JP2003503070A - ヘパラナーゼに対して遠い相同性を有するポリヌクレオチドおよびそれによってコードされるポリペプチド - Google Patents

ヘパラナーゼに対して遠い相同性を有するポリヌクレオチドおよびそれによってコードされるポリペプチド

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イリス ペッカー，
イスラエル ミシャル，
ハナン イツハキ，
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Abstract

(57)【要約】 ヘパラナーゼに対する遠い相同性を有するポリペプチドをコードする新規なポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む核酸構築物、前記核酸構築物を発現する遺伝子操作された細胞、前記ポリヌクレオチドによってコードされ、かつヘパラナーゼ活性または他のグリコシルヒドロラーゼ活性を有する組換えタンパク質、前記組換えタンパク質を認識する抗体、前記ポリヌクレオチドに由来するオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドアナログならびにそれを含むリボザイム。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野および背景 本発明は、ヘパラナーゼに対する遠い相同性を有するポリペプチドをコードす
る新規なポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む核酸構築物、前記核酸
構築物を発現する遺伝子操作された細胞、前記ポリヌクレオチドによってコード
され、かつヘパラナーゼ活性または他のグリコシルヒドロラーゼ活性を有する組
換えタンパク質、前記組換えタンパク質を認識する抗体、前記ポリヌクレオチド
に由来するオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドアナログならびにそれ
を含むリボザイムに関する。
【０００２】 本明細書中における何らかの参考文献の引用または一体化は、そのような参考
文献が本発明に対する先行技術として利用できることの承認として解釈されるも
のではない。
【０００３】 グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）類 ＧＡＧは、ウロン酸およびヘキソサミンからなる二糖ユニットが反復するポリ
マーである。ヒアルロン酸を除くＧＡＧの生合成はコアタンパク質から開始され
る。プロテオグリカンは、類似するファミリーまたは異なるファミリーに由来す
るいくつかのＧＡＧ側鎖を含有し得る。ＧＡＧは、Ｎ−脱アセチル化およびＮ−
硫酸化、その後、イズロン酸へのグルクロン酸のＣ５−エピマー化およびＯ−硫
酸化によって連続的に修飾され得るホモポリマーとして合成される。様々な組織
から得られたＧＡＧの化学的組成は非常に異なっている。
【０００４】 動物におけるＧＡＧの自然の代謝は加水分解によって行われている。一般に、
ＧＡＧは２工程の方法で分解される。最初に、プロテオグリカンは、ＧＡＧ鎖の
最初の解重合が行われるエンドソームにおいて内在化される。この工程は、主に
加水分解性であり、オリゴ糖が生じる。さらなる分解が、脱硫酸化および単糖へ
の末端からの解重合が行われるリソソームと融合した後に行われる（４２）。
【０００５】 これまでに特徴付けられた、ＧＡＧを内部から分解する哺乳動物の酵素は、ヒ
アルロニダーゼだけである。ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸およびコンドロ
イチン硫酸を解重合する１−４エンドグルコサミニダーゼのファミリーである。
精子と結合したＰＨ−２０（Ｈｙａｌ３）、ならびにリソソームヒアルロニダー
ゼのＨｙａｌ１およびＨｙａｌ２をコードするｃＤＮＡがクローン化され、発表
された（２７）。これらの酵素は、４０％の全体的な相同性を互いに有し、異な
った組織特異性、細胞局在性および至適ＰＨを有している。
【０００６】 末端分解性ヒドロラーゼはそれらよりもよく特徴付けられている。この中には
、β−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼおよびβ−Ｎ−アセチルグル
コサミニダーゼが含まれる。多糖鎖のグリコシド結合の加水分解に加えて、ＧＡ
Ｇの分解には脱硫酸化が含まれる。これは、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−
スルファターゼ、イズロン酸−２−スルファターゼおよびヘパリンスルファミダ
ーゼなどのいくつかのリソソームスルファターゼによって触媒されている。リソ
ソームＧＡＧ分解酵素のいずれかの欠損は、リソソーム蓄積症のムコ多糖沈着症
をもたらす。
【０００７】 グリコシルヒドロラーゼ： グリコシルヒドロラーゼは、２つ以上の炭水化物間のｏ−グリコシド結合また
は炭水化物基と非炭水化物基との間のｏ−グリコシド結合を加水分解する酵素の
幅広い群である。グリコシド結合の酵素的加水分解は、アノマー立体配置の全体
的な保持または反転を生じさせる１つまたは２つの主要な機構を使用することに
よって生じている。両方の機構において、触媒作用には、プロトン供与体および
求核種の２つの残基が関与する。グリコシルヒドロラーゼは、アミノ酸類似性に
基づいて５８のファミリーに分類されている。１、２、５、１０、１７、３０、
３５、３９および４２の各ファミリーに由来するグリコシルヒドロラーゼは、非
常に様々な基質に作用するが、それらはすべて、アノマー立体配置が保持された
まま、一般的な酸加水分解機構でグリコシド結合を加水分解する。この機構には
、プロトン供与体および求核種である２つのグルタミン酸残基が、プロトン供与
体の前に常に位置するアスパラギンとともに関与している。この群に由来する１
組の知られている３Ｄ構造の分析により、それらの触媒活性ドメインは、低いレ
ベルの配列同一性にもかかわらず、β４鎖およびβ７鎖のＣ末端側にそれぞれ位
置するプロトン供与体および求核種を伴う類似した（α／β）８回の折り畳み構
造（ｆｏｌｄ）を取っていることが明らかにされた。リソソームグリコシルヒド
ロラーゼの機能的に保存されたアミノ酸における変異が、様々なリソソーム蓄積
症において同定された。
【０００８】 β−グルクロニダーゼ、β−マンノシダーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、
β−ガラクトシダーゼおよびα−Ｌ−イズロニダーゼを含むリソソームグリコシ
ルヒドロラーゼはすべて、ＧＨ−Ａクランに属するエキソグリコシルヒドロラー
ゼであり、類似した触媒活性部位を互いに有している。しかし、細菌および真菌
のキシレナーゼおよびセルラーゼなどの様々な生物に由来する多くのエンドグル
カナーゼは、この触媒活性ドメインを有している（１）。
【０００９】 ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）類 ＨＳＰＧは、脊椎動物組織および非脊椎動物組織の広範囲の細胞の細胞表面お
よび細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と結合した遍在性高分子である（３〜７）。
ＨＳＰＧの基本的な構造は、線状のヘパラン硫酸の鎖が数個共有結合しているタ
ンパク質コアからなる。この多糖鎖は、典型的には、Ｎ−結合およびＯ−結合の
硫酸基成分とＮ−結合のアセチル基とによって様々な程度で置換されている、ヘ
キスロン酸とＤ−グルコサミンとの反復した二糖ユニットから構成されている（
３〜７）。細胞接着、増殖および分化におけるＥＣＭ分子の関与に関する研究に
より、胚の形態形成、血管形成、転移、神経突起成長および組織修復におけるＨ
ＳＰＧの中心的な役割が解明された（３〜７）。多数のタンパク質に結合できる
その能力において特徴的なヘパラン硫酸（ＨＳ）鎖は、広範囲のエフェクター分
子が細胞表面に結合することを保証している（６〜８）。ＨＳＰＧはまた、血管
の突出した成分でもある（５）。大きな血管では、ＨＳＰＧは内膜および内側媒
体に主に集中しているが、毛細管では、増殖して遊走する内皮細胞を支持し、か
つ毛細管壁の構造を安定化する内皮下の基底膜において主に見出されている。コ
ラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンなどのＥＣＭ高分子と、そして原形
質膜上の種々の結合部位と相互作用するＨＳＰＧの能力は、ＥＣＭ成分の自己会
合および不溶化、ならびに細胞の接着および移動におけるこのプロテオグリカン
の重要な役割を示唆している。従って、ＨＳの切断は、内皮下ＥＣＭの解離をも
たらし、従って、血液で運ばれる正常な細胞および悪性細胞の管外遊出における
決定的な役割を果たし得る（９〜１１）。ＨＳの異化作用が、炎症、傷害修復、
糖尿病およびガン転移において認められている。このことは、ＨＳを分解する酵
素が病理学的プロセスにおいて様々な重要な役割を果たしていることを示唆して
いる。
【００１０】 ヘパラナーゼ ヘパラナーゼは、ある種のグリコサミノグリカン類の異化作用に関与している
グリコシル化された酵素である。これは、ヘパラン硫酸を特定の鎖内部位で切断
するエンドグルクロニダーゼである（１２〜１５）。Ｔリンパ球およびＢリンパ
球、血小板、顆粒、マクロファージならびにマスト細胞と内皮下の細胞外マトリ
ックス（ＥＣＭ）との相互作用は、ヘパラナーゼ活性によるヘパラン硫酸の分解
に関連している（１６）。ｃ−ケモカインである結合組織活性化ペプチドＩＩＩ
（ＣＴＡＰ）が、ヘパラナーゼ様活性を有することが見出された。胎盤のヘパラ
ナーゼは、接着分子として、あるいは微小環境のｐＨに依存する分解性酵素とし
て作用している（１７）。
【００１１】 ヘパラナーゼは、様々な活性化シグナル（例えば、トロンビン、カルシウムイ
オノホア、免疫複合体、抗原および分裂促進因子）に応答して細胞内区画（例え
ば、リソソーム、特定の顆粒）から放出される。このことは、炎症応答および細
胞免疫性応答におけるその調節された関与を示唆している（１６）。
【００１２】 ヘパラナーゼは、刺激を加えることなく４℃で６０分間インキュベーションす
ることによってヒト好中球から容易に放出され得ることもまた明らかにされた（
１８）。
【００１３】 ヒト好中球の三次顆粒においてヘパラナーゼとともに見出される別のＥＣＭ分
解酵素であるゼラチナーゼが、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート
（ＰＭＡ）の処置に応答して好中球から分泌される（１９〜２０）。
【００１４】 これに対して、様々な腫瘍細胞は、その転移能と相関した構成的な様式でヘパ
ラナーゼを発現して分泌しているようである（２１）。
【００１５】 ヘパラナーゼによるヘパラン硫酸の分解は、基底膜、細胞外マトリックスおよ
び細胞表面のヘパラン硫酸によって捕捉されるヘパリン結合性の増殖因子、酵素
および血漿タンパク質の放出をもたらす（２２〜２３）。
【００１６】 ヘパラナーゼ活性が、培養された皮膚繊維芽細胞、ヒト好中球、活性化された
ラットＴリンパ球、正常なネズミＢリンパ球および新生物性ネズミＢリンパ球、
ヒト単球およびヒト臍静脈内皮細胞、ＳＫヘパトーム細胞、ヒト胎盤およびヒト
血小板を含む数多くの細胞タイプにおいて記載されている。
【００１７】 天然型ヘパラナーゼを精製する手法が、ＳＫヘパトーム細胞およびヒト胎盤（
米国特許第５，３６２，６４１号）について、そしてヒト血小板由来酵素（６２
）について報告された。
【００１８】 ヘパラナーゼ遺伝子のクローニングおよび発現 ヒトのヘパトーム細胞から単離されたヘパラナーゼの精製画分をトリプシン消
化した。ペプチドを高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分離し、微
量配列決定を行った。１つのペプチドの配列を使用して、対応する逆翻訳された
ＤＮＡ配列に対する相同性についてデータベースのスクリーニングを行った。こ
の手法により、２７ｂｐの３’非翻訳領域およびポリＡテールが続く９６３ｂｐ
のオープンリーディングフレームを含む１０２０塩基対（ｂｐ）のインサートを
含有するクローンが同定された。この新しい遺伝子はｈｐａと呼ばれた。ｈｐａ
の不足している５’端のクローニングを胎盤ｃＤＮＡ混合物からのＭａｒａｔｈ
ｏｎ ＲＡＣＥによって行った。結合させたｈｐａのｃＤＮＡ（これはまたｐｈ
ｐａとして示される）フラグメントは、５４３個のアミノ酸からなり、計算され
た分子量が６１，１９２ダルトンであるポリペプチドをコードするオープンリー
ディングフレームを含有した（２）。このクローニング手順は、米国特許出願第
０８／９２２，１７０号、同第０９／１０９，３８６号および同第０９／２５８
，８９２号に詳しく記載されている。後者は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／
１７９５４（１９９８年８月３１日出願）の一部継続出願である。これらはすべ
て参考として本明細書中に組み込まれる。
【００１９】 ヘパラナーゼをコードするゲノム遺伝子座は約４０ｋｂに広がっている。この
遺伝子座は、１１個のイントロンによって隔てられた１２個のエキソンから構成
され、ヒトの第４染色体に局在化している。
【００２０】 ｈｐａ遺伝子産物がヘパラン硫酸（ＨＳ）のインビトロでの分解を触媒する能
力を、ｈｐａのオープンリーディングフレーム全体を、Ｈｉｇｈファイブ細胞お
よびＳｆ２１昆虫細胞において、そして哺乳動物のヒト２９３胚性腎臓細胞株発
現システムにおいて発現させることによって調べた。感染細胞またはトランスフ
ェクション細胞の抽出物をヘパラナーゼの触媒活性についてアッセイした。この
目的のために、細胞溶解物を、硫酸基が標識されたＥＣＭ由来ＨＳＰＧ（ピーク
Ｉ）とインキュベーションし、その後、反応混合物のゲルろ過分析（セファロー
ス６Ｂ）を行った。基質単独は高分子量物質からなっていたが、ｈｐａ含有ベク
ターによる感染細胞またはトランスフェクション細胞の溶解物とともにＨＳＰＧ
基質をインキュベーションすることにより、高分子量基質は、低分子量の標識さ
れたヘパラン硫酸分解フラグメントに完全に変換された（例えば、米国特許出願
第０９／０７１，６１８号（これは参考として本明細書中に組み込まれる）を参
照のこと）。
【００２１】 他の実験において、ｐＦｈｐａウイルスを感染させた細胞により発現されるヘ
パラナーゼ酵素は、自然に産生される無傷なＥＣＭに存在する他の高分子量成分
（例えば、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン）に複合体化したＨＳを、
非常に転移しやすい腫瘍細胞または免疫系の活性化細胞について報告されている
様式（７、８）と類似する様式で分解し得ることが明らかにされた（米国特許出
願第０９／１０９，３８６号（これは参考として本明細書中に組み込まれる）を
参照のこと）。
【００２２】 ヒト乳ガンおよび肝細胞ガンにおけるｈｐａ遺伝子の優先的な発現 半定量的ＲＴ−ＰＣＲを、種々の転移度を示すヒト乳ガン細胞株によるｈｐａ
遺伝子の発現を評価するために適用した。非転移性ＭＣＦ−７乳ガン細胞株、中
程度の転移性ＭＤＡ２３１乳ガン細胞株、および非常に転移しやすいＭＤＡ４３
５乳ガン細胞株の転移能と相関するｈｐａ遺伝子発現の顕著な増大が認められる
。重要なことに、ｈｐａ遺伝子発現の示差的なパターンは、ヘパラナーゼ活性の
