JP2011518551A - ヘパラナーゼ欠損非ヒト哺乳動物 - Google Patents
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Abstract
Description
ヘパラナーゼ欠損マウスの作製
ヘパラナーゼ欠損マウスは、ES細胞における該遺伝子の標的妨害により作製した。最小プロモーター領域(転写開始点の約500bp上流)及び第1エクソン全体を欠失させて機能的変異を生成するために、標的ベクターを構築した(図1A)。欠失部分のヌクレオチド配列は配列番号1に示されている。この目的のために、ヘパラナーゼ遺伝子(Hpse)の5’末端を含有する15−kbゲノムクローンを、バクテリオファージマウス(株129/Sv)ゲノムライブラリー(Stratagene社、シダークリーク、TX)から単離した。エクソン1の上流の2.5−kbフラグメントを、短い相同性アームとして、ネオマイシン耐性遺伝子(新カセット)の下流のpNT−Lox2プラスミド(Peter Carmeliet博士、Department of Molecular and Cellular Medicine、Catholic University、ルーベン、ベルギーにより提供)にクローニングした。エクソン1の下流の4.8−kbフラグメントは、内在性遺伝子の長い相同性アームとして新カセットの上流にクローニングした。標的ベクター構築物は、約14.5−kbの合計サイズを有した。
ヘパラナーゼ欠損マウスの表現型分析
ホモ接合変異動物は、明らかに異常な表現型を示さず、繁殖性であり、正常な寿命を示した。いずれかの可能性のある年齢に関連した表現型を調べるために、6、12及び18カ月齢マウスを屠殺し、臓器を切開し、96%エタノール、1%氷酢酸及び3%蒸留水含有溶液で固定した。パラフィン包埋組織切片を、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。脳、心臓、肝臓、肺、腎臓及び脾臓由来の切片の組織学的検査は、Hpse−KOマウスにおける重大な構造的又は病理学的異常性を明らかにしなかった。
ヘパラナーゼ欠損マウスにおけるヘパラン硫酸構造の生化学分析
ヘパリン硫酸(HS)の分解がヘパラナーゼの1つの主要な機能であることから、選択された臓器由来のHSを分析した。この目的のために、野生型及びHpse−KOマウスに0.5 mCi Na2 35SO4(特異的活性1,500 Ci/mmol;Perkin Elmer社、ワルトハム、MA)を腹腔内注射し、水及び食べ物を自由に摂取させて45分間維持した。動物を次いで頸椎脱臼により屠殺し、臓器を切開した。組織は、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma−Aldrich社)を含有する、6容量の氷冷50mM Tris−HCl、pH7.4、1%(v/v)Triton X−100、4M尿素、0.25M NaClにおいてDounceホモジナイザーによりホモジナイズした後、4℃で一晩インキュベートした。遠心分離後、上清を、50mM Tris−HCl、pH7.4、0.3M NaClで平衡化したDEAE−Sephacelカラムに適用した。カラムは同緩衝液で大規模洗浄し、次いで1.5M NaCl含有同緩衝液で溶出した。溶出液を脱塩し、凍結乾燥し、コンドロイチナーゼABC(Seikagaku社、東京、日本)及びベンゾナーゼ(Merck社、サンディエゴ、CA)で消化した。消化物は、次いでDEAE−Sephacelに再適用して、分解されたコンドロイチン硫酸及びオリゴヌクレオチドを除去した。1.5M NaClで溶出したHSPG画分は、さらなる分析のためプールした。
ヘパラナーゼ欠損マウスにおける内皮発芽及び血管新生の分析
ヘパラナーゼの細胞移動及び血管新生への関与は、十分に文献化されている。したがって、内皮細胞移動及び発芽に対するヘパラナーゼノックアウトの影響が評価された。先ず、エクスビボ大動脈輪アッセイが適用された。簡単には、8匹のwt及び8匹のHpse−KOマウスを屠殺し、この大動脈を浄化、及び1〜2mmの厚さの輪にカットした。輪を3次元増殖因子枯渇マトリゲル(BD Biosciences社、サンホセ、CA)に包埋し、添加FGF−2(50ng/mL)の存在下又は非存在下で0.5ml Bio−MPM(Biological industries社、ベスハエメク、イスラエル)でインキュベートした。輪を6日間維持し(37℃、8%CO2、加湿雰囲気)、培地及びFGF−2の両方を2日ごとに交換した。血管発芽を毎日、6日間評価し、次いで4%ホルマリンで24時間固定し、エタノール中0.02%クリスタルバイオレット(Sigma−Aldrich社)で染色し、Nikon Eclipse TS 100フェーズコントラスト顕微鏡を用いて撮影した。予想通り、FGF−2の非存在下ではwt又はHpse−KO輪のいずれにおいても発芽はほとんど又は全くなかった(不図示)。FGF−2による刺激では、wt及びHpse−KO輪のいずれも内皮発芽を示した(図4A)。特に、Hpse−KO由来の輪は、wt大動脈輪(図4A、上のパネル)と比べてより顕著な管形成を示し(図4A、下のパネル)、FGF−2刺激に対する反応の増加を示唆した。
