value. If the amount of signal in the patient sample is significantly altered compared to the control sample, the level of mutation in the nucleotide sequence encoding CCYPR in the sample will reveal the presence of the associated disease. Such assays can be used to estimate the efficacy of a particular treatment in animal studies, clinical trials, or monitoring the treatment of an individual patient.
[0219]
A summary of normal or standard expression is established to provide a basis for the diagnosis of diseases associated with CCYPR expression. This can be achieved by combining a sequence encoding CCYPR or a fragment thereof with a body fluid or cells extracted from a normal subject, either animal or human, under conditions suitable for hybridization or amplification. . Standard hybridization can be quantified by comparing values obtained from normal subjects to values from experiments in which known amounts of substantially purified polynucleotides are used. Standard values obtained from normal samples can be compared to values obtained from subjects exhibiting symptoms of the disease. The deviation between the reference value and the subject's value is used to determine whether the subject is affected.
[0220]
Once the presence of the disease has been determined and the treatment protocol has begun, the hybridization assay can be repeated on a regular basis to estimate if the level of expression in the subject has begun to approach the value shown in a normal patient. is there. The results of repeated assays can be used to see the effect of treatment over a period of days to months.
[0221]
In cancer, abnormal amounts of transcripts in living tissue from an individual are predisposed to the development of the disease and can provide a way to detect the disease before actual clinical symptoms occur. This type of more definitive diagnosis allows medical professionals to use preventative or aggressive treatment early to prevent the development or progression of cancer.
[0222]
Further diagnostic uses of oligonucleotides designed from sequences encoding CCYPR may include the use of PCR. Such oligomers can be chemically synthesized, enzymatically produced, orin in vitroCan be generated. The oligomer preferably includes a fragment of a polynucleotide encoding CCYPR or a fragment of a polynucleotide complementary to a polynucleotide encoding CCYPR, and is used to identify a specific gene or condition under optimal conditions. You. Oligomers can also be used for the detection and / or quantification of closely related DNA or RNA sequences under somewhat mild stringent conditions.
[0223]
In some embodiments, oligonucleotide primers derived from a polynucleotide sequence encoding CCYPR can be used to detect single nucleotide polymorphisms (SNPs). SNPs are nucleotide substitutions, insertions, and deletions that often cause congenital or acquired genetic disorders in humans. Non-limiting methods for detecting SNPs include single-stranded conformation polymorphism (SSCP) and fluorescent SSCP (fSSCP) methods. In SSCP, DNA is amplified by the polymerase chain reaction (PCR) using oligonucleotide primers derived from the polynucleotide sequence encoding CCYPR. This DNA can be derived, for example, from lesions or normal tissue, biopsy samples, body fluids, and the like. The SNPs in this DNA cause a difference in the secondary and tertiary structure of the single-stranded PCR product. This difference is detectable using gel electrophoresis in a non-denaturing gel. In fSCCP, by labeling oligonucleotide primers with fluorescence, it becomes possible to detect an amplimer with a high-throughput device such as a DNA sequencing device. Further, a sequence database analysis method called in silico SNP (isSNP) can identify polymorphisms by comparing the sequences of individual overlapping DNA fragments used to construct a common consensus sequence. . These computer-based methods eliminate sequence variability due to automated analysis of DNA sequence chromatograms and sequencing errors using statistical models and laboratory DNA preparation. Alternatively, SNPs are detected and characterized by mass spectrometry using, for example, a high-throughput MASSARRAY system (Sequenom, Inc., San Diego CA).
[0224]
Methods that can be used to quantify CCYPR expression include radiolabeling or biotin labeling of nucleotides, co-amplification of regulatory nucleic acids, and standard curves with results added (eg, Melby, PC, et al. (1993) J. Immunol. Methods, 159: 235-44; Duplaa, C., et al. (1993) Anal. Biochem. 229-236). The rate of quantification of large numbers of samples was accelerated by using high throughput assays in which the oligomers or polynucleotides of interest were included in various dilutions and quantification was rapid by spectrophotometry or non-color response.
[0225]
In yet another example, oligonucleotides or longer fragments from any of the polynucleotide sequences described herein can be used as targets in a microarray. Microarrays can be used in transcription imaging techniques to simultaneously monitor the relative expression levels of many genes. For this, see Seilhamer, J. et al. J. No. 5,840,484, issued to another, entitled "Comparative Gene Transcript Analysis", which is hereby incorporated by reference. Microarrays can also be used to identify genetic mutations, mutations and polymorphisms. This information is used to determine gene function, elucidate the genetic basis of the disease, diagnose the disease, monitor the progression / regression of the disease associated with gene expression, and develop and develop therapeutic agents in the treatment of the disease. Monitoring. In particular, this information can be used to create a pharmacological genomic profile for the patient in order to select the optimal and effective treatment for the patient. For example, based on a patient's pharmacogenomic profile, one can select a therapeutic that is extremely effective for the patient but has few side effects.
[0226]
In another example, an antibody specific for CCYPR, CCYPR or a fragment thereof, can be used as an element on a microarray. Microarrays can be used to monitor and measure protein-protein interactions, drug-target interactions and gene expression profiles as described above.
[0227]
Certain embodiments relate to the use of a polynucleotide of the invention to produce a transcribed image of a tissue or cell type. The transcribed image represents the global pattern of gene expression by a particular tissue or cell type. Global gene expression patterns are analyzed by quantifying the number and relative abundance of genes expressed at predetermined times under predetermined conditions (Seilliamer et al., US Patent No. 5,840,484, "Comparative Gene"). Transscript Analysis ", incorporated herein by reference to this patent). Thus, by hybridizing the polynucleotide of the present invention or its complementary sequence to the entire transcript or reverse transcript of a particular tissue or cell type, a transcribed image can be generated. In some embodiments, the polynucleotides of the invention or their complements are hybridized on a microarray in a high-throughput format that constitutes a subset of a plurality of elements. The resulting transcribed image can be a profile of gene activity.
[0228]
Transcript images may be generated using transcripts isolated from tissues, cell lines, biopsy samples, or other biological samples. Therefore, the transcribed image isin Vivo, Or in the case of cell linesin in vitroReflects gene expression in
[0229]
Transcript images showing the expression profile of the polynucleotides of the present invention can also be used for toxicity testing of synthetic or natural compounds,in in vitroIt can be used in connection with preclinical evaluation of model systems and drugs. All compounds cause characteristic gene expression patterns, often referred to as molecular fingerprints or toxic signatures, suggesting mechanisms of action and toxicity (Nuwaysir, EF et al. (1999) Mol. Carcinog). 24: 153-159, Steiner, S. and NL Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112-113: 467-471, also incorporated herein by reference.) . If the test compounds have the same signature as the signature of a known toxic compound, it is likely that they share toxic properties. The more useful a fingerprint or signature becomes, the more useful it is and the more accurate it contains expression information from genes and gene families. Ideally, expression should be measured across the genome to provide the highest quality signature. Genes that are not altered by any test compound are equally important. This is because the expression levels of these genes can be used to normalize the remaining expression data. Normalized treatment is useful for comparing expression data after treatment with different compounds. Assigning gene function to elements of a toxic signature helps to elucidate the mechanism of toxicity, but knowledge of gene function is not required for statistical matching of signatures leading to toxicity prediction (eg, February 29, 2000). See Press Release 00-02, published by the National Institute of Environmental Health Sciences, which is available at http://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htm. Therefore, it is important and desirable to include all expressed gene sequences in a toxicity screen using a toxicity signature.
[0230]
In certain embodiments, the toxicity of a test compound is assessed by treating a biological sample containing nucleic acids with the test compound. Nucleic acids expressed in the treated biological sample can be hybridized with one or more probes specific for a polynucleotide of the invention, thereby quantifying the level of transcription corresponding to the polynucleotide of the invention. The transcript level in the treated biological sample is compared to the level in an untreated biological sample. Differences in transcript levels between the two samples indicate a toxic reaction caused by the test compound in the treated sample.