パターンと相関していた。
【００２３】 ヒト乳ガンにおけるｈｐａ遺伝子の発現が、保存されていたパラフィン包埋ヒ
ト乳房組織に対するインサイチュハイブリダイゼーションによって明らかにされ
た。ヘパラナーゼのアンチセンスリボプローブの浸襲性管ガン組織切片に対する
ハイブリダイゼーションは、ガン腫細胞に対して特異的に局在化した大きな陽性
染色をもたらした。ｈｐａ遺伝子はまた、線維嚢胞性変化を示すガン腫に隣接す
る領域においても発現していた。縮小乳房形成に由来する正常な乳房組織は、ｈ
ｐａ転写物を発現させていなかった。ｈｐａ遺伝子の大きな発現が、ヒト肝細胞
ガン標本に由来する組織切片においても認められたが、正常な成人肝臓細胞では
認められなかった。さらに、卵巣の腺ガン、頸部の扁平上皮ガン、および結腸腺
ガンに由来する組織標本は、それぞれの非悪性コントロール組織におけるｈｐａ
のｍＲＮＡの非常に低い染色と比較した場合、ｈｐａのＲＮＡプローブによる強
い染色を示した（２）。
【００２４】 対応する正常な組織に対するヒト腫瘍におけるヘパラナーゼの優先的な発現が
、モノクローナル抗ヘパラナーゼ抗体を用いたパラフィン包埋切片の免疫組織化
学的染色によっても認められた。陽性の細胞質染色が、結腸ガンの新生物細胞に
おいて、そして同じ標本で見出された管状絨毛状腺腫の異形成上皮細胞において
見出された。一方、ガン腫から離れたところに位置する正常に見える結腸上皮細
胞はほとんど染色されなかった。特に重要なことは、周囲の正常な肝臓組織と比
較した場合、肝臓内に転移している結腸腺ガン細胞が強く免疫染色されることで
あった。
【００２５】 ヘパラナーゼタンパク質の潜在形態および活性形態 バキュロウイルス発現システムにおいて産生された組換え酵素の見かけの分子
サイズは約６５ｋＤａであった。このヘパラナーゼポリペプチドは、６個の可能
なＮ−グリコシル化部位を含む。ペプチドＮ−グリコシダーゼを用いた処理によ
る脱グリコシル化の後、タンパク質は、５７ｋＤａのバンドとして現れた。この
分子量は、推定された３ｋＤａのシグナルペプチドが切断された後の、ｈｐａの
全長型ｃＤＮＡによってコードされる５４３アミノ酸ペプチドの推定分子量（６
１，１９２ダルトン）に対応する。Ｎ−脱グリコシル化タンパク質の見かけサイ
ズにおけるさらなる低下は、同時に行われたＯ−グリコシダーゼ処理およびノイ
ラミニダーゼ処理の後には認められなかった。脱グリコシル化は、酵素活性に対
して検出できるほどの影響を有していなかった。
【００２６】 バキュロウイルス酵素とは異なり、哺乳動物細胞（例えば、２９３腎臓細胞、
ＣＨＯ）における全長型ヘパラナーゼポリペプチドの発現は、細胞溶解物におい
て、約５０ｋＤａの主要なタンパク質と約６５ｋＤａの微量タンパク質とをもた
らした。約６５ｋＤａ形態の培養培地中への優先的な放出が、トランスフェクシ
ョンされたＣＨＯクローンのいくつかで認められた。この２つの形態の酵素活性
を、半定量的なゲルろ過アッセイを使用して比較すると、５０ｋＤａ酵素は、６
５ｋＤａ形態よりも約１００倍大きな活性を有することが明らかにされた。同様
な差が、組換え６５ｋＤａバキュロウイルス酵素の比活性を、ヒト血小板、ＳＫ
−ｈｅｐ−１細胞または胎盤から精製された５０ｋＤａヘパラナーゼ調製物の比
活性と比較したときに認められた。これらの結果は、５０ｋＤａのタンパク質が
、潜在型ヘパラナーゼ前駆体のプロセシングされた成熟形態であることを示唆し
ている。血小板ヘパラナーゼのアミノ末端配列分析により、切断がｇｌｕ１５７ −ｌｙｓ１５８のアミノ酸の間で生じていることが示された。ヘパラナーゼのヒ
ドロパシープロットによって示されるように、この部位は、露出すると考えられ
、従ってプロテアーゼと接触し得る親水性ピークの内部に位置している。
【００２７】 腫瘍細胞侵入および転移におけるヘパラナーゼの関与 毛細血管床において捕捉される循環している腫瘍細胞は、多くの場合、隣り合
う内皮細胞間の細胞間接合部あるいはその近くに接着する。転移性細胞のそのよ
うな接着は、その後に、接合物の破壊、内皮細胞境界の収縮、および露出した支
持する基底膜（ＢＭ）に向かう内皮内の裂け目の移動が続く（２４）。内皮細胞
とＢＭとの間に位置すると、侵入細胞は、血管区画から遊走するために、ＢＭの
内皮下の糖タンパク質およびプロテオグリカンを分解しなければならない。いく
つかの細胞酵素（例えば、コラゲナーゼＩＶ、プラスミノーゲン活性化因子、カ
テプシンＢ、エラスターゼなど）がＢＭの分解に関与していることが考えられる
（２５）。これらの酵素の１つが、ＨＳを特定の鎖内部位で切断するヘパラナー
ゼである（１６、１１）。ＨＳを分解するヘパラナーゼの発現が、マウスのリン
パ腫細胞の転移能（２６）と、そして線維肉腫細胞およびメラノーマ細胞の転移
能（２１）と相関していることが見出された。さらに、ヘパラナーゼの高まった
レベルが、転移性腫瘍を有する動物およびメラノーマ患者に由来する血清（２１
）において、そしてガン患者の腫瘍生検物（１２）において検出された。
【００２８】 ヘパラナーゼに対するヘパリンの様々な非抗凝固性化学種の阻害作用を、血液
で運ばれる細胞の管外遊出を妨げることにおけるそれらの潜在的な使用を考慮し
て試験した。ヘパラナーゼ阻害剤を用いた実験動物の処置は、Ｂ１６メラノーマ
細胞、ルイス肺ガン細胞および乳腺ガン細胞によって誘導される肺転移の発生率
を顕著に（＞９０％）低下させた（１２、１３、２８）。抗トロンビンＩＩＩに
対する高親和性ヘパリン画分および低親和性ヘパリン画分は、匹敵し得る大きな
抗転移活性を示した。このことは、ヘパリンのヘパラナーゼ阻害活性は、その抗
凝固的な活性ではなくむしろ、多糖の抗転移的な性質において役割を果たしてい
ることを示している（１２）。
【００２９】 ガン転移におけるヘパラナーゼの直接的な役割が２つの実験システムによって
明らかにされた。ネズミのＴリンパ腫細胞株Ｅｂは検出できるほどのヘパラナー
ゼ活性を有していない。Ｅｂ細胞へのｈｐａ遺伝子の導入により転移挙動がこれ
らの細胞に付与されるかどうかを検討した。この目的のために、Ｅｂ細胞をヒト
ｈｐａの全長型ｃＤＮＡでトランスフェクションした。安定的にトランスフェク
ションされた細胞は、ヘパラナーゼｍＲＮＡおよび酵素活性の大きな発現を示し
た。これらのｈｐａトランスフェクションＥｂ細胞およびモックトランスフェク
ションＥｂ細胞をＤＢＡ／２マウスに皮下注射して、マウスを生存期間および肝
臓転移について調べた。モックトランスフェクション細胞が注射されたマウスは
すべて（ｎ＝２０）、実験の最初の４週間にわたって生存したが、ｈｐａ ｃＤ
ＮＡでトランスフェクションされたＥｂ細胞が接種されたマウスでは、５０％の
死亡が認められた。ｈｐａトランスフェクション細胞が接種されたマウスの肝臓
は、肝臓表面の目視評価および組織切片の顕微鏡検査の両方により明かであるよ
うに、無数のＥｂリンパ腫細胞が浸潤していた。これに対して、転移性病巣は、
モックトランスフェクションされたコントロールＥｂ細胞が接種されたマウスの
肝臓の全体的な検査により検出することができない。リンパ腫細胞が肝臓組織に
浸潤していることはほとんど見出されなかった。腫瘍転移の異なるモデルにおい
て、低転移性Ｂ１６−Ｆ１マウスメラノーマ細胞へのヘパラナーゼ遺伝子の一過
性トランスフェクション、その後のｉ．ｖ．接種により、肺転移は４倍〜５倍増
大した。
【００３０】 最後に、Ｂ１６-Ｆ１メラノーマ細胞に外因的に接着させたヘパラナーゼは、
コントロールのマウスと比較した場合、Ｃ５７ＢＬマウスにおける肺転移のレベ
ルを増大させた（米国特許出願第０９／１４０，８８８号の一部継続出願で、参
考として本明細書中に組み込まれる米国特許出願第０９／２６０，０３７号（名
称：患者への生物学的材料の導入）を参照のこと）。
【００３１】 腫瘍の血管形成におけるヘパラナーゼの考えられる関与 様々な繊維芽細胞増殖因子は、ヘパリンに対する大きな親和性を特徴とする構
造的に関連するポリペプチドのファミリーである（２９）。繊維芽細胞増殖因子
は、血管内皮細胞に対して大きな分裂促進作用を有し、血管新生の最も強力な誘
導剤に含まれる（２９〜３０）。塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が、イ
ンビトロで産生された内皮下ＥＣＭ（３１）から、そして角膜の基底膜（３２）
から抽出されている。このことは、ＥＣＭがｂＦＧＦの貯蔵体として作用し得る
ことを示している。免疫組織化学的な染色により、多様な組織および血管の基底
膜におけるｂＦＧＦの局在化が明らかにされた（２３）。ｂＦＧＦが正常な組織
に遍在的に存在するにも関わらず、これらの組織における内皮細胞の増殖は、通
常、非常に低い。このことは、ｂＦＧＦがその作用部位からいくらかか隔離され
ていることを示している。ｂＦＧＦとＥＣＭとの相互作用に関する研究により、
ｂＦＧＦはＥＣＭ内のＨＳＰＧに結合しており、そしてＨＳ分解酵素により活性
形態で放出され得ることが解明された（３３、３２、３４）。血小板、マスト細
胞、好中球およびリンパ腫細胞によって発現されるヘパラナーゼ活性は、活性な
ｂＦＧＦのＥＣＭおよび基底膜からの放出に関与していることが明らかにされた
（３５）。このことは、ヘパラナーゼ活性は細胞遊走および細胞侵入において機
能し得るだけでなく、間接的な血管新生応答を誘発し得ることもを示唆している
。これらの結果により、ＥＣＭのＨＳＰＧは自然の貯蔵デポ部をｂＦＧＦおよび
おそらくは他のヘパリン結合性増殖促進因子に提供していることが示唆される（
３６、３７）。従って、ｂＦＧＦを基底膜内およびＥＣＭ内のその貯蔵部から追
い出すことにより、正常な状況および病理学的状況における血管新生の誘導に対
する新しい機構が提供され得る。
【００３２】 最近の研究は、ヘパリンおよびＨＳが、高親和性の細胞表面受容体に対するｂ
ＦＧＦの結合、およびｂＦＧＦの細胞シグナル変換に関与していることを示して
いる（３８、３９）。さらに、最適な作用のために必要とされるＨＳのサイズは
、ヘパラナーゼによって放出されるＨＳフラグメントのサイズと類似していた（
４０）。同様な結果が、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を用いて得られた（
４１）。このことは、ヘパリン結合性増殖因子との細胞相互作用においてＨＳを
伴う二重受容体機構が働いていることを示唆している。従って、ＥＣＭ内に内皮
細胞増殖因子を制限することにより、血管内皮に対するそれらの全身的な作用が
妨げられること、従って、非常に低い速度の内皮細胞回転および血管増殖が維持
されることが提案される。一方、ｂＦＧＦをＨＳフラグメントとの複合体として
ＥＣＭ内の貯蔵部から放出させることにより、傷害治癒、炎症発症および腫瘍発
達などのプロセスにおける局在化した内皮細胞の増殖および血管新生が誘発され
得る（３６，３７）。
【００３３】 他の生理学的プロセスにおけるヘパラナーゼの関与およびその潜在的な治療的
適用 腫瘍細胞の転移、炎症および自己免疫性におけるその関与とは別に、哺乳動物
のヘパラナーゼは、ヘパリン結合性増殖因子の生体利用性；ヘパリン結合性増殖
因子（例えば、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ）およびサイトカイン（ＩＬ−８）に対する
細胞応答（４４、４１）；血漿リポタンパク質との細胞相互作用（４９）；ある
種のウイルス感染症およびいくつかの細菌感染症および原生動物感染症に対する
細胞感受性（４５〜４７）；ならびにアミロイド斑の崩壊（４８）を調節するた
めに適用することができる。
【００３４】 ウイルス感染：細胞表面にヘパラン硫酸が存在することが、ヘルペス単純ウイ
ルス（４５）およびデングウイルス（４６）の細胞への結合にとって、そしてそ
の後の細胞感染にとって主要な条件であることが示されている。従って、細胞表
面のヘパラン硫酸をヘパラナーゼによって除くことにより、ウイルス感染をなく
すことができる。実際、細菌の（ヘパラン硫酸を分解する）ヘパリチナーゼまた
は（ヘパランを分解する）ヘパラナーゼで細胞を処理することにより、２つの関
連する動物ヘルペスウイルスの細胞への結合が低下し、そして細胞は、ウイルス
感染に対して少なくとも部分的に耐性になった（４５）。細胞表面のヘパラン硫
酸がＨＩＶの感染にも関与していることを示すものがいくつかある（４７）。
【００３５】 神経変性疾患：ヘパラン硫酸プロテオグリカンが、ゲンストマン−シュトロイ
スラー症候群、クロイツフェルト−ヤコブ病およびスクレイピーのプリオンタン
パク質アミロイド斑において同定された（４８）。ヘパラナーゼは、アルツハイ
マー病の病因において役割を果たしていることもまた考えられるこれらのアミロ
イド斑を崩壊させることが考えられる。
【００３６】 再狭窄およびアテローム性動脈硬化症：内皮の傷害およびコレステロールが多
いリポタンパク質に応答した動脈平滑筋細胞（ＳＭＣ）の増殖は、アテローム性
動脈硬化症および再狭窄の病因における基本的な事象である（５０）。ヘパリン
結合性増殖因子に対する親和性が低い受容体としてのＳＭＣ増殖におけるその関
与とは別に、ＨＳはまた、リポタンパク質の結合、保持および取込みにも関与し
ている（５１）。ＨＳＰＧおよびリポタンパク質リパーゼは、コレステロールが
多いリポタンパク質の実質的な細胞蓄積および間質蓄積を可能にし得る新規な異
化経路に関与していることが明らかにされた（４９）。後者の経路は、細胞コレ
ステロール含有量によるフィードバック阻害とは関係なく、ａｐｏＢおよびａｐ
ｏＥが多いリポタンパク質（例えば、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、キロミクロン類）の蓄
積を促進することによって大きなアテローム発生性になることが予想される。従
って、ＳＭＣのＨＳをヘパラナーゼによって除くことにより、ＳＭＣの増殖およ
び脂質の蓄積の両方が阻害されることが期待され、従って、再狭窄およびアテロ
ーム性動脈硬化症の進行を停止させることができる。
【００３７】 肺の疾患： 文献から得られたデータは、感染速度および炎症速度を低下させることに関連
して示される洞分泌物および気道分泌物の粘度を低下させることにおける、ヘパ
ラナーゼ、結合組織活性化ペプチド、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、スルフ
ァターゼおよびコンドロイチナーゼ（これらに限定されない）などのＧＡＧ分解
酵素に対する可能な役割を示唆している。ＣＦ患者から得られた痰は少なくとも
３％のＧＡＧを含有し、従って、これはその容量的および粘性的な性質に寄与し
ている。組換えヘパラナーゼはＣＦ患者の痰の粘度を低下させることが示されて
いる（米国特許出願第０９／０４６，４７５号を参照のこと）。
【００３８】 まとめると、ヘパラナーゼは、このように、傷害治癒、血管形成、再狭窄、ア
テローム性動脈硬化症、炎症、神経変性疾患およびウイルス感染などの状態に対
して有用であることを示し得る。哺乳動物のヘパラナーゼは、プロタミンの潜在
的な代替物として、血漿ヘパリンを中和するために使用することができる。抗ヘ
パラナーゼ抗体は、生検標本、血漿サンプルおよび体液における微小転移物、自
己免疫病巣および腎不全の免疫検出および診断のために適用することができる。
【００３９】 従って、グリコシルヒドロラーゼ活性を有するさらなる分子に対する要求は広
く認識されており、そしてグリコシルヒドロラーゼ活性を有するさらなる分子を
得ることは非常に好都合である。これは、そのような分子が、知られているヘパ
ラナーゼよりも大きな、ある種の基質に対する比活性または異なる基質特異性を