ヘパラナーゼ欠損マウスにおける代償反応の分析
Hpse−KOマウスでの異常な乳腺形態及び新血管形成の増加という予想外の結果は、この表現型の背後にあるメカニズムの調査につながった。1つの疑問は、他のECM分解酵素(単数又は複数)が、ヘパラナーゼ発現の欠如を代償しているかどうかであった。ヘパラナーゼ遺伝子と顕著な相同(約38%)を示す(WO01/77341に開示)が、いかなる検出可能なヘパラナーゼ酵素活性も欠く遺伝子であるHpa2が、調査の第1候補であった。Hpa2発現の分析は、wtとHpse−KOマウスとの間のいかなる差を明らかにしなかった。さらに、Hpse−KOマウスで見出されるHS長の増加は、別のヘパラナーゼ様酵素を指し示さない。
多発性硬化症を治療するための候補化合物の評価モデルとしてのヘパラナーゼ欠損マウス
実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、次のスキームによりC57/Bl遺伝的背景の最適には6〜8週齢のHpse−KOメスマウスにおいて誘導される。
Claims (15)
- 少なくとも1つの破壊されたヘパラナーゼ対立遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記破壊されたヘパラナーゼ対立遺伝子がプロモーター及びエクソン1を欠く、請求項1に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記破壊されたヘパラナーゼ遺伝子が、Hind III−Xbalフラグメントを欠く、請求項2に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- ヘパラナーゼ遺伝子の破壊に対してホモ接合である、請求項1から3までのいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 請求項1から4までのいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物由来の単離細胞。
- a)非ヒト哺乳動物胚性幹細胞での相同組換えによりヘパラナーゼ遺伝子の部分を欠失させるステップと、
b)ステップa)で得られた組換え細胞を単離された胚盤胞に導入するステップと、
c)前記胚盤胞を偽妊娠した非ヒト哺乳動物に移植するステップと、
d)前記移植された胚盤胞がトランスジェニック非ヒト哺乳動物に発達することを可能にするステップと、
e)前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物を飼育して子孫を産生するステップと、
f)前記子孫をスクリーニングして、少なくとも1つの破壊されたヘパラナーゼ対立遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を同定するステップと
を含む、請求項1に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。 - a)において欠失された部分が、配列番号1に示されたヌクレオチド配列を含む、請求項6に記載の方法。
- 請求項1に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製するためのベクターであって、ヘパラナーゼコーディング配列の1つのエクソンの少なくとも一部分が、選択可能なマーカー配列に置換されている、ヘパラナーゼノックアウト構築物をコードする核酸配列を含む上記ベクター。
- 前記選択可能なマーカー配列がネオマイシン耐性遺伝子を含む、請求項8に記載のベクター。
- a)請求項1に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供するステップと、
b)前記哺乳動物を疾患刺激に曝露するステップと、
c)前記哺乳動物に前記薬剤候補を投与するステップと、
d)前記疾患刺激により誘導された疾患の発症について前記哺乳動物を分析するステップと
を含む、治療剤候補のスクリーニング方法。 - 前記疾患刺激が接種された腫瘍細胞を含み、前記ステップd)が任意の腫瘍転移形成を決定することを含む、請求項10に記載の方法。
- 前記疾患刺激が炎症刺激であり、前記ステップd)が任意の炎症反応のレベルを決定することを含む、請求項10に記載の方法。
- 前記疾患刺激が実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導する、請求項10に記載の方法。
- 前記疾患刺激がアレルギー反応を誘導する、請求項10に記載の方法。
- 野生型非ヒト哺乳動物において得られた対応する結果と、得られた結果を比較することをさらに含む、請求項10から14までのいずれか一項に記載の方法。
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