[0231]
Another example involves analyzing a tissue or cell type proteome using a polypeptide sequence of the invention. The term "proteome" refers to the global pattern of protein expression in a particular tissue or cell type. Each protein that makes up the proteome can be further individually analyzed. Proteome expression patterns or profiles are analyzed by quantifying the number of proteins expressed at a given time under given conditions and their relative abundance. Thus, a proteomic profile of a cell can be generated by separating and analyzing polypeptides of a particular tissue or cell type. In some embodiments, such separation is performed by two-dimensional gel electrophoresis. In the two-dimensional gel electrophoresis, proteins are first separated from a sample by one-dimensional isoelectric focusing, and then separated according to molecular weight by two-dimensional sodium dodecyl sulfate slab gel electrophoresis (Steiner and above). Anderson). These proteins are usually visualized in the gel as dispersed discretely located spots by staining the gel with a stain such as Coomassie blue or silver or fluorescent stain. The optical density of each protein spot is usually proportional to the protein level in the sample. The optical density of equidistant protein spots obtained from different samples, eg, biological samples, either treated or untreated with a test compound or therapeutic agent, is compared to determine changes in protein spot density associated with treatment. The proteins in the spots are partially sequenced using standard methods of mass spectrometry, for example, after cleavage chemically or enzymatically. The identity of a protein within a spot can be determined by comparing its partial sequence, which is preferably at least 5 contiguous amino acid residues, to a polypeptide sequence of the invention. In some cases, additional sequences are obtained for definitive protein identification.
[0232]
Proteome profiles can also be generated by quantifying CCYPR expression levels using antibodies specific for CCYPR. In one embodiment, protein expression levels are quantified using antibodies as elements on the microarray and exposing the microarray to a sample to detect the level of protein binding to each array element (Lueking, A. et al. (1999). ) Anal. Biochern. 270: 103-111, Mendose, LG et al. (1999) Biotechniques 27: 778-788). Detection can be performed in a variety of ways known in the art, for example, reacting proteins in a sample with a thiol-reactive or amino-reactive fluorescent compound to detect the amount of fluorescent binding at each array element .
[0233]
Toxic signatures at the proteome level are also useful for toxicological screening and should be analyzed in parallel with toxic signatures at the transcript level. For certain proteins in certain tissues, the correlation between the abundance of the transcript and the abundance of the protein may be low (Anderson, NL and J. Seilhammer (1997) Electrophoresis 18: 533-537). The proteome toxic signature may be useful in the analysis of compounds that do not significantly affect the transcribed image but alter the proteome profile. In addition, analysis of transcription in body fluids is difficult due to the rapid degradation of mRNA. Thus, in such cases, proteome profiling is more reliable and informative.
[0234]
In another embodiment, the toxicity of the test compound is assessed by treating a biological sample containing the protein with the test compound. The proteins expressed in the treated biological sample are separated so that the amount of each protein can be quantified. The amount of each protein is compared to the amount of the corresponding protein in an untreated biological sample. A difference in the amount of protein in both samples is indicative of a toxic response to the test compound in the treated sample. Individual proteins are identified by sequencing their amino acid residues and comparing these subsequences to the polypeptides of the invention.
[0235]
In another embodiment, the toxicity of the test compound is assessed by treating a biological sample containing the protein with the test compound. A protein obtained from a biological sample is incubated with an antibody specific for a polypeptide of the invention. The amount of protein recognized by the antibody is quantified. The amount of protein in the treated biological sample is compared to the amount of protein in the untreated biological sample. A difference in the amount of protein between the two samples indicates a toxic response to the test compound in the treated sample.
[0236]
Microarrays are prepared, used and analyzed by methods well known in the art. (See, for example, Brennan, TM et al. (1995) U.S. Patent No. 5,474,796; Schena, M. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619; Baldeschweiler et al. (1995)). PCT Application No. WO95 / 251116; Shalon, D. et al. (1995) PCT Application No. WO95 / 35505; Heller, RA et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 2150-2155; and Heller, M. J. et al. (1997) U.S. Patent No. 5,605,662). Various types of microarrays are well known, and for more informationDNA Microarrays: A Practical Approach, M .; Schena, ed. (1999) Oxford University Press, London. This document is incorporated herein by reference.
[0237]
In another embodiment of the present invention, nucleic acid sequences encoding CCYPR can also be used to generate hybridization probes useful for mapping native genomic sequences. Although either coding or non-coding sequences can be used, in certain instances, non-coding sequences are preferred over coding sequences. For example, conserved coding sequences between members of a multigene family can result in unwanted cross-hybridization during chromosome mapping. This sequence may be a specific chromosome, a specific region of a chromosome or an artificial chromosome, such as a human artificial chromosome (HAC), a yeast artificial chromosome (YAC), a bacterial artificial chromosome (BAC), a bacterial P1 product, or a single chromosome cDNA library. (Harrington, JJ, et al. (1997) Nat Genet. 15: 345-355, Price, CM (1993) Blood Rev. 7: 127-134, Trask, BJ. (1991) Trends Genet. 7: 149-154 and the like). Once mapped, a nucleic acid sequence of the present invention can be used to create a genetic linkage map that correlates, for example, the inheritance of a disease state with the inheritance of a particular chromosomal region or restriction fragment length polymorphism (RFLP) (Lander , ES and D. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7353-7357).
[0238]
in sitFluorescence hybridization (FISH) can be correlated with other physical and genetic map data (see, eg, Heinz-Ulrich, et al. (1995) in Meyers, supra, pp. 965-968). Examples of genetic map data can be found in various scientific journals or on the World Wide Web site of Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Since the correlation between the location of the gene encoding CCYPR on the physical chromosomal map and a particular disease, or a predisposition to a particular disease, can help determine the DNA region associated with such a disease, additional locations may be needed. Determining cloning is performed.
[0239]
Chromosome specimenin sitThe genetic map can also be extended using physical mapping techniques such as hybridization and binding analysis using defined chromosomal markers. Placing a gene on the chromosome of another mammal, such as a mouse, often reveals related markers, even if the exact location of the human chromosome is not known. This information is valuable to researchers working on genetic diseases using positional cloning or other gene discovery techniques. Once the location of one or more genes involved in the disease or syndrome has been roughly determined by gene binding to a particular gene region, such as 11q22-23 in telangiectasia, any sequence mapping for that region (See, eg, Gatti, RA et al. (1988) Nature 336: 577-580) for further investigation. The target nucleotide sequence of the present invention may be used to detect a difference in chromosomal position between a normal person and a carrier, that is, an infected person due to translocation or inversion.
[0240]
In another embodiment of the invention, CCYPR, its catalytic or immunogenic fragments or oligopeptides thereof, can be used to screen libraries of compounds in any of a variety of drug screening techniques. The fragments used for such screening are free in solution, fixed to a solid support, retained on the surface of a cell, or exist in a cell. Complex formation due to binding of CCYPR to the agent to be tested may be measured.
[0241]
Another method used for drug screening is used to increase the screening capacity of compounds having suitable binding affinity for the protein of interest (eg, Geysen, et al. (1984) PCT Application No. WO84 / 03564). See). In this method, a significant number of different small test compounds are synthesized on plastic pins or other substrates. The test compound is washed after reacting with CCYPR or a fragment thereof. Next, the bound CCYPR is detected by methods well known in the art. Purified CCYPR can also be coated directly on plates used in the drug screening techniques described above. Alternatively, non-neutralizing antibodies can be used to capture the peptide and immobilize it on a solid support.
[0242]
In another example, a competitive drug screening assay can be used in which neutralizing antibodies capable of binding CCYPR specifically compete with the test compound for binding to CCYPR. In this method, the antibody detects the presence of any peptide that shares one or more antigenic determinants with CCYPR.
[0243]
In another embodiment, using the nucleotide sequence encoding CCYPR in developing molecular biology techniques, characteristics of the nucleotide sequence such as, but not limited to, the currently known triplet code and specific base pairing interactions Can provide new technologies that depend on
[0244]
Those skilled in the art will be able to utilize the present invention to its fullest extent without the need for further explanation. Therefore, the specific preferred embodiments described below are for illustration purposes and do not limit the invention.
[0245]
Part of this specification is made with reference to all patent applications, patents, and publications mentioned above and below, particularly US patent application Ser. Nos. 60 / 145,075, 60 / 153,129, 60 / 164,647. And
[0246]
(Example)
1 cDNA Creating a library
RNA was purchased from Clontech or isolated from the tissues listed in Table 4. First, a part of this tissue is homogenized and dissolved in a guanidinium isothiocyanate solution, while another part of the tissue is homogenized and dissolved in phenol, or TRIZOL (Life Technologies), guanidinium isothiocyanate. Dissolved in a mixture of suitable modifiers, such as a single phase solution of thiocyanate and phenol. The lysate was extracted by centrifugation on cesium chloride or with chloroform. RNA was precipitated from this lysate with either isopropanol or sodium acetate and ethanol, or otherwise.