示し得るからである。
【００４０】発明の開示 本発明の１つの局面により、配列番号１、４、６またはその一部と、６ｘＳＳ
Ｃ、１％ＳＤＳ、５ｘデンハルト、１０％デキストラン硫酸、１００μｇ／ｍｌ
サケ精子ＤＮＡおよび３２ｐ標識プローブにおいて６８℃でハイブリダイゼーシ
ョン可能であり、かつ３ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを用いて６８℃で洗浄さ
れるポリヌクレオチドを含む単離された核酸が提供される。
【００４１】 本発明の別の局面により、配列番号１、４、６またはその一部と、６ｘＳＳＣ
、１％ＳＤＳ、５ｘデンハルト、１０％デキストラン硫酸、１００μｇ／ｍｌサ
ケ精子ＤＮＡおよび３２ｐ標識プローブにおいて６８℃でハイブリダイゼーショ
ン可能であり、かつ１ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを用いて６８℃で洗浄され
るポリヌクレオチドを含む単離された核酸が提供される。
【００４２】 本発明のさらに別の局面により、配列番号１、４、６またはその一部と、６ｘ
ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５ｘデンハルト、１０％デキストラン硫酸、１００μｇ／
ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび３２ｐ標識プローブにおいて６８℃でハイブリダイゼ
ーション可能であり、かつ０．１ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを用いて６８℃
で洗浄されるポリヌクレオチドを含む単離された核酸が提供される。
【００４３】 本発明のさらにまた別の局面により、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇ
ｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（ウイスコンシン大学）によって開発されたＤＮＡ配列分析
ソフトウエアパッケージのＢｅｓｔｆｉｔ法（ギャップ生成ペナルティー：５０
、ギャップ伸長ペナルティー：３）を使用して決定される配列番号１、４、６ま
たはその一部との同一性が少なくとも６０％であるポリヌクレオチドを含む単離
された核酸が提供される。
【００４４】 本発明のさらに別の局面により、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏ
ｕｐ（ＧＣＧ）（ウイスコンシン大学）によって開発されたＤＮＡ配列分析ソフ
トウエアパッケージのＢｅｓｔｆｉｔ法（ギャップ生成ペナルティー：５０、ギ
ャップ伸長ペナルティー：３）を使用して決定される配列番号３、５、７または
その一部との相同性が少なくとも６０％であるポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドを含む単離された核酸が提供される。
【００４５】 下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴により、ポ
リヌクレオチドは、配列番号１、４、６またはその一部に示されている通りであ
る。
【００４６】 本発明のさらなる局面により、本明細書中に記載されているポリヌクレオチド
によってコードされるポリペプチドを含む組換えタンパク質が提供される。
【００４７】 本発明のさらにまたさらなる局面により、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（ウイスコンシン大学）によって開発されたＤＮＡ配列
分析ソフトウエアパッケージのＢｅｓｔｆｉｔ法（ギャップ生成ペナルティー：
５０、ギャップ伸長ペナルティー：３）を使用して決定される配列番号３、５、
７またはその一部との相同性が少なくとも６０％であるポリペプチドを含む組換
えタンパク質が提供される。
【００４８】 下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴により、ポ
リペプチドは、配列番号３、５、７またはその一部に示されている通りである。
【００４９】 本発明のなおさらなる局面により、本明細書中に記載されている単離された核
酸を含む核酸構築物が提供される。
【００５０】 本発明のさらなる局面により、本明細書中に記載されている組換えタンパク質
をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物が提供される。
【００５１】 本発明のなおさらなる局面により、本明細書中に記載されているように、ポリ
ヌクレオチドまたは構築物を含み、かつ／または組換えタンパク質を発現する宿
主細胞が提供される。
【００５２】 本発明のさらにまたさらなる局面により、（ｉ）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕ
ｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（ウイスコンシン大学）によって開発されたＤＮ
Ａ配列分析ソフトウエアパッケージのＢｅｓｔｆｉｔ法（ギャップ生成ペナルテ
ィー：５０、ギャップ伸長ペナルティー：３）を使用して決定される配列番号３
、５、７またはその一部との相同性が少なくとも６０％であるポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド鎖の一部、または（ｉｉ）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐ
ｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（ウイスコンシン大学）によって開発されたＤ
ＮＡ配列分析ソフトウエアパッケージのＢｅｓｔｆｉｔ法（ギャップ生成ペナル
ティー：５０、ギャップ伸長ペナルティー：３）を使用して決定される配列番号
１、４、６またはその一部との同一性が少なくとも６０％であるポリヌクレオチ
ド鎖の一部と、生理学的条件のもと、インビボでハイブリダイゼーションし得る
少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログを含む
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは核酸構築物が提供される。
【００５３】 本発明の別の局面により、本明細書中に記載されているアンチセンスオリゴヌ
クレオチドと、リボザイム配列とを含むリボザイムが提供される。
【００５４】 本発明は、ヘパラナーゼ、ＧＡＧ分解酵素に対する相同性におそらくは基づい
て、ＧＨ−Ａクランのａｓｐ−ｇｌｕグリコシルヒドロラーゼのクラスに属する
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供する。
【００５５】図面の簡単な説明 本発明は、添付された図面を参照して、例としてのみ説明される。 図１は、ｈｎｈｐ１のヌクレオチド配列（配列番号１〜２）および推定アミノ
酸配列（配列番号２〜３）を示す。 図２は、ｈｎｈｐ１（配列番号２〜３）およびヘパラナーゼ（配列番号９）の
推定アミノ酸配列の比較である。比較は、ＧＣＧパッケージのＧａｐプログラム
を使用して行われた（ギャップ生成ペナルティー：５０、ギャップ伸長ペナルテ
ィー：３）。 図３は、ｈｎｈｐ１転写物の変化性を例示する。ｈｎｈｐ１は、遺伝子特異的
プライマーのｐｎ９−３１２ｕ（配列番号１４）およびｈｎ１１−２３０（配列
番号１１）を使用して胎盤および精巣のマラソン・レディーｃＤＮＡライブラリ
ーから増幅された。 図４は、動物ブロットを示す。様々な種から得られたゲノムＤＮＡの１０マイ
クログラムをＥｃｏＲＩで消化して、０．７％アガロース−ＴＢＥゲルで分離し
た。電気泳動後、ゲルをＨＣｌで処理し、次いでＮａＯＨで処理し、そしてＤＮ
Ａフラグメントを０．４ＮのＮａＯＨとともにナイロンメンブラン（Ｈｙｂｏｎ
ｄ Ｎ＋、Ａｍｅｒｓｈａｍ）に下向きで移した。メンブランを、ｈｎｈｐ１の
ｃＤＮＡ（クローンｐｎ９）を含有する１．７ＫｂのＤＮＡプローブとハイブリ
ダイゼーションさせた。レーン順序：Ｈ−ヒト；Ｍ−マウス；Ｒｔ−ラット；Ｐ
−ブタ；Ｃｗ−雄ウシ；Ｈｒ−ウマ；Ｓ−ヒツジ；Ｒｂ−ウサギ；Ｄ−イヌ；Ｃ
ｈ−ニワトリ；Ｆ−サカナ。サイズマーカー（λＢｓｔｅＩＩ）を左側に示す。 図５は、ｈｐａとｈｎｈｐ１との交差ハイブリダイゼーションを例示する。ｈ
ｐａは、マラソン・レディー胎盤ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって増幅
された。ｈｎｈｐ１は、精巣マラソン・レディーｃＤＮＡライブラリーから増幅
された。ＰＣＲ産物を二連でアガロースゲルで泳動し、ナイロンメンブランに移
した。一方のメンブランを３２ｐ標識のｈｐａ ｃＤＮＡで、もう一方をｈｎｈ
ｐ１（クローンｐｎ９）でプローブした。 図６は、ヘパラナーゼおよびｈｎｈｐ１のヒドロパシープロフィルの比較であ
る。曲線は、１７アミノ酸のウインドウにわたってＫｙｔｅおよびＤｕｌｉｔｔ
ｌｅ法に従って計算された。 図７は、ヒト胚性腎臓２９３細胞において発現させた組換えｈｎｈｐ１のウエ
スタンブロット分析を示す。Ａ：コントロールのヘパラナーゼ−ＦＬＡＧ前駆体
、Ｂ〜Ｄ：コントロールｐＳＩベクター（Ｂ）、ｐＳＩ−ｐｎ６（Ｃ）およびｐ
ＳＩ−ｐｎ９（Ｄ）でトランスフェクションされた２９３細胞。細胞抽出物をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐナイロンメンブラン（Ｍ
ｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。メンブランを１：１０００の抗ＦＬＡＧ Ｆｌａ
ｇ抗体とともにインキュベーションした（Ｋｏｄａｋ、抗ＦｌａｇＭ２、ｃａｔ
：ＩＢ１３０２５）。
【００５６】好適な実施形態の説明 本発明は、ヘパラナーゼに対して遠い相同性を有するポリペプチドをコードす
る新規なポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む核酸構築物、前記核酸
構築物を発現する遺伝子操作された細胞、前記ポリヌクレオチドによってコード
され、かつヘパラナーゼ活性または他のグリコシルヒドロラーゼ活性を有し得る
組換えタンパク質、前記組換えタンパク質を認識する抗体、前記ポリヌクレオチ
ドに由来するオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドアナログならびにそ
れを含むリボザイムである。
【００５７】 本発明の本質および作用は、図面および添付されている説明を参照してより十
分に理解され得る。
【００５８】 本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適
用において、下記の説明において示されているか、または図面に例示されている
構成の細部および構成要素の配置に限定されないことを理解しなければならない
。本発明は、他の実施形態が可能であり、あるいは様々な方法で実施され得るか
、または実施される。また、本明細書中において用いられている表現法および用
語法は説明のためであり、限定として見なしてはならないことを理解しなければ
ならない。
【００５９】 本発明を実行しながら、ヒトＥＳＴデータベースを、ヒトヘパラナーゼのアミ
ノ酸配列全体（配列番号９）を使用して相同的な配列についてスクリーニングし
た。相同性が遠いフラグメントが得られた：精巣Ｂ細胞および胎児胚から調製さ
れたＳｏａｒｅｓ ＮＦＬ Ｔ ＧＢＣ Ｓ１ヒトｃＤＮＡライブラリーに由来
するアクセション番号ＡＩ２２２３２３、ＩＭＡＧＥクローン番号１８４３１５
５。このクローンは５６０ｂｐのインサート（配列番号２３）を含有し、その３
’領域は、ヒトヘパラナーゼをコードするヒトｈｐａ遺伝子に対して相同的であ
った。この新しく同定されたクローンに由来するプライマーを使用して、選択的
スプライシングをインフレームで反映するいくつかのオープンリーディングフレ
ームを含むｃＤＮＡがいくつか単離された。その最長体（ｐｎ６）を図１（配列
番号１、２および３）に示し、長さは２０６０ヌクレオチドである。これは１７
７６ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含有し、６６．５ｋＤａの
計算された分子量を有する５９２アミノ酸のポリペプチドをコードしている。こ
の新しくクローン化された遺伝子はｈｎｈｐ１と呼ばれた。より短い２つの形態
のｐｎ９およびｐｎ５ならびにそれらの推定アミノ酸配列を、それぞれ、配列番
号４および６ならびに配列番号５および７に示す。これらは下記の実施例の節に
さらに記載されている。ｈｎｈｐ１およびヘパラナーゼのアミノ酸配列同士の比
較を図３に示す。この２つのタンパク質間の相同性は、用いたソフトウエアに依
存して５２．８％または５５．３％である。ｈｐａとｈｎｈｐ１との交差ハイブ
リダイゼーションは、非常に適度な洗浄条件のもとでさえ検出されなかった（図
５）。動物ブロット分析により、ｈｎｈｐ１遺伝子および他の関連する遺伝子（
これらは新しい遺伝子ファミリーを形成することがおそらく考えられる）が、哺
乳動物および鳥類を含む他の生物のゲノム内に存在することが明らかにされた。
ｈｎｈｐ１の染色体局在化が、Ｇ３放射ハイブリッドパネルを使用して、ヒト第
１０染色体においてＳＨＧＣ−５７７２１の隣りであることが決定された。これ
らの結果はまた、遺伝子の別のコピーの可能性または関連遺伝子の可能性を示し
ていた。ｈｎｈｐ１遺伝子は、リンパ節、脾臓、結腸および卵巣において低いレ
ベルで発現し；前立腺および小腸においてわずかに大きなレベルで発現し；そし
て精巣においてさらにより顕著なレベルで発現している。骨髄、肝臓、胸腺、扁
桃または白血球においては、用いたアッセイでは発現は検出されなかった。ヘパ
ラナーゼならびにｈｎｈｐ１のアミノ酸配列を用いたマウスＥＳＴデータベース
のスクリーニングにより、マウスのＥＳＴクローン（マウス胸腺に由来するクロ
ーン１３７８４５２、アクセション番号ＡＩ０１９２６９、配列番号８）が得ら
れた。しかし、このクローンは、そのオープンリーディングフレームを妨げる２
つのフレームシフト変異を含んでいる。
【００６０】 ｈｎｈｐ１およびヘパラナーゼのアミノ酸配列間における全体的な相同性は、
これらの２つのタンパク質が類似する機能を互いに有することを示唆している。
この２つのタンパク質間の相同性は７つの領域に集中している。これらは、タン
パク質の機能的ドメインを表し得る。変化性は、基質認識、細胞局在化および活
性パラメーターにおける潜在的な差を示唆し得る。
【００６１】 ヘパラナーゼと他のグリコシルヒドロラーゼとの間に全体的な相同性がないに
も関わらず、ＧＨ−Ａクランのグリコシルヒドロラーゼのプロトン供与体に特徴
的なアミノ酸対ａｓｐ−ｇｌｕ（ＮＥ、配列番号１３）が、ヘパラナーゼの２２
４位、２２５位において見出された。他のクランメンバーの場合のように、この
ＮＥ対はβ鎖の末端に存在している。図２に示されているように、ＮＥ対の周り
の領域は、ｈｎｈｐ１の予想されるアミノ酸配列において保存されている。この
ことは、ｈｎｈｐ１の産物がグリコシルヒドロラーゼであることを示唆している
。この定義は、多糖分解酵素（エキソ型またはエンド型のいずれかのグリコシダ
ーゼ）のいずれかを含み、そしてヘパラナーゼに対する類似性に基づいて、それ
はＧＡＧ分解酵素をコードすると考えられる。
【００６２】 さらに、ヘパラナーゼおよびｈｎｈｐ１のヒドロパシープロットの重ね合わせ
により、重なり合うパターンがこれらのタンパク質に沿って示される（図６）。
グリコシルヒドロラーゼに特徴的なアミノ酸配列が、アラインメントされたタン
パク質において、親水性ピーク内の同じ位置に存在している。ヒドロパシーパタ
ーンにおける顕著な差が、酵素のプロセシング部位を構成するヘパラナーゼのア
ミノ酸１５７、１５８の付近に認められる。ヘパラナーゼにおいて、この部位は
親水性ピークの頂上に位置しているが、ｈｎｈｐ１の等価領域はどちらかといえ
ば親水性ではない。ヘパラナーゼのアミノ酸１１０付近のピークが、ｈｎｈｐ１
のアミノ酸１３０付近にも見られる。この領域におけるヘパラナーゼの切断が、
酵素の活性化をもたらすことが示された。ｈｎｈｐ１のこの等価領域は、潜在的
なプロセシング部位であると考えられる。
【００６３】 ヘパラナーゼは、６７ｋＤａ形態のＮ末端に潜在的なシグナルペプチドを有し
ている。２つのタンパク質間の相同性はＮ端部では低く、シグナルペプチドはｈ
ｎｈｐ１ポリペプチドでは同定されなかった。
【００６４】 本発明の１つの局面により、配列番号１、４、６またはその一部と、６ｘＳＳ
Ｃ、１％ＳＤＳ、５ｘデンハルト、１０％デキストラン硫酸、１００μｇ／ｍｌ
サケ精子ＤＮＡおよび３２ｐ標識プローブにおいて６８℃でハイブリダイゼーシ
ョン可能であり、かつ３ｘＳＳＣ、１ｘＳＳＣまたは０．１ｘＳＳＣおよび０．
１％ＳＤＳを用いて６８℃で洗浄されるポリヌクレオチドを含む単離された核酸
が提供される。
【００６５】 本明細書中において、そして下記の請求項の節において使用されている用語「
一部（「ｐｏｒｔｉｏｎ」または「ｐｏｒｔｉｏｎｓ」）は、核酸またはアミノ
酸の連続した広がりをいう。そのような一部は、例えば、少なくとも９０ヌクレ
オチド（少なくとも３０アミノ酸に等しい）、少なくとも１２０ヌクレオチド（
少なくとも４０アミノ酸に等しい）、少なくとも１５０ヌクレオチド（少なくと
も５０アミノ酸に等しい）、少なくとも１８０ヌクレオチド（少なくとも６０ア
ミノ酸に等しい）、少なくとも２１０ヌクレオチド（少なくとも７０アミノ酸に
等しい）、少なくとも３００ヌクレオチド（少なくとも１００アミノ酸に等しい
）、少なくとも６００ヌクレオチド（少なくとも２００アミノ酸に等しい）、少
なくとも９００ヌクレオチド（少なくとも３００アミノ酸に等しい）、少なくと
も１，２００ヌクレオチド（少なくとも４００アミノ酸に等しい）、少なくとも
１，５００ヌクレオチド（少なくとも５００アミノ酸に等しい）、またはそれ以
上を含み得る。
【００６６】 本発明の別の局面により、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（
ＧＣＧ）（ウイスコンシン大学）によって開発されたＤＮＡ配列分析ソフトウエ
アパッケージのＢｅｓｔｆｉｔ法（ギャップ生成ペナルティー：５０、ギャップ
伸長ペナルティー：３）を使用して決定される配列番号１、４、６またはその一
部との同一性が少なくとも６０％（好ましくは少なくとも６５％、より好ましく
は少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、さらにまた好ましく
は少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なく
とも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％〜１００％）であるポリヌクレオ
チドを含む単離された核酸が提供される。
【００６７】 本発明のさらに別の局面により、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏ
ｕｐ（ＧＣＧ）（ウイスコンシン大学）によって開発されたＤＮＡ配列分析ソフ
トウエアパッケージのＢｅｓｔｆｉｔ法（ギャップ生成ペナルティー：５０、ギ
ャップ伸長ペナルティー：３）を使用して決定される配列番号３、５、７または
その一部との相同性が少なくとも６０％（好ましくは少なくとも６５％、より好
ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、さらにまた好
ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは
少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％〜１００％）であるポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸が提供される。
【００６８】 本明細書中において、そして下記の請求項の節において使用されている用語「
相同的」は、同一的＋類似的をいう。
【００６９】 本発明のさらなる局面により、本明細書中に記載されているポリヌクレオチド
によってコードされるポリペプチドを含む組換えタンパク質が提供される。
【００７０】 本発明による核酸は、相補的なポリヌクレオチド配列、ゲノムポリヌクレオチ
ド配列または複合ポリヌクレオチド配列であり得る。
【００７１】 本明細書中で使用されている表現「相補的なポリヌクレオチド配列」には、逆
転写酵素または任意の他のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用してメッセン
ジャーＲＮＡの逆転写から最初に生じる配列が含まれる。そのような配列は、続
いてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用してインビボまたはインビトロで増
幅することができる。
【００７２】 本明細書中で使用されている表現「ゲノムポリヌクレオチド配列」には、最初
は染色体に由来し、そして染色体の連続した一部を反映する配列が含まれる。
【００７３】 本明細書中で使用されている表現「複合ポリヌクレオチド配列」には、少なく
とも部分的に相補的であり、かつ少なくとも部分的にゲノム性である配列が含ま
れる。複合配列は、ポリペプチドをコードするために必要とされるいくつかのエ
キソン配列、ならびにそれらの間に介在するいくつかのイントロン配列を含むこ
とができる。イントロン配列は、他の遺伝子を含む任意の提供源のものとするこ
とができ、典型的には、保存されたスプライシングシグナル配列を含む。そのよ
うなイントロン配列はさらに、シス作用する発現調節エレメントを含み得る。
【００７４】 従って、本発明のこの局面は下記を包含する：（ｉ）配列番号１、４および６
に示されるポリヌクレオチド；（ｉｉ）そのフラグメントまたは一部；（ｉｉｉ
）それらとハイブリダイゼーション可能な配列；（ｉｖ）それらに対して相同的
な配列；（ｖ）それらに対応するゲノム配列および複合配列；（ｖｉ）異なるコ
ドン使用によって類似するポリペプチドをコードする配列；ならびに（ｖｉｉ）
１つまたは２つ以上のヌクレオチド（天然に存在するか、人為的に誘導されたか
のいずれか）の無作為または標的化様式のいずれかでの欠失、挿入または置換な
どの変異によって特徴付けられる変化した配列。
【００７５】 本発明のさらにまたさらなる局面により、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（ウイスコンシン大学）によって開発されたＤＮＡ配列
分析ソフトウエアパッケージのＢｅｓｔｆｉｔ法（ギャップ生成ペナルティー：
５０、ギャップ伸長ペナルティー：３）を使用して決定される配列番号３、５、
７またはその一部との相同性が少なくとも６０％（好ましくは少なくとも６５％
、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、さら
にまた好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好
ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％〜１００％）であ
るポリペプチドを含む組換えタンパク質が提供される。
【００７６】 本発明のさらにさらなる局面により、本明細書中に記載されている単離された
核酸を含む核酸構築物が提供される。
【００７７】 本発明の好ましい実施形態により、核酸構築物はさらに、単離された核酸の発
現をセンス方向またはアンチセンス方向で調節するためのプロモーターを含む。
そのようなプロモーターは、その下流に存在する配列を転写するＤＮＡ依存性Ｒ
ＮＡポリメラーゼに結合するのに役立つので、転写に必要とされるシス作用の配
列エレメントであることが知られている。そのような下流の配列は、リボザイム
装置によって翻訳可能なセンスＲＮＡの転写を生じさせるか、あるいは翻訳可能
な配列を典型的には含まず、しかし内因性配列（ｍＲＮＡまたは染色体ＤＮＡの
いずれか）との二重鎖または三重鎖を形成して、遺伝子発現を妨げることができ
るアンチセンスＲＮＡの転写を生じさせる２つの可能な向きのいずれか一方であ
り得る。これらはすべて下記にさらに記載されている。
【００７８】 本明細書中に記載されている単離された核酸は本発明の不可欠な要素であるが
、それはモジュール状であり、種々の範囲において使用することができる。本発
明とともに使用される選ばれたプロモーターは二次的に重要であり、任意の好適
なプロモーターを含む。しかし、転写開始部位がオープンリーディングフレーム
の上流に確実に存在しなければならないことは当業者によって理解されている。
本発明の好ましい実施形態において、選択されるプロモーターは、目的とする特
定の宿主細胞において活性であるエレメントを含む。このようなエレメントは、
熱ショックタンパク質（これに限定されない）を含む、ストレスまたは飢餓の条
件でこれらの宿主細胞の生存に不可欠な遺伝子の転写を活性化する転写調節因子
から選択され得る。
【００７９】 本発明による構築物は、好ましくは、適切な選択マーカーをさらに含む。本発
明によるより好ましい実施形態において、構築物はさらに複製起点を含む。本発
明による別の非常に好ましい実施形態において、構築物はシャトルベクターであ
る。これは、大腸菌（構築物が適切な選択マーカーおよび複製起点を含む場合）
において増殖することができ、そして選ばれた生物の細胞における増殖、または
選ばれた生物のゲノムにおける組み込みに対して適合し得る。本発明のこの局面
による構築物は、例えば、プラスミド、バクミド、ファージミド、コスミド、フ
ァージ、ウイルスまたは人工染色体であり得る。
【００８０】 あるいは、本発明のこの局面による核酸構築物は、正の選択マーカーおよび負
の選択マーカーをさらに含み、従って、ノックイン手法およびノックアウト手法
において用いられる相同的組換え（これに限定されない）を含む相同的組換え事
象を選択するために用いることができる。当業者は、構築物との相同的組換え事
象を経たトランスフェクションされた胚性幹細胞を効率的に選択するために正の
選択遺伝子と負の選択遺伝子との両方を含むノックアウト構築物またはノックイ
ン構築物を容易に設計することができる。そのような細胞は、キメラ体を作製す
るために発達中の胚に導入することができ、そしてその子孫を、ノックアウト構
築物またはノックイン構築物を有することについて調べることができる。本発明
によるノックアウト構築物および／またはノックイン構築物は、新しい遺伝子の
機能性をさらに検討するために使用することができる。そのような構築物はまた
、必要に場合には、不完全な機能的対立遺伝子の活性を破壊するか、または機能
的対立遺伝子の増大を破壊するか、または生物におけるサイレントな対立遺伝子
の活性の喪失を置き換え、それによって活性をダウンレギュレーションまたはア
ップレギュレーションするために体細胞遺伝子治療および／または生殖細胞遺伝
子治療において使用することができる。ノックアウト構築物およびノックイン構
築物の構築および使用に関してさらに詳しいことは下記に見出すことができる：
Ｆｕｋｕｓｈｉｇｅ，Ｓ．およびＩｋｅｄａ，Ｊ．Ｅ．：Ｃｒｅ−ｌｏｘ部位に
特異的な組換えによる哺乳動物プロモーターの捕捉、ＤＮＡ Ｒｅｓ、３（１９
９６）、７３〜８０；Ｂｅｄｅｌｌ，Ｍ．Ａ．、Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｎ．Ａ．およ
びＣｏｐｅｌａｎｄ，Ｎ．Ｇ．：ヒト疾患のマウスモデル パートＩ：マウスに
おける遺伝子分析のための技術および供給源、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔ、１１（１９９７）、１〜１１；Ｂｅｒｍｉｎｇｈａｍ，Ｊ．Ｊ．
、Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ｓ．Ｓ．、Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｓ．、Ａｒｒｏｙｏ，Ｅ．
、Ｋａｌｌａ，Ｋ．Ａ．、Ｐｏｗｅｌｌ，Ｆ．Ｌ．およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ，
Ｍ．Ｇ．：Ｔｓｔ−１／Ｏｃｔ−６／ＳＣＩＰは末梢のミエリン形成における特
異な段階を調節し、正常な呼吸に必要である、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ、１０（１９
９６）、１７５１〜６２。これらは参考として本明細書中に組み込まれる。
【００８１】 本発明のさらにまた別の局面により、本明細書中に記載されているように、核
酸構築物またはその一部を含む宿主細胞または動物が提供される。宿主細胞（原
核生物および真核生物の両方）および生物を核酸構築物で形質転換する方法、な
らびに形質転換体（例えば、形質転換された細胞またはトランスジェニック動物
）の選択方法は、当業者には十分に知られている。さらに、トランスフェクショ
ンされると、そのような細胞および生物は、様々なクロマトグラフィー法および
ゲル電気泳動法（これらに限定されない）を含む知られている方法によってその
後精製され得る十分な量の組換えタンパク質の産生を行わせることを目的とし得
る。そのような精製された組換えタンパク質は、下記にさらに詳しく記載されて
いるように、抗体を誘発させるために役立ち得る。細胞および生物の形質転換方
法は参考文献４３に詳しく記載されており、一方、組換えタンパク質の精製方法
は参考文献５２に詳しく記載されている（ともに参考として本明細書中に組み込
まれる）。
【００８２】 本発明のさらに別の局面により、本明細書中に記載されている単離された核酸
と特異的にハイブリダイゼーション可能な少なくとも１７塩基、少なくとも１８
塩基、少なくとも１９塩基、少なくとも２０塩基、少なくとも２２塩基、少なく
とも２５塩基、少なくとも３０塩基または少なくとも４０塩基のオリゴヌクレオ
チドが提供される。
【００８３】 より短い核酸（２００ｂｐ未満の長さ、例えば、１７ｂｐ〜４０ｂｐの長さ）
のハイブリダイゼーションが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション、適
度なハイブリダイゼーションまたは穏和なハイブリダイゼーションによって行わ
れる。この場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、６ｘＳＳＣお
よび１％ＳＤＳまたは３Ｍ ＴＭＡＣＩ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６
．８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ
変性サケ精子ＤＮＡおよび０．１％脱脂粉乳のハイブリダイゼーション溶液、Ｔ ｍ よりも１℃〜１．５℃低いハイブリダイゼーション温度、Ｔｍよりも１℃〜１
．５℃低い温度における、３Ｍ ＴＭＡＣＩ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ６．８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、０．５％ＳＤＳの最終洗浄液に
よって行われる；適度なハイブリダイゼーションは、６ｘＳＳＣおよび０．１％
ＳＤＳまたは３Ｍ ＴＭＡＣＩ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、
１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ
精子ＤＮＡおよび０．１％脱脂粉乳のハイブリダイゼーション溶液、Ｔｍよりも
２℃〜２．５℃低いハイブリダイゼーション温度、Ｔｍよりも１℃〜１．５℃低
い温度における、３Ｍ ＴＭＡＣＩ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８
）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、０．５％ＳＤＳの最終洗浄液、６ｘＳＳ
Ｃの最終洗浄液、および２２℃での最終洗浄によって行われる；一方、穏和なハ
イブリダイゼーションは、６ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳまたは３Ｍ ＴＭＡＣＩ
、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６
）、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび０．１％脱脂
粉乳のハイブリダイゼーション溶液、３７℃でのハイブリダイゼーション温度、
６ｘＳＳＣの最終洗浄液、および２２℃での最終洗浄によって行われる。
【００８４】 本発明のさらなる局面により、本明細書中に記載されている単離された核酸と
逆向きに特異的にハイブリダイゼーションすることができ、それにより、ポリメ
ラーゼ連鎖反応などの核酸増幅反応においてその一部の指数関数的な増幅を行わ
せるような、それぞれが独立して少なくとも１７塩基、少なくとも１８塩基、少
なくとも１９塩基、少なくとも２０塩基、少なくとも２２塩基、少なくとも２５
塩基、少なくとも３０塩基または少なくとも４０塩基である１対のオリゴヌクレ
オチドが提供される。ポリメラーゼ連鎖反応および他の核酸増幅反応はこの分野
では十分に知られており、本明細書中ではさらなる説明を必要としない。本発明
のこの局面による１対のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、適合し得る融解温
度（Ｔｍ）を有するように、例えば、７℃未満、好ましくは５℃未満、より好ま
しくは４℃未満、最も好ましくは３℃未満、理想的には３℃〜０℃だけ異なる融
解温度を有するように選択される。従って、本発明のさらにまたさらなる局面に
より、本明細書中に記載されているプライマー対を使用して得られる核酸増幅産
物が提供される。そのような核酸増幅産物は、ゲル電気泳動またはサイズに基づ
く任意の他の分離技術によって単離することができる。あるいは、そのような核
酸増幅産物は、鎖親和性または配列親和性のいずれかのアフィニティー分離によ
って単離することができる。さらに、単離されると、そのような産物は、活性の
アップレギュレーションおよび／またはダウンレギュレーションに関連する多数
の適用のいずれかに役立たせるために、制限、連結などによってさらに遺伝子操
作することができる。
【００８５】 本発明のさらにさらなる局面により、（ｉ）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅ
ｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（ウイスコンシン大学）によって開発されたＤＮＡ配
列分析ソフトウエアパッケージのＢｅｓｔｆｉｔ法（ギャップ生成ペナルティー
：５０、ギャップ伸長ペナルティー：３）を使用して決定される配列番号３、５
、７またはその一部との相同性が少なくとも６０％（好ましくは少なくとも６５
％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、さ
らにまた好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より
好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％〜１００％）で
あるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド鎖の一部；または（ｉｉ）Ｇｅ
ｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（ウイスコンシン大学）
によって開発されたＤＮＡ配列分析ソフトウエアパッケージのＢｅｓｔｆｉｔ法
（ギャップ生成ペナルティー：１２、ギャップ伸長ペナルティー：４）を使用し
て決定される配列番号１、４、６またはその一部との同一性が少なくとも６０％
（好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ま
しくは少なくとも７５％、さらにまた好ましくは少なくとも８０％、より好まし
くは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少な
くとも９５％〜１００％）であるポリヌクレオチド鎖の一部と、生理学的条件の
もと、インビボでハイブリダイゼーションし得る少なくとも１０塩基（好ましく
は１０塩基〜１５塩基の間、より好ましくは５０塩基〜２０塩基の間、最も好ま
しくは少なくとも１７塩基、少なくとも１８塩基、少なくとも１９塩基、少なく
とも２０塩基、少なくとも２２塩基、少なくとも２５塩基、少なくとも３０塩基
または少なくとも４０塩基）のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナロ
グを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。
【００８６】 そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、下記にさらに詳述されている
ように遺伝子発現をダウンレギュレーションするために使用することができる。
そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、固相オリゴヌクレオチド合成を
使用して容易に合成することができる。
【００８７】 選択された所定の配列を有する化学合成されたオリゴヌクレオチドおよびその
アナログの能力は、遺伝子発現をダウンレギュレーションするための手段を提供
する。これらのタイプの遺伝子発現調節方法が検討され得る。
【００８８】 転写レベルにおいて、ゲノムＤＮＡに鎖置換または三重鎖形成によって結合す
るアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドまたはアナ
ログは転写を阻止し得る。転写物レベルにおいて、標的ｍＲＮＡ分子に結合する
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアナログは、細胞内ＲＮａｓｅＨによる
ハイブリッドの酵素的切断をもたらす。この場合、標的化されたｍＲＮＡにハイ
ブリダイゼーションすることによって、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレ
オチドアナログは、ＲＮａｓｅＨ酵素によって認識および破壊される二重鎖ハイ
ブリッドを提供する。あるいは、そのようなハイブリッド形成は、正しいスプラ
イシングの妨害をもたらし得る。その結果、両方の場合において、翻訳に使用さ
れる標的ｍＲＮＡの完全な転写物の数が減少または除去される。翻訳レベルにお
いて、標的ｍＲＮＡ分子に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアナ
ログは、不可欠な翻訳因子（リボソーム）の標的ｍＲＮＡ分子への結合を立体的
な障害によって阻止する。これは、そのようなｍＲＮＡの翻訳を不能にするハイ
ブリダイゼーションアレストとしてこの分野では知られている現象である。
【００８９】 従って、アンチセンス配列は、本明細書中上記に記載されているように、それ
らの特異的な配列に依存して任意の内因性遺伝子および／または外因性遺伝子の
発現を停止させ得るので、アンチセンス法を新しい薬理学的ツールに開発するこ
とに専念している科学者および薬理学者によって大きく注目された。
【００９０】 例えば、いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、造血細胞の増殖、成
長、細胞周期のＳ期への進入、低下した生存性を停止させ、そして受容体媒介の
応答を妨げることが示されている。
【００９１】 アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアナログを使用して遺伝子発現を効率
的にインビボで阻害するためには、オリゴヌクレオチドまたはアナログは下記の
条件を満足しなければならない：（ｉ）標的配列に対する結合における十分な特
異性；（ｉｉ）水溶性；（ｉｉｉ）細胞内および細胞外のヌクレアーゼに対する
安定性；（ｉｖ）細胞膜を通り抜ける能力；および（ｖ）生物を処置するために
使用される場合における低い毒性。
【００９２】 修飾されていないオリゴヌクレオチドは、典型的には、アンチセンス配列とし
て使用することに関して実施することができない。これは、そのようなオリゴヌ
クレオチドは、インビボでの半減期が短く、その間にヌクレアーゼによって迅速
に分解されるからである。さらに、そのようなオリゴヌクレオチドは、ミリグラ
ム以上の量で調製することが困難である。さらに、そのようなオリゴヌクレオチ
ドは細胞膜の浸透性が良くない。
【００９３】 従って、上記に列記されたすべての条件を満たすために、オリゴヌクレオチド
アナログを好適な様式で考案しなければならないことは明かである。従って、修
飾型オリゴヌクレオチドに対する広範な研究が開始されている。
【００９４】 例えば、三重らせんの形成による二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）認識に関連して
生じる問題は、巧妙な「スイッチバック」化学結合によって小さくなっている。
これにより、一方の鎖におけるポリプリンの配列が認識され、そして「スイッチ
ングバック」により、反対側の鎖におけるホモプリン配列が認識され得る。また
、良好ならせん形成が、人工塩基を使用し、それによりイオン強度およびｐＨに
関して結合条件を改善することによって得られている。
【００９５】 さらに、半減期ならびに膜浸透性を改善するために、ポリヌクレオチド骨格に
おける非常に多くの変化が行われている。それにも関わらず、ほとんど成功して
いない。
【００９６】 オリゴヌクレオチドは、塩基部、糖部またはリン酸基部のいずれかにおいて修
飾することができる。これらの修飾には、例えば、メチルホスホナート、モノチ
オホスホナート、ジチオホスホナート、ホスホラミダート、リン酸エステル、架
橋されたホスホロチオアート、架橋されたホスホラミダート、架橋されたメチレ
ンホスホナート、ならびにシロキサン架橋、カルボナート架橋、カルボキシメチ
ルエステル架橋、カルボナート架橋、カルボキシメチルエステル架橋、アセトア
ミド架橋、カルバマート架橋、チオエーテル架橋、スルホキシ架橋、スルホノ架
橋、様々な「プラスチック」ＤＮＡ、α−アノマー架橋およびホウ素誘導体を伴
うデホスホインターヌクレオチドアナログを使用することが含まれる。
【００９７】 国際特許出願公開ＷＯ ８９／１２０６０には、そのような組み立てブロック
を規定された配列で連結することによって形成されるオリゴヌクレオチドアナロ
グならびにオリゴヌクレオチドアナログを合成するための様々な組み立てブロッ
クが開示されている。これらの組み立てブロックは、「堅い」（すなわち、環構
造を含む）または「柔軟」（すなわち、環構造を有しない）のいずれかであり得
る。両方の場合において、組み立てブロックはヒドロキシ基およびメルカプト基
を含有し、これらを介して、組み立てブロックは、オリゴヌクレオチドアナログ
を形成させるために結合させられると記載されている。オリゴヌクレオチドアナ
ログにおける連結成分は、スルフィド（−Ｓ−）、スルホキシド（−ＳＯ−）お
よびスルホン（−ＳＯ２−）からなる群から選択される。
【００９８】 国際特許出願公開ＷＯ ９２／２０７０２は、選択された化学核塩基またはア
ナログのいずれかが連なり、そして天然のＤＮＡまたはＲＮＡの場合のように暗
号文字として役立つペプチド骨格を含む非環状オリゴヌクレオチドを記載してい
る。これらの新しい化合物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）として知られており、細
胞内において、それらの天然の対応物よりも安定であるだけでなく、天然のＤＮ
ＡおよびＲＮＡと、天然核酸の結合よりも５０倍〜１００倍強く互いに結合する
。ＰＮＡオリゴマーは、メリーフィールド固相ペプチド合成によって、チミン、
シトシン、アデニンおよびグアニンを含有する４つの保護されたモノマーから合
成することができる。水溶性を増大させ、かつ凝集を防止するために、リシンの
アミノ基がＣ末端領域に置かれ、そしてＰＥＧ化され得る。
【００９９】 従って、アンチセンス技術は、翻訳を阻害する二重らせんを形成するためにメ
ッセンジャーＲＮＡがオリゴヌクレオチドと対形成することを必要とする。アン
チセンスによって媒介される遺伝子治療の概念は、ガン治療のために１９７８年
に既に導入されていた。この方法は、ガン細胞の細胞分裂および増殖において極
めて重要ないくつかの遺伝子に基づいていた。遺伝物質ＤＮＡの合成フラグメン
トによってこの目的が達成され得る。そのような分子は、腫瘍細胞のＲＮＡ内の
標的化された遺伝子分子に結合し、それによって、遺伝子の翻訳を阻害して、こ
れらの細胞の機能不完全な増殖をもたらす。他の機構もまたいくつか提案されて
いる。これらの方法は、ガンの処置、ならびにウイルス疾患および他の感染性疾
患を含む他の病気の処置において使用され、ある程度の成功を収めている。アン
チセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には１３ヌクレオチド〜３０ヌクレオチ
ドの長さで合成される。血液中におけるオリゴヌクレオチド分子の寿命期間はか
なり短い。従って、オリゴヌクレオチド分子は、体内に存在する遍在性のヌクレ
アーゼによる分解を妨げるために化学修飾されなければならない。ホスホロチオ
アートは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの進行中の臨床試験において非常に
広く使用されている修飾である。新世代のアンチセンス分子は、合成ＤＮＡの中
心部分を有するハイブリッドアンチセンスオリゴヌクレオチドからなり、同時に
、各末端における４つの塩基が、ＲＮＡに類似させるために２’Ｏ−メチルリボ
ースによって修飾されている。実験室動物における前臨床研究において、そのよ