[0247]
Extraction and precipitation of RNA with phenol were repeated as necessary to increase the purity of the RNA. Optionally, the RNA is treated with a DNase. For most libraries, poly (A +) RNA was isolated using oligo d (T) -linked paramagnetic particles (Promega) or OLIGOTEX latex particles (QIAGEN. Valencia CA) and the OLIGOTEX mRNA purification kit (QIAGEN). Alternatively, isolation was performed directly from tissue lysates using another RNA isolation kit such as the POLY (A) PURE mRNA purification kit (Ambion, Austin TX).
[0248]
In some cases, the RNA was provided to Stratagene and Stratagene generated a corresponding cDNA library. If not, cDNA was synthesized using the UNIZAP vector system (Stratagene) or the SUPERSCRIPT plasmid system (Life Technologies) by recommended or similar methods well known in the art to create a cDNA library. (See, e.g., Ausubel, 1997, supra, units 5.1-6.6). Reverse transcription was started with oligo d (T) or random primer. After binding the synthetic oligonucleotide adapter to the double-stranded cDNA, the cDNA was digested with one or more suitable restriction enzymes. For most libraries, the size of the cDNA (300-1000 bp) was selected by SEPHACRYL S1000 or SEPHAROSE CL2B, SEPHAROSE CL4B column chromatography (Amersham Pharmacia Biotech), or agarose gel electrophoresis. Suitable plasmids such as PBLUESCRIPT plasmid (Stratagene) or pSPORT1 plasmid (Life Technologies), pcDNA2.1 plasmid (Invitrogen Carlsbad CA), plNCY plasmid (Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto CA, a plasmid compatible with a linker suitable for a cDNA such as a plasmid compatible with a linker such as an enzyme compatible with a linker such as a plasmid suitable for the enzyme. Combined. This recombinant plasmid was introduced into competent E. coli cells containing XL1-Blue, XL1-BIueMRF, SOLR from Stratagene, or DH5α or DH 10B, ELECTROMAX DH 10B from Life Technologies.
[0249]
2 cDNA Clone isolation
Plasmids obtained as described in Example 1 above utilized the UNIZAP vector system (Stratagene) or cell lysis.in VivoRecovered from host cells by excision. Magic or WIZARD Minipreps DNA Purification System (Promega), AGTC Miniprep Purification Kit (Edge Biosystems, Gaithersburg MD), QIAGEN Plasmid, QIAPELPlasmid, QIAPELPlasmid, QIAPELPlasmid of QIAGEN The plasmid was purified using at least one of the following. After settling, they were resuspended in 0.1 ml of distilled water and stored at 4 ° C. with or without lyophilization.
[0250]
Alternatively, plasmid DNA was amplified from host cell lysates by a high-throughput direct binding PCR method. (Rao, VB (1994) Anal. Biochem. 216: 1-14). The lysis and thermal cycling process of the host cells was performed in a single reaction mixture. Samples are processed and then transferred to a 384-well plate for storage, and the concentration of amplified plasmid DNA is determined using a PICOGREEN dye (Molecular Probes, Eugene OR) and a Fluoroskan II fluorescence scanner (Labsystems Oy, Helsinki, Finland). Was measured.
[0251]
3 Sequencing and analysis
The method for sequencing Incyte cDNA recovered in the plasmid as described in Example 2 is as follows. The cDNA sequencing reaction can be performed by standard methods or by using ABI CATALYST 800 (PE Biosystems) thermal cycler or PTC-200 thermal cycler (MJ Research) and HYDRA micro dispenser (Robins Scientific Lotion). This was performed using a high-throughput apparatus such as a combination with the above. For preparation of the cDNA sequencing reaction, ABI sequencing using a reagent such as Amersham Pharmacia Biotech or a kit containing ABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit (PE Biosystems). For the electrophoretic separation of cDNA sequencing reactions and detection of labeled polynucleotides, the ABI PRISM 373 or 377 sequencing system using the MEGABACE 1000 DNA sequencing system (Molecular Dynamics), standard ABI protocols and base pairing software. (PE Biosystems), other sequence analysis systems known in the art. The reading frame for the cDNA sequence was determined using standard methods (Ausubel, 1997, supra, unit 7.7). Some of the cDNA sequences were selected and the sequences were extended by the method described in Example 6 above.
[0252]
Construction and analysis of polynucleotide sequences obtained from cDNA sequencing was performed in combination with software utilizing algorithms well known to those skilled in the art. Table 5 shows a summary of the tools, software, and algorithms used, their descriptions, references, and threshold parameters. Column 1 in Table 5 is the tools and programs and algorithms used, column 2 is a brief description of them, column 3 is a cited reference that is incorporated herein by reference, and column 4 is a two-part sequence. Shows the score, probability value, and other parameters used in the evaluation of the degree of coincidence (the higher the probability value, the higher the homology between the sequences). For analysis of the sequence, MACDNASIS PRO software (Hitachi Software Engineering, S. San Francisco CA) and LASERGENE software (DNASTAR) were used.
[0253]
Validation of polynucleotide sequences was performed by removing vectors and linkers, polyA sequences and masking ambiguous base pairs using programs and algorithms based on BLAST and dynamic programming, dinucleotide nearest neighbor analysis. . Then, using programs based on BLAST, FASTA, and BLIMPS, the public databases of primates and rodents, mammals, vertebrates, and eukaryotes of GenBank, and BLOCKS, PRINTS, DOMO, PRODOM, and PFAM. Annotations were obtained by querying these sequences against sequences selected from databases such as. These sequences were assembled into full-length polynucleotide sequences using programs based on Phred and Phrap, Consed and screened for open reading frames with programs based on BLAST and FASTA, BLIMPS. The full-length polynucleotide sequence is translated to derive the corresponding full-length amino acid sequence, and the GenBank database (described above) and databases such as SwissProt, BLOCKS, PRINTS, DOMO, PRODOM and Prosite, or hidden Markov models such as PFAM (HMM These full-length sequences were analyzed by querying a protein family database based on). The HMM utilizes probability to analyze the consensus primary structure of a gene family (see, eg, Eddy, SR (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6: 361-365).
[0254]
The programs described above for the construction and analysis of full-length polynucleotide and amino acid sequences can also be used to identify fragments of the polynucleotide sequence from SEQ ID NO: 55-108. Fragments of up to about 20-4000 nucleotides are useful for hybridization and amplification and have been described in the above invention.
[0255]
4. Analysis of polynucleotide expression
Northern analysis is an experimental technique used to detect the presence of a gene transcript, which involves the hybridization of a labeled nucleotide sequence to a membrane to which RNA from a particular cell type or tissue is bound. (See, eg, Sambrook, supra, chapter 7, and Ausubel FM et al., Supra, chapters 4 and 16).
[0256]
Similar computer techniques used for BLAST are used to search for identical or related molecules in a cDNA database such as GenBank or LIFESEQ (Incyte Pharmaceuticals). This analysis is much faster than many membrane-based hybridizations. In addition, the sensitivity of the computer search can be changed to determine whether any particular match is classified as an exact match or a homologous match. Search criteria are:
[0257]
(Equation 1)
Is the product score defined as The product score is a standardized value of 0 to 100, and is obtained as follows. Multiply the BLAST score by the percent identity of the nucleotide sequences and divide the product by 5 times the shorter length of the two sequences. A BLAST score is calculated by assigning a +5 score to each matching base in the high score segment pair (HSP) and -4 to each mismatched base pair. The two sequences may share more than one HSP (separated by a gap). If there is more than one HSP, calculate the product score using the base pair with the highest BLAST score. The product score represents a balance between fragmented overlap and quality of the BLAST alignment. For example, a product score of 100 is only obtained if there is a 100% match over the shorter length of the two compared sequences. The product score 70 is either the case where one end overlaps 70% at 100% match or the other end overlaps 100% at 88% match. The product score 50 is either the case where one end overlaps 50% at 100% match or the other end overlaps 100% at 79% match.