うな化合物は、第１世代の未修飾型ホスホロチオアートと比較した場合、体組織
における代謝に対する大きくなった安定性、および改善された安全性プロフィル
を示している。数十の他のヌクレオチドアナログもまたアンチセンス技術におい
て試験されている。
【０１００】 ＲＮＡオリゴヌクレオチドもまた、標的との安定なＲＮＡ−ＲＮＡ二重鎖を形
成するのでアンチセンス阻害のために使用することができる。このことは効率的
な阻害を示唆している。しかし、それらの低い安定性のために、ＲＮＡオリゴヌ
クレオチドは、典型的には、この目的のために設計されたベクターを使用して細
胞の内部において発現される。この方法は、大量に存在する長寿命のタンパク質
をコードするｍＲＮＡを標的化することを試みる場合には好都合である。
【０１０１】 最近の科学刊行物は、肝炎、ガン、冠状動脈再狭窄および他の疾患の動物モデ
ルにおけるアンチセンス化合物の効き目の有効性を評価している。最初のアンチ
センス薬物が最近ＦＤＡによって承認された。Ｉｓｉｓによって開発されたこの
薬物（フォミビルセン：Ｆｏｍｉｖｉｒｓｅｎ）は、ＣＭＶ網膜炎に対する他の
処置に対して不耐性であるか、またはそのような処置に対して禁忌者であるか、
あるいはＣＭＶ網膜炎に対する以前の処置に対して不十分な応答性であったＡＩ
ＤＳ患者におけるサイトメガロウイルスの局所的処置に対して指示されている（
Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ Ｎｅｗｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ）。
【０１０２】 いくつかのアンチセンス化合物が、現在、米国において臨床試験中である。こ
れらには、局所投与される抗ウイルス剤、全身的なガン治療剤が含まれる。アン
チセンス治療法は、従来の薬物を上回る数多くの利点とともに、命を脅かす多く
の疾患を処置する可能性を有している。従来の薬物は、疾患原因タンパク質が形
成された後に介入する。しかし、アンチセンス治療剤は、ｍＲＮＡの転写／翻訳
を阻止するので、タンパク質が形成される前に介入する。アンチセンス治療剤は
１つの特定のｍＲＮＡのみを標的化するので、アンチセンス治療剤は、現在のタ
ンパク質阻害治療よりも少ない副作用により、より効果的であるはずである。
【０１０３】 転写レベルで遺伝子発現を中断させるための第２の選択肢により、二本鎖ＤＮ
Ａとハイブリダイゼーションし得る合成オリゴヌクレオチドが使用される。三重
らせんが形成される。そのようなオリゴヌクレオチドは、遺伝子のプロモーター
に対する転写因子の結合を妨げ、従って転写を阻害することができる。あるいは
、そのようなオリゴヌクレオチドは、二重鎖がほどけることを妨げ、従って、三
らせん構造内の遺伝子の転写を妨げることができる。
【０１０４】 従って、本発明のさらなる局面により、本明細書中に記載されているアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む薬学的組成物
が提供される。薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、アンチセンスオリゴヌ
クレオチドが負荷されたリポソームであり得る。局所投与される配合物には、ロ
ーション、軟膏、ゲル剤、クリーム、坐薬、ドロップ剤、液剤、スプレー剤およ
び粉末剤が含まれ得るが、これらに限定されない。従来の薬学的キャリア、水性
、粉末または油性の基剤、増粘剤などが必要または所望され得る。経口投与され
る組成物には、粉末剤または顆粒剤、水または非水性媒体における懸濁剤または
溶液剤、サッシェ剤、カプセル剤または錠剤が含まれる。増粘剤、希釈剤、風味
剤、分散助剤、乳化剤または結合剤が所望され得る。非経口投与用の配合物には
、緩衝剤、希釈剤および他の好適な添加剤をも含有し得る滅菌された水溶液が含
まれ得るが、これに限定されない。
【０１０５】 本発明のさらにさらなる局面により、本明細書中に記載されているアンチセン
スオリゴヌクレオチドと、それに融合したリボザイム配列とを含むリボザイムが
提供される。そのようなリボザイムは、固相オリゴヌクレオチド合成を使用して
容易に合成することができる。
【０１０６】 リボザイムは、目的とするタンパク質をコードするｍＲＮＡの切断による遺伝
子発現の配列特異的な阻害のためにますます使用されている。任意の特定の標的
ＲＮＡを切断するリボザイムを設計できることにより、リボザイムは、基礎的な
研究および治療的適用の両方で有用なツールになっている。治療領域において、
リボザイムは、感染性疾患におけるウイルスＲＮＡ、ガンにおける優勢なガン遺
伝子、および遺伝子疾患における特定の体細胞変異を標的化するために利用され
ている。最も注目されることに、ＨＩＶ患者に対するいくつかのリボザイム遺伝
子治療プロトコルが既に第１相試験にある。より近年に、リボザイムは、トラン
スジェニック動物研究、遺伝子標的有効性評価および経路解明のために使用され
ている。いくつかのリボザイムが臨床試験の様々な段階にある。ＡＮＧＩＯＺＹ
ＭＥは、ヒトの臨床試験において研究され得る最初に化学合成されたリボザイム
であった。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、血管形成経路における重要な成分であるＶＥ
ＧＦ−ｒ（血管内皮増殖因子受容体）の形成を特異的に阻害する。Ｒｉｂｏｚｙ
ｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．ならびに他の企業が、動物モ
デルにおける抗血管形成治療剤の重要性を明らかにしている。ＨＥＰＴＡＺＹＭ
Ｅは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを選択的に破壊するように設計された
リボザイムであり、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡを細胞培養アッセイで減少させるこ
とにおいて効果的であることが見出された（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ−ＷＥＢホームページ）。
【０１０７】 本発明のさらに別の局面により、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏ
ｕｐ（ＧＣＧ）（ウイスコンシン大学）によって開発されたＤＮＡ配列分析ソフ
トウエアパッケージのＢｅｓｔｆｉｔ法（ギャップ生成ペナルティー：５０、ギ
ャップ伸長ペナルティー：３）を使用して決定される配列番号３、５、７または
その一部との相同性（同一性＋類似性）が少なくとも６０％（好ましくは少なく
とも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも７
５％、さらにまた好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５
％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％〜１０
０％）であるポリペプチドを特異的に認識して結合する免疫グロブリンを含む抗
体が提供される。本発明のこの局面の好ましい実施形態により、抗体は、配列番
号３、５、７またはその一部に示されるポリペプチドを特異的に認識して結合す
る。
【０１０８】 本発明は、血清免疫グロブリン、ポリクローナル抗体またはそのフラグメント
（すなわち、抗体の免疫反応性誘導体）、あるいはモノクローナル抗体またはそ
のフラグメントを利用することができる。モノクローナル抗体、あるいは抗原結
合領域の一部を少なくとも有するモノクローナル抗体の精製されたフラグメント
（これらには、Ｆｖ、Ｆ（ａｂｌ）２、Ｆａｂの各フラグメント（Ｈａｒｌｏｗ
およびＬａｎｅ、１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ）、単鎖抗体（米国特許第４，９４６，７７８号）、キメラ抗体または
ヒト化抗体、および相補性決定領域（ＣＤＲ）などが含まれる）は、従来の手法
によって調製することができる。これらの血清免疫グロブリン抗体またはフラグ
メントの精製は、当業者に知られている様々な方法によって達成され得る。その
ような方法には、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムによる沈殿化、その後
の生理食塩水に対する透析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィーまたは免疫アフィニティークロマトグラフィー、ならびにゲル
ろ過、ゾーン電気泳動などが含まれる（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第
２版）、１０４頁〜１２６頁、１９８６年、Ｏｒｌａｎｄｏ、Ｆｌａ、Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。正常な生理学的条件のもとで、抗体は、
血漿および他の体液において、そしてある種の細胞の膜において見出され、Ｂ細
胞と呼ばれるタイプのリンパ球またはその機能的等価体によって産生される。Ｉ
ｇＧクラスの抗体は、ジスルフィド結合によってともに連結された４つのポリペ
プチド鎖から構成される。完全なＩｇＧ分子の４つの鎖は、Ｈ鎖として示される
２つの同一な重鎖、およびＬ鎖として示される２つの同一な軽鎖である。さらな
るクラスには、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよび関連するタンパク質が含
まれる。
【０１０９】 モノクローナル抗体の作製および選択に関する方法は、例えば、Ｔｒａｍｏｎ
ｔａｎｏおよびＳｃｈｌｏｅｄｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、１７８、５５１〜５６８、１９８９年などの総説にまとめられているよう
にこの分野では十分に知られている。本発明の組換えタンパク質は、インビトロ
で抗体を作製するために使用することができる。より好ましくは、本発明の組換
えタンパク質は、インビボで抗体を誘発させるために使用される。一般には、好
適な宿主動物が本発明の組換えタンパク質で免疫化される。好都合には、使用さ
れる動物宿主は同系交配系統のマウスである。動物は、典型的には、生理学的に
受容可能なビヒクルにおける本発明の組換えタンパク質の溶液と、免疫原に対す
る増強された免疫応答を達成する任意の好適なアジュバントとを含む混合物で免
疫化される。例として、一次免疫化が、本発明の組換えタンパク質の溶液とフロ
イント完全アジュバントとの混合物を用いて都合良く達成され得る。この場合、
前記混合物は油中水型エマルションの形態で調製される。典型的には、免疫化は
、筋肉内に、皮内に、皮下に、腹腔内に、肉趾内に、または任意の適切な投与経
路によって動物に施される。免疫原の免疫化スケジュールは、必要に応じて適合
化され得るが、通例的には、フロイント不完全アジュバントなどのより穏和なア
ジュバントを使用する数回のその後の免疫化または二次免疫化を含む。抗体の力
価および組換えタンパク質に対する結合特異性が、例として、放射免疫アッセイ
または酵素結合免疫吸着アッセイ（これはＥＬＩＳＡアッセイとして知られてい
る）を含む任意の便利な方法によって免疫化スケジュールの途中で測定され得る
。好適な抗体力価が達成された場合、免疫化動物に由来する抗体産生リンパ球が
得られ、そして抗体産生リンパ球は、この分野で知られているように、培養、選
抜およびクローン化が行われる。典型的には、リンパ球は免疫化動物の脾臓から
大量に得ることができるが、循環、リンパ節または他のリンパ様器官からもまた
回収することができる。その後、リンパ球は、この分野で十分に知られているよ
うに、ハイブリドーマを得るために任意の好適なミエローマ細胞株と融合させら
れる。あるいは、リンパ球はまた、確立されたプロトコルに従って、培養状態で
増殖させるために刺激することができ、そしてウイルス、化学薬品、またはガン
遺伝子などの核酸にこれらのリンパ球をさらすことを含むこの分野で知られてい
る方法によって不死化され得る。融合後、ハイブリドーマは、例えば、マルチウ
エルプレートにおいて好適な培養条件のもとで培養され、そして培養上清が、選
ばれたハプテンを認識する抗体を含有する培養物を同定するためにスクリーニン
グされる。本発明の組換えタンパク質を認識する抗体を分泌するハイブリドーマ
が、適切な培養条件のもとで、限界希釈によってクローン化され、そして拡大培
養される。モノクローナル抗体は精製され、そして免疫グロブリンのタイプおよ
び結合親和性に関して特徴付けられる。
【０１１０】 本発明のさらなる様々な目的、利点および新規な特徴は、限定することを意図
しない下記の実施例を検討したときに当業者には明らかになる。さらに、上記に
概略され、そして下記の請求項の節において記載されている本発明の様々な実施
形態および局面はそれぞれ、下記の実施例において実験的に裏付けられている。
【０１１１】 実施例 次に、下記の実施例が参照される。下記の実施例は、上記の説明とともに、非
限定的な様式で本発明を例示する。
【０１１２】 一般に、本明細書中に記載されている命名法、および下記に記載されている組
換えＤＮＡ技術における実験室手法は、この分野で十分に知られているものであ
り、かつ広く用いられている。標準的な技術が、クローニング、ＤＮＡおよびＲ
ＮＡの単離、増幅および精製のために使用されている。一般に、ＤＮＡリガーゼ
、ＤＮＡポリメラーゼおよび制限エンドヌクレアーゼなどを含む酵素反応は、製
造者の説明書に従って行われている。これらの技術および様々な他の技術は、一
般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８
９年）に従って行われている（これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
他の一般的な参考文献が本明細書中に提供されている。それらの手法は、この分
野では十分に知られていると考えられ、読者の便宜を図るために提供されている
。それらに含まれる情報はすべて、参考として本明細書中に組み込まれる。
【０１１３】 材料および実験方法 下記のプロトコルおよび実験の細部が下記の実施例において参照される： プライマーの一覧： hn11116 5’−GGAGAGCAAGTCTGTGTTGATTC−3’ （配列番号１０） hn11230 5’−CACTGGTAGCCATGAGTGTGAG−3’ （配列番号１１） hn1u350 5’−TTGGTCATCCCTCCAGTCACCA−3’ （配列番号１２） pn9−312u 5’−CTTGCCTGTAGACAGAGCTGCAG−3’ （配列番号１４） hpu−685 5’−GAGCAGCCAGGTGAGCCCAAGA−3’ （配列番号１６） hp1967 5’−TCAGATGCAAGCAGCAACTTTGGC−3’ （配列番号１７） mn1u118 5’−CACCCTGATGTCATGCTGGAG−3’ （配列番号１８） mn11563 5’−CATCTAGGAGAGCAATGACGTTC−3’ （配列番号１９） Ap1 5’−CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC−3’ （配列番号２０） Ap2 5’−ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC−3’ （配列番号２１）
【０１１４】 サザン分析： ゲノムＤＮＡを、血液および細胞培養ＤＮＡｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎｅ
）を使用して動物またはヒト血液から抽出した。ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、
ゲル電気泳動によって分離し、そしてナイロンメンブランＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋（
Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。ＰＣＲ産物を同様な手順で処理した。ハイブリダ
イゼーションを、６ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５ｘデンハルト、１０％デキストラ
ン硫酸、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび３２ｐ標識プローブにおいて６
８℃で行った。１６２ヌクレオチドを除くオープンリーディングフレーム全体（
ｄｅｌ：４７３〜６３４、配列番号１）を含有するｐｎ９（１．７ｋｂフラグメ
ント）をプローブとして使用した。ハイブリダイゼーション後、メンブランを、
３ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて６８℃で洗浄し、Ｘ線フィルムに３日間感
光させた。その後、メンブランを、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて６
８℃で洗浄して、４日間にわたって再感光した。
【０１１５】 ＲＴ−ＰＣＲ： ＲＮＡを、製造者の説明書に従ってＴＲＩ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｃ．）を使用して調製した。１．２５μｇを、
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）およびオリゴ（
ｄＴ）１５プライマー（配列番号２２）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用する逆転写反
応のために用いた。得られた第１鎖ｃＤＮＡの増幅を、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ）を用いて、あるいはＥｘｐａｎｄ高忠実性（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて行った。
【０１１６】 ｃＤＮＡ配列分析： 配列決定を、ベクター特異的プライマーおよび遺伝子特異的プライマーを用い
て、自動化されたＤＮＡ配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
、モデル３７３Ａ）を使用して行った。各ヌクレオチドを少なくとも２つの独立
したプライマーから読んだ。コンピューター処理および配列分析およびアライン
メントを、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（ウイス
コンシン大学）によって開発されたＤＮＡ配列分析ソフトウエアパッケージを使
用して行った。２つの配列のアラインメントを、Ｂｅｓｔｆｉｔ（ギャップ生成
ペナルティー：１２、ギャップ伸長ペナルティー：４）を使用して、あるいはＧ
ａｐプログラム（ギャップ生成ペナルティー：５０、ギャップ伸長ペナルティー
：３）を用いて行った。
【０１１７】 組織分布： ｈｎｈｐ１転写物の組織分布を半定量的ＰＣＲによって決定した。ｃＤＮＡパ
ネルをＣｌｏｎｔｅｃｈから得た。ＰＣＲを、遺伝子に特異的なプライマーのｈ
ｎ１ｕ３５０（配列番号１２）およびｈｎ１１１１６（配列番号１０）を用いて
行った。ＰＣＲプログラムは下記の通りであった：９４℃で３分間、その後、９
４℃で４５秒間、６４℃で１分間、７２℃で１分間の４０サイクル。サンプルを
、２５サイクル、３０サイクル、３５サイクルおよび４０サイクルの後でさらな
る分析のために採取した。
【０１１８】 染色体局在化： ｈｎｈｐ１の染色体局在化を、放射ハイブリッドパネルのＳｔａｎｆｏｒｄ
Ｇ３を使用して行った。このパネルは、Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
のヒトゲノムセンターによって提供された。ｈｎｈｐ１遺伝子の２２５ｂｐのゲ
ノムフラグメントを、遺伝子に特異的なプライマーのｈｎ１ｕ３５０（配列番号
１２）およびｈｎ１１１１６（配列番号１０）を使用して増幅した。ＰＣＲプロ
グラムは下記の通りであった：９４℃で３分間、その後、９４℃で４５秒間、６
４℃で１分間、７２℃で１分間の３９サイクル。結果の分析を、Ｓｔａｎｆｏｒ
ｄヒトゲノムセンターのＲＨサーバーによって行った。
【０１１９】 実施例１ 新規なヘパラナーゼ遺伝子に対するＥＳＴのクローニング ヒトヘパラナーゼのアミノ酸配列全体（配列番号９）を使用して、ヒトＥＳＴ
データベースを相同的な配列についてスクリーニングした。スクリーニングを、
ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ２．０サーバー、ベーシックＢＬＡＳＴサーチ、ｔｂｌａ
ｓｔｎプログラムを使用して行った。
【０１２０】 相同性が遠いフラグメントが得られた：精巣Ｂ細胞および胎児胚から調製され
たＳｏａｒｅｓ ＮＦＬ Ｔ ＧＢＣ Ｓ１ヒトｃＤＮＡライブラリーに由来す
るアクセション番号ＡＩ２２２３２３、ＩＭＡＧＥクローン番号１８４３１５５
。この配列に対する検索値は下記の通りであった：スコア＝３８．３ビット（８
７）、予想＝０．１５、同一性＝１６／３６（４４％）、陽性＝２２／３６（６
０％）。アクセション番号ＡＩ２２２３２３の配列は、（配列番号２３のヌクレ
オチド１６５〜５４３に対して相補的な）クローン１８４３１５５の３’の３７
８ヌクレオチドを含有する。
【０１２１】 このクローンはＩＭＡＧＥコンソーシアムから購入した。これは、５６０ｂｐ
（配列番号２３）のインサートを含有した。全ヌクレオチド配列を決定して、ヒ
トヘパラナーゼをコードするｈｐａのｃＤＮＡと比較した。クローン１８４３１
５５とｈｐａ ｃＤＮＡとの相同性は、ｃＤＮＡクローンの３’領域に限定され
ていた。クローン１８４３１５５のヌクレオチド９９〜２７５（配列番号２３）
と、ｈｐａのヌクレオチド１５３２〜１７０８（配列番号２４）との相同性は５
９％であった。この領域の推定アミノ酸配列は、ヒトヘパラナーゼのアミノ酸４
８８〜５４２（配列番号９）に対して６０％の相同性（同一性＋類似性）を有し
ていた。下流の配列（ヌクレオチド２７６〜５６０、配列番号２３）は３’非翻
訳領域およびポリＡテールを表す。上流の配列（ヌクレオチド１〜９８、配列番
号２３）は、ヘパラナーゼとは関係がなかった。この関連しない配列が、同じラ
イブラリーに由来する１つの異なるｃＤＮＡクローンと同一であることが見出さ
れた。従って、ＩＭＡＧＥコンソーシアムから得られたヒトＥＳＴクローン１８
４３１５５は、１つのベクターに連結された２つの関連しない部分的なｃＤＮＡ
を含有するキメラであると考えられる。
【０１２２】 実施例２ 新規なヘパラナーゼ遺伝子のｃＤＮＡのクローニング 完全なｃＤＮＡを単離するために、３つのプライマーをクローン１８４３１５
５の配列に従って設計した。ｃＤＮＡを、製造者の説明書に従ってＭａｒａｔｈ
ｏｎ ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって胎盤ｃＤＮＡから増幅した。最初の
サイクルは、遺伝子特異的プライマーｈｎ１１１１６（配列番号１０）とユニバ
ーサルプライマーＡｐ１（配列番号２０）とを用いて行った。次のサイクルは、
遺伝子特異的プライマーｈｎ１１２３０（配列番号１１）とユニバーサルプライ
マーＡｐ２（配列番号２１）とを用いて行った。増幅後、約１．７ｋｂの広がっ
たバンドが得られた。このｃＤＮＡ増幅産物をｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にサブクローン化して、３つの独立したクロ
ーン（ｐｎ５、ｐｎ６およびｐｎ９）のヌクレオチド配列を決定した。最長ｃＤ
ＮＡ（ｐｎ６）のコンセンサス配列を図１に示す（配列番号１、２および３）。
これは、２０６０ヌクレオチドの長さであり、１７７６ヌクレオチドのオープン
リーディングフレームを含み、６６．５ｋＤａの計算された分子量を有する５９
２アミノ酸のポリペプチドをコードしている。この新しくクローン化された遺伝
子はｈｎｈｐ１と呼ばれた。２つのより短い形態のｐｎ９およびｐｎ５ならびに
それらの推定アミノ酸配列を配列番号４および６ならなびに配列番号５および７
にそれぞれ示す。ｐｎ９およびｐｎ５はｐｎ６と同一であったが、それらの一方
はそれぞれ、選択的スプライシングの結果としてのインフレームの欠失を含有し
ていた。ｐｎ９は、配列番号３のアミノ酸１５０〜２０３に対応する１６２ヌク
レオチド（配列番号１の４７３〜６３４）の欠失を含有する。その結果、ｐｎ９
は、計算された分子量が６０．４ｋＤａである５３８アミノ酸（配列番号５）の
仮想的なポリペプチドをコードする。ｐｎ５は、配列番号３のアミノ酸１５０〜
２６１に対応する３３６ヌクレオチド（配列番号１の４７３〜８０８）の欠失を
含有する。従って、これは、計算された分子量が５３．９ｋＤａである４８０ア
ミノ酸（配列番号７）の仮想的なポリペプチドをコードする。配列番号３の１１
番目のアミノ酸残基はメチオニンである。最初のメチオニンが哺乳動物における
翻訳開始部位として作用することが一般に受け入れられている。しかし、２番目
のＡＴＧの周りのヌクレオチドが翻訳開始部位に対するＫｏｚａｋコンセンサス
配列とより良好に一致している。従って、翻訳は、この２番目のメチオニンから
開始され、計算された分子量が６５．４ｋＤａである５８１アミノ酸のタンパク
質をもたらし得る。様々な長さの転写物の存在が、下記の２つの遺伝子特異的プ
ライマーを使用するｈｎ１ｈｐ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって確認された：５
’末端の近いところに位置するｐｎ９−３１２ｕ（配列番号１４）、およびオー
プンリーディングフレームの３’末端における停止コドンと重なるｈｎ１１２３
０（配列番号１１）。増幅を、胎盤および精巣から調製されたＭａｒａｔｈｏｎ
レディーｃＤＮＡから行った。ＰＣＲ産物を図３に示す。４つのバンドが胎盤か
ら得られた：ｐｎ９およびｐｎ６と類似している１．４５ｋｂおよび１．６ｋｂ
の２つの主バンド、およびｐｎ５に類似している１．３５ｋｂのバンドと１．８
ｋｂの別のバンドとの２つの微量バンド。後者の配列はまだ決定されていない。
精巣ｃＤＮＡの増幅は異なるパターンをもたらした。１．３５ｋｂ、１．６５ｋ
ｂ、１．８５ｋｂおよび２．０５ｋｂの４つのバンドが認められ、そして１．５
ｋｂの微量バンドが認められた。これらの様々な形態は、選択的スプライシング
の産物を表していることが考えられる。これまでに特徴付けられた欠失体がオー
プンリーディングフレームを保持しているので、これらの様々なｃＤＮＡの翻訳
産物はタンパク質ファミリーを構成し得る。ｈｎｈｐ１およびヘパラナーゼのア
ミノ酸配列間の比較を図３に示す。アミノ酸配列全体をアラインメントするＧＣ
Ｇパッケージのｇａｐプログラムを使用した場合、２つのタンパク質間の相同性
は４５．５％の同一性および７．３％の類似性であり、全体的な相同性は５２．
８％である（ギャップ生成ペナルティー：５０、ギャップ伸長ペナルティー：３
）。ＢｅｓｔＦｉｔプログラムにより、最も良い相同性の領域が２つの配列間に
明らかにされる。このプログラムを使用した場合、２つのアミノ酸配列間の相同
性は、ｈｎ１ｈｐ１の６３位（配列番号３）およびヘパラナーゼの４１位（配列
番号９）から始まり、そして４７．５％の同一性および７．８％の類似性である
（すなわち、５５．３％の相同性）。ｈｎｈｐ１およびｈｐａのヌクレオチド配
列間の相同性は、ＢｅｓｔＦｉｔプログラムによって計算された場合には５７％
である。相同的な領域は、ｈｎｈｐ１のヌクレオチド６３８〜１８１２（配列番
号１）とｈｐａのヌクレオチド５６４〜１７０８（配列番号２４）との間に存在
している。Ｇａｐプログラムを使用した場合、相同性は配列全体で５１％である
（ギャップ生成ペナルティー：５０、ギャップ伸長ペナルティー：３）。
【０１２３】 実施例３ 動物ブロット ｈｎｈｐ１のｃＤＮＡを、ヒトＤＮＡおよび様々な動物のＤＮＡにおける相同
的な配列を検出するためのプローブとして使用した。サザン分析のオートラジオ
グラムを図４に示す。数個のバンドがヒトＤＮＡにおいて検出された。数個の強
いバンドがすべての動物において検出されたが、かすかなバンドがニワトリにお
いて検出された。このことは、ヒトと、調べられた動物との系統発生的な関係と
相関している。強いバンドは、ｈｎｈｐ１が、哺乳動物の間に、そしてより遺伝
的に遠い生物において保存されていることを示している。多数のバンドのパター
ンは、すべての動物において、ｈｎｈｐ１の遺伝子座が大きなゲノム領域を占め
ていることを示唆している。数個の特定のバンドがストリンジェントな洗浄の後
で消失した。これらは相同的な配列を表していることが考えられる。このことは
、ここに報告されているヒトｈｎｈｐ１に対するそれらの相同性に基づいて単離
され得る遺伝子ファミリーの存在を示唆している。
【０１２４】 実施例４ 交差ハイブリダイゼーションによりヘパラナーゼとの比較 ストリンジェンシーが低い条件のもとでｈｐａおよびｈｎｈｐ１が交差ハイブ
リダイゼーションし得る可能性を調べるために、ヒトｈｐａおよびｈｎｈｐ１の
コード領域全体をＰＣＲによって増幅した。ヒトｈｐａを、ｈｐｕ−６８５（配
列番号１６）およびｈｐ１９６７（配列番号１７）のプライマーを使用するＲＴ
−ＰＣＲによって血小板ｍＲＮＡから増幅し、そしてｈｎｈｐ１を、ｈｎ１１２
３０（配列番号１１）およびｐｎ９−３１２ｕ（配列番号１４）のプライマーを
使用して精巣から増幅した。生成物を定量し、１００ｐｇおよび１ｎｇのサンプ
ルをアガロースゲルで泳動して、サザンハイブリダイゼーションに供した。メン
ブランを、３２ｐ標識ｈｐａ ｃＤＮＡおよびｈｎｈｐ１ ｃＤＮＡを用いてプ
ローブした。交差ハイブリダイゼーションは、５日間の感光を行った後でさえ認
められなかった（図５）。ｈｐａは、今日、ｈｎｈｐ１の配列に対して最も類似
した知られている配列であるので、この実験は、図４のオートラジオグラフにお
いて検出されたバンドは、ｈｎｈｐ１遺伝子またはそれに対して相同的な未だ知
られていない配列（これらは遺伝子ファミリーを構成し得る）に由来することを
示している。このことはさらに、そのような配列が、関連するライブラリーをス
クリーニングするためのプローブとしてｈｎｈｐ１を使用するか、あるいは関連
するｃＤＮＡ配列またはＤＮＡ配列を増幅するためのｈｎｈｐ１由来ＰＣＲプラ
イマーを使用して単離されることを示している。
【０１２５】 実施例５ 染色体局在化 ｈｎｈｐ１の染色体局在化を、Ｇ３放射ハイブリッドパネルを使用して決定し
た。ｈｎｈｐ１を８３個のヒト／マウスの放射ハイブリッドから増幅した。結果
をＲＨサーバーによって分析して、ｈｎｈｐ１遺伝子が、第１０染色体に対して
、マーカーＳＨＧＣ−５７７２１の隣りにマッピングされた。これらの結果はま
た、この遺伝子の別のコピーの可能性を示していた。