[0258]
The results of the Northern analysis are reported as the percentage distribution of the library in which transcripts encoding CCYPR occurred. The analysis also includes the classification of the cDNA library by organ / tissue and disease. Organ / tissue categories include cardiovascular, dermal, developmental, endocrine, gastrointestinal, hematopoietic / immune, musculoskeletal, nervous, reproductive, urinary. Disease categories include cancer, inflammation, trauma, cell proliferation, nerves, and pooled. For each category, the number of libraries expressing the sequence of interest was counted and divided by the number of libraries in the entire range. Table 3 shows the ratio (percent) specifically expressed in each tissue and the ratio expressed in each disease.
[0259]
5 CCYPR Chromosome Mapping of Polynucleotide Encoding
The cDNA sequence used to construct SEQ ID NOs: 55-108 was compared to the sequences in the Insight LIFESEQ database and the public domain database using the BLAST and Smith-Waterman algorithms. Sequences from these databases consistent with SEQ ID NOs: 55-108 were incorporated into clusters of contiguous and overlapping sequences using construction algorithms such as Phrap (Table 5). Radiation hybrid and gene mapping data are already clustered using radiation hybrid and gene mapping data available from public sources such as the Stanford Human Genonce Center (SHGC), the Whitehead Institute for Genome Research (WIGR) and Genethon. Find out if. If the cluster contained a sequence that was mapped, all sequences in that cluster (including the specific SEQ ID NO) were assigned to that mapping location.
[0260]
SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 81, SEQ ID The positions of the genetic maps of NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 104, and SEQ ID NO: 105 are described herein as sections or ranges of human chromosomes. CalligraphyinventionDescribed in the section. In SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 90, and SEQ ID NO: 100, two or more mapping positions are described, which are SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, suggesting that incompletely matched but already mapped sequences with similarity to SEQ ID NO: 90 and SEQ ID NO: 100 were incorporated into their respective clusters. The range of the mapping position indicated by centiMorgan was measured from the end of the short arm (p) of the chromosome. (Centimorgan (cM) is a unit indicating a distance based on the crossover rate between genes on the same chromosome. On average, 1 cM is approximately equal to one megabase of human chromosome, but can vary greatly due to high and low recombination rates). The distance cM is based on Genethon-mapped gene markers that can detect the boundaries of radiation hybrid markers whose sequences are contained in each cluster. Disease genes that have already been identified using publicly available information such as the human genome map and the NCBI "GeneMap '99" World Wide Web site (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/) It can be determined whether it exists in the above-mentioned section or in the adjacent part.
[0261]
6 CCYPR Of polynucleotides encoding
The full-length nucleic acid sequence of SEQ ID NOs: 55-108 was generated by extending a suitable fragment of the full-length molecule using an oligonucleotide primer designed from the suitable fragment of the full-length molecule. One primer was synthesized to initiate the 5 'extension of a known fragment and the other primer was synthesized to initiate the 3' extension of a known fragment. The starting primer is about 22 to about 30 nucleotides in length, has a GC content of about 50% or more, using OLIGO 4.06 software (National Biosciences) or other suitable program, and has a GC content of about 68%. It was designed to anneal to the target sequence at a temperature of 7272 ° C. Nucleotides were extended to avoid hairpin structures and primer-primer dimers.
[0262]
This sequence was extended using a selected human cDNA library. If more than one step extension is required or desired, additional or nested primer sets are designed.
[0263]
Amplification was performed with high fidelity by a PCR method using a method known in the art. PCR was performed in a 96-well block plate using a PTC-200 thermal cycler (MJ Research, Inc.). The reaction mixture was composed of template DNA and 200 nmol of each primer, Mg2 +And (NH4)2SO4And a buffer containing β-mercaptoethanol, Taq DNA polymerase (Amersham Pharmacia Biotech), ELONGASE enzyme (Life Technologies), and Pfu DNA polymerase (Stratagene). Amplification was performed on the primer set, PCI A and PCI B, with the following parameters.
Step 1 @ 94 ° C for 3 minutes
Step 2: 15 seconds at 94 ° C
Step 3-1 minute at 60 ° C
Step 4 @ 68 ° C for 2 minutes
Step 5—Repeat steps 2, 3, and 4 20 times
Step 6 @ 68 ° C for 5 minutes
Step 7 Store at 4 ℃
Alternatively, amplification was performed on the primer set, T7 and SK +, with the following parameters.
Step 1 @ 94 ° C for 3 minutes
Step 2: 15 seconds at 94 ° C
Step 3-1 minute at 57 ° C
Step 4 @ 68 ° C for 2 minutes
Step 5—Repeat steps 2, 3, and 4 20 times
Step 6 @ 68 ° C for 5 minutes
Step 7 Store at 4 ° C.
[0264]
The DNA concentration in each well was determined by adding 100 μl of PICOGREEN quantitative reagent (0.25% (v / v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR) dissolved in 1 × TE and 0.5 μl of undiluted PCR product to opaque fluorescence The solution is distributed to each well of a photometer plate (Coming Costar, Acton MA) so that the DNA can bind to the reagent and the measurement is performed. The plate is scanned with a Fluoroskan II (Labsystems Oy, Helsinki, Finland) and the fluorescence of the sample is measured to quantify the DNA concentration. An aliquot of 5-10 μl of the reaction mixture is analyzed by electrophoresis on a 1% agarose minigel to determine which reaction has successfully extended the sequence.
[0265]
The extended nucleotides are desalted and concentrated, transferred to a 384-well plate, digested with CviJI choleravirus endonuclease (Molecular Biology Research, Madison WI), and religated to a pUC 18 vector (Amersham Pharmacia Biotech) prior to sonication. Or shear was performed. For shotgun sequencing, the digested nucleotides were separated on a low concentration (0.6-0.8%) agarose gel to cut the fragments and the agar was digested with Agar ACE (Promega). A clone extended using T4 ligase (New England Biolabs, Beverly MA) was religated to a pUC18 vector (Amersham Pharmacia Biotech), and Pfu DNA polymerase (Stratagene) was used to extend the restriction site in E. coli cells by treating with Pfu DNA polymerase (Stratagene). Was transfected. The transfected cells were selected and transferred to a medium containing an antibiotic, and each colony was cut out and cultured in a 384-well plate of LB / 2X carbenicillin culture at 37 ° C. overnight.
[0266]
The cells were lysed, and the DNA was PCR-amplified using Taq DNA polymerase (Amersham Pharmacia Biotech) and Pfu DNA polymerase (Stratagene) according to the following procedure.
Step 1 @ 94 ° C for 3 minutes
Step 2: 15 seconds at 94 ° C
Step 3-1 minute at 60 ° C
Step 4-2 minutes at 72 ° C
Step 5—Repeat steps 2, 3, and 4 29 times
Step 6-5 minutes at 72 ° C
Step 7 Store at 4 ° C.
DNA was quantified with the PICOGREEN reagent (Molecular Probes) as described above. Samples with poor DNA recovery were amplified again under the conditions described above. The sample was diluted with 20% dimethylsulfoxide (1: 2, v / v), and the DYENAMIC DIRECT kit (Amersham Pharmacia Biotech) or the ABI PRISM BIGDYE seq. Thing.
[0267]
Similarly, using the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 55-108, the above procedure was used to obtain 5 'regulatory sequences using oligonucleotides designed for this extension and a suitable genomic library.
[0268]
7 Labeling and use of individual hybridization probes
A cDNA, mRNA, or genomic DNA is screened using a hybridization probe derived from SEQ ID NO: 55-108. Particular mention is made of the labeling of oligonucleotides of about 20 base pairs, but essentially the same procedure is used for larger cDNA fragments. Oligonucleotides were designed using state-of-the-art software such as OLIGO 4.06 software (National Bioscience), and 50 pmol of each oligomer and 250 μCi of [γ-32P] Adenosine triphosphate (Amersham, Chicago, IL) and T4 polynucleotide kinase (DuPont NEN, Boston MA) are used in combination for labeling. The labeled oligonucleotide is substantially purified using a SEPHADEX G-25 ultra-fine exclusion dextran bead column (Amersham Pharmacia Biotech). 10 per minute7An aliquot containing the labeled probe in counts is typically human genomic DNA cut with one of the following endonucleases: Ase I, Bgl II, Eco RI, Pst I, Xbal or Pvu II (DuPont NEN). Used in membrane-based hybridization analysis.
[0269]
DNA from each cut is fractionated on a 0.7% agarose gel and transferred to a nylon membrane (Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH). Hybridization is performed at 40 ° C. for 16 hours. To remove non-specific signals, blots are sequentially washed at room temperature, for example, under conditions of up to 0.1 × sodium salt citrate and 0.5% sodium dodecyl sulfate. Hybridization patterns are visualized and compared by autoradiography or other imaging means.
[0270]
8 Microarray
The concatenation or synthesis of array elements on a microarray can be achieved using photolithography, piezo printing (see inkjet printers, see Baldschweiler, supra), mechanical microspotting techniques and derivatives thereof. . In each of the above techniques, the substrate should be a uniform, non-porous solid (Schena (1999), supra). Recommended substrates include silicon, silica, glass slides, glass chips and silicon wafers. Alternatively, arrays similar to dot or slot blots can be used to place and attach elements to the surface of the substrate by thermal, ultraviolet, or chemical or mechanical binding means. Regular arrays can be made using available methods and machines and can include any suitable number of elements (Schena, M. et al. (1995) Science 270: 467-470; Shalon. D. et al. ( 1996) Genome Res. 6: 639-645, Marshall, A. and J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16: 27-31.).
[0271]
Full-length cDNA, expressed gene sequence fragments (ESTs), or fragments or oligomers thereof, can be elements of a microarray. Fragments or oligomers suitable for hybridization can be selected using software well known in the art such as LASERGENE software (DNASTAR). The array element is hybridized with a polynucleotide in a biological sample. Polynucleotides in a biological sample are conjugated to a fluorescent label or other molecular tag to facilitate detection. After hybridization, unhybridized nucleotides are removed from the biological sample and hybridization at each array element is detected using a fluorescence scanner. Alternatively, hybridization can be detected using laser desorption and mass spectrometry. The degree of complementarity and relative abundance of each polynucleotide that hybridizes to an element on the microarray can be calculated. The preparation and use of the microarray in one embodiment is described in detail below.
[0272]
Prepare tissue or cell samples
Total RNA was isolated from tissue samples using the guanidinium thiocyanate method and poly (A) was isolated using the oligo (dT) cellulose method.+Purify the RNA. Each poly (A)+RNA samples were MMLV reverse transcriptase, 0.05 pg / μl oligo (dT) primer (21 mer), 1 × first strand buffer, 0.03 units / μl RNase inhibitor, 500 μM dATP, 500 μM dGTP, Reverse transcription is performed using 500 μM dTTP, 40 μM dCTP, 40 μM dCTP-Cy3 (BDS) or dCTP-Cy5 (Amersham Pharmacia Biotech). This reverse transcription reaction was performed using a GEMBRIGHT kit (Incyte) using 200 ng of poly (A).+Perform in a 25 ml volume containing RNA. Specific control poly (A)+RNA isin in vitroIt is synthesized from non-coding yeast genomic DNA by transcription. After incubation at 370 ° C. for 2 hours, each reaction sample (one Cy3 label and the other Cy5 label) was treated with 2.5 ml of 0.5 M sodium hydroxide and incubated at 850 ° C. for 20 minutes to stop the reaction. To denature the RNA. Samples are purified using two consecutive CHROMA SPIN 30 gel filtration spin columns (CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA). After binding, the two reaction samples are ethanol precipitated using 1 ml glycogen (1 mg / ml), 60 ml sodium acetate and 300 ml 100% ethanol. The sample is then dried and finished using a SpeedVAC (Savant Instruments Inc., Holbrook NY) and resuspended in 14 μl 5 × SSC / 0.2% SDS.
[0273]
Preparation of microarray
Array elements are made using the sequences of the present invention. Each array element is amplified from bacterial cells containing the vector containing the cloned cDNA insert. PCR amplification uses primers complementary to the vector sequence adjacent to the cDNA insert. The array elements are amplified from an initial amount of 1-2 ng to a final amount greater than 5 μg by 30 cycles of PCR. The amplified array elements are purified using SEPHACRYL-400 (Amersham Pharmacia Biotech).
[0274]
The purified array element is immobilized on a polymer-coated glass slide. Microscope glass slides (Corning) are washed during and after treatment with large amounts of distilled water and ultrasonically in 0.1% SDS and acetone. Slides are etched in 4% hydrofluoric acid (VWR Scientific Products Corporation (VWR), West Chester PA), washed extensively in distilled water, and 0.05% aminopropylsilane in 95% ethanol (Sigma). ). The coated slide glass is cured by heating at 110 ° C.
[0275]
Array elements are added to a coated glass substrate using the method described in US Pat. No. 5,807,522. The specification is incorporated herein by reference. 1 μl of array element DNA having an average concentration of 100 ng / μl is filled into an open capillary printing element by a high-speed mechanical device. The device then dispense approximately 5 nl of array element samples per slide.
[0276]
The microarray is UV cross-linked using the STRATALLINKER UV crosslinker (Stratagene). The microarray is washed once with 0.2% SDS at room temperature and three times with distilled water. Non-specific binding sites were determined by incubating the microarray in 0.2% casein in phosphate buffered saline (PBS) (Tropix, Inc., Bedford MA) at 60 ° C. for 30 minutes, followed by 0 minutes as described above. Block by washing with 2% SDS and distilled water.
[0277]
Hybridization
The hybridization reaction solution contained 9 μl of a sample mixture containing 0.2 μg each of Cy3 and Cy5 labeled cDNA synthesis products in a 5 × SSC, 0.2% SDS hybridization buffer. The sample mixture was heated at 65 ° C. for 5 minutes, dispensed aliquots on the microarray surface and then 1.8 cm2 Cover with cover glass. The array is transferred to a waterproof chamber with a cavity slightly larger than the microscope slide. 140 μl of 5 × SSC is added to the corner of the chamber to keep the inside of the chamber at 100% humidity. The chamber containing the array is incubated at 60 ° C. for about 6.5 hours. Arrays were washed three times in a first wash buffer (1 × SSC, 0.1% SDS) for 10 minutes at 45 ° C. and in a second wash buffer (0.1 × SSC) for 10 minutes at 45 ° C. And then dried.
[0278]
detection
The reporter-labeled hybridization complex is an Innova 70 mixed gas 10 W laser (Coherent, Inc., Santa Clara CA) capable of producing 488 nm spectral lines for exciting Cy3 and 632 nm for exciting Cy3. Detect with a microscope equipped with. Focus the excitation laser light on the array using a 20 × microscope objective lens (Nikon, Inc., Melville NY). The slide containing the array is placed on a computer controlled XY stage of a microscope and raster scanned through an objective. The 1.8 cm × 1.8 cm array used in this example is scanned at a resolution of 20 μm.
[0279]
In two different scans, the mixed gas multi-line laser excites the two phosphors sequentially. The emitted light is split into two photomultiplier tube detectors (PMT R1277, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ) corresponding to the two phosphors based on wavelength. The signal is filtered using a suitable filter located between the array and the photomultiplier. The maximum emission of the phosphor used is 565 nm for Cy3 and 650 nm for Cy5. The instrument can record spectra from both fluorophores simultaneously, but scans once per fluorophore and filters each array typically twice, using filters suitable for the laser source.
[0280]
The sensitivity of the scan is usually calibrated using the signal intensity generated by the cDNA control species added to the known concentration of the sample mixture. Specific locations on the array include complementary DNA sequences so that the intensity of the signal at that location correlates to a 1: 100,000 weight ratio of hybridizing species. When two samples from different samples (eg, representative of test and control cells) are each labeled with a different fluorophore and hybridized to a single array to identify genes that are differentially expressed The calibration is performed by labeling a cDNA sample to be calibrated having two fluorophores, and adding an equal amount to each of the hybridization mixtures.
[0281]
The output of the photomultiplier is digitized using a 12-bit RTI-835H analog-to-digital (AID) conversion board (Analog Devices, Inc., Norwood MA) installed on an IBM compatible PC computer. The digitized data is displayed as an image in which the signal intensity is mapped to a pseudo-color range from blue (low signal) to red (high signal) using a linear 20-color conversion. The data is also analyzed quantitatively. If two different phosphors are excited and measured simultaneously, the data is first corrected for optical crosstalk between the phosphors (due to overlapping emission spectra) using the emission spectra of each phosphor. .
[0282]
The grid is superimposed on the fluorescent signal image so that the signal from each spot is centered on each element of the grid. The fluorescent signal within each element is integrated to give a numerical value corresponding to the average intensity of the signal. The software used for signal analysis is a GEMTOOOLS gene expression analysis program (Incyte).
[0283]
9 Complementary polynucleotides
A sequence that is complementary to the sequence encoding CCYPR or any portion thereof is used to reduce or inhibit the expression of native CCYPR. Although the use of oligonucleotides containing from about 15 to about 30 base pairs is noted, essentially the same method can be used for fragments of smaller or larger sequences. The appropriate oligonucleotides are designed using the Oligo 4.06 software (National Biosciences) and the coding sequence of CCYPR. To inhibit transcription, a complementary oligonucleotide is designed from the most unique 5 'sequence and used to prevent the promoter from binding to the coding sequence. To inhibit translation, complementary oligonucleotides are designed to prevent the ribosome from binding to transcripts encoding CCYPR.
[0284]
10 CCYPR Expression of
Expression and purification of CCYPR can be performed using a bacterial or viral based expression system. For expression of CCYPR in bacteria, the cDNA is subcloned into a suitable vector containing an inducible promoter that enhances antibiotic resistance and the level of cDNA transcription. Such promoters include, but are not limited to, the T5 or T7 bacteriophage promoter and the trp-lac (tac) hybrid promoter associated with the lac operator regulatory element. The recombinant vector is transformed into a suitable bacterial host, such as BL21 (DE3). Bacteria with antibiotic resistance express CCYPR when induced with isopropyl β-D thiogalactopyranoside (IPTG). Expression of CCYPR in eukaryotic cells is commonly known as baculovirus in insect or mammalian cell linesAutographica californicaIt is performed by infecting with a nuclear pleiotropic virus (AcMNPV). The non-essential polyhedrin gene of the baculovirus is replaced with cDNA encoding CCYPR by either homologous recombination or bacterial-mediated gene transfer with transfer plasmid-mediated. The infectivity of the virus is maintained and the strong polyhedrin promoter drives high levels of cDNA transcription. Recombinant baculoviruses are oftenSpodoptera frugiperda (Sf9) Used for infection of insect cells, but may also be used for infection of human hepatocytes. In the latter case, further genetic modification of the baculovirus is required. (See, for example, Engelhard. EK. Et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-2327; Sandig, V. et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7: 1937-1945.) .
[0285]
In most expression systems, CCYPR is a fusion protein synthesized with, for example, glutathione S-transferase (GST) or a peptide epitope tag such as FLAG or 6-His. Can be performed quickly and in one go.Schistosoma japonicumThe 26-kilodalton enzyme, GST, allows purification of fusion proteins with immobilized glutathione while maintaining protein activity and antigenicity (Amersham Pharmacia Biotech). After purification, the GST moiety can be proteolytically cleaved from the CCYPR at the specific engineered site. FLAG, an eight amino acid peptide, allows for immunoaffinity purification using commercially available monoclonal and polyclonal anti-FLAG antibodies (Eastman Kodak). 6-His, a stretch of six consecutive histidine residues, allows purification on metal chelating resins (QIAGEN). Methods for protein expression and purification are described in Ausubel (1995, supra, ch 10, 16). The assays of Examples 11 and 15 below can be performed directly using CCYPR purified by these methods.
[0286]
11 CCYPR Demonstration of activity
For CCYPR activity, cell proliferation is measured as newly initiated DNA synthesis in Swiss mouse 3T3 cells. Plasmids containing the polynucleotide encoding CCYPR are transfected into quiescent 3T3 cells using methods well known in the art. The transiently transfected cells are then used as radioactive DNA precursors [3[H] Incubate in the presence of thymidine. Appropriately varying amounts of CCYPR ligand are added to the transfected cells. It was incorporated into the acid-insoluble DNA at appropriate time intervals [3H] Thymidine is measured. This captured [3The amount of [H] thymidine is proportional to the activity of the newly synthesized DNA and thus of CCYPR.
[0287]
12 Functional Assay
CCYPR function is assessed by expression of sequences encoding CCYPR at physiologically elevated levels in mammalian cell culture systems. The cDNA is subcloned into a mammalian expression vector containing a strong promoter that expresses the cDNA at high levels. Such vectors include pCMV SPORTTM (Life Technologies.) And pCR 3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), both containing the cytomegalovirus promoter. 5-10 μg of the recombinant vector is transiently transfected into human cell lines, eg, endothelial or hematopoietic, by liposome preparation or electroporation. In addition, 1-2 μg of plasmid containing the sequence encoding the labeled protein is co-transfected. Expression of the labeled protein allows one to distinguish between transfected and non-transfected cells. In addition, the expression of the cDNA from the recombinant vector can be accurately predicted by the expression of the labeled protein. Such labeled proteins include green fluorescent protein (GFP; Clontech), and CD64 or CD64-GFP fusion protein. Identify transfected cells that express GFP or CD64-GFP using automated flow cytometry (FCM) using laser optics-based technology and evaluate the apoptotic state and other cellular properties of the cells I do. In addition, the FCM detects and measures the incorporation of a fluorescent molecule that diagnoses the phenomenon of preceding or simultaneous cell death. These phenomena include changes in nuclear DNA content as measured by staining of DNA with propidium iodide, down-regulation of DNA synthesis as measured by reduced uptake of bromodeoxyuridine, and specific antibodies. And changes in plasma membrane composition as measured by binding of the fluorescent complex annexin V protein to the cell surface, as measured by the reactivity of E. coli. Flow cytometry is described in Ormerod, M .; G. FIG. By (1994)Flow Cytometry Oxford, New York, NY. It is described in.
[0288]
The effect of CCYPR on gene expression can be assessed using a highly purified cell population transfected with sequences encoding CCYPR and either CD64 or CD64-GFP. CD64 or CD64-GFP is expressed on the surface of transformed cells and binds to a conserved region of human immunoglobulin G (IgG). Transformed and non-transformed cells can be separated using magnetic beads coated with either human IgG or an antibody against CD64 (DYNAL. Lake Success. NY). mRNA can be purified from cells by methods well known in the art. Expression of mRNA encoding CCYPR and other genes of interest can be analyzed by Northern analysis or microarray technology.
[0289]
Thirteen CCYPR Of antibodies specific for
Using CCYPR substantially purified by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE; see, eg, Harrington, MG (1990) Methods Enzymol. 1816-3088-495) or other purification techniques, Immunize rabbits with a simple protocol to produce antibodies.
[0290]
Alternatively, the CCYPR amino acid sequence is analyzed using LASERGENE software (DNASTAR) to determine the region of high immunogenicity, and the corresponding oligopeptide is synthesized and used to generate antibodies using methods well known to those skilled in the art. Produce. The selection of suitable epitopes, such as those near the C-terminus or in adjacent hydrophilic regions, is well known in the art (see, eg, Ausubel, 1995, supra, Chapter 11).
[0291]
Usually, an oligopeptide having a length of about 15 residues is synthesized by an Fmoc method chemistry using an Applied Biosystems ABI 431A peptide synthesizer (PE Biosystems) to give N-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS). The reaction used binds KLH (Sigma-Aldrich, St. Louis MO) to enhance immunogenicity (see, eg, Ausubel, 1995, supra). Rabbits are immunized with the oligopeptide-KLH complex in Freund's complete adjuvant. To test the anti-peptide activity and anti-CCYPR activity of the obtained antiserum, peptide or CCYPR was bound to a substrate, blocked with 1% BSA, washed with rabbit antiserum, washed, React with iodine-labeled goat anti-rabbit IgG.
[0292]
14 Natural using specific antibodies CCYPR Purification
Native or recombinant CCYPR is substantially purified by immunoaffinity chromatography using an antibody specific for CCYPR. An immunoaffinity column is formed by covalently binding an anti-CCYPR antibody to a resin for activation chromatography such as CNBr-activated SEPHAROSE (Amersham Pharmacia Biotech). After binding, the resin is blocked and washed according to the manufacturer's instructions.
[0293]
The culture solution containing CCYPR is passed through an immunoaffinity column, and the column is washed under conditions that allow preferential adsorption of CCYPR (for example, with a buffer having high ionic strength in the presence of a surfactant). The column is eluted under conditions that disrupt the binding of the antibody to CCYPR (eg, with a buffer of pH 2-3 or a high concentration of chaotropic ions such as urea or thiocyanate ions) to recover CCYPR.
[0294]
Fifteen CCYPR Of molecules that interact with
CCYPR or a biologically active fragment thereof,125Label with I Bolton Hunter reagent (see, for example, Bolton AE and WM Hunter (1973) Biochem. J. 133: 529). Candidate molecules pre-arranged in a multiwell plate are incubated with labeled CCYPR, washed, and all wells with labeled CCYPR complexes are assayed. Using the data obtained at the various CCYPR concentrations, values are calculated for the quantity and affinity of CCYPR bound to the candidate molecule, as well as for association.
[0295]
Alternatively, molecules that interact with CCYPR are identified in Fields, S .; And O. The analysis is performed using a commercially available kit based on a two-hybrid system such as the yeast two-hybrid system described in Song (1989, Nature 340: 245-246) or the MATCHMAKER system (Clontech).
[0296]
CCYPR is also used in the PATHHCALLING process (CuraGen Corp., New Haven CT) using a high-throughput yeast two-hybrid system to determine all interactions between proteins encoded by two large libraries of genes. (Nandabalan, K. et al. (2000) U.S. Patent No. 6,057,101).
[0297]
Those skilled in the art will be able to make various modifications of the described method and system without departing from the scope and spirit of the invention. Although the invention has been described with reference to certain preferred embodiments, it is to be understood that the scope of the invention should not be unduly limited to such specific embodiments. Indeed, various modifications of the described modes for carrying out the invention which are obvious to those skilled in molecular biology or related fields are within the scope of the following claims.
[0298]
(Brief description of the table)
Table 1 shows the sequence numbers (SEQ ID NO), clone identification numbers, cDNA libraries, and cDNA fragments of the polypeptide and nucleotide sequences used to generate the full length sequence encoding CCYPR.
[0299]
Table 2 shows the characteristics of each polypeptide sequence including latent motifs and homologous sequences, as well as the methods, algorithms, and searchable databases used for CCYPR analysis.
[0300]
Table 3 shows the selected fragments of each nucleic acid sequence, the tissue-specific expression patterns of each nucleic acid sequence determined by Northern analysis, the diseases, disorders and conditions associated with these tissues, and the respective DNA clones. Vector.
[0301]
Table 4 shows tissues used for preparing a cDNA library from which a cDNA clone encoding CCYPR was isolated.
[0302]
Table 5 shows the tools, programs, and algorithms used to analyze the polynucleotides and polypeptides of the present invention, along with descriptions, references, and threshold parameters.
[0303]
[Table 1]
[0304]
[Table 2]
[0305]
[Table 3]
[0306]
[Table 4]
[0307]
[Table 5]
[0308]
[Table 6]
[0309]
[Table 7]
[0310]
[Table 8]
[0311]
[Table 9]
[0312]
[Table 10]
[0313]
[Table 11]
[0314]
[Table 12]
[0315]
[Table 13]
[0316]
[Table 14]
[0317]
[Table 15]
[0318]
[Table 16]
[0319]
[Table 17]
[0320]
[Table 18]
[0321]
[Table 19]
[0322]
[Table 20]
[0323]
[Table 21]
[0324]
[Table 22]
[0325]
[Table 23]
[0326]
[Table 24]
[0327]
[Table 25]
[0328]
[Table 26]
[0329]
[Table 27]
[0330]
[Table 28]
[0331]
[Table 29]
[0332]
[Table 30]
[0333]
[Table 31]
[0334]
[Table 32]
[0335]
[Table 33]
[0336]
[Table 34]
[0337]
[Table 35]
[0338]
Claims (28)
(a)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、およびSEQ ID NO:54からなる一群から選択されたアミノ酸配列と、
(b)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、およびSEQ ID NO:54からなる一群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列と、
(c)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、およびSEQ ID NO:54からなる一群から選択されたアミノ酸配列の生物学的に活性な断片と、
d)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、およびSEQ ID NO:54からなる一群から選択されたアミノ酸配列の免疫原性断片とで構成される一群から選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする単離されたポリペプチド。An isolated polypeptide,
(A) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 , SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 , SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, and SEQ ID An amino acid sequence selected from the group consisting of NO: 54;
(B) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 , SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 , SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, and SEQ ID NO: a natural amino acid sequence having at least 90% sequence identity to an amino acid sequence selected from the group consisting of: 54;
(C) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 , SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 , SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, and SEQ ID A biologically active fragment of the amino acid sequence selected from the group consisting of NO: 54;
d) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, and SEQ ID NO And an immunogenic fragment of an amino acid sequence selected from the group consisting of: 54. An isolated polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:
(a)前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項1のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に結合されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養するステップと、
(b)そのように発現したポリペプチドを回収するステップとを含むことを特徴とする請求項1のポリペプチドの生産方法。A method for producing the polypeptide of claim 1,
(A) culturing cells transformed with a recombinant polynucleotide comprising a promoter sequence operably linked to a polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1 under conditions suitable for expression of said polypeptide. Steps and
(B) recovering the polypeptide thus expressed.
(a)SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、およびSEQ ID NO:108からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と、
(b)SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、およびSEQ ID NO:108からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と少なくとも70%の配列同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列と、
(c)前記(a)に相補的なポリヌクレオチド配列と、
(d)前記(b)に相補的なポリヌクレオチド配列と、
(e)前記(a)乃至(d)のRNA等価物とで構成される一群から選択されたポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド。An isolated polynucleotide, comprising:
(A) SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 64 , SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO : 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ D NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO : 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107 And a polynucleotide sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 108;
(B) SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 64 , SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO : 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ D NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO : 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107 And a natural polynucleotide sequence having at least 70% sequence identity to a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 108;
(C) a polynucleotide sequence complementary to (a),
(D) a polynucleotide sequence complementary to (b);
(E) an isolated polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of the RNA equivalents of (a) to (d).
(a)前記サンプル内の前記標的ポリヌクレオチドと相補的な配列からなる少なくとも20個の連続するヌクレオチドを含むプローブで前記サンプルをハイブリダイズするステップであって、前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片とのハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、前記プローブが前記標的ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする、該ステップと、
(b)前記ハイブリダイゼーション複合体が存在するか否かを検出し、存在する場合には随意選択でその収量を測定するステップとを含むことを特徴とする標的ポリヌクレオチドの検出方法。A method for detecting a target polynucleotide having a polynucleotide sequence according to claim 11 in a sample,
(A) hybridizing the sample with a probe comprising at least 20 consecutive nucleotides consisting of a sequence complementary to the target polynucleotide in the sample, wherein the probe and the target polynucleotide or a fragment thereof The probe specifically hybridizes to the target polynucleotide under conditions under which a hybridization complex is formed with the step,
(B) detecting whether the hybridization complex is present and, if so, optionally measuring the yield thereof.
(a)ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて、前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅するステップと、
(b)増幅された前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在するか否かを検出し、存在する場合には随意選択でその収量を測定するステップとを含むことを特徴とする標的ポリヌクレオチドの検出方法。A method for detecting, in a sample, a target polynucleotide having the polynucleotide sequence of claim 11,
(A) amplifying the target polynucleotide or a fragment thereof using polymerase chain reaction amplification;
(B) detecting whether the amplified target polynucleotide or a fragment thereof is present, and, if present, optionally measuring the yield thereof. Method.
(a)請求項1のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、
(b)前記サンプルのアゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。A method for screening a compound effective as an agonist of the polypeptide of claim 1,
(A) exposing a sample comprising the polypeptide of claim 1 to a compound;
(B) detecting the agonist activity of the sample.
(a)請求項1のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、
(b)前記サンプルにおけるアンタゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。A method for screening a compound effective as an antagonist of the polypeptide of claim 1,
(A) exposing a sample comprising the polypeptide of claim 1 to a compound;
(B) detecting antagonist activity in the sample.
(a)請求項1のポリペプチドを好適な条件下で少なくとも1つの試験化合物と結合させるステップと、
(b)請求項1のポリペプチドと前記試験化合物との結合を検出して、請求項1のポリペプチドと特異的に結合する化合物を同定するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。A method for screening for a compound that specifically binds to the polypeptide of claim 1,
(A) binding the polypeptide of claim 1 to at least one test compound under suitable conditions;
(B) detecting the binding between the polypeptide of claim 1 and the test compound to identify a compound that specifically binds to the polypeptide of claim 1.
(a)請求項1のポリペプチドを、その活性が許容される条件下で少なくとも1つの試験化合物と結合させるステップと、
(b)前記試験化合物の存在下での請求項1のポリペプチドの活性を評価するステップと、
(c)前記試験化合物の存在下での請求項1のポリペプチドの活性と、前記試験化合物の不在下での請求項1のポリペプチドの活性とを比較するステップとを含み、
前記試験化合物の存在下での請求項1のポリペプチドの活性の変化が、請求項1のポリペプチドの活性を調節する化合物の存在を示唆すること特徴とするスクリーニング方法。A method for screening a compound that modulates the activity of the polypeptide according to claim 1,
(A) binding the polypeptide of claim 1 to at least one test compound under conditions permitting its activity;
(B) assessing the activity of the polypeptide of claim 1 in the presence of said test compound;
(C) comparing the activity of the polypeptide of claim 1 in the presence of the test compound to the activity of the polypeptide of claim 1 in the absence of the test compound;
A screening method, wherein a change in the activity of the polypeptide of claim 1 in the presence of the test compound indicates the presence of a compound that modulates the activity of the polypeptide of claim 1.
(a)前記標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、
(b)前記標的ポリヌクレオチドの発現の変化を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。A method for screening a compound effective for altering the expression of a target polynucleotide comprising the sequence of claim 5, comprising:
(A) exposing a sample containing the target polynucleotide to a compound;
(B) detecting a change in expression of the target polynucleotide.
(a)核酸を含む生体サンプルを前記試験化合物で処置するステップと、
(b)処置した前記生体サンプルの核酸を、請求項11のポリヌクレオチドの連続する少なくとも20個のヌクレオチドを含むプローブと、前記プローブと前記生体サンプルの標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下でハイブリダイズさせるステップであって、標的ポリヌクレオチドが請求項11のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列またはその断片を含む、前記ステップと、
(c)ハイブリダイゼーション複合体の収量を測定するステップと、
(d)前記処置した生体サンプルにおけるハイブリダイゼーション複合体の収量を、未処置の生体サンプルにおけるハイブリダイゼーション複合体の収量とを比較するステップとを含み、
前記処置した生体サンプルにおけるハイブリダイゼーション複合体の収量の差が試験化合物の毒性を示唆することを特徴とする試験化合物の毒性評価方法。A method for evaluating the toxicity of a test compound, comprising:
(A) treating a biological sample containing nucleic acids with the test compound;
(B) specific hybridization of the treated nucleic acid of the biological sample with a probe comprising at least 20 contiguous nucleotides of the polynucleotide of claim 11 and the probe and a target polynucleotide of the biological sample. Hybridizing under conditions under which a complex is formed, wherein the target polynucleotide comprises the polynucleotide sequence of the polynucleotide of claim 11 or a fragment thereof;
(C) measuring the yield of the hybridization complex;
(D) comparing the yield of hybridization complex in the treated biological sample with the yield of hybridization complex in an untreated biological sample.
A method for evaluating the toxicity of a test compound, wherein a difference in the yield of the hybridization complex in the treated biological sample indicates the toxicity of the test compound.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US14507599P | 1999-07-21 | 1999-07-21 | |
US15312999P | 1999-09-08 | 1999-09-08 | |
US16464799P | 1999-11-10 | 1999-11-10 | |
PCT/US2000/019948 WO2001007471A2 (en) | 1999-07-21 | 2000-07-21 | Cell cycle and proliferation proteins |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004500804A true JP2004500804A (en) | 2004-01-15 |
Family
ID=27386213
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001512554A Pending JP2004500804A (en) | 1999-07-21 | 2000-07-21 | Cell cycle and cell growth proteins |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1196577A2 (en) |
JP (1) | JP2004500804A (en) |
AU (1) | AU6230700A (en) |
CA (1) | CA2379784A1 (en) |
WO (1) | WO2001007471A2 (en) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU6181400A (en) * | 1999-07-29 | 2001-02-19 | Helix Research Institute | Gene expressed specifically in human fetal heart muscle |
EP1227149A4 (en) * | 1999-10-27 | 2004-03-31 | Takeda Chemical Industries Ltd | Novel protein and use thereof |
CA2389600A1 (en) * | 1999-11-01 | 2001-05-10 | Lexicon Genetics Incorporated | Novel human melastatin-like proteins and polynucleotides encoding the same |
US7335749B2 (en) | 2000-02-09 | 2008-02-26 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Tumor suppressor gene, p47Ing3 |
US20030099976A1 (en) * | 2001-01-17 | 2003-05-29 | Tai-Jay Chang | Androgen receptor complex-associated protein |
US20030082721A1 (en) * | 2001-01-17 | 2003-05-01 | Tai-Jay Chang | Transgenic animals expressing androgen receptor complex-associated protein |
US6974683B2 (en) | 2001-01-17 | 2005-12-13 | Veterans General Hospital | Nucleic acid encoding androgen receptor complex-associated protein |
JPWO2003023031A1 (en) * | 2001-09-04 | 2004-12-24 | 日本新薬株式会社 | Methods for diagnosing the effectiveness of nucleic acid therapy |
JP4265402B2 (en) * | 2001-09-25 | 2009-05-20 | ソニー株式会社 | Composition for inhibiting transcription comprising p300 histone acetylase inhibitor and method for screening for inhibitor capable of inhibiting p300 histone acetylase inhibitor |
WO2003059948A1 (en) * | 2002-01-15 | 2003-07-24 | Medigene Ag | Dilated cardiomyopathy associated gene-2 (dcmag-2): a cytoplasmatic inducer of sarcomeric remodeling in cardiomyocytes |
KR101083852B1 (en) | 2002-07-25 | 2011-11-15 | 소니 주식회사 | A gene transcription regulator and a screening method for a compound inhibiting histone deacetylase |
EP2444409A2 (en) * | 2002-09-16 | 2012-04-25 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the treatment of immune related diseases |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6001619A (en) * | 1995-10-04 | 1999-12-14 | Cold Spring Harbor Laboratory | Ubiquitin ligases, and uses related thereto |
JP2001519667A (en) * | 1997-04-10 | 2001-10-23 | ジェネティックス・インスチチュート・インコーポレーテッド | Secretory expression sequence tags (sESTs) |
CA2296792A1 (en) * | 1999-02-26 | 2000-08-26 | Genset S.A. | Expressed sequence tags and encoded human proteins |
-
2000
- 2000-07-21 WO PCT/US2000/019948 patent/WO2001007471A2/en not_active Application Discontinuation
- 2000-07-21 CA CA002379784A patent/CA2379784A1/en not_active Abandoned
- 2000-07-21 EP EP00948872A patent/EP1196577A2/en not_active Withdrawn
- 2000-07-21 AU AU62307/00A patent/AU6230700A/en not_active Abandoned
- 2000-07-21 JP JP2001512554A patent/JP2004500804A/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2001007471A2 (en) | 2001-02-01 |
WO2001007471A9 (en) | 2001-05-17 |
CA2379784A1 (en) | 2001-02-01 |
WO2001007471A3 (en) | 2002-01-17 |
AU6230700A (en) | 2001-02-13 |
EP1196577A2 (en) | 2002-04-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2003527089A (en) | Membrane-related proteins | |
JP2004537270A (en) | Aminoacyl-tRNA synthetase | |
JP2003533967A (en) | Human synthetase | |
JP2004516812A (en) | Receptor | |
JP2003509053A (en) | Protein phosphatase and protein kinase | |
JP2004500804A (en) | Cell cycle and cell growth proteins | |
JP2003505083A (en) | Receptors and related proteins | |
JP2003505029A (en) | GTP binding protein | |
JP2004500114A (en) | Transcription factor | |
JP2003529325A (en) | Human transport protein | |
JP2003532419A (en) | Cytoskeletal binding protein | |
JP2002543839A (en) | Full-length molecule expressed in human tissues | |
JP2005503751A (en) | Extracellular matrix and cell adhesion molecules | |
JP2003517290A (en) | Human transcription regulatory protein | |
JP2003530071A (en) | Intracellular signaling molecule | |
US20050048623A1 (en) | Cell cycle and proliferation proteins | |
JP2004507225A (en) | Apoptosis regulator | |
JP2004533829A (en) | Cell growth, differentiation and cell death related proteins | |
JP2004500813A (en) | Vesicle transport protein | |
JP2004511208A (en) | RNA metabolism protein | |
JP2004509610A (en) | Nuclear hormone receptor | |
JP2004516009A (en) | Aminoacyl-tRNA synthetase | |
JP2003510035A (en) | Apoptotic protein | |
JP2003533975A (en) | Secreted protein | |
JP2004519217A (en) | Microtubule-associated proteins and tubulin |