【０１２６】 実施例６ ｈｎｈｐ１の発現パターン ｈｎｈｐ１転写物の組織分布を、校正されたヒトｃＤＮＡパネル（Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａ）を使用して決定した。結果を下記の表１に
示す。発現レベルは一般に低い。ＰＣＲ産物が、４０サイクルの増幅の後におい
てのみ明瞭に認められた。 表 １ 組織 ｈｎ１（４０サイクル） 骨髄 肝臓 リンパ節 ＋ 白血球 脾臓 ＋ 胸腺 扁桃 結腸 ＋ 卵巣 ＋ 前立腺 ＋＋ 小腸 ＋＋ 精巣 ＋＋＋
【０１２７】 実施例７ マウスホモログのクローニング ヘパラナーゼならびにｈｎｈｐ１のアミノ酸配列を用いてマウスＥＳＴデータ
ベースをスクリーニングすることにより、マウスのＥＳＴクローンが得られた。
これは、ヘパラナーゼとの遠い相同性を有し、ｈｎｈｐ１と著しく大きな相同性
を有している。マウス胸腺に由来するＥＳＴクローン１３７８４５２（アクセシ
ョン番号ＡＩ０１９２６９）は、３５１ヌクレオチドの長さであり、配列番号８
に示されている。これは、ＧＣＧパッケージのＢｅｓｔＦｉｔプログラムを使用
して、ヒトのｈｐａヌクレオチド（配列番号２４）およびマウスのｈｐａヌクレ
オチド（配列番号１５）に対して１６１ヌクレオチド（１９１〜３５１、配列番
号８）にわたって６１％〜６３％の同一性を有し、ｈｎｈｐ１ヌクレオチド配列
（配列番号１）に対して９３％の同一性を有している。このクローンのヌクレオ
チド配列はオープンリーディングフレームを含んでいなかった。２つのフレーム
シフトが、ｈｎｈｐ１配列と比較した場合、ＥＳＴデータベースで見出された配
列において同定された。このフレームシフトは、その後、このクローンのヌクレ
オチド配列分析によって、そしてこのフラグメントをＢＬ６マウスメラノーマ細
胞から単離して、そのヌクレオチド配列を決定することによって確認された。こ
のマウス遺伝子は非常に低いレベルで転写されている。低いレベルの発現が示さ
れた。そのため、増幅産物は、４０サイクルのＰＣＲの後、マウスの心臓、脳、
脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣、ならびに７日目、１１日目、１５日目お
よび１７日目の胚に由来するｃＤＮＡを含むマウスｃＤＮＡパネル（Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａ）から得られなかった。増幅は、遺伝子特異
的プライマーのｍｎ１ｕ１１８（配列番号１８）およびｍｎ１１５６３（配列番
号１９）を使用して行った。
【０１２８】 実施例８ 哺乳動物細胞におけるｈｎｈｐ１の発現 哺乳動物発現ベクターを、ｈｎｈｐ１をヒト細胞において過剰発現させるため
に構築した。ｈｎｈｐ１の翻訳産物を検出するために、ｈｎｈｐ１発現ベクター
を、Ｃ末端が標識されたｈｎ１タンパク質をコードするように設計した。８アミ
ノ酸のＦＬＡＧ（Ｋｏｄａｋ）をコードするＤＮＡ配列を、ｈｎｈｐ１のオープ
ンリーディングフレームの３’端に融合した。
【０１２９】 ＦＬＡＧ配列のｈｎｈｐ１コード配列への融合は、プライマーｈｎ１−ｃ−ｆ
ｌａｇ：５’−Ａ−３’（配列番号２５）およびプライマー：ｐｎ９−３１２ｕ
（配列番号１４）を使用するＰＣＲ増幅によって得られた。ＰＣＲプログラムは
下記の通りであった：９４℃で３分間、その後、９４℃で４５秒間、５０℃で４
５秒間および７２℃で２分間の５サイクル、その後、９４℃で４５秒間、６４℃
で４５秒間および７２℃で２分間の３２サイクル。
【０１３０】 増幅産物をｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙにサブクローン化して、その配列を確認し
た。得られたプラスミドはｐＧＥＭ−ｐｎ６ＦおよびｐＧＥＭ−ｐｎ９Ｆと呼ば
れた。
【０１３１】 ２つの構築物をｐＳＩ哺乳動物発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）において作製
した：第１の構築物は完全なｈｎｈｐ１配列（ｐｎ６）を含有し、第２の構築物
は選択的スプライシング形態（ｐｎ９）を含有した。ｐＳＩ−ｐｎ６発現ベクタ
ーを下記フラグメントの三重連結によって構築した：ｐＧｅｍ−Ｔ−ｅａｓｙ−
ｐｎ９から切り出される、ｈｎ１−ｐｎ６の５’端を含有するＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩフラグメント、ｐＧＥＭ−ｐｎ６Ｆから切り出される、３’ＦＬＡＧ標識
ｈｎｈｐ１を含有するＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩフラグメント、およびＥｃｏＲＩ−
ＮｏｔＩで消化されたｐＳＩ。
【０１３２】 ｐＳＩ−ｐｎ９発現ベクターを下記フラグメントの三重連結によって同様に構
築した：ｐＧｅｍ−Ｔ−ｅａｓｙ−ｐｎ９から切り出される、ｈｎｈｐ１−ｐｎ
６の５’端を含有するＥｃｏＲＩ−ＳｓｐＩフラグメント、ｐＧｅｍ−ｐｎ６Ｆ
から切り出される、３’ＦＬＡＧ標識ｈｎｈｐ１を含有するＳｓｐＩ−ＮｏｔＩ
フラグメント、およびＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩで消化されたｐＳＩ。
【０１３３】 得られたプラスミドを、Ｆｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用してヒト胚性腎臓２９３細胞にトランス
フェクションした。トランスフェクションの４８時間後に細胞を集め、タンパク
質をウエスタンブロットにより分析した。２．５ｘ１０５個の細胞の溶解物をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ナイロンメンブランに移し、１：１０００希釈
の抗ＦＬＡＧ抗体（Ｋｏｄａｋ抗ＦＬＡＧＭ２ ｃａｔ：ＩＢ１３０２５、最終
濃度：１０μｇ／ｍｌ）とともにインキュベーションした。約６５ｋＤａおよび
６０ｋＤａのタンパク質が、それぞれ、ｐＳＩ−ｐｎ６ＦおよびｐＳＩ−ｐｎ９
Ｆでトランスフェクションされた細胞において検出された。これらのタンパク質
は、対応するオープンリーディングフレームの翻訳産物について計算される分子
量によって予想されるタンパク質にサイズが類似している。完全なｈｎｈｐ１の
ｃＤＮＡおよびｐｎ９スプライシング形態はともに、ヒト２９３細胞において問
題なく転写および翻訳されることが明らかにされる。しかし、ヘパラナーゼとは
異なり、Ｈｎｈｐ１のタンパク質生成物は、主要なプロセシングをこれらの細胞
において受けていない。
【０１３４】 本発明をその特定の実施形態に関連して説明してきたが、多くの代替、改変お
よび変化が当業者には明かであることは明白である。従って、本発明は、添付さ
れた請求項の精神および広い範囲に含まれるすべてのそのような代替、改変およ
び変化を包含するものとする。本明細書中に引用されている刊行物はすべて、そ
の全体が参考として組み込まれる。
【参考文献】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ｈｎｈｐ１のヌクレオチド配列（配列番号１〜２）および推定アミノ酸配列（
配列番号２〜３）を示す。
【図２】 ｈｎｈｐ１（配列番号２〜３）およびヘパラナーゼ（配列番号９）の推定アミ
ノ酸配列の比較である。
【図３】 ｈｎｈｐ１転写物の変化性を例示する。
【図４】 動物ブロットを示す。
【図５】 ｈｐａとｈｎｈｐ１との交差ハイブリダイゼーションを例示する。
【図６】 ヘパラナーゼおよびｈｎｈｐ１のヒドロパシープロフィルの比較である。
【図７】 ヒト胚性腎臓２９３細胞において発現させた組換えｈｎｈｐ１のウエスタンブ
ロット分析を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 9/24 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 イツハキ， ハナン イスラエル， 74062 ネス ズィオナ， ハタヤシム ストリート 36／16 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA12 BA80 CA01 CA04 CA11 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 4B050 CC01 CC03 DD01 LL01 LL03 4B065 AA01X AA57X AA87X AA90Y AA93Y AB01 BA01 CA31 CA44 CA46

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号１、４、６またはその一部と、６ｘＳＳＣ、１％Ｓ
    ＤＳ、５ｘデンハルト、１０％デキストラン硫酸、１００μｇ／ｍｌサケ精子Ｄ
    ＮＡおよび３２ｐ標識プローブにおいて６８℃でハイブリダイゼーション可能で
    あり、かつ３ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを用いて６８℃で洗浄されるポリヌ
    クレオチドを含む単離された核酸。
  2. 【請求項２】 Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）
    （ウイスコンシン大学）によって開発されたＤＮＡ配列分析ソフトウエアパッケ
    ージのＢｅｓｔｆｉｔ法（ギャップ生成ペナルティー：５０、ギャップ伸長ペナ
    ルティー：３）を使用して決定される配列番号１、４、６またはその一部との同
    一性が少なくとも６０％であるポリヌクレオチドを含む単離された核酸。
  3. 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドは、配列番号１、４、６またはその一
    部に示されている通りである、請求項２に記載の単離された核酸。
  4. 【請求項４】 Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）
    （ウイスコンシン大学）によって開発されたＤＮＡ配列分析ソフトウエアパッケ
    ージのＢｅｓｔｆｉｔ法（ギャップ生成ペナルティー：５０、ギャップ伸長ペナ
    ルティー：３）を使用して決定される配列番号３、５、７またはその一部との相
    同性が少なくとも６０％であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含
    む単離された核酸。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載されるポリヌクレオチドによってコードされ
    るポリペプチドを含む組換えタンパク質。
  6. 【請求項６】 請求項２に記載されるポリヌクレオチドによってコードされ
    るポリペプチドを含む組換えタンパク質。
  7. 【請求項７】 請求項３に記載されるポリヌクレオチドによってコードされ
    るポリペプチドを含む組換えタンパク質。
  8. 【請求項８】 請求項４に記載されるポリヌクレオチドによってコードされ
    るポリペプチドを含む組換えタンパク質。
  9. 【請求項９】 Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）
    （ウイスコンシン大学）によって開発されたＤＮＡ配列分析ソフトウエアパッケ
    ージのＢｅｓｔｆｉｔ法（ギャップ生成ペナルティー：５０、ギャップ伸長ペナ
    ルティー：３）を使用して決定される配列番号３、５、７またはその一部との相
    同性が少なくとも６０％であるポリペプチドを含む組換えタンパク質。
  10. 【請求項１０】 前記ポリペプチドは、配列番号３、５、７またはその一部
    に示されている通りである、請求項９に記載の組換えタンパク質。
  11. 【請求項１１】 請求項１に記載される単離された核酸を含む核酸構築物。
  12. 【請求項１２】 請求項２に記載される単離された核酸を含む核酸構築物。
  13. 【請求項１３】 請求項３に記載される単離された核酸を含む核酸構築物。
  14. 【請求項１４】 請求項４に記載される単離された核酸を含む核酸構築物。
  15. 【請求項１５】 請求項１１に記載される核酸構築物を含む宿主細胞。
  16. 【請求項１６】 請求項１２に記載される核酸構築物を含む宿主細胞。
  17. 【請求項１７】 請求項１３に記載される核酸構築物を含む宿主細胞。
  18. 【請求項１８】 請求項１４に記載される核酸構築物を含む宿主細胞。
  19. 【請求項１９】 （ｉ）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（
    ＧＣＧ）（ウイスコンシン大学）によって開発されたＤＮＡ配列分析ソフトウエ
    アパッケージのＢｅｓｔｆｉｔ法（ギャップ生成ペナルティー：５０、ギャップ
    伸長ペナルティー：３）を使用して決定される配列番号３、５、７またはその一
    部との相同性が少なくとも６０％であるポリペプチドをコードするポリヌクレオ
    チド鎖の一部；または （ｉｉ）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（ウイス
    コンシン大学）によって開発されたＤＮＡ配列分析ソフトウエアパッケージのＢ
    ｅｓｔｆｉｔ法（ギャップ生成ペナルティー：５０、ギャップ伸長ペナルティー
    ：３）を使用して決定される配列番号１、４、６またはその一部との同一性が少
    なくとも６０％であるポリヌクレオチド鎖の一部 と、生理学的条件のもと、インビボでハイブリダイゼーションし得る少なくとも
    １０塩基のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログを含むアンチセン
    スオリゴヌクレオチド。
  20. 【請求項２０】 請求項１９に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチド
    とリボザイム配列とを含むリボザイム。
  21. 【請求項２１】 （ｉ）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（
    ＧＣＧ）（ウイスコンシン大学）によって開発されたＤＮＡ配列分析ソフトウエ
    アパッケージのＢｅｓｔｆｉｔ法（ギャップ生成ペナルティー：５０、ギャップ
    伸長ペナルティー：３）を使用して決定される配列番号３、５、７またはその一
    部との相同性が少なくとも６０％であるポリペプチドをコードするポリヌクレオ
    チド鎖の一部；または （ｉｉ）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（ウイス
    コンシン大学）によって開発されたＤＮＡ配列分析ソフトウエアパッケージのＢ
    ｅｓｔｆｉｔ法（ギャップ生成ペナルティー：５０、ギャップ伸長ペナルティー
    ：３）を使用して決定される配列番号１、４、６またはその一部との同一性が少
    なくとも６０％であるポリヌクレオチド鎖の一部 と、生理学的条件のもと、インビボでハイブリダイゼーションし得る少なくとも
    １０塩基のアンチセンスＲＮＡ配列の合成を導くプロモーター配列およびポリヌ
    クレオチド配列を含むアンチセンス核酸構築物。